JPH09117288A - オンコスタチンｍ誘導造血 - Google Patents
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 哺乳類の造血幹細胞の分化及び増殖を誘導す
ること。 【解決手段】 哺乳類の造血幹細胞の分化及び増殖を、
オンコスタチンＭ遺伝子を形質移入及び発現を行うこと
により誘導する。これにより、細胞毒性物質または放射
線に被爆したリンパ球の生存を延長することができる。
ること。 【解決手段】 哺乳類の造血幹細胞の分化及び増殖を、
オンコスタチンＭ遺伝子を形質移入及び発現を行うこと
により誘導する。これにより、細胞毒性物質または放射
線に被爆したリンパ球の生存を延長することができる。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】造血において発生する様々な
細胞において、造血幹細胞の特徴であるような、自己再
生能を有し及び多能性能を維持する細胞は存在しないと
考えられている。この再生能及び多能性能は、骨髄の分
割量の移植後に、完全な造血機能の回復を可能とする。
この自己再生の能力のため、造血幹細胞はまた、宿主生
命を生存させる遺伝子の改質に理想的に適している。造
血幹細胞は、二種類のうち一種類の経路に従い分化し
て、ミエロイドまたはリンパ球系細胞の系列のどちらか
の元となる。ミエロイド幹細胞はマクロファージ、好酸
球、赤血球、巨核球及びマスト細胞に分化するのに対
し、リンパ球系前駆体は、Ｂ細胞及びＴ細胞の元とな
る。成熟Ｂリンパ球は、成体哺乳類の骨髄に一次的起源
を有する。Ｔリンパ球は、前駆体としては骨髄が起源で
あるが、分化は胸腺で行われる。胸腺内への移行におい
て、Ｔ細胞前駆体から成熟Ｔ細胞を特徴付ける臨界マー
カーが欠落する。すなわち、一般的に、これらはその表
面上に、ＴＣＲ分子、ＣＤ３複合体またはＣＤ４若しく
はＣＤ８分子を発現しない。これらの細胞はＣＤ４及び
ＣＤ８双方を欠如しているので、“二重−陰性（double
-negative)”細胞としばしば呼ばれる。胸腺細胞はこの
二重陰性プールから発生し、“二重陽性（double-posit
ive)”細胞と呼ばれるＣＤ４+ 及びＣＤ８+ である細胞
へと発達する。次に、二重陽性細胞はさらに、ＣＤ４ま
たはＣＤ８どちらか及び高レベルのＴＣＲ−ＣＤ３複合
体を発現する比較的成熟した胸腺細胞に分化する。
細胞において、造血幹細胞の特徴であるような、自己再
生能を有し及び多能性能を維持する細胞は存在しないと
考えられている。この再生能及び多能性能は、骨髄の分
割量の移植後に、完全な造血機能の回復を可能とする。
この自己再生の能力のため、造血幹細胞はまた、宿主生
命を生存させる遺伝子の改質に理想的に適している。造
血幹細胞は、二種類のうち一種類の経路に従い分化し
て、ミエロイドまたはリンパ球系細胞の系列のどちらか
の元となる。ミエロイド幹細胞はマクロファージ、好酸
球、赤血球、巨核球及びマスト細胞に分化するのに対
し、リンパ球系前駆体は、Ｂ細胞及びＴ細胞の元とな
る。成熟Ｂリンパ球は、成体哺乳類の骨髄に一次的起源
を有する。Ｔリンパ球は、前駆体としては骨髄が起源で
あるが、分化は胸腺で行われる。胸腺内への移行におい
て、Ｔ細胞前駆体から成熟Ｔ細胞を特徴付ける臨界マー
カーが欠落する。すなわち、一般的に、これらはその表
面上に、ＴＣＲ分子、ＣＤ３複合体またはＣＤ４若しく
はＣＤ８分子を発現しない。これらの細胞はＣＤ４及び
ＣＤ８双方を欠如しているので、“二重−陰性（double
-negative)”細胞としばしば呼ばれる。胸腺細胞はこの
二重陰性プールから発生し、“二重陽性（double-posit
ive)”細胞と呼ばれるＣＤ４+ 及びＣＤ８+ である細胞
へと発達する。次に、二重陽性細胞はさらに、ＣＤ４ま
たはＣＤ８どちらか及び高レベルのＴＣＲ−ＣＤ３複合
体を発現する比較的成熟した胸腺細胞に分化する。
【０００２】
【発明が解決しようとする課題】造血的発生における幹
細胞の中心的役割において、当業技術は、造血的再生、
増殖及び分化を誘導する方法を必要とする。造血を刺激
することは、目的とする遺伝子治療と共に、ミエロイド
及びリンパ球系細胞の障害から起こる様々な疾患の治療
的関与の機会を与える。非常に驚くべきことに、本発明
は、これらの及び他の関連する要求を満たすものであ
る。
細胞の中心的役割において、当業技術は、造血的再生、
増殖及び分化を誘導する方法を必要とする。造血を刺激
することは、目的とする遺伝子治療と共に、ミエロイド
及びリンパ球系細胞の障害から起こる様々な疾患の治療
的関与の機会を与える。非常に驚くべきことに、本発明
は、これらの及び他の関連する要求を満たすものであ
る。
【０００３】
【課題を解決するための手段】本願発明は、哺乳類造血
幹細胞の増殖及び分化を、遺伝子的改質により誘導する
方法を与える。本発明の方法は、哺乳類造血幹細胞をオ
ンコスタチンＭをコードする遺伝子を含むベクターによ
り形質移入を行い、オンコスタチンＭの有効量を産生す
る遺伝子を発現し、及び幹細胞を造血増殖及び分化を支
持する培体中で生育することを含む。一つの実施態様に
おいて、細胞は、ヒト骨髄を例とするような、組織適合
性哺乳類宿主内で生育する。他の態様においては、細胞
は培地中で生育する。オンコスタチンＭをコードする遺
伝子は構成または組織特異性プロモーターの制御下であ
ってもよい。好ましい態様においては、オンコスタチン
Ｍをコードする遺伝子は、ｌｃｋ遺伝子由来の基部プロ
モーターの制御下にある。該造血幹細胞はまた再配列し
たＴ細胞レセプターまたはイムノグロブリンを発現する
ベクターを含んでいてもよい。
幹細胞の増殖及び分化を、遺伝子的改質により誘導する
方法を与える。本発明の方法は、哺乳類造血幹細胞をオ
ンコスタチンＭをコードする遺伝子を含むベクターによ
り形質移入を行い、オンコスタチンＭの有効量を産生す
る遺伝子を発現し、及び幹細胞を造血増殖及び分化を支
持する培体中で生育することを含む。一つの実施態様に
おいて、細胞は、ヒト骨髄を例とするような、組織適合
性哺乳類宿主内で生育する。他の態様においては、細胞
は培地中で生育する。オンコスタチンＭをコードする遺
伝子は構成または組織特異性プロモーターの制御下であ
ってもよい。好ましい態様においては、オンコスタチン
Ｍをコードする遺伝子は、ｌｃｋ遺伝子由来の基部プロ
モーターの制御下にある。該造血幹細胞はまた再配列し
たＴ細胞レセプターまたはイムノグロブリンを発現する
ベクターを含んでいてもよい。
【０００４】他の観点において、本発明はリンパ球の生
存を延長する方法に関係している。該方法は、造血幹細
胞をオンコスタチンＭをコードする遺伝子により形質移
入を行い、哺乳類に造血を誘導する遺伝子を発現するこ
とを含む。哺乳類における造血誘導は、放射線またはマ
イトマイシンＣのような化学療法剤を例とする細胞毒性
物質にさらされた場合、哺乳類のリンパ球の生存を延長
する。延長された生存を示すリンパ球は哺乳類に固有の
非形質移入リンパ球であってもよく、または形質移入さ
れた幹細胞の分化から誘導されたものであってもよい。
本発明の方法は、リンパ腫、再生不良性貧血、β−地中
海貧血、血小板減少、血友病、複合型免疫欠損、ＡＩＤ
Ｓ、または白血病のような疾患の処置に有用である。さ
らに、本発明の方法は、放射線治療または化学療法の際
にリンパ球の生存の延長に有効である。
存を延長する方法に関係している。該方法は、造血幹細
胞をオンコスタチンＭをコードする遺伝子により形質移
入を行い、哺乳類に造血を誘導する遺伝子を発現するこ
とを含む。哺乳類における造血誘導は、放射線またはマ
イトマイシンＣのような化学療法剤を例とする細胞毒性
物質にさらされた場合、哺乳類のリンパ球の生存を延長
する。延長された生存を示すリンパ球は哺乳類に固有の
非形質移入リンパ球であってもよく、または形質移入さ
れた幹細胞の分化から誘導されたものであってもよい。
本発明の方法は、リンパ腫、再生不良性貧血、β−地中
海貧血、血小板減少、血友病、複合型免疫欠損、ＡＩＤ
Ｓ、または白血病のような疾患の処置に有用である。さ
らに、本発明の方法は、放射線治療または化学療法の際
にリンパ球の生存の延長に有効である。
【０００５】
【発明の実施の形態】本発明は、オンコスタチンＭをコ
ードする遺伝子を含むベクターを形質移入することによ
り、哺乳類の造血幹細胞（以下“ＨＳＣｓ”と称する）
の増殖及び分化を誘導する方法に関する。遺伝子は、オ
ンコスタチンＭの有効量を産生するように発現され、及
び誘導されたＨＳＣｓは、造血増殖及び分化を支持する
媒体中で生育する。他の観点において、本発明はリンパ
球の生存を延長する方法に関する。本方法は、造血幹細
胞をオンコスタチンＭをコードする遺伝子により形質移
入を行い、哺乳類に造血を誘導する遺伝子を発現するこ
とを含む。哺乳類での造血の誘導は、放射線またはマイ
トマイシンＣのような化学療法剤にさらされた際に、哺
乳類のリンパ球の生存を延長する。本発明の方法はリン
パ腫、再生不良性貧血、β−地中海貧血、血小板減少、
血友病、複合型免疫欠損、ＡＩＤＳ、または白血病のよ
うな疾患の処置に有用である。本発明の方法は、また、
放射線治療または化学療法のリンパ球を消耗させる効果
の低減に有効である。
ードする遺伝子を含むベクターを形質移入することによ
り、哺乳類の造血幹細胞（以下“ＨＳＣｓ”と称する）
の増殖及び分化を誘導する方法に関する。遺伝子は、オ
ンコスタチンＭの有効量を産生するように発現され、及
び誘導されたＨＳＣｓは、造血増殖及び分化を支持する
媒体中で生育する。他の観点において、本発明はリンパ
球の生存を延長する方法に関する。本方法は、造血幹細
胞をオンコスタチンＭをコードする遺伝子により形質移
入を行い、哺乳類に造血を誘導する遺伝子を発現するこ
とを含む。哺乳類での造血の誘導は、放射線またはマイ
トマイシンＣのような化学療法剤にさらされた際に、哺
乳類のリンパ球の生存を延長する。本発明の方法はリン
パ腫、再生不良性貧血、β−地中海貧血、血小板減少、
血友病、複合型免疫欠損、ＡＩＤＳ、または白血病のよ
うな疾患の処置に有用である。本発明の方法は、また、
放射線治療または化学療法のリンパ球を消耗させる効果
の低減に有効である。
【０００６】造血を誘導し得るオンコスタチンＭをコー
ドする核酸、相同体、及びこれらのフラグメントまたは
そのフラグメント（例として、オンコスタチンＭ“遺伝
子”）は、出願中の米国特許第07/623,867、08/075,19
9、08/078,707、08/085,279、及び08/312,205号に記載
されており、全てここに引用文献として記載する。オン
コスタチンＭの遺伝子はプロモーター及び転写ターミネ
ーターに結合可能なベクター内に導入される。プロモー
ターの選択は、ＨＳＣ造血を誘導するために有効量のオ
ンコスタチンＭを発現するという要求に従うものであ
り、及び誘導可能、抑制可能または本質的であってもよ
い。さらに、プロモーターは、ＨＳＣｓを哺乳類宿主に
形質移入した後に、オンコスタチンＭの発現の抑制を働
かせるように使用してもよい。様々な組織特異性プロモ
ーターを、特にリンパ器官におけるＨＳＣｓの分化を誘
導するために使用してもよい。例えば、ｌｃｋ遺伝子の
胸腺特異的基部プロモーターを、Ｂ細胞及びＴ細胞への
リンパ球の分化を誘導するのに使用してもよい。Malik
ら、Mol. Cell. Biol., 15(5):2349-2358(1995)をここ
に参考文献として引用する。改質のための構成物は、通
常、ＤＮＡを組み込む細胞を選択せしめるマーカーを含
む。様々なマーカーが存在するが、特に、Ｇ４１８、ハ
イグロマイシン（hygromycin) 及びその他に対して耐性
であるような抗生物質の耐性マーカーが挙げられる。構
成物は、様々な慣用的手法により調製される。様々なプ
ロモーター、マーカー、及び制限部位を有する多数のベ
クターが入手可能である。このように、オンコスタチン
Ｍの遺伝子を、適する転写開始及び終了部位並びに翻訳
開始及び終了部位と共に適するベクターに、導入しても
よい。
ドする核酸、相同体、及びこれらのフラグメントまたは
そのフラグメント（例として、オンコスタチンＭ“遺伝
子”）は、出願中の米国特許第07/623,867、08/075,19
9、08/078,707、08/085,279、及び08/312,205号に記載
されており、全てここに引用文献として記載する。オン
コスタチンＭの遺伝子はプロモーター及び転写ターミネ
ーターに結合可能なベクター内に導入される。プロモー
ターの選択は、ＨＳＣ造血を誘導するために有効量のオ
ンコスタチンＭを発現するという要求に従うものであ
り、及び誘導可能、抑制可能または本質的であってもよ
