CN101044239B

CN101044239B - 用于蛋白质生产的哺乳动物细胞培养方法

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Publication number: CN101044239B
Application number: CN2003801099349A
Authority: CN
Inventors: B·M·施林; L·马特洛克; S·G·泽加雷利; W·V·小伯内特; C·E·约斯滕; J·D·巴施; S·萨克哈穆里; S·S·李
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2002-12-23
Filing date: 2003-12-18
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2023-12-18
Also published as: CA2511520A1; US20050019859A1; EP1575998A4; JP4541157B2; AU2003300276B2; US7541164B2; AU2003300276A1; BR0317723A; PL377731A1; JP2006520186A; EP1575998A2; MXPA05006523A; CN101857851A; TWI312368B; WO2004058800A2; US20120015438A1; CN101044239A; WO2004058800A3; KR20050088136A; TW200512297A

Abstract

本发明描述了通过动物细胞或哺乳动物细胞，优选地，但不限于补料-分批细胞培养生产蛋白质，尤其糖蛋白的方法和过程。一方面，所述方法包括培养期期间至少两次温度转换，其中在培养期结束时温度低于最初细胞培养时温度。在它们的整个持续时间内，包括两次或多次向下温度转换的本发明的细胞培养方法维持高细胞生存力，可以产生蛋白质产物的更大的终末滴定度，和高质量蛋白质产物，如通过所产生的蛋白质的唾液酸含量所确定的。另一方面，所述方法包括在培养期内延迟加入聚阴离子化合物。聚阴离子化合物的延迟加入维持所培养细胞的高生存力，并且可以延长生产期，延迟死亡期的来临，和遏制死亡期。

Description

用于蛋白质生产的哺乳动物细胞培养方法

本发明要求2002年12月23日提交的临时美国申请序号60/436,101的优先权，这里完整引用该临时申请作为参考。

发明领域

本发明涉及培养哺乳动物细胞的新的方法和过程，所述哺乳动物细胞产生蛋白质产物，优选糖基化蛋白质产物。细胞培养方法和过程的性能导致高细胞生存力并且还可以导致高产物质量和数量，延长生长期，延迟死亡期的出现，和遇制死亡期。

发明背景

动物细胞培养，特别是哺乳动物细胞培养优选用以表达用于治疗和/或预防应用的重组产生的糖基化蛋白质。重组糖蛋白的糖基化模式是重要的，因为糖蛋白的寡糖侧链影响蛋白质功能，以及蛋白质的不同区域之间的分子内相互作用。这些分子内相互作用与蛋白质构象和糖蛋白的三级结构有关(见，例如，A.Wittwer等人，1990，Biochemistry，29：4175-4180；Hart，1992，Curr.Op.Cell Biol.，4：1017-1023；Goochee等人，1991，Bio/Technol.，9：1347-1355；和R.B.Parekh，1991，Curr.Op.Struct.Biol.，1：750-754)。此外，寡糖基于特异细胞糖受体可以将特定多肽靶定到某些结构。(M.P.Bevilacqua等人，1993，J.Clin.Invest.，91：379-387；R.M.Nelson等人，1993，J.Clin.Invest.，91：1157-1166；K.E.Norgard等人，1993，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90：1068-1072；和Y.mai等人，1993，Nature，361-555-557)。公知糖蛋白寡糖侧链的末端唾液酸成分影响糖蛋白的多种方面和性质，包括吸收、溶解性、热稳定性、血清半寿期、从血清的清除，以及其物理和化学结构/行为和其免疫原性(A.Varki，1993，Glycobiology，3：97-100；R.B.Parekh，Id.，Goochee等人，Id.，J.Paulson等人，1989，TIBS，14：272-276；和A.Kobata，1992，Eur.J.Biochem.，209：483-501；E.Q.Lawson等人，1983，Arch.Biochem.Biophys.，220：572-575；和E.Tsuda等人，1990，Eur.J.Biochem.，188：405-411)。

通常基于哺乳动物细胞培养的系统中蛋白质表达水平比微生物表达系统，例如，细菌或者酵母表达系统中低得多。然而，细菌和酵母细胞在最佳地表达高分子量蛋白质产物、正确地折叠具有复杂立体结构的蛋白质，和/或提供必要的翻译后修饰使所表达的糖蛋白成熟的能力方面受到限制，从而影响产物的免疫原性和清除速度。

由于培养动物或哺乳动物细胞，尤其产生重组产物的动物或者哺乳动物细胞的限制，已经研究了多种参数的操作，这些参数包括使用大规模培养容器；改变基本培养条件，如孵育温度、溶解氧浓度、pH等等；使用不同类型的培养基和向培养基加入添加剂；和增加所培养细胞的密度。此外，延长运行时间以增加终产物浓度而保持高产物质量的能力的发展将有益于哺乳动物细胞培养的方法开发。重要的产物质量参数是温度和多肽产物的糖基化结构的完全性，唾液酸含量通常用于糖蛋白质量的量度。

细胞培养过程，尤其非连续方法的运行时间通常受到细胞的剩余生存力的限制，所述剩余生存力通常随着运行过程减小。因此希望最大可能地延长高细胞生存力。产物质量的考虑也促使最小化存活细胞密度的减小并且保持高细胞生存力，因为细胞死亡可以释放唾液酸酶到培养上清液中，这可以减少所表达的蛋白质的唾液酸含量。蛋白质纯化考虑进一步促使最小化存活细胞密度的减小并且保持高细胞生存力。培养物中存在细胞碎片和死亡细胞的成分可以负面地影响在培养试验末端分离和/或纯化蛋白质产物的能力。通过培养中使细胞保持更长时间的存活，伴随着细胞蛋白质和酶对培养基的污染的减少，所述细胞蛋白质和酶为例如，细胞蛋白酶和唾液酸酶，它们可以导致细胞产生的所希望的糖蛋白的降解和最终质量降低。

已经研究了实现细胞培养中高细胞生存力的多种参数。一种参数包括最初在37℃培养后仅降低培养温度(例如，Roessler等人，1996，Enzyme and Microbial Technology，18：423-427；T.Etcheverry等人的美国专利号5,705,364和5,721,121，1998；K.Furukawa等人的美国专利号5,976,833，1999；L.Adamson等人的美国专利号5,851,800，Genentech，Inc.的WO 99/61650和WO 00/65070；WO 00/36092 to Biogen，Inc.；和Girard等人的美国专利号4,357, 422)。

所研究的其他参数包括向培养基中加入组分。证明生长因子抑制剂苏拉明在中国仓鼠卵巢(CHO)K1：CycE的指数生长期间防止编程性细胞死亡(Zhangi等人，Biotechnol.Prog.2000，16，319-325)。然而，苏拉明不在死亡期保护细胞防止编程性细胞死亡。结果，苏拉明能够在生长期保持高生存力，但是不允许延长培养寿命。相同的作者报导对于CHO111-10PF细胞系，硫酸葡聚糖和硫酸聚乙烯类似于苏拉明可以相对于对照培养物增加第三天存活细胞密度和生存力。然而没有报导死亡期期间硫酸葡聚糖或者硫酸聚乙烯的作用。还报导苏拉明、硫酸葡聚糖和硫酸聚乙烯可以有效防止细胞聚集。

已经向动物细胞培养基中补加肝素以便使依赖锚定的细胞系适应悬浮条件(例如，McKenna和Granados的美国专利号5,348,877，1994)。还公知肝素结合生长因子，如肝素结合类EGF生长因子(HB-EGF；Raab和Klagsbrun，Biochim.Biophys.Acta 1997，1333，F179-F199)。报导细胞表面硫酸类肝素蛋白聚糖(HSPG)增强HB-EGF结合和某些细胞类型(包括野生型CHO细胞)的生物活性(Raab和Klagsbrun，1997)。[硫酸类肝素和肝素的区别仅在于硫酸类肝素具有更少的N-和O-硫酸基团和更多N-乙酰基(McKenna和Granados，1994)。为了本公开的目的，认为肝素和硫酸类肝素是等价的并且将通常称作肝素]。对于结合肝素的生长因子EGF-2，已经提出对HSPG的结合增加细胞表面上局部FGF-2浓度，这又增加了FGF-2结合细胞的酪氨酸激酶受体的可能性(Raab和Klagsbrun，1997)。已经表明聚硫酸戊聚糖可以阻断培养的细胞上肝素结合生长因子的作用(Zugmaier等人，J.Nat.Cancer Inst.1992，84，1716-1724)。

关于在动物细胞培养物中使用硫酸葡聚糖的专利文献涉及向培养基补加硫酸葡聚糖，目的是：1)提高生长速度和增加人内皮细胞衰老前群体加倍的次数(Levine等人的美国专利号4,994,387和5,132,223，1991，1992)；2)增加哺乳动物细胞系中重组蛋白产率(Israel，1994的美国专利号5,318,898)；3)诱导昆虫细胞系中单一细胞悬浮(Shuler和Dee的美国专利号5,728,580，1996)；4)增加人肝细胞生长因子的生长促进活性和抑制其降解(Naka的美国专利号5,545,722和5,736,506，1996和1998)；5)增加存活细胞密度和重组蛋白质表达(Gorfien等人的WO 98/08934，1997)。

在关于在培养基中存在或者补加硫酸葡聚糖的所有报导的情况中，在该给定培养基中整个培养时间内都存在硫酸葡聚糖。没有报导延迟加入的益处。而且，还没有报导硫酸葡聚糖可以延迟死亡期的出现，延长生长期，或者遇制死亡期。

随着培养中产物浓度的增加，可以在细胞培养过程中观察到产物质量下降，这通过寡糖糖结构的所测量的唾液酸含量确定。通常存在通过药物清除研究确定的可接受的唾液酸含量的下限。培养中细胞产生的高丰度蛋白质优选伴随着高质量蛋白质，所述蛋白质最终经回收用于所计划的用途。

正确糖基化的重组产生的蛋白质在医学上和临床上变得越来越重要，用于治疗和预防。因此，开发经济而有效地实现增加的最终蛋白质产物浓度，以及高水平产物质量(如通过唾液酸含量确定)的可靠的细胞培养方法实现了本领域中所希望和需要的目标。

发明概述

本发明提供了通过动物或者哺乳动物细胞培养生产蛋白质，优选重组蛋白质产物，更优选糖蛋白产物的新方法。这些新方法实现了增加的细胞生存力。

本发明的一方面涉及使用两次或多次温度转换。在该方面，本发明的细胞培养方法可以有利地实现增加的最终滴定度或者产物(例如，糖蛋白)浓度，以及所培养细胞产生的糖蛋白的增加的唾液酸含量。更具体地，根据本发明，细胞培养期期间两次或多次温度转换维持培养中细胞的高细胞生存力并且可以在整个培养运行期间提供所产生的产物的高数量和质量。而且，根据本发明的一个方面，包括两次或多次温度转换的培养方法可有利地允许延长培养的生产期。在延长的生产期期间，所希望的产物的滴定度增加了，产物质量(如以唾液酸含量为特征)保持在高水平；并且细胞生存力也保持在高水平。此外，与本发明的培养方法有关的延长的生产期允许产物的产量超过标准生产期期间产生的产量。

在本发明的一个方面，使用多步温度转换，优选包含两次或者多次向下温度转换的定时多步温度转换培养哺乳动物细胞以产生所希望的蛋白质产物，尤其糖蛋白产物。两次或多次(即，至少两次)温度转化可以在培养的生长期之后进行，其构成本发明的方法。使用至少两次温度转换，优选在转换之间相隔约4天，可以实现高蛋白质产率以及伴随着所希望的蛋白质产物的高唾液酸含量。包括多次温度转换的培养方法可以实现蛋白质产物的高质量和数量，以及在培养期的持续时间内维持细胞生存力。

根据本发明的另一方面，包括两次或多次温度转换的培养方法可允许细胞在培养物中保持一段时间，其有利地延长培养运行以实现蛋白质生产的高质量和数量。本发明有利地提供的蛋白质生产期的这种延长指可以进行的生产期超过培养运行中没有温度转换，或者仅一次温度转换时得到的蛋白质生产期。延长的生产期与包括所描述的细胞培养方法的多次温度转换有关。根据本发明的新的细胞培养方法，温度中两次、三次、四次或多次向下转换与第一次温度转换的联合允许细胞培养物维持高细胞生存力并且在本发明的一个实施方案中提供了延长的生产期，在该期间蛋白质产物的滴定度增加了并且以唾液酸含量为特征的产物质量保持直到培养运行结束都保持高水平。

本文中所用的培养运行指培养期，优选整个培养期。对于包括两次或多次温度转换的培养运行，整个培养运行的长度可以持续短至仅第二次温度转换后(例如，约10-14天)到长达约28到30天，或更长。对于含有三次(或者多次)温度转换的培养运行，整个运行的长度可以从短至仅第三次(或者最后一次)温度转换后(例如，约14到21天)到长达约28到30天或者更长时间。从而，按照本发明的方法，可以培养细胞的总的运行期为大于10天，大于14天，或者大于21天。优选地，培养运行持续至少约10到14天到约21到30天，或者更长时间。

总的培养运行可以包括2、3、4或多步温度转换。作为非限制性实例，如下实施两步温度转换：从第0天到约第6天，培养温度最初保持在37℃，或者接近37℃；从约第6天到约第10天，培养温度保持在34℃，或者约34℃；从约第10天往后，例如，到约第14到28天，到约第14到18天，或者到培养运行末，培养温度保持在32℃，或者接近32℃。根据本发明的三步温度转换培养方法包括下面的非限制性、代表性形式：从第0天到约第6天，培养温度控制37℃，或者接近37℃；从约第6天到约第10天，培养温度保持在34℃，或者约 34℃；从约第10天到约第14天，培养温度保持在32℃，或者接近32℃；从约第14天往后，例如，到约第21到30天，或者更长时间，例如到培养运行末，培养温度保持在30℃，或者接近30℃。

从而，使用本发明细胞培养方法不仅对具有“更短”，例如标准持续时间(例如，约10到约14天)的培养运行有益，而且对可以比标准培养运行耐受更长时间的培养运行有益，其中本发明细胞培养方法包括两次或者多次温度转换，其中实现了高数量和质量的蛋白质产物。实现这种更长的持续时间培养运行是因为本发明的方法提供了延长培养细胞产生蛋白质的最初或者标准的生产期(最初或者标准生产期通常在约第6到14天发生)。例如，与不使用温度转换或者，最多使用一次温度转换的培养物中蛋白质产生和产物质量相比，通过在根据本发明的培养运行中使用两次、三次或者多次温度转换，蛋白质产生的高质量和数量和细胞生存力可以保持和维持约10-14天的总运行时间到约21到28天或者更长时间的总运行时间。

本发明的另一方面提供了包含大于如上描述的两次或三次温度转换的细胞培养方法。在这些多步温度转换运行中，基本上如对于三步培养期所描述的培养细胞，并进行额外的向下温度转换直到培养期结束。例如，可以在第三次温度转换培养期后在从培养开始后的第15-19天或约第15-19天，优选第18天实施第四次向下温度转换，即，温度降低，其中细胞培养温度进一步从约30℃转换到约28℃或29℃，优选约29℃。所述细胞培养方法中可以包括额外的温度转换，其中细胞保持在更低的温度，例如，＜29℃，以进一步延长蛋白质产生直到运行结束，优选长于28-30天。在所有情况中，通常使用如本文中描述的本领域中常规实施的技术回收，例如分离和/或充分纯化(如果希望)培养期末细胞产生的蛋白质。此外，通过常规方法评估唾液酸含量。

在一个具体方面，本发明提供了一种方法，其中通过使用两步或多步温度转换方法，产物的最终滴定度得到增强，并且所产生的糖蛋白的唾液酸含量更高。根据该具体方面，两次或多次定时温度转换维持了培养物的高细胞生存力，从而使得培养期延长，在该培养期期间产物，优选重组产物的滴定度增加并且以唾液酸含量为特征的产物质量保持在高水平。这种两步或多步温度转换可以使得细胞培养过程期间产物的生产中蛋白质滴定度和唾液酸含量之间的优势折衷 (prevailing trade-off)最小。从而，温度转换为增强培养过程的一个重要参数，即“终(即最终)滴定度”×“终(即最终)唾液酸”的算术乘积(“终滴定度×终唾液酸”)提供了正效应。

因此，在另一具体方面，对于在如本文中新近描述的两步培养方法，从第0天到第6天或约第6天，细胞保持在37℃，或者接近37℃的培养物中；在第6天或约第6天，细胞培养物的温度降低到34℃，或者接近34℃；在第10-14天或者约第10-14天，温度再次降低到32℃，或者接近32℃。在这种两步温度转换方法的一个实施方案中，生产期延长到超过约第14天并持续到培养运行结束，例如，直到约第21天，或者约第28天到30天，或更长，在该时间内细胞保持在32℃，或者接近32℃的较低温度下培养。可以如本文中进一步描述的在延长的生产期结束时回收蛋白质产物。

本发明的再一方面是提供通过在培养运行期间将细胞进行两次或者多次温度转换增加培养物中细胞生存力的方法。如果存在诸如温度中两次或多次转换的条件时在一段时间内培养物中细胞生存力比不存在该条件时的细胞生存力更高，那么该条件导致增加的细胞生存力。根据该方面，如所描述的两次或者多次温度转换细胞培养方法允许细胞在更长的时间内，如超过标准生产期的时间内保持存活。如本文中讨论的，所培养细胞的增加的细胞生存力的有益结果可以是在诱导保持存活细胞的条件下，培养期结束时产生更大量的(高质量)产物。

本发明的另一方面是两次或多次温度转换细胞培养方法的实施导致的增加的细胞生存力与培养物中细胞碎片和死亡或者将死细胞随时间释放的内容物的量相关。培养物中存在细胞碎片和死亡细胞内容物可以负面地影响分离和/或纯化培养运行结束时蛋白质产物的能力。通过使细胞在培养中更长时间地保持存活，伴随着细胞蛋白质和酶，例如，细胞蛋白酶和唾液酸酶对培养基污染的减少，所述酶可以导致细胞产生的所希望的糖蛋白的降解和最终质量降低。

本发明的另一方面涉及向细胞培养物延迟加入聚阴离子化合物。延迟加入聚阴离子化合物实现增加的细胞生存力。聚阴离子化合物优选为硫酸葡聚糖。在孵育后的某一时间向培养物加入聚阴离子化合物。

