DE10107737A1 - Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor zur Tumortherapie - Google Patents

Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor zur Tumortherapie

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Abstract

Beschrieben wird die Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor, vorzugsweise Hyper-IL-6, zur Behandlung eines Tumors. Bei dem Tumor handelt es sich vorzugsweise um ein Melanom, ein Nieren- oder ein Pankreaskarzinom.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor, vorzugsweise Hyper-IL-6, zur Behandlung eines Tumors. Bei dem Tumor handelt es sich vorzugsweise um ein Melanom, ein Nieren- oder ein Pankreas-Karzinom.
Die Expression von Zytokingenen durch entsprechend transfizierte Tumorzellen wurde bisher als eine Strategie zur Erhöhung der Immunantworten gegenüber verschiedenen Krebsarten erprobt. Für Zytokine, z. B. TNF-α, IFN-gamma, IL-2, IL-4, IL- 6, IL-12, IL-18 oder GM-CSF, exprimierende Tumorzellen konnte gezeigt werden, daß sie Bildung von tumorspezifischen T- Lymphozyten fördern oder nicht-T-Zell-vermittelte Mechanismen der Tumorzellenabtötung induzieren können, z. B. Granulozyten- Entzündungsreaktionen. Inzwischen befinden sich auf diesen Zytokinen basierende genetisch modifizierte Tumorvakzine (GMTV) als spezifische Immuntherapeutika zur Krebsbehandlung in der klinischen Untersuchung. Dabei wurden allogene oder autologe Tumorzellen mit den entsprechenden Zytokingenen modifiziert, um so einerseits hohe Konzentrationen der als Adjuvans wirkenden Zytokine an der Impfstelle erreichen zu können, andererseits aber die systemische Konzentration niedrig halten zu können. Allerdings lassen die bisher mit dieser Vorgehensweise erreichten Ergebnisse noch keine endgültige Schlußfolgerung darüber zu, ob sie tatsächlich einen ausreichend wirksamen therapeutischen Ansatz zur Krebsbehandlung darstellen können.
Somit liegt der vorliegenden Erfindung das technische Problem zugrunde, ein spezifisches Immuntherapeutikum bereitzustellen, das eine wirksame Krebstherapie erlaubt.
Die Lösung dieses technischen Problems erfolgte durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Ausführungsformen. Es wurde überraschenderweise gefunden, daß das vorstehende technische Problem durch die Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem Il-6 Rezeptor, vorzugsweise Hyper-IL-6, gelöst werden kann. Bei den zu der vorliegenden Erfindung führenden Untersuchungen wurde die niedrig­ immunogene murine Melanomzellinie B16 mit einem Säugerexpressionsvektor transfiziert, der die cDNA für ein sIL-6R/IL-6-Fusionsprotein (mit der Bezeichnung Hyper-Il-6 oder H-IL-6) enthielt. Das entsprechende sezernierte p84- Glykoprotein konnte im Überstand von transfizierten Zellen nachgewiesen werden und es zeigte auf BAF/gp130-Zellen, die auf IL-6/sIL-6R reagieren nicht jedoch auf IL-6 alleine, volle Aktivität. Die Verabreichung von rekombinantem H-IL-6 an C57BL/6-Mäuse führte zur einer verlängerten Expression eines Akutphaseproteins, was auf eine lange systemische Verweildauer des Fusionsprotein hinweist. Transfizierte B16-Zellen (B16/H- IL-6-Zellen) zeigten morphologische Veränderungen zusammen mit einer dramatischen Wachstumshemmung in vitro. Die subkutane Injektion in C57BL/6-Mäuse führte zu einer praktisch vollständigen Abstoßung der B16/H-IL-6-Zellen, wobei dieser Effekt in für einen GM-CSF-Rezeptorantagonisten transgenen Mäusen zum Teil wieder aufgehoben wurde. Diese deutet auf eine GM-CSF-abhängige Abstoßung von mit H-IL-6 transfizierten Zellen hin. Die systemische Behandlung von Mäusen mit Tumoren mit rekombinantem H-IL-6 verringerte das Tumorwachstum um etwa 40 bis 60%. Diese Ergebnisse zeigen, daß H-IL-6 (vor allem in Kombination mit GM-CSF) ein hohes antitumorales Potential aufweist und daß es auch zu einer gesteigerten Bildung von antigenpräsentierenden Zellen (APC), z. B. dentritischen Zellen, kommt, was auch ex vivo bestätigt werden konnte.