い。さらに、プロモーターは、ＨＳＣｓを哺乳類宿主に
形質移入した後に、オンコスタチンＭの発現の抑制を働
かせるように使用してもよい。様々な組織特異性プロモ
ーターを、特にリンパ器官におけるＨＳＣｓの分化を誘
導するために使用してもよい。例えば、ｌｃｋ遺伝子の
胸腺特異的基部プロモーターを、Ｂ細胞及びＴ細胞への
リンパ球の分化を誘導するのに使用してもよい。Malik
ら、Mol. Cell. Biol., 15(5):2349-2358(1995)をここ
に参考文献として引用する。改質のための構成物は、通
常、ＤＮＡを組み込む細胞を選択せしめるマーカーを含
む。様々なマーカーが存在するが、特に、Ｇ４１８、ハ
イグロマイシン（hygromycin) 及びその他に対して耐性
であるような抗生物質の耐性マーカーが挙げられる。構
成物は、様々な慣用的手法により調製される。様々なプ
ロモーター、マーカー、及び制限部位を有する多数のベ
クターが入手可能である。このように、オンコスタチン
Ｍの遺伝子を、適する転写開始及び終了部位並びに翻訳
開始及び終了部位と共に適するベクターに、導入しても
よい。
【０００７】本発明のＨＳＣｓに、生体外(ex vivo)(例
えば細胞培養内）で、またはインビボ（例えば哺乳類の
骨髄細胞内）でオンコスタチンＭの遺伝子により形質移
入を行ってもよい。ＨＳＣｓは例えば直接的なレトロウ
ィルス感染またはリポソーム形質移入を使用して、イン
ビボで形質移入を行ってもよい（Nabel ら、Science,24
9:1285-1288(1990)）。例として、リポソームを抗ＣＤ
３４抗体を使用してヒトＨＳＣｓへの標的としてもよ
く、またはＨＳＣｓの脂質膜を伴う結合フラグメントと
してもよい。典型的には、ＨＳＣｓは哺乳類宿主から除
去され、及び共沈殿、原形質融合、エレクトロポレーシ
ョン、またはレトロウィルス形質移入のような方法を使
用して生体外で形質移入を行ってもよい。J. Sambrook,
E.F. Fritsch & T. Maniatis' Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Har
bor Laboratory Press, 1989 を参考文献としてここに
引用する。
えば細胞培養内）で、またはインビボ（例えば哺乳類の
骨髄細胞内）でオンコスタチンＭの遺伝子により形質移
入を行ってもよい。ＨＳＣｓは例えば直接的なレトロウ
ィルス感染またはリポソーム形質移入を使用して、イン
ビボで形質移入を行ってもよい（Nabel ら、Science,24
9:1285-1288(1990)）。例として、リポソームを抗ＣＤ
３４抗体を使用してヒトＨＳＣｓへの標的としてもよ
く、またはＨＳＣｓの脂質膜を伴う結合フラグメントと
してもよい。典型的には、ＨＳＣｓは哺乳類宿主から除
去され、及び共沈殿、原形質融合、エレクトロポレーシ
ョン、またはレトロウィルス形質移入のような方法を使
用して生体外で形質移入を行ってもよい。J. Sambrook,
E.F. Fritsch & T. Maniatis' Molecular Cloning, A
Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Har
bor Laboratory Press, 1989 を参考文献としてここに
引用する。
【０００８】ＨＳＣｓのオンコスタチンＭ形質移入に使
用するベクターは、オンコスタチンＭの有効量を、生体
外、インビボまたは両方において発現させるように選択
してもよい。一般的には、生体外におけるオンコスタチ
ンＭ形質移入ＨＳＣｓの発現は、細胞が造血増殖及び分
化を支持する培地内に存在する場合になされる。一度形
質移入したＨＳＣｓがインビボで生育したならば、生体
外発現に続き、細胞を宿主に移植してもよく、かつ有効
量のオンコスタチンＭが引き続き発現されてもよい。イ
ンビボ移植の前にＨＳＣｓを分化細胞から分離してもよ
い。または、オンコスタチンＭ形質移入ＨＳＣｓを宿主
に導入し、オンコスタチンＭをインビボ（例として、組
織特異性プロモーターを使用して行う）で発現し、有効
量の遺伝子産生物を産生する。当業者らに理解されるよ
うに、宿主は移植ＨＳＣｓに対し免疫耐性でなければな
らない。例として、宿主は免疫抑制剤の投与を受けてい
るかまたは移植片拒絶を避けるのに十分に組織適合性で
ある。有効量のオンコスタチンＭは造血増殖及び分化を
誘導する。造血増殖及び分化をアッセイする方法は当業
者らに公知である。
用するベクターは、オンコスタチンＭの有効量を、生体
外、インビボまたは両方において発現させるように選択
してもよい。一般的には、生体外におけるオンコスタチ
ンＭ形質移入ＨＳＣｓの発現は、細胞が造血増殖及び分
化を支持する培地内に存在する場合になされる。一度形
質移入したＨＳＣｓがインビボで生育したならば、生体
外発現に続き、細胞を宿主に移植してもよく、かつ有効
量のオンコスタチンＭが引き続き発現されてもよい。イ
ンビボ移植の前にＨＳＣｓを分化細胞から分離してもよ
い。または、オンコスタチンＭ形質移入ＨＳＣｓを宿主
に導入し、オンコスタチンＭをインビボ（例として、組
織特異性プロモーターを使用して行う）で発現し、有効
量の遺伝子産生物を産生する。当業者らに理解されるよ
うに、宿主は移植ＨＳＣｓに対し免疫耐性でなければな
らない。例として、宿主は免疫抑制剤の投与を受けてい
るかまたは移植片拒絶を避けるのに十分に組織適合性で
ある。有効量のオンコスタチンＭは造血増殖及び分化を
誘導する。造血増殖及び分化をアッセイする方法は当業
者らに公知である。
【０００９】有効量のオンコスタチンＭの発現を誘導し
た後、ＨＳＣｓを生体外またはインビボ媒体内で生育せ
しめ、ＨＳＣの増殖及び分化を行う。ＨＳＣｓが生育す
る媒体は培地を例とする生体外でもよく、または宿主の
骨髄を例とするインビボでもよい。幹細胞の導入前の、
様々な段階において、宿主を元のリンパ球または造血能
を切除するという処置を行ってもよい。オンコスタチン
Ｍ形質移入ＨＳＣｓは生理学的に許容されるどのような
媒体に投与されてもよく、通常脈管内であるが、これら
はまた、骨髄または細胞が再生及び分化を行うのに適す
る部位である他の簡便な部位に導入されてもよい。通
常、少なくとも１×１０3 細胞が投与され、１×１０4
以上であることが好ましい。細胞は、注射、カテーテル
等により導入されてもよい。必要な場合には、細胞の導
入の目的により、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−
ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、エリスロポエチン、スロンボポエ
チン等のようなインターロイキン類のような因子を導入
してもよい。これらの因子の量は、細胞の投与の目的及
び特に患者の必要性により決定される。
た後、ＨＳＣｓを生体外またはインビボ媒体内で生育せ
しめ、ＨＳＣの増殖及び分化を行う。ＨＳＣｓが生育す
る媒体は培地を例とする生体外でもよく、または宿主の
骨髄を例とするインビボでもよい。幹細胞の導入前の、
様々な段階において、宿主を元のリンパ球または造血能
を切除するという処置を行ってもよい。オンコスタチン
Ｍ形質移入ＨＳＣｓは生理学的に許容されるどのような
媒体に投与されてもよく、通常脈管内であるが、これら
はまた、骨髄または細胞が再生及び分化を行うのに適す
る部位である他の簡便な部位に導入されてもよい。通
常、少なくとも１×１０3 細胞が投与され、１×１０4
以上であることが好ましい。細胞は、注射、カテーテル
等により導入されてもよい。必要な場合には、細胞の導
入の目的により、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−６、Ｇ−
ＣＳＦ、ＩＦＮ−γ、エリスロポエチン、スロンボポエ
チン等のようなインターロイキン類のような因子を導入
してもよい。これらの因子の量は、細胞の投与の目的及
び特に患者の必要性により決定される。
【００１０】本願発明のＨＳＣｓは、特別な系統若しく
はそのような系統の下位に分化させるか、または特定の
機能を増強させる、遺伝子治療に使用されてもよい。例
えば、再配列されたＴ細胞レセプターまたはイムノグロ
ブリン遺伝子はＨＳＣｓに導入されてもよく、該ＨＳＣ
ｓはオンコスタチンＭを胸腺特異的基部ｌｃｋ遺伝子プ
ロモーターから発現させることによりリンパ球生成分化
を行う。他の態様においては、オンコスタチンＭ形質移
入ＨＳＣｓはまた、基部ｌｃｋ遺伝子プロモーターのよ
うなプロモーターによりリンパ球を分化せしめて刺激す
ることにより、ＣＤ４（例として、ＣＤ４+ −ＣＤ
８+ ）を発現する二重陽性細胞を過剰に発現してもよ
い。これらの二重陽性細胞はＨＩＶウィルス負荷を減少
するシンク（sink) として使用してもよく、これによ
り、成熟ＣＤ４+ Ｔ細胞を保護する。二重陽性細胞の、
ウィルス感染のための特定の優性−陰性（dominant-neg
ative)突然変異体による共形質移入(co-tranfection)を
次の感染を防ぐために使用してもよい。
はそのような系統の下位に分化させるか、または特定の
機能を増強させる、遺伝子治療に使用されてもよい。例
えば、再配列されたＴ細胞レセプターまたはイムノグロ
ブリン遺伝子はＨＳＣｓに導入されてもよく、該ＨＳＣ
ｓはオンコスタチンＭを胸腺特異的基部ｌｃｋ遺伝子プ
ロモーターから発現させることによりリンパ球生成分化
を行う。他の態様においては、オンコスタチンＭ形質移
入ＨＳＣｓはまた、基部ｌｃｋ遺伝子プロモーターのよ
うなプロモーターによりリンパ球を分化せしめて刺激す
ることにより、ＣＤ４（例として、ＣＤ４+ −ＣＤ
８+ ）を発現する二重陽性細胞を過剰に発現してもよ
い。これらの二重陽性細胞はＨＩＶウィルス負荷を減少
するシンク（sink) として使用してもよく、これによ
り、成熟ＣＤ４+ Ｔ細胞を保護する。二重陽性細胞の、
ウィルス感染のための特定の優性−陰性（dominant-neg
ative)突然変異体による共形質移入(co-tranfection)を
次の感染を防ぐために使用してもよい。
【００１１】他の態様においては、リンパ球生成は個体
内で刺激されるものであり、その個体において胸腺誘導
Ｔ細胞の発生は損なわれているか、または欠落している
（すなわち、胸腺除去されているか、胸腺欠損であ
る）。リンパ球生成は、基部ｌｃｋ遺伝子プロモーター
のような胸腺特異的プロモーターを使用して、そのよう
な個体内で刺激され、オンコスタチンＭの発現を形質移
入したＨＳＣｓ内で発現してもよい。本願発明の他の態
様において、オンコスタチンＭの有効量をリンパ球の生
存を延長するために使用してもよい。細胞毒性物質（例
として、化学療法剤、放射線）の効果から回避したリン
パ球は、非形質移入された宿主リンパ球、または形質移
入され、オンコスタチンＭ形質移入ＨＳＣｓから誘導さ
れたリンパ球であってもよい。本願発明の方法では、オ
ンコスタチンＭ形質移入ＨＳＣｓの発現及び生育の種々
の組み合わせを使用してもよい。例えば、形質移入され
たＨＳＣｓのオンコスタチンＭを生体外で発現し、目的
のレベルにまで培養を増加させてもよく、続いて、宿主
骨髄の媒体における継続した発現及び生育のために、生
体内（インビボ）に導入してもよい。あるいは、オンコ
スタチンＭの有効量を、例えばオンコスタチンＭの遺伝
子に実施可能なように結合した組織特異的プロモーター
を使用して、インビボにおいて、発現及び生育双方を行
ってもよい。オンコスタチンＭ誘導造血を受けたＨＳＣ
ｓは、放射線及び化学療法による細胞毒性活性の影響を
受けにくい。このように、例えば、オンコスタチンＭ誘
導ＨＳＣｓを、細胞毒性物質、マイトマイシンＣの投与
による宿主のリンパ球レベルの減少を軽減するために使
用してもよい。さらに、オンコスタチンＭ誘導ＨＳＣｓ
それ自身は、非形質移入（非導入）ＨＳＣｓよりも細胞
毒性物質に対してより耐性である。オンコスタチンＭの
有効量の発現による造血誘導を、細胞毒性物質処理の
前、処理中または処理後に行ってもよい。誘導を処理中
または処置後に行うのが好ましい。
内で刺激されるものであり、その個体において胸腺誘導
Ｔ細胞の発生は損なわれているか、または欠落している
（すなわち、胸腺除去されているか、胸腺欠損であ
る）。リンパ球生成は、基部ｌｃｋ遺伝子プロモーター
のような胸腺特異的プロモーターを使用して、そのよう
な個体内で刺激され、オンコスタチンＭの発現を形質移
入したＨＳＣｓ内で発現してもよい。本願発明の他の態
様において、オンコスタチンＭの有効量をリンパ球の生
存を延長するために使用してもよい。細胞毒性物質（例
