JP4846148B2 - 神経変性疾患治療用il6ril6キメラ - Google Patents
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Description
[本発明の分野]
本発明は、一般に、神経学的疾患および障害の分野に属する。詳細には、本発明は、神経変性疾患(neurodegenerative diseases)、神経保護(neutoprotection)、神経ミエリン形成およびミエリン鞘を生産する細胞の産生に関する。さらに詳細には、本発明は、神経学的疾患または障害の治療用医薬、とくに神経保護用ならびに脱髄疾患の治療および神経再生の促進用医薬の製造を目的とするIL6RIL6の用途を提供する。
【0002】
[本発明の背景]
神経鞘形成は、中枢神経系(CNS)および末梢神経系(PNS)区分の形成と機能とにおいて必須の過程である。軸索周囲のミエリン鞘は、神経に沿った電気インパルスの適切な伝導に必要である。ミエリンの破壊は多くの疾患で生じており、その多くの疾患には、CNSに変調をきたす多発性硬化症(MS)、ギヤン−バレー症候群、CIDPおよびその他がある(Abramsky and Ovadia,1997; Trojaborg, 1998, Hartung et al, 1998参照)。感染性の病原菌または自己免疫による攻撃などの様々な病因があるが、脱髄疾患はすべて神経学的機能の破壊を引き起こし、結果として麻痺や死をもたらし得る。現在の治療剤はMSにおける炎症性の攻撃をおさえ、疾患の進行を遅くするが、ミエリン再形成および神経学的機能の回復を導くことができる治療法を開発する必要がある(Abramsky and Ovadia, 1997, Pohlau et al, 1998)。
【0003】
ミエリンの合成は、特殊化したグリア細胞、すなわちCNSにおけるオリゴデンドロサイトおよびPNSにおけるミエリン形成シュワン細胞、の機能による。完全に分化した状態にあるそれらの2つの細胞型は、ミエリン形成細胞と呼ばれることがある。ミエリンは、多くの異なるタンパク質を含有する脂質膜構造である。ミエリン塩基性タンパク質(MBP)は、CNSおよびPNSのミエリンタンパク質の主要成分(30%)に相当する。オリゴデンドロサイトおよびミエリン形成シュワン細胞が最終的に分化するあいだ、MBPおよび様々なミエリンタンパク質をコードするほかの遺伝子が発現する(たとえば、P0、PMP−22、PNSにおけるMAG、CNSにおけるPLP、MOG)。それらの細胞の起源は胚の神経冠にあって(Fraser, 1991)、胚の神経冠からそれらの細胞は移動し、多くの段階で進行する分化を経る。シュワン細胞(SC)の発生は、1)移動する細胞に由来する前駆体(pSC)の産生;2)増殖、およびS100タンパク質を発現する胚SC(eSC)への変化;3)eSC群の一部による、MBPおよびほかのミエリンタンパク質を発現するミエリン形成SCへの生後(postnatal)の最終的な分化(Kioussi and Gruss, 1996)、の3つの主要段階が関係するようである。神経冠から移動する細胞は、pSCだけではなく、感覚および交感ニューロン、平滑筋細胞、ならびに皮膚や毛包に到達し色素が沈着したメラニン細胞になる細胞をも生み出す。神経冠細胞の運命は、様々な誘導因子により影響される。すなわち、グリア細胞、ニューロンおよび筋肉への分化は、それぞれ、グリア成長因子(GGF)などのニューレグリン、BMP2/4およびTGF−βにより促進される(Anderson, 1997)。メラニン細胞への分化は、bFGFまたはPDGFまたはSDFなどの成長因子によって促進され得る(Stocker et al, 1991; Anderson, 1997)。
【0004】
シュワンおよびオリゴデンドロサイトの前駆体から活発にミエリン形成を行なう細胞への最終的な分化、およびミエリン形成そのものは、神経軸索とグリア細胞との間の相互作用によって生じるシグナルに依存するようである(Lemke and Chao, 1988; Trapp et al, 1988)。軸索−シュワン細胞の接触が妨げられると、神経損傷後のように、細胞はミエリン非形成状態に戻り、ミエリンタンパク質遺伝子の発現は失われる(Jessen and Mirsky, 1991)。ミエリン形成またはミエリン再形成を刺激することを可能にするために、神経疾患または外傷ののちに、ミエリン合成を誘導し得る因子を同定することは非常に重要である。
【0005】
外傷、低酸素症および虚血を含む急性傷害により誘導されるCNSへの損傷は、ニューロンと白質の双方に作用し得る。神経細胞死を導く過程に多くの注意がはらわれているが、増加する証拠は、軸索にミエリンを形成するオリゴデンドロサイトに対する損傷がCNS損傷の特定の要素でもあることを示唆する。したがって、オリゴデンドロサイトの異常は、ラットにおける脳虚血後の非常に早い時期に(3時間)明示され、それらの細胞が神経細胞に比べて、興奮毒性の事象に対してさらにいっそう弱いことを示唆した(Pantoni et al, 1996)。細胞死を媒介する1つの可能性ある候補は、多くの急性CNS損傷に伴うグルタミン酸濃度の著しい上昇である(Lipton et al. 1994)。実際に、ニューロンのあたりでは、オリゴデンドロサイトでさえAMPA/カイニン酸サブタイプに属する機能的グルタミン酸受容体を発現することが見出された。そのうえ、オリゴデンドロサイトは、グルタミン酸適用に対して高い脆弱性を示した(McDonald et al, 1998)。
【0006】
胚シュワン細胞前駆体に作用するGGFなどのニューレグリンはまた、損傷した神経における、生後のオリゴデンドロサイトおよびシュワン細胞のための生存、増殖および成熟因子であり、GGFは軸索の接触により供給されるマイトジェン因子の1つである(Topliko, et al. 1996)。多発性硬化症のマウスモデル(Cannella et al, 1998)または挫滅した末梢神経(Chen et al, 1998)において、組換え体hGGF2は長期投与によりミエリン再形成を増強することができた。軸索の接触により、シュワン細胞において誘導される別のサイトカインは、毛様体神経栄養因子CNTFである(Lee et al, 1995)。白血病阻害因子(LIF)と同様に、CNTFは、bFGFまたはPDGFとともにインビトロで培養された視神経由来のオリゴデンドロサイトの生存を促進し、それらの培養物において、MBPを発現するオリゴデンドロサイトの数を増加させることが示された(Mayer et al, 1994)。しかしながら、CNTFおよびLIFは、グリア前駆細胞に添加されると、むしろアストロサイトの分化に有利に働いて、アストロサイトのGFAPマーカーの発現を誘導するようであり、一方、オリゴデンドロサイトにおいては、MBP遺伝子発現のレベルにほとんど影響せず、主に生存作用を有するのであろう(Kahn and De Vellis, 1994, Bonni et al, 1997)。それにもかかわらず、CNTFと脳由来神経栄養因子BNDFとの組み合わせは、損傷を受けた末梢坐骨神経の回復を向上させる(Ho et al, 1998)。
