CN100473417C - Cd2-结合剂调节记忆效应t-细胞的制药用途和组合物 - Google Patents

Abstract

公开了选择性调节具有疾病的受治者的记忆效应T-淋巴细胞的方法。该方法使用CD2结合剂。

Description

CD2-结合剂调节记忆效应T-细胞的制药用途和组合物

本发明的技术领域

本发明涉及使用CD2/LFA-3相互作用的抑剂治疗哺乳动物包括人类的疾病，该疾病以存在激活的T细胞为特征。这类疾病包括炎性肠病，牛皮癣性关节炎，类风湿性关节炎，以及多发性硬化。

本发明背景

抗原呈递细胞(APC)在细胞表面表达高密度的II类组织相容性复合体(MHC)。MHC-II类分子与胞吞的抗原衍生的肽结合，并主要由辅助性T淋巴细胞识别。T细胞上的T细胞受体识别抗原为结合在MHC编码的细胞表面分子上的肽片段(Springer，“免疫系统的粘着受体”，自然(Nature)，346，pp.425-27(1990))。

除了T细胞受体/MHC相互作用之外，表达在这种APC表面和T细胞表面的分子之间还有很多相互作用。这些表面分子，常称为粘附分子，参与多种功能包括细胞粘附，抗原识别，T细胞激活中的共-刺激信号传递以及刺激T细胞细胞毒性效应器(“在炎性疾病的诊断和治疗中的粘着分子”，The Lancet，336，pp.1351-52(1990))。这些细胞粘附看来在免疫反应的产生中参与激活T细胞的增殖(Hughes etal.，“作为T-细胞功能的调节剂的内皮细胞”，免疫学综述(Immunol. Rev.)，117，pp.85-102(1990))。

激活T细胞的一种方式是将其抗原特异性T细胞受体与诸如巨噬细胞的抗原呈递细胞表面的肽-MHC复合体结合。T细胞的活化刺激两类功能性T细胞增殖和分化：辅助性细胞，它促进产生抗体的B淋巴细胞的增殖和成熟，以及杀伤细胞，它裂解靶细胞(Bierer等，“LFA-3的单克隆抗体，CD2配体，特异性固定主要组织相容性复合体蛋白”，欧洲免疫学杂志(Eur.J.ImmunoI.)19：pp.661-65(1989)；Springer“免疫系统的粘着受体”，Nature，346，pp.425-34(1990))。

有许多以不正常免疫反应为特征的疾病，并且其中有很多特别地具有增强的T细胞活化的特征。T细胞通过与靶和抗原呈递细胞相互作用在免疫反应中起重要作用。例如，T′细胞介导的杀死靶细胞是多步骤的过程，包括起始的细胞裂解性T细胞(效应器细胞)对靶细胞的粘附。而且，辅助性T细胞通过粘附抗原呈递细胞起始免疫反应。

T细胞的这些与靶和抗原呈递细胞的相互作用是高度专一的并且依赖于T细胞表面的多种特异性抗原受体对靶或APC表面的抗原的识别。

T细胞和其它细胞的受体-抗原相互作用也受到多种T细胞表面蛋白质的促进，例如抗原-受体复合体CD3和辅助性粘附分子诸如CD4，LFA-1，CD8，和CD2。它也受到表达于靶或抗原呈递细胞表面的辅助性粘附分子诸如LFA3，ICAM-I和MHC的促进。例如，LFA-I和其对应受体ICAM-I或ICAM-2，以及CD2和其对应受体LFA-3与细胞粘附和T细胞活化有关。已经知道LFA-I/ICAM和CD2/LFA-3相互作用是独立的。许多出现在其它T细胞上的其它分子亦与T细胞粘附有关，包括E2(MIC2)，VLA-4(CD49d)，CD44(Hermes，Pgp-1，ECMRIII)，以及H19(N4)(参看Maggoba等，“CD2-LFA3和LFA-1-ICAM途径：有关T-细胞识别”，今日免疫学(Immunol，Today)，10，pp.417-22(1989))。

在激活T细胞活性方面，对CD2和LFA-3之间的相互作用知之甚少。最近的研究提示CD2(一种T细胞粘附分子)和LFA-3(一种靶细胞和APC粘附分子)之间有特异性相互作用，介导了T细胞对靶或抗原呈递细胞的粘附。这种细胞-细胞粘附与起始T细胞功能反应有关(Dustin等，“纯化的淋巴细胞功能相关的抗原3结合CD2并介导T淋巴细胞粘着”实验医学杂志(J.Ex-p.Med.)，165，pp.677-92(987)；Springer et al.，“淋巴细胞功能相关的LFA-1，CD2和LFA-3分子：免疫系统的细胞粘着受体”，免疫学年鉴(Ann.Rev.Immunol.)，5，pp.223-52(1987))。

发现于多种细胞包括人红血细胞表面的LFA-3成为相当多项研究的对象，目的是进一步阐明它在多种T细胞相互作用中功能(参看例如，Krensky等，“LFA-1，LFA-2和LFA-3的功能重要性，分布和结构：与CTL-靶相互作用相关的细胞表面抗原”，免疫学杂志(J.Immunol.)，131(2)，pp.611-16(1983)：Shaw等，“人细胞毒性T-细胞克隆所用的两种抗原独立性粘着途径”，Nature，323，pp.262-64(1986))。

已经确定了两种天然形式的LFA-3。一种形式的LFA-3(“跨膜LFA-3”)通过一个跨膜疏水结构域固定在细胞膜。已经克隆了这种形式的LFA-3的cDNA并测定了序列(参看例如，Wallner等，“淋巴细胞功能相关的抗原-3(LFA-3)的一级结构”，J.Exp.Med.，166，pp.923-32(1987))。另一种形式的LFA-3通过共价键连接到含磷脂酰肌醇(“PI”)的糖脂上固定在细胞膜。这后一种形式命名为“连接PI的LFA-3”亦克隆了这种形式的LFA-3的cDNA并测定了序列(Wallner等，PCT Pub.WO 90/02181)。

人类CD2分子是一个50kD的表面糖蛋白，表达在>95％的胸腺细胞和实际上所有的外周淋巴细胞。使用特异性单克隆抗体进行的生化测定提示CD2是T谱系特异的并以数种不同的糖基化形式存在于细胞表面(Howard等，“由阻断E-玫瑰花结形成的单抗定义的人T淋巴细胞区分标记”，J.Immunol.，126，pp.2117-22(1981)；Brown等，白细胞III型，McMichael编，Oxford University Press，pp.110-12(1987)；Sayre等，“TII cDNA的分子克隆和表达提示人T淋巴细胞上的受体样结构”，美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，84，pp.2941-45(1987))。

已经报道了人类CD2基因的序列(Seed and Aruffo，“通过快速免疫选择过程的CD2抗原，T-细胞红细胞受体的分子克隆”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，pp.3365-69(1987)；Sayre等，“T11cDNA的分子克隆和表达揭示人T淋巴细胞的受体样结构”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，pp.2941-45(1987))。CD2的cDNA克隆预测有一段24个氨基酸残基的信号肽，一段185个残基的胞外片段，一段25个残基的跨膜结构域和一段117个残基的细胞质区域(Sayre等，(1987)；Sewell等，“人T-淋巴细胞表面CD2(T11)抗原的分子克隆”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，pp.8718-22(1986)；Seed and Aruffo，同上(1987)；Clayton等，Eur.J.Immun.，17，pp.1367-70(1987))。已经报道了含有LFA-3结合结构域的溶解性CD2多肽(PCT Publn.WO 90/08187)。亦报道了CD2的单克隆抗体，例如TS2/18，T11₁，T11₂，T11₃以及LFA3的单克隆抗体例如TS2/9(参看例如，Hughes等，“作为T-细胞功能的调节剂的内皮细胞”，Immunol，Reviews，117，pp.85-102(1990)；Meuer，“T-细胞活化的另一途径：50KD T11绵羊红细胞受体蛋白的功能性作用”，细胞(Cell)，36，pp.897-906(1984))。

抗原特异性T细胞受体与抗原呈递细胞表面的肽-复合体的结合也涉及通常在需要接触抗原的适应性免疫反应中形成的所谓“记忆”细胞的形成以及抗原-特异性记忆细胞的扩展。T-细胞记忆可能依赖于抗原的重复刺激。记忆性T-细胞通过增加CD2，LFA-3和其它辅助性粘附分子的表达增强它们对抗原呈递细胞的结合亲和力。实际上，白细胞抗原CD45R同工型的一个重要表型改变使得可以区分表达CD45R的天然T细胞和与低分子量形式的CD45RO反应的记忆性T细胞。

意识到多数，如果不是全部，记忆细胞受到抗原的重复轰击，那么很可能多数与CD45RO亚群相关的特征实际上体现了效应T细胞。有不断增加和引起兴趣的文献描述了CD45RO记忆效应T细胞与现存的多种炎性疾病的关系，诸如炎性肠病，包括局限性回肠炎和溃疡性结肠炎，(Horiuchi等，J.Japan.Soc.Colo.Protol.，45：391-393(1992))；牛皮癣性关节炎(Veale等，风湿病年鉴(Ann.Rheum.Dis.)53：450-454(1994))，类风湿性关节炎(Muller等，自身免疫(Autoimmunity)14；37-43(1992))；眼色素层炎(Ohta等，(Curr.Eye Res.)，15：299-306(1996))；肾炎(Rodruguez-Poerez等，美国肾病杂志(Am.J.Nephorl.)，15：386-391(1995))；以及多发性硬化(Crucian等，临床诊断实验免疫学(Clin.Diag.Lab.Immunol.)，2：249-252(1995)，Lehmann等，临床免疫学免疫病理学(Clin.Immunol.Immunopathol.)，85：202-209(1997)，Muller等，Autoimmunity 14：37-43(1992)，Qin等，临床免疫学杂志(J.Clin.Immunol.)，13：152-161(1993))。

由于这些记忆效应T淋巴细胞在发病机制中的可能作用，因而存在着调节这类疾病的病人中的此类细胞的改进的方法的需要。

本发明概述

本发明提供了一种预防和治疗疾病的方法，该类疾病的特征是记忆效应T淋巴细胞浸润到哺乳动物的器官中。在该方法中，将CD2结合剂给药，其能够调节记忆效应T淋巴细胞的数量和/或分布。有很多原因使本发明方法在治疗这类疾病时比先前存在的方法优越，包括本方法更具选择性，从而比先前存在的治疗方法更少免疫抑制性，具有更小的一般毒性。

依据本发明的方法，可以使用的物质包括任何CD2结合剂的分子。这包括调节CD2/LFA-3相互作用的分子或其它化学实体。优选地，该剂选自抗-LFA-3抗体同系物，抗-CD2-抗体同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，CD2或LFA-3模拟剂(诸如小有机分子)及其衍生物。

本发明一方面是一种选择性调节病人体内记忆效应T淋巴细胞的方法，该方法包括向病人给予有效量的CD2结合剂。在个体中记忆T淋巴细胞可能浸润靶器官。优选地，记忆效应T淋巴细胞是CD45RO T淋巴细胞。CD2结合剂选自抗-LFA-3抗体同系物，抗-CD2-抗体同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，CD2模拟剂，以及LFA-3模拟剂。本发明的另一种方法涉及治疗特征为记忆效应T淋巴细胞与发病机制有关的病人疾病，该方法包括向病人给予有效量的CD2结合剂。该类疾病选自牛皮癣性关节炎，类风湿性关节炎，多发性硬化，特应性皮炎，眼色素层炎，炎性肠病，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，以及皮肤T细胞淋巴瘤。

本发明的又一方法是调节哺乳动物中记忆效应T淋巴细胞的一种方法，其中的哺乳动物特征是记忆效应T淋巴细胞浸润到哺乳动物的器官。该方法包括向哺乳动物给予在上述器官中足以选择性调节该器官中记忆效应T淋巴细胞的CD2结合剂。哺乳动物患有选自牛皮癣性关节炎，类风湿性关节炎，多发性硬化，特应性皮炎，眼色素层炎，炎性肠病，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，以及皮肤T细胞淋巴瘤的疾病。

本发明的组合物含有一种群的获自患病哺乳动物的记忆效应T淋巴细胞，该哺乳动物疾病特征是有记忆效应T淋巴细胞浸润到哺乳动物的器官中，其中的该种群与CD2结合剂联合。

附图的简要描述

图1图示在牛皮癣病人接受CD2结合剂LFA3-TIP治疗后记忆效应T细胞相对于自然(T细胞的选择性降低。X轴上方的水平框代表治疗持续时间，在大约80天时停止。曲线代表在各治疗组中57位病人的平均淋巴细胞计数。对于记忆T细胞(CD 45 RO+)是统计上显著的治疗和时间效应，对原初T细胞(CD45 RA+)则不是。在80天的给药时期，不同CD2结合剂治疗中T细胞计数均显示降低，达到某种相对恒定的值。在治疗终止后，记忆效应T细胞计数开始回复。

本发明的详细描述

定义

此处使用的“效应T淋巴细胞”，“效应T细胞”，“记忆效应T淋巴细胞/细胞”以及类似术语交互使用，意思是已经暴露于抗原的T淋巴细胞(即那些非“原初(naive)”的)。更特异地，该术语是指与“自然”的CD45RA T淋巴细胞相对的CD45RO T淋巴细胞。

此处使用的“CD2”意思是与天然存在的LFA-3多肽结合的CD2多肽，它由(a)天然存在的哺乳动物CD2的DNA序列(如序列5)；(b)与天然存在的CD2的DNA序列简并的DNA；或(c)在相当于Tm值以下大约20C至27C的和1M氯化钠的条件下与上述任何一段DNA序列杂交的DNA序列编码。

