JP2004503507A - リンパ球シグナルのブロックおよびｌｆａ−１媒介性接着のブロックによる細胞性免疫応答の調節方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、少なくとも３種の異なる細胞表面分子の相互作用を、それらの天然のリガンドで妨害することによって、細胞性免疫応答、免疫系疾患および同種異系移植片拒絶反応を調節する方法を提供する。第１の細胞相互作用は、ＣＤ２８／Ｂ７／ＣＴＬＡ４によって媒介され、第の２の相互作用は、ＣＤ４０／ＣＤ１５４によって媒介され、そして第３の相互作用は、ＬＦＡ−１とそのリガンドの相互作用によって媒介される。細胞性免疫応答の調節は、同種異系移植に関連する疾患などの免疫系疾患に影響を及ぼす。

Description

【０００１】
本出願を通して、種々の文献が引用される。これらの文献の記載は、本発明が関係する当業界の状態をより詳しく記述するために、全体を参考文献として本出願に援用される。
【０００２】
（技術分野）
本発明は、細胞表面分子とそれらの天然のリガンドとの間の少なくとも３種の相互作用を分裂させることによる細胞性免疫応答の改良された調節方法に関する。
【０００３】
（発明の背景）
後天性（特異的）免疫は、抗原チャレンジと戦うのに役立つ選択のレパートリーを広げるために身体が用いる戦略である。後天性免疫は、骨髄中で造血によって生産されるリンパ球によって媒介される。抗原認識および結合に応答したリンパ球媒介性免疫の活性化によって、Ｂリンパ球（Ｂ細胞）およびＴリンパ球（Ｔ細胞）という２つの主要サブ集団の活性化が起こる。
ＴおよびＢ細胞は、相互依存的な様式で活性化される。宿主への抗原チャレンジの後、Ｂ細胞、マクロファージおよび樹状細胞などの宿主細胞は、細胞表面に提示するために、抗原を捕捉し、中和し、処理する。次いで、Ｔ細胞（特に、ヘルパーＴ細胞として知られるＴ細胞のサブセット）による提示された抗原の認識および結合の後、Ｔ細胞は、他のＴ細胞ならびにＢ細胞を活性化する。次には、活性化されたＢ細胞が、休止Ｔ細胞を刺激する。それらの活性を調節するＢ細胞とＴ細胞間の複雑な相互作用は、幾つかの細胞表面分子によって媒介されることが知られている。
【０００４】
アロ抗原の認識および結合に続くＴ細胞の活性化の調節は、細胞表面分子によって媒介される２つの別個の分子シグナルを必要とすることがわかっている。第１のシグナルは、Ｔ細胞受容体の抗原認識および結合を介してＴ細胞に提供されるが、一方、第２のシグナルは、Ｔ細胞表面上の１つまたはそれ以上の推定の受容体分子のそれらのリガンドによる認識および結合によって提供されると考えられる（１）。今日までに、これらの細胞表面受容体分子のうち最も有望なものは、ＣＤ２８（２−５）、ＣＴＬＡ４（６０−６１）およびＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌまたはｇｐ３９としても知られる）（６−９）である。ＣＤ２８分子は、ほとんどすべてのＣＤ１５４＋Ｔ細胞および約５０％のＣＤ８＋Ｔ細胞上に発現される（４）。ＣＤ２８のリガンドは、Ｂ細胞などの抗原提示細胞の表面に発現されるＢ７−１およびＢ７−２（それぞれ、ＣＤ８０およびＣＤ８６としても知られる）分子であることがわかっている（４；５；１０）。ＣＤ２８とＢ７分子の間の相互作用が、Ｔ細胞の活性化を刺激する。
【０００５】
Ｂ７分子は、活性化したＴ細胞上に存在する細胞表面受容体ＣＴＬＡ４のリガンドでもある。ＣＴＬＡ４とＢ７の間の相互作用は、Ｔ細胞におけるアネルギー状態を誘発し、ＣＤ２８／Ｂ７が誘発するＴ細胞の活性化を相殺する。
ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４とＢ７リガンドとの相互作用は、Ｂ７−１およびＢ７−２に対してＣＤ２８よりもアヴィデティーの高い融合タンパク質である可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇによって効果的にブロックすることができる（ＣＴＬＡ４ＩｇをコードするＤＮＡは、１９９１年５月３１日にバージニア州２０１１０−２２０９マナサス、ユニバーシティ・ブールバード１０８０１番にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ受託番号６８６２９にて寄託された；チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞であるＣＴＬＡ４Ｉｇ−２４は、１９９１年５月３１日にＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１０７６２にて寄託された）。この受容体経路のブロックにより、生体内（１３；１４）および試験管内（１２；１５；１６）の両方においてＴ細胞の抗原活性化が阻害されることが、多くの研究において報告されている。
【０００６】
ＣＤ１５４分子は、主に活性化Ｔ細胞に発現されるが、ＣＤ４０は、Ｂ細胞などの抗原提示細胞に発現される。ＣＤ１５４とＣＤ４０の間の相互作用は、Ｂ細胞を活性化し、Ｔ細胞をさらに活性化する。モノクローナル抗体によるＣＤ４０／ＣＤ１５４経路のブロックもまた、試験管内（１７；１８）および生体内（１９−２１）におけるリンパ球媒介免疫応答の効果的な阻害方法であることがわかっている。
ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４およびＣＤ１５４が、最も多く研究されているリンパ球受容体であるが、他の細胞表面分子も細胞調節プロセスに関係している。これらの分子として、４−１ＢＢ、ＩＣＯＳ、ＣＤ９９およびリンパ球機能関連抗原−１（ＬＦＡ−１）などのインテグリンファミリー由来の幾つかの接着分子が挙げられる（２２−３３）。
【０００７】
ＬＦＡ−１分子は、インテグリンαＬサブユニット（ＣＤ１１ａ）とインテグリンβ２サブユニット（ＣＤ１８）の組合せによって形成される。ＬＦＡ−１は、リンパ球（たとえば、Ｔ細胞）、顆粒球、単球、マクロファージなどの多くの白血球細胞タイプに発現され、ＩＣＡＭファミリー由来の分子（たとえば、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２およびＩＣＡＭ−３）などの種々のリガンドとの相互作用を介して、細胞−細胞および細胞−マトリックス相互作用を媒介することが詳細に報告されている。ＬＦＡ−１のβ２サブユニット（ＣＤ１８）の他のリガンドとして、αアクチニンおよびサイトヘシン−１などが挙げられる。白血球、上皮細胞および内皮細胞におけるＬＦＡ−１ポジティブ細胞とＩＣＡＭ−１などのＬＦＡ−１結合リガンドの間の相互作用を増大させる、接着分子としてのＬＦＡ−１の機能は、長い間認識されている；しかし、ごく最近では、抗原認識に続くＴ細胞のシグナリングプロセスにおけるＬＦＡ−１の関わりを示す証拠が現れている（２６；２７；３４−３８）。
【０００８】
同種間の臓器あるいは組織移植に続く、細胞媒介性移植片拒絶反応は依然として、長期間の移植片生存の成功に対する主な障害である。ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用をブロックするモノクローナル抗体の使用が、移植片生存を延長することが明らかにされている（３９−４４）。さらに、近年、ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗ＣＤ４０／ＣＤ１５４モノクローナル抗体などのリンパ球相互作用をブロックする作用剤が、非ヒト霊長類などの多くの動物モデルにおいて、移植片拒絶プロセスに対して効能があることが実証されている。さらに、ＣＤ２８とＣＤ４０／ＣＤ１５４ブロックの両方を組合せると、移植片生存が劇的に改善され、幾つかの動物モデルの移植において、長期移植片受諾および同種異系反応性低下が達成された（５２−５４）。今なお、ＢＡＬＢ／ｃ−＞Ｃ５７ＢＬ／６マウスの皮膚移植などの他のモデルの同種異系移植は、ＣＤ２８＋ＣＤ１５４ブロックに対して抵抗性があることが明らかにされており、他のシグナリング経路が同種異系移植片認識に関与しているかもしれないことが示唆される。
【０００９】
現在、移植組織の生存率を増加するために、たとえば、組織移植後の移植片（同種異系移植片など）拒絶反応を抑制するなどの、抗原提示後の細胞性免疫応答を調節する方法を提供する必要がある。
ＣＤ２８／Ｂ７、ＣＴＬＡ４／Ｂ７および／またはＣＤ４０／ＣＤ１５４シグナルのブロックから得られる免疫応答の阻害は、強力であるが、幾つかの場合、不完全である。本明細書に述べる結果は、ＬＦＡ−１経路のブロックに加えて、これらの経路をブロックすると、意外にも、移植片生存が増強され、抗原提示に対する細胞性免疫応答が調節されることを実証する。
【００１０】
（発明の概要）
本明細書に開示された発明は、ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ１５４などの細胞表面分子およびＬＦＡ−１などの接着分子と、それらのリガンドの間の相互作用をブロックすることを含む細胞性免疫応答の調節方法を提供する。本発明は、これらの分子が移植片の長期生存を促進する改善方法を提供するという発見を伴っている。ＬＦＡ−１に対する作用剤の添加は、Ｂ７に対する作用剤（可溶性ＣＴＬＡ４分子など）およびＢ７に対する作用剤（抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体など）で処理されたマウスにおいて、マウス皮膚移植および心臓移植の両方について、同種異系移植片の生存を大きく増加する。たとえば、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７、ＣＤ４０／ＣＤ１５４およびＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ経路それぞれに対する３つの作用剤の組合せの使用もまた、マウス皮膚移植片生存を増進する。また本発明は、同種異系移植片移植に関連する疾患などの免疫系疾患の調節方法を提供する。
【００１１】
（発明の詳細な記載）
定義
本明細書中での使用においては、以下の用語および語句は、明記された意味をもつ。
本明細書において、「リガンド」は、他の分子を認識し、結合する分子を意味する。
本明細書において、「調節する」は、応答を阻害または刺激することを意味し、たとえば、「リンパ球媒介性免疫応答を調節すること」は、リンパ球関連免疫応答を阻害または刺激することを意味する。
本明細書において、「受容体」は、リガンドによって結合された場合に、別の細胞状態に導く細胞内経路カスケードを扇動する分子を意味する。受容体は、リンパ球などの幾つかの細胞タイプにおいて見られる。
本明細書において、受容体、シグナルまたは分子を「ブロック」または「阻害」するとは、業界承認テストによって検出されるような、受容体、シグナルまたは分子の活性化を妨害することを意味する。たとえば、細胞性免疫応答のブロックは、同種異系移植片生存の増強を決定することによって検出することができる。ブロックまたは阻害は、部分的または全体的である。
【００１２】
本明細書において、「細胞−細胞を阻害」または「細胞−マトリックス接着」は、細胞表面接着分子と他の細胞上または細胞外マトリックス中のそのリガンドの間の相互作用を妨げることを意味する。接着分子およびリガンドの例として、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８またはインテグリンαＬβ２としても知られる）、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）、ｐ１５０，９５（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、ＶＬＡ−１、ＣＤ４４、ＣＤ６２（Ｅ、ＬおよびＰ）、ＣＤ１０６、フィブリノーゲン、αアクチニン、フィラミンおよびサイトヘシン−１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１３】
本明細書において、分子の「部分」または「フラグメント」は、結合活性を保持する無傷の分子のどのような部分をも意味する。たとえば、「ＣＴＬＡ４のフラグメント」または「ＣＴＬＡ４の部分」は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインまたはＢ７などのターゲットを認識して結合するそのセグメントである。
本明細書において、「誘導体」は、その親分子の配列相同性および活性を共有する分子である。たとえば、ＣＴＬＡ４の誘導体として、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインに少なくとも７０％類似するアミノ酸配列を有し、可溶性ＣＴＬＡ４分子またはＢ７を認識して結合する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子が挙げられる。可溶性ＣＴＬＡ４分子の一例は、ＣＴＬＡ４Ｉｇである（１９９１年５月３１日にバージニア州２０１１０−２２０９マナサス、ユニバーシティ・ブールバード１０８０１番にあるアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）にＡＴＣＣ受託番号６８６２９にて寄託された）。ＣＴＬＡ４Ｉｇを発現しているチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系であるＣＴＬＡ４Ｉｇ−２４は、１９９１年５月３１日にＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１０７６２にて寄託された。可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子の一例は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇである（２０００年６月１９日にＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２１０４にて寄託された）。
【００１４】
本明細書において、「作用剤」、免疫応答を媒介する分子をブロックすることによって細胞性免疫応答を調節するために用いられる分子を意味する。
本明細書において、「第１作用剤」は、リンパ球上のＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＢ７分子を認識して結合する分子またはその部分もしくは部分（複数）である。たとえば、「第１作用剤」として、可溶性ＣＴＬＡ４分子（たとえば、可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子）、可溶性ＣＤ２８分子、可溶性Ｂ７分子、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体または抗Ｂ７モノクローナル抗体、およびそれらのフラグメントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、「第２作用剤」は、リンパ球上のＣＤ４０またはＣＤ１５４（ＣＤ４０Ｌまたはｇｐ３９としても知られる）を認識して結合する分子またはその部分もしくは部分（複数）である。たとえば、「第２作用剤」として、可溶性ＣＤ４０、可溶性ＣＤ１５４、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体または抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体、およびそれらのフラグメントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、「第３作用剤」は、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチン、フィラミンまたはサイトヘシン−１などのＬＦＡ−１のリガンドへのその接着を妨げる分子またはその部分もしくは部分（複数）である。たとえば、「第３作用剤」として、抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体、抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体、抗ＩＣＡＭ−２モノクローナル抗体、抗ＩＣＡＭ−３モノクローナル抗体、抗ＣＤ１１ａモノクローナル抗体、抗ＣＤ１８モノクローナル抗体およびＬＦＡ−１、ＣＤ１１ａ、ＣＤ１８、ＩＣＡＭ−１（ＣＤ５４）、ＩＣＡＭ−２またはＩＣＡＭ−３の可溶性体、およびそれらのフラグメントまたは誘導体が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００１５】
本明細書において、「Ｂ７」は、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４を認識して結合するＢ７−１（ＣＤ８０としても知られる）、Ｂ７−２（ＣＤ８６としても知られる）およびＢ７−３分子を包含するＢ７ファミリーのメンバーを意味する。
本明細書において、「野生型ＣＴＬＡ４」は、Ｂ７を結合する、および／またはＢ７のリガンドとＢ７の結合を妨げる、天然の全長ＣＴＬＡ４（米国特許第５４３４１３１、５８４４０９５、５８４１７９５号）またはその細胞外ドメインのアミノ酸配列をもつ。特定の具体例において、野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、＋１位にてメチオニンで始まり、＋１２４位にてアスパラギン酸で終わるか、または野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、−１位にてアラニンで始まり、＋１２４位にてアスパラギン酸で終わる。野生型ＣＴＬＡ４は、Ｎ末端細胞外ドメイン、膜貫通ドメインおよびＣ末端細胞質ドメインを有する細胞表面タンパク質である。細胞外ドメインが、Ｂ７などの標的抗原に結合する。細胞において、天然の野生型のＣＴＬＡ４タンパク質は、Ｎ末端にシグナルペプチドを含む未成熟ポリペプチドとして翻訳される。未成熟ポリペプチドは、シグナルペプチドの切断および除去を含む翻訳後プロセシングを受け、未成熟体におけるＮ末端とは異なる新たに生じたＮ末端を有するＣＴＬＡ４切断産物が産生される。当業者であれば、さらなる翻訳後プロセシングが起こり、ＣＴＬＡ４切断産物の新たに生じたＮ末端から１つまたはそれ以上のアミノ酸が除去されることを理解するであろう。ＣＴＬＡ４分子の成熟体は、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインまたはＢ７に結合するそのどのような部分をも含む。
【００１６】
「ＣＴＬＡ４Ｉｇ」は、野生型ＣＴＬＡ４またはＢ７を結合するその部分の細胞外ドメインを含む可溶性融合タンパク質である。特定の具体例は、＋１位にてメチオニンで始まり、＋１２４位にてアスパラギン酸で終わるか；または−１位にてアラニンで始まり、＋１２４位にてアスパラギン酸で終わる野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン；＋１２５位のジャンクションアミノ酸残基グルタミン；および＋１２６位のグルタミン酸〜＋３５７位のリシンを包含する免疫グロブリン部分を含む（図５）。
本明細書において、「融合タンパク質」は、当業者に公知の方法および米国特許第５４３４１３１または５６３７４８１号に記載の方法を用いて一緒に連結された１つまたはそれ以上のアミノ酸配列として定義される。その方法によって、連結されたアミノ酸配列は、１つの融合タンパク質を形成する。
本明細書において、「可溶性」は、細胞に結合または付着されない、すなわち、循環するどのような分子またはそのフラグメントおよび誘導体をも意味する。たとえば、ＣＴＬＡ４、Ｂ７またはＣＤ２８は、免疫グロブリン（Ｉｇ）部分を、それぞれＣＴＬＡ４、Ｂ７またはＣＤ２８の細胞外ドメインに付着することによって可溶性にすることができる。別法として、ＣＴＬＡ４など分子の膜貫通ドメインを除去することによって、その分子を可溶性にすることができる。本発明方法に用いる可溶性分子は、シグナル（またはリーダー）配列を含んでも含まなくてもよい。典型的には、分子はリーダー配列を含まない。
【００１７】
本明細書において、「可溶性ＣＴＬＡ４分子」は、循環するか、または非細胞表面結合ＣＴＬＡ４分子またはＢ７を結合するＣＴＬＡ４分子のどのような機能的部分をも意味し、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：ＣＴＬＡ４融合タンパク質（ここで、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、免疫グロブリン（Ｉｇ）部分に融合して、融合分子またはそのフラグメントおよび誘導体を可溶性になる）；パピローマウイルスＥ７遺伝子産物（ＣＴＬＡ４−Ｅ７）、メラノーマ関連抗原ｐ９７（ＣＴＬＡ４−ｐ９７）またはＨＩＶエンベロープタンパク質（ＣＴＬＡ４−ｅｎｖ ｇｐ１２０）などの生物学的活性または化学的活性タンパク質の部分に融合または結合したＣＴＬＡ４の細胞外ドメインもしくはそれらのフラグメントおよび誘導体を含むタンパク質；ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４Ｉｇなどのハイブリッド（キメラ）融合タンパク質またはそれらのフラグメントおよび誘導体；タンパク質を可溶性にするために膜貫通ドメインが除去されたＣＴＬＡ４分子またはそのフラグメントおよび誘導体「可溶性ＣＴＬＡ４分子」は、そのフラグメント、部分または誘導体も包含する。本発明に用いる可溶性ＣＴＬＡ４分子は、シグナル（またはリーダー）配列を含んでも含まなくてもよい。典型的には、分子はリーダー配列を含まない。
【００１８】
本明細書において、「ＣＴＬＡ４突然変異分子」は、１つまたは多数の突然変異を有する（野生型ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインにあるのが好ましい）野生型ＣＴＬＡ４またはその部分（誘導体またはフラグメント）を意味する。ＣＴＬＡ４突然変異分子は、野生型ＣＴＬＡ４分子の配列と類似しているが同一ではなく、しかし、依然としてＢ７を結合する配列を有する。突然変異は、保存的構造または化学的特性（たとえば、イソロイシンでロイシンを置換）または非保存的構造または化学的特性（たとえば、トリプトファンでグリシンを置換）にてアミノ酸置換された１つまたはそれ以上のアミノ酸残基、アミノ酸欠失、付加、フレームシフトまたはトランケーションを含む。突然変異ＣＴＬＡ４分子は、たとえば、免疫グロブリン定常ドメインに結合したＣＴＬＡ４の細胞外ドメインまたはその部分もしくはフラグメントなどの、その中またはそれに結合する非ＣＴＬＡ４分子を含んでもよく、米国特許出願番号６０／２８７５７６および６０／２１４０６５（これらは全体を参考文献として本発明に援用される）において共継続中である、ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子（ＡＴＣＣ６８６２９）またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ分子（ＡＴＣＣ　ＰＴＡ−２１０４）が得られる。突然変異分子は、可溶性（すなわち循環性）でも、あるいは細胞表面に結合してもよい。さらに別のＣＴＬＡ４突然変異分子として、米国特許出願番号０９／８６５３２１、６０／２１４０６５および６０／２８７５７６；および米国特許第６０９０９１４、５８４４０９５および５７７３２５３号に記載されたものが挙げられる。ＣＴＬＡ４突然変異分子は、合成的または組換え的に製造することができる。
【００１９】
当業者は、ヌクレオチド配列における突然変異の結果として、アミノ酸配列に変化が起こるかまたは起こらないということを理解するであろう。それを考慮すると、幾つかのコドンは、同じアミノ酸をコードする。例として、アミノ酸アルギニン（Ｒ）をコードするＣＧＴ、ＣＧＧ、ＣＧＣおよびＣＧＡコドン；またはアミノ酸アスパラギン酸（Ｄ）をコードするＧＡＴおよびＧＡＣコドンが挙げられる。したがって、タンパク質は、特定のヌクレオチド配列において異なるが、依然として同一配列をもつタンパク質分子をコードする１つまたはそれ以上の核酸分子によってコードすることができる。配列をコードするアミノ酸は、以下の通りである。
【００２０】
【表１】

