JPH06133793A

JPH06133793A - ミュレル管抑制物質様ポリペプチドおよびその製造方法

Info

Publication number: JPH06133793A
Application number: JP5178268A
Authority: JP
Inventors: Richard L Cate; エルケイトリチャード; Patricia K Donahoe; ケイドナヒューパトリシア
Original assignee: Biogen NV; General Hospital Corp; Biogen Inc
Current assignee: Biogen NV; General Hospital Corp; Biogen Inc
Priority date: 1985-10-30
Filing date: 1993-07-19
Publication date: 1994-05-17
Anticipated expiration: 2011-10-09
Also published as: EP0221761B1; ATE119915T1; JPS62190084A; AU606584B2; DE3650266T2; IL80451A0; EP0221761A2; CA1307753C; DE3650266D1; KR870004143A; DK517986A; PT83655B; JP2541761B2; AU6452186A; EP0221761A3; JPH0720431B2; PT83655A; US5047336A; ZA868251B; HUT43627A

Abstract

(57)【要約】【目的】少なくとも１種のミュレル管抑制物質（ＭＩ
Ｓ）様ポリペプチドおよびその製造方法を得る。【構成】ＤＮＡ配列の分離およびクローン化におい
て、ウシＭＩＳ蛋白に基づく選択手段を採用した。従っ
て、ウシ睾丸からウシＭＩＳ蛋白質を精製し、かつこの
蛋白の各種断片のアミノ酸配列を決定した。これら蛋白
はいれつに基づき、次いで最小のヌクレオチド縮退を有
する精製ウシ蛋白の領域に対応する数種の反対方向のオ
リゴヌクレオチドＤＮＡを合成した。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ＤＮＡ配列、組換ＤＮ
Ａ分子およびミュレル管抑制物質（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ
ＩｎｈｉｂｉｔｉｎｇＳｕｂｓｔａｎｃｅ）（ＭＩ
Ｓ）−様ポリペプチドの製造方法に関するものである。
さらに詳細には、本発明は、少なくとも１種のＭＩＳ−
様ポリペプチドをコードすることを特徴とするＤＮＡ配
列および組換ＤＮＡ分子に関するものである。したがっ
て、これら配列により形質転換された宿主を本発明の方
法に使用して、本発明のＭＩＳ−様ポリペプチドを産生
させることができる。これらのポリペプチドは抗腫瘍活
性を有すると共に、特に女性生殖系の癌（たとえば卵巣
癌）のような癌を処置するのに有用である。

【０００２】

【従来の技術とその問題点】分化直後の男性生殖腺によ
る少なくとも２種の睾丸因子の生成は、ジョストの兎去
勢実験により正常な雄生殖発育にとって必要であること
が最初に示された［Ｃ．Ｒ．Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ、第１４
０巻、第４６３〜４６４頁（１９４６）およびＣ．Ｒ．
Ｓｏｃ．Ｂｉｏｌ、第１４１巻、第１３５〜１３６頁
（１９４７）］。１つの因子であるテストステロンは、
ウオルフ氏管からの副睾丸、輸精管および貯精嚢の分化
に寄与することが示されている。しかしながら、第２の
因子である非ステロイド系因子が存在してミュレル管
（すなわち雄生殖系の原基）の退行を刺激しなければ、
雄の男性化は完全でなかった。ジョストは、この第２の
調整因子をミュレル管抑制物質（ＭＩＳ）と名付けた
［Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇ．ＨｏｒｍＲｅｓ、第８巻、第３
７９〜４１８頁（１９５３）］。ＭＩＳを精製する関心
が高まったのは、ウシＭＩＳが発育におけるその重要な
役割に加えてヒト卵巣腫瘍細胞ラインＨＯＣ−２１に対
しインビトロにて細胞毒性である［ドナホーエ等、サイ
エンス、第２０５巻、第９１３〜９１５頁（１９７９）
およびフラー等、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏ
ｌ．Ｍｅｔａｂ、第５４巻、第１０５１〜１０５５頁
（１９８２）］と共に裸ネズミモデルにてインビボでも
細胞毒性である［ドナホーエ等、Ａｎｎ．Ｓｕｒｇ、第
１９４巻、第４７２〜４８０頁（１９８１）］ことが判
明したからである。高度に精製したウシＭＩＳのフラク
ションは、患者に由来する主として卵巣および子宮癌の
コロニー成長をも抑制する［フラー等、Ｇｙｎ．Ｏｎｃ
ｏｌ、（１９８５）］。

【０００３】ＭＩＳの精製を試みて種々の方法が使用さ
れている［たとえばジョッソ等、Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇ．Ｈ
ｏｍ．Ｒｅｓ、第３３巻、第１１７〜１６７頁（１９７
７）およびドナホーエ等、Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇ．Ｈｏｍ．
Ｒｅｓ、第３８巻、第２７９〜３３０頁（１９８２）参
照］。ウシ新生児の睾丸は誕生後８週間まで高レベルの
ＭＩＳを含有し［ドナホーエ等、Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏ
ｄ、第１６巻、第２３８〜２４３頁（１９７７）］、生
化学的精製に利用しうる組織源を供給する。ドナホーエ
および共同研究者等は、プロテアーゼ阻止剤の存在下で
グアニジン塩酸塩と共に培養することにより、ウシ睾丸
の活性かつ粗製のＭＩＳ調製物を初めて得た［スワン
等、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ、第６９巻、第７３〜８４頁（１
９７９）］。イオン交換またはゲル濾過クロマトグラフ
ィーによるその後の分画は純度を約３倍高めた。胎児ウ
シ睾丸からの培養培地を用いた他の研究により、同様な
結果が得られた［ピカード等、バイオメジスン、第２５
巻、第１４７〜１５０頁（１９７６）およびジョッソ
等、Ｒｅｃ．Ｐｒｏｇ．Ｈｏｍ．Ｒｅｓ、第３３巻、第
１１７〜１６７頁（１９７７）］。順次のイオン交換ク
ロマトグラフィーを順次のレクチン親和性クロマトグラ
フィーと組合せることにより、ウシＭＩＳの純度がさら
に高められた［ブジク等、セル、第２１巻、第９０９〜
９１５頁（１９８０）；米国特許第４，４０４，１８８
号；および米国特許第４，５１０，１３１号］。ブジク
等（上記）の結果は、ウシＭＩＳが高分子量のグリコ蛋
白であって、半精製したＭＩＳフラクションを与え、こ
れを用いて抗−ＭＩＳモノクローナル抗体を作成したこ
とを示唆している［ムジェット−ハンター等、ジャーナ
ル・イミュノロジー、第１２８巻、第１３２７〜１３３
３頁（１９８２）；シマ等、ハイブリドーマ、第３巻、
第２０１〜２１４頁（１９８４）；および米国特許第
４，４８７，８３３号］。自然条件下でのゲル濾過によ
り分画したレクチン親和性精製したウシＭＩＳは約２０
０，０００ダルトンに単一のピークを示したが、ポリア
クリルアミドゲルでの変性に際しこのフラクションは複
数成分を含有して、複数サブ単位構造を示唆した［ブジ
ク等、セル、第２１巻、第９０９〜９１５頁（１９８
０）］。

【０００４】その後、マトリックス・ゲル・グリーンＡ
を用いて２０００倍以上のウシＭＩＳ精製を達成すると
共に、出発時の活性の６０％回収を得た。これは透析可
能な保護剤である２−メルカプトエタノールとＥＤＴＡ
とノニデット−Ｐ４０（ＮＰ４０）とでＭＩＳ活性を安
定化させることにより達成された。ＳＤＳ−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動による２０００倍精製ＭＩＳフラ
クションの分析は、多数の成分が検出されたが、１４
０，０００ダルトンにて移動する１種のみの成分が減成
に対し感受性であることを示した。電気泳動前の試料の
減成は１４０，０００ダルトンの喪失と同時に７４，０
００ダルトンの新たなバンドを示したのに対し、このフ
ラクションにおける他の全成分の移動は効果上未変化で
あった［ブジク等、セル、第３４巻、第３０７〜３１４
頁（１９８３）］。このことは、ウシＭＩＳが１２４，
０００ダルトンの総分子量を有するジスルフィド結合サ
ブ単位の二量体であるという示唆と一致する［ピカード
等、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｅｎｄｏｃｒｉｎｏｌ、第１２
巻、第１７〜３０頁（１９７８）］。

【０００５】より高い純度のＭＩＳが腫瘍学研究のため
緊急に多量必要である。何故なら、女性生殖系の癌を処
置する現在の方法は不充分であるからである。女性生殖
系の癌は、人間における癌全体の約９％を占める。現
在、医者は、生殖系癌が早期に検出された場合（たとえ
ば卵巣癌第Ｉ−IIａ期）、手術または放射線照射を行な
う。これらの処置方法は有効ではあるが、患者を不妊症
にする。患者が手術不可能であると判定された進行癌の
場合（第III −IV期）には、化学療法が用いられる。化
学療法剤のうちシスプラチヌム．アドリアマイシンおよ
びシトキサンが最も一般的に使用される。これらの薬剤
は、シスプラチヌム含有の処方と組合せて長期間使用す
れば最も効果的であることが判明している。これらの各
薬剤は毒性が高いと思われ、その使用には患者の間欠的
入院を必要とする。

【０００６】天然の生物学的退行剤としてのＭＩＳは、
その特異性により副作用が少ないと思われる。他の潜在
的なＭＩＳの用途は、高レベルの上皮成長因子（ＥＧ
Ｆ）リセプタ（たとえば頭および首、肺、消化官上皮
系、角膜および皮膚などからのもの）による腫瘍の処置
を含有する［ハットソン等、サイエンス、第２２３巻、
第５８６〜５８９頁（１９８４）］。さらに、ＭＩＳは
生殖細胞減数分裂を抑制すると思われる。何故なら、こ
の物質はグラフ細胞の顆粒膜細胞に局在しているからで
ある。たとえば、避妊剤としてのその使用が開発されつ
つある。これら幅広い潜在的用途は、ＭＩＳの充分な供
給源を提供する重要性をさらに増大させる。

【０００７】ウシＭＩＳの精製法がドナホーエおよび共
同研究者により案出されている［ブジク等、発生メカニ
ズム：正常および異常、Ｊ．Ｗ．ラッシュ編、アラン・
Ｒ・リス・インコーポレーション、科学・医学および学
術出版、第２０７〜２３３頁（１９８５）］。規模拡大
した方法を用いて、８０％純度の蛋白約１ｍｇをウシ新
生児の睾丸１０００個から分離することができる。しか
しながら、この精製法は労力を要しかつ高価につく。特
に重大なことは、広範な腫瘍学研究に充分な原料を提供
し得ないことである。組換ＤＮＡ技術は、より大きいウ
シＭＩＳの供給源をもたらす。

【０００８】ＭＩＳに関する殆どの研究はウシＭＩＳに
ついて行われているが、ひな鳥ＭＩＳにも若干の興味が
持たれる。ケミカルウィーク（１９８５年１月３０日、
第６９頁）の論文に見られるように、Ｃ．Ｓ．テングは
ひな鳥ＭＩＳを精製しかつひな鳥の胚からＭＩＳ遺伝子
を分離した。しかしながら、それ以上の詳細は報告され
ていない。