として、化学療法剤、放射線）の効果から回避したリン
パ球は、非形質移入された宿主リンパ球、または形質移
入され、オンコスタチンＭ形質移入ＨＳＣｓから誘導さ
れたリンパ球であってもよい。本願発明の方法では、オ
ンコスタチンＭ形質移入ＨＳＣｓの発現及び生育の種々
の組み合わせを使用してもよい。例えば、形質移入され
たＨＳＣｓのオンコスタチンＭを生体外で発現し、目的
のレベルにまで培養を増加させてもよく、続いて、宿主
骨髄の媒体における継続した発現及び生育のために、生
体内（インビボ）に導入してもよい。あるいは、オンコ
スタチンＭの有効量を、例えばオンコスタチンＭの遺伝
子に実施可能なように結合した組織特異的プロモーター
を使用して、インビボにおいて、発現及び生育双方を行
ってもよい。オンコスタチンＭ誘導造血を受けたＨＳＣ
ｓは、放射線及び化学療法による細胞毒性活性の影響を
受けにくい。このように、例えば、オンコスタチンＭ誘
導ＨＳＣｓを、細胞毒性物質、マイトマイシンＣの投与
による宿主のリンパ球レベルの減少を軽減するために使
用してもよい。さらに、オンコスタチンＭ誘導ＨＳＣｓ
それ自身は、非形質移入（非導入）ＨＳＣｓよりも細胞
毒性物質に対してより耐性である。オンコスタチンＭの
有効量の発現による造血誘導を、細胞毒性物質処理の
前、処理中または処理後に行ってもよい。誘導を処理中
または処置後に行うのが好ましい。
【００１２】
【実施例】次の実施例は説明するためのものであり、限
定するためのものではない。実施例１ この実施例は、ウシオンコスタチンＭのクローン化、発
現及び分析について述べている。ウシゲノムライブラリ
ー（Stratagene) の１０５のプラークをヒトオンコスタ
チンＭ（ｈＯＳＭ）ｃＤＮＡの32Ｐ−ラベルしたＢｇｌ
ＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを用いて、スクリーニング
を行った。ニトロセルロースフィルターを５０％ホルム
アミドを含むハイブリダイゼーションバッファー中、４
２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは0.１５ＭＮａＣｌ＋0.０１５Ｍクエン酸
ナトリウム）−0.１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）内で６５℃において洗浄し、次に0.５×ＳＳＣ−0.
１％ＳＤＳ内で６５℃において洗浄した。精製したλフ
ァージＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション分析を行
い、及び4.７-kb ＥｃｏＲＩフラグメントをブルースク
リプト（Bluescript)II SK+ （Stratagene) 内にサブク
ローン化を行った。
定するためのものではない。実施例１ この実施例は、ウシオンコスタチンＭのクローン化、発
現及び分析について述べている。ウシゲノムライブラリ
ー（Stratagene) の１０５のプラークをヒトオンコスタ
チンＭ（ｈＯＳＭ）ｃＤＮＡの32Ｐ−ラベルしたＢｇｌ
ＩＩ−ＸｈｏＩフラグメントを用いて、スクリーニング
を行った。ニトロセルロースフィルターを５０％ホルム
アミドを含むハイブリダイゼーションバッファー中、４
２℃で一晩ハイブリダイゼーションを行い、２×ＳＳＣ
（１×ＳＳＣは0.１５ＭＮａＣｌ＋0.０１５Ｍクエン酸
ナトリウム）−0.１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ
Ｓ）内で６５℃において洗浄し、次に0.５×ＳＳＣ−0.
１％ＳＤＳ内で６５℃において洗浄した。精製したλフ
ァージＤＮＡをサザンハイブリダイゼーション分析を行
い、及び4.７-kb ＥｃｏＲＩフラグメントをブルースク
リプト（Bluescript)II SK+ （Stratagene) 内にサブク
ローン化を行った。
【００１３】ｂＯＳＭ遺伝子のオープンリーディングフ
レーム及びエクソン／イントロン境界をジデオキシ鎖末
端法により両方のストランドから配列を決定した。３.2
-kbＳｓｔＩ−Ｅａｇｌフラグメントを使用してｂＯＳ
Ｍ遺伝子を細胞内に発現した。このＤＮＡは、イニシエ
ーターＭｅｔの１２ｂｐ上流から始まり、ターミネーシ
ョンコドンの３４０ｂｐ過ぎまで続く。種々のシトカイ
ンｍＲＮＡのすばやいターンオーバーを媒介すると考え
られるＡＴ過剰配列は（Shaw et al., Cell, 46:659-66
9(1986) をここに参考文献として引用する) 、遠位のＥ
ａｇ１部位の下流に存在しこのゲノムフラグメントには
含まれていなかった。３.2-kb ｂＯＳＭＤＮＡをクレナ
ウ（Klenow）フラグメントにより処理を行い、鈍端（bl
unt-end)結紮により、ｐπＨ３内にクローニングを行い
（Aruffin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:85
73-8577 (1987)をここに参考文献として引用する）、こ
れは、サイトメガロウィルスプロモーター及びサルウィ
ルス４０複製起源を含んでいる。ヒトＯＳＭ遺伝子のｐ
πＨ３内でのクローニング及びＣＯＳ細胞内でのその発
現は、Malik らにより、Mol. Cell. Biol., 9:2847-285
3(1989) に報告されており、この内容はここに参考文献
として引用する。
レーム及びエクソン／イントロン境界をジデオキシ鎖末
端法により両方のストランドから配列を決定した。３.2
-kbＳｓｔＩ−Ｅａｇｌフラグメントを使用してｂＯＳ
Ｍ遺伝子を細胞内に発現した。このＤＮＡは、イニシエ
ーターＭｅｔの１２ｂｐ上流から始まり、ターミネーシ
ョンコドンの３４０ｂｐ過ぎまで続く。種々のシトカイ
ンｍＲＮＡのすばやいターンオーバーを媒介すると考え
られるＡＴ過剰配列は（Shaw et al., Cell, 46:659-66
9(1986) をここに参考文献として引用する) 、遠位のＥ
ａｇ１部位の下流に存在しこのゲノムフラグメントには
含まれていなかった。３.2-kb ｂＯＳＭＤＮＡをクレナ
ウ（Klenow）フラグメントにより処理を行い、鈍端（bl
unt-end)結紮により、ｐπＨ３内にクローニングを行い
（Aruffin et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84:85
73-8577 (1987)をここに参考文献として引用する）、こ
れは、サイトメガロウィルスプロモーター及びサルウィ
ルス４０複製起源を含んでいる。ヒトＯＳＭ遺伝子のｐ
πＨ３内でのクローニング及びＣＯＳ細胞内でのその発
現は、Malik らにより、Mol. Cell. Biol., 9:2847-285
3(1989) に報告されており、この内容はここに参考文献
として引用する。
【００１４】ＣＯＳ細胞は、１０％ウシ胎児血清を含む
ダルベコの調製イーグル（Eagle's)培地で培養し、ＤＥ
ＡＥデキストランサルフェートにより形質移入を行っ
た。４８時間後、培養物を血清を含まない培地に植え、
この条件付けた培地を２４時間後に採取した。ウエスタ
ン免疫ブロット分析のため、条件付けた培地を１Ｍ酢酸
に対して透析を行い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った。タンパクをニトロセルロース上に移動
し、ｂＯＳＭペプチド（RTAGQVLRGWGERQGRSRRC)に対す
るウサギ抗血清と共に培養を行った。ｂＯＳＭ抗体複合
体はアルカリ性ホスファターゼ結合タンパクＡにより検
出を行った。
ダルベコの調製イーグル（Eagle's)培地で培養し、ＤＥ
ＡＥデキストランサルフェートにより形質移入を行っ
た。４８時間後、培養物を血清を含まない培地に植え、
この条件付けた培地を２４時間後に採取した。ウエスタ
ン免疫ブロット分析のため、条件付けた培地を１Ｍ酢酸
に対して透析を行い、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電
気泳動を行った。タンパクをニトロセルロース上に移動
し、ｂＯＳＭペプチド（RTAGQVLRGWGERQGRSRRC)に対す
るウサギ抗血清と共に培養を行った。ｂＯＳＭ抗体複合
体はアルカリ性ホスファターゼ結合タンパクＡにより検
出を行った。
【００１５】一つのポジティブクローンをサザンハイブ
リダイゼーションにより分析を行い、ＤＮＡ配列分析を
行った。図１及び２は、ｈＯＳＭに関連したタンパクを
コードする４.7−ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントの部分的
制限地図を示している。この遺伝子に対するオープンリ
ーディングフレームは３種のエクソン上に含まれてお
り、ｈＯＳＭの遺伝子に対して７３％相同である。イン
トロンＩ及びIIはそれぞれ1,418 及び572 の核酸を有す
る長さである。
リダイゼーションにより分析を行い、ＤＮＡ配列分析を
行った。図１及び２は、ｈＯＳＭに関連したタンパクを
コードする４.7−ｋｂＥｃｏＲＩフラグメントの部分的
制限地図を示している。この遺伝子に対するオープンリ
ーディングフレームは３種のエクソン上に含まれてお
り、ｈＯＳＭの遺伝子に対して７３％相同である。イン
トロンＩ及びIIはそれぞれ1,418 及び572 の核酸を有す
る長さである。
【００１６】図３はｈＯＳＭタンパクのモデル並びにヒ
ト及びサルのタンパクのｂＯＳＭアミノ酸配列を示して
いる（Bruce et al., Prog. Growth Factor Res., 4:15
7-170 (1992)をここに参考文献として引用する) 。全三
種の遺伝子のオープンリーディングフレームを分けるエ
クソン／イントロンの縁は同じである。ウシ及びヒト前
駆タンパクは５８％同一である。重要な類似点が、様々
な領域で見られ、シグナルペプチド及びタンパク分解に
よりｈＯＳＭより除去されるカルボキシルエクステンシ
ョンを含む。ｈＯＳＭタンパクは、無極性残基の繰り返
しパターンを有し、７−残基ヘプタッド（heptad）のｉ
及びｉ＋３の位置において起こる、4 種類の両親媒性の
ヘリックスを有すると考えられている。ｂＯＳＭの４種
類のヘリックスの無極性残基の多くは、ｈＯＳＭのそれ
と一致し、多くの置換基は保存的置換を示す。ジスルフ
ィド結合を有する４種類のシステイン残基もまた一致
し、及びレセプター結合に重要であると考えられる二種
類の領域、すなわち、ＡＢループ及びＤ１領域は強力に
保存される。Ｄ１領域における一つの注意すべき除外
は、ＧからＮへの置換である。このＧ残基は、らせん状
のターンにおいて突起しており、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ及び
顆粒球コロニー刺激因子内で保存される。ウシタンパク
におけるらせん束の関係を効果的に変化させる他の置換
は、ヘリックスＢに続き、ヘリックスＣの始めであるル
ープ領域を含む、１４アミノ酸の欠失である。この配列
の発散（divergence) は、機能にとって重要でなくても
よく、これは、ヘリックスＢ及びＣがレセプター−結合
ドメインの反対に位置していると考えられるからであ
る。
ト及びサルのタンパクのｂＯＳＭアミノ酸配列を示して
いる（Bruce et al., Prog. Growth Factor Res., 4:15
7-170 (1992)をここに参考文献として引用する) 。全三
種の遺伝子のオープンリーディングフレームを分けるエ
クソン／イントロンの縁は同じである。ウシ及びヒト前
駆タンパクは５８％同一である。重要な類似点が、様々
な領域で見られ、シグナルペプチド及びタンパク分解に
よりｈＯＳＭより除去されるカルボキシルエクステンシ
ョンを含む。ｈＯＳＭタンパクは、無極性残基の繰り返
しパターンを有し、７−残基ヘプタッド（heptad）のｉ
及びｉ＋３の位置において起こる、4 種類の両親媒性の
ヘリックスを有すると考えられている。ｂＯＳＭの４種
類のヘリックスの無極性残基の多くは、ｈＯＳＭのそれ
と一致し、多くの置換基は保存的置換を示す。ジスルフ
ィド結合を有する４種類のシステイン残基もまた一致
し、及びレセプター結合に重要であると考えられる二種
類の領域、すなわち、ＡＢループ及びＤ１領域は強力に
保存される。Ｄ１領域における一つの注意すべき除外
は、ＧからＮへの置換である。このＧ残基は、らせん状
のターンにおいて突起しており、ＬＩＦ、ＣＮＴＦ及び
顆粒球コロニー刺激因子内で保存される。ウシタンパク
におけるらせん束の関係を効果的に変化させる他の置換
は、ヘリックスＢに続き、ヘリックスＣの始めであるル