【表２】

【００２１】
本明細書において、「ＣＴＬＡ４の細胞外ドメイン」は、Ｂ７を認識して結合するＣＴＬＡ４のどのような部分でもある。たとえば、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、＋１位のメチオニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含む（図５）。別の態様では、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインは、−１位のアラニンから＋１２４位のアスパラギン酸を含む（図５）。細胞外ドメインは、Ｂ７を結合するＣＴＬＡ４のフラグメントまたは誘導体を含む。
本明細書において、「リンパ球」は、液性または細胞性免疫を媒介する単核細胞を意味する。リンパ球の主なサブセットは、ＢおよびＴ細胞である。
【００２２】
本明細書において、「免疫系疾患」は、自己免疫障害、免疫増生性障害および移植片関連障害を意味し、以下のものが挙げられるが、これらに限定されるものではない：移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）（たとえば、骨髄移植から、あるいは寛容性の導入において生じるものなど）；移植片拒絶反応関連免疫障害（たとえば、慢性拒絶反応、固形臓器、皮膚、小島、筋肉、肝細胞、神経などの組織または細胞の同種異系または異種移植片）；Ｔ細胞リンパ腫；乾癬；Ｔ細胞急性リンパ芽球白血病；精巣血管中枢Ｔ細胞リンパ腫；良性リンパ球脈管炎；および狼瘡などの自己免疫疾患（たとえば、紅斑性狼蒼、腎炎性狼蒼）、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（たとえば、インスリン依存型糖尿病、インスリン非依存型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感神経性眼炎、自己免疫ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫溶血性貧血、突発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（たとえば、慢性関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症および混合性結合組織病。
【００２３】
本明細書において、「患者」は、免疫応答を調節するために、作用剤を投与することができる、どのような生きている生物をも意味する。患者として、ヒト、サル、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ハムスター、いずれかのトランスジェニック動物、いずれかの同種異系移植片レシピエント、いずれかの異種移植片レシピエントまたはいずれかの移植片レシピエントが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
本明細書において、「投与する」は、いずれかの慣例方法によって患者に作用剤を提供することを意味し、経口投与、吸入投与、静脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、筋肉内投与、座剤または局所接触による投与、もしくはベシクルまたはカプセルなどの遅延放出手段による投与が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００２４】
本明細書において、「遺伝子療法」は、核酸の配列を細胞に導入し、次いで、核酸によってコードされたいずれかの遺伝子産物を細胞が発現するように、遺伝子操作によって疾患を治療するプロセスである。たとえば、当業者には公知のように、核酸導入は、対象の核酸を含む発現ベクターを、たとえば、リン酸カルシウム沈殿法、ジエチルアミノエチルデキストラン、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、電気穿孔法、直接注入、リポフェクションまたはウイルス感染などの種々の方法で、生体外または試験管内で細胞に挿入することによって行う（６３、６４、６５）。別法として、たとえば、患者への核酸の直接投与（６６）、またはウイルスベクターへの核酸の挿入および患者のウイルス感染（６７−７０）などの種々のベクターおよび種々の方法を用いて、生体内で対象の核酸配列を細胞に導入してもよい。生体内導入のための他の方法として、リポソームへの核酸の封入および患者への該リポソームの直接導入、または血球凝集センダイウイルスと組合せたリポソームの導入が挙げられる（７１）。トランスフェクトまたは感染された細胞は、疾患または疾患の症状を寛解するために、核酸がコードするタンパク質産物を発現する。発現タンパク質は、分泌されるかまたはトランスフェクトまたは感染された細胞に残留する。
【００２５】
本明細書において、「医薬的に許容しうる担体」は、いずれかの剤形において、作用剤を患者に投与するために作用剤と組合せることできるどのような物質をも意味する。たとえば、担体は、患者に投与した時に、作用剤の有効な活性を維持し、患者の免疫系と反応しない物質である。可能な担体として、いずれかの溶媒、培地、懸濁液、乳濁液、あるいはデンプン、ミルク、糖類、あるタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸、ステアリン酸塩、タルカム、オイル、ガム、グリコール、香味剤、保存剤または着色添加物などの他の賦形剤が挙げられるが、これらに限定されるものではない。可能な担体の形体として、滅菌溶液、エアロゾル、リポソーム、ベシクル、座剤、丸剤、錠剤またはカプセル剤が挙げられる。　本明細書に記載の発明をより詳しく理解するために、以下の説明を述べる。
【００２６】
（発明の方法）
本発明は、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０またはＣＤ１５４などのリンパ球上の受容体とそれらのリガンドの間の相互作用をブロックすること、およびさらにＬＦＡ−１媒介性相互作用をブロックすることによる細胞性免疫応答の調節方法を提供する。該方法は、リンパ球上のＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＢ７などの分子を第１作用剤と接触させることによって、第１のリンパ球シグナルをブロックすること；リンパ球上のＣＤ４０またはＣＤ１５４などの分子を第２作用剤と接触させることによって、第２のリンパ球シグナルをブロックすること；および接着分子（たとえば、ＬＦＡ−１）または接着分子のリガンドと第３作用剤を接触させることによって、接着分子のリガンドと接着分子の間の接着分子媒介性相互作用をブロックすることを含む。
【００２７】
本発明は、ＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ４０またはＣＤ１５４などのリンパ球上の受容体とそれらのリガンドの間の相互作用をブロックすること、およびさらにＬＦＡ−１媒介性相互作用をブロックすることによる免疫系疾患の治療方法を提供する。該方法は、少なくとも３つの作用剤を投与することを含む：ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＢ７を結合することによって、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７媒介性シグナルをブロックする第１作用剤；ＣＤ４０またはＣＤ１５４のいずれかを結合することによって、ＣＤ４０／ＣＤ１５４媒介性シグナルをブロックする第２作用剤；およびＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１に結合することによって、接着分子媒介性相互作用をブロックする第３作用剤。３つの作用剤のいずれかの組合せによるブロックは、免疫系関連疾患を治療的に処置する。
【００２８】
第１作用剤は、リンパ球上の受容体（たとえば、ＣＤ２８および／またはＣＴＬＡ４）とそのリガンド（たとえば、Ｂ７−１および／またはＢ７−２）の間の相互作用を妨げることによって作用するのが好ましい。第１作用剤の例として、受容体またはリガンドを認識して結合する抗体（もしくはその部分または誘導体）などの分子；可溶性ＣＴＬＡ４などの受容体またはリガンドの可溶性体（もしくはその部分または誘導体）；受容体／リガンド媒介性相互作用を介してリンパ球シグナルを妨げるように設計されたペプチドフラグメントまたは他の小さい分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい具体例において、第１作用剤は、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２９）またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（ＡＴＣＣ　ＰＴＡ２１０４）などの可溶性ＣＴＬＡ４分子、ＣＤ２８Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２８）などの可溶性ＣＤ２８分子、Ｂ７Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２７）などの可溶性Ｂ７分子、抗Ｂ７モノクローナル抗体（たとえば、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２５３、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２２３、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２２６、ＡＴＣＣ　ＨＢ−３０１、ＡＴＣＣ　ＨＢ−１１３４１、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体（たとえば、ＡＴＣＣ　ＨＢ−３０４および参考文献８２−８３に記載のモノクローナル抗体）および参考文献８０−８１に記載のモノクローナル抗体）および／または抗ＣＤ２８モノクローナル抗体（たとえば、ＡＴＣＣ　ＨＢ１１９４４および参考文献７９に記載のｍＡｂ９．３）である。
【００２９】
第２作用剤は、リンパ球上の第２の受容体（たとえば、ＣＤ１５４）とそのリガンド（たとえば、ＣＤ４０）の間の相互作用を妨げることによって作用する。第２作用剤の例として、第２の受容体または抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体などのリガンドを認識して結合する抗体（もしくはその部分または誘導体）などの分子；受容体またはリガンドの可溶性体（もしくはその部分または誘導体）；第２の受容体／リガンド媒介性相互作用を介してリンパ球シグナルを妨げるように設計されたペプチドフラグメントまたは他の小さい分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい具体例において、第２作用剤は、抗ＣＤ１５４（たとえば、参考文献５６に記載のＭＲ１、ＡＴＣＣ　ＨＢ−１０９１６、ＡＴＣＣ　ＨＢ−１２０５５およびＡＴＣＣ　ＨＢ−１２０５６）および／または抗ＣＤ４０モノクローナル抗体（たとえば、ＡＴＣＣ　ＨＢ−９１１０）である。
【００３０】
第３作用剤は、接着分子（たとえば、ＬＦＡ−１）とそのリガンドの相互作用を妨げる。接着分子およびリガンドの例として、ＬＦＡ−１（ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８）、Ｍａｃ−１（ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８）、ｐ１５０，９５（ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８）、ＩＣＡＭ（１、２および３）、ＶＬＡ−１、ＣＤ４４、ＣＤ６２（Ｅ、ＬおよびＰ）、ＣＤ１０６、フィブリノーゲン、αアクチニン、フィラミンおよびサイトヘシン−１が挙げられるが、これらに限定されるものではない。ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３などのＬＦＡ−１リガンドは、他の細胞上または細胞外マトリックス中に位置することができる。第３作用剤の例として、接着分子またはリガンドを認識して結合する抗体（もしくはその部分または誘導体）などの分子；接着分子またはリガンドの可溶性体（もしくはその部分または誘導体）；接着分子／リガンド相互作用を妨げるように設計されたペプチドフラグメントまたは他の小さい分子が挙げられるが、これらに限定されるものではない。好ましい具体例において、第３作用剤は、抗ＬＦＡ−１（たとえば、ＡＴＣＣ　ＨＢ−９５７９およびＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１３）、抗ＩＣＡＭ−１（たとえば、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１８７８およびＡＴＣＣ　ＨＢ−２３３）、抗ＩＣＡＭ−２、抗ＩＣＡＭ−３、抗αアクチニン（たとえば、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２５２）、抗フィラミン、抗サイトヘシン−１、抗ＣＤ１１ａ（たとえば、Ｍ１７／５．２　ＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２３７、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２０２、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２４４およびＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１７）および／または抗ＣＤ１８（ＡＴＣＣ　ＨＢ−２０３、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２２６およびＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１８）モノクローナル抗体である。
【００３１】
本発明の好ましい具体例は、少なくとも３つの細胞経路をブロックすることによって、細胞性免疫応答を調節する：第１作用剤であるＣＴＬＡ４ＩｇによるＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７媒介性経路；第２作用剤であるＣＤ１５４モノクローナル抗体ＭＲ１による抗ＣＤ４０／ＣＤ１５４経路；および第３作用剤である抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体Ｍ１７／５．２による接着分子媒介性経路。
【００３２】
本発明のさらに別の態様は、免疫応答を調節するための、前記の１つまたはそれ以上の経路を標的とする１つまたはそれ以上の作用剤を包含する。たとえば、第１および第２作用剤が、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７経路を妨げ（たとえば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ＋抗Ｂ７モノクローナル抗体）、第３作用剤が、接着分子媒介性経路を妨げる（たとえば、抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体）。別法として、３つの作用剤すべてが、１つの経路を妨げてもよい（たとえば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、抗Ｂ７−１モノクローナル抗体＋抗Ｂ７−２モノクローナル抗体）。
【００３３】
本発明は、有効量の前記３つの作用剤を含む、免疫系疾患の治療に用いる医薬組成物を包含する。したがって、抗原チャレンジに対する細胞性免疫応答は、少なくとも３種の細胞接触を分断するために、患者に少なくとも３つの作用剤の組合せを適用することによって、調節することができる。患者として、ヒト、サル、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ハムスターなどが挙げられる。組成物はさらに、薬物毒素、酵素、抗体（もしくはその部分または誘導体）または複合体などの他の治療剤を含んでもよい（これらに限定されるものではない）。
