DE60019415T2

DE60019415T2 - Modifizierte chimärische polypeptide mit verbesserten pharmakokynetischen eigenschaften

Info

Publication number: DE60019415T2
Application number: DE60019415T
Authority: DE
Inventors: J. Nicholas PAPADOPOULOS; Samuel Davis; D. George YANCOPOULOS
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2006-03-09
Anticipated expiration: 2020-05-24
Also published as: DE60019415D1; CN1369009A; ATE417928T1; EP1183353A1; NO2013010I1; SK17522001A3; LU92195I2; BRPI0011407B1; NO2022060I1; LTPA2013009I1; BR0011407A; KR20020019070A; HRP20010908B1; PT1183353E; WO2000075319A1; CZ303656B6; HUS1300052I1; FR13C0028I1; FR13C0028I2; HRP20010908A2

Description

Diese Anmeldung beansprucht die Priorität der vorläufigen U.S.-Anmeldung Nr. 60/138 133, welche am 8. Juni 1999 eingereicht wurde.
Einführung
Beim Gebiet dieser Erfindung handelt es sich um modifizierte Polypeptide mit verbesserter Pharmakokinetik. Spezifisch gesagt, bezieht sich das Gebiet dieser Erfindung auf Flt1-Rezeptor-Polypeptide, welche auf eine solche Weise modifiziert worden sind, dass ihr pharmakokinetisches Profil verbessert wird. Das Gebiet dieser Erfindung betrifft auch Verfahren zur Herstellung und Verwendung der modifizierten Polypeptide, einschließlich, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, die Verwendung der modifizierten Polypeptide zur Verringerung oder Inhibierung von Plasma-Ausströmung und/oder Gefäß-Durchlässigkeit in einem Säuger.
Hintergrund
Das Vermögen von Polypeptidliganden, an Zellen zu binden und dadurch eine phänotypische Antwort, wie Zellwachstum, Überleben, Zellproduktsekretion oder Differenzierung, hervorzurufen, wird häufig über Transmembranrezeptoren auf den Zellen vermittelt. Die extrazelluläre Domäne solcher Rezeptoren (d.h. derjenige Teil des Rezeptors, der auf der Oberfläche der Zelle präsentiert wird) ist im allgemeinen der am besten kennzeichnende Teil des Moleküls, da er dem Protein seine Ligandenbindungs-Charakteristik gibt. Die Bindung eines Liganden an die extrazelluläre Domäne führt im allgemeinen zur Signaltransduktion, welche ein biologisches Signal an intrazelluläre Ziele übermittelt. Häufig funktioniert diese Signaltransduktion über eine katalytische intrazelluläre Domäne. Die jeweilige Anordnung von Sequenzmotiven dieser katalytischen intrazellulären Domäne bestimmt ihren Zugang zu potentiellen Kinasesubstraten (Mohammadi et al., 1990, Mol. Cell. Biol. 11:5068–5078; Fantl et al., 1992, Cell 69:413–413). Beispiele von Rezeptoren, welche Signale über katalytische intrazelluläre Domänen transduzieren, schließen die Rezeptortyrosinkinasen (RTKs), wie die Trk-Familie von Rezeptoren, welche im allgemeinen auf Zellen des Nervensystems beschränkt sind, die Cytokin-Familie von Rezeptoren, einschließlich des dreiteiligen bzw. tripartaten CNTF-Rezeptorkomplexes (Stahl & Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25:1454–1466), welche ebenfalls auf die Zellen des Nervensystems beschränkt ist, G-Protein-gekoppelte Rezeptoren, wie den β₂-adrenergen Rezeptor, welcher beispielsweise auf Herzmuskelzellen gefunden wird, und den multimeren IgE-Hochaffinitätsrezeptor FcεRI, welcher größtenteils auf Mastzellen und Basophilen lokalisiert ist (Sutton & Gould, 1993, Nature 366:421–428), ein.
Alle bislang identifizierten Rezeptoren scheinen eine Dimerisierung, Multimerisierung oder sonstige verwandte Konformationsänderung im Anschluß an die Ligandenbindung zu durchlaufen (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sci. 13:443–447; Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203–212; Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9:383–391), und molekulare Wechselwirkungen zwischen dimerisierenden intrazellulären Domänen führen zur Aktivierung der katalytischen Funktion. In manchen Fällen, wie beim Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), ist der Ligand ein Dimer, welches zwei Rezeptormoleküle bindet (Hart et al., 1988, Science, 240:1529–1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264:8905–8912), wohingegen beispielsweise im Falle von epidermalem Wachstumsfaktor (EGF) der Ligand ein Monomer ist (Weber et al., 1984, J. Biol. Chem. 259:14631–14636). Im Falle des FcεRI-Rezeptors liegt der Ligand, IgE, gebunden an FcεRI in einer monomeren Weise vor, und wird nur aktiviert, wenn Antigen an den IgE/FcεRl-Komplex bindet und benachbarte IgE-Moleküle vernetzt (Sutton & Gould, 1993, Nature 366:421–428).