【０００９】臨床用途には、動物源のＭＩＳよりもヒト
ＭＩＳが好ましい。しかしながら、ヒトＭＩＳは、ヒト
組織が充分量で得られないため入手するのがずっと困難
である。したがって、ヒトＭＩＳを製造する唯一の途は
組換ＤＮＡ技術である。よって、ＭＩＳ用のヒト遺伝子
を分離することが極めて重要である。

【００１０】

【発明が解決しようとする課題】本発明の目的、少なく
とも１種のＭＩＳ−様ポリペプチドをコードするＤＮＡ
配列、この種の配列を含む組換ＤＮＡ分子、この種の配
列を含む宿主、並びに前記ＤＮＡ配列により形質転換さ
れた宿主にて前記ポリペプチドを従来可能であったより
も、高純度で製造する方法を提供することにより、上記
問題を解決することにある。

【００１１】

【課題を解決するための手段】本発明のＤＮＡ配列は、
（ａ）式

【００１２】

【化１０】

【００１３】

【化１１】

【００１４】

【化１２】

【００１５】

【化１３】

【００１６】

【化１４】

【００１７】

【化１５】

【００１８】

【化１６】

【００１９】

【化１７】

【００２０】（ｂ）上記ＤＮＡ配列にハイブリッド化し
かつ発現に際しヒトＭＩＳ−様ポリペプチドまたはウシ
ＭＩＳ−様ポリペプチドをコードし、好ましくは前記Ｄ
ＮＡ配列に対し実質的な同質性程度（より好ましくは少
なくとも約７０％の同質性、特に好ましくは少なくとも
約８０％の同質性）を有するＤＮＡ配列；および（ｃ）
上記ＤＮＡ配列のいずれかにより発現に際しコードされ
たポリペプチドを発現に際しコードするＤＮＡ配列より
なる群から選択される。これらＤＮＡ配列を含む組換Ｄ
ＮＡ分子、これらにより形質転換された宿主、およびこ
れらにより発現に際しコードされるＭＩＳ−様ポリペプ
チドも本発明の一部を構成する。

【００２１】本発明のＤＮＡ配列、組換ＤＮＡ分子、宿
主および方法の発明は、卵巣癌や他の感受性癌の処置に
使用するためのＭＩＳ−様ポリペプチドの製造を可能に
する。

【００２２】さらに、本発明の範囲内には、式

【００２３】

【化１８】

【００２４】

【化１９】

【００２５】

【化２０】

【００２６】

【化２１】

【００２７】これらに関連するＭＩＳ−様ポリペプチド
よりなる群から選択されるポリペプチド、並びにこれら
ポリペプチドの１種と医薬上許容し得るキャリヤとから
なる抗癌医薬組成物および女性生殖系の癌（たとえば卵
巣癌）などの感受性癌を処置する際の前記組成物の使用
方法も包含される。

【００２８】本発明を一層充分に理解しうるよう、以下
詳細に説明する。

【００２９】以下の説明において、次の用語を使用す
る：ヌクレオチド：糖成分（ペントース）と燐酸塩と含窒素
複素環塩基とからなるＤＮＡもしくはＲＮＡの単量体単
位。塩基はグリコシド炭素（ペントースの１′炭素）を
介して糖成分に結合される。塩基と糖との結合体はヌク
レオチドと呼ばれる。各ヌクレオチドはその塩基を特徴
とする。４種のＤＮＡ塩基はアデニン（“Ａ”）、グア
ニン（“Ｇ”）、シトシン（“Ｃ”）およびチミン
（“Ｔ”）である。４種のＲＮＡ塩基はＡ、Ｇ、Ｃおよ
びウラシル（“Ｕ”）である。

【００３０】ＤＮＡ配列：隣接ペントースの３′炭素と
５′炭素との間のホスホジエステル結合により互いに結
合されたヌクレオチドの線状列。

【００３１】コドン：ｍＲＮＡを介してアミノ酸と翻訳
開始信号と翻訳終了信号とをコードする３種のヌクレオ
チド（トリプレット）のＤＮＡ配列。たとえばヌクレオ
チドトリプレットＴＴＡ、ＴＴＧ、ＣＴＴ、ＣＴＣ、Ｃ
ＴＡおよびＣＴＧはアミノ酸ロイシン（“Ｌｅｕ”）を
コードし、ＴＡＧ、ＴＡＡおよびＴＧＡは翻訳停止信号
であり、ＡＴＧは翻訳開始信号である。

【００３２】解読枠：アミノ酸配列までｍＲＮＡを翻訳
する際のコドンのグループ化。翻訳の際、適切な解読枠
を維持せねばならない。たとえば、ＤＮＡ配列ＧＣＴＧ
ＧＴＴＧＴＡＡＧは３つの解読枠（すなわち相）におい
て発現することができ、その各々は異なるアミノ酸配列ＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧ−−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｃｙｓ−ＬｙｓＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧ−−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−ＶａｌＧＣＴＧＧＴＴＧＴＡＡＧ−−Ｔｒｐ−Ｌｅｕ−（停止）を与える。

【００３３】ポリペプチド：隣接するアミノ酸のα−ア
ミノ基とカルボキシル基との間のペプチド結合により互
いに結合されたアミノ酸の線状列。

【００３４】ゲノム：細胞もしくはウイルスの全ＤＮ
Ａ。これは、特に物質のポリペプチドをコードする構造
遺伝子、ならびにオペレータ、プロモータおよびリボソ
ーム結合ならびにたとえばシャイン−ダルガーノ配列の
ような配列を含めて相互作用配列を包含する。

【００３５】遺伝子：雛型もしくはメッセンジャーＲＮ
Ａ（“ｍＲＮＡ”）を介して、特定ポリペプチドに特徴
的なアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列。

【００３６】転写：遺伝子もしくはＤＮＡ配列からｍＲ
ＮＡを生成する過程。

【００３７】翻訳：ｍＲＮＡからポリペプチドを生成す
る過程。

【００３８】発現：ポリペプチドを生成するため遺伝子
もしくはＤＮＡ配列により受ける過程。これは、転写と
翻訳との組合せである。

【００３９】ｃＤＮＡクローン：ｍＲＮＡから合成され
かつイントロンを含有しないＤＮＡ挿入物を含むクロー
ン。ベクターはプラスミドまたはファージとすることが
できる。

【００４０】ゲノムクローン：ゲノムの断片であるＤＮ
Ａ挿入物を含むクローン（すなわち、全細胞ＤＮＡから
分離される）。これは、遺伝子の蛋白コード化領域を中
断するイントロンを含むことができる。ベクターはプラ
スミド、ファージまたはコスミドとすることができる。

【００４１】エクソン：転写後に、先駆体ＲＮＡのスプ
ライス後のｍＲＮＡに維持される遺伝子の部分。

【００４２】イントロン：転写後にスプライス・アウト
される遺伝子の部分。

【００４３】プラスミド：完全「レプリコン」からなる
非クロモソーム二重鎖ＤＮＡ配列であり、これによりプ
ラスミドは宿主細胞内で複製される。プラスミドを単細
胞微生物に入れると、その生物の特性がプラスミドのＤ
ＮＡ挿入の結果として変化または形質転換する。たとえ
ば、テトラサイクリン耐性（Ｔｅｔ^R）についての遺伝
子を担持するプラスミドは従前テトラサイクリンに感受
性であった細胞をこれに対し抵抗性の細胞に形質転換さ
せる。プラスミドにより形質転換された細胞を「（形質
転換体）」と呼ぶ。

【００４４】ファージもしくはバクテリオファージ：細
菌性ウイルスであり、その多くは蛋白質エンベロプもし
くは被覆（「カプシド」）中にカプセル化されたＤＮＡ
配列からなっている。

【００４５】コスミド：バクテリオファージλの凝集末
端（「ｃｏｓ」）部位を有するプラスミド。コスミド
は、ｃｏｓ部位が存在するため、λコート蛋白中に封入
され、これを用いて適当な宿主にインフェクトすること
ができる。外来ＤＮＡの大型断片に対するその能力のた
め、コスミドはクローン化ベヒクルとして有用である。

【００４６】クローン化ベヒクル：宿主細胞中で複製し
得るプラスミド、フアージＤＮＡ、コスミドまたはその
他のＤＮＡ配列であり、これは１個または少数のエンド
ヌクレアーゼ識別部位を特徴とし、その部位においてこ
のＤＮＡ配列はＤＮＡの本質的な生物学的機能（たとえ
ば再現性）、被覆蛋白質の生成の喪失またはプロモータ
もしくは結合部位の喪失を伴わずに決定可能に切断さ
れ、またこの部位は形質変換細胞の同定（たとえばテト
ラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性）に使用する
のに適する標識を有する。クローン化ベヒクルはしばし
ばベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）と呼ばれる。

【００４７】クローン化：微生物またはＤＮＡ配列の増
殖を得る過程であって、無性増殖によりこの種の一種の
微生物または配列から得られる。

【００４８】組換ＤＮＡ分子すなわちヒブリドＤＮＡ：
生体細胞の外部で末端−末端結合されかつ生存細胞に維
持される能力を有する、異なるゲノムからのＤＮＡ断片
よりなる分子。

【００４９】発現制御配列：遺伝子の発現をこれら遺伝
子に作用結合された際に制御しかつ調整するヌクレオチ
ドの配列。これらはｌａｃ系、β−ラクタマーザ系、ｔ
ｒｐ系、ｔａｃおよびｔｒｃ系、ファージλの主オペレ
ータおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領
域、ＳＶ４０の早期および後期プロモータ、ポリオーマ
ウイルスおよびアデノウイルスから生ずるプロモータ、
メタロチオニンプロモータ、３−ホスホグリセレートキ
ナーゼもしくはその他の糖分解酵素のプロモータ、酸ホ
スファターゼのプロモータ（たとえばＰｈｏ５）、酵母
α−交配因子のプロモータ、並びに原核もしくは真核細
胞およびそのそのウイルスまたはその組み合わせの遺伝
子の発現を制御することが知られた配列を包含する。哺
乳動物細胞の場合、遺伝子は、たとえばジヒドロホレー
トレダクターゼをコードする遺伝子に結合されかつ支那
ハムスター卵細胞で選択増幅されて活性転写された真核
遺伝子の多コピーを有する細胞ラインを生成するＳＶ４
０の早期領域に対するような真核プロモータに結合する
ことができる。

