KR101936049B1 - IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 - Google Patents
IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101936049B1 KR101936049B1 KR1020160132633A KR20160132633A KR101936049B1 KR 101936049 B1 KR101936049 B1 KR 101936049B1 KR 1020160132633 A KR1020160132633 A KR 1020160132633A KR 20160132633 A KR20160132633 A KR 20160132633A KR 101936049 B1 KR101936049 B1 KR 101936049B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- culture
- cell
- producing
- fusion protein
- protein
- Prior art date
Links
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 54
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 title claims abstract description 54
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 29
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 19
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 claims abstract description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 121
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 81
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 79
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 26
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 20
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims description 16
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims description 15
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 15
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 claims description 12
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 12
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 12
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 12
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 7
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 7
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 7
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 claims description 6
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 claims description 6
- 229940098197 human immunoglobulin g Drugs 0.000 claims description 6
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 6
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 6
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 claims description 4
- 238000012007 large scale cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 2
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 abstract description 28
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 abstract description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 24
- 230000008859 change Effects 0.000 description 21
- 229960002833 aflibercept Drugs 0.000 description 20
- 108010081667 aflibercept Proteins 0.000 description 20
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 108091006020 Fc-tagged proteins Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 2
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 description 2
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine S-imide-S-oxide Natural products CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WLCZTRVUXYALDD-IBGZPJMESA-N 7-[[(2s)-2,6-bis(2-methoxyethoxycarbonylamino)hexanoyl]amino]heptoxy-methylphosphinic acid Chemical compound COCCOC(=O)NCCCC[C@H](NC(=O)OCCOC)C(=O)NCCCCCCCOP(C)(O)=O WLCZTRVUXYALDD-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 208000005623 Carcinogenesis Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 1
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 1
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 1
- 208000001344 Macular Edema Diseases 0.000 description 1
- 206010025415 Macular oedema Diseases 0.000 description 1
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 description 1
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 101000996351 Mus musculus Glutamine synthetase Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J Trypan blue Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].C1=C(S([O-])(=O)=O)C=C2C=C(S([O-])(=O)=O)C(/N=N/C3=CC=C(C=C3C)C=3C=C(C(=CC=3)\N=N\C=3C(=CC4=CC(=CC(N)=C4C=3O)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)C)=C(O)C2=C1N GLNADSQYFUSGOU-GPTZEZBUSA-J 0.000 description 1
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000012615 aggregate Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 229960000397 bevacizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000036952 cancer formation Effects 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 108091006028 deamidated proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 238000007599 discharging Methods 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000012526 feed medium Substances 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 201000010230 macular retinal edema Diseases 0.000 description 1
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 229960003407 pegaptanib Drugs 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 229960003876 ranibizumab Drugs 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 208000004644 retinal vein occlusion Diseases 0.000 description 1
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
- C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/177—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- A61K38/179—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6801—Drug-antibody or immunoglobulin conjugates defined by the pharmacologically or therapeutically active agent
- A61K47/6803—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates
- A61K47/6811—Drugs conjugated to an antibody or immunoglobulin, e.g. cisplatin-antibody conjugates the drug being a protein or peptide, e.g. transferrin or bleomycin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/10—Antioedematous agents; Diuretics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K19/00—Hybrid peptides, i.e. peptides covalently bound to nucleic acids, or non-covalently bound protein-protein complexes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0681—Cells of the genital tract; Non-germinal cells from gonads
- C12N5/0682—Cells of the female genital tract, e.g. endometrium; Non-germinal cells from ovaries, e.g. ovarian follicle cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
- C12N5/12—Fused cells, e.g. hybridomas
- C12N5/16—Animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/036—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif targeting to the medium outside of the cell, e.g. type III secretion
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2523/00—Culture process characterised by temperature
Abstract
본 발명은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로, 본 발명은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 제조방법에 있어서, 감소된 배양 온도에서 상기 융합 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 단계를 추가함으로써, 세포 성장 및 세포 생존율을 증가시켜 상기 융합 단백질의 생산성을 증가시키고 응집체(aggregates) 생성을 억제함으로써, 품질 및 생산 수율을 향상시키는 것을 특징으로 한다.
Description
본 발명은 인간 면역글로블린 G(IgG) Fc 도메인을 가지는 융합 단백질[특히, 혈관 내피세포 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포 외 도메인과 인간 면역글로블린 G(IgG) Fc 도메인이 융합된 단백질(예컨대, 아플리버셉트(Aflibercept)]의 생산방법에 관한 것이다.
혈관 내피세포 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF)는 혈관 신생과 혈관 투과성을 증가시키는 중요한 인자이다. 특히, VEGF는 종양 세포에서 과발현되어 비정상적으로 혈관 신생 및 종양 증식을 촉진시킨다 (Oncogene,2004, 23, 1745-1753). 또한, 비정상적인 혈관 신생이 종양 발생 외에도 다른 질병에도 중요하게 관련되어 있다고 보고되고 있다. VEGF를 통한 기전에서 비정상적인 혈관 신생은 안과적 질환인 습성황반변성, 당뇨망박병증, 및 망막정맥폐쇄 황반부종 등에 연관되어 있다 (J. Korean Med. Assoc.,2014,, 57,7, 614-623).
이러한, 안과적 질병에 대한 치료제는 페갑타니브(Pegaptanib) (RNA 압타머), 라니비주맙(Ranibizumab)(모노클로날 IgG 항체 단편(Fab)), Bevacizumab (모노클로날 IgG 항체)가 사용되고 있고, 아플리버셉트(Aflibercept)(IgG1 Fc로 융합된 VEGFR1 및 VEGFR2)가 습성황반변성의 치료제로 2011년에 미국에서 승인되었다 (Biol. Ther.,2012, 2, 3, 1-22; Drug Design Development Therapy, 2013, 3, 7, 711-722).