ープ領域を含む、１４アミノ酸の欠失である。この配列
の発散（divergence) は、機能にとって重要でなくても
よく、これは、ヘリックスＢ及びＣがレセプター−結合
ドメインの反対に位置していると考えられるからであ
る。
【００１７】実施例II この実施例は、ヒト及びウシのオンコスタチンＭの、レ
セプター結合及び成長阻害アッセイによる比較を示して
いる。オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）レセプター結合アッ
セイにおいて、７mlの組み換えｂＯＳＭを含む条件付け
培地（成長阻害アッセイにより測定したｈＯＳＭの６３
０ngに相当する）を凍結乾燥を行い、５００ｐＭ〔125
Ｉ〕ｈＯＳＭを含む、１mlの結合バッファー（２０mMＮ
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
フォン酸〔ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７.4〕５％ウシ血清アルブ
ミンＢＳＡ、及びＰＲＭＩ１６４０中の０.2％アジ化ナ
トリウム％）内に再懸濁を行った。このカクテルを〔
125 Ｉ〕ｈＯＳＭを含む結合バッファーで２倍量に希釈
し、最終的に１２８倍量まで希釈した。Ｈ２９８１肺カ
ルシノーマ細胞（Horn et al., Growth Factors, 22:15
7-165(1990) をここに参考文献として引用する。) を、
ダルベコの調製イーグルス（Eagle's)培地と１０％ウシ
胎児血清内で２４時間培養した。細胞を結合バッファー
で一度洗浄し、次に希釈した条件付け培地（２００μ
ｌ）内で１.5時間、２０℃で、回転式攪拌機で培養を行
った。細胞を５００μｌの結合バッファーで三回洗浄
し、２００μｌの１ＭＮａＯＨで６０℃、３０分間溶解
し、次にパッカードコブラオートガンマ（Packard Cobr
a Autogamma)計測機で結合放射線活性を測定した。各基
準点は、三重測定からの平均及び標準偏差を示す（図
４）。
セプター結合及び成長阻害アッセイによる比較を示して
いる。オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）レセプター結合アッ
セイにおいて、７mlの組み換えｂＯＳＭを含む条件付け
培地（成長阻害アッセイにより測定したｈＯＳＭの６３
０ngに相当する）を凍結乾燥を行い、５００ｐＭ〔125
Ｉ〕ｈＯＳＭを含む、１mlの結合バッファー（２０mMＮ
−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−２−エタンスル
フォン酸〔ＨＥＰＥＳ；ｐＨ７.4〕５％ウシ血清アルブ
ミンＢＳＡ、及びＰＲＭＩ１６４０中の０.2％アジ化ナ
トリウム％）内に再懸濁を行った。このカクテルを〔
125 Ｉ〕ｈＯＳＭを含む結合バッファーで２倍量に希釈
し、最終的に１２８倍量まで希釈した。Ｈ２９８１肺カ
ルシノーマ細胞（Horn et al., Growth Factors, 22:15
7-165(1990) をここに参考文献として引用する。) を、
ダルベコの調製イーグルス（Eagle's)培地と１０％ウシ
胎児血清内で２４時間培養した。細胞を結合バッファー
で一度洗浄し、次に希釈した条件付け培地（２００μ
ｌ）内で１.5時間、２０℃で、回転式攪拌機で培養を行
った。細胞を５００μｌの結合バッファーで三回洗浄
し、２００μｌの１ＭＮａＯＨで６０℃、３０分間溶解
し、次にパッカードコブラオートガンマ（Packard Cobr
a Autogamma)計測機で結合放射線活性を測定した。各基
準点は、三重測定からの平均及び標準偏差を示す（図
４）。
【００１８】成長阻害アッセイにおいて、組み換えｂＯ
ＳＭを、既に述べたＡ３７５メラノーマ細胞の増殖阻害
活性測定法によりアッセイを行った(Malik et al, Cell
Biol., 11:453-459(1992); Rose et al, Proc Natl. A
cad. Sci. USA, 88:8641-8645(1991),この二つの文献を
ここに参考として引用する。) 。簡単に述べると、ダル
ベコの調製イーグル培地及び１０％ウシ胎児血清を含む
９６−ウェルミクロタイタープレートに、ウェル当たり
3.５×１０6 の細胞を蒔いた。２時間後、培地をｂＯＳ
Ｍタンパクにより条件付けた培地の希釈を含む２００μ
ｌで置換を行った。７２時間置いた後、培養に、125 Ｉ
−デオキシウリジン（０.1μＣｉ）を含む新鮮な培地１
００μｌを用いて８時間適用した。細胞を次に１ＭＮａ
ＯＨで溶解し、ＤＮＡ内に取り込まれた放射線同位体の
量を測定した。マウスＭ１ミエロイド白血病細胞（ウェ
ル当たり２.5×１０3 ）を７２時間、１０％ウシ胎児血
清を含むＰＲＭＩ１６４０培地中及びｂＯＳＭタンパク
を含む条件付けた培地の様々な希釈条件で培養を行っ
た。細胞に０.1μＣｉの[3Ｈ] チミジンを含む５０μｌ
の培地を６時間適用し、次に採取を行い、及びＤＮＡに
取り込まれた１分当たりのカウントを測定した。各基準
点は、三重測定の平均を示している（図６〜９）。
ＳＭを、既に述べたＡ３７５メラノーマ細胞の増殖阻害
活性測定法によりアッセイを行った(Malik et al, Cell
Biol., 11:453-459(1992); Rose et al, Proc Natl. A
cad. Sci. USA, 88:8641-8645(1991),この二つの文献を
ここに参考として引用する。) 。簡単に述べると、ダル
ベコの調製イーグル培地及び１０％ウシ胎児血清を含む
９６−ウェルミクロタイタープレートに、ウェル当たり
3.５×１０6 の細胞を蒔いた。２時間後、培地をｂＯＳ
Ｍタンパクにより条件付けた培地の希釈を含む２００μ
ｌで置換を行った。７２時間置いた後、培養に、125 Ｉ
−デオキシウリジン（０.1μＣｉ）を含む新鮮な培地１
００μｌを用いて８時間適用した。細胞を次に１ＭＮａ
ＯＨで溶解し、ＤＮＡ内に取り込まれた放射線同位体の
量を測定した。マウスＭ１ミエロイド白血病細胞（ウェ
ル当たり２.5×１０3 ）を７２時間、１０％ウシ胎児血
清を含むＰＲＭＩ１６４０培地中及びｂＯＳＭタンパク
を含む条件付けた培地の様々な希釈条件で培養を行っ
た。細胞に０.1μＣｉの[3Ｈ] チミジンを含む５０μｌ
の培地を６時間適用し、次に採取を行い、及びＤＮＡに
取り込まれた１分当たりのカウントを測定した。各基準
点は、三重測定の平均を示している（図６〜９）。
【００１９】ｂＯＳＭ遺伝子が生物学的に活性なタンパ
クをコードしているかどうか決定するために、発明者ら
は、レセプター結合活性及び培養細胞における機能の試
験を行った。ｂＯＳＭ遺伝子の3.２−ｋｂ部位を、その
オープンリーディングフレーム及び二つのイントロンと
共にｐπＨ３、すなわちサイトメガロウィルスプロモー
ター及びサルウィルス４０複製起源を含む発現プラスミ
ドに挿入した。ＣＯＳ細胞を形質移入し、血清を含まな
い培地で培養を行った。ｂＯＳＭペプチドに対するウサ
ギ抗血清を用いてウェスタンブロット分析により、上澄
みのｂＯＳＭタンパクのアッセイを行った。目的の約３
０ｋＤａのサイズのタンパクを、ｂＯＳＭ−形質移入細
胞内で検出したが、偽−形質移入培養では検出されなか
った。ｈＯＳＭが、レセプター結合において、ｂＯＳＭ
と競合するかどうかを試験するために、発明者らは、ヒ
トＨ２９８１肺カルシノーマ細胞を[125Ｉ] ｈＯＳＭと
共に培養し、ｂＯＳＭ−形質移入または偽−形質移入を
行ったＣＯＳ細胞の上澄みから調製したタンパクの様々
な濃度で行った。９０分後培養を洗浄し、溶解し、[125
Ｉ] ｈＯＳＭ結合の測定を行った。図４に示されるよう
に、ｂＯＳＭタンパクを含む培地はｈＯＳＭの細胞への
結合を８５％阻止し、過剰のラベル化していないｈＯＳ
Ｍにより得られたものと同等のレベルであった。コント
ロールＣＯＳ細胞からの上澄みはｈＯＳＭ結合へはほと
んど効果がなかった。この結果はｂＯＳＭが、ヒトの細
胞のＯＳＭ−特異的レセプターを認識し得ることを示し
ている。というのは、Ｈ２９８１細胞はＬＩＦＲβの発
現またはＬＩＦを発現しないからである。
クをコードしているかどうか決定するために、発明者ら
は、レセプター結合活性及び培養細胞における機能の試
験を行った。ｂＯＳＭ遺伝子の3.２−ｋｂ部位を、その
オープンリーディングフレーム及び二つのイントロンと
共にｐπＨ３、すなわちサイトメガロウィルスプロモー
ター及びサルウィルス４０複製起源を含む発現プラスミ
ドに挿入した。ＣＯＳ細胞を形質移入し、血清を含まな
い培地で培養を行った。ｂＯＳＭペプチドに対するウサ
ギ抗血清を用いてウェスタンブロット分析により、上澄
みのｂＯＳＭタンパクのアッセイを行った。目的の約３
０ｋＤａのサイズのタンパクを、ｂＯＳＭ−形質移入細
胞内で検出したが、偽−形質移入培養では検出されなか
った。ｈＯＳＭが、レセプター結合において、ｂＯＳＭ
と競合するかどうかを試験するために、発明者らは、ヒ
トＨ２９８１肺カルシノーマ細胞を[125Ｉ] ｈＯＳＭと
共に培養し、ｂＯＳＭ−形質移入または偽−形質移入を
行ったＣＯＳ細胞の上澄みから調製したタンパクの様々
な濃度で行った。９０分後培養を洗浄し、溶解し、[125
Ｉ] ｈＯＳＭ結合の測定を行った。図４に示されるよう
に、ｂＯＳＭタンパクを含む培地はｈＯＳＭの細胞への
結合を８５％阻止し、過剰のラベル化していないｈＯＳ
Ｍにより得られたものと同等のレベルであった。コント
ロールＣＯＳ細胞からの上澄みはｈＯＳＭ結合へはほと
んど効果がなかった。この結果はｂＯＳＭが、ヒトの細
胞のＯＳＭ−特異的レセプターを認識し得ることを示し
ている。というのは、Ｈ２９８１細胞はＬＩＦＲβの発
現またはＬＩＦを発現しないからである。
【００２０】ヒトメラノーマから誘導されたＡ３７５細
胞は、ｈＯＳＭのナノモルレベルの存在において球状に
なり、生育を終止した。この阻害はＯＳＭ−特異性レセ
プターを介在して起こる。このマウスＭ１白血病細胞は
またｈＯＳＭの存在下において分裂を終止し、静止状態
のマクロファージ様細胞へと分化した。ｇｐ１３０及び
ＬＩＦＲβを含むレセプター複合体を通してこの効果は
得られた。これらの二種類の細胞タイプにおけるｂＯＳ
Ｍの機能活性を試験するために、ｂＯＳＭ−形質移入Ｃ
ＯＳ細胞及びコントロール形質移入細胞からの上澄みを
１０％血清を含む培地中で希釈した。Ａ３７５細胞（図
６及び図７）及びＭ１細胞（図８及び９）を様々な希釈
段階において３日間培養を行った。示されるようにＤＮ
Ａ合成は両方の細胞系列において投与量依存的に阻害さ
れた。偽−形質移入した細胞からの上澄み液の希釈を行
ったコントロール実験は細胞増殖に全く効果を示さなか
った。これらの結果は、上記で述べたレセプター競合ア
ッセイと比較して、ウシゲノムＤＮＡライブラリーから
分離された遺伝子は生物学的に活性なタンパクをコード
することを示唆しており、このタンパクはマウス及びヒ
トｇｐ１３０−ベースのレセプターの両方と相互作用し
得るものである。
胞は、ｈＯＳＭのナノモルレベルの存在において球状に
なり、生育を終止した。この阻害はＯＳＭ−特異性レセ
プターを介在して起こる。このマウスＭ１白血病細胞は
またｈＯＳＭの存在下において分裂を終止し、静止状態
のマクロファージ様細胞へと分化した。ｇｐ１３０及び
ＬＩＦＲβを含むレセプター複合体を通してこの効果は
得られた。これらの二種類の細胞タイプにおけるｂＯＳ
Ｍの機能活性を試験するために、ｂＯＳＭ−形質移入Ｃ
ＯＳ細胞及びコントロール形質移入細胞からの上澄みを
１０％血清を含む培地中で希釈した。Ａ３７５細胞（図
６及び図７）及びＭ１細胞（図８及び９）を様々な希釈
段階において３日間培養を行った。示されるようにＤＮ
Ａ合成は両方の細胞系列において投与量依存的に阻害さ
れた。偽−形質移入した細胞からの上澄み液の希釈を行
ったコントロール実験は細胞増殖に全く効果を示さなか
った。これらの結果は、上記で述べたレセプター競合ア
ッセイと比較して、ウシゲノムＤＮＡライブラリーから
分離された遺伝子は生物学的に活性なタンパクをコード
することを示唆しており、このタンパクはマウス及びヒ
トｇｐ１３０−ベースのレセプターの両方と相互作用し
得るものである。
【００２１】実施例III この実験は形質転換マウスにおける標的ウシオンコスタ
チンＭの発現について述べている。全てのトランス遺伝
子は３.2-kｂｂＯＳＭの遺伝子フラグメント（実施例
Ｉ）を含有していた。発現ベクター及びその制限配列は
以下に示されるものであった：ＭｔｂＯＳＭ（０.7-kb
マウスメタロチオネインプロモーター及びヒト成長ホル
モン遺伝子からの３’ポリアデニル化シグナル配列（0.
