MXPA06008918A - Metodos de tratamiento de trastornos de la piel. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan metodos de tratamiento de trastornos de la piel.

Description

MÉTODOS DE TRATAMIENTO DE TRASTORNOS DE LA PIEL CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención concierne a métodos de tratamiento de una variedad de condiciones, incluyendo condiciones mediadas por células T. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN La psoriasis afecta a 4.5 millones de adultos en los Estados Unidos, AMEVIVE® (Alefacept) es un agente biológico aprobado para uso al tratar psoriasis. SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona métodos de tratar una variedad de condiciones, incluyendo condiciones mediadas por células T, por ejemplo condiciones mediadas por células T de memoria, por ejemplo, condiciones de la piel tales como psoriasis, dermatitis atópica, linfoma de células T cutáneo, dermatitis por contacto irritante y alérgica, liquen plano, alopecia areata, gangrena cutánea, vitíligo, penfigoide cicatrizal ocular, daños por rayos UV y urticaria. Los métodos descritos en la presente conciernen a la administración de ciclos múltiples de un inhibidor de la interacción LFA-3/CD2, por ejemplo, un polipéptido de LFA-3 soluble, por ejemplo una proteína de fusión LFA-3-Inmunoglobulina (Ig) tal como AMEVIVE® (Alefacept) (en lo sucesivo AMEVIVE) . Se ha encontrado que ciclos múltiples de tratamiento con dichos agentes proporcionan resultados más significativos (por ejemplo, períodos de remisión notablemente más prolongados) que un ciclo único de terapia o un ciclo doble de terapia con, sorprendentemente, ningún riesgo adicional aparente de efectos secundarios. En una modalidad preferida, los métodos descritos en la presente conciernen al tratamiento de psoriasis. Por consiguiente, en un aspecto, la invención caracteriza un método de tratar una condición, por ejemplo, una condición de la piel tal como psoriasis u otra condición de la piel descrita en la presente. En una modalidad, la condición es una mediada por células T efectoras de memoria. El método incluye administrar una corrida múltiple de tratamiento (preferiblemente al menos tres ciclos de tratamiento) de un polipéptido de LFA-3 que enlaza a CD2, soluble a un sujeto. Preferiblemente, el polipéptido de LFA-3 que enlaza a CD2 es una proteína de fusión de LFA-3, por ejemplo, una proteína de fusión de LFA-3/inmunoglobulinas (Ig) . Una proteína de fusión de LFA-3/lg ejemplar incluye un polipéptido de LFA-3 que enlaza a CD2, soluble fusionado a toda o parte de una región Fe de una IgG, por ejemplo, fusionada a toda o parte de una región de articulación de cadena pesada de IgG y a toda o parte de una región constante de cadena pesada. En una modalidad preferida, la proteína de fusión con Ig consiste de 92 aminoácidos amino terminales de LFA-3 maduro, los 10 aminoácidos C-terminales de una región de articulación de IgGl humana, una región CH2 de una cadena pesada de IgGl humana, t toda o parte de una región CH3 de una cadena pesada de IgGl humana. Una proteína de fusión tal es AMEVIVE. AMEVIVE es codificada por un inserto contenido en el plásmido pSAB152, depositado con American Type Culture Collection bajo el número de acceso ATCC 68720. AMEVIVE es descrita con más detalle posteriormente en la presente. La corrida múltiple de tratamiento incluye al menos tres ciclos de tratamiento, cada ciclo que incluye (a) un período de administración durante el cual un agente terapéutico es administrado al menos dos veces, seguido por (b) un período de descanso durante el cual el agente terapéutico no es administrado, en donde el período de descanso es substancialmente más prolongado que el intervalo entre administraciones (IA) en el ciclo, y preferiblemente al menos tan prolongado como el período de administración. En algunas modalidades, la corrida múltiple incluye al menos cuatro ciclos, cinco ciclos, seis ciclos, siete ciclos, ocho ciclos, nueve ciclos, diez ciclos, once ciclos de tratamiento o más. El período de administración de cada ciclo de la corrida múltiple puede ser preseleccionado o es determinado por, por ejemplo, un proporcionador de atención médica para el paciente particular. Típicamente, el período de administración es suficientemente prolongado para provocar una respuesta terapéutica, por ejemplo, para provocar un nivel seleccionado de remisión que se determina por medio de una medición clínica tal como la evaluación PASI. En algunas modalidades, el período de administración es de al menos 8 semanas, de al menos 10 semanas, de al menos 12 semanas, de al menos 14 semanas, de al menos 20 semanas o más, pero es típicamente de entre 4 y 24 semanas. En una modalidad preferida, cada ciclo consiste de 12 semanas de administración una vez semanalmente del polipéptido seguido por 12 semanas de descanso durante las cuales el paciente es evaluado al menos una vez para un efecto del agente, por ejemplo, un efecto terapéutico o un efecto secundario. En una modalidad preferida, el período de descanso de cada ciclo sucesivo de la corrida múltiple es más prolongada que el período de descanso de un ciclo previo en la corrida múltiple. En algunas modalidades, el período de descanso del último ciclo de la corrida múltiple puede ser de al menos 2 años, de al menos 18 meses, de al menos 3 años, de al menos 4 años, cinco años o más prolongado. El polipéptido LFA-3 de enlace a CD2 puede ser administrado en un dosificación que varía desde aproximadamente 0.001 a aproximadamente 50 mg de agente de enlace por kg de peso corporal. En una modalidad, el polipéptido res administrado de manera generalizada, preferiblemente por ruta intramuscular (IM) o intravenosa (IV) . El período de administración típicamente incluye la administración periódica del polipéptido, por ejemplo, una vez por semana, dos veces por semana, semi-semanalmente, o mensualmente. El polipéptido es típicamente administrado en una dosificación unitaria que varía desde 2 a 15 mg cuando se administra por ruta IV (por ejemplo, bolus de 7.5 mg) y una dosificación unitaria que varía desde 2 a 30 mg cuando se administra por ruta IM (por ejemplo, inyección IM de 10 o 15 mg) . En una modalidad el método incluye evaluar al sujeto por los efectos del polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble durante uno o ambos del período de administración y el período de descanso de cada ciclo en la corrida múltiple. En una modalidad, el método incluye administrar al sujeto un agente profiláctico o terapéutico adicional durante la corrida múltiple de tratamiento, por ejemplo, radiación de rayos UV (por ejemplo, radiación por rayos UV b) ciclosporina A, prednisona, FK506, metotrexate, esteroides, retinoides, interferon y mostaza nitrogenada.

El agente adicional puede ser administrado durante el período de administración, durante el período de descanso, o ambos, durante uno o más ciclos. El sujeto es preferiblemente un humano. Los sujetos preferidos incluyen aquellos que tienen síntomas de un trastorno de la piel mediado por células T tal como psoriasis, por ejemplo, proliferación de células dérmicas, formación elevada de placas rojas, escamosidad, prurito, agrietamiento, picazón, quemaduras o placas sangrantes, y aquellos que han sido diagnosticados con psoriasis . En otro aspecto, la invención presenta métodos de tratar a un sujeto que tiene psoriasis. El método incluye (a) seleccionar a un sujeto que ha tenido al menos dos ciclos, por ejemplo, seleccionar a un sujeto con la base de haber tenido al menos dos ciclos, de tratamiento con un polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble, y (b) administrar un ciclo adicional, por ejemplo, un tercer, cuarto, quinto, sexto, séptimo, octavo, noveno, décimo o más ciclos de tratamiento de un polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 al sujeto. En otro aspecto, la invención presenta métodos de tratar a un sujeto, o de avisar o aconsejar a un sujeto ser tratado, con un polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 descrito en la presente. El método incluye instruir o proporcionar instrucciones a un sujeto, o a otro individuo, por ejemplo, a un proporcionador de atención médica, por ejemplo, un médico, una enfermera, un empleado de un hospital, HMO u otra entidad que proporcione atención médica, que al sujeto puede administrarse una corrida múltiple del tratamiento descrito en la presente. Los métodos descritos en la presente pueden ser usados para tratar cualquier condición mediada por células T efectoras de memoria. Los métodos descritos en la presente pueden ser usados para tratar condiciones de la piel tales como psoriasis y escleroderma, y condiciones no de la piel tales como enfermedades intestinales inflamatorias, artritis psoriática, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, y escleroderma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Las Figuras ÍA y IB presentan las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de una proteína de fusión de LFA-3/lgG. El péptido de señal corresponde a los aminoácidos 1-28 de la Figura Ia; la región LFA-3 madura corresponde a los aminoácidos 29-120 de la Figura Ia; y la región IgGl corresponde a los aminoácidos 121-347 de la Figura ÍA. La Figura 2 es una gráfica de barras del porcentaje de pacientes de psoriasis que lograron PASI 50 a 2 u 12 semanas después de tratamiento para los ciclos A-D de una corrida múltiple de tratamiento con AMEVIVE . La Figura 3, es una gráfica del beneficio y repetición de respuesta en una corrida múltiple de tratamiento con AMEVIVE para psoriasis. La Figura 4, es una gráfica de barras de la longitud máxima de tiempo de respuesta en cuatro pacientes de psoriasis que recibieron una corrida múltiple de tratamiento con AMEVIVE. La Figura 5, es una gráfica de las cuentas de células T CD4+ medias para pacientes que tienen una corrida múltiple de tratamiento con AMEVIVE. La Figura 6A es una gráfica del porcentaje de pacientes que lograron PASI 75 a cualquier tiempo de duración de una corrida múltiple de tratamiento intravenoso (IV) con AMEVIVE . La Figura 6B es una gráfica del porcentaje de pacientes que lograron PASI 50 a cualquier tiempo de duración de una corrida múltiple de tratamiento IV con AMEVIVE . La Figura 7A es una gráfica del porcentaje de pacientes que lograron unas respuestas de PGA de "clara" o "casi clara" a cualquier tiempo de duración de una corrida múltiple de tratamiento IV con AMEVIVE. La Figura 7B es una gráfica del porcentaje de pacientes que lograron unas respuestas de PGA de "clara" o "casi clara" a cualquier tiempo de duración de una corrida múltiple de tratamiento IM con AMEVIVE .

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Los métodos descritos en la presente conciernen generalmente a terapia de corrida múltiple con un polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble, para el tratamiento de trastornos medados por células T (por ejemplo psoriasis) . Se encontró que la terapia de corrida múltiple proporciona períodos de remisión más prolongados que un ciclo individual o doble de terapia con, sorprendentemente, ningún riesgo adicional aparente de efectos secundarios . Tratamiento de Corrida Múltiple Como se usa en la presente, un "ciclo" de tratamiento incluye (a) un período de administración durante el cual un agente terapéutico es administrado al menos dos veces (el intervalo entre administraciones es mencionado como IA) , seguido por (b) un período de descanso durante el cual no se administra el agente terapéutico. El período de descanso es substancialmente más prolongado, por ejemplo, al menos 4-5 veces más prolongado, que le IA máximo, y es preferiblemente al menos tal prolongado como el período de administración. Durante el período de administración del ciclo, el agente puede ser administrado al menos 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18 o 20 veces a (intervalos (preferiblemente regulares) . Típicamente, el período de administración es suficientemente prolongado para que un paciente exhiba un nivel pre-seleccionado de mejoramiento de la enfermedad, por ejemplo, una evaluación de PASI pre-seleccionada, , por ejemplo, PASI 50 o PASI 75. El período de descanso puede incluir monitorear al paciente para una respuesta al agente terapéutico (por ejemplo, un efecto terapéutico o un efecto secundario) . En un ciclo preferido, el agente es administrado una vez a la semana durante un período de administración de 12 semanas seguido por un período de descanso de 12 semanas durante el cual el paciente es evaluado por un proporcionador de atención médica al menos una vez . En la modalidad preferida habrá menos de 50, 40, 30, 20 o 15 administraciones durante el período de administración. En modalidades preferidas el mayor intervalo entre cualquiera de dos administraciones adyacentes (IA) en el período de administración del ciclo es de menos de 30, menos de 20, menos de 15 o menos de 10 días. En modalidades preferidas, el intervalo entre administraciones es de aproximadamente una semana. El período de administración del ciclo puede variar con respecto a la estrategia de dosificación. Por ejemplo, si el período de administración es medido en semanas o meses, el período de administración puede incluir la administración mensual, semanal, bi-semanal , semi-semanal o diariamente del agente por un número específico de semanas, como determinó un practicante médico para un paciente particular. Un período de administración preferido de un ciclo incluye aproximadamente 6-24 administraciones con un IA de 3-15 días. Más preferiblemente, el período de administración de un ciclo incluye aproximadamente 10-14 administraciones con un IA de 5-9 días. En algunos casos el período de descanso es tanto o más prolongado que el período durante el cual el agente tiene un efecto remitivo substancial sobre el paciente, que se midió por una medición clínica estándar. Por ejemplo, el período de descanso para un paciente de psoriasis durante un ciclo de tratamiento puede ser el período durante el cual una evaluación específica del índice de Severidad y Área de Psoriasis (PASI) (por ejemplo, PASI 50 o PASI 75) o una Evaluación General Medica (PGA) (PGA) (por ejemplo, LGA "clara" o "casi clara") es mantenida, o más prolongada. No obstante, un período de descanso que sea al menos tan prolongado como el período de remisión es típicamente entre 1 y 10 años, por ejemplo, entre 2 y 10 años, por ejemplo, entre 2 y 5 años. En algunas modalidades, el período de descanso es de al menos 1 año, preferiblemente de al menos 18 meses, 2 años, 30 meses, 36 meses, 48 meses o más prolongado. Una "corrida múltiple de tratamiento" quiere decir al menos tres ciclos de tratamiento. Los ciclos en una corrida múltiple de tratamiento puede ser idéntica pero no necesariamente idéntica, por ejemplo, pueden ser diferentes en la estrategia de dosificación durante el período de administración; o en duración de ya sea el IA, extensión del período de administración, período de descanso, o ambos. Por ejemplo, una corrida múltiple de tratamiento puede incluir (a) un primer ciclo que consiste de 12 semanas de administración una vez semanalmente de AMEVIVE seguido por 12 semanas de descanso, seguido por (b) un segundo ciclo que consiste de 12 semanas de administración de AMEVIVE una vez semanalmente seguido por un período de descanso de un año durante el cual el agente tiene un efecto remitivo substancial, seguido por (c) un tercer ciclo que consiste de 10 semanas de administración semi-semanalmente del agente terapéutico seguido por dos años de descanso, seguido opcionalmente por (d) ciclos sucesivos, por ejemplo, cuatro, cinco, seis, siete, ocho o más ciclos adicionales. En modalidades preferidas, el período de descanso y el efecto remitivo incrementan con el número creciente de ciclos durante una corrida múltiple de tratamiento. El incremento en la duración del período de descanso o del efecto remitivo con cada ciclo creciente de tratamiento es preferiblemente de al menos 10 %, más preferiblemente de al menos 15 % o 20 %, más preferiblemente de al menos 25 %, 30 %, 40 %, 50 % o más. En algunas modalidades, el período de descanso y el efecto remitivo del tercer ciclo (y/o ciclos subsecuentes) en una corrida múltiple de tratamiento es de al menos 18 meses, preferiblemente de al menos 2 años, más preferiblemente de al menos 30 meses, 36 meses, 42 meses, 48 meses o más. Inhibidores de la Interacción de CD2.LFA-3 Cualquier inhibidor de la interacción de CD2:LFA-3 es útil en los métodos de esta invención. Dichos inhibidores incluyen polipéptidos de LFA-3 solubles, homólogos del anticuerpo anti-LFA-3, homólogos del anticuerpo anti-CD2, polipéptidos de CD2 soluble, moléculas pequeñas (por ejemplo, un agente químico que tenga un peso molecular de menos de 2500 Da, preferiblemente, menos de 1500 Da, un producto químico, por ejemplo, una molécula orgánica pequeña, por ejemplo un producto de una biblioteca combinatoria) , agentes miméticos de LFA-3 y CD2 y derivados del mismo. Los inhibidores preferidos para uso en los métodos descritos en la presente son polipéptidos de LFA-3 de enlace a CD2 solubles.