【0007】
CNTFおよびLIFは、LIF受容体(LIFR)およびgp130鎖からなる共通の受容体系を介して作用するサイトカインである。gp130鎖はインターロイキン−6(IL−6)受容体複合体の一部でもある(Ip et al., 1992)。したがって、CNTFおよびLIFは、サイトカインのIL−6ファミリーの一部である。CNTFおよびLIFの場合、シグナル伝達はLIFRとgp130との二量体形成を介して作動するが、IL−6の場合、シグナルは2つのgp130鎖の二量体形成により生じる(Murakami et al, 1993)。gp130に結びつくために、IL−6は、IL−6受容体鎖と複合体をつくる。そのIL−6受容体鎖は、特定の細胞上にgp80膜貫通タンパク質として存在するが、その可溶型は細胞外から供給されるとIL−6アゴニストとしても機能する(Taga et al, 1989, Novick et al. 1992)。可溶性IL−6受容体(sIL−6R)およびIL−6をコードするcDNAの完全なコード領域を融合することによって、組換え体IL6RIL6キメラをCHO細胞において生産することができる(Chebath et al, 1997, WO99/02552)。このIL6RIL6キメラは、IL−6型の生物学的活性を増強し、インビトロでは、IL−6とsIL−6Rとの混合物よりも非常に高い効率でgp130に結びつく(Kollet et al, 1999)。
【0008】
中枢および末梢神経系の細胞に対するIL−6の影響の再検討により、サイトカインは、炎症性神経変性疾患の過程に関与するだけではなく、神経細胞への保護効果を有し得ることが示された(Gadient and Otten. 1997, Mendel et al, 1998)。グリア細胞において、CNTFおよびLIFは、IL−6よりもさらに有効にアストロサイトの分化を刺激し、ミエリンタンパク質生産細胞への影響はなかった(Kahn and De Vellis, 1994)。IL−6は、線条体のニューロン(Toulmond et al. 1992)だけではなく、海馬のニューロンにおけるグルタミン酸誘導性細胞死を予防することが見出された(Yamada et al. 1994)。グルタミン酸受容体のNMDAサブタイプに対する選択的アゴニストであるNMDAによって生じる細胞毒性に対するIL−6の神経保護メカニズムは、なお知られていない。実際上、IL−6はNMDAが介在する細胞内カルシウムの上昇を増強することが見出された。脳の舌下神経核の衰退性標識(retrograde labelling)によって示されるように(Hirota et al, 1996)、IL−6および可溶性IL−6R(sIL6−R)双方を高レベルで発現するトランスジェニックマウスにおいて、舌下神経の損傷の後に加速的な神経再生が観察された。その研究において、後根神経節(DRG)細胞の培養物にIL−6およびsIL−6Rを添加すると、ニューロンにおいて著しいニューライト伸長が示されたが、ミエリン形成細胞への影響はなんら報告されなかった。
【0009】
前記したデータを考慮すると、CNTF、LIFまたはIL−6とsIL−6Rとの混合物は、グリア細胞からミエリン形成細胞への最終的な分化を誘導することを示していない。しかしながら、上に略記したように、ミエリン形成細胞分化の刺激は、脱髄または神経変性疾患に苦しむ患者にとって非常に有用であろう。
【0010】
本明細書におけるいかなる文献の引用も、そのような文献が、関連する先行技術または本件出願の請求の範囲の特許性を検討する資料であることを認めるものとして理解されることを意図するものではない。文献の内容または日付に関する記載は、出願時に出願人に利用可能な情報に基づいており、そのような記載の正確性を認めるものではない。
【0011】
[本発明の要旨]
本発明の目的は、神経学的疾患および障害の治療および/または予防のための手段を提供することである。詳細には、本発明の目的は、前駆体または分化したグリア細胞からミエリン形成細胞への分化を刺激または増強するための手段を提供することである。本発明の原理は、IL−6とsIL−6Rとの混合物よりも、gp130に対して著しく高い親和性を有する組換え体IL6RIL6キメラタンパク質の用途にある。
【0012】
さらに、本発明の目的は、インビボでの坐骨神経切断に続いて誘導される軸索のミエリン再形成により、さらにはインビトロでのミエリン遺伝子の誘導へのIL−6キメラのミエリン形成効果により説明される、損傷線維のミエリン形成またはミエリン再形成を刺激または増強するための手段を提供することである。
【0013】
また本発明の目的は、後根神経節(DRG)培養物において発生するシュワン細胞の数を増加させるために、IL6RIL6キメラを使用することである。その上、本発明の目的は、シュワン細胞株と初代DRGとの共培養において説明されるように、それらの細胞が軸索周囲を包み、ミエリン塩基性タンパク質を生産するまで、それらの細胞の分化を誘導するためにIL6RIL6を使用することである。
【0014】
本発明のもう1つの目的は、マウスのメラノーマに対するIL6RIL6の影響により説明されるように、メラニン細胞の表現型を有する細胞がシュワンのミエリン形成表現型に転換する分化転換の系において、ミエリン塩基性タンパク質(MBP)遺伝子の転写を誘導するためにIL6RIL6キメラを使用することである。
【0015】
本発明のもう1つの目的は、神経保護剤としてIL6RIL6キメラを使用すること、および記憶の記銘に関する領域であってアルツハイマー病や虚血において早期に変性を示す領域である海馬における神経細胞死を予防するためにIL6RIL6キメラを使用することである。
【0016】
本発明のもう1つの目的は、新生ラットの小脳ニューロンの初代培養物においてIL−6キメラによりもたらされるグルタミン酸誘導性神経毒性からの保護によって説明されるように、興奮性アミノ酸により生じる神経毒性の過程に対する保護剤としてIL6RIL6キメラを使用することである。
【0017】
MBP遺伝子分化を誘導しミエリン形成表現型をもたらす特異的な転写因子をIL6RIL6が誘導して抑制するという分子機構が提案される。
【0018】
このように、本発明は、神経学的疾患および障害の治療および/または予防用医薬の製造のためのIL6RIL6キメラの用途を提供する。詳細には、本発明は、外傷性神経変性、CNSまたはPNSの脱髄疾患、および/または神経変性疾患の治療用医薬の製造のためのIL6RIL6キメラの用途を提供する。
【0019】
さらに詳細には、本発明は、多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病、パーキンソン病またはALSの治療におけるIL6RIL6キメラの用途を提供する。
【0020】
本発明はまた、IL6RIL6キメラおよび任意には1つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤からなる、神経学的疾患および障害を治療および/または予防する医薬組成物を提供する。詳細には、その医薬組成物は、外傷性神経変性、CNSまたはPNSの脱髄疾患、および/または神経変性疾患の治療用である。