在本发明的一个方面，在接种后某个时间向培养物加入聚阴离子化合物，该时间在最初的死亡期开始之前，或者最初的生长期期间，或者最初生长期的后半期期间，或者在最初生长期结束时或者约最初生长期结束时。根据本发明的该方面，生长期延长和/或死亡期来临延迟了一段时间，如数天。此外，一旦死亡期开始，死亡速度被极大地减小。

在本发明的另一方面，在最初死亡期期间向培养物加入聚阴离子化合物。根据本发明的该方面，细胞死亡受到一段时间，如数天的遏制。

在本发明的另一优选的方面并且作为本文中进一步描述的，该新近开发的细胞培养方法(包括两次或多次温度转换的那些方法和包括延迟加入聚阴离子化合物的方法)尤其适于生产可溶细胞毒性T淋巴细胞抗原-4(CTLA4)分子和可溶CTLA4突变分子，如细胞毒性T淋巴细胞抗原-4免疫球蛋白(CTLA4Ig)和L104EA29YIg，它们可通过基因工程化以表达和产生这些蛋白质的宿主细胞来产生(见实施例1到11)。本发明的优选实施方案包括在培养运行期间使用多次温度转换培养产生CTLA4Ig和L104EA29YIg的细胞以实现大量高质量CTLA4Ig和L104EA29YIg产物，所述高质量可通过终产物的唾液酸测量确定。本发明的优选实施方案包括使用延迟加入聚阴离子化合物培养产生CTLA4Ig和L104EA29YIg的细胞。

在阅读了本发明的详细描述和考虑了附图后将理解本发明的其他方面、特征和优点。

附图描述

图1显示不同的温度转换对在5升(5L)反应器规模培养的细胞生存力的影响。从本文实施例3中描述的实验得到这些结果。在包括无温度转换(“无T转换”)、一次温度转换(“一次T转换”)和两次向下温度转换(“双T转换”)的培养方法之间进行了比较。

图2显示不同的温度转换对在50升(50L)反应器规模培养的细胞生存力的影响。从本文实施例3中描述的实验得到这些结果。在包括三次向下温度转换(“三次T转换”)和两次向下温度转换(“双T转换”)的培养方法之间进行了比较。

图3描绘了CTLA4Ig的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)和所编码的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)，CTLA4Ig具有信号肽、在+1位甲硫氨酸开始到+124位天冬氨酸结束，或者在-1位丙氨酸开始到+124位天冬氨酸结束的CTLA4的胞外结构域的野生型氨基酸序列，和Ig区。

图4描绘了CTLA4突变分子(L104EA29YIg)的核苷酸序列(SEQ IDNO：3)和所编码的氨基酸序列(SEQID NO：4)，该CTLA4突变分子具有信号肽、在+1位甲硫氨酸开始到+124位天冬氨酸结束，或者在-1位丙氨酸开始到+124位天冬氨酸结束的CTLA4的突变胞外结构域的野生型氨基酸序列，和Ig区。

图5描绘了与制癌蛋白M信号肽(-26位到-2位)融合的人CTLA4受体(此处称作“野生型”CTLA4)的核酸序列(SEQ ID NO：5)和所编码的完整氨基酸序列(SEQ ID NO：6)(美国专利号5,434,131和5,844,095)。

图6显示了延迟加入硫酸葡聚糖对培养物中活细胞密度、总细胞密度，和生存力的影响，在所述培养基中，硫酸葡聚糖在最初生长期结束时加入。从本文的实施例6中描述的实验得到这些结果。在最初生长期结束时加入硫酸葡聚糖的培养物和其中未加入硫酸葡聚糖的培养物之间进行了比较。对平均值作图；误差线代表标准差。

图7显示了延迟加入硫酸葡聚糖对死亡率的影响。其为存活细胞密度作为时间的函数的对数表示。从本文实施例6中描述的实验得到这些结果。在其中在最初生长期结束时加入硫酸葡聚糖的培养物和其中未加入硫酸葡聚糖的培养物之间进行了比较。对平均值作图；误差线代表标准差。

图8显示了延迟加入硫酸葡聚糖对培养物中存活细胞密度、总细胞密度，和生存力的影响，在所述培养基中，硫酸葡聚糖在最初死亡期期间加入。从本文实施例7中描述的实验得到这些结果。在其中在最初死亡期期间加入硫酸葡聚糖的培养物和其中未加入硫酸葡聚糖的培养物之间进行了比较。

图9显示了延迟加入硫酸葡聚糖对培养物中存活细胞密度、总细胞密度，和生存力的影响，在所述培养基中，硫酸葡聚糖在最初死亡期期间加入。从本文实施例8中描述的实验得到这些结果。在最初死亡期期间加入硫酸葡聚糖的培养物和其中未加入硫酸葡聚糖的培养物之间进行了比较。

图10显示了培养物中存活细胞密度、总细胞密度，和生存力，所述培养基中在培养的第0天加入硫酸葡聚糖。这些结果从本文实施例9中描述的实验得到。

图11显示了培养物中存活细胞密度和生存力，所述培养基中在最初生长期的三个不同的时间(第三天、第四天和第五天)加入硫酸葡聚糖。这些结果从本文实施例10中描述的实验得到。

图12显示了不同温度转换对存活细胞密度的影响。这些结果从本文实施例11中描述的实验得到。在包括无温度转换(“无T转换”)、一次温度转换(“一次T转换”)和两次向下温度转换(“两次T转换”)的培养方法之间进行了比较。

图13显示了不同温度转换对生存力的影响。这些结果从本文实施例11中描述的实验得到。在包括无温度转换(“无T转换”)、一次温度转换(“一次T转换”)和两次向下温度转换(“两次T转换”)的培养方法之间进行了比较。

图14显示了不同温度转换对滴定度的影响。这些结果从本文实施例11中描述的实验得到。在包括无温度转换(“无T转换”)、一次温度转换(“一次T转换”)和两次向下温度转换(“两次T转换”)的培养方法之间进行了比较。

发明详述

本发明描述在哺乳动物或动物细胞培养中生产蛋白质，优选重组蛋白质产物，更优选糖蛋白产物的新方法。这些方法实现了增加的细胞生存力。

包括两次或多次温度转换的细胞培养方法

包括两次或多次温度转换的根据本发明的细胞培养方法实现了增加的细胞生存力并且可以实现培养中细胞产生的产物的最终滴定度或浓度增加。此外，所培养细胞产生的糖蛋白的唾液酸含量可以为高水平，从而表明在培养期产生高质量的蛋白质产物。

更具体地，根据本发明，细胞培养运行期间两次或多次温度转换保持并维持培养物中细胞的高细胞生存力，例如，实现增加的细胞生存力，并且可以在整个培养运行期间提供高数量和质量的产物。而且，根据本发明，两次或多次温度转换可有利地允许延长培养的生产期。在延长的生产期期间，细胞生存力得到保持；并且所希望的产物的滴定度增加了；并且以唾液酸含量为特征的产物质量保持在高水平。

根据本发明，与不包括温度转换，或者仅一次温度转换的培养方法相比，在细胞培养期间，两次或多次温度转换，优选向下温度转换可允许在培养期结束时细胞产生的蛋白质产物的高数量和质量。作为例证，如实施例3中所示，与没有温度转换或者仅一次温度转换相比，不管培养运行的总长度如何，证明具有两次或三次温度转换的培养方法导致蛋白质数量(例如，最终滴定度)增加。此外，本发明的方法尤其适于生长和保持为补料-分批培养的细胞，如下文中进一步描述。

因为培养方法的两次或多次温度转换还保持和维持培养中细胞的高生存力，所以该培养方法可以延长蛋白质的生产期。具体地，在包含延长的生产期的细胞培养方法期间，细胞生存力保持高水平，并且所希望的产物的滴定度增加了；并且以唾液酸含量为特征的产物质量也保持在高水平。如本发明新提供的，所述细胞培养方法提供的生产期超过通过包括无温度转换，或者最多一次温度转换的培养方法产生的生产期。

包括多次温度转换的细胞培养方法

在本发明的实施方案中，在哺乳动物细胞的培养中使用定时多步温度转换以产生所希望的蛋白质产物，尤其糖蛋白产物。更优选地，培养中的细胞产生了重组产生的蛋白质、多肽或者肽产物。然而，在某些情况中，细胞可以积极产生，或者过量产生内源或者天然产物，所述产物可以在实施本发明方法后收获或回收。如本文描述，两次或多次温度转换，优选受控的向下温度转换(在培养期期间以适当定时间隔实施)可用于本发明的方法中以实现高蛋白质产率以及相伴的高唾液酸含量。

根据本发明的细胞培养方法和过程(也称作生产或者发酵运行)，在培养运行期间结合两次或多次温度转换的培养的细胞可以在运行期间产生高数量和质量的产物，所述高数量和高质量为例如通过运行结束时终点滴定度和唾液酸含量所测量。不管培养运行实施的总运行时间为约10-14天还是大于14天，相对于没有温度转换，或者最多使用一次温度转换的方法，得到了与本发明方法相关的蛋白质生产的高数量和质量。此外，作为培养过程期间两次或多次温度转换的结果，细胞可以在培养物中保持一段时间，该时间段基本上延长了标准或者最初生产期。标准或者最初生产期通常为约6到14天。在包括两次或多次温度转换的本培养方法的延长的生产期期间实现了高质量蛋白质的增加的产量，以及持续的细胞生存力。

还根据本培养方法，细胞可以培养的总运行期大于约10天，大于约14天，大于约21天，或者大于约28天，优选约14到30天，或者以上。例如，在包括两次或多次温度转换的本发明的培养运行中，整个培养的长度可以持续短至仅第二次(或最后)温度转换后(例如，约14天)到长达约21到30天或以上，优选约28天或以上。

在本发明的实施方案中，构成本发明的细胞培养方法的多次温度转换与延长的培养期相关。根据本发明的新的细胞培养方法，第二次、第三次或多次温度转换与第一次温度转换的联合不仅允许细胞培养物在整个培养运行持续时间内产生高数量和质量的产物，还允许在整个运行和/或整个延长的生产期直到培养运行结束培养物都维持高细胞生存力。在包括延长的生产期的培养运行期间，蛋白质产物的滴定度增加了并且如以唾液酸含量为特征的产物质量保持高水平。

更具体地，在一个特定实施方案中，本发明包括细胞培养方法，其延长了培养细胞的蛋白质生产的最初生产期(即包括约6-14天的标准生产期得到延长)。通过在根据本发明的培养运行中使用两次或多次温度转换，实现了约14-21天的延长生产期。使用培养运行中的三次(或多次)温度转换，将培养运行进一步延长到约第21-28天或30天，或者更长，并且伴随着高质量(例如，高唾液酸含量)的蛋白质产物的更高产率(例如，实施例3)。

在本发明的另一特定实施方案中，细胞培养(或发酵)方法包括两步向下温度转换，其中细胞在整个培养运行期间保持在三种不同的温度下。在该实施方案中，总细胞培养期持续大于约10天，更具体地，约14到28天或更长，即，约2到3周或更长，之后得到最终蛋白质产物(并测量唾液酸含量)。例如，在这种两步方法中，细胞在约36℃到38℃，优选37℃或者接近37℃的第一种温度下保持从第0天到约第6天的最初培养期。之后，从约第5天到第7天，优选第6天到约第10天，培养温度保持在约33℃到约35℃，优选34℃，或接近34℃的第二种温度下。在34℃或接近34℃的细胞培养后，将温度再次转换(再次-T转换)到约31℃到33℃，优选32℃或接近32℃的第三种温度。再次T转换发生在或约第6天到约第14天，优选从约第10天到约第14天，更优选在或者约第10天，所述再次T转换在多种实施方案中可以在标准生产期期间、生长期期间，或者死亡期期间。优选地，在第一次和第二次温度转换之间有约4天增量，更优选4天增量。细胞保持在32℃或者接近32℃的温度下直到总培养运行结束，例如，长于约第10天，更特别地，到约12-18天，或者到约14-18天，或者约14-28天或30天，或者更长时间。在培养过程结束时，通常从例如培养上清液(如果产物分泌到培养基中)分离和/或纯化蛋白质产物。

备选地，在本发明的多次温度转换培养方法中，可以首先基于培养期降低温度。第一次温度转换优选发生在死亡期开始前。在一个实施方案中，首先降低温度，同时细胞生长减慢。例如，温度从37℃，或者接近37℃转换到34℃或者接近34℃，此时细胞不再处于它们的指数生长期并且培养物处于稳定期，例如，在或者约培养的第6天。此时，存活细胞浓度已经达到蛋白质生产，优选增强的蛋白质生产的适宜的细胞密度，例如，约2-12×10⁶个细胞/mL，如2-9×10⁶个细胞/mL，3-7×10⁶个细胞/mL，4-5×10⁶个细胞/mL，3-4×10⁶个细胞/mL，2-4×10⁶个细胞/mL，4-6×10⁶个细胞/mL，6-8×10⁶个细胞/mL，8-10×10⁶个细胞/mL，或10-12×10⁶个细胞/mL。不希望被理论所束缚，可能细胞生长的减慢与细胞培养基中的营养物和/或特定组分的耗竭，例如，培养基中氮限制相关。

在另一实施方案中，第一次温度转换发生在生长期期间，例如，当存活细胞浓度为约2-12×10⁶个细胞/mL，如2-9×10⁶个细胞/mL，3-7×10⁶个细胞/mL，4-5×10⁶个细胞/mL，3-4×10⁶个细胞/mL，2-4×10⁶个细胞/mL，4-6×10⁶个细胞/mL，6-8×10⁶个细胞/mL，8-10×10⁶个细胞/mL，或10-12×10⁶个细胞/mL时。

在包括两步温度转换培养方法的另一特定实施方案中，细胞培养14天运行期，其中从第0到第6天培养温度保持在或者接近37℃。从约第6天到约第10天，培养温度保持在或者接近34℃；从约第10天到约第14天，培养温度保持在或者接近32℃。作为另一实施方案，细胞培养约21天时期，其中从第0到约第6天培养温度保持在或者接近37℃；从约第6天到约第10天，培养温度保持在或者接近34℃；从约第10天到约第21天，培养温度保持在或者接近32℃。作为再一个实施方案，细胞培养约28天时期，其中从第0到约第6天培养温度保持在或者接近37℃；从约第6天到约第10天，培养温度保持在或者接近34℃；从约第10天到约第28天，培养温度保持在或者接近32℃。

本发明还包括实施方案，其中细胞培养方法包括三次或多次温度转换。在包括三步温度转换培养方法的一个实施方案中，细胞最初在约36℃到38℃，优选在或约37℃的第一种温度下培养约6天；之后，转换培养温度并在约33℃到35℃，优选在或接近34℃下保持给定时限；之后发生第二次转换到约31℃到33℃，优选在或接近32℃的温度。在或接近32℃的培养期之后，第三次温度转换到约29℃到31℃，优选在或接近30℃的温度；然后温度保持在或接近30℃直到运行结束。

在其他实施方案中，在所述培养方法的第三次温度转换后可以进行进一步温度转换，优选向下温度转换。例如，可以在第三次转换后在或者接近培养开始后的第15-20天，优选约第18天进行第四次温度转换。第四次向下转换保持培养温度在或者接近28℃到29℃，优选约29℃，并增加培养运行到大于约28天，例如，到约28-32天或者更长，此时得到产物。

如在根据本发明的两步温度转换培养运行方法中，当细胞基本上停止生长并且变得稳定或者大约稳定时，可发生本发明的多次温度转换中的第一次温度转换。作为例证，当存活细胞浓度为约2-12×10⁶ 个细胞/mL，如2-9×10⁶个细胞/mL，3-7×10⁶个细胞/mL，4-5×10⁶ 个细胞/mL，3-4×10⁶个细胞/mL，2-4×10⁶个细胞/mL，4-6×10⁶个细胞/mL，6-8×10⁶个细胞/mL，8-10×10⁶个细胞/mL，或10-12×10⁶ 个细胞/mL时进行温度转换。备选地，在生长期期间，例如，当存活细胞浓度为约2-12×10⁶个细胞/mL，如2-9×10⁶个细胞/mL，3-7×10⁶ 个细胞/mL，4-5×10⁶个细胞/mL，3-4×10⁶个细胞/mL，2-4×10⁶个细胞/mL，4-6×10⁶个细胞/mL，6-8×10⁶个细胞/mL，8-10×10⁶个细胞/mL，或10-12×10⁶个细胞/mL时发生第一次温度转换。在优选实施方案中，多步细胞培养方法包括在约3到4周，例如，21-30天或以上，优选28天或以上的培养期期间的三次定时和受控的温度转换，从而提供培养物中细胞更长时间地生产产物。为了阐明，三步温度转换方法包括从0到约第6天，优选第6天的最初培养期，在该期间细胞在37 ℃，或者接近37℃培养。从约第6天到约第10天，细胞在34℃，或者接近34℃培养。从约第10天到约第14天，细胞在32℃，或者接近32℃培养；从约第14天往后，即，到约第21天到第30天或以上，或者到运行结束时，培养温度保持在30℃，或者接近30℃。因此，在本发明的三步温度转换培养方法中，也可以延长生产期以产生蛋白质的更高终点滴定度和保持更高细胞生存力长于约14天的时限，相比具有仅一次或者没有温度转换的培养方法的标准生产期为约6到约14天。有利地，通过所述三步T转换方法可以将生产期和细胞生存力进一步延长，即延长到三周或者更长时间，伴随着如通过唾液酸含量所测量的产物的高质量。

在本发明的多种实施方案中，第二次温度转换到32℃，或者接近32℃允许培养运行结束时蛋白质的更高的数量和质量，并且还与运行期间更长的蛋白质生产有关，该运行可以持续约2周以上。温度中两次或多次转换允许培养物的细胞生存力的缓慢下降稳定下来，所述细胞生存力的缓慢下降可以在培养的前两周发生。在约两周或两周附近定时的从32℃或接近32℃到30℃，或者接近30℃的另一次温度转换提供了生产期的进一步延长，从而将细胞培养物的生产期延长到培养运行结束，例如，到约第21天到第30天或者以上，而保持细胞生存力并且不牺牲所产生的产物的质量(如通过唾液酸化测量)。(见实施例5，表2和3)。额外的温度转换可以将细胞生产延长到超过两次和三次温度转换运行的细胞生产。