Polipéptidos de LFA-3 y CD2 Soluble Los polipéptidos de LFA-3 soluble y los polipéptidos de CD2 solubles que inhiben la interacción de LFA-3 y CD2 son útiles en los métodos de la presente invención. Los polipéptidos de LFA-3 solubles, en particular se prefieren fusiones de Ig/LFA-3 solubles. Como se usa en la presente, un "polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble es un polipéptido que incluye al menos el dominio de enlace a CD2 de LFA-3 (SEC ID NO: 2) y es incapaz de anclaje por sí mismo en una membrana. Dichos polipéptidos solubles incluyen, por ejemplo, polipéptidos de LFA-3 que carecen de una porción suficiente de su dominio de espaciamiento de membrana para anclar el polipéptido o son modificados de modo que el dominio de espaciamiento de membrana no es funcional. Los polipéptidos de LFA-3 de enlace a CD2 soluble incluye proteínas de fusión solubles que incluyen al menos el dominio de enlace a CD2 de LFA-3 fusionado a un polipéptido heterólogo. En una modalidad, el polipéptido heterólogo es una región Fe de una inmunoglobulina (por ejemplo, una región de articulación de IgGl y dominios de CH2-CH3) o una porción substancial de los mismos. Los polipéptidos de LFA-3 solubles pueden derivarse de la forma transmembrana de LFA-3, particularmente el dominio extracelular (por ejemplo, los aminoácidos 1-187 de la SEC ID NO: 2 de U.S. 6,162,432, la cual se incorpora a la presente como referencia) . Dichos polipéptidos se describen en las Patentes U.S. No. 4,956,281 y No. 6,162,432, las cuales se incorporan a la presente como referencia. Los polipéptidos de LFA-3 solubles preferidos incluyen polipéptidos que incluyen los residuos 1-92 de la SEC ID NO: 2, los residuos 1-80 de la SEC ID NO: 2, los residuos 50-65 de la SEC ID NO: 2 y los residuos 20-80 de la SEC ID NO: 2, en donde la SEC ID NO: 2 se muestran en la Patente U.S. No. 6,162,432. UN vector que comprende una secuencia de ADN (SEC ID NO: 1) que codifica a la secuencia de aminoácidos de la SEC ID NO: 2 es depositada con la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland bajo el Número de Acceso 75107, en donde la SEC ID NO: 1 y 2 se muestran en la US 6,162,432. Los polipéptidos de LFA-3 solubles pueden también ser derivados de la forma ligada a Pl de LFA-3, tales como los descritos en la Solicitud de Patente PCT con No. de Serie WO 90/02181. Un vector que comprende una secuencia de ADN (SEC ID NO: 3) que codifica a LFA-3 ligada a Pl es depositada con la American Type Culture Collection, Rockville, Maryland bajo el Número de Acceso 68788. Se comprende que la forma ligada a Pl de LFA-3 y la forma transmembrana de LFA-3 tiene idénticas secuencias de aminoácidos a través del dominio extracelular completo.

Por consiguiente, los polipéptidos de LFA-3 ligados a Pl preferidos son los mismos que para la forma transmembrana de LFA-3. Los polipéptidos de LFA-3 de enlace a CD2 solubles más preferidos para uso en la presente invención son proteínas de fusión LFA-3/lg. Un ejemplo de una proteína de fusión tales AMEVIVE® (Alefacept) . AMEVIVE® (Alefacept) AMEVIVE es una proteína de fusión que incluye el primer dominio extracelular de LFA-3 humano (CD58) fusionado a una porción Fe de IgGl humana. En particular, AMEVIVE incluye los 92 aminoácidos amino terminales de LFA-3 maduro, Los 10 aminoácidos C-terminales de una región de articulación IgGl humana que contiene los dos residuos cisteina aunque participan en el enlace disulfuro intercadena, y una parte substancial de las regiones CH2 y CH3 de un dominio constante de cadena pesada de IgGl humana (por ejemplo, SEC ID NO: 8) . La proteína es un dímero ligado a disulfuro, glicosilado con un peso molecular de aproximadamente 112 kD bajo condiciones no reductoras de PAGE. La región constante de AMEVIVE tiene variabilidad C-terminal que corresponde a una forma variante empalmada del polipéptido de fusión de extensión total . Un plásmido, pSAB152, que codifica a AMEVIVE es depositado con American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, bajo el Número de acceso ATCC 68720. pMDR(92)Ig-3 es un ejemplo de un vector de expresión que puede ser usado para producir AMEVIVE. pMDR(92)Ig-3 incluye los elementos siguientes: (a) Un segmento de pBR322 que contiene el origen ColEl y el "cassette" de expresión de beta lactamasa (Acceso a GenBank No. J01749) ; (b)el "cassette" de expresión de DHFR que consiste de: promotor precoz de SV40 con el mejorador eliminado (una porción del No. de Acceso a GenBank J02400) , cADN de DHFR de roedor (No. de Acceso a GenBank L26316) , sitio Poli A de SV40, y el intron t pequeño (porciones de No. de Acceso a GenBank J02400) , y secuencia terminadora de transcripción de gastrina humana, 3'UTR (Sato y colaboradores (1986) Mol. Cell Biol. 6: 1032-1043); (c)un "cassette" de expresión de AMEVIVE que incluye preferentemente en el siguiente orden: El mejorador/promotor precoz de SV40 (No. de Acceso a GenBank J02400) , Promotor Tardío Principal de Adenovirus y líder tripartito, que incluye un donador de empalme y una secuencia intrón (una porción de No. de Acceso a GenBank J01917) , secuencia intrón de región variable de cadena pesada de Ig y receptor de empalme (Kaufman y Sharp (1982) Mol Cell Biol. 2: 1304-1319, (opcionalmente) ligadores de clonación, los primeros 92 aminoácidos del gen de LFA-3 como aislado de una biblioteca de cADN de tonsil humano, fusionado en estructura a un ácido nucleico que codifica a las regiones de articulación CH2 y CH3 de un gen de IgGl como aislado a partir de una biblioteca de ADN genómico fibroblástico humano, ligadores de clonación (opcionalmente), región MIS 3'UT que incluye el sitio poli A (No. de acceso a GenBank K03474) , y sitio poli A de SV40 e intrón t pequeño (No. de acceso a GenBank J02400) ; y un segmento de pBR327 (No. de acceso a GenBank L08856) . Las líneas celulares huéspedes que pueden ser usadas para producir AMEVIVE pueden derivarse de células CHO-DukX-Bl. En una modalidad, un mutante de DHFR (-) de esta línea celular puede ser transfectada con el vector pMDR(92) Ig-3, y transformantes de DHFR (+) pueden ser cultivados en medio selectivo (por ejemplo, que contenga 25 nM de metotrexate (MTX) ) . Los transformantes positivos pueden ser sometidos a concentraciones crecientes de MTX (por ejemplo, 50 nM) , y colonias que producen altos niveles de AMEVIVE pueden entonces ser seleccionadas. La producción de AMEVIVE puede llevarse a cabo como sigue: células huéspedes CHO son descongeladas, escaladas hasta un cultivo de 2000 L, mantenidas en cultivo por 6-7 días con control de pH y alimentación de nutrientes (48 horas, 96 horas, y 120 horas), después de lo cual el medio acondicionado es cosechado a través de microfiltración. MTX está presente preferiblemente en el medio de cultivo. Puede recuperarse AMEVIVE a partir del medio acondicionado llevando a cabo las etapas siguientes: (i) cromatografía de Proteína A, (ii) cromatografía de hidroxiapatita de cerámica, (iii) inactivación viral a bajo pH, (iv) cromatografía de interacción hidrofóbica, (v) seguido por concentración, diafiltración, filtración viral, y una segunda etapa de concentración que produce el producto de fusión Otra manera de producir AMEVIVE para uso en los métodos de esta invención se describe en la Solicitud de Patente U.S. con No. de Serie 07/770,967 provisional asignada comúnmente. Generalmente, medio de cultivo acondicionado de células CHO o COS7 transfectadas con pSAB152 fueron concentradas usando el sistema de cartucho espiral AMICON S1Y30 AMICON, Danvers, Massachussetts) y sometido a cromatografía sobre Protein A-Sepharose 4B (Sigma, St. Louis, Missouri) . Las proteínas enlazadas fueron eluidas y sometidas a cromatografía de filtración sobre gel se Sepharose-12 (Pharmacia/LKB, Picataway, New Jersey) . Las fracciones de Sepharose-12 que contenían AMEVIVE con la mínima cantidad de proteínas contaminantes, que se determinó por geles de SDS-PAGE y por análisis por tinción Western, (ver, por ejemplo, Towbin y colaboradores, Proc.