【0021】
本発明の医薬組成物の好ましい用途は、MS、アルツハイマー病、パーキンソン病またはALSの治療である。
【0022】
[本発明の詳細な説明]
本発明において、IL6IL6R組換えタンパク質を後根神経節細胞またはメラノーマ細胞の培養物に添加すると、それらの細胞からミエリン形成細胞への分化が刺激されるということが見出された。また、IL6IL6R組換えタンパク質を神経細胞およびシュワン細胞の共培養物に添加すると、後者が軸索周辺における正常な髄鞘の形成を誘導することも見出された。したがって、本発明は、ミエリン形成細胞を産生するための、またはミエリン形成細胞の産生を刺激し、促進し、または加速させる医薬の製造のためのIL6RIL6キメラの用途に関する。
【0023】
さらに、IL−6キメラは、ラットの坐骨神経軸索切断(sciatic nerve axiotomy)に沿った離断線維(transected fibers)のミエリン再形成を、インビボにて誘導する。したがって、本発明はさらに、とくに神経損傷もしくは外傷または軸索損傷ののちに、ミエリン再形成を誘導し、促進し、または加速させる医薬の製造のための、IL6RIL6キメラの用途に関する。
【0024】
さらに、IL6IL6R組換えタンパク質を器官培養物(organotypic cultures)に添加すると、神経毒性の薬物に対する長期保護効果を誘導することが見出された。したがって、本発明はまた、神経保護とくに神経毒性の薬物に対する神経保護を誘導し、促進し、長期化させ、または加速させる医薬の製造のための、および神経細胞死、たとえばアポトーシスによる神経細胞死を阻害、低減または減速するための、IL6RIL6キメラの用途に関する。
【0025】
本発明は、生来存在する可溶性IL−6受容体δ−Valの完全なコード配列を、生来存在する成熟IL−6の完全なコード配列に融合して得られる組換え糖タンパク質である「IL6RIL6キメラ」(「IL6RIL6」またはIL−6キメラともいう)の用途に関する。両コード配列はヒト由来である。IL6RIL6キメラは、酵母細胞、昆虫細胞などのいかなる適当な真核細胞において生産されてもよい。IL6RIL6キメラは、哺乳類細胞において生産されるのが好ましく、WO99/02552に記載されたような遺伝子的に処理されたCHO細胞において生産されるのがもっとも好ましい。ヒト由来のタンパク質が好ましいけれども、本明細書に記載する生物学的活性を有するかぎり、本発明において、ほかに由来する同様の融合タンパク質を使用し得ることは、当業者により理解されるであろう。
【0026】
さらに詳細には、本発明は、前駆または分化したグリア細胞からミエリン形成細胞への分化を刺激するためのIL6RIL6キメラの用途にかかわる。本明細書に記載するように、IL6RIL6誘導性ミエリン形成細胞の分化過程は、ミエリン非形成の表現型に必要な遺伝子の抑制に加え、神経軸索周囲のミエリン鞘の形成に必要な遺伝子の活性化に関係する。
【0027】
本発明において、妊娠14〜15日のマウス胚から単離した後根神経節(eDRG)細胞の培養物に対するIL6RIL6キメラの添加は、DRGに存在するシュワン細胞前駆体の発生に強い影響を及ぼすことが観察された。2〜5日後、培養物において、胚シュワン細胞数の著しい増加、DRGの軸索を膜で包みはじめるというそれらの細胞の著しい表現型の変化、およびMBPの誘導がみられた。本発明によると、シュワン細胞と神経との共培養において、IL−6キメラは、5時間以内で、ミエリン非形成軸索に沿ったシュワン細胞の結合の顕著な増加を誘導し得ることが、さらに観察された。フッ化金でラベルしたシュワン細胞は伸長し、数日後、蛍光を発する細胞質が、軸索周囲に正常な髄鞘を形成するのをみることができる。キメラがなければ、またはNFGがあれば、シュワン細胞はほとんど結合せず、髄鞘を形成しない。
【0028】
したがって、さらに本発明は、末梢神経系のシュワン細胞によるミエリン形成だけではなく、シュワン細胞の増殖および/または分化を誘導する医薬の製造のためのIL6RIL6キメラの用途に関する。
【0029】
本発明において、IL−6キメラは、末梢神経のミエリン再形成をインビトロにて誘導し得ることが示された。ラットの坐骨神経軸索切断および近位部と遠位部の断端の対置(juxtaposition of proximal and distal stumps)により、IL−6キメラは、末梢神経の再生および離断線維のミエリン再形成を、インビボにて誘導することができた。IL−6キメラの存在するところで、ミエリン形成線維の数および厚みに4倍の増加がみられ、より遠くの線維のミエリン形成の増加がみられた。したがって、本発明はさらに、末梢神経系におけるミエリン再形成を誘導する医薬の製造のためのIL6RIL6キメラの用途に関する。
【0030】
そのうえ、本発明において、IL−6キメラは、シュワン細胞などの末梢神経のミエリン形成細胞、およびオリゴデンドロサイトなどの中枢神経系の細胞においてMBP、PLPおよびP0遺伝子などのミエリンタンパク質の成分をコードする遺伝子の発現を誘導し得ることが見出された。したがって、本発明はさらに、中枢神経系のオリゴデンドロサイトによるミエリン形成および/またはミエリン再形成を誘導する医薬の製造のためのIL6RIL6キメラの用途に関する。
【0031】
本発明において、IL6RIL6キメラをB16/F10.9マウスのメラノーマ細胞株に添加すると、6〜12時間以内にMBP遺伝子の発現が誘導されることが見出された。CNPase遺伝子などのミエリンのタンパク質をコードするほかの遺伝子は誘導されるが、メラニン産生(メラニン色素沈着の形成)に関するチロシナーゼなどの遺伝子の発現は、強く抑制される。IL6RIL6で処理されたF10.9細胞はまた、著しい形態変化を経て、シュワン様表現型を獲得する。IL6RIL6が、メラニン細胞の状態からミエリンを形成する状態への細胞の分化転換を生じさせるという仮定は、表現型の変化および特定のミエリン遺伝子の誘導により支持される。胚において、神経冠から移動する細胞は、メラニン細胞、あるいはミエリン形成シュワン細胞およびオリゴデンドロサイトのいずれかを生み出すことができるので、IL6RIL6は細胞の運命に影響を及ぼすことができ、またミエリン形成細胞の形成を開始させることができるということが示唆される。したがって、本発明はまた、末梢神経系および中枢神経系においてミエリン形成細胞の形成を誘導し、促進させ、増強し、または加速させる医薬の製造のための、および/またはメラニン細胞からミエリン形成細胞への分化転換を誘導する医薬の製造のための、IL6RIL6キメラの用途に関する。
【0032】
そのうえ、ミエリン形成シュワン細胞に分化する前に胚の神経冠細胞で発現される遺伝子、ホメオボックス遺伝子Pax−3(Kioussi and Gruss, 1996)をダウンレギュレーションするために、IL6RIL6は作用するということが本発明において示される。Pax−3は、MBP遺伝子を抑制することが知られている。したがって、Pax−3抑制は、ミエリン形成細胞の最終的な成熟における重要な事象であるようである。したがって、IL6RIL6は、重要な分化スイッチに作用する(たとえば、pax−3抑制)。