在其他实施方案中，本发明涉及(i)细胞培养方法，(ii)增加蛋白质生产，优选联合增加的细胞生存力的方法，(iii)增强蛋白质产物的唾液酸化的方法，(iv)增强细胞生存力的方法，或(v)延长细胞生产，包括两次或多次温度转换的方法，该方法包括：在允许细胞生长的条件下在37℃或者接近37℃的温度下培养表达目标蛋白质的宿主细胞允许该细胞生长的时间；当培养物处于稳定期时，降低细胞培养的温度并在34℃或者接近34℃的第二种温度下培养细胞；再次降低细胞培养的温度并在约第6天到第14天的标准生长期期间的某一时间，例如，在或者约从培养开始第10天，在32℃或者约32℃的第三种温度下培养细胞直到培养期结束。如本文中已经提到的，培养期可以包括大于10天、大于14天、大于21天，或者大于28-30天的总运行时间。细胞在32℃培养后，即在培养运行结束后，得到所产生的蛋白质产物，优选糖蛋白。

在其他实施方案中，本发明涉及(i)细胞培养方法，(ii)增加蛋白质生产，优选联合增加的细胞生存力的方法，(iii)增强蛋白质产物的唾液酸化的方法，(iv)增强细胞生存力的方法，或(v)延长细胞生产，包括两次或多次温度转换的方法，该方法包括：在允许细胞生长的条件下在37℃或者接近37℃的温度下培养表达目标蛋白质的宿主细胞允许该细胞生长的时间；从第5天到第7天开始降低细胞培养的温度并在34℃或者接近34℃的第二种温度下培养细胞；再次降低细胞培养的温度并在约第6天到第14天开始，例如，在或者约从培养开始第10天，在32℃或者约32℃的第三种温度下培养细胞直到培养期结束。如本文中已经提到的，培养期可以包括大于10天、大于14天、大于21天，或者大于28-30天的总运行时间。细胞在32℃培养后，即在培养运行结束后，得到所产生的蛋白质产物，优选糖蛋白。

在另一实施方案中，本发明提供了培养方法，其还包括从培养开始的14天或约14天将在或者接近32℃的温度向下转换到在或者接近30℃直到培养过程结束，从而将培养期延长到适当地超过标准生产期。为了进一步延长培养过程期间的蛋白质生产，以及细胞生存力，该方法可以包括从培养开始的15天或约15天到19天，优选18天，将在或者接近30℃的温度向下转换到在或者接近29℃直到培养过程结束。

本发明的温度转换通常在或者约培养期的第6天，其可以在培养物的生长期期间或者之后，并且之后以约4天增量，优选4天增量。在某些实施方案中，温度转换的定时可以接近标准生产期的开始(例如，在或者约第6天)，中间(例如，在或者约第10天)和末尾(例如，在或者约第14天)。在根据本发明的培养过程或者方法中，通过使用多步(例如，两步、三步或更多步)温度转换，所产生的糖蛋白的最终滴定度和唾液酸含量得到增强，至少两种定时温度转换的组合允许总培养运行实施10天以上、14天以上、21天以上，或者28天以上或更多天，而不牺牲产物的最终滴定度和唾液酸化。根据本发明的培养方法，与进行相同时限但是不包括两次或多次温度转换的运行相比，两次或多次温度转换维持培养物的高细胞生存力并且可以允许在培养运行中产生更高滴定度和高质量的蛋白质。而且，两次或多次温度转换可以允许培养的生产期延伸超过标准生产期和/或超过没有温度转换，或者最多一次温度转换的培养的生产期。这种多步温度转换，如两步或多步温度转换，可以最小化细胞培养过程中蛋白质产物的生产中滴定度(“终滴定度”)和唾液酸含量之间的优势折衷。从而，温度转换为增强“终滴定度”×“终唾液酸”的算术乘积提供了正效应，其改进了蛋白质生产方法。

包括两次或多次温度转换的细胞培养方法的根据本发明的其他实施方案

在一个实施方案中，本发明包括细胞培养方法，该方法包括在允许细胞生长的条件下37℃或接近37℃的第一种温度下培养表达目标蛋白质的宿主细胞允许该细胞生长的时间。细胞生长期后，当细胞生长减慢并且接近稳定时，在34℃或者接近34℃的第二种温度下培养细胞。之后，在培养的标准生产期期间，即在或者约第6天到在或者约第14天在32或者接近32℃的第三种温度下培养细胞。在培养过程结束时，可以得到所产生的蛋白质产物。

根据本发明的优选实施方案，细胞以分批补料方法培养，该分批补料方法包括几个时期，即生长期，在该期间细胞培养在37℃或者接近37℃的第一种温度下；最初或者标准生产期，在该期间细胞在34℃或者接近34℃的第二种温度下和在32℃或者接近32℃的第三温度下培养，以便提供延长的蛋白质生产期，其可以包括30℃或者接近30℃的第四种温度，并且任选之后，还包括额外的降低温度，如29℃或者接近29℃。对于本发明的两步或多步温度转换运行，蛋白质生产的延长与温度的两次或多次向下转换有关。如本文中描述，延长的生产期包括从37℃或接近37℃到34℃或接近34℃的第一次温度转换后将培养温度以不同的间隔连续降低两次或多次。相对于没有温度转换，或者仅一次温度转换，通过实施包括培养运行期间两次或多次向下温度转换的这些方法，蛋白质生产增加了并且得到高产物质量(如通过终产物的唾液酸含量测量)。

在细胞培养的生长期，例如，从第0天到约第6天，由于在该指数细胞生长期或者对数期细胞通常快速分裂，培养物中的细胞密度增加。在本发明的某些方法中存在的非生长相关的细胞培养和蛋白质生产方法中，在生长期期间没有产生大量蛋白质产物，在所述生长期中细胞生长在适宜的生长条件下基本上最大化。从而，由于培养中营养限制的原因，细胞通常在约第4到6天进入稳定期，其中快速生长达到稳定状态和/或下降。在这些培养方法中，当细胞生长基本上结束(例如，在约第6天到约第10天)时，开始蛋白质生产期(实施例3)。

根据一个实施方案的培养方法，当在约第6天细胞达到稳定期时，温度从37℃或者接近37℃向下转换到34℃或者接近34℃。之后，在接近第一次温度转换(约第6天)和延长的生产期开始(约第14天)之间中点某一时间，再次将培养温度从34℃或者接近34℃降低到32℃或者接近32℃。第二次温度转换允许培养稳定细胞生存力，细胞生存力通常从约第14天缓慢下降；之后，开始生产期的延长(在约第14天到约第21到30天或更长，优选到约21天到约28天或更长)。如上面描述的，在培养运行的延长的生产期期间可以使用其他温度转换，例如，第三次、第四次或更多次温度转换。

包括延迟加入聚阴离子化合物的细胞培养方法

根据本发明，提供了包括延迟加入聚阴离子化合物的细胞培养方法。该方法包括接种后某一时间向细胞培养物加入聚阴离子化合物。与不加入聚阴离子化合物时所观察到的相比，或者与接种时加入聚阴离子化合物所观察到的相比，聚阴离子化合物的延迟加入实现了更大的细胞生存力。

从而，在一个实施方案中，本发明涉及细胞培养方法，其包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在接种后某一时间向细胞培养物加入聚阴离子化合物。

已经发现(实施例6)当实施本发明时，细胞培养物的百分数细胞生存力增加了。百分数细胞生存力，也称作细胞生存力，是细胞总数中活细胞的百分数。如果存在某一条件时培养物中细胞生存力比不存在该条件时长一段时间，那么该条件(如延迟加入聚阴离子化合物)导致增加的细胞生存力。

从而，在其他实施方案中，本发明涉及(1)细胞培养方法，和(2)增加培养物中细胞生存力的方法，该方法包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在接种后某一时间向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中细胞培养物的细胞生存力增加了。

聚阴离子化合物包括，但不限于，硫酸葡聚糖(可从Sigma-Aldrich，St.Louis，MO得到)、肝素(可从Sigma-Aldrich得到)、硫酸乙酰肝素(可从Sigma-Aldrich得到)、硫酸甘露聚糖、硫酸软骨素(可从Sigma-Aldrich得到)、硫酸皮肤素(可从Sigma-Aldrich得到)、硫酸角质素(可从Sigma-Aldrich得到)、透明质酸盐(可从Sigma-Aldrich得到)、聚(乙烯基硫酸盐)(可从Sigma-Aldrich得到)、κ-角叉菜胶(可从Sigma-Aldrich得到)、和苏拉明(可从Sigma-Aldrich得到)。所述化合物可以容易地从所列来源得到，或者通过本领域中技术人员公知的方法容易地得到。这些化合物通常以盐的形式(包括但不限于钠盐)得到，但是也可以以非盐形式使用。聚阴离子化合物包括其所有形式，包括但不限于盐形式，如钠盐。

优选的聚阴离子化合物为多硫酸化化合物，包括但不限于：硫酸葡聚糖、肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸戊聚糖、硫酸甘露聚糖、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、硫酸角质素、聚(乙烯基硫酸盐)、κ-角叉菜胶、和苏拉明。最优选为硫酸葡聚糖。硫酸葡聚糖可以具有5,000到500,000Da的平均分子量。优选具有5,000Da分子量的硫酸葡聚糖。

根据本发明，接种后某一时间加入聚阴离子化合物，即聚阴离子化合物不存在于基础培养基中并且接种时不存在。优选地，在培养的第1天或者更晚加入聚阴离子化合物。接种在第0天进行。

根据本发明，在特定时限(例如，孵育后某时)期间可以向细胞培养物加入聚阴离子化合物一次、两次、三次、或任何次数。可以联合使用一种或多种聚阴离子化合物。即，聚阴离子化合物的任何给定的单次加入可以包括加入一种或多种聚阴离子化合物。类似地，如果存在一次以上的聚阴离子化合物加入，可以在不同的加入时加入不同聚阴离子化合物。额外的化合物和物质，包括聚阴离子化合物，可以在加入聚阴离子化合物之前、之时或者之后加入(在或者不在所述特定时限期间)。在优选实施方案中，存在单次，即一次聚阴离子化合物加入。在优选实施方案中，加入一种聚阴离子化合物。

根据本发明，可通过任何方法向细胞培养物加入聚阴离子化合物。加入聚阴离子化合物的方法包括，但不限于，溶于水中、溶于培养基中，溶于送料培养基中、溶于适宜的培养基中，和以其所得的形式。优选地，所加入的聚阴离子化合物溶于水中。

根据本发明，加入聚阴离子化合物使培养物中浓度达到适宜的水平。作为非限制性实例，加入聚阴离子化合物到浓度为1-1000mg/L、1-200mg/L、1-100mg/L、或25-75mg/L。优选地，加入聚阴离子化合物到浓度25-200mg/L或25-100mg/L，更优选地约50-100mg/L或50-100mg/L，更优选地约50mg/L或约100mg/L，最优选地50mg/L或100mg/L。

根据本发明，加入聚阴离子化合物后培养物可以运行任何时间长度。本领域中技术人员基于相关因素，如可回收蛋白质的数量和质量，和细胞裂解导致的上清液中污染性细胞种类(例如，蛋白质和DNA)的水平(其将目标蛋白质的回收复杂化)确定培养运行时间。

在本发明的增加细胞生存力的细胞培养过程和方法的具体实施方案中，在接种后某一时间加入聚阴离子化合物，该时间在最初死亡期开始之前。优选地，在接种后最初生长期期间的某一时间加入聚阴离子化合物。更优选地，在最初生长期的后半期期间加入聚阴离子化合物。更优选地，在最初生长期结束时或者约结束时加入聚阴离子化合物。

最初生长期指不存在聚阴离子化合物的特定加入时观察到的生长期。最初死亡期指不存在聚阴离子化合物的特定加入时观察到的死亡期。

当最初死亡期开始时最初生长期结束，或者在最初生长期和最初死亡期之间存在任何长度的稳定期。

在特定实施方案中，在其中最初生长期为从第0天到第6天并且最初死亡期在第7天开始的细胞培养中，在特定实施方案中，在接种后并且第7天前加入聚阴离子化合物。在特定实施方案中，在接种后并且到第6天时加入聚阴离子化合物。在特定实施方案中，在第1天和第6天之间加入聚阴离子化合物。在一特定实施方案中，在第4、5或6天加入聚阴离子化合物。在其他特定实施方案中，在约第6天，或者在第6天加入聚阴离子化合物。

已经发现(见实施例6和10)，当接种后并且在最初的死亡期开始之前的某一时间加入聚阴离子化合物时，生长期可以超过最初生长期。超过最初生长期的生长期具有比最初生长期更长的持续时间，即比不加入聚阴离子化合物时观察到的生长期更长。优选地，在延长的生长期期间，实现了比最初生长期期间实现的峰值活细胞密度更高的峰值活细胞密度。

从而，在其他实施方案中，本发明涉及(1)细胞培养方法，和(2)延长细胞培养物的生长期的方法，其包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；在接种后最初死亡期开始前的某一时间向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中生长期得到延长。在更具体的实施方案中，本发明涉及(1)细胞培养方法，和(2)延长细胞培养物的生长期的方法，其包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在接种后最初生长期期间的某一时间向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中生长期得到延长。在更具体的实施方案中，本发明涉及(1)细胞培养方法，和(2)延长细胞培养物的生长期的方法，其包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在最初生长期的后半期期间向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中生长期得到延长。在其他具体实施方案中，本发明涉及(1)细胞培养方法，和(2)延长细胞培养物的生长期的方法，其包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在最初生长期结束或者约结束时向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中生长期得到延长。

生长期可以比最初生长期的持续时间延长任何时限。仅作为实例，生长期可以延长1-10天、2-9天、3-8天、或者约5天。优选地，生长期延长1天或多天，更优选2天或多天，更优选3天或多天，最优选4天或多天。例如，在实施例6中，生长期延长到第11天，其中最初生长期为直到第6天。从而，在实施例6中，生长期已经比最初生长期的持续时间延长5天。所延长的生长期可以接着是死亡期或者稳定期。同样，最初生长期可以接着死亡期或者稳定期。

已经发现(见实施例6和10)，当接种后并且在最初的死亡期开始之前的某一时间加入聚阴离子化合物时，死亡期的出现可以比最初的死亡期延迟，即，比不加入聚阴离子化合物时观察到的死亡期的出现延迟。出现受到延迟的死亡期在比最初死亡期更晚的时间开始。

从而，在其他实施方案中，本发明涉及(1)细胞培养方法，和(2)延迟细胞培养物的死亡期的方法，其包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在接种后最初死亡期开始前的某一时间向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中死亡期的出现得到延迟。在更具体的实施方案中，本发明涉及(1)细胞培养方法，和(2)延迟细胞培养物的死亡期的方法，其包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在接种后最初生长期期间向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中最初死亡期的出现得到延迟。在更具体的实施方案中，本发明涉及(1)细胞培养方法，和(2)延迟细胞培养物的死亡期的方法，其包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在接种后最初生长期的后半期期间向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中最初死亡期的出现得到延迟。在其他实施方案中，本发明涉及延迟细胞培养物的死亡期的方法，该方法包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在最初生长期结束或者约结束时向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中死亡期的出现得到延迟。

死亡期的出现可以延迟任何时限。仅作为实例，死亡期的出现可以延迟1-10天、2-9天、3-8天、或者约5天。优选地，死亡期的出现延迟1天或多天，更优选2天或多天，更优选3天或多天，最优选4天或多天。在增加上面本发明的细胞生存力的细胞培养过程和方法的另一个具体实施方案中，在接种后最初死亡期期间加入聚阴离子化合物。

已经发现(见实施例7和8)，当在最初死亡期期间加入聚阴离子化合物时，死亡期可以受到遇制。遇制死亡期指不加入聚阴离子化合物时观察到的活细胞密度下降停止一段时间。该遇制可以发生在聚阴离子化合物加入即刻后，或者可以在更晚的时间发生。当死亡期受到遇制时，接下来可以是生长期或者稳定期。当然，最后培养物将再次进入死亡期。

从而，在其他实施方案中，本发明涉及(1)细胞培养方法，和(2)遇制细胞培养物的死亡期的方法，其包括：培养表达目标蛋白质的宿主细胞；和在最初死亡期期间的某时刻向细胞培养物加入聚阴离子化合物；其中死亡期受到遇制。

死亡期可以受到任何时限的遇制，之后再次进入死亡期。仅作为实例，死亡期可以受到抑制1-20天，例如2-18天，5-15天，或者8-13天。优选地，死亡期受到1天或多天的抑制，更优选地，受到2天或多天的抑制，更优选地，受到3天或多天的抑制，最优选地，受到4天或多天的抑制。不一定暗含死亡抑制的连续性，即，在两段恒定或者增加的活细胞密度之间可以存在活细胞密度图中“局部”减少。

细胞培养方法，尤其非连续方法的运行时间通常受到剩余的活细胞密度的限制，剩余活细胞密度在死亡期期间减小。更长的运行时间可以允许实现更高的产物滴定度。因此希望延迟死亡期，包括尽可能地延长生长期，或者遇制死亡期。产物质量的考虑也提供了延迟或者遇制死亡期的动机，因为细胞死亡可以向培养物上清液释放唾液酸酶，其可以减少所表达的蛋白质的唾液酸含量。蛋白质纯化考虑提供了延迟或者遇制死亡期的另一动机。细胞碎片的存在和培养物中死亡细胞的含量可以不利地影响分离和/或纯化培养运行结束时蛋白质产物的能力。

在特定实施方案中，本文中描述的包括两次或多次温度转换的细胞培养方法的任一种与本文中描述的包括延迟加入聚阴离子化合物的细胞培养方法的任一种一起用于细胞培养中。在特定实施方案中，本发明涉及(i)细胞培养方法，和(2)增加细胞生存力的方法，其包括：a)在允许细胞生长的条件下在37℃或者接近37℃培养产生目标蛋白质的宿主细胞允许细胞生长的时间；b)降低细胞培养的温度并从约第5天到第7天开始在34℃或者接近34℃的另一温度下培养细胞；(c)再次降低细胞培养的温度并从约第6天到第14天开始在32℃或者接近32℃的第三种温度下培养细胞；和(d)在接种后的某一时间向细胞培养物加入聚阴离子化合物。

