RS50073B

RS50073B - Modifikovani himerni polipeptidi sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama

Info

Publication number: RS50073B
Application number: YUP-869/01A
Authority: RS
Inventors: Nicholas J. Papadopoulos; Samuel Davis; George D. Yancopoulos
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals I.N.C.,
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2009-01-22
Also published as: MEP3208A; EP1544299B1; KR100659477B1; CZ303656B6; NO2013010I2; FR13C0028I1; HK1132653A1; NO332559B1; JP2011024595A; CZ302689B6; CN101433715B; CN1369009A; BR0011407A; YU86901A; HRP20010908B1; NO2013010I1; CA2376379A1; FR13C0028I2; BE2013C029I2; MXPA01012630A

Abstract

Izolovani molekul nukleinske kiseline, naznačen time, što se sastoji od: (a) nukleotidne sekvence koja kodira receptorsku komponentu vaskularnog endotelijanog faktora rasta [VEGF] koja se sastoji u osnovi od domena 2 prvog VEGF receptora sličnog imunoglobulinu (Ig) i Ig domena 3 drugog VEGF receptora; i (b) nukleotidne sekvence koja kodira multimerizacionu komponentu, gde je prvi VEGT receptor Fltl, a drugi VEGF receptor je F1kl ili Flt4 i VEGF receptorska komponenta je samo VEGF receptorska komponenta fuzionog polipeptida.

Description

MODIFIKOVANI HIMERNI POLIPEPTIDI SA POBOLJŠANIM

FARMAKOKINETIČKIM OSOBINAMA

Ova patentna prijava ima prioritet provizorne US prijave 60/138,133, podnete 8 juna 1999. U ovoj prijavi su date reference za različite publikacije. Otkrića u tim publikacijama u njihovoj celovitosti su ovde inkorporirani kao referenca u odnosu na ovu prijavu.

Oblast ovog pronalaska su modifikovani polipeptidi sa poboljšanom farmakokinetikom. Naročito, oblast ovog pronalaska odnosi se na Fltl receptor polipeptida koji su modifikovani tako da poboljšaju njihov farmakokinetieki profil. Oblast ovog pronalaka takođe se odnosi na postupak pripremanja i upotrebu modifikovanih polipeptida uključujući ali se ne ograničavajući na upotrebu modifikovanih polipeptida da smanji ili inhibira propuštanje plazme i/ili vaskularnu permeabilnost kod sisara.

Sposobnost polipeptidnih liganada da se veže za ćelije i na taj način izmami fenotipski odgovor kao što je rast ćelija, opstanak, sekrecija ćelijskih proizvoda ili diferencijacija je često posredovana transmembranskim receptorima na ćeliji. Ekstracelularni domen takvih receptora (tj. taj deo receptora koji je izložen na površini ćelije) je u opšte najkarakterističniji deo molekula, koji obezbeđuje protein sa karakteristikama vezivanja liganda. Vezivanje liganda za ekstracelularni domen u opšte rezultuje pretvaranjem signala koji prenosi biološki signal do intracelularnog cilja. Cesto, ovo pretvaranje signala se dešava preko katalitičkih intracelularnih domena. Određeni raspored motiva sekvence katalitičkog intracelularnog domena određuje njegov prilaz potencijalnim kinazmm supstratima (Mohammadi, et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 11: 5068-5078; Fantl, et al., 1992, Cell 69:413-413). Primeri receptora koji pretvaraju signale preko katalitičkih intracelularnih domena uključuju receptor tirozin kinazu (RTKs) kao što je Trk familija receptora koji su generalno ograničeni na ćelije nervnog sistema, familiju receptora citokina koja uključuje trostruki CNTF receptorski kompleks (Stahl & Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25: 1454-1466) koji je takođe u opšte ograničen na ćelije nervnog sistema, receptore kuplovane sa G-proteinom kao što je p2-adrenergični receptor nađen, na primer, na srčanim mišićnim ćelijama i multimerm IgE receptor visokog afiniteta FceRI koji su lokalizovani, za većinu delova, na mlečnim ćelijama i bazofilima (Sutton & Gould, 1993, Nature 336:421-428).

Svi do sada identifikovani receptori podležu dimerizaciji, multimerizaciji ili nekoj bliskoj konformacionoj promeni koja prati vezivanje liganda (Schlessinger, J. , 1988, Trend Biochem. Sci. 13:443-447; Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212; Schlessinger & Urlich, 1992, Neuron 9:383-391) i molekulskoj interakciji između dimernih intracelularnih domena koji dovode do aktivacije katalitičkih funkcija. U nekim slučajevima, kao što je faktor rasta iz krvnih pločica (PDGF), ligand je dimer koji vezuje dva molekula receptora (Hart, et al., 1988, Science, 240:1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905-8912) dok, na primer, u slučaju epidermalnog faktora rasta (EFG), ligand je monomer (Weber, et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:14631-14636). U slučaju FcsRI receptora, ligand, IgE, izlazi vezan za FcsRI na monomerni način i jedino postaje aktiviran kada se antigen veže za IgE/FceRI kompleks i unakrsnim vezama veže za IgE molekule (Sutton & Gould, 1993, Nature 366:421- 428).

Cesto, raspoređenost na tkivu određenih receptora kod viših organizama obezbeđuje uvid u biološku funkciju receptora. RTK za neke faktore rasta i diferencijacije, kao što je faktor rasta fibroblasta (FGF), je široko rasprostranjen i zbog toga se čini da igra jedna opšta uloga u rastu tkiva i održavanju. Članovi Trk RTK familije (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3:262-268) receptora su uopšte ograničeni na ćelije nervnog sistema, i familija neravnih faktora rasta (Nerve Grouth Factor-NGF) se sastoji od nervnog faktora rasta (NGF), neurotrofičnog faktora iz mozga (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3) i neurotrofma-4/5 (NT-4/5), koji se vezuju za receptore Trk RTK familije, potpomažući diferencijaciju različitih grupa neurona u mozgu i preriferiji (Linsdav, R. M, 1993, u Neurotrophic Factors, S.E. Loughlin & J.H. Fallcon, eds., str. 257-284, San Diego, CA, Academic Press). FceRI je lokalizovan na ograničeni tip ćelija kao što su mlečne ćelije i bazofile. Mlečne ćelije potiču iz linije roda pluripotentnih hematopoietskih ćelija koštane srži, ali su završile svoju mutaciju u tkivu koja je pratila migraciju iz krvnog toka (Videti Janeway & Travers, 1996, u Immunobiologv, 2<nd>Edition, M. Robertson & E. Lawrence, eds, str. 1:3-l :4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher) i uključene su u alergični odgovor.

Mnoge studije su pokazale da ekstracelularni domeni receptora obezbeđuju specifične karakteristike vezivanja liganda. Osim toga, okruženje ćelije u kom se receptor ispoljava, može uticati na biološki odgovor koji se pokazuje posle vezanja liganda za receptor. Na primer, kada se neuronska ćelija sa Trk receptorom izloži neurotrofinu koji se vezuje za taj receptor, dolazi do opstanka neurona i diferencijacije. Kada se isti receptor koji ima fibroblast, izloži neurotrofinu, dolazi do proliferacije fibroblasta (Glass, et al, 1991, Cell 66:405-413).

Klasa dimernih mitogena, koja potiče iz ćelija sa selektivnošću za vaskularne endotelijalne ćelije, je identifikovana i označena kao vaskularni endotelijalni ćelijski faktor rasta (VEGF-Vascular Endothelial cell Growth Factor). VEGF je prečišćen iz kondicioniranog medijuma rasta ćelija glioma pacova [Conn et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, str. 2628-2632]; i kondicioniraog medijuma rasta goveđih zvezdastih ćelija folikula hipofize [Ferrara and Henzel, (1989), Biochem. Biophvs. Res. Comm., 161, str. 851-858; Gozpadorowicz et al, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, str. 7311-7315] i humanog kondicioniranog medijuma rasta U937 ćelija [Connolly, D.T. et al (1989), Science, 246, str. 1309-1312]. VEGF je dimer sa prividnom molekulskom masom od oko 46 kDa sa svakom podjedinicom koja ima prividnu molekulsku masu od oko 23 kDa. VEGF ima neke strukturne sličnosti sa faktorom rasta koji potiče iz krvnih pločica (PDGF), koji je mitogen za ćelije vezivnog tkiva ali nije mitogen za vaskularne endotelijalne ćelije iz velikih krvnih sudova.

Receptor tirozin kinaze vezan za membranui, poznat kao Flt, je pokazano daje VEGF receptorpeVries, C. et. al, (1992), Science, 255, str.989-991]. Flt receptor se specifično veže za VEGF što indukuje mitogenezu. Drugi oblik VEGF receptora, označen KDR, je takođe poznat po vezivanju VEGF i indukuje mitogenezu. Parcijalna cDNA sekvenca i takođe je poznata gotovo čitave dužine proteinska sekvence KDR-a [Terman, B.I. et al,

(1991) Oncogene 6, str. 1677-1683; Terman, B. I. et al., (1992) Biochem. Biophvs. Res. Comm. 187, str. 1579-1586].

Istrajna angiogeneza može uzrokovati ili pogoršati izvesne bolesti kao što je psorijaza, reumatoidni artritis, hemangion, angiofibrom, dijabetičarsku retinopatiju i neovaskularni glaukom. Inhibitor VEGF aktivnosti može biti koristan u lečenju takvih bolesti i drugih VEGF-indukovanih patoloških angiogeneza i stanja vaskularne permeabilnosti kao što je vaskularizacija tumora. Ovaj pronalazak se odnosi na VEGF inhibitore koji su zasnovani na VEGF receptorima Fltl.

Propuštanje plazme, ključna komponenta zapaljenja, dešava se u određenom podsetu mikro krvnih sudova. Naročito, u većini organa propuštanje plazme specifično se dešava u venulama. Nasuprot arteriolama i kapilarima, venule počinju da propuštaju kao odgovor na brojne inflamatorne posrednike uključujući histamin, bradikinin i serotonin. Jedna karakteristika zapaljnja je propuštanje plazme kao rezultat intracelularnih pukotina koji nastaju u endotelijumu venula. Većina eksperimentalih modela zapaljenja ukazuje da ove intracelularne pukotine nastaju između endotelijalnih ćelija postkapilara i sakupljajućih venula (Baluk, P., et al., Am. J. Pathol. 1998 152:1463-76). Pokazano je da se izvesni lecitini mogu koristiti da se otkriju karakteristike fokalnih mesta propuštanja plazme, endotelijalnih pukotina i "finger-like"postupaka na endotelijalnoj ćelijskoj granici kod venula u zapaljenju (Thurston, G et al, Am. J. Phvsiol, 1996, 271: H2547-62). Naročito, biljni lecitini su korišćeni za vizuelizaciju morfoloških promena na endotelijanim ćelijskim granicama kod venula u zapaljenju, na primer kod traheja pacova. Lecitini, kao što je konkavalin A i ricin, koji se vezuju fokalno za venule u zapaljenju otkrivaju regione subendotelijalnih zidova sudova koji imaju pukotine koje odgovaraju mestima propuštanja plazme (Thurston, G., et al, Am J Phvsiol, 1996, 271: H2547-62).

Osobine mikro krvnih sudva su dinamične. Hronične bolesti zapaljenja, na primer, su u vezi sa remodelovanjem mikro krvnih sudova, uključujući angiogenska proširenja i proširenja mikro krvnih sudova. Mikro krvni sudovi takođe mogu biti remodelovani sticanjem abnormalnih fenotipskih osobina. Kod hroničnog zapaljenja disajnih puteva na modelu kod pacova i miševa, kapilari vazdušnih puteva stiču osobine od venula, uključujući proširenje prečnika krvnih sudova, povećanu imunoreaktivnost za von Willebrand-ov faktor i povećanu imunoreaktivnost na P-selektin. Dodatno, ovi remodelovani krvni sudovi propuštaju kao odgovor na inflamatorne posrednike, dokle isti krvni sudovi u vazdušnom putu kod normalnih miševa ne propuštaju.

Pokazano je da izvesne supstance smanjuju ili inhibiraju vaskularnu propustljivost i/ili propuštanje plazme. Na primer, mistiksini su sintetički polipeptidi za koje je ustanovljeno da inhibiraju propuštanje lazme bez blokiranja nastanka endotelijalnih pukotina (Baluk, P., et al, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998, 284: 693-9). Takođe, agonist beta 2-adrenegičnih receptora, formoterol redukuje mikrovaskularna propuštanja inhibiranjem nastanka endotelijalnih pukotina (Baluk, P. and McDonald, D.M., Am. J. Phvsiol., 1994, 266: L461-8).

Angiopoietini i članovi familije endotelijalnih faktora rasta (VEGF) su jedini faktori rasta koji su u velikoj meri specifični za vaskularne endotelijalne ćelije. Studije ciljne genske inaktivacije kod miševa pokazale su da VEFG je neophodan za rane stadijume vaskularnog razvoja i da Ang-1 je tražen u kasnijim stupnjevima vaskularnog remodelovanja.

US Patent No. 6,011,003, izdat 4 januara 2000, u ime Metris Therapeutics Limited, otkriva izmenjen, rastvorni oblik FLT polipeptida koji je sposoban za vezivanje VEFG-a i pomoću toga vrši inhibitorni uticaj na njih, polipeptid se sastoji od pet ili manje kompletnih imunoglobulinskih domena.

US Patent No. 5,712,380 izdat 27 januara 1998 u ime Merck & Co., otkriva inhibitore vaskularnog endotelijalnog ćelijskog faktora rasta (VEGF) koji se javljaju u prirodi ili dobijeni rastvorni oblici rekombinantnom tehnikom sa ili bez C-terminalnog transmembranskog regiona receptora za VEGF.

Takođe u ime Merck & Co. je objavana PCT WO 98/13071, 2. aprila 1998, koja otkriva metodologiju genske terapije za inhibiciju primarnog rasta tumora i metastaza pomoću transfera gena nukleotidne sekvence koja kodira rastvorni proteinski receptor koji vezuje VEGF.

PCT objava Br. WO 97/44453, objavljena 27 novembra, 1997 u ime Genentech, Inc. otkriva novi himerni proteinski VEGF receptor koji sadrži sekvence amino kiselina koje su izvedene iz receptora vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF) Fltl i KDR, uključujući i murinske homologe humanom KDR receptora FLK1, gde pomenuti himerni protein sa VEGF receptorom vezuje se za VEGF i antagonizira proliferaciju endotelijalnih ćelija i njihovu angiogenesku aktivnost.

PCT objava br. WO 97/13787 , objavljena 17 aprila 1997, na ime Toa Gosei Co., LTD., otkriva inhibitore VEGF niske molekulske mase upotrebljive u lečenju bolesti koje su u vezi sa neovaskularizacijom kao što su čvrsti tumori. Polipeptid sadrži prvi domen sličan imunoglobulinu i drugi domen sličan imunoglobulinu u ekstracelularnom regionu VEGF receptora FLT ali ne sadrži šesti domen sličan imunoglobulinu i njegov sedmi domen sličan imunoglobulinu i pokazuje VEGF inhibitorsku aktivnost.

Sharifi, J. et al., 1998, The Quarterly Jour. of Nucl. Med. 42:242-249, otkrivaju da zato što su monoklonalna antitela (MAbs) osnovna, pozitivno naelektrisani proteini i ćelije sisara su negativno naelektrisane, elektrostatička interakcija između ta dva može kreirati viši nivo za vezivanje u pozadini koji rezultuje niskim odnosom tumor/normalan organ. Da bi se prevazišao ovaj efekat, istraživači su pokušali da poboljšaju MAb klirans, korišćenjem različitih metoda koa što je sekundarno sredstvo kao i hemijske promene i promene naelektrisanja samog MAb.

Jasen-Pippo, et al, 1996, Pharmaceutical Research 13:102-107, otkriva da projektovanje strukture terapeutskih proteina, faktora stimulacije rekombinantne humane kolonije granulocita (PEG-G-CSF), koja rezultuje porastom stabilnosti i retencijomin vivobioaktivnosti kada su davana intraduodenalnim putem.

Tsutsumi, et al., 1997, Thromb Haemost. 77:168-73, otkrivaju eksperiment gdein vivotrombopoietska aktivnost polietilen glikol modifikovanog interleukina-6 (MPEG-IL-6), u kojem 54% od 14 lizinskih amino grupa EL-6 se kupluje sa PEG, je upoređivana sa prirodnim IL-6.

Yang et al., 1995, Cancer 76:687-94, otkrivaju da konjugacija polietilenglikola sa rekombinantnim humanim interleukinom-2 (IL-2) rezultuje jedinjenjem, polietilen glikol modifikovanim IL-2 (PEG-IL-2) koje zadržava aktivnost IL-2 in vitro i in vivo, ali pokazuje značajno produžen polu život cirkulacije.

R. Duncan i F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306, 296 (1994) prikazuju napore da se poboljša polu-život u plazmi asparaginaze u konjugaciji sa polietilen glikolom.

Međunarodna objava PCT Br. WO 99/03996 objavljena 28 januara 1999 u ime Regeneron Pharmaceuticals, Inc. i The Regents of The University of California opisuju modifikovane humane polipeptide koji imaju izbrisane regione baznih amino kiselina. Modifikovani humani polipeptidi su opisani tako da zadržavaju biološku aktivnost dok imaju smanjen afinitet za heparin i superiornu farmakokinetiku u životinjskom serumu u poređenju sa nemodifikovanim humanim.

SUŠTINA PRONALASKA

Ovaj pronalazak se odnosi na VEGF antagoniste sa poboljšanim farmakokinetičkim osobinama. Poželjno izvođenje je izolovani molekul nukleinske kiseline koji kodira fuzioni polipeptid sposoban da veže VEFG polipeptid koji se sastoji od (a) nukleotidne sekvence koja kodira VEGF receptorsku komponentu koja je operativno vezana za (b) nukleotidnu sekvencu koja kodira multimerizacionu komponentu, gde je VEGF receptorska komponenta samo VEGF receptorska komponenta fuzionog polipeptida i gde nukleotidna sekvenca (a) se sastoji suštinski od nukleotidne sekvence koja kodira amino kiselinsku sekvencu Ig domena 2 ekstracelularaog domena prvog VEGF receptora i nukleotidne sekvence koja kodira amino kiselinsku sekvancu Ig domena 3 ekstracelularnog domena drugog VEGF receptora.

U daljem izvođenju, izolovana nukleinska kiselina prvog VEFG receptora je Fltl.

U daljem izvođenju, izolovana nukleinska kiselina drugog VEGF receptora je FM.

U još jednom izvođenju, izolovana nukleinska kiselina drugog VEGF receptora je Flt4

U drugom poželjnom izvođenju, nukleotidna sekvenca kodira Ig domen 2 ekstracelularnog domena prvog VEGF receptora je ispred nukleotidne sekvence koja kodira Ig domen 3 ekstracelularnog domena drugog VEGF receptora.

U još jednom poželjnom izvođenju, nukleotidna sekvenca, kodira Ig domen 2 ekstracelularnog domena prvog VEGF receptora je iza nukleotidne sekvence koja kodira Ig domen 3 ekstracelularnog domena drugog VEGF receptora.

U poželjnom izvođenju pronalaska, multimerizaciona komponenta se sastoji od imunoglobulinskog domena.

U još jednom izvođenju, imunoglobulinski domen je izabran od grupe koja se sastoji od Fc domena IgG, teškog lanca IgG i lakog lanca IgG.