【0033】
Pax−3は、メラニン細胞の表現型に重要なチロシナーゼおよびほかの遺伝子の発現を順番に誘導および維持する小眼球症関連転写因子MITFのトランスアクチベーターである。したがって、IL6RIL6によるPax−3の速やかな抑制の発見は、神経冠由来細胞のミエリン形成活性を促進する分子的事象を説明することができる。ミエリンを形成された軸索は、神経損傷ののち、ウォーラー変性の一部として脱髄を経る。その過程のあいだ、シュワン細胞は、MBP遺伝子およびほかに関係のあるミエリンタンパク質遺伝子の発現を減少させる。同時に、Pax−3のアップレギュレーション、およびミエリンを形成するSCからミエリン非形成であって増殖するSCへの逆転を示すGFAPのアップレギュレーションがおこる(Kioussi and Gruss 1996)。本発明において、IL6RIL6キメラは、ミエリン形成活性化を再開するため、Pax−3を抑制し、SCを誘導することでウォーラー神経変性の過程から復帰させるための有力なサイトカインとなるようである。外傷のように、脳脱髄疾患の神経変性は、マクロファージやほかの炎症細胞(inflammatory cells)によって開始される脱髄過程により刺激されるので、同じ考えが脳脱髄疾患に適用されるであろう。したがって、本発明はまた、神経損傷および/または外傷性神経脱髄および/または軸索損傷の治療に対する医薬の製造のための、IL6RIL6キメラの用途に関する。
【0034】
IL6RIL6は、慢性的な再発性多発性硬化症のモデル系として、MBPを用いる免疫により自己免疫性脱髄(autoimmune demyelinating)が誘導されているマウス(Cannella et al, 1998)に、注入され得る。ミエリンタンパク質遺伝子やミエリン形成グリア細胞の分化を誘導するというIL6RIL6の能力は、この薬学的実例を用いて、インビボにて観察することができる。したがって、本発明はさらに、自己免疫脱髄疾患の治療および/または予防、とくに多発性硬化症の治療および/または予防に対する医薬の製造のための、IL6RIL6キメラの用途に関する。
【0035】
IL−6キメラはまた、神経保護効果を有しており、記憶の記銘に関係しアルツハイマー病および虚血において早期変性を示す領域において興奮毒性の薬物により誘導される神経細胞生存能力の低下を予防することが示されている。IL−6キメラは、グルタミン酸誘導性神経毒性から神経を保護することが見出された。したがって、本発明は、細胞死とくに神経毒性の薬物の影響による細胞死からの神経細胞の保護のための、およびたとえばアルツハイマー病、パーキンソン病またはALSなどの神経変性疾患の治療および/または予防のための、医薬の製造のためのIL6RIL6キメラの用途に関する。
【0036】
さらに、IL6RIL6キメラで治療され得る神経学的疾患は、発作、運動障害、てんかん、痛みなどである。
【0037】
「薬学的に許容し得る」の定義は、活性成分の生物学的活性の有効性を損なわず、投与する宿主に対して毒性がないあらゆる担体を網羅することを意味する。たとえば、非経口投与用に、IL6RIL6は、食塩水、デキストローズ溶液、血清アルブミンおよびリンガー液などのビヒクルに、注射剤用の単位量形式(a unit dose form)で処方され得る。
【0038】
IL6RIL6は、その投与を必要とする患者に、様々な方法で投与することができる。投与経路は、皮内、経皮(たとえば、徐放的な処方にて)、筋内、腹腔内、静脈内、皮下、経口、硬膜外、局所および鼻腔内経路である。そのほかの治療に有効な投与経路、たとえば、上皮または内皮組織を介する取り込み、または、インビボでIL6RIL6キメラを発現し分泌させるIL6RIL6キメラをコードするDNA分子を患者に投与する(たとえば、ベクターによる)遺伝子治療による取り込みを、利用することができる。さらに、IL6RIL6キメラは、薬学的に許容し得る界面活性剤、賦形剤、担体、希釈剤およびビヒクルなどのそのほかの生物学的活性剤の成分とともに投与され得る。
【0039】
非経口(たとえば、静脈内、皮下、筋内)投与用に、IL6RIL6キメラは、薬学的に許容し得る非経口ビヒクル(たとえば、水、生理食塩水、デキストローズ溶液)や等浸透圧性を維持する添加剤(たとえば、マンニトール)もしくは化学的安定性を維持する添加剤(たとえば、防腐剤および緩衝剤)とともに、液剤、懸濁剤、乳剤または凍結乾燥された粉剤として処方され得る。その処方は、一般的に使われる技術により殺菌する。
【0040】
「有効量」は、前述の疾患の進行および発病度に充分作用し、そのような異常の減少もしくは回復を導く活性成分の量とする。有効量は、投与経路および患者の状態に依存するであろう。
【0041】
単回量または複数回量のように、個体に投与する量は、IL6RIL6キメラの薬物動態学的能力(pharmacokinetic properties)、投与経路、患者の状態および特性(性別、年齢、体重、健康状態、サイズ)、症状の程度、現在の治療、治療の頻度ならびに所望の効果を含む様々な要因により、変化するであろう。確立された用量範囲の調整および操作(manipulation)は、神経のミエリン再形成を解決するインビトロおよびインビボでの手法と同様に、当業者の能力内で充分に行うことができる。
【0042】
本発明は、特定の実施態様とともに記載されるが、さらなる変更が可能であることは理解されるであろう。本出願は、本発明の原理に概ねしたがった本発明のあらゆる変型、用途または適応、および、本発明が属する分野における既知の慣例または慣行の範囲内にあって、添付の請求の範囲で説明される前記の本質的特徴に適用され得る本開示の変更を含む本発明のあらゆる変型、用途または適応を包含することを意図する。
【0043】
刊行物、論文または要約、公開もしくは未公開の特許出願明細書、発行もしくは外国特許、またはそのほかの参考文献を含む本明細書中で引用されたすべての参考文献は、すべてのデータ、表、図面および引用される参考文献の本文を含めて、参考文献により完全に本明細書中に包含される。さらには、本明細書中で引用された参考文献で引用される参考文献のすべての内容もまた、参考文献により完全に包含される。
【0044】
さて、本発明は、以下の非限定的な実施例および添付の図面においてさらに詳細に説明される。
【0045】
実施例
実施例1:インビトロでのミエリン形成およびミエリン再形成へのIL6RIL6の影響