【００３４】
作用剤の投与は、同時または別々に行う。たとえば、作用剤は、特定の順序で投与することができ、時間従属的適用において、同時または連続的もしくはそのいずれかの組合せで適用することができる。作用剤は、連続的または同時に投与してもよく、いずれかの順序にて投与してもよい。用量および適用モードに応じて、抗原提示に対する免疫応答の前、最中または後（それらのいずれかの組合せ）に、患者を作用剤で処置することができる。
【００３５】
作用剤の用量は、患者のタイプ（たとえば、生物種）、用いられる作用剤（たとえば、ＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ）、抗原チャレンジの位置、影響を及ぼされた組織のタイプ、治療される免疫系疾患のタイプ、疾患の重篤度、患者の健康状態および作用剤による治療に対する応答などの多くの因子に依存する（これらに限定されるものではない）。したがって、作用剤の用量は、各患者、作用剤および投与モードに応じて変えることができる。たとえば、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇなどの可溶性ＣＴＬＡ４分子（図６に示す；ＡＴＣＣ受託番号ＰＴＡ−２１０４で寄託されたＤＮＡによってコードされる；および米国特許出願番号０９／５７９９２７、６０／２８７５７６および６０／２１４０６５号に記載；これらは全体を参考文献として本発明に援用される）は、０．１〜２０．０ｍｇ／ヒト重量ｋｇ／日、好ましくは、０．５〜１０．０ｍｇ／ｋｇ／日の量で投与する。
【００３６】
作用剤の投与は、注射（たとえば、静脈内、腹腔内、筋肉内など）、経口投与、吸入、局所接触、遺伝子療法、ポンプなどの機械的放出手段による投与、ベシクルまたはカプセルなどの遅延放出手段による投与または座剤などの多くの許容しうる方法で行えるが、これらに限定されるものではない。投与手段に応じて、慣例の適用および作用剤の有効使用のための医薬的に許容しうる担体と作用剤を混合することができる。
【００３７】
医薬組成物は、本発明の分子（たとえば、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹまたはＬ１０４Ｅなどの可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子）と組合せた時に、分子の活性を保持し、患者の免疫系と反応しない、いずれかの物質などの適当な担体およびアジュバントも含むのが好ましい。適当な担体およびアジュバントの例として、ヒト血清アルブミン；イオン交換体；アルミナ；レシチン；リン酸塩などの緩衝物質；グリシン；ソルビン酸；ソルビン酸カリウム；および硫酸プロタミンなどの塩または電解質が挙げられるが、これらに限定されるものではない。他の例は、リン酸緩衝食塩水溶液；水；油／水乳濁剤などの乳濁剤；および種々のタイプの湿潤剤などの標準的医薬担体のいずれかを包含する。さらに他の担体として、滅菌溶液；コーティング錠などの錠剤およびカプセルが挙げられる。このような担体の代表的なものとして、デンプン、ミルク、ミルク、糖類、あるタイプの粘土、ゼラチン、ステアリン酸またはその塩、ステアリン酸マグネシウムまたはカルシウム、タルカム、植物油、ガム、グリコールなどの賦形剤および他の公知の賦形剤が挙げられる。このような担体には、香味剤および着色添加物または他の成分も包含される。
このような担体を含む組成物は、公知の慣例の方法で製剤される。このような組成物はまた、リポソームなどの種々の脂質組成物ならびにポリマーマイクロスフィアなどの種々のポリマー組成物内に配合することもできる。
【００３８】
細胞性免疫応答を調節するためにいずれかの形態における作用剤を投与することにより、免疫増生性疾患または免疫系の自己免疫疾患／障害などの免疫系疾患などの発症に影響を及ぼすこともできる。免疫系疾患の例として、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、乾癬、移植片拒絶反応関連免疫障害（たとえば、同種異系移植片拒絶反応）、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球白血病、精巣血管中枢Ｔ細胞リンパ腫、良性リンパ球脈管炎、狼瘡（たとえば、紅斑性狼蒼、腎炎性狼蒼）、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（たとえば、インスリン依存型糖尿病、Ｉ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感神経性眼炎、自己免疫ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫溶血性貧血、突発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（たとえば、慢性関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症および混合性結合組織病が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００３９】
さらに本発明は、患者の免疫系疾患の治療方法を提供する。免疫系疾患の例は、上記の通りである。一例において、本発明は、自己免疫障害の治療方法を提供する。多くの自己免疫障害は、自己抗原に対して反応し、疾患の病理に関連するサイトカインおよび自己抗体の産生を促進するＴリンパ球の不適当な活性化に起因する。本発明の３つの作用剤を自己免疫障害を患うかまたは冒されやすい患者に投与すると、自己反応性Ｔ細胞の活性化を妨げることができ、疾患の症状を減少または取り除くことができる。
本発明の好ましい具体例では、同種異系移植片生存アッセイによってモニターされるように、少なくとも３つの作用剤、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体および抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体の投与が、免疫応答を調節する。
【００４０】
さらに本発明は、患者による同種異系移植片拒絶反応を阻害する方法を提供する。代表的には、移植において、移植片拒絶反応は、Ｔ細胞による異物としての認識とそれに続く移植片を破壊する免疫応答を介して開始される。本発明の３つの作用剤は、細胞表面分子とそれらのリガンドとの相互作用を阻害することにより、同種異系移植片移植に続いて起こる免疫応答をブロックする。作用剤の投与によって影響を及ぼされる免疫応答の例は、全身性免疫抑制を必要とすることのない長期移植片受諾における組織破壊の減少および抗原特異的Ｔ細胞無応答の誘発が得られるＴリンパ球増殖および／またはサイトカイン分泌の阻害である。
【００４１】
さらに、本発明の作用剤は、他の薬物など（これに限定されない）の他の医薬品とともに投与することができる。たとえば、カルシニューリンインヒビター（シクロスポリンＡまたはＦＫ５０６など）；免疫抑制マクロライド（ラパマイシンまたはその誘導体（４０−Ｏ−（２−ヒドロキシ）エチルラパマイシンなど）など）；リンパ球ホーミング剤（ＦＴＹ７２０またはその類縁体など）；コルチコステロイド；シクロホスファミド；アザチオプレン；メトトレキセート；レフルノミドまたはその類縁体；ミゾリビン；マイコフェノール酸；マイコフェノール酸モフェチル；１５−デオキシスペルガリンまたはその類縁体；免疫抑制モノクローナル抗体（もしくはその部分または誘導体）［白血球受容体（もしくはその部分または誘導体）に対するモノクローナル抗体など（ＭＮＣ、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８、ＣＤ７、ＣＤ２５、ＣＤ２７、Ｂ７、ＣＤ４０、ＣＤ４５、ＣＤ５８、ＣＤ１３７、ＩＣＯＳ、ＣＤ１５０（ＳＬＡＭ）、ＯＸ４０、４−１ＢＢまたはそれらのリガンドなど）］；または他の免疫調節化合物（セレクチンアンタゴニストおよびＶＬＡ−４アンタゴニストなど）と組合せて用いてもよい。
本発明の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子を、他の免疫抑制／免疫調節または抗炎症療法（たとえば、先に記載したようなもの）と共に投与する場合、共投与される免疫抑制、免疫調節または抗炎症化合物の投与量は、もちろん、用いる共薬物のタイプ（たとえば、ステロイドであるかシクロスポリンであるか）、用いる特定の薬物、治療される身体状態などに応じて、変わる。
【００４２】
前述にしたがって、本発明は、さらに別の態様において、遊離型または医薬的に許容しうる塩型である治療上有効量の本発明分子、および免疫抑制、免疫調節または抗炎症薬（前記）である第２の薬物物質の共投与（たとえば、同時または順次に）を含む前記方法を提供する。さらに本発明は、遊離型または医薬的に許容しうる塩型である、同時または順次に用いる本発明分子を、免疫抑制、免疫調節または抗炎症薬を含む少なくとも１つの医薬組成物とともに含む、前記方法のいずれかなどに用いるための治療用コンビネーション（たとえば、キット）を提供する。
【００４３】
遺伝子療法は、現在、免疫増生性疾患（ガンなど）または自己免疫疾患（糖尿病など）などの種々の免疫系疾患を治療するために用いられている。本発明の作用剤は、移植拒絶反応を調節し、免疫系疾患を治療するために、遺伝子療法によって患者に投与することもできる。遺伝子療法として、患者の細胞への生体内原位置での導入のために患者に直接遺伝子をデリバリーする生体内法、あるいは培養中の細胞に遺伝子を導入し、次いで培養された細胞を患者に移植する生体外または試験管内法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。１つまたはそれ以上の治療剤をコードする対象遺伝子が患者の細胞にいったん挿入されると、遺伝子産物が発現し、疾患または疾患の症状を寛解するのに用いられる。
【００４４】
対象遺伝子を細胞に直接挿入するための可能な方法として、シミアンウイルス４０、アデノウイルス、ヒト免疫不全ウイルス−１または他のウイルスなどの組換えウイルスの使用が挙げられる。細胞への対象遺伝子の直接マイクロインジェクションなどの方法または他の導入方法を用いてもよい。
対象遺伝子を細胞に挿入するための生体外または試験管内での可能な方法として、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、脂質媒介トランスフェクション、細胞を透過性にするための高電圧電流への細胞の曝露（電気穿孔）、マイクロインジェクションまたは細胞へ導入するための赤血球ゴーストへの対象遺伝子の封入などの導入操作が挙げられる。
【００４５】
遺伝子療法を用いて種々の疾患を治療または治療を増強することができる。たとえば、本発明において、１つまたはそれ以上のＣＴＬＡ４Ｉｇまたはｇｐ３９などの作用剤をコードするＤＮＡをレトロウイルスベクターに挿入し、ウイルス劉氏へパッケージングすることができる。ウイルス粒子を用いて、患者の細胞を感染させ、対象遺伝子を患者に導入する。遺伝子が患者にいったん導入されると、移植片拒絶反応を調節し、免疫系疾患を治療するのに十分な量で遺伝子産物が発現する。
【００４６】
本発明は、細胞表面分子と種々のリガンドの間の相互作用を分裂させ、それによって、免疫応答の改善された調節および免疫系疾患の治療を誘発することによる患者における細胞性免疫応答の調節方法および疾患の治療方法を提供する。分裂されうる特異的相互作用として、ＣＴＬＡ４／Ｂ７、ＣＤ２８／Ｂ７、ＣＤ１５４／ＣＤ４０およびＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ経路が挙げられるが、これらに限定されるものではない。３つまたはそれ以上の相互作用の分裂によって、免疫応答の調節、移植片生存および免疫増生性の調節が増強される。
【００４７】
本発明はまた、本発明方法に用いるためのキットを提供する。キットは、遊離型または医薬的に許容しうる担体と組み合わせた３つの作用剤を含む。さらに、キットは、本発明の３つの作用剤と共に、１つまたはそれ以上の免疫抑制剤を含んでもよい。可能な免疫抑制剤として、コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（Ｃｏｘ−２インヒビターなど）、シクロスポリンプレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキセート、ＴＮＦαブロッカーまたはアンタゴニスト、インフリキシマブ、炎症性サイトカインを標的とするいずれかの生物学的作用剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾプリン、金塩、エタネルセプト、アナキンラが挙げられるが、これらに限定されるものではない。
【００４８】
本発明方法のために本明細書において明らかにした分子に加えて、他の分子（リガンドなど）を結合アッセイなどの標準的技術を用いて明らかにすることができる。たとえば、本発明の分子のいずれか（たとえば、ＬＣＴＬＡ４、ＣＤ２８、Ｂ７、ＣＤ１５４、ＣＤ４０、ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１の相互作用）を用いて、種々のスクリーニング技術のいずれかにおいて、小さな分子のライブラリーを含むリガンド分子をスクリーニングすることができる。このようなスクリーニングに用いる本発明の分子は、溶液中で遊離していても、固相支持体に付着していても、あるいは細胞表面に生じていてもよい。本発明の分子のいずれかとテストされる作用剤の間での結合複合体の形成は、測定することができる（国際公開Ｗ０８４／０３５６４； Ｐｒｉｃｅ， Ｍ． Ｒ．ら １９８６． Ｂｒ． Ｊ． Ｃａｎｃｅｒ ５４： ３９３ （８８）； Ｇａｌｌｅｇｈｅｒ， Ｇ．ら １９９３． Ｔｕｍｏｕｒ Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ， ｐａｇｅｓ ６３−７９， Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ （８９）など）。
【００４９】
他のスクリーニング技術は、国際公開ＷＯ８４／０３５６４に記載されているような、本発明の分子に対する適当な結合親和性をもつ分子の高スループットスクリーニングを含む。この方法において、本発明の分子に適用すると、多数の異なる小さなテスト分子を、プラスチックピンまたは幾つかの他の表面などの固体基質上に合成することができる。テスト分子を本発明の分子と反応させ、洗浄することができる。本発明の結合分子は、当業界で公知の方法により検出することができる。本発明の精製分子は、スクリーニングアッセイで用いるプレート上に直接塗布することができる。別法として、非中和抗体（もしくはその部分または誘導体）を用いて、本発明の分子を捕捉し、固相支持体上に固定することができる。
【００５０】
他の競合的スクリーニングアッセイは、本発明の分子への結合について、テスト分子と特異的に競合するための中和抗体（本発明の分子を結合する能力がある）の使用を含む。この様式において、該抗体を用いて、本発明の分子と１つまたはそれ以上の抗原決定基を共有するいずれかのタンパク質／ペプチド分子の存在を検出することができる。
本発明が属する当業者には明らかなように、本発明は、本発明の意図または本質的特徴から逸脱することなく、本明細書中に特に記載されたもの以外の形態に具体化されてもよい。したがって、本明細書に記載された本発明の特定の具体例は、例証的であるとみなすべきであり、限定的とみなすべきではない。本発明の範囲は、以下の記載に包含される実施例に限定されるというよりもむしろ添付の請求の範囲に説明されるものである。
【００５１】
実施例１：マウス尾部皮膚移植
材料および方法
マウス：成体雄性６〜８週齢の老Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ（インディアナポリス、インディアナ）から購入する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスは移植片ドナーであり、ＢＡＬＢ／ｃマウスはレシピエントである。
試薬：ＣＴＬＡ４Ｉｇ（Ｌｉｎｓｌｅｙ（１３）およびＷａｌｌａｃｅ（８７））ならびにモノクローナル抗体ＭＲ１（ハムスター抗マウスＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４）（５６）およびＭ１７／５．２（抗マウスＬＦＡ−１／ＣＤ１１ａ）は、先に記載したものであり、使用前に培養上清から精製する（６２）。