【００５０】ＭＩＳ−様ポリペプチド：ＭＩＳ−蛋白の
生物学的もしくは免疫学的活性を示すポリペプチド。本
明細書に使用する「ＭＩＳ蛋白の生物学的活性」という
用語は、ＭＩＳ−様ポリペプチドが天然ＭＩＳ蛋白と実
質的に同様な生物学的活性の交差部分を有することを意
味すると理解すべきである（たとえば、これはミュレル
管の退行を刺激することができ、または卵巣腫瘍細胞の
１種もしくはそれ以上、たとえば細胞ラインＨＯＣ−２
１に対し細胞毒性であり、好ましくはこれはミュレル管
の退行を刺激すると共に卵巣腫瘍細胞の１種もしくはそ
れ以上に対し細胞毒性である）。本明細書に使用する
「ＭＩＳ蛋白の生物学的活性」という用語は、天然ＭＩ
Ｓ蛋白に対し特異性である抗体と交差反応するＭＩＳ−
様ポリペプチドの能力を意味すると理解すべきである。
この種の抗体の例は米国特許第４，４８７，８３３号公
報に開示されている。ＭＩＳ−様ポリペプチドは、天然
ＭＩＳ蛋白の他にアミノ酸を含むことができ、或いは天
然ＭＩＳ蛋白のアミノ酸全部を含まなくてもよい。たと
えば、これはＮ−末端メチオニンを含むことができる。
さらに、このポリペプチドは成熟蛋白もしくは未熟蛋白
とすることができ、或いは未熟蛋白から誘導される蛋白
（たとえば信号配列の１部のみが切断されている蛋白）
とすることもできる。この種のポリペプチドの例は、Ｍ
ＩＳアミノ酸配列を改変してその性質（たとえば、より
大きい貯蔵安定性または増大したインビボによる半減
期）の向上を得るべく作成したＭＩＳポリペプチドの誘
導体である。本明細書において「誘導されるＭＩＳ−様
ポリペプチド」という用語は、本発明におけるＭＩＳポ
リペプチド（たとえば、ウシＭＩＳもしくはヒトＭＩ
Ｓ）だけでなく、この定義に記載した種類の各種の関連
ポリペプチドをも意味すると理解すべきである。

【００５１】本発明は、ＭＩＳポリペプチドをコードす
るＤＮＡ配列および組換ＤＮＡ分子、並びにこれらポリ
ペプチドの製造方法に関するものである。

【００５２】本発明によるＤＮＡ配列の分離およびクロ
ーン化において、ウシＭＩＳ蛋白に基づく選択手段を採
用した。したがって、本発明によれば、ウシ睾丸からウ
シＭＩＳ蛋白質を精製し、かつこの蛋白の各種断片のア
ミノ酸配列を決定した。これら蛋白配列に基づき、次い
で最小のヌクレオチド縮退を有する精製ウシ蛋白の領域
に対応する数種の反対方向のオリゴヌクレオチドＤＮＡ
試料を合成した。次いでこれらの試料を用いてファージ
クローン化ベクター中に挿入されたウシ睾丸ｃＤＮＡ配
列を含むイー・コリ細胞からなるウシｃＤＮＡライブラ
リをスクリーニングした。

【００５３】スクリーニングするため、プラークハイブ
リッド化スクリーニング分析を利用してオリゴヌクレオ
チド試料をウシｃＤＮＡライブラリにハイブリッド化さ
せかつこれら多数の試料にハイブリッド化するクローン
を選択した。選択したウシｃＤＮＡ挿入物を分離しかつ
プラスミド中にサブクローン化した後、そのヌクレオチ
ド配列を決定しかつ精製ウシＭＩＳ蛋白のペプチドから
得られたアミノ酸配列と比較した。この比較の結果、分
割した全クローンのヌクレオチド配列がウシＭＩＳ蛋白
のアミノ酸配列をコードすることを突き止めた。

【００５４】１種のウシＭＩＳｃＤＮＡクローン（ｐ
Ｓ２１）の挿入物を用いて、ヒトＭＩＳ遺伝子をヒトコ
スミドライブラリから分離しかつ部分ｃＤＮＡクローン
をヒトｃＤＮＡライブラリから分離した。ヒト新生児の
睾丸から抽出した全ＲＮＡからヒトｃＤＮＡライブラリ
を作成した。

【００５５】本発明のｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮ
Ａ配列は発現制御配列に作用結合させることができ、か
つこれを各種の哺乳動物またはその他の真核もしくは原
核宿主細胞に使用して、これらによりコードされたＭＩ
Ｓ用ポリペプチドを産生させることができる。さらに、
本発明のｃＤＮＡ配列もしくはゲノムＤＮＡ配列は、Ｍ
ＩＳ用ポリペプチドをコードする他の配列につきヒトｃ
ＤＮＡライブラリをスクリーニングする試料として有用
である。

【００５６】上記ヒトゲノムＤＮＡ配列は数個のイント
ロンを有する。これらイントロンの１個もしくはそれ以
上または全部が欠失しているＤＮＡ配列および組換ＤＮ
Ａ分子も本発明の範囲内に入ると考えられる。

【００５７】本発明のウシおよびヒトＭＩＳ−様ポリペ
プチド（好ましくは、ヒトＭＩＳ−様ポリペプチド）は
抗癌剤として有用である。たとえば、この種の組成物は
抗癌上有効量の本発明によるＭＩＳ−様ポリペプチドと
医薬上許容し得るキャリヤとから構成することができ
る。この種の治療は一般にこれら組成物により医薬上許
容し得る方法で患者を処置する方法からなっている。

【００５８】一般に、本発明の医薬組成物は、他の医薬
上重要なポリペプチド（たとえばα−インタフェロン）
について使用すると同様な方法を用いて処方しかつ投与
することができる。たとえば、これらポリペプチドを凍
結乾燥型で貯蔵し、投与直前に滅菌水で再編成しかつ静
脈投与することができる。好ましくは、本発明の医薬組
成物は、米国特許第４，５１０，１３１号公報に開示さ
れたＭＩＳ蛋白につき使用されているものと同様な投与
量および投与方式で投与され、前記米国特許の開示を参
考のためここに引用する。

【００５９】広範な種類の宿主／クローン化ベヒクル組
合せ物を、本発明により作成されたＭＩＳ−様ポリペプ
チドＤＮＡ配列をクローン化しまたは発現させるのに使
用することができる。たとえば、有用なクローン化もし
くは発現ベヒクルは染色体、非染色体および合成ＤＮＡ
配列の断片、たとえば各種公知のＳＶ４０の誘導体およ
び公知の細菌プラスミド、たとえばｃｏｌＥ１、ｐＣＲ
１、ｐＢＲ３２２、ｐＭＢ９およびその誘導体を含むイ
ー・コリからのプラスミド、広範な宿主範囲のプラスミ
ド、たとえばＲＰ４、ファージＤＮＡ、たとえばファー
ジλの多数の誘導体、たとえばＮＭ９８９およびその他
のＤＮＡファージ、たとえばＭ１３およびフィラメント
状−本鎖ＤＮＡファージおよびプラスミドとファージＤ
ＮＡとの組合せ物から誘導されるベクター、たとえばフ
ァージＤＮＡもしくはその他の発現制御配列を用いるよ
う改変したプラスミド、或いは酵母プラスミド、たとえ
ば２μプラスミドもしくはその誘導体で構成することが
できる。ｃＤＮＡクローン化のための好適な発現ベクタ
ーは、λｇｔ１０であり、好適宿主はイー・コリＢＮＮ
１０２である。動物細胞の発現には、好適な発現ベクタ
ーは支那ハムスター卵細胞（ＣＨＯ）におけるｐＢＧ３
１１およびｐＢＧ３１２である。

【００６０】各特異性クローン化もしくは発現ベヒクル
の内部には、本発明のＭＩＳ−様ポリペプチドＤＮＡ配
列を挿入するための各種の部位を選択することができ
る。一般にこれらの部位はこれを切断する制限エンドヌ
クレアーゼにより命名され、当業者に充分認識されてい
る。ＤＮＡ配列を、これらの部位に挿入して組換ＤＮＡ
分子を生成させるための各種の方法も周知されている。
たとえば、これらはｄＧ−ｄＣもしくはｄＡ−ｄＴ処
理、直接結合、合成リンカ、エキソヌクレアーゼおよび
ポリメラーゼ結合修復反応に続く結合、或いはＤＮＡポ
リメラーゼおよび適当な一本鎖雛型によるＤＮＡ鎖の延
長に続く結合を包含する。勿論、本発明に有用なクロー
ン化もしくは発現ベヒクルは、選択ＤＮＡ断片を挿入す
るための制限エンドヌクレアーゼ部位を有する必要がな
いことを了解すべきである。むしろ、このベヒクルは、
他の手段によって断片に結合することができる。

【００６１】各種の発現制御配列を選択して、本発明の
ＤＮＡ配列の発現を行なうことができる。これらの発現
制御配列はたとえばｌａｃ系、β−ラクタマーゼ系、ｔ
ｒｐ系、ＴＡＣ系、ＴＲＣ系、ファージλの主オペレー
タおよびプロモータ領域、ｆｄコート蛋白の制御領域、
３−ホスホグリセレートキナーゼもしくはその他の糖分
解酵素のプロモータ、酸ホスファターゼのプロモータ
（たとえばＰｈｏ５）、酵母α−交配因子のプロモー
タ、哺乳動物細胞のプロモータ、たとえばＳＶ４０の早
期プロモータ、アデノウイルス後期プロモータおよびメ
タロチオニンプロモータ、並びに原核もしくは真核細胞
またはそのウイルスの遺伝子の発現を制御することが知
られたその他の配列、およびその各種組合せを包含す
る。哺乳動物細胞においては、さらに遺伝子をジヒドロ
ホレートレダクターゼに結合しかつ宿主支那ハムスター
卵細胞に対し選択を行なって発現単位を増幅することも
できる。

【００６２】本発明のＤＮＡ配列を発現させるには、こ
れらＤＮＡ配列を発現ベクターにおける上記発現制御配
列の１種もしくはそれ以上に作用結合させる。選択した
ＭＩＳ−様ポリペプチドＤＮＡ配列がクローン化ベヒク
ル中に挿入される前または挿入された後に行ない得るこ
の種の作用結合は、発現制御配列がＤＮＡ配列の発現を
制御しかつ促進することを可能にする。

【００６３】本発明に使用する選択ＤＮＡ断片および発
現制御配列を挿入するためここで選択したベクターもし
くは発現ベヒクルおよび特に部位は各種の因子、たとえ
ば特定制限酵素に感受性である部位の個数、発現すべき
蛋白の大きさ、たとえばベクター配列に対する開始およ
び停止コドンの位置などの発現特性、並びに当業者に認
識されたその他の因子によって決定される。ベクター、
発現制御配列および特定のＭＩＳ−様ポリペプチド配列
の挿入部位の選択はこれら因子のバランスによって決定
され、必ずしも全ての選択が所定の場合に同等に有効で
あるとは限らない。

