BG107210A

BG107210A - Разтворими ctla4 мутантни молекули и тяхното използване

Info

Publication number: BG107210A
Application number: BG107210A
Authority: BG
Inventors: Robert Peach; Joseph NAEMURA; Peter Linsley; Jurgen Bajorath
Original assignee: Bristol-Myers Squibb Company
Priority date: 2000-05-26
Filing date: 2002-10-22
Publication date: 2003-06-30
Also published as: BG65928B1; NZ522031A

Abstract

Изобретението се отнася до разтворими CTLA4 мутантни молекули, които са по-склонни да се свързват към CD80 и/или CD86 антиген, отколкото към див тип СТLA4 или немутирал СТLA4Ig. Разтворимите CTLA4 молекули имат първа аминокиселинна последователност,съдържаща извънклетъчен домен от СТLA4, където някои аминокиселинни остатъци в S25-R33 областта и М97 - G107 областта са мутирали. Мутантните молекули могат също така да включват втора аминокиселиннапоследователност, която повишава разтворимостта им.

Description

ОБЛАСТ НА ТЕХНИКАТА

Настоящето изобретение се отнася до разтворими CTLA4 молекули, които са мутирали от див тип CTLA4, да задържат способността да се свързват към CD80 и/или CD86.

ПРЕДШЕСТВУВАЩО СЪСТОЯНИЕ НА ТЕХНИКАТА

Антиген-неспецифични междумолекулни взаимодействия между Т-лимфоцити и антиген-представящи клетки (APCs) генерират Т клетъчни костимулаторни сигнали, които генерират Т клетъчни отговори към антиген (Jenkins and Johnson (1993) Curr. Opin. Immunol. 5:361-367). Костимулаторните сигнали определят величината на Т клетъчните отговори към антигена, и дали този отговор активира, или инактивира следващите отговори към антигена (Mueller et al. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: 445-480).

T клетъчно активиране в отсъствието на костимулиране води до несполучлив, или anergic Т клетъчен отговор (Schwartz, R. Н. (1992) Cell 71:1065-1068). Един ключов костимулаторен сигнал се осигурява чрез взаимодействие на Т клетъчния повърхностен рецептор CD28 с В7 свързани молекули на антиген представящи клетки (например, също така известни като С В7-1 и В7-2, или CD80 и CD86, съответно) (Р. Linsley and J.

Ledbetter (1993) Annu. Rev. Immunol. 11:191-212).

Молекулата, известна сега като CD80 (В7-1) е описана оригинално като асоцииран с човешка В клетка активационен антиген (Yokochi, Т et al. (1981) J. Immunol. 128:823-827; Freeman, G. J. et al. (1989) J. Immunol 143:2714-2722), и в последствие идентифициран като противорецептор за свързани с Т клетки молекули CD28 и CTLA4 (Linsley, Р., et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:5031-5035; Linsley, P. S. et al. (1991a) J. Exp. Med. 173:721-730; Linsley, P. S. et al. (1991b) J. Exp. Med. 174:561-570).

В последно време, друг противорецептор за CTLA4 е идентифициран с антиген представящи клетки (Azuma, N. et al. (1993) Nature 366:76-79; Freeman (1993a) Science 262:909-911; Freeman, G. J. et al. (1993b) J. Exp. Med. 178:2185-2192; Hathcock, K. L. S., et al. (1994) J. Exp. Med. 180:631-640; Lenschow, D. J. et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1105411058; Ravi-Wolf, Z., et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11182-11186; Wu, Y. et al. (1993) J. Exp. Med. 178:1789-1793;). Тази молекула, известна сега като CD86 (Caux, С., et al. (1994)

J. Exp. Med. 180:1841-1848), но също така наричана B7-0 (Azuma et al., (1993), supra), или B7-2 (Freeman et al., (1993a), supra), споделя приблизително 25 % идентичност на последователност с CD80 в неговата извънклетъчна област (Azuma et al., (1993), supra; Freeman et al., (1993a), supra, (1993b), supra). СО86-трансфектирани клетки изстрелват СО28-медиирани Тклетъчни отговори (Azuma et al., (1993), supra; Freeman et al., (1993a), supra, (1993b), supra).

Сравнения на експресирането на CD80 и на CD86 са били предмет на няколко изследвания (Azuma et al., (1993), supra; W Hathcock, et al. (1994) supra; Larsen, C. P., et al. (1994) J.

Immunol. 152:5208-5219; Stack, R. M., et al., (1994) J. Immunol. 152:5723-5733). Последни данни сочат, че експресирането на CD80 и на CD86 се регулират разделно, и подсказва, че експресията на CD86 има тензенцията да предшества експресията на CD80 по време на имунен отговор.

Разтворими форми на CD28 и CTLA4 са конструирани чрез сливане на променливи (у)-подобни извънклетъчни домени на CD28 и CTLA4 към имуноглобулин (lg) константни домени, което води до CD28lg и CTLA4lg. CTLA4lg свързва и CD80 ^ч* позитивни и CD86 позитивни клетки по-здраво отколкото

CD28lg (Linsley, Р. et al. (1994) Immunity 1:793-80). Много T клетъчно-зависими отговори се блокират чрез CTLA4lg и in vitro и in vivo. (Linsley, et al., (1991b), supra; Linsley, P. S. et al., (1992a) Science 257:792-795; Linsley, P. S. et al., (1992b), J. Exp. Med. 176:1595-1604; Lenschow, D. J. et al. (1992), Science 257:789-792; Tan, P. et al., (1992) J. Exp. Med. 177:165-173; Turka, L. A., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:11102-11105).

Peach et al., (J. Exp. Med. (1994) 180:2049-2058) идентифицираха области в CTLA4 извънклетъчния домен, които са важни

за здравото свързване към CD80. Специфично, хексапептиден мотив (MYPPPY (SEQ ID NO: 9)) в определящата комплементарността област 3 (СОРЗ)-подобна област, е идентифицирана като напълно запазена във всички CD28 и CTLA4 членове на фамилията. Аланин сканираща мутагенеза посредством MYPPPY (SEQ ID N0:9) мотив в CTLA4 и при избрани участъци в CD28lg, намалява или премахва свързването с CD80.

Конструирани са също химерни молекули, разменящи хомоложни области от CTLA4 и CD28. Молекули HS4, HS4-A и HS4В са конструирани чрез присадка на CDRS-подобни области от CTLA4, които също включват една крайна карбокси част, които са удължени за да включват някои не съхранени аминокиселинни остатъци върху CD28lg. Тези хомоложни мутанти показват поголяма свързваща склонност към CD80 отколкото към CD28lg.

В друга група химерни хомоложни мутанти, CDR1подобната област на CTLA4, която не е съхранена в CD28 и се предсказва, че е пространствено съседна на СОРЗ-подобната област, е присадена в HS4 и HS4-A. Тези химерни хомоложни мутантни молекули (обозначени HS7 и HS8) показват дори поголяма склонност за свързване с CD80 отколкото с CD28lg.

Създадени са също химерни хомоложни мутантни молекули чрез присадка в HS7 и HS8 СОР2-подобната област на CTLA4, но тази комбинация не подобрява по-нататък готовността за свързване с CD80. Така, MYPPPY мотивът на CTLA4 и CD28 е определен като критичен за свързване с CD80, но не-съхранени аминокиселинни остатъци в CDR1- и CDRS-подобните области на CTLA4 също са отговорни за повишената готовност за свързване на CTLA4 с CD80.

CTLA4lg е показал, че свързва ефективно CDSO-асоциирано Т клетъчно ко-стимулиране, но не е така ефективен при блокиране на СО86-асоциирани отговори. Разтворими CTLA4 мутантни молекули, по-специално тези, които имат по-висока готовност за CD86, отколкото див тип CTLA4, са конструирани като възможно по-добре способни да блокират прайминга на антиген специфично активирани клетки, отколкото CTLA4lg.

Остава необходимостта от подобряване на CTLA4 молекули, за да се осигурят по-добри фармацевтични състави за имунна супресия и лечение на рак, отколкото известните преди С това разтворими форми на CTLA4.

ТЕХНИЧЕСКА СЪЩНОСТ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Съгласно всичко това, изобретението предоставя разтворими CTLA4 мутантни молекули, които свързват CD80 и/или CD86. Мутантните молекули съгласно изобретението включват тези, които могат да разпознават и да свързват било CD80, било CD86, или и двата. Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, мутантните молекули, свързват CD80 и/или CD86 с по-голяма готовност, отколкото CTLA4.

Един пример за CTLA4 мутантна молекула е L104EA29Ylg (фигура 7), както се описва тук. Друг пример за CTLA4 мутантна молекула е L104Elg (фигура 8), както се описва тук. L104EA29Ylg и L104Elg свързват CD80 и CD86 с по-голяма склонност, отколкото CTLA4lg.

КРАТКО ОПИСАНИЕ НА ФИГУРИТЕ

Фигура 1 показва изследване на равновесие на свързване на L104EA29Ylg и L104Elg, и див тип CTLA4lg към CD86lg.

Фигури 2А & 2В илюстрират данни от FACS изследвания, показващи свързване на L104EA29Ylg, L104Elg и CTLA4lg с човешки CD80- или СО86-трансфекгирани СНО клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.

Фигури ЗА & ЗВ представят инхибиране пролиферацията на CDeO-положителни и СО86-положителни СНО клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.

Фигури 4А & 4В показват, че L104EA29Ylg е по-ефективен от CTLA4lg при инхибиране пролиферацията на първично и вторично ало-стимулирани Т клетки, както е описано в Пример 2, подолу.

Фигури 5А-С илюстрират, че L104EA29Ylg е по-ефективен от CTLA4lg при инхибиране IL-2 (Фиг. 5А), IL-4 (Фиг. 5В) и γ-интерферон (Фиг. 5С) цитокин продукцията на ало-стимулирани човешки Т клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.

Фигура 6 демонстрира, че L104EA29Ylg е по-ефективен от CTI_A4lg при инхибиране пролиферацията на фитохемаглутинин(РНА) стимулирани маймунски Т клетки, както е описано в Пример 2, по-долу.

Фигура 7 представя нукпеотидна и аминокиселинна последователност (SEQ ID NOS: 3 и 4, съответно) на CTLA4 мутантна молекула (L104EA29Ylg), съдържаща сигнален пептид; мутиран извънклетъчен домен на CTLA4, започващ при метионин в позиция +1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124, или започващ при аланин в позиция -1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124; и една lg област, както е описано в Пример 1, по-долу.

Фигура 8 представя нуклеотидна и аминокиселинна последователност (SEQ ID NOS: 5 и 6, съответно) на CTLA4 мутантна молекула (L104Elg) съдржаща сигнален пептид; мутиран извънклетъчен домен на CTLA4

започващ при метионин в позиция +1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124, или започващ при аланин в позиция -1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124; и една lg област, както е описано в Пример 1, по-долу.

Фигура 9 представя нуклеотидна и аминокиселинна последователност (SEQ ID NOS: 7 и 8, съответно) на CTLA4lg, съдържаща сигнален пептид; див тип аминокиселинна последователност на извънклетъчния домен на CTLA4, започваща при метоинин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124, или започваща при аланин в позиция -1 до аспаргинова киселина в позиция +124; и една lg област.

Фигури 10А-С са SDS гел (Фиг. 10А) за CTI_A4lg (ивица 1), L104Elg (ивица 2) и L104EA29Ylg (ивица 3); гелово проникваща хроматография на CTLA4lg (Фиг. 10В) и L104EA29Ylg (Фиг. 10С).

Фигура 11 илюстрира лентова диаграма (лява страна) на CTLA4 извънклетъчно lg V-подобно нагъване, генерирано от структурата в разтвор, определена с NMR спектроскопия. Дясната страна на фиг. 11 показва разширен изглед на S25-R33 областта и MYPPPY (SEQ ID NO: 9) областта, показващ местоположението и ориентация на странична верига на мутации повишаващи готовността, L104 и А29.

Фигура 12 изобразява схематична диаграма на вектор, piLNLEA29Y, притежаващ L104EA29Ylg инсерт.

ПОДРОБНО ОПИСАНИЕ НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

ДЕФИНИЦИИ

Така като се използват в това описание, следните думи или фрази имат специфични значения.

Така, както се използува тук “див тип CTLA4” има амино киселинна последователност от естествен произход, пълна дължина на CTLA4 (U. S. Patent Nos. 5,434,131, 5,844,095, 5,851,795), или неговия извънклетъчен домен, който свързва CD80 и/или CD86, и/или интерферира с CD80 и/или CD86, като свързва техните лиганди. Съгласно по-специални варианти за изпълнение, извънклетъчният домен на див тип CTLA4 започва с метионин на позиция +1, и завършва при аспарагинова киселина на позиция +124, или извънклетъчният домен на див тип CTLA4 започва с аланин на позиция -1 и завършващ при аспарагинова киселина на позиция +124. Див тип CTLA4 е повърхностен клетъчен протеин, имащ N-терминален извънклетъчен домен, трансмембранен домен, и С-терминален цитоплазмен домен. Извънклетъчният домен се свързва към насочени антигени, такива като CD80 и CD86. В клетка, срещаща се в природата, див тип CTLA4 протеин се транслира като незрял полипептид, който включва сигнален пептид на N-терминалния край. Незрелият полипептид претърпява пост-транслационно преобразуване, което включва разцепване и отнемане на сигналния пептид, за да се генерира продукт от CTLA4 разцепване, имащ ново-генериран N-терминален край, който се различава от N-терминалния край в незрялата форма. Специалистите в областта на техниката ще преценят, че могат да се появат допълнително пост-транслационно преобразуване, което отнема една, или повече от амино киселините от новогенерирания N-терминален край на продукта от CTLA4 разцепване. Зрялата форма на CTLA4 молекулата включва извънклетъчния домен на CTLA4, или която и да е негова част, която се свързва към CD80 и/или CD86.

s “CTLA4lg” е разтворим слят протеин, включващ един извънклетъчен домен на див тип CTLA4, или част от него, който свързва CD80 и/или CD86, присъединен с една Ig опашка. Поспециален вариант на изпълнение включва извънклетъчния домен на див тип CTLA4, започващ при метионин в позиция +1 и завършващ при аспаргинова киселина в позиция +124; или започващ при аланин в позиция - 1 при аспаргинова киселина в позиция +124; свързващ аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125; и една имуноглобулинова част обхващаща глутаминова киселина в позиция С +126, чрез лизин в позиция +357 (Фигура 9; SEQ ID NO: 8).