マウス尾部皮膚移植：マウスにおける皮膚移植片拒絶反応率を調べるために、尾部皮膚移植片を試験する。簡単に言えば、安楽死させたドナーマウスから尾部皮膚を無菌的に除去する。レシピエントの尾部皮膚に外科手術用にアルコールを施し、約１×０．５ｃｍの領域のレシピエント皮膚を尾部の下面から除去して、移植床を形成する。次いで、該床と等しい大きさのドナーからの皮膚移植片を床に置き、サージカルテープによって尾部に固定される保護ガラス管で２〜３日間覆った後、管とテープを除去する。移植片の壊死を毎日調べ、＞７５％壊死した場合に拒絶されたと考える。
尾部皮膚移植は、第０日に行う。３つの作用剤、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＭＲ１（ハムスター抗マウスＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４）およびＭ１７／５．２（抗マウスＬＦＡ−１／ＣＤ１１ａ）を、個別に、もしくは２つまたは３つの作用剤を組合せてマウスに腹腔内投与する。ＣＴＬＡ４Ｉｇは、移植後第０、２および４日に２００μｇ用量で投与する。ＭＲ１は、移植後第０、２および４日に２５０μｇ用量で投与する。抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体は、移植後第０、１、２、３、４、５、６、１４および２１日に２００μｇ用量で投与する。
【００５２】
結果
抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体は、マウス皮膚移植後のリンパ球相互作用ブロック誘発移植片生存を増加させる。
ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用のブロックが、移植のマウスモデルにおいて同種異系皮膚移植片生存を延長することが、これまでに明らかにされている。これらのモデルでは、長期移植片生存は、ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の両方に対する抗体の組合せを一緒に投与する場合のみに達成される。さらにまた、これまでの研究において、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体ＭＲ１が、組合せて用いる場合に、あるドナー／レシピエント系の組合せにおいて同種異系皮膚移植の長期移植片生存をもたらすことが立証されている。ＢＡＬＢ／ｃ＞Ｃ５７ＢＬ／６の組合せでは、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗ＣＤ１５４抗体ＭＲ１を単独で用いる場合は、移植片生存が延長されず、組合せて投与する場合に、長期移植片生存がもたらされる。
抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体投与と可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＣＤ１５４抗体投与のいずれかとを組合せる効果を評価するために、ＢＡＬＢ／ｃドナーの皮膚を、抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体Ｍ１７／５．２、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体ＭＲ１、または３つの作用剤の組合せで処置したＣ５７ＢＬ／６レシピエントの尾部に移植する。移植片の生存を毎日モニターし、結果を図１に示す。データから、抗ＬＦＡ−１を可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇと共に投与すると、それぞれの作用剤単独の場合と比べて、移植片生存を大いに長くすることが立証される。抗ＬＦＡ−１＋ＣＴＬＡ４Ｉｇ処置マウスの移植片生存中央値（５５．０日）は、抗ＬＦＡ−１（２２．０日）または可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２１．０日）のいずれかの単独よりも大きい。また、データから、抗ＬＦＡ−１と抗ＣＤ１５４抗体ＭＲ１の組合せ投与が、抗ＬＦＡ−１および抗ＣＤ１５４単独の移植片生存中央値である２２．０日および１４．０日から、共に投与する場合の３４．０日へと移植片生存を大いに長くすることが立証される。これまでに報告しているように、可溶性ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＭＲ１の共投与は、この皮膚移植片モデルにおいては、長期移植片生存をもたらさないが（ＭＳＴ＝２９．０日）、この処方に抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体を加えると移植片生存中央値が６５．０日へと長くなる。したがって、三重療法は、二重療法よりもいっそう好結果をもたらす。
【００５３】
実施例２：マウス新生児心臓の耳への移植
材料および方法
マウス：成体雄性６〜８週齢の老Ｃ５７ＢＬ／６およびＢＡＬＢ／ｃマウスをＨａｒｌａｎ（インディアナポリス、インディアナ）から購入する。新生児Ｃ５７ＢＬ／６心臓ドナーを我々の設備で飼育する。Ｃ５７ＢＬ／６マウスはドナーであり、ＢＡＬＢ／ｃマウスはレシピエントである。
試薬：ＣＴＬＡ４Ｉｇ（Ｌｉｎｓｌｅｙ（１３）およびＷａｌｌａｃｅ（８７））ならびにモノクローナル抗体ＭＲ１（ハムスター抗マウスＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４）（５６）およびＭ１７／５．２（抗マウスＬＦＡ−１／ＣＤ１１ａ）は、先に記載したものであり、使用前に培養上清から精製する（６２）。
マウス新生児心臓の耳への移植：Ｆｕｌｍｅｒらの記載（５７）にしたがって心臓移植を行う。誕生後４８時間以内の新生のマウスから新生児心臓を得る。麻酔をして耳介の付け根に小さい切開を施し、耳介から皮膚を徐々に持ち上げてポケットを作成することによって準備したレシピエントマウスに心臓を移植する。切開により、ポケット内へドナーの心臓を皮下挿入することが可能になる。手術後に、血管連結が確立されるまでの移植後３〜５日間までは、心臓組織は脈動しない。心臓の脈動は、拡大視するか、または適当なＥＣＧ（心電計）装置にて収縮活動を測定することによって、観察することができることが多い。マウスを毎日観察し、移植した移植片の収縮活性を毎日モニターする。移植片拒絶反応の時間を、移植後に収縮活動が停止する日数として定義する。
３つの作用剤、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＭＲ１（ハムスター抗マウスＣＤ４０Ｌ／ＣＤ１５４）およびＭ１７／５．２（抗マウスＬＦＡ−１／ＣＤ１１ａ）を、個別に、または２つもしくは３つの作用剤を組合せてマウスに腹腔内投与する。ＣＴＬＡ４Ｉｇは、移植後第０、２および４日に２００μｇ用量で投与する。ＭＲ１は、移植後第０、２および４日に２５０μｇ用量で投与する。抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体は、移植後第０、２、４および６日に２００μｇ用量で投与する。
図３および４に示すように、第１０、１７および４０日に、マウスを安楽死させ、移植片を切除して組織病理学用にホルマリンに入れる。炎症性浸潤および心筋損傷を調べるために、切片にヘマトキシリンおよびエオシン（Ｈ＆Ｅ）染色を行う。各グループの移植片における心臓組織残存パーセントを示す図解にて図３に心筋損傷分析の結果を示す。すなわち、高スコアは、存在する心臓組織パーセントが大きく、したがって、組織損傷が少ないことを示す。炎症性浸潤の結果は、図４に、低スコアが種々の処置グループの移植片に存在する炎症が少ないことを示していることで示される。
【００５４】
結果
抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体は、マウス心臓移植後のリンパ球相互作用ブロック誘発移植片生存を増加させる。
ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用のブロックが、移植のマウスモデルにおいて同種異系心臓移植片生存を延長することが、これまでに明らかにされている。これらのモデルでは、長期移植片生存は、ＬＦＡ−１およびＩＣＡＭ−１の両方に対する抗体の組合せを一緒に投与する場合のみに達成される。さらにまた、これまでの研究において、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗ＣＤ１５４抗体が、組合せて用いる場合に、同種異系心臓移植の長期移植片生存をもたらすことが立証されている。各作用剤単独では、組合せて投与する場合と比べて、移植片生存を有意に少なくしか延長しない。
抗ＬＦＡ−１投与と可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇまたは抗ＣＤ１５４抗体投与のいずれかとを組合せる効果を評価するために、新生児Ｃ５７ＢＬ／６の心臓を、抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体、または３つの作用剤の組合せで処置した成体ＢＡＬＢ／ｃレシピエントの耳介に移植する。これらの心臓の収縮活動をＥＣＧによって毎日モニターし、心臓移植片生存結果を図２に示す。データから、抗ＬＦＡ−１を可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇと共に投与すると、それぞれの作用剤単独の場合と比べて、移植片生存を大いに長くすることが立証される。抗ＬＦＡ−１＋ＣＴＬＡ４Ｉｇ処置マウスの移植片生存中央値（５７日）は、抗ＬＦＡ−１（１８日）または可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２０日）のいずれかの単独よりも大きい。また、データから、抗ＬＦＡ−１と抗ＣＤ１５４の組合せ投与が、抗ＬＦＡ−１および抗ＣＤ１５４単独の移植片生存中央値である１８．０日および３３．０日から、共に投与する場合の６７．５日へと移植片生存を大いに長くすることが立証される。これまでに報告しているように、可溶性ＣＴＬＡ４Ｉｇおよび抗ＣＤ４０Ｌの共投与は、非常に長期の移植片生存をもたらす（ＭＳＴ＞８０日）。
データの結果はさらに、多重療法を受けたグループ（ＣＴＬＡ４Ｉｇ、ＭＲ１および抗ＬＦＡ−１のいずれかの二重または三重の組合せ）が、他の療法グループと比べて、高いパーセンテージで心筋組織を保持し（図３）、炎症が少ないこと（図４）を示す。
【００５５】
実施例３：ヒトＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの構築
本実施例は、たとえば、ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇなどのヒト可溶性ＣＴＬＡ４分子をコードするヌクレオチド配列の作成に用いた方法の説明を提供する。
まず、ＣＴＬＡ４Ｉｇをコードする核酸配列を後記のように作成し、次いで、ＣＴＬＡ４Ｉｇ配列からシングルサイト突然変異を誘導し、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に対する結合動態をテストする。テンプレートとしてＬ１０４ＥＩｇヌクレオチド配列を用いてダブルサイト突然変異ＣＴＬＡ４配列、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを作成し、ＣＤ８０および／またはＣＤ８６に対する結合動態をテストする。
【００５６】
ＣＴＬＡ４Ｉｇの構築
ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインおよびＩｇＣガンマ１ドメインを含むＣＴＬＡ４Ｉｇをコードする遺伝構築物を、米国特許第５８４４０９５および５８５１７９５号の記載にしたがって構築する（これらは全体を参考文献として本発明に援用される）。ＣＴＬＡ４遺伝子の細胞外ドメインを、Ｄａｒｉａｖａｃｈら（７２）に記載の公表された配列に対応する合成オリゴヌクレオチドを用いるＰＣＲによってクローニングする。
ＣＴＬＡ４に対するシグナルペプチドは、ＣＴＬＡ４遺伝子内に同定されないので、オーバーラッピングオリゴヌクレオチドを用いる２ステップ法にて、ＣＴＬＡ４の予測配列のＮ末端をオンコスタチンＭ（７３）のシグナルペプチドに融合する。第１ステップでは、オリゴヌクレオチド、ＣＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣＣＴＧＴＴＴＣＣＡＡＧＣＡＴＧＧＣＧＡＧＣＡＴＧＧＣＡＡＴＧＣＡＣＧＴＧＧＣＣＣＡＧＣＣ（ＣＴＬＡ４のＮ末端７アミノ酸に融合したオンコスタチンＭシグナルペプチドからのＣ末端１５アミノ酸をコードする）をフォワードプライマーとして用い、ＴＴＴＧＧＧＣＴＣＣＴＧＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＧ（ＣＴＬＡ４受容体をコードし、ＢｃｌＩ制限酵素サイトを含むアミノ酸残基１１９−１２５のアミノ酸配列をコードする）をリバースプライマーとして用いる。このステップのためのテンプレートは、Ｈ３８細胞（ＭＤ、ベセスダ、Ｄｒｓ．ＳａｌａｈｕｄｉｎおよびＧａｌｌｏによって提供されたＨＴＬＶ ＩＩ感染Ｔ細胞性白血病細胞系）の全ＲＮＡ１μｇから合成されたｃＤＮＡである。オンコスタチンＭシグナルペプチドのＮ末端部分をコードし、ＨｉｎｄＩＩＩ制限エンドヌクレアーゼサイト、ＣＴＡＧＣＣＡＣＴＧＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧＡＧＧＡＣＧＣＴＧＣＴＣＡＧＴＣＴＧＧＴＣＣＴＴＧＣＡＣＴＣを含むオーバーラッピングフォワードプライマーおよび同じリバースプライマーを用いて、第１ステップからのＰＣＲ産物の一部を再増幅する。ＰＣＲ反応の産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢｃｌＩで消化し、ＩｇＣ１のヒンジ、ＣＨ２およびＣＨ３に対応するアミノ酸配列をコードするＢｃｌＩ／ＸｂａＩ切断ｃＤＮＡフラグメントと一緒に、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断発現ベクターＣＤＭ８またはＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩ切断発現ベクターｐｉＬＮ（πＬＮとしても知られる）内へライゲートする。
ＣＴＬＡ４Ｉｇに対応するアミノ酸配列をコードするＤＮＡは、１９９１年５月３１日にブダペスト条約下にＡＴＣＣに寄託され、ＡＴＣＣ受託番号６８６２９を付与された。
【００５７】
二重突然変異を起こすためのＣＴＬＡ４Ｉｇコドンベース突然変異誘発
ＣＤ８０および／またはＣＤ８６分子からの解離速度をより遅くする（速度“オフ”）突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子を同定するために、突然変異誘発およびスクリーニング方策を展開する。テンプレートとしてＣＴＬＡ４Ｉｇ（米国特許だい５８４４０９５、５８５１７９５および５８８５７９６号；ＡＴＣＣ受託番号６８６２９）を用いて、シングルサイト突然変異ヌクレオチド配列を作成する。コドンの１位および２位にはいずれの塩基をも許可するが、３位にはグアニンまたはチミンのみを許可すること（ＸＸＧ／Ｔ；ＮＮＧ／Ｔとしても知られる）によって、特異的ｃＤＮＡコドンのランダム突然変異誘発のための突然変異誘発性オリゴヌクレオチドＰＣＲプライマーを設計する。この様式において、アミノ酸をコードする特異的コドンを、それぞれ２０個のアミノ酸をコードするようにランダムに突然変異させることができる。そのことについては、ＸＸＧ／Ｔ突然変異誘発は、それぞれ２０アミノ酸をコードする３２の可能なコドンをもたらす。ＣＴＬＡ４Ｉｇの−Ｍ９７−Ｇ１０７のごく近くにある突然変異をコードするＰＣＲ産物（図５参照）をＳａｃＩ／ＸｂａＩで消化し、同様に切断したＣＴＬＡ４ＩｇπＬＮ発現ベクター内にサブクローニングする。この方法を用いて、シングルサイトＣＴＬＡ４突然変異分子Ｌ１０４ＥＩｇを作成する。
【００５８】