６３ｂｐ）を含む。Low et al, Cell, 41:211-219 (198
5) の内容をここに参考文献として引用する。）；ＲＩ
βｂＯＳＭ（サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）依存性プ
ロテインキナーゼのＲＩβサブユニットの３.5-kb プロ
モーターフラグメント（Rogers et al.,Mol. Endocrino
l., 6:1756-1765(1992)をここに参考文献として引用す
る。))及びマウスプロタミン−１（ｍＰ１）遺伝子由来
の３’イントロン及びポリアデニル化シグナル配列
（０.5 kb)（Perchon et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84:5316-5319(1987) をここに参考文献として引用
する。) ；ＬｅｋｂＯＳＭ（ｌｃｋ遺伝子の３.1-kb 基
部プロモーター(Chaffin et al., EMBO J. 9:3821-3829
(1990)をここに参考文献として引用する。))及び０.5-k
b ｍＰ１ＤＮＡ；Ｋ１４−ｂＯＳＭ（２.7 kb のマウス
ケラチン-14 遺伝子プロモーター(Vassar et al., Gene
s Dev., 5:714-727(1991) をここに参考文献として引用
する。))及び０.6３-kb ヒト成長ホルモンＤＮＡ；及び
ＩｎｓｂＯＳＭ（０.6-kb プロモーター及びラットイン
スリン−１遺伝子の非コード化エキソン１（Lo et al.,
Cell, 53:159-168(1988) をここに参考文献として引用
する。))及び０.6３-kb ヒト成長ホルモンＤＮＡ。
チンＭの発現について述べている。全てのトランス遺伝
子は３.2-kｂｂＯＳＭの遺伝子フラグメント（実施例
Ｉ）を含有していた。発現ベクター及びその制限配列は
以下に示されるものであった：ＭｔｂＯＳＭ（０.7-kb
マウスメタロチオネインプロモーター及びヒト成長ホル
モン遺伝子からの３’ポリアデニル化シグナル配列（0.
６３ｂｐ）を含む。Low et al, Cell, 41:211-219 (198
5) の内容をここに参考文献として引用する。）；ＲＩ
βｂＯＳＭ（サイクリックＡＭＰ（ｃＡＭＰ）依存性プ
ロテインキナーゼのＲＩβサブユニットの３.5-kb プロ
モーターフラグメント（Rogers et al.,Mol. Endocrino
l., 6:1756-1765(1992)をここに参考文献として引用す
る。))及びマウスプロタミン−１（ｍＰ１）遺伝子由来
の３’イントロン及びポリアデニル化シグナル配列
（０.5 kb)（Perchon et al, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 84:5316-5319(1987) をここに参考文献として引用
する。) ；ＬｅｋｂＯＳＭ（ｌｃｋ遺伝子の３.1-kb 基
部プロモーター(Chaffin et al., EMBO J. 9:3821-3829
(1990)をここに参考文献として引用する。))及び０.5-k
b ｍＰ１ＤＮＡ；Ｋ１４−ｂＯＳＭ（２.7 kb のマウス
ケラチン-14 遺伝子プロモーター(Vassar et al., Gene
s Dev., 5:714-727(1991) をここに参考文献として引用
する。))及び０.6３-kb ヒト成長ホルモンＤＮＡ；及び
ＩｎｓｂＯＳＭ（０.6-kb プロモーター及びラットイン
スリン−１遺伝子の非コード化エキソン１（Lo et al.,
Cell, 53:159-168(1988) をここに参考文献として引用
する。))及び０.6３-kb ヒト成長ホルモンＤＮＡ。
【００２２】トランス遺伝子は制限酵素により消化を行
った後、プラスミド配列から分離し、アガロースゲル電
気泳動を行い、及びＴＡＥ（０.0４Ｍトリスアセテート
〔ｐＨ８.4〕、０.0０１ＭＥＤＴＡ）バッファーに溶出
した。ＤＮＡをlow ＴＥ（１０ｍＭトリス〔ｐＨ７.
5〕、０.5ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁し（１０μｇ／ｍ
ｌ）、予備洗浄した０.2２μｍの孔サイズのアクロディ
スク（acrodisk)(Gelman Sciences)を通して濾過を行っ
た。（Ｃ３Ｈ×Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆマウスからの受精し
た卵母細胞を前核注入に使用した。胚を一晩培養し、偽
妊娠のＣ５７ＢＬ／６雌の輸卵管に導入した。テイルＤ
ＮＡを放射線ラベル化したＤＮＡプローブとハイブリダ
イゼーションを行った後遺伝子導入マウスを個体識別し
た。検死のために準備した組織を４％パラホルムアルデ
ヒド中に固定しパラフィン中に包埋した。選択した物質
をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、顕微鏡で分析
を行った。
った後、プラスミド配列から分離し、アガロースゲル電
気泳動を行い、及びＴＡＥ（０.0４Ｍトリスアセテート
〔ｐＨ８.4〕、０.0０１ＭＥＤＴＡ）バッファーに溶出
した。ＤＮＡをlow ＴＥ（１０ｍＭトリス〔ｐＨ７.
5〕、０.5ｍＭＥＤＴＡ）に再懸濁し（１０μｇ／ｍ
ｌ）、予備洗浄した０.2２μｍの孔サイズのアクロディ
スク（acrodisk)(Gelman Sciences)を通して濾過を行っ
た。（Ｃ３Ｈ×Ｃ５７ＢＬ／６）Ｆマウスからの受精し
た卵母細胞を前核注入に使用した。胚を一晩培養し、偽
妊娠のＣ５７ＢＬ／６雌の輸卵管に導入した。テイルＤ
ＮＡを放射線ラベル化したＤＮＡプローブとハイブリダ
イゼーションを行った後遺伝子導入マウスを個体識別し
た。検死のために準備した組織を４％パラホルムアルデ
ヒド中に固定しパラフィン中に包埋した。選択した物質
をヘマトキシリン及びエオシンで染色し、顕微鏡で分析
を行った。
【００２３】ヒトＯＳＭは、培養細胞における生物学的
な反応の範囲を調節するが、そのインビボにおける効果
はほとんど知られていない。従って、遺伝子導入マウス
におけるｂＯＳＭの発現を標的とするように一連の実験
が計画された。表１（下記）には、ｂＯＳＭ遺伝子を調
節するのに使用した様々な組織−特異的プロモーター及
びそれらにより得られた遺伝子導入マウスの頻度及び他
の関係しない導入遺伝子が挙げられている。
な反応の範囲を調節するが、そのインビボにおける効果
はほとんど知られていない。従って、遺伝子導入マウス
におけるｂＯＳＭの発現を標的とするように一連の実験
が計画された。表１（下記）には、ｂＯＳＭ遺伝子を調
節するのに使用した様々な組織−特異的プロモーター及
びそれらにより得られた遺伝子導入マウスの頻度及び他
の関係しない導入遺伝子が挙げられている。
【００２４】
【表１】 表１ 遺伝子導入マウスにおけるｂＯＳＭの標的発現プロモーター 組織 遺伝子 a b c Ｍｔ−１ 汎存種 オステオグリシン 51 12 23.5 エピセリン 41 8 18.1 ｂＯＳＭ 116 1 0.8 ケラチン-14 基底細胞 Ｈ３ 93 13 17.3 エピセリア アンフィレギュリン 75 9 9.6 ｂＯＳＭ 136 0 0 ＲＩβ ニューロン ＲＩβ−ＬａｃＺ 50 10 20.0 219 16 7.3 インシュリン-1 β細胞 ＮＧＦ* 47 8 17.0 ｂＯＳＭ 73 3 4.1Ｌｃｋ 胸腺細胞 ｂＯＳＭ 55 2 3.6 a; 産生数 b;形質転換された子の数 c;形質転換された子の割合(%) * ＮＧＦ 神経成長因子
【００２５】ｂＯＳＭに反応する器官系列を認識するた
めの最初の試験は、多数の組織において転写を行うメタ
ロチオネインプロモーターを使用した。このプロモータ
ーにより得られたｂＯＳＭ遺伝子導入マウスの頻度（fr
equency)は、ステオグリシンまたはエピセリン遺伝子を
使用して得られた頻度と比較して有意に減少し、これは
複数の器官におけるｂＯＳＭの発現は、マウスの発育に
おいて有害であることを示している。この議論は、Ｍｔ
ｂＯＳＭのモザイクである一種類の遺伝子導入動物（Ｔ
Ｇ９４３）により示される表現型により強力に支持され
る。すなわち、該導入遺伝子はサザン分析によって決定
されたように無傷であったが、そのマウスは細胞当たり
一つより少ない導入遺伝子のコピーを含有していた。こ
のマウスは慢性的な震えを示し、非常に巨大化した後脚
を有していた。このオスの動物を飼育する試みは失敗し
た。検死後、このマウスは精子形成が欠損していること
が判明した。精巣管には成熟精子は全く見られず、ま
た、細精管における精母細胞の発達が無いことも明らか
であった。管の末梢につながる精原細胞が欠損してい
た。ＴＧ９４３の巨大化した後脚は大腿骨及び指節骨の
過剰な成長の結果であった。骨髄腔は、未成熟骨及び骨
膜骨の付着物で満たされていた。関連実験から、大腿の
成長プレートが破壊され、機能しなかったことが判明し
た。ハーバース系は存在するが最小限であり、例え存在
したとしても、この新しい骨においてはほとんど再編成
が起こらない。
めの最初の試験は、多数の組織において転写を行うメタ
ロチオネインプロモーターを使用した。このプロモータ
ーにより得られたｂＯＳＭ遺伝子導入マウスの頻度（fr
equency)は、ステオグリシンまたはエピセリン遺伝子を
使用して得られた頻度と比較して有意に減少し、これは
複数の器官におけるｂＯＳＭの発現は、マウスの発育に
おいて有害であることを示している。この議論は、Ｍｔ
ｂＯＳＭのモザイクである一種類の遺伝子導入動物（Ｔ
Ｇ９４３）により示される表現型により強力に支持され
る。すなわち、該導入遺伝子はサザン分析によって決定
されたように無傷であったが、そのマウスは細胞当たり
一つより少ない導入遺伝子のコピーを含有していた。こ
のマウスは慢性的な震えを示し、非常に巨大化した後脚
を有していた。このオスの動物を飼育する試みは失敗し
た。検死後、このマウスは精子形成が欠損していること
が判明した。精巣管には成熟精子は全く見られず、ま
た、細精管における精母細胞の発達が無いことも明らか
であった。管の末梢につながる精原細胞が欠損してい
た。ＴＧ９４３の巨大化した後脚は大腿骨及び指節骨の
過剰な成長の結果であった。骨髄腔は、未成熟骨及び骨
膜骨の付着物で満たされていた。関連実験から、大腿の
成長プレートが破壊され、機能しなかったことが判明し
た。ハーバース系は存在するが最小限であり、例え存在
したとしても、この新しい骨においてはほとんど再編成
が起こらない。
【００２６】ＯＳＭはＡＩＤＳ−関連カポシ肉腫細胞
の、活性なマイトジェンであるため、ケラチン−１４
（Ｋ１４）プロモーターを、重層上皮の基底層において
ｂＯＳＭを発現するマウスを誘導するために使用した。
このプロモーター及び非関連遺伝子βＨ３から得られた
遺伝子導入マウスの頻度は、ほとんど２０％であった。
重度の角質化の結果、上皮成長因子レセプターのリガン
ドであるマウスアンフィレグリンを発現する遺伝子導入