此处使用的“LFA-3”意思是与天然存在的CD2多肽结合的LFA-3多肽，它由(a)天然存在的哺乳动物LFA-3的DNA序列(即序列1或序列3)；(b)与天然存在的LFA-3的DNA序列简并的DNA；或(c)在如下的标准杂交条件下与上述任何一段DNA序列杂交的DNA序列编码。

此处使用的“CD2结合剂”是一种分子，或化合物，或其它化学实体，它能调节CD2/LFA-3相互作用和/或调节CD2信号传递(signaling)。该术语包括抗-LFA-3抗体同系物，抗-CD2-抗体同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，CD2或LFA-3模拟剂及其衍生物。虽然定义中未排除这种强度和/或结合能力的增加，术语“调节”的意思是CD2结合剂改变(优选地是降低)CD2信号传递的强度和/或干涉CD2与LFA3的结合。CD2结合剂亦“调节”记忆效应T淋巴细胞(即CD45RO)且在上下文中术语“调节”意思是结合剂将改变接受了CD2结合剂的个体中记忆效应T淋巴细胞的数量和/或分布。在优选的方法中，结合剂将“选择性”调节这种记忆效应T淋巴细胞，意思是与原初T淋巴细胞(例如CD45RA T淋巴细胞)相比调节了记忆效应T淋巴细胞。

此处使用的“可溶性LFA-3多肽”或“可溶性CD2多肽”是不能将其自身锚定在膜上的LFA-3或CD2多肽。这类可溶性多肽包括例如缺乏足够的跨膜结构域部分来锚定该多肽或修饰使其跨膜结构域失去功能的CD2和LFA-3多肽。此处使用的LFA-3多肽包括全长或截短的(例如有内部缺失)PI-连接的LFA-3。

此处使用的“抗体同系物”是一种蛋白质，含有选自免疫球蛋白轻链，免疫球蛋白重链及其抗原-结合片段中的一种或几种多肽，其能够结合一种或多种抗原。由超过一个多肽构成的抗体同系物的多肽组分可任选地由二硫键或其它共价交联。相应地，抗体同系物包括完整的IgA，IgG，IgE，IgD，IgM型(及其亚型)免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。抗体同系物还包括保持抗原结合特异性的完整免疫球蛋白的部分，例如Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，F(v)片段，重链单体或双体，轻链单体或双体，由一个重链和一个轻链组成的双体，及其类似物。

此处使用的“人源化重组抗体同系物”是一种抗体同系物，通过重组DNA技术产生，其中抗原结合不需要的人免疫球蛋白轻或重链的部分或所有氨基酸取代非人哺乳动物免疫球蛋白轻或重链的相应氨基酸。

此处使用的“嵌合重组抗体同系物”是一种抗体同系物，通过重组DNA技术产生，其中免疫球蛋白轻链，重链或两者的铰链和恒定区所有或部分取代另一免疫球蛋白轻链或重链的相应区域。

本发明的方法可用于任何哺乳动物，优选地用于人。

“氨基酸”-肽，多肽，或蛋白质单体。在天然存在的肽，多肽，或蛋白质中发现了20种氨基酸，均为L-异构体。该术语还包括氨基酸的类似物和蛋白质氨基酸的D-异构体及其类似物。

“蛋白质”-基本上含有来自20种氨基酸的任何氨基酸的聚合物。虽然“多肽”常用于指相对较大的多肽，而“肽”常用于指相对较小的多肽，本领域使用这些术语是有交叉的和可变的。除非特别说明，此处使用的术语“蛋白质”是指肽，蛋白质和多肽。

“融合”-是指使用编码蛋白的多核苷酸的遗传表达或蛋白质合成方法将两个或多个蛋白质或其片段通过各自的肽骨架共线性连接。优选地，蛋白质或其片段是不同来源的。这样，优选的融合蛋白包括一种CD2结合剂，它是共价连接到是不同的CD2结合剂或根本不是CD2结合剂的第二个组分的蛋白或片段。特别地，“CD2结合剂蛋白质/Ig融合体”是一种连接到免疫球蛋白链N-末端的含有本发明CD2结合剂的蛋白质，或其片段，其中免疫球蛋白的N-末端的一部分被CD2结合剂取代。

“突变体”-生物的遗传物质的任何变化，特别是野生型多核苷酸序列的任何变化(即缺失，取代，插入或变更)或野生型蛋白质的任何变化。

“标准杂交条件”-杂交和洗涤的盐和温度条件，基本上均对应于0.5 X SSC至大约5 X SSC和65℃。此处使用的术语“标准杂交条件”因而是一种操作定义并包括一定范围的杂交条件。高严紧的条件可以是例如包括，在噬斑筛选缓冲液杂交(0.2％聚乙烯吡咯烷酮，0.2％Ficoll 400；0.2％牛血清白蛋白，50mM Tris-盐酸(pH7.5))；1M氯化钠；0.1％焦磷酸钠；1％ SDS)；10％葡聚糖硫酸酯和100微克/毫升变性的超声波处理的鲑精DNA，在65℃保持12-20小时，并在65℃下75mM氯化钠/7.5mM柠檬酸钠(0.5 X SSC)/1％ SDS洗涤。低严紧的条件可以是例如包括，在噬斑筛选缓冲液杂交，10％葡聚糖硫酸酯和110微克/毫升变性的超声波处理的鲑精DNA，在55℃保持12-20小时，并在55℃下300mM氯化钠/30mM柠檬酸钠(2.0 X SSC)/1％SDS洗涤。亦可参看分子生物学现代方法(Current Protocols inMolecular Biology)，John Wiley & Sons，Inc.New York，Section6.3.1-6.3.6，(1989)。

“表达控制序列”-当可操作的连接到基因后能够控制和调节基因表达的多核苷酸序列。

“可操作连接”-当表达控制序列控制和调节多核苷酸序列的转录和翻译时，该多核苷酸序列(DNA，RNA)即为可操作连接到表达控制序列。术语“可操作连接”包括在要表达的多核苷酸序列前面有合适的起始信号(例如ATG)和保持正确的阅读框架，从而使多核苷酸序列的表达在表达控制序列的控制下并产生多核苷酸序列编码的目的多肽。

“表达载体”-诸如DNA质粒或噬菌体(选自通用例子之中)的多核苷酸，在表达载体引入宿主细胞后，能够至少表达一个基因。载体能在或不能在细胞中复制。

“分离的”(与“基本纯化的”交互使用)-当指核酸，即编码多肽的多核苷酸序列时，意思是RNA或DNA多核苷酸，基因组多核苷酸的一部分，cDNA或合成的多核苷酸，根据其来源或操作，它们：(i)不与其天然相连接的所有多核苷酸相连(例如在宿主细胞中作为表达载体或部分存在)；或(ii)同非其天然相连的核苷酸或其它化学组分连接；或(iii)非天然存在的。“分离的”进一步意味着多核苷酸序列是：(i)通过例如聚合酶链式反应(PCR)体外扩增的；(ii)化学合成的；(iii)通过克隆重组产生的；或(iv)诸如通过切割和凝胶分离纯化的。

因此，“基本上纯的核酸”是非与其衍生的生物体的天然基因组中正常邻连的一个或两个编码序列紧密邻接的核酸。

“分离的”(与“基本纯化的”交互使用)-当指多肽时，意思是多肽或其部分，其根据其来源或操作，是(i)宿主细胞中一部分表达载体的产物；或(ii)同非其天然相连的蛋白质或其它化学实体相连；(iii)非天然存在的。“分离的”进一步指一种蛋白质，其是(i)化学合成的；或(ii)在宿主细胞中表达并从相关蛋白质中纯化出来。该术语通常意思是从其它天然的蛋白质和核酸中分离出的多肽。优选地，该多肽亦从用于纯化它的诸如抗体或凝胶基质(聚丙烯酰胺)等物质中分离出来。

“异源启动子”-此处用作与一个基因或纯化的核酸非天然结合的启动子。

“同源的”-此处用作术语“同一性”的同义词并且是指两个多肽，分子或两个核酸之间的序列类似性。当由相同的碱基或氨基酸单体占有两个比较的序列的同一个位置时(例如，两个DNA分子的同一个位置是腺嘌呤，或两个多肽的同一位置是赖氨酸)，则相应分子在该位置是同源的。两个序列之间的同源百分数是两个序列匹配或同源位置的数目除以比较的位置的数目的函数×100。例如，如果两个序列的10个位置中有6个是匹配或同源的，则两个序列是60％同源的。举例说明，DNA序列CTGACT和CAGGTT有50％同源性(总共6个位置中的3个是匹配的)。通常，将两个序列比对以给出最大的同源性进行比较。这种比对可以使用例如Needleman et al.，J.Mol Biol.48：443-453(1970)的方法，可方便的通过诸如Align程序(DNAstar，Inc.)来完成。同源序列有共同或类似的氨基酸残基，其中类似的残基保守取代或是“允许的点突变”对比的参考序列中的相应氨基酸残基。在这一方面，参考序列中残基的“保守取代”是那些物理上或功能上类似于相应参考残基的取代，例如具有类似的大小，形状，电荷，化学性质，包括形成共价键或氢键，等等。特别优选的是符合Dayhoff et al，5：Atlasof Protein Sequence and Structure，5：Suppl.3，chapter 22：354-352，Nat.Biomed.Res.Foundation，Washington，D.C.(1978)中定义的“可接受点突变”标准的保守取代。“同源性”和“同一性”各自指两个多肽序列的序列相似性，同一性是更严格的比较。同源性和等同可分别通过为了比较的目的比较各序列中可能对齐的位置来确定。当比较的序列中的一个位置被相同的氨基酸残基占有时，则多肽在该位置是等同的；当相应位点被同一氨基酸(例如相同的)或类似氨基酸(例如立体和/或电性性质类似)，则分子在该位置是同源的。序列间同源或等同的百分数是序列间匹配或同源的位置的数目的函数。一个“不相关的”或“不同源的”序列与本发明AR序列有少于40％的相同性，尽管优选少于25％相同性。

可以使用不同的对比算法和/或程序，包括FASTA，BLAST或ENTREZ。FASTA和BLAST是GCG序列分析软件包(Universiyt ofWisconsin，Madison，Wis.)的一部分，可使用缺省值运行。ENTREZ可通过Bethesda，Md的国家健康研究所，国家医学图书馆，生物技术信息国家中心(National Center of Biotechnology Information，National Library of Medicine，National Institute of Health，Bethesda，Md)获得。在一个实施方案中，通过GCG程序确定两个序列的等同的百分数，缺口(gap)的权重为1，即每个缺口的权重相当于两个序列间一个氨基酸或核苷酸不匹配。

此处的术语“肽”，“蛋白质”和“多肽”交互使用。此处的术语“多核苷酸序列”和“核苷酸序列”亦交互使用。

如果本发明的分子的量对治疗的特定疾病产生结果或有影响，则是“有效量”。

“多聚物”是由许多叫做“单体”的小结构单元构建的大分子，通过任何可能的模式连接。只使用一种单体构建大分子时，产物叫做“同聚物”，与“多聚物”交互使用。如果一个链由超过一个的不同单体组成，该物质通常称为“杂聚物”。连接CD2结合剂或片段或变体的多聚物组分优选地是聚二醇多聚物，但可使用任何多聚物骨架，最优选的是那些水溶性的，无毒的和非免疫原性的。

如非另有说明，本发明的实践将运用细胞生物学，细胞培养，分子生物学，微生物学，重组DNA，蛋白质化学和免疫学常规方法，均在本领域技术范围内。这些技术在文献中有描述。参看例如，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版(Sambrook，Fritsch and Maniatis，eds)，Cold Spring HarborLaboratory Press，1989；DNA克隆(DNA Cloning)，卷I和卷II(D.N.Glover，ed)，1985；多核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait，ed.)，1984；U.S.Patent No.4,683,195(Mullis etal.，)；核酸杂交(Nucleic Acid Hybridization)(B.D.Hames andS.J.Higgins，eds.)，1984；转录和翻译(Transcription andTranslation)(B.D.Hames and S.J.Higgins，eds.)，1984；动物细胞培养(Culture of Animal Cells)(R.I.Freshney，ed).AlanR.Liss，Inc.，1987；固定化细胞和酶(Immobilized Cells andEnzymes)，IRL Press，1986；分子克隆实用指南(A Practical Guideto Molecular Cloning)(B.Perbal)，1984；酶学方法(Methods inEnzymology)，Volumes 154 and 155(Wu etal.，eds)，Academic Press，New York；哺乳动物基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)(J.H.Miller and M.P.Calos，eds.)，1987，ColdSpring Harbor Laboratory；细胞和分子生物学免疫化学方法(Immunochemical Methods in Cell and Molecular Biology)(Mayerand Walker，eds.)，Academic Press，London，1987；实验免疫学手册(Handbook of Experiment Immunology)，Volumes I-IV(D.M.Weir and C.C.Blackwell，eds.)，1986；小鼠胚胎操作(Manipulating the Mouse Embryo)，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，1986。

由于不想被理论束缚，申请人相信依据本发明的方法使用CD2结合剂能够预防和治疗性治疗上述疾病，因为它们或调节LFA3/CD2相互作用和/或调节CD2信号传递，其中的一个结果是抑制T细胞增殖和活化，更特别的是调节记忆效应T淋巴细胞的数目和分布。

申请人相信此处讨论的疾病的负面效应是由于这类T细胞的增殖和活化。申请人相信由于多种原因本发明的方法优于先前治疗这类疾病的疗法，包括抑制呈递的所有抗原的抗原特异性相互作用，抑制T细胞活化，没有一般的免疫抑制和可能引发耐受性。特别地，申请人相信，使用本发明的方法将能够实际上在损伤起始阶段更特异的靶向治疗T细胞，而不影响多形核白细胞或巨噬细胞介导的效应器机制。相应地，与使用类固醇或其它一般免疫抑剂相比病人更不易感染。因而，此处提供的抑制T细胞活化的方法对这类皮肤疾病可以预防和治疗。