Poželjna izvođenja uključuju izolovani molekul nukleinske kiseline koji se sastoji od nukleinske sekvence koja kodira modifikovani Fltl receptor fuzionog polipeptida, gde region nukleinske kiseline koji kodira je izabran iz grupe koju čine

(a) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 13A-13D; (b) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 14A-14C; (c) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 15A-15C; (d) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 16A-16C; (e) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 21A-21C; (f) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 22A-22C; (g) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 24A-24C; i (h) nukleotidna sekvenca, kao rezultat degeneracije genetičkog koda, koja se razlikule od nukleotidnih sekvenca (a), (b), (c), (d), (e), (f) ili (g) i koja kodira molekul fuzionog polipeptida koji ima biološku aktivnost modifikovanog Fltl receptora fuzionog proteina.

U daljem izvođenju pronalaska, fuzioni polipeptid je kodiran gore opisanim izolovanim molekulom nukleinske kiseline.

Poželjno izvođenje je kompozicija sposobna da veže VEGF molekul da bi nastao nefunkcionalni kompleks koji sadrži multimer fuzionog polipeptida.

Takođe poželjna je kompozicija kada je multimer dimer.

U još jednom izvođenju, kompozicija je u nosaču.

Drugo izvođenje je vektor koji se sastoji od gore opisanih molekula nukleinske kiselina i uključuje ekspresioni vektor koji se sastoji od opisanih molekula nukleinske kiseline gde molekul nukleinske kiseline je operativno vezan za ekspresionu kontrolnu sekvencu.

Druga uključena ostvarenja su sistem domaćin-vektor za proizvodnju fuzionog polipeptida koji se sastoji od ekspresionog vektora, u pogodnoj ćeliji domaćinu; sistem domaćin-vektor u kojem je pogodna ćelija domaćin bakterijska ćelija, ćelija kvasca, ćelija insekta ili ćelija sisara; sistem domaćin-vektor gde je E. Coli pogodna ćelija domaćin; sistem domaćin-vektor gde je COS ćelija pogodna ćelija domaćin; sistem domaćin-vektor gde je CHO ćelija pogodna ćelija domaćin.

Drugo izvođenje pronalaska je postupak dobijanja fuzionog polipeptida koji se sastoji od ćelija koje rastu sistema domaćin-vektor pod uslovima koji dozvoljavaju dobijanje fuzionog polipeptida i izolovanje tako dobijenog fuzionog polipeptida.

Dodatna izvođenja uključuju fuzioni polipeptid kodiran sekvencom nukleinske kiseline prikazane na slici 10A-10D ili slici 24A-24C, koja je modifikovana acetilacijom ili pegilacijom gde je acetilacija postignuta sa bar 100-strukim molarnim viškom reagensa za acetilovanje ili kada je acetilacija postignuta sa molarnim viškom reagensa za acetilaciju koji se kreće od 10-strukog molarnog viška do oko 100-strukog molarnog viška ili gde je pegilacija 10K ili 20K PEG.

Poželjno izvođenje uključuje postupak smanjenja ili inhibicije propuštanja plazme kod sisara koji se sastoji iz davanja sisaru gore opisanog fuzionog proteina, uključujući izvođenja u kojima je sisar čovek, i kada je fuzioni polipeptid acetilovan ili je fuzioni protein podvrgnut pegilaciji.

Dalja izvođenja su fuzioni polipeptid koji se specifično veže za VEGF ligand VEGF receptora.

Poželjno izvođenje pronalaska je postupak blokiranja rasta krvnih sudova kod ljudi koji se sastoji u davanju efikasna količine gore opisanog polipeptida.

Takođe je poželjan postupak inhibicije ligandne aktivnosti VEGF receptora kod sisasra koja se sastoji iz davanja sisaru efikasna količine gore opisanog fuzionog polipeptida.

Poželjna izvođenja prema ovom postupku su ona kada je sisar čovek.

Dalja izvođenja prema ovom postupku uključuju smanjenje ili prevenciju rasta tumora kod ljudi; smanjenje ili prevenciju edema kod ljudi; naročito kada je edem, edem mozga; smanjenje ili prevenciju nastanka ascita kod ljudi, naročito kada je ascit, ascit u vezi sa kancerom jajnika.

Poželjna izvođenja pronalaska uključuju fuzioni polipeptid sposoban da veže VEGF polipeptid koji se sastoji od (a) VEFG receptorske komponenete operativno vezane za (b) multimerizacionu komponentu, gde je VEGF receptorska komponenta je samo VEGF receptorska komponenta u fuzionom polipeptidu i suštinski se sastoji od amino kiselinske sekvence Ig domena 2 ekstracelularnog domena prvog VEGF receptora i amino kiselinske sekvence Ig domena 3 ekstracelularnog domena drugog VEGF receptora.

U daljem izvođenju fuzionog polipeptida, prvi VEGF receptor je Fltl.

U još daljem izvođenju fuzionog polipeptida, drugi VEGF receptor je Flkl.

Još jedno izvođenje fuzionog polipeptida je ono u kome drugi VEGF receptor je Flt4.

Poželjna izvođenja uključuju fuzioni polipeptid gde amino kiselinske sekvence Ig domena 2 ekstracelularnog domena prvog VEGF receptora je ispred amino kiselinske sekvence Ig domena 3 ekstracelularnog domena drugog VEGF receptora i fuzioni polipeptid gde amino kiselinska sekvenca Ig domena 2 ekstracelularnog domena prvog VEGF receptora je iza aminokiselinske sekvence Ig domena 3 ekstracelularnog domena drugog VEGF receptora.

U još jednom izvođenju, fuzioni polipeptid multimerizacionih komponenti se sastoji od imunoglobulinskog domena koji obuhvata izvođenje gde imunoglobulinski domen je izabran od grupe koja se sastoji od Fc domena IgG, teškog lanca IgG i lakog lanca IgG.

Poželjna izvođenja uključuju fuzioni polipeptid koji se sastoji od amino kiselinske sekvence modifikovanog Fltl receptora, gde je amino kiselinska sekvenca izabrana od grupe koju čine (a) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 13A-13D; (b) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 14A-14C; (c) amino kiselinska sekvenca prikazanea na slici 15A-15C; (d) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 16A-16D; (e) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 21A-21C; (f) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 22A-22C; (g) amino kiselinska sekvenca prikazana na slici 24A-24B.

Drugo poželjno izvođenje je postupak smanjenja ili inhibicije propuštanja plazme kod sisara koji se sastoji od davanja sisaru gore opisanog fuzionog polipeptida.

Alternativno poželjno izvođenje je postupak inhibicije ligandne aktivnosti VEGF receptora kod sisara koji se sastoji od davanja sisaru efikasne količine gore opisanog fuzionog polipeptida.

Kratak opis slika nacrta

Slika 1. IEF gel analiza nemodifikovanih i acetilovanih Fltl(l-3)-Fc proteina. Nemodifikovan Fltl(l-3)-Fc protein ne može da uđe u gel zbog njegovog >9.3 pl, dok acetilovani Fltl(l-3)-Fc mogu da uđu u gel i postignu ravnotežu na pl 5.2.

Slika 2. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc i acetilovanih Flt 1(1-3)-Fc proteina za ploče prevučene sa Matrigel<®->om. Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc proteini vezuju se obimno za komponente ekstracelularnog matriksa u Matrigel<®->u, dok se acetilovani Fltl(l-3)-Fc ne vezuju.

Slika 3. Vezivanje nemodifikovanih Fltl(l-3)-Fc, acetilovanih Fltl(l-3)-Fc i pegilovanih Fltl(l-3)-Fc u Biacor testu. Acetilovane (kolone 13-16), pegilovane (kolone 17-20) i tretirane heparinom Fltl(l-3)-Fc (kolone 21-24) su sve kompetitivne za Biacore čip -veza Fltl(l-3)-Fc za VEGF vezivanje u poređenju sa kontrolom (kolone 1-4) i irelevantnim proteinom (kolone 5-8). Javlja se da nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc (kolone 5-6) je samo delimično kompetitivn u Biacore čip-veza Fltl(l-3)-Fc za VEGF vezivanju. Međutim, ispiranje vezanih uzoraka sa 0.5 M NaCl (kolone 7-8) rezultuje profilom vezivanja koji je sličan modifikovanim oblicima Fltl(l-3)-Fc, ukazuje da nemodifikovani protein pokazuje ne-spsecifično vezivanje za čip koje može biti eliminisano ispiranjem sa solima.

Slika 4. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, acetilovanog Fltl(l-3)-Fc i pegilovanog Fltl(l-3)Fc za VEGF u ELISA testu. Oba proteina Fltl(l-3)-Fc, i pegilovani i acetilovani vežu se za VEGF sa afinitetom koji se bliži onom nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc.

Slika 5. Farmakokinetički profil nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, acetilovanog Fltl(l-3)-Fc i pegilovanog Fltl(l-3)-Fc. Balb/c miševima (23-28g) je injektovano subkutanozno 4mg/kg nemodifikovanog, acetilovanog i pegilovanog Fltl(l-3)Fc. Praćeno je propuštanje kod miševa u toku 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana i 3 dana posle injekcije proteina i serum je analiziran u standardnom ELISA testu napravljenom da bi se detektovao Fltl(l-3)Fc protein. Tmaxza sve Fltl(l-3)-Fc proteine je između vremenskih tačaka od 6 sati i 24 sata. Cmaxza različite proteine je kao što sledi: Nemodifikovani: 0.06 pg/ml-0.15 u.g/ml; acetilovani: 1.5f.ig/ml-4.0 pg/ml i pegilovani: približno 5pg/ml.

Slika 6A-6B. IEF gel analiza nemodifikovanih i delimično acilovanih Fltl(l-3)Fc proteina. Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein je nesposoban da uđe u gel zbog njegovog >9.3 pl, dok je većina delimično aeilovanih Fltl(l-3)-Fc uzoraka (30-100-struki višak uzoraka) bio u mogućnosti da migrira u gel i postine ravnotežu pl u opsegu između 4.55-8.43 u zavisnosti od stepena acilacije.

Slika 7. Vezivanje nemodifikovanih Fltl (l-3)-Fc i delimično aeilovanih Fltl(l-3)-Fc proteina za ploče prevučene sa Matrigel<®->om. S obzirom da irelevantni kontroli protein, rTe2-Fc, delimično acilovani Fltl(l-3)-Fc (uzorci u 20 i 30-ostukom višku) ne pokazuju bilo kakvo vezivanje za ploče prevučene sa Matrigel-om, dok ne-acetilovani Fltl(l-3)-Fc protein pokazuje značajno vezivanje. 10-ostruki višak uzorka pokazuje redukovano vezivanje, ali stepen acetilacije nije dovoljan da kompletno blokira vezivanje za komponente ekstracelularnog matriksa.

Slika 8. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc i delimično acilovaniog Fltl(l-3)-Fc u Biacore testu. Pri sub-stehiometrijskom odnosu (0.5 pg/ml ili nemodifikovanog Fltl(l-3) ili delimično acilovanog Fltl(l-3)-Fc nas. 0.2 |ig/ml VEGF), nema dovoljno Fltl(l-3)-Fc (ili modifikovanog ili delimično acetilovanog) u rastvoru da se kompletno veže VEGF. Na 1.0 ug/ml koji je otprilike stehiometrijski odnos 1:1, oba i nemodifikovan i delimično modifikovan Fltl(l-3)-Fc su bolje kompetitivni u vezivanju VEGF, ali još uvek je nedovoljno Fltl(l-3)Fc proteina (ili nemodifikovanog ili delimično modifikovanog) da kompletno zasite dostupni VEGF. Međutin na 5.0 u.g/ml, koji je nekoliko puta veći nego stehiometrijski odnos 1:1, oba i Fltl(l-3)-Fc i delimično acilovani Fltl(l-3)-Fc proteini su sposobni da zasite VEGF bez obzira na stepen acilacije.

Slika 9. Farmakokinetiči profil nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc i delimično acetilovanog Fltl(l-3)-Fc. Balb/c miševima (23-28g) je injektovano subkutanozno 4 mg/kg nemodifikovanog ili 10, 20, 40, 60 i 100-struki višak uzoraka delimično acetilovanog Fltl(l-3)-Fc-a (3 miša za nemodifikovani, 10, 20 i 40- struki višak uzoraka i 2 miša za 60 i 100-struki višak uzoraka). Praćeno je propuštanje kod miševa na 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana i 3 dana posle injekcije. Serum je analiziran ELISA testom kojim se otkriva Fltl(l-3)-Fc. Tmaxza sve Fltl(l-3)-Fc proteine je bio na vremenskoj tačci od 6 sati, ali Cmaxje bio kao što sledi: nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc: 0.06 pg/ml; 10-struki višak uzorka:-0.7 ug/ml, 20-struki višak uzorka-2 |ig/ml, 40-struki višak uzorka - 4ug/ml, 60-struki višak uzorka - 2|iig/ml, 100-struki višak uzorka - lpg/ml.

Slika 10A-10D. Nukleinska kiselina i izvedena amino kiselinska sekvenca Fltl(l-3)-Fc.

Slika11. Šematski dijagram strukture Fltl.

Slika 12A i 12B. Analiza hidrofilnosti amino kiselinske sekvence Ig domena 2 i Ig domena 3 Fltl.

Slika 13A-13D. Nukleinska kiselina i izvedena amino kiselinska sekvenca Muti: Fltl(1-3ab)-Fc.

Struktura 14A-14C. Nukleinska kiselina i izvedena amino kiselinska sekvenca Mut2: Fltl(2-3ab)-Fc.

Slika 15A-15C. Nukleinska kiselina i izvedena amino kiselinska sekvenca Muti: Fltl(2-3)-Fc.

Slika 16A-16D. Nukleinska kiselina i izvedena amino kiselinska sekvnca Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc.

Slika 17. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, mutantnog Fltl(l-3)-Fc sa izbrisanim osnovim regionom i Fltl(l-3)R_>Nmutantnog proteina u Biacore testu. Pri sub-stemometrijskom odnosu (0.25 pg/ml Fltl(l-3)-Fc nemodifikovanog, acetilovaniog ili generalno modifikovanog uzorka nas. 0.1 jug/ml VEGF), postoji nedovoljno Fltl(l-3)-Fc proteina da bi se blokiralo vezivanje VEGF za Fltl(l-3)-Fc imobiliziran na Biacore čipu. Pri 0.5fig/ml nemodifikovanog, acetilovanog ili generalno modifikovanog Fltl(l-3)-Fc proteina, stehiometrijski odnos je blizu 1:1 i postoji povećana sposobnost za blokiranje VEGF vezivanja za Biacore čip. Pri 1.0 pg/ml nemodifikovanog, acetilovanog ili generalno modifikovanog Fltl(l-3)-Fc proteina, koji su približno u stehiometrijskom odnosu 10:1, Fltl(l-3)-Fc proteini su u mogućnosti da blokiraju vezivanje VEFG za Biacore čip, ali nisu ekvivalentni. Nemodifikovani, acetilovani i Muti: Fltl(1-3AB)-Fc su suštinski jednaki u svojoj sposobnosti blokiranjaVEGF vezivanja, dok Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc je manje efikasan u blokiranju vezivanja.

Slika 18. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, Muti: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3ab)-Fc i Fltl(2-3) izmenjenih proteina za ploče prevučene sa Matrigel®-om. Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein veže se intenzivno za ta udubljenja, Mut3: Fltl(2-3)-Fc protein se veže nešto slabije, Muti: Fltl(l-3AB)-Fc protein se veže još slabije i Mut2: Fltl(2-3ab)-Fc protein pokazuje najbolji profil, vezujući se slabije nego bilo koji drugi izmenjeni protein. Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc glikozilacijom izmenjeni protein pokazuje samo marginalne koristi na Matrigelovom testu.

Slika 19. Vezivanje nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, Muti: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3ab)-Fc i Fltl(2-3) izmenjenih proteina u ELISA testu. Pri testiranim koncentracijama, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc, Muti: Fltl(1-3ab)-Fc, Mut2: Fltl(l-3)-Fc i Fltl(2-3) izmenjeni proteini vezuju slično

VEGF.

Slika 20. Farmakokinetički profili nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, Muti: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc i Fltl(2-3) izmenjenih proteina. Cmaxza ove reagense je kao što sledi: Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc - 0.15 pg/ml; 40 -ostruki molarni višak acetilovanog Fltl(l-3)-Fc - 1.5 p.g/ml; i Muti: Fltl(l-3AB)-Fc - 0.7 ul/ml.

Slika 21A-21C. Nukleotid i izvedena amino kiselinska sekvenca modifikovanog Fltl receptora označenog kao FltlD2.FlklD3.FcACl(a).

Slika 22A-22C. Nukleotid i izvedena amino kiselinska sekvenca modifikovanog Fltl receptora označenog kao FltlD2.VEGFR3D3. FcACl(a).

Slika 23. Test ekstracelularnog (ECM) matriksa. Rezultati ovog testa pokazuju da FltlD2.FlklD3.FcACl(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) proteini se znatno manje prijanjau na ECM-u u poređenju sa Fltl(l-3)-Fc proteinom.

Slika 24A-24C. Nukleotid i izvedena amino kiselinska sekvenca modifikovanog Fltl receptora koji je označen kao VEGFRlR2-FcACl(a).

Slika 25A-25C. Test fosforilacije. Pri 1.5 molarnom višku ili Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40) ili privremenog FlklD2FlklD3.FcACl(a) postoji kompletna blokada stimulacije receptora sa ova tri modifikovana Fltl receptora u poređenju sa kontrolnim medijumom. Nasuprot, privremeni FlklD2VEGFR3D3.FcACl(a) ne pokazuje značajnu blokadu pri ovom molarnom višku, u poređenju sa VEGF pozitivnom kontrolom. Slični rezultati su viđeni na Slici 25B, gde su modifikovani Flt receptori u 3-ostrukom molarnom višku u odnosu na VEGF 165 ligand. Na slici 25C, gde su modifikovani receptori Fltl u 6-strukom molarnom višku u odnosu na VEGF 165 ligand, privremeni FlklD2VEGFR3D3.FcACl(a) može biti pokazano da delimično blokira VEGF165 -indukovanu stimulaciju receptora na površini ćelije.

Slika26A-26B. Test fosforilacije. Detekcijom Western-ove mrlje tirozin fosforilovanog VEGFR2(Flkl) pomoću ligandne stimulacije VEGF165 pokazuje da receptori na površini ćelije nisu fosforilovani u odnosu na uzorke koji imaju VEGF165 prethodno inkubiran sa 1 i 2 strukom molarnim viškom (Slika 26A) ili 3 i 4-ostruki molarni višak (Slika 26B) ili privremenog FlklD2FlklD3.FcACl(a), stabilnog FlklD2FlklD3.FcACl(a) ili privremeni VEGFRlR2-FcACl(a). Pri svim ovde testiranim koncentracijama modifikovanog Fltl receptora, postoji kompletno vezivanje VEGF165 liganda u toku preinkubacije, što rezultuje u nedetektiblnoj stimulaciji receptora na površini ćelije ne vezivanjem VEGF 165 u poređenju sa kontrolnim medijumom.