【００６４】さらに、クローン化もしくは発現ベヒクル
の選択部位に挿入される本発明によるＭＩＳ−様ポリペ
プチドをコードするＤＮＡ配列は、ＭＩＳ−様ポリペプ
チドをコードする実際の遺伝子の１部でないヌクレオチ
ドを包含することができ、或いはこのポリペプチドを全
遺伝子の断片のみを包含し得ることも了解すべきであ
る。唯一の必要なことは、いかなるＤＮＡ配列を使用し
ても、形質転換宿主がＭＩＳ−様ポリペプチドを産生す
ることである。たとえば、本発明のＭＩＳ−様ポリペプ
チド関連ＤＮＡ配列を、本発明の発現ベクターにおける
同じ読枠中で、少なくとも１種の真核もしくは原核信号
配列をコードする少なくとも１種の真核もしくは原核キ
ャリヤ蛋白もしくはＤＮＡ配列或いはその組合せをコー
ドするＤＮＡ配列の少なくとも１部に融合させることが
できる。この種の作成は、所望のＭＩＳ−様ポリペプチ
ド関連ＤＮＡ配列の発現を助け、精製を向上させ、また
は宿主細胞からのＭＩＳ−様ポリペプチドの分泌、好ま
しくは熟成を可能にする。或いは、ＭＩＳ−様ポリペプ
チド関連ＤＮＡ配列は、ＡＴＧ開始コドンを単独で或い
は他のコドンと一緒に含むことができ、または天然の成
熟ＭＩＳ−様ポリペプチドの第１アミノ酸をコードする
配列に直接融合させることもできる。この種の作成は、
たとえばメチオニルもしくはその他のペプチジル−ＭＩ
Ｓ−様ポリペプチドの産生をも可能にし、これも本発明
の１部である。次いで、このＮ−末端メチオニンもしく
はペプチドを各種の公知方法により細胞内でまたは細胞
外で切断することができ、或いはメチオニンもしくはペ
プチドが結合したＭＩＳ−様ポリペプチドを未切断のま
ま医薬組成物および本発明の方法に使用することもでき
る。

【００６５】本発明のＭＩＳ−様ポリペプチドコード配
列を含むクローン化ベヒクルまたは発現ベクターを本発
明にしたがって使用し、適当な宿主を形質転換させて、
この宿主がＤＮＡ配列のコードするＭＩＳ−様ポリペプ
チドを発現するのを可能にする。

【００６６】有用なクローン化もしくは発現宿主はイー
・コリ、たとえばイー・コリＣ６００、イー・コリＥＤ
８７６７、イー・コリＤＨ１、イー・コリＬＥ３９２、
イー・コリＨＢ１０１、イー・コリＸ１７７６、イー・
コリＸ２２８２、イー・コリＭＲＣＩ、イー・コリＢＮ
Ｎ１０２、イー・コリＪＭ８３、イー・コリＪＡ２２
１、並びにシュードモナス、バチルスおよびストレプト
ミセス、酵母およびその他の真菌類の菌株、動物宿主、
たとえばＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞もしくはネズミ細胞、
その他の動物（ヒトを含む）宿主、培養中の植物細胞ま
たはその他の宿主を包含する。

【００６７】適する宿主の選択も、当業界で認識された
多数の因子によって管理される。これらは、たとえば選
択ベクターとの適合性、ハイブリッドプラスミドにより
コードされる蛋白の毒性、宿主細胞酵素による蛋白分解
減成に対する所望蛋白の感受性、精製の際に除去するの
が困難な宿主細胞蛋白による発現蛋白の汚染もしくは結
合、所望蛋白の回収容易性、発現特性、生物安全性およ
びコストなどを包含する。これら因子のバランスは、必
ずしも全ての宿主ベクター組合せか特定組換ＤＮＡ分子
のクローン化もしくは発現のいずれに対しても同等には
有効でないという理解に立脚せねばならない。

【００６８】ＭＩＳ−様ポリペプチド（前記宿主で本発
明により作成される）は、融合蛋白の形態のポリペプチ
ド（たとえば原核、真核もしくは組合せＮ−末端断片に
結合して分泌を指令し、安定性を向上させ、精製を改善
し、またはＮ−末端断片の可能な切断を向上させる）、
ＭＩＳ−様ポリペプチドの先駆体の形態（たとえば、Ｍ
ＩＳ−様ポリペプチド信号配列またはその他の真核もし
くは原核信号配列の全部または部分から出発する）、成
熟ＭＩＳ−様ポリペプチドの形態、またはｆｍｅｔ−Ｍ
ＩＳ−様ポリペプチドの形態のポリペプチドを包含す
る。上記したように、本明細書中に使用する「誘導され
るＭＩＳ−様ポリペプチド」という用語は、この種のＭ
ＩＳ−様ポリペプチドを包含すると理解すべきである。

【００６９】本発明によるポリペプチド、または少なく
ともその先駆体の１種の特に有用な形態は、容易に切断
されるアミノ酸もしくはアミノ酸シリーズがアミノ末端
に結合した成熟ＭＩＳ−様ポリペプチドである。この種
の作成は、適当な宿主におけるポリペプチドの合成を可
能にし、成熟ポリペプチドに存在してはならない開始信
号を必要とし、さらに余分なアミノ酸のインビボもしく
はインビトロの切断を可能にして成熟ＭＩＳ−様ポリペ
プチドを産生する。この種の方法は当業界で既に存在す
る（たとえば、米国特許第４，３３２，８９２号、第
４，３３８，３９７号および第４，４２５，４３７号各
公報参照）。さらに、これらポリペプチドは、天然ＭＩ
Ｓ−蛋白と同様にグリコシル化されていても或いはグリ
コシル化されていなくてもよく、または天然ＭＩＳ−蛋
白のパターンとは異なるグリコシル化パターンを有する
こともできる。この種のグリコシル化は宿主細胞の選
択、或いは特定ＭＩＳ−様ポリペプチドにつき選択した
発現後の処理によって生ずる。さらに、本発明のポリペ
プチドは、本発明のＤＮＡ配列におけるコドンの幾つか
または全部につき異なるコドンを特徴とするＤＮＡ配列
によって発現に際しコードされるＭＩＳ−様ポリペプチ
ドをも包含する。これらの置換コドンは、置換されたコ
ドンによりコードされるものと同一のアミノ酸をコード
し得るが、より高収率のポリペプチドをもたらす。代案
として、アミノ酸置換をもたらす、或いはより長いもし
くはより短いＭＩＳ−様ポリペプチドをもたらすコドン
の１個もしくは組合せの置換は、その性質を通常のよう
に変化させることができる（たとえば安定性を増大さ
せ、溶解度を増大させ、または治療活性を増大させ
る）。

【００７０】本発明をより良く理解するよう、以下の実
施例により本発明を説明する。これらの実施例は説明の
目的であって、本発明の範囲を決して限定するものでは
ないと理解すべきである。

【００７１】

【実施例】実施例１ウシＭＩＳ蛋白の配列ブドゥツィク等［Ｃｅｌｌ、第３４巻、第３０７〜３１
４頁（１９８３）］の方法によって新生のウシ睾丸から
ウシＭＩＳ蛋白を分離した。マトリックスゲルグリーン
Ａカラムから０．５ＭＮａＣｌで溶出した後、ウシＭ
ＩＳ画分（グリーン−３）を濃縮し、ＰＢＳ緩衝液と
０．０１％ノニデット−Ｐ４０で透析し−７０℃で保存
した。

【００７２】分析的ＳＤＳ−ＰＡＧＥ還元によるＭＩＳ
（グリーン−３画分）は７４Ｋｄと７０Ｋｄの主なポリ
ペプチド、並びに１４０に近い種と９５Ｋｄを含む幾つ
かの少量成分を含んでいた。７４Ｋｄと７０Ｋｄ種の高
精製試料を半調製ＳＤＳ−ＰＡＧＥの組合せに続く溶離
により得ることが出来た。これらの各々を末端分析に付
した。７０Ｋｄと７４Ｋｄポリペプチドの両方とも同じ
Ｎ−末端（ＡｒｇＧｌｕＧｌｕＶａｌＰｈｅＳｅｒ）を
有していた。

【００７３】還元しかつカルボルキシメチル化した７４
Ｋｄと７０ＫｄＭＩＳポリペプチドの夫々の約１ノナモ
ルをＴＰＣＫ−トリプシンで別々に消化した。カルボル
キシメチル化後、精製ポリペプチドを０．１ＭＮＨ₄
ＨＣＯ₃と０．１ｍＭＣａＣｌ₂中に再分散して精製
し、次いでＴＰＣＫ−トリプシンで１６時間３７℃下に
培養した。この培養中、トリプシンを３回に分けて添加
し、初回に全蛋白に対し最終濃度２．０％、４時間後に
４．０％、１２時間後に６．０％である。

【００７４】これら培養による開裂フラグメントを０．
１％トリフロロ酢酸中の０〜７５％勾配のアセトニトリ
ルを使用して高圧液体クロマトグラフィーにより分解し
て、Ｃ１８カラムに結合のペプチドを溶出した。２つの
トリプチル地図は極めて近似しており、同じ一次構造を
示し、かつ７０Ｋｄポリペプチドに由来することが推定
された。従って、各々の培養からの選択保存ピークを組
合せ、次いでガス相配列解析機（アプライドバイオシス
テムス４７０Ａ）を使用して配列分析した。５μｍシア
ノカラム（ハイパーシル）により、０．０２Ｍ酢酸ナト
リウム（ｐＨ５．７）中の１５〜５５％勾配のアセトニ
トリル：メタノール（４：１）を使用して高圧液体クロ
マトグラフィーによりＰＴＨ−アミノ酸を分析した。

【００７５】トリプチル培養は２０以上のピークを生成
した。この内の６つは蛋白配列を与えた。一つのトリプ
チルペプチド、＃Ｔ１０５−１０６の配列を図１に示
す。

【００７６】トリプシン又はＳ．アウレウスＶ８プロテ
アーゼによる¹²⁵Ｉ−標識付け７４Ｋｄ及び７０ＫｄＭ
ＩＳの分析的培養によると、生成ペプチドの大部分は１
０Ｋｄより大きく、かつＣ１８カラムによる高性能液体
クロマトグラフィーで低収率で回収した。ＳＤＳ−尿素
ＰＡＧＥ及び高性能液体クロマトグラフィー分析の両方
を使用して、保存開裂生成物は７０Ｋｄと７４ＫｄＭＩ
Ｓの間に生起することが再び観察され、２つのポリペプ
チドは関係があることを確認した。

【００７７】基本ｐＨにおけるＴＰＣＫ−トリプシンに
よる培養程度を増大するため、培養の前に１ノナモルの
ＭＩＳをこはく酸付加体とし、次いで得られたペプチド
をＣ８カラムで分解した（９０％収率）。５〜１６残渣
に亘る６つのペプチド配列を更に得た。この内の２つは
前に得た配列であることを確認した。トリプチルペプチ
ド＃Ｔ８１の配列を図１に示す。

【００７８】培養に際し、２Ｍ尿素を含ませることによ
り、ＴＰＣＫ−トリプシンによるＭＩＳの培養効率が更
に向上した。このようにして得たペプチドを使用して、
更に１１個のペプチド配列を得た。総計して、２３個の
ペプチド配列を得、その内の２つを図１に示す。