Така както се използва тук, “слят протеин” се дефинира като една или повече аминокиселинни последователности, които са свързани заедно, като са използвани добре известни методи в тази област, както е описано в U.S. Pat.No. 5,434,131 или 5,637,481. При това свързаните аминокиселинни последователности образуват един слят протеин.

Така както се използва тук, “CTLA4 мутантна молекула” е молекула, която може да бъде пълноверижен CTLA4 или част от него (производни или фрагменти), които имат една мутация или множествени мутации в CTLA4 (предпочитано в извънклетъчния домен на CTLA4), така че тя е сходна, но не е идентична с дивия тип CTLA4 молекула. CTLA4 мутантни молекули свързват или CD80 или CD86, или и двата. Мутантни CTLA4 молекули могат да включват една биологично или химично активна не-СТ1_А4 молекула в тях или прикачена към тях. Мутантните молекули могат да бъдат разтворими (т.е. циркулиращи) или прикрепени към повърхност. CTLA4 мутантни молекули могат да включват целия извънклетъчен домен на CTLA4 или част от него, например фрагменти или производни. Мутантните молекули CTLA4 могат да са получени синтетично, или рекомбинантно.

Така, както се използува тук, терминът “мутация” е промяна в нуклеотидната, или в амино киселинната последователност на див-тип полипептид. В този случай, има промяна в извънклетъчния домен на див тип CTLA4. Промяната може да е промяна на амино киселина, което включва замествания, елиминирания, добавяния, или окастряния. Мутантната молекула може да има една, или повече мутации. Мутации в нуклеотидна последователност могат да доведат до, или могат да не доведат до мутация в амино киселинната последователност, което се разбира добре в областта на техниката. В този смисъл, някои нуклеотидни кодони кодират същата амино киселина. Примерите включват нуклеотидни кодони CGU, CGG, CGC, и CGA кодиращи амино киселината, аргинин (R); или кодони GAU и GAC кодиращи амино киселината, аспарагинова киселина (D). Така, протеинът може да се кодира от една, или от повече молекули нуклеинова киселина, които се различават в тяхната специфична нуклеотидна последователност, но все пак кодират молекули протеин, имащи идентични последователности. Последователността кодираща амино киселинна е както следва:

Амино	Символ	Знак с	Кодони
киселина		една буква
Аланин	AI	А	GCU, GCC, GCA, GCG
Цистеин	Cys	С	UGU, UGC
Аспарагинова	Asp	D	GAU, GAC

киселина

Глутаминова	GLU	E	GAA GAG
Киселина Фенилаланин	Phe	F	UUU, UUC
Глицин	Gly	G	GGU, GGC, GGA, GGG
Хистидин	His	H	CAU, CAC
Изолевцин	lie	I	AUU, AUC, AUA
Лизин	Lys	K	AAA, AAG
Левцин	Leu	L	UUA, UUG, CUU, CUC,
Метионин	Met	M	CUA, CUG AUG
Аспаргин	Asn	N	AAU, AAC
Пролин	Pro	P	CCU, CCC, CCA, CCG
Глутамин	Gin	Q	CAA, CAG
Аргинин	Arg	R	CGU, CGC, CGA, CGG
Серин	Ser	S	AGA, AGG UCU, UCC, UCA, ACG
Треонин	Thr	T	AGU, AGC ACU, ACC, ACA, ACG
Валин	Val	V	GUU, GUC, GUA, GUG
Триптофан	Trp	w	UGG
Тирозин	Tyr	Y	UAU, UAC

Както се използва тук “извънклетъчният домен на CTLA4” е част от CTLA4, който разпознава и свързва CD80 и/или CD86. Например, извънклетъчен домен на CTLA4 включва метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124 (Фигура 9, SEQ ID N0:8 ). Алтернативно, извънклетъчният домен на CTLA4 включва аланин в позиция - 1 до аспаргинова киселина в позиция +124 (Фигура 9; SEQ ID N0:8). Извънклетъчният домен включва фрагменти, или производни на CTLA4, които свързват CD80 и/или CD86.

Както се използува тук “не-СТ1_А4 протеин последователност”, или “молекула не-СТ1_А4” се дефинира като която и да е молекула, която не свързва CD80 и/или CD86, и не интерферира със свързването на CTLA4 до неговата мишена. Един пример включва, но не се ограничава от, имуноглобулин (Ig) константна област, или част от нея. За предпочитане, Ig константната област е човешка, или маймунска Ig константна област, например, човешки С(гама)1, включващ СН2 и СНЗ области. Ig константната област може да е мутирала, за да редуцира нейните ефекторни функции (U. S. Patent Nos: 5,637,481; и 6,132,992).

Както се използува тук “фрагмент от CTLA4 мутантна молекула” е част от CTLA4 мутантна молекула, за предпочитане извънклетъчния домен на CTLA4, или част от него, която разпознава и свързва неговата мишена, например, CD80 и/или CD86.

Както се използува тук “производно на CTLA4 мутантна молекула” е молекула, която ангажира най-малко със 70% сходство на последователност и функции подобни на извънклетъчен домен на CTLA4, тоест, тя разпознава и свързва CD80 и/или CD86.

Както се използува тук “част от CTLA4 молекула” включва фрагменти и производни на CTLA4 молекула, които свързват CD80 и/или CD86.

С цел по-пълно да се разбере описаното тук изобретение, правят се следните описания.

СЪСТАВИ СЪГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Настоящето изобретение предоставя разтворими CTLA4 молекули, които разпознават и свързват CD80 и/или CD86. В някои изпълнения, разтворимите CTLA4 мутанти имат по-голяма склонност към CD80 и/или CD86 в сравнение с CTLA4lg.

Примери за CTLA4 мутантни молекули включват L104EA29Ylg (Фигура 7; SEQ ID NOS: 3 и 4). Аминокиселинната последователност на L104EA29Ylg може да започва при аланин в аминокиселинна позиция -1 и да завършва при лизин в аминокиселинна позиция +357. По избор, аминокиселинната последователност на L104EA29Ylg може да започва при метионин в аминокиселинна позиция +1 и да завършва при лизин в аминокиселинна позиция +357. CTLA4 частта от L104EA29Ylg обхваща метионин в аминокиселинна позиция +1 чрез аспарагинова киселина в аминокиселинна позиция +124. L104EA29Ylg включва свързващ аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125 и имуноглобулинова част, обхващаща глугаминова киселина в позиция +126 до лизин в позиция +357 (Фигура 7; SEQ ID N0:4) L104EA29Ylg се свързва с приблизително 2-кратно по-голяма склонност, отколкото див тип CTLA4lg (тук по-долу обозначен като CTLA4lg) с CD80 и приблизително 4-кратно с по-голяма склонност с CD86. Това по-силно свързване води до това, че L104EA29Ylg става по-чувствителен, отколкото CTLA4lg при блокиране на имунни отговори.

CTLA4 мутантни молекули съдържат най-малко извънклетъчния домен на CTLA4, или части от него, които свързват CD80 и/или CD86. Извънклетъчната част на CTLA4 мутантна молекула съдържа аминокиселинна последователност, започваща с метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124(Фигура 7 (SEQ ID N0:4) или Фигура 8 (SEQ ID N0:6)). По избор, извънклетъчната част на CTLA4 може да включва аминокиселинна последователност започваща с аланин в позиция 1 до аспарагинова киселина в позиция +124 (Фигура 7 (SEQ ID N0:4) или Фигура 8 (SEQ ID N0:6)).

В едно изпълнение, разтворимата CTLA4 молекула е слят белтък, съдържащ извънклетъчния домен на CTLA4, притежаващ една или повече мутации в една област на аминокиселинна последователност, започващ със серин при +25 и завършващ с аргинин при +33 (S25-R33). Например, аланин в позиция +29 на див тип CTLA4 може да бъде заменен с тирозин (кодони: UAU, UAC). По избор, аланин може да бъде заменен с левцин (кодони: UUA, UUG, CUU, CUC, CUA, CUG), фенилаланин (кодони: UUU, UUC), триптофан (кодон: UGG), или треонин (кодони: ACU, АСС, АСА, ACG). Както специалистите в тази област ще разберат, урацил (U) нуклеотида от РНК последователността съответства на тимидин (Т) нуклеотида на ДНК последователността.

В друго изпълнение, разтворимата CTLA4 молекула е слят протеин, съдържащ извънклетъчния домен на CTLA4, включващ една или повече мутации във, или близо до област на аминокиселинна последователност, започваща с метионин при +97 и завършваща с глицин при +107 (M97-G107). Например, левцин в позиция +104 на див тип CTLA4 може да бъде заменен с глутаминова киселина (кодони: GAA, GAG). CTLA4 мутантна молекула, съдържаща тази замяна, е обозначена тук като L104Elg (Фигура 8; SEQ ID NOS: 5 и 6).

В друго изпълнение, разтворимата CTLA4 мутантна молекула е слят протеин, включващ извънклетъчния домен на CTLA4 , притежаващ една или повече мутации в S25-R33 и M97-G107 областите. Например, в едно изпълнение, CTLA4 мутантна молекула включва тирозин в позиция +29 вместо аланин; и глутаминова киселина в позиция +104 вместо левцин. CTLA4 мутантна молекула, притежаваща тези замествания е обозначена тук като L104EA29Ylg (Фигура 7; SEQ ID N0: 3 и 4). Молекулата нуклеинова киселина, която кодира L104EA29Ylg се съдържа в pD16L104EA29Ylg и е депозирана на 19 юни 2000 г. с American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Blvd., Mansas, VA 20110-2209 (ATCC No. PTA-2104). PD16 L104EA29Ylg C векторът е производно на pcDNA3 вектор (INVITROGEN).

Изобретението, освен това, предоставя разтворима CTLA4 мутантна молекула, съдържаща един извънклетъчен домен на CTLA4 мутант, както е показано във Фигура 7 (SEQ ID NOS: 3 и 4) или Фигура 8 (SEQ ID NOS: 5 и 6), или негова(и) част(и) и един остатък, който променя разтворимостта, афинитета и/или валентността на CTLA4 мутантната молекула.

Съгласно практическо използване на изобретението, остатъкът може да бъде имуноглобулинова константна област или част от нея. За използване in vivo, се предпочита имуноглобулиновата константна област да не предизвиква вредни имунни отговори у индивида. Например, в клинични протоколи, може да се предпочита мутантни молекули да включват човешки или маймунски имуноглобулинови константни области. Пример за подходяща област на имуноглобулин е човешки С (гамма)1, включваща прикачените СН2 и СНЗ области. Възможни са други изотипове. Освен това възможни са други имуноглобулин константни области (предпочитано други слаби или не-имуногенни имуноглобулинови константни области).

Други остатъци включват полипептидни опашки. Примерите за разтворими опашки включват, но не се ограничават до, /*”

W

J**· p97 молекулата, env gp120 молекула, E7 молекула и ova молекула (Dash, B., et al. (1994) J.Gen.Virol. 75:1389-97; Ikeda, T. et al. (1994) Gene 138:193-6; Falk, K. et al. (1993) Cell.lmmunol. 150:447-52; Fujisaka, K. et al. (1994) Virology 204:789-93). Възможни са други молекули за използване като опашки (Gerard, С. et al. (1994) Neuroscience 62:721-739; Byrn, R. et al. J.Virol. (1989) 63:4370-4375; Smith, D. et al., (1987) Science 238:1704-1707; Lasky, L., (1996) Science 233:209-212).

Изобретението, освен това, предоставя разтворими мутантни CTLA4lg слети белтъци, преимуществено по-реактивни с CD80 и/или CD86 антиген, в сравнение с див тип CTLA4. Един пример е L104EA29Ylg, както е показано във Фигура 7(SEQ ID NOS.3 и 4).

В друго изпълнение, разтворимата CTLA4 мутантна молекула включва присъединен аминокиселинен остатък, който е разположен между CTLA4 частта и имуноглобулиновата част. Присъединената аминокиселина може да бъде всяка аминокиселина, включително глутамин. Присъединената аминокиселина може да бъде въведена с молекулярни или синтетични методи, които са известни в тази област.

В друго изпълнение, разтворимата CTLA4 мутантна молекула включва имуноглобулиновата част (например, прикачени, СН2 и СНЗ домени), където някои или всички от цистеиновите остатъци, в прикачения домен на имуноглобулиновата част, са заместени със серин, например цистеините в позиции +130, +136 или +139 (Фигура 7 (SEQ ID N0:4) или Фигура 8 (SEQ ID NO: 6)). Мутантната молекула може също да включва пролина в позиция +148 заместен с един серин, както е показано във Фигура 7 (SEQ ID N0:4) или 8 (SEQ ID N0: 6).

Разтворимата CTLA4 мутантна молекула може да включва сигнална пептидна последователност, свързани с N-терминалния край на извънклетъчния домен на CTLA4 частта от мутантната молекула. Сигналният пептид може да бъде която и да е последователност, която би дала възможност за секретиране на мутантната молекула, включително сигналният пептид на онкостатин М (Malik, et al., (1989) Molec. Cell. Biol. 9:28472853), r.r CD5 (Jones, N. H. et al., (1986) Nature 323:346-349), или сигналният пептид от който и да е извънклетъчен протеин.