이러한 치료용 재조합 단백질에 대한 수요가 증가하고 있기 때문에 세포 선별, 배지 최적화 및 배양 공정 제어의 개선을 통해 세포 성장, 생존력 및 단백질 생산 및 품질의 향상에 많은 노력을 하고 있다. 세포 배양으로 생산되는 많은 단백질과 폴리펩타이드는 세포를 일정시간 동안 일정 온도나 pH에서 회분식 또는 유가식 방법으로 배양하여 생산하고 분리하는 방법으로 제조된다. 그러므로, 생산량과 품질은 세포 배양 조건에 의해 영향 받을 수 있다. 동물 세포 배양에서 단백질의 생산과 관련하여 세포 배양 조건의 조절 및 최적화에 통하여 단백질 생산량 증가나 미스폴드/응집된 단백질 생성 억제, 단백질의 탈아미드체나 아미노산의 치환·결실체의 생성을 억제하여 면역원성 등의 안전성 문제와 정제 공정의 복잡화를 방지할 수 있는 방법이 요구된다.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 단백질 발현량을 증가시키기 위한, IgG Fc 융합 단백질의 생산 방법을 제공한다.
본 발명의 다른 목적은, 전술한 생산 방법으로 목적 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 목적 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 전술한 제조 방법으로 제조된 치료용 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포의 배양 조건을 최적화시킴으로써, 상기 융합 단백질의 생산성 및 품질이 향상되는 것을 확인하였다. 구체적으로는, 일정 기간 통상의 배양 온도(35.0℃~ 38.0℃)에서 배양한 후, 배양 온도를 28.0℃ ~ 35.0℃로 감소시켜 배양함으로써, 상기 융합 단백질의 생산성 증가와 상기 융합 단백질의 응집체(aggregates) 생성 억제를 확인하였고, 이에 기초하여 본 발명을 완성하였다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포 배양에서 혈관 내피세포 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포 외 도메인과 인간 면역글로블린 G(Immunoglobulin G) Fc 도메인이 융합된 단백질의 생산 방법으로서, 상기 융합 단백질의 발현량을 증가시키기 위해 세포를 28.0℃ 내지 35.0℃ 이하의 감소된 온도에서 배양하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 방법으로 제조된 융합 단백질은 응집체(aggregates)가 감소된 것일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 세포 배양은 대규모 세포 배양일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포 배양은 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포 배양은 유가(fed-batch) 세포 배양일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 세포는 포유류 세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 포유류 세포는 CHO 세포일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 CHO 세포는 DG44, DXB-11, K-1 및 CHO-S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 세포주일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 배양 개시일로부터 온도 변경 전까지 배양 온도는 33.0℃ 내지 38.0℃ 이하의 온도 범위를 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 감소된 온도는 30.0℃ 내지 35.0℃일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 배양 개시일로부터 온도 변경 전까지 배양 기간이 1 내지 5일일 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 온도 감소 후 배양 기간이 2 내지 15일일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 제1항에 있어서, 온도 변경 전의 배양 기간 및 온도 변경 후의 배양 기간의 합이 3일 이상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에 따르면, 상기 VEGF 수용체의 가용성 세포외 도메인은 제1 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 2 및 제2 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 3을 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 생산된 단백질은 치료용 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 생산 방법으로 목적 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 목적 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 목적 단백질을 생산하는 세포가 배양된 배양액으로부터 상기 목적 단백질을 회수하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 바람직한 또 다른 일실시예에 따르면, 상기 목적 단백질은 치료용 단백질일 수 있다.
본 발명은 또한, 전술한 제조 방법으로 제조된 치료용 단백질 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포를 감소된 배양 온도에서 배양하는 단계를 추가함으로써, 세포 성장 및 세포 생존율을 증가시키고, 상기 융합 단백질의 발현량을 증가시키며, 응집체(aggregates) 생성을 억제하여, 결과적으로 상기 융합 단백질의 생산성을 증가시키고 품질을 향상시키는바, 상기 융합 단백질의 대량 제조 및 공급이 가능하다.
도 1은 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 세포 성장 및 세포 생존율의 변화를 분석한 그래프이다.
도 2는 시간(X 축; 배양 시간[일])에 따른 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의, IVC로 정규화된, 통합 생존 세포수(Y축; IVC[정규화된 109세포×일/L])를 나타낸 그래프이다.
도 3은 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 특정 생산율(specific production rate) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 발현량의 변화를 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 분석한 그래프이다.
도 5는 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 저온 배양 온도에 따른 세포 성장 및 세포 생존율의 변화를 분석한 그래프이다.
도 6는 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 저온 배양 온도에 따른 발현량의 변화를 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 분석한 그래프이다.
도 7는 2L 생물반응기(bioreactor)에서 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 세포 성장 및 세포 생존율의 변화를 분석한 그래프이다.
도 8은 2L 생물반응기(bioreactor)에서 시간(X 축; 배양 시간[일])에 따른 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의, IVC로 정규화된, 통합 생존 세포수(Y축; IVC[정규화된 109세포×일/L])를 나타낸 그래프이다.
도 9은 2L 생물반응기(bioreactor)에서 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 특정 생산율(specific production rate) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 2L 생물반응기(bioreactor)에서 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 발현량의 변화를 Protein A-HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 분석한 그래프이다.
도 11은 2L 생물반응기(bioreactor)에서 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 응집된 단백질의 변화를 SE-HPLC(사이즈 배제 고성능 액체 크로마토그래피)로 분석한 그래프이다.
도 2는 시간(X 축; 배양 시간[일])에 따른 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의, IVC로 정규화된, 통합 생존 세포수(Y축; IVC[정규화된 109세포×일/L])를 나타낸 그래프이다.
도 3은 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 특정 생산율(specific production rate) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 발현량의 변화를 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 분석한 그래프이다.
도 5는 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 저온 배양 온도에 따른 세포 성장 및 세포 생존율의 변화를 분석한 그래프이다.
도 6는 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 저온 배양 온도에 따른 발현량의 변화를 HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 분석한 그래프이다.
도 7는 2L 생물반응기(bioreactor)에서 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 세포 성장 및 세포 생존율의 변화를 분석한 그래프이다.
도 8은 2L 생물반응기(bioreactor)에서 시간(X 축; 배양 시간[일])에 따른 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의, IVC로 정규화된, 통합 생존 세포수(Y축; IVC[정규화된 109세포×일/L])를 나타낸 그래프이다.
도 9은 2L 생물반응기(bioreactor)에서 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 특정 생산율(specific production rate) 변화를 나타낸 그래프이다.
도 10은 2L 생물반응기(bioreactor)에서 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 발현량의 변화를 Protein A-HPLC(고성능 액체 크로마토그래피)로 분석한 그래프이다.