脊髄において、後根は本質的に感覚神経からなり、感覚神経は後根神経節(DRG)にシナプスを形成する。マウスの胚形成中(e14〜e15日)、DRGは、神経および未だミエリン形成SCに分化していない胚シュワン細胞の手ごろな供給源である。インビトロ培養のためにDRGの外植片を得る方法は、リー(Li)(1998)によって記載されている。培養は、F12/DMEM培地(ギブコ社(Gibco)製)中の、コスタープレート(Costar plates)のウェルに設置されたガラス製カバーガラス上で実施した。カバーガラスは、本質的には同様の結果を有するコラーゲンまたはポリ−D−リシンのどちらかで被覆されていた。培養は、成長因子またはサイトカインを含まない培地または神経成長因子(NGF、40ng/ml)を補充した培地、またはIL6RIL6キメラ組換えタンパク質(3μg/ml)を補充した培地のいずれかにおいてなされた。培養物は、ビデオカメラ画像システム(レイカ(Leica)LIDAシステム)に連結したオリンパス倒立顕微鏡を用いる光学顕微鏡検査法により、毎日、検査された。カバーガラスの一部をパラホルムアルデヒドで固定し、ミエリン塩基性タンパク質に対するモノクローナル一次抗体および蛍光接合二次抗体を用いて、MBPタンパク質を標識した。神経の細胞体および軸索は、神経線維タンパク質に対する抗体を用いて染色された。カバーガラスの一部は、走査型電子顕微鏡法(EM)により検査された。2〜5日後、何も添加せずに培養されたDRG外植片は、その外殖片から増殖した細胞が多角形または楕円形のどちらかになることを示した。しかしながら、NGFが添加されると、楕円形の細胞は長い軸索の突起を形成し、神経線維に対する抗体により染色される散在的なネットワークを形成した。いくつかの軸索は長く、分岐していたが、シュワン細胞は軸索に沿って観察されなかった。対照的に、IL6RIL6を用いた培養では、神経線維を染色される軸索を有する神経細胞だけではなく、先端が分岐し、長く両極に伸長した平らな細胞のようにみえるシュワン細胞も存在することを示した。それらの伸長物は、神経線維タンパク質を染色されなかった。走査型EMにより、それらのシュワン細胞は、軸索周囲を包みはじめる膜ラッフリングとともに、軸索の突起に沿って観察された。
【0046】
抗MBPを用いる染色法により、IL6RIL6で処理した培養物において、とくに、順に一列に並ぶ細胞の配置において、はっきりと染色されたシュワン細胞が示された。一方、IL6RIL6ではなくNGFで処理した培養物において、MBP特異的蛍光はみられなかった。
【0047】
同様の結果が、e15ラット胚由来のDRG培養物において観察された。マウスの坐骨神経に由来するシュワン細胞はまた、IL6RIL61.4μg/lと共にインビトロにて培養され、MBPのRNA転写物のレベルが測定された。対照的に、細胞において環状AMPレベルを人工的に増加させ、また、MBPを誘導することが知られている薬物であるフォルスコリン(Lemke and Chao, 1998)20μMで、同じ培養物が処理された。その結果、IL6RIL6は、MBP遺伝子発現を誘導することに対してフォルスコリンと同様の効果があり、培養3日後のMBPのRNAレベルを維持することに対してより効果的であることが示された(図1)。
【0048】
研究において、18日胚の後根神経節(DRG)では、IL−6キメラがMBPおよびP0のmRNAの発現を3日以内に誘導するが、Pax−3のmRNAは同じ細胞系において強く抑制されることが見出された。P0およびMBP遺伝子発現へのIL−6キメラの影響の用量依存曲線は、500ng/mlにおいて、IL−6キメラの最大効果を示す。したがって、IL−6キメラは、正常な神経グリア細胞におけるミエリン遺伝子発現の重要な誘導物質であるようである。
【0049】
ラットの坐骨神経由来またはラットの後根神経節(DRG)由来のシュワン細胞株は、IL−6キメラの影響をさらに研究するために産生された。ラットの坐骨神経由来のシュワン細胞株は、IL−6キメラに応答し、RT−PCRおよびノザンブロット解析による測定によると、2〜3倍のP0遺伝子が誘導され、そのタンパク質産物は末梢神経ミエリンの約50%を形成することが見出された。
【0050】
IL−6キメラによるミエリン遺伝子成分の転写活性を研究するために、MBPプロモーターを発現ベクターのルシフェラーゼレポーター遺伝子の上流に導入し、ラットの坐骨神経シュワン細胞株で試験した。フォルスコリンのない状態で、それらの細胞におけるIL−6キメラに応答して、MBPプロモーターに由来する7倍以上の転写活性の誘導が観察された。さらなるレポーター遺伝子検定で、それらの細胞において、IL−6キメラはP0遺伝子のプロモーターに由来する転写に関し2.5倍の誘導を誘導することが見出された。
【0051】
前記の結果は、IL−6キメラは、導入されたシュワン細胞内で、ミエリン遺伝子転写に直接的な影響を及ぼすことを示唆する。
【0052】
さらなるシュワン細胞株が、ラットの後根神経節(DRG)から単離され、CH細胞株と名づけられた。この細胞株は、増殖速度が遅いこと、および増殖はIL−6キメラ(140ng/ml)に依存することが見出された。興味深いことに、CH細胞はオリゴデンドロサイトに似た星状の形態であった。その細胞は、IL−6キメラによるミエリン形成の誘導に関して、機能するようであった。その細胞はP0およびMBPを発現し、キメラ非存在下の血清含有培地で増殖させられると死滅した。
【0053】
実施例2:インビトロにおけるオリゴデンドロサイト増殖の阻害
中枢神経系の細胞に対するIL−6キメラの影響が研究された。オリゴデンドロサイトの分化は増殖の阻害につながり、ついでオリゴデンドロサイトによる髄鞘形成およびミエリン形成を促進するということが立証された。
【0054】
したがって、オリゴデンドロサイトの増殖を阻害するというIL6R/IL6キメラの能力が、インビトロで試験された。t−neu癌遺伝子で不死化されたマウスの初代オリゴデンドロサイト(オリゴデンドログリア)細胞株(「oli−neu」細胞株)が、この実験に使用された。培養条件だけでなくoli−neu細胞株の確立および特性も、ユング(Jung)ら(1995)により記載されている。未分化oli−neu細胞の増殖は、IL6R/IL6キメラの様々な量(1μg/ml、500ng/ml、250ng/ml、125ng/mlおよび0ng/ml(対照))に対し、1、2および3日後に測定された。増殖速度は、蛍光定量法/比色分析用増殖指示薬(fluorometric/colorimentric growth indicator)アラマーブルー(Alamar Blue)で細胞の代謝活性を測定することにより、定量された。この薬剤は、細胞増殖によって生じた増殖培地の化学的還元に対して蛍光を発し、その色を変化させる酸化還元指示薬である。使用したその薬剤および検定法は、アーメド(Ahmed)ら(1994)および米国特許第5,501,959号に記載されている。
【0055】
その結果を図2に示す。IL6R/IL6キメラをオリゴデンドロサイトの培養培地へ添加すると、48時間後にはすでに、増殖の顕著な減少が導かれた。72時間後、対照と比較して、増殖は40から50%まで減じられた。興味深いことに、IL6R/IL6キメラ(1μg)の最大量は、500から125ng/mlまでの少ない量よりも効果が低かった。
【0056】
この実験は、IL6R/IL6キメラがインビトロでオリゴデンドロサイトの増殖を強く抑制することを示し、IL6R/IL6キメラがオリゴデンドロサイトの分化のプロモーターであることを表す。オリゴデンドロサイトは、CNSにおいてミエリン鞘を生産するグリア細胞であるので、インビボにてミエリン形成を積極的に促進する薬剤となり得る。
【0057】
実施例3:オリゴデンドロサイトの形態へのIL6R/IL6キメラの影響
オリゴデンドログリアの形態に対するIL6キメラの影響を研究するために、oli−neu(実施例2参照)を、3日間、1μg/mlのIL6R/IL6キメラの存在下で培養した。