Die vorliegende Erfindung betrifft somit die Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem Il-6 Rezeptor oder einer dieses Konjugat kodierenden DNA-Sequenz zur Behandlung eines Tumors.
Der hier verwendete Begriff "Konjugat aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor" betrifft ein Polypetid, das IL-6 (oder den biologisch aktiven Teil von IL-6) und den IL-6-Rezeptor (oder den für die Liganden-Bindung verantwortlichen Anteil des Rezeptors) umfaßt. Bei diesem Polypeptid kann es sich um ein Polypetid handeln, bei dem z. B. die beiden Partner über kovalente oder nicht-kovalente Bindungen gemäß dem Fachmann bekannten Routineverfahren miteinander verknüpft sind. Die beiden Polypeptide können beispielsweise über eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft sein. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Konjugat um ein Fusionsprotein aus IL- 6 und einem IL-6-Rezeptor. Vorzugsweise enthält das Konjugat den löslichen Anteil des IL-6-Rezeptors (sIL-6R), d. h. die extrazelluläre bzw. lösliche Untereinheit des Interleukin-6- Rezeptors. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform sind die beiden Polypeptide des Fusionproteins über einen Peptidlinker verbunden.
In einer noch mehr bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Konjugat um ein IL-6/sIL-6R Fusionsprotein (Hyper-IL-6), d. h. ein Fusionspolypeptid, das ein humanes sIL- 6R-Polypeptid und ein humanes IL-6-Polypeptid umfaßt, wobei die beiden Polypeptide über einen Polypeptidlinker miteinander verknüpft sind. Die Struktur von "Hyper-IL-6" sowie dessen Aminosäuresequenz sind in DE 196 08 813 C2 beschrieben sowie in Peters et al., J. Immunol. 161 (1998), 3575-3581. Der in der vorliegenden Anmeldung verwendete Ausdruck "IL-6/sIL-6R Fusionsprotein (Hyper-IL-6)" umfaßt dabei das Fusionsprotein mit der in DE 196 08 813 C2 gezeigten Aminosäuresequenz, sowie ein Fusionsprotein, das sich gegenüber dem in DE 196 08 813 C2 offenbarten Fusionsprotein dadurch unterscheidet, daß es Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure(n) aufweist, wobei die biologische Aktivität nicht wesentlich beeinflußt wird. Ob ein solches Fusionsprotein noch die gewünschten biologischen Eigenschaften aufweist, kann mittels üblicher Verfahren, z. B. mittels des in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren untersucht werden.
Je nach Ausgestaltung der erfindungsgemäßen Verwendung kann es zweckmäßig sein, das Konjugat, vorzugsweise Hyper-IL-6, als Immuntherapeutikum zu verabreichen, d. h. in Form von allogenen oder autologen Tumorzellen, die mit einer DNA-Sequenz transformiert sind, die das Polypeptid, vorzugsweise Hyper-IL- 6, kodiert, und wobei dieses exprimiert wird. Der Fachmann kennt geeignete Transformationssysteme und Vektoren, z. B. zur Gentherapie, und in diesem Zusammenhang wird auf DE 196 08 813 C2 und die nachstehenden Beispiele verwiesen.