도 11은 2L 생물반응기(bioreactor)에서 아플리버셉트(Aflibercept)를 생산하는 세포의 배양 온도에 따른 응집된 단백질의 변화를 SE-HPLC(사이즈 배제 고성능 액체 크로마토그래피)로 분석한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.
상술한 바와 같이, 치료용 재조합 단백질에 대한 수요의 증가로 세포 선별, 배지 최적화 및 배양 공정 제어의 개선을 통해 세포 성장, 생존력 및 단백질 생산과 품질의 향상에 많은 노력을 하고 있으며, 동물 세포 배양에서 단백질의 생산과 관련하여 세포 배양 조건의 조절 및 최적화를 통해 단백질 생산량 증가 또는 미스폴드/응집된 단백질 생성 억제, 단백질의 탈아미드체나 아미노산의 치환·결실체의 생성을 억제하여 면역원성 등의 안전성 문제와 정제 공정의 복잡화를 방지할 수 있는 방법이 요구되고 있다.
이에, 본 발명자들은 일정 기간 통상의 배양 온도(35.0℃ ~ 38.0℃)에서 배양한 후, 배양 온도를 28.0℃ ~ 35.0℃로 감소시켜 배양함으로써, IgG(Immunoglobulin G) Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산성이 증가하고 상기 융합 단백질의 응집체(aggregates) 생성이 억제됨을 확인하고, 세포 배양에서 단백질의 발현량이 증가된, IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산 방법을 제공함으로써 상술한 문제의 해결방안을 모색하였다. 본 발명의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산 방법은 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포를 감소된 배양 온도에서 배양하는 단계를 수행함으로써, 세포 성장 및 세포 생존율을 증가시키고, 상기 융합 단백질의 발현량을 증가시키며, 응집체(aggregates) 생성을 억제하여, 결과적으로 상기 융합 단백질의 생산성을 증가시키고 품질을 향상시키는바, 상기 융합 단백질의 대량 제조 및 공급이 가능하다.
본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서 "IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질"은 인간 면역글로블린 G (IgG)의 불변 영역인 Fc 영역에 결합된 단백질을 의미한다. 이때, 본 발명에서 "단백질"은 펩티드 결합으로 수 개 이상의 아미노산 중합체를 의미한다.
본 발명에서 "아미노산 중합체"는 인간 VEGF 수용체 1과 2가 사용될 수 있고, 바람직하게는 VEGF 수용체 1과 2의 세포외 도메인(extracellular domain)이 사용될 수 있다.
본 발명에서 "Fc 영역"은 항체의 불변영역으로 인간 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4가 사용될 수 있고, 바람직하게는 IgG1의 Fc 영역이 사용될 수 있다.
본 발명은 세포 배양에서 혈관 내피세포 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포 외 도메인과 인간 면역글로블린 G(Immunoglobulin G) Fc 도메인이 융합된 단백질의 생산 방법으로서, 상기 융합 단백질의 발현량을 증가시키기 위해 세포를 28.0℃ 내지 35.0℃ 이하의 감소된 온도에서 배양하는 방법을 제공한다.
상기 융합 단백질의 생산 방법에 있어서, 상기 세포 배양은 대규모 세포 배양일 수 있으며, 세포 배양 방법은 통상적으로 사용되는 세포 배양법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 상기 세포 배양 방법은 이로 한정되는 것은 아니지만, 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있다.
상기 "회분 배양법"은 배지에 소량의 종배양액을 첨가하고, 배양 중에 새롭게 배지를 추가하거나 또는 배양액을 배출하거나 하지 않고, 세포를 증식시키는 배양 방법이다. 상기 "연속 배양법"은 배양 중에 연속적으로 배지를 추가하고, 또한 연속적으로 배출시키는 배양 방법이다. 또, 연속 배양법에는 관류 배양 (perfusion culture)도 포함된다. 상기 "유가 배양법"은 회분 배양법과 연속 배양법의 중간에 해당되므로, 반(半) 회분 배양법 (semi-batch culture)이라고도 불리고, 배양 중에 연속적으로 또는 축차적으로 배지가 추가되는데, 연속 배양법과 같은 연속적인 배양액의 배출이 실시되나 세포의 유출이 되지 않는 배양 방법이다. 본 발명에서는 상기 배양 방법들 중 어느 배양 방법을 사용해도 되는데, 바람직하게는, 유가 배양법 또는 연속 배양법이 사용될 수 있고, 특히 바람직하게는, 유가 배양법이 사용될 수 있다.
본 발명에서 Fc 융합 단백질의 발현에 사용하는 세포는 상기 융합 단백질을 지속적으로 발현할 수 있는 안정한 세포주라면 제한없이 사용할 수 있으며, 바람직하게는 포유류 세포일 수 있다. 더 바람직하게는 CHO 세포, HEK 세포, COS 세포, 3T3 세포, 미엘로마 세포, BHK 세포, HeLa 세포, Vero 세포 등 일반적으로 사용되고 있는 동물 배양 세포를 사용하고, 대량 발현을 목적으로 하는 경우에는 특히 CHO 세포가 바람직하다. 또한, 원하는 단백질을 제조하기 위해서는, 특히, DHFR 유전자를 결손한 CHO 세포인 dhfr- CHO 세포 (Proc. Natl. Acad. Sci. USA,1980, 77, 4216-4220)나 CHO K-1 세포 (Proc.Natl. Acad. Sci. USA,1968, 60, 1275) 등 원하는 유전자를 도입하는 데에 적합한 세포인 것이 바람직하다. 상기 CHO 세포로는 특히, DG44 주, DXB-11 주, K-1 주 또는 CHO-S 주가 바람직하고, 특히 K-1 주가 바람직하며 숙주 세포로의 벡터의 도입은 인산칼슘법, DEAE 덱스트란법, 일렉트로 포레이션법, 리포펙션 등의 방법으로 실시하는 것이 가능하다.
본 발명의 VEGF 수용체의 가용성 세포 외 도메인과 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단백질의 생산 방법에 있어서, 배양 개시일로부터 온도 변경 전까지의 배양 온도는 세포 종류에 따라 통상적으로 사용되는 배양 온도를 선택하여 사용할 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포 배양을 위해 통상적으로 사용되는 온도 범위는 33.0℃ 내지 38.0℃ 이하일 수 있고, 특히 바람직하게는 37.0℃일 수 있다. 본 발명의 바람직한 일실시예에서는 재조합형 아플리버셉트를 과발현하는 세포를 배양 개시일로부터 온도 변경 전까지 37.0℃에서 배양하여 세포를 성장시켰다.