CD2结合剂

本发明使用的CD2结合剂有其卓越特征，能够调节CD2信号传递和调节优选是抑制CD2/LFA-3相互作用。给出的CD2结合剂可能同时具有这两种功能。这类剂包括抗-LFA-3抗体同系物，抗-CD2-抗体同系物，可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，LFA-3和CD2模拟剂及其衍生物。优选的CD2结合剂是可溶性CD2和LFA-3多肽，抗-CD2-抗体同系物，以及LFA-3和CD2模拟剂。

可以通过例如检测它们调节LFA-3/CD2相互作用的能力来确认本发明方法中特定可溶性CD2多肽，可溶性LFA-3多肽，抗-LFA-3抗体同系物，抗-CD2-抗体同系物或LFA-3和CD2模拟剂的用途。这种能力可通过例如使用简单的细胞结合检验进行测定，该检验能够可视的(在放大后)评价推定的CD2结合剂抑制LFA-3和CD2在承载这种分子的细胞上的相互作用。Jurkat细胞是优选的CD2+底物，绵羊红血细胞或人JY细胞是优选的LA-3+底物。可以使用多种已知的方法检测在本发明中有用的溶解性多肽，抗体同系物和模拟剂的结合特性，例如如果合适的话，放射性标记抗体同系物，多肽或药剂(例如35S或125I)并将标记的多肽，模拟物或抗体同系物与LFA-3+细胞的CD2+接触。也可使用合适的酶标记第二抗体检测结合特性。还可使用Seed等(Proc.Natl.Acad.Sci.UA，84，pp.3365-69(1987))描述的玫瑰花结竞争检测方法。

A.抗-LFA-3和抗-CD2抗体同系物

许多类型的抗-LFA-3和抗-CD2抗体同系物可用于本发明的方法。它们包括单克隆抗体，重组抗体。嵌合重组抗体，人源化重组抗体，及其抗原结合部分。

在抗-LFA-3抗体同系物中，优选的使用单克隆抗-LFA-3抗体。更优选地，使用选自登记号为ATCC HB 10693(1E6)，ATCC HB 10694(HC-1B11)，ATCC HB 10695(7A6)和ATCC HB 10696(8B8)的组中的杂交瘤产生的单克隆抗-LFA-3-抗体，或称为TS2/9的单克隆抗体(Sanchez-Madrid等，“与人T淋巴细胞介导的细胞溶解相关的三种不同抗原：LFA-1，LFA-2 and LFA-3”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，pp.7489-93(1982))。最优选地，单克隆抗LFA-3-抗体由选自登记号为ATCC HB 10695(7A6)和ATCC HB 10693(1E6)的组中的杂交瘤产生。

在抗-CD2抗体同系物中，优选地使用单克隆抗-CD2抗体，诸如称为T11表位抗体的抗-CD2单克隆抗体，包括TS2/18(Sanchez-Madrid等，“与人T淋巴细胞介导的细胞溶解相关的三种不同抗原：LFA-1，LFA-2 and LFA-3”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79，pp.7489-93(1982))。

产生单克隆抗体的技术是为人熟知的。简言之，将无限增殖细胞(典型的是骨髓瘤细胞)与来自哺乳动物的用含有给定抗原的剂免疫的淋巴细胞(典型的是脾细胞)融合，筛选产生的杂交瘤细胞培养物上清液中是否含抗该抗原的抗体。一般可参看Kohler等，自然，“分泌具有预定特异性的抗体的融合细胞的连续培养”，256，pp.495-97(1975)。对本发明的目的有用的免疫原包括载有CD2或LFA-3的细胞，以及含有LFA-3，CD2或其反受体-结合的片段(例如结合结合CD2的LFA-3或LFA-3片段的CD2片段)的无细胞剂。

可使用标准程序进免疫。单位剂量和免疫体系依赖于免疫的哺乳动物物种，其免疫状态，哺乳动物的体重等等。典型地，从免疫的哺乳动物取血并使用适当的筛选方法检测各血样的血清中的特定抗体。例如，通过测定免疫血清阻抑由于细胞表面分别有LFA-3和CD2而产生的绵羊红血细胞重排Jurkat细胞的能力，可以确定有用的抗-LFA-3-或抗CD2-抗体。用于产生杂交瘤的淋巴细胞典型的从免疫的哺乳动物分离，已经使用这类筛选检测方法证实该动物的血清有所需的抗体存在。

典型地，无限增殖细胞系(例如骨髓瘤细胞系)与淋巴细胞来自相同的哺乳动物。优选的无限增殖细胞系是对含次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培养物(“HAT培养基”)敏感的鼠骨髓瘤细胞系。典型地，使用聚乙二醇(“PEG”)3350将HAT-敏感的鼠骨髓瘤细胞与鼠脾细胞融合。然后使用HAT培养基筛选融合产生的杂交瘤细胞，培养基能杀死未融合的细胞和非生产性的融合骨髓瘤细胞(未融合的脾细胞数天后因为未转化而死亡)。通过筛选杂交瘤培养上清液的例如结合它们各自的对应受体或阻碍Jurkat细胞粘附到绵羊红血细胞的能力，测定了产生目的抗体的杂交瘤。为了保证单克隆性，典型的通过有限稀释亚克隆杂交瘤培养物。

为了产生抗-LFA-3或抗-CD2抗体，在营养培养基中一定条件下培养上述筛选测定中检测为阳性的杂交瘤细胞，培养足够的时间使杂杂交瘤细胞将单克隆抗体分泌到培养物中。组织培养技术和合适的培养基是众所周知的。通过熟知的技术可以收集符合条件的杂交瘤培养上清液和可任选的进一步纯化所需的抗体。

或者，可通过将杂交瘤细胞注射到降植烷致敏小鼠的腹腔产生目的抗体。杂交瘤细胞在腹腔增殖，分泌抗体，抗体积累成为腹水。可使用注射器通过从腹腔抽取腹水收获抗体。

本发明有用的抗-CD2和抗-LFA-3抗体同系物亦可为重组抗体，它们由使用编码所需抗体的免疫球蛋白轻和重链的DNA转化的宿主细胞产生。可通过熟知的基因工程技术产生重组抗体。参看例如美国专利号4,816,397，以参考文献并于此处。例如，通过从产生本发明中有用的抗体同系物的杂交瘤细胞中克隆编码目的抗体的免疫球蛋白轻和重链cDNA或基因组DNA，可以产生重组抗体。然后将编码这些多肽的cDNA或基因组DNA插入到表达载体使两种基因可操作的连接到它们自身的转录和翻译表达控制序列。选择的表达载体和表达控制序列与使用的表达宿主细胞是相容的。典型地，两基因均插入到同一表达载体。可以使用原核或真核宿主细胞。优选的在真核细胞中表达，因为这种细胞比原核细胞更可能组装和分泌正确折叠的和具免疫学活性的抗体。然而，任何由于不正确折叠产生的无活抗体都可能依据熟知的方法进行复性(Kim and Baldwin，“小蛋白的折叠反应中的特异性中间体和蛋白折叠机理”，Ann.Rev.Biochem.，51，pp.459-89(1982))。宿主细胞可能产生完整的抗体的部分，诸如轻链双体或重链双体，依据本发明它们也是抗体同系物。

可以理解本发明中对上述程序加以变化是有用的。例如，可能需要使用编码抗体同系物的轻链或重链(而不是两者都)的DNA转化宿主细胞。亦可使用DNA重组技术除去一些或所有编码为CD2或LFA-3对应受体结合所不需的轻链或重链的一个或两者的DNA。从这种截短的DNA分子表达的分子对本发明的方法是有用的。此外，可以产生双功能抗体，其中一个重链和一个轻链是抗-CD2或抗-LFA-3抗体同系物，另一个重链和轻链是对非CD2或LFA-3，或CD2或LFA-3的另一种表位的抗原专一的。

用合适的表达载体转化宿主细胞可以产生嵌合重组抗-LFA-3或抗-CD2抗体同系物，该载体含有编码目的免疫球蛋白轻链和重链的DNA，该DNA中编码重链和/或轻链的铰链和恒定区的所有或部分DNA被来自不同物种的免疫球蛋白的轻链或重链的相应区域的DNA取代。当初始的重组抗体是非人的，而CD2结合剂是要用于人的，用相应的人序列取代是优选的。一个嵌合重组抗体的例子中含有小鼠的可变区和人的铰链和恒定区。通常可参看美国专利号4,816,397和Morrison等，“嵌合的人抗体分子：带有人恒定区结构域的小鼠抗原结合结构域”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81，pp.6851-55(1984)。使用合适的表达载体转化宿主细胞可以产生人源化重组体抗-LFA-3或抗-CD2抗体，该载体含有编码目的非人源免疫球蛋白轻链和重链的DNA，该DNA中编码与抗原结合无关的氨基酸的所有或部分DNA被来自目的人源免疫球蛋白的轻链或重链的相应区域的DNA取代。通常可参看，Jones.，“用来自小鼠的区域代替人抗体中的互补性决定区”；Nature，321，pp.522-25(1986)。

不是完整抗体的抗-CD2和抗-LFA-3抗体同系物在本发明中也是有用的。这种同系物可从上述任何抗体同系物衍生。例如，从上述抗体衍生的抗原结合片段，以及全长的单体，双体或三体多肽本身是有用的。这种类型的抗体抗体同系物包括Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，F(v)片段，重链单体或双体，轻链单体或双体，一个重链和一个轻链组成的双体，等等。抗-LFA-3重链是优选的抗-LFA-3抗体片段。

也可通过化学方法产生抗体片段，例如使用蛋白酶诸如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶切割完整的抗体，并可任选的用还原试剂处理切割产物。另一种方法是使用截短的重链和/或轻链基因转化的宿主细胞产生有用的片段。使用还原试剂诸如二硫苏糖醇处理完整抗体，随后纯化分离链，可产生重链和轻链单体。也可使用编码所需重链或轻链但非同时编码两者的DNA转化的宿主细胞产生重链或轻链单体。参看例如，Ward等，“从大肠杆菌分泌的单免疫球蛋白可变区的所有组成成分的结合活性”，Nature，341，pp.544-46(1989)；Sastry等，“在大肠杆菌中克隆产生单克隆催化性抗体的免疫全部组成成分：构建重链可变区一特异性cDNA文库”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86，pp.572832(1989)。

B.可溶性CD2和LFA-3多肽

调节LFA-3和CD2相互作用的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽在本发明的方法中是有用的。优选的是可溶性LFA-3多肽。

可溶性LFA-3多肽可从LFA-3的跨膜形式衍生，特别是胞外结构域(例如序列2的AA1-AA187)。这类多肽描述于美国专利号4,956,281和美国专利号5,547,853(与本申请有相同的受让人)，以参考文献并于此处。优选的可溶性LFA-3多肽包括由序列2的AA1-AA92，序列2的AA1-AA80，序列2的AA50-AA65以及序列2的AA20-AA80组成的多肽。含有编码序列2的氨基酸的DNA序列(序列1)的载体已经保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，Maryland，登记号是75107。

最优选的这种类型的蛋白质是融合蛋白，它含有成熟LFA-3氨基末端的92个氨基酸，含有认为它们参与形成链间二硫键的两个半胱氨酸的人IgG 1铰链区的C末端10个氨基酸，人IgGI重链恒定结构域的CH2和CH3区(例如序列8)。这种融合蛋白此处称为“LFA3TIP”。编码示例的LFA3TIP的质粒pSAB152已经保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，Maryland，登记号是ATCC68720。pSAB152插入片段的DNA序列是序列7。设计这种重组蛋白是为了通过与CD2受体的相互作用调节免疫反应。融合体的LFA-3部分结合到T淋巴细胞上的CD2受体。IgG₁部分结合到FcgammaRI(巨噬细胞)和FcgammaRIII(NK细胞和噬中性白细胞)受体。已经显示LFA3TIP和CD2的相互作用能够体外抑制T淋巴细胞反应。参看美国专利5,728677和5,547,853。在美国专利5,547,853中描述了本发明方法中使用的LFA3TIP的产生方法。

通常，使用AMICN SI Y3 0螺旋柱系统(AMICON，Danvers，Massachusetts)将pSAB15转染的COS7或CHO细胞的条件培养物浓缩并加样到蛋白质A-琼脂糖凝胶4B(Sigma，St.Louis，Missouri)层析柱。洗脱结合的蛋白质并加样到Superose-12(Phamacia/LKB，Piscataway，New Jersey)凝胶层析柱。将通过SDS-PAGE凝胶和Western印迹检测(参看例如Towbin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，74，pp.4350-54(1979)；Antibodies：A Laboratory Manual，pp.474-510(Cold Spring Harbor Laboratory(1988))确定的含LFA3TIP和最少量的杂蛋白质的Superose-12级分混合并在YM30 CENTRICON(AMICON)中浓缩。使用兔抗-LFA-3多克隆抗血清在Western印迹上，随后通过可检测的标记的山羊抗-兔IgG检测到LFA3TI。纯化的COS7或CHO细胞的LFA3TIP是两个单体LFA-3-Ig融合蛋白的双体，通过二硫键连接。

另一个优选的融合蛋白由融合到人IgG1铰链CH2和CH3区域的第一和第二个LFA-3胞外结构域构成，此处称为LFA3-Ig.