Bei Verwendung des Konjugats, vorzugsweise Hyper-IL-6, als Immuntherapeutikum, ist die z. B. Hyper-IL-6 kodierende DNA- Sequenz in einen für die Gentherapie geeigneten Vektor inseriert, z. B. einen Vektor, der auf einem Virus basiert, beispielsweise ein Adenovirus, Vaccinia-Virus oder ein AAV- Virus. Besonders bevorzugt sind Retroviren. Beispiele für geeignete Retroviren sind MoMuLV, HaMuSV, MuMTV, RSV oder GaLV. Weitere geeignete Viren sind Fowlpox-Virus, Canarypox- Virus, Influenza-Virus oder Sindbis-Virus auch als Basis einer Vakzine. Für Zwecke der Gentherapie kann die Hyper-IL-6 kodierende DNA-Sequenz auch in Form von kolloidalen Dispersionen zu den Zielzellen transportiert werden. Dazu zählen beispielsweise Liposomen oder Lipoplexe (Mannino et al., Biotechniques 6 (1988), 682).
Die für die Anwendung als Immuntherapeutikum geeigneten Bedingungen sind dem Fachmann bekannt. So kann beispielsweise folgendermaßen vorgegangen werden:
Eine allogene Melanomzellinie (z. B. Mich-1 oder Mich-2) wird mit z. B. Hyper-IL-6 cDNA transduziert, wobei vorzugsweise MSCV-basierte dicistronische retrovirale Doppelkopie-Vektoren verwendet werden. Hierbei werden von einem Transkript zwei Proteine abgelesen, wobei dies durch die Verwendung einer "Internal Ribosome Entry" Site erreicht wird. Nach Expansion werden die gezüchteten Zellen trypsiniert, bestrahlt (z. B. mit 100 Gy unter Verwendung von Co-60 oder 6 MV-Photonen), aliquotiert und in flüssigem Stickstoff eingefroren. Vor dem Eingefrieren werden die Zellen hinsichtlich Kontaminationen (Bakterien, Pilze oder Mycoplasmen) getestet und kurz vor der Vakzinierung aufgetaut. Die Vakzinierung der Patienten kann subkutan (z. B. mit 5 × 107 Zellen) erfolgen, wobei anfänglich die Patienten viermal in Abständen von zwei Wochen immunisiert, dann ein Jahr lang jeweils einmal pro Monat und danach in Abständen von zwei Monaten immunisiert werden können. Im Fall des Fortschreitens der Erkrankung kann die Vakzinierung öfter erfolgen, z. B. anfänglich achtmal in Abständen von zwei Wochen und dann einmal pro Monat.
Besonders bevorzugt ist die Verwendung des vorstehend definierten Konjugats zur Behandlung eines Melanoms, eines Nieren- oder eines Pankreaskarzinoms.
Da es sich in den zu der vorliegenden Erfindung führenden Untersuchungen zeigte, daß die durch H-IL-6 induzierte Immunantwort gegen B16-Zellen von der Anwesenheit von GM-CSF abhängt, kann es für die erfindungsgemäße Verwendung vorteilhaft sein, nicht nur das IL-6/IL-6R-Konjugat sondern auch GM-CSF zu verabreichen (z. B. als Substanz oder über Transfektion der Zellen mit einer GM-CSF kodierenden DNA- Sequenz). Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor in Kombination mit GM-CSF.
Kurze Beschreibung der Figuren Fig. 1: Design und Expression von Hyper-IL-6
  • a) Schematische Darstellung des für die Expression und Sezernierung von H-IL-6 in Säugerzellen entworfenen Vektors pCDM8
    Die cDNA für das Fusionsprotein enthält eine Strecke von 39 bp, die einen flexiblen Linker zwischen sIL-6R und IL-6 kodieren.
  • b) Nachweis von H-IL-6 im Überstand von transfizierten B16- Zellen
    B16/H-IL-6-Zellen wurden ü. N. radioaktiv markiert und H-IL-6 wurde vom Überstand mittels eines anti-IL-6-Antikörpers immunpräzipitiert. In nicht-transfizierten Zellen konnte kein H-IL-6 nachgewiesen werden.