본 발명에서 온도 변경의 타이밍은 목적 단백질의 발현량에 의해 결정된다. 구체적으로는, 실시예 2에 나타내는 실험을 실시함으로써, 최적의 온도 변경 타이밍을 알 수 있지만 사용하는 세포나 배양 조건에 따라 최종 세포 밀도가 상이하기 때문에, 일반적으로는 1×106 세포/㎖ 내지 1×108 세포/㎖ 정도가 바람직하다.
본 발명은, 상기 융합 단백질의 제조를 목적으로 하여, 단백질을 코드하는 유전자를 도입한 CHO 세포를 배양할 때, 세포당 생산성의 증가와 응집체를 억제하기 위한 방법으로서, 배양 개시일부터 1 일 후 내지 5 일 후까지 통상의 배양 온도에서 배양하고, 그 후 배양 온도를 감소시키는 것을 특징으로 한다. 저온으로 온도 변경된 후부터 배양을 종료할 때까지의 기간으로는, 일반적으로는 1 일 내지 30 일이고, 바람직하게는 2 일 내지 15 일일 수 있다. 온도 변경 전의 배양 기간과 온도 변경 후의 배양 기간의 합은 3일 이상일 수 있다. 구체적으로는, 상기 융합 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 상기 단백질을 생산하는 방법에 있어서, 일정 기간 통상의 배양 온도에서 배양한 후, 감소된 온도에서 계속해서 배양하는 것을 특징으로 한다. 여기서 통상의 배양 온도는 항온 동물 유래의 세포의 세포 증식에 적합한 온도인 33.0℃ 내지 38.0℃가 일반적이고, 37.0℃가 가장 일반적이다.
본 발명의 VEGF 수용체의 가용성 세포 외 도메인과 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단백질의 생산 방법에 있어서, 감소된 배양 온도는 통상의 배양 온도보다 낮은 온도 범위를 의미하며, 최적의 감소된 배양 온도는 목적 단백질의 발현량에 의해 결정된다. 따라서, 본 발명에서는 실시예 2에 기재된 바와 같이 실험을 수행하여 목적 단백질이 최대로 발현되는 최적의 감소된 배양 온도 범위를 도출하였다. 실시예 2와 같은 실험을 통해 최적의 변경 온도를 알 수 있지만 사용하는 세포의 종류나 배양 조건에 따라 최종 세포 밀도가 상이하기 때문에, 최적의 감소된 배양 온도는 바람직하게는 28.0℃ 내지 35.0℃, 더욱 바람직하게는 30.0℃ 내지 34.0℃ 일 수 있다.
본 발명의 VEGF 수용체의 가용성 세포 외 도메인과 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단백질의 생산 방법에 있어서, 상기 VEGF 수용체의 가용성 세포 외 도메인은 제1 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 2 및 제2 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 3을 포함할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 생산 방법으로 생산된 단백질은 치료용 단백질일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일실시예에서는 재조합형 아플리버셉트를 과발현하는 세포를 배양 개시일로부터 온도 변경 전까지의 배양 온도를 37.0℃로 하여 플라스크에서 세포의 밀도가 8x106 세포/mL에 도달할 때까지 3일 동안 배양하였다. 이후, 32.0℃로 온도를 낮추어 표 1의 공급 스케줄에 따라 유가 배양하였다.
도 1에 나타난 바와 같이, 플라스크에서 통상의 배양 온도보다 낮은 온도에서 성장하는 세포는 37.0℃에서 계속해서 배양한 세포보다(대조군) 더 높은 생존 능력을 나타내어 배양기간이 늘었으며, 이로 인해 도 4에 나타난 바와 같이, 단백질의 발현량이 증가 되었다. 반면, 도 2에 나타난 바와 같이, 플라스크에서 통상의 배양 온도보다 낮은 온도에서 성장하는 세포는 IVC 수와 발현된 단백질의 총량(PV = 배양 부피 × 발현량)에 영향을 주지 않기 때문에 특정 생산율(specific production rate)이 증가하지 않았다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서는 재조합형 아플리버셉트를 과발현하는 세포를 배양 개시일로부터 온도 변경 전까지의 배양 온도를 37.0℃로 하여 플라스크에서 세포의 밀도가 8x106 세포/mL에 도달할 때까지 2일 동안 배양하였다. 이후, 30.0℃ 또는 32.0℃ 또는 34.0℃로 온도를 낮추어 표 1의 공급 스케줄에 따라 유가 배양하였다.
도 5에 나타난 바와 같이, 플라스크에서 34.0℃로 감소된 배양 온도의 배양에서 다른 온도에 비해 세포 농도는 증가하지만, 도 6에 나타난 바와 같이, 32.0℃로 감소된 배양 온도의 배양에서 단백질의 발현량이 가장 많이 증가 되었다.
본 발명의 바람직한 다른 일실시예에서는 재조합형 아플리버셉트를 과발현하는 세포를 배양 개시일로부터 온도 변경 전까지의 배양 온도를 37.0℃로 하여 생물반응기에서 세포의 밀도가 4x106 세포/mL 또는 8x106 세포/mL에 도달할 때까지 1일 또는 2일 동안 배양하였다. 이후, 32.0℃로 온도를 낮추어 표 1의 공급 스케줄에 따라 유가 배양하였다. 상기 생물반응기 내 배양액의 pH 는 배양하는 세포에 따라 상이하나, 일반적으로는 pH 6.8 내지 7.6, 바람직하게는 pH 6.8 내지 7.4일 수 있다. 또한, 상기 생물 반응기 내 배양액의 DO(Dissolved oxygen)는 일반적으로 20% 내지 60%, 바람직하게는 30% 내지 50%, 보다 바람직하게는 40%가 사용된다.