可溶性LFA-3多肽亦可衍生自PI-连接形式的LFA-3，诸如PCT专利申请系列号WO 90/02181中所述。含有编码PI-连接的LFA-3(即序列3)的DNA序列的载体已经保藏在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)，Rockville，Maryland，登记号是68788。应当理解PI-连接形式的LFA-3和跨膜形式的LFA-3在整个胞外结构域有相同的氨基酸序列。

相应地，优选的PI-连接的LFA-3多肽和跨膜形式的LFA-3是相同的。可溶性CD2多肽可以衍生自全长的CD2，特别是胞外结构域(例如序列6的AA1-AA185)。这种多肽可能含有CD2的所有或部分胞外结构域。示例的可溶性CD2多肽描述于PCT WO 90/08187，以参考文献并于此处。

本发明中有用的可溶性多肽可通过多种已知方法产生。例如，多肽可通过组合使用特定的内切肽酶和外切肽酶蛋白酶解，Edman降解或两者结合处理完整的跨膜LFA-3或CD2分子或完整的PI-连接的LFA-3分子衍生出来。随之可使用常规方法从天然来源纯化完整的LFA-3分子或完整的CD2分子。另一种方法是，通过重组DNA技术使用cDNA产生完整的LFA-3或CD2(参看例如美国专利号4,956,281，Wallner等；Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.，84，pp.2941-45(1987)；Sayre等.Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84，pp.2941-45(1987))。

优选地，本发明中可溶性多肽是直接产生的，从而消除了以完整的LFA-3分子或完整的CD2分子作为起始材料的需要。这可以通过常规化学合成技术或熟知的重组DNA技术完成，其中只有那些编码所需肽的DNA序列在转化的宿主中表达。例如，使用寡核苷酸合成仪通过化学方法可以合成编码所需可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽的基因。这种寡核苷酸是基于所需的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽的氨基酸序列设计的。通过分离特定的限制性内切核酸酶片段或PCR合成特定区域可以从全长DNA序列衍生编码目的肽的特定DNA序列。

可以使用标准方法合成编码本发明中有用的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽的基因。例如，可以使用完整的氨基酸序列构建出反向-翻译基因。可以一步合成含有编码本发明中有用的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽的核苷酸序列的DNA寡聚体。另一种方法是，可以合成几个较小的编码部分的目的多肽的寡核苷酸然后进行连接。优选地，将本发明中有用的可溶性LFA-3多肽或可溶性CD2多肽合成为几个分离的寡核苷酸然后将其连接在一起。各寡核苷酸典型的含有5’或3’突出端进行互补组装。组装后，优选的基因序列上的特征是，能被限制性内切核酸酶识别(包括单一限制性位点用于直接组装到克隆或表达载体)，考虑了使用的宿主表达系统的优选的密码子以及转录时能够产生稳定的，有效翻译的MRNA的序列。可以通过核苷酸测序，限制性图谱，以及在适当的宿主中表达生物活性多肽等来证实正确的组装。

本技术领域熟练人员将可意识到，由于遗传密码的简并性，含有许多其它核苷酸序列的DNA分子能够编码由上述特定DNA序列编码的可溶性LFA-3和CD2多肽。这些简并序列亦编码本发明中有用的多肽。

DNA序列可以在单细胞宿主中表达。如本领域人员所熟知，为了获得在宿主中转染基因的高表达水平，基因必须可操作的连接到在选择的表达宿主中有功能的转录和翻译表达控制序列。优选地，表达控制序列和感兴趣的基因将包含在表达载体中并进一步含有一个细菌选择标记和复制起点。如果表达宿主是真核细胞，表达载体应当进一步含有附加的在表达宿主中有用的表达标记。编码所需可溶性多肽的DNA序列可能编码或不编码信号序列。如果表达宿主是原核的，通常优选的是DNA序列不编码信号序列。如果表达宿主是真核的，通常优选的是编码信号序列。在表达产物中可能存在或不存在氨基末端甲硫氨酸。若表达载体未切除末端甲硫氨酸，如果需要可以使用标准技术化学法切除。

可以使用多种表达宿主/载体的组合。对真核宿主有用的表达载体包括例如含有来自SV40，牛乳头瘤病毒，腺病毒和巨细胞病毒的表达控制序列的载体。对细菌宿主有用的表达载体包括已知的细菌质粒，诸如来自E.coli的质粒，包括col E1，PCRI，pBR322，pMB9及其衍生物，广泛宿主范围质粒，诸如RP4，噬菌体DNA，例如噬菌体λ的多种衍生物，例如NM989，以及其它DNA噬菌体，诸如M13和丝状单链DNA噬菌体。对酵母细胞有用的表达载体包括2μ质粒及其衍生物。对昆虫细胞有用的载体包括Pv1941。另外，在这些载体中可以使用多种表达控制序列。这类表达控制序列包括与上述表达载体的结构基因有关的表达控制序列。有用的表达控制序列的例子例如是，SV40或腺病毒的早期和晚期启动子，lac系统，trp系统，TAC或TRC系统，噬菌体λ的主操纵基因和启动子区，fd包被蛋白质的控制区，3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，酸性磷酸酶的启动子，例如Pho5，酵母非-交配(a-mating)系统的启动子以及已知能控制原核或真核细胞或其病毒的基因的表达的其它序列，及其不同的组合。

多种单细胞宿主细胞是可用的。这些宿主可包括熟知的真核和原核宿主，诸如大肠杆菌，假单胞菌，芽孢杆菌，链霉菌，真菌，酵母，昆虫细胞诸如草地夜蛾细胞(Spodoptera frugiperda(SF9))，动物细胞诸如CHO和小鼠细胞，非洲绿猴细胞诸如COS1，COS7，BSC1，BSC40以及BMT10，以及人细胞，还有组织培养中的植物细胞。对动物细胞表达，我们优选C140细胞和COS 7细胞。当然，必须理解的是并非所有的载体和表达控制序列均能同样好的表达此处描述的DNA序列。也不是所有的宿主同样好的匹配同一表达系统。但是，不需更多实验，本领域熟练人员可以选择出载体，表达控制序列和宿主。例如，选择载体时必须考虑宿主，因为载体必须在其中表达。还要考虑载体的拷贝数，控制该拷贝数的能力，以及载体编码的任何其它蛋白质的表达，诸如抗生物素标记。

选择表达控制序列时，要考虑多种因素。包括例如该序列的相对强度，的控制能力，及其与此处讨论的DNA序列的相容性，特别是相对于可能的二级结构的相容性。选择单细胞宿主时，要考虑它们与选择的载体的相容性，DNA序列编码产物的毒性，它们的分泌特征，它们正确折叠可溶性多肽的能力，它们的发酵或培养需求，以及纯化DNA序列编码的产物的难易程度。在这些参数中，本领域熟练人员可能选择出多种载体/表达控制序列/宿主的组合，该组合可在发酵或大规模动物培养中表达所需的DNA序列，例如使用CHO细胞或COS 7细胞。

可以使用任何常规方法从发酵液或细胞培养物中分离可溶性LFA-3和CD2多肽并纯化。本领域熟练人员可任选择最合适的分离和纯化技术。

重组DNA技术是优选的产生序列长度大于20氨基酸的有用的可溶性CD2多肽或可溶性LFA-3多肽的方法，而常规的化学合成技术则是生产序列长度小于20氨基酸的CD2多肽或LFA-3多肽的方法。合成的本发明有用的多肽具有极高产量的优势，并易于纯化。优选地，这种可溶性CD2多肽或可溶性LFA-3多肽通过液相或固相多肽合成方法合成并且可任选地，用羧肽酶消化(除掉C末端氨基酸)或通过手工Edman降解来降解(除掉N末端氨基酸)。如Kent在多肽和蛋白质的化学合成Ann.Rev.Biochem.，57，pp.95789(1988))中所述，在易于形成二硫键的氧化条件下可获得多肽的正确折叠。然后使用本领域熟知的分离技术纯化产生的多肽，优选的使用反向HPLC。使用液相合成的优势是可以向生长的多肽链直接添加某种衍生的氨基酸，诸如酪氨酸的O-硫酸酯。这样避免了对随后的修饰本发明有用的多肽的任何残基的修饰步骤的需要。

C.LFA-3和CD2模拟剂

LFA-3和CD2模拟剂在本发明的方法中也是有用的。这些剂可能是肽，半-肽化合物或非-肽化合物，它们是CD2结合剂能够调节CD2信号传递(signaling)和/或CD2/LFA-3相互作用。最优选的CD2和LFA-3模拟剂至少象抗-LFA3单克隆抗体7A6或抗-CD2单克隆抗体TS2/18(见上面所述)一样抑制CD2/LFA-3相互作用。这类模拟剂可通过合成多种肽(例如长度为520个基酸)，半-肽化合物或非-肽化合物，有机化合物，然后筛选它们抑制CD2/LFA-3相互作用的能力而产生。一般可参看美国专利号4,833,092，Scott和Smith，“用表位文库筛选肽配体”，Science，249，pp.386-90(1990)，以及Devlin等，“随机肽文库：特异性蛋白结合分子的来源”，Science，249，pp.40407(1990)，以参考文献并于此处。

D.衍生的CD2结合剂

衍生的CD2结合剂诸如CD2/LFA-3相互作用的调节剂在本发明的方法中也是有用的，其中，例如，此处描述的任何抗体同系物，可溶性CD2和LFA-3多肽，或CD2和LFA-3模拟剂功能性连接到(通过化学偶联，遗传融合或其它方式)独立的选自抗-LFA-3和抗-CD2抗体同系物，可溶性LFA-3和CD2多肽，CD2和LFA-3模拟剂，细胞毒性剂和药剂的一个或多个成分。一类衍生的CD2结合剂是交联两个或多个CD2结合剂(相同类型或不同类型)产生的。合适的交联包括那些异双功能的，含有被适当的间隔臂分开的两个不同的反应基团(例如间-顺丁烯二酰亚氨苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯)或同双功能的(例如disuccinimidyl suberate)。可从Pierce Chemical Company，Rockford，Illinois获得这种接头。另一种可能的交联是利用PI-连接的LFA-3中的PI接头信号序列或其片段。特定地，将编码PI连接信号序列(例如序列4的AA162-AA212)的DNA连接到编码所需多肽优选的是可溶性LFA-3多肽的DNA的下游。如果这种构建体在合适的真核细胞中表达，细胞将会识别PI连接信号序列并将PI共价连接到多肽。然后可利用PI的疏水特性来形成多肽的胶束聚集体。

连接到一种或多种细胞毒性或药物剂的CD2结合剂也是有用的。可用的药物剂包括生物活性肽，多肽和蛋白质，诸如对人的非CD2或LFA-3的多肽专一的抗体同系物，或其部分。可用的药物剂和细胞毒性剂还包括环孢霉素A，强的松，FK506，氨甲蝶呤，类固醇，类维生素A，干扰素，和氮芥。

用药物剂衍生的优选CD2结合剂包括重组产生的多肽，其中将可溶性LFA-3多肽，可溶性CD2多肽，或肽基CD2或肽基LFA-3模拟剂融合到所有或部分的免疫球蛋白重链铰链区和所有或部分重链恒定区。用于制备这类融合蛋白的优选多肽是可溶性LFA-3多肽。最优选的融合蛋白含有LFA-3的AA1-AA92(例如序列2)，其融合到人IgG I铰链区的一部分(包括铰链区的C末端10个氨基酸，它含有两个认为参与形成链间二硫键的半胱氨酸残基)和IgG1重链恒定区的CH2和CH3区域。预期这种融合蛋白显示延长的血清半寿期和使CD2结合剂二聚化。

亦预期显示延长的血清半寿期的其它衍生的CD2结合剂是最优选的连接到一个或多个多聚物(包括聚(亚烷基)二醇多聚物)的CD2结合剂。预期多聚物选择性的与CD2结合剂的自由氨基或其它反应基团反应，并且理论上，多聚物的反应可使结合发生在任何存在的氨基基团，诸如赖氨酸的α氨基或ε氨基，或半胱氨酸的-SH基团。CD2结合剂的自由的羧基，合适的活化羰基，羟基，胍基，氧化的碳氢组分和巯基基团(如果存在)均可作为结合部位。

特别地，如果CD2结合剂是蛋白质，为了保护硫醇而对任何半胱氨酸(例如内部或N-末端半胱氨酸)的化学修饰，伴随与聚二醇组分(即聚乙二醇或PEG)的缀合，可由本领域熟练人员通过多种方法进行。参看美国专利4,179,337。巯基组分，以硫醇盐离子作为活性部分，是蛋白质中最活跃的官能基团。有许多试剂与硫醇的反应比对任何其它基团的反应快。参看蛋白质偶合与交联的化学(S.S.Wong，CRC Press，Boca Raton，FL，1991)。

其它提供聚二醇和半胱氨酸连接的方法的例子是与α-卤乙酰基化合物，有机汞剂，二硫化物试剂，以及其它N-取代顺丁烯二酰亚胺的反应。这些活性物质的许多衍生物是商品化的(例如，碘乙酸乙酯(Aldrich，Milwaukee WI)，二硫二苯(Aldrich)，以及N-芘顺丁烯二酰亚胺(Molecular Probes，Eugene OR))或可以容易的合成(例如，N-烷基碘乙酰胺，N-烷基顺丁烯二酰亚胺，以及有机汞剂)。由于没有简单的化学策略可以将聚二醇多聚物诸如PEG靶向CD2结合剂，直接的方法是遗传工程制造一个可用于靶定聚合物部分的位点，诸如使用定点诱变。例如，在蛋白质性质的CD2结合剂的C末端或其附近插入Cys使得可以允许使用顺丁烯二酰亚胺，乙烯砜或卤乙酸-活化的聚(亚烷基)二醇(例如PEG)进行专一修饰。可以使用任何用于将生物活性物质与惰性多聚物反应的适当方法进行反应。