涉及糖蛋白纯化和分析的技术和方法

在本发明包括的培养方法(两种细胞培养方法都包括两次或多次温度转换并且所述细胞培养方法包括延迟加入聚阴离子化合物)中，通常在总细胞培养期结束时使用本领域中公知的和实践的分离和纯化方法收集、回收、分离、和/或纯化，或者基本上纯化(如希望)细胞产生的蛋白质。优选地，从培养基或者上清液分离培养细胞分泌的糖蛋白；然而，使用本领域中公知和实践的如下文进一步描述的方法也可以从宿主细胞，例如，细胞裂解物回收蛋白质。

含有通过本发明的方法产生的糖蛋白的复杂碳水化合物可以常规地分析，如果希望，通过碳水化合物分析的常规技术进行分析。例如，本领域中熟知的技术，如凝集素印迹揭示末端甘露糖或者其他糖，如半乳糖的比例。通过使用无水肼或者酶促方法从蛋白质释放糖并通过离子交换层析、大小排阻层析，或者本领域中熟知的其他方法分级分离寡糖可以证实单-、二-、三-、或四-触角寡糖以唾液酸结束。

在神经氨酸酶处理以除去唾液酸之前和之后，还可以测量糖蛋白的pl。神经氨酸酶处理后pl的增加表明该糖蛋白上存在唾液酸。碳水化合物结构通常在所表达的蛋白质上作为N-连接或者O-连接的碳水化合物发生。N-连接和O-连接的碳水化合物主要在它们的核心结构中不同。N-连接的糖基化指糖部分通过GlcNAc附着肽链中的天冬酰胺残基。N-连接的糖都含有共同的Man1-6(Man1-3)Manβ1-4GlcNAcβ1-4GlcNAcβ-R核心结构，其中该核心结构中的R代表天冬酰胺残基。所产生的蛋白质的肽序列将含有天冬酰胺-X-丝氨酸、天冬酰胺-X-苏氨酸、和天冬酰胺-X-半胱氨酸，其中X为除了脯氨酸之外的任何氨基酸。

相比，O-连接的糖的特征是共同的核心结构，其为附着到苏氨酸或丝氨酸的羟基的GalNAc。N-连接的和O-连接的糖中，最重要的是复杂N-和O-连接的糖。这些复杂糖含有数个触角结构。单-、二-、三-、和四-外部结构对于加入末端唾液酸是重要的。这些外部链结构为包括所述蛋白质产物的糖的特定糖和连接提供了额外的位点。

可以通过本领域中任何公知的技术分析所得糖。一些方法在本领域中公知用于分析糖基化并且可用于本发明背景中。这些方法提供了关于连接所产生的肽的寡糖的身份和组成的信息。可用于本发明的糖分析方法包括，但不限于凝集素层析；HPAEC-PAD，其使用高pH阴离子交换层析基于电荷分离寡糖；NMR；质谱；HPLC；GPC；单糖组成分析；和顺序酶促消化。

此外，释放寡糖的方法是本领域中公知并且实践的。这些方法包括1)酶促方法，其通常使用肽-N-糖苷酶F/内-β-半乳糖苷酶进行；2)β-消去法，使用苛刻碱性环境以释放主要O-连接的结构；和3)化学方法，使用无水肼释放N-和O-连接的寡糖。使用下面的步骤进行分析：1.针对去离子水透析样品以除去所有缓冲盐，然后冻干。2.用无水肼释放完整寡糖链。3.用无水含甲醇盐酸处理完整寡糖链以释放作为O-甲基衍生物的单独的单糖。4.任何伯氨基团的N-乙酰化。5.衍生化以产生per-O-三甲基甲硅烷基甲基糖苷。6.通过在CP-SIL8柱上毛细管气相液相层析(GLC)分离这些衍生物。7.通过GLC和质谱的存留时间与公知的标准相比鉴定各种糖苷衍生物。8.通过FID使用内标(13-O-甲基-D-葡萄糖)定量各种衍生物。

通过高效阴离子交换层析联合脉冲电流检测(HPAE-PADCarbohydrate System；Dionex Corp.)可以确定中性和氨基糖。例如，通过在20％(v/v)三氟乙酸中100℃水解6小时释放糖。然后通过冻干或者使用Speed-Vac(Savant Instruments)干燥水解产物。将残渣溶于1％三水合乙酸钠溶液中并在HPLC-AS6柱(如Anumula等人，1991，Anal.Biochem.，195：269-280描述)上分析。

备选地，可以实施免疫印迹碳水化合物分析。在该方法中，使用商业化聚糖检测系统(Boehringer)检测蛋白质结合的糖，所述系统是基于Haselbeck等人(1993，Glycoconjugate J.，7：63)描述的氧化免疫印迹方法。按照生产商推荐的染色方案，只是将蛋白质转移到聚偏二氯乙烯膜而不是硝酸纤维素膜，并且封闭缓冲液含有10mM Tris缓冲液(pH 7.4)中的5％牛血清白蛋白，该缓冲液含有0.9％氯化钠。用连接碱性磷酸酶缀合物(Boehringer)的抗地高辛抗体实施检测，该抗体以1∶1000在Tris缓冲盐溶液中稀释，使用磷酸酶底物：溶于100mMTris缓冲液(pH 9.5)的0.03％(w/v)氯化4-氮蓝四唑和0.03％(w/v)5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸，该缓冲液含有100mM氯化钠和50mM氯化镁。通常在约10到15分钟内显现含有糖的蛋白质带。

通过肽-N-糖苷酶F消化也可以分析结合蛋白质的糖。根据该方法，将残基悬浮在含有0.18％SDS，18mMβ-巯基乙醇，90mM磷酸盐，3.6mM EDTA的14μL缓冲液(pH 8.6)中并在100℃加热3分钟。冷却到室温后，将样品分成两个相等部分。一份不进一步处理，其作为对照。另一份调节到约1％NP-40去污剂，然后加入0.2单位肽-N-糖苷酶F(Boehringer)。两份样品都在37℃保温2小时，然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。

此外，通过常规方法评估糖蛋白产物的唾液酸含量。例如，通过直接比色方法(Yao等人，1989，Anal.Biochem.，179：332-335)，优选使用一式三份样品分别测定唾液酸。另一种唾液酸测定方法包括使用硫代巴比要酸，如Warren等人，1959，J.Biol Chem.，234：1971-1975所描述。再一种方法包括高效层析，如H.K.Ogawa等人，1993，J.Chromatography，612：145-149描述。

作为例证，对于糖蛋白回收、分离和/或纯化，离心细胞培养基或细胞裂解物以除去颗粒细胞和细胞碎片。通过适宜的纯化技术从污染性可溶蛋白和多肽分离或纯化所希望的多肽产物。下面的方法提供了代表性但是非限制性蛋白质纯化方法：在免疫亲和或者离子交换柱上分离或者分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；在树脂，如硅胶，或者阳离子交换树脂，例如，DEAE上层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；凝胶过滤，使用例如，Sephadex G-75，Sepharose；蛋白质Asepharose层析以除去免疫球蛋白污染物；等等。其他添加剂，如蛋白酶抑制剂(例如，PMSF或者蛋白酶K)可用于抑制纯化期间蛋白质水解性降解。技术人员将理解给定目标多肽的纯化方法可能需要修改以容许细胞培养中重组表达的多肽中的变化。尤其优选可以选择糖并且富集唾液酸的那些纯化方法，例如，离子交换软凝胶层析，或者使用阳离子-或者阴离子-交换树脂的HPLC，其中收集更酸性的级分。

细胞、蛋白质和细胞培养物

在本发明的细胞培养过程或方法(包括两次或多次温度转换的细胞培养方法以及包括延迟加入聚阴离子化合物的细胞培养方法)中，如本领域中公知的，细胞可以保持在多种细胞培养基中，即基础培养基中。例如，这些方法可以用于将大体积细胞保持在细胞培养基中，所述培养基可以补加营养物等等。通常，“细胞培养基”(也称作“培养基”)是本领域中技术人员理解的术语并且公知表示营养溶液，其中生长细胞，优选动物或者哺乳动物细胞，并且该营养溶液通常提供下面的至少一种或多种组分：能源(通常为糖，如葡萄糖的形式)；所有必需氨基酸，通常20种基本氨基酸，加上半胱氨酸；维生素和/或以低浓度需要的其他有机化合物；脂质或游离脂肪酸，例如亚油酸；和微量元素，例如，无机化合物或者天然发生的元素，它们通常以极低浓度需要，通常在微摩尔范围内。还可以向细胞培养基补加多种任选组分，如激素和其他生长因子，例如，胰岛素、转铁蛋白、表皮生长因子、血清，等等；盐，例如，钙、镁和磷酸盐，和缓冲液，例如HEPES；核苷和碱基，例如腺苷、胸苷、次黄嘌呤；和蛋白和组织水解物，例如水解动物蛋白(蛋白胨或蛋白胨混合物，其可以从动物副产品获得，纯化的明胶或植物材料)；抗生素，例如庆大霉素和细胞保护基，例如，Pluronic多元醇(Pluronic F68)。优选无血清并且没有动物来源的产物或者成分的细胞营养培养基。

如技术人员所理解的，动物或者哺乳动物细胞培养于适于特定细胞培养并且可以通过本领域技术人员不用过多实验就可以确定的培养基中。可以使用通过商业途径得到的培养基并且它们包括，例如，最小基本培养基(MEM，Sigma，St.Louis，MO)；Ham′s F10培养基(Sigma)；Dulbecco氏改良的Eagle培养基(DMEM，Sigma)；RPMI-1640培养基(Sigma)；HyClone细胞培养基(HyClone，Logan，UT)；和化学定义的(CD)培养基，它们用于特定细胞类型，例如CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)。如必需或者希望，可以向前面的代表性培养基添加适宜浓度或量的上述补充组分或成分，包括任选组分，并且所述添加将是本领域技术人员公知的并且使用常规技术可以实现的。

此外，适于本发明方法的细胞培养条件是细胞的分批、补料分批，或者连续培养通常使用和公知的那些条件，注意pH，例如约6.5到约7.5；溶解氧(O₂)，例如空气饱和度的约5-90％和二氧化碳(CO₂)，搅拌和湿度，以及温度。作为阐明性且非限制性实例，适于本发明的补料分批方法的细胞培养基包括改良CD-CHO培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)，例如实施例1。还可以使用送料培养基，如改良的eRDF培养基(Invitrogen，Carlsbad，CA)，例如，实施例1或实施例7。优选还含有D-半乳糖的送料培养基。

动物细胞、哺乳动物细胞、培养细胞、动物或哺乳动物宿主细胞、宿主细胞、重组细胞、重组宿主细胞等等都是细胞术语，它们可以根据本发明的方法培养。这些细胞通常是从哺乳动物得到或来源于哺乳动物的细胞系并且当置于含有适宜营养物和/或生长因子的培养基中单层培养或者悬浮培养时能够生长和存活。特定细胞培养物的生长和保持所必需的生长因子和营养物可以容易地由相关领域中技术人员通过经验确定，如例如由Barnes和Sato，(1980，Cell，22：649)；Mammalian Cell Culture，编者，J.P.Mather，Plenum Press，NY，1984；和美国专利号5,721,121描述。

根据本发明方法可以培养多种细胞类型。细胞通常是动物或者哺乳动物细胞，它们可以表达和分泌，或者经分子工程化后表达和分泌大量特定蛋白质，更具体地，目标糖蛋白到培养基中。将理解宿主细胞产生的糖蛋白可以是宿主细胞内源的或者同源的。备选地，和优选地，糖蛋白是异源的，即宿主细胞外来的，例如，中国仓鼠卵巢(CHO) 宿主细胞产生和分泌的人糖蛋白。还优选哺乳动物糖蛋白，即最初从哺乳动物生物得到和来源的那些糖蛋白可通过本发明方法得到并且优选通过细胞分泌到培养基中。

通过本发明方法可以优选产生的哺乳动物糖蛋白的实例包括，但不限于，细胞因子、细胞因子受体、生长因子(例如，表皮生长因子(EGF)、人表皮生长因子受体-2(HER-2)、成纤维细胞生长因子-α(FGF-α)、成纤维细胞生长因子-β(FGF-β)、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、血小板衍生生长因子(PDGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、胰岛素样生长因子-2(IGF-2)、神经生长因子(NGF)、神经生长因子-β(NGF-β))；生长因子受体，包括融合和嵌合蛋白。其他非限制性实例包括生长激素(例如，人生长激素、牛生长激素)；胰岛素(例如，胰岛素A链和胰岛素B链)、胰岛素原；红细胞生成素(EPO)；集落刺激因子(例如，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF))；白介素(例如，IL-1到IL-12)；血管内皮生长因子(VEGF)和其受体(VEGF-R)；干扰素(例如，IFN-α、β、或γ)；肿瘤坏死因子(例如，TNF-α和TNF-β)和它们的受体TNFR-1和TNFR-2；血小板生成素(TPO)；凝血酶；脑钠尿肽(BNP)；凝血因子(例如，因子VIII、因子IX，冯·维勒布兰德因子，等等)；抗凝因子；组织纤溶酶原激活物(TPA)，例如，尿激酶或者人尿或组织型TPA；促卵泡激素(FSH)；黄体生成素(LH)；降钙素；CD蛋白(例如，CD3、CD4、CD8、CD28、D19等等)；CTLA蛋白(例如，CTLA4)；T-细胞和B-细胞受体蛋白；骨形态发生蛋白(BMPs，例如，BMP-1、BMP-2、BMP-3等等)；神经营养因子，例如，骨来源的神经营养因子(BDNF)；神经营养蛋白，例如3-6；肾素；类风湿因子；RANTES；白蛋白；松弛素；巨噬细胞抑制蛋白(例如，MIP-1、MIP-2)；病毒蛋白质或抗原；表面膜蛋白；离子通道蛋白；酶；调节蛋白；抗体；免疫调节蛋白(例如，HLA、MHC，B7家族)；归巢受体；转运蛋白；超氧化物歧化酶(SOD)；G-蛋白偶联的受体蛋白(GPCRs)；神经调节蛋白；阿尔茨海默氏病相关蛋白质和肽(例如，A-β)，和本领域中公知的其他糖蛋白。通过本发明的方法可以产生的适宜的蛋白质、多肽和肽还包括融合蛋白和多肽、嵌合蛋白和多肽，以及上面提到的蛋白质任一种的片段或部分，或者突变体、变体或类似物。

适于容纳、表达和产生蛋白质以随后分离和/或纯化的动物或哺乳动物宿主细胞的非限制性实例包括中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，如CHO-K1(ATCC CCL-61)、DG44(Chasin等人，1986，Som.Cell Molec.Genet.，12：555-556；Kolkekar等人，1997，Biochemistry，36： 10901-10909；)、CHO-K1 Tet-On细胞系(Clontech)、CHO指定的ECACC 85050302(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)、CHO克隆13(GEIMG，Genova，IT)、CHO克隆B(GEIMG，Genova，IT)、CHO-K1/SF指定的ECACC 93061607(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)、RR-CHOK1指定的ECACC 92052129(CAMR，Salisbury，Wiltshire，UK)、二氢叶酸脱氢酶阴性CHO细胞(CHO/-DHFR，Urlaub和Chasin，1980，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，77：4216)，和dp12.CHO细胞(美国专利号5,721,121)、SV40转换的猴肾CV1细胞(COS细胞，COS-7，ATCCCRL-1651)；人胚胎肾细胞(例如，293细胞，或亚克隆以悬浮培养的293细胞，Graham等人，1977，J.Gen.Virol.，36：59)、幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL-10)、猴肾细胞(CV1，ATCCCCL-70)、非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587；VERO，ATCCCCL-81)、小鼠支持细胞(TM4，Mather，1980，Biol.Reprod.，23：243-251)、人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL-2)、犬肾细胞(MDCK，ATCCCCL-34)、人肺细胞(wu38，ATCC CCL-75)、人肝癌细胞(HEP-G2，HB8065)、小鼠乳腺肿瘤细胞(MMT 060562，ATCC CCL-51)、水牛大鼠肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL-1442)、TRI细胞(Mather，1982，AnnalsNYAcad.Sci.，383：44-68)、MCR 5细胞、FS4细胞。优选CHO细胞，特别是CHO/-DHFR细胞。

适于在本发明的培养方法和过程中培养的细胞可以含有导入的(例如，通过转化、转染、感染，或者注射)的表达载体(构建体)，如质粒等等，其含有编码序列或者其部分，所述编码序列或者其部分编码在培养过程中表达和生产的蛋白质。这种表达载体含有所插入的编码序列的转录和翻译必要的元件。本领域中技术人员熟知并且实践的方法可用于构建表达载体，其含有编码所产生的蛋白质和多肽的序列，以及适宜的转录和翻译控制元件。这些方法包括体外重组DNA技术，合成技术，和体内基因重组。这些技术在J.Sambrook等人，1989，Molecular Cloning，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborPress，Plainview，N.Y.和F.M.Ausubel等人，1989，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.中描述。

控制元件，或者调节序列是载体的非翻译区，例如，增强子、启动子、5’和3’非翻译区，这些非翻译区与宿主细胞蛋白质相互作用以实施转录和翻译。这些元件可以在长度和特异性方面不同。根据所用的载体系统和宿主细胞，可以使用任何数目的适宜的转录和翻译元件，包括组成性和可诱导的启动子。在哺乳动物细胞系统中，优选来自哺乳动物基因或者哺乳动物病毒的启动子。设计用于蛋白质表达系统的构建体以含有至少一种启动子、一种增强子序列(任选地，用于哺乳动物表达系统)，和基因表达的正确转录和调节所必需或者需要的其他序列(例如，转录起始和终止序列、复制位点的原点、多腺苷酸化序列，例如，牛生长激素(BGH)多聚A序列)。

如本领域技术人员将理解的，适宜的载体，例如质粒，和真核(例如，哺乳动物)表达系统中产生的蛋白质的转录、表达和分离组分的选择是本领域中技术人员公知并且常规确定和实践的。根据本发明方法培养的细胞的蛋白质表达可以置于启动子的控制下，所述启动子为例如病毒启动子，例如，巨细胞病毒(CMV)、劳氏内瘤病毒(RSV)、磷酸甘油激酶(PGK)、胸苷激酶(TK)，或者α-肌动蛋白启动子。此外，特定化合物或者分子可以赋予受调节启动子的可诱导性，例如，小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)的糖皮质激素应答元件(GRE)受到糖皮质激素的诱导(V.Chandler等人，1983，Cell，33：489-499)。而且，如果必要或者希望，可以使用组织特异启动子或者调节元件(G.Swift等人，1984，Cell，38：639-646)。