플라스크 배양(Erlenmeyer flask)과는 다르게, 생물 반응기를 사용하여 통상적인 배양 온도(37.0℃)로 8x106 세포/mL의 세포 밀도까지 배양한 후 통상의 배양 온도보다 낮은 온도로 변경하여 배양된 세포는 도 8에 나타난 바와 같이 IVC 수에는 영향을 주지 않지만, 도 9에 나타난 바와 같이 발현된 단백질의 총량(PV = 배양 부피 × 발현량)이 증가하여 특정 생산율(specific production rate)이 증가하였고, 도 7에 나타난 바와 같이 배양 기간의 증가하여 결과적으로 도 10에 나타난 바와 같이 단백질 발현량이 증가하였다. 또한, 도 11에 나타난 바와 같이 응집체(aggregates)가 적게 생성되어 모노머 순도(monomer purity)가 증가함을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산 방법은 세포 배양 조건의 최적화를 통해 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질을 생산하는 세포의 성장 및 생존율을 증가시키고 단백질의 발현량을 증가시켜, 상기 융합 단백질의 생산성을 증가시킬 수 있다.
또한, 본 발명의 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산 방법은 포유 동물 세포의 배양 방법을 개선하여, 상기 융합 단백질의 생산성을 증가시키고, 상기 융합 단백질의 품질에 영향을 미치는 단백질 응집체(aggregates)의 생성을 억제하여 품질이 향상된 융합 단백질을 제공할 수 있다.
본 발명의 방법은 원하는 단백질을 생산하는 세포를 배양하여 상기 융합 단백질을 제조할 때, 원하는 단백질의 생산성을 증가하고 응집체 성분의 생성을 억제하는 것을 특징으로 한다. 따라서, anti-VEGF 수용체의 리간드 결합부분이 IgG1의 Fc 영역에 융합된 단백질인 아플리버셉트(Aflibercept)의 생산성과 응집체 성분의 생성을 억제하여 정제 공정 개선에 도움이 될 것이다.
본 발명은 또한, 전술한 생산 방법으로 목적 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 목적 단백질의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 목적 단백질의 제조 방법은, 상기 목적 단백질을 생산하는 세포가 배양된 배양액으로부터 상기 목적 단백질을 회수하는 공정을 추가로 포함할 수 있다.
상기 목적 단백질의 제조 방법으로 제조된 목적 단백질은 치료용 단백질일 수 있으며, 제조된 치료용 단백질은 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 약학적 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 유효성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 투여를 위해서 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1 종 이상 포함하여 의약 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 제조된 치료용 단백질의 종류에 따라, 인간을 비롯한 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 예를 들어, 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구적인 투여방법으로는 이에 제한되는 것은 아니나, 정맥내, 근육내, 동맥내, 골수내, 경막내, 심장내, 경피, 피하, 복강내, 비강내, 장관, 국소, 설하, 직장내 또는 유리체내(intravitreal injection) 투여일 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하며, 보통으로 숙련된 의사는 소망하는 치료 또는 예방에 효과적인 투여량을 용이하게 결정 및 처방할 수 있다.
이하, 본 발명의 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
[제조예]
재조합형 아플리버셉트(Aflibercept) 발현 벡터 및 발현 세포주의 제조
pSGHV0(GenBank Accession No. AF285183)에서 shGH, His tag, TEV site를 제거한 개량 벡터를 이용하여 융합 단백질로서 재조합형 아플리버셉트(Aflibercept)를 클로닝하였으며, 단백질 고유의 신호 서열(signal sequence)을 이용하여 세포 외로 분비되도록 하였다.
또한, 상기 융합 단백질을 지속적으로 발현하는 세포주(stable cell line) 구축을 위한 선별마커로 GS 시스템을 도입하였으며, 이를 위하여 마우스 글루타민 신테타아제(mouse glutamine synthetase) 유전자를 벡터에 삽입하였다. 발현량 증대를 위해 신호 서열에 Kozac 서열을 추가로 삽입하였다. 그 다음, 이렇게 제조된 클론을 CHO-K1 세포주(ATCC, Cat.CCL-61)에 유전자 도입하여, 메티오닌 술포시민(methionine sulphoximine, MSX) 선별을 진행하여, 안정한 세포주를 확보하였다. 다만, 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 주어진 상황에 따라 통상적으로 사용되는 벡터 및 세포주를 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
감소된
온도 배양에 따른 세포 상태 및
IgG
Fc
융합 단백질 생산에 대한 효과의 확인
상기 제조예에서 제조된, 재조합형 아플리버셉트(Aflibercept)를 과발현하는 세포를 2개의 125mL에 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 식물 유래의 가수분해 단백질이 첨가된 배지에 동일한 농도 및 조건으로 접종하고 37.0℃ CO2 인큐베이터(incubator)에서 진탕 배양하였다. 세포를 회분 배양으로 성장시킨 다음, 세포 농도가 약 8x106cell/mL일 때, 32.0℃로 온도를 낮추어 유가 배양하였다. 실험 조건에 대한 공급 스케줄은 하기 표 1에 요약되어 있다. 유가 공급물 부피는 생물반응기 내의 배양 시작 부피의 백분율로서 기재되어 있다. 세포 샘플은 배양으로부터 매일 취하여 생존 세포수, 세포 생존율, 발현량 및 특정 생산율(specific production rate)의 수준을 측정하였다. "통합 생존 세포수" 또는 "IVC(Integral viable cell)"는 배양이 실행되는 시간으로 곱한 배양의 과정에 걸친 생존 세포의 평균 밀도를 의미한다. 생산된 단백질의 양이 배양의 과정에 걸쳐 존재하는 생존 세포의 수에 비례할 때, 통합 생존 세포 밀도는 배양의 과정에 걸쳐 생산된 단백질의 양을 추정하는데 사용되었다. 통합 생존 세포수(IVC, Integral viable cell)는 트리판 블루로 염색하여 현미경으로 측정하는 세포 밀도 검사를 이용하여 측정함으로써 계산하였고 IVC로 정규화하였다. IVC는 시험된 모든 실험 조건에 대해 수확일 통합 생존 세포 밀도의 산술 평균을 계산함으로써 결정하였다. 발현량은 Protein A-HPLC로 측정하여 특정 생산율(specific production rate)을 계산하였다.