マウスの頻度はほぼ１０％に減少した。しかし、Ｋ１４
−ｂＯＳＭを使用した時には、遺伝子導入動物は全く得
られなかった。これは、皮膚の発育においてｂＯＳＭが
毒性であることを示している。
の、活性なマイトジェンであるため、ケラチン−１４
（Ｋ１４）プロモーターを、重層上皮の基底層において
ｂＯＳＭを発現するマウスを誘導するために使用した。
このプロモーター及び非関連遺伝子βＨ３から得られた
遺伝子導入マウスの頻度は、ほとんど２０％であった。
重度の角質化の結果、上皮成長因子レセプターのリガン
ドであるマウスアンフィレグリンを発現する遺伝子導入
マウスの頻度はほぼ１０％に減少した。しかし、Ｋ１４
−ｂＯＳＭを使用した時には、遺伝子導入動物は全く得
られなかった。これは、皮膚の発育においてｂＯＳＭが
毒性であることを示している。
【００２７】ＬＩＦ及びＣＮＴＦと共に、ＯＳＭは神経
芽細胞において、神経ペプチド遺伝子を誘導する。ｂＯ
ＳＭのインビボにおける神経細胞に対する活性効果を試
験するために、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼのＲ
Ｉβサブユニット遺伝子のプロモーターにより、ニュー
ロン特異的遺伝子を脳、脊髄及び末梢神経節内で発現さ
せる。遺伝子導入ｂＯＳＭ頻度（７.3％）は通常に比べ
ほぼ３分の１であった。５匹の、同腹子と比較して全て
成長阻害である動物は、運動失調による重度の震えを示
した。これらの動物は後脚から始まって進行的に衰弱
し、６〜８週間以内に死亡した。残りの４匹の動物は、
表現型及び導入遺伝子発現が全くなかった。これらの結
果は、ニューロンにおけるｂＯＳＭの発現は障害を受け
ていることを示しているが、このプロモーターを用いて
生育可能なマウス系を確立することが不可能であったた
め、神経におけるｂＯＳＭの活性の分析を妨げた。
芽細胞において、神経ペプチド遺伝子を誘導する。ｂＯ
ＳＭのインビボにおける神経細胞に対する活性効果を試
験するために、ｃＡＭＰ依存性プロテインキナーゼのＲ
Ｉβサブユニット遺伝子のプロモーターにより、ニュー
ロン特異的遺伝子を脳、脊髄及び末梢神経節内で発現さ
せる。遺伝子導入ｂＯＳＭ頻度（７.3％）は通常に比べ
ほぼ３分の１であった。５匹の、同腹子と比較して全て
成長阻害である動物は、運動失調による重度の震えを示
した。これらの動物は後脚から始まって進行的に衰弱
し、６〜８週間以内に死亡した。残りの４匹の動物は、
表現型及び導入遺伝子発現が全くなかった。これらの結
果は、ニューロンにおけるｂＯＳＭの発現は障害を受け
ていることを示しているが、このプロモーターを用いて
生育可能なマウス系を確立することが不可能であったた
め、神経におけるｂＯＳＭの活性の分析を妨げた。
【００２８】ラットインスリン−１プロモーターにより
得られたｂＯＳＭ遺伝子導入マウスの頻度もまた有意に
減少した。膵島細胞におけるｂＯＳＭのｍＲＮＡの一定
した発現を示すこの構成を有する動物系は確立された。
これらのマウスは膵島及び血管の周囲における塊状基底
細胞の増殖を示した。この繊維症は、腺房萎縮及び水腫
を伴った。ほとんどの膵島は基底において正常であった
が、幾つかは、リンパ球の大きなカフにさらされてい
た。これらのマウスにおいて高血糖は観察さなかった
が、これは、膵島機能が障害を受けなかったことを示し
ている。恐らく血清におけるｂＯＳＭの蓄積のため、多
くのＩｎｓｂＯＳＭ動物の骨髄腔中で多数の巨核球が１
０倍より多く増加したことが見いだされた。この結果
は、ＯＳＭがインビトロにおいて巨核球コロニーの形成
を、また、インビボにおいて血小板の産生を刺激すると
いう結果と一致する（Vassar et al., 同上) 。
得られたｂＯＳＭ遺伝子導入マウスの頻度もまた有意に
減少した。膵島細胞におけるｂＯＳＭのｍＲＮＡの一定
した発現を示すこの構成を有する動物系は確立された。
これらのマウスは膵島及び血管の周囲における塊状基底
細胞の増殖を示した。この繊維症は、腺房萎縮及び水腫
を伴った。ほとんどの膵島は基底において正常であった
が、幾つかは、リンパ球の大きなカフにさらされてい
た。これらのマウスにおいて高血糖は観察さなかった
が、これは、膵島機能が障害を受けなかったことを示し
ている。恐らく血清におけるｂＯＳＭの蓄積のため、多
くのＩｎｓｂＯＳＭ動物の骨髄腔中で多数の巨核球が１
０倍より多く増加したことが見いだされた。この結果
は、ＯＳＭがインビトロにおいて巨核球コロニーの形成
を、また、インビボにおいて血小板の産生を刺激すると
いう結果と一致する（Vassar et al., 同上) 。
【００２９】最後に、基部ｌｃｋプロモーターを使用し
て胸腺での発現を標的としてＴ細胞の発生に影響を及ぼ
すかどうかｂＯＳＭの試験を行った。ＬｃｋｂＯＳＭ系
列の動物は、致死性の自己免疫表現型及びリンパ組織の
発達においてに有意の変化を獲得した。例えば、胸腺の
構築は妨害され、及び皮質及び延髄領域の分画は欠失し
た。皮質、ＣＤ４+ ＣＤ８+ 胸腺細胞内で通常見いださ
れる多くの細胞型は、明らかに十分に表されていず、及
びこれらの領域はＢリンパ球を含有する小胞に代わっ
た。巨脾腫の存在に加えて、ほとんどのＣＤ４+ ＣＤ８
+ “胸腺細胞”のリンパ増殖のため、結節は増大した。
このように、これらの動物において、第一（胸腺）及び
第二（結節）のリンパ組織の正常な分離が失われ、これ
は自己免疫表現型に関係しているであろう。
て胸腺での発現を標的としてＴ細胞の発生に影響を及ぼ
すかどうかｂＯＳＭの試験を行った。ＬｃｋｂＯＳＭ系
列の動物は、致死性の自己免疫表現型及びリンパ組織の
発達においてに有意の変化を獲得した。例えば、胸腺の
構築は妨害され、及び皮質及び延髄領域の分画は欠失し
た。皮質、ＣＤ４+ ＣＤ８+ 胸腺細胞内で通常見いださ
れる多くの細胞型は、明らかに十分に表されていず、及
びこれらの領域はＢリンパ球を含有する小胞に代わっ
た。巨脾腫の存在に加えて、ほとんどのＣＤ４+ ＣＤ８
+ “胸腺細胞”のリンパ増殖のため、結節は増大した。
このように、これらの動物において、第一（胸腺）及び
第二（結節）のリンパ組織の正常な分離が失われ、これ
は自己免疫表現型に関係しているであろう。
【００３０】実施例IV この実施例は、基部Ｌｃｋプロモーターの制御下にある
ヒト及びウシオンコスタチンＭを発現する遺伝子導入マ
ウスのリンパ組織の発生及び同定を述べている。遺伝子
導入マウスは実施例III で述べた方法により作成した。
（Ｃ３Ｈ×Ｃ５７Ｂ１／６）Ｆ1 マウスからの受精卵母
細胞を、前核注入に使用した。胚を一晩培養し、偽妊娠
のＣ５７ＢＬ／６雌の輸卵管に導入した。テイルＤＮＡ
を放射線ラベル化したＤＮＡプローブとハイブリダイゼ
ーションを行った後遺伝子導入マウスを個体識別した。
ヒト及びウシオンコスタチンＭを発現する遺伝子導入マ
ウスのリンパ組織の発生及び同定を述べている。遺伝子
導入マウスは実施例III で述べた方法により作成した。
（Ｃ３Ｈ×Ｃ５７Ｂ１／６）Ｆ1 マウスからの受精卵母
細胞を、前核注入に使用した。胚を一晩培養し、偽妊娠
のＣ５７ＢＬ／６雌の輸卵管に導入した。テイルＤＮＡ
を放射線ラベル化したＤＮＡプローブとハイブリダイゼ
ーションを行った後遺伝子導入マウスを個体識別した。
【００３１】オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）のＬｃｋｂＯ
ＳＭ遺伝子導入マウスにおける発現は、胸腺、脾臓及び
末端結節を含むリンパ組織のサイズ及び重量において劇
的な増加を起こした。遺伝子導入リンパ節の細胞充実性
は、コントロール細胞と比較して５０倍も増加すること
が見いだされた。脾臓及び胸腺の細胞充実性はリンパ増
殖のために増加した。しかし、遺伝子導入動物の巨脾腫
はリンパ増殖によるものではない。それよりも、この結
果は、他のリンパ組織と同様に脾臓においてミエロイド
及びエリスロイド幹細胞の数が増加したことを示してい
る。脾臓及び腸間膜節に対して、遺伝子導入胸腺の細胞
充実性は非遺伝子導入コントロールと比較して減少し
た。胸腺、脾臓及びリンパ節に存在する様々な細胞型
は、ＦＡＣＳ分析及び非遺伝子導入マウスとの比較から
決定した。図１１に示されているように、コントロール
の胸腺に対して、ＣＤ４+ ＣＤ８+ （ＤＰ）胸腺細胞
は、生後１０週のマウスにおいて検出不可能であった。
さらに、“成熟”Ｔ細胞の蓄積は、高レベルのＣＤ３を
示す細胞の増加を証拠として、検出された（図１２）。
このように、遺伝子導入胸腺は、骨髄及び第二のリンパ
組織の混合表現型を獲得した。ＬｃｋｂＯＳＭ遺伝子導
入に対して、自己免疫性は再構築マウスにおいて欠損ま
たは有意に減少した。
ＳＭ遺伝子導入マウスにおける発現は、胸腺、脾臓及び
末端結節を含むリンパ組織のサイズ及び重量において劇
的な増加を起こした。遺伝子導入リンパ節の細胞充実性
は、コントロール細胞と比較して５０倍も増加すること
が見いだされた。脾臓及び胸腺の細胞充実性はリンパ増
殖のために増加した。しかし、遺伝子導入動物の巨脾腫
はリンパ増殖によるものではない。それよりも、この結
果は、他のリンパ組織と同様に脾臓においてミエロイド
及びエリスロイド幹細胞の数が増加したことを示してい
る。脾臓及び腸間膜節に対して、遺伝子導入胸腺の細胞
充実性は非遺伝子導入コントロールと比較して減少し
た。胸腺、脾臓及びリンパ節に存在する様々な細胞型
は、ＦＡＣＳ分析及び非遺伝子導入マウスとの比較から
決定した。図１１に示されているように、コントロール
の胸腺に対して、ＣＤ４+ ＣＤ８+ （ＤＰ）胸腺細胞
は、生後１０週のマウスにおいて検出不可能であった。
さらに、“成熟”Ｔ細胞の蓄積は、高レベルのＣＤ３を
示す細胞の増加を証拠として、検出された（図１２）。
このように、遺伝子導入胸腺は、骨髄及び第二のリンパ
組織の混合表現型を獲得した。ＬｃｋｂＯＳＭ遺伝子導
入に対して、自己免疫性は再構築マウスにおいて欠損ま
たは有意に減少した。
【００３２】遺伝子導入リンパ節の細胞充実性が大きく
増加するのに対して、これらの組織におけるＴ−及びＢ
−細胞の比は、ほぼ正常であることが見いだされ、これ
はオンコスタチンＭがこれらの両細胞型に対してリンパ
球活性を有していたことを示している。しかし、遺伝子
導入結節における大多数の細胞は、ＣＤ４+ ＣＤ８
+（ＤＰ）胸腺細胞（例として、ＨＳＡ+ 、ＣＤ
３dull、ＭＨＣＩdull）と似ていた。図１３に示される
ように、これらの細胞は、最初に生後１０日後に現れ、
１０週間後細胞内で頻度が６０％近くにまで増加し、３
０週間までに徐々に消失した。“成熟”Ｔ細胞の付随し
た増加も見られた（図１４）。このように、結節はＴ細
胞リンパ球生成に対して許容となった。結局、Ｌｃｋｂ
ＯＳＭマウスは、増加したＴ−及びＢ−細胞リンパ球生
成を示し、その立地は異常であった。追加データは、Ｏ
ＳＭが他の造血系列内で幹細胞の増殖を刺激したことを
示した。末端節のＤＰ細胞及びＢ−細胞における劇的な
増加は、ＯＳＭがオートクライン（autocrine)成長因子