ＣＴＬＡ４ＩｇのＳ２５−Ｒ３３に近い突然変異誘発のために、ＰＣＲプライマー配向性突然変異誘発によって、沈黙ＮｈｅＩ制限サイトを最初にこのループの５’に導入する。ＰＣＲ産物をＮｈｅ／ＸｂａＩで消化し、同様に切断したＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇ発現ベクター内にサブクローニングする。この方法を用いて、ダブルサイトＣＴＬＡ４突然変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを作成する（図６）。特に、シングルサイトＣＴＬＡ４突然変異分子Ｌ１０４ＥＩｇをコードする核酸分子をテンプレートとして用いて、ダブルサイトＣＴＬＡ４突然変異分子Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇを作成する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの配列は図６に示するとおりであり、Ｎ末端リーダー配列を含む。
【００５９】
以下の記載は、非突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇ分子と比べて、ＣＤ８０およびＣＤ８６抗原に対してより高い結合活性を示す、前記の構築物から発現されたングルサイトおよびダブルサイト突然変異ＣＴＬＡ４ポリペプチドの同定に用いるスクリーニング法の説明である。
最新の試験管内および生体内実験では、ＣＴＬＡ４Ｉｇ単独では、抗原特異的活性化Ｔ細胞の初回抗原刺激を完全にブロックすることができないことを述べている。ＣＤ８０またはＣＤ８６に対して特異的なＣＴＬＡ４Ｉｇおよびどちらかのモノクローナル抗体を用いて、Ｔ細胞増殖の阻害を測定する試験管内実験では、抗ＣＤ８０モノクローナル抗体は、ＣＴＬＡ４Ｉｇの阻害を増大しなかったことを述べている。しかし、抗ＣＤ８６モノクローナル抗体は阻害を増大し、このことは、ＣＴＬＡ４Ｉｇが、ＣＤ８６相互作用のブロックにおいて有効ではなかったことを示している。これらのデータは、ＣＤ８０媒介性細胞応答を阻害するには、ＣＤ８６媒介性応答を阻害する場合と比べて、約１００分の１の濃度のＣＴＬＡ４Ｉｇしか必要としないことを明らかにしているＬｉｓｎｌｅｙらの先行知見（７４）をサポートする。これらの知見に基いて、ＣＤ８６に対して、野生型ＣＴＬＡ４よりも、より高いアヴィディティーを有する可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子が、ＣＴＬＡ４よりも、より有効に抗原特異的活性化細胞の初回抗原刺激をブロックすることができることが推測される。
【００６０】
このために、ＣＤ８０およびＣＤ８６に対する結合アヴィディティーを改善するＣＴＬＡ４の細胞外ドメインにおける幾つかの突然変異を同定するための新規なスクリーニング手順を用いて、前述の可溶性ＣＴＬＡ４突然変異分子をスクリーニングする。Ｏ’Ｓｈａｎｎｅｓｓｙら（７５）に記載されているように、“オフ”速度の決定は濃度依存性ではないので、このスクリーニング方策は、タンパク質精製または定量化を必要とすることなく、明らかにより遅い“オフ”速度をもつ突然変異を直接同定する有効な方法を提供する。
個々のミニプレップ精製プラスミドＤＮＡでＣＯＳ細胞をトランスフェクトし、数日間増殖させる。可溶性ＣＤ８０ＩｇまたはＣＤ８６Ｉｇを塗布したＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ ＡＢ， ウプサラ、スウェーデン）に３日間ならし培地を入れる。すべての実験は、２５℃にて、ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭまたはＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ２０００バイオセンサーで行う。標準Ｎ−エチル−Ｎ’−（ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドカップリング（７６、７７）を用いて、リサーチグレードのセンサーチップにリガンドを固定する。
【００６１】
スクリーニング法
２４ウエル組織培養プレートで培養したＣＯＳ細胞を、突然変異ＣＴＬＡ４ＩｇをコードするＤＮＡで一時的にトランスフェクトする。分泌された可溶性突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇを含む培養培地を３日後に採集する。
Ｇｒｅｅｎｅら（７８）の記載にしたがって、ならしＣＯＳ細胞培養培地を、ＣＤ８６ＩｇまたはＣＤ８０Ｉｇで誘導体化したＢＩＡｃｏｒｅバイオセンサーチップに流し、野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇで観察された速度よりも遅い“オフ”速度で、突然変異分子を同定する。選択された培地サンプルに対応するｃＤＮＡの配列決定を行い、より大きい規模のＣＯＳ細胞一時的トランスフェクションを行うように調製したＤＮＡから、培養培地のプロテインＡ精製に続いて、突然変異ＣＴＬＡ４Ｉｇタンパク質を調製する。
Ｇｒｅｅｎｅら（７８）の記載にしたがって、ＢＩＡｃｏｒｅ分析条件および平衡結合データ分析を行う。
【００６２】
ＢＩＡ ｃｏｒｅ データ分析
分析前に、センサーグラムのベースラインを標準化してゼロ応答ユニット（ＲＵ）にする。ｍｏｃｋ誘導体化フローセルにサンプルを流して、溶液間のバルク屈折率の差異によるバックグラウンド応答ユニット（ＲＵ）値を決定する。Ｒ_ｅｑ対Ｃのプロット（ここで、Ｒ_ｅｑは定常状態応答マイナスｍｏｃｋ誘導体化チップ上の応答であり、Ｃはアナライトのモル濃度である）から平衡解離定数（Ｋ_ｄ）を計算する。市販の非線形曲線フィッティングソフトウェア（Ｐｒｉｓｍ、ＧｒａｐｈＰＡＤソフトウェア）を用いて結合曲線を分析する。
まず、単一の受容体へのシングルリガンド結合モデル（１−サイトモデル、すなわちシンプルラングミュアシステム、Ａ＋Ｂ⇔ＡＢ）に実験データをフィットさせ、次いで、式：Ｒ＝Ｒ_ｍａｘ・Ｃ／（Ｋ_ｄ＋Ｃ）から平衡解離定数（Ｋ_ｄ＝［Ａ］・［Ｂ］＼［ＡＢ］）を計算する。続いて、リガンド結合のシンプレスト２−サイトモデル（すなわち、式：Ｒ＝Ｒ_ｍａｘ１・Ｃ＼（Ｋ_ｄ１＋Ｃ）＋Ｒ＝Ｒ_ｍａｘ２・Ｃ＼（Ｋ_ｄ２＋Ｃ）によって表される２つの非相互作用性独立結合サイトを有する受容体への結合モデル）にデータをフィットさせる。
【００６３】
これらの２つのモデルの適合度を、実験データと比較することにより視覚的に分析し、二乗和のＦ検定によって統計的に分析する。２−サイトモデルが有意にすぐれてフィットしない限り（ｐ＜０．１）、最適フィットとして、より単純な１−サイトモデルが選択される。
ＢＩＡ評価２．１ソフトウェア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を用いて、会合および解離分析を行う。ホモジニアスシングルサイト相互作用とパラレル２サイト相互作用の両方を仮定して、２つの方法で会合速度定数ｋ_ｏｎを計算する。シングルサイト相互作用については、式：Ｒ_ｔ＝Ｒ_ｅｑ（１−ｅｘｐ^{−ｋｓ（ｔ−ｔ} _０ ^））にしたがって、ｋ_ｏｎ値を計算する（式中、Ｒ_ｔは所定の時間ｔにおける応答；Ｒ_ｅｑは定常状態における応答；ｔ_０は注入開始時間；およびｋ_ｓ＝ｄＲ／ｄｔ＝Ｃｋ_ｏｆｆである（ここで、Ｃは単量体結合サイトに置き換えて計算したアナライトの濃度である））。２サイト相互作用については、式：Ｒ_ｔ＝Ｒ_ｅｑ１（１−ｅｘｐ^{−ｋｓ１（ｔ−ｔ} _０ ^））＋Ｒ_ｅｑ２（１−ｅｘｐ^{−ｋｓ２（ｔ−ｔ} _０ ^））にしたがって、ｋ_ｏｎ値を計算する。各モデルについて、ｋ_ｓ対Ｃのプロットの計算された傾き（約７０％の最大会合まで）からｋ_ｏｎの値を決定する。
【００６４】
１サイト（ＡＢ＝Ａ＋Ｂ）または２サイト（ＡｉＢｊ＝Ａｉ＋Ｂｊ）モデルにしたがって、解離データを分析し、最良フィット曲線から速度定数（ｋ_ｏｆｆ）を計算する。剰余が機械バックグラウンドよりも大きい場合（２〜１０ＲＵ、機械によって異なる）（この場合２サイト結合モデルを用いる）を除いては、結合サイトモデルを用いる。ｔ_１／２＝０．６９３ｋ_ｏｆｆという関係を用いて受容体占有のハーフタイムを計算する。
【００６５】
フローサイトメトリー
Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ（サンホセ、カリフォルニア）からマウスｍＡｂ Ｌ３０７．４（抗ＣＤ８０）、およびＰｈａｒｍａｃｉａ（サンディエゴ、カリフォルニア）からＩＴ２．２（抗Ｂ７−０［ＣＤ８６としても知られる］）を購入する。免疫染色のために、１０ｍＭのＥＤＴＡを含むリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）中でインキュベートすることによって、ＣＤ８０ポジティブおよび／またはＣＤ８６ポジティブＣＨＯ細胞をそれらの培養容器から除去する。まず、１０％胎児ウシ血清（ＦＢＳ）を含むＤＭＥＭ中、ＣＨＯ細胞（１〜１０×１０^５）をｍＡｂまたは免疫グロブリン融合タンパク質とともにインキュベートし、次いで、洗浄し、フルオレセインイソチオシアネート複合ヤギ抗マウスまたは抗ヒト免疫グロブリン第２ステップ試薬（Ｔａｇｏ、バーリンゲーム、カリフォルニア）とともにインキュベートする。細胞を最終洗浄に付し、ＦＡＣＳｃａｎ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）にて分析する。
【００６６】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィー
トリス／グリシン４〜２０％アクリルアミドゲル（Ｎｏｖｅｘ、サンディエゴ、カリフォルニア）上でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行う。分析用ゲルをクーマシーブルーで染色し、デジタルスキャニングによってウエットゲルのイメージを得る。を含む０．０２％ＮＡＮ_３を含むリン酸緩衝生理食塩水で平衡化したＴＳＫ−ＧＥＬ Ｇ３００ ＳＷ_ＸＬカラム（７．８×３０ｎｍ、Ｔｏｓｏｈａａｓ、モンゴメリービル、ＰＡ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによって、流速１．０ｍｌ／分にて、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（２５μｇ）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（２５μｇ）を分析する。
【００６７】
ＣＴＬＡ４Ｘ _{Ｃ１２０Ｓ} およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸ _{Ｃ１２０Ｓ}
先に述べたとおり（Ｌｉｎｓｌｅｙら， （１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０： １５４１７−１５４２４ （８４））、一本鎖ＣＴＬＡ４ＣＴＬＡ４Ｘ_{Ｃ１２０Ｓ}を調製する。簡単に述べると、オンコスタチンＭ ＣＴＬＡ４（ＯＭＣＴＬＡ４）発現プラスミドをテンプレートとして用い、フォワードプライマーＧＡＧＧＴＧＡＴＡＡＡＧＣＴＴＣＡＣＣＡＡＴＧＧＧＴＧＴＡＣＴＧＣＴＣＡＣＡＣＡＧは、ベクター中の配列とマッチするように選択し、リバースプライマーＧＴＧＧＴＧＴＡＴＴＧＧＴＣＴＡＧＡＴＧＡＡＴＣＡＧＡＡＴＣＴＧＧＧＣＡＣＧＧＴＴＣは、ＣＴＬＡ４の細胞外ドメインの最後の７アミノ酸（すなわち、アミノ酸１１８〜１２４）に対応し、制限酵素サイトおよび終止コドン（ＴＧＡ）を含む。リバースプライマーは、Ｃ１２０Ｓ（１２０位におけるシステインからセリンへ）突然変異を指定する。特に、上記リバースプライマーのヌクレオチド配列ＧＣＡ（ヌクレオチド３４〜３６）が、以下のヌクレオチド配列：ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴまたはＧＣＴのうちの１つで置き換えられる。当業者であれば、ヌクレオチド配列ＧＣＡが、システインに対するコドンＴＧＣの逆相補配列であることを理解するであろう。同様に、ヌクレオチド配列ＡＧＡ、ＧＧＡ、ＴＧＡ、ＣＧＡ、ＡＣＴまたはＧＣＴは、セリンに対するコドンの逆相補配列である。ポリメラーゼ鎖反応産物をＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｂａＩで消化し、発現ベクターπＬＮ（Ｂｒｉｓｔｏｌ−Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｃｏｍｐａｎｙ， プリンストン， ニュージャージー）に直接サブクローニングする。同様の様式で、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＸ_{Ｃ１２０Ｓ}を調製する。各構築物をＤＮＡシーケンシングによって検証する。
【００６８】
高アヴィディティー突然変異体の同定および生化学的特徴付け
突然変異誘発のために２４個のアミノ酸を選択し、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ；上記）によって、得られる〜２３００個の突然変異タンパク質をアッセイする。各サイトにおける突然変異誘発の主な効果を表ＩＩに示す。Ｓ２５−Ｒ３３における幾つかのアミノ酸のランダム突然変異誘発は、明らかにリガンド結合を変更しない。Ｅ３１およびＲ３３ならびにＭ９７−Ｙ１０２の突然変異誘発は、明らかにリガンド結合を減少させる。Ｓ２５、Ａ２９ならびにＴ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３、Ｌ１０４およびＧ１０５の突然変異誘発からは、遅い“オン”および／または“オフ”速度をもつタンパク質が得られる。これらの結果から、Ｓ２５−Ｒ３３領域にある残基およびＭ９７−Ｙ１０２にあるかまたはその近傍にある残基は、リガンド結合に影響を及ぼすという先の知見（Ｐｅａｃｈら， （１９９４） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ．， １８０ ： ２０４９−２０５８ （８５））が確認される。
【００６９】
サイトＳ２５、Ｔ３０、Ｋ９３、Ｌ９６、Ｙ１０３およびＧ１０５の突然変異誘発から、ＣＤ８６Ｉｇからのより遅い“オフ”速度をもつ幾つかの突然変異タンパク質が同定される。しかし、これらの場合、遅い“オフ”速度は、遅い“オン”速度によって損なわれ、野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇに見られるものと明らかに同種のＣＤ８６Ｉｇに対する全体的アヴィディティーをもつ突然変異タンパク質が生じる。さらに、Ｋ９３の突然変異誘発からは、観察される動態的変化の原因であった有意な集合が生じる。Ｌ１０４のランダム突然変異誘発に続くＣＯＳ細胞トランスフェクションおよびＳＰＲによる固定化ＣＤ８６Ｉｇ上の培養培地サンプルのスクリーニングから、野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも約２倍遅い“オフ”速度をもつ突然変異タンパク質を含んでいる６つの培地サンプルが得られる。これらの突然変異に対応するｃＤＮＡのシーケンシングを行うと、それぞれロイシンからグルタミン酸への突然変異（Ｌ１０４Ｅ）をコードすることが見出される。明らかに、アスパラギン酸へのロイシン１０４の置換は、ＣＤ８６Ｉｇ結合に影響を及ぼさない。
【００７０】
次いで、表ＩＩに挙げた各サイトにて突然変異誘発を繰り返すが、この時は、前述の野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇの代りにＰＣＲテンプレートとしてＬ１０４Ｅを用いる。再度固定化ＣＤ８６Ｉｇを用いるＳＰＲ分析により、野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも約４倍のより遅い“オフ”速度をもつタンパク質におけるアラニン２９の突然変異誘発から、６つの培養培地サンプルが同定される。最も遅い２つはチロシン置換（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙ）であり、２つはロイシン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｌ）、１つはトリプトファン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｗ）および１つはトレオニン（Ｌ１０４ＥＡ２９Ｔ）である。明らかに、野生型ＣＴＬＡ４Ｉｇにおいてアラニン２９が単独でランダムに突然変異を起こす場合には、遅い“オフ”速度の突然変異体は同定されない。