Slika 27. MG/R2 Test ćelijske proliferacije. Sledeći modifikovani Flt receptori Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) i FltlD2.VEGFR3De.FcACl(a), sa irelevantnim receptorom značen kao Tie2-Fc kao negativna kontrola, su titrovani sa 40 nM do 20pM i inkubirani na ćelijama u toku 1 sata na 37°C. Humani rekombinantni VEGF 165 u definisanom mediju je zatim dodat u sve otvore u koncentraciji od 1.56 nM. Negativna kontrola, receptor Tie2-Fc ne blokira VEGF 165-indukovanu proliferaciju ćelija pri bilo kojoj koncentraciji s obzirom da FltlD2.FlklD3.FcACl(a) blokira 1.56 nM VEGF 165 sa polovinom maksimalne doze 0.8 nM. Fltl(l-3)-Fc i FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) su manje efikasni u blokiranju VEGF 165 u ovom testu sa polovinom maksimalne doze od~2 nM. Sam VEGF165 daje apsorbancu koja se očitava kao 1.2 jedinice i pozadina je 0.38 jedinica absorbance.

Slika 28. Biacore test stehiometrije vezivanja. Stehiometrija vezivanja je izračunata kao molarni odnos vezanih VEGF 165 u odnosu na imobilizirane FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a), korišćenjem faktora konverzije od 1000 RU ekvivalenata do 1 ng/ml. Rezultati ukazuju na steriohemiju vezivanja jednog VEGF165 dimernog molekula po jednom FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a) molekulu.

Slika 29 i slika 30. Stereohemija ekskulzione hromatografije prema veličini. FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a) pri koncentraciji od lnM (procenjeno da je 1000 puta viša nego KD za FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a)/VEGF165 interakcije) su pomešani sa različitim koncentracijama VEGF165. Posle inkubacije, merena je koncentracije slobodnog FltlD2FlklD3.FcACl(a) u rastvoru. Podatci pokazuju da dodavanje 1 nM VEGF 165 u FltlD2FlklD3.FcACl(a) rastvor potpuno blokira FltlD2FlklD3.FcACl(a) vezivanjem za VEGF165 površinu. Ovaj rezultat sugeriše stehiometriju vezivanja jednog VEGF 165 molekula na jedan FltlD2FlklD3.FcACl(a) molekul.

Slika 31. Eksluziona hromatografija prema veličini (SEC) pri prirodnim uslovima. Maksimum #1 predstavlja FltlD2FlklD3.FcACl(a) /VEG165 kompleks i maksimum #2 predstavlja nevezani VEGF 165. Eluirane frakcije između 1.1 i 1.2 ml su sakupljene i guanidinijum hidrohlorid (GuHCl) je dodat do krajnje koncentracije 4.5 M da bi kompleks disosovao.

Slika 32. Ekskluziona hromatografija prema veličini (SEC) pri uslovima disocijacije. Da bi se odvojile komonente kompleksa receptor-ligand i odredio njihov molarni odnos, 50 ixl disosovanog kompleksa je naneseno na Superose 12 PC 3.2/30 ekvilibrisanu sa 6M GuHCl i eluiranu. Maksimum #1 predstavlja FltlD2FlklD3.FcACl(a) i maksimum #2 predstavlja VEGF165.

Slika 33, slika 34 i slika 35. Ekskluziona hromatografija prema veličini (SEC) sa raseivačem svetla u sklopu sistema. Kolona za ekskluzionu hromatografiju prema veličini sa MiniDovvn raseivačem svetlosti u okviru sistema kao detektorom (Wyatt Technology, Santa Barbara, Califoraia) i detektorima indeksa refrakcije (Schimadzu, Kyoto, Japan) je korišćena da bi se odredila molekulska masa (MT) kompleksa receptor-ligand. Kao što je prikazano na slici 33, eluacioni profil pokazuje dva maksimuma. Maksimum #1 predstavlja kompleks receptor-ligand i maksimum #2 predstavlja nevezani VEGF 165. MT je izračunata iz LS i RI signala. Isti postupak je korišćen da se odredi MT individualnih komponenti kompleksa receptor ligand. Rezultati ovih određivanja su kao što sledi: MT za FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165 kompleks ima poziciju maksimuma na 157 300 (Slika 33), MT VEGF 165 ima poziciji maksimuma na 44 390 (Slika 34) i MT R1R2 na maksimumu je 113 300 (Slika35).

Slika 36. Mapiranje peptida i test glikozilacije. Disulfidne strukture i glikozilaciona mesta u FltlD2FlklD3.FcACl(a) su određena postupkom mapiranja peptida. Postoji ukupno deset cisteina u FltlD2FlklD3.FcACl(a) ; njih šest pripada Fc regionu. Cys 27 je disulfidno vezan za Cys76. Cysl21 je disulfidno vezan za Cys 182. Prva dva cisteina u Fc regionu (Cys211 i Cys214) grade intramolekulsku disulfidnu vezu sa ista dva cisteina u drugom Fc lancu. Međutim, ne može biti određeno da li se disulfidna veza javlja između istih cisteina (na primer, Cys211 za Cys211) ili između Cys211 i Cys214. Cys216 je disulfidno vezan za Cys306. Cys 352 je disulfidno vezan za Cys410.

Postoji pet mogućih N-vezanih glikozilacionih mesta u FUTD2FlklD3.FcACl(a) i pronađeno je da su glikozilovani u različitom stepenu. Kompletna glikolizacija je primećena kod Asn33, Asnl93 i Asn282. Delimična glikozilacija je primećena kod Asn65 i Asnl20. Mesta glikozilacije su istaknuta podvlačenjem na slici.

Slika 37. Farmakokinetika Flt(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) i VEGFRlR2-FcACl(a). Balb/c miševima je injektovano subkutanozno 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) dobijenog privremenom ekspresijom iz CHO, FltlD2FlklD3.FcACl(a) dobijen stabilnom ekspresijom iz CHO i VEGFRlR2-FcACl(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO. Praćeno je propuštanje kod miševa u toku 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana, 3 dana i 6 dana posle injekcije. Serum je analiziran pomoću ELISA da bi se detektovali Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a). Tmax za Fltl(l-3)-Fc (A40) je bio na 6 sati dok Tmax za prolazni i stabilni FltlD2FlklD3.FcACl(a) i privremeni VEGFRlR2-FcACl(a) je bio 24 sata. Cmax za Fltl(l-3)-Fc (A40) je bio 8ug/ml, za oba privremena (FltlD2FlklD3.FcACl(a) i VEGFRlR2-FcACl(a)) Cmax je bio 18 fig/ml i Cmax za stabilni VEGFRlR2-FcACl(a) je bio30 ug/ml.

Slika 38. Farmakokinetika Flt(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) i FltlD2.VEGFRlR2-FcACl(a). Balb/c miševima je injektovano subkutanozno 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) dobijenog privremenom ekspresijom iz CHO i FltD2.VEGFR3D3.FcACl(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO. Praćeno je propuštanje kod miševa u toku 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 i 20 dana posle injekcije. Serum je analiziran pomoću ELISA da bi se detektovali Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Fltl(l-3)-Fc (A-40) ne može više biti detektovan u serumu posle 5 dana, a FltlD2.FlklD3. FcACl(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcAC3(a) su detektovam u toku 15 dana ili kasnije.

Slika 39. Sposobnost FltlD2.FlklD3. FcACl(a) da inhibira in vivo rast HT-1080 tumora fibrosarkoma. Svakog drugog dana ili 2 puta nedeljno tretirani su SCID miševi sa 25 mg/kg FlklD2.FlklD3.FcACl(a) značajno smanjujući rast subkutanoznog HT-1080 tumora fibrosarkoma.

Slika 40. Sposobnost FltlD2.FlklD3.FcACl(a) da inhibira in vivo rast C6 tumora glioma. Svakog drugog dana ili 2 puta nedeljno tretiranje miševa sa

FlkD2.FlklD3.FcACl(a) značajno smanjuje rast subkutanoznog C6 tumora glioma pri niskim dozama kao 2.5 mg/kg.

Slika 41.VEGF indukovana hiperpermeabilnost uterusa. PSMG je injektovan subkutanozno (5 IU) da bi izazvao ovulaciju kod predpubertetskih ženskih pacova što je rezultovalo dizanjem estradiola posle 2 dana koji je u navratu izazvao indukciju VEGF u materici. Ova indukcija rezultuje hiperpermeabilnošću materice i povećavanjem vlažnosti uterusa. Subkutanoznom injekcijom 25 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A-40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) 1 sat posle injekcije PMSG rezultuje inhibicijom oko 50% porasta težine vlažnosti uterusa.

Slika 42A-42B.Procena angiogeneze žutog tela pomoću progesterona kao obeleživača. PMSG je injektovan subkutanozno (5 IU) da bi se indukovala ovulacija kod predpubertetskih ženskih pacova, što rezultuje potpuno funkcionalnim žutim telom koje sadrži gustu mrežu krvnih sudova koji luče progesteron u krvotok da bi pripremili matericu za oplodnju. Indukovana angiogeneza žutog tela zahteva VEGF. Nivo mirovanja progesterona je oko 5 ng/ml i može biti indukovan do 25-40 ng/ml posle PMSG-a. Subkutanoznom injekcijom 25 mg/kg ili 5 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40) ili FltlD2.FlklD3.FcACl(a) na 1 sat posle PMSG injekcije rezultuje u kompletnoj inhibiciji indukcije progesterona u toku 4 dana.

Detaljni opis pronalaska

Postoji dugoročni probelm u stanju tehnike za proizvodnjom antagonista zasnovanog na VEGF receptorima koji ima farmakokinetički profil koji je odgovarajući za uzimanje u obzir pri razmatranju antagonista kao terapeutskog kandidata. Prijavioci ovde opisuju, po prvi put, himerni polipeptidni molekul, sposoban da antagonizira VEGF aktivnost, koji pokazuje poboljšane farmakokinetičke osobine u poređenju sa drugim poznatim antagonistima zasnovanim na VEGF receptorima. Ovde opisani himerni polipeptidni molekuli tako obezbeđuje po prvi put odgovarajuće molekule za upotrebu u terapiji kod kojih antagonizam VEGF daje željeni rezultat.

Ovaj pronalazak obezbeđuje nove himerne molekule polipeptida nastale spajanjem modifikovanih ekstracelularnih domena za vezivanje liganada Fltl receptora do Fc regiona IgG.

Ekstracelularni domen vezivanja liganada je definisan kao deo receptora koji, u prirodnoj konformaciji u ćelijskoj membrani je orijentisan ekstracelularao gde može kontaktirati sa svojim srodnim ligandom. Ekstracelularni domen za vezivanje liganda ne uključuje hidrofobne amino kiseline u vezi sa transmembranskim domenom receptora ili bilo koje amino kiseline u vezi sa intracelularnim domenom receptora. U opšte, intracelularni ili citoplazmatičan domen receptora je uglavnom sastavljen od pozitivno naelektrisanih ili polarnih amino kiselina (tj. lizin, arginin, histidin, glutaminska kiselina, asparaginska kiselina). Prethodnih 15-30, pretežno hidrofobnih ili nepolarnih amino kiselina (tj. leucin, valine, izoleucin i fenilalanin) čine transmembranski domen. Ekstracelularni domen se sastoji od amino kiselina koje prethode zastupljenim hidrofobnim transmembranskim amino kiselinama. Uglavnom transmembranski domen su zaobišle pozitivno naelektrisane ili polarne amino kiseline kao što su lizin i arginin. von Heijne je objavio detaljna pravila koja se obično koriste ljudi iz struke kada određuju koja amino kiselina datog receptora pripada ekstracelularnim, transmembranskim ili intracelularnim domenima (videti von Heijne, 1995, BioEssavs 17:25-30). Alternativno, vvebsite na internetu kao što je http:// ulrec3. unil. ch/ software/ TNPRED form. htlm. je postao dostupan da obezbedi hemičarima, koji se bave proteinima, informacije o postavljanju predviđanja u vezi sa proteinskim domenima.

Ovaj pronalazak obezbeđuje konstrukciju molekula nukleinske kiseline koji kodiraju himerne polipeptidne molekule koji su umetnuti u vektor koji je sposoban da vrši ekspresiju molekula himernog polipeptida kada je uneti u odgovarajuću ćeliju domaćina. Odgovarajuća ćelija domaćina uključuje, ali nije ograničena na, bakterijske ćelije, ćelije kvasca, ćelije insekata i ćelije sisara. Bilo koji od postupaka poznatih ljudima iz struke za umetanje DNA fragmenta u vektor može se koristiti da se konstruiše ekspresioni vektor koji kodira molekule himernih polipeptida pod kontrolom transkripciono/translatornog kontrolnog signala. Ovi postupci mogu uključivati in vitro rekombinantne DNA i sintetičke tehnike i in vivo rekombinacije (genetičke rekombinacije) (videti Sambrook, et al., Molecular Cloning, A Laboratorv Manual, Cold Spring Harbor Laboratorv; Current Protocols in Molecular Biologv, Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY).

Ekspresija molekula nukleinske kiseline koji kodiraju molekule himernih polipeptida, može se regulisati drugom sekvencom nukleinske kiseline tako da dođe do ekspresije molekula himernog polipeptida u domaćinu transformisanom sa rekombinanatnim DNA molekulom. Na primer, ekspresija molekula himernog polipeptida ovde opisana može biti kontrolisana bilo kojim elementom promoter/produživač pozantaim u stanju tehnike. Promoteri koji mogu biti korišćeni u kontroli ekspresije molekula himernih polipeptida uključuju, ali nisu ograničeni na, dugo termmalno ponavljanje kao što je opisano kod Squinto et al (1991., Cell 65:1-20); SV40 rani region promotera (Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290: 304-310), CMV promoter, M-MuLV 5' terminalno ponavljanje promotera u 3' dugačkom terminalnom ponavljanju Rous sarcoma virus (Yamamoto,. et al, 1980, Cell 22: 787-797), promoter herpes timidin kinaze (Wagner et al., 1981, Pore. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445), regulatornu sekvencu gena za metalotionin (Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42); prokariotski ekspresioni vektor kao što je promoter p-laktamaze (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) ili tac promoter (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25, videti takođe "Useful proteins from recombinant bacteria" u Scientific American, 1980, 242:74-94); elemente promotera iz kvasca ili druge gljive kao što je Gal 4 promoter, ADH (alkohol dehidrogenazni) promoter, PGK (fosfoglicerol kinaza) promoter, promoter alkalne fosfataze i sledeći životinjski regioni transkripcione kontrole, koji ispoljavaju specifičnosti tkiva i korišćene su kod transgenskih životinja: kontrolni region gena elastaze I koji je aktivan kod zrnastih ćelija pankreasa (Swift et al, 1984, Cell 38: 639-646; Oraitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); kontroli region gena za insulin koji je aktivan u beta ćelijama pankreasa (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122) region kontrole gena za imunoglobulin koji je aktivan kod limfnih ćelija (Grosschedl et al, 1984, Cell 38:647-658; Adames et al., 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7;1436-1444), kontrolni region virusnog tumora mlečne žlezde kod miša, koji je aktivan u testisnim, grudnim, limfoidnim i mlečnim ćelijama (Leder et al., 1986, Cell 45:485-495), kontrolni region gena za albumin koji je aktivan u jetri (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276), kontrolni region gena za alfa-fetoprotein, koji je aktivan u jetri (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer et al, 1987, Science 235:53-58); kontrolni region gena za alfa 1-antitripsin koji je aktivan u jetri (Kelsey et al, 1987, Genes and Devel. 1:161-171, kontrolni region gena za beta-globulin koji je aktivan u mijeloidnim ćelijama (Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al., 1986, Cell 46:89-94); kontrolni region gena za osnovni protein mijelina koji je aktivan u oligodendrocitnim ćelijama u mozgu (Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712), kontrolni region gena za miozinski laki lanac-2 koji je aktivan u skeletnim mišićima (Shani, 1985, Nature 314:283-286) i kontrolni region gena za lučenje gonadotropnog hormona koji je aktivan u hipotalamusu (Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378).

Prema tome, prema pronalasku, ekspresiom vektori sposobni da se repliciraju u bakterijskom ili eukariotskom domaćinu koji sadrži molekul himernog polipeptida kodiran od strane ovde opisane nukleinske kiseline, se koriste da se transfektuje domaćin i zatim direktnom ekspresijom takve nukleinske kiseline da se dobiju molekuli himernog polipeptida, koji se mogu izolovati u biološki aktivnom obliku. Kao što je ovde korišćeno biološki aktivni oblik uključuje oblik koji je sposoban da se veže za VEGF.

Ekspresioni vektor sadrži ovde opisane molekule himerne nukleinske kiseline koji mogu biti identifikovane pomoću tri opšta prilaza: (a) DNA-DNA hibridizacija, (b) prisustvo ili nedostatak funkcija marker gena i (C) ekspresijom umetnutih sekvenci. U prvom prilazu, prisustvo stranog ubačenog gena u ekspresioni vektor može biti detektovan DNA-DNA hibridizacijom, korišćenjem proba koje sadrže sekvence koje su homologe umetnutim sekvencama himernih polipeptida. U drugom prilazu, sistem rekombinanti vektor/domaćin može biti identifikovan i odabran na osnovu prisustva ili nedostatka izvesnih funkcija marker gena (na pr., aktivnosti timidin kinaze, otpornosti na antibiotike, transformacije fenotipa, okulzione telesne formacije kod bakulovirusa itd.) izazvani umetanjem stranih gena u vektor. Na primer, ako DNA sekvenca himernog polipeptidnog molekula je umetnuta između sekvence marker gena vektora, rekombinanti sadrže umetak koji može biti identifikovan odsustvom funkcije marker gena. U trećem prilazu, rekombinantni ekspresioni vektor može biti identifikovan rekombinantnim testiranjem proizvoda ekspresije stranog gena. Takvi testovi mogu biti zasnovani, na primer, na fizičkim ili funkcionalnim osobinama molekula himernih polipeptida.

Ćelije prema ovom pronalasku mogu privremeno ili poželjno je konstitutivo i permanentno da vrše ekspresiju himernih polipeptidnih molekula.

Himerni polipeptidni molekuli mogu biti prečišćeni bilo kojom tehnikom koja omogućava posle toga nastanak stabilnog, biološki aktivnog himernog polipeptidnog molekula. Na primer, i ne samo kao ograničenja, faktori mogu biti izolovani iz ćelije ili kao rastvorni proteini ili kao inkluziona tela, iz kojih mogu biti ekstrahovani kvantitativno sa 8 M guanidinijum hidrohloridom i dializom (videti na primer, US Patent No. 5,663, 304). U cilju daljeg prečišćavanja faktora, mogu se koristiti konvencionalna jonoizmenjivačka hromatografija, hromatografija sa hidrofobnim interakcijama, hromatografija sa reversnom fazom ili gel filtracija.

U jednom izvođenju pronalaska, nukleotidna sekvenca koja kodira prvu komponentu je ispred nukleotidne sekvence koja kodira drugu komponentu. U drugom izvođenu pronalaska, nukleotidna sekvenca koja kodira prvu komponentu je iza nukleotidne sekvence koja kodira drugu komponentu. Dalja izvođenja prema pronalasku mogu se pripremiti na način da prva, druga i treća fuziona polipeptidna komponenta su razmeštene. Na primer, ako nukleotidna sekvenca koja kodira prvu komponentu je obeležena sa 1, nukleotidna sekvenca koja kodira drugu komponentu je označena sa 2 i nukleotidna sekvenca treće komponente je obeležena sa 3, tada raspored komponenti na izolovanoj nukleinskoj kiselini prema pronalasku čitana od 5' do3' može biti bilo koja od sledećih šest kombinacija: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; ili 3,2,1.