  • c) Nachweis von H-IL-6 mittels Westernblot-Analysen
    107 B16/H-IL-6-Zellen wurden 24 Stunden in 5 ml 0,1 FCS enthaltendem Medium inkubiert. 100 µl Überstand wurden für die Westernblot-Analysen mit einem anti-IL-6-Antikörper verwendet. H-IL-6 konnte als Protein mit einer relativen molekularen Masse von 84 kD nur im Überstand von transfizierten B16-Zellen nachgewiesen werden. Die rechten Spuren wurden mit 200 ng rekombinantem IL-6 bzw. sIL-6R beladen.
Fig. 2: Biologische Aktivität von Hyper-IL-6
  • a) Proliferation von BAF/qp130-Zellen als Reaktion auf ansteigende Mengen an H-IL-6 und IL-6.
  • b) Das gleiche Experiment wie 1a), jedoch mit ansteigenden Mengen an Überständen von B16/H-IL-6-Zellen (siehe Fig. 1c).
    Die Daten stellen Mittelwerte ± Standardabweichung aus drei parallelen Experimenten dar.
  • c) Induktion der Haptoalobin-Synthese in vivo.
    C57BL/6-Mäuse (neun Tiere) wurden mit 2 µg rekombinantem H-IL- 6 behandelt und 72 Stunden nach der Injektion getötet. Haptoglobin wurde in den Seren der Mäuse durch Westernblot- Analysen nachgewiesen.
Fig. 3: Wachstumshemmung und morphologische Veränderungen von mit H-IL-6 transfizierten B16-Melanomzellen
  • a) Proliferation von B16- und B16/H-IL-6-Zellen nachgewiesen über MTT-Assay.
  • b) B16/H-IL-6-Zellen zeigen eine verlängerte Morphologie und neigen zur Ausbildung von Zellprotrusionen.
Untere Abbildung: Kontrollzellen; obere Abbildung: Mit H-IL-6 transfizierte Zellen. Vergrößerung: 200fach.
Fig. 4: MHC-1-Expression in unveränderten B16/H-IL-6-Zellen
Die Oberflächenexpression von MHC-1-Molekülen Kb und Db auf B16/H-IL-6-Zellen und Kontrollzellen wurde mittels FACS unter Verwendung eines anti-H-2KbDb-MAK bestimmt.
Fig. 5: Tumorwachstum in Mäusen, denen H-IL-6 transfizierte, scheintransfizierte oder parentale B16-Melanomzellen s.c. injiziert worden waren
  • a) C57BL/6-Mäusen wurden 5 × 103 H-IL-6-transfizierte, scheintransfizierte oder parentale B16-Zellen s.c. injiziert. Nach zwei Wochen wurden die Tiere getötet und die Tumorvolumina nach Exzision bestimmt. Das Tumorwachstum war in Tieren, die B16/H-IL-6-Zellen erhielten, drastisch verringert. Jeder Punkt in der Figur entspricht einem Tier.
  • b) Überleben von Mäusen, denen 5 × 105 H-IL-6-transfizierte oder parentale B16-Zellen s.c. injiziert worden waren.
Fig. 6: Reduzierte Wachstumshemmung von B16/H-IL-6-Zellen in für einen GM-CSFR-Antagonisten transgenen Mäusen
  • a) Serumspiegel des K14E/E21K GM-CSF-Proteins in Wildtypmäusen und transgenen Mäusen nachgewiesen über ELISA.
  • b) Acht transgenen Mäusen (Stamm tg2) und acht Wildtyp- FvB/BL76-Mäusen wurden s.c. 5 × 105 B16/H-IL-6-Zellen injiziert und das Tumorwachstum wurde nach zwei Wochen bestimmt. Als Kontrolle wurden transgenen Mäusen und Wildtypmäusen 5 × 105 parentale B16-Zellen injiziert.