【００７１】
ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって、精製Ｌ１０４ＥおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの相対分子量および集合の状態をアッセイする。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（〜１μｇ；レーン３）およびＬ１０４ＥＩｇ（〜１μｇ；レーン２）は、還元（〜５０ｋＤａ；＋βＭＥ；プラス２−メルカプトエタノール）および非還元（〜１００ｋＤａ；＋βＭＥ）条件下、明らかに、ＣＴＬＡ４Ｉｇ（〜１μｇ；レーン１）と同じ電気泳動移動度をもつ（図７Ａ）。サイズ排除クロマトグラフィーから、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図７Ｃ）が、明らかに、二量体ＣＴＬＡ４Ｉｇ（図７Ｂ）と同じ移動度をもつことが立証される。大きいピークは、タンパク質二量体を表すが、図７Ｂ中のより早く溶離している小さいピークは、より分子量の大きい集合体を表す。約５．０％のＣＴＬＡ４Ｉｇが、より分子量の大きい集合体として存在するが、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇの集合の証拠はない。したがって、Ｌ１０４ＥＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇに見られるＣＤ８６Ｉｇへのより強い結合を、突然変異誘発によって誘発される集合の原因とすることはできない。
【００７２】
平衡および動態結合分析
表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）を用い、タンパク質Ａ精製ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇにおいて平衡および動態結合分析を行う。結果を表Ｉに示す。濃度範囲（５．０〜２００ｎＭ）にわたって作成された結合曲線から、観察された平衡解離定数（Ｋ_ｄ；表Ｉ）を計算する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、Ｌ１０４ＥＩｇまたはＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強くＣＤ８６Ｉｇに結合する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（３．２１ｎＭ）が、Ｌ１０４ＥＩｇ（６．０６ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（１３．９ｎＭ）よりも低いＫ_ｄをもつことは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＣＤ８６Ｉｇに対する結合アヴィディティーがより高いことを示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（３．６６ｎＭ）が、Ｌ１０４ＥＩｇ（４．４７ｎＭ）またはＣＴＬＡ４Ｉｇ（６．５１ｎＭ）よりも低いＫ_ｄをもつことは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのＣＤ８０Ｉｇに対する結合アヴィディティーがより高いことを示す。
【００７３】
動態結合分析から、ＣＤ８０に対するＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの結合の比較的“オン”速度は、ＣＤ８６Ｉｇに対する“オン”速度と同様に、類似していることが示される（表Ｉ）。しかし、これらの分子の“オフ”速度は、等価ではない（表Ｉ）。ＣＴＬＡ４Ｉｇと比べて、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、約２倍遅いＣＤ８０Ｉｇからの“オフ”速度をもち、約４倍遅いＣＤ８６Ｉｇからの“オフ”速度をもつ。Ｌ１０４ＥＩｇは、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇとＣＴＬＡ４Ｉｇの中間の“オフ”速度をもつ。これらの突然変異の導入は、“オン”速度に有意に影響を及ぼされないので、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇにおいて観察されるＣＤ８０ＩｇおよびＣＤ８６Ｉｇに対するアヴィディティーの増大は、主として、“オフ”速度の低下によるものであると考えられる。
【００７４】
ＣＤ８６ＩｇおよびＣＤ８０Ｉｇに対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのアヴィディティーの増大が、各単量体が二量体として会合する方法に影響を及ぼしている突然変異によるものかどうか、または各単量体に導入されるアヴィディティー増強性構造変化があるかどうかを決定するために、前述（Ｌｉｎｓｌｅｙら，（１９９５） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７０： １５４１７−１５４２４ （８４））のシステイン１２０からセリンへの突然変異誘発にしたがって、ＣＴＬＡ４ＩｇおよびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの細胞外ドメインの一本鎖構築物を調製する。ＳＰＲによってそれらのリガンド結合特性を分析する前に、ゲル浸透クロマトグラフィー（Ｌｉｎｓｌｅｙら，（１９９５），前記（８４））によって精製タンパク質ＣＴＬＡ４Ｘ_{Ｃ１２０Ｓ}およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＸ_{Ｃ１２０Ｓ}が単量体であることが示される。結果から、ＣＤ８６Ｉｇに対する両方の単量体タンパク質の結合親和性は、それぞれの二量体に見られるもの約３５〜８０分の１であることが示される（表Ｉ）。このことは、高いアヴィディティーリガンド結合にはＣＴＬＡ４の二量体化が必要であるということを立証している先に公表されたデータ（Ｇｒｅｅｎｅら， （１９９６） Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．， ２７１： ２６７６２−２６７７１ （７８））をサポートする。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＸ_{Ｃ１２０Ｓ}は、ＣＤ８０ＩｇおよびＣＤ８６Ｉｇの両方に対して、ＣＴＬＡ４Ｘ_{Ｃ１２０Ｓ}よりも約２倍高い親和性で結合する。増大した親和性は、両方のリガンドからの解離速度が約３倍遅いことによる。したがって、Ｌ１０４ＥＡ２９Ｙによる、より強いリガンド結合は、分子が二量体化される変化よりもむしろ各単量体鎖に導入されるアヴィディティー増強性構造変化によるものと考えられる。
【００７５】
アヴィディティー増強性突然変異の位置および構造分析
近年、ＮＭＲ分光分析によって、ＣＴＬＡ４の細胞外ＩｇＶ様ドメインの溶液構造が決定されている（Ｍｅｔｚｌｅｒら， （１９９７） Ｎａｔｕｒｅ Ｓｔｒｕｃｔ． Ｂｉｏｌ．， ４： ５２７−５３１ （８６））。このことによって、三次元折り畳みにおけるロイシン１０４およびアラニン２９の正確な位置が与えられる（図８Ａ〜Ｂ）。ロイシン１０４は、高度に保存されたＭＹＰＰＰＹアミノ酸配列の近くに位置している。アラニン２９は、Ｓ２５−Ｒ３３領域のＣ末端の近くに位置しており、ＭＹＰＰＰＹ領域に空間的に隣接する。これらの２つの領域の基底においては残基の間に有意な相互作用があるのに対して、Ｌ１０４とＡ２９の間には、それらの両方がタンパク質中の近接する疎水性コアの部分を構成するのだが、直接的相互作用は明らかにない。２つのアヴィディティー増強性突然変異の構造的結果をモデリングによって評価する。Ａ２９Ｙ突然変異は、Ｓ２５−Ｒ３３領域とＭＹＰＰＹ領域の間の間隙に容易に収容することができ、ＭＹＰＰＹ領域のコンホメーションを安定化するのに役立つ。野生型ＣＴＬＡ４では、Ｌ１０４は、ＭＹＰＰＰＹ領域に近いＬ９６およびＶ９４との広範な疎水性相互作用を形成する。２つの理由から、グルタミン酸突然変異がＬ１０４のコンホメーションに類似したコンホメーションを採用することはまったくありそうもない。第１には、Ｓ２５−Ｒ３３領域に対する相当な動揺なしに、より長いグルタミン酸側鎖を構造内に収容するには不十分な空間しかない。第２には、疎水性領域におけるグルタミン酸側鎖の負の電荷を覆い隠すエネルギー的損失が大きいことである。その代りに、モデリング実験から、グルタミン酸側鎖が、その電荷が溶媒和によって安定化されうる表面上にはじきだされることが予測される。このようなコンホメーションの変化は、領域内の他の残基に対する最小の歪みをともなって、Ｇ１０５により、容易に収容されうる。
【００７６】
ＣＤ８０またはＣＤ８６を発現しているＣＨＯ細胞への高アヴィディティー突然変異体の結合
ＣＴＬＡ４およびトランスフェクトされたＣＤ８０＋およびＣＤ８６＋ＣＨＯ細胞に安定に結合している突然変異分子のＦＡＣＳ分析（図９）を行う。ＣＴＬＡ４Ｉｇ、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇまたはＬ１０４ＥＩｇの濃度を増加しながらＣＤ８０ポジティブおよびＣＤ８６ポジティブＣＨＯ細胞をインキュベートし、次いで、洗浄する。フルオレセインイソチオシアネート複合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンを用いて、結合した免疫グロブリン融合タンパク質を検出する。
図９に示すように、ＣＤ８０ポジティブまたはＣＤ８６ポジティブＣＨＯ細胞（１．５×１０^５）を指示された濃度のＣＴＬＡ４Ｉｇ（四角）、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（丸）またはＬ１０４ＥＩｇ（三角）とともに２３℃にて２時間インキュベートし、洗浄し、次いで、フルオレセインイソチオシアネート複合ヤギ抗ヒト免疫グロブリンとともにインキュベートする。ＦＡＣＳｃａｎで総数５０００個の生存能力のある細胞上の結合を分析し（１回測定）、ＰＣ−ＬＹＳＹＳを用いてデータヒストグラムから平均蛍光強度（ＭＦＩ）を決定する。第２ステップ試薬のみとともにインキュベートした細胞上で測定されたバックグラウンド蛍光（ＭＦＩ＝７）に対してデータを補正する。コントロールＬ６ｍＡｂ（８０μｇ／ｍｌ）は、ＭＦＩ＜３０である。これらの結果は、４回の独立実験の代表的なものである。
ヒトＣＤ８０トランスフェクトＣＨＯ細胞へのＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＣＴＬＡ４の結合は、明らかに等価である（図９Ａ）。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＬ１０４ＥＩｇは、ヒトＣＤ８６に安定にトランスフェクトされたＣＨＯ細胞に、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強く結合する（図９Ｂ）。
【００７７】
機能アッセイ
免疫磁性ネガティブセレクション（Ｌｉｎｓｌｅｙら、（１９９２） Ｊ． Ｅｘｐ． Ｍｅｄ． １７６： １５９５−１６０４ （８３））によって、ヒトＣＤ４ポジティブＴ細胞を単離する。滴定濃度のインヒビターの存在下、酢酸ミリスチン酸ホルボール（ＰＭＡ）＋ＣＤ８０ポジティブまたはＣＤ８６ポジティブＣＨＯ細胞で、単離したＣＤ４ポジティブＴ細胞を刺激する。照射ＣＨＯ細胞スティミュレーターを含むかまたは含まない１ｎＭ ＰＭＡの存在下、ＣＤ４ポジティブＴ細胞（８〜１０×１０^４個／ウエル）を培養する。７２時間の培養中、最後の７時間に１μＣｉ／ウエルの［３Ｈ］チミジンを添加することによって、増殖性応答を測定する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＬ１０４ＥＩｇにより、ＰＭＡ＋ＣＤ８０ポジティブＣＨＯまたはＣＤ８６ポジティブＣＨ刺激Ｔ細胞の阻害が行われる。結果を図１０に示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＤ８０ポジティブＰＭＡ処理ＣＨＯ細胞の増殖をＣＴＬＡ４Ｉｇよりも強く阻害する（図１０Ａ）。またＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、ＣＤ８６ポジティブＰＭＡ処理ＣＨＯ細胞の増殖の阻害においても、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効である（図１０Ｂ）。したがって、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、Ｔ細胞のＣＤ８０およびＣＤ８６媒介性共刺激のより強力なインヒビターである。
【００７８】
図１１は、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇによる、前述のように調製した異種刺激ヒトＴ細胞、ならびに、さらにＣＤ８０およびＣＤ８６を発現するＰＭと称されるヒトＢリンパ芽球細胞系（ＬＣＬ）で異種刺激したヒトＴ細胞の阻害を示す（Ｔ細胞は３．０×１０^４個／ウエルであり、ＰＭは８．０×１０^３個／ウエルである）。一次異種刺激を６日間行ない、次いで、該細胞に^３Ｈチミジンを７時間適用した後、放射標識の取り込みを測定する。
二次刺激は、以下のように行う。７日間一次異種刺激したＴ細胞をリンパ球分離培地（ＬＳＭ）（ＩＣＮ、オーロラ、オハイオ）上で収穫し、２４時間休止させる。次いで、滴定量のＣＴＬＡ４ＩｇまたはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの存在下、上記と同じ比率でＰＭを加えることによって、Ｔ細胞を再刺激（二次）する。刺激を３日間行い、次いで、細胞に放射標識を適用し、上記のように収穫する。一次異種刺激Ｔ細胞におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果を図１１Ａに示す。二次異種刺激Ｔ細胞におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇの効果を図１１Ｂに示す。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、一次および二次Ｔ細胞増殖応答の両方を、ＣＴＬＡ４よりも強く阻害する。
【００７９】
サイトカイン産生を測定するために（図１２）、二重の二次異種刺激プレートを組み立てる。３日後、使用説明書の条件に従い、ＥＬＩＳＡキット（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ、カマリロ、カリフォルニア）を用いて培養培地をアッセイする。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、二次異種刺激後のＴ細胞ＩＬ−２、ＩＬ−４およびγ−ＩＦＮサイトカイン産生のブロックにおいて、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも、より強力であることが見出される（図１２Ａ〜Ｃ）。
サル混合リンパ球応答（ＭＬＲ）におけるＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの効果を図１３に示す。二匹のサルからの末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ’Ｓ；各サルから３．５×１０^４細胞／ウエル）をリンパ球分離培地（ＬＳＭ）上で精製し、２μｇ／ｍｌのフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）と混合する。細胞を３日間刺激し、次いで、放射標識を１６時間適用した後、収穫する。Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇは、サルＴ細胞増殖をＣＴＬＡ４Ｉｇよりも、より強く阻害する。
【００８０】
【表３】