Prikazani pronalazak takođe ima dijagnostičke i terapeutske mogućnosti. U specifičnom izvođenju pronalaska, postupak detekcije odstupanja u funkciji ili ekspresiji molekla himernih proteina može biti korišćen u diagnozi poremećaja. U drugom izvođenju, manipulacija molekulima himernih polipeptida ili agonistima ili antagonistima koji se vezuju za molekule himernog proteina mogu biti korišćene u lečenju bolesti. U daljem izvođenju, molekuli himernih polipeptida koji se koriste kao sredstvo za blokiranje sredstva za vezivanje za njegov cilj.

Kroz niz primera, ali ne ograničenja, postupak prema pronalasku može biti korisan u lečenju kliničkih stanja koji se karakterišu vaskularnom permeabilnošću, edemom ili upalom kao što su edem na mozgu u vezi sa povredom, kapi ili tumorom; edem u vezi sa bolestima upale kao što je psorijaza i artritis, uključujući reumatoidni artritis; asmu; u opšte edeme u vezi sa opekotinama; asciti i pleuralne perfuzije u vezi sa tumorima, upalama ili povredama; hronične upale vazdušnih puteva; sindrom propuštanja kapilara; sepsa; bolest bubrega u vezi sa povećanim propuštanjem proteina; poremećaji oka kao što su makularna degeneracija u vezi sa godinama i diabetska retinopatija.

Analiza amino kiselinske sekvence Fltl(l-3)-Fc otkriva prisustvo neuobičajeno velikog broja (46) baznih amino kiselinskih ostataka lizina. IEF analiza Fltl(l-3)-Fc pokazuje da ovaj protein ima pl veći od 9.3, potvrđujući predviđanje daje veoma bazan protein. Postavljena je hipoteza da bazna priroda Fltl(l-3)-Fc proteina uzrokuje njegovo vezivanje za komponente ekstracelularnog matriksa i da ova interakcija može biti uzrok ekstremno kratkog poluživota u serumu Fltl(l-3)-Fc kada se injektuje u miša. U cilju testiranja ove hipoteze, Fltl(l-3)-Fc protein je acetilovan na lizinskom ostatku da bi se smanjilo bazno naelektrisanje. Acetilovani Fltl(l-3)-Fc je zatim testiran u analizama opisaniminfra.

Sledeći primeri su ponuđeni kao brojne ilustracije a ne kao ograničenja.

PRIMERI

Primer 1: Ekspresija Fltlf l- 3)- Fc proteina u CHO Kl ćelijama

Korišćenjem standardnih tenhika molekulske biologije (videti na pr., Molecular Cloning, A Laboratorv Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratorv), Current Protocols in molecular Biologv (Eds. Ausubel, et al., Green Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY), gen koji kodira Fltl(l-3)-Fc je umetnut u ekspresioni vektor pEE14.1 (Lonza Biologics, plc) na višestrukom mestu kloniranja iza CMV promotera. CHO Kl ćelije su transfektovane sa konstruisanim pEE14.1/Fltl(l-3)-Fc DNA pomoću lipofektamina (Gaithersburg, MD). Transfektovane CHO Kl ćelije su rasle u DMEM-u (JRH, Kansas City, MO) bez glutamina koji sadrži 25 pM metionin sulfoksimina (MSX) od Sigma Ine, St. Louis, MO i dobijeni su visoko rekombinantni proteinski ekspresori proveravanjem CHO Kl ćelijskog supernatanta na oko 100 ručno uzetih kolonija izolovanih korišćenjem standardog imuno testa koji hvata i detektuje humani Fc. Izabrani ručno uzeti klonovi su amplifikovani u prisustvu 100 uM MSX što je praćeno sa drugim postupkom proveravanja ampliflkovanih klonova. Klon sa najvećom produkcijom rekombinantne Fltl(l-3)-Fc proteina ima specifičnu produktivnost 55 pg/ćeliji/dnevno.

Izabrani klon je raširen u 225 cm T-Balon (Corning, Acton, MA) a zatim u 8.5 1 valjkaste flaše (Corning, Acton, MA) korišćenjem medijuma za kultivaciju ćelija opisanog kaosupra.Ćelije su uklonjenje iz valjkastih boca standardnom tripsinizacijom i stavljene su u medium od 3.5 1 suspenzije. Suspenzioni medij um se sastoji od medijuma ISCHO bez glutamina (Irving Scientific, Santa Ana, CA) koji sadrži 5% seruma goveđeg fetusa (FBS od Hyclone Labs, Logan, UT), 100 um MSX i GS dodatka (JRH Scientific, Kansas City, MO) u 5 ml Celligen bioreaktoru (New Brunsvvick Scientific, New Brunsvvick, NJ) pri gustini od 0.3 x IO<6>ćelija/ml. Pošto ćelije dostignu gustinu 3.6 x IO<6>/ml i kada su se adaptirale na suspenziju, premeštene su u 60 1 bioreaktor (ABEC, Allentovra, PA) pri gustini od 0.5 x IO<6>ćelija/ml u 20 1 medijuma ISCHO sa 5% serumom goveđeg fetusa. Posle dva dana dodato je još 20 1 ISCHO + 5% seruma goveđeg fetusa u bioreaktor. Omogućeno je da ćelije rastu još dva dana dok ne dostignu krajnju gustinu od 3.1 x IO<6>ćelija/ml i krajnja koncentracija Fltl(l-3)-Fc pri sakupljanju bila je 95 mg/l. Pri sakupljanju ćelije su uklonjene pomoću ceđenja sa tangencionalnim protokom sa 0.45 pm Prostak Filters (Millipore, Ine, Bedford, MA).

Primer 2: Prečišćavanje Fltl( l- 3)- Fc proteina dobijenog iz CHO Kl

ćelija

Fltl(l-3)-Fc protein je inicijalno prečišćen afinitetnom hromatografljom. Korišćena je proteinska A kolona da veže sa visokom specifičnošću, Fc deo molekula. Ovako afinitetno prečišćen protein je zatim koncentrovan i propušten kroz SEC kolonu. Zatim je protein eluiran u formulaciji pufera. Sledi opi ovog postupka do detalja.

Materijali i metodi

Sve hemikalije su dobijene od J.T. Baker, Phillipsburg, NJ sa izuzetkom PBS, koji je nabavljen kao 10x koncentrat od Life Technologies, Gaithersburg, MD. Preparativne smole protein A sa brzim protokom i Superdex 200 su nabavljene od Pharmacia-e, Piscataway, NJ. Oprema i membrane za koncentraciju proteina su nabavljene od Millipore-a, Bredford, MA.

Približno 401 proceđenog na 0.45 pm CHO kondicioniranog medijuma koji sadrži Fltl(l-3)-Fc protein je naneseno na 290 ml kolonu proteina A sa brzim protokom (10 cm-prečnik) koja je ekvilibrisana sa PBS. Kolona je isprana sa PBS-om koji sadrži 350 mM NaCl i 0.02% CHAPS i vezani protein je eluiran sa 20 mM limunskom kiselinom koja sadrži 10 mM Na2HP04. Sakupljen je jedan maksimum pri eluiranju i pH je podignut do neutralnog sa IM NaOH. Frakcija eluata je koncentrovana do približno 9 mg/ml korišćenjem 10K membrana od regenerisane celuloze za ceđenje sa tangencijalnim protokom i mešanjem ćelijskog koncentrata. Da bi se uklonili agregati i druga onečišćenja, koncentrovani protein je nanesen na kolonu spakovanu sa smolom Superdex 200 preparativne čistoće (10 cm x 55 cm) u PBS-u koji sadrži 5% glicerola. Glavni maksimumi frakcija su objedinjeni, sterilnno proceđeni, napravljeni alikvoti i čuvani na -80°C.

Primer 3: Acetilacija Fltl( l- 3)- Fc proteina

Dva miligrama Fltl(l-3)-Fc proteina je acetilovano kao što je opisano u uputstvu priručnika obezbeđenom uz kit sulfo-NHS-acetatnih modifikacija (Pierce, Chemical Co., Rockford, 11, Cat #26777).

Primer 4: Karakterizaciia acetilovanog Fltl( l- 3)- Fc proteina

( a.) IEF analize: Fltl(l-3)-Fc i acetilovani Fltl(l-3)-Fc su analizirani standardnim IEF analizama. Kao što je prikazano na slici 1, Fltl(l-3)-Fc protein nije u stanju da migrira u gel i prema tome mora imati pl veći od 9.3, najveći pl u standardu. Međutim, acetilovani Fltl(l-3)-Fc može da migrira u gelu i postiže ravnotežu na pl približno 5.2. Ovaj rezultat pokazuje da acetilacija smanjuje ukupno pozitivno naelektrisanje proteina i zbog toga je njegov pl značajan.

( b) Vezivanje za komponente ekstracelularnog matriksa

U testu za vezivanje za komponente ekstracelularnog matriksa, Fltl(l-3)-Fc i acetilovani Fltl(l-3)-Fc su testirani u testu podražava interakciju sa komponentama ekstracelularnog matriksa. U ovom tetu, ploča sa 96 otvora sa kulturama tkiva je prevučena sa Matrigel-om (ploča sa 96 otvora sa Biocoat MATRIGEL<®>tankim slojem matriksa, Catalog #40607, Becon Dickinson Labvvare, Bedford, MA). Ploče su inkubirane sa različitim koncentracijama ili Fltl(1-3)-Fc, acetilovanog Fltl(l-3)-Fc ili rTie2-Fc (irelevantna kontrola) proteina dodatim u otvore. Ploče su inkubirane u toku 1-2 sata ili na sobnoj temperaturi ili na 37°C stepeni i zatim je detektovanje vezanih proteina postignuto dodavanjem sekundarne alkalne fosfataze u konjugatu sa anti-humanim Fc antitelom u otvore. Na kraju, dodat je substrat alkalne fosfataze u otvore i merena je optička gustina. Slika 2 pokazuje rezultate ovog testa. Kao irelevantni kontrolni protein rTie2-Fc, acetilovani Fltl(l-3)-Fc ne pokazuje uopšte vezivanje za ploče prevučene Matrigelom, dok ne-acetilovani Fltl(l-3)-Fc protein pokazuje značajno vezivanje. Rezultati ukazuju da acetilacija baznih amino kiselinskih ostataka je efikasan način da se utiče na interakcije naelektrisanja koje postoje između pozitivno naelektrisanih proteina i negativno naelektrisanih komponenti matriksa koje su izloženein vivo.

Primer 5: Pegilacija Fltl( l- 3)- Fc proteina

Mada je pokazano da pegilacija (polietilen glikol-PEG) proteina povećava njihovuin vivoaktivnost unapređivanjem stabilnosti i biodostupnosti dok se minimizira imunogenost (videti reference citiranesupra),to je nasuprot intinuitivnosti da su pegilovani molekuli suviše veliki da se cede pomoću bubrežastih glomerula što će poboljšati njihove farmakokinetičke osobine. Bez obzira na teoriju, prijavioci su predpostavili da pegilacijom Fltl (1-3)-Fc molekula će se poboljšati farmakokinetičke osobine, moguće ne menjanjem pozitivnog naelektrisanja ili smanjem pl Fltl(l-3)-Fc, nego pre fizičkim zasenjenjem pozitivnih naelektrisanja za interakciju sa ekstracelularnim matriksom. Prijavioci su odlučili da poboljšaju farmakokinetičke osobine Fltl(l-3)-Fc molekula vezivanjem nizova 20K PEG kao što je opisanoinfra.

Materijali i metodi

Prečišćeni Fltl(l-3)-Fc koji potiče od CHO ćelija (videtisupra) jekorišćen u sledećim eksperimentima pegilacije. Funkcionalnizovani PEG su dobijeni od Shearvvater Polvmers, Huntsville, AL; Bicine iz Sigma, St. Louis, MO; Superose 6 za kolone iz Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS kao 10x koncentrat iz Life Technologies, Gaithersburg, MD; Glicerol iz J.T. Baker, Phillipsburg, NJ; i Bis-Tris pripremljani gelovi iz Novex, CA.

20K PEG nizovi funkcionalizovani sa amin specifičnim terminalnim delovima su korišćeni u studijama sa malom skalom koji su podešeni da procene različite reakcione uslove u kojima je PEG:protein stehiometrija varilala. Zasnovano na ovim reakcijama i analizama uzoraka na standardnom SDS-PAGE, Fltl(l-3)-Fc pri koncentraciji od 1.5 mg/ml je reagovao na pH 8.1 sa 20 K SPA-PEG (PEG sukcinimidil propionat) molekulima u molarnom odnosu PEG-Fltl(l-3)-Fc monomer 1:6. Omogućeno je da se reakcija odvija na 8°C u toku noći. Za inicijalno prečišćavanje reakcioni proizvodi su naneseni na kolonu 10 mm x 30 cm Superose 6 ekvilibrisanu sa PBS koji sadrži 5% glicerola. Ispostavilo se da kolona odvaja pegilovane Fltl(l-3)-Fc molekule na osnovu stepena pegilacije. Sakupljene su frakcije koje odgovaraju primarno mono-pegilovanim i di-pegilovanim dimerima Fltl(l-3)-Fc, što je prosuđeno na osnovu sakupljenih uzoraka traka redukovanja i ne-redukovanja SDS-PAGE gela. Koncentracija proteina je određena merenjem absorbance na 280 nm. Pegilovani Fltl(l-3)-Fc protein je sterilno proceđen, podeljen u alikvote i čuvan na -40°C.

Primer6: Vezivanje nemodifikovanog, acetilovanog i pegilovanog

Fltl( l- 3)- Fc u Biacore testu

Nemodifikovani, acetilovani i pegilovani Fltl(l-3)-Fc proteini su testirani u Biacore testu da bi se procenila njihova sposobnost vezivanja za Fltl liganad, VEGF. U ovom testu, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein je imobiliziran na površini Biacore čipa (videti Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Pisccataway, NJ, za standardni postupak) i uzorak koji sadrži 0.2 pg/ml VEGF i ili nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, acetilovanog Fltl(l-3)-Fc ili pegilovanog Fltl(l-3)-Fc (svaki 25 pg/ml) je propušten preko Fltl(l-3)-Fc prevučenog čipa. Da bi se minimizirali efekti nespecifičnog vezivanja, vezani uzorci su isprani sa 0.5 M NaCl. U jednom uzorku, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc je pomešan sa heparinom. Heparin je negativno naelektrisan molekul i Fltl(l-3)-Fc protein je pozitivno naelektisan molekul, tako da kada su dva molekula pomešana zajedno, oni mogu intereagovati sa njihovim odgovarajućim naelektrisanjima. Suštinski neutralizovano Fltl(l-3)-Fc nasleđe pozitivne šarže čini da se molekul ponaša kao daje hemijski ili genetski modifikovan tako da smanji njegovo naelektrisanje i tendenciju da se veže preko interakcije naelektrisanja. Kao što je prikazano na slici 3, acetilovani (kolone 13-16), pegilovani (kolone 17-20) i tretirani sa heparinom Fltl(l-3)-Fc (kolone 21-24) su sve u stanju da su kompletno kompetitivne u vezivanju Biacore čip veza Fltl(l-3)-Fc za VEGF u poređenju sa kontrolnim (kolone 1-4) i irelevantnim proteinom (kolone 5-8). Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc (kolone 5-6) se javlja da je samo delimično kompetitivan u vezivanju Biacore čip veza Fltl(1-3)-Fc za VEGF. Međutim, ispiranje vezanih uzoraka sa 0.5 M NaCl (kolone 7-8) rezultuju u profilu vezivanja sličnom modifikovanim oblicima Fltl(l-3)-Fc ukazujući da nemodifikovani protein je pokazivao ne-specifična vezivanja za čip koja mogu biti eliminisan ispiranjem sa solju.

Primer 7: Vezivanje nemodifikovanog, acetilovanog i pegilovanog

Fltl( l- 3VFc ELISA testu

Nemodifikovani, acetilovani i pegilovani Fltl(l-3)-Fc proteini su testirani u standardnom ELISA testu da bi se procenila njihova sposobnost vezivanja Fltl receptora za ligand VEGF. Kao što je pokazano na slici 4, oba i pegilovani i acetilovani Fltl(l-3)-Fc proteini su sposobni da vežu VEGF, pokazujući da modifikovanje proteina ili pegilacijom ili acetilacijom ne uništava njihovu sposobnost za vezivanje liganda.

Primer8: Farmakokinetičke analize nemodifikovanog Fltl( l- 3)- Fc,

acetilovanog Fltl( l- 3)- Fc i pegilovanog Fltl( l- 3)- Fc

In vivoeksperimenti su kreirani da bi se procenio farmakokinetički profil nemodifikovanih Fltl(1-3)-Fc, acetilovanih Fltl(l-3)-Fc i pegilovanih Fltl(l-3)-Fc proteina. Balb/c miševima (23-28g; 3 miša/grupa) je injektovan subkutanozno 4 mg/kg nemodifikovanog, acetilovanog ili pegilovanog Fltl(l-3)-Fc. Kod miševa je praćeno propuštanje u toku 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana i 3 dana posle injekcije proteina. Serum je analiziran standardnim ELISA testom koji je napravljen za detektovanje Fltl(l-3)-Fc proteina. Na kratko, test uključuje prevlačenje ELISA ploče sa VEGF, vezivanje seruma koji sadrži nemodifikovani, acetilovani ili pegilovani Fltl(l-3)-Fc i izazivanje sa anti-Fc antitelom vezanim za alkalnu fosfatazu. Kao što je prikazano na slici 5, Tmax za sve Fltl(l-3)-Fc proteine je bio između vremenskih tačaka od 6 sati do 24 sata. Cmax za različite proteine je bio kao što sledi: nemodifikovani: 0.06pAnl-0.15 pg/ml; acetilovani: 1.5 p.g/ml-4.0 pg/ml i pegilovani: približno 5 pg/ml.

Primer 9: Dclimična acetilacija Fltl( l- 3)- Fc

Da bi se odredila minimalna količina acetilacije koja je neophodna da eliminiše vezivanje za komponente ekstracelularnog matriksa, konstruisan je eksperiment da se acetiluje Fltl(l-3)-Fc protein u koracima korišćenjem povećavanja količine molarnog viška acetilacionog regensa u acetilacionoj reakcionoj smeši. Opseg molarnog viška je bio kao što sledi: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 i 100 mola acetilacionog reagensa po 1 molu Flt 1(1-3)-Fc monomera. Reakcije su izvedene do detalja kao u priručnom uputstvu koje je obezbeđeno uz sulfo-NHS-acetatni kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat.# 26777).

Primer 10: Karakterizaciia delimično aeilovanih Fltl( l- 3)- Fc

( a) IEF analize Nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc i delimično acilovani Flt 1(1-3)-Fc proteini su analizirani u standardnim IEF analizama. Kao što je prikazano na slikama 6A-6B, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein nije bio sposoban da migrira u gel zbog ekstremno visokog pl (većeg od 9.3). Međutim, većina delimično aeilovanih Fltl(l-3)-Fc uzoraka (30-100 - struki molarni višak uzoraka) su bili u stanju da migriraju u gel i postignu ravnotežni pl u opsegu od 4.55-8.43 u zavisnosti od stepena acetilacije proteina. Rezultati ukazuju da acetilacija može promeniti pozitivno

naelektrisanje proteina na kontrolisan način i da smanjenje pl može biti kontrolisano kontrolisanjem stepena acetilacije.