Мутантна молекула може да включва сигналния пептид на w онкостатин М, свързан към N-терминалния край на извънклетъчния домен на CTLA4, и човешката имуноглобулинова молекула (например, hinge, СН2, и СНЗ), свързани към С-терминалния край на извънклетъчния домен на CTLA4. Тази молекула включва сигналния пептид на онкостатин М, обхващащ амино киселинна последователност, имаща метионин на позиция -26 до аланин на позиция -1, CTLA4 частта, обхващаща амино киселинна последователност, имаща метионин на позиция +1, до аспарагинова киселина на позиция +124, присъединен амино киселинен остатък глутамин на позиция +125, и ^v имуноглобулиновата част, обхващаща амино киселинна последователност, имаща глутаминова киселина на позиция +126, до лизин на позиция +357.

Разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно изобретението може да се получи посредством молекулярни, или химически синтетични методи. Молекулярните методи могат да включват следните етапи: въвеждане на подходяща клетка гостоприемник с молекула нуклеинова киселина, която експресира и кодира разтворима CTLA4 мутантна молекула; култивиране на така вкараната клетка гостоприемник при условия, които дават възможност на клетката гостоприемник да експресира мутантни молекули; и изолиране на експресираните мутантни молекули. Частта от сигналния пептид на мутантната молекула дава възможност на белтъчните молекули да бъдат експресирани по клетъчната повърхност и да бъдат секретирани от клетката гостоприемник. Транслираните мутантни молекули могат да претърпят пост-транслационнна модификация, включваща разцепване на сигналния пептид, за получаване на зрял протеин, притежаващ CTLA4 и имуноглобулиновите части. Разцепването може да се появи след аланин в позиция -1, което има за резултат зряла мутантна молекула, съдържаща метионин в позиция +1 като първата аминокиселина (Фигура 7 (SEQ ID NO: 4) или 8 (SEQ ID NO:

6)). Алтернативно, разцепването може да се появи след метионина в позиция -2, което има за резултат зряла мутантна молекула, съдържаща аланин в позиция -1, като първата аминокиселина.

Едно предпочитано изпълнение е, разтворима CTLA4 мутантна молекула, притежаваща извънклетъчен домен на човешки CTLA4, свързан с цялата или част от човешка имуноглобулинова молекула (например, прикачени, СН2 и СНЗ). Тази предпочитана молекула включва CTLA4 частта на разтворимата молекула, обхващаща аминокиселинна последователност, притежаваща метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124, един присъединен аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125, и имуноглобулиновата част обхващаща глутаминова киселина в позиция +126 до лизин в позиция +357. Частта притежаваща извънклетъчния домен на CTLA4 е мутирана така че аланин в позиция +29 е заменен с тирозин и левцин в позиция +104 е заменен с глутаминова к-на. Имуноглобулиновата част на мутантната молекула може да бъде мутирана, така че цистеините в позиции +130, +136 и +139 са заместени със серин и пролинът в позиция+148 е заместен със серин. Тази мутантна молекула е обозначена тук като L104EA29Ylg (Фигура 7 (SEQ ID NOS: 3 и 4)).

Друго изпълнение на L104EA29Ylg е мутантна молекула, включваща аминокиселинна последователност, притежаваща аланин в позция -1 до аспаргинова киселина в позиция +124, един присъединен аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125 и имуноглобулинова част обхващаща глутаминова киселина в позиция +126 (например, +126 до лизин в позиция +357). Частта притежаваща извънклетъчния домен на CTLA4 е мутирана така, че аланин в позиция +29 е заместен с тирозин; и левцин в позиция +104 е заместен с глутаминова киселина. Имуноглобулиновата част на мутантната молекула е мутирана така, че цистеините в позиции +130, +136 и +139 са заместени със серин и пролинът в позиция +148 е заместен със серин. Тази мутантна молекула тук е обозначена като L104EA29Ylg (Фигура 7 (SEQ D NOS: 3 и 4)). След като сигналната последователност е разцепена, L104EA29Ylg може да започва или с метионин в позиция +1, или да започва с аланин в позиция -1.

Друга мутантна молекула на изобретението е разтворима CTLA4 мутантна молекула, съдържаща извънклетъчния домен на човешки CTLA4, свързан с човешката имуноглобулинова молекула (например, прикачени, СН2 и СНЗ). Тази молекула включва частта от аминокиселинната послеователност кодираща CTLA4, започваща с метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124, присъединен аминокиселинен остатък глутамин в позиция +125 и имуноглобулинова част, обхващаща една аминокиселинна последователност, притежаваща глутаминова киселина в позиция +126 до лизин в позиция +357. Частта, притежаваща извънклетъчния домен на CTLA4 е мутирана, така че левцин в позиция +104 е заместен с глутаминова киселина. Прикачената част на мутантната молекула е мутирана, така че цистеините в позиции +130, +136 и +139 са заместени със серин, и пролинът в позиция +148 е заместен със серин. Тази мутантна молекула е обозначена тук като L104Elg (Фигура 8 (SEQ ID NOS: 5 и

6))·

Алтернативно, едно изпълнение на L104Eig е разтворима CTLA4 мутантна молекула, притежаваща извънклетъчен домен на човешки CTLA4, свързан с човешка имуноглобулинова молекула (например, прикачени, СН2 и СНЗ). Тази предпочитана молекула включва CTLA4 частта, обхващаща аминокиселинна последователност, започваща с аланин в позиция -1 до аспаргинова киселина в позиция +124, присъединен аминокиселинен остатък глутамин в позиция +126 до лизин в позиция +357. Частта притежаваща извънклетъчния домен на CTLA4 е мутирана, така че левцин в позиция +104 е заместен с глутаминова киселина. Прикачената част на мутантната молекула е мутирана, така че цистеините в позиции +130, +136 и +139, са заместени със серин и пролинът в позиция +148 е заместен със серин. Тази мутантна молекула е обозначена тук като L104Elg (Фигура 8(SEQ ID NOS: 5 иб)).

Също така, изобретението предоставя разтворима CTLA4 мутантна молекула, притежаваща: (а) първа аминокиселинна последователност на мембранен гликопротеин, например, CD28, CD86, CD80, CD40 и др39, който блокира Т клетъчна пролиферация, слята до втора аминокиселинна последователност; (Ь) втората аминокиселинна последователност, която е фрагмент от извънклетъчния домен на мутантен CTLA4, който блокира Т клетъчна пролиферация, като например, молекула на аминокиселина, съдържаща метионин в позиция +1 до аспаргинова киселина в позиция +124 (Фигура 7 (SEQ ID NO: 4) или 8 (SEQ ID N0:6); и (с) трета аминокиселинна последователност, която действа като идентификационна опашка или повишава разтворимостта на молекулата. Например, третата аминокиселинна последователност може да се състои в основни линии от аминокиселините остатъци на прикачените, СН2 и СНЗ области на не-имуногенната имуноглобулинова молекула. Примери за подходящи имуноглобулинови молекули включват, но не се ограничават до, човешки или маймунски имуноглобулин, например С(гамма)1. Възможни са също други изотипове.

Изобретението предоставя също така молекули нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидни последователности кодиращи аминокиселинните последователности, съответстващи на разтворимите CTLA4 мутантни молекули на изобретението. В едно изпълнение, молекулата нуклеинова киселина е ДНК (например, кДНК) или неин хибрид. Алтернативно, молекулите нуклеинова киселина са РНК или нейни хибриди.

Освен това, изобретението предоставя вектор, който съдържа нуклеотидните последователности на изобретението. Предоставя се също така, векторна система гостоприемник. Векторната система гостоприемник съдържа вектора на изобретението в подходяща клетка гостоприемник. Примерите за подходящи клетки гостоприемници включват, но не се ограничават до, прокариотни и еукриотни клетки.

Изобретението включва фармацевтични състави за използване при лечението на заболявания на имунната система, съдържащи фармацевтично ефективни количества разтворими CTLA4 мутантни молекули. Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, заболявания на имунната система са медиирани от взаимодействие на CD28- и/или СТ1_А4-положителна клетка с CD80 и/или CD86 положителни клетки. Разтворимите CTLA4 мутантни молекули предпочитано са CTLA4 молекули, притежаващи една или повече мутации в извънклетъчния домен на CTLA4. Фармацевтичният състав може да включва разтворими CTLA4 мутантни белтъчни молекули и/или молекули нуклеинова киселина, и/или вектори, кодиращи молекулите. В предпочитани изпълнения, разтворимите CTLA4 мутантни молекули имат аминокиселинната последователност на извънклетъчния домен на CTLA4 както е показано във Фигури 7 (SEQ ID NO: 4) или 8(SEQ ID N0:6) (L104EA29Y или L104E, съответно). Още по-предпочитано, разтворимата CTLA4 мутантна молекула е L104EA29Ylg както е представено тук. Съставите могат допълнително да включват други терапевтични агенти, включително, но не ограничено до, лекарствени токсини, ензими, антитела или конюгати.

Фармацевтичните състави също предпочитано включват подходящи носители и адюванти, които включват някакъв материал, който когато се комбинира с молекулата на изобретението (например, разтворима CTLA4 мутантна молекула, като L104EA29Y или L104E), запазва активността на молекулата и не е реактивен за имунната система на индивида. Примери на подходящи носители и адюванти включват, но не се ограничават до, човешки серум албумин; йонообменници; алуминиев диоксид; лецитин; буфериращи вещества, като фосфати; глицин; сорбинова киселина; калиев сорбат; и соли или електролити, като протамин сулфат. Други примери включват някои от стандартните фармацевтични носители, като

буфериран с фосфат физиологичен разтвор; вода; емулсии, такива като масло/вода; и различни видове овлажняващи средства. Други носители могат, също така, да включват стерилни разтвори; таблетки, включително таблетки с покритие и капсули. Характерно, такива носители съдържат инертни пълнители, такива като нишесте, мляко, захар, някои видове глина, желатин, стеаринова киселина, или нейни соли, магнезиев, или калциев стеарат, талк, растителни мазнини, или масла, смоли, гликоли, или други известни инертни пълнители. Такива носители могат, също така, да включват добавки за подобряване на вкуса и оцветители, или други съставни части. От състави, съдържащи такива носители, се изготвят лекарствени форми чрез добре известни конвенционални методи. Такива състави могат да се изготвят като лекарствени форми в състава на различни липидни състави, такива като, например, липозоми, така както и в различни полимерни състави, такива като полимерни микросфери.

Фармацевтичните състави съгласно изобретението могат да се прилагат, като се използуват конвенционални начини на приложение, включително, но без да се ограничават от, интравенозно (i. ν.) приложение, интраперитонеално (i. р.) приложение, интрамускулно (i. m.) приложение, подкожно приложение, орално приложение, приложение като супозитории, или като локален контакт, или имплантиране на устройство със забавено освобождаване, такова като миниосмотична помпа, върху субекта.

Фармацевтичните състави съгласно изобретението могат да бъдат в разнообразни единични форми за еднократно приложение, които включват, но без да се ограничават от, течни разтвори, или суспензии, таблетки, пилюли, прахове, супозитории, полимерни микрокапсули, или микровезикули, липозоми, и инжектируеми, или инфузионни разтвори. Предпочитаната форма зависи от начина на приложение, и от терапевтичното използуване.

Най-ефективният начин на приложение и режим на дозиране за съставите съгласно това изобретение зависи от това колко тежко е заболяването, и от курса на болестта, от здравето на пациента, от отговора на пациента към лечението, и от преценката на лекуващия лекар. Съгласно това, дозиранията на съставите трябва да се титруват спрямо индивидуалния пациент.

Разтворимите CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат върху субект в количество, и в продължение на време (например продължителността на времето и/или колко пъти във времето), достатъчно, за да блокира В7 (например, CD80 и/или CD86) молекули от свързване към техните съответни лиганди, у субекта. Блокирането на ендогенно В7/лиганд свързване, и с това инхибиране на взаимодействие между В-7 позитивни клетки (например, CD80- и/или СО86-позитивни клетки) с CD28- и CTLA4- позитивни клетки. Дозирането на терапевтично средство зависи от много фактори, включително, но без да се ограничават от, от вида на засегнатата тъкан, от вида на автоимунното заболяване, което трябва да се лекува, от това колко тежко е заболяването, от здравето на субекта, и от отговора на субекта към лечението със средствата. Имайки предвид всичко това, дозиранията на средствата могат да варират, в зависимост от субекта и от начина на приложение. Разтворимите CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат в количество между 0,1 и 20,0 mg/kg тегло на пациента/ден, за предпочитане между 0,5 и 10,0 mg/kg/ден. Приложението на фармацевтични състави съгласно изобретението може да се осъществи през различни интервали от време. Съгласно един вариант за изпълнение, фармацевтичния състав съгласно изобретението може да се прилага през един, или през повече часа. Освен това, приложението може да се повтори, в зависимост от това колко тежко е заболяването, така както и в зависимост от други фактори, както се разбира от специалистите в областта на техниката.

Освен това, изобретението предоставя методи за получаване на протеин, които се състоят в прорастване на векторна система гостоприемник съгласно изобретението, така че да се продуцира протеина в гостоприемника, и да се покрие така продуцирания протеин.

Също така, изобретението предоставя методи за регулиране на функционално взаимодействия на CTLA4- и CD28-noзитивни Т клетки с CD80- и/или CD86- позитивни клетки. Методите се състоят в контактуване на CD80- и/или СО86-позитивните клетки с разтворима CTLA4 мутантна молекула съгласно изобретението, така че да се образува CTLA4/CD80 и/или мутантни CTLA4/CD86 комплекси, комплексите интерферират с реакция на ендогенен CTLA4 антиген с CD80 и/или CD86, и/или комплексите интерферират с реакция на ендогенен CD28 антиген с CD80 и/или CD86. Съгласно един вариант за изпълнение, разтворимата CTLA4 мутантна молекула е слят протеин, който съдържа най-малко част от извънклетъчния домен на мутантен CTLA4. Съгласно друг вариант за изпълнение на изобретението, разтворимата CTLA4 мутантна молекула съдържа: първа амино киселинна последователност, имаща метионин на позиция +1, до аспарагинова киселина на позиция +124, включваща най-малко една мутация; и втора амино киселинна последователност, включваща прикачените СН2 и СНЗ области на човешки имуноглобулин гамма 1 молекула (Фигура 7 (SEQ ID NO: 4) или Фигура 8 (SEQ ID N0:6)).