【００７９】実施例２オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブの合成ウシＭＩＳ蛋白の各種範囲のアミノ酸配列を決定した後
（図１参照）。これら蛋白配列の幾つかに対しコードさ
れた抗認識オリゴヌクレオチドＤＮＡプローブの２つの
プールを化学的に合成した（図２および図３参照）。こ
れらは最小核酸縮退を有するＭＩＳ蛋白の範囲に相当す
るため図２および図３に示す２つのプール（１−４及び
９−１２）を合成した。各アミノ酸配列に対し、総ての
コードンに相補のプローブ混合物を合成した。プローブ
はアミノ酸配列にコードするＤＮＡ配列に相補で、即
ち、プローブは抗認識であってプローブがＤＮＡ並びに
ｍＲＮＡ中の対応する配列を認識するのを可能とされ
る。ＭＩＳ蛋白の２つの選択された範囲のアミノ酸配列
及びこれらにコードする総ての可能なヌクレオチドコー
ドン組み合わせとを図２および図３に示す。コードする
縮退を次ぎに示す：Ｎ＝Ｃ、Ｔ、Ａ又はＧ；Ｒ＝Ａ又は
Ｇ；Ｙ＝Ｃ又はＴ；及びＨ＝Ａ、Ｃ又はＴ。

【００８０】図１のトリプチルフラグメントＴ１０５−
１０６及びＴ８１の配列から誘導したプローブの２つの
プールは夫々２５６倍縮退を有する１７量体又は５１２
倍縮退を有する２０量体であった。プールの中央の縮退
コードンにて開裂することにより、４群中の各プールを
合成した。かくして、６４の４つのサブプール［１−
４］中のＴ１０５−１０６の２５６倍縮退１７量体及び
１２８の４つのサブプール［９−１２］中の５１２倍縮
退２０量体とを調製した。これにより正しい配列を含む
サブプールを区別するためノーザンブロートによりこれ
らを別々に使用して縮退を減少することが出来た（下記
参照）。アプライドバイオシステムス３８０ＡＤＮＡ
合成機によりプローブを合成し、次いでこれらをゲル電
気泳動により精製した。このプローブを［γ−３２Ｐ］
−ＡＴＰ及びポリヌクレオチド助酵素を使用して標識付
けした［マックサムとギルバートＰｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、第７４巻、第５６０頁（１９７
７）］。

【００８１】ノーザン分析を使用して１−４及び９−１
２の２つのプローブの縮退を減少した。生後２週間及び
３箇月のウシ睾丸、並びに成体ウシ腎臓からのＲＮＡを
有するノーザンプロートのためプローブ各々にハイブリ
ッド形成した。生後２週間ウシ睾丸のみが生物学的に活
性ＭＩＳを含んでいたので、ノーザン分析はどの群内の
プローブが正しいＭＩＳ配列を含むか区別するであろう
と期待された。それでｃＤＮＡライブラリをスクリーン
するためにより少量の縮退プローブを使用した。ＭＩＳ
プローブ１−４を有するノーザンプロートはプローブ２
が正しいオリゴマー配列を含むことを暗示し、一方ＭＩ
Ｓプローブ９−１２を有するノーザンプロートはプロー
ブ１２が正しいオリゴマー配列を含むことを示した。両
方の場合、２０００ヌクレオチド転写が生後２週間のウ
シ睾丸からのＲＮＡに観察されたが、他のＲＮＡには観
察されなかった。サブプール２を１６倍縮退の４つのサ
ブプール（１３−１６）に切断し、一方プローブ１２を
３２倍縮退の４つのサブプール（１７−２０）に切断し
た。生後２週間のウシ睾丸ＲＮＡに２０００ヌクレオチ
ド転写へハイブリッド形成されたというプローブのノー
ザン分析により、正しい選択がなされたことが確証され
た。転写は生後３箇月のウシ睾丸又は腎臓には存在しな
かった。

【００８２】実施例３ウシ睾丸ｃＤＮＡライブラリの
構成並びにスクリーニングウシ睾丸から分離したポリＡ⁺ｍＲＮＡのウシｃＤＮＡ
ライブラリを構成した。ｃＤＮＡをλｇｔ１０に挿入
し、かつイー・コリＢＮＮ１０２細胞の配列を増幅し
た。

【００８３】Ａ．ウシ睾丸からＲＮＡの抽出屠殺直後の生後２週間の仔ウシからの睾丸を入手した。
白膜から精液生成の細管を除去し、これらを液体窒素中
で急速冷凍した。冷凍組織の約１０ｇを粉砕し、これを
抽出緩衝液（４Ｍグアジニンチオサイアネート、０．５
％ＳＤＳ、２５ｍＭクエン酸ナトリウム、０．１％シグ
マ泡止め剤）１００ｍｌ中でポリトロンを使用して２分
間高速で均質化した。ホモジネートをソルバールＲＣ２
Ｂ遠心機で４℃、２０分間、８０００ｒｐｍで遠心分離
した。７５ｍｌの上澄み液を回収し、それをＣｓＣｌ緩
衝液（５．７ＭＣｓＣｌ、２５ｍＭＮＡＯＡｃｐ
Ｈ５．０、１ｍＭＥＤＴＡ）の３０ｍｌ（各々１０ｍ
ｌ含有の３管）にとり、次いでＳＷ２８ロータ中で２２
０００ｒｐｍ、１６時間遠心分離した。ペレットを１０
ｍＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）１ｍＭＥＤＴＡ及
び０．１％ＳＤＳの１０ｍｌに再分散した。０．３Ｍ酢
酸ナトリウム中−２０℃で一晩核酸をエタノール沈澱さ
せ、これをソルバールＲＣ２Ｂ遠心機（ＳＳ３４ロー
タ）で１４Ｋｒｐｍ、４℃、２０分間でペレット化し
た。ペレットを５ｍｌの０．３Ｍ酢酸ナトリウム中に再
分散し、再び上記のようにして核酸をエタノール沈澱さ
せた。最終ペレットを３００μｌのＨ₂０中に再分散
し、−２０℃で保存した。ポリ（Ａ）⁺ＲＮＡ用のＲＮ
Ａ調製品をオリゴ（ｄＴ）−セルローズカラム（ＰＬバ
イオケム）に通して濃縮した。

【００８４】Ｂ．λＧＴ１０中の生後２週間のウシ睾丸
のポリＡ⁺ｍＲＮＡからのｃＤＮＡライブラリの構成１．ｃＤＮＡの合成上記のようにして生後２週間のウシ睾丸から分離した本
発明Ａ⁺ｍＲＮＡ２５μｇからｃＤＮＡを合成した。ｍ
ＲＮＡをＨ₂０中５５μｇ／ｍｌに希釈し、水酸化メチ
ル−マーキュリ（ＣＨ₃ＨｇＯＨ）で処理することによ
り変性した。次いで５０ｍＭに１ＭＣＨ₃ＨｇＯＨ
（アルファベネトロン）を添加した。５μｌの５０ｍＭ
ＣＨ₃ＨｇＯＨを５０μｌのＨ₂０中のｍＲＮＨ２５
μｇに添加し、室温で１０分間温置した。１．４Ｍのβ
−メルカプトエタノール１０μｌを添加することにより
反応を停止した。

【００８５】変性ｍＲＮＡ混合物を、４２℃の０．１Ｍ
トリス−ＨＣｌ、０．０１ＭＭｇＣｌ₂、０．０１Ｍ
ＤＴＴ、１ｍＭｄＡＴＰ、０．５ｍＭｄＣＴＰと
５０μＣｉ³Ｈ−ｄＣＴＰ（２５．７Ｃｉ／ｍｍｏｌ、
ニューイングランドヌクレア）、１ｍＭｄＧＴ
Ｐ、１ｍＭｄＴＴＰ、２．５ｍＭバナジルリボヌクレ
オシド複合体（ベテスダリサーチラブス）、２０μｇオ
リゴｄＴ１２１８（ＰＬビオケム）、及び１９６Ｕ
ＡＭＶ逆転写酵素（セイカガクアメリカ）からなる反
応混合物へ添加した。混合物の最終容量は２００μｌで
あった。混合物を３分間室温で、４４℃で３時間培養
し、次いで０．５ＭＮａ₂ＥＤＴＡ１／２０容量添
加することにより反応を停止した（ｐＨ８．０）。

【００８６】反応混合物をＴＥ飽和フェノールとクロロ
ホルム（５０：５０）の混合物で抽出した。（ＴＥ緩衝
液は１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．０、１ｍＭ
Ｎａ₂−ＥＤＴＡ）。次いで有機層をＴＥ緩衝液で再抽
出し、混合液相を、０．０１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）、０．１ＭＮａＣｌ、０．０１ｍＭＮａ₂
ＥＤＴＡ、０．０５％ＳＤＳを含有する５ｍｌの殺菌ピ
ペットを介してクロマトグラフィーに付した。ＬＫＢ液
体シンチレーションカウンター中の各画分のアリコート
をカウントした。前ピークから尾部を差し引いてプール
し、ｃＤＮＡを９５％エタノール２．５容量を使用して
−２０℃で沈澱した。ｃＤＮＡの収量はｃＤＮＡ−ｍＲ
ＮＡハイブリッドとして得られた８．１μｇであった。

【００８７】２．二本鎖合成ｃＤＮＡをＨ₂０に再分散し、各々４μｇのｃＤＮＡを
含む重複二次鎖反応物を設定した。各４００μｌの反応
物は０．０２Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、０．１Ｍ
ＫＣｌ、０．００５ＭＭｇＣｌ₂、０．５ｍＭｄ
ＡＴＰ＋１００μＣｉα−ｄＡＴＰ³²（３０００Ｃｉ／
ｍｍｏｌ、ニューイングランドヌクレア）、１ｍＭ
ｄＣＴＰ、１ｍＭｄＧＴＰ、１ｍＭｄＴＴＰ、１
００ｕＤＮＡＰｏｌＩクレノー画分（ボーリンゲル
マンハイム）、及び４ｕＲナーゼＨ（Ｐ．Ｌ．ビオケ
ム）を含有した。反応物を１２℃で１時間、室温で１．
５時間培養し、次いでｐＨ８／０で０．５ＭＮａ₂Ｅ
ＤＴＡを１／２０容量添加して反応を停止した。次いで
前節に記載したｃＤＮＡ合成工程におけるようにフェノ
ール：クロロホルムで反応混合物を抽出し、抽出物を
０．２容量の１０Ｍ酢酸アンモニウムと２．５容量の９
５％エタノールを−７０℃、２０分間にて添加して沈澱
させた。得られた混合物を室温に加温し、次いでエッペ
ンドルフ遠心機で１５分間回転して二本鎖ｃＤＮＡをペ
レットとした。ペレットをＴＥ緩衝液に再分散し、酢酸
アンモニウムで沈澱を繰り返し（最終濃度２Ｍ）、エタ
ノールで２回沈澱させた。

【００８８】ペレットを高速真空で乾燥し、ＴＥ緩衝液
１００μｌ中に再分散した。次いで２５μｇの煮沸Ｒナ
ーゼＡ（シグマ）を添加し、混合物３７℃で３０分間培
養し、フェノール：クロロホルムで抽出し、ｃＤＮＡ合
成工程に対し上記したようにセファデックスＧ１５０を
介してクロマトグラフに付した。