Die nachstehenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1 Allgemeine Verfahren (A) Herstellung der Plasmide und Transfektionsverfahren
Die H-IL-6-cDNA wurde unter Verwendung der Vektoren pCDM8-sIL- 6R und pCDM8-IL-6 hergestellt, von denen die sIL-6R und IL-6 cDNAs über PCR erzeugt wurden. Die Linker-cDNA wurde unter Verwendung von XhoI-Stellen am C-Terminus von sIL-6R und am N- Terminus von IL-6 eingeführt. H-IL-6 cDNA wurde erneut in den Vektor pCDM8 mittels einer N-terminalen MotI- und einer C- terminalen HindIII-Stelle ligiert. Bezüglich der genaueren Schritte zur Erzeugung der H-IL-6-cDNA wird auf DE 196 08 813 C2 verwiesen. Die Zellinie B16/H-IL-6 wurde durch Transfektion mit 20 µg pCDM8-H-IL-6-DNA zusammen mit 2 µg pSV2Neo-Plasmid- DNA (Southern und Berg, J. Mol.Appl.Genet. 1 (1982), 327-341) (Copräzipitation mit Calciumphosphat) erzeugt.
(B) Nachweis und biologische Aktivität von H-IL-6 im Überstand von B16/H-IL-6-Zellen
107 B16/H-IL-6-Zellen wurden ü. N. mit 50 µg [35S]Methionin/Cystein in Methionin/Cystein-freiem Medium metabolisch markiert und H-IL-6 wurde mit einem an Protein A- Sepharose gebundenen anti-IL-6-Antikörper immunpräzipitiert. Für einen Western-Blot wurden 107 B16/H-IL-6-Zellen 24 Stunden mit 5 ml 0,1% FCS enthaltendem Medium inkubiert. Der Überstand wurde entfernt und zehnfach konzentriert. Für die Western- Blot-Analysen mit dem anti-IL-6-Antikörper mAB-8 (CLB, Amerstam, Niederlande) wurden 10 µg des konzentrierten Überstands verwendet.
(C) Zellkultur und Assays
Die Zellen wurden in DMEM bei 5% CO2 in einer wassergesättigten Atmosphäre gezüchtet. Alle Zellkulturmedien waren mit 10% FCS, 100 mg/ml Streptomycin und 60 mg/l Penicillin supplementiert. Die Proliferation der B16- und B16/H-IL-6-Zellen wurde in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (10 000 Zellen/Vertiefung/0,1 ml) gemessen. Die Dichte der lebenden Zellen wurde nach 24, 48, 72, 96 und 120 Stunden mittels des MTT (3-[4,5-Dimethyl-thiazol-2-yl]-2,5- diphenyltetrazoliumbromid)-Assays der mitochrondrialen Succinatdehydrogenase bestimmt (Boehringer Mannheim, Deutschland). Morphologische Veränderungen der B16/H-Il-6- Zellen wurden nach Züchtung der Zellen auf Kammerträgern (NUNC, Naperville, IL, USA) für 24 Stunden bestimmt. Mikroaufnahmen wurden bei einer 200fachen Vergrößerung in einem CID("differential interference contrast")-Modus aufgenommen.
(D) Tiere
C57BL/6-Mäuse wurden in einem Zyklus von 12 Stunden Licht und 12 Stunden Dunkelheit gehalten und mit Futter und Wasser nach Bedarf versorgt.