( b) Vezivanje delimično acetilovanog Fltl( l- 3)- Fc za komponente

ekstracelularnog matriksa

U testu vezivanja za komponente ekstracelularnog matruksa, Fltl(l-3)-Fc i delimično acetilovani Fltl(l-3)-Fc su testirani u gore opisanom testu da bi se podražavala interakcija između komponenti ekstracelularnog matriksa. Različite koncentracije ili nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, delimično acilovanog V (10, 20 i 30-ostrukom višku uzorka) ili rTie2-Fc (irelevantna kontrola) protein su dodati u otvore. Ploče su inkubirane u toku 1-2 sata na sobnoj temperaturi ili 37°C i zatim detekcijom vezanih proteina pomoću dodavanja konjugata sekundarne alkalne fosfataze sa anti-humanim Fc anti telom u otvore. Substrat alkalne fosfataze je zatim dodat u otvore i merena je optička gustina. Slika 7 prikazuje rezultate ovoga testa. Kao irelevantna kontrola protein rTie2-Fc, delimično acetilovani Fltl(l-3)-Fc (20 i 30 - ostrukom molarnom višku uzoraka) ne pokazuje bilo kakvo značajno vezivanje za ploče prevučene Metrigelom, dok ne-acetilovani Fltl(l-3)-Fc protein može pokazivati značajno vezivanje. Vezivanje je zasićeno, ukazujući da Fltl(l-3)-Fc protein može se vezati za specifična mesta, pre nego mnogo opštije interakcije u kojima učestvuje naelektrisanje, koje neće biti zasićene. 10-ostruki molarni višak uzorka pokazuje smanjeno vezivanje, ali stepen acetilacijenije nije bio dovoljan da kompletno blokira vezivanje za komponente ekstracelularnog matriksa. 20-ostruki i viši molarni višak uzoraka pokazuje vezivanje koje se može detektovati, uprkos činjenici da IEF analize (Slika 6A i 6B) manjeg molarnog viška još imaju veliko ukupno pozitivno naelektrisanje. Ovi rezultati pokazuju da nije neophodno da se kompletno acetiluju sve dostupne bazne amino grupe u cilju eliminisanja vezivanja za komponente ekstracelularnog matriksa.

( c.) Vezivanje delimično acetilovanih Fltl( l- 3)- Fc u Biacore

zasnovanom testu

Nemodifikovani i delimično acilovani Fltl(l-3)-Fc proteini su testirani u Biacore zasnovanom testu da bi se procenila njihova sposobnost vezivanja za Fltl ligand, VEGF. U ovom testu, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein (0.5, 1.0 ili 5.0 p) je imobiliziran na površini Biacore čipa (videti Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ za standardne postupke) i rastvor koji sadrži 0.2 pg/ml VEGF ili nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc (ili 0.5, 1.0 ili 5.0 pg/ml) ili 10 različitih delimično aeilovanih Fltl(l-3)-Fc uzoraka (na 0.5, 1.0 ili 5.0 pg/ml) su propušteni kroz čip prevučen sa Fltl(l-3)-Fc. Kao što je prikazano na slici 8, u sub-stehiometrijskom odnosu (0.5 pg/ml ili nemodifikovanom Fltl(l-3) ili delimično acetilovanom Flfl(l-3)-Fc 0.2 pg/ml VEGF), ne postoji dovoljno Fltl(l-3)-Fc (ili nemodifikovanom ili delimično acetilovanom) u rastvoru do potpunog vezivanja VEGF. Na 1.0 pg/ml sa približno 1:1 stehiometrijskom odnosu, oba i nemodifikovan i delimično acetilovan Fltl(l-3)-Fc su bolji u kompeticiji za vezivanje VEGF-a, ali je i dalje nedovoljno Fltl(l-3)-Fc proteina (ili nemodifikovanog ili delimično-acilovanog) da se potpuno veže za dostupni VEGF. Međutim, 5.0 pg/ml, koji je nekoliko puta veći nego stehiometrijski odnos 1:1, oba i Fltl (1-3)-Fc i delimično acetilovani Fltl(l-3)-Fc proteini su sposobni da se vežu za VEGF, bez obzira na stepen acetilacije. Ovo jesno pokazuje da acetilacija ne menja Fltl(l-3)-Fc sposobnost vezivanja VEGF.

( d) Farmakokinetičke osobine delimično acetilovanih Fltl( l- 3)- Fc

In vivoeksperimenti su konstruisani da bi se procenio farmakokinetički profil nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc i delimično aeilovanih Fltl(l-3)-Fc proteina. Balb/c miševima (23-28 g) je injektovano subkutanozno 4 mg/kg nemodifikovanog ili 10, 20, 40, 60 i 100 struki molarni višak uzorka delimično acetilovanog Fltl(l-3)-Fc (3 miša za nemodifikovan, 10, 20 i 40 ostruki molarni višak uzorka i 2 miša za 60 i 100 struki molarni višak uzorka). Pračćeno je propuštanje kod miševa u toku 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana i 3 dana posle injekcije. Serum je analiziran u ELISA testu da bi se detektovao Fltl(l-3)-Fc (opisansupra).Slika 9 detaljno daje rezultate ovog ispitivanja. Tmax je za sve Fltl(l-3)-Fc proteine testirane na vremenskoj tačci od 6 sati, ali je Cmax je bio kao što sledi: nemodifikovani Fltl (1-3)-Fc: 0.06 pg/ml; 10 ostruki molarni višak uzorka: -0.7 pg/ml, 20 -ostruki molarni višak uzorka -2pg/ml, 40 struki molarni višak uzorka - 4 pg/ml, 60-ostruki molarni višak uzorka - 2 pg/ml, 100 struki molarni višak -1 pg/ml. Rezultati pokazuju da acetilacija ili pegilacija Fltl(l-3)-Fc značajno poboljšava njegov farmakokinetički profil.

Primer 11: Konstruisanje mutanta sa izbrisanim Fltl( l- 3)- Fc

osnovnim regionom označenim kao Muti: Fltl( l- 3Ag)- Fc

Na osnovu posmatranja da acetilovani Fltl(l-3)-Fc, koji ima pl ispod 6, ima mnogo bolju farmakokinetiku nego visoko pozitivni nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc (pl >9.3), postavlja se pitanje da li razlika u farmakokinetici može poticati od ukupnog naelektrisanja proteina, koji omogućava prijanjanje za negativno naelektrisane komponente ekstracelularnog matriksa, ili da li postoje specifične lokacije na površini Fltl(l-3)-Fc proteina koje čine specifično mesto vezivanja za komponente ekstracelularnog matriksa. Na primer, poznato je mnogo proteina koji imaju vezivno mesto kao heparin, koje se često sastoji od grupe baznih ostataka. Ponekad ovi ostatci su nađeni u grupi u primarnoj sekvenci proteina; neka literatura identifikuje saglasne sekvence za takva mesta vezivanja heparina (videti na primer Hileman, et al., 1998, Bioessavs 20(2): 156-67). U drugom slučaju, poznata kristalna struktura proteina otkriva grupu pozitivno naelektrisanih ostataka na površini proteina, ali ostatci dolaze iz različitih regiona primarne sekvence i zajedno su onda kada se protein savilje u tercijarnu strukturu. Ovo je teško deducirati bez obzira da li izolovani amino kiselinski ostatci formiraju deo grupe baznih ostataka na površini proteina. Međutim, ukoliko postoji grupa pozitivno naelektrisanih amino kiselinskih ostataka u primarnoj sekvenci, nije neosnovano pretpostaviti da su ostatci prostorno bliski jedan drugom i zbog toga mogu biti deo vezivnog mesta za komponente ekstracelularnog matriksa. Fltl receptor je proučavan intenzivno i različiti domeni su opisani (videti primer Tanaka et al., 1997, Jpn. J. Cancer Res 88:867-876) u odnosu na nukleinsku kiselinu i amino kiselinsku sekvencu prikazanu na slici 10A-10D ove prijave, neko može identifikovati signalnu sekvencu za sekreciju koja je locirana na početku sekvence i produžena je do koda za glicin za oko 76-78 nukleotida. Dospeo protein počinje sa Ser-Lys-Leu-Lys, polazeći od nukleotida 79 nukleinske sekvence. Fltl Ig doman 1 produžen sa nukleotidima 79 do 393, završava se sa amino kiselinom Ser-Asp-Thr. Fltl Ig domen 2 produžen za nukleotide 394 do 687 (kodira Gly-Arg-Pro do Asn-Thr-Ile) i Flt 1 Ig domena 3 produžen za nukleotide 688 do 996 (kodirane Ile-Asp-Val do Asp-Lys-Ala). Postoji amino kiselinska sekvenca koja premošćava, Gly-Pro-Gly, kodirana nukleotidima 997-1005, praćena nukleotidnom sekvencom humanog Fc (nukleotidi 1006-1701 ili amino kiseline Glu-Pro-Lys do Pro-Gly-Lys-stop).

Detaljnija analiza Fltl amino kiselinske sekvence otkriva da naime postoji grupa, amino kiselinskih ostataka 272-281 (KNKRASVRR) sa Slike 10A-10D, u kojoj 6 od 10 amino kiselinskih ostataka su bazne. Sekvenca je locirana na Fltl Ig domenu 3 receptora (videti sliku 11), koja nije po sebi bitna za vezivanje VEGF liganda, ali koja daje visoko afinitetno vezivanje za ligand. Poravnjanje sekvence Ig domena 3 sa onom Ig domena 2 pokazuje da u ovom regionu, postoji slabo poravnanje između dva Ig domena i postoji oko 10 dodatnih amino kiselina u Ig domenu 3. Analizom profila hidofilnosti (MacVector computer sofhvare) ova dva domena jasno indikuje prisustvo hidrofilnog regiona u proteinu (Slkika 12A-12B). Ova zapažanja povećavaju mogućnost da sadašnja trodimenzionalna konformacija Fltl Ig domena 3 je dozvoljena za neke tipove izbočenja koja nisu u Fltl Ig domenu 2. Da bi se testirala ova hipoteza, 10 dodatnih amino kiselina su izbrisane i rezultujući protein je testiran da se vidi da li će ispuštanje uticati na farmakokinetičku favorizovanost bez ozbiljnog ugrožavanja afiniteta receptora za VEGF. Ovako konstruisana DNA, koja je konstruisana korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije (videti na pr., Molecular Cloning, A Laboratorv Manual (Sambrook, et al., Clod Spring Harbor Laboratorv), Current Protocols in Molecular Biologv (Eds. Asubel, et al, Green Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY) za ekspresione vektore pMT21 kod sisara (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA) na koju se poziva kao Muti: Fltl(l-3AB)-Fc. Muti: sintetizovan Fltl(l-3AB)-Fc potiče od Fltl(l-3)-Fc brisanjem nukleotida 814-843 (prikazanih na slici 10A-10D), koji briše 10 visoko baznih amino kiselinskih ostataka sekvence Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg iz Fltl Ig domena 3.

Krajnja sintetisana DNA sekvenca je verifikovana korišćenjem ABI 373A DNA sekventora i Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit-a (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekvenca Muti: Fltl(1-3ab)-Fc je prikazana na slici 13A-13D.

Primer 12: Konstruisanie mutanta sa izbrisanim Fltl( l- 3)- Fc

osnovnim regionom označenim kao Mut 2: FK1( 1- 3ar)- Fc

Druga konstrukcija mutanta brisanjem, označenog kao Mut2: Flt(2-3AB)-Fc izveden je iz Muti: Flt(l-3AB)-Fc konstruisanim brisanjem Flt 1 Ig domena 1 koji kodira nukleotide 79-393 (videti Sliku 10A-10D); zgodno je, nukleotide 73-78 (TCA GGT) promeniti u TCC GGA. Ovo uvodi restrikciono mesto (BspEl) bez menjanja amino kiselinske sekvence u vezi sa njom, Ser-Gly. Ovako konstrusani DNA, koji je konstruisan korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije (videti na pr., Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al, Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Green Publ.Assoc, Wiley-Interscience, NY) za ekspresioni vektor pMT21 kod sisara (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA), takođe je potvrđena sekvenca korišćenjem ABI 373A DNA sekventora i Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekvenca Mut2: Flt(2-3,iB)-Fc je prikazana na slici 14A-14C.

Primer 13: Konstruisanie brisanjem Fltl( l- 3VFc mutanta označenog

kao Mut: Fltl( 2- 3) Fc

Treća konstrukcija mutanta brisanjem, označenog kao Mut 3: Fltl(2-3)-Fc, je konstruisana na isti način kao i Mut2: konstrukcijom Fltl (2-3Ab), osim što je Flt 1 Ig domen 3 nije dirnut (bazni region amino kislina nije izbrisan). Konstrukcija je izvršena korišćenjem standardnih tehnika molekularne biologije i sekvenca krajnjeg proizvoda je potvrđenasupra.Sekvenca Mut3: Fltl(2-3)-Fc je prikazana na Slici 15A-15C.

Primer 14: Konstruisanie mutanta Fltl( l- 3)- Fc sa glikozilovanim

baznim regionom označenim kao Mut4: Fltl( l- 3R. >N)- Fc

Krajnji proizvod konstrukcije je napravljen uvođenjem N-glikozilacionog mesta u sredinu baznog regiona Fltl Ig domena 3. Ovaj proizvod konstrukcije je označen kao Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc i napravljen je promenom nukleotida 824-825 od GA do AC, zbog toga promenom kodiranog Arg ostatka (AGA) u Asn ostatak (AAC) (videti sliku 10A-10D). Rezultujuća amino kiselinska sekvanca je prema tome izmenjena od Arg-Ala-Ser u Asn-Ala-Ser, što se slaže sa kanonskim signalom(Asn-Xxx-Ser/Thr) za dodavanje N-glikozilacionog mesta na Asn ostatku. Sekvenca Mut4: Fltl(l-3R_>N)-Fc je prikazana na Slici 16A-16D.

Primer 15: Karakterizaciia acetilovanog Fltl( l- 3Y- Fc Muti: Fltld-3AR)- Fc i Mut4: Fltl( l- 3tt.^- Fc mutanata

( a) Vezivanje za komonente ekstracelularnog matriksa

Da bi se odredilo da li tri modifikovana proteina su više ili manje imaju poboljšane farmakokinetičke osobine, ploče sa 96 otvora su prevučena sa Matrigelom (kao što je opisanosupra)i inkubirane su sa različitim koncentracijama mutiranih proteina i detektovane su anti/humanom Fc/alkalnom fosfatazom konjugovanom sa antitelima. Kao što je prikazano na Slici 18, eksperiment je pokazao da dok nemodifikovani Fltl(21-3)-Fc protein može da se veže brzo za ove otvore, Mut3: Fltl(2-3)-Fc protein se veže nešto slabije, Muti: Fltl(l-3AB)-Fc protein se vezuje još slabije a Mut2: Fltl(2-3ab)-Fc protein pokazuje najbolji profil, i vezuje se slabije u odnosu na bilo koji drugi izmenjeni protein. Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc glikozilovani izmenjeni protein pokazuje samo marginalni doprinos u Matrigelovom testu. Ovi rezultati potvrdu hipotezu da linearna sekvenca pozitivnih amino kiselina može biti izbrisana iz primarna sekvence rezultujući opadanjem interakcija naelektrisanja sa komponentama ekstracelularnog matriksa.

( b) Vezivanje Muti:Fltl( l- 3AR)- Fc iMut4:Fltl( i- 3R^ N)- Fc uBiacore

testu

Nemodifikovan i acetilovan Fltl(l-3)-Fc i genetički modifikovani Muti: Fltl(l-3AB)-Fc i Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc proteini su testirani u Biacore testu da se proceni njihova sposobnost vezivanja za Fltl ligand, VEFD. U ovom testu, nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc protein (0.25, 0.5 ili 1.0 pg/ml) je imobiliziran na površini Biacore čipa (videti Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, za standardni postupak) i rastvor koji sadrži 0.1 pg/ml VEGF i ili prečišćeni ili COS ćelijski superaatant koji sadrži nemodifikovane Fltl(l-3)-Fc (pri približno (0.25, 0.5 ili 1.0 pg/ml), prečišćenog acetilovanog Fltl(l-3)-Fc(pri (0.25, 0.5 ili 1.0 pg/ml), COS ćelijski superaatant koji sadrži Muti: Fltl(l-3AB)-Fc (pri približno (0.25, 0.5 ili 1.0 pg/ml) ili COS ćelijski supernatant koji sadrži Mut4: Fltl(l-3R.

>n)-Fc (pri približno (0.25, 0.5 ili 1.0 pg/ml) su propušteni preko Fltl(l-3)-Fc prevučenog čipa. Kao što je prikazano na Slici 17, pri sub-stehiometrijskom odnosu (0.25 pg/ml Fltl(l-3)-Fc nemodifikovanog, acetilovanog ili genetički modifikovanog uzorka vs. 0.1 pg/ml VEGF), ne postoji dovoljno Fltl(l-3)-Fc proteina da blokira vezivanje VEGF na Fltl(l-3)-Fc imobilizovanom Biacore čipu. Pri 0.5 pg/ml nemodifikovanog, acetilovanog ili genetički modifikovanog Fltl(l-3)-Fc proteina, u stehiometrijskom odnosu približno 1:1 postoji povećana mogućnost blokiranja VEGF vezivanja za Biacore čip. Pri 1.0 pg/ml nemodifikovanog, acetilovanog ili genetički modifikovanog Fltl(l-3)-Fc proteina, koji je približno u stehiometrijskom odnosu 10:1, Fltl(l-3)-Fc proteini su sposobni da blokitraju vezivanje VEGF za Biacore čip, ali nisu ekvivalntni. Nemodifikovani, acetilovani i Muti: Fltl(l-3)-Fc su suštinski jednaki u svojoj sposobnosti da blokiraju VEGF vezivanje, pošto Mut4: Fltl(l-3R.>N)-Fc je nešto manje efikasan u blokiranju vezivanja. Ovi rezultati potvrđuju hipotezu da je moguće redukovati ne-specifično vezivanje pozitivno naelektrisanih molekula genetskim uklanjanjem linearne sekvence predominanto negativno naelektrisanih amino kiselina. (c) Vezivanje Muti: Fltl( 1- 3AR)- Fc, Mut2: Fltl( 2- 3AR)- Fc, Mut3:

Fltl( l- 3)- Fc u ELISA testu

Da bi se odredilo da li tri izmenjena proteina mogu vezivati Fltl ligand VEGF, urađeni su eksperimenti vezivanja u kojima ploče sa 96 otvora su prevučene sa VEGF-om i različitim koncentracijama odgovarajućih izmenjenih proteina i posle ispiranja, vezana količina je detektovana inkubiranjem sa alkalnom fosfatazom konjugovanom sa anti humanim antitelima i kvantifikovana kolorimetrijski dodavanjem odgovarajućeg substrata alkalne fosfataze. Kao što je prikazano na Slici 19, onaj eksperiment je pokazao da izmenjeni proteini se mogu slično vezati za VEGF u testiranim koncentracijama.

Primer 16: Farmakokinetičke analize acetilovananog Fltl( l- 3)- Fc,

Muti: Fltl( l- 3AB)- Fc i nemodifikovanog Fltl( l- 3)- Fc

In vivoeksperimenti su napravljeni da procene farmakokinetički profil nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc, Muti: FuT(1-3ab)-Fc i 40-struki molarni višak acetilovanog Fltl(l-3)-Fc proteina. Balb/c miševima (25-30g) je injektovano subkutanozno 4 mg/kg nemodifikovanog Fltl(l-3)-Fc i Muti: Fltl(l-3AB)-Fc proteina (4 miša svaki). Praćeno je propuštanje miševa na 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana, 3 dana i 5 dana posle injektovanja. Serum je analiziran ELIZA -om napravljenom da bi se detektovao Fltl(l-3)-Fc protein koji uključuje prevlačenje ELISA ploča sa VEGF-om, vezivanje Fltl(l-3)-Fc i izazivanje sa anti -Fc antitelima vezanim za alkalnu fosfatazu. Kao što je prikazano na Slici 20, Cmax za ove reagense je kao što sledi: nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc - 0.15 pg/ml; 40-ostruki molarni višak acetilovanog Fltl(l-3)-Fc; i Muti: Fltl(l-3An)-Fc - 0.7 pg/ml.