Oftmals gewährt die Gewebeverteilung eines besonderen Rezeptors innerhalb höherer Organismen eine Einsicht in die biologische Funktion des Rezeptors. Die RTKs für manche Wachstums- und Differenzierungsfaktoren, wie Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF), werden in weitem Umfang exprimiert und scheinen daher eine gewisse allgemeine Rolle bei Gewebewachstum und -aufrechterhaltung zu spielen. Mitglieder der Trk-RTK-Familie (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3:262–268) von Rezeptoren sind allgemeiner auf Zellen des Nervensystems beschränkt, und die Nervenwachstumsfaktor-Familie, bestehend aus Nervenwachstumsfaktor (NGF), Gehirn-abgeleitetem neurotrophen Faktor (BDNF), Neurotrophin-3 (NT-3) und Neurotrophin-4/5 (NT-4/5), welche die Trk-RTK-Familien-Rezeptoren binden, fördern die Differenzierung diverser Gruppen von Neuronen im Gehirn und der Peripherie (Lindsay, R. M., 1993, in Neurotrophic Factors, Hrsg.: S.E. Loughlin & J. H. Fallon, S. 257–284, San Diego, CA, Academic Press). FcεRI ist auf eine sehr limitierte Anzahl von Zelltypen, wie Mastzellen und Basophile, lokalisiert. Mastzellen stammen aus der pluripotenten hämatopoietischen Stammzell-Abstammungslinie des Knochenmarks, aber vervollständigen ihre Reifung im Gewebe im Anschluß an eine Wanderung aus dem Blutstrom (siehe Janeway & Travers, 1996, in Immunobiology, 2. Auflage, Hrsg.: M. Robertson & E. Lawrence, S. 1:3–1:4, Current Biology Ltd., London, Großbritannien, Publisher) und sind an der allergischen Antwort beteiligt. Viele Untersuchungen haben gezeigt, dass die extrazelluläre Domäne eines Rezeptors die spezifische Ligandenbindungscharakteristik vorsieht. Darüber hinaus kann die zelluläre Umgebung, in der ein Rezeptor exprimiert wird, die biologische Antwort, welche nach Bindung eines Liganden an den Rezeptor aufgezeigt wird, beeinflussen. Wenn zum Beispiel eine neuronale Zelle, welche einen Trk-Rezeptor exprimiert, an ein Neurotrophin exponiert wird, das an diesen Rezeptor bindet, resultieren das neuronale Überleben und Differenzierung. Wenn der gleiche Rezeptor von einem Fibroblasten exprimiert wird, führt die Exposition an das Neurotrophin zur Proliferation des Fibroblasten (Glass et al., 1991, Cell 66:405–413).
Eine Klasse von Zell-abgeleiteten dimeren Mitogenen mit Selektivität für Gefäßendothelzellen ist identifiziert und als vaskulärer endothelialer Zell-Wachstumsfaktor (VEGF) bezeichnet worden. VEGF ist aus konditioniertem Wachstumsmedium von Rattengliomzellen [Conn et al., (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, S. 2628–2632]; und konditioniertem Wachstumsmedium von follikulären Sternzellen der Rinderhypophyse [Ferrara und Henzel, (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, S. 851–858; Gozpadorowicz et al., (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, S. 7311–7315] und konditioniertem Wachstumsmedium von humanen U937-Zellen [Connolly, D. T., et al., (1989), Science, 246, S. 1309–1312] gereinigt worden. VEGF ist ein Dimer mit einer scheinbaren molekularen Masse von etwa 46 kDa, wobei jede Untereinheit eine scheinbare molekulare Masse von etwa 23 kDa besitzt. VEGF besitzt einige Strukturähnlichkeiten zum Blutplättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor (PDGF), welcher ein Mitogen für Bindegewebszellen ist, aber nicht mitogen für Gefäßendothelzellen aus großen Gefäßen ist.
Von dem, als Flt bekannten, membrangebundenen Tyrosinkinase-Rezeptor wurde gezeigt, ein VEGF-Rezeptor zu sein [DeVries, C., et al., (1992), Science, 255, S. 989–991]. Der Flt-Rezeptor bindet spezifisch VEGF, was eine Mitogenese induziert. Eine andere Form des VEGF-Rezeptors, die als KDR bezeichnet wird, bindet bekanntermaßen ebenfalls VEGF und induziert Mitogenese. Die partielle cDNA-Sequenz und die beinahe Volllängen-Proteinsequenz von KDR sind ebenfalls be kannt [Terman, B. I., et al., (1991) Oncogene 6, S. 1677–1683; Terman, B. I., et al., (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, S. 1579–1586].