通过本领域中技术人员公知的多种基因转移方法可以将表达构建体导入细胞中，所述方法为例如，常规基因转染方法，如磷酸钙共沉淀、脂质体转染、微注射、电穿孔，和感染或者病毒转导。方法的选择是本领域技术人员的能力范围之内的。本领域中技术人员将明白可以将携带在细胞中表达的DNA序列的一种或多种构建体转染细胞，从而在所述细胞中随后产生或者从所述细胞得到表达产物。

在具体方面，含有适宜的控制和调节序列的哺乳动物表达系统优选用于本发明的表达蛋白质的哺乳动物细胞中。通常用于产生哺乳动物表达载体的真核控制序列包括与哺乳动物细胞相容的启动子和控制序列，例如，巨细胞病毒(CMV)启动子(CDM8载体)和鸟肉瘤病毒(ASV)，(πLN)。其他常用的启动子包括源于猿病毒40(SV40)的早和晚启动子(Fiers等人，1973，Nature，273：113)，或者其他病毒启动子，如源于多形瘤、腺病毒2、和牛乳头状瘤病毒的那些启动子。也可以使用可诱导的启动子，如hMTII(Karin等人，1982，Nature，299：797-802)。

适于真核宿主细胞的表达载体的实例包括，但不限于，哺乳动物细胞的载体(例如，BPV-1、pHyg、pRSV、pSV2、pTK2(Maniatis)、pIRES(Clontech)、pRc/CMV2、pRc/RSV、pSFV1(LifeTechnologies)、pVPakc载体、pCMV载体、pSG5载体(Stratagene)、逆转录病毒载体(例如，pFB载体(Stratagene))、pcDNA-3(Invitrogen)、腺病毒载体；腺相关病毒载体、杆状病毒载体、酵母载体(例如，pESC载体(Stratagene))、或者前面任一种载体的改良修饰。载体还可以包括含有用于优化基因表达的启动子区域序列上游或下游的增强子序列。

也可以在重组载体(例如，质粒)中使用可选择标记以赋予对含有(优选已经稳定整合)该载体的细胞抗性以允许它们在适宜的选择培养基中选择。可以使用许多选择系统，它们包括但不限于，单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV TK)(Wigler等人，1977，Cell，11：223)；次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT)(Szybalska和Szybalski，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，48：202)；和腺嘌呤磷酸核糖基转移酶(Lowy等人，1980，Cell，22：817)基因，它们分别可用于tk-、hgprt-、或aprt-细胞(APRT)中。

抗代谢物抗性也可用作标记基因的下面的非限制性实例的选择基础：dhfr，其赋予氨甲蝶呤抗性(Wigler等人，1980，Natl.Acad.Sci.USA 77：357；O′Hare等人，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：1527)；gpt，其赋予霉酚酸抗性(Mulligan和Berg，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78：2072)；neo，其赋予氨基糖苷G-418抗性(Clinical Pharmacy，12：488-505；Wu和Wu，1991，Biotherapy，3：87-95；Tolstoshev，1993，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，32：573-596；Mulligan，1993，Science，260：926-932；Anderson，1993，Ann.Rev.Biochem.，62：191-21；May，1993，TIB TECH，11(5)：155-215)；和hygro，其赋予潮霉素抗性(Santerre等人，1984，Gene 30：147)。本领域中公知的重组DNA技术的方法可常规地用于选择所希望的重组克隆，并且这些方法在例如，Ausubel等人(编者)，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY (1993)；Kriegler，Gene Transfer and Expression，A LaboratoryManual，Stockton Press，NY(1990)；和第12和13章，Dracopoli等人(编者)，Current Protocols in Human Genetics，John Wiley& Sons，NY(1994)；ColberreGarapin等人，1981，J.Mol.Biol.150：1中描述，这些文献在此处被完整并入作为参考。

通过载体扩增可以提高所表达的蛋白质分子的表达水平(综述，见Bebbington和Hentschel，使用基于基因扩增的载体在哺乳动物细胞中表达克隆的基因，DNA cloning，卷3(Academic Press，New York，1987))。当表达蛋白质的载体系统中的标记物是可扩增的时候，宿主培养物中存在的抑制剂的水平的增加将增加该标记基因的拷贝数。因为扩增的区域与编码蛋白质的基因结合，所以蛋白质的产量将伴随着增加(Crouse等人，1983，Mol.Cell.Biol.3：257)。

可以分别在药物甲硫氨酸sulphoximine或者氨甲蝶呤的存在下扩增含有作为选择标记的编码谷氨酰胺合酶(GS)或者二氢叶酸还原酶(DHFR)的核酸的载体。基于谷氨酰胺合酶的载体的优点是可以利用谷氨酰胺合酶阴性细胞系(例如，鼠骨髓瘤细胞系，NSO)。通过提供额外抑制剂以防止谷氨酰胺合酶内源基因的作用，谷氨酰胺合酶表达系统也可以在表达谷氨酰胺合酶的细胞(例如，CHO细胞)中发挥功能。

表达作为选择标记的DHFR的载体包括，但不限于pSV2-dhfr质粒(Subramani等人，Mol.Cell.Biol.1：854(1981)。表达作为选择标记的谷氨酰胺合酶的载体包括，但不限于Stephens和Cockett，1989，Nucl.Acids.Res.，17：7110中描述的pEE6表达载体。谷氨酰胺合酶表达系统和其组分在PCT公布：WO87/04462、WO86/05807、WO89/01036、WO89/10404、和WO91/06657中详述，这里完整引用这些文献作为参考。此外，可以根据本发明使用的谷氨酰胺合酶表达载体可通过商业途径从供应商(包括，例如，LonzaBiologics，Inc.(Portsmouth，NH))得到。

在特定实施方案中，可以将编码可溶性CTLA4分子或者可溶性CTL4突变分子的核酸序列插入经设计用于在真核宿主中表达外来序列的载体中。所述载体的调节元件可以根据具体真核宿主而变。在真核宿主细胞中表达可溶CTLA4或者可溶CTLA4突变体的载体包括用于优化蛋白质表达的增强子序列。

细胞培养类型

为了理解的目的，然而不限制，技术人员将理解用于蛋白质生产的细胞培养和培养运行可以包括三种通常的类型；即连续培养、分批培养和补料-分批培养。在连续培养中，例如，在培养期间为细胞提供新鲜培养基补充(即，补料培养基)，而每天除去旧培养基，并且例如，每天或者连续收获产物。在连续培养中，送料培养基每天加入并且可以连续地，即作为滴液或者输注加入。对于连续培养，细胞可以在培养物中保持所希望的长时间，只要细胞保持活着并且保持环境和培养条件。

在分批培养中，细胞最初在培养基中培养，并且在培养运行期间或者结束前该培养基既不除去、替换，也不补加，即不用新鲜培养基“喂养”细胞。在培养运行末收获所希望的产物。

对于补料分批培养，通过在运行期间用新鲜培养基每天补加培养基一次或多次(或者连续)，即在培养期期间用新鲜培养基(“送料培养基”)“喂养”细胞。补料分批培养可以包括多种喂饲方案和次数，例如，每天、每隔一天、每两天，等等，每天一次以上，或者每天小于一次，等等。此外，可以用送料培养基连续喂饲补料分批培养物。

然后在培养/生产运行结束时收获所希望的产物。本发明优选包括补料-分批细胞培养，其中培养期期间两次或多次温度转换产生了更高数量和质量的蛋白质并且可以延长蛋白质生产期使其超过不使用温度转换，或者仅使用一次温度转换时发生的生产期。本发明优选包括补料-分批细胞培养，其中在接种后加入聚阴离子化合物。

还设想在本发明的培养方法中，可以向送料培养基补加D-半乳糖，或者D-半乳糖可以通过不同于在送料培养基中的方法喂饲培养物。在培养运行期间并且直到培养运行结束，优选每天(或者连续)用含有半乳糖的送料培养基喂饲，或者其他形式喂饲，尽管可以应用其他喂饲方案。在包括D-半乳糖的这种连续喂饲方案中，培养物接受送料培养基，其作为连续提供的“滴液”，或者输注，或者其他向培养物的自动化添加，以定时的、受调节的，和/或程序化的方式加入，以期实现并保持培养物中适宜量的半乳糖。最优选的方案包括在培养运行的每天，从培养运行开始到收获细胞的那一天用含有半乳糖的送料培养基每天一次大丸剂喂饲。根据本发明的包括用半乳糖喂饲的方法，送料培养基中D-半乳糖的浓度优选以如此的量提供，所述量提供在培养过程培养物，或者反应器中D-半乳糖的持续或者稳定的水平。适于用于送料培养基中的D-半乳糖的量为约1g/L到约50g/L，优选约3g/L到约25g/L，更优选约3g/L到约20g/L。作为具体但是非限制性实例，送料培养基中12.5g/L D-半乳糖适于用于本发明的培养方法中，尤其例如，用于50L反应器规模。此外，优选用于培养细胞的送料培养基中残留半乳糖的浓度(例如，反应器或者培养容器中)在整个培养运行中保持并维持在约0.1-10g/L，优选约0.1-5g/L，更优选约0.2-5g/L，更优选，约0.2-2.5g/L，甚至更优选，约0.5-2g/L，最优选约0.5-1.0g/L(见，共同转让的专利申请美国序号60/436,050(2002年12月23日提交)和相伴提交的美国序号10/________，这里引用所述专利申请作为参考)。

在包含两次或多次温度转换的本发明的方面，本发明的包含两次或多次温度转换的细胞培养方法导致培养物中更多活细胞，直到该方法或者生产运行结束。存活细胞的数目越大，在蛋白质生产的非生长相关过程，如本文中例证的过程中产生的蛋白质产物的量就越大。从而，在这些情况中，在该方法结束时得到的所希望的产物的累积量越大。根据本发明，培养物中单独细胞产生蛋白质或者糖蛋白的速度(即，细胞特定生产率)不受本发明的温度转换培养方法的影响或增加(例如，实施例6)。相比，在生长相关的培养过程中，主要通过培养物的生长期期间正生长的细胞产生蛋白质。(例如，见下文和实施例4)。

根据本发明，使用惯用于动物或者哺乳动物细胞培养的培养容器和/或培养设备，在大规模或者小规模蛋白质生产条件下，可以实施细胞培养，并且可以由细胞产生糖蛋白。如本领域中技术人员将理解的，组织培养皿、T-烧瓶和旋转瓶通常用于实验室规模。对于大规模培养(例如，500L，5000L，等等，例如，如在一般转让的专利申请美国序号60/436,050(2002年12月23日提交)和相伴提交的美国序号10/________所描述的，这里引用所述专利申请作为参考)，方法包括，但不限于，可以使用流化床生物反应器、中空纤维生物反应器、滚瓶培养，或者搅拌釜生物反应器系统。微载体可以与或者不与滚瓶或者搅拌釜生物反应器系统一起使用。系统可以以分批、连续、或者补料-分批模式运行。此外，培养设备或者系统可以装备或者不装备细胞分离器，该分离器使用过滤、重力、离心力，等等。

细胞培养期和相关参数

术语“接种”指向起始培养基加入细胞以开始培养。

培养的生长期指这样的期间，在该期间任何时间点的活细胞密度都高于任何以前的时间点的活细胞密度。

培养的稳定期指这样的期间，在该期间活细胞密度在任何长度的时限内约恒定(即在测量误差内)。

培养的死亡期是生长期之后或者生长期和稳定期之后出现的时期，在该期间内任何时间点的活细胞密度都低于前面期内任何时间点的活细胞密度。

在生长相关的培养方法中，如聚阴离子化合物导致延长的生长期的情况，生产期可以在延长的生长期期间开始。

在非生长相关的培养方法中，细胞培养的生产期可以是稳定期。

优选地，在生产期期间补加(“喂饲”)培养基以提供持续蛋白质生产，尤其在延长的生产期中，以得到大量高质量糖蛋白产物(如通过蛋白质回收时高水平终末唾液酸含量例证和/或确定)。喂饲可以每天发生，或者根据其他方案进行以维持细胞生存力和蛋白质生产。

在延长的生产期期间，温度经转换而连续低于生长和标准(最初)生产期的温度，细胞得到喂饲并保持存活。这导致在比最初培养温度下，或者当温度从最初培养温度仅转换一次时发生的总时限延长的或者更长的总时限内生产所希望的蛋白质产物。根据本发明的培养方法可以导致更多活细胞存活直到培养期结束。因此，在一些实施方案中，存活的细胞越多，产生所希望的产物的细胞越多。这又导致培养方法结束时积累更大量的产物，而单个细胞生产蛋白质的速度，即细胞特定生产率保持相同(见，例如实施例4)。如本领域中公知的细胞特定生产率或者细胞特定速度通常指每个细胞，或者细胞质量或者体积的每一量度产生的产物的特定表达速度。例如，以所产生的蛋白质克数/细胞/天测量细胞特定生产率，并且可以根据积分方法测量细胞特定生产率，该积分方法包括下式：

dP/dt＝q_p X，或者

P＝q_p∫₀ ^t Xdt

其中qp为细胞特定生产率常数；X为细胞数或者细胞体积，或者细胞质量当量；dP/dt为蛋白质生产速度。从而，可以从产物浓度对活细胞的时间积分得到qp(∫₀ ^t Xdt“活细胞天数”)。根据该公式，当将产生的糖蛋白产物的量对可变细胞数作图时，斜率等于细胞特定速度。可以通过几种量度确定细胞，所述量度为例如，生物量、O₂摄取速度、乳糖脱氢酶(LDH)、压紧细胞体积或者浊度(例如，T.Etcheverry等人的美国专利号5,705,364)。

通过本发明的培养方法产生可溶CTLA4分子和可溶CTLA4突变分子

在本发明包括的其他实施方案中，细胞培养方法用于产生可溶CTLA4分子或可溶CTLA4突变分子，如下述。可溶CTLA4分子优选为CTLA4融合蛋白，优选CTLA4Ig。更优选含有如图3中所示的-1到357或者+1到357位氨基酸的CTLA4Ig。最优选由图3中所示的-1到357或者+1到357位氨基酸组成的CTLA4Ig。可溶CTLA4突变分子优选为L104EA29YIg，其含有如图4中所示的-1到357或者+1到357位氨基酸。最优选由图4中所示的-1到357或者+1到357位氨基酸组成的L104EA29YIg。包括蛋白质产物的延长生产期的两步或三步温度转换细胞培养方法尤其适于通过培养物中的宿主细胞产生高质量和大量可溶性CTLA4分子和可溶性CTLA4突变分子。

在优选实施方案中，通过重组工程化宿主细胞产生CTLA4Ig。通过用含有编码CTLA4Ig的DNA序列的载体转染的CHO细胞可以重组产生CTLA4Ig融合蛋。(见，P.S.Linsley等人的美国专利号5,844,095，和本文中实施例2)。当在本发明的多步温度转换方法中培养时，CTLA4Ig融合蛋白以高数量产生并且被适宜地唾液酸化。本发明提供生产高水平可回收的蛋白质产物，例如，唾液酸化CTLA4Ig蛋白质产物。在另一优选实施方案中，含有如图4中所示的-1到357或+1到357氨基酸的可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg由本发明的细胞培养方法产生。

CTLA4的配体是B7分子。如本文中所用的“配体”指特异识别并结合另一分子的分子。分子和其配体的相互作用可以受到本发明的培养方法的产物的调节。例如，通过施用CTLA4Ig分子可以阻断CTLA4与其配体B7的相互作用。作为其他实施例，通过施用etanercept或者其他TNF/TNFR阻断分子可以阻断肿瘤坏死因子(TNF)与其配体(TNFR)的相互作用。

野生型CTLA4或者“非突变的CTLA4”具有天然发生的，全长CTLA4的氨基酸序列，如图5中所示(也在美国专利号5,434,131、5,844,095和5,851,795中描述，这里将它们完整并入作为参考)，或者识别并结合B7分子或者干扰B7分子，从而与CD28和/或CTLA4(例如，内源CD28和/或CTLA4)的结合被阻断。野生型CTLA4含有特定部分，包括，例如，以+1位甲硫氨酸开始并且以+124位天冬氨酸结束的野生型CTLA4的胞外结构域，或者以-1位丙氨酸开始并且以+124位天冬氨酸结束的野生型CTLA4的胞外结构域，如图5中所示。

天然发生的野生型CTLA4是细胞表面蛋白质，其具有N-末端胞质结构域、跨膜结构域，和C-末端胞质结构域。胞外结构域结合靶分子，如B7分子。在细胞中，天然发生的，野生型CTLA4蛋白质以不成熟多肽翻译，其包括氨基端，或者N-末端的信号肽。该不成熟多肽经历翻译后加工，其包括切割并除去信号肽以产生CTLA4切割产物，其具有与不成熟形式中的N-末端不同的N-末端。本领域中技术人员将理解可以发生额外的翻译后加工，其从CTLA4切割产物的新近产生的N-末端除去一个或多个氨基酸。成熟CTLA4蛋白质可以在+1位甲硫氨酸或者-1位丙氨酸开始。CTLA4分子的成熟形式包括结合B7的胞外结构域或者其任何部分。

如本文中所用的CTLA4突变分子指含有如图5中所示的野生型CTLA4的分子，或者其任何部分或者衍生物，所述衍生物在野生型CTLA4序列，优选野生型CTLA4的胞外结构域中具有一处突变或多处突变，并且结合B7。CTLA4突变分子具有与野生型CTLA4分子相似，但是不相同的序列，但是仍然结合B7。所述突变可以包括将一个或多个氨基酸残基用具有保守(例如，亮氨酸代替异亮氨酸)或者非保守(例如，色氨酸代替甘氨酸)结构或者化学特性的氨基酸、氨基酸缺失、加入、移码或者截断代替。

CTLA4突变分子可以在其中包括非-CTLA4分子或者附着非-CTLA4 分子，即，CTLA4突变融合蛋白。所述突变分子可以是可溶的(即，循环的)或者它们可以结合到细胞表面(膜结合)。CTLA4突变分子包括L104EA29YIg和美国专利序号09/865,321、60/214,065和60/287,576；WO 01/92337 A2；美国专利号6,090,914、5,844,095和5,773,253；和R.J.Peach等人1994，J Exp Med，180：2049-2058中描述的那些分子。可以合成或者重组产生CTLA4突变分子。