Съгласно практиката на изобретението, CD80- или CD86положителни клетки са поставени в контакт с фрагменти или производни на разтворимите CTLA4 мутантни молекули на изобретението. Алтернативно, разтворимата CTLA4 мутантна молекула е CD28lg/CTI_A4lg слят протеин, притежаващ пърза аминокиселинна последователност, съответстваща на част от ^w извънклетъчния домен на CD28 рецептор, слят с втора аминокиселинна последователност, съответстваща на част от извънклетъчния домен на CTLA4 мутантен рецептор и трета аминокиселинна последователност, съответстваща на прикачените СН2 и СНЗ области на човешки имуноглобулин С-гамма-1.

Очаква се разтворимите CTLA4 мутантни молекули да проявят инхибиторни свойства in vivo. При условия, където Т клетка/АРС клетка взаимодействия, например, Т клетка/В клетка взаимодействия, се появяват в резултат на контакт между Т клетки и АРС клетки, свързване на въведени CTLA4 мутантни молекули да - взаимодействат с CD80- и /или СО86-положителни клетки, например В клетки, може да интерферира, т.е. да инхибира, Т клетка/АРС клетка взаимодействията, което води до регулиране на имунните отговори.

Изобретението предоставя методи за низходяща регулация на имунните отговори. Низходяща регулация на имунните отговори с разтворими CTLA4 мутантни молекули може да бъде чрез инхибиране или блокиране на имунния отговор, който е в развитие или може да включва предотвратяване индукцията на имунен отговор. Разтворимите CTLA4 молекули на изобретението могат да инхибират функциите на Т клетки, такива като пролифериране на Т лимфоцити и секретиране на цитокини, чрез подтискане Т клетъчни отговори, или чрез индуциране на специфичен толеранс в Т клетки, или и чрез двете.

Настоящето изобретение също така предоставя методи за лечение на заболявания на имунната система, и индуциране на толеранс. Съгласно по-специални варианти за изпълнение на изобретението, заболяванията на имунната система се медиират от взаимодействия на CD28- и/или СТ1_А4-позитивни клетки с CD80/CD86 позитивни клетки. Съгласно друг вариант, инхибират се Т клетъчни взаимодействия. Заболяванията на имунната система включват, но без да се ограничават от, автоимунни заболявания, имунопролиферативни заболявания, и смущения свързани с присаждания. Тези методи се състоят в приложение върху субект на разтворими CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението, за да регулират взаимодействия Т клетки с CD80- и/или CD86- позитивните клетки. Алтернативно, хибрид на CTLA4 мутант, имащ мембранен гликопротеин, прикрепен към CTLA4 мутантна молекула може да бъде приложен. Примерите за заболявания свързани с присаждане включват graft versus host заболяване (GVHD) (например, такива, които могат да са в резултат от трансплантиране на костен мозък, или в индуциране на толерантност), имунни заболявания, асоциирани с отхвърляне на присадени трансплантанти, хронично отхвърляне, и тъканни, или клетъчни ало-, или ксенографти, включващо твърди органи, кожа, islets, мускули, хепатоцити, неврони. Примерите за имунопролиферативни заболявания включват, но без да се ограничават от, псориазис; Т клетъчна лимфома; Т клетъчна остра лимфобластна левкемия; тестикуларна ангиоцентрична Т клетъчна лимфома;

доброкачествен лимфоцитен ангиит; и автоимунни заболявания като лупус (например, lupus erythematosus, lupus nephritis), Hashimoto’s тиреоидит, първичен микседем, болест на Graves, пернициозна анемия, автоимунен атрофичен гастрит, болест на Addison, диабет (например, инсулин зависим захарен диабет, тип I захарен диабет), good pasture’s синдром, myasthenia gravis, pemphigus, болест на Crohn, офталмия симпатика, автоимунен увеит, множествена склероза, автоимунна хемолитична анемия, идиопатична тромбоцитопения, първична билиарна цироза, хроничен хепатит,язвен колит, Sjogren's синдром, ревматични заболявания (например, ревматоиден артрит) полимиозит, склеродермия и смесено заболяване на съединителната тъкан.

Настоящето изобретение предоставя също метод за инхибиране отхвърлянето от индивида на присадката на орган и/или на тъканен трансплантат. Обикновено, при гьканни трансплантати, отхвърлянето на присадката се започва чрез нейното разпознаване като чужда от Т клетки, последвано от имунен отговор, който разрушава присадката. Разтворимите CTLA4 мутантни молекули на това изобретение, чрез инхибиране Т лимфоцитната пролиферация я* и/или секреция на цитокин, могат да доведат до намаляване на тъканната деструкция и индуциране на антиген-специфична Т клетъчна имуносупресия, което може да има за резултат продължително приемане на присадката без да е необходима обща имуносупресия. Освен това, разтворимите CTLA4 мутантни молекули на изобретението могат да бъдат въведени с други фармацевтични препарати, включително, но не ограничено до, кортикостеро-иди, циклоспорин, rapamycicn, mycophenolate, mofetil, azathioprine, tacrolismus, basiliximab, и/или други биологични препарати.

Настоящето изобретение предоставя също методи за инхибиране реакцията на присадката срещу приемника у даден индивид. Този метод се характеризира с това, че на индивида се въвежда разтворима CTLA4 мутантна молекула на изобретението, самостоятелно или заедно със следните допълнителни лиганди, реактивни с IL-2, IL-4 или γ-интерферон. Например, разтворима CTLA4 мутантна молекула на изобретението, може да бъде въведена у приемник на костно-мозъчен трансплантат, за инхибиране алореактивността на донорни Т клетки. Алтернативно, донорни Т клетки в присадка на костен мозък, могат да бъдат направени толерантни спрямо алоантигени на реципиента ex vivo, преди трансплантацията.

Инхибиране на Т клетъчни отговори чрез разтворими CTLA4 мутантни молекули могат да бъдат използвани за лечение на автоимунни разстройства. Много автоимунни разстройства са резултат на неподходящо активиране на Т клетки, които са реактивни срещу автоантигени и които спомагат за продуцирането на цитокини и автоантитела, които участват в патологията на заболяването. Въвеждането на разтворима CTLA4 мутантна молекула у индивид, страдащ от, или предразположен към автоимунно разстройство, може да предотврати активирането на автореактивни Т клетки и може да намали, или да елиминира симптомите на заболяването. Този метод може също да включва въвеждане у даден индивид на разтворима CTLA4 мутантна молекула на изобратанието, самостоятелно или заедно с други допълнителни лиганди, реактивни с IL-2, IL-4 или γ-интерферон.

Освен това изобретението обхваща използуването на разтворимите CTLA4 мутантни молекули заедно с други имуносупресори, например, циклоспорин (виж Mathiesen, in: “Prolonged Survival and Vascularisation of Xenografted Human Glioblastoma Cells in the Central Nervous System of Cyclosporin ATreated Rats” (1989) Cancer Lett., 44:151-156), преднизон, азатиоприн, и метотрексат (R. Kandschumacher “Chapter 53” Drugs Used for Immunosuppression” pages 1264-1276). Други имуносупресори са възможни. Например, за лечението на ревматоиден артрит, разтворими CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат с фармацевтични препарати, включително, но без да се ограничават от, кортикостероиди, нектероидни противовъзпалителни лекарства/Сох-2 инхибитори, метотрексат, хидроксихлорокин, сулфасалазоприн, златни соли, етанерсепт, инфликсимаб, анакинра, азатиоприн, и/или други подобни анти-TNF биологични препарати. За лечението на системен еритематозен лупус, разтворими CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат с фармацевтични препарати, включително, но без да се ограничават от, кортикостероиди, цитоксан, азатиоприн, хидроксихлорокин, микофенолат мофетил, и/или други биологични препарати. Освен това, за лечението на мултиплена склероза, разтворими CTLA4 мутантни молекули могат да се прилагат с фармацевтични препарати, включително, но без да се ограничават от, кортикостероиди, интерферон бетаla, интерферон бета-1Ь, глатирамер ацетат, митоксантрон хидрохлорид, и/или други биологични препарати.

Разтворими CTLA4 мутантни молекули (за предпочитане L104EA29Ylg ) могат също така да се използуват в комбинация с едно, или с повече от следващите средства, за регулиране на имунен отговор: разтворим др39 (известен също така като CD40 лиганд (CD40L), CD154, Т-ВАМ, TRAP), разтворим CD29, разтворим CD40, разтворим CD80, разтворим CD80, разтворим CD80, разтворим CD80, разтворим CD86, разтворим CD28, разтворим CD56, разтворим Thy-1, разтворим CD3, разтворим TCR, разтворим VLA-4, разтворим VCAM-1, разтворим LECAM1, разтворим ELAM-1, разтворим CD44, антитела реактивни с др39, антитела реактивни с CD40, антитела реактивни с В7, антитела реактивни с CD28, антитела реактивни с LFA-1, антитела реактивни с LFA-2, антитела реактивни с IL-2, антитела реактивни с IL-12, антитела реактивни с IFN-гама, антитела реактивни с CD2, антитела реактивни с CD48, антитела реактивни с ICAM (например, ICAM-2), антитела реактивни CTLA4, антитела реактивни с Thy-1, антитела реактивни с CD56, антитела реактивни с CD3, антитела реактивни с CD29, антитела реактивни с TCR, антитела реактивни с VLA-4, антитела реактивни с VCAM-1, антитела реактивни с LECAM-1, антитела реактивни с ELAM-1, антитела реактивни с CD44. Съгласно някои варианти за изпълнение на изобретението, се предпочитат моноклонални антитела. Съгласно други варианти за изпълнение на изобретението, предпочитат се фрагменти антитела. Както специалистите в областта на техниката добре разбират, комбинирането може да включва разтворимите CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението и едно друго имуносупресоращо средство, разтворимите CTLA4 мутантни молекули с две други имуносупресорни средства, разтворимите CTLA4 мутантни молекули с три други имуносупресорни средства, и т. н. Определянето на оптималната комбинация и дозирания може да се определи и да се оптимизира, използувайки методи, добре известни в областта на техниката.

Някои специфични комбинации включват следните: L104EA29Yig и CD80 mAbs; L104EA29Yig и CD86 mAbs; L104EA29Yig и gp39 mAbs; L104EA29Yig и CD40 mAbs; L104EA29Yig и CD28 mAbs; L104EA29Yig, CD80 и CD86 mAbs и gp39; L104EA29Yig, CD80 и CD86 и CD40 mAbs; и L104EA29Yig, анти-LFAI mAb, и анти- gp39 mAb. Специфичен пример за gp39 mAb e MR1. Други комбинации ще се оценят лесно, и ще се разберат от лекарите специалисти в областта на техниката.

Разтворимите CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението, например, L104EA29Y, могат да се прилагат като единствена съставна част, или заедно с други лекарства в имунорегулиращи режими, или с други противо-възпалителни средства, например, за лечението, или за предотвратяването на ало-, или ксенографт остро, или хронично отхвърляне, или възпаление, или автоимунни разстройства, или за да се индуцира толерантност. Например, те могат да се използуват в комбинация с инхибитори на калциневрин, например цикпоспорин А, или FK506; с имуносупресорен макролид, например, рапамицин, или негово производно; например, 40-0-(2хидрокси)етил-рапамицин, средство завръщащо левкоцити, например, FTY720, или негов аналог; кортикостероиди; циклофосфамид; азатиопрен; метотрексат; лефлуномид, или негов аналот; мизорибин; микофенолова киселина; микофенолат мофетил; 15-деоксиспергуалин, или негов аналог; имуносупресорни моноклонални антитела, например, монокпонални антитела към левкоцит рецептори, например, МНС, CD2, CD3, CD4, CD 11a/CD18, CD7, CD25, CD27, В7, CD40, CD45, CD58, CD137, ICOS, CD150, (SLAM), 0X40, 4-1ВВ, или други лиганди; или други имуносупресорни съединения, например, CTLA4/ CD28lg, или други инхибитори на адхезията на молекули, например, mAbs, или инхибитори с ниско молекулно тегло, включително LFA-1 антагонисти, антагонисти на Селектин и VLA-4 антагонисти. Съединенията са особено полезни в комбинация със съединение, което интерферира с CD40 и негови лиганди, например, антитела за CD40 и антитела за CD40-L, например, в описаните по-горе индикации, например, индикацията за толеранс.

Където разтворимите CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението се прилагат заедно с други имуносупресорна/имуномодулаторна, или противовъзпълителна терапия, например, както е специфицирано по-горе, дозиранията на едновременно-прилаганото имуносупресорно, имуномодулаторно, или противо-възпълително съединение ще зависят много, разбира се, от вида на едновременно-използуваното лекарство, например, дали то е стероид, или цикпоспорин, от специфичното лекарство, което се прилага, от състоянието, което се лекува, и така нататък.

Като се има предвид посоченото по-горе, настоящето изобретение предоставя, съгласно друг аспект, методи, както се дефинира по-горе, които се състоят в едновременно-приложение, например, съпътсвуващо, или последователно, на терапевтично ефективно количество от разтворими CTLA4 мутантни молекули съгласно изобретението, L104EA29Yig, в свободна форма, или под формата на фармацевтично приемлива сол, и второ лекарствено вещество, като посоченото второ лекарствено вещество да бъде имуносупресорно, имуномодулаторно, или противо-възпълително лекарствено средство, например, както се посочва по-горе. Освен това, предоставят се терапевтични комбинации, например, кит (набор), например, за използуване съгласно който и да е метод, както се дефинира по-горе, съдържащ L104EA29Yig, в свободна форма, или под формата на фармацевтично приемлива сол, което да се използува съпътствуващо, или последователно с най-малко един фармацевтичен състав, съдържащ имуносупресорно, имуномодулаторно, или противо-възпълително лекарствено средство. Наборът може да съдържа инструкции за неговото приложение.