Primer 17: Konstrukcija vektora modifikovanog Fltl receptora

Obrazloženje za konstruisanje modifikovanih verzija Fltl receptora (takođe poznatih kao VEGFR1) je zasnovano na posmatranju da proteinska sekvenca Fltl je visoko bazna i zbog toga verovatno se veže za ekstracelularni matriks (ECM). Visoko bazna priroda Fltl verovatno objašnjava zašto nemodifikovani Fltl(l-3)-Fc (opisanisupra)imaju siromašnu farmakokinetiku koja otežava njihovu upotrebu kao terapeutskih sredstava. Kao što je opisanosupra,hemijski modifikovani oblici 40-ostrukog molarnog viška acetilovanog Fltl(l-3)-Fc, dole označenog kao A40, pokazuje značajno poboljšani farmakokinetičkoi profil u odnosu na neacetilovan Fltl(l-3)-Fc. Prema tome, učinjeni su pokušaji da se konstruišu DNA molekuli koji se mogu koristiti kao rekombinantni modifikovani ekspresioni oblici Fltl molekula receptora koji će imati poboljšani PK profil prikazan za A40 i dalje će zadržavati sposobnost da se jako vežu za VEGF.

Poznato je u literaturi da prvi Ig domen Fltl (koji ima ukupno naelektrisanje +5 na neutralnom pH) nije esencijalan za čvrsto vezivnje za VEGF, pa je ovaj domen izbrisan. Treći Ig domen (koji ima ukupno naelektrisanje +11) nije esencijalan za vezivanje, ali ima viši afinitet za VEGF nego drugi Ig domen, tako da umesto brisanja u potpunosti, zamenjen je sa ekvivalentnim domenima Fltl receptora srodnih Flkl (takođe poznatih kao VEGFR2) i Flt4 (takođe poznatih kao VEGFR3). Ovi himerni molekuli (označeni kao R1R2 (Fltl.D2.Flkl.D3. FcACl(a) i VEGERlR2-FcACl(a) i R1R3 (FltlD2.VEGFR3D3-FcACl(a) i VEGFRlR3-FcACl(a) respektivno, gde Rl i FltlD2 =Ig domen 2 Fltl (VEGFR1); R2 i FlklD3 = Ig domen 3 Flkl (VEGFR2); i R3 i VEGFR3D3 = Ig domen 3 od Flt4 (VEGFR 3)) dosta manje prijanjaju na ECM, kao što je procenjenoin vivotestom ECM vezivanja što je opisanoinfrai ima veoma poboljšan PK kao što je opisanoinfra.Dodatno, ovi molekuli su sposobni da vežu VEGF čvrsto kao što je opisanoinfrai blokiraju fosforilaciju prirodnog Flkl receptora koji se javlja u endotelijalnim ćelijama kao što je opisanoinfra.

( a) Konstruisanieekspresionih plazmida pFltlD2. FlklD3.FcACKa)

Ekspresija plazmida pMT21.Fltl(l-3).Fc (6519bp) i pMT21.Flk-l(l-3).Fc (5230bp) su plazmidi koji kodiraju otpornost na ampicilin i Fc-obeležena verzija Ig 1-3 domena humanog Fltl i humanog Flkl, respektivno. Ovi plazmidi se koriste da bi se konstruisao DNA fragment koji se sastoji od spajanja Ig domena 2 Fltl sa Ig domenom 3 Flkl, pomoću PCR amplifikacije odgovarajućih Ig domena praćeno daljim postpcima PCR-a da bi se postigla fuzija dva domena ujedan fragment. Za Ig domen 2 Fltl, 5' i 3' amplifikovani prajmeri su kao što sledi:

5' amplificirani prajmeri kodiraju BspEI mesto rekristriktivnog enzima ispred Ig domena 2 Fltl, definisanog kao amino kiselinska sekvenca GRPFVEM (koji odgovara amino-kiselinama 27-33 na slici 21A-21C). 3' prajmer kodira reverzno komplementarni 3' kraj Fltl Ig domena 2 spojenog direktno za 5' početkom Flkl Ig domena 3, sa tačkom spoja definisanom kao TUD Fltl (što odgovara amino kiselinama 123-126 na slici 21A-21C) i nastavljanjem u VVLS (što odgovara amino-kiselinama 127-130 slika 21A-21C) Flkl-a.

Za Ig domen 3 Flkl, 5' i 3' amplifikacioni prajmeri su kao što sledi:

5' Amplifikacioni prajmer kodira kraj Fltl Ig domena 2 spojenog direktno za početak Flkl Ig domena 3, kao što je ovde opisano. 3' amplifikacioni prajmer kodira kraj Flkl Ig domena 3, definisanog amino kiselinama VRVHEK (odgovara amino kiselinama 223-228 Slika 21A-21C), praćenim sa sekvencom za premošćavanje koja uključuje sekvencu prepoznavanja za restrikcioni enzim Srfl i kodira amino kiseline GPG. Sekvenca koja premošćava odgovara amino kiselinama 229-231 slike 21A-21C.

Posle postupka PCR amplifikacije da bi se dobili individualni domeni, proizvodi su sakupljeni u epruvetu i podvrgnuti daljem postupku PCR sa prajmerima bsp/fltlD2 i FlklD3/apa/srf.as (opisanihsupra)da bi dobili fuzioni proizvod. PCR proizvod je zatim podrgnut restrikcionim enzimima BspEI i Smal i rezultujući 614bp fragment je podkloniran u BspEI do Srfl restrikciona mesta vektora pMT21/AB2.Fc, da bi se stvorio plazmid pMT21/FltD2.FlklD3.Fc. Nukleotidna sekvenca FltlD2-FlklD3 spajanja gena umetanjem je potvrđena standardnom analizom sekvence. Ovaj plazmid je zatim podvrgnut restrikcionim enzimima EcoRI i Srfl i rezultujući 702bp fragment je premešten u EcoRI do Srfl restrikciona mesta plazmida pFltl(l-3)B2-FcACl(a) da bi se dobio plazmid pFltlD2.FlklD3.FcACl(a). Kompletna DNA i dedukovana amino kiselinska sekvenca FltlD2.FlklD3.FcACl(a) himernog molekula je prikazana na Slici 21A-21C.

( a) Konstrukcija ekspresionog plazmidapFltlD2VEGFR3D3FcACl( a)

Ekspresioni plazmid pMT21.Flt(l-3).Fc (6519bp) kodira otpornost na ampicilin i Fc obeleženu verziju Ig domena 1-3 humanog Fltl receptora. Ovaj plazmid je korišćen da proizvede DNA fragment koji sadrži Ig domen 2 Fltl od PCR. RNA iz ćelijske linije HEL921.7 je korišćen da se dobije Ig domen 3 Flkl, korišćenjem standardne RT-PCR metodologije. Dalji krug PCR amplifikacija je korišćen da se postigne spajanje dva Ig domena u jedan spojeni fragment. Za Ig domen 2 Fltl, 5' i 3' amplifikacija "prajmera" je bila kao što sledi:

5' amplifikacioni prajmer kodira BspEI restrikciono mesto iznad Ig domena 2 od Fltl, definisano aminokiselinskom sekvencom GRPFVEM (koja odgovara amino kiselinama 27-33 slike 22A-22C). 3' amplifikacioni prajmer kodira reverzni komplement kraja Fltl Ig domena 2 spojenog direktno na početak VEGFR3 Ig domena 3, sa tačkom spoja deflnisanom kao TIF Fltl (odgovara amino kiselinama 123-126 slike 22A-22C) i nastavlja u IQLL VEGFR3 (odgovara amino kiselinama 127-130 na slici 22A-22C).

Za Ig domen 3 VEGFR3, 5' i 3' prajmeri korišćeni za RT-PCR su kao što sledi:

Oba 5' i 3' amplifikovana prajmera slažu se sa sekvencom VEGFR3. 296bp amplifikacioni proizvod RT-PCR reakcije je izolovan standardnim tehnikama i podvrgnut je daljem postupku PCR da bi se dodale pogodne sekvence da bi se omogućilo spajanje FltlD2 sa FlklD3 domenima i spajanje FlklD3 i Fc domena preko GPG mosta (videti dole). Amplifikovani "prajmeri" su kao što sledi:

5' amplifikacioni prajmer kodira 3' kraj Fltl Ig domena 2 spojenog direktno za početak (5' kraj) VEGFR3 Ig domena 3, kao što je gore opisano. 3' amplifikovan prajmer kodira 3' kraj VEGFR3 Ig domena 3, definisanog amino kiselinama VIVHEN (koji odgovara amino kiselinama 221-226 Slike 22A-22C), koji prati sekvenca za premošćavanje koja uključuje sekvencu za prepoznavanje za Srfl i kodira amino kiseline GPG. Sekvenca koja premošćava odgovara amino kiselinama 227-229 slike 22A-22C.

Posle jednog kruga (za Fltl Ig domen 2) ili dva kruga (za Flt 4 Ig domen 3) PCR da se dobije individualan Ig domen, PCR proizvodi su sakupljeni u epruvetu i podvrgnuti daljim postupcima PCR amplifikacije sa amplifikacionim prajmerima bsp/fltlD2 i VEGFR3D3/srf.as deflnisanihsuprada bi se dobio fuzioni proizvod. Ovaj PCR proizvod je zatim podvrgnut restrikcionim ezimima BspEI i Smal i rezultujuća 652bp fragment je subkloniran u BspEI do Srfl restrikciona mesta vektora pMT21/FltlAB2. Fc (opisanihsupra),da bi se kreirao plazmid pMT21/FltlD2.VEGFR3D3.Fc. Sekvenca umetnutog spojenog gena FltD2-VEGFR3D3 je potvrđena standardnm analizom sekvence. Ovaj plazmid je zatim podvrgnut restrikcionim enzimima EcoRI i Srfl i rezultujući 693bp fragment je subkloniran u EcoRI do Srfl restrikciona mesta plazmida pFltl(l-3)AB2-FcACl(a) da bi se dobio plazmid označen kao pFltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Kompletna DNA dedukovana amino kiselinska sekvenca FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) himernog molekula je prikazana na slici 22A-22C.

Primer 18: Test vezivanja- Vezivanje za ekstracelularni matriks ( ECM>

ECM prevučene ploče (Becon Dickinson catalog # 35-4607) su bile rehidratisane sa toplim DME sa dodatkom glutamina (2 mM), 100U penicilina, 100U eritromicina i 10% BCS bar 1 sat pre dodavanja uzorka. Ploče su inkubirane u toku 1 sata na sobnoj temperaturi sa promenjivim koncentracijama FltlD2.FlklD3.FcACl(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) počevši na lOnM sa 2-strukim razblaženjem koje sledi u PBS-u sa 10%BCS. Zatim su ploče isprane 3 puta sa PBS sa 0.1% Triton-X i inkubirane sa alkalnom fosfatazom konjugovanom sa anti-humanim Fc antitelom (Promega, 1:4000 u PBS-u plus 10% BCS) u toku 1 sata na sobnoj temperaturi. Zatim su ploče isprane 4 puta sa PBS-om 0.1%. Triton-X i alkalna fosfataza/pNPP rastvor (Sigma) je dodat za razvijanje boje. Ploče su čitane na I = 405-570 nm. Rezultati eksperimenta su prikazani na slici 23 i pokazuju da FltlD2.FlklD3.FcACl(a) i FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) proteini se značajno manje prijanjaju za EMC u poređenju sa Fltl (1-3) proteina.

Primer 19: Privremena ekspresija pFltlD2. FlklD3. FcACl( a) u CHO-Kl ( El A) ćelijama

Velika količina (21) kulture E. coli DH10B ćelija koje nose pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) plazmid opisansuprau primeru 17(a) je narasla u toku noći u Terriffic Broth (TB) sa 100 pg/ml ampicilina. Sledećeg dana, plazmid DNA je ekstrahovan korišćenjem QIAgen Endofree Megaprep kit-a sledeći protokol proizvodnje. Koncentracija prečišćenog plazmida DNA je određena standardnim tehnikama korišćenjem UV spektrofotometra i fluorometra. Plazmid DNA je potvrđen podvrgavanjem alikvota sandardnim restrikcionim enzimima a korišćeni su restrikcioni enzimi EcoRI sa Notl-om i Asel. Svi fragmenti posle restrikcionih enzima odgovaraju predviđenoj veličini kada su analizirani na 1% gelu agaroze.

Četrdeset petrijevih šolja od 15 cm je zasejano sa CHO-K1A ćelijama gustine 4 X 106 ćelija/šolji. Medijum u šoljama je bio Gibco Ham's F-12 sa dodatkom 10% Hvclone seruma goveđeg fetusa (FBS), lOOUpenicilina/lOOU streptomicina i glutamina (2mM). Sledećeg dana svaka Šolja je transfektovana sa 6 pg pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) plazmidom DNA korišćenjem Gibco Optimem i Gibco Lipofectamine u zapremini od 12 ml, a sledeći manufakturni protokol. Četiri sata posle dodavanja transfekcione mešavine u ćelije, dodato je 12 ml/šolji Optimem -a obogaćenog sa 10% FBS . Šolje su inkubirane na 37°C u 5% C02inkubatoru u toku noći. Sledećeg dana medijum je uklonjen iz svake šolje i dodato je 25 ml ekspresionog medijuma (Gibco CHO-S-SFM II sa dodatkom glutamina (2mM) i lmM natrij um butirata). Šolje su inkubirane sa 37°C u toku 3 dana. Posle 3 dana inkubacije, medijum je ispario iz svake šolje i centrifugiran na 400 rpm u rotorom sa ljuljajućem nosačima do loptice ćelija. Supernatant je dekantovan u sterilne 11 flaše i prečišćavanje proteina dobijenih ekspresijom je obavljeno kao što je opisanoinfra.

Primer 20: Konstrukcija pVEGFRIRZFcACUa) ekspresionog vektora

pVEGFRlR2.FcACl(a) ekspresioni plazmid je konstruisan umetanjem DNA koja kodira amino kiseline SDT (odgovara amino kiselinama 27-29 na slici 24A-24C) između Fltld2-Flkld3-FcACl(a) amino kiselina 26 i 27 sa slike 21A-21C (GG) i uklanjanja DNA kodirajućih amino kislina GPG koje odgovaraju amino kiselinama 229-231 na slici. SDT amino kiselinska sekvenca je srodna Fltl receptom i dodata je nazad sa opadanjem verovatnoće u obradi heterogenog N-terminala. GPG (sekvenca za premošćavanje) je uklonjena tako da Fltl i Flkl Ig domeni su bili spojeni direktno jedan za drugi. Kompletna DNA i deduciranu amino kiselinska sekvenca pVEGFRlR2.FcACl(a) himernog molekula je prikazana na slici 24A-24C.

Primer 21: Postupak ćeliiske kulture korišćen da se dobiju

modifikovani Fltl receptori

( a) Postupak ćeliiske kulture korišćen za dobiianie FltlD2. FlklD3.

FcACKa)

Postupak za proizvodnju FltlD2.FlklD3. FcACl(a) proteina korišćenjem ekspresionog plazmida pFltlD2.FlklD3. FcACl(a) opisanogsuprau primeru 1 uključuje suspendovanu kulturu rekombinantnih ćelija jajnika Kineskog hrčka (CHO K1/E1A) koje konstitutivno daju proteinski proizvod. Ćelije su rasle u bioreaktrou i proteinski proizvod je izolovan i prečišćen afinitetnim i ekskluzionom hromatografijom na osnovu veličine. Postupak je dole opisan u više detalja.

C r elijska ekspanzija

Dva konfluentna T-225 cm<2>balona koja sadrže FltlD2.FlklD3.FcACl(a) ekspresione ćelijske linije su proširene stavljanjem ćelija u osam T-225 cm<2>u medij umu (GMEM + 10% serum, GIBCO) i inkubirane su na 37°C i 5% CO2. Kada baloni postanu konfluentni (približno 3 do 4 dana) ćelije su odvojene koristeći tripsin. Dodat je svež medijum da štiti ćelije od daljeg izlaganja tripsinu. Ćelije su centrifugirane i resuspendovane u svežem medijumu a zatim prenesene u osam valjkastih boca od 850 cm<2>i inkubirane na 37°C i 5% CO2do konfluentnosti.

Suspendovana kultura u bioreaktoru

Ćelije narasle u valjkastim bocama su tretirane tripsinom da bi se odvoile od površine i isprale sa medijumom suspendovane kulture. Ćelije su aseptički premeštene u 51 bioreaktor (New Brunsvvick Celligen Plus) gde su ćelije narasle u 3.5 1 suspendovane kulture. Medijum suspendovane kulture je niže glukozna modifikacija IS-CHO (Irvine Scientific) bez glutamina kome je dodato 5% seruma goveđeg fetusa (Hvclone), GS dodatak (Life Technologies) i 25 pM metionin sulfoksamina (Sigma). pH je kontrolisan na 7.2 dodavanjem ugljen dioksida kroz otvor za gas ili dodavanjem tečnog rastvora natrijum karbonata u bioreaktor. Nivo rastvorenog kiseonika je održavan na 30% pomoću zasićenja dodavanjem ili kiseonika ili azota kroz otvor gasa i temperatura je kontrolisana na 37 °C. Kada se postigne gustina 4 x IO<6>ćelija/ml, ćelije se premeste u bioreaktor od 40 1 koji sadrži isti medijum i set za kontrolu bioreaktora. Set za kontrolu temperature je redukovan na 34°C da bi usporio rast ćelija i povećao relativnu brzinu ekspresije proteina.

( b) Postupak za ćeliiske kulture korišćen pri dobiianiu

FltlD2. VEGFR3D3.FcACUa)

Ista metodologija, kao što je opisanosupraza Fltl D2.FlklD3. FcACl(a) je korišćena da se proizvede FltlD2.VEGFR3D3. FcACl(a)

Primer22: Sakupljanje i prečišćavanje izmenjenih Fltl receptora

U )Sakupljanje i prečišćavanje FItlD2. FIklD3. FcACl( a)

Dobijeni proteini su pod aseptiČkim uslovima sakupljeni iz bioreaktora dok su zadržane ćelije korišćenjem Milipore Prostaka modula za ceđenje sa tangencijalnim protokom i "low-shear"mehaničkom pumpom (Fristam). Sveži medijum je dodat u bioreaktor da zameni uklonjeni za vreme skupljanja ceđenjem. Približno 40 1 sakupljanog filtrata je zatim naneto na 400 ml kolonu koja sadrži Protein A Sepharosnu smolu (Amersham Pharmacia). Pošto je naneseno na smolu, smola je isprana sa puferom koji se sastoji od 10 mM natrijum fosfata, 500 nm natrijum hlorida, pH 7.2 da bi se uklonio ne vezani kontaminirajući proteini. FltlD2.FlklD3. FcACl(a) protein je eluiran sa pH 3.0 citratnim puferom. Eluirani protein je neutralizovan dodatkom Tris baze i zamrznut je na -20°C.