【００８１】
【表４】

【００８２】
（参考文献）
【表５】

【００８３】
【表６】

【００８４】
【表７】

【００８５】
【表８】

【００８６】
【表９】

【００８７】
【表１０】

【００８８】
【表１１】

【００８９】
【表１２】

【００９０】
【表１３】

【００９１】
【表１４】

【図面の簡単な説明】
【図１】実施例１に記載した、皮膚移植拒絶反応速度における可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよびモノクローナル抗体ＭＲ１および抗ＬＦＡ−１の効果を示すグラフである。
【図２】実施例２に記載した、心臓移植拒絶反応速度における可溶性ＣＴＬＡ４−Ｉｇおよびモノクローナル抗体ＭＲ１および抗ＬＦＡ−１の効果を示すグラフである。
【図３】実施例２に記載した、マウス異所心臓移植モデルにおける、移植ならびに可溶性ＣＴＬＡ４およびモノクローナル抗体ＭＲ１および抗ＬＦＡ−１による処置後の心筋残存パーセンテージを示す。
【図４】実施例２に記載した、マウス異所心臓移植モデルにおける、移植ならびに可溶性ＣＴＬＡ４およびモノクローナル抗体ＭＲ１および抗ＬＦＡ−１による処置後の炎症重篤度スコアを示す。
【図５】実施例３に記載した、分子のＮ末端に結合したリーダー配列をもつヒトＣＴＬＡ４Ｉｇのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図６】実施例３に記載した、分子のＮ末端に結合したリーダー配列をもつヒトＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇのアミノ酸および核酸配列を示す。
【図７】ＣＴＬＡ４Ｉｇ（レーン１）、Ｌ１０４ＥＩｇ（レーン２）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（レーン３Ａ）のＳＤＳゲル（図７Ａ）；およびＣＴＬＡ４Ｉｇ（図７Ｂ）およびＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（図７Ｃ）のサイズ排除クロマトグラフィーである。
【図８Ａおよび８Ｂ】図８Ａおよび８Ｂは、ＮＭＲ分光分析によって決定された溶液構造から作成されたＣＴＬＡ４細胞外ＩｇＶ様折り畳みのリボン図である。図８Ｂは、アヴィディティー増強突然変異Ｌ１０４およびＡ２９の位置および側鎖配向を示しているＳ２５−Ｒ３３領域およびＭＹＰＰＰＹ領域の拡大図を示す。
【図９Ａおよび９Ｂ】実施例３に記載した、ヒトＣＤ８０またはＣＤ８６トランスフェクトＣＨＯ細胞に対するＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ、Ｌ１０４ＥＩｇおよびＣＴＬＡ４Ｉｇの結合を示すＦＡＣＳアッセイのデータを示す。
【図１０Ａおよび１０Ｂ】実施例３に記載した、ＣＤ８０ポジティブおよびＣＤ８６ポジティブＣＨＯ細胞の増殖の阻害を示す。
【図１１Ａおよび１１Ｂ】実施例３に記載した、一次および二次異種刺激されたＴ細胞の増殖の阻害において、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効であることを示す。
【図１２Ａ〜Ｃ】実施例３に記載した、異種刺激されたヒトＴ細胞のＩＬ−２（図１２Ａ）、ＩＬ−４（図１２Ｂ）およびγインターフェロン（図１２Ｃ）サイトカイン産生の阻害において、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効であることを示す。
【図１３】実施例３に記載した、フィトヘマグルチニン（ＰＨＡ）刺激されたサルＴ細胞の増殖の阻害において、Ｌ１０４ＥＡ２９ＹＩｇが、ＣＴＬＡ４Ｉｇよりも有効であることを示す。

Claims (36)