CTLA4Ig是可溶性融合蛋白，其含有野生型CTLA4的胞外结构域，或其结合B7的部分，所述胞外结构域或者其部分与免疫球蛋白(Ig)分子，或者其部分结合。CTLA4的胞外结构域或者其部分结合到Ig部分，其含有免疫球蛋白所有或者一部分，优选免疫球蛋白恒定区的所有或者一部分，如IgCγ1(IgCgamma1)、IgCγ2(IgCgamma2)、IgCγ3(IgCgamma3)、IgCγ4(IgCgamma4)、IgCμ(IgCmu)、IgCα1(IgCalpha1)、IgCα2(IgCalpha2)、IgCδ(IgCdelta)或IgCε(IgCepsilon)的所有或者一部分，使得该融合蛋白可溶。Ig部分可以包括前述恒定区或者其他恒定区的铰链、CH2和CH3结构域、或者CH1、铰链、CH2和CH3结构域。优选地，Ig部分来源于人或者猴，并且包括铰链、CH2和CH3结构域。最优选地，Ig部分含有人IgCγ1的铰链、CH2和CH3结构域，或者由人IgCγ1的铰链、CH2和CH3结构域组成。在CTLA4Ig的Ig部分中，可以突变Ig恒定区或者其部分，从而导致减小其效应物功能(见，例如，美国专利号5,637,481、5,844,095和5,434,131)。本文中所用的术语IgG部分、Ig恒定区、IgC(恒定)结构域、IgCγ1(IgCgamma1)、IgCγ2(IgCgamma2)、IgCγ3(IgCgamma3)、IgCγ4(IgCgamma4)、IgCμ(IgCmu)、IgCα1(IgCalpha1)、IgCα2(IgCalpha2)、IgCδ(IgCdelta)或IgCε(IgCepsilon)包括天然序列和已经突变的序列，如在恒定区中具有突变的序列，其减小效应物功能。

与CTLA4有关的特定实施方案包括在+1位甲硫氨酸开始并且在+124位天冬氨酸结束，或者在-1位丙氨酸开始到+124位天冬氨酸的野生型CTLA4的胞外结构域；+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺；和免疫球蛋白部分，其包括+126位谷氨酸到+357位赖氨酸，如图3中所示。根据布达佩斯条约的条款，编码该CTLA4Ig的DNA在1991年5月31日保存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 UniversityBlvd.，Manassas，VA 20110-2209，并且已经给予ATCC保藏号ATCC 68629；P.Linsley等人，1994，Immunity 1：793-80。表达CTLA4Ig的CHO细胞系于1991年5月31日保藏在ATCC，保藏号为CRL-10762。根据本文中描述的方法产生的可溶性CTLA4Ig分子可以或不必包括信号(前导)肽序列。图8和9包括对信号(前导)肽序列的说明。通常，分子不包括信号肽序列。

L104EA29YIg是融合蛋白，其是可溶性CTLA4突变分子，该分子含有野生型CTLA4的胞外结构域，其具有氨基酸改变A29Y(酪氨酸氨基酸残基置换29位的丙氨酸)和L104E(谷氨酸氨基酸残基置换+104位亮氨酸)，该胞外结构域连接到IgG尾。备选地，L104EA29YIg的氨基酸序列含有+1位氨基酸位置的甲硫氨酸到+357氨基酸位置的赖氨酸，如图4中所示。L104EA29YIg含有+125位的连接氨基酸残基谷氨酰胺和IgG部分，其包括+126位谷氨酸到+357位赖氨酸。根据布达佩斯条约的条款，编码L104EA29YIg的DNA在2000年6月20日保存在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，并且已经给予ATCC保藏号PTA-2104。L104EA29YIg在共同待决美国专利申请序号09/579,927、60/287,576和60/214,065和WO/01/923337 A2中描述，将所述专利完整并入本文作为参考。通过本发明的培养方法产生的可溶性L104EA29YIg分子可以或者不必包括信号(前导)肽序列。通常，根据本发明产生的分子不包括信号肽序列。

如本文中所用的，术语可溶的指不结合或者附着细胞的任何分子，或者其片段，即循环的。例如，通过将Ig部分分别附着到CTLA4、B7或者CD28的胞外结构域，可以使CTLA4、B7或者CD28可溶。备选地，诸如CTLA4的分子可以通过除去其跨膜结构域使该分子可溶。通常，根据本发明产生的可溶分子不包括信号(或者前导)序列。

可溶性CTLA4分子指非细胞表面结合(即，循环)的分子，其含有野生型CTLA4，或者其结合B7的部分或者衍生物，包括，但不限于，可溶性CTLA4融合蛋白；可溶性CTLA4融合蛋白，如CTLA4Ig融合蛋白(例如，ATCC 68629)，其中CTLA4的胞外结构域融合到Ig部分，Ig部分是Ig分子的全部或者一部分，优选Ig恒定区的全部或一部分，如IgCγ1(IgCgamma1)、IgCγ2(IgCgamma2)、IgCγ3(IgCgamma3)、IgCγ4(IgCgamma4)、IgCμ(IgCmu)、IgCα1(IgCalpha1)、IgCα 2(IgCalpha2)、IgCδ(IgCdelta)或IgCε(IgCepsilon)的全部或者一部分，使得该融合分子可溶；可溶性CTLA4融合蛋白，其中胞外结构域融合到或者结合生物活性或者化学活性蛋白质的一部分，所述蛋白质为诸如乳头瘤病毒E7基因产物(CTLA4-E7)、黑素瘤相关抗原p97(CTLA4-p97)或者HIV env蛋白质(CTLA4-env gp120)，如美国专利号5,844,095中所描述的，这里将该专利完整并入作为参考；如美国专利号5,434,131所描述的，杂交(嵌和)融合蛋白如CD28/CTLA4Ig；这里将其完整引入作为参考；跨膜结构域被除去而使得该蛋白质可溶的CTLA4分子(见，例如，M.K.Oaks等人，2000，Cellular Immunology，201：144-153，这里将其完整并入作为参考)；可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg。

可溶性CTLA4分子也可以是可溶性CTLA4突变分子。根据本发明产生的可溶性CTLA4分子可以包括或不包括信号(前导)肽序列。信号肽序列可以是将允许该分子分泌的任何序列，包括来自制癌蛋白M的信号肽(Malik等人，1989，Molec.Cell.Biol.，9：2847-2853)，或者CD5(N.H.Jones等人，1986，Nature，323：346-349)的信号肽，或者来自任何胞外蛋白质的信号肽。通过本发明的培养方法产生的可溶性CTLA4分子可以包括制癌蛋白M信号肽，其连接在CTLA4的胞外结构域的N-末端。通常，在本发明中，该分子不包括信号肽序列。

本文中所用的CTLA4融合蛋白指含有野生型CTLA4的胞外结构域，或者其结合B7的部分的分子，所述胞外结构域或者其部分与使得CTLA4分子可溶的非CTLA4部分，如Ig部分融合。例如，CTLA4融合蛋白可以包括与Ig恒定区的所有或者部分融合的CTLA4的胞外结构域。可与CTLA4融合的Ig恒定结构域(或者其部分)的实例包括所有，但不限于上文中所列出的那些Ig恒定结构域。CTLA4融合蛋白还可以是CTLA4突变分子。

本文中所用的“非CTLA4部分”指不结合CD80和/或CD86并且不干扰CTLA4与其配体结合的分子或者其部分。实例包括但不限于，Ig部分，其为Ig分子的所有或部分；生物活性或者化学活性蛋白质的一部分，所述蛋白质为诸如乳头瘤病毒E7基因产物(CTLA4-E7)、黑素瘤相关抗原p97(CTLA4-p97)或者HIV env蛋白质(CTLA4-envgp120)(如美国专利号5,844,095中所描述的，这里将该专利完整并入作为参考)。Ig部分的实例包括免疫球蛋白恒定区的所有或部分，如IgCγ1(IgCgamma1)、IgCγ2(IgCgamma2)、IgCγ3(IgCgamma3)、IgCγ4(IgCgamma4)、IgCμ(IgCmu)、IgCα1(IgCalpha1)、IgCα2(IgCalpha2)、IgCδ(IgCdelta)或IgCε(IgCepsilon)。Ig部分可以包括前述恒定区或者其他恒定区的铰链、CH2和CH3结构域、或者CH1、铰链、CH2和CH3结构域。优选地，Ig部分来源于人或者猴，并且包括铰链、CH2和CH3结构域。最优选地，Ig部分包括人IgCγ1的铰链、CH2和CH3结构域，或者为人IgCγ1的铰链、CH2和CH3结构域。在CTLA4Ig的Ig部分中，在Ig部分中，可以突变Ig恒定区或者其部分，从而导致减小其效应物功能(见，例如，美国专利号5,637,481、5,844,095和5,434,131)。

CTLA4的胞外结构域指识别并结合B7的野生型CTLA4的任何部分。例如，CTLA4的胞外结构域含有+1位甲硫氨酸到+124位天冬氨酸(图5)。例如，CTLA4的胞外结构域含有-1位丙氨酸到+124位天冬氨酸(图5)。

本文中所用术语突变指野生型分子中核苷酸或者氨基酸序列中的改变，例如，野生型CTLA4胞外结构域的DNA和/或氨基酸序列中的改变。DNA中突变可以改变密码子，导致所编码的氨基酸序列中的改变。DNA改变可以包括置换、缺失、插入、备选剪接，或者截断，或者蛋白质的加工或者切割错误。备选地，核苷酸序列中的突变可以导致氨基酸序列中沉默突变，如本领域中熟知的。还如所理解的，某些核苷酸密码子编码相同的氨基酸。实例包括核苷酸密码子CGU、CGG、CGC、和CGA，它们编码氨基酸精氨酸(R)；或者密码子GAU和GAC，它们编码氨基酸天冬氨酸(D)。

从而，可以由一种或多种核酸分子编码一种蛋白质，这些核酸分子在它们的特定核苷酸序列中不同，但是仍然编码具有相同序列的蛋白质分子。突变分子可以具有一个，或者一个以上的突变。为了指导，氨基酸编码序列如下：

氨基酸	符号	单字母符号	密码子
				丙氨酸	Ala	A	GCU，GCC，GCA，GCG
半胱氨酸	Cys	C	UGU，UGC
				天冬氨酸	Asp	D	GAU，GAC
谷氨酸	Glu	E	GAA，GAG
				苯丙氨酸	Phe	F	UUU，UUC
甘氨酸	Gly	G	GGU，GGC，GGA，GGG
				组氨酸	His	H	CAU，CAC
异亮氨酸	Ile	I	AUU，AUC，AUA
				赖氨酸	Lys	K	AAA，AAG
亮氨酸	Leu	L	UUA，UUG，CUU，CUC，CUA，CUG
				甲硫氨酸	Met	M	AUG
天冬酰胺	Asn	N	AAU，AAC
				脯氨酸	Pro	P	CCU，CCC，CCA，CCG
谷氨酰胺	Gln	Q	CAA，CAG
				精氨酸	Arg	R	CGU，CGC，CGA，CGG，AGA，AGG
丝氨酸	Ser	S	UCU，UCC，UCA，UCG，AGU，AGC
				苏氨酸	Thr	T	ACU，ACC，ACA，ACG
缬氨酸	Val	V	GUU，GUC，GUA，GUG
				色氨酸	Trp	W	UGG
酪氨酸	Tyr	Y	UAU，UAC

本文中所用的片段或部分是分子的任何部分或节段。对于CTLA4或者CD28，片段或部分优选为CTLA4或者CD28的胞外结构域，或者其部分，其识别并结合B7或者干扰B7，从而阻断其对CD28和/或CTLA4的结合。而且，如本文中所用的，“相应”指具有序列同一性。

本文中所用的B7指分子的B7家族的任何成员，包括，但不限于，B7-1(CD80)(Freeman等人，1989，J Immunol.，143：2714-2722，将其完整并入本文作为参考)、B7-2(CD86)(Freeman等人，1993，Science，262：909-911，将其完整并入本文作为参考；Azuma等人， 1993，Nature，366：76-79，将其完整并入本文作为参考)，其识别并结合CTLA4和/或CD28。CD28指识别并结合B7的分子，如美国序号5,580,756和5,521,288(将其完整并入本文作为参考)所描述。本文中所用的B7阳性细胞包括在细胞表面表达一种或多种类型的B7分子的任何细胞。

本文中所用的“衍生物”为与其亲代分子具有序列相似性并且具有亲代分子的活性的分子。例如，CTLA4的衍生物包括与野生型CTLA4的胞外结构域具有至少70％相似的氨基酸序列并且识别并结合B7的可溶性CTLA4分子，例如CTLAIg或者可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg。衍生物指氨基酸序列和/或氨基酸的化学质量的任何改变，例如氨基酸类似物。

本文中所用的，调节免疫应答指激活、刺激、上调、抑制、阻断、减小、减弱、下调或者修饰免疫应答。多种疾病，例如，自身免疫疾病，可以通过调节免疫应答，例如，通过调节功能CTLA4-和/或CD28-阳性细胞与B7阳性细胞的相互作用得到治疗。例如，调节免疫应答的方法包括将B7阳性细胞与可溶CTLA4分子，如根据本发明产生的那些分子接触，以形成可溶性CTLA4/B7复合体，其中可溶性CTLA4分子干扰内源CTLA4和/或CD28分子与B7分子的反应。“阻断”或“抑制”如本文中所称作的受体、信号或分子指干扰受体、信号或分子的活化，这可通过本领域中公知的试验检测。阻断或者抑制可以是部分或全部的。

本文中所用的，“阻断B7相互作用”指干扰B7与其配体，如CD28和/或CTLA4的结合，从而阻碍T细胞和B7阳性细胞相互作用。阻断B7相互作用的试剂的实例包括，但不限于，分子，如识别并结合CTLA4、CD28或B7分子(例如，B7-1、B7-2)任一种的抗体(或者其部分)；分子的可溶形式(或者其部分)，如可溶CTLA4；经设计通过CTLA4/CD28/B7介导的相互作用干扰细胞信号的肽片段或者其他小分子。在优选实施方案中，阻断剂为可溶性CTLA4分子，如CTLA4Ig(ATCC68629)或L104EA29YIg(ATCC PTA-2104)；可溶性CD28分子，如CD28Ig(ATCC 68628)；可溶性B7分子，如B7-Ig(ATCC 68627)；抗-B7单克隆抗体(例如，ATCC HB-253、ATCC CRL-2223、ATCCCRL-2226、ATCC HB-301、ATCC HB-11341和如美国专利号6,113,898 或者Yokochi等人，1982，J.Immunol.，128(2)：823-827中描述的单克隆抗体)；抗-CTLA4单克隆抗体(例如，ATCC HB-304，和如在参考文献82-83中描述的单克隆抗体)；和/或抗-CD28单克隆抗体(例如，ATCC HB11944和MAb 9.3，如在Hansen等人，1980，Immunogenetics，10：247-260，或Martin等人，1984，J.Clin.Immunol.，4(1)：18-22中描述的)。通过本领域中公知的试验，如确定与免疫疾病(例如，风湿性疾病)相关的症状的减轻，通过确定T细胞/B7细胞相互作用的减小，或者通过确定B7与CTLA4/CD28的相互作用的减小可以检测阻断B7相互作用。阻断可以是部分或全部的。

还如本文中所用的，分子的有效量指阻断该分子与其配体相互作用的量。例如，阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子的有效量为当结合B7-阳性细胞上B7分子时，抑制B7分子结合内源配体，如CTLA4和CD28的分子的有效量。备选地，阻断B7与CTLA4和/或CD28相互作用的分子的有效量为当结合T细胞上CTLA4和/或CD28分子时，抑制B7分子结合内源配体，如CTLA4和CD28的分子的有效量。抑制或阻断可以是部分或全部的。

对于临床方案，优选融合蛋白，如CTLA4Ig或突变CTLA4Ig的Ig部分不在受试者中引起有害免疫应答。优选的部分是Ig恒定区域(包括人或者非人灵长类Ig恒定区)的所有或部分。适宜的区域的实例包括IgCγ1(IgCgamma1)、IgCγ2(IgCgamma2)、IgCγ3(IgCgamma3)、IgCγ4(IgCgamma4)、IgCμ(IgCmu)、IgCα1(IgCalpha1)、IgCα2(IgCalpha2)、IgCδ(IgCdelta)或IgCε(IgCepsilon)，包括铰链、CH2和CH3结构域、或者CH1、铰链、CH2和CH3结构域，它们与效应物功能，如结合Fc受体、依赖补体的细胞毒性(CDC)，或者依赖抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)有关。Ig部分中可以有一个或多个突变(例如，在CH2结构域中以减小效应物功能，如CDC或ADCC)，其中所述突变通过增加或减小Ig结合Fc受体的能力调节Ig结合其受体的能力。例如，Ig部分中的突变可以包括铰链结构域内任何或所有其半胱氨酸残基中的改变。例如，如图8中所示，在+130、+136、和+139位中的半胱氨酸残基用丝氨酸置换。Ig部分还包括+148位脯氨酸用丝氨酸置换，如图8中所示。此外，Ig部分中的突变可以包括+144位亮氨酸用苯丙氨酸置换；+145位亮氨酸用谷氨酸置换，或者+147位甘氨酸用丙氨酸置换。

实施例

下面的实施例陈述本发明的具体方面以阐明本发明并为本领域技术人员提供本发明方法的描述。不应将这些实施例理解为限制本发明，因为这些实施例仅提供具体方法学和例证，它们用于理解和实施本发明及其多个方面。

下面陈述的实施例1-4描述了涉及培养运行期间温度转换的细胞培养方法的实验。实施例6-11描述涉及包括向培养物中延迟加入聚阴离子化合物的细胞培养方法的实验。

实施例1

该实施例提供了用于本发明的方法中的材料和试剂，所述方法用于培养产生如本文实施例2-4中描述的代表性CTLA4Ig融合蛋白的重组细胞。

1.细胞培养基

用于细胞接种物生产所有期和用于培养物在生物反应器(包括5升(5L)和50升(50L)生产反应器)中生长的基础细胞培养基为改良CD-CHO培养基，其含有谷氨酰胺、碳酸氢钠、胰岛素和氨甲蝶呤(Invitrogen，Carlsbad，CA)，如表1中例证。用1N HCl调节培养基的pH到7.0。