として作用することを示している。
増加するのに対して、これらの組織におけるＴ−及びＢ
−細胞の比は、ほぼ正常であることが見いだされ、これ
はオンコスタチンＭがこれらの両細胞型に対してリンパ
球活性を有していたことを示している。しかし、遺伝子
導入結節における大多数の細胞は、ＣＤ４+ ＣＤ８
+（ＤＰ）胸腺細胞（例として、ＨＳＡ+ 、ＣＤ
３dull、ＭＨＣＩdull）と似ていた。図１３に示される
ように、これらの細胞は、最初に生後１０日後に現れ、
１０週間後細胞内で頻度が６０％近くにまで増加し、３
０週間までに徐々に消失した。“成熟”Ｔ細胞の付随し
た増加も見られた（図１４）。このように、結節はＴ細
胞リンパ球生成に対して許容となった。結局、Ｌｃｋｂ
ＯＳＭマウスは、増加したＴ−及びＢ−細胞リンパ球生
成を示し、その立地は異常であった。追加データは、Ｏ
ＳＭが他の造血系列内で幹細胞の増殖を刺激したことを
示した。末端節のＤＰ細胞及びＢ−細胞における劇的な
増加は、ＯＳＭがオートクライン（autocrine)成長因子
として作用することを示している。
【００３３】実施例Ｖ この実施例は、胸腺節の由来の同定及び遺伝子導入骨髄
が宿主リンパ球を救う能力について述べている。骨髄は
ＬｃｋｂＯＳＭマウスから分離され、及び１×１０7 骨
髄細胞を、致死的に放射腺照射した（１０００rad)正
常、胸腺切除、及び胸腺欠損のヌードマウスの尾部静脈
に注入した。表２（下記）に示されるように、ＯＳＭ骨
髄により再構築されたマウスのみが正常な胸腺の典型で
ある二重陽性細胞を含んでいた。全てのケースにおい
て、これらのＯＳＭ表現型は、胸腺を有するかどうか、
胸腺切除されたものかどうか、或いは胸腺欠損であるか
どうかに関わらず、マウスの腸間膜節内に導入された。
このように、ＯＳＭの発現は、正常な胸腺環境には無関
係に前胸腺細胞（prothymocyte) の増加及び分化を刺激
した。
が宿主リンパ球を救う能力について述べている。骨髄は
ＬｃｋｂＯＳＭマウスから分離され、及び１×１０7 骨
髄細胞を、致死的に放射腺照射した（１０００rad)正
常、胸腺切除、及び胸腺欠損のヌードマウスの尾部静脈
に注入した。表２（下記）に示されるように、ＯＳＭ骨
髄により再構築されたマウスのみが正常な胸腺の典型で
ある二重陽性細胞を含んでいた。全てのケースにおい
て、これらのＯＳＭ表現型は、胸腺を有するかどうか、
胸腺切除されたものかどうか、或いは胸腺欠損であるか
どうかに関わらず、マウスの腸間膜節内に導入された。
このように、ＯＳＭの発現は、正常な胸腺環境には無関
係に前胸腺細胞（prothymocyte) の増加及び分化を刺激
した。
【００３４】
【表２】 表２ 腸間膜節の再構築 ドナーBM 未処理 コントロール コントロール OSM OSM 未処理 コントロール OSM宿主マウス コントロール +Thy(5) -Thy(2) +Thy(4) -Thy(4) Nu(1) Nu(2) Nu(2) 比細胞数 1 0.2 0.5 9 2.6 -- -- -- 比細胞数 -- --- --- -- --- 1 3.5 17.5 ％CD+4+CD8+ <1.0 <1.0 <1.0 42 35 <1.0 <1.0 59
【００３５】宿主マウスは致死性の放射線照射を受け、
示したドナー骨髄（ＢＭ）により再構築された。宿主マ
ウスは正常なＢ６／Ｃ３ＨＦ１マウス（+Thy) 、胸腺切
除したＢ６／Ｃ３ＨＦ１マウス（-Thy) 及びＢ６ヌード
マウス(Nu)を使用した。ドナー骨髄は、コントロールＢ
６マウスまたはＬｃｋｂＯＳＭマウス由来である。括弧
内の動物の数は、処置後最初の６〜７週間に調べた数で
ある。養子免疫伝達実験はまた、ＬｃｋｂＯＳＭ骨髄が
効果的に宿主リンパ球を救うことを示した。Ｂ６ドナー
はＨ２−Ｄb ハプロタイプのみを発現したのに対し、宿
主Ｂ６／Ｃ３ＨＦ1 マウスは、Ｈ２−Ｄb 及びＨ２−Ｄ
k 両方のハプロタイプを発現した。コントロール骨髄に
より再構築された大多数のマウスのリンパ球はＨ２−Ｄ
b ハプロタイプを発現した。ＯＳＭ骨髄により再構築さ
れたマウスの細胞は、Ｈ２−Ｄb 、Ｈ２−Ｄk 及び鈍ｂ
の間の混合物であり、後者はＤＰ胸腺細胞に期待される
ものである。この結果は、宿主誘導骨髄／リンパ球がＯ
ＳＭ骨髄により救済されたこと及びＯＳＭが、通常放射
腺照射により死亡する宿主細胞を救済したことを示し
た。
示したドナー骨髄（ＢＭ）により再構築された。宿主マ
ウスは正常なＢ６／Ｃ３ＨＦ１マウス（+Thy) 、胸腺切
除したＢ６／Ｃ３ＨＦ１マウス（-Thy) 及びＢ６ヌード
マウス(Nu)を使用した。ドナー骨髄は、コントロールＢ
６マウスまたはＬｃｋｂＯＳＭマウス由来である。括弧
内の動物の数は、処置後最初の６〜７週間に調べた数で
ある。養子免疫伝達実験はまた、ＬｃｋｂＯＳＭ骨髄が
効果的に宿主リンパ球を救うことを示した。Ｂ６ドナー
はＨ２−Ｄb ハプロタイプのみを発現したのに対し、宿
主Ｂ６／Ｃ３ＨＦ1 マウスは、Ｈ２−Ｄb 及びＨ２−Ｄ
k 両方のハプロタイプを発現した。コントロール骨髄に
より再構築された大多数のマウスのリンパ球はＨ２−Ｄ
b ハプロタイプを発現した。ＯＳＭ骨髄により再構築さ
れたマウスの細胞は、Ｈ２−Ｄb 、Ｈ２−Ｄk 及び鈍ｂ
の間の混合物であり、後者はＤＰ胸腺細胞に期待される
ものである。この結果は、宿主誘導骨髄／リンパ球がＯ
ＳＭ骨髄により救済されたこと及びＯＳＭが、通常放射
腺照射により死亡する宿主細胞を救済したことを示し
た。
【００３６】本願明細書に記載した全ての出版物、特許
出願及び特許は、個々の出版物または特許がここに参考
として詳細にかつ個々に記載されたように、その内容を
この明細書に引用する。明瞭な理解のために、図及び実
施例により上記の発明を詳細に述べたが、適当な変換及
び修飾は付随のクレームの観点を変えない限り行っても
よい。
出願及び特許は、個々の出版物または特許がここに参考
として詳細にかつ個々に記載されたように、その内容を
この明細書に引用する。明瞭な理解のために、図及び実
施例により上記の発明を詳細に述べたが、適当な変換及
び修飾は付随のクレームの観点を変えない限り行っても
よい。
【図１】図１は、ウシオンコスタチンＭ遺伝子を示して
おり、ウシゲノムＤＮＡ（４.7kb) の部分的制限エンド
ヌクレアーゼ地図を表している。ＲＩ、ＥｃｏＲＩ；
Ｓ、ＳｓｔＩ；Ｅ、ＥａｇＩ。
おり、ウシゲノムＤＮＡ（４.7kb) の部分的制限エンド
ヌクレアーゼ地図を表している。ＲＩ、ＥｃｏＲＩ；
Ｓ、ＳｓｔＩ；Ｅ、ＥａｇＩ。
【図２】図２は、ｂＯＳＭ遺伝子のオープンリーディン
グフレームを表している。このＤＮＡ配列は、ｂＯＳＭ
発現ベクターに含まれるエクソン／イントロンの境界及
びフランキング領域を含む。
グフレームを表している。このＤＮＡ配列は、ｂＯＳＭ
発現ベクターに含まれるエクソン／イントロンの境界及
びフランキング領域を含む。
【図３】図３は、ヒトオンコスタチンＭ（ｈＯＳＭ）タ
ンパクの構造ドメインを示している。影（灰色）部分
は、４種類の両親媒性のヘリックスの位置を示してい
る。斜線部分は、タンパク分解によりプロセシッングを
受ける前駆タンパクの部分を示している。システイン残
基と分子内のジスルフィド結合が示されている。ＡＢル
ープ及びＤ１及びＤ２領域はレセプター結合内に包含さ
れている。
ンパクの構造ドメインを示している。影（灰色）部分
は、４種類の両親媒性のヘリックスの位置を示してい
る。斜線部分は、タンパク分解によりプロセシッングを
受ける前駆タンパクの部分を示している。システイン残
基と分子内のジスルフィド結合が示されている。ＡＢル
ープ及びＤ１及びＤ２領域はレセプター結合内に包含さ
れている。
【図４】図４は、ウシＯＳＭタンパクによる、
〔 125Ｉ〕ヒトＯＳＭのＨ２９８１肺ガン細胞への結合
阻害を示している。ウシＯＳＭ発現ベクターにより形質
移入を行ったＣＯＳ細胞からの条件付けを行った媒体を
連続的に結合バッファーで希釈し、細胞と共に２０℃で
１.5時間培養を行った。細胞を次に洗浄し、〔 125Ｉ〕
ヒトＯＳＭ結合をアッセイした。
〔 125Ｉ〕ヒトＯＳＭのＨ２９８１肺ガン細胞への結合
阻害を示している。ウシＯＳＭ発現ベクターにより形質
移入を行ったＣＯＳ細胞からの条件付けを行った媒体を
連続的に結合バッファーで希釈し、細胞と共に２０℃で
１.5時間培養を行った。細胞を次に洗浄し、〔 125Ｉ〕
ヒトＯＳＭ結合をアッセイした。
【図５】図５は、ヒトＯＳＭ、サルＯＳＭ及びウシＯＳ
Ｍの前駆タンパクのベストフィット配列を示している。
ヒトの配列に対して異なるアミノ酸配列が示されてい
る。一次配列の欠損は点で示されている。二箇所の太線
は、ヒト、サル及びウシ遺伝子のイントロン／エクソン
の境界位置を示している。ジスルフィド結合に関与する
システイン残基は、黒枠内に示されている。
Ｍの前駆タンパクのベストフィット配列を示している。
ヒトの配列に対して異なるアミノ酸配列が示されてい
る。一次配列の欠損は点で示されている。二箇所の太線
は、ヒト、サル及びウシ遺伝子のイントロン／エクソン
の境界位置を示している。ジスルフィド結合に関与する
システイン残基は、黒枠内に示されている。
【図６】図６は、ウシＯＳＭによるヒトＡ３７５メラノ
ーマ細胞の増殖阻害を示している。ｐπＨ３ｂＯＳＭま
たはｐπＨ３Ｍどちらかにより形質移入を行ったＣＯＳ
細胞からの条件付けた媒体（ＣＭ）の示された容量を、
新鮮な培養媒体により最終的に２００μｌにまで希釈
し、細胞と共に７２時間培養を行った。培養物に 1 25Ｉ
−デオキシウリジンを、８時間適用し、次に、ＤＮＡへ
取り込まれた放射性核酸のアッセイを行った。
ーマ細胞の増殖阻害を示している。ｐπＨ３ｂＯＳＭま
たはｐπＨ３Ｍどちらかにより形質移入を行ったＣＯＳ
細胞からの条件付けた媒体（ＣＭ）の示された容量を、
新鮮な培養媒体により最終的に２００μｌにまで希釈
し、細胞と共に７２時間培養を行った。培養物に 1 25Ｉ
−デオキシウリジンを、８時間適用し、次に、ＤＮＡへ
取り込まれた放射性核酸のアッセイを行った。
【図７】図７は、ヒトＯＳＭプラスミドｐπＨ３ｈＯＳ
Ｍにより形質移入を行ったＣＯＳ細胞から分離された条
件付けた媒体を使用して同様の実験を行った結果を示し
ている。
Ｍにより形質移入を行ったＣＯＳ細胞から分離された条
件付けた媒体を使用して同様の実験を行った結果を示し
ている。
【図８】図８は、マウスＭ１白血病細胞増殖のウシＯＳ
Ｍによる阻害を示している。ｂＯＳＭにより形質移入を
行ったＣＯＳ細胞からの条件付けた媒体（ＣＭ）の示さ
れた容量を、新鮮な培養媒体により最終的に２００μｌ
にまで希釈し、細胞と共にミクロタイタープレート内で
培養を行った。７２時間後、培養物に〔3 Ｈ〕チミジン
を、６時間適用し、次に、ＤＮＡへ取り込まれた放射性
核酸のアッセイを行った。
Ｍによる阻害を示している。ｂＯＳＭにより形質移入を
行ったＣＯＳ細胞からの条件付けた媒体（ＣＭ）の示さ
れた容量を、新鮮な培養媒体により最終的に２００μｌ