МЕТОДИ ЗА ПРОДУЦИРАНЕ НА МОЛЕКУЛИТЕ СЪГЛАСНО ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Експресиране на CTLA4 мутантни молекули може да бъде в прокариотни клетки. Прокариотите най-често се представят чрез различни бактериални щамове. Бактериите могат да бъдат грам положителни, или грам отрицателни. Характерно, грам-отрицателни бактерии, такива като Е. coli се предпочитат. Други микробиални щамове могат също така да се използуват.

Последователности, кодиращи CTLA4 мутантни молекули могат да се инсерират във вектор, предназначен за експресиране на чужди последователности в прокариотни клетки, такива като Е. coli. Тези вектори могат да включват обичайно използувани прокариотни контролни последователности, които са дефинирани тук че включват промотори за иницииране на транскрибиране, по избор с оператор, заедно с последователности на сайт свързване на рибозоми, включват такива обичайно използувани промотори като бета-лактамазата (пеницилиназа) и лактоза (lac) промоторна система (Chang, et al., (1977) Nature 198:1056), промоторната система на триптофан (trp) (Goeddel, et al., (1980) Nucleic Acids Res. 8:4057) и производния на ламбда Pl промотор, и N-ген рибозом свързващ сайт (Shimatake, et al., (1981) Nature 292:128).

Такива експресиращи вектори трябва също така да включват начала на репликация и избираеми маркери, такива като бета-лактамаза, или неомицин фосфотрансферазен ген, придаващ резистентност към антибиотици, така че векторите могат да реплицират в бактерии, и клетки, осъществяващи плазмидии, могат да се избират всеки път когано са прорастнали в присъствие на антибиотици, такива като ампицилин, или канамицин.

Експресионният плазмид може да се внесе в прокариотни клетки посредством различни стандартни методи, включително, но без да се ограничават от, CaCI₂-shock (Cohen, (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69:2110, и Sambrook et al.(eds.), “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, 2^nd Edition, Cold Spring Harbor Press, (1989)) и електопорация.

Съгласно практиката на изобретението, еукариотни клетки също са подходящи клетки гостоприемници. Примерите за еукариотни клетки включват които и да са животински клетки, първични, или имортализирани, дрожди (например, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pomb, и Pichia pastoris), и растителни клетки. Миелома, COS и СНО клетки са примери за животински клетки, които могат да се използуват като гостоприемници. По-специално СНО клетки включват, но без да се ограничават от, DG44 (Chasin, et al., 1986 Som. Cell. Molec. Genet. 12:555-556; Kolkekar 1997 Biochemistry 36:10901), CHO-K1 (ATCC No. CCL-61), CHO-K1 Tet-Om клетъчна линия (Clontech), СНО обозначен ECACC 85050302 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), СНО клон 13 (GEIMG, Genova, IT), СНО клон B (GEIMG, Genova, IT), CHO-K1/SF обозначен ECACC 93061607 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK), и RR-CHOK1 обозначен ECACC 92052129 (CAMR, Salisbury, Wiltshire, UK). Примерните растителни клетки включват тютюневи (цяло растение, клетъчна култура, или калус), царевични, соеви, и оризови клетки. Царевични, соеви, и оризови семена също са приемливи.

Последователности от нуклеинови киселини кодиращи CTLA4 мутантни молекули могат също така да се инсерират във вектор, предназначен за експресиране на чужди последователности в еукариотен гостоприемник. Регулаторният елемент на вектора може да варира в зависимост с специфичния еукариотен гостоприемник.

Обичайно използувани еукариотни контролни последоС вателности за използуване в експресиращи вектори включват промотори и контролни последователности, съвместими с клетки на бозайници, такива като, например, CMV промотор (CDM8 вектор) и авиан саркома вирус (ASV) (πΙ_Ν вектор). Други обичайно използувани промотори включват ранни и късни промотори от Simian Virus 40 (SV40) (Fiers, et al., (1973) Nature 273:113), или други вирусни промотори, такива като тези, производни на полиома, Adenfvirus 2, и вируса на говежда папилома. Един индуцируем промотор, такъв като hMTII (Karin, et al., (1982) Nature 199:797-802) може също така да се използува.

Вектори за експресиране CTLA4 мутантни молекули в еукариоти също така могат да пренасяг последователности, наречени енхансерни области. Те са важни за оптимизиране на генното експресиране, и са намерени или по посока на, или upstream, или downstream на промотора.

Примерите за експресиращи вектори за еукариотни клетки гостоприемници включват, но без да се ограничават от, вектори за клетки гостоприемници от бозайници (например, BPV-1, pHyg, pRSV, pSV2,pTK2 (Maniatis); pIRES (Clontech); pRc/CMV1,pRc/RSV, pSFV1 (Life Technologies); pVPakc вектори, pCMV вектори, pSG5 вектори (Stratagene)), вектори на ретровируси (например, pFB вектори (Stratagene)), pCDNA-3 (Invitrogen), или техни модифицирани форми, вектори на аденовируси; вектори на адено-асоциирани вируси, вектори на бакуловирус, вектори от дрожди (например, pESC вектори (Stratagene)).

Последователности на нуклеинови киселини кодиращи CTLA4 мутантни молекули могат да се интегрират в генома на еукариотна клетка гостоприемник, и да се реплицират като репликати на генома на гостоприемника. Алтернативно, вектор С пренасящ CTLA4 мутантни молекули може да съдържа начало на репликация, позволяващи екстрахромозомална репликация.

За експресиране на последователности от нуклеинови киселини в Saccharomyces cerevisiae, първоизточник на репликация от ендогенния дрождев плазмид, може да се използува 2μ кръг. (Broach, (1983) Meth. Enz. 101:307). Алтернативно, могат да се използуват последователности от генома на дрожди, способни да предизвикат автономна репликация (виж, например, Stinchcomb et al., (1979) Nature 282:39); Tscemper et al., (1980) Gene 10:157; и Clarke et al., (1983) Meth. Enz. 101:300).

Контролни последователности за транскрибирането на вектори от дрожди включват промотори за синтезирането на гликолитични ензими (Hess et al., (1968) J. Adv. Enzime Reg. 7:149; Holland et al., (1978) Biochemistry 17:4900. Други промотори, известни в областта на техниката включват CMV промотора, предоставен в CDM8 вектора (Toyama and Okayama, (1990) FEBS 268:217-221); промоторът за 3-фосфоглицерат киназа (Hitzeman et al., (1980) J. Biol. Chem. 255:2073), и тези за други гликолитични ензими.

Други промотори са индуцируеми, понеже те могат да се регулиратпосредством стимули от околната среда, или култивационната среда на клетките. Тези индуцируеми промотори включват такива, от гените на протеини от топлинен шок, алкохол дехидрогеназа 2, изоцитохром С, кисела фосфатаза, ензими, асоциирани с азотния катаболизъм, и ензими, отговорни за използуване на малтоза и галактоза.

Регулаторни последователности могат, също така да се намират на 3’-я край на кодиращите последователности. Тези последователности могат да действуват като стабилизират информационна РНК. Такива терминатори се намират на 3’-ата нетранслирана област, след кодиращите последователности в накои гени, получени от дрожди и от бозайници.

Примерните вектори за растения и растителни клетки включват, но без да се ограничават от, Agrobacterium Tj плазмиди, вируса на зелевата мозайка (CaMV), и вируса на златистата мозайка по доматите (TGMV).

Общите аспекти на трансформациите на системата от клетки гостоприемници от бозайници са описани от Axel (U. S. Patent No. 4,399,216 issued Aug. 16, 1983). Клетки на бозайник могат да се транформират чрез методи, включително, но без да се ограничават от, трансфектиране в присъствието на калциев фосфат, микроинжектиране, електопорация, или посредством трансдукция с вирусни вектори.

Методи за въвеждане на чужда ДНК последователности в растителни и дрождеви геноми включват (1) механични методи, такива като микроинжектиране на ДНК в единични клетки, или протопласти, обработване на клетки във вортекс апарат със стъклени перли в присъствие на ДНК, или бомбардиране на волфрамови, или златни сфери, покрити с ДНК в клетки, или протопласти; (2) въвеждане на ДНК, като клетъчни мембрани се правят пропускливи за макромолекули чрез обработване с полиетилен гликол, или като се подлагат на действието на високо волтажни електрически пулсации (електропорация); (3) използуването на липозоми (съдържащи сДНК), които се сливат с клетъчните мембрани.

Експресиране на CTLA4 мутантни молекули може да се открие чрез методи, известни в областта на техниката. Например, мутантните молекули могат да се открият чрез оцветяване на SDS-PAGE гелове по Coomassie и имуноблотинг, използувайки антитела, които свързват CTLA4. Възстановяването на протеина може да се осъществи, като се използуват стандартни начини за пречистване на протеин, например, афинитетна хроматография, или йонно-обменна хроматография, за да се получи в основни линии чист продукт (R. Scopes in “Protein Purification, Principles Practice”, Third Edition, Springer-Verlag (1994)).

Изобретението също така предоставя разтворими CTLA4 мутантни молекули, продуцирани тук по-горе.

МУТАГЕНЕЗИС НА БАЗАТА НА CTLA4lg КОДОН

Съгласно един вариант за изпълнение на изобретението, сйат-насочен мутагенезис и нова скринираща процедура се използуват, за да се идентифицират няколко мутации във извънклетъчния домен на CTLA4, който подобрява склонността към свързване към CD86. Съгласно този вариант за изпълнение, мутации се осъществяват в остатъци в областите на извънклетъчния домен на CTLA4 от серин 25 до аргинин 33, С’ верига (аланин 49 и треонин 51), F веригата (лизин 93, глутаминова киселина 95 и левцин 96), и в областта от метионин 97 до тирозин 102, тирозин 103 до глицин 107 и в G веригата на позиции глутамин 111, тирозин 113 и изолевцин 115. Тези сайтове се избират на базата на изследвания на химерните CD28/ CTLA4 сляти протеини (Peach et al., Exp. Med., 1994, 180:2049-2058), и на утвърдяващия модел, чиито страничните вериги на амино киселинния остатък са изложени на разтворител, и липсата от идентичност на амино киселинния остатък, или хомология на някои позиции между CD28 и CTLA4. Също така, всеки остатък, който е много близо пространсвено (5 до 20 ангстрьомни единици) до идентифицираните остатъци се смята като част от настоящето изобретение.

За синтезирането и за скринирането на разтворими CTLA4 мутантни молекули с променен афинитет към CD80 или CD86, есе приема дву-степенна стратегия. Експериментите най-напред установяват генериране на библиотека от мутации на специфичния кодон на една извънклетъчна част от CTLA4, и след това скринирането им чрез BIAcore анализ, за да се идентифицират мутантите с променена реактивност към CD80, или CD86. Системата за изследване Biacore (Pharmacia, Piscatway, N.J.) използува детекторна система на повърхностен резонанс на плазмон, която в основни линии включва ковалентно свързване било на CD80lg, било на CD86lg към декстран-покрит сензорен чип, който се намира в детектора. След това изпитателната молекула може да се инжектира в камера, съдържаща сензорния чип, и количеството комплементарен протеин, който се свързва, може да се оцени на базата на промяната в молекулната маса, която физически е асоциирана с декстран-. покритата страна сензорния чип; промяната в молекулната маса може да се измери посредством детекторната система.

ПРЕДИМСТВА НА ИЗОБРЕТЕНИЕТО

Тъй като свързването на CTLA4 към CD80 и CD86 се характеризира с голяма “on” скорост и голяма скорост (“off’) на дисоцииране, и понеже CTLA4lg-CD86 комплексите се дисоциират приблизително 5- до 8-пъти по-бързо, отколкото CTLA4lgCD80 комплексите, резонно е, че забавянето на скоростта на дисоцииране на CTLA4lg от CD80 и/или CD86 би довело до молекули с по-мощни имуносупресорни свойства. Така, разтворими CTLA4 мутантни молекули, имащи по-висока активност към CD80- или CD86- позитивни клетки, в сравнение с див тип CTLA4, или не-мутирали форми на CTLA4lg, се приемат да блокират праймирането на антиген специфично активирани клетки с по-голяма резултатност, отколкото див тип CTLA4, или не-мутирали форми на CTLA4lg.

Освен това, продуцирането на CTI_A4lg струва много скъпо. Мутантните молекули CTLA4lg с висока склонност, имащи по-високи имуносупресорни свойства, могат да се използуват в клиниката, в значително по-ниски дози, отколкото не-мутирали CTI_A4lg, за постигане на подобни нива на имуносупресиране. Така, разтворими CTLA4 мутантни молекули, например, L104EA29Yig, могат да имат много скъпа ефективност.

Следващите примери са представени, за да илюстрират настоящето изобретение, и да подпомогнат специалистите в областта на техниката при получаването, и при използуването на същите. Примерите не ограничават по никакъв начин обхвата на изобретението.

ПРИМЕРИ

Пример 1

Този пример дава описание на методите, използвани за създаване на нуклеотидни последователности, кодиращи разтворимите CTLA4 мутантни молекули на изобретението. Създаден е мутант с единичен сайт L104Elg и е тестиран за кинетика на свързване с CD80 и/или CD86. L104Elg нуклеотидната последователност е използвана като матрица за създаване на дву-сайтова г* мутантна CTLA4 последователност, L104EA29Ylg, която е тестирана за кинетика на свързване с CD80 и/или CD86.