실험 조건 | 37.0℃ | 37.0→32.0℃ |
2일 | 2.86% | 2.86% |
3일 | 2.86% | 2.86% |
4일 | 2.86% | 2.86% |
5일 | 2.86% | 2.86% |
6일 | 2.86% | 2.86% |
7일 | 2.86% | 2.86% |
8일 | 2.86% | 2.86% |
그 결과, 125mL 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 저온 배양된 세포는 IVC 수와 발현된 단백질의 총량(PV = 배양 부피 x 발현량)에 영향을 주지 않기 때문에 특정 생산율(specific production rate)이 증가하지 않았다(도 2 및 3). 그러나, 저온에서 성장하는 세포는 더 높은 세포 생존 능력을 발생시킴으로써(도 1), 배양 기간과 발현량을 증가시켰다(도 4).
IgG Fc 융합 단백질의 발현량에 따른 최적의 변경 온도 확인
상기 제조예에서 제조된, 재조합형 아플리버셉트(Aflibercept)를 과발현하는 세포를 3개의 125mL에 삼각 플라스크(Erlenmeyer flask)에서 식물 유래의 가수분해 단백질이 첨가된 배지에 동일한 농도 및 조건으로 접종하고 37.0℃ CO2 인큐베이터(incubator)에서 진탕 배양하였다. 세포를 회분 배양으로 성장시킨 다음, 세포 농도가 약 8x106cell/mL일 때, 30.0℃, 32.0℃ 또는 34.0℃로 각각 온도를 낮추어 유가 배양하였다. 실험 조건에 대한 공급 스케줄은 실시예 1의 표 1과 같이 진행하였다. 세포의 다양한 상태는 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다.
그 결과, 34.0℃ 저온 배양된 세포는 생존율의 변화 없이 세포 농도가 가장 많이 증가하였다(도 5). 그러나, 32.0℃ 저온 배양된 세포의 발현량이 다른 온도에 비해 가장 많이 증가되었다(도 6).
생물반응기(bioreactor) 확인 실험
상기 제조예에서 제조된, 재조합형 아플리버셉트(Aflibercept)를 과발현하는 세포를 NBS(New Brunswick Scientific) 생물반응기(bioreactor) 내에서 식물 유래의 공급물 배지로서 사용하였고 pH 6.8~7.4와 80rpm의 속도로 교반하였다. 생물반응기는 1일이나 2일째에 4x106cell/mL이나 8x106cell/mL의 세포 농도에 도달하면 37.0℃로부터 32.0℃로 온도를 변화시켜 배양하였다. 실험 조건에 대한 공급 스케줄은 실시예 1의 표 1과 같이 진행하였다. 세포의 다양한 상태는 실시예 1에 기재된 바와 같이 측정하였다.
그 결과, 125mL 삼각 플라스크 배양(Erlenmeyer flask)과는 다르게 8x106cell/mL에서 저온 배양된 세포는 IVC 수에는 영향을 주지 않지만 발현된 단백질의 총량(PV = 배양 부피 x 발현량)이 증가하여 특정 생산율(specific production rate)이 증가하였고 배양 기간의 증가로 발현량이 증가하였다(도 7 내지 10). 상기 온도 조건으로 배양된 시료를 Protein A 컬럼으로 단백질을 분리하고 SE-HPLC로 분석하였다. SE-HPLC로 분석한 결과로부터 모노머(monomer) 비율을 계산하고, 고분자 불순물인 응집체(aggregates)와 저분자 불순물인 단편(fragments)의 비율을 계산하였다. 실험 결과 온도를 감소한 배양에서 응집체(aggregates)가 적게 생성되어 모노머 순도(monomer purity)가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 11).
이상의 결과는 본 발명의 VEGF 수용체의 가용성 세포 외 도메인과 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단백질의 생산 방법을 통해 상기 융합 단백질로 대표되는 아플리버셉트(Aflibercept)를 응집체 생성을 억제하여 고품질로 생산할 수 있을 뿐만 아니라 감소된 온도에서의 배양을 통해 발현량이 현저하게 증가하여 생산성 또한 증가시킬 수 있다는 것을 입증한다.
세포 배양을 통한 융합 단백질의 생산에 있어서, 단백질의 품질 및 생산성을 동시에 만족하는 배양 조건은 단백질의 종류에 따라 상이하여 최적화된 조건을 찾기 위해서는 수많은 시행착오가 필요하다. 상기 실시예에서 입증된 바와 같이, 본 발명의 융합 단백질 생산 방법은 VEGF 수용체의 가용성 세포 외 도메인과 인간 IgG Fc 도메인이 융합된 단백질(예를 들어, 아플리버셉트) 생산에 최적화된 것으로 단백질의 종류가 달라지면 해당 단백질의 생산성과 품질이 현저하게 달라질 수 있다. 따라서, 생산하고자 하는 목적 단백질의 종류가 달라지게 되면 품질 및 생산성을 향상시키기 위한 최적화된 조건을 재설정하고 이를 검증하는 과정이 필수적으로 요구될 것이다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
Claims (21)
- 세포 배양에서 혈관 내피세포 성장 인자(Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF) 수용체의 가용성 세포 외 도메인과 인간 면역글로불린 G(Immunoglobulin G) Fc 도메인을 포함하는 융합 단백질의 생산 방법으로서, 상기 VEGF 수용체의 가용성 세포 외 도메인은 제1 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 2 및 제2 VEGF 수용체의 면역글로불린-유사 도메인 3을 포함하고, 상기 융합 단백질의 발현량을 증가시키기 위해 세포를 30.0℃ 내지 35.0℃ 이하의 감소된 온도에서 배양하는 것을 포함하며, 상기 방법은 세포의 생존율을 증가시키는 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 방법으로 제조된 융합 단백질은 응집체(aggregates)가 감소된 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포 배양은 대규모 세포 배양인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제3항에서 있어서, 상기 세포 배양은 회분 배양법 (batch culture), 반복 회분 배양법 (repeated batch culture), 유가 배양법 (fed-batch culture), 반복 유가 배양법 (repeated fed-batch culture), 연속 배양법 (continuous culture) 및 관류 배양법 (perfusion culture)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 세포 배양은 유가(fed-batch) 세포 배양인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 포유류 세포인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 포유류 세포는 CHO 세포인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제7항에 있어서, 상기 CHO 세포는 DG44, DXB-11, K-1 및 CHO-S로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나의 세포주인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 배양 개시일로부터 온도 감소 전까지 배양 온도는 33.0℃ 내지 38.0℃ 이하의 온도 범위를 포함하는 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 배양 개시일로부터 온도 감소 전까지 배양 기간이 1 내지 5일인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 온도 감소 후 배양 기간이 2 내지 15일인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제1항에 있어서, 온도 감소 전의 배양 기간 및 온도 감소 후의 배양 기간의 합이 3일 이상인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 생산된 융합 단백질은 치료용 단백질인 것인 융합 단백질의 생산 방법.