にまで希釈し、細胞と共にミクロタイタープレート内で
培養を行った。７２時間後、培養物に〔3 Ｈ〕チミジン
を、６時間適用し、次に、ＤＮＡへ取り込まれた放射性
核酸のアッセイを行った。
【図９】図９は、純粋な組み換えヒトＯＳＭタンパクに
より上記と同じ操作を繰り返した結果を示している。
より上記と同じ操作を繰り返した結果を示している。
【図１０】図１０はＬｃｋｂＯＳＭ遺伝子導入マウスの
リンパ組織における湿潤重量及び細胞数の変化を示して
いる。黒丸は、非遺伝子導入動物の胸腺、脾臓及び腸間
膜節の重さと年齢の関係を表している。白い四角形は、
ＬｃｋｂＯＳＭマウスに相当する。黒色の棒線及び白色
棒線は、それぞれコントロール及び遺伝子導入マウスを
表している。
リンパ組織における湿潤重量及び細胞数の変化を示して
いる。黒丸は、非遺伝子導入動物の胸腺、脾臓及び腸間
膜節の重さと年齢の関係を表している。白い四角形は、
ＬｃｋｂＯＳＭマウスに相当する。黒色の棒線及び白色
棒線は、それぞれコントロール及び遺伝子導入マウスを
表している。
【図１１】図１１は、ＬｃｋｂＯＳＭ遺伝子導入マウス
の胸腺におけるリンパ球増殖の年齢による変化を示して
いる。ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ“胸腺細胞”の頻度；黒丸
は、非遺伝子導入を、また、白い四角形はＬｃｋｂＯＳ
Ｍ遺伝子導入マウスを表している。
の胸腺におけるリンパ球増殖の年齢による変化を示して
いる。ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ“胸腺細胞”の頻度；黒丸
は、非遺伝子導入を、また、白い四角形はＬｃｋｂＯＳ
Ｍ遺伝子導入マウスを表している。
【図１２】図１２は、ＬｃｋｂＯＳＭ遺伝子導入マウス
の胸腺におけるリンパ球増殖の年齢による変化を示して
いる。ＣＤ３hi染色により測定した成熟Ｔ細胞の頻度；
黒丸は、非遺伝子導入を、また、白い四角形はＬｃｋｂ
ＯＳＭ遺伝子導入マウスを表している。Ｂ細胞の頻度
は、１００％からＴ細胞のパーセントを引いて、グラフ
から外挿することにより得られる。
の胸腺におけるリンパ球増殖の年齢による変化を示して
いる。ＣＤ３hi染色により測定した成熟Ｔ細胞の頻度；
黒丸は、非遺伝子導入を、また、白い四角形はＬｃｋｂ
ＯＳＭ遺伝子導入マウスを表している。Ｂ細胞の頻度
は、１００％からＴ細胞のパーセントを引いて、グラフ
から外挿することにより得られる。
【図１３】図１３は、ＬｃｋｂＯＳＭ遺伝子導入マウス
の腸間膜節におけるリンパ球の増殖の年齢による変化を
示している。ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ“胸腺細胞”の頻
度；黒丸は、非遺伝子導入を、また、白い四角形はＬｃ
ｋｂＯＳＭ遺伝子導入マウスを表している。
の腸間膜節におけるリンパ球の増殖の年齢による変化を
示している。ＣＤ４＋ＣＤ８＋ＤＰ“胸腺細胞”の頻
度；黒丸は、非遺伝子導入を、また、白い四角形はＬｃ
ｋｂＯＳＭ遺伝子導入マウスを表している。
【図１４】図１４は、ＬｃｋｂＯＳＭ遺伝子導入マウス
の腸間膜節におけるリンパ球の増殖の年齢による変化を
示している。ＣＤ３hi染色により測定した成熟Ｔ細胞の
頻度；黒丸は、非遺伝子導入を、また、白い四角形はＬ
ｃｋｂＯＳＭ遺伝子導入マウスを表している。Ｂ細胞の
頻度は、１００％からＴ細胞のパーセントを引いて、グ
ラフから外挿することにより得られる。
の腸間膜節におけるリンパ球の増殖の年齢による変化を
示している。ＣＤ３hi染色により測定した成熟Ｔ細胞の
頻度；黒丸は、非遺伝子導入を、また、白い四角形はＬ
ｃｋｂＯＳＭ遺伝子導入マウスを表している。Ｂ細胞の
頻度は、１００％からＴ細胞のパーセントを引いて、グ
ラフから外挿することにより得られる。
フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (16)
- 【請求項１】 哺乳類の造血幹細胞の増殖及び分化を誘
導する方法であって：該幹細胞をオンコスタチンＭをコ
ードする遺伝子を含むベクターで形質移入し；有効量の
オンコスタチンＭを産生する該遺伝子を発現し；及び該
幹細胞を造血増殖及び分化を支持する培体中で生育する
ことを含む方法。 - 【請求項２】 該細胞が組織適合性哺乳類宿主内で生育
することを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項３】 該ベクターがレトロウィルスベクターで
あることを特徴とする請求項１記載の方法。 - 【請求項４】 該遺伝子が構成物または組織特異性プロ
モーターの制御下にあることを特徴とする請求項１記載
の方法。 - 【請求項５】 該プロモーターが基部Ｌｃｋプロモータ
ーであることを特徴とする請求項４記載の方法。 - 【請求項６】 該幹細胞が骨髄内で生育することを特徴
とする請求項５記載の組成物。 - 【請求項７】 該幹細胞がさらに再配列したＴ細胞レセ
プターまたはイムノグロブリンを発現するベクターを含
むことを特徴とする請求項６記載の方法。 - 【請求項８】 該幹細胞が生体外で生育することを特徴
とする請求項１記載の方法。 - 【請求項９】 該細胞を生体外で生育せしめた後、哺乳
類宿主に移植することを特徴とする請求項８記載の方
法。 - 【請求項１０】 該宿主が胸腺除去されるかまたは先天
性胸腺欠損であることを特徴とする請求項２記載の方
法。 - 【請求項１１】 リンパ球の生存を延長する方法であっ
て：造血幹細胞をオンコスタチンＭをコードする遺伝子
を含むベクターで形質移入し；及び哺乳類に造血を誘導
する遺伝子を発現し、その発現により該哺乳類における
該リンパ球の細胞毒性物質に対する生存を延長すること
を含む方法。 - 【請求項１２】 宿主が放射線を受け、造血システムを
除去されたものであることを特徴とする請求項１１記載
の方法。 - 【請求項１３】 該細胞毒性物質が化学療法剤または放
射線であることを特徴とする請求項１１記載の方法。 - 【請求項１４】 該化学療法剤がマイトマイシンＣであ
ることを特徴とする請求項１３記載の方法。 - 【請求項１５】 該リンパ球が該形質移入された幹細胞
から誘導されたものであることを特徴とする請求項１１
記載の方法。 - 【請求項１６】 該リンパ球が該哺乳類の非形質移入リ
ンパ球であることを特徴とする請求項１１記載の方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US47302695A | 1995-06-06 | 1995-06-06 | |
| US08/473026 | 1995-06-06 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09117288A true JPH09117288A (ja) | 1997-05-06 |
Family
ID=23877884
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP8179739A Pending JPH09117288A (ja) | 1995-06-06 | 1996-06-05 | オンコスタチンｍ誘導造血 |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0748870A3 (ja) |
| JP (1) | JPH09117288A (ja) |
| CA (1) | CA2178256A1 (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017079611A (ja) * | 2015-10-23 | 2017-05-18 | 学校法人北里研究所 | 大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物及びその利用 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9806530D0 (en) | 1998-03-26 | 1998-05-27 | Glaxo Group Ltd | Inflammatory mediator |
| EP1619242A4 (en) * | 2003-03-25 | 2006-09-06 | Japan Science & Tech Agency | CONTROL OF INDUCTION OF DIFFERENTIATION OF STEM CELLS AND DIFFERENTIATION CAPACITY |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6463395A (en) * | 1987-05-04 | 1989-03-09 | Oncogen | Oncostatin m and novel composition having antitumor activity |
| US5814307A (en) * | 1989-04-10 | 1998-09-29 | Bristol-Myers Squibb Company | Method for regulating cell growth, leukocyte differentiation and tumor cell growth using Oncostatin M to stimulate synthesis of IL-6 |
| IL96593A0 (en) * | 1989-12-08 | 1991-09-16 | Oncogen | Novel proteins with oncostatin m activity and process for their preparation |
-
1996
- 1996-06-05 CA CA002178256A patent/CA2178256A1/en not_active Abandoned
- 1996-06-05 JP JP8179739A patent/JPH09117288A/ja active Pending
- 1996-06-05 EP EP96109045A patent/EP0748870A3/en not_active Withdrawn
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017079611A (ja) * | 2015-10-23 | 2017-05-18 | 学校法人北里研究所 | 大腸炎又は大腸癌モデル非ヒト動物及びその利用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0748870A3 (en) | 1997-03-26 |
| EP0748870A2 (en) | 1996-12-18 |
| CA2178256A1 (en) | 1996-12-07 |
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