Nati. Acad. Sci. USA, 74 pp. 4350-54 (1979); Antibodies: A Laboratory Manual, pp. 474-510 (Cold Spring Harbor Laboratory (1988) ) , fueron conjuntados y concentrados en un Centricon YM30 (AMICON) . Se detectó AMEVIVE sobre tinciones Western usando un antisuero policlonal anti-LFA-3 de conejo, seguido por IgG anti-conejo de cabra marcado detectablemente. El AMEVIVE purificado de células COS7 y CHO fue un dímero de dos proteínas de fusión LFA-3-Ig, conectadas por enlaces disulfuro. La actividad de la fusión LFA-3-Ig puede ser probada usando los siguientes bioensayos : (1) un ensayo de puenteo de U937 CD32/64 (Fe gama de RI/RII) , y (2) un ensayo de puenteo de células de Jurkat CD16 (Fe gama de RUI) . Ambos ensayos probaron la habilidad de AMEVIVE para puentear células CHO que presentan CD2 de superficie celular a células que expresan a receptores de Fc-gama. Este ensayo, ensayo (2) , involucra cultivar células CD2-CHO adherentes para formar una monocapa en placas de 96 pocilios; añadir controles de AMEVIVE y muestras; añadir células de Jurkat- CD16(+) marcadas fluorescentemente; y medir la intensidad de la fluorescencia. Enlace de la fusión de LFA-3-Ig a CD2 inmovilizado sobre un substrato, por ejemplo, un microelemento, puede también ser usado para probar las proteínas de fusión. Polipéptidos de CD2 Los polipéptidos de CD2 solubles pueden derivarse de CD2 de extensión total, particularmente el dominio extracelular. Dichos polipéptidos pueden comprender todo o parte del dominio extracelular de CD2. Los polipéptidos de CD2 soluble ejemplares se describen en PCT WO 90/08187, la cual se incorpora a la presente como referencia. Producción de Polipéptidos Solubles La producción de los polipéptidos solubles útiles en esta invención puede lograrse por medio de una variedad de métodos conocidos en el arte. Por ejemplo, los polipéptidos pueden derivarse de LFA-3 transmembrana intactos o de moléculas de CD2 o de una molécula LFA-3 ligada a Pl intacto por proteólisis usando endopeptidasas específicas en combinación con exopeptidasas, degradación de Edman o ambas. La molécula de LFA-3 intacta o la molécula de CD2 intacta, a su vez pueden ser purificadas a partir de su fuente natural usando métodos convencionales. De manera alternativa, la LFA-3 o CD2 intactos pueden ser producidos por medio de técnicas de ADN recombinantes conocidas usando cADNs (ver, por ejemplo, la Patente U.S. No. 4,956,281 de Wallner y colaboradores; Aruffo y Seed, Procc. Nati. Acad. Sci., 84 pp. 2941-45 (1987); Sayre y colaboradores, Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 84 pp. 2941-45 (1987)) . Preferiblemente, los polipéptidos solubles útiles en la presente invención son producidos directamente, eliminando así la necesidad de una molécula de LFA-3 entera o de una molécula de CD2 entera como un material inicial. Esto puede lograrse por medio de técnicas de síntesis química convencional o por medio de técnicas de ADN recombinante bien conocidas en donde solamente aquellas secuencias de ADN. que codifican a los péptidos deseados son expresadas en huéspedes transformados. Por ejemplo, un gen que codifica al polipéptido de LFA-3 soluble deseado o al polipéptido de CD2 soluble pueden ser sintetizadas por medios químicos usando un sintetizador oligonucleótido. Dichos oligonucleótidos son diseñados con base en la secuencia de aminoácidos del polipéptido de LFA-3 soluble deseado o del polipéptido de CD2 soluble. Las secuencias de ADN específicas que codifican para el péptido deseado también pueden derivarse de la secuencia de ADN de extensión total por aislamiento de fragmentos de endonucleasa de restricción específicos o por síntesis por PCR de la región específica. Pueden aplicarse métodos estándares para sintetizar a un gen que codifica a un polipéptido de LFA-3 soluble o a un polipéptido . de CD2 soluble que es útil en esta invención. Por ejemplo, puede usarse la secuencia de aminoácidos completa para construir un gen retro- trasladado. Un oligómero de ADN que contiene una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de LFA-3 soluble o para un polipéptido de CD2 soluble útil en esta invención puede ser sintetizado en una sola etapa. De manera alternativa varios oligonucleótidos más pequeños que codifican para porciones del polipéptido deseado pueden ser sintetizados y luego ligados. Preferiblemente, un polipéptido de LFA-3 soluble o un polipéptido de CD2 soluble útiles en esta invención serán sintetizado como varios oligonucleótidos separados que son subsecuentemente ligados juntos. Los oligonucleótidos individuales típicamente contienen suspensiones en 5' o 3' para montaje complementario. Una vez montaos, los genes preferidos serán caracterizados por secuencias que son reconocidas por endonucleasas de restricción (que incluyen sitios de restricción únicos para montaje directo en un vector de clonación o de expresión) codones preferidos que toman en consideración el sistema de expresión del huésped a ser usado, y una secuencia que, cuando es transcrita produce un mARN trasladado eficientemente, estable. El montaje apropiado puede ser confirmado por formación de secuencias de nucleótidos, mapeo de restricción y expresión de un polipéptido activo biológicamente en un huésped adecuado.

Los expertos en la materia apreciarán que, debido a la degeneración del código genético, moléculas de ADN que comprenden muchas otras secuencias de nucleótidos también serán capaces de codificar a polipéptidos de CD2 y de LFA-3 solubles codificados por las secuencias de ADN específicas descritas anteriormente. Estas secuencias degeneran también el código para polipéptidos que son útiles en esta invención. Las secuencias de ADN pueden ser expresadas en huéspedes unicelulares, o preferiblemente en células huéspedes de mamíferos aisladas. Como es bien sabido en el arte, a fin de obtener altos niveles de expresión de un gen transfectado en un huésped, el gen debe de ser operativamente ligado a secuencias de control de expresión translacionales o transcripcionales que son funcionales en el huésped de expresión seleccionado. Preferiblemente, las secuencias de control de expresión, y el gen de interés, estarán contenidos en el vector de expresión que comprende adicionalmente un marcador de selección bacteriana y origen de replicación. Si el huésped de expresión es una célula eucariótica, el vector de expresión puede comprender adicionalmente un marcador de expresión adicional útil en el huésped de expresión. Las secuencias de ADN que codifican a los polipéptidos solubles deseados pueden o no codificar a una secuencia de señal. Si el huésped de expresión e procariótico, generalmente se prefiere que la secuenciad e ADN no codifique a una secuencia de señal. Si el huésped de expresión es eucariótico, generalmente se prefiere que una secuencia de señal sea codificada. Una metionina amino terminal puede estar o no presente en el producto expresado. Si la metionina terminal no es fragmentada por el huésped de expresión, puede, si se desea, ser eliminada químicamente por medio de técnicas estándares . Puede emplearse una amplia variedad de combinaciones huésped/vector. Los vectores de expresión útiles para huéspedes eucarióticos, por ejemplo, vectores que comprenden secuencias de control de expresión a partir de SV40, virus de papiloma bovino, adenovirus y citomegalovirus . Los vectores de expresión útiles para huéspedes bacterianos incluyen plásmidos bacterianos conocidos, tales como plásmidos de E. coli que incluyen col El, pCRl, pBR322, pMB9 y sus derivados, más amplio intervalo de huéspedes plásmidos, tales como RP4, ADNs de fagos, por ejemplo los numerosos derivados de fago lambda, por ejemplo, NM989, y otros ADN fagos, tales como M13 y fagos y ADN fagos filamentosos de una sola hebra. Los vectores de expresión útiles para células de levaduras incluyen el plásmido 2µ y derivados del mismo. Los vectores útiles para células de insectos incluyen pVL 941. Además, cualquiera de una amplia variedad de secuencias de control de expresión puede ser usada en estos vectores. Dichas secuencias de control de expresión útiles incluyen las secuencias de control de expresión asociadas con genes estructurales de los vectores de expresión extraños. Ejemplos de secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo, los promotores tardío y precoz de SV40 o adenovirus, el sistema lac, el sistema trp, el sistema TAC o TRC, el operador principal y las regiones promotoras del fago lambda, las regiones de control de la proteína de recubrimiento fd, el promotor para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas, los promotores de la fosfatasa acida, por ejemplo, Pho5, los promotores del sistema a-acoplado de levaduras y otras secuencias conocidas para controlar la expresión de genes de células procarióticas o eucarióticas o sus virus, y varias combinaciones de los mismos. Una amplia variedad de células huéspedes son útiles. Las células huéspedes pueden ser un organismo unicelular, o pueden ser obtenidas a partir de organismos multicelulares, por ejemplo, células aisladas a partir de un huésped multicelular. Estoas huéspedes pueden incluir huéspedes procarióticos y eucarióticos bien conocidos, tales como cepas de E. coli, Pseudomonas, Bacillus, Streptomyces, hongos, levaduras, células de insectos tales como Spodoptera frugiperda (SF9) , células de animales tales como células CHO y de ratón, células del mono verde Africano tales como células COSÍ, COS7, BSC1, BSC40 y BMT 10, y humanas, así como también células vegetales en cultivo de tejido. Para la expresión de células de animales, se prefieren células CHO y células COS 7. Se comprenderá que no todos los vectores y secuencias de control de expresión funcionarán igualmente bien para expresar a las secuencias de ADN descritas en la presente. Ni todos los huéspedes funcionarán igualmente bien con el mismo sistema de expresión. No obstante, un experto en la materia puede hacer una selección entre estos vectores, secuencias de control de expresión y huéspedes sin experimentación indebida. Por ejemplo al seleccionar un vector, el huésped debe de ser considerado porque el vector debe de replicar en él . El número de copias del vector, la habilidad para controlar que el número de copias, y la expresión de cualquier otra de las proteínas codificada por el vector, tal como marcadores de antibióticos, deberán también ser considerados. Al seleccionar una secuencia de control de expresión, una variedad de factores deberán también ser considerados. Estos incluyen, por ejemplo, la resistencia relativa de la secuencia, su controlabilidad, y su compatibilidad con las secuencias de ADN discutidas en la presente, particularmente con respecto a estructuras secundarias potenciales. Los huéspedes unicelulares deberán ser seleccionados en consideración a su compatibilidad con el vector seleccionado, la toxicidad del producto codificado por las secuencias de ADN, sus características de secreción, su habilidad para doblar correctamente a los polipéptidos solubles, sus requerimientos de fermentación o de cultivo, y la facilidad de purificación de los productos codificados por las secuencias de ADN. En estos parámetros, un experto en la materia puede seleccionar varias combinaciones de huésped/secuencia de control de exprésio /vector que expresarán a las secuencias de ADN deseadas en fermentación o en cultivo animal a gran escala, por ejemplo con células CHO o células COS 7. Los polipéptidos de CD2 y LFA-3 solubles pueden ser aislados a partir de la fermentación o cultivo celular y purificados usando cualquiera de una variedad de métodos convencionales. Un experto en la materia puede seleccionar las técnicas de purificación y de aislamiento apropiadas. Aunque las técnicas de ADN recombinante son el método preferido de producir polipéptidos de CD2 soluble útiles o polipéptidos de LFA-3 solubles que tienen una secuencia de más de 20 aminoácidos, polipéptidos de LFA-3 o de CD2 más cortos que tienen menos de aproximadamente 20 aminoácidos son preferiblemente producidos por medio de técnicas de síntesis química convencionales. Los polipéptidos producidos sintéticamente útiles en esta invención pueden ser ventajosamente producidos con rendimientos extremadamente altos y pueden ser purificados fácilmente. Preferiblemente, dichos polipéptidos de CD2 solubles o polipéptidos de LFA-3 solubles son sintetizados por síntesis de polipéptido en fase sólida o en fase en solución y, opcionalmente, son digeridos con carboxipeptidasa (para eliminar los aminoácidos C- terminales) o son degradados por medio de la degradación de Ed an manual (para eliminar los aminoácidos N- terminales) . El uso de síntesis en fase en solución permite la adición directa de ciertos aminoácidos derivatizados para desarrollar la cadena polipeptídica, tal como éster O-sulfato de tirosina. Esto obvia la necesidad por una etapa de derivatización subsecuente para modificar cualquier residuo de los polipéptidos útiles en esta invención. El doblaje apropiado de los polipéptidos puede lograrse bajo condiciones oxidativas que favorecen la formación del puente disulfuro como se describe en Kent, "Chemical Syntesis of Polypeptides and Proteins", Ann. Rev. Biochem., 57, pp. 957-89 (1988). Los polipéptidos producidos de esta manera pueden entonces ser purificados por medio de técnicas de separación ampliamente conocidas en el arte. Homólogos de los Anticuerpos Anti-CD2 y Anti-LFA-3 Como se usa en la presente, un "homólogo de anticuerpo" es una proteína que comprende uno o más polipéptidos seleccionados de cadenas ligeras de inmunoglobulina, cadenas pesadas de inmunoglobulina y fragmentos de enlace antigénico de los mismos, los cuales son capaces de enlazar a un antígeno. Los componentes polipeptídicos de un homólogo de anticuerpo compuesto de más de un polipéptido puede ser opcionalmente enlazado a disulfuro de otra manera reticulado covalentemente. Por consiguiente, los homólogos de anticuerpos incluyen inmunoglobulinas intactas de los tipos IgA, IgG; IgE, IgD, IgM (así como también subtipos de los mismos) , en donde las cadenas ligeras de la inmunoglobulina pueden ser de los tipos kapa o lambda. Los homólogos de anticuerpos también incluyen porciones de inmunoglobulinas intactas que retienen la especificidad de enlace antigénico, por ejemplo, fragmentos Fab, fragmentos Fab' , fragmentos (F(ab')2, fragmentos F(v), monómeros o dímeros de cadena pesada, monómeros o dímeros de cadena ligera, dímeros que consisten de una cadena pesada y de una cadena ligera, y los similares. El término incluye anticuerpos recombinantes, anticuerpos humanizados e injertados a CDR, quiméricos, u otros anticuerpos modificados para ser menos inmunogénicos en un humano. Como se usa en la presente, un "homólogo de anticuerpo humanizado o recombinante humanizado" es un homólogo de anticuerpo, producido por tecnología de ADN recombinante, en el cual algunos o todos los aminoácidos de una cadena ligera o pesada de inmunoglobulina humana que se requieren para enlace antigénico han sido substituidas por los aminoácidos correspondientes desde una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina de mamífero no humana. Como se usa en la presente, un "homólogo de anticuerpo recombinante quimérico" es un homólogo de anticuerpo, producido por tecnología de ADN recombinante, en el cual todas o parte de las regiones constantes y de articulación de una cadena pesada, cadena ligera de inmunolgobulina, o ambas, han sido substituidas por las regiones correspondientes a partir de otra cadena pesada o cadena ligera de inmunoglobulina. Muchos tipos de homólogos de anticuerpos anti-CD2 o anti-LFA-3 son útiles en los métodos de esta invención. Estos incluyen anticuerpos monoclonales, anticuerpos recombinantes, anticuerpos recombinantes quiméricos, anticuerpos recombinantes humanizados, así como también porciones de enlace antigénico de los precedentes. Entre los homólogos del anticuerpo anti-LFA-3, es preferible usar anticuerpos anti-LFA-3 monoclonales. Es más preferible usar un anticuerpo anti-LFA-3 monoclonal producido por un hibridoma seleccionado del grupo de hibridomas que tienen Nos. de Acceso ATCC HB 10693 (IE6) , ATCC HB 10694 (HC-lBll) , ATCC HB 10695 (7A6) , y ATCC HB 10696 (8B8) , o el anticuerpo monoclonal conocido como TS2/9 (Sánchez-Madrid y colaboradores, "Three Distinct Antigens Associated with Human T-Lymphocyte- Mediated Cytolysis: LFA-1, LFA-2 y LFA-3", Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 79, pp. 7489-93 (1982)). Más preferiblemente, el anticuerpo anti-LFA-3 monoclonal es producido por un hibridoma seleccionado del grupo de hibridomas que tienen Nos. de Acceso ATCC HB 10695 (7A6) y ATCC HB 10693 (IE6) . Entre los homólogos de anticuerpo anti-CD2, es preferible usar anticuerpos anti-CD2 monoclonales, tales como los anticuerpos monoclonales anti-CD2 conocido como los anticuerpos epítopes de Tlla, que incluyen TS2/18 (Sánchez-Madrid y colaboradores, "Three Distinct Antigens Associated with Human T-Lymphocyte- Mediated Cytolysis: LFA-1, LFA-2 y LFA-3", Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 79, pp. 7489-93 (1982) ) . La tecnología para producir anticuerpos monoclonales es bien conocida. Ver generalmente, , Harlow, E. y Lañe, D. (1988) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Kohier y colaboradores, nature, "Continuous Cultures of Fused Cells Secreting Antibody of Predefined Specificity" , 256 pp, 495-97 pp. 495-497 (1975) . Inmunógenos útiles para el propósito de esta invención incluyen células que poseen LFA-3 o CD2, así como también preparaciones libres de células que contienen LFA-3, CD2 o fragmentos de enlace del contra receptor de los mismos (por ejemplo, fragmentos de CD2 que enlaza a LFA-3 o a fragmentos de LFA-3 que enlazan a CD2) . La inmunización puede lograrse usando procedimientos estándares. La dosis unitaria y el régimen de inmunización dependen de las especies de mamíferos inmunizados, su estado inmune, el peso corporal del mamífero, etc. Típicamente, los mamíferos inmunizados son sangrados y el suero de cada una de las muestras de sangre es ensayado para anticuerpos particulares usando ensayos de cribado. Por ejemplo, anticuerpos anti-CD2 o anti-LFA-3 pueden ser identificados por medio de la prueba de la habilidad del suero inmune para bloquear glóbulos rojos de sangre de oveja que afloran de células de Jurkat, lo cual resulta de la presencia de LFA-3 y CD2 sobre las superficies respectivas de estas células. Los linfocitos usados en la producción de células de hibridoma típicamente son asilados de mamíferos inmunizados cuyo suero ha probado ya ser positivo para la presencia de los anticuerpos deseados usando dichos ensayos de cribado. Los homólogos de anticuerpos anti-CD2 y anti-LFA-3 útiles en la presente invención pueden también ser anticuerpos recombinantes producidos por células huéspedes transformadas con ADN que codifica a las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina de un anticuerpo deseado. Los anticuerpos recombinantes pueden ser producidos por medio de técnicas de ingeniería genética bien conocidos. Ver, por ejemplo, la Patente U.S. No. 4,816,397, la cual se incorpora a la presente como referencia. Por ejemplo, los anticuerpos recombinantes pueden ser producidos por clonación de cADN o de ADN genómico que codifican a las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina del anticuerpo deseado a partir de una célula de hibridoma que produce un homólogo de anticuerpo útil en esta invención. El cADN o ADN genómico que codifica a los polipéptidos es entonces insertado en vectores de expresión de modo que ambos genes son ligados operativamente a sus propias secuencias de control de expresión traslacional y transcripcional. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión son seleccionados para ser compatibles con la célula huésped de expresión usada. Típicamente, ambos genes son insertados en el mismo vector de expresión. Pueden usarse células huéspedes procarióticas o eucarióticas. Se prefiere la expresión en células huéspedes eucarióticas porque dichas células son más probables que las células procarióticas para conjuntar y secretar un anticuerpo activo inmunológicamente y doblado apropiadamente. Es posible que las células huéspedes producirán porciones de anticuerpos aislados, tales como dímeros de cadena ligera o dímeros de cadena pesada, los cuales son también homólogos de anticuerpos de conformidad con la presente invención. Se comprenderá que variaciones sobre el procedimiento anterior son útiles en la presente invención. Por ejemplo, puede desearse transformar a una célula huésped con ADN que codifica ya sea a la cadena ligera o bien a la cadena pesada (pero no ambas) de un homólogo de anticuerpo. Puede usarse la tecnología de ADN recombinante para eliminar algo o todo el ADN que codifica ya sea a una o a otra o a ambas de las cadenas pesada y ligera que no es necesario para enlazar al contra receptor de CD2 o LFA-3. Las moléculas expresadas desde moléculas de ADN truncadas tales son útiles en los métodos de esta invención. Además, pueden producirse anticuerpos bifuncionales en los cuales una cadena pesada y una ligera son homologas de los anticuerpos anti-CD2 o anti-LFA-3 y la otra cadena ligera y pesada son específicas para un antígeno diferente de CD2 o LFA-3, u otro epítope de CD2 o LFA-3. Los homólogos de anticuerpos anti-CD2 o anti-LFA-3 recombinantes quiméricos pueden ser producidos por transformación de una célula huésped con un vector de expresión adecuado que comprende ADN que codifica a las cadenas pesada y ligera de inmunoglobulina deseadas en las cuales todo o algo del ADN que codifica a las regiones constante y de articulación de la cadena ligera y/o la cadena pesada han sido substituidos con ADN de la región correspondiente de una cadena pesada o ligera de inmunoglobulina de una especie diferente. Cuando el anticuerpo recombinante original no es humano, y el inhibidor es para ser administrado a un humano, se prefiere la substitución de las secuencias humanas correspondientes . Un anticuerpo recombinante quimérico ejemplar tiene regiones variables de ratón y regiones constante y de articulación humanas. Ver generalmente, la Patente U.S. No. 4,816,397; Morrison y colaboradores, "Chimeric Human Antibody Molecules: Mouse Antigen- Binding Domains With Human Constant Región Domains", Proc. Nati. Acad. Sci. Usa, 81, pp. 6851 - 55 (1984); Robinson y colaboradores, Publicación de Patente Internacional PCT/US 86/02269; Akira y colaboradores, Solicitud de Patente Europea 184,187; Tamiguchi, M. , Solicitud de Patente europea 171,496; Neuberger y colaboradores, Solicitud Internacional WO 86/01533; Better y colaboradores (1988 Science 240:1041.1043); Liu y colaboradores (1987) PNAS 84:3439-3443; Liu y colaboradores, 1987, J. Immunol . 139:3521-3526; Sun y colaboradores (1987) PNAS 84:214-218; Nishimura y colaboradores, 1987, Canc. Res. 47:999-1005; Wood y colaboradores (1985) Nature 314: 446-449; y Shaw y colaboradores, 1988, J. Nati. Cáncer Inst. 80:1553-1559. Los anticuerpos anti-CD2 o anti-LFA-3 recombinantes humanizados pueden ser generados reemplazando las secuencias de la región variable Fv que no está directamente involucrada en el enlace antigénico con secuencias equivalentes de las regiones variables Fv humanas. Se porporcionan métodos generales para generar anticuerpos humanizados en Morrison, S. L., 1985, US 5,585,089, US 5,693,761 y US 5,693,762, cuyos contenidos totales se incorporan a la presente como referencia. Estos métodos incluyen aislar, manipular y expresar a secuencias de ácidos nucleicos que codifican a toda o a parte de las regiones variables Fv de inmunoglobulina. Las fuentes de dichos ácidos nucleicos son bien conocidas por los expertos en la materia y, por ejemplo, puede ser obtenido a partir de hibridoma produciendo un anticuerpo anti-LFA-3 o anti-CD2. Los ácidos nucleicos que codifican a un anticuerpo humanizado, o fragmento del mismos, puede entonces ser clonado en un vector de expresión apropiado.