通常该反应包括制备活化的多聚物(可能至少含有一个末端羟基)，然后使蛋白质与活化的多聚物反应，产生适于用作药剂的可溶性蛋白。上述修饰反应可通过多种方法实现，包含一个或多个步骤。在本发明的实践中，将C1-C4烷基聚二醇的聚二醇残基，优选的是聚乙二醇(PEG)，或这类乙二醇的聚(氧)二醇残基，有利地引入在感兴趣的多聚物系统中。这样，蛋白质附着的多聚物可以是聚乙二醇(PEG)的同聚物，或者是聚氧乙烯化多烃基化合物，只要聚合物在室温下溶于水即可。这类多聚物的非限制的例子包括聚环氧烷同聚物诸如PEG或聚丙二醇，聚氧乙烯化二醇，它们的共聚物以及嵌段共聚物，条件是保持嵌段共聚物的水溶性。

聚氧乙烯化多烃基化合物的例子包括，例如聚氧乙烯化甘油，聚氧乙烯化山梨醇，聚氧乙烯化葡萄糖等。聚氧乙烯化甘油的骨架是以单-，双，和三甘油酯形式在例如动物和人中天然存在的相同骨架。因此，这种分支无需认为是身体的外源剂。

作为聚环氧烷的替代物，可以使用基于葡聚糖，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酰胺，聚乙烯醇，碳水化合物的多聚物及类似物。此外，可以使用美国专利5,359,030中描述的杂聚物(即由种类超过一种的单体组成的聚合物，诸如共聚物)(例如缀合到含有聚二醇部分和一个或多个脂肪酸的多聚物的蛋白质)。本领域普通技术人员将会认识到前面的列举只是为了说明并且所有具有此处描述的性质的多聚物材料均在考虑之内。

另外，本发明的另一个方面，可以使用共价连接到多聚物组分的衍生的CD2结合剂，其中的缀合的性质涉及可以切断的共价化学键。这样可以根据时间进程控制多聚物从CD2结合剂的切除。共价键可以通过化学或酶法反应切除。多聚物-CD2结合剂产品保持可接受量的活性。同时，在缀合多聚物中含有聚二醇部分，赋予多聚物-CD2结合剂缀合物很高的水溶性和延长的血液循环能力。作为改进特征的结果，本发明考虑对活性多聚物-CD2结合剂种类的肠胃外的，气雾剂的，和口服给药以及在水解切除后CD2结合剂本身在体内应用中的生物利用度。

依据本发明的药物组合物和方法

本发明提供了一种预防和治疗哺乳动物疾病的优选方法，该疾病特征是：记忆效应T淋巴细胞浸润到哺乳动物的一种或多种器官；和/或此类T淋巴细胞与该疾病有关。该方法包括向哺乳动物给药一种或多种CD2结合剂，诸如CD2/LFA-3相互作用的抑剂，或它们的衍生形式，它们能够较之于幼稚T淋巴细胞选择性的调节记忆效应器淋巴细胞。优选的，给药有效量的CD2结合剂或其衍生物。“有效量”意思是指能够降低此处描述的疾病的扩展或严重程度。

对本领域熟练技术人员显而易见的是，有效量的CD2结合剂依赖于，其中包括，给药方式，给药单位剂量，CD2结合剂是否与其它药物联用，病人的免疫状况和健康状况，特定CD2结合剂的治疗活性以及血清半寿期。

CD2结合剂或药物组合物可以是多种形式的。包括例如，固体，半固体和液体剂量形式，诸如片剂，丸剂，粉剂，溶液，散剂或悬剂，脂质体，栓剂，可输液注射的，以及局部剂。优选的形式依赖于想采取的用药和治疗应用的方式。优选的形式是可注射或输液的溶液。CD2结合剂或药物组合物可以通过灌注，口服，局部用药或吸入的方法进行静脉内，肌肉内，皮下，关节内，鞘内，骨膜，肿瘤内，病灶内，病灶周围给药。优选的是皮下，肌肉内或静脉内给药。最优选的是皮下给药。CD2结合剂可通过口服，颊，肠胃外，直肠，鞘给药，鼻内吸入喷剂，肺内吸入或其它方式给药。特别地，根据本发明的药剂可制成剂，成为用于吸入的喷剂或粉剂，用于注射(例如皮下，肌肉内，静脉内，关节内或脑池内注射)的剂，用于灌注或用于口服给药的剂，可以是安瓿或片剂的单位剂量形式或多剂量小管或其它容器，有添加的防腐剂。组合物可采取存在于油或水溶液赋形剂中的悬液，溶液或乳浊液或凝胶的形式，并可含有形成剂的药剂，诸如使悬浮，使稳定和/或致散的药剂。另一种方法是，活性成分是可直接给药的或使用前与适当的赋形剂(例如无菌，无热源水，标准盐或5％葡萄糖)配药的粉剂和/或冻干形式。

优选地，单位剂量以每星期一到三次或每天一到三次给药。更优选地，大约每天给药一到三次持续3到7天，或一个月为基础大约每天给药一到三次持续3到7天。但是将可认识到可以使用低或高些的剂量和其它的流程。优选地，CD2结合剂以每公斤体重在大约0.001和约50毫克之间的剂量给药，更优选地每公斤体重在约0.01和约10毫克之间给药，最优选地每公斤体重在约0.1和约4毫克之间给药。

例如，为了向病人给药本发明的CD2结合剂(可溶性LFA-3多肽LFA3TIP)，特别优选的CD2结合剂是包装成小管中的冷冻溶液形式，含有10毫克/毫升的重组LFA-3/IgG₁融合蛋白和赋形剂(氯化钠，磷酸氢钾和磷酸二氢钠。在冰箱或室温溶解小管并用0.9％氯化钠稀释至终体积5毫升，用于静脉内给药(IV bolus administration)。如Miller等(1993)J.Exp.Med.178:211所述构建LFA3TIP，以参考文献并于此处，并通过吸附到蛋白质-A Sepharose 4B(Pharmacia)和使用50mM甘氨酸，250mM氯化钠(pH3.0)洗脱，从转染的CHO(中国仓鼠卵巢)细胞系的培养物中分离。混合含蛋白质的级分并在

(Phamacia)上磷酸盐缓冲溶液(PBS)中进行凝胶过滤。混合峰级分并通过12％的还原和非还原的SDS-PAGE检测纯度。

在一个示例方案中，该病人每星期接受一次静脉内给药，剂量优选地在大于0.025毫克/公斤的范围，可以高至0.075毫克/公斤和0.150毫克/公斤之间。这个CD2结合剂的剂量基于对象的基线体重。其它给药方案可包括一次肌肉内(IM)注射，剂量不少于0.005毫克/公斤，优选的剂量范围至0.025毫克/公斤，最优选的剂量选自0.005，0.075，0.1125和0.165毫克/公斤。

应当给予单位剂量直到观察到效果。可通过多种方法检测效果。对MS，可通过标准的磁共振方法测定治疗效果。对IBD，测定腹痛程度，瘘管痊愈程度，大便频率等等，在牛皮癣性关节炎时，检测关节肿胀和活动范围。参考熟知的医疗程序，医疗领域的一般技术人员可容易的测定此处描述的任何一种临床效果。

CD2结合剂或其衍生物优选的以含有药学可接受载体的组合物形式给药。“药学可接受载体”意思是不使用药的病人产生过敏反应或其它不适效应的载体。合适的药学可接受载体包括例如，水，盐，磷酸缓冲液盐，葡萄糖，甘油，乙醇等等中的一种或几种，以及它们的组合。药学可接受载体可进一步含有少量的辅助性物质诸如润湿或乳化剂，防腐剂或缓冲液，它们能延长CD2结合剂的货架时间或效果。

药物组合物或CD2结合剂可以与其它的治疗或预防药剂联合给药。这些药剂包括例如，环孢霉素A，类固醇，类维生素A，氮芥，干扰素，氨甲蝶呤，抗生素和抗组胺药。这些药剂可以以单剂的形式与CD2结合剂一起给药(即作为同一药物组合物的一部分)，以多剂的形式与CD2结合剂分开，但同时给药，或以多剂的形式对两者分别但顺序给药。另一种方法是，CD2结合剂和其它活性药剂成为单一缀合分子。可通过本技术领域熟知的标准交联技术进行两种组分的缀合。单一分子也可以采取重组融合蛋白的形式。此外，本发明有用的CD2结合剂或药物组合物可与其它疗剂诸如化疗剂组合使用。这种组合治疗的优势是可使用低剂量的治疗药物。

基因治疗

本发明进一步基于基因治疗为基础的CD2结合剂给药，即作为哺乳动物宿主中核酸序列的表达产物。优选的对基因产物的用活体材料的系统给药使用重组的病毒或非病毒载体，随后体外转染特定哺乳动物细胞种群，回收和纯化转染的细胞并对病人给药。体内基因治疗使用相同的载体和转染，而不除去病人的任何细胞或组织。作为含有目的核酸序列的重组载体的转染的靶的特定细胞种群包括，但不限于，(1)含有造血祖细胞的骨髓细胞种群；(2)外周血白细胞种群，优选的是CD34+血液白细胞种群，它富含造血细胞并可用于无须脱离的引入病人后用于种群恢复转染的造血细胞；(3)外周血液淋巴细胞种群；(4)成肌细胞，在体外转染了感兴趣核酸后可移植回宿主；和(5)通过肌肉内注射进行含有感兴趣核酸序列的重组病毒或非病毒载体的或核酸序列本身的给药。

例如，对含有包括一个能编码表达CD2结合剂的载体的造血祖细胞的骨髓细胞的离体使用在本领域熟练技术人员能力内。简言之，取出骨髓细胞，用重组病毒感染，重新引入哺乳动物宿主。这样，一个基因或基因片段在哺乳动物宿主系统性分布，表达该DNA序列使基因产物在哺乳动物宿主中系统性给药。

外周血液是用作病毒介导的载体感染的哺乳动物细胞的一个来源。更特定的地，血液白细胞，特别是含有循环造血干细胞的CD34+种群，可用作病毒感染的靶细胞，随后使哺乳动物宿主骨髓种群恢复化而不需脱离(Karsson等，1993，骨髓移植(Bone Marrow Transplant)11(supp.1)：124-127)。另外，淋巴细胞也可用作促进感兴趣核酸序列的系统性给药的靶细胞。可从宿主的外周血液取出淋巴细胞，用已知技术培养并用作含有感兴趣核酸序列的病毒载体感染的靶细胞种群。然后可将感染的淋巴细胞注射到哺乳动物宿主(例如参看Anderson等，1990，人类基因治疗(Human Gene Therapy)1：331-361)。另外一个靶细胞种群是成肌细胞。血液流入相对大量的骨骼肌使这些组织成为感兴趣核酸序列的局部保藏处。这样，将成肌细胞体外注射和重新引入到哺乳动物宿主在宿主中提供了局部靶，能够将CD2产物系统给药。可以通过已知技术进行成肌细胞培养，感染和重新引入到宿主(例如参看Dai等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10892-10895)。

为此，体内直接注射到细胞或组织是将编码CD2结合剂的载体分子局部给药的另一种方法。直接注射，在表达基因产物后，最终导致将治疗产物在哺乳动物宿主中系统给药(Wolff等，1990，科学(Science)247：1465-1468；Raz等，1993，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：4523-4527)。在这种方式的局部给药中使用了直接注射裸DNA，优选的是一种非病毒载体诸如质粒DNA。

在质粒载体构建中可以使用本领域熟练技术人员可得的已知可上调感兴趣核酸的表达的任何真核生物启动子和或增强子序列，包括但不限于巨细胞病毒(CMV)启动子，Rous肉瘤病毒(RSV)启动子，鼠白血病病毒(MLV)启动子，β-肌动蛋白启动子，以及任何已知在细胞中靶向转导的活性细胞-特异性真核启动子序列。可以使用本领域任何已知方法将多核苷酸序列插入载体。参看例如，Sambrook等，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，ColdSpring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)和Ausubel等，分子生物学现代方法(Current Protocols in MolecularBiology)，J.Wiley & Sons，NY(1992)。常规载体由可操作的连接到用作特定干扰素的多核苷酸序列的合适的转录/翻译控制信号组成。亦可使用启动子/增强子控制干扰素的表达。(参看第III部分)

用于细胞基因治疗的与哺乳动物宿主细胞相容的表达载体包括例如质粒；禽，鼠和人反转录载体；腺病毒载体；疱疹病毒载体；细小病毒载体；和非复制型痘病毒；特别地，在只能产生有复制-缺陷的病毒的包装细胞系中可产生复制-缺陷重组病毒。参看分子生物学现代方法(Current Protocols in Molecular Biology)：Sections 9.10-9.14(Ausubel et al.，eds.)，Greene Publishing Associcates，1989。

用于基因转移系统的特定病毒载体现已充分确定。参看例如：Madzak等，J.Gen.Virol.，73：1553-36(1992)(乳多空病毒SV40)；Berkner等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：39-61(1992)(腺病毒)；Moss等，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：25-38(1992)(痘苗病毒)；Muzyczka，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：97-123(1992)(腺-伴随病毒)；Margulskee，Curr.Top.Microbiol. Immunol.,158：67-93(1992)(单纯疱疹病毒和Epstein-Barr病毒(HBV))；Miller，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，158：1-24(1992)(反转录病毒)；Bradyopadhyay等，Mol.Cell.Biol.，4：749-754(1984)(反转录病毒)；Miller等，Nature，357：455-450(1992)(反转录病毒)；Anderson，Science，256：808-813(1992)(反转录病毒)。