1. ａ．ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＢ７を結合することによって、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７媒介性シグナルをブロックする第１作用剤；
   ｂ．ＣＤ４０またはＣＤ１５４のいずれかを結合することによって、ＣＤ４０／ＣＤ１５４媒介性シグナルをブロックする第２作用剤；および
   ｃ．ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１に結合することによって、接着分子媒介性相互作用をブロックする第３作用剤；
   を投与することによって細胞性免疫応答を調節することを含む細胞性免疫応答の調節方法。
2. 請求項１記載の方法によって細胞性免疫応答を調節することによる免疫系疾患の治療方法。
3. ａ．ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＢ７を結合することによって、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７媒介性シグナルをブロックする第１作用剤；
   ｂ．ＣＤ４０またはＣＤ１５４のいずれかを結合することによって、ＣＤ４０／ＣＤ１５４媒介性シグナルをブロックする第２作用剤；および
   ｃ．ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１に結合することによって、接着分子媒介性相互作用をブロックする第３作用剤；
   を患者に投与することによって免疫系疾患を阻害することを含む患者における免疫系疾患の阻害方法。
4. ａ．ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＢ７を結合することによって、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７媒介性シグナルをブロックする第１作用剤；
   ｂ．ＣＤ４０またはＣＤ１５４のいずれかを結合することによって、ＣＤ４０／ＣＤ１５４媒介性シグナルをブロックする第２作用剤；および
   ｃ．ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１に結合することによって、接着分子媒介性相互作用をブロックする第３作用剤；
   を移植片を有する患者に投与することによって移植片拒絶反応に対する細胞性免疫応答を阻害することを含む患者における移植片拒絶反応の阻害方法。
5. 第１作用剤がＢ７を結合し、可溶性ＣＴＬＡ４分子、可溶性ＣＤ２８分子または抗Ｂ７モノクローナル抗体であり；第１作用剤がＣＴＬＡ４を結合し、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体または可溶性Ｂ７分子であり；および／または第１作用剤がＣＤ２８を結合し、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体または可溶性抗Ｂ７分子である請求項１、３または４記載の方法。
6. 可溶性ＣＴＬＡ４分子がＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２９）またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（ＡＴＣＣ　ＰＴＡ２１０４）であり；可溶性ＣＤ２８分子がＣＤ２８Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２８）であり；可溶性Ｂ７分子がＢ７Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２７）であり；抗Ｂ７モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−２５３、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２２３、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２２６、ＡＴＣＣ　ＨＢ−３０１またはＡＴＣＣ　ＨＢ−１１３４１であり；抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−３０４であり；抗ＣＤ２８モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ１１９４４またはｍＡｂ９．３である請求項５記載の方法。
7. 第２作用剤がＣＤ１５４を結合し、抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体であり；および／または第２作用剤がＣＤ４０を結合し、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である請求項１、３または４記載の方法。
8. 抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体がＭＲ１、ＡＴＣＣ　ＨＢ−１０９１６、ＡＴＣＣ　ＨＢ−１２０５５またはＡＴＣＣ　ＨＢ−１２０５６であり、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−９１１０である請求項７記載の方法。
9. 第３作用剤がＬＦＡ−１を結合し、抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体であり；第３作用剤がＩＣＡＭ−１を結合し、抗ＩＣＡＭ−１抗体であり；第３作用剤がＩＣＡＭ−２を結合し、抗ＩＣＡＭ−２抗体であり；第３作用剤がＩＣＡＭ−３を結合し、抗ＩＣＡＭ−３抗体であり；第３作用剤がαアクチニンを結合し、抗αアクチニン抗体であり；第３作用剤がフラミンを結合し、抗フラミン抗体であり；第３作用剤がサイトヘシン−１を結合し、抗サイトヘシン−１抗体であり；第３作用剤がＣＤ１８を結合し、抗ＣＤ１８抗体であり；および／または第３作用剤がＣＤ１１ａを結合し、抗ＣＤ１１ａ抗体である請求項１、３または４記載の方法。
10. 第３作用剤がＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１のいずれかを結合し、可溶性ＬＦＡ−１であり；および／または第３作用剤がＬＦＡ−１に結合し、可溶性ＩＣＡＭ−１、可溶性ＩＣＡＭ−２、可溶性ＩＣＡＭ−３、可溶性αアクチニン、可溶性フィラミンまたは可溶性サイトヘシン−１である請求項１、３または４記載の方法。
11. 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−９５７９またはＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１３であり；抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１８７８またはＡＴＣＣ　ＨＢ−２３３であり；抗ＣＤ１１ａモノクローナル抗体がＭ１７／５．２（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２３７）、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２０２、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２４４またはＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１７であり；抗ＣＤ１８モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−２０３、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２２６またはＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１８であり；および抗αアクチニンモノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２５２である請求項１０記載の方法。
12. 接着分子媒介性相互作用をブロックする第３作用剤がＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミン、サイトヘシン−１相互作用をブロックする請求項１、３または４記載の方法。
13. 免疫系疾患が、移植片対宿主病（ＧＶＨＤ）、乾癬、移植片拒絶反応関連免疫障害、Ｔ細胞リンパ腫、Ｔ細胞急性リンパ芽球白血病、精巣血管中枢Ｔ細胞リンパ腫、良性リンパ球脈管炎、狼瘡（たとえば、紅斑性狼蒼、腎炎性狼蒼）、橋本甲状腺炎、原発性粘液水腫、グレーブス病、悪性貧血、自己免疫萎縮性胃炎、アジソン病、糖尿病（たとえば、インスリン依存型糖尿病、Ｉ型糖尿病）、グッドパスチャー症候群、重症筋無力症、天疱瘡、クローン病、交感神経性眼炎、自己免疫ブドウ膜炎、多発性硬化症、自己免疫溶血性貧血、突発性血小板減少症、原発性胆汁性肝硬変、慢性活動性肝炎、潰瘍性大腸炎、シェーグレン症候群、リウマチ性疾患（たとえば、慢性関節リウマチ）、多発性筋炎、強皮症および混合性結合組織病からなるグループから選択される請求項２または３記載の方法。
14. 第１、第２および第３作用剤を局所的または全身的に投与する請求項１、３または４記載の方法。
15. 第１、第２および第３作用剤を連続的または同時に投与する請求項１、３または４記載の方法。
16. ヒト、有尾サル、無尾サル、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ウサギ、マウスおよびラットからなるグループから患者を選択する請求項３または４記載の方法。
17. ａ．可溶性ＣＴＬＡ４である第１作用剤；および
    ｂ．抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体である第２作用剤；および
    ｃ．抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体である第３作用剤；
    で細胞性免疫応答を阻害してブロックすることによる免疫系疾患の調節方法。
18. ａ．可溶性ＣＴＬＡ４である第１作用剤；および
    ｂ．抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体である第２作用剤；および
    ｃ．抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体である第３作用剤；
    で移植片に対する細胞性免疫応答を阻害してブロックすることによる同種異系移植片拒絶反応の阻害方法。
19. ａ．ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＢ７を結合することによって、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７媒介性シグナルをブロックする第１作用剤；
    ｂ．ＣＤ４０またはＣＤ１５４のいずれかを結合することによって、ＣＤ４０／ＣＤ１５４媒介性シグナルをブロックする第２作用剤；および
    ｃ．ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１に結合することによって、接着分子媒介性相互作用をブロックする第３作用剤；
    である第１、第２および第３作用剤を含む医薬組成物。
20. ａ．ＣＤ２８、ＣＴＬＡ４またはＢ７を結合することによって、ＣＤ２８／ＣＴＬＡ４／Ｂ７媒介性シグナルをブロックする第１作用剤；
    ｂ．ＣＤ４０またはＣＤ１５４のいずれかを結合することによって、ＣＤ４０／ＣＤ１５４媒介性シグナルをブロックする第２作用剤；および
    ｃ．ＬＦＡ−１、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１に結合することによって、接着分子媒介性相互作用をブロックする第３作用剤；
    である有効量の第１、第２および第３作用剤を含む移植片拒絶反応の治療用キット。
21. コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（Ｃｏｘ−２インヒビターなど）、シクロスポリンプレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキセート、ＴＮＦαブロッカーまたはアンタゴニスト、インフリキシマブ、炎症性サイトカインを標的とするいずれかの生物学的作用剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾプリン、金塩、エタネルセプトおよびアナキンラからなるグループから選ばれる少なくとも１種の免疫抑制剤をさらに含む請求項１９記載の医薬組成物。
22. 第１作用剤がＢ７を結合し、可溶性ＣＴＬＡ４分子、可溶性ＣＤ２８分子または抗Ｂ７モノクローナル抗体であり；第１作用剤がＣＴＬＡ４を結合し、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体または可溶性Ｂ７分子であり；および／または第１作用剤がＣＤ２８を結合し、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体または可溶性抗Ｂ７分子である請求項１９記載の医薬組成物。
23. 可溶性ＣＴＬＡ４分子がＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２９）またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（ＡＴＣＣ　ＰＴＡ２１０４）であり；可溶性ＣＤ２８分子がＣＤ２８Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２８）であり；可溶性Ｂ７分子がＢ７Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２７）であり；抗Ｂ７モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−２５３、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２２３、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２２６、ＡＴＣＣ　ＨＢ−３０１またはＡＴＣＣ　ＨＢ−１１３４１であり；抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−３０４であり；抗ＣＤ２８モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ１１９４４またはｍＡｂ９．３である請求項２２記載の医薬組成物。
24. 第２作用剤がＣＤ１５４を結合し、抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体であり；および／または第２作用剤がＣＤ４０を結合し、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である請求項１９記載の医薬組成物。
25. 抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体がＭＲ１、ＡＴＣＣ　ＨＢ−１０９１６、ＡＴＣＣ　ＨＢ−１２０５５またはＡＴＣＣ　ＨＢ−１２０５６であり、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−９１１０である請求項２４記載の医薬組成物。
26. 第３作用剤がＬＦＡ−１を結合し、抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体であり；第３作用剤がＩＣＡＭ−１を結合し、抗ＩＣＡＭ−１抗体であり；第３作用剤がＩＣＡＭ−２を結合し、抗ＩＣＡＭ−２抗体であり；第３作用剤がＩＣＡＭ−３を結合し、抗ＩＣＡＭ−３抗体であり；第３作用剤がαアクチニンを結合し、抗αアクチニン抗体であり；第３作用剤がフラミンを結合し、抗フラミン抗体であり；第３作用剤がサイトヘシン−１を結合し、抗サイトヘシン−１抗体であり；第３作用剤がＣＤ１８を結合し、抗ＣＤ１８抗体であり；および／または第３作用剤がＣＤ１１ａを結合し、抗ＣＤ１１ａ抗体である請求項１９記載の医薬組成物。
27. 第３作用剤がＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１のいずれかを結合し、可溶性ＬＦＡ−１であり；および／または第３作用剤がＬＦＡ−１に結合し、可溶性ＩＣＡＭ−１、可溶性ＩＣＡＭ−２、可溶性ＩＣＡＭ−３、可溶性αアクチニン、可溶性フィラミンまたは可溶性サイトヘシン−１である請求項１９記載の医薬組成物。
28. 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−９５７９またはＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１３であり；抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１８７８またはＡＴＣＣ　ＨＢ−２３３であり；抗ＣＤ１１ａモノクローナル抗体がＭ１７／５．２（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２３７）、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２０２、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２４４またはＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１７であり；抗ＣＤ１８モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−２０３、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２２６またはＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１８であり；および抗αアクチニンモノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２５２である請求項２７記載の医薬組成物。
29. コルチコステロイド、非ステロイド性抗炎症薬（Ｃｏｘ−２インヒビターなど）、シクロスポリンプレドニゾン、アザチオプリン、メトトレキセート、ＴＮＦαブロッカーまたはアンタゴニスト、インフリキシマブ、炎症性サイトカインを標的とするいずれかの生物学的作用剤、ヒドロキシクロロキン、スルファサラゾプリン、金塩、エタネルセプトおよびアナキンラからなるグループから選ばれる少なくとも１種の免疫抑制剤をさらに含む請求項２０記載のキット。
30. 第１作用剤がＢ７を結合し、可溶性ＣＴＬＡ４分子、可溶性ＣＤ２８分子または抗Ｂ７モノクローナル抗体であり；第１作用剤がＣＴＬＡ４を結合し、抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体または可溶性Ｂ７分子であり；および／または第１作用剤がＣＤ２８を結合し、抗ＣＤ２８モノクローナル抗体または可溶性抗Ｂ７分子である請求項２０記載のキット。
31. 可溶性ＣＴＬＡ４分子がＣＴＬＡ４Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２９）またはＬ１０４ＥＡ２９ＹＩｇ（ＡＴＣＣ　ＰＴＡ２１０４）であり；可溶性ＣＤ２８分子がＣＤ２８Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２８）であり；可溶性Ｂ７分子がＢ７Ｉｇ（ＡＴＣＣ６８６２７）であり；抗Ｂ７モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−２５３、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２２３、ＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２２６、ＡＴＣＣ　ＨＢ−３０１またはＡＴＣＣ　ＨＢ−１１３４１であり；抗ＣＴＬＡ４モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−３０４であり；抗ＣＤ２８モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ１１９４４またはｍＡｂ９．３である請求項３０記載のキット。
32. 第２作用剤がＣＤ１５４を結合し、抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体であり；および／または第２作用剤がＣＤ４０を結合し、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体である請求項２０記載のキット。
33. 抗ＣＤ１５４モノクローナル抗体がＭＲ１、ＡＴＣＣ　ＨＢ−１０９１６、ＡＴＣＣ　ＨＢ−１２０５５またはＡＴＣＣ　ＨＢ−１２０５６であり、抗ＣＤ４０モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−９１１０である請求項３２記載のキット。
34. 第３作用剤がＬＦＡ−１を結合し、抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体であり；第３作用剤がＩＣＡＭ−１を結合し、抗ＩＣＡＭ−１抗体であり；第３作用剤がＩＣＡＭ−２を結合し、抗ＩＣＡＭ−２抗体であり；第３作用剤がＩＣＡＭ−３を結合し、抗ＩＣＡＭ−３抗体であり；第３作用剤がαアクチニンを結合し、抗αアクチニン抗体であり；第３作用剤がフラミンを結合し、抗フラミン抗体であり；第３作用剤がサイトヘシン−１を結合し、抗サイトヘシン−１抗体であり；第３作用剤がＣＤ１８を結合し、抗ＣＤ１８抗体であり；および／または第３作用剤がＣＤ１１ａを結合し、抗ＣＤ１１ａ抗体である請求項２０記載のキット。
35. 第３作用剤がＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＩＣＡＭ−３、αアクチニン、フィラミンまたはサイトヘシン−１のいずれかを結合し、可溶性ＬＦＡ−１であり；および／または第３作用剤がＬＦＡ−１に結合し、可溶性ＩＣＡＭ−１、可溶性ＩＣＡＭ−２、可溶性ＩＣＡＭ−３、可溶性αアクチニン、可溶性フィラミンまたは可溶性サイトヘシン−１である請求項２０記載のキット。
36. 抗ＬＦＡ−１モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−９５７９またはＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１３であり；抗ＩＣＡＭ−１モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＣＲＬ−１８７８またはＡＴＣＣ　ＨＢ−２３３であり；抗ＣＤ１１ａモノクローナル抗体がＭ１７／５．２（ＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２３７）、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２０２、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２４４またはＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１７であり；抗ＣＤ１８モノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＨＢ−２０３、ＡＴＣＣ　ＨＢ−２２６またはＡＴＣＣ　ＴＩＢ−２１８であり；および抗αアクチニンモノクローナル抗体がＡＴＣＣ　ＣＲＬ−２２５２である請求項３５記載のキット。

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