(E) Erzeugung von hinsichtlich des GM-CSF-Rezeptors transgenen Mäusen
Die für murines GM-CSF kodierende cDNA (Gough et al., Nature 309 (1984), 763-767) wurde in Übereinstimmung mit den veröffentlichten Aminosäureänderungen K14E und E12K (Altmann und Kastelein, J. Biol.Chem. 270 (1995), 2233-2240) modifiziert. Diese cDNA wurde in den Keratin 10- Expressionsvektor (Blessing et al., J. Cell.Biol. 135 (1996), 227-239) inseriert und für die pronukleäre Mikroinjektion von befruchteten Eiern von Mäusen des Stamms FVB/N wie in Hogan et al. (Manipulating the Mouse Embryo. A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor, NY (1986)) beschrieben verwendet. An den Nachkommen wurden an Ohren und Schwänzen Biopsien vorgenommen und diese wurden mittels PCR unter Verwendung eines Rinderkeratin 10-spezifischen Primers (5'-TAA CAC ATG TGG GAT ACA CCC-3') und eines murinen GM-CSF- spezifischen Oligonukleotids (5'-CTG GCT GTC ATG TTC AAG GCG- 3'; Position 1021-1042; GenBank-Zugangsnummer X05906) analysiert. Die für die tumorinduzierenden Experimente verwendeten Mäuse waren F1-Kreuzungen von für den FVB/N GM- CSF-Rezeptorantagonisten transgenen Mäusen und C57BL/6-Mäusen. Die Experimente wurden mit dem Stamm tg2 durchgeführt.
(F) Subkutane "Challenae" Experimente
Die Mäuse wurden am Rücken rasiert und subkutan wurden 105 B16 oder B16/H-IL-6-Zellen injiziert. Das Tumorwachstum wurde durch Messung der senkrechten Durchmesser überwacht. Die Mäuse wurden nach zwei Wochen getötet oder wenn die Tumore eine schwere Nekrose zeigten oder eine Größe von 300 mm2 erreicht hatten. Alle Tumore wurden exzisiert und durch Bestimmung des Gewichts und Volumens bewertet.
(G) Durchflußzytometrie-Analysen
B16- und B16/H-IL-6-Zellen wurden zweimal mit PBS (0,1% Tween) gewaschen und eine indirekte Immunfluoreszenzfärbung wurde durch Inkubation der Zellen (4°C, 30 Min.) mit einem FITC- gekoppelten monoklonalen anti-H-2KHDH-Antikörper (Cedar Lane, Hernby, Ontario, Kanada) durchgeführt. Nach zweimaligem Waschen der Zellen mit PBS (0,1% Tween) wurden Durchflußzytometrie-Analysen mittels eines "FACScan"-Geräts (Becton Dickinson, Mountain View, CA, USA) durchgeführt. Debris und tote Zellen wurden ausgesondert und lebende Zellen mittels der "FACScan Lysis II"-Software (Becton Dickinson) geplottet. Zur Kontrolle wurde das gleiche Experiment mit einem für IgG2 spezifischen Antikörper durchgeführt.
Beispiel 2 Transfektion von H-IL-6-cDNA in B16-Melanomzellen
B16-Zellen wurden mit einem die cDNA für das Fusionsprotein H- IL-6 unter Kontrolle des CMV-Promotors enthaltenden Plasmid (Fig. 1a) und mit dem pSV2-neo-Plasmid cotransfiziert. 