优选的载体是DNA病毒，包括腺病毒(优选地是基于Ad-2或Ad-5的载体)，疱疹病毒(优选地是基于单纯疱疹病毒的载体)，以及细小病毒(优选地是基于“缺陷”或非-自主的细小病毒的载体，更优选地是基于腺-伴随病毒的载体，最优选地是基于AAV-2的载体)。参看例如，Ali等，基因治疗(Gene Therapy)1：367-384，1994；美国专利4,797,368和5,399,346并在下面讨论。腺病毒载体可以向事实上所有细胞类型提供极高水平的转基因递药，无论它们处于何种有丝分裂阶段。在293个细胞中(腺病毒-转化的，互补的人胚胎肾细胞系：ATCC CRL1573)很容易的产生高滴度的(10¹¹噬斑形成单位/毫升)重组病毒并且冷冻很长一段时期而没有可见的损失。在有各种疾病的模式动物中证实了该系统向体内传递与遗传不平衡互补的治疗性转基因的效率。参看，Y.Watanabe，Atherosclerosis，36：261-268(1986)；K.Tanzawa等，FEBS Letters.118(1)：81-84(1980)；J.L.Golasten等，New Engl.J.Med.，309(1983)：288-296(1983)；S.Ishibashi等，J.Clin.Invest.，92：883-893(1993)；和S.Ishibashi等，J.Clin.Invest.，93：1889-1893(1994)。实际上已经批准了将编码囊性纤维化跨膜调节蛋白(CFTR)的cDNA的重组的复制缺陷腺病毒用于人类CF临床实验。参看J.Wilson，Nature，365：691-692(Oct.，21，1993)。对于将重组腺病毒用于基因治疗的安全性的进一步支持是活腺病毒疫苗在人类种群中应用的广泛经验。

腺-伴随病毒(AAV)也已经用作体基因治疗的载体。AAV是小的单链DNA病毒，基因组组织简单(4.7kb)，使它成为基因工程的理想材料。两个开放阅读框编码一系列rep和cap多肽。Rep多肽(rep68，rep62和rep40)涉及复制，拯救和整合AAV基因组。cap蛋白质(VP1，VP2和VP3)形成病毒粒子衣壳。在5’和3’末端的rep和cap开放阅读框侧翼是145bp的反转末端重复(ITRs)，其中开始的125bp能够形成Y-或T-形双螺旋结构。在开发AAV载体中重要的是，可以切掉整个rep和cap结构域并替换上治疗或报告转基因。参看B.J.Carter，细小病毒手册(Handbook of Parvoviruses)，ed，P.Tijsser，CRCPress，pp.155-168(1990)。已经表明ITR代表AAV基因组复制，拯救，包装，和整合所需的最小序列。以表明AAV在小鼠中的高水平基因表达持续至少1.5年。参看Xiao，Li和Samulski(1996)Journal of Virology 70，8089-8108。由于未发现病毒毒性或细胞宿主免疫反应，已经克服了病毒基因治疗的这些局限。Fisher等(Nature Medicine(1997)3，306-312)报道将AAV注射到小鼠后小鼠中的稳定基因表达。再次证明该病毒是安全的。未测到对病毒或外源基因产物的细胞或体液免疫反应。

动物模型：存在有不同指征的合适的动物模型(诸如用于多发性硬化的已知的EAE模型)使得能够测定描述的CD2结合剂和方法。实施例中描述了多种动物模型。

保藏

本发明中有用的鼠杂交瘤细胞和抗-LFA-3抗体作为例子按照布达佩斯条约保藏在美国典型培养物保藏中心，R0ckville，Maryland，U.S.A.，1991年3月5日，鉴定为：

命名       ATCC登记号

1E6        HB 10693

HC-1B11    HB 10694

7A6        HB 10695

8B8        HB 10696

携带编码跨膜LFA-3的质粒的噬菌体根据布达佩斯条约保藏在InVitro International，Inc.，Linthicum，Maryland，U.S.A.，1987年5月28日，登记号IVI-10133。该保藏物在1991年6月20日转移到美国典型培养物保藏中心(10801 Univeristy Blvd.，Manassas，Virginia 20110-2209，United States)并鉴定为：

命名                 ATCC登记号

λHT16[λgt10/LFA-3]      75107

用编码PI-连接的LFA-3的质粒转化的大肠杆菌根据布达佩斯条约保藏在In Vitro International，Inc.，Linthicum，Maryland，U.S.A.，1988年7月22日，登记号IVI-10180。该保藏物在1991年6月20日转移到美国典型培养物保藏中心(目前地址是1080Univeristy Blvd.，Manassas，Virginia，U.S.A.)并鉴定为：

命名           ATCC登记号

p24            68788

序列

下面是序列表中列举的序列的总结：

序列1 跨膜LFA-3的DNA序列

序列2 跨膜LFA-3的氨基酸序列

序列3 PI-连接的LFA-3的DNA序列

序列4 PI-连接的LFA-3的氨基酸序列

序列5 CD2的DNA序列

序列6 CD2的氨基酸序列

序列7 LFA3TIP的DNA序列

序列8 LFA3TIP的氨基酸序列

为了更好的理解本发明，举出下列实施例。这些实施例仅是为了说明，而不以任何方式解释为限制本发明的范围。

实施例1：记忆效应T淋巴细胞的调节

本实施例说明特定的CD2结合剂，LFA3TIP(序列8)，将会在有牛皮癣的哺乳动物个体中选择性调节记忆效应T淋巴细胞。

材料和方法

我们进行了LFA3TIP在慢性斑牛皮癣病人中的二期，随机，双盲，平行设计，四分支(four arm)，安慰剂-对照的研究实验。主要研究目的是测定临床反应与0.025至0.15毫克/公斤剂量范围之间的关系。在美国的22个地方登记了229例从18到70岁的病人。登记的标准包括至少有一年的斑牛皮癣，涉及超过10％的表面积并且不能通过局部药剂控制。平均病龄是16年(范围在1-62)。在研究开始前一个月中断光线治疗和系统治疗。LFA3TIP以冷冻溶液包装在小管中，每管含有10毫克/毫升的融合蛋白，以及赋形剂(氯化钠，磷酸二氢钾，以及磷酸氢二钠)。小管贮存在-70℃(-94℉)，在冰箱或室温融化并用0.9％氯化钠稀释至终体积5毫升，用于静脉内块给药。

将CD2结合剂通过静脉内注射每星期给药一次持续12个星期；在最后一次给药后对病人再给药12个星期。使用身体综合评价和牛皮癣活性及严重指数(PASI)评价了疾病的程度，在最后一次将研究的药物给药后2个星期时评价主要功效终点。

从病人抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度离心分离淋巴细胞。通过流式细胞计量术(FACSTAR PLUS，Becton Dickinson，San Jose，CA)检测细胞(大约3×10⁵)。监测了一万个事例。

结果

在许多终点，我们看到LFA3TIP和安慰剂之间的统计差别，包括在两个较高的LFA3TIP剂量时的PASI值降低。临床反应速率随LFA3TIP浓度的增加而增强(未发表资料)。此外，使用这种CD2结合剂的治疗是与外周CD4+和CD8+ T淋巴细胞的降低相关的，且与天然杀伤细胞有关。我们观察到CD45RO+记忆-效应T细胞相对于CD45RA+原初的CD4+和CD8+细胞的选择性降低。特别地，流式细胞仪检测揭示，有记忆/效应器表型的高密度T细胞(CD4-CD45RO和CD8-CD45RO)比有原初的表型的低密度CD2 T细胞(CD4-CD45RA和CD8-CD45RA)有更多的减低。图1图示在接受LFA3TIP治疗后的牛皮癣病人中记忆效应T细胞相对原初的T细胞的选择性降低。X轴上方的水平框代表长期治疗的持续期，在接近80天时停止。曲线代表在各治疗组中的57位病人的平均绝对淋巴细胞亚群的计数。记忆效应T细胞(CD45RO+)有统计学显著的剂量-相关减少。不管治疗方案如何，均未观察到外周原初的T细胞(CD45RA+)的变化。不同的CD2结合剂治疗中的T细胞计数显示出降低，在80天的长期给药期中达到某种相对恒定的值。在治疗终止后，记忆效应T细胞计数开始增加。

LFA3TIP可以很好耐受报道的非药物-相关的严重负面事件。在接受LFA3TIP的所有病人中观察到外周淋巴细胞的绝对数量有一个从输注前水平的瞬时，温和，剂量-依赖的降低。在总的CD2，CD4，和CD8淋巴细胞，但设在CD19淋巴细胞记录到这种降低。

实施例II：类风湿性关节炎的治疗

选择有类风湿性关节炎(RA)的病人进行治疗，使用CD2结合剂诸如LFA3-TIP。本药物如实施例1中所述制备和包装，以每星期大约7.5至10毫克的剂量向病人给药，持续12-24个星期。为了确定最优化的剂量和程序，使用上面引用的不同体系进行平行设计研究。从病人抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度离心分离淋巴细胞。如上所述通过流式细胞计量术(FACSTAR PLUS，Becton Dickinson，SanJose，CA)检测细胞(大约3×10⁵)。使用多种标记(indicia)监测病人，包括关节肿胀和触痛分数，作为一部分包括在标准化的“ACR 20”研究中。参看Felson，D.T.等，“美国风湿学院的类风湿性关节炎临床试验的疾病活性检测”，Arth.Rheum.，26：729-740(1993)。

实施例III：炎性肠病(IBD)，局限性回肠炎，结肠炎的治疗

炎性肠病是一个通用术语，与一组涉及胃肠道的未知病因的慢性炎性疾病有关。溃疡性结肠炎(UC)和局限性回肠炎，两种主要形式的自发炎性肠病(IBD)，是广泛存在但对其了解甚少的疾病(Kirsner，J.B.等编，Inflammatory Bowel Disease：3^rd ed.，Lea和Febiger，Philadephia(1988)；Goldner，F.H.等，Idiopathic InflammatoryBowel Disease，in Stein，J.H.，编，Internal Medicine，LittleBrown & Co.，Boston，pp.369-380(1990)；Cello，J.P.等，Ulcerative Coltis，in Sleisenger，M.H.，等，等编，Gastrointestinal Disease：Pathophysiology DiagnosisManagement，W.B.Saunders Co.，Philadelphia，p.1435(1989))。由于不知道炎性肠病的原因，可能的病因因素包括感染的，免疫学的，家族的或心理学的因素。在慢性炎性肠病中常常出现次级肠外表现，诸如关节炎和胆管周炎。对炎性肠病的药物治疗包括将抗炎症药柳氮磺胺吡啶(活性组分认为是5-氨基水杨酸盐，最可能的是通过抑制前列腺素合成)和糖皮质激素给药。

局限性回肠炎或区域性回肠炎是用于小肠的一个区域发炎的疾病的术语。这通常伴随有腹痛，肠不规则，失重和轻微发热。腹部通常不舒服并且可能感到增厚的肠。变窄的肠道可能会阻塞，需要立即做手术。不知道该疾病的病因。主要损伤是肠粘膜下层和淋巴腺的淋巴组织增生。局限性回肠炎是慢性胃肠道疾病，最常感染回肠，结肠或两者都感染。通过不同的诊断使其与溃疡性结肠炎相区分。

与局限性回肠炎的深层，常常涉及跨粘膜和裂隙相比较，溃疡性结肠炎的病理学通常更多的是指浅层粘膜疾病(Riddle，R.H.编，Pathology of Drug-induced and Toxic Diseases，ChurchillLivingstone，New York(1982)；Morrison，B.C.等编，Gastrointestinal Pathology，2d ed.，London(1979)；Fenoglio-Pieiser，C.M.等编，Gastrointestinal Pathology：AnAtlas and Text，Raven Press，New York(1989)；Goldman，H.等，Hum.Pathol.13：981-1012(1982))。溃疡性结肠炎典型地涉及直肠并邻近延伸，但不干涉无关的“跳跃(skip)”区域，那是局限性回肠炎的标志。

用于IBD的现有动物模型可分为天然存在的和实验-诱导的动物模型。不幸的是，只有少数自发的并很少出现的由于遗传缺陷造成的肠炎症的模型，它们大都不是自发性的而是由细菌或其它感染剂诱发的(例如用Bacillus psyliformnis在小鼠中诱导和使用“杆状细菌”在仓鼠中诱导增生，隐窝脓肿，溃疡)(Strober，W.，Dig.Dis.Sci.33 Suppl.：3S-10S(1988))。少见形式的自发溃疡性结肠炎和肉芽小肠结肠炎亦分别在鼠和马中出现。此外，绒猴和the cotton-toptamarin用作溃疡性结肠炎和结肠腺癌的模型(Clapp，N.K.等编，Dig.Dis.Sci.33 Suppl.：1S-158S(1988))。实验诱导的溃疡性结肠炎的动物模型通常是暴露于有毒的食物，药理剂或其它环境化学物质，或注射来自病人的物质或对动物免疫系统进行操作来诱导的(Strober，W.，Dig.Dis.Sci 33 Suppl.：3S-10S(1988)；Beekan，W.L.，实验性肠病，见于：Kirsner，J.B.等编，炎性肠病，Lea和Febiger，Philadelphia，pp.37-49(1988)；Onederdonk，A.B.，Dig.Dis.Sci.33 Suppl.：40S-44S(1988))。

可以检查CD2结合剂在使用cotton-top tamarin模型动物时治疗局限性回肠炎的潜在治疗功效和机制。参看例如，J.Madara等，“Characterization of Spontaneous Colitis in Cotton-Top Tamarin(Saguinus oedipus)and Its Response to Sulfasalazine，”Gastroenterology，88，pp.13-19(1985)。准备了在无菌盐水中的CD2结合剂(例如LFA3TIP)和安慰剂对照(只有盐水)的贮备液用于向表现自发性结肠炎(即腹泻等：参看前面Madara等)的10只CottonTop Tamarin(CTTs)给药。通过静脉内注射，5只CTT接受CD2结合剂，5只接受安慰剂。向接受CD2结合剂的CTTs每天注射1毫克药剂(基于CTT的大约半公斤的重量，即为2毫克/公斤/天)持续8天(在实验的0，1，2，3，4，5，6，和7天)。隔天对获自动物的结肠组织样品进行活组织检查(在实验的0，2，4，6，8和10天)。使用活组织检查的资料确定各动物的急性炎症指数，提供结肠炎病程的半-定量分析。(参看前面Madara等)抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度离心分离淋巴细胞。如上所述通过流式细胞计量术(FACSTAR PLUS，Becton Dickinson，San Jose，CA)检测细胞(大约3×10⁵)。预期结果会显示记忆效应T淋巴细胞的选择性降低以及用CD2结合剂导致急性炎症指数的显著(p<0.01)降低。