Moléculas de anticuerpo injertado a CDR o inmunoglobulinas pueden ser producidas por injerto de CDR o por substitución de CDR, en donde uno, dos, o todas las CDRs de una cadena de inmunoglobulina pueden ser reemplazados. Ver, por ejemplo, la Patente US 5,225,539; Jones y colaboradores 1986, Nature 321:552-525; Verhoeyan y colaboradores 1988 Science 239:1534; Beidler y colaboradores 1988 J. Immunol . 141:4053-4060; Winter US 5,225,539, cuyos contenidos se incorporan expresamente a la presente como referencia. Winter describe un método de injertar CDR que puede ser usado para preparar los anticuerpos humanizados de la presente invención (Solicitud de Patente UK GB 2188638A presentada el 26 de marzo de 1987; Winter US 5,225,539), cuyos contenidos son expresamente incorporados como referencia. Todas las CDRs de un anticuerpo humano particular pueden ser reemplazadas con al menos una porción de una CDR no humana o solamente algunas de las CDRs pueden ser reemplazadas con CDRs no humanas. Solamente es necesario reemplazar el número de CDRs requeridas para el enlace del anticuerpo humanizado a un antígeno predeterminado, por ejemplo, LFA-3 o CD2. También están en el alcance de la invención los anticuerpos humanizados, incluyendo inmunoglobulinas, en las cuales aminoácidos específicos han sido substituidos, eliminados o añadidos. En particular, los anticuerpos humanizados preferidos tienen substituciones de aminoácidos en la región estructural, tal como mejorar el enlace al antígeno. Por ejemplo, un número pequeño, seleccionado de residuos estructurales receptores de la cadena de inmunoglobulina humanizada puede ser reemplazado por los aminoácidos donadores correspondientes. Las localizaciones preferidas de las substituciones incluyen residuos de aminoácidos adyacentes a la CDR, olas cuales son capaces de interactuar con una CDR (ver por ejemplo, US 5,585,089). El criterio para seleccionar los aminoácidos a partir de los donadores se describe en US 5,585,089, por ejemplo, las columnas 12-16 de US 5,585,089 cuyos contenidos se incorporan a la presente como referencia. Otras técnicas para humanizar cadenas de inmunoglobulinas, que incluyen anticuerpos, se describen en Padlan y colaboradores EP 519 596 Al, publicada el 23 de Diciembre de 1992. Los anticuerpos monoclonales humanos (mAbs) dirigidos contra LFA-3 o CD2 pueden ser generados usando ratones transgénicos que portan el sistema inmune humano completo preferiblemente a sistema de ratón. Los esplenocitos de estos ratones transgénicos inmunizados con el antígeno de interés son usados para producir hibridomas que secretan mAbs humano con afinidades específicas por epítopes de una proteína humana (ver, por ejemplo, Wood y colaboradores Solicitud Internacional WO 91/00906; Kucherlapati y colaboradores Publicación de PCT WO 91/10741; Lonberg y colaboradores Solicitud Internacional WO 92/03918; Kay y colaboradores Solicitud Internacional 92/03917; Lonberg N y colaboradores 1994 Nature 368:856-859; Green, L. I. y colaboradores 1994 Nature Genet. 7: 13-21; Morrison, S. L. y colaboradores 1994 Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81: 6851-6855; Bruggeman y colaboradores 1993 Year Immunol. 7:33-40; Tuaillon y colaboradores 1993 PNAS 90:3720-3724; Bruggeman y colaboradores 1991 Eur J. Immunol 21:1323- 1326) . Los anticuerpos monoclonales pueden también ser generados por medio de otros métodos conocidos por los expertos en el arte de la tecnología de ADN recombinante. Un método alternativo, mencionado como el método de "presentación del anticuerpo combinatorio" , se ha desarrollado para identificar y aislar fragmentos de anticuerpo que tengan una especificidad antigénica particular, y pueden ser utilizados para producir anticuerpos monoclonales (para descripción de la presentación del anticuerpo combinatorio ver, por ejemplo, Sustry y colaboradores 1989 PNAS 86:5728; Huse y colaboradores 1989 Science 246:1275; y Orlandi y colaboradores 1989 PNAS 86 :3833) .Después de inmunizar a un animal con un inmunógeno como se describió anteriormente el repertorio de anticuerpos del conjunto de células B resultante es clonado. Los métodos son generalmente conocidos para obtener la secuencia de ADN de las regiones variables de una población diversa de moléculas de inmunoglobulina usando una mezcla de cebadores oligómeros y PCR (Larrick y colaboradores, 1991, Biotechniques 11:152-156; Larrick y colaboradores, 1991, Methods: Companion to Methods in Enzymology 2: 106-110) .Pueden encontrarse ejemplos de métodos y de reactivos particularmente manejables para uso al generar una biblioteca que presenta el anticuerpo variegado en, por ejemplo, Ladner y colaboradores Patente U.S. No. 5,223,409; Kang y colaboradores Publicación Internacional No. WO 92/18619, Dower y colaboradores Publicación Internacional No. WO 91/17271; Winter y colaboradores Publicación Internacional No. WO 92/20791; Markland y colaboradores Publicación Internacional No. WO 92/15679; Breitling y colaboradores Publicación Internacional No. WO 93/01288; McCafferty y colaboradores Publicación Internacional No. WO 92/01047; Garrard y colaboradores Publicación Internacional No. WO 92/09690; Ladner y colaboradores Publicación Internacional No. WO 90/02809; Puchs y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1370-1372; Hay y colaboradores (1992) Hum Antibod Hybrido as 3:81-85; Huse y colaboradores (1989) Science 246:1275-1281; Griffths y colaboradores (1993) EMBO J 12:725-734; Hawkins y colaboradores (1992) J Mol Biol 226: 889- 896; Clackson y colaboradores (1991) Nature 352:624-628; Gram y colaboradores (1992) PNAS 89: 3576-3580; Garrad y colaboradores (1991) Bio/Technology 9:1373-1377; Hoogenboom y colaboradores (1991) Nuc Acid Res. 19:4133-4137; y Barbas y colaboradores (1991) PNAS 88:7978-7982. Los equipos para generar bibliotecas de presentación de fago están comercialmente disponibles (por ejemplo el Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, NO. de Catálogo 27-9400-01; y el equipo de presentación de fago de Stratagene SurfZAPTM, No. de Catálogo 240612) . En ciertas modalidades, los dominios de la región B de cadenas pesadas y ligeras pueden ser expresados sobre el mismo polipéptido, unidos por un enlazador flexible para formar un fragmento Fv de cadena única y el gen scFV subsecuentemente puede ser clonado en el vector de expresión o genoma de fago deseados . Como se describió generalmente en McCafferty y colaboradores, Nature (1990) 348:552-554, los dominios VL y VH completos de un anticuerpo, unidos por un enlazador flexible (Gly4-Ser)3 pueden ser usados para producir un anticuerpo de cadena única que puede convertir el empaque de presentación separable con base en la afinidad antigénica. Los anticuerpos de scFV aislados inmunoreactivos con el antígeno puede ser formulado en una preparación farmacéutica para uso en el método en cuestión.