表1

改良CD-CHO培养基组分	浓度
		CD-CHO 25×酸I (Invitrogen，Carlsbad，CA)	40ml/L
CD-CHO 25×酸II (Invitrogen，Carlsbad，CA)	40ml/L
		CD-CHO 25×盐I (Invitrogen，Carlsbad，CA)	40ml/L
CD-CHO 25×盐II (Invitrogen，Carlsbad，CA)	40ml/L
		L-谷氨酰胺 (Invitrogen)	0.585g/L
r-人胰岛素 (10mg/mL)(Invitrogen)	0.1ml/L
		氨甲蝶呤(20mM溶液) (ICN，Costa Mesa CA)	5μl/L
碳酸氢钠 (Mallenkrodt Bake，Phillipsburg，NJ)	2.22g/L

对于补料-分批方法中喂饲细胞，使用改良送料培养基，即，eRDF-1培养基(Invitrogen)，其含有葡萄糖、谷氨酰胺、胰岛素和TCYeastolate(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，如表2中所示。加入所有组分后用1N NaOH调节送料培养基的pH到7.0。

表2

改良的eRDF培养基组分	浓度
		eRDF-1 (Invitrogen，Carlsbad，CA)	16.8g/L
右旋糖 (VWR-Mallenkrodt Baker)	30.94g/L
		L-谷氨酰胺 (Invitrogen)	4.1g/L
r-人胰岛素 (10mg/mL)(Invitrogen)	1ml/L
		TC Yeastolate(Becton Dickinson， Franklin Lakes，NJ)	5g/L

2.生物反应器中的生产期

生产生物反应器最初以分批反应器运行，密切监视并控制温度、压力、pH和溶解氧浓度。通过测量活细胞密度和几种关键代谢物的浓度评估培养物状况。接种后一天启动送料方法。剩下的发酵以补料-分批方式进行。

使用5L规模生物反应器(具有一个海洋搅拌器的玻璃反应器)和50L规模生物反应器(具有两个海洋搅拌器的不锈钢反应器)(见实施例4)。数据获取系统(Intellution Fix 32)在整个运行期间记录温度、pH和溶解氧(DO)。通过转子流速计控制气流。气体通过沉水frit(5μm孔大小)喷入反应器，反应器头部空间用于CO₂去除。分子氧通过相同的frit喷射用于DO控制。CO₂通过相同frit喷射用于pH控制。

3.喂饲策略

接种后24小时，如果葡萄糖浓度≥3.0g/L，加入最小1％培养物体积的改良eRDF-I送料培养基。如果葡萄糖浓度低于3g/L，每天加入经计算的大丸送料体积使葡萄糖浓度回到3g/L。在分批表格上记录每天送料量。

4.取样

每天从反应器取出细胞样品。将用于细胞计数的样品用锥虫蓝(Sigma，St.Louis，MO)染色。通过血细胞计数法使用显微镜进行细胞计数和细胞生存力测量。为了分析代谢物，将额外的样品以2000转/分钟(4℃)离心20分钟以分离细胞。用上清液分析下面的参数：滴定度、唾液酸、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、pH、pO₂、pCO₂、铵，和任选地，乳酸脱氢酶(LDH)。额外的备份样品在-20℃冷冻。

实施例2

该实施例描述从经培养的CHO细胞生产CTLA4Ig，其如图3中-1到357或+1到357所示(编码DNA保藏为ATCC 68629)。

该实施例还描述产生高质量和高数量的CTLA4Ig蛋白质的本发明方法，该方法包括具有两步或三步温度转换的培养运行和14、21或28-30天的总运行时间。从37℃到34℃的温度转换(T-转换)发生在第6天(对数生长期末)，从34℃到32℃的第二次T-转换发生在第10天。该运行在第14、21、或28天结束，对于两步转换，温度控制在第10天转换时的32℃直到运行结束。对于三步转换，温度从转换那天控制在30℃直到运行结束。与一次温度转换或者无温度转换的运行相比，所描述的方法导致蛋白质产物的增加的终末滴定度，增加的终末细胞生存力，和容积生产力。根据本发明，第二次和第三次T转换将标准发酵(培养)方法的运行时间延长到2到3周(或更长)，而保持高细胞生存力。在整个生产期间观察到产物滴定度接近线性增加。

用于CTLA4Ig表达的CHO细胞在含有谷氨酰胺、碳酸氢钠、胰岛素，和氨甲蝶呤的改良CD-CHO培养基中扩大(见实施例1)，使用T-75烧瓶(Corning，Corning，NY)和250和500mL旋转器(Bellco，Vineland，NJ)。T-烧瓶和旋转器在37℃6％CO₂中孵育。产生足够接种物后，将培养物转移到5L(Applikon，Foster City，CA)或50L生物反应器(Feldmeier，Syracuse，NY)，它们分别含有上述培养基的3L或30L工作体积。最初接种密度为约2×10⁵个活细胞/mL。

5L容器为装备一个海洋搅拌器(Applikon，Foster City，CA)的玻璃反应器；50L反应器为装备两个海洋搅拌器的不锈钢反应器(Feldmeier，Syracuse，NY)。整个运行期间用数据获取系统，其使用Intellution Fix32(Intellution，Foxboro，MA)记录温度、pH和溶解氧(DO)。通过转子流速计(Cole Parmer，Vernon Hills，IL)控制气流。气体通过沉水frit(5μm孔大小)喷入反应器，反应器头部空间用于CO₂去除。分子氧通过相同的frit喷射用于DO控制。CO₂通过相同frit喷射用于高压侧pH控制。低压侧pH控制通过加入1N NaOH实现。不受限制，pH的可接受范围为6-9，优选6.8-7.2，摩尔渗透压浓度为200-500mOsm，优选280-340mOsm。

使用如实施例1，表2中描述的改良eRDF培养基(Invitrogen，CA)如下对生物反应器中的培养物给予每天大丸喂饲：从接种后第一天开始，加入最小1％培养物体积作为送料培养基；或者如果葡萄糖水平降到3g/L以下，加入经计算的体积使葡萄糖水平回到3g/L。

发酵过程在5L规模时持续时间为21天，在50L规模时为28天。在50L规模下培养运行的更长持续时间与该运行所加的温度转换相关。每天从反应器采集样品用于分析。例如，用于细胞计数的样品用锥虫蓝(Sigma，St.Louis，MO)染色。通过血细胞计数器进行细胞计数和细胞生存力测定，并在显微镜下计数活的染色细胞。为了分析代谢物，将额外的样品等分试样以2000转/分钟(4℃)离心20分钟以沉淀细胞。使用本领域中惯用的技术和方案，用上清液分析蛋白质滴定度、唾液酸、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、pH、pO₂、pCO₂、氨，和LDH。

实施例3

该实施例描述并给出评估按照本发明的方法实施的多种培养方法(包括多步培养方法)的比较性评价。(g/L)，如蛋白质的终末滴定唾液酸含量一样测定确定糖蛋白产物的终末滴定度、运行结束时细胞生存力(终末细胞生存力)和运行结束时细胞密度(存活终末细胞密度)。

实验I-A、I-B和I-C；II-A，II-B和II-C；和III-A，III-B和III-C指在不同时间评估的具有相同温度转换的相同细胞培养运行，即对于I-A，II-A和III-A，在第14天后评估产物和细胞参数，对于II-A，II-B和II-C在21天后评估，对于III-A，III-B和III-C在28天后评估。这些实验在5L反应器中进行，其中如下控制培养条件：pH为7.0；溶解氧为40％；搅拌为60转/分钟；最初温度为37℃。根据本发明的方法从补料-分批细胞培养发酵得到数据。

如下设计实验I、II和III：

实验I：从第0天到第21天，细胞培养温度控制在37℃(无温度转换)。

实验II：从第0天到第6天，细胞培养温度控制在37℃；从第6天到第21天细胞培养温度控制在34℃(一次温度转换)。

实验III：从第0天到第6天，细胞培养温度控制在37℃；从第6天到第10天细胞培养温度控制在34℃；从第10天到第21天细胞培养温度控制在32℃(本发明的两步温度转换方法)。

实验IV-A和V-A显示使用最初(标准)生产期，14天的培养运行后评估的产物滴定度、终末细胞生存力和存活终末细胞密度的结果。实验IV-B和V-B显示了使用延长的生产期，21天的培养运行后评估的这些结果；实验IV-C和V-C显示使用第二次延长的生产期，28天的培养运行后评估的结果。实验IV和V在50L生物反应器中进行，其中如下控制培养条件：pH为7.0；溶解氧为40％；搅拌为30转/分钟；最初温度为37℃。

如下设计实验IV和V：

实验IV：从第0天到第6天，细胞培养温度控制在37℃；从第6天到第10天细胞培养温度控制在34℃；从第10天到第28天细胞培养温度控制在32℃(本发明的两步温度转换方法)。

实验V：从第0天到第6天，细胞培养温度控制在37℃；从第6天到第10天细胞培养温度控制在34℃；从第10天到第14天细胞培养温度控制在32℃；从第14天到第28天细胞培养温度控制在30℃(本发明的三步温度转换方法)。实验V-A、V-B和V-C指在不同时间评估的具有相同温度转换的相同细胞培养运行，即，对于V-A，在第14天后评估产物和细胞参数，对于V-B在21天后评估，对于V-C在28天后评估。

实验I-V代表如上描述的5种不同的培养运行。如所描述的，将14天的运行称作“A”，将21天的运行称作“B”，而将28天的运行称作“C”。

表3给出了实验结果，表明在5L反应器规模下不同温度转换对培养物中细胞生产CTLA4Ig的影响。

表3

实验 #

反应器规模 (L)

温度转换

终末滴定度 (g/L)

终末滴定度(％) (Exp.I-A 设置为 100％)

终末SA (NANA*) (摩尔比)

终末滴定度 *终末 SA (NANA)

终末细胞生存力 (％)

存活终末细胞密度 (×10<sup>6</sup>个细胞/mL)

使用最初(标准)生产期，14天的运行后评估产物滴定度、终末细胞生存力和存活终末细胞密度

I-A	5	37℃ (0-14天) 无T-转换	0.73	100	7.3	5.3	56	0.8
									II-A	5	37℃(0-6天) 34℃(6-14天) 一步T转换	1.30	178	8.1	10.5	82	1.5
III-A	5	37℃(0-6天) 34℃(6-10天) 32℃(10-14天) 两步T转换	2.30	315	7.6	17.5	81	3.1

使用延长生产期，21天的运行后评估产物滴定度、终末细胞生存力和存活终末细胞密度

I-B	5	37℃(0-21天) 无T-转换	1.30	178	6.6	8.6	20	0.3
									II-B	5	37℃(0-6天) 34℃(6-21天) 一步T转换	2.70	370	5.3	14.3	28	0.4
III-B	5	37℃(0-6天) 34℃(6-10天) 32℃(10-21天) 两步T转换	3.50	480	6.5	22.8	57	1.7

*：“NANA”(N-氨基-N-神经氨酸)指唾液酸(SA)。“终末NANA”指培养结束时产物的NANA。

表4给出了实验结果，表明在50L反应器规模下不同温度转换对培养物中细胞生产CTLA4Ig的影响。

表4

实验#

反应器规膜 (L)

温度转换

终末滴定度 (g/L)

终末细胞生存力 (％)

存活终末细胞密度 (×10<sup>6</sup>个细胞/mL)

IV-A	50	37℃(0-6天) 34℃(6-10天) 32℃(10-14天) 两步T转换	1.4	95	5.5
						V-A	50	37℃(0-6天) 34℃(6-10天) 32℃(10-14天) 30℃(14-21天) 三步T转换	1.4	91	5.4

IV-B	50	37℃(0-6天) 34℃(6-10天) 32℃(10-21天) 两步T转换	2.5	67	2.5
						V-B	50	37℃(0-6天) 34℃(6-10天) 32℃(10-14天) 30℃(14-21天) 三步T转换	2.6	82	3.2

使用延长生产期，28天的运行后评估产物滴定度、终末细胞生存力和存活终末细胞密度

IV-C	50	37℃(0-6天) 34℃(6-10天) 32℃(10-28天) 两步T转换	2.8	47	1.1
						V-C	50	37℃(0-6天) 34℃(6-10天) 32℃(10-14天) 30℃(14-28天) 三步T转换	3.1	69	1.4

如已经通过该实施例中实验阐明的，发现多步温度转换在整个培养过程中保持高细胞生存力。具体地，在表3中，实验III-B表明使用定时两步温度转化图在整个21天培养过程(包括延长的生产期)中保持高细胞生存力(也见图1)，允许6.5[摩尔比]的高唾液酸含量下滴定度达到3.5g/L。高的“终末效价×终末唾液酸”的算术乘积值也可以证明两步培养方法的成功。

相比，不包括温度转换(表3，实验I-B)的培养方法导致细胞生存力提早下降。此外，发现与根据本发明的两步温度转换和方法相比，使用一步温度转换(表3，实验II-B)产生较低的终末滴定度、终末唾液酸和“终末滴定度×终末唾液酸”算术乘积。

此外，在表4中给出的包括50L反应器规模下进行的细胞培养的结果表明了本发明的多步温度转换培养技术的优点。第三次温度转换到30℃定时在第14天发生。具体地，三次温度转换对细胞生存力和使用三次转换的终末滴定度(表4，实验V-C，和图2)的益处可以从与两次温度转换的比较中看到。根据本发明方法，三次温度转换还相对于无转换或一次转换的方法延长了细胞生存力并从而延长了蛋白质生产。由于细胞培养中常见的放大试验效应，发现50L反应器规模下滴定度产生比5L规模下的低一些。然而，容易理解这种效应不会有损于如通过本发明提供的两次或多次温度转换培养运行的优点。

如通过实施例3中给出的结果所证明的，对于其中在第6天，即对数生长期结束时进行的温度转换运行，与没有温度转换的对照运行相比，在终末滴定度和细胞生存力方面得到好得多的结果。如从所述结果观察到的，通过使用一次温度转换，容积生产力增加了2倍。在第10天进行的第二次温度转换产生了更高的细胞生存力并进一步增加了容积生产力(与没有T转换的运行相比约3倍)，而保持高产物质量，如通过糖蛋白产物的唾液酸含量确定的。

实施例4

该实施例给出的数据表明包括根据本发明的两次向下温度转换的细胞培养方法对每个细胞每单位时间产生的蛋白质，例如，该实施例中的CTLA4Ig的量没有统计学显著影响。根据本发明的新近给出的细胞培养(发酵)方法，该方法中蛋白质的总产量是直到该方法结束时存活的更多活细胞的结果。因为对于延长的生产时间更多细胞存活，更多的活细胞在产生在该方法结束时所希望的蛋白质。这又在该方法或者培养运行结束时产生更大量的所希望的蛋白质产物。

表5阐明本发明所包括的方法中多种时间处细胞特定生产率。通过如上文给出的公式确定细胞特定生产率。从而为产生CTLA4Ig、其他可溶性CTLA4分子，和可溶性CTLA4突变分子设计的培养方法是非生长相关的方法，其中蛋白质生产在第6天或约第6天开始，即，约在稳定期开始时，在指数细胞生长之后。表5中给出的数据涉及实施例3中进行的实验。

表5

实例/T-转换参数	细胞特定蛋白质生产 (时间)	细胞特定蛋白质生产的量
			I-A/无T转换	14天后	44.7pg/细胞/天
I-B/无T转换	21天后	64.1pg/细胞/天

II-A/一次T转换	14天后	55.5pg/细胞/天
			II-B/一次T转换	21天后	60.9pg/细胞/天

III-A/两次T转换	14天后	47.5pg/细胞/天
			III-B/两次T转换	21天后	51.9pg/细胞/天

使用细胞密度和滴定度测量计算表5中细胞特定生产率，如上文所述。本领域中技术人员将明白，细胞密度测量通常具有约10-20％标准差(SD)，即高SD，并且是不精确的。因此，细胞特定生产率的测定具有相应10-20％标准差。从而，考虑到与这些类型技术有关的高SD，不同运行时间每个细胞每天产生的产物的量在没有T转换、有一次T转换、有两次T转换的方法之间无显著不同。通过本发明的新近提供的细胞培养方法产生的高质量蛋白质产物的高水平和蛋白质产量的总体增加归因于从包括多步向下温度转换的整个培养方法幸存下来的更高数目的活细胞。

实施例5

实施例5A

该实施例提供了用于本发明方法中的材料和试剂，该方法用于培养重组细胞，所述细胞产生如本文实施例5B-16中描述的代表性L104EA29YIg。

1.细胞培养基

用于细胞接种物生产所有期的基础细胞培养基为改良CD-CHO培养基，其含有谷氨酰胺、碳酸氢钠、胰岛素和氨甲蝶呤(Invitrogen，Carlsbad，CA)，如表6中例证。用1N HCl将培养基的pH调节到7.0。用于生物反应器，包括5升(5L)、10升(10L)和50升(50L)生产反应器中培养物生长的基础细胞培养基也是表6中所示改良CD-CHO培养基，只是不使用氨甲蝶呤。用1N HCl将培养基的pH调节到7.0。

表6

在除了实施例8的所有实施例中，对于补料-分批方法中的喂饲细胞，使用改良送料培养基，即，eRDF-1培养基(Invitrogen)，其含有葡萄糖、谷氨酰胺、胰岛素和TC Yeastolate(Becton-Dickinson，Franklin Lakes，NJ)，如表7所示。加入所有组分后用1N NaOH调节送料培养基的pH到7.0。

表7

改良的eRDF培养基组分	浓度
		eRDF-1 (Invitrogen，Carlsbad，CA)	16.8g/L
右旋糖 (VWR-Mallenkrodt Baker)	30.94g/L
		L-谷氨酰胺 (Invitrogen)	4.1g/L
r-人胰岛素 (10mg/mL)(Invitrogen)	1ml/L

TC Yeastolate(Becton Dickinson， Franklin Lakes，NJ)	5g/L
		D-半乳糖(Ferro-Pfanstiehl，Waukegan，IL)	12.5g/L