30 Neo-resistente Klone wurden hinsichtlich der Expression des H- 11-6-Proteins durch Testen der Aktivität von Zellüberständen von BAF3/gp130-Zellen gescreent. Für dieses Beispiel wurden zwei positive Klone ausgewählt und ein scheintransfizierter Klon, der nur das pSV2-neo-Plasmid enthielt. Fig. 1b zeigt die Expression des 84 kD Glykoproteins einer positiven Transfektante, nachgewiesen mittels Immunpräzipitation des radioaktiv markierten Proteins aus dem Überstand über einen anti-IL-6-Antikörper. Negative Transfektanten und parentale B16-Zellen sezernierten nicht H-IL-6 ins Medium. Fig. 1c zeigt eine Westernblot-Analyse des Mediums von transfizierten und parentalen B16-Zellen nach einer zehnfachen Konzentrierung. Das IL-6/sIL-6R-Fusionsprotein wurde mit dem anti-IL-6-Antikörper genauso effizient nachgewiesen wie rekombinantes IL-6. Es gab keine Kreuzreaktion des anti-IL-6- MAK mit sIL6R (rechte Spur). Die H-IL-6-Spiegel im Überstand transfizierter Zellen wurden durch Messung der biologischen Aktivität des Fusionsproteins auf einer mit gp130 transfizierten BAF3-Zellinie (BAF3/gp130) bestimmt (Fig. 2b). Untransfizierte BAF3-Zellen exprimierten gp130 und IL-6R nicht, antworten daher nicht auf IL-6 oder H-IL-6. Zellüberstände transfizierter B16-Zellen wurden nach 24 Stunden geerntet und es konnte eine dosisabhängige Proliferation der BAF3/gp130-Zellen beobachtet werden. Die ECso-Konzentration wurde mit 0,2 µl/ml bestimmt (Fig. 2b). Dies entspricht H-IL-6-Spiegeln von 500 pg/ml/107 Zellen/24 Stunden (Fig. 2a). Die biologische Aktivität von H-IL-6 in vivo und dessen Stabilität wurden durch Injektion (i. p.) von 2 µg rekombinantem H-IL-6 in C57BL/6-Mäuse getestet. Die Expression des Akutphase-Proteins Haptoglobin wurde nach 72 Stunden durch Bestimmung der Serumspiegel mittels Westernblot- Analysen analysiert (Fig. 2c). Nach IL-6-Injektion konnten nach 72 Stunden keine erhöhten Haptoglobin-Spiegel nachgewiesen werden. Acht von neun getesteten Mäusen zeigten deutlich erhöhte Haptoglobin-Spiegel im Vergleich zu Kontrolltieren, die PBS erhielten. Somit kann H-IL-6 bei wesentlich geringeren Dosen als IL-6 Akutphase-Proteine in Mäusen induzieren.
Beispiel 3 Untersuchung der in vitro-Eigenschaften von parentalen B16- Zellen und Transfektanten
Um zu untersuchen ob H-IL-6-Transfektion das Zellwachstum in vitro beeinflußt wurden Proliferationsassays durchgeführt und die Zelldichten mittels eines kolorimetrischen Assays mit MTT bestimmt. Fig. 3a zeigt die Proliferation von parentalen B16- und transfizierten B16/H-IL-6-Zellen, die über einen Zeitraum von fünf Tagen zu verschiedenen Zeitpunkten gemessen wurde. In B16/H-IL-6-Zellen war das Zellwachstum deutlich gehemmt und die Zelldichten betrugen etwa 10% im Vergleich zu den parentalen B16-Zellen am Ende der Zeitreihe. Außerdem zeigten transfizierte B16-Zellen eine veränderte Morhologie, die durch verlängerte Zellauswölbungen, Verlust der Pigmentierung und ein Aneinanderliegen in langen Reihen gekennzeichnet war, was auf einen veränderten Differenzierungsstatus hinweist (Fig. 3b). Ähnliche Effekte konnten beobachtet werden, wenn B16-Zellen mit rekombinantem IL-6/sIL-6R-Fusionsprotein behandelt worden waren. Außerdem ergab die Messung von MHC-1 keinen Unterschied zwischen parentalen B16-Zellen und Transfektanten, was darauf hinweist, daß der niedrige immunogene Status aufgrund der geringen MHC- 1-Expression von transfizierten B16-Zellen nicht durch das Transfektionsverfahren und die Expression von H-IL-6 veränderte wurde (Fig. 4).