【0058】
ジブチルcAMP(dbcAMP)は、オリゴデンドロサイトにおいて分化を誘導することが知られている薬剤である(たとえば、ユングら(1995)参照)。dbcAMPの効果にIL6R/IL6キメラがどのような形態的影響を加えるかということを検討するために、oli−neu細胞は、IL6R/IL6キメラとdbcAMPの添加前にdbcAMPで3日間前処理された。並行して、前処理をせずに、細胞をIL6R/IL6キメラで処理した。
【0059】
形態の変化は、位相差顕微鏡により、またはオリゴデンドロサイトのマーカーCNPase(2′,3′−サイクリックヌクレオチド3′−ホスホジエステラーゼ)およびGalC(シアロガングリオシド類およびスルファチド類)を染色し、ミエリン脂質ガラクトセレブロシド特異的な抗体A2B5を用いる免疫組織化学により、評価された。
【0060】
IL6R/IL6キメラの添加は、oli−neu細胞における形態変化を明らかに誘導した。細胞体は整列して集合し、それらの突起はより伸長した。それらの細胞そのものが伸長しており、また融合されているように感じられ、分化の進行状態を示した。
【0061】
オリゴデンドロサイトマーカーの発現は、免疫組織化学により示された。細胞は、オリゴデンドロサイトの特異的マーカーA2B5抗原およびCNPaseに陽性であるが、アストログリアのマーカーGFAPに陰性であり、つまり実際にオリゴデンドロサイトの表現型を維持していた。
【0062】
dbcAMP前処理、およびIL6R/IL6キメラとdbcAMPを組み合わせた処理は、3日後に、髄鞘を形成したオリゴデンドロサイトの数を増加させた。IL6R/IL6キメラのみで、伸長した細胞がみられたほか、その細胞の形態はさらによく分化しているようにみえた。シート様の形状の細胞を観察することができ、進行した分化の状態を示していた。
【0063】
結論として、IL6R/IL6キメラでの処理は、インビトロにてオリゴデンドロサイトの形態変化を生じさせ、つまり、オリゴデンドログリアの分化およびミエリン形成の誘導物質としての役割をさらに裏付けた。
【0064】
実施例4:神経細胞シュワン細胞相互作用に対するIL−6キメラの影響
DNA合成阻害剤アラビノースC(AraC)およびフルオロデオキシウリジン(FudR)の存在下でマウスDRGを培養することにより、神経細胞は軸索を発達させることができるが、グリア細胞の増殖は抑制される。それらのDRG培養物はミエリン非形成軸索を有する神経細胞の供給源として使用され得る。ニューロンとシュワン細胞とのあいだの相互作用を研究するために、シュワン細胞は、それらの細胞に外因的に添加される。
【0065】
ラット坐骨神経のシュワン細胞株は、細胞膜の脂質二重層を貫通して細胞の機能に影響を及ぼすことなく長期間維持される標識であるフッ化金で標識された。IL−6キメラの存在下での神経細胞とシュワン細胞との共培養は、軸索細胞に沿ったシュワン細胞の結合の著しい増加を、5時間以内に導いた。細胞は伸長し、数日後、蛍光を放つそれらの細胞質が軸索の周囲に通常の髄鞘を形成するのを見ることができた。キメラではなくNGFの場合、シュワン細胞の結合は非常に少なく、また髄鞘は形成されない。それらの結果は、IL−6キメラがグリア細胞と神経細胞との相互作用に対して非常にすばやい効果を有していることを示し、接着分子が誘導または活性化されていることを示唆する。
【0066】
実施例5:神経細胞とシュワンの混合培養物におけるミエリン形成に対するIL6R/IL6キメラの影響
IL6R/IL6キメラのミエリン形成誘導活性をさらに検討するために、マウスE15(15日胚)の大脳半球から分離した培養物を調製した。その調製および培養条件は、ルベツキ(Lubetzki)ら(1993)により記載されている。初代細胞は8日間培養され、IL6R/IL6(1.5μg/ml)を添加して11日間維持された。
【0067】
MBP(ミエリン塩基性タンパク質)およびオリゴデンドロサイト特異的タンパク質PLP(プロテオリピドタンパク質)は、成熟および/またはミエリン形成オリゴデンドロサイトに対するマーカーであって、CNSミエリンの主要な構成物質である。したがって、それらを、細胞培養物において生じる活発なミエリン形成を評価するためのマーカーとして使用することができる。培養条件下、4日で、ミエリン形成はない。したがって、4日後のmRNAは、この実験における標準物質として使用することができる。培養条件下、19日で、細胞培養物においてミエリン形成が観察される。
【0068】
したがって、MBPおよびPLPのmRNAを定量するために、4および19日で、mRNAは処理または未処理のウェルから抽出された。
【0069】
MBP、PLPおよび内部対照RNAとして使用し得るGAPDHのmRNAは、PEアプライドバイオシステムズプリズムモデル7700配列決定器械(a PE Applied Biosystems Prism model 7700 sequence detection instrument)を用いて、リアルタイム定量RT−PCR(real-time quantitative RT-PCR)(メドハースト(Medhurst)ら、(2000))により、測定された。
【0070】
その結果を下記の表Iに要約する。2つの独立した実験を実施した。mRNA発現は、4日後の対照RNAの発現の何倍であるかで示した。双方の実験において、IL6R/IL6キメラは、MBPおよびPLPの発現を2倍明らかに増強し、ミエリン形成の誘導物質またはエンハンサーとしてのIL6R/IL6の役割をさらに裏付けた。
【0071】
【表1】
【0072】
結論として、実施例1〜5は、IL6R/IL6キメラが抗増殖、分化およびミエリン形成誘導活性を有することを示している。IL6R/IL6キメラのこの活性は、末梢および中枢神経系ミエリン形成に対するIL6R/IL6キメラの有益な効果を強く示唆する。この効果は、CNSまたはPNS神経細胞のミエリン形成欠損、脱髄もしくは不充分なミエリン形成に基づくすべての障害において、利用することができる。したがって、IL6R/IL6キメラは、たとえば多発性硬化症などの、ミエリン再形成および/または脱髄障害を治療する有効な薬物となり得る。
【0073】
実施例6:インビボでの末梢神経再生に対するIL6RIL6の影響
ラットの坐骨神経軸索切断および近位部と遠位部の断端の対置により、インビボにて末梢神経の再生を誘導することができ、また離断線維のミエリン再形成を誘導することができた(Sahenk et al. 1994)。軸索切断に続く末梢神経のミエリン再形成に対するIL−6キメラの影響が実験された。ラット(7匹)に、手術の日から12日間、100mcg/Kgの用量を2日毎に腹腔内に与えた。対照動物(9匹のラット)には、PBSを注射した。12日後、軸索切断から2.5および5mm下方に再生した神経の切片を、透過型電子顕微鏡により解析し、明らかな線維の数を求めた。PBS処理した対照に比べ、IL−6キメラの存在下では、軸索切断のから2.5mm下方に離れた所で、ミエリン形成した線維の数に2.5倍の増加がみられた。
【0074】
実施例7:メラノーマB16−F10.9細胞の培養物でのIL6RIL6によるMPB遺伝子の誘導