对于实施例8，送料培养基为上述送料培养基，其具有一处变动：eRDF的浓度为25.2g/L。

2.生物反应器中生产相

使用5L规模生物反应器(具有一个海洋搅拌器的玻璃反应器)、10L规模生物反应器(具有两个海洋搅拌器的玻璃反应器)和50L规模生物反应器(具有两个海洋搅拌器的不锈钢反应器)(见实施例2)。数据获取系统(Intellution Fix 32)在整个运行期间记录温度、pH和溶解氧(DO)。通过转子流速计控制气流。气体通过沉水frit(5μm孔大小)喷入反应器，反应器头部空间用于CO₂去除。分子氧通过相同的frit喷射用于DO控制。CO₂通过相同frit喷射用于pH控制。

3.喂饲策略

4.取样

每天从反应器取出细胞样品。将用于细胞计数的样品用锥虫蓝(Sigma，St.Louis，MO)染色。通过血细胞计数法使用显微镜，或者通过Cedex自动细胞计数器(Innovatis AG，Bielefeld，德国)进行细胞计数和细胞生存力测量。为了分析代谢物，将额外的样品以2000转/分钟(4℃)离心20分钟以分离细胞。用上清液分析下面的参数：滴定度、唾液酸、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、pH、pO₂、pCO₂、氨，和任选地，乳酸脱氢酶(LDH)。额外的备份样品在-20℃冷冻。

实施例5B

该实施例5B描述从经培养的CHO细胞生产L104EA29YIg，其如图4中-1到357或+1到357所示(编码DNA保藏为ATCC PTA-2104)。

该实施例5B还描述本发明的一种方法，其包括向细胞培养物加入聚阴离子化合物，更具体地，硫酸葡聚糖。

用于L104EA29YIg表达的CHO细胞在含有谷氨酰胺、碳酸氢钠、胰岛素，和氨甲蝶呤的改良CD-CHO培养基(Invitrogen，CA)中扩大，使用T-75烧瓶和摇瓶。T-烧瓶和摇瓶在37℃6％CO₂中孵育。产生足够接种物后，将培养物转移到5L或10L生物反应器，使用如上描述的经改良的CD-CHO培养基。最初接种密度为200,000个活细胞/mL或10⁶个细胞/mL。

5L和10L容器为分别装备一个和两个海洋搅拌器(Applikon，CA)的玻璃反应器。通过转子流速计控制气流。气体通过沉水frit(5μm孔大小)喷入反应器，反应器头部空间用于CO₂去除。分子氧通过相同的frit喷射用于DO控制。CO₂通过相同frit喷射用于高压侧pH控制。低压侧pH控制通过加入1N NaOH或Na₂CO₃实现。

使用含有葡萄糖、谷氨酰胺、胰岛素和TCYeastolate(BectonDickinson)的改良eRDF培养基(Invitrogen，CA)如下对生物反应器中的培养物给予每天大丸喂饲：从接种后第一天开始，加入最小1％培养物体积；或者如果葡萄糖水平降到3g/L以下，加入经计算的体积使葡萄糖水平回到3g/L。

在除了实施例11的所有实施例中，温度控制在从第0到第6天37℃，从第6天到第10天34℃，第10天开始32℃。

发酵过程通常的持续时间为14-19天。每天从反应器采集样品。用于细胞计数的样品用锥虫蓝(Sigma，St.Louis，MO)染色。使用Cedex自动细胞计数器(Innovatis AG，Bielefeld，德国)进行细胞计数和细胞生存力测定。用上清液分析LEA29Y滴定度、葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸、pH、pO₂、pCO₂、氨。

将硫酸葡聚糖(钠盐，来自平均分子量5000Da的葡聚糖，Sigma，MO)溶于水中或培养基中。将溶液无菌过滤并加入反应器中至50mg/L的浓度。所加入的体积组成了加入时反应器的工作体积的至多2％。

实施例6

该实施例描述并给出了接种后某一时刻加入聚阴离子化合物，更具体地，硫酸葡聚糖的比较研究结果。

5L和10L生物反应器接种0.2×10⁶个细胞/mL产生L104EA29Y的细胞。

如下设计实施例6-a和6-b：

实施例6-a：培养物中不加入硫酸葡聚糖(“对照”培养物：4个5L生物反应器中培养，4个10L生物反应器中培养)。

实施例6-b：在第6天向培养物加入50mg/L浓度的硫酸葡聚糖(“DS天6培养物：2个5L生物反应器中培养，1个10L生物反应器中培养)。

在图6中报告实施例6-a和6-b的平均生存力、活细胞密度、和总细胞密度图，和它们的标准差。

在对照培养中，在第6和7天之间观察到活细胞密度中的平台，相应于稳定期。对于对照培养，在第7天后观察到活细胞密度和生存力的下降，相应于死亡期。当在第6天向培养物加入硫酸葡聚糖后，生长期延长到第11天。活细胞密度达到平均5.2×10⁶个细胞/mL，而对照为3.5×10⁶个细胞/mL。在该延长的生长期期间生存力保持在90％以上。第11天后，活细胞密度和总细胞密度成比例地下降，表明细胞裂解，并且结果生存力指数直到第15天都保持高于90％。

图7是活细胞密度作为加入硫酸葡聚糖的培养时间和对照运行时间的函数的对数表示。死亡率(通过图2中活细胞密度的斜率给出)依赖于硫酸葡聚糖的存在或不存在而不同。在硫酸葡聚糖的存在下，死亡速度在第12到第19天约为恒定，值为0.0012h^-1。相比，在第8天到第12天，对照的平均死亡速度最大值为0.0024h^-1。从而，在第6天加入的硫酸葡聚糖将死亡期期间细胞死亡率减慢了一半。

尽管具有上述硫酸葡聚糖的有益效果，但是加入或不加入硫酸葡聚糖，产物L104EA29YIg的滴定度是相似的(表8)。

表8：第6天加入硫酸葡聚糖对第14天产物L104EA29YIg滴定度的影响

条件	运行数	第14天平均滴定度	滴定度的标准差
				对照方法	8	1.60	0.18
第六天硫酸葡聚糖	3	1.57	0.13

在表9中报告了不同运行的L104EA29YIg唾液酸化程度。考虑相对大的运行之间的可变性，可以认为L104EA29YIg唾液酸化不受在第6天加入硫酸葡聚糖的显著影响。

表9：第6天加入硫酸葡聚糖时L104EA29YIg唾液酸化的影响

条件	运行#	NANA摩尔比
			对照方法	1	6.8(14)
对照方法	2	5.5(14)
			对照方法	3	5.7(15)
对照方法	4	5.5(15)
			对照方法	5	5.5(15)
对照方法	6	6.3(16)
			第六天硫酸葡聚糖	7	5.4(14)
第六天硫酸葡聚糖	8	6.9(14)
			第六天硫酸葡聚糖	9	6.9(16)

实施例7

该实施例显示加入硫酸葡聚糖对死亡期中细胞培养物的影响。

以10⁶个细胞/mL向5L生物反应器接种产生L104EA29YIg的细胞，死亡期在第5天开始。在第6天加入硫酸葡聚糖。

在图8中给出生存力、活细胞密度、和总细胞密度图。在第6天向这种培养物中加入硫酸葡聚糖可以防止活细胞密度显著下降长达第17天。从而，当在死亡期期间加入硫酸葡聚糖时，可以抑制细胞死亡数天。

在该运行中，在第14天得到1.9g/L滴定度，NANA摩尔定量为6.6。

实施例8

该实施例显示了向处于死亡期的细胞培养物加入硫酸葡聚糖的影响。

以0.2×10⁶个细胞/mL向10L生物反应器接种产生L104EA29YIg的细胞。在该特定实例中，每天补料为更浓的制剂，结果死亡期的出现延长到第10天(图9)。在第14天之前未加入硫酸葡聚糖。

在图9中给出生存力、活细胞密度、和总细胞密度图。在第14天加入硫酸葡聚糖允许活细胞密度稳定4天，之后培养停止。

该实施例又阐明了当向培养物加入硫酸葡聚糖时对死亡期期间细胞死亡的抑制。

实施例9

该实施例显示了在第0天加入硫酸葡聚糖的效果。通过比较该实验中看到的效果与硫酸葡聚糖的加入延迟的其他实验中看到的效果可以看到延迟加入硫酸葡聚糖的效果。

以0.2×10⁶个细胞/mL向两个重复的5L生物反应器接种产生L104EA29YIg的细胞，在接种当天(第0天)加入浓度为50mg/L的硫酸葡聚糖。

在图10中给出生存力、活细胞密度、和总细胞密度图。两个培养物都没有实现比没有硫酸葡聚糖的培养物更高的细胞密度(比较图6和 10)。细胞在第7或8天进入死亡期，而当在第6天加入硫酸葡聚糖时，细胞在第11天进入死亡期(比较图6和10)。此时在这些运行的第14天所得L104EA29YIg滴定度为0.57g/L(运行#1)和0.86g/L(运行#2)，它们显著小于对照方法或者第6天加入硫酸葡聚糖(见实施例6)的方法中的滴定度。

这些结果表明硫酸葡聚糖的加入的时间选择对于加入结果的重要性。

不被理论束缚，我们认为硫酸葡聚糖的加入的所观察到的效果和它们对加入的时间选择的依赖性可以通过硫酸葡聚糖对多种自分泌因子的结合来解释，所述结合类似于多硫酸戊聚糖对肝素结合生长因子的结合(Zugmaier等人，1992)。我们认为硫酸葡聚糖结合到这些因子的肝素结合结构域，其变得不能被细胞表面硫酸乙酰肝素蛋白聚糖利用。结果，硫酸葡聚糖-结合因子不能在细胞表面浓缩，这极大地降低了它们结合它们的受体的可能性。净效果为这些因子不再发挥它们在细胞上的正常作用。在接种后的前几天里，细胞产生某些生长因子，它们的功能是信号细胞生长。在第0天加入的硫酸葡聚糖不可逆地结合所产生的那些因子。然而硫酸葡聚糖与这些因子的结合不以不利地方式显著影响细胞生长，可能是因为细胞能够通过增加生长因子产生应答。后来，在生长期，生长因子的产生停止，并且细胞开始产生不同类型的自分泌因子，它们在高浓度的效果是示意(signal)生长期结束和死亡期来临。这些因子从第0天的低浓度积累到后来的高浓度。那时，这些因子有效示意细胞停止生长并进入稳定期和死亡期。我们提出硫酸葡聚糖优先结合这些死亡示意因子，从而使它们的信号功能失效，并允许延长生长期。通过这些因子的持续诱导似乎是细胞死亡进行所需的，结果当死亡信号因子被硫酸葡聚糖失效时，进入死亡期的细胞可以重新调节进入稳定期(实施例7和8)，甚至晚至培养中的第14天。相反地，在第0天加入的已经结合到生长因子的硫酸葡聚糖在生长期结束时仍然结合这些因子，使得不能用于结合死亡信号分子。从而，对于在第0天加入硫酸葡聚糖的情况(实施例9)，不发生生长期延长和细胞死亡期延迟，同样，在生长期结束时加入硫酸葡聚糖发生生长期延长和细胞死亡期延迟。

假定在实施例6中在第6天补加硫酸葡聚糖导致培养物中细胞生长抑制和第11天细胞死亡发生是由不同于硫酸葡聚糖-结合的自分泌因子的诱导的机理导致。可能，11天生长后培养基中特定营养物的耗竭是造成这些培养物中生长期结束的原因。

实施例10

该实施例比较最初生长期期间三个不同时间加入硫酸葡聚糖的效果。

以10⁶个细胞/mL向5L生物反应器接种产生L104EA29YIg的细胞的培养物。在不同时间向培养物加入浓度为50mg/L的硫酸葡聚糖。在一个培养物中，在第3天加入硫酸葡聚糖，另一个在第4天，第三个在第5天。

在图11中报告生存力和活细胞密度图。在所有三种加入情况(第3、4或5天)中都实现了高活细胞密度(＞10⁷个细胞/mL)，但是较早加入(第3或4天)不能防止生长期后活细胞密度的立即下降。相反，第5天加入使活细胞密度在生长期后稳定4天。在250h后的时间点，第5天硫酸葡聚糖的加入中活细胞密度总是高于或等于(测量误差内)第4天硫酸葡聚糖加入培养物中的，第4天硫酸葡聚糖的加入中活细胞密度总是高于或等于(测量误差内)第3天硫酸葡聚糖加入培养物中的。从而，从该实例似乎硫酸葡聚糖加入的最佳时间是在最初生长期(指缺少任何硫酸葡聚糖加入时观察到的生长期)结束时。较早加入可以延长生长期，但是将在硫酸葡聚糖诱导的延长的生长期后稳定活细胞密度不那么有效，而较晚(死亡期期间)加入将稳定活细胞密度但是不能提供活细胞密度的充分增加(见实施例7和8)。因此，在第14天，用第5天硫酸葡聚糖加入得到2.7g/L的滴定度，而用第3天或第4天硫酸葡聚糖加入得到2.6g/L的第14天滴定度，用第6天硫酸葡聚糖加入得到1.9g/L的第14天滴定度(实施例7中)。在上面提到的运行中NANA摩尔比分别为6.3、6.6、6.0和6.6，表明用硫酸葡聚糖加入的最佳时间选择得到的更高的滴定度伴随着一致的唾液酸化水平。

实施例11

该实施例显示了产生L104EA29YIg的培养中一次和两次温度转换的效果。还将培养物进行延迟加入硫酸葡聚糖。

以200,000个细胞/mL接种5L反应器。

应用两次、一次或无T转换。对于一次温度转换，在第6天温度从37℃转换到34℃。对于两次温度转换，温度在第6天从37℃转换到34℃，并且在第10天从34℃转换到32℃。在所有情况中，在第6天加入硫酸葡聚糖。两次温度转换情况是三次运行的平均值，标准差以条线显示。

分别在图12、13和14中报告活细胞密度、生存力和滴定度。

结果表明应用至少一次温度转化的益处。对于整个运行期间温度保持在37℃的情况，培养物在第10天进入死亡期，并且活细胞密度和生存力的降低迅速。结果，培养12天后L104EA29YIg容积生产力明显下降。对于14天和更长的培养时间，明显具有一次或两次温度转换的培养物关于滴定度优于恒定温度培养。

对于仅进行一次温度转换(在第6天，转换到34℃)的情况，在第16天后观察到活细胞密度和生存力的迅速下降。除了第一次温度转换还进行第二次温度转换(在第10天，到32℃)的培养物在第16天后不表现处活细胞密度和生存力的那么迅速的下降。在18天后的培养时间，一次T转换培养的容积生产力明显比两次T转换培养中的差。相反，在第11天到第15天，具有一次T转换的培养物中容积生产力高于两次T转换培养物中的容积生产力。

总之，第一次温度转换是有益的，其不依赖于所希望的收获时间，而第二次温度转换的益处依赖于计划的收获时间和有效下游处理的生存力要求。没有第二次温度转换将允许达到较高产物滴定度直到第20天，但是对于大于20天的运行的培养，使用两次温度转换的培养将在滴定度方面优于具有一次温度转换的运行。此外，必须考虑第12天后的收获物在一次T转换中比两次T转换中含有更高量的细胞裂解产物，这使得下游处理复杂化。对于一次T转换，第12天后观察到的活细胞密度的急剧下降可以是产物质量的一种考虑，因为相应的细胞死亡可以向上清液释放大量唾液酸酶，其可以降低产物唾液酸化。

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Claims

1.细胞培养方法，其包括：

a)在允许细胞生长的条件下在37℃的温度下培养产生可溶性CTLA4分子的宿主细胞允许该细胞生长的时间；

b)然后在34℃的第二种温度下培养细胞；

c)然后在32℃的第三种温度下培养细胞；和

d)从培养开始后两周开始在30℃的第四种温度下培养细胞直到培养过程结束。

2.权利要求1的方法，其中在培养的第5天到第7天开始在第二种温度下培养细胞，并且其中在培养的第10天到第14天开始在第三种温度下培养细胞。

3.权利要求2的方法，其中在培养的第6天开始在第二种温度下培养细胞，并且其中在培养的第10天开始在第三种温度下培养细胞。

4.权利要求2的方法，其中在第二种温度开始到第三种温度开始之间有4天。

5.权利要求1的方法，其中可溶性CTLA4分子为CTLA4融合蛋白。

6.根据权利要求5的方法，其中可溶性CTLA4融合蛋白为CTLA4Ig。

7.根据权利要求6的方法，其中可溶性CTLA4融合蛋白为含有如SEQ ID NO：2中所示-1到357或+1到357氨基酸的CTLA4Ig。

8.根据权利要求1的方法，其中可溶性CTLA4分子为可溶性CTLA4突变分子。

9.根据权利要求8的方法，其中可溶性CTLA4突变分子为含有如SEQ ID NO：4中所示-1到357或+1到357氨基酸的L104EA29YIg。

10.权利要求2的方法，其中细胞培养方法为补料分批方法或连续方法。

11.权利要求2的方法，其中细胞从第6天到第10天在34℃培养并且从第10天到第14天在32℃培养。

12.权利要求11的方法，其中蛋白质为可溶性CTLA4融合蛋白，其为含有如SEQ ID NO：2中所示-1到357或+1到357氨基酸的CTLA4Ig，或者为含有如SEQ ID NO：4中所示-1到357或+1到357氨基酸的可溶性CTLA4突变分子L104EA29YIg。

13.权利要求1的方法，其中当培养物中细胞浓度为2-12×10⁶个细胞/mL时，培养物的温度从37℃转换到34℃。

14.权利要求1的方法，其中当培养物处于稳定期时，培养物的温度从37℃转换到34℃。

15.权利要求2的方法，其中所产生的蛋白质的唾液酸化在细胞培养期间增强。

16.权利要求2的方法，其中细胞为哺乳动物细胞。

17.根据权利要求16的方法，其中哺乳动物细胞是CHO细胞。

18.权利要求2的方法，其中蛋白质产生增加。

19.权利要求2的方法，其中细胞生存力提高。

20.细胞培养方法，其包括：

a)在允许细胞生长的条件下在37℃培养产生可溶性CTLA4分子的CHO细胞允许该细胞生长的时间；

b)然后在培养的第6天开始在34℃培养细胞；

c)然后在培养的第10天开始在32℃培养细胞；和

d)然后从第14天开始在30℃培养细胞。