- 제1항 내지 제9항, 제11항 내지 제13항 및 제15항 중 어느 한 항의 융합 단백질의 생산 방법으로 목적 단백질을 생산하는 세포를 배양하는 것을 포함하는 목적 단백질의 제조 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 목적 단백질을 생산하는 세포가 배양된 배양액으로부터 상기 목적 단백질을 회수하는 공정을 추가로 포함하는 목적 단백질의 제조 방법.
- 제16항에 있어서, 상기 목적 단백질은 치료용 단백질인 것인 목적 단백질의 제조 방법.
- 삭제
- 제17항에 있어서, 상기 목적 단백질은 치료용 단백질인 것인 목적 단백질의 제조 방법.
- 삭제
Priority Applications (16)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202210985550.8A CN115247196A (zh) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | 用于生产具有igg fc结构域的融合蛋白的方法 |
PL16855776.7T PL3363811T3 (pl) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Sposób wytwarzania białka fuzyjnego z domeną fc igg |
RU2018117705A RU2732237C2 (ru) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Способ получения афлиберцепта |
EP22186197.4A EP4098659A1 (en) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Method for producing fusion protein having igg fc domain |
JP2018519736A JP6783305B2 (ja) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | IgG Fcドメインを有する融合タンパク質の生産方法 |
BR112018007590-6A BR112018007590A2 (pt) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | método para produzir proteína de fusão que tem domínio fc de igg |
US15/767,806 US11414476B2 (en) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Method for producing fusion protein having IgG Fc domain |
ES16855776T ES2945537T3 (es) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Método para producir proteína de fusión que tiene un dominio Fc de IgG |
CA3001977A CA3001977C (en) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Method for producing fusion protein having igg fc domain |
AU2016339642A AU2016339642B2 (en) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Method for producing fusion protein having IgG Fc domain |
MX2018004580A MX2018004580A (es) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Metodo para producir proteina de fusion con dominio fc de igg. |
PCT/KR2016/011561 WO2017065559A1 (ko) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
EP16855776.7A EP3363811B1 (en) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | Method for producing fusion protein having igg fc domain |
CN201680059726.XA CN108137672B (zh) | 2015-10-15 | 2016-10-14 | 用于生产具有igg fc结构域的融合蛋白的方法 |
JP2020082131A JP2020114266A (ja) | 2015-10-15 | 2020-05-07 | IgG Fcドメインを有する融合タンパク質の生産方法 |
US17/859,466 US20220348636A1 (en) | 2015-10-15 | 2022-07-07 | Method for producing fusion protein having igg fc domain |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
KR1020150144330 | 2015-10-15 | ||
KR20150144330 | 2015-10-15 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20170044594A KR20170044594A (ko) | 2017-04-25 |
KR101936049B1 true KR101936049B1 (ko) | 2019-01-08 |
Family
ID=58703642
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020160132633A KR101936049B1 (ko) | 2015-10-15 | 2016-10-13 | IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US11414476B2 (ko) |
EP (2) | EP3363811B1 (ko) |
JP (2) | JP6783305B2 (ko) |
KR (1) | KR101936049B1 (ko) |
CN (2) | CN115247196A (ko) |
AU (1) | AU2016339642B2 (ko) |
BR (1) | BR112018007590A2 (ko) |
CA (1) | CA3001977C (ko) |
ES (1) | ES2945537T3 (ko) |
MX (1) | MX2018004580A (ko) |
PL (1) | PL3363811T3 (ko) |
RU (1) | RU2732237C2 (ko) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AR095196A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
TW202330904A (zh) | 2015-08-04 | 2023-08-01 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
KR101936049B1 (ko) * | 2015-10-15 | 2019-01-08 | (주)알테오젠 | IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
BR112019021923A2 (pt) | 2017-04-21 | 2020-06-02 | Yuhan Corporation | Método para produzir proteínas de função dupla e suas derivadas |
CN115197961B (zh) * | 2022-06-20 | 2024-04-16 | 岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心 | 一种非洲猪瘟病毒b602l重组蛋白稳定表达细胞系及其构建方法和应用 |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080269132A1 (en) * | 2007-04-23 | 2008-10-30 | Wyeth | Use of low temperature and/or low ph in cell culture |
US20100331250A1 (en) * | 2009-03-18 | 2010-12-30 | Joe Zhou | Anti-angiogenesis fusion proteins |
Family Cites Families (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
TR200504220T2 (tr) | 1998-12-17 | 2007-04-24 | Biogen Idec Ma Inc. | Aktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimeAktif limfotoksin-beta reseptör imunoglobülin şimerik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştrik proteinlerinin yüksek düzey ifadesi ve saflaştırılması için bir yöntem.ırılması için bir yöntem. |
US7396664B2 (en) * | 1999-06-08 | 2008-07-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same |
RS50073B (sr) * | 1999-06-08 | 2009-01-22 | Regeneron Pharmaceuticals I.N.C., | Modifikovani himerni polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama |
US20030064053A1 (en) * | 2001-08-31 | 2003-04-03 | Shengjiang Liu | Multivalent protein conjugate with multiple ligand-binding domains of receptors |
MXPA05006523A (es) * | 2002-12-23 | 2005-08-26 | Squibb Bristol Myers Co | Procesos de cultivo de celulas de mamiferos para la produccion de proteinas. |
US7300773B2 (en) * | 2004-08-27 | 2007-11-27 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of TNFR-Ig |
US8911964B2 (en) | 2006-09-13 | 2014-12-16 | Abbvie Inc. | Fed-batch method of making human anti-TNF-alpha antibody |