在人中选出IBD病人进行CD2结合剂诸如LFA3-TIP治疗。这种药剂如实施例1中所述制备和包装，并以每星期大约7.5至10毫克的剂量对病人用药，持续12-24个星期。为了确定最优化的剂量和程序，使用上面引用的不同体系进行了平行设计研究。从病人抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度离心分离淋巴细胞。如上所述通过流式细胞计量术(FACSTAR PLUS，Becton Dickinson，San Jose，CA)检测细胞(大约3×10⁵)。使用多种指标监测病人，包括局限性回肠炎活性指数(Kjeldsen，J，and Schaffalitzky de Muckadell，O.B.，Scand.J.Gastroenterol.28：1-9(1993))。

实施例IV：治疗眼色素层炎

眼色素层炎是眼部疾病，可遍及眼部包括眼睛的后和前眼房以及玻璃体。眼色素层炎是眼色素层发炎，在美国占大约10％的视力损伤由此产生。全色素层炎是指整个眼睛的眼色素层(血管的)。后眼色素层炎通常是指脉络膜视网膜炎而前眼色素层炎是指虹膜睫状体炎。在眼睛的流体区域包括前眼房，后眼房和玻璃体区域以及涉及炎症反应的组织，通常可发现这些炎症的发炎产物，即细胞，血纤蛋白，多余的蛋白质。眼色素层炎可发生在手术或眼睛创伤后，作为自体免疫疾病诸如类风湿性关节炎，贝赫切特综合征病，关节强硬性脊椎炎结节病的组分，或作为独立的免疫介导的眼病，即扁平部睫状体炎，虹膜睫状体炎等，与已知的病因学无关，和发生在造成抗原-抗体复合体沉积在眼色素层组织的某些系统疾病之后。这些疾病总的说来代表非-感染性眼色素层炎。

在哺乳动物中的治疗

使用了三只短尾猴(cynomologous monkeys)。对所有程序使用氯胺酮麻醉动物(30毫克/公斤)。将含有6毫克LFA3-TIP的装置移植到右眼并将只含有多聚物的对照装置移植到左眼。猴子有发育完好的pars plana因而不需cryopexy。所有的装置均移植到下颞部边缘后方3毫米处。在第一星期，2星期，4星期，2月，4月和6月麻醉动物并使用检眼镜间接检查法和视网膜电描记法检测。按所述进行视网膜电描记法，但5个反应的平均是使用Nicolet CA-1000临床平均器(clinical averager)(Madison，Wis.)和CKA Ganzfeld flash(Gaithersbur，MD.)获取的。在第6个月时，使用HPLC检测血样的环孢霉素(检测限度＝25纳克/毫升)。在6个月后使用过量戊巴比妥杀死动物然后立即通过左室灌注10％福尔马林缓冲液。将眼睛置入固定剂随后包埋在石蜡中，切片并以掩蔽方式检查毒性证据。抽取外周血液并使用ficoll-hypaque梯度离心分离淋巴细胞。通过流式细胞计量术(FACSTAR PLUS，Becton Dickinson，San Jose，CA)检测细胞(大约3×10⁵)。

药物动力学

使用了24只动物(第一组)。将CD2结合剂混合到50:50的乙醇：水保藏溶液，浓度为1微克/20微升和10微克/20微升。亦将含氚的CD2结合剂(1微居里/20毫升)加入保藏溶液。用氯胺酮(60毫克)和塞拉嗪(20毫克)麻醉并用一滴盐酸苯福林(25％)和托吡卡胺(1％)扩大瞳孔。使用30号针头通过边缘后方大约5毫米的上直肌向玻璃体内注射CD2结合剂。12只动物接受20微升中1微克的剂量，12只动物接受20微升中10微克的剂量。注射到玻璃体中央空腔并小心避免晶状体。对于1微克组，在0.5，3，6和24小时各杀死3只动物。对于10微克组，在0.5，6，24和48小时各杀死3只动物。摘出眼球并随后立即在-70℃冷冻。如下所述制备组织进行检测。从1n浓度对时间作图的回归分析确定了玻璃体内半寿期和分布体积。

治疗

使用了11只动物。将含有CD2结合剂的缓释装置插入右眼。将只含有多聚物的装置插入左眼。在插入装置前进行了包括检眼镜检查法和视网膜电描记法(ERG)检测。使用接触晶状体电极(ERG-Jet)和两频道临床信号平均器(Cadwell 5200，Kennewick，Wash)和Ganzfeldflash unit(Cadwell VPA-10，Kennewick，Wash.)记录了两眼的暗适应和光适应视网膜电描记信号(ERG’s)。在暗适应至少30分钟后进行的暗适应ERG在0.33Hz激发并且平均了20个刺激的显示。光适应ERG在光适应至少5分钟后在2.8Hz进行，亦为20刺激的平均。评估了产生的波的振幅和潜伏期。为了尽量减小个体效应和不同天的差异(13-15)，使用实验振幅(右)和对照振幅(左)的比率评价ERG反应。当实验和对照眼的振幅相同时，比率为1。比率的降低反映实验眼的振幅的相对降低。

实验在第1，7，14和然后的6个月内两周一次重复进行。在第6周杀死3只动物，在第16周杀死2只动物。为了评价可逆毒性，在16周从3只动物除去该装置。每周检查动物一次，持续两个月，然后杀死。剩余的两只动物在26周杀死。杀死后使用固定液(10％缓冲的福尔马林或6％磷酸盐缓冲戊二醛)通过左室灌注动物。摘除眼睛并置于固定液。然后将来自后极(posterior pole)的3个3毫米×6毫米样品包埋在石蜡或塑料中并切片。每一样品一个切片，以掩蔽的方式检查毒性的证据。

实施例V.牛皮癣性关节炎的治疗

本实施例提供了一个方案，检测CD2结合剂在牛皮癣性关节炎病人中的临床效果和组织反应。

牛皮癣性关节炎存在于5-8％的牛皮癣病人中，是常见的慢性风湿性疾病，如果不加治疗可能导致相当严重的关节损伤。最近的临床研究关注于确定不良的预后。在有显著的关节炎症和某些HLA抗原病人中需要早期的积极治疗。牛皮癣和牛皮癣性关节炎被认为是典型的T细胞介导疾病。免疫发病机制的证据继续指向I类HLA介导的疾病，其可能有CD8+ T细胞重要作用。

研究设计

这是在牛皮癣性关节炎病人中对作为实例的CD2结合剂II期临床研究。

该研究将包括3个月的疗程，每周静脉注射CD2结合剂。在治疗开始、期间和治疗后，使用本领域的临床和常规实验室方法测定对牛皮癣性皮肤损伤和关节炎的功效。紧接的以前，4周后和治疗期结束后使用标准方法实施滑液的活组织检查，以进行免疫组织学研究。紧接的以前，4周和12周后以及在3个月的治疗后时期的末尾使用标准方法实施皮肤活组织检查，以进行免疫组织学研究。

研究群体

对象的数量

为了选择用于本研究的病人，筛选了有牛皮癣的病人是否符合下列的所有标准：

1)18到70岁之间(包括)的男性或女性病人。

2)女性病人必须是不具生育可能的(手术绝育或至少绝经一年)或在筛选就诊时有阴性的妊娠结果并在研究给药之前至少一个月，研究中和给药后6个月内保持有效的生育控制方法。

3)病人必须满足明确的牛皮癣性关节炎诊断。

4)病人必须至少一个膝关节和3个其他关节有临床上明显的关节炎，至少30分钟的早晨强直以及至少28mm的红细胞沉降速率(ESR)。

5)病人必须有比第一剂研究药物给药前12个月更严重的斑-型牛皮癣诊断。

6)病人的PASI必须是12或更高。

7)在至少筛选面试前4周，除了非-类甾醇类抗-炎症药物(NSAID)外，病人必须中断使用所有免疫调节药物诸如氨甲蝶呤，环孢霉素A和皮质类固醇以及所有其它用于治疗牛皮癣和/或牛皮癣性关节炎的化合物。

8)在第一剂给药之前14天内，病人的绝对CD4+淋巴细胞计数必须在或大于正常的低限。

治疗方案

将CD2结合剂以7.5毫克固定剂量的静脉内块bolus给药，每周一次，总共12剂。

治疗方案的改进

为了病人能接受下一剂的研究药物，必须有下列情况出现：

-在给药24小时内从每一受试者获得的外周淋巴细胞的绝对数目必须大于正常下限的67％或大于受治者的基线测定值的50％。

-在上一次给药前获得的绝对CD4+淋巴细胞必须大于300细胞/立方毫米。

如果任何一条上述标准不能满足，将停止向该受治者给药并在下一个星期对该受治者重新评估。如果受治者在超过28天的时间内外周淋巴细胞绝对数目或绝对CD4+淋巴细胞数目持续减少，将永远的停止使用研究药物。

研究药物和受治者的终止

下面的部分描述了停用研究药物的标准，以及撤出研究的标准。

事件方案

检测和评价

在某日的同一时间收集血液学和淋巴细胞亚群分析所需的血液样品，以防止昼夜变化造成的假象。

除非特别说明，在每次将研究药物给药前的指定的时间点进行下列测试和评价：

-在就诊5，9和13(Visits 5，9，and 13)进行完整的体格检查。

-在就诊1到13和15到17进行生命体征检测。

-在就诊1到13和15到17进行体重记录。

-在就诊5，9，13和17进行尿分析。

-在就诊5，9，13和17进行血液化学分析。

-在就诊1到17进行血液学分析。第一个实验室检测在第一剂研究药物前48小时内进行。所有其它检测在每次给药前24小时内进行。

-在就诊1到17进行淋巴细胞亚群分析。

-在就诊5，13和17进行女性妊娠(尿)检测。

-在就诊13进行免疫球蛋白IgG，IgA和IgM的定量测定。

-在就诊1，3，5，7，9，11和13到17进行PASI。

-在就诊1，3，5，7，9，11和13到17进行甲评估。

-在就诊1，3，5，7，9，11和13到17测定sIL-2R和sCD27。

-在就诊1，5，13对相关的，来自未暴露于阳光的非-靶的损伤，可任选的在就诊17进行皮肤打孔活组织检查。

-在就诊1，5，9，13和17评价ACR Core Set。

-在就诊5，9，13和17评价ACR改进标准。

-在就诊1，5和13进行滑膜的膝关节镜活组织检查。

功效评价

临床功效评价

关节炎

对各个对象由同一个检查人/风湿病学家进行对关节炎的所有功效评价：

-ACR core Set和改进测定

皮肤损伤

对各病人由同一个检查人/皮肤学家进行对皮肤损伤的所有功效评价：

-PASI分数

-指(趾)甲评估。

实验室功效评估

-关节镜检查法滑液活组织检查

-滑膜的免疫组织学研究

-牛皮癣的血清疾病活性标记

-皮肤活组织检查

-皮肤的免疫组织学研究

安全性评估

临床安全性评估

-体格检查

-生命体征(温度，心率，呼吸频率，以及仰卧血压)

-体重

-监控感染

-监控副事件

实验室安全性评估

-血液学：服药24小时内进行示差和血小板计数的全血细胞计数，并由检查人在各位点监测。

-血液化学分布：钠，钾，氯，重碳酸盐，血液尿素氮，肌酸酐，钙，磷酸盐，白蛋白，总蛋白，碱性磷酸酶，总胆红素，ALAT，ASAT，以及γ-谷氨酰转氨酶。

-尿分析

产物/实验专一性安全评价

-利用T淋巴细胞(CD4，CD8)明确的亚群标记，使用流式细胞计量术进行外周淋巴细胞亚群定量。

统计声明和分析计划

样本大小的考虑

使用10位对象的临床试验研究认为适用于评价安全性和功效。做过的用CD2结合剂诸如LFA-3/IgG₁融合蛋白的实验证实了对总淋巴细胞以及CD4和CD8亚群的一致功效。

终点的描述

关节炎和牛皮癣的主要临床功效终点基于12周后治疗的结束。临床功效的替代终点基于治疗4周和8周。主要安全性终点基于治疗后3个月观察期的结束。在皮肤和滑膜中免疫组织学变化的替代终点是基于两个时间点：治疗后4周和12周。

在客观分析中要使用的统计学方法

分析的一般方法是建立基线和治疗结束时的临床和实验室差别。这可以使用例如方差或协方差，或逻辑回归完成。在分析前可能需要将反应进行转换。合适时，使用非参数技术。

临床功效分析

确定在ACR Core Set检测中显示20％的改进的病人的比例。确定其PASI分数比基线至少降低50％的病人的比例。其它的功效测定包括最小PASI分数，总红斑分数，总硬结分数，总脱屑分数和指(趾)甲分数。

实验室功效分析

对滑膜和皮肤的免疫组织学研究以及牛皮癣活性标记的血清水平将提供与基线值比较的资料。

我们描述了本发明的多种实施方案，显而易见可将我们的基本实施方案加以改变提供使用本发明方法的其它的实施方案。因而，应当理解本发明的范围包括所有可任选择的实施方案和变体，并在上面的说明和附录的权利要求书中定义；本发明不受此处列举作为例子的特定实施方案限制。

序列表

(1)一般资料：

  (i)申请人Magilavy，Daniel

  (ii)发明名称：调节记忆效应器T-细胞的方法和组合物

  (iii)序列数目：8

  (iv)通讯地址：

     (A)联系人：BIOGEN，INC.