Eine persistente Angiogenese kann bestimmte Krankheiten, wie Psoriasis, rheumatoide Arthritis, Hämangiome, Angiofibrome, diabetische Retinopathie und neovaskuläres Glaucom, verursachen oder verschlimmern. Ein Inhibitor der VEGF-Aktivität wäre nützlich als eine Behandlung für derartige Krankheiten und andere VEGF-induzierte pathologische Angiogenese- und Gefäßdurchlässigkeits-Zustände, wie Tumorvaskularisierung. Die vorliegende Erfindung betrifft einen VEGF-Inhibitor, welcher auf dem VEGF-Rezeptor Flt1 basiert.
Plasma-Ausströmung, eine Schlüsselkomponente von Entzündung, tritt in einer bestimmten Untergruppe von Mikrogefäßen auf. Insbesondere findet in den meisten Organen die Plasma-Ausströmung spezifisch in den Venülen statt. Anders als Arteriolen und Kapillaren werden Venülen in Antwort auf zahlreiche Entzündungs-Mediatoren, einschließlich Histamin, Bradykinin und Serotonin, undicht. Ein Merkmal von Entzündung ist die Plasma-Ausströmung, welche von interzellulären Lücken herrührt, die sich im Endothel von Venülen bilden. Die meisten experimentellen Modelle für Entzündung weisen darauf hin, dass diese interzellulären Lücken zwischen den Endothelzellen von Postkapillaren- und Sammel-Venülen auftreten (Baluk, P., et al., Am. J. Pathol. 1998, 152:1463–76). Es ist gezeigt worden, dass bestimmte Lectine verwendet werden können, um Merkmale von Brennpunkten von Plasma-Ausströmung, Endothel-Lücken und fingerartigen Ausläufern an Endothelzellgrenzen in entzündeten Venülen aufzuzeigen (Thurston, G., et al., Am. J. Physiol., 1996, 271:H2547–62). Im besonderen sind Pflanzenlectine verwendet worden, um morphologische Änderungen an Endothelzellgrenzen in entzündeten Venülen beispielsweise der Ratten-Luftröhre sichtbar zu machen. Lectine, wie Conconavalin A und Ricin, welche brennpunktmäßig an entzündete Venülen binden, enthüllen Regionen der subendothelialen Gefäßwand, welche durch Lücken freiliegen, die den Stellen des Plasma-Ausströmens entsprechen (Thurston, G., et al., Am. J. Physiol., 1996, 271:H2547–62).
Die Eigenschaften der Mikrogefäße sind dynamisch. Chronische Entzündungskrankheiten sind beispielsweise mit der Neumodellierung bzw. Rekonstruktion von Mikrogefäßen, einschließlich Angiogenese und Mikrogefäßvergrößerung, assoziiert. Mikrogefäße können auch durch Erwerben abnormaler phänotypischer Eigenschaften neumodelliert werden. In einem Mausmodell der chronischen Luftwegsentzündung erwerben Luftwegskapillaren Eigenschaften von Venülen, einschließlich erweitertem Gefäßdurchmesser, erhöhter Immunreaktivität für den von-Willebrand-Faktor und erhöhter Immunreaktivität für P-Selectin. Darüber hinaus lecken diese neumodellierten Gefäße in Antwort auf Entzündungs-Mediatoren, wohingegen Gefäße in der gleichen Position in den Luftwegen normaler Mäuse dies nicht tun.
Von bestimmten Substanzen ist gezeigt worden, die Gefäßdurchlässigkeit und/oder das Plasma-Ausströmen zu vermindern oder zu inhibieren. Beispielsweise sind Mystixine synthetische Polypeptide, welche berichtetermaßen die Plasma-Ausströmung inhibieren, ohne die Endothel-Lückenbildung zu blockieren (Baluk, P., et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1988, 284:693–9). Auch der beta2-adrenerge Rezeptoragonist Formoterol reduziert die Mikrogefäßausströmung durch Inhibieren der endothelialen Lückenbildung (Baluk, P., und McDonald, D. M., Am. J. Physiol., 1994, 266:L461–8).
Die Angiopoietine und Mitglieder der vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor(VEGF)-Familie sind die einzigen Wachstumsfaktoren, welche angenommenerweise in großem Maße spezifisch für Gefäßendothelzellen sind. Zielgelenkte Geninaktivierungs-Untersuchungen in Mäusen haben gezeigt, dass VEGF notwendig für die frühen Stufen der Gefäßentwicklung ist, und dass Ang-1 für die späteren Stufen der Gefäß-Neumodellierung erforderlich ist.
Das U.S.-Patent Nr. 6 011 003, erteilt am 4. Januar 2000 im Namen von Metris Therapeutics Limited, offenbart, dass eine veränderte lösliche Form des FLT-Polypeptids in der Lage ist, an VEGF zu binden und dadurch einen inhibitorischen Effekt darauf auszuüben, wobei das Polypeptid fünf oder weniger vollständige Immunoglobulindomänen umfasst.