Los anticuerpos específicos con altas afinidades por una proteína de superficie pueden ser elaborados de conformidad con los métodos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, métodos que involucran el cribado de bibliotecas (Ladner, R. C. y colaboradores, Patente U.S. No. 5,233,409; Ladner, R. C, y colaboradores, Patente U.S. No. 5,403,484). De manera adicional, los métodos de estas bibliotecas pueden ser usados en tamices para obtener determinantes de enlace que sean miméticos de los determinantes estructurales de los anticuerpos. Ver, por ejemplo Bajorath, J. y Sheriff, 1996, Proteins: Struct., Funct., and Genet. 24(2), 152-157; Webster, D. M. y A. R. Rees, 1995, "Molecular modeling of antibody- combining sites", en S. Paul, Ed., Methods in Molecular Biol. 51, Antibody engineering Protocols, Human Press, Totowa, NJ, pág. 17-49; y Johnson, G., Wu, T. T. y E. A. Kabat, 1995, "Seqhunt : A program to screen nucleotide and amino acid sequences", en methods in Molecular Biol. 51, op. cit., pág. 1-15. Los homólogos de anticuerpos anti-CD2 y anti-LFA-3 que no son anticuerpos intactos son también útiles en esta invención. Dichos homólogos pueden ser derivados de cualquiera de los homólogos de anticuerpos descritos anteriormente. Por ejemplo, fragmentos de enlace antigénico, así como también polipéptidos monoméricos, diméricos y triméricos de extensión total derivados de los anticuerpos anteriormente mencionados son por sí mismos útiles. Los homólogos de anticuerpos de este tipo útiles incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, CL y CH1; (ii)un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab ligados por un puente disulfuro en la región articulada; (iii) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (iv)un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de un solo ramal de un anticuerpo, (v) un fragmento dAb (Ward y colaboradores, (1989) Nature 341: 544-546), el cual consiste de un domino VH; y (vi) una región determinante de complementaridad (CDR) aislada.

Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, son codificados por genes separados, pueden unirse, usando métodos recombinantes, por medio de un enlazador sintético que les facilita ser elaborados como una cadena proteínica única en la cual las regiones VL y VH se emparejan para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv de cadena única (scFv) ; ver por ejemplo, Bird y colaboradores (1988) Science 242: 423-426; y Huston y colaboradores (1988) Proc. Nati. Acad. Aci. USA 85: 5879-5883) . Dichos anticuerpos de cadena única están previstos también para ser abarcados en el término "fragmento de enlace antigénico" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo son obtenidos usando las técnicas convencionales conocidas por los expertos en la materia, y los fragmentos son cribados por utilidad de la misma manera que los son los anticuerpos intactos. Las cadenas pesadas de anti-LFA-3 se prefieren de los fragmentos de anticuerpo anti-LFA-3. Los fragmentos de anticuerpos pueden también ser producidos por métodos químicos, por ejemplo, por fragmentación de un anticuerpo intacto con una proteasa, tal como pepsina o papaína, y opcionalmente tratamiento del producto fragmentado con un agente reductor. De manera alternativa, los fragmentos útiles pueden ser producidos usando células huéspedes transformadas con genes de cadena ligera y/o de cadena pesada truncados . Los monómeros de cadena ligera y de cadena pesada pueden ser producidos por tratamiento de un anticuerpo intacto con un agente reductor, tal como ditiotreitol, seguido por purificación para separar las cadenas. Los monómeros de cadena pesada y ligera pueden también ser producidos por medio de células huéspedes transformadas con ADN que codifica ya sea a la cadena pesada o bien a la cadena ligera deseadas, pero no a ambas. Ver, por ejemplo, Ward y colaboradores, "Binding Activities of a Repertoire of Single Immunoglobulin Variable Domains Secreted from Escherichia coli", Nature, 341. pág. 544-46 (1989); Sastry y colaboradores, "Cloning of Immunological Repertoire in Escherichia coli for Generation of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Chain Variable Region-Specific cADN Library", Proc. Nati. Acad. Sci. USA 86, pág. 5728-32 (1989) . Agentes de Molécula pequeña o Miméticos de LFA-3 y CD-2 También son útiles en los métodos de esta invención los agentes miméticos de LFA-3 y CD2. Estos agentes, los cuales pueden ser péptidos, compuestos semi-específieos o compuestos no peptídicos (por ejemplo, moléculas orgánicas pequeñas), son inhibidores de la interacción CD2:LFA-3. Los agentes miméticos de LFA-3 y CD2 preferidos inhibirán la interacción de CD2:LFA-3 al menos tan bien como el anticuerpo monoclonal anti-LFA-3 7A6 o el anticuerpo monoclonal anti-CD2 TS2/18 (descrito en supra) . En modalidades preferidas, el agente de prueba es un elemento de una biblioteca combinatoria, por ejemplo, una biblioteca combinatoria orgánica o peptídica, o una biblioteca de productos naturales. En una modalidad preferida, la pluralidad de los compuestos de prueba, por ejemplo, elementos de la biblioteca, incluye al menos 10, 102, 103, 104, 105, 10s, 107, o 108 compuestos. En una modalidad preferida, la pluralidad de compuestos de prueba, por ejemplo, elementos de la biblioteca. comparten una característica estructural o funcional. En una modalidad, la invención proporciona bibliotecas de inhibidores de LFA-3 y/o CD2. La síntesis de bibliotecas combinatorias es bien conocida en el arte y ha sido revisada (ver, por ejemplo, E. M. Gordon y colaboradores, J. Med. Chem. (1994) 37: 1385-1401; De Witt, S.H.; Czarnik, A. W. Acc. Chem. Res. (1996) 29:114; Armstrong, R. . ; Combs, A. P.; Te pest, P.A.; Brown, S. D.; Keating T. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 123; Ellman, J. A. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 132; Gordon, E. M. ; Gallop, M. A.; Patel, D. V. Acc. Chem. Res. (1996) 29: 144; Lowe, G. Chem. Soc. Rev. (1995) 309, Blobdelle y colaboradores Trends Anal. Chem. (1995) 14:83; Chen y colaboradores J. Am. Chem. Soc. (1994) 116: 2661; Patentes U.S. Nos. 5,359,115, 5,362,899, y 5,288,514; Publicación de PCT Nos. WO 92/10092, WO 93/09668, WO 91/07087, WO 93/20242, WO 94/08051) . Las bibliotecas de compuestos de la invención pueden ser preparadas de conformidad con una variedad de métodos, algunos de los cuales son conocidos en el arte. Por ejemplo, puede implementarse una estrategia de "conjunto subdividido" de la manera siguiente: se colocan perlas de un soporte polimérico funcionalizado en una pluralidad de recipientes de reacción; una variedad de soportes poliméricos adecuados para síntesis peptídica en fase sólida son conocidos, y algunos están comercialmente disponibles (ver, por ejemplo, M. Bodansky "Principies of Peptide Synthesis", 2A edición, Springer-Verlag, Berlín (1993)). A cada alícuota de perlas se añade una solución de un aminoácido activado diferente, y se deja que procedan las reacciones para producir una pluralidad de aminoácidos inmovilizados, uno en cada recipiente de reacción. Las alícuotas de perlas derivatizadas son entonces lavadas, "conjuntadas" (es decir, recombinadas) , y el conjunto de perlas es otra vez dividido, con cada alícuota que es colocada en un recipiente de reacción separado. Otro aminoácido activado es entonces añadido a cada alícuota de perlas. El ciclo de síntesis es repetido hasta que se obtiene una extensión de péptido deseada. Los residuos de aminoácidos añadidos a cada ciclo de síntesis pueden ser seleccionados aleatoriamente; alternativamente, los aminoácidos pueden ser seleccionados para proporcionar una biblioteca "desviada", por ejemplo, una biblioteca en la cual ciertas porciones del inhibidor son seleccionadas no aleatoriamente, por ejemplo, para proporcionar un inhibidor que tenga similaridad u homología estructural conocida hacia un péptido conocido capaz de interactuar con un anticuerpo, por ejemplo, el sitio de enlace antígeno anticuerpo anti-idiotípico. Se apreciará que una amplia variedad de compuestos peptídicos, peptidomiméticos, o no- peptídicos pueden generarse fácilmente de esta manera. La estrategia de "conjunto subdividido" da como resultado una biblioteca de péptidos, por ejemplo, inhibidores, que pueden ser usados para preparar una biblioteca de compuestos de prueba de la invención. En otra síntesis ilustrativa, se crea una "biblioteca diversómera" por medio del método de Hobbs DeWitt y colaboradores (Procc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 (1993)). Otros métodos de síntesis, que incluyen la técnica de la "bolsa de té" de Houghten y colaboradores, Nature 354:84-86 (1991)) puede también ser usada para sintetizar bibliotecas de compuestos de conformidad con la invención. Las bibliotecas de compuestos pueden ser cribadas para determinar si algunos elementos de la biblioteca tienen la actividad deseada, si sí la tienen, identificar las especies activas. Se han descrito métodos de cribar bibliotecas convencionales (ver, por ejemplo, Gordon y colaboradores, J. Med. Chem. Supra) . Las bibliotecas de compuestos solubles pueden ser cribadas por cromatografía por afinidad con el receptor adecuado para aislar ligandos del receptor, seguido por identificación de los ligandos aislados por medio de técnicas convencionales (por ejemplo, espectrometría de masa, NMR, y las similares) .