Beispiel 4 Untersuchungen zum Tumorwachstum
Die Tumorigenizität der H-IL-6-Transfektanten wurde durch s.c. Injektion in syngene C57BL/6-Mäuse untersucht. Fig. 5a zeigt, daß B16/H-IL-6-Zellen im Vergleich zu parentalen oder scheintransfizierten B16-Zellen wesentlich kleinere Tumore bildeten. Sechs von acht Tieren in der B16/H-IL-6-Gruppe zeigten nach zwei Wochen eine vollständige Abstoßung der Tumorzellen. Das mittlere Volumen der etablierten Tumore in dieser Gruppe betrug 50 bis 100 mm3, während die parentalen oder scheininfizierten B16-Zellen Tumore mit 1800 bzw. 1900 mm3 ausbildeten. In einem parallelen Experiment wurde das Überleben von Mäusen beobachtet, denen s.c. parentale oder transfizierte B16-Zellen injiziert worden wären (Fig. 5b). 50% der Tiere, die B16-Zellen erhalten hatten, waren moribund und mußten nach drei Wochen getötet werden. Kein Tier dieser Gruppe überlebte 33 Tage nach Injektion, während 8 von 10 Mäusen, die B16/H-IL-6-Zellen erhalten hatten, nach 89 Tagen überlebt hatten. Um zu untersuchen, ob ein durch rekombinantes H-IL-6 induziertes verringertes Wachstum von B16-Zellen in vivo beobachtet werden kann, wurden Mäusen, die parentale B16- Zellen erhalten hatten, dreimal pro Woche 2 µg rekombinantes H-IL-6 i. p. injiziert. Nach zwei Wochen wurden die Mäuse getötet und die Tumorgewichte bestimmt. Diese systemische Behandlung mit rekombinantem H-IL-6 verringerte das Tumorwachstum um etwa 40 bis 50%.
Beispiel 5 Die Abstoßung von B16/H-IL-6-Zellen ist in für einen GM-CSFR- Antagonisten transgenen Mäusen beeinträchtigt
Es wurde davon ausgegangen, daß GM-CSF eine Schlüsselrolle bei der Abstoßung von Tumorzellen durch das Immunsystem einnimmt. Um die Rolle von GM-CSF bei der Abstoßung von H-IL-6 sezernierenden B16-Melanomzellen zu untersuchen wurden transfizierte und parentale B16-Zellen in für das mutierte K14E/E21K GM-CSF-Protein transgene Mäuse injiziert. Für dieses GM-CSF-Mutein konnte kürzlich gezeigt werden, daß es zwar an die GM-CSF-Rezeptor-α-Kette binden, nicht jedoch die signaltransduzierende 13-Einheit des GM-CSF-Rezeptorkomplexes stimulieren konnte. Somit verhält sich das K14E/E21K-GM-CSF- Protein als ein GM-CSF-Rezeptorantagonist. Für den K14E/E21K- GM-CSF-Antagonisten transgene Mäuse zeigten Spiegel von 2 bis 15 ng/ml im Serum (Fig. 6a). Transgene und nicht-transgene Kontrollmäuse wurden nach zwei Wochen getötet und die Tumorvolumina wurden wie vorstehend beschrieben bestimmt. Das Tumorwachstum der B16/H-IL-6-Zellen in Wildtypmäusen FVB/N × C57BL/6 war mit dem in C57BL/6-Mäusen vergleichbar mit einem durchschnittlichen Tumorvolumen von 50 bis 100 mm3. Die Tumorvolumina in transgenen GM-CSF K14E/E21K-Mäusen war eine Größenordnung höher als in den nicht-transgenen Kontrollmäusen (900 mm3), was darauf hindeutet, daß die Abstoßung der transfizierten Tumorzellen von der Anwesenheit von biologisch aktivem GM-CSF abhing (Fig. 6b). Von parentalen B16-Zellen sowohl in transgenen als auch Wildtyp-Mäusen produzierte Tumore waren mit denen in C57BL/6-Mäusen vergleichbar.

Claims (6)

1. Verwendung eines Konjugats aus IL-6 und einem IL-6 Rezeptor oder einer dieses Konjugat kodierenden DNA-Sequenz zur Behandlung eines Tumors.
2. Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Konjugat ein Fusionsprotein aus IL-6 und dem löslichen Anteil des IL-6- Rezeptors (sIL-6R) ist.
3. Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Fusionsprotein Hyper- IL-6 ist.
4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Konjugat in Form eines Immuntherapeutikums verwendet wird.
5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei der Tumor ein Melanom, ein Nieren- oder ein Pankreaskarzinom ist.
6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei außerdem GM-CSF verabreicht wird.
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