     (B)街道：14 Cambridge Center

     (C)城市：Cambridge

     (D)州：Massachusetts

     (E)国家：美国

     (F)邮编：02142

  (v)计算机可读形式：

     (A)媒介类型：软盘

     (B)计算机：IBM PC兼容机

     (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

     (D)软件：patentIn

  (vi)目前申请资料：

     (A)申请号；

     (B)提交日期：31-AUG-1999

  (vii)先前申请资料：

     (A)申请号：06/098,456

        (B)提交日期：31-AUG-1999

  (viii)律师/代理人资料：

        (A)姓名：Kaplan，Warren

        (B)注册号：34，199

        (C)参考/档案号：A005PCT

  (ix)电传信息：

        (A)电话：(617)679-3598

        (B)电传：(617)679-2838

(2)序列1信息：

  (i)序列特征：

        (A)长度：753碱基对

        (B)类型：核酸

        (C)链型：单链

        (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (ix)特征：

        (A)命名/关键词：CDS

        (B)位置：1..750

  (ix)特征：

        (A)命名/关键词：sig_peptide

        (B)位置：1..84

  (ix)特征：

      (A)命名/关键词：mat_peptide

      (B)位置：85..750

  (ix)特征：

      (A)命名/关键词：混合特征(misc_feature)

      (B)位置：1..750

      (D)其它信息：/注释＝“人跨膜LFA-3”

  (ix)特征：

      (A)命名/关键词：misc_feature

      (B)位置：646

      (D)其它信息：/注释＝“跨膜结构域”

  (xi)序列描述：序列1：

(2)序列2信息：

  (i)序列特征：

     (A)长度：250个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (D)拓扑类型：线性

  (ii)分子类型：蛋白质

  (xi)序列描述：序列2：

(2)序列3信息：

  (i)序列特征：

     (A)长度：723碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑类型：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (ix)特征：

     (A)命名/关键词：CDS

     (B)位置：1..720

(ix)特征：

     (A)命名/关键词：sig_peptide

     (B)位置：1..84

(ix)特征：

     (A)命名/关键词：成熟肽(mat_peptide)

     (B)位置：85..720

(ix)特征：

     (A)命名/关键词：混合特征(misc_feature)

     (B)位置：1..720

     (D)其它信息：/注释＝“人PI-连接的LFA-3”

(ix)特征：

     (A)命名/关键词：混合特征(misc_feature)

     (B)位置：568..720

     (D)其它信息：/注释＝“PI-连接的信号序列”

(xi)序列描述：序列3：

(2)序列4信息

   (i)序列特征：

      (A)长度：240个氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (D)拓扑结构：线性

   (ii)分子类型：蛋白质

   (xi)序列描述：序列4：

(2)序列5信息：

  (i)序列特征：

     (A)长度：1056碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(ix)特征：

      (A)命名/关键词：CDS

      (B)位置：1..1053

(ix)特征：

      (A)命名/关键词：信号肽(sig_peptide)

      (B)位置：1..72

(ix)特征：

      (A)命名/关键词：成熟肽(mat_peptide)

      (B)位置：73..1053

(ix)特征：

      (A)命名/关键词：混合特征(misc_feature)

      (B)位置：1..1053

      (D)其它信息：/注释＝“人CD2”

(ix)特征：

      (A)命名/关键词：混合-特征

      (B)位置：628..702

      (D)其它信息：/注释＝“跨膜结构域”

(xi)序列描述：序列5：

(2)序列6信息：

  (i)序列特征：

     (A)长度：351个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：蛋白质

  (xi)序列描述：序列6：

(2)序列7信息：

   (i)序列特征：

      (A)长度：1050碱基对

      (B)类型：核酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑类型：线性

   (ii)分子类型：cDNA

   (ix)特征：

      (A)命名/关键词：CDS

      (B)位置：1..1041

(ix)特征：

      (A)命名/关键词：信号肽(sig_peptide)

      (B)位置：1..84

(ix)特征：

      (A)命名/关键词：成熟肽(mat_peptide)

      (B)位置：85..1041

(ix)特征：

      (A)命名/关键词：混合特征(misc_feature)

      (B)位置：85..1041

      (D)其它信息：/注释＝“LFA3TIP”

(ix)特征：

      (A)命名/关键词：混合特征(misc_feature)

      (B)位置：360..361

      (D)其它信息：/注释＝“LFA-3/IgG融合位点”

(xi)序列描述：序列7：

(2)序列8信息：

  (i)序列特征：

     (A)长度：347个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (D)拓扑类型：线性

  (ii)分子类型：蛋白质

  (xi)序列描述：序列8：

Claims (68)

1.剂量足以选择性降低具有医学疾病的受治者的CD45 RO阳性记忆效应T淋巴细胞的有效量的CD2结合剂LFA-3多肽在制备治疗所述疾病的药物组合物中的用途，其中该疾病选自牛皮癣性关节炎、多发性硬化、特应性皮炎、眼色素层炎、炎性肠病、局限性回肠炎、溃疡性结肠炎以及皮肤T细胞淋巴瘤。

2.权利要求1的用途，其中LFA-3多肽的剂量为每公斤受治者体重0.001-50mg。

3.权利要求1的用途，其中LFA-3多肽含有选自下列组中的氨基酸序列：(a)序列2的氨基酸1到92；(b)序列2的氨基酸1到80；(c)序列2的氨基酸50到65；和(d)序列2的氨基酸20到80。

4.权利要求1的用途，其中所述的疾病是皮肤T细胞淋巴瘤。

5.权利要求1的用途，其中所述的疾病是特应性皮炎。

6.权利要求1的用途，其中所述的疾病是炎性肠病。

7.权利要求1的用途，其中所述的疾病是局限性回肠炎。

8.权利要求1的用途，其中所述的疾病是溃疡性结肠炎。

9.权利要求1的用途，其中所述的疾病是牛皮癣性关节炎。

10.权利要求1的用途，其中所述的疾病是眼色素层炎。

11.权利要求1的用途，其中所述的疾病是多发性硬化。

12.权利要求1的用途，其中LFA-3多肽的剂量是每公斤体重0.025-0.15mg。

13.权利要求1的用途，其中LFA-3多肽的剂量选自每公斤体重0.05、0.075、0.1125和0.165mg。

14.权利要求1-13任一项的用途，其中的LFA3多肽是融合蛋白，其含有成熟LFA-3的氨基末端92个氨基酸和人IgG1铰链区的C-末端10个氨基酸。

15.权利要求14的用途，其中的LFA3融合蛋白进一步包含人IgG1重链恒定区的CH2和CH3区。

16.权利要求1-13任一项的用途，其中LFA-3多肽与氨甲蝶呤组合使用。

17.权利要求1-13任一项的用途，其中LFA-3多肽与环孢菌素A组合使用。

18.权利要求1-13任一项的用途，其中LFA-3多肽是LFA3TIP，即SEQ ID NO：8的1-319位氨基酸。

19.权利要求16的用途，其中LFA-3多肽为LFA3TIP，即SEQID NO：8的1-319位氨基酸。

20.权利要求17的用途，其中LFA-3多肽为LFA3TIP，即SEQID NO：8的1-319位氨基酸。

21.剂量足以选择性降低具有类风湿性关节炎的受治者的CD45RO阳性记忆效应T淋巴细胞的有效量的CD2结合剂LFA-3多肽在制备治疗类风湿性关节炎的药物组合物中的用途，其中所述的LFA-3多肽与氨甲蝶呤组合使用。

22.权利要求21的用途，其中LFA-3多肽和氨甲蝶呤配制在单一剂型中。

23.权利要求21的用途，其中LFA-3多肽和氨甲蝶呤同时使用。

24.权利要求21的用途，其中LFA-3多肽和氨甲蝶呤依次使用。

25.权利要求21的用途，其中LFA-3多肽的剂量为每公斤受治者体重0.001-50mg。

26.权利要求25的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.01-10mg。

27.权利要求25的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.1-4.0mg。

28.权利要求25的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.075-0.150mg。

29.权利要求21的用途，其中LFA-3多肽含有选自下列组中的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1到92；(b)SEQ ID NO：2的氨基酸1到80；(c)SEQ ID NO：2的氨基酸50到65；和(d)SEQ ID NO：2的氨基酸20到80。

30.权利要求21-29中任一项的用途，其中的LFA-3多肽是融合蛋白，其含有成熟LFA-3的氨基末端92个氨基酸和人IgG1铰链区的C-末端10个氨基酸。

31.权利要求30的用途，其中的LFA3融合蛋白进一步包含人IgG1重链恒定区的CH2和CH3区。

32.权利要求21-29中任一项的用途，其中LFA-3多肽是LFA3TIP，即SEQ ID NO：8的1-319位氨基酸。

33.剂量足以选择性降低具有类风湿性关节炎的受治者的CD45RO阳性记忆效应T淋巴细胞的有效量的CD2结合剂LFA-3多肽在制备治疗类风湿性关节炎的药物组合物中的用途，其中所述的LFA-3多肽与环孢菌素A组合使用。

34.权利要求33的用途，其中LFA-3多肽和环孢菌素A配制在单一剂型中。

35.权利要求33的用途，其中LFA-3多肽和环孢菌素A同时使用。

36.权利要求33的用途，其中LFA-3多肽和环孢菌素A依次使用。

37.权利要求33的用途，其中LFA-3多肽的剂量为每公斤受治者体重0.001-50mg。

38.权利要求37的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.01-10mg。

39.权利要求37的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.1-4.0mg。

40.权利要求37的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.075-0.150mg。

41.权利要求33的用途，其中LFA-3多肽含有选自下列组中的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1到92；(b)SEQ ID NO：2的氨基酸1到80；(c)SEQ ID NO：2的氨基酸50到65；和(d)SEQ ID NO：2的氨基酸20到80。

42.权利要求33-41中任一项的用途，其中的LFA-3多肽是融合蛋白，其含有成熟LFA-3的氨基末端92个氨基酸和人IgG1铰链区的C-末端10个氨基酸。

43.权利要求42的用途，其中的LFA3融合蛋白进一步包含人IgG1重链恒定区的CH2和CH3区。

44.权利要求33-41中任一项的用途，其中LFA-3多肽是LFA3TIP，即SEQ ID NO：8的1-319位氨基酸。

45.剂量足以选择性降低具有牛皮癣性关节炎的受治者的CD45RO阳性记忆效应T淋巴细胞的有效量的CD2结合剂LFA-3多肽在制备治疗牛皮癣性关节炎的药物组合物中的用途，其中所述的LFA-3多肽与氨甲蝶呤组合使用。

46.权利要求45的用途，其中LFA-3多肽和氨甲蝶呤配制在单一剂型中。

47.权利要求45的用途，其中LFA-3多肽和氨甲蝶呤同时使用。

48.权利要求45的用途，其中LFA-3多肽和氨甲蝶呤依次使用。

49.权利要求45的用途，其中LFA-3多肽的剂量为每公斤受治者体重0.001-50mg。

50.权利要求49的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.01-10mg。

51.权利要求49的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.1-4.0mg。

52.权利要求49的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.075-0.150mg。

53.权利要求45的用途，其中LFA-3多肽含有选自下列组中的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1到92；(b)SEQ ID NO：2的氨基酸1到80；(c)SEQ ID NO：2的氨基酸50到65；和(d)SEQ ID NO：2的氨基酸20到80。

54.权利要求45-53中任一项的用途，其中的LFA-3多肽是融合蛋白，其含有成熟LFA-3的氨基末端92个氨基酸和人IgG1铰链区的C-末端10个氨基酸。

55.权利要求54中任一项的用途，其中的LFA3融合蛋白进一步包含人IgG1重链恒定区的CH2和CH3区。

56.权利要求45-53中任一项的用途，其中LFA-3多肽是LFA3TIP，即SEQ ID NO：8的1-319位氨基酸。

57.剂量足以选择性降低具有牛皮癣性关节炎的受治者的CD45RO阳性记忆效应T淋巴细胞的有效量的CD2结合剂LFA-3多肽在制备治疗牛皮癣性关节炎的药物组合物中的用途，其中所述的LFA-3多肽与环孢菌素A组合使用。

58.权利要求57的用途，其中LFA-3多肽和环孢菌素A配制在单一剂型中。

59.权利要求57的用途，其中LFA-3多肽和环孢菌素A同时使用。

60.权利要求57的用途，其中LFA-3多肽和环孢菌素A依次使用。

61.权利要求57的用途，其中LFA-3多肽的剂量为每公斤受治者体重0.001-50mg。

62.权利要求61的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.01-10mg。

63.权利要求61的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.1-4.0mg。

64.权利要求61的用途，其中的剂量为每公斤受治者体重0.075-0.150mg。

65.权利要求57的用途，其中LFA-3多肽含有选自下列组中的氨基酸序列：(a)SEQ ID NO：2的氨基酸1到92；(b)SEQ ID NO：2的氨基酸1到80；(c)SEQ ID NO：2的氨基酸50到65；和(d)SEQ ID NO：2的氨基酸20到80。

66.权利要求57-65中任一项的用途，其中的LFA-3多肽是融合蛋白，其含有成熟LFA-3的氨基末端92个氨基酸和人IgG1铰链区的C-末端10个氨基酸。

67.权利要求66的用途，其中的LFA3融合蛋白进一步包含人IgG1重链恒定区的CH2和CH3区。

68.权利要求57-65中任一项的用途，其中LFA-3多肽是LFA3TIP，即SEQ ID NO：8的1-319位氨基酸。

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