メラニン色素を生産する皮膚メラニン細胞およびシュワン細胞の胚の起点(embryonic origin)は、e8マウス胚の神経冠から移動する共通の前駆細胞に由来する。メラノーマは、メラニン細胞由来の皮膚において発展する悪性腫瘍であり、したがってまた、神経冠の先駆体(ancesors)に由来する。B16細胞株はBalb/cマウスの自然発生的なメラノーマに由来し、F10.9細胞は、その強い悪性転移表現型のために、B16から単離された。F10.9細胞は、ほかのB16のように黒いユーメラニン色素を生産し、メラニン生成経路の最初の酵素であるチロシナーゼが豊富である(Bertolotto et al, 1996)。
【0075】
F10.9細胞は、30,000細胞個/穴で96穴マイクロプレートに播種され、0.3〜1μg/μlの濃度のIL6RIL6を含まないまたは含む10%FCSとDMEMにおいて3日間培養された。全細胞のRNAが抽出され、MBPに対するcDNAプローブを用いるノザンブロットにより解析された。MBPのmRNAは、IL6RIL6により、F10.9細胞において48で非常に強く誘導された(図3A)。時間の経過をみる研究(time course study)は、細胞培養物にIL6RIL6キメラを添加したのち12時間でMBPのRNAの増加が始まったことを示した。
【0076】
IL6RIL6キメラは、MBP遺伝子発現だけでなく、ミエリンの別の成分であって分化したシュワン細胞に対するマーカーである環状2′3′AMPホスホジエステラーゼまたはCNPaseを誘導する。細胞はまた、細胞体と逆の極で伸長した突起を発達させ、培養物中のシュワン細胞に典型的な長い配置に整列した。
【0077】
驚いたことに、IL6RIL6は、F10.9細胞の表現型をメラニン産生細胞からミエリン生産シュワン細胞に変換させた。チロシナーゼ酵素活性およびメラニンの生産は、細胞にIL6RIL6キメラを添加したのち48時間で完全に失われた。
【0078】
MITFは、チロシナーゼ遺伝子を活性化する転写因子である(Bertolotto et al. 1996)。IL6RIL6によるF10.9の処理は、MITF遺伝子発現を強く抑制した。MITFそのものはホメオティック転写因子Pax−3によりトランス活性化されており(Watanabe et al. 1998)、IL6RIL6処理されたF10.9細胞におけるPax−3mRNAの測定値は、Pax−3発現が6時間から48時間に徐々に減少することを示した(図3B)。Pax−3はMBP遺伝子を抑制することが知られている(Kioussi and Gruss, 1996)。したがって、IL6RIL6キメラの効果は、ミエリン形成前の胚シュワン細胞の発生中に発現してミエリン形成が生じるために抑制されなけらばならないPax−3ホメオボックスス遺伝子に対する遺伝子制御効果にあるといえる。その上、変性し脱髄する神経において、シュワン細胞がMBP生産を停止すると、それらの細胞におけるPax−3が再発現された。したがって、IL6RIL6はPax−3を抑制し、かつ、ミエリンタンパク質遺伝子を誘導することによりシュワン細胞のミエリン形成細胞への分化を生じさせる。
【0079】
実施例8:慢性的に再発する多発性硬化症のマウスのモデルにおけるIL6RIL6の注射
SJL/L種のマウスは、60μgのマイコバクテリウム ツベルクローシス(Mycobacterium tuberculosis)H37Ra(ディフコ社(Difco)製)を含有する不完全フロイントアジュバント中0.4mgのウシMBPによる免疫ののち、実験的な自己免疫性脳脊髄炎(EAE)を発現した。その疾患は、免疫後10日経た3千万のリンパ腺細胞の静脈注射により、同系のレシピエントに受身的に移入され得る。麻痺の臨床的徴候は、1週間から10日ののちにあらわれる。疾患の急性期ののち、回復および再発が続く。それらのマウスに対し、マウス(体重約25g)あたり1、3および5μgの用量で、IL6RIL6を腹腔内的にまたは皮下的に注射した。注射は、受身移入ののち3日または7日のどちらかに開始し、週あたり4回、少なくとも3週間与えられた。動物の臨床スコア(clinical score)は次のとおりであって、1)尾の硬直の低下;2)後ろ足の衰弱;3)片側の手足の麻痺;4)両側の手足の麻痺;5)致死、のように等級分けされた。動物の脳および脊髄は、ルクソールファストブルーによるミエリンの染色に続いて、光学顕微鏡により調べられた。臨床的等級の減少および脳の白質の減少に対するIL6RIL6の影響が、確かめられ得る。
【0080】
実施例9:神経細胞およびオリゴデンドログリアの神経毒性に対するIL6キメラの神経保護効果
器官培養物は、脳の生理機能と異常の多くの側面を調べるための類のない方法を提供する。記憶の記銘にかかわる領域であって、アルツハイマー病および虚血で早期変性を示す領域である海馬に由来する長期切片培養物は、シナプス可塑性機構(たとえば、長期増強)の発現および病理上の傷害(たとえば、興奮性毒性)に対する応答性のために、この点についてはとくに価値がある。
【0081】
培養物は、重要ではない改変を加えてバーらによって以前に記載されたように(Bahr 1995)調製する。海馬を8日歳のウィスターラット(Wistar rats)から切断し、400μm厚の切片を、多孔性で透明のミリセル−CM膜(Millicel-CM membrane)(ミリポア社(Millipore)製)上に置き、6穴のマルチウェルプレートにて培養した。4つの切片をそれぞれの膜上に置いた。培養培地は、50%の最小必須培地(+25mM HEPES、+4mM NaHCO3+NaOH pH7.2)、25%のウマ血清および25%ハンクス液、グルコース(6.4g/l)、ペニシリン/ストレプトマイシン(10ml/l)、L−グルタミン(2mM)から構成された。使用前、培養物は、37℃の温度に設定された5%CO2インキュベーター内で少なくとも3週間維持された。培地は毎週変えられた。
【0082】
海馬の切片を、10pg/mlから10μg/mlにわたる濃度でIL6またはIL6キメラに15分間さらし、そののち、NMDA50μMを添加してさらに30分間おいた。その培養物を、IL6またはIL6キメラを含むまたは含まない新鮮な培地に置いた。少なくとも4つの切片は、それぞれの実験の観点に役に立った。NMDA誘導性の細胞死は、ヨウ化プロピジウム(propidium iodide)(PI5μl/ml)を含有する新鮮な培地中で培養物を1時間保温することによる実験的傷害ののち、1日または3〜7日のどちらかで評価された。PIは、その親水性の特性のため、破裂した細胞に入って核のクロマチンに結合する。放出される赤い蛍光(細胞死のマーカー)は、増強された電荷結合デバイスカメラ(an intensified charged-coupled device camera)に連結した倒立蛍光顕微鏡(ゼイス(Zeiss))を用いて調べた。全蛍光の定量は、画像解析システム(イメージプロプラス(Image Pro Plus)により実施された。
【0083】