Das U.S.-Patent Nr. 5 712 380, das am 27. Januar 1998 erteilt und an Merck & Co. zugewiesen wurde, offenbart Inhibitoren des vaskulären endothelialen Zell-Wachstumsfaktors (VEGF), welche natürlich vorkommende oder rekombinant hergestellte lösliche Formen mit oder ohne eine C-terminale Transmembranregion des Rezeptors für VEGF sind.
Ebenfalls zugewiesen an Merck & Co. ist die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 98/13071, veröffentlicht am 2. April 1998, welche eine Gentherapie-Methodik für die Inhibition von primärem Tumorwachstum und Metastase durch Gentransfer einer Nukleotidsequenz, die ein lösliches Rezeptorprotein codiert, welches an VEGF bindet, offenbart.
Die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/44453, die am 27. November 1997 im Namen von Genentech, Inc. veröffentlicht wurde, offenbart neue chimäre VEGF-Rezeptorproteine, welche Aminosäuresequenzen umfassen, abgeleitet aus den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor(VEGF)-Rezeptoren Flt1 und KDR, einschließlich des Maus-Homologs zum humanen KDR-Rezeptor FLK1, wobei die chimären VEGF-Rezeptorproteine an VEGF binden und dessen Endothelzellproliferative und angiogenetische Aktivität antagonisieren (siehe auch Davis-Smyth et al., EMBO J., 1996, Band 15, S. 4919–4927).
Die PCT-Veröffentlichung Nr. WO 97/13787, veröffentlicht am 17. April 1997 im Namen von Toa Gosei Co., LTD., offenbart einen niedermolekulargewichtigen VEGF-Inhibitor, der in der Behandlung von Krankheiten, welche von Neovaskularisierung begleitet werden, wie festen Tumoren, verwendbar ist. Ein Polypeptid, welches die erste Immunoglobulin-artige Domäne und die zweite Immunoglobulin-artige Domäne in der extrazellulären Region eines VEGF-Rezeptors FLT enthält, jedoch nicht die sechste Immunoglobulin-artige Domäne und die siebte Immunoglobulin-artige Domäne davon enthält, zeigt eine VEGF-inhibierende Aktivität.
Sharifi, J., et al., 1998, The Quaterly Jour. of Nucl. Med. 42:242–249, offenbaren, dass, weil monoklonale Antikörper (MAbs) basische positiv geladene Proteine sind und Säugerzellen negativ geladen sind, die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen den Beiden höhere Spiegel an Hintergrundbindung hervorrufen können, was zu niedrigen Tumor-zu-normalen-Organ-Verhältnissen führt. Um diesen Effekt zu überwinden, versuchten die Forscher, die MAb-Clearance unter Anwendung verschiedener Verfahren zu verbessern, wie sekundären Mitteln sowie chemischen und Ladungs-Modifikationen des MAb selbst.
Jensen-Pippo, et al., 1996, Pharmaceutical Research 13:102–107, offenbaren, dass die Pegylierung eines therapeutischen Proteins, rekombinantem humanen Granulozyten-koloniestimulierenden Faktor (PEG-G-CSF), zu einer Erhöhung der Stabilität und der Beibehaltung von in vivo Bioaktivität führt, wenn eine Verabreichung auf dem intraduodenalen Weg vorgenommen wird.
Tsutsumi, et al., 1997, Thromb. Haemost. 77:168–73, offenbaren Experimente, worin die in vivo thrombopoietische Aktivität von Polyethylenglycol-modifiziertem Interleukin-6 (MPEG-IL-6), in welchem 54 % der 14 Lysin-Aminogruppen von IL-6 mit PEG gekoppelt waren, mit derjenigen von nativem IL-6 verglichen wurde.
Yang, et al., 1995, Cancer 76:687–94, offenbaren, dass die Konjugation von Polyethylenglycol an rekombinantes humanes Interleukin-2 (IL-2) zu einer Verbindung führt, Polyethylenglycol-modifiziertem II-2 (PEG-IL-2), welche die in vitro und in vivo Aktivität von IL-2 beibehält aber eine merklich verlängerte Kreislauf-Halbwertszeit aufzeigt.
R. Duncan und F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27:290–306, 296 (1994), geben eine Übersicht über Bestrebungen, die Plasma-Halbwertszeit von Asparaginase durch Konjugation von Polyethylenglycol zu verbessern.
Die Internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 99/03996, welche am 28. Januar 1999 im Namen von Regeneron Pharmaceuticals Inc., und 'The Regents of The Universitiy of California' veröffentlicht wurde, beschreibt modifizierte humane Noggin-Polypeptide, welche Deletionen von Regionen basischer Aminosäuren aufweisen. Die modifizierten humanen Noggin-Polypeptide werden als biologische Aktivität beibehaltend beschrieben, während sie eine reduzierte Affinität für Heparin und eine überlegene Pharmakokinetik in Tierseren im Vergleich zum unmodifizierten humanen Noggin aufweisen.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend

a) eine Nukleotidsequenz, die eine Rezeptorkomponente für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), bestehend im wesentlichen aus einer Immunoglobulin-artigen (Ig)-Domäne 2 eines ersten VEGF-Rezeptors und einer Ig-Domäne 3 eines zweiten VEGF-Rezeptors, codiert; und
b) eine Nukleotidsequenz, die eine multimerisierende Komponente codiert, worin der erste VEGF-Rezeptor Flt1 ist und der zweite VEGF-Rezeptor Flk1 oder Flt4 ist und die VEGF-Rezeptorkomponente die einzige VEGF-Rezeptorkomponente des Fusionspolypeptids ist.

In einer bevorzugten Ausführungsform liegt die Nukleotidsequenz, welche die Ig-Domäne 2 der extrazellulären Domäne des ersten VEGF-Rezeptors codiert, stromaufwärts der Nukleotidsequenz, welche die Ig-Domäne 3 der extrazellulären Domäne des zweiten VEGF-Rezeptors codiert.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt die Nukleotidsequenz, welche die Ig-Domäne 2 der extrazellulären Domäne des ersten VEGF-Rezeptors codiert, stromabwärts der Nukleotidsequenz, welche die Ig-Domäne 3 der extrazellulären Domäne des zweiten VEGF-Rezeptors codiert.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung umfasst die multimerisierende Komponente eine Immunoglobulin-Domäne.
In einer anderen Ausführungsform wird die Immunoglobulin-Domäne aus der Gruppe gewählt, die aus der Fc-Domäne von IgG und der schweren Kette von IgG besteht.
Bevorzugte Ausführungsformen schließen ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ein, umfassend eine Nukleotidsequenz, welche ein modifiziertes Flt1-Rezeptor-Fusionspolypeptid codiert, wobei die codierende Region des Nukleinsäuremoleküls aus einer Nukleotidsequenz besteht, die gewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus

(a) der in der 21A–21C dargestellten Nukleotidsequenz;
(b) der in der 22A–22C dargestellten Nukleotidsequenz;
(c) der in der 24A–24C dargestellten Nukleotidsequenz; und
(d) einer Nukleotidsequenz, welche sich als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes von der Nukleotidsequenz von (a), (b) oder (c) unterscheidet und welche ein Fusionspolypeptid-Molekül codiert, das die biologische Aktivität des modifizierten Flt1-Rezeptor-Fusionspolypeptids aufweist.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung wird ein Fusionspolypeptid von den isolierten Nukleinsäuremolekülen, welche obenstehend beschrieben sind, codiert.
Eine andere Ausführungsform ist ein Vektor, welcher die obenstehend beschriebenen Nukleinsäuremoleküle umfasst, einschließlich eines Expressionsvektors, umfassend die beschriebenen Nukleinsäuremoleküle, worin das Nukleinsäuremolekül operativ an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist.
Andere eingeschlossene Ausführungsformen sind ein Wirts-Vektorsystem für die Herstellung eines Fusionspolypeptids, welches den Expressionsvektor, in einer geeigneten Wirtszelle, umfasst; das Wirts-Vektorsystem, worin die geeignete Wirtszelle eine Bakterienzelle, Hefezelle, Insektenzelle oder eine Säugerzelle ist; das Wirts-Vektorsystem, wobei die geeignete Wirtszelle E. Coli ist; das Wirts-Vektorsystem, wobei die geeignete Wirtszelle eine COS-Zelle ist; das Wirts-Vektorsystem, worin die geeignete Wirtszelle eine CHO-Zelle ist.
Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung eines Fusionspolypeptids, welches das Wachsenlassen von Zellen des Wirts-Vektorsystems unter Bedingungen, die die Herstellung des Fusionspolypeptids und das Gewinnen des so hergestellten Fusionspolypeptids ermöglichen, umfasst.
Zusätzliche Ausführungsformen schließen einen dimeren Antagonist des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF) ein, umfassend zwei Fusionspolypeptide, wobei jedes Fusionspolypeptid folgendes umfasst:

(a) eine VEGF-Rezeptorkomponente, bestehend im Wesentlichen aus einer Immunoglobulin-artigen (Ig)-Domäne 2 von einem Flt1-VEGF-Rezeptor und einer Ig-Domäne 3 von einem Flk-1- oder Flt-4-VEGF-Rezeptor; und
(b) eine multimerisierende Komponente, worin die VEGF-Rezeptorkomponente die einzige VEGF-Rezeptorkomponente jedes Fusionsproteins ist.

Ein derartiger Antagonist kann durch Acetylierung oder Pegylierung modifiziert sein.
Das Fusionsprotein der Erfindung kann zur Verringerung oder Inhibierung von Plasma-Ausströmung in einem Säuger durch Verabreichen des obenstehend beschriebenen Fusionspolypeptids an den Säuger verwendet werden, einschließlich Ausführungsformen, worin der Säuger ein Mensch ist, das Fusionspolypeptid acetyliert ist oder das Fusionspolypeptid pegyliert ist. Das Fusionspolypeptid kann auch zur Blockierung des Blutgefäßwachstums in einem Menschen verwendet werden.
Weitere Anwendungen der Erfindung schließen die Abschwächung oder Verhinderung von Tumorwachstum beim Menschen; Abschwächung oder Verhinderung von Ödem in einem Menschen, insbesondere wobei das Ödem ein Gehirnödem ist; Abschwächung oder Verhinderung von Aszites-Bildung beim Menschen, insbesondere wobei der Aszites ein mit Eierstockkrebs assoziierter Aszites ist, ein.
Die Erfindung sieht ferner ein Fusionspolypeptid vor, umfassend