Мутагенеза на базата на CTLA4lg кодон:

Създадена е стратегия за мутагенеза и скрининг за идентифициране на CTLA4lg молекули, които имат по-бавна скорост на дисоциация (“off’ скорости) в сравнение с CD80 и/или CD86 молекули. Създадени са мутантни нуклеотидни последователности с единичен сайт като е използван CTLA4lg (U.S. Patent Nos: 5,844,095; 5,851,795; и 5,851,796; ATCC ключов No.68629) като матрица. Мутагенни олигонуклеотидни PCR праймери са планирни за случайна мутагенеза на специфичен кДНК кодон, като се допуска всяка база в позиции 1 и 2 на кодона, но само гуанин или тимидин в позиция 3 (XXG/T; също известен като NNG/T). По този начин, специфичен кодон, кодиращ аминокиселина, може да бъде случайно мутиран да кодира всяка от 20-те аминокиселини. В това отношение, XXG/T мутагенеза дава 32 потенциални кодона, кодиращи всяка от 20-те аминокиселини. PCR продукти, кодиращи мутации в непосредствена близост до -M97-G107 на CTLA4lg (виж Фигура 7 (SEQ ID NOS:3 и 4) или 8 (SEQ ID NOS: 5 и 6)), са хидролизирани със Sacl/Xbal и са субклонирани в подобен отрязък CTLA4lgTtLN (известен още като piLN) екстпресионен вектор. Този метод е използван за създаване на единичен-сайт CTLA4 мутантната молекулаИ04Е1д (Фигура 8 (SEQ ID NOS: 5 и 6).

За мутагенеза в близост до S25-R33 на CTLA4lg, един тих Nhel сайт най-напред е въведен от 5’ края на тази бримка, с PCR праймер-насочена мутагенеза. PCR продукти са хидролизирани с Nhel/Xbal и са субклонирани в подобно срязани CTLA4lg или L104Eig експресионни вектори. Този метод е използван за създаване на ^w двоен сайт CTLA4 мутантна молекула L104EA29Ylg (Фигура 7; SEQ ID NOS: 3 и 4). По-специално, молекулата нуклеинова киселина, кодираща единичен-сайт CTLA4 мутантната молекула, L104Elg, е използвана като матрица за създаване на двоен-сайт CTLA4 мутантната молекула, L104EA29Ylg. Векторът piLN, притежаващ L104EA29Ylg е представен във Фигура 12.

Пример 2

Следващото дава описание на скрининг методите, използвани за идентифициране на единичен- и двоен-сайт CTLA4 полипептиди, експресирани от конструктите, описани в Пример 1, които проявяват по-висока свързваща склонност за CD80 и CD86 антигени, в сравнение с не-мутираните CTLA4lg молекули.

Настоящи in vitro и in vivo проучвания показват, че CTLA4lg сам по себе си не е способен напълно да блокира праймирането на антиген специфично активирани Т клетки. Проучвания in vitro с CTLA4lg и или моноклонално антитяло, специфично за CD80, или CD86 измеримо инхибиране на Т клетъчна пролиферация показват, че анти-CDeo моноклонално антитяло не увеличава CTLA4lg инхибиране. Обаче, анти- CD86 моноклонално антитяло увеличава CTLA4lg инхибирането, което показва, че CTLA4lg не е така ефективно за блокиране на CD86 взаимодействията. Тези данни подчертават по-ранните заключения направени от Linsley et al. (Immunity, (1994), 1:793-801), показвайки инхибиране на С080-медиирани клетъчни отговори, изискващи приблизително 100 пъти по-ниски CTLA4lg концентрации, отколкото за СО86-медиирани отговори. На базата на тези заключения, предполага се, че разтворими CTLA4 мутантни молекули, имащи по-голяма склонност за CD86, отколкото див тип CTLA4 трябва да са по-способни да блокират прайминга на антиген специфично активирани клетки, отколкото CTLA4lg.

Към този край, разтворимите CTLA4 мутантни молекули, описани в пример 1 по-горе се скринират, използувайки процедура на скриниране за идентифициране на няколко мутации в извънклетъчния домен на CTLA4, който подобрява склонността за свързване за CD80 и CD86. Тази стратегия на скриниране предоставя ефективен метод за директно идентифициране на мутанти с очевидно ниски “off” скорости без необходимостта от пречистване на протеина, или количествено определяне тъй като “off” скоростното определяне е независимо от концентрация (O’Scannessy et al., (1993) Anal. Biochem., 212:457-468).

COS клетки се трансфектират c индивидуален miniprep пречистен c плазмидна ДНК и разпространен в продължение на няколко дни. Три дневна културална среда се прилага върху BIAcor биосензорни чипове (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Sweden) покрити c разтворим CD80lg, или CD86lg. Специфичното свързване и дисоцииране на мутантни протеини се измерва чрез повърхностен резонанс на плазмон (O’Shannessy, D. J., (1993) Anal. Biochem. 212:457-468). Всички експерименти се провеждат с BIAcor™, или BIAcor™ 2000 биосензори при 25°С. Лиганди се обездвижват със сензорни чипове NCM5 чисти за анализ (Pharmacia), използувайки стандартно М-етил-№-(диметиламинопропил) карбодиимидИ-хидроксисукцинимид свързване (Johnson, В., et al. (1991) Anal. Biochem. 198: 268-277; Khilko,

S. N., etal. (1993) J. Biol. Chem 268:5425-15434).

Метод на скриниране

COS клетки, прорастнали в 24 ямкава блюда с тъканна култура се трансфектират влеменно с ДНК кодиращ мутант CTLA4lg. Културална среда, съдържаща секретиран разтворим мутант CTLA4lg се събира 3 дена по-късно.

Кондиционирана COS клетъчна културална среда се оставя да тече върху BIAcor биосензорни чипове, производни от CD86lg, или CD80lg (както е описано в Green et al., 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771), и мутантни молекули се идентифицират с “off’ скорости по-бавни от тези, наблюдавани за див тип CTLA4lg. сДНК съответствуваща на избраните проби от средата се секвенира, и се получава ДНК, за да се даде възможност за по-голяма гама на временно трансфектиране на COS клетки, от които се получава мутантен CTLA4lg протеин, последван от А пречистване на културална среда.

Данни за условията от BIAcor анализ и данни равновесие на свързване се получават, както се описва в J. Green et al. 1996 J. Biol. Chem. 271:26762-26771, и както е описано тук.

Данни от BIAcor анализ

Базовата линия на Senosorgram се нормализира на нула единици отговор (RU) преди анализа. Пробите се преливат над mock-производни протичащи клетки за определяне стойностите на единицата (RU) на отговора на фона, дължаща се на големината на различията на индекси на рефракция между разтвори. Равновесните константи на дисоциация (K_d) се изчисляват от чертежите на R_eq спрямо С, където R_eq е отговора с постоянно състояние минус отговора на mock-производен чип, и С е моларната концентрация на анализа. Кривите на свързване се анализират, използувайки търговски нелинеен софтуер за чертане на криви (Prism, GraphPAD Sostware).

Експериментални данни най-напред се измерват на модела за свързване на единична лиганда към единичен рецептор (1-сайтов модел, например, обикновенна система langmuir, Α+ΒθΑΒ), и равновесни асоциационни константи (Κ_ά=[Α]·[Β]\[ΑΒ]) се изчисляват от уравнението R=Rmax*C/(K_d+C). След това данните се измерват на най-простия дву-сайтов модел за свързване на лиганда (например, към рецептор, имащ два не-взаимодействуващи си независимо свързващи сайтове, както се описва от уравнението R=Rmax1*C\(K_di+C)+R_max2*(K_d2+C)).

Най-силните подготовки на тези модели се анализират визуално, като се сравняват с експериментални данни и статистически чрез F изследване със суми от квадрати. По-простият едно-сайтов модел се избира като най-доброто измерване, освен в случаите, когато измерването на дву-сайтовия модел е значително по-добро (р<0,1).

Асоциационни и дисоциационни анализи се осъкествяват, използувайки BIA evaluation 2.1 Software (Pharmacia). Скоростната константа на асоциация к_оп се изчислява по два начина, допускайки и хомогенни едно-сайтови взаимодействия, и успоредни дву-сайтови взаимодействия. За едно-сайтови взаимо действия, к_оп стойностите се изчисляват съгласно уравнението Rt=R_eq(1-exp’^ks(t'^to), където Rt е отговор на определено време, t; Req е отговор в постоянно състояние; to е времето на началото на инжектирането; и ks=dR/dt=kon*CkOffq и където С е аналитичната концентрация, изчислена като мономерни свързващи сайтове. За дву-сайтови взаимодействия, kon стойностите се изчисляват съгласно уравнението Rt=Req(1-exp'^ks1(t’^to⁾+Req2(1-exp^ks2(t'^to⁾. За всеки модел, стойностите на k_on се определят от изчисления наклон (до приблизително 70% максимална асоциация) на чертежа на k_s спрямо С.

^w Дисоциационни данни се анализират съгласно модели с един сайт (АВ=А+В), или с два сайта (AiBj=Ai+Bj), и скороства константа (к_оп) се изчислява от най-добре измерените криви. Модела на свързващ сайт се използува с изключение на случаи, когато остатъчните са по-големи отколкото фона на апаратурата (2-10 RU, съгласно апаратура), като в такъв случай се използува модела с два свързващи сайта. Полу-времето на заемането от рецептора се изчислява, използувайки отношението ti/₂=0,693/k_off.

^v Поточна цитрометрия

Миши гпАЬ1_307.4 (анти-С080) се купува от Becton Dickinson (San Jose, California), a IT2.2 (анти-В7-0 [също така известно като CD86]), от Pharmingen (San Diego, California). За имунооцветяване, СО80-позитиви и/или СО86-позитиви СНО клетки се отнемат от с техните културални съдове чрез инкубиране във физиологичен разтвор буфериран с фосфатен буфер (PBS), съдържащ 10 mM EDTA. Клетките СНО (1-10 х 10⁵) найнапред се инкубират с mAbs, или имуноглобелин слят протеин в DMEM, съдържащ 10 % ембрионален говежде серум (FBS),

/ съответствуващ на последните седем амино киселини (например, амино киселини 118 - 124) в извънклетъчния домен на CTLA4, и съдържащ рестрикционен ензимен сайт, и стоп кодон (TGA). обратния праймер специфицирал C120S (цистеин до серин на позиция 120) мутация. По-специално, нукпеотидната последователност GCA (нуклеотиди 34 - 36) на обратния праймер, показан по-горе, се реплицира с една от следните нуклеотидни последователности: AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, или GCT. Ккато забелязват специалистите в областта на техниката, нукпеотидната последователност GCA е обратна комплементарна последователност на кодона TGC за цистеин. По подобен начин, нуклеотидните последователности AGA, GGA, TGA, CGA, ACT, или GCT са обратни комплементарни последователности на кодона за серин. Продукти на верижна реакция на полимераза се усвояват с Hind/lll/Xbal и направо се субклонират в експресионния вектор πΙ_Ν (Bristol-Myers Squibb Company, Princeton, NJ). L1O4EA29YX_Ci2os се получава no идентичен начин. Всяка структура се проверява чрез ДНК секвениране.

Идентифициране и биохимично охарактеризиране на мутанти с голяма склонност

Двадесет и четири амино киселини се избират за мутагенезис и получените ~ 2300 метантни протеини се изследват за CD86lg свързване с резонанс на повърхностен плазмон (SPR; както се описва, supra). Предоминантните ефекти на мутагенезиса на всеки сайт се сумират в таблица II. Рандомизиран мутагенезис на някои амино киселини в S25 - R33 видимо не изменят свързването на риганда. Мутагенезис на Е31 и R33 и остатъци М97 - Y102 видимо водят до намаляване свързването на лиганда. Мутагенезис на остатъци, S25, А29, и ТЗО, К93, L96, Υ103, L104, и G105, водят до протеини с малки “on” и/или малки “off” скорости. Тези резултати потвърждават схващането, че остатъци в областта S25 - R33, и остатъци в, или близо до М97 - Y102 влияят върху свързването на лиганда (Peach etal., (1994) J. Exp. Med., 180:2049-2058.

Мутагенезис на сайтове S25, ТЗО, К93, L96, Y103, и G105 водят до идентифицциране на някои мутантни протеини, които са имали по-малки “off’ скорости от CD86lg. Обаче, в такива моменти, HHCKaTa“off’ скорост се компрометира от ниската “onf скорост, която води до мутантни протеини с повече склонност за CD86lg, отколкото е било очевидно подобно на това, наблюдавано с див тип CTI_A4lg. Освен това, мутагенезис на Н93 води до значително агрегиране, което може да е отговорно за наблюдаваните кинетични промени.

Рандомна мутагенеза на L104, последвана от трансфектиране на COS клетки и скриниране с SPR на пробите културална среда върху неподвижен CD86lg дава шест проби на културална среда, съдържащи мутантни протеини с приблизително 2-кратно по-малки “off’ скорости, отколкото див тип CTLA4lg. Когато съответстващата сДНК на тези мутанти се секвенира, установява се, че всеки един кодира левцин до глутаминова киселина мутация (L104E). Очевидно, заместване на левцин 104 до аспарагинова киселина (L104D) не засяга CD86lg свързване.

След това мутагенезата се повтаря за всеки от сайтовете, изброени в таблицаП, използувайки в това време L104E като PCR матрица вместо див тип CTLA4lg, съгласно описаното погоре. SPR анализ, използуващ отново обездвижен CD86lg, идентифицирани шест проби културална среда от мутагенезиса на аланин 29 с протеини, имащи приблизително 4-кратно помълки “off” скорости, отколкото див тип CTLA4lg. Двата найбавни са тирозин замествания (L104EA29Y), два са тирозин (L104EA29L), един е триптофан (L104EA29W), и един е треонин (L104EA29T). Очевидно, мутанти с не-малка “off’ скорост се идентифицират, когато аланин 29 е мутирал рандомизирано, сам, в див тип CTLA4lg.

Относителната молекулна маса и състояние на агрегация на пречистен L104E и L104EA29Yig се оценяват посредством SDS-PAGE и хроматография с изключване по размер. L104EA29Yig (~ 1 цд; ивица 3) и L104Eig (~ 1 цд; ивица 2) очевидно имат еднаква електрофоретична подвижност като CTLA4lg (~ 1 цд; ивица 1) в условия на редуциране (~ 50 kDa; + βΜΕ; плюс 2-меркаптоетанол) и в не-редукционни (- 100 kDa; - βΜΕ) условия (фигура 10А).