Nekoliko zamrznutih serija FltlD2.FlklD3.FcACl(a) proteina iz gornje faze sa Proteina A su otopljeni, spojeni i koncentrovani korišćenjem Millipore 30kD filtracionu membranu sa nominalnim molekulskim sitom na osnovu težine (NMWCO) i tangencijalnim protokom. Protein je prenesen u ćelijski koncentrator koji se meša (Millipore) i dalje je koncentrovan do 30 mg/ml korišćenjem 30kD NMWCO membrane. Koncentrovani proteini su naneseni na kolonu za ekskluziju prema veličini spakovanu sa Superdex 200 smolom (Amersham Pharmacia) koja je ekvilibrisana sa fosfatnim puferom soli sa 5% glicerolom. Isti pufer je korišćen pri eluiranju sa kolone. Frakcije koje odgovaraju FltlD2.FlklD3. FcACl(a) dimeru su sakupljene, sterilno ceđene kroz 0.22 mikronski filter, napravljeni su alikvoti i zamrznuti su.

( c) Sakupljanje i prečišćavanje FltlD2. VEGFR3D3. FcACKa)

Ista metodologija kao što je opisanosupraza FltlD2.FlklD3. FcACl(a) je korišćena pri sakupljanju i prečišćavanju F1UD2.VEGFR3D3. FcACl (a).

Primer 23: Fosforilacioni test za VEGFR2 dobijen privremenom

ekspresijom

Osnovne humane endotelijalne ćelije pupčane vene (HUVEC), propuštene 4-6, su izgladnjene u toku 2 sata u DME visoko glukoznom mediju bez seruma. Uzorci sadrže 40 ng/ml (1 nM) humanog VEGF165 koji je ligand za VEGF receptore Fltl, Flk 1 i Flk4(VEGFR3) koji su pripremljeni i prethodno inkubirani u toku 1 sata na sobnoj temperaturi sa različitim količinatma Fltl receptora Flt(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A 40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) i FltlD2.VEGFR3D3. FcACl(a) u serumu bez DME visoko glukoznom medijumu koji sadrži 0.1% BSA. Ćelije su izazivane u toku 5 minuta sa gore pripremljenim uzorcima +/- VEGF165, a zatim praćene sa potpunom lizom ćelija pomoću kompletnog pufera za lizu. Ćelijski lizat je zatim imunoprecipitiran sa antitelima protiv C-terminalnog VEGFR2 receptora. Imunoprecipitirani lizati su naneseni na 4-12% SDS-PAGE Novex gel i zatim preneseni na PVDF membrane korišćenjem standardnih metodologija transfera. Detekcija fosforilovanih VEGFR2 je urađena imounomrljama sa anti fosfo Tirozinom mAb koji se zove 4G10 (UBI) i razvijen je korišćenjem ECL reagensa (Amersham). Slike 25A-25C i 26A-26B pokazuju rezultate ovog eksperimenta. Slika 25A-25C otkriva da detekcija Westera mrlja tirozin fosforilovanog VEGFR2(Flkl) sa stimulacijom VEGF 165 ligandom pokazuje da ćelijska površina receptora je fosforilovana do različitih nivoa u zavisnosti od kojih modifikovanih Fltl receptora je korišćena u toku preinkubacije sa VEGF-om. Kao što se vidi na slici 25A, pri 1.5 molarnim višku ili Flt(l-3)-Fc, Flt(l-3)-Fc (A40) ili privremenom FltlD2.FlklD3. FcACl(a) postoji kompletna blokada stimulacije receptora od strane ova tri modifikovamna Fltl receptora u poređenju sa kontrolnim medijumom. Na suprot tome, privremeni FltlD2.VEGFR3D3. FcACl(a) ne pokazuje značajno blokiranje pri ovom molarnom višku u poređenju sa VEGF pozitivnom kontrolom. Slični rezultati su viđeni na Slici 25B, gde izmenjenii Flt receptori su 3-strukom molarnom višku u odnosu na VEGF165 ligand. Na slici 25C, gde modifikovani Fltl receptori su u 6-ostrukom molarnom višku u odnosu na VEGF1651igand, prelazni F1UD2.VEGFR3. FcACl(a) može sada biti pokazano da delimično blokira VEGF 165 indukovanu stimulaciju receptora na ćelijskoj površini.

Na slici 26A-26B, detekcijom Western mrlja fosforilovanog tirozina VEGFR2(Flkl) sa VEGF 165 stimulacijom liganada pokazuje da receptori sa površine ćelije nisu fosforilovani u odnosu na uzorke kojii maju VEGF165 preinkubiran sa 1 i 2-strukim molarnim viškom (Slika 26A) ili 3 i 4 -o.strukim molarnijm viškom (slika 26B) ili prolaznim FltlD2.FlklD3. FcACl(a), stabilnim FltlD2.FlklD3. FcACl(a) ili prolaznim VEGFR1R2. FcACl(a). Na svim testirnim koncentracijama modifikovanih Fltl receptora postoji kompletno vezivanje VEGF 165 liganda u toku preinkubacije, što rezultuje nedetektovanom stimulacijom receptora na ćelijskoj površini nevezanog VEGF 165 u poređenju sa kontrolnim medijumom.

Primer 24: Biotest ćeliiske proliferacije

Testirana ćelijska populacija su MG87 ćelije koje su stabilno transfektovane sa ekspresionim plazmidom koji sadrži umetnut DNA koji kodira VEGFR2(Flkl) ekstracelularni domen spojen sa Trk intracelularnim kinaznim domenom, koji proizvodi himeri molekul. Razlog zbog koga je korišćen Trk intracelularni kinazni domen pre nego prirodni VEGFR2(Flkl) intracelularni kinazni domen, je da intracelularni kinazni domen VEGFR2(Flkl) ne uzrokuje jak proliferativni odgovor kada se stimuliše sa VEGF165 u ovim ćelijama. Poznato je da MG87 ćelije koje sadrže TrkB receptore potpune dužine daju snažan proliferativni odgovor kada su stimulisane sa BDNF-om, tako da TrkB intracelularni kinazni domen je konstruisan da zameni intracelularni kinazi domen VEGFR(Flkl) da bi nadvladao ovu proliferativnu sposobnost odgovora.

5x10 ćelije/otvoru smeštene na ploču sa 96 otvora i omogućeno je da se ustale u toku 2 sata na 37 °C. Sledeći modifikovani Flt receptori Flt(l-3)-Fc, FltD2. FlklD3. FcACl(a) i F1UD2. VEGFR3D3.FcACl(a) sa jednim irelevantnim receptorom označenim kao Tie2-Fc kao negativnom kontrolom, su titrovane sa 40 nM do 20pM i inkubirane na ćelijama u toku 1 sata na 37 °C. Zatim je dodat ljudski rekombinantni VEGF165 u defmisanom mediju su u sve otvore u koncentraciji od 1.56nM. Ploče su inkubirane u toku 72 sata na 37°C a zatim je dodat MTS (Ovven's reagent, Promega) i ploče su inkubirane u toku još dodatnih 4 sata. Na kraju, ploče su čitane na spektrofotometru na 450/570 nm. Rezultati eksperimenta su prikazani na Slici 27. Kontrolni receptorr Tie-Fc ne blokira VEGF 165 indukovanu ćelijsku proliferaciju pri bilo kojim koncentracijama gde FltlD2.FlklD3.FcACl(a) blokira 1.56nM VEGF 165 pri polovini maksimalne doze 0.8 nM. Fltl(l-3)-Fc i FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) su manje efikasne u blokiranju VEGF 165 u ovom testu sa polovinom maksimalne doze od~2nM. VEGF165 same daju očitavanje od 1.2 jedinica absorbance i pozadina od 0.38 absorpcionih jedinica.

Primer 25: Stehiometrija vezivanja izmenjenih Flt receptora za

VEGF165

( a) BIAcore analize

Stehiometrija FltlD2FlklD3.FcACl(a) i VEGFRlR2-FcAl(a) interakcije sa humanim VEGF 165 je određena merenjem ili nivoa zasićenosti VEGF vezivanja za FltD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a) površina ili merenjem koncentracije VEGF 165 potrebnog da se kompletno spreči vezivanje FltD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a) za VEGF površinu BIAcore čipa.

Izmenjeni receptori FltD2FlklD3.FcACl(a) i VEGFRlR2-FcACl(a) su zarobljeni sa anti-Fc specifičnim antitelima koja su prvo imobilizirana na Biacore čipu (BIACORE) pomoću hernije amino kuplovanja. Prazna površina antitela je korišćena kao negativna kontrola. VEGF165 je injektovan pri koncentracijama od 1 nM, 10 nM i 50 nM preko FltD2FlklD3.FcACl(a) i VEGFRlR2-FcACl(a) površina pri 1Opi/min u toku jednog sata. Signal vezivanja u stvarnom vremenu je sniman i zasićenje vezivanja je postignuto pri kraju injektiranja. Stehiometrija vezivanja je izračunata kao molarni odnos vezanih VEGF165 u odnosu na imobilizirani FltD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl (a), korišćenjem konverzionog faktora od 1000RU ekvivalentnog lng/ml. Rezultati ukazuju na stehiometriju vezivanja jednog VEGF165 dimernog molekula po jednom FltD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a) molekulu (slika 28).

U rastvoru, FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a) pri koncentraciji od 1 nM (procenjenoj da će biti 100 puta veća od KD FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a)/VEGF165 interakcija) su pomešane sa različitim koncentracijama VEGF 165. Posle inkubacije od jednog sata, koncentracija slobodnog FltlD2FlklD3.FcACl (a) u rastvoru je merena kao signal vezivanja za amino-kuplovane VEGF165 površine. Kalibraciona kriva je korišćena da konvertuje FltlD2FlklD3.FcACl(a) BIAcore signal vezivanja za njegovu molarnu koncentraciju. Podatci pokazuju da dodavanje lnM VEGF 165 u rastvor FltlD2FlklD3.FcACl(a) kompletno blokira FltlD2FlklD3.FcACl(a) vezivanje za VEGF 165 površinu. Ovaj rezultat sugeriše da je stehiometrija vezivanja jednog VEGF 165 molekula po jednom FltlD2FlklD3.FcACl(a) molekulu (Slika 29 i slika 30). Kada je koncentracija FltlD2FlklD3.FcACl(a) nanesena kao funkcija dodate koncentracije VEGF165, nagib linearnog dela je -1.06 za FltlD2FlklD3.FcACI(a) i -1,07 za VEGFRlR2-FcACl(a). Magnituda nagiba, veoma blizu negativnom je indikativna da jedan molekul VEGF165 veže se za jedan molekul ili FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFR1R2-FcACl(a).

( b)Ekskluziona hromatografija na osnovu veličine

FltlD2FlklD3.FcACl(a) je pomešan sa 3-strukim viškom VEGF 165 i receptor-ligand komplaks je prečišćen pomoću kolone za ekskluzionu hromatografiju na osnovu veličine na Pharmacia Superose 6. Receptor-ligand kompleks je zatim inkubiran u puferu koji sadrži 6M gvanidin hidrohlorid u cilju njegove disocijacije u njegove proteinske komponente.

FltlD2FlklD3.FcACl(a) je odvojen od VEGF 165 pomoću kolone ekskluzine hromatografije Superose 6 u 6M guanidijum hloridu. U cilju određivanja stehiometrije kompleksa, nekoliko injektovanja FltlD2FlklD3.FcACl(a) i VEGF165 je učinjeno i visina maksimuma ili integriran intenzitet maksimuma je nanesen kao funkcija koncentracije injektovanih proteina. Kalibracija je urađena pod uslovima koji su identični onima koji su korišćeni u odvajanju komponenti FltlD2FlklD3.FcACl(a)/ VEGF kompleksa. Kvantifikacija FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF kompleksne kompozicije je zasnovana na kalibracionim krivama. Rezultati ovog eksperimenta su prikazani na slivi 28, koje pokazuju odnos VEGF 165 u odnosu na FltlD2FlklD3.FcACl(a) u kompleksu daje 1:1.

Primer 26: Određivanje stehiometrije vezivanja

FltlD2FlklD3. FcACl( aWEGF165 kompleksa pomoću ekskluzuzine

hromatografije na osnovu veličine

Pobijanje FltlD2FlklD3. FcACl( aWEGF165 kompleksa

VEGF165 (koncentracija = 3.61 mg/ml) je pomešan sa CHO ćelijama koje privremeno daju FltlD2FlklD3.FcACl(a) (koncentracija = 0.9 mg/ml) u molarnom odnosu 3:1 (VEGF165: FltlD2FlklD3.FcACl(a)) i inkubiran u toku noći na 4°C.

( a) Ekskluziona hromatografija na osnovu veličine ( SEC) pod običnim

uslovima

Da bi se odvojio kompleks od nevezanog VEGF165, 50 pl kompleksa je nanesen na Pharmacia Superode 12 PC 3.2/30 koja je ekvilibrisana sa PBS puferom. Uzorak je eluiran sa istim puferom sa brzinom protoka od 40pl/min na sobnoj temperaturi. Rezultat ovog SEC je prikazan na Slici 31. Maksimum #1 predstavlja kompleks i maksimum #2 predstavlja ne vezani VEGF165. Frakcije eluirane između 1.1 i 1.2 ml su sakupljene i dodat je gvanidinijum hlorid (GuHCl) do finalne koncentracije 4.5 M da bi disocirao kompleks.

( b) Ekskluziona hromatografija na osnovu veličine ( SEC) u uslovima

disocijacije

Da bi se odvojile komponente receptor-ligand kompleksa i odredio njihov molarni odnos, 50pl disosovanog kompleksa kao što je opisanosupra,je naneseno na Superosu 12 PC 3.2/30 ekvilibrisanu sa 6M GuHCl i eluiranu sa istim rastvorom sa protokom od 40 pl/min. pri sobnoj temperaturi. Rezultat ove SEC je prikazan na slici 32. maksimum #1 predstavlja FltlD2FlklD3.FcACl(a) i maksimum #2 predstavlja VEGF 165.

( c) Izračunavanje stehiometrije za FltlD2FlklD3. FcACl( a) :VEGF165

kompleks

Stehometrija kompleksa receptor ligand je određena iz površine maksimuma ili visine maksimuma komponenti. Koncentracije VEGF165 i FltlD2FlklD3.FcACl(a) koje odgovaraju visini maksimuma ili površini maksimuma, respektivno, su dobijene iz standardnih kriva za VEGF165 i FltlD2FlklD3.FcACl(a). Da bi se dobila standardna kriva, četiri različite koncentracije (0.04 mg/ml-0.3 mg/ml) svake komponente koje su nanesene na Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolonu su ekvilibrisane sa 6M guanidijum hloridom i eluirane sa istim rastvorom pri brzini protoka 40 pl/min. na sobnoj temperaturi. Standardna kriva je dobijena nanošenjem površine maksimuma naspram koncentracije proteina. Molarni odnos VEGF165: FltlD2FlklD3.FcACl(a) određen prema površini maksimuma komponenti je 1.16. Molarni odnos VEGF 165: FltlD2FlklD3.FcACl(a) je određen iz visine maksimuma komponenti je bio 1.10.

Primer 27: Određivanje stehiometrije

FItlD2FlklD3. FcACl( a)/ VEGF165 kompleksa ekskluzionom

hromatografijom na osnovu veličine sa rasipanjem svetlausklopu

sistema

Pobijanje kompleksa

VEGF165 je pomešan sa CHO koji privremeno vrše ekspresiju FltlD2FlklD3.FcACl(a) proteina u molarnom odnosu 3:1 (VEGF 165: FltlD2FlklD3.FcACl(a)) i inkubiran u toku noći na 4°C.

( a) Ekskluziona hromatografija na osnovu veličine sa rasipanjem

svetla u okviru sistema

Kolona za ekskluzionu hromatografiju na osnovu veličine sa MiniDawn detektorom u okviru sistema za rasipanje svetla (Wyatt Technology, Santa Barbara, California) i sa detektorom za merenje refraktivnog indeksa (RI)

(Shimadzu, Kyoto, Japan) su korišćeni da se odredi molekulska težina (MT) receptor-ligand kompleksa. Uzorci su injektovani na Superose 12 HR 10/30 kolonu (Pharmacia) ekvilibrisanu u PBS puferu i eluiranu sa istim puferom sa brzinom proticanja 0.5 ml/min. na sobnoj temperaturi. Kao što je prikazano na slici 33, elucioni profil pokazuje dva maksimuma. Maksimum #1 predstavlja receptor-ligand kompleks i maksimum #2 predstavlja nevezani VEGF 165. MT je izračunata iz LS i RI signala. Isti postupak je korišćen da se odredi MT individualnih komponenti receptor-ligand kompleksa. Rezultati ovih određivanja su kao što sledi:MT FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165 kompleksa na poziciji maksimuma je 157 300 (slika 33), MT VEGF 165 je na poziciji maksimuma 44 390(slika 34) i MT R1R2 na maksimumu je 113 300 (slika35).

Podatci pokazuju da stehiometrija FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF kompleksa 1:1 odgovara sumi molekulskih težina za FltlD2FlklD3.FcACl(a) i VEGF 165. Važno je da ovaj metod ubedljivo dokazuje da FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165 kompleks je stvarno bio sačinjen od samo jednog molekula VEGF 165 liganda i samo jednog molekula FltlD2FlklD3.FcACl(a).

Primer 28: Peptidno mapiranie FltlD2FlklD3. FcACl( a)

Disulfidne strukture i glikozilaciona mesta u FltlD2FlklD3.FcACl(a) su određena postupkom peptidnog mapiranja. U ovom metodu, protein se prvo čepa sa tripsinom. Triptinski fragmenti su analizirani i identifikovani sa HPLC-om kuplovanim sa masenim spektrometrom, dodatno uz N-terminalnu tehniku sekvenciranja. Redukcija triptinskog tretiranja je korišćeno da bi se pomoglo identifikaciji fragmenata koji sadrže disulfidne veze. Tretiranje triptinskih fragmenata sa PNGazom F(Glyko, Novato, CA) je korišćeno da pomogne identifikaciji fragmenata sa N-vezanim glikozilacionim mestima. Rezultati su sakupljeni na slici 36.

Ima ukupno 10 cisteina u FltlD2FlklD3.FcACl(a); šest njih pripada Fc regionu. Potvrđeno je daje Cys 27 disulfidno vezan sa Cys76. Potvrđeno je daje Cysl21 disulfidno vezan za Cysl82. Prva dva cisteina u Fc regionu (Cys211 i Cys214) grade intramolekulske disulfidne veze sa ista dva cisteina u drugom Fc lancu. Međutim, zbog toga što ta dva cisteina ne mogu biti odvojena enzimski jedan odrugog, ne može biti određeno da li se disulfidno vezivanje javlja između istih cisteina (na primer Cys211 za Cys211,) ili između Cys211 i Cys214. Potvrđeno je da je Cys216 disulfidno vezan za Cys306. Potvrđeno je daje Cys 352 vezan disulfidnom vezom za Cys410.

Postoji pet mogućih N-vezanih glikozilacionih mesta u FltlD2FlklD3.FcACl(a). Svih pet njih je nađeno da su glikozilovani u različitim stupnjevima. Kompletna glikozilacija je primećena kod Asn33 (amino kiselinska sekvenca NIT), Asnl93 (amino kiselinska sekvenca NST) i Asn282 (amino kiselinska sekvenca NST). Dodatno, delimična glikozilacija je primećena kod Asn65 i Asnl20. Glikozilaciona mesta u istaknuta podvlačenjem na slici 36.