Los compuestos inmovilizados pueden ser cribados poniendo en contacto los compuestos con un receptor soluble; preferiblemente, el receptor soluble es conjugado a una marca (por ejemplo, enzimas colorimétricas, radioisótopos, compuestos de luminiscencia, y los similares) que pueden ser detectados para indicar en enlace del ligando. De manera alternativa, los compuestos inmovilizados pueden ser liberados selectivamente y dejarlos difundir a través de una membrana para interactuar con un receptor. Ensayos ejemplares útiles para cribar las bibliotecas de la invención se describen a continuación. En una modalidad, los compuestos de la invención pueden ser cribados por la habilidad para interactuar con un polipéptido de CD2 o de LFA-3 por ensayo de la actividad de cada compuesto para enlazar directamente al polipéptido o para inhibir una interacción CD2:LFA-3, por ejemplo, incubando el compuesto de prueba con un polipéptido de LFA-3 o de CD2 y un lisado, por ejemplo, un lisado de células T o APC, por ejemplo, en un pocilio o placa multipocillos, tal como la placa para microtítulo de 96 pocilios estándar. En una modalidad, la actividad de cada compuesto individual puede ser determinada. Un pocilio o pocilios que no tengan compuestos de prueba pueden ser usados como un control. Después de incubación, puede ser determinada la actividad de cada compuesto de prueba ensayando cada pocilio. Así, puede determinarse la actividad de una pluralidad de compuestos de prueba en paralelo. En aún otra modalidad, gran número de compuestos de prueba pueden ser probados simultáneamente para actividad de enlace. Por ejemplo, los compuestos de prueba pueden ser sintetizados sobre perlas de resina sólida en síntesis de "un compuesto-una perla" ; los compuestos pueden ser inmovilizados sobre el soporte de resina por medio de un enlazador fotolábil . Una pluralidad de perlas (por ejemplo, tantas como 100,000 perlas o más) pueden entonces combinarse con células de levaduras y rociadas en una pluralidad de "nano-gotículas" , en las cuales cada gotícula incluye una sola perla (y por consiguiente, un solo compuesto de prueba) . La exposición de las nano- gotículas a rayos UV da entonces como resultado la fragmentación de los compuestos a partir de las perlas . Se apreciará que estos ensayos permiten el cribado de grandes bibliotecas de compuestos de prueba en un formato rápido. Pueden sintetizarse bibliotecas combinatorias de compuestos con "marcas" para codificar la identidad de cada elemento de la biblioteca (ver, por ejemplo, W. C. Still y colaboradores, Patente U.S. No. 5,565,324 y Publicaciones de PCT Nos. WO 94/08051 y WO 95/28640). En general, este método se caracteriza por el uso de marcas inertes, pero fácilmente detectables que están fijadas al soporte sólido o a los compuestos. Cuando se detecta un compuesto activo (por ejemplo, por medio de una de las técnicas descritas anteriormente) , la identidad del compuesto es determinada por identificación de la única marca que lo acompaña. Este método de marcado permite la síntesis de grandes bibliotecas de compuestos que pueden ser identificadas a niveles muy bajos. Un esquema de marcado tal puede ser útil, por ejemplo en el ensayo de cribado de "nano-gotículas" descrito anteriormente, para identificar compuestos liberados de las perlas . En modalidades preferidas, las bibliotecas de compuestos de la invención contienen al menos 30 compuestos, más preferiblemente al menos 100 compuestos, y aún más preferiblemente al menos 500 compuestos. En modalidades preferidas, las bibliotecas de compuestos de la invención contienen menos de 109 compuestos, más preferiblemente menos de 108 compuestos, y aún más preferiblemente menos de 107 compuestos. Inhibidores Derivatizados También son útiles en los métodos de esta invención inhibidores derivatizados de la interacción de CD2:LFA-3 en la cual, por ejemplo, cualquiera de los homólogos de anticuerpos, polipéptidos de LFA-3 y CD2 solubles, o agentes miméticos de LFA-3 y CD2 descritos en la presente están unidos funcionalmente (por medio de acoplamiento químico, fusión genética o de otra manera) a uno o más elementos independientemente seleccionados del grupo que consiste de homólogos de anticuerpos anti-CD2 y anti-LFA-3, polipéptidos de LFA-3 y CD2 solubles, agentes miméticos de LFA-3 y CD2, agentes citotóxicos y agentes farmacéuticos . Un tipo de inhibidor derivatizado es producido por reticulación de dos o más inhibidores (del mismo tipo o de diferentes tipos) . Los reticuladores adecuados incluyen aquellos que son heterobifuncionales, que tienen dos grupos reactivos indistintamente separados por un espaciador apropiado (por ejemplo, m-maleimidobenzoil-N- hidroxisuccinimida éster) u homobifuncional (por ejemplo suberato de disuccinimidilo) . Dichos espaciadores están disponibles de Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois. Otra posibilidad de reticulación toma ventaja de la secuencia de señal de Pl en LFA-3 enlazada a Pl, o fragmentos de ésta. Específicamente, el ADN que codifica a la secuencia de señal de enlace a Pl (por ejemplo, los aminoácidos 162-212 de la SEC ID NO: 4) es ligada desde el extremo 5 ' hacia el extremo 3 ' en el sentido de la hebra de ADN dupleto que codifica a un polipéptido deseado, preferiblemente a un polipéptido de LFA-3 soluble. Si esta construcción es expresada en una célula eucariótica apropiada, la célula reconocerá a la secuencia de señal de enlace a Pl y unirá covalentemente Pl al polipéptido. La propiedad hidrofóbica del Pl puede entonces ser explotada para formar aglutinados micelares de los polipéptidos. Son también útiles los polipéptidos unidos a uno o más agentes farmacéuticos o citotóxicos. Los agentes farmacéuticos útiles incluyen péptidos, polipéptidos y proteínas activos biológicamente, tales como homólogos de anticuerpos específicos para un polipéptido humano diferente de CD2 o LFA-3, o porciones de éstos. Los agentes farmacéuticos y agentes citotóxicos útiles También incluyen la radiación UV, (por ejemplo UV B) , ciclosporina A, prednisona, FK506, metotrexate, esteroides, retinoides, interferones, y mostaza nitrogenada. Los inhibidores derivatizados con un agente farmacéutico preferidos incluyen el polipéptido producido recombinantemente en el cual un polipéptido de LFA-3 soluble, polipéptido de CD2 soluble, o un agente mimético de peptidil CD2 o peptidil LFA-3 es fusionado a toda o parte de una región de articulación de cadena pesada de inmunoglobulina y a toda o parte de una región constante de cadena pesada. Los polipéptidos preferidos para preparar dichas proteínas de fusión son polipéptidos de LFA-3 solubles. Son más preferidas las proteínas de fusión que contienen los aminoácidos 1-92 de LFA-3 maduro fusionadas a una porción de una región de articulación de IgGl humana (que incluye los diez aminoácidos C-terminales de la región de articulación que contiene dos residuos cisteina aún para participar en el enlace disulfuro intercadena) y las regiones CH2 y CH3 de un dominio constante de cadena pesada de IgGl. Se espera dichas proteínas de fusión inhiban las vidas medias prolongadas de suero y faciliten la dimerización del inhibidor. La utilidad en los métodos de esta invención de polipéptidos de CD2 solubles específicos, polipéptidos de LFA-3 solubles, homólogos del anticuerpo anti-LFA-3, homólogos del anticuerpo anti-CD2 o agentes miméticos de LFA-3 y CD2 puede ser determinada fácilmente ensayando su habilidad para inhibir la interacción de LFA-3/CD2. Esta habilidad puede ser ensayada, por ejemplo usando un ensayo de enlace celular simple que permite la evaluación visual (bajo amplificación) de la habilidad del inhibidor putativo para inhibir la interacción entre LFA-3 y CD2 sobre células que poseen estas moléculas. Se prefieren las células de Jurkat como el substrato CD2+ y glóbulos rojos de oveja o células JY humanas se prefieren como el substrato de LFA-3+. Las características de enlace de polipéptidos solubles, homólogos de anticuerpos y agentes miméticos útiles en esta invención pueden ser ensayados de varis maneras preferidas, tales como radiomarcado del homólogo de anticuerpo, polipéptido o agente (por ejemplo, con 35S o 15I) y luego poner en contacto el polipéptido marcado, agente mimético u homólogo de anticuerpo con células CD2+ de LFA-3+, según sea apropiado. Las características de enlace pueden también ser ensayadas usando un anticuerpo secundario marcado enzimáticamente apropiado. Pueden también usarse los ensayos de comparación en roseta tales como los descritos por Seed y colaboradores (Proc. Nati. Sci. USA, 84 págs. 3365-69 (1987) ) . Terapia en Combinación Pueden usarse los agentes, por ejemplo, polipéptidos de LFA-3 de enlace a CD2 solubles en combinación con otras terapias, por ejemplo, otros agentes. Los otros agentes son mencionados en la presente como "segundos agentes" o "agentes adicionales" e incluyen uno o más de: un inmunosupresor (por ejemplo, metotrexate, ciclosporina, o clorambucil) , ciclofosfamida, prednisona, FK506, esteroides, retinoides, interferón, mostaza nitrogenada, un agente de enlace de citoquina (por de tipo 2, por ejemplo un agente de enlace de IL-2 o IL-8, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-IL-2 o anti-IL-8 (Abgenix) ) , un inhibidor de una interacción de ICAM/LFA-1, por ejemplo, un agente de enlace a ICAN (por ejemplo, un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) contra ICAM-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-ICAM-1 humanizado, quimérico o humano) ; o un agente de enlace a LFA-1 (también conocido como CDlla) (por ejemplo, un anticuerpo, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal) contra LFA-1 (por ejemplo, un anticuerpo anti-LFA-1 humanizado, quimérico o humano, por ejemplo, Raptiva (Genentech/Xoma) ) ; un agente de enlace a molécula co-estimuladora, por ejemplo un agente de enlace a B7-1 (CD80) (por ejemplo, un anticuerpo monoclonal anti-B7-l (IDEC) ; un vasodilatador (por ejemplo, un inhibidor de ACE o minoxidil) ; un corticoesteroide o penicilamina. En una modalidad, el agente, por ejemplo, un inhibidor de la interacción de CD2:LFA-3, es administrado en combinación con uno o más inhibidores de interleuquina-1 (IL-1) , IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, TGF-ß, PDGF, granzi a A o leucotrieno B4. Dicha terapia en combinación puede utilizar ventajosamente dosificaciones más bajas de los agentes terapéuticos o profilácticos. Administrados "en combinación" , como se usa en la presente, quiere decir que dos (o más) tratamientos diferentes son liberados al sujeto durante el transcurso de la aflicción del sujeto con el trastorno, por ejemplo, los dos o más tratamientos son liberados después de que el sujeto ha sido diagnosticado con el trastorno y antes de que el trastorno haya sido curado o eliminado. En algunas modalidades, la liberación de un tratamiento tiene lugar aún cuando la liberación del segundo comienza, de modo que haya una sobre posición. Esto es algunas veces mencionado en la presente como "liberación concurrente" o "simultánea". En otras modalidades, la liberación del tratamiento termina antes de que la liberación del otro tratamiento comience. En algunas modalidades de un caso u otro o ambos, el tratamiento es más efectivo a causa de la administración combinada. Por ejemplo, el segundo tratamiento es más efectivo, por ejemplo, un efecto equivalente es visto con menos del segundo tratamiento, o el segundo tratamiento reduce los síntomas en un mayor grado, que el que se vería si el segundo tratamiento fuera administrado en ausencia del primer tratamiento, o la situación análoga es vista con el primer tratamiento. En algunas modalidades, la liberación es que la reducción de los síntomas, u otros parámetros relacionados con el trastorno, por ejemplo reducción en el nivel de células T o en la actividad, es mayor a los que se observaría con un tratamiento liberado en la ausencia del otro. El efecto de los dos tratamientos puede ser parcialmente aditivo, aditivo completo o mayor que aditivo. La liberación puede ser tal que un efecto del primer tratamiento liberado es aún detectable cuando el segundo es liberado, por ejemplo, cuando el agente de enlace a LFA-3 o CD2- es liberado primero, una reducción en el nivel o actividad de células T es aún detectable cuando el segundo agente es liberado. En una modalidad preferida, una liberación del primer tratamiento y una liberación del segundo tratamiento tiene lugar en 1, 2, 5, 10, 15 o 30 días de uno a otro. En una modalidad preferida, el agente de enlace a CD2 (por ejemplo, la fusión de LFA-3/lg) , el segundo agente (o ambos) o una composición farmacéutica que contiene el mismo es administrado de manera generalizada, por ejemplo intravenosa, intramuscular, subcutánea, intra-articular, transdérmica, intraraquídea, periostal, intratumoral, intralesional, perilesionalmente por infusión (por ejemplo, usando un dispositivo de infusión) , oral, tópicamente o por inhalación. De manera preferible, el agente de enlace a CD2 es administrado intramuscular o intravenosamente. En otra modalidad, el agente de enlace a CD2 es administrado localmente, por ejemplo, tópicamente o por inyección sin agujas, en un área afectada. La administración parenteral del agente de enlace a CD2 (por ejemplo, la fusión LFA-3/lg) , el segundo agente, (o ambos) o una composición farmacéutica que la contiene puede ser efectuada usando una aguja o una jeringa sin aguja por medio de procedimientos conocidos en el arte.