EP3165606A1 (en) | 2009-05-01 | 2017-05-10 | Ophthotech Corporation | Methods for treating or preventing ophthalmological diseases |
WO2011134919A2 (en) * | 2010-04-26 | 2011-11-03 | Novartis Ag | Improved cell cultivation process |
JO3283B1 (ar) * | 2011-04-26 | 2018-09-16 | Sanofi Sa | تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI) |
AR091967A1 (es) | 2012-08-02 | 2015-03-11 | Sanofi Sa | Articulo de fabricacion que comprende aflibercept o 2iv-aflibercept |
AR095196A1 (es) * | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
KR101771832B1 (ko) | 2013-04-15 | 2017-08-25 | 텔레호낙티에볼라게트 엘엠 에릭슨(피유비엘) | Mtc 디바이스들로 시스템 정보의 시그널링 |
CN103319610B (zh) * | 2013-07-05 | 2016-01-27 | 华博生物医药技术(上海)有限公司 | 重组融合蛋白及其制法和用途 |
AU2014380174B2 (en) | 2014-01-29 | 2018-08-30 | Amgen Inc. | Overexpression of N-glycosylation pathway regulators to modulate glycosylation of recombinant proteins |
CN104974262B (zh) * | 2014-04-04 | 2019-08-09 | 华博生物医药技术(上海)有限公司 | 重组双功能融合蛋白及其制法和用途 |
EP3152318A1 (en) | 2014-06-03 | 2017-04-12 | Lupin Limited | Cell culture process for producing a protein |
KR20160132633A (ko) | 2015-05-11 | 2016-11-21 | 주식회사 엘지화학 | 배터리 시스템 및 그 연결 제어 방법 |
KR101936049B1 (ko) * | 2015-10-15 | 2019-01-08 | (주)알테오젠 | IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
-
2016
- 2016-10-13 KR KR1020160132633A patent/KR101936049B1/ko active IP Right Grant
- 2016-10-14 EP EP16855776.7A patent/EP3363811B1/en active Active
- 2016-10-14 CN CN202210985550.8A patent/CN115247196A/zh active Pending
- 2016-10-14 RU RU2018117705A patent/RU2732237C2/ru active
- 2016-10-14 ES ES16855776T patent/ES2945537T3/es active Active
- 2016-10-14 JP JP2018519736A patent/JP6783305B2/ja active Active
- 2016-10-14 BR BR112018007590-6A patent/BR112018007590A2/pt active Search and Examination
- 2016-10-14 MX MX2018004580A patent/MX2018004580A/es unknown
- 2016-10-14 EP EP22186197.4A patent/EP4098659A1/en active Pending
- 2016-10-14 AU AU2016339642A patent/AU2016339642B2/en active Active
- 2016-10-14 CA CA3001977A patent/CA3001977C/en active Active
- 2016-10-14 PL PL16855776.7T patent/PL3363811T3/pl unknown
- 2016-10-14 US US15/767,806 patent/US11414476B2/en active Active
- 2016-10-14 CN CN201680059726.XA patent/CN108137672B/zh active Active
-
2020
- 2020-05-07 JP JP2020082131A patent/JP2020114266A/ja active Pending
-
2022
- 2022-07-07 US US17/859,466 patent/US20220348636A1/en active Pending
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20080269132A1 (en) * | 2007-04-23 | 2008-10-30 | Wyeth | Use of low temperature and/or low ph in cell culture |
US20100331250A1 (en) * | 2009-03-18 | 2010-12-30 | Joe Zhou | Anti-angiogenesis fusion proteins |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP2020114266A (ja) | 2020-07-30 |
CN115247196A (zh) | 2022-10-28 |
CA3001977A1 (en) | 2017-04-20 |
US20220348636A1 (en) | 2022-11-03 |
CN108137672B (zh) | 2022-09-06 |
RU2732237C2 (ru) | 2020-09-14 |
JP6783305B2 (ja) | 2020-11-11 |
US11414476B2 (en) | 2022-08-16 |
PL3363811T3 (pl) | 2023-07-17 |
EP3363811B1 (en) | 2023-04-19 |
US20180298078A1 (en) | 2018-10-18 |
RU2018117705A (ru) | 2019-11-15 |
CA3001977C (en) | 2023-06-20 |
MX2018004580A (es) | 2018-09-19 |
RU2018117705A3 (ko) | 2019-11-15 |
EP4098659A1 (en) | 2022-12-07 |
EP3363811A1 (en) | 2018-08-22 |
KR20170044594A (ko) | 2017-04-25 |
ES2945537T3 (es) | 2023-07-04 |
AU2016339642A1 (en) | 2018-04-12 |
BR112018007590A2 (pt) | 2018-10-23 |
JP2018530344A (ja) | 2018-10-18 |
EP3363811A4 (en) | 2019-03-13 |
AU2016339642B2 (en) | 2019-07-25 |
CN108137672A (zh) | 2018-06-08 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR101936049B1 (ko) | IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 | |
TWI384069B (zh) | 多胜肽之製法 | |
EP3400241B1 (en) | Modulation of afucosylated species in a monoclonal antibody composition | |
WO2017120359A1 (en) | Reduction of high molecular weight species, acidic charge species, and fragments in a monoclonal antibody composition | |
CN103012590B (zh) | 一种抗cd20单克隆抗体及其制备方法和用途 | |
CN102276722B (zh) | 新型血管内皮生长因子人源化单克隆抗体 | |
JP7093087B2 (ja) | 遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを含む組成物および遺伝子組み換えヒト甲状腺刺激ホルモンを生産する方法 | |
EP3055327B1 (en) | Monoclonal olfml-3 antibodies and uses thereof | |
US20220119535A1 (en) | Bispecific anti-vegf and anti-trkb binding molecules for the treatment of eye diseases | |
WO2017065559A1 (ko) | Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 | |
CN106699885B (zh) | 一种人源抗vegfr2抗体及其应用 | |
WO2023028914A1 (zh) | 抗Her3抗体及其应用 | |
US10131891B2 (en) | Method of using insulin for controlling glycosylation of recombinant glycoprotein | |
KR20230170717A (ko) | 세포 배양 방법 | |
KR101794289B1 (ko) | 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬을 포함하는 조성물 및 상기 재조합 인간 갑상선 자극 호르몬의 정제 방법 | |
CN102336834A (zh) | 全人TNFα-Fab抗体及其PEG化抗体 | |
NZ733430A (en) | A method for controlling glycosylation of recombinant glycoprotein |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A201 | Request for examination | ||
AMND | Amendment | ||
AMND | Amendment | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
AMND | Amendment | ||
E601 | Decision to refuse application | ||
AMND | Amendment | ||
X701 | Decision to grant (after re-examination) | ||
GRNT | Written decision to grant |