Хроматографията с изключване по размер демонстрира, че L104EA29Ylg (фигура 10С) очевидно има същата подвижност както димерен CTLA4lg (фигура 10В). Главният пик представлява протеин димер, докато малкият пик на по-бавно елуиране на фигура 10В представлява агрегати с по-голямо молекулно тегло. Приблизително 5,0 % от CTLA4lg се представят като агрегати с по-голямо молекулно тегло, но няма очевидност за агрегиране на L104EA29Ylg, или L104Elg. Поради това, поздравото свързване към CD86lg, наблюдавано с L104Elg и L104EA29Yig не би трябвало да се причислява към агрегация, индуцирана от мутагенезис.

Анализ на равновесие и кинетика на свързването

Анализът на равновесие и кинетика на свързването се осъществява с протеин А пречистени CTLA4lg, L104Elg, и

L104EA29Yig, използувайки повърхностен резонанс на плазмон (SPR). Резултатите са показани на таблица I. Наблюдаваната равновесна дисоциационна константа (K_d; таблица I), се изчислява от кривите на свързване, генерирани в обхват от концентрации (5,0 - 200 пМ). L104EA29Yig се свързва по-здраво към CD86lg, отколкото L104Elg, или CTLA4lg. По-ниската K_d на L104EA29Yig (3,2 пМ), отколкото на L104Elg (6,06 пМ), или на CTLA4lg (13,9 пМ), показва по-висока склонност за свързване на L104EA29Yig към CD86lg. По-ниската K_d на L104EA29Yig (3,66 пМ), отколкото на L104Elg (4,47 пМ), или на CTLA4lg (6,51 пМ), показва по-висока склонност за свързване на L104EA29Yig към CD80lg.

Анализът на кинетиката на свързване разкрива, че сравнителните “on” скорости за CTLA4lg, L104Elg, и L104EA29Yig свързване кам CD80 са подобни, както са “on” скоростите за CD86lg (таблица I). Обаче, “off’ скоростите на тези молекули не са еквивалентни (таблица I). В сравнение с CTLA4lg, L104EA29Ylg има приблизително 2-кратно по-малка “off” скорост от CD80lg, и приблизително 4-кратно по-малка “off’ скорост от CD86lg. L104E има “off” скорости междинни между L104EA29Yig и CTLA4lg. Тъй като въвеждането на такива мутации не засяга чувствително “on” скоростите, повишаването на склонността за CD80lg и CD86lg, наблюдавана с L104EA29Yig като че ли се дължи първостепенно на понижение на “off’ скоростите.

За да се определи дали повишаването на склонността на L104EA29Ylg за CD86lg и CD80lg се дължи на мутациите, засягащи начина, по който всеки един мономер се асоциира като димер, или дали има склонност, усилваща структурни промени, въвесени във всеки мономер, едноверижни структури от извънклетъчни домени на CTLA4 и L104EA29Y се получават след мутагенезис на цистеин 120 до серин, съгласно описаното supra, и от Linsley et al., (1995) J. Biol. Chem., 270:15417-15424. Пречистените протеини CTI_A4X_Ci2os и L1O4EA29YX_Ci2os показват, че са мономерни чрез гел проникваща хроматография (Linsley et al., (1995), supra), преди свойствата на техните лиганди за свързване да се анализират чрез SPR. Резултатите показват, че афинитетът към свързване на двата мономерни протеина към CD86lg са приблизително 35 - 8—кратно помалки, отколкото наблюдаваните за техните съответни димери (таблица I). Това поддържа публикуваните преди това данни, установяващи, че димеризирането на CTLA4 се изисква за лиганди с голяма склонност към свързване (Green et al., (1996) J. Biol. Chem., 271:26762-26771).

L1O4EA29YX_Ci2os се свързва c приблизително 2-кратно поголям афинитет, отколкото CTLA4X_Ci2os както към CD80lg, така и към CD86lg. Повишеният афинитет се дължи на приблизително 3-кратно по-малка скоростна дисоцииране от двата лиганда. Поради това, по-здравото свързване на лиганди от L104EA29Y по-вероятно се дължи на усилващи склонността структурни промени, които се въвеждат във всяка една мономерна верига, по-скоро, отколкото на изменения, при които молекулата се димеризира.

Анализ на местоположението и структурата на усилващи склонността мутации

Структурата на течността на извънклетъчния lgV-подобен домен неотдавна беше определен посредством NMR спектроскопия (Metzler et al., (1997) Ndture Struct. Biol., 4:527-531. Това позволява акуратно местоположение на левцин 14 и аланин 29

54.

/»·* Чвг в тридимензионалното нагъване (Фигура 11). Левцин 104 е разположен близо до високо консервираната MYPPPY (SEQ ID N0:9) аминокиселинна последователност. Аланин 29 е разположен близо до С-терминалния край на S25-R33 областта, която е пространствено съседна на MYPPPY (SEQ ID N0:9) област. Тъй като има значително взаимодействие между остатъци в основата на тези области, има видимо не пряко взаимодействие между L104 и А29 , въпреки че те и двете съдържат част от съседна хидрофобна сърцевина в протеина. Структурните последици от двете повишаващи склонността мутации, са определени чрез моделиране. A29Y мутация може лесно да бъде настанена в цепнатината между S25-R33 областта и MYPPPY (SEQ ID N0:9) областта, и може да служи за стабилизиране конформацията на MYPPPY (SEQ ID N0:9) областта. У дивия тип CTLA4, L104 образува големи хидрофобни взаимодействия с L96 и V94 близо до MYPPPY (SEQ ID NO: 9) областта. Много невероятно е, глутаминова киселина мутацията да придобива конформация, сходна с тази на L104 по две причини. Първо, има недостатъчно пространство за да се помести по-дългата странична верига на глутаминова киселина в структурата, без значимо смущение в S25-R33 областта. Второ, енергетичните разходи за покриване на отрицателния заряд на веригата на глутаминовата киселина в хидрофобната област биха били големи. Вместо това, моделиращи проучвания предсказват, че страничната верига на глутаминовата киселина се избутва навън по повърхността, където нейните заряди могат да бъдат стабилизирани чрез солватиране. Такава конформационна промяна може лесно да бъде приспособена с G105, с минимална деформация към други остатъци в областите.

Свързване на мутанти с голяма склонност към СНО клетки експресиращи CD80, или CD86

FACS анализиране (фигура 2) на свързване на CTLA4 и мутантни молекули към стабилни трансфектирани CD80+ и CD86+CHO клетки, се осаществява както се описна тук. С080-позитивни и СО86-позитивни СНО клетки се инкубират с повишаващи концентрации CTLA4lg, L104EA29Ylg, или L104Elg, и след това се промиват. Свързан имуноглобулин слят протеин се открива, използувайки флуоресцеин изотиоцианатконюгиран кози анти-човешки имуноглобулин.

Както е показано на фигура 2, CD80- позитивни и CD86позитивни СНО клетки (1,5x10⁵) се инкубират с посочените концентрации на CTLA4lg (затворени квадрати), L104EA29Ylg (кръгове), или L104Elg (триъгълници) за 2 часа при 23°С, промиват се, и се инкубират с флуоресцеин изотиоцианат-конюгиран кози анти-човешки имуноглобулин антитяло. Свързване общо на 5,000 жизнеспособни клетки се анализира (единично определяне) с FACScan, и средния интензитет на флуоресценция (MFI) се определя от данни на хистограми, използувайки PC-LYSYS. Данните се корегират за измерения фон на флуоресценция само на инкубирани клетки с втора степен на реактив (MFI = 7). Контролен L6 mAb (80 gg/ml) дава MFI < 30. Тези резултати са представителни за четири независими експерименти.

Свързване на L104EA29Ylg, L104Elg, и CTLA4lg към човешки С080-трансфектирани СНО клетки е приблизително еквивалентно (фигура 2А). L104EA29Ylg и L104Elg се свързват по-здраво към СНО клетки стабилно трансфектирани с човешки CD86, отколкото CTLA4lg (фигура 2В).

Функционално оценяване:

Човешки СО4-позитивни Т клетки се изолират чрез имуномагнетична негативна селекция (Linsley et al., (1992) J. Exp. Med. 176:1595-1604). Изолираните СО4-позитивни T клетки се стимулират с форбал миристат ацетат (РМА) плюс CDSO-позитивни и СО86-позитивни СНО клетки в присъствие на титриращи концентрации инхибитор. СО4-позитивни Т клетки (8 - 10 х 10⁴/ямка) се култивират в присъствие на 1 пМ РМА с, или без облъчени СНО клетъчни стимулатори. Пролиферативни отговори се измерват чрез прибавяне на 1 μθΐ/ямка от [ЗН]тимидин в продължение на 7 часа на 72 часова култура. Инхибиране на РМА плюс С080-позитивни СНО, или CD86позитивни СНО, стимулирани Т клетки чрез L104EA29Ylg и CTLA4lg се осъществява. Резултатите са показани на фигура 3. L104EA29Ylg инхибира пролиферирането на СО80-позитивни СНО клетки третирани с РМА, повече, отколкото CTLA4lg (фигура ЗА). L104EA29Ylg също е по-ефективен, отколкото CTLA4lg при инхибиране пролиферирането на СО86-позитивни СНО клетки третирани с РМА (фигура ЗВ). Поради това, L104EA29Ylg е по-мощен инхибитор иза двете - и за CD80-, и за СО86-медиирана ко-стимулиране на Т клетки.

Фигура 4 показва инхибиране с L104EA29Ylg и CTLA4lg на алостимулирани човешки Т клетки, получени по-горе, и следващо алостимулиране с човешки В лимфобластоидна клетъчна линия (LCL) наречена РМ, която експресира CD80 и CD86 (Т клетки при 3,0 х 10⁴/ямка и РМ при 8,0 х 10³/ямка). Първично алостимулиране става за 6 дни, след това клетките се пулсират с ³Н-тимидин за 7 дни, преди да се определи инкорпориране на радиоактивен изотоп.

Вторично алостимулиране се осъществява както следва. Седем дневни първично алостимулирани Т клетки се събират чрез лимфоцит разделяща среда (LSM) (ICN, Aurora, OH), и остават в продължение на 24 часа. След това Т клетките се стимулират отново (вторично), в присъствие на титруващи количества CTLA4lg, или L104EA29Ylg, чрез прибавяне на РМ в същото съотношение както по-горе. Стимулиране става за 3 дни, след това клетките се пулсират като се бележат радиоактивен изотоп и се събират както по-горе. Ефектът на L104EA29Ylg върху алостимулирани Т клетки е показан на фигура 4А. Ефектът на L104EA29Ylg върху алостимулирани Т клетки е показан на фигура 4В. L104EA29Ylg инхибира и първични и вторични отговори на пролиферативни Т клетки подобре отколкото CTLA4lg.

За измерване продуцирането на цитокини (фигура 5), двойни алостимулационни плата се приготвят. След 3 дни, културалната течност се изследва, използувайки кит (набор) ELISA (Biosource, Camarillo, СА), използувайки условията, препоръчвани от производителя. Установява се, че L104EA29Ylg е помощен, отколкото CTLA4 при блокиране продуцирането на Т клетки IL-2, IL-4, и γ-IFN цитокин, след вторично алогенно стимулиране (фигури 5А - С).

Ефектите от CTLA4lg върху отговор смесени лимфоцити от маймуни (MLR) са показани на фигура 6. Мононукпеарни клетки от периферна кръв (PBMC’S; 3,5 х 10⁴ кпетки/ямка от всяка маймуна) от 2 маймуни се пречистват в среда разделяща лимфоцити (LSM) и се смесват с 2 pg/ml фитохемаглутинин (РНА). Клетките се стимулират 3 дена, след това се пулсират и бележат с радиоактивен изотоп 16 часа преди събирането.

L104EA29Ylg инхибирано пролифериране на маймунски Т клетки е по-добро, отколкото с CTLA4lg.

Таблица I

Равновесната и видимата кинетична константи са дадени в следващата таблица (стойностите са средни ± стандартно отклонение от три различни експерименти):

Обездвижен протеин	аналитично	K„„(x10⁵) M'¹ S‘¹	K_off(x 10'³) S'¹	K_d nM
CD80lg	CTLA4lg	3,44±0,29	2,21±0,18	6,51±1,08
CD80lg	L104Elg	3,02±0,05	1,35±0,08	4,47±0,36
CD80lg	L104EA29Ylg	2,96±0,20	1,08±0,05	3,66±0,41
CD80lg	CTI_A4Xci2os	12,0±1,0	230±10	195±25
CD80lg	L1O4EA29YX_Ci2os	8,3±0,26	71±5	85±2,5
CD86lg	CTLA4lg	5,95±0,57	8,16±0,52	13,9±2,27
CD86lg	L104Elg	7,03±0,22	4,26±0,11	6,06±0,05
CD86lg	L104EA29Ylg	6,42±0,40	2,06±0,03	3,21±0,23
CD86lg	CTLA4Xci2os	16,5±0,5	840±55	511±17
CD86lg	L104EA29YXci2os	11,4±1,6	300±10	267±29

Таблица II

Ефекта на CD86lg ссвързване от мутагенезис на CTLA4lg върху изброените сайтовете се определя чрез SPR, описан supra. Преобладаващият ефект е отбелязан със знак

Мутагенезисен	Ефекти	Намалено
сайт		от мутагенезис	свързване
			на лиганди
	Няма	Малка
	видим ефект	“оп”скорост/малка “oif'CKopocT
S25		+
Р26	+
G27	+
К28	+
А29		+
ТЗО		+
Е31			+
R33			+
К93		+
L96		+
М97			+
Y98			+
Р99			+
Р100			+
Р101			+
Y102			+
Y103		+
L104		+
G105		+

1106	+
G107	+
Q111	+
Y113	+
1115	+

Както е очевидно за специалистите в областта на техниката, за които се отнася изобретението, настоящето изобретение може да има варианти за изпълнение под форми, различни от тези, описани специфицирано по-горе, без с това да се излиза от духа, или от основните характеристики на изобретението. По-специалните варианти за изпълнение на изобретението, описани по-горе, поради това трябва да се смятат като илюстриращи, а не ограничаващи. Обхватът на настоящето изобретение, както се посочва ясно в приложените патентни претенции, не се ограничава от примерите, които се съдържат в горното описание.