【００８９】鈍い端部を確認するため、二本鎖ｃＤＮＡ
をＨ₂０に再分散し、それを０．００１Ｍ酢酸マグネシ
ウム、０．１７ＭＤＴＴ、８８μｇＢＳＡ、０．２
５ｍＭｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰ、及
び１８ｕＴ₄ＤＮＡポリメラーゼ（ニューイングラン
ドバイオラブス）を含む反応物へ添加した。最終反応
物の容量は３００μｌであった。反応物を３７℃で１時
間培養し、次いで抽出し、２次鎖合成工程に対して記載
したように２Ｍ酢酸アンモニウムと２．５容量の９５％
エタノールで２回沈澱させた。

【００９０】鈍い端部化ｃＤＮＡの２μｇを独特なオリ
ゴマリンカーに結合させた。このリンカーはリンカー２
７、配列５′ＡＡＴＴＧＡＧＣＴＣＧＡＧＣＧＣ
ＧＧＣＣＧＣで５′ホスホリル化リンカー２８への２
２量体、配列５′ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＣＴＣＧＡ
ＧＣＴＣ３での１８量体を煮もどしすることにより
形成した。煮もどししたリンカーは鈍い端部化ｃＤＮＡ
への結合に対するホスホリル化鈍い端部とλｇｔ１０培
養したＥｃｏＲＩへの結合に対する非ホスホリル化５′
突出配列（ＡＡＴＴ）とを含有する。リンカーは次ぎの
限定酵素に対して認識配列を含んでいた：Ａｌｕｌ、Ａ
ｖａｌ、Ｂａｎ２、Ｂｓｐ１２、Ｆｎｕ４Ｈ、ＦｎｕＤ
２、Ｈａｌ３、ＨｇｉＡ１、Ｈｈａ１、ＨｉｎＰ１、
Ｎｏｔ１、Ｓｓｔ１、Ｘｈｏ１、Ｘｍａ３。

【００９１】リンカー２７−２８の２μｇを０．０５Ｍ
トリス−ＨＣｌｐＨ７．８の２μｇｃＤＮＡ、０．０
１ＭＭｇＣｌ₂、０．０３ＭＮａＣｌ、１ｍＭスペ
ルミジン、０．２ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ、２ｍＭＤＴ
Ｔ、１００μｇ／ｍｌＢＳＡ、０．４ｍＭＡＴＰ、
及び１０００ｕＴ₄ＤＮＡリガーゼ（ニューイングラ
ンドバイオラブス）中の２μｇのｃＤＮＡへ４℃で２
４時間にて最終容量２６μｌ中で結合した。過剰リンカ
ーを除去し、かつｃＤＮＡの大きさを分割するため、Ｔ
Ｅ飽和フェノールとクロロホルム混合物で結合反応物を
抽出した。有機層をＴＥＮ緩衝液（０．０１Ｍトリス−
ＨＣｌｐＨ７．５、０．１ＭＮａＣｌ、及び１ｍＭ
Ｎａ₂ＥＤＴＡ）で再抽出し、混合水溶液を、予めＴ
ＥＮ緩衝液で平衡化された１×３０ｃｍバイオゲルＡ５
０（ビオラッド）でクロマトグラフに付した。ＴＢＥ緩
衝液（０．０８９Ｍトリス−ＨＣｌ、０．０８９ほう酸
及び２．５ｍＭＮａ₂ＥＤＴＡ）中の１％アガロース
ゲルにカラム画分のアリコートを流し、ゲルを乾燥し、
それを−７０℃でコダックＸＡＲ−５フィルムにさらし
た。５００ｂｐより大きなｃＤＮＡを含む画分をプール
し、次いでこれらをエタノール沈澱させた。大きな分離
した二本鎖ｃＤＮＡの収率は９００ｎｇであった。

【００９２】３．ライブラリ構成 λＧＴ１０切断ＥｃｏＲＩの６μｇを、０．０５Ｍトリ
ス−ＨＣｌｐＨ７．８、０．０１ＭＭｇＣｌ₂、
０．０３ＭＮａＣｌ、１ｍＭスペルミジン、０．２ｍ
ＭＮａ₂ＥＤＴＡ、２ｍＭＤＴＴ及び３１．２μｌ
中の１００μｇ／ｍｌＢＳＡに混合した。これら成分
を７０℃３分間、４５℃１５分間加熱し、氷上で冷却
し、次いでエッペンドルフ遠心機で５秒間回転した。反
応混合物を０．２５ｍＭＡＴＰと２０００ｕＴ₄ＤＮ
Ａリガーゼ（ＮＥＢ）へ調節し、次いで１６時間１５℃
で培養した。結合のアリコート３．４μｌをアメルシャ
ムによって供給される記録に従ってアメルシャム包装混
合物を使用するファージ粒子に詰め込み、包装ＤＮＡを
感染Ｅ．コリＢＮＮ１０２細胞へ使用した。ライブラリ
のプラーク形成は増幅しかつＣｓＳＬ結合したところの
５．４×１０⁶の独立プラークを生成した。プラークの
４１％は２．２×１０⁶再結合のライブラリ複雑度を示
すインサートを有した。ファージ結合のＣｓＳＬ力値は
１．６×１０¹³ＰＦＵ／ｍｌであった。

【００９３】Ｃ．ライブラリのスクリーニングベントンとダビス［サイエンス、第１９６巻、第１８０
頁（１９７７）］のプラークハイブリッド形成スクリー
ニング技術を使用してＭＩＳ蛋白配列のコードしたヌク
レオチドに対し、標識付けしたオリゴヌクレオチドのプ
ローブ１６でライブラリをスクリーンした。

【００９４】Ｌ−ブロスと０．２％マルトース中でＢＮ
Ｎ１０２細胞の一晩培養物をペレット化し、それをＳＭ
緩衝液（５０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．５、１００
ｍＭＮａＣｌ、１０ｍＭＭｇＳＯ₄、及び０．０１％
ゼラチン）の等量に再分散した。次いで、０．３ｍｌの
細胞を室温で１５分間、５×１０⁴ファージ粒子で予備
吸着した。次いでＬＢ＋１０ｍＭＭｇＳＯ₄と０／７
％アガロースの８ｍｌに５５℃で分散物を希釈した。こ
のようなプレートを３０個作り、次いでプラークが殆ど
接触するまで約８時間３７℃でプレートを培養した。次
いでプレートを１時間４℃で冷却してアガロースを硬化
させた。

【００９５】ニトロセルロースフィルターを再結合プラ
ークを含むプレートの上に５分間置き、次いで持ち上
げ、かつ０．５ＮＮａＯＨ／１．５ＭＮａＣｌのプ
ールの上に５分間置くことによりフィルターを溶解し、
次いで同じ緩衝液に５分間浸漬した。フィルターを０．
５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）、１．５ＭＮａＣ
ｌに５分間ずつ２回浸漬することにより中和した。１Ｍ
ＮＨ₄ＯＡｃに２分間洗浄してそれを空気乾燥し、２
時間８０℃で加熱した。

【００９６】０．２％ポリビニル−ピロリドン、０．２
％フィコール（ＭＷ４０００００）、０．２％ウシ血清
アルブミン、０．０５Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．
５）、１ＭＮａＣｌ、０．１％ピロリン酸ナトリウ
ム、１％ＳＤＳ、１０％デキストランサルフェイト（Ｍ
Ｗ５０００００）及び１００μｇ／ｍｌｔＲＮＡ中の
オリゴヌクレオチドプローブ１６へフィルターを予備ハ
イブリッド形成及びハイブリッド形成をした。オートラ
ジオグラフィーによってλ−ｃＤＮＡ配列がハイブリッ
ド形成されたことを検出した。

【００９７】この技術によって、同じプローブを使用し
て低密度で１９正のプラークを取り上げかつスクリーン
した。

【００９８】これらのクローンのＤＮＡを分離し、クー
ソルで消化し、サザンブロート技術によってオリゴマー
プローブ１６及び１８でそれをハイブリッド形成した
［Ｅ．Ｍ．サザン、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、第９８巻、
第５０３−１８頁（１９７５）］。クローンの９つは挿
入ｃＤＮＡを含み、それはトリプチルペプチドＴ１０５
−１０６にコードするプローブ１６へのみならずトリプ
チルペプチドＴ８１にコードするプローブ１８へもハイ
ブリッド形成した。

【００９９】クローンλ８．２１のＤＮＡをＳａＣ１で
消化し、かつｐＵＣ１８のフラグメントをサブクローン
して再結合プラスミドｐＳ２１を生成した。クーソルを
使用して、クローンλ８．２１のインサートを除去も
し、かつそれをｐＵＣ１８にサブクローンして再結合プ
ラスミドｐＸ２１を生成した。次いでこのプラスミドを
マクサムとギルバート［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａ
ｄ．Ｓｃｉ、第７４巻、第５６０頁（１９７７）］の方
法によって配列した。この分析はクローンｐＳ２１はウ
シＭＩＳ蛋白のアミノ酸配列に相当するヌクレオチド配
列を含むことを実証した。このインサートの２０００ｂ
ｐ内で、成熟Ｎ−末端を含んで配列された総ての２３ペ
プチドをコードするＤＮＡ配列であった（即ち、Ａｒｇ
ＧｌｕＧｌｕＶａｌＰｈｅＳｅｒ）。クローンは推定
上、先行配列である１０アミノ酸を上流コードする配列
の３０ｂｐを含有した。

【０１００】総ての成熟蛋白に対するＤＮＡ配列が得ら
れたことを確認するため、コスミドライブラリからのウ
シＭＩＳ（ｃｂｍｉｓｌ５）に対するゲノムクローンを
分離しかつチャーチとギルバート［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ、第８１巻、第１９９１−９５頁
（１９８４）］の方法により５′末端を配列した。この
ことはクローンｐＳ２１のインサートの５′端末から上
流配列を付与した。ＡＴＧは成熟蛋白配列と同じ先行フ
レーム、成熟Ｎ−末端のアルグ残余の７２ｂｐ上流に位
置していた。この７２ｂｐ先行２４アミノ酸にコードし
ている。この先行の１６又は１７アミノ酸は信号配列を
構成しているように思われ、これは蛋白が分泌されるこ
とを可能にする［ホンハイジネ分析、Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．、第１３３巻、第１７−２１頁（１９８
３）から推定した］。残留７又はアミノ酸は引き続き開
裂されて成熟蛋白を生成する（この開裂が蛋白を活性化
するのに必要かどうか明らかでない）。プロモータ配列
ＴＡＴＡは開始メチオニン（３４ｂｐ）から上流に位置
し、このことは５′非翻訳領域が極めて短いことを暗示
する。このことを次の一次拡大実験により確認したが、
これはＲＮＡ開始は開始ＡＴＧの上流約１０ヌクレオチ
ドに起こることを示した。抗認識キナーゼ化オリゴマー
（５′−Ａ＊ＧＴＣＣＣＡＧＧＣＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧ
ＡＴＧＡＧＴＧＣＣＣ３′）がウシ睾丸からのポリＡ⁺
ＲＮＡへハイブリッド形成され、かつ逆転写酵素で拡大
された。これは開始ＡＴＧからの上流のｍＲＮＡ１０又
は１１ヌクレオチドの５′端末を配置した。この分析
は、５８Ｋｄ蛋白に対しコードするウシＭＩＳに対する
総ての遺伝子が分離されたことを証明した。ＤＮＡ配列
を図４−図８に示す。最初の１００ｂｐはプロモータと
５′非転写範囲を含む。ウシＭＩＳ蛋白と３′非転写配
列の８１ｂｐをコードする１８７５ｂｐがこれに続く。