Ejemplos de sistemas de jeringas sin agujas y modalidades de administración se describen en US 6,132,395, US 6,096,002, US 5,993,412, US 5,893,397, US 5,520,639, US 5,503,627, US 5,399,163, US 5,383,851, US 5,312,577, US 5,312,335, cuyos contenidos se incorporan a la presente como referencia. Composiciones Farmacéuticas Preferiblemente, es administrada una cantidad efectiva del inhibidor de CD2-LFA-3 (por ejemplo, un polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble descrito en la presente). Por "cantidad efectiva", se quiere decir, una cantidad capaz de disminuir la diseminación o la severidad de las condiciones descritas en la presente. En modalidades terapéuticas, una cantidad efectiva del agente se refiere a una cantidad de un agente que es efectiva, a partir de la administración en dosis única o múltiple al sujeto, al inhibir, reducir o mejorar el trastorno (por ejemplo, mejorar la evaluación PASI o evaluación PGA para un paciente con psoriasis) , o al prolongar la supervivencia del paciente con el trastorno más allá de lo esperado en ausencia de dicho tratamiento. El mejoramiento de psoriasis, por ejemplo, es predicho para conducir a la calidad de vida mejorada, que se evaluó, por ejemplo, por el cuestionario de salud SF-36 desarrollado por RAND Health, una división de la RAND Corporation (Santa Mónica, CA) . Una cantidad efectiva no indica necesariamente una eliminación total del trastorno. En modalidades profilácticas, una cantidad efectiva de un agente de enlace a LFA-3 o CD2 descrito en la presente se refiere a una cantidad de un agente que es efectiva, a partir de la administración en dosis única o múltiple al sujeto, al prevenir o retardar la ocurrencia del principio o la recurrencia del trastorno. Para los expertos en la materia será obvio que la cantidad efectiva del agente dependerá, inter alia, del trastorno tratado (por ejemplo, el trastorno mediado por células T de la piel Vs. trastorno mediado por células T de otro órgano diferente de la piel) , el programa de administración, la dosis unitaria administrada, si el agente es administrado en combinación con otros agentes terapéuticos, el estado inmune y la salud del paciente, la actividad terapéutica o profiláctica del agente particular administrado y la vida media del suero. Dependiendo del trastorno a ser tratado el agente puede ser empacado de manera diferente. Preferiblemente, el polipéptido LFA-3 de enlace a CD2, soluble (por ejemplo LFA3-TIP) es administrado en una dosis de entre aproximadamente 0.001 y aproximadamente 50 mg del agente por kg de peso corporal, más preferiblemente, entre aproximadamente 0.01 y aproximadamente 10 mg del agente por kg de peso corporal, mayormente se prefiere entre aproximadamente 0.1 y aproximadamente 4 mg del agente por kg de peso corporal. En una modalidad preferida, el polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 es administrado a una dosificación unitaria que varía desde 2 a 15 mg cuando es administrado por ruta IV (por ejemplo, bolus de 7.5 mg IV) y a una dosificación que varía desde 2 a 30 mg cuando es administrado por la ruta IM (por ejemplo, inyección IM de 10 mg o 15 mg) . Se prefiere la administración IM e IV. Las dosis unitarias son administradas típicamente hasta que se observa un efecto. El efecto puede ser medido por una variedad de métodos, incluyendo los ensayos de actividad de células T in vitro y la eliminación o el mejoramiento de las áreas de la piel afectadas, o el mejoramiento en otras áreas del cuerpo afectadas que pueden ser relevantes para el trastorno particular. Preferiblemente, la dosis unitaria es administrada a intervalos regulares durante un ciclo de tratamiento, tales como una vez por semana. Más preferiblemente, es administrada a intervalos regulares, por ejemplo, a intervalos semanales por un período de administración de varias semanas, por ejemplo, once semanas. Administraciones más frecuentes, por ejemplo, dos o tres veces por semana se contemplan también y pueden adoptarse si el trastorno del sujeto es severo o si está indicada la intervención urgente. Administraciones menos frecuentes, por ejemplo una vez o dos veces por mes, se contemplan también y pueden ser adoptadas si el sujeto responde bien a terapia de modo que mantener la dosificación sea apropiado. Se reconocerá, sin embargo, que pueden emplearse dosificaciones más altas o más bajas y otros programas de administración durante uno cualquiera de los ciclos particulares de administración. El agente, por ejemplo, el polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 (por ejemplo AMEVIVE) es también administrado preferiblemente en una composición que incluya un portador aceptable farmacéuticamente. Por "portador aceptable farmacéuticamente" se quiere decir un portador que no cause una reacción alérgica u otro efecto indeseable en pacientes en quienes se haya administrado. Los portadores aceptables farmacéuticamente adecuados incluyen por ejemplo, uno o más de agua, solución salina, solución salina regulada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y los similares, así como también combinaciones de los mismos. Portadores aceptables farmacéuticamente pueden comprender adicionalmente cantidades mínimas de substancias auxiliares tales como agentes emulsificantes o humectantes, conservadores o reguladores, los cuales mejoran la vida de anaquel o la efectividad del agente. Las formulaciones, por ejemplo, formulaciones farmacéuticas, de agentes de enlace a CD2 pueden ser preparadas en formas acuosas o no acuosas, por ejemplo liofilizadas. Las formulaciones farmacéuticas preferidas son adecuadas para inyección. Un ejemplo de una formulación acuosa abarcada por la presente invención incluye formulaciones líquidas congeladas con solución salina regulada con fosfato (PBS) . Un ejemplo de una formulación liofilizada incluye una vez o más de: citrato, glicina o sacarosa. Por ejemplo, una formulación liofilizada preferida incluye 1 a 5 % de sacarosa, preferiblemente 2.5 % de sacarosa, y 0.5 % a 2 % de glicina, preferiblemente 1 % de glicina, en regulador de ácido cítrico-citrato de sodio (al menos 10 mM, preferiblemente 25 mM) regulada a pH de al menos aproximadamente 4, preferiblemente 5, más preferiblemente 6 (o aún más preferiblemente, 6.8). El segundo agente puede ser administrado en un forma de dosificación única con el agente de enlace a CD2 (es decir como parte de la misma composición farmacéutica) , una forma de dosificación múltiple en donde los dos componentes son administrados separada y específicamente. De manera alternativa, el agente de enlace a CD2 y el otro agente activo puede estar en la forma de una molécula única conjugada. La conjugación de los dos componentes puede lograrse por medio de técnicas de reticulación estándares bien conocidas en el arte. Una molécula única puede también tomar la forma de una proteína de fusión recombinante. Además, una composición farmacéutica útil en la presente invención puede ser usada en combinación con otras terapias tales como PUVA, quimioterapia y rayos UV. Dichas terapias en combinación pueden utilizar ventajoamente dosificaciones más bajas de los agentes terapéuticos o profilácticos. El agente de enlace a CD2, o la composición farmacéutica, puede estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación sólidas, semi-líquidas y líquidas, tales como tabletas, pildoras, polvos, soluciones líquidas, dispersiones o suspensiones, liposomas, supositorios, inyectables infusionables, y preparaciones tópicas . La forma preferida depende del modo de administración y la aplicación terapéutica. Las formas preferidas son soluciones infusionables e inyectables. La invención incluye formulaciones adecuadas para uso como protectores solares o protectores contra rayos UV aplicados tópicamente. Las modalidades preferidas incluyen preparaciones de AMEVIVE . El ingrediente activo puede ser formulado en un liposoma. El producto puede ser aplicado antes de, durante o después de exposición a los rayos UV, o antes de, durante o después del desarrollo del enrojecimiento.

Secuencias Lo siguiente es un resumen de las secuencias descritas en US 6,162,432 y mencionadas en el transcurso de la solicitud: SEC ID NO: 1 Secuencia de ADN de LFA-3 transmembrana SEC ID NO: 2 Secuencia de aminoácidos de LFA-3 transmembrana SEC ID NO: 3 Secuencia de ADN de LFA-3 enlazada a Pl SEC ID NO: 4 Secuencia de aminoácidos de LFA-3 enlazada a Pl SEC ID NO: Secuencia de ADN de CD2 SEC ID NO: 6 Secuencia de aminoácidos de CD2 SEC ID NO: 7 Secuencia de ADN de AMEVIVE SEC ID NO: 8 Secuencia de aminoácidos de AMEVIVE EJEMPLOS EJEMPLO 1: Tratamiento en corridas múltiples de psoriasis con AMEVIVE® (Alefacept) Este ejemplo examinó la eficiencia y la seguridad en pacientes que han recibido una corrida múltiple de tratamiento de hasta nueve ciclos de terapia con AMEVIVE® durante 4.5 años . Tratamiento El ciclo de tratamiento inicial en el estudio de marca abierta es mencionado como ciclo A. Los ciclos subsecuentes son marcados ciclo B, C, D, y así sucesivamente. Los pacientes recibieron una vez semanalmente el tratamiento por 12 semanas (período de administración) seguido por 12 semanas de observación (período de descanso) en cada ciclo. Se administraron 7.5 mg de AMEVIVE por inyección de bolus intravenoso (IV) . Antes de la iniciación del tratamiento en la extensión del estudio se estableció la necesidad de terapia generalizada con base en las evaluaciones de la severidad de la enfermedad del médico, y las cuentas de células T CD4+ estuvieron en o superiores al límite inferior del normal (LLN; 404 células/mm3) . La elegibilidad de un ciclo subsecuente se basó en el criterio mencionado anteriormente y, además, los pacientes debieron de haber recibido > 8 dosis de AMEVIVE durante el período de tratamiento de 12 semana del ciclo previo y para el ciclo C y ciclos subsecuentes, la cuenta de linfocitos se requirió que fuera de > 75 % de la cuenta registrada en la visita de selección del estudio. En cualquier ciclo dado, si los pacientes tuvieron cuentas de células T CD4+ < 300 pero > 200 células /mm3, la dosis de AMEVIVE se redujo en 50 % (3.75 mg) . Si la cuenta de células T CD4+ fue < 200 células/mm3, la dosis programada se mantuvo. Si la cuenta de células T CD4+ fue < 200 células/mm3 por 4 visitas consecutivas, se mantuvo AMEVIVE permanentemente. La dosis de AMEVIVE fue retenida por 2 semanas cuando hubo evidencia de una infección clínicamente significativa. Evaluación Se evaluó la eficiencia en el índice de Severidad y Área de Psoriasis (PASI) y por Evaluación Global del Médico (PGA) . Para el ciclo A, se hicieron las evaluaciones en las semanas 1, 3, 5, 7, 9, 11, y 12 durante el tratamiento y a 2, 4, 6, 8, y 12 semanas después de tratamiento. Para, los ciclos subsecuentes, las evaluaciones se hicieron en las semanas 1 y 7 durante el tratamiento y a 2 y 12 semanas después del tratamiento. Se reportaron las proporciones de pacientes que lograron > 50 % y > 75 % de mejoramiento en PASI a partir de la línea base (PASI 50 y PASI 75, respectivamente) y aquellos que lograron PGA de "claro" o "casi claro" . Los análisis de principio de linfocitos y linfocitos totales se condujeron en cada visita de estudio, excepto a 4 semanas después de tratamiento en el ciclo A y 4 y 8 semanas después de tratamiento en todos los ciclos subsecuentes . Los pacientes con infecciones virales, bacterianas o fúngicas en proceso fueron monitoreados en todas las visitas. Los eventos adversos fueron monitoreados en el transcurso del estudio. Resultados En el momento de este análisis, los pacientes habían recibido ciclos repetidos de terapia con AMEVIVE durante 4.5 años. En este estudio, 175 pacientes habían recibido > 1 ciclo de AMEVIVE; 126 recibieron > 2 ciclos; 96 recibieron > 3 ciclos; y 71 recibieron > 4 ciclos. Algunos pacientes habían recibido hasta 9 ciclos de AMEVIVE como un resultado de la exposición a AMEVIVE en estudios previos de dos fases . Eficiencia Las proporciones de pacientes que lograron PASI 50 en 2 o 12 semanas después de tratamiento para los ciclos A-D se muestran en la Figura 2. La velocidad de respuesta de los ciclos C y de s notablemente creciente en comparación a los ciclos A y B. Las proporciones de pacientes que lograron PASI 75 fueron 29 %, 33 %, 34 %, y 52 % en los ciclos A, B, C, y D, respectivamente. Las velocidades de respuesta correspondientes para un PGA de "claro" o "casi claro" fueron de 24 %, 29 %, 33 %, y 34 %, respectivamente. Para los ciclos A-D, el beneficio creciente y la repetición de respuesta de ciclos adicionales de terapia con AMEVIVE se muestran en la Figura 3. Para los respondedores del ciclo A es decir, pacientes que lograron PASI 50 en el ciclo A) que recibieron ciclos adicionales de AMEVIVE, las proporciones de pacientes que lograron PASI 50 aumentó con cada ciclo subsecuente. En general, los pacientes continuaron respondiendo a la repetición del tratamiento con AMEVIVE sin evidencia de taquifilaxis . De aquellos que lograron PASI 50 en un ciclo dado, 75 % a 90 % de pacientes lograron PASI 50 en ciclos subsecuentes (es decir, respuesta repetida) . Eventos Adversos La incidencia de eventos adversos, en general, no varió considerablemente a través de los ciclos . El perfil de seguridad global de AMEVIVE después de administración de ciclos múltiples (una corrida de tratamiento múltiple) es similar a la reportada en estudios de 3 fases. La incidencia de eventos adversos serios fue de 7 % o menos en cualquier ciclo, y el espectro de eventos adversos fue similar a estudios de 2 y de 3 fases previos . Dos pacientes de cada uno de los ciclos A y B y 1 paciente en el ciclo E interrumpieron el tratamiento a acusa de un evento adverso. La incidencia de malignidad fue baja: 3 % o menos en cualquier ciclo; la mayoría tuvieron cáncer de piel . Duración de la respuesta libre de tratamiento En los estudios de 3 fases, se demostró la acción remitiva de AMEVIVE, con pacientes que mantuvieron respuestas de PASI 50 para una media de 7 meses. En este ejemplo, algunos pacientes habían sido seguidos por períodos prolongados después de ciclos de tratamiento exitosos. La Figura 4 muestra la extensión máxima de tiempo de respuesta en 4 de dichos pacientes . , La respuesta ala terapia con AMEVIVE se mantuvo por 18-24 meses en algunos pacientes. Cuenta de Linfocitos A través de los ciclos de tratamiento múltiples con AMEVIVE, la disminución en la secuencias linfocíticas fue consistente. La disminución en las cuentas linfocíticas observadas con cada ciclo no fueron acumulativas . Las cuentas de células T CD4+ medias permanecieron superiores al LLN para todos los ciclos y no disminuyeron con exposición a AMEVIVE en corridas múltiples (Figura 5) .