Claims

ПАТЕНТНИ ПРЕТЕНЦИИ

1. CTLA4 мутантна молекула, която свързва CD80 и/или CD86, съдържаща извънклетъчен домен на CTLA4, така че в извънклетъчния домен (а) аланин на позиция +29 е заместен с амино киселина, избрана от групата, състояща се от тирозин, левцин, триптофан, и треонин, и (Ь) левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина.
2. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че също така съдържа амино киселинна последователност, която изменя разтворимостта, афинитета, или валентността на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.
3. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че амино киселинната последователност съдържа човешка имуноглобулин константна област.
4. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 2, характеризираща се с това, че също така съдържа амино киселинна последователност, която дава възможност за секретиране на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.
5. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 4, характеризираща се с това, че амино киселинните последователности съдържат онкостатин М сигнален пептид.
6. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че съдържа метионин на позиция +

1 и аспарагинова киселина на позиция +124, както е показано на фигура 7.
7. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 1, характеризираща се с това, че съдържа аланин на позиция -1 и аспарагинова киселина на позиция +124, както е показано на фигура 7.
8. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 3, характеризираща се с това, че човешката имуноглобулин константна област е мутирала да включва цистеин на позиция +130, заместен със серин, цистеин на позиция +136, заместен със серин, цистеин на позиция +139, заместен със серин, и пролин на позиция +148, заместен със серин, както е показано на фигура 7.
9. CTLA4 мутантна молекула, която свързва с по-голяма склонност към CD80 и/или CD86, отколкото CTLA4, съдържаща извънклетъчен домен на CTLA4, като в извънклетъчния домен, аланин на позиция +29 е заместен с тирозин, а левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина както е показано на фигура 7.
10. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че също така съдържа амино киселинна последователност, която изменя разтворимостта, афинитета, или валентността на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.
11. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че съдържа амино киселинна последователност, съдържаща човешка имуноглобулин константна област.
12. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 10, характеризираща се с това, че също така съдържа амино киселинна последователност, която дава възможност за секретиране на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.
13. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 12, характеризираща се с това, че амино киселинната последователност съдържа онкостатин М сигнален пептид.
14. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че съдържа метионин на позиция +1 и аспарагинова киселина на позиция +124, както е показано на фигура 7.
15. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 9, характеризираща се с това, че съдържа аланин на позиция -1 и аспарагинова киселина на позиция +124, както е показано на фигура 7.
16. CTLA4 мутантната молекула съгласно претенция 11, характеризираща се с това, че човешката имуноглобулин константна област е мутирала да включва цистеин на позиция +130, заместен със серин, цистеин на позиция +136, заместен със серин, цистеин на позиция +139, заместен със серин, и пролин на позиция +148, заместен със серин, както е показано на фигура 7.
17. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, която свързва с по-голяма склонност към CD80 и/или CD86, отколкото CTLA4, съдържаща извънклетъчен домен на CTLA4, като в извънклетъчния домен, левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина както е показано на фигура 8.
18. Молекула нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща амино киселинна последователност, съответстваща на разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 1.
19. Молекула нуклеинова киселина, съдържаща нуклеотидна последователност, кодираща амино киселинна последователност, съответстваща на разтворимата CTLA4 мутантна молекула, съгласно претенция 9.
20. Молекулата нуклеинова киселина, съгласно претенция

18, характеризираща се с това, че има нуклеотидна последователност, започваща с аденин на нуклеотидна позиция +1, и завършваща с аденин на +1071, както е показано на фигура 7 или 8.
21. Молекулата нуклеинова киселина, съгласно претенция

19, характеризираща се с това, че има нуклеотидната последователност, започваща с аденин на нуклеотидна позиция +1, и завършваща с аденин на +1071, както е показано на фигура 7 или 8.
22. Молекулата нуклеинова киселина, съгласно претенция

18, характеризираща се с това, че има нуклеотидната последователност, започваща с гуанин на -3, и завършваща с аденин на +1071, както е показано на фигура 7 или 8.
23. Молекулата нуклеинова киселина, съгласно претенция

19, характеризираща се с това, че има нуклеотидната последователност, започваща с гуанин на -3, и завършваща с аденин на +1071, както е показано на фигура 7 или 8.
24. Вектор, съдържащ нуклеотидната последователност, Q съгласно която и да е от претенции 18 да 23.
25. Вектор, кодиращ L104EA29Ylg, означен като pD16 L104EA29Ylg и депозиран в АТСС като АТСС № РТА-2104.
26. Векторна система гостоприемник, съдържаща вектор от претенция 24 или 25 в подходяща клетка гостоприемник.
27. Векторна система гостоприемник, съгласно претенция 26, където подходящата клетка гостоприемник е бактериална клетка, или еукариотна клетка.
28. Клетка гостоприемник, имаща вектора от претенция 24, или 25.
29. Клетката гостоприемник съгласно претенция 28, характеризираща се с това, че е еукариотна клетка.
30. Клетката гостоприемник съгласно претенция 29, характеризираща се с това, че еукариотната клетка е COS клетка.
31. Клетката гостоприемник съгласно претенция 29, характеризираща се с това, че еукариотната клетка е Chinest Hamster Ovary (СНО) клетка.
32. Клетката гостоприемник съгласно претенция 31, характеризираща се с това, че СНО клетката се избира от групата, състояща се от DG44, СНО-К1, СНО-К1 Tet-On клетъчна линия, СНО се обозначава като ЕСАСС 85050302, СНО клон 13, СНО клон В, CHO-H1/SF, RR-CHOK1.
33. Метод за продуциране на разтворим CTLA4 мутантен протеин, характеризиращ се с това, че се състои в прорастване на векторната система гостоприемник съгласно претенция 26, така че да се продуцира CTLA4 мутантния протеин в клетката гостоприемник, и възстановяване на така продуцирания протеин.
34. Метод за продуциране на L104EA29Ylg, характеризиращ се с това, че се състои в прорастване на векторната система гостоприемник съгласно претенция 28, така че да се продуцира L104EA29Ylg в клетката гостоприемник, и възстановяване на така продуцирания протеин.
35. Разтворим CTLA4 мутантен протеин, продуциран съгласно метода на претенция 33.
36. L104EA29Yig, продуциран съгласно метода на претенция 34.
37. Метод за регулиране на Т клетъчно взаимодействие с CD80 и/или CD86 позитивна клетка, характеризиращ се с това, че се състои в контактуване на CD80 и/или CD86 позитивната клетка с разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 1, така че да се образува комплекс CTLA4 мутантна молекула/ CD80, или CTLA4 мутантна молекула/СО86, като комплексът интерферира с взаимодействие между Т клетката и CD80 и/или CD86 позитивната клетка.
38. Метод за регулиране на Т клетъчно взаимодействие с CD80 и/или CD86 позитивна клетка, характеризиращ се с това, че се състои в контактуване на CD80 и/или CD86 позитивната клетка с разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 9, така че да се образува комплекс CTLA4 мутантна молекула/С080, или CTLA4 мутантна молекула/СО86, комплексът интерфериращ с взаимодействие между Т клетката и CD80 и/или CD86 позитивната клетка.
39. Методът съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че разтворимата CTLA4 мутантна молекула съдържа извънклетъчен домен на CTLA4, където в извънклетъчния домен, левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина, както е показано на фигура 8.
40. Методът съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че CD80 и/или CD86 позитивната клетка контактува с фрагмент, или с производно на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.
41. Методът съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че CD80 и/или CD86 позитивната клетка контактува с фрагмент, или с производно на разтворимата CTLA4 мутантна молекула.

^:W*'
42. Методът съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че CD80 и/или CD86 позитивната клетка е представяща антиген клетка.
43. Методът съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че CD80 и/или CD86 позитивната клетка е представяща антиген клетка.
44. Методът съгласно претенция 37, характеризиращ се с това, че взаимодействието на СТ1_А4-позитивните Т клетки с CD80 и/или CD86 позитивните клетки се инхибира.
45. Методът съгласно претенция 38, характеризиращ се с това, че взаимодействието на СТ1_А4-позитивните Т клетки с CD80 и/или CD86 позитивните клетки се инхибира.
46. Използуване на CD80 и/или CD86 позитивни клетки за лечение на заболяване на имунната система медиирано от Т клетъчни взаимодействия с CD80 и/или CD86 позитивни клетки, което се състои в прилагане върху субект на разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 1, за регулиране на Т клетъчни взаимодействия с CD80 и/или CD86 позитивни клетки.
47. Използуване на CD80 и/или CD86 позитивни клетки за лечение на заболяване на имунната система медиирано от Т клетъчни взаимодействия с CD80 и/или CD86 позитивни клетки, което се състои в прилагане върху субект на разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 9, за регулиране на Т клетъчни взаимодействия с CD80 и/или CD86 позитивни клетки.
48. Използуване съгласно претенция 46, където разтворимата CTLA4 мутантна молекула съдържа извънклетъчен домен на CTLA4, където в извънклетъчния домен, левцин на позиция +104 е заместен с глутаминова киселина, както е показано на фигура 8.
49. Използване съгласно претенция 46, където посочените Т клетъчни взаимодействия се инхибират.
50. Използване съгласно претенция 47, където посочените

Т клетъчни взаимодействия се инхибират.
51. Използване на разтворимата CTLA4 мутантна молекула от претенция 1 и лиганд, реактивен към IL-4, за инхибиране на заболяване предизвикано от реакция на присадката срещу приемника, което включва въвеждане у даден индивид на разтворимата CTLA4 мутантна молекула, съгласно претенция 1 и

С лиганд, реактивен към IL-4.
52. Използване за получаване на разтворимата CTLA4 мутантна молекула от претенция 9 и лиганд, реактивен към IL-4, за инхибиране на заболяване, предизвикано от реакция на присадката срещу приемника, което включва въвеждане у даден индивид на разтворимата CTLA4 мутантна молекула, съгласно претенция 1 и лиганд реактивен към IL-4.
53. Използване съгласно претенция 51, където разтворимият CTLA4 мутант съдържа извънклетъчен домен от CTLA4, където извънклетъчният домен, левцин на позиция +104, е

С заместен с глутаминова киселина, както е показано на фигура 8.
54. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, кодирана от молекулата нуклеинова киселина, обозначена като АТСС № РТА2104.
55. ДНК последователност, кодираща L104EA29Ylg и имаща АТСС № РТА-2104.
56. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, съдържаща аминокиселинната последователност от фигура 7.
57. Молекула нуклеинова киселина, кодираща разтворимата CTLA4 мутантна молекула, съгласно претенция 56.
58. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, която свързва CD86 с по-голяма склонност, отколкото див тип CTLA4.
59. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, която има помалка дисоциационна скорост от свързване на CD80 и/или CD86, отколкото див тип CTLA4. .
60. Разтворима CTLA4 мутантна молекула, която има помалка асоциационна и дисоциационна скорости от свързване на CD80 и/или CD86, отколкото див тип CTLA4.
61. Част от разтворима CTLA4 мутантна молекула, кодирана от молекулата нуклеинова киселина, обозначена като АТСС№. РТА-2104, където частта съдържа извънклетъчния домен на мутанта CTLA4.
62. Частта от разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 61, съдържаща също така, lg опашка.
63. Част от молекула нуклеинова киселина, кодираща разтворима CTLA4 мутантна молекула, и имаща АТСС№. РТА2104, където частта кодира извънклетъчния домен от CTLA4 мутантната молекула.
64. Частта от молекулата нуклеинова киселина съгласно претенция 63, съдържаща също така, молекула нуклеинова киселина, която кодира lg опашка.
65. Фармацевтичен състав за лечение на заболяване на имунната система, характеризиращ се с това, че съдържа фармацевтично приемлив носител и разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 1.
66. Фармацевтичен състав за лечение на заболяване на имунната система, характеризиращ се с това, че съдържа фармацевтично приемлив носител и разтворимата CTLA4 мутантна молекула съгласно претенция 9.

СПИСЪК НА ПОСЛЕДОВАТЕЛНОСТИТЕ <110> Peach, Robert J.

Naemura, Joseph R

Linsley, Peter S.

Bajorath, Jurgen <120> РАЗТВОРИМИ CTLA4 МУТАНТНИ МОЛЕКУЛИ И ТЯХНОТО ИЗПОЛЗВАНЕ <130> D0028PCT/30436.57WOU1 <140> PCT/US01/17139 <141> 2001-05-23 <150> 60/287,576 <151> 2000-05-26 <150> 60/214,065 <151> 2000-06-26 /**· <160> 9 <170> Patentin Ver. 2.1 <210> 1 <211> 41 <212> ДНК <213> Изкуствена последователност <220>

<223> Описание на изкуствена последователност :Онкостатин М

CTLA4 (OMCTLA4) Отправящ Праймер <400> 1 gaggtgataa agcttcacca atgggtgtac tgctcacaca g 41 <210> 2 <211> 42 <212> ДНК f <213> Изкуствена последователност <220>

<223> Описание на изкуствена последователност:Онкостатин М CTLA4 (OMCTLA4) Обратен Праймер <400> 2 gtggtgtatt ggtctagatc aatcagaatc tgggcacggt tc <^210> 3 <211> 1152 <212> DNA <213> Изкуствена последователност <220>

<223> Описание на изкуствена последователност:L104EA29YIg <400> 3 atgggtgtac tgctcacaca gaggacgctg ctcagtctgg tccttgcact cctgtttcca 60 agcatggcga gcatggcaat gcacgtggcc cagcctgctg tggtactggc cagcagccga 120