IL−6およびIL−6キメラの双方はNMDA誘導性の海馬の細胞死を防ぐことが見出された。培養1日後、IL−6は0.1から10ng/mlにわたる濃度で、ほぼ50%〜30%の神経細胞をそれぞれ保護することが見出され、一方、IL−6キメラは0.05から1pg/mlにわたる濃度で、ほぼ40%〜75%の神経細胞を保護した。IL−6キメラの最大の保護効果(75%の細胞の保護)は、0.5pg/mlの濃度で観察された(図3)。
【0084】
IL−6の保護効果は、時間が経つにつれて減少することが見出された。処理後、神経細胞の生存率は低下し、2日後には、5日で細胞の30%のみに保護効果を有するIL−6の0.1ng/ml濃度でだけ、IL−6の保護効果は維持された。それに比較し、IL−6キメラは0.5pg/mlの濃度で、長い保護効果を有しており、およそ60%の細胞を5日間維持した(図4)。
【0085】
器官切片におけるオリゴデンドロサイトの存在は、特異的なオリゴデンドロサイトマーカーであるGal−Cを用いる免疫組織化学的に染色することにより、決定された。2〜3週間後、器官切片はインビトロにて30分間、50μMのNMDAにさらされた。
【0086】
グルタミン酸イオンチャネル型受容体の活性化は、興奮性アミノ酸により引き起こされる神経毒性の過程における一次事象を示す。新生ラットの小脳の神経細胞の初代培養物(>97%の神経細胞を含む)は、グルタミン酸誘導性神経毒性に対するIL6キメラの影響を研究するために用いられ、IL−6の影響と比較された。小脳の顆粒細胞の初代培養物は、8日歳のスプラグーダウレイラット(Sprague-Dawley rat)の仔から、以前に記載されたように調製した(Pizzi et al. 1993)。2.5×105細胞個/cm2の密度で、細胞をポリ−L−リシンで被覆された皿の上に載せ、10%の熱で不活化したウシ胎児血清、グルタミン(2mM)、ゲンタマイシン(50μg/ml)、およびKCl(25mM)を含有する基本イーグル培地にて培養した。非神経細胞の細胞増殖を防ぐために、播種後18時間後、シトシンアラビノシド(10μM)を培養物に添加した。神経細胞を10日間培養したのち、実験を実施した。
【0087】
別段の指示がない限り、培養物は、Mg2+なしのロック液中で、50μMのグルタミン酸に15分間さらされた。IL6またはIL6キメラは、グルタミン酸処理の5分前に添加された。ついで、37℃、95%大気/5%CO2において皿を培養条件の培地に戻し、細胞生存率を18〜24時間後に測定した。
【0088】
18時間後、細胞生存率は、以前に記載されたように(Pizzi et al. 1993)、フルオレセインジアセテートとヨウ化プロピジウムの混合物を用いる生体内染色により評価された。単層において生存する神経細胞のパーセンテージは、それぞれの単層由来の3つの典型的な領域の顕微鏡写真における、フルオレセインジアセテート(緑色の生存細胞)とヨウ化プロピジウムを加えたフルオレセインジアセテート染色(全細胞)との比を評価することにより算出した。値は3つの姉妹皿(sister dises)から得た。
【0089】
1から10ng/mlにわたる用量でIL6を用いても、ラット小脳の顆粒細胞に対する何の保護効果も誘導されなかったが、0.1pg/mlおよび1pg/mlのIL−6キメラは、グルタミン酸誘導性神経毒性から、それぞれ40〜20%の神経細胞を保護した。
【0090】
実施例10:NGF使用中止後の上頸神経節ニューロンの生存に対するIL6R/IL6キメラの影響
IL6R/IL6キメラにより発揮される神経保護効果はまた、末梢神経培養系でも研究された。
【0091】
上頸神経節(SCG)は、P0−P3(出生後0から3日)ラットの上頸神経節から単離された。神経細胞は、5%ラット血清およびNGFを含有する培地において、4日間維持された。NGFは、生存のために神経細胞に必要とされ、NGF除去は、アポトーシスを誘導するために細胞の死を導く。最初の培地は、成長因子の中和抗体を含有するNGFなしの培地で置きかえられた。この時点で、0.1または1μgのIL6R/IL6キメラは、1%DMSO最終濃度中に添加された。その培養物は、37℃で24時間維持された。
【0092】
24時間の処理後のNGFを除去した神経細胞の生存率に対するIL6R/IL6キメラの影響は、モスマン(Mosmann)(1983)により詳細に記載されているMTT検定により測定される細胞のミトコンドリア活性によって、ならびに顕微鏡によって評価された。使用されたIL6R/IL6キメラの濃度は、NGFで処理したSCG神経細胞に対して、いかなる毒性効果または形態的効果も示さなかった。
【0093】
MTT検定の結果から判断できるように(図6)、100ng/mlおよび1μg/mlの濃度でのIL6R/IL6キメラの添加は、40%までのSCG神経細胞をNGF除去により誘導されていた神経細胞死から救った。このように、IL6R/IL6キメラは、末梢神経に対する神経保護効果を有し、たとえば、アルツハイマー病、パーキンソン病またはALS(筋萎縮性側索硬化症)などの神経変性における活性化を示唆している。
【0094】
いまや、本発明を完全に記載したが、本発明の精神および範囲から離れることなく、および過剰な実験をせずに、広い範囲にわたる等価値のパラメータ、濃度および条件において、同じことを実施し得るということは、当業者により理解されるであろう。
【0095】
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【図面の簡単な説明】
【図1】 図1は、IL6RIL6キメラまたはフォルスコリン(FSK)により処理されたシュワン細胞の培養物、または処理されていない(NT)シュワン細胞の培養物におけるMBP RNAの増加を示す図である。
【図2】 図2は、異なる量のIL6R/IL6キメラで処理した24、48および72時間後に測定された未分化oli−neu細胞の増殖を示す図である。
【図3】 図3は、IL6RIL6がF10.9細胞内で時間をかけて強力にMBP mRNAを誘導し(A)、Pax−3 mRNAを減少させる(B)ことを示す図である。
【図4】 図4は、海馬の器官切片においてNMDAが介在する神経毒性に関する、IL−6単独およびIL−6キメラによる神経保護の比較を示す図である。
【図5】 図5は、海馬の器官切片での、IL−6キメラの延長した神経保護効果に対するIL−6単独の効果を示す図である。
【図6】 図6は、MTT分析により測定された、24時間の処理後のNGF欠乏ニューロンの生存に対するIL6R/IL6キメラの効果を示す図である。
Claims (3)
- 神経学的疾患の治療および/または予防用医薬の製造のためのIL6RIL6キメラの使用であって、該神経学的疾患が、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択される使用。
- 前記医薬がさらに薬学的に許容し得る担体を含む請求項1記載の使用。
- IL6RIL6キメラおよび任意には1つ以上の薬学的に許容し得る賦形剤を含む、神経学的疾患を治療および/または予防するための医薬組成物であって、該神経学的疾患が、アルツハイマー病およびパーキンソン病から選択される医薬組成物。
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