Primer 29: Farmakokinetike analize modifikovanih Flt receptora

( a) Farmakokinetičke analize Fltl( l- 3)- Fc ( A- 40),

FltlD2. FlklD3. FcACl( a) i VEGFRlR2- FcACl( a)

Balb/c miševima (25-30 g) je injektovano subkutanozno 4mg/kg Fltl(1-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) dobijen privremenom ekspreijom iz CHO, FltlD2FlklD3.FcACl(a) dobijen stabilnom ekspresijom iz CHO i VEGFRlR2-FcACl(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO. Praćeno je propuštanje pri 1, 2, 4, 6, 24 sata, 2 dana, 3 dana i 6 dana posle injektiranja. Serum je analiziranu ELISA namenjenom da otkrije Fltl (1-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a). ELISA uključuju prevlačenje ELISA ploča sa VEGF 165, vezivanje detektovanog Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a) i izazivanje sa anti-Fc antitelom vezanim za peroksidazu iz rena. Rezultati eksperimenta su prikazani na slici 37. Tmaxza Fltl(l-3)-Fc (A40) je 6 sati dok je Tmaxza privremeni i stabilni FltlD2FlklD3.FcACl(a) i prolazni VEGFRlR2-FcACl(a) je bilo 24 sati. Cmaxza Fltl(l-3)-Fc (A40) je bio 8pg/ml. Za oba prolazna (FltlD2FlklD3.FcACl(a) i VEGFR1R2-FcACl(a)), Cmax je bio 18 ug/ml i Craax za VEGFRlR2-FcACl(a je bio 30 pg/ml.

( b) Farmakokinetičke analize Fltl( l- 3)- Fc ( A40),

FltlD2FlklD3. FcACl( a) i VEGFRlR2- FcACl( a)

Balb/c miševima (25-30 g) je injektovano subkutanozno 4mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO i sa VEGFRlR2-FcACl(a) dobijen privremenom ekspresijom iz CHO. Praćeno je oticanje pri 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 i 20 dana posle injektiranja. Serum je analiziranu ELISA namenjenom da otkrije Fltl(1-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). ELISA uključuju prevlačenje ELISA ploča sa 165, vezivanje detektovanog Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili F1UD2.VEGFR3D3-FcACl(a) i izazivanje sa anti-Fc antitelom vezanim za peroksidazu iz rena. Fltl(l-3)-Fc (A40) ne može biti više detektovan u serumu posle 5 dana, dok FltlD2FlklD3.FcACl(a) i FltlD2.VEGFR3D3-FcACl(a) su se mogli detektovati u toku 15 dana ili više. Rezultati eksperimenta su prikazani na slici 38.

Primer30:Procenasposobnosti FltlD2FlklD3. FcACl( a)da inhibira

rast tumora in vivo

Da bi se procenila sposobnost FltlD2FlklD3.FcACl(a) da inhibira rast tumora na in vivo modelu u kojem je suspenzija ćelija tumora implantirani subkutanozno na desnu slabinu muškog miša koji je korišćen sa ozbiljno kombinovanom imunodeficijencijom (SC1D). Dve ćelijske linije, Humane HT-1080 ćelije iz linije fibrosarkoma (ATCC dodatak br.CCL-121) i ćelijska linija glioma C6 pacova (ATTC dodatak br. CCL-107) od kojih svaka pokazuje osobito različitu morfologiju i karakteristike rasta su korišćene u testu. Prva doza FltlD2FlklD3.FcACl (a) (pri 25mg/kg ili kako je pokazano na slici 39 i40) je data na dan kada je izvršena implantacija tumora. Životinje su posle toga primile subkutanozno injekciju Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili slepe probe ili svakog drugog dana (EOD) ili dva puta nedeljno (2X/ned) u periodu od 2 nedelje. Posle 2 nedelje, životinje su prelivene sa fiksativom, tumori su uklonjeni i uzorci su zatamljeni. Zapremina tumora je određena menijem dužine i širine vidljivih subkutanoznih tumora. Oba Fltl(l-3)-Fc (A40) i FltlD2FlklD3.FcACl(a) značajno redukuju rast tumora nastalog od HT-1080 i C6 ćelija. Rezultati ovih eksperimenata su prikazani na slici 39 i slici 40.

Primer 31: Efekat VEGF165 i izmenjenih Flt receptora na ženski

reproduktivni sistem

Stereotipni uzorak vaskularnog remodelovanja koji se dešava u materici i jajniku u toku reproduktivnog ciklusa dobro je karakterisan, čineći ova tkiva pogodnim za studiju mehanizma koji reguliše angiogenezu, vaskularno remodelovanje i vaskularau regresiju. U stvari,in situhibridizacione studije u reproduktivnim tkivima obezbeđuju prvi jasan dokaz da VEGF deluje kao posrednik fiziološke angiogeneze kod zrelih glodara, kao i ljudi i ne-humanih primata (Phillips et al., 1990; Ravindranath et al, 1992; Shvveiki et al, 1993; Kamat et al, 1995). S obzirom da su ciklična angiogeneza i vaskularno remodelovanje istaknute karakteristike normalnih jajnika i materice, nije iznenađujući rast abnormalnih krvnih sudova i/ili vaskularne disfunkcije koji je nađeno da karakteriše mnogo patoloških stanja koji utiču na ove organe. Osim toga, ove vaskularne patogene abnormalnosti se smatra da su izazvane ili ovekovečene neregulisanom ekspresijom jedne ili više angiogenetskih ili anti-angiogenetskih faktora, najistaknutijeg VEGF.

Na primer, abnormalna angiogeneza je karakteristika policistične bolesti jajnika, endometroze i karcinoma endometrijuma i u svakom slučaju u napadnutim tkivima dolazi do preterane ekspresije VEGF (Kamat et al, 1995; Shifren et al, 1996; Guidi et al, 1996; Donnez et al, 1998). Preterana ekspresija VEGF se takođe mislilo da igra patogenu ulogu u postavljanju sistemskih vaskularnih bolesti hiperpermeabilnosti kod sindroma hiperstimulacije jajnika (McClure et al, 1994; Levin et al, 1998) i preeklamsije (Baker et al, 1995; Sharkev et al, 1996). Dodatno VEGF je bio upleten kao faktor permeabilnost odgovoran za dobijanje ascita u vezi sa karcinomom jajnika i drugim tumorima (Senger et al, 1983; Boocock et al, 1995). Sredstva koja efikasno neutrlalizuju biološko dejstvo VEGF mogu biti mogu se realno smatrati da su od koristi za lečenju gore nevedenim i drugim stanjima.

Angiogeneza i vaskularno remodelovanje su takođe oznake implantacije blastocita i razvoja placente (findalav, 1986). Postoji jaka ekspresija VEGF i kod decidue materice i kod embrionskih tromboblasta, gde se mislilo da prvo stimuliše ekspanziju i hiperpermeabilnost vaskularnog sistema materice u toku perioda peri-implantacije i zatim posreduje u nastanku obe i maternalne i embrionske komponenta vaskulature placente (Shweiki et al, 1993; Cullinan-Bove and Koos, 1993; Chakraborty et al, 1995; Das et al, 1997). VEGF je takođe potreban za leutnu angiogenezu i vezi sa njom neophodnim lučenjem progesterona da se pripremi materica za implantaciju (Ferra et al, 1988). Prema tome, sredstva koja inhibiraju biološku aktivnost VEGF mogu dokazati da su korisna kao kontraceptivna sredstva (sprečavajući implantaciju), ili kao sredstva za abortus u ranim stadijumima trudnoće. Sledeća prijava će možda naći naročitu upotrebu nehiruške intervencije za prekid ektopičnih trudnoća.

Dok je ekspresija VEGF receptora visoko ograničena vaskularnim endotelijumom kod reprodukcije normalnih tkiva, takođe ekspresija Fltl od strane tromboblasta u placenti kod ljudi i životinja (Clark et al, 1996; He et al, 1999) gde je bilo predloženo da igraju ulogu u invaziji tromboblasta. Interesantno, ekspresija oba Fltl i KDR (Flkl) od strane ćelijske linije BEWo horiokarcinoma (Charnock-jones et al, 1994) i VEGF je prikazano da potpomaže DNA sintezu i tirozin fosforilaciju MAP kinaze u ovim ćelijama. Dalje, primarni i metastatički karcinomi jajnika ne samo vrše ekspresiju visokog nivoa VEGF, nego dodatno vaskularnom endotelijumu-ćelije tumora same vrše ekspresiju KDR i/ili Fltl (Book rat al, 1995). Ova otkrića sugerišu da VEGF ne mora biti sam kritički uključen u generaciju i održavanje tumorne vaskulature, nego da bar u nekim tumorima reproduktivnog porekla VEGF mogu imati i autokrinu ulogu, direktno podržavajući opstanak i proliferaciju ćelija tumora. Prema tome sredstvo koje blokira dejstvo VEGF može imati naročito korisnu primenu u lečenju tumora reproduktivnog porekla.

Metodi i rezultati

( a) Procena VEGF indukovane hiperpermeabilnosti materice

Serum gonadotropin trudne kobile (PMSG) je injektovan subkutanozno (5 IU) da se izazove ovulacija kod predpubertetskih ženskih pacova. Ovo rezultuje uzburkanim estradiolom posle 2 dana koji zauzvrat izaziva indukciju VEGF-a u materici. Zabeleženo je da ovi izazvani rezultati hiperpermeabilnosti materice i povećanja u težini vlažne materice posle 6 sati, što prema tome može potencijalno biti blokirano sa izmenjenim Flt receptorima Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFR1R2-FcACl(a). U ovom in vivo modelu, normalna težina materice pacova je oko 50 mg a može biti izazvano do 300-350 mg PMSG. Osušena tkiva otkrivaju daje ovo sva vodena masa. Subkutanoznom injekcijom Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) ili VEGFRlR2-FcACl(a) 25 mg/kg posle 1 sata posle PSMG injekcije rezultuje u oko 50% inhibicije porasta težini vlažnnosti materice. Povećavanjem doze izmenjenih Flt receptora ne smanjuje dalje porast u težini vlage što sugeriše da postoji VEGF nezavisna komponenta u ovom modelu, rezultatui eksperimenta su prikazani na slici 41.

( a) Procena angiogeneze žutog ta pomoću progesterona kao

obeleživača

Serum gonadotropin ždrebne kobile (PMSG) je injektovan subkutanozno (5IU) da izazove ovulaciju kod predpubertetskih ženskih pacova. Ovo rezultuje punom funkcijom žutog tela koje sadrži gustu mrežu krvnih sudova posle 4 dana što omogućava izlučivanje progestrona u krvotok u cilju pripremanja materice za implantaciju. Izazivanje angiogeneze u žutom telu zahteva VEGF; prema tome, blokiranje VEGF će rezultovati nedostatkom novih krvnih sudova i prema tome nedostatkom progesterona izlučenog u krvotok. Na ovom in vivo modelu, u mirovanju je nivo progesterona oko 5nm/ml i može se izazvati nivo 25-40 ng/ml posle PMSG. Subkutanoznom injekcijom Fltl(l-3)-Fc (A40) ili FltlD2FlklD3.FcACl(a) pri 25 mg/kg ili 5mg/kg 1 sat posle PSMG injekcije rezultuje u kompletnoj inhibiciji indukcije progesterona do 4 dana. Rezultati ovog eksperimenta su pokazani na slici 42A-42B.

Primer 33: Farmakokinetičke analizeFltl( l- 3)- Fc ( A40) ipegilovanog

Fltl( l- 3VFc

Fltl(l-3)-Fc je pegilovan sa ili lOkD PEG il 20KD PEG i testiran je na balb/c miševima zbog njihovog faramkokinetičkog profila. Oba PEG-ilovana oblika je nađeno da imaju mnogo bolje PK profile nego Flt(l-3)-Fc (A40), sa Tmax oko 24 sata za PEGilovane molekula nasuprot do 6 sati za Fltl(l-3)-Fc (A40).

Primer 34: VEGF165 ELISA za testiranjeafiniteta izmenjenih Fltl

varijanti receptora

10 pM VEGF 165 je inkubiran u toku noći na sobnoj temperaturi sa modifikovanim Fltl varijantama receptora u opsegu od 160 pM do 0.1M. Modifikovani Fltl varijante receptora korišćene u ovom eksperimentu su Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlDlFlklD3.FcACl(a) koji je dobijen privremenom ekspresijom, FltlD2VEGFRD3-FcACl(a), Fltl(l-3NAs)-Fc, Fltl(l-3R_>C)-Fc i Tie2-Fc. F1U(1-3nas)-Fc je modifikovan verzija Fltl(l-3)-Fc u kojoj visoko bazne amino kiselinske sekvence KNKRASVRRR su zamenjene sa NASVNGSR, što rezultuje u inkorporaciji dva nova glikozidna mesta i smanjenju ukupnog +5 naelektrisanja, oba u cilju smanjenja nepovoljnih efekata ove sekvence na PK. Fltl(l-3R_>C)-Fc je modifikacija u kojoj pojedini argininski (R) ostatak u okviru iste bazne amino kiselinske sekvence je promenjen u cistein (C) (KNKRASVRRR->KNKCASVRRR) da omogući pegilaciju na ostatku, koji će zatim zaštititi bazni region od vršenja njegovog nepovoljnog efekta na PK. Posle inkubacije rastvor je premešten na ploču koja sadrži zarobljena tela VEGF 165 (R&D). Količina slobodnog VEGF 165 je zatim određivana korišćenjem antitela da bi se registrovao slobodni VEGF 165. Ovo pokazuje da modifikovana varijanta Fltl receptora sa visokim afinitetom za VEGF165 (određenim kao najniža količina slobodnog VEGF165) je FltlD2FlklD3.FcACl(a), a zatim sledi Fltl(l-3)-Fc i Fltl(l-3)-Fc(A40) i zatim Fltl(l-3R.>C), Fltl (1-3NAS) i FltlD2VEFGFR3D3-FcACa(a). Tie2Fc nema afinitet za VEGF 165.

Claims

1. Izolovani molekul nukleinske kiseline, naznačen time, što se sastoji od: (a) nukleotidne sekvence koja kodira receptorsku komponentu vaskularnog endotelijanog faktora rasta [VEGF] koja se sastoji u osnovi od domena 2 prvog VEGF receptora sličnog imunoglobulinu (Ig) i Ig domena 3 drugog VEGF receptora; i (b) nukleotidne sekvence koja kodira multimerizacionu komponentu, gde je prvi VEGT receptor Fltl, a drugi VEGF receptor je Flkl ili Flt4 i VEGF receptorska komponenta je samo VEGF receptorska komponenta fuzionog polipeptida.

2. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 1, naznačen time, što nukleotidna sekvenca koja kodira Ig domen 2 ekstracelularnog domena prvog VEGF receptora je ispred nukleotidne sekvence koja kodira Ig domen 3 ekstracelularnog domena drugog VEGF receptora.

3. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 1, naznačen time, što nukleotidna sekvenca koja kodira Ig domen 2 ekstracelularnog domena prvog VEGF receptora je iza nukleotidne sekvence koja kodira Ig domen 3 ekstracelularnog domena drugog VEGF receptora.

4. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema bilo kom prethodnom patentom zahtevu, naznačen time, što multimerizaciona komponenta se sastoji od domena imunoglobulina.

5. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema patentnom zahtevu 4, naznačen time, što je domen imunoglobulina izabran iz grupe koja se sastoji od Fc domena IgG i teškog lanca IgG.

6. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 1, naznačen time, što se sastoji od nukleotidne sekvence izabrane iz grupe koju čine: (a) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 21A-21C; (b) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 22A-22C; (c) nukleotidna sekvenca prikazana na slici 24A-24C; i (d) nukleotidna sekvenca, koja kao rezultat degeneracije genetičkog koda, se razlikuje od nukleotidnih sekvenca (a), (b) ili (c).

7. Izolovani molekul nukleinske kiseline prema zahtevu 1, naznačen time, što su komponente fuzionog polipeptida složene kao 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; ili 3,2,1, gde je 1 prva komponente VEG receptora, 2 je druga komponenta VEGF receptora i 3 je multimerizaciona komponenta.

8. Fuzioni polipeptid, naznačen time, što je kodiran izolovanom molekulom nukleinske kiseline prema bilo kom prethodnom patentnom zahtevu.

9. Vektor, naznačen time, što se sastoji od molekula nukleinske kiseline prema bilo kom od patentnih zahteva 1 do 7.

10. Ekspresioni vektor koji se sastoji od molekula nukleinske kiseline prema bilo kom patentom zahtevu od 1 do 7, naznačen time, što je molekul nukleinske kiseline operativno vezan za ekspresionu kontrolnu sekvencu.

11. Sistem domaćin-vektor za proizvodnju fuzionog polipeptida, naznačen time, što se sastoji od ekspresionog vektora prema patentnom zahtevu 10, u pogodnoj ćeliji domaćinu.

12. Sistem domaćin-vektor prema patentom zahtevu 11, naznačen time, što je pogodna ćelija domaćin bakterijska ćelija, ćelija kvasca, ćelija insekta ili ćelija sisara.

13. Sistem domaćin-vektor prema patentnom zahtevu 12, naznačen time, što je pogodna ćelija domaćin E.Coli ili CHO ćelija.

14. Postupak za dobijanje fuzionog polipeptida, naznačen time, što se sastoji od gajenja ćelija sistema domaćin-vektor prema bilo kom od patentnih zahteva 11 do 13, pod uslovima koji dozvoljavaju dobijanje fuzionog polipeptida i izolovanje tako dobijenog fuzionog polipeptida.

15. Dimerni antagonist vaskularnog endotelijalnog faktora rasta (VEGF), naznačen time, što se sastoji od dva fiiziona polipeptida, a svaki fuzioni polipeptid se sastoji od a) VEGF receptorske komponente koja se u osnovi sastoji od domena 2 Fltl VEGF receptora sličnog imunoglobulinu (Ig) i Ig domena 3 Flt-1 ili Flt-4 VEGF receptora; i b) multimerizacione komponente; gde VEGF receptorska komponeta je samo VEGF receptorska komponenta svakog fuzionog proteina.

16. Dimerni antagonist prema zahtevu 15, naznačen time, stoje modifikovan acetilacijom ili pegilacijom.

17. Fuzioni polipeptid, naznačen time, što se sastoji: (a) VEGF receptorske komponente koja se u osnovi sastoji od domena 2 Flt-1 VEGF receptora sličnog imunoglobulinu (Ig) i Ig domena 3 Flkl ili Flk-4 VEGF receptora; i (b) multimerizacione komponente; gde je VEGF receptorska komponenta jedina VEGF receptorska komponenta u fiizionom polipeptidu.

18. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 17, naznačen time, što mu se multimerizaciona komponenta sastoji od imunoglobulinskog domena.

19. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 18, naznačen time, što je imunoglobulisnki domen izabran iz grupe koj čine Fc domen IgG i težak lanac IgG.

20. Fuzioni polipeptid prema zahtevu 19, naznačen time, što se sastoji iz amino-kiselinske sekvence prikazane na slikama 21A-21C, slikama 22A-22C ili slikama 24A-24C.

21. Upotreba fuziong polipeptida prema bilo kom od patentnih zahteva 17 do 20 ili dimernog antagonista prema bilo kom od zahteva 15 ili 16 u proizvodnji leka za ublažavanje ili inhibiciju rasta tumora, za ublažavanje ili sprečavanje edema, za ublažavanje ili spečavanje ascita, za smanjenje ili inhibiciju propuštanja plazme ili za blokiranje rasta krvnih sudova kod čoveka.