En resumen este estudio muestra que una corrida múltiple de tratamiento (3 ciclos de tratamiento o más) proporciona resultados más significativos que una corrida única de terapia, con ningún riesgo adicional aparente de efectos secundarios . Los ciclos múltiples de AMEVIVE fueron bien tolerados por los pacientes, y la incidencia de eventos adversos no varió considerablemente a través de los ciclos. Ejemplo 2: Tratamiento en corridas múltiples de psoriasis con AMEVIVE Este ejemplo examinó la respuesta clínica a un segundo ciclo de tratamiento con AMEVIVE en pacientes con psoriasis que no lograron una reducción de > 50 % en índice de Severidad y Área de Psoriasis (PASI %=) o una reducción > 25 % (PASI 25) durante un primer ciclo de tratamiento con AMEVIVE, así como también la eficiencia de ciclos múltiples de terapia. Pacientes Los pacientes fueron de > 16 años de edad y tuvieron psoriasis de placa crónica por > 12 meses que involucró > 10 % del área superficial corporal. Las cuentas de células T CD4+ requirieron estar encima del límite inferior de la normal (LLN) . El tratamiento con fototerapia, retinoides generalizadas, corticoesteroides generalizados, fumaratos generalizados, inmunosupresores (metotrexate, ciclosporina, azatioprina, y tioguanina) , y corticoesteroides tópicos de alta potencia fueron prohibidos en 4 semanas antes de tratamiento con AMEVIVE y en el transcurso de los estudios . El uso de corticoesteroides tópicos de potencia moderada, retinoides tópicos, alquitrán de hulla, queratolíticos, y análogos de vitamina D fueron prohibidos en 2 semanas de tratamiento con AMEVIVE y en el trasncurso de los estudios, excepto en el cuero cabelludo, ingles, y plantas de los pies. Para ser elegible para enrolamiento en los estudios de extesnión, se requirió que los pacientes hubieran recibido > 8 dosis de AMEVIVE y haber completado la visita de seguimiento final del ciclo de terapia previo. Se excluyeron los pacientes de los estudios de extensión si estaban enrolados en cualquier otro estudio de investigación de terapia de fármacos o sin fármacos o si iniciaron tratamientos de soriasis generalizados alternativos, fototerapia, u otras terapias desaprobadas antes de 8 semanas del ciclo previo Tratamiento Los estudios de 3 fases fueron de centro múltiple, aleatorios, doble ciego, y controlados por placebo (Krueger y colaboradores, J. Am. Acad. Dermatol. 47: 821- 833, 2002; Lebwohl y colaboradores, Arch. Dermatol. 139: 719-727, 2003) . En el estudio de 3 fases de tratamiento intravenoso (IV) con AMEVIVE, los pacientes recibieron dos ciclos de tratamiento, donde cada ciclo consistió de (i) un período de administración de 12 semanas ya sea de una vez a la semana de AMEVIVE (7.5 mg) o placebo, y (ii) un seguimiento de 12 semanas (período de descanso) . En el estudio de 3 fases de tratamiento intramuscular (IM) con AMEVIVE, los pacientes recibieron un ciclo único de tratamiento que consistió de un período de administración de 12 semanas ya sea de AMEVIVE (10 mg o 15 mg) o placebo una vez por semana, seguido por 12 semanas de observación (período de descanso) . En los estudios de terapia por corrida múltiple, los pacientes que recibieron ciclos adicionales de tratamiento con AMEVIVE (mismo régimen de dosificación) fueron aquellos cuya enfermedad había progresado para requerir terapia generalizada o fototerapia, como determinó el investigador, y había cuenta de células T CD4+ circulantes en o encima de LLN (Gordon y colaboradores, J. Drugs Dermatol. 2: 624-628, 2003). Evaluación Durante los estudios de 3 fases, se evaluaron PASI y la Evaluación Global del Médico (Physician Global Assessment, PGA) en línea base, cada dos semanas durante el tratamiento, y cada 2 a 4 semanas durante el seguimiento. Se evaluaron también PASI y PGA a varios puntos de tiempo durante el estudio de corrida múltiple IV, mientras que solamente se evaluó PGA durante el estudio de corrida múltiple IM. Análisis Los datos del estudio de 3 fases de 2 ciclos de tratamiento IV con AMEVIVE fueron usados para determinar la eficiencia de un segundo ciclo de tratamiento con AMEVIVE en dos grupos de pacientes: (a) aquellos que no lograron PASI 50 en el primer ciclo y (b) aquellos que no lograron PASI 25 en el primer ciclo. Se determinaron las proporciones de pacientes que no lograron PASI 50 y PASI 25 durante el ciclo 1 de tratamiento con AMEVIVE que lograron PASI 50 o reducciones de PASI de > 75 % (PASI 75) en cualquier momento durante un segundo ciclo de tratamiento. Las proporciones anormales y los intervalos de confianza de 95 % correspondientes (CIs) fueron calculados para comparar las velocidades de respuesta entre pacientes que recibieron un segundo ciclo de tratamiento con AMEVIVE y aquellos que recibieron placebo. Se determinaron también, las proporciones de pacientes que lograron PASI 50, PASI 75, y PGA de "claro" o "casi claro" en cualquier momento durante cada uno de los ciclos de tratamiento IV, y la proporción de pacientes que lograron un PGA de "claro" o de "casi claro" en cualquier momento durante cada uno de los ciclos de tratamiento IM. Resultados Los pacientes tuvieron una edad media de ~ 45 años, y ~ 70 % fueron machos. La duración media de psoriasis fue de ~ 19 años, y el área superficial media involucrada fue de ~ 22 %. El número de pacientes que recibieron cada ciclo de tratamiento IV e IM con AMEVIVE se resume en la Tabla 1.

Tabla 1. Número de pacientes que recibieron múltiples ciclos de AMEVIVE .

Eficiencia de un segundo ciclo de tratamiento en pacientes que no lograron previamente PASI 50 o PASI 75 Se observó mejoramiento de PASI durante un segundo ciclo de tratamiento IV con AMEVIVE en 93 % de los pacientes que no lograron PASI 50 durante el primer ciclo y 89 % de pacientes que no lograron PASI 25 durante el primer ciclo. El tratamiento con AMEVIVE en el segundo ciclo dio como resultado proporciones significativamente mayores de pacientes que lograron PASI 50 y PASI 75 que el tratamiento con placebo (Tabla 2) . 19 % de pacientes que no lograron PASI 50 durante el ciclo inicial de tratamiento con AMEVIVE lograron PASI 75 durante el segundo ciclo y 53 % lograron PASI 50. 14 % de pacientes que no lograron PASI 25 durante el ciclo de tratamiento inicial con AMEVIVE lograron PASI 75 durante el segundo ciclo y 47 % lograron PASI 50 (Tabla 2) . Proporciones anormales mostraron que pacientes que no lograron PASI 50 o PASI 25 en el ciclo 1 fueron 2 a 3 veces más probablemente que lograran PASI 50 o PASI 75 en el ciclo 2 en comparación con pacientes que no recibieron otro ciclo (Tabla 2) . Tabla 2. Mejoramiento de PASI en cualquier momento durante un segundo ciclo de AMEVIVE en pacientes que no lograron PASI 50 o PASI 25 durante el primer ciclo.

A = Pacientes que no lograron PASI 50 en el primer ciclo de AMEVIVE .

Eficiencia de la Terapia en Corrida Múltiple Los pacientes que recibieron ciclos múltiples de tratamiento IV con AMEVIVE mostraron mejoramiento creciente en PASI durante cada ciclo de tratamiento subsecuente. La proporción de pacientes que lograron PASI 75 aumentó desde 29 % durante el ciclo 1 a un máximo de 54 % durante el ciclo 5 (Figura 6A) . De manera similar, la proporción de pacientes que lograron PASI 50 aumentó desde 56 % durante el ciclo 1 a un máximo de 74 % durante el ciclo 5 (Figura 6B) . PGA resultó apoyar adicionalmente el incremento en el mejoramiento clínico en psoriasis observado con ciclos múltiples de tratamiento con AMEVIVE. 23 % de pacientes tuvieron un PGA de "claro" o "casi claro" durante el ciclo 1 de tratamiento IV con AMEVIVE . Durante el ciclo 5, 44 % de pacientes lograron este nivel de respuesta (Figura 7A) . Para el tratamiento IM con AMEVIVE, las velocidades de respuesta de PGA "claro"/"casi claro" incrementaron de 21 % durante el ciclo 1 a un máximo de 41 % durante el ciclo 4 (Figura 7B) . En resumen, se vio el mejoramiento clínico creciente después de ciclos sucesivos de tratamiento con AMEVIVE, indicando su eficiencia para el tratamiento a largo plazo de pacientes con psoriasis de placa crónica. Los datos de terapia en corrida múltiple mostraron que la respuesta de pacientes al tratamiento adicional con AMEVIVE es crecientemente benéfico con respecto a la respuesta al tratamiento inicial .

Claims (30)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes : REIVINDICACIONES
1. l.Un método de tratar a un sujeto que tiene psoriasis, el método está caracterizado porque comprende administrar una corrida múltiple de tratamiento de un polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble al sujeto, porque la corrida múltiple comprende múltiples ciclos de tratamiento, y porque cada ciclo comprende un período de administración y un período de descanso.
2. 2.El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble es una proteína de fusión de LFA-3.
3. 3.El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble es una proteína de fusión LFA-3/inmunoglobulina (Ig) .
4. 4.El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble comprende un polipéptido de LFA-3 soluble fusionado a toda o parte de la región de articulación de la cadena pesada de Ig y toda o parte de una región constante de cadena pesada.
5. 5.El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble comprende una proteína de fusión que consiste de los 92 aminoácidos amino terminales de LFA-3 maduro, los 10 aminoácidos C terminales de una región de articulación de IgGl humano, una región CH2 de una cadena pesada de IgGl humana, y al menos parte de la región CH3 de una cadena pesada de IgGl humana.
6. 6.El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble es AMEVIVE (Figura 1) .
7. 7.El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble es codificado por un inserto contenido en el plásmido pSAB152, depositado con American Type Culture Collection bajo el Número de Acceso ATCC 68720.
8. 8.El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque la corrida múltiple comprende al menos cuatro ciclos de tratamiento.
9. 9.El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque la corrida múltiple comprende al menos cinco ciclos de tratamiento.
10. 10. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque la corrida múltiple comprende al menos seis ciclos de tratamiento.
11. 11. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque la corrida múltiple comprende al menos siete ciclos de tratamiento.
12. 12. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque la corrida múltiple comprende al menos ocho ciclos de tratamiento.
13. 13. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el período de descanso de cada ciclo sucesivo de la corrida múltiple es más largo que el período de reposo de un ciclo previo en la corrida múltiple.
14. 14. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el período de descanso del último ciclo de la corrida múltiple es al menos de 2 años .
15. 15. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el período de descanso del último ciclo de la corrida múltiple es al menos de 3 años .
16. 16. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el período de administración de cada ciclo de la corrida múltiple es al menos de 8 semanas.
17. 17. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el período de administración de cada ciclo de la corrida múltiple es ai menos de 10 semanas.
18. 18. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el período de administración de cada ciclo de la corrida múltiple es al menos de 12 semanas.
19. 19. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el polipéptido es administrado intramuscularmente.
20. 20. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el polipéptido es administrado intravenosamente.
21. 21. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el polipéptido es administrado en una dosificación unitaria que varía de 2 a 30 mg.
22. 22. El método de conformidad con una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 caracterizado porque el método comprende adicionalmente administrar al sujeto un agente terapéutico o profiláctico adicional durante la corrida múltiple de tratamiento.
23. 23.Un método de tratar a un sujeto en necesidad de tratamiento para psoriasis, el método está caracterizado porque comprende administrar una corrida múltiple de tratamiento de AMEVIVE (Figura 1) al sujeto, porque la corrida múltiple de tratamiento comprende al menos tres ciclos de tratamiento, cada ciclo de tratamiento comprende un período de administración de administración una vez por semana de AMEVIVE (Figura 1) por 12 semanas, seguido por un período de descanso de al menos 12 semanas.
24. 24.El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la corrida múltiple de tratamiento comprende al menos cuatro ciclos de tratamiento.
25. 25.El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la corrida múltiple de tratamiento comprende al menos cinco ciclos de tratamiento.
26. 26.El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el método comprende evaluar al sujeto por los efectos de AMEVIVE (Figura 1) durante uno o ambos del período de administración y el período de descanso de cada ciclo en la corrida múltiple.
27. 27.El método de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque el método comprende adicionalmente administrar al sujeto un agente terapéutico o profiláctico adicional durante la corrida múltiple de tratamiento.
28. 28.Un método de tratar a un sujeto que tiene psoriasis, el método está caracterizado porque comprende (a) seleccionar a un sujeto con base de haber tenido al menos dos ciclos de tratamiento con un polipéptido de LFA- 3 de enlace a CD2 soluble y (b) administrar un tercer ciclo de tratamiento de un polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble al sujeto.
29. 29.El método de conformidad con la reivindicación 28, caracterizado porque el polipéptido de LFA-3 de enlace a CD2 soluble es AMEVIVE (Figura 1) .
30. 30.Un equipo caracterizado porque comprende una composición farmacéutica que comprende AMEVIVE e instrucciones para administrar la composición farmacéutica a un paciente que ha tenido previamente dos ciclos de tratamiento con AMEVIVE (Figura 1) .