【０１０１】実施例４ヒトゲノムクローンの分離ウシｃＤＮＡクローンｐＳ２１を使用してヒトコスミド
ライブラリからヒトクローン（Ｃｈｍｉｓ３３）を分離
した。総ての遺伝子を配列したが、この配列は２．８Ｋ
ｄの距離を測る５個のイクスオン中に含まれる。図１０
は一般的ヒト遺伝子の構造を示し、一方図１１〜図１７
はヌクレオチド配列を示している。図１１〜図１７にお
いて、最初の１００ｂｐはヒトプロモータと５′非転写
範囲を含む。範囲をコードする５個の蛋白を含む２６２
２ｂｐがこれに続き、これはＤＮＡ配列の下に示されて
いる。最後の１１２ｂｐは３′非転写範囲である。

【０１０２】実施例５完全な長さのヒトｃＤＮＡの構成次ぎの４つのフラグメントを使用して図１９に示す４つ
の結合方法を介してｐＢＧ３１２（ｐＤ１）の完全な長
さのヒトｃＤＮＡの構成した；１）ｐＧＡＰ１．６から
の２７１ｂｐＳｔｕＩ−ＭｓｔIIフラグメント；２）
ｐＭＩＳＤ／Ｆからの３２３ｂｐＭｓｔII−Ｘｈｏ
Ｉフラグメント；３）ｐＢＧ３１２．ｈｍｉｓからの１
２９９ｂｐＸｈｏＩ−ＳｔｕＩフラグメント；および
４）ｐＢＧ３１２．ｈｍｉｓからの６２５１ｂｐＳｔ
ｕＩフラグメント。ｐＢＧ３１２．ｈｍｉｓの構成は実
施例７に記載されている。ｐＧＡＰ１．６とｐＭＩＳ
Ｄ／Ｆの構成は以下に記載される。

【０１０３】隙間のある変異誘発を介して最初のイント
ロンがないプラスミドｐＧＡＰ１．６を生成した。Ｃｈ
ｍｉｓ３３（図１０）からの１６０００ｂｐＰｖｕIIフ
ラグメントをｐＵＣ１８のＳｍａＩ部位のサブクローン
化してｐＵＣ１８．ＰＶ２を生成した。このプラスミド
はＳｓｐＩで直線化し、変性し、次いでＳｔｕＩとＭｓ
ｔIIで消化した変性ｐＵＣ１８．ＰＶ２へ煮もどしし
た。これにより消化ＳｓｐＩとｐＵＣ１８．ＰＶ２消化
のＳｔｕＩとＭｓｔIIの間の２重ハイブリッドの形成が
可能となった。エクソン１の３′端末とエクソン２の
５′端末とからの配列を含むオリゴマを２重ハイブリッ
ドへ煮もどした（即ち、最初のイントロンをなくすこ
と）。ＤＮＡポリメラーゼ１−大フラグメントを使用し
て第２次鎖を合成した。Ｅコリを転換しかつ³²Ｐ標識付
けしたオリゴマでコロニーをスクリーンした。正クロー
ン、ｐＧＡＰ１．６を同定し、次いでそれを配列して最
初のイントロンが除去されたことを実証した。４つの結
合方法に対して２７１ｂｐＳｔｕＩ−ＭｓｔIIフラグ
メントを分割した（図１９）。

【０１０４】イントロン２、３および４を除いたｐＭＩ
ＳＤ／Ｆの構成は２工程を含んだ。第１工程におい
て、ｐＢＧ３１２でトランスフェクト化されたＣＯＳ細
胞から分離したＲＮＡより作ったλｇｔ１０ｃＤＮＡラ
イブラリからのラムダクローンλＭＩＳ２１を分離した
（実施例７参照）。このクローンのインサートを配列し
て、イントロン３および４が除かれたことを決定した。
第２工程において、エクソン３からエクソン５の５′端
末へ隔てるλＭＩＳ２１の２６９ｂｐＡｖａＩＸｈｏＩ
フラグメントを分離し、かつそれをリンカーとベクトル
ｐｃＨＳＡ３５のＸｈｏＩ−ＨｉｎｄIII フラグメント
へ結合した。リンカーはエクソン２のＭｓｔII部位から
エクソン３のＡｖａＩ部位へのＤＮＡ配列を含むが、イ
ントロン２を除いた６３ヌクレオチドの２つのオリゴマ
を合成することにより作られた。更に、リンカーは、
５′端末のＨｉｎｄIII 部位をコードするＤＮＡ配列を
含んだ（ＭｓｔII部位に調節）。３つの結合方法はイン
トロン２、３および４が除かれたプラスミドｐＭＩＳ
Ｄ／Ｆを生成した。次ぎに３２３ｂｐＭｓｔII−Ｘｈ
ｏＩフラグメントを４つの結合方法に対して分離した
（図１９）。

【０１０５】ｐｃＨＳＡ３５はプラスミドｐｃＨＳＡ３
６から構成された。ｐｃＨＳＡ３６はロックビイルマ
リーランドにあるアメリカ型培養収集の培養収集中に１
９８２年１２月９日に預けられ、そこにてＨＳＡ−Ｂと
して同定され、ＡＴＣＣ登録番号３９２５３が割り当て
られた。

【０１０６】ｐｃＨＳＡ３６を限定酵素ＢｓｔＥIIで消
化して完成し、エクソンヌクレアーゼＢａ１３１で鈍い
端末とし、続いて限定酵素ＢａｍＨＩで消化し、次にＤ
ＮＡポリメラーゼＩ−大フラグメントで鈍い端末化した
粘性端末とした。得られた直線プラスミドを結合により
環化し、単一ＸｈｏＩ部位を含むプラスミドを分離し
て、ｐｃＨＳＡ３５と命名した。

【０１０７】実施例６ウシ遺伝子の発現ウシｃＤＮＡクローン（ＰＸ２１）からの配列とウシゲ
ノムコスミドクローン（ｃｂｍｉｓ．１５）からの配列
とを動物細胞の発現ベクターｐＢＧ３１１において組合
せることにより、ＣＯＳ細胞およびＣＨＯ細胞において
全ウシ蛋白を発現させた（図９）。発現は、ノーザンお
よびＳ１分析にとりＲＮＡを分析して検出することがで
きる。さらに、組換ウシＭＩＳは、ＲＩＡによりおよび
器官培養分析により検出することができる。プラスミド
ｐＢＧ３１１．ｂｍｉｓを有するイー・コリ菌株ＪＭ８
３をインビトロ・インターナショナル・インコーポレー
ション委託機関に受託番号第ＩＶ１１００９０号として
寄託した。

【０１０８】実施例７動物細胞におけるヒト遺伝子の発現ヒトＭＩＳ遺伝子を動物細胞にて発現させるため、ｃｈ
ｍｉｓ３３からの４．５ＫｂＡｆｌII断片をゲート等に
より記載されるように［セル第４５巻、第６８５〜６９
８頁（１９８６）］動物細胞発現ベクターｐＢＧ３１１
およびｐＢＧ３１２中へ挿入して、ｐＢＧ３１１．ｈｍ
ｉｓとｐＢＧ３１２．ｈｍｉｓとをそれぞれ生成させた
（図１８）。ｐＢＧ３１１はＳＶ４０早期プロモータを
用いる一方、ｐＢＧ３１２は発現を始動させるためにア
デノウイルス−２の主後期プロモータを使用した。これ
らの作成物をＣＯＳ細胞［欠失ＳＶ４０形質転換サル細
胞、グルツマン、セル第２３巻、第１７５〜１８２頁
（１９８１）］中に導入して一時的に発現させ、次いで
支那ハムスター卵細胞（ＣＨＯ）［チェイシンおよびウ
ルラウブ、ＰＮＡＳ第７７巻、第４２１６〜４２２０頁
（１９８０）］中に挿入して安定的に発現させた。

【０１０９】ソムペイラックおよびドンナのＤＥＡＥ／
デキストラン法［ＰＮＡＳ第７８巻、第７５７５〜７５
７８頁（１９８１）］を用いてＣＯＳ細胞にｐＢＧ３１
２．ｈｍｉｓをトランスフェクトさせた。Ｓ１分析を使
用して、ヒトＭＩＳ遺伝子が転写されかつＲＮＡがスプ
ライスされることを示した。次いで、器官培養分析［ド
ナホーエ等、Ｊ．Ｓｒｕｇ．Ｒｅｓ、第２３巻、第１４
１〜１４８頁（１９７７）］を使用して、ヒトＭＩＳ遺
伝子をトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞が生物学上活
性なＭＩＳを分泌することを示した。ｐＢＧ３１２．ｈ
ｍｉｓをインフェクトさせたＣＯＳ細胞からの状態調節
した培地はこの分析においてミュレル管の等級３の退行
を生じたのに対し、ヒト組織プラスミノーゲン活性化ｃ
ＤＮＡをトランスフェクトさせたＣＯＳ細胞からの比較
培地および状態調節培地は退行を生ぜしめなかった。こ
のことは、ヒトＭＩＳ遺伝子をトランスフェクトさせた
ＣＯＳ細胞が生物学上活性なＭＩＳを分泌してラットの
ミュレル管の退行をインビトロで生ぜしめることを示し
ている。

【０１１０】ＣＨＯ細胞にてヒトＭＩＳ遺伝子を発現さ
せるため、プラスミドｐＢＧ３１１．ｈｍｉｓおよびプ
ラスミドｐＳＶ２ＤＨＦＲ［サブラマニ等、モレキュラ
・セル・バイオロジー、第１巻、第８５４〜８６４頁
（１９８１）］をジヒドロホレートレダクターゼが欠失
しているＣＨＯ細胞中へシャイル等の方法［ＰＮＡＳ第
８０巻、第４６５４〜４６５８頁（１９８３）］により
導入した。ヌクレオシドを欠失している培地中で増殖し
た２５種のクローンを選択し、これらをＴ７５フラスト
へ拡大させた。これらのクローンから全ＲＮＡを分離
し、かつＳ１分析によりヒトＭＩＳｍＲＮＡの存在につ
き分析し、これらのクローンのうち１０種がヒトＭＩＳ
ｍＲＮＡを含有していた。次いで、ＭＩＳｍＲＮＡにつ
き陽性の１種の細胞ライン、３１１〜２２から得た状態
調節培地を器官培養分析で試験した。これは器官培養分
析にてミュレル管の等級３〜４の退行を生じたのに対
し、比較細胞ラインＧ２からの状態調節培地は退行を示
さなかった。

【０１１１】細胞ライン３１１〜２２の状態調節培地か
らのヒト組換ＭＩＳをレンチル−レクチンクロマトグラ
フィーによって部分精製し、かつ２種の異なる抗体を用
いてウエスタンブロットで分析した［トゥビン等、ＰＮ
ＡＳ、第７６巻、第４３５０頁（１９７９）］。一方の
抗体は変性ウシＭＩＳに対して生じたのに対し、他方は
ヒトＭＩＳのペプチドに対して生じた。両者の場合、こ
れらの抗体は分子量約７０，０００を有する３１１〜２
２の状態調節培地にて蛋白を識別した。比較ＣＨＯ細胞
ラインＧ２の状態調節培地には、検出し得る蛋白が存在
しなかった。このことは、ＣＨＯ細胞で作成されたヒト
ＭＩＳが新生児睾丸から分離したウシＭＩＳと同レベル
もしくはほぼ同レベルまでグリコシル化されていること
を示す。さらに、ＣＨＯ細胞を［Ｈ³］−グリコサミン
の存在下で２４時間増殖させることにより、これらＣＨ
Ｏ細胞で産生されたＭＩＳを標識した。次いでグリコ蛋
白を状態調節培地からレンチル−レクチン−セファロー
スによりバッチ精製し、かつＭＩＳを変性ウシＭＩＳに
対する抗体で免疫沈澱させた。

【０１１２】組換ＭＩＳの性質および構造を確認した。
クローン３１１−２Ａ９Ｂ７（３０ｎＭメソトレキセー
トで増殖）からの状態調節された血清フリー培地を限外
濾過によって濃縮し、かつグリコ蛋白をレンチル−レク
チンで抽出した。７０ＫｄバンドをＳＤＳ−ＰＡＧＥ後
のクーマシー染色により検出したが、これは陰性比較と
して作用する細胞ラインの状態調節培地には存在しなか
った。２−Ｄゲル電気泳動（非減成−減成）を行なっ
て、ヒト組換ＭＩＳがジスルフィド減成二量体であるこ
とを示した。蛋白のＣＮＢｒ地図は、ＭＩＳの公知メチ
オニン分布と一致する断片のパターンを示した。４００
ｍｌの状態調整された血清フリー培地からの７０Ｋｄバ
ンド２０μｇのレンチル−レクチンとゲル濾過クロマト
グラフィーとの組合せにより部分精製した。調製用ＳＤ
Ｓゲルから蛋白を電気溶出させ、蛋白の微小配列分析を
行なった。組換蛋白のアミノ末端はＬＲＡＥＥであっ
て、ヒトＭＩＳがＣＨＯ細胞により正確に処理されたこ
とを示している。

【０１１３】ＣＨＯ細胞ラインにおけるＭＩＳの発現レ
ベルは、メソトレキセート始動の遺伝子増幅により増大
させることができる［カウフマンおよびシャープ、Ｊ．
Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ、第１５９巻、第６０１〜６２１頁
（１９８２）］。

【０１１４】プラスミドｐＢＧ３１２．ｈｍｉｓを有す
るイー・コリ菌株ＪＡ２２１をインビトロ・インターナ
ショナル・インコーポレーション寄託機関に受託番号第
ＩＶ１１００８９号として寄託した。

【０１１５】実施例８ヒトｃＤＮＡの発現実施例５に記載したプラスミドｐＤ１は、動物発現ベク
ターｐＢＧ３１２における全長ｃＤＮＡ配列を含有す
る。プラスミドｐＤ１は、ソムペイラックおよびドンナ
のＤＥＡＥ／デキストラン法［ＰＮＡＳ第７８巻、第７
５７５〜７５７８頁（１９８１）］によりＣＯＳ細胞中
に導入してヒトＭＩＳを産生させることができる。全ヒ
トｃＤＮＡ配列はＡｆｌIIを用いてプラスミドｐＤ１か
ら除去してｐＢＧ３１１のＳｍａ１部位に挿入すること
により、ＣＨＯ細胞にてヒトｃＤＮＡを発現させること
ができる。

【０１１６】全長ヒトｃＤＮＡ挿入物を含有するｐＤ１
の挿入物を除去してイー・コリおよび酵母ベクター中に
挿入し、イー・コリおよび酵母中でヒトＭＩＳを発現さ
せることができる。これらの作成物は、完全ヒトＭＩＳ
蛋白をコードするＤＮＡ配列または成熟ヒトＭＩＳ蛋白
をコードするＤＮＡ配列を含有することができる。

【０１１７】以上、本発明を多くの実施例につき説明し
たが、この基本構成を改変して本発明の方法及び組成物
を用いる他の実施態様を提供し得ることが了解されよ
う。

【０１１８】

【発明の効果】本発明に係るＭＩＳ様ポリペプチドは、
卵巣癌やその他の感受性癌を処置するのに有用である。

【図面の簡単な説明】

【図１】ウシＭＩＳのトリプチンペプチドの配列分析か
ら得られたアミノ酸配列を示すものであって、得られた
２３種の配列のうち２種のみを示す説明図である。

【図２】ウシｃＤＮＡクローンを分離するために使用し
た化学合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ試料の１６種のプ
ールを示す説明図である。

【図３】図２に続く、ウシｃＤＮＡクローンを分離する
ために使用した化学合成オリゴヌクレオチドＤＮＡ試料
の１６種のプールを示す説明図である。

【図４】全長のｃＤＮＡ配列およびプロモータ領域を包
含するウシ遺伝子のヌクレオチド配列を示す説明図であ
る。

【図５】図４に続く、全長のｃＤＮＡ配列およびプロモ
ータ領域を包含するウシ遺伝子のヌクレオチド配列を示
す説明図である。

【図６】図５に続く、全長のｃＤＮＡ配列およびプロモ
ータ領域を包含するウシ遺伝子のヌクレオチド配列を示
す説明図である。

【図７】図６に続く、全長のｃＤＮＡ配列およびプロモ
ータ領域を包含するウシ遺伝子のヌクレオチド配列を示
す説明図である。

【図８】図７に続く、全長のｃＤＮＡ配列およびプロモ
ータ領域を包含するウシ遺伝子のヌクレオチド配列を示
す説明図である。

【図９】本発明のウシＤＮＡ配列を発現させるために使
用しうるプラスミドｐＢＧ３１１．ｂｍｉｓｓの作成を
示す説明図である。

【図１０】ヒトゲノムクローンｃｈｍｉｓ３３を示しか
つこれをウシｃＤＮＡクローンｐＳ２１と比較し、実線
ブロックは蛋白コード化領域を含むエクソンを示すもの
である。

【図１１】コスミドクローンｃｈｍｉｓ３３におけるヒ
ト遺伝子のヌクレオチド配列を示す説明図であり、蛋白
配列をＤＮＡ配列の下に示し、かつこれは４個所でイン
トロンにより中断されるものである。

【図１２】図１１に続く、コスミドクローンｃｈｍｉｓ
３３におけるヒト遺伝子のヌクレオチド配列を示す説明
図である。

【図１３】図１２に続く、コスミドクローンｃｈｍｉｓ
３３におけるヒト遺伝子のヌクレオチド配列を示す説明
図である。

【図１４】図１３に続く、コスミドクローンｃｈｍｉｓ
３３におけるヒト遺伝子のヌクレオチド配列を示す説明
図である。

【図１５】図１４に続く、コスミドクローンｃｈｍｉｓ
３３におけるヒト遺伝子のヌクレオチド配列を示す説明
図である。

【図１６】図１５に続く、コスミドクローンｃｈｍｉｓ
３３におけるヒト遺伝子のヌクレオチド配列を示す説明
図である。

【図１７】図１６に続く、コスミドクローンｃｈｍｉｓ
３３におけるヒト遺伝子のヌクレオチド配列を示す説明
図である。

【図１８】本発明のヒトＤＮＡ配列を発現させるために
使用し得るプラスミドｐＢＧ３１１．ｈｍｉｓｓおよび
ｐＢＧ３１２．ｈｍｉｓｓの作成を示す説明図である。

【図１９】本発明のヒトＤＮＡ配列を発現させるために
使用しうる全長ｃＤＮＡを含むプラスミドｐＤ１の作成
を示す説明図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所Ａ６１Ｋ 35/74 Ｄ 7431−4Ｃ 35/78 Ｃ 7167−4Ｃ 37/02 ＡＤＵ 8314−4ＣＣ０７Ｋ 13/00 8517−4ＨＣ１２Ｎ 1/21 7236−4Ｂ 5/10 15/12 ＺＮＡ //(Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (72)発明者リチャードエルケイトアメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02416、ブルックリン、アパートメント４ビー、ビーコンストリート 1120番 (72)発明者パトリシアケイドナヒューアメリカ合衆国、マサチューセッツ州 02193、ウェストン、アシュストリート 48番

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ミュレル管抑制物質（ＭＩＳ）蛋白の生
物学的または免疫学的活性を示すポリペプチドを製造す
るに際し、（ａ）ＤＮＡ配列、【化１】【化２】【化３】【化４】【化５】【化６】【化７】よりなる群から選択されるＤＮＡ配列のいずれかにハイ
ブリッド形成しかつヒトまたはウシＭＩＳ蛋白の生物学
的または免疫学的活性を示すポリペプチドをコードする
ＤＮＡ配列、および（ｂ）前記特定したＤＮＡ配列のい
ずれかに遺伝子コードの結果として縮退したものであり
かつヒトまたはウシＭＩＳ蛋白の生物学的または免疫学
的活性を示すポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、よ
りなる群から選択されるＤＮＡ配列を含み、かつ前記Ｄ
ＮＡ配列が組換ＤＮＡ分子中の発現制御配列に作用結合
される組換ＤＮＡ分子によって形質変換された宿主を培
養する工程からなることを特徴とするポリペプチドの製
造方法。
【請求項２】組換ＤＮＡ分子を、ｐＢＧ３１１．ｂｍ
ｉｓ、ｐＢＧ３１１．ｈｍｉｓおよびｐＢＧ３１２．ｈ
ｍｉｓよりなる群から選択する請求項１記載の方法。
【請求項３】宿主が、イー・コリ、シュードモナス、
バチルス、酵母および培養された動物細胞からなる請求
項１記載の方法。
【請求項４】動物細胞が、ＣＯＳ、ＣＨＯ細胞、マウ
ス細胞、ブタ細胞および培養されたヒト組織細胞よりな
る群から選択された請求項３記載の方法。
【請求項５】式【化８】およびヒトＭＩＳ蛋白の生物学的または免疫学的活性を
示すこれらの断片よりなる群から選択されるヒトＭＩＳ
蛋白の生物学的または免疫学的活性を示す組換ポリペプ
チド。
【請求項６】式【化９】およびウシＭＩＳ蛋白の生物学的または免疫学的活性を
示すこれらの断片よりなる群から選択されるウシＭＩＳ
蛋白の生物学的または免疫学的活性を示す組換ポリペプ
チド。
【請求項７】抗癌上有効量の請求項５または６記載の
少なくとも１種のポリペプチドと、医薬上許容し得るキ
ャリヤとからなる感受性癌を処置するための医薬組成
物。
【請求項８】処置を必要とする患者に抗癌上有効量の
請求項６記載のポリペプチドを投与することからなる感
受性癌の処置方法。