(a) eine VEGF-Rezeptorkomponente, bestehend im Wesentlichen aus einer Immunoglobulin-artigen (Ig)-Domäne 2 von einem Flt-1-VEGF-Rezeptor und einer Ig-Domäne 3 von einem Flk-1- oder Flk-4-VEGF-Rezeptor; und
(b) eine multimerisierende Komponente, worin die VEGF-Rezeptorkomponente die einzige VEGF-Rezeptorkomponente des Fusionspolypeptids ist.

Bevorzugte Ausführungsformen schließen ein Fusionspolypeptid ein, worin die Aminosäuresequenz von Ig-Domäne 2 der extrazellulären Domäne des ersten VEGF-Rezeptors stromaufwärts der Aminosäuresequenz von Ig-Domäne 3 der extrazellulären Domäne des zweiten VEGF-Rezeptors liegt, sowie ein Fusionspolypeptid, worin die Aminosäuresequenz von Ig-Domäne 2 der extrazellulären Domäne des ersten VEGF-Rezeptors stromabwärts der Aminosäuresequenz von Ig-Domäne 3 der extrazellulären Domäne des zweiten VEGF-Rezeptors liegt.
In noch einer anderen Ausführungsform umfasst die Fusionspolypeptid-Multimerisierungs-Komponente eine Immunoglobulin-Domäne, einschließlich einer Ausführungsform, worin die Immunoglobulin-Domäne aus der Gruppe gewählt wird, die aus der Fc-Domäne und der schweren Kette von IgG besteht.
Bevorzugte Ausführungsformen schließen ein Fusionspolypeptid ein, umfassend eine Aminosäuresequenz eines modifizierten Flt1-Rezeptors, wobei die Aminosäuresequenz aus der Gruppe gewählt wird, die besteht aus

(a) der in der 21A–21C dargestellten Aminosäuresequenz;
(b) der in der 22A–22C dargestellten Aminosäuresequenz; und
(c) der in der 24A–24C dargestellten Aminosäuresequenz.

Eine andere bevorzugte Ausführungsform ist die Verwendung eines Fusionspolypeptids oder dimeren Antagonisten der Erfindung in der Herstellung eines Medikamentes zur Verwendung zur Abschwächung oder Verhinderung des Tumorwachstums, zur Abschwächung oder Verhinderung von Ödem, zur Abschwächung oder Verhinderung von Aszites-Bildung, zur Verringerung oder Inhibierung von Plasma-Ausströmung oder zur Hemmung des Blutgefäßwachstums beim Menschen.
Kurze Beschreibung der Figuren
1. IEF-Gelanalyse von unmodifizierten und acetylierten Flt1(1-3)-Fc-Proteinen. Unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc-Protein ist aufgrund seines >9,3 pl nicht in der Lage, in das Gel einzutreten, wohingegen acetyliertes Flt1(1-3)-Fc in der Lage ist, in das Gel einzutreten und sich bei pl 5,2 zu äquilibrieren.
2. Bindung von unmodifizierten Flt1(1-3)-Fc- und acetylierten Flt1(1-3)-Fc-Proteinen an Matrigel^®-beschichtete Platten. Unmodifizierte Flt1(1-3)-Fc-Proteine binden umfangreich an extrazelluläre Matrixkomponenten in Matrigel^®, wohingegen acetyliertes Flt1(1-3)-Fc nicht bindet.
3. Bindung von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc, acetyliertem Flt1(1-3)-Fc und pegyliertem Flt1(1-3)-Fc in einem Biacore-basierenden Assay. Acetyliertes (Säulen 13–16), pegyliertes (Säulen 17–20) und Heparin-behandeltes Flt1(1-3)-Fc (Säulen 21–24) sind jeweils in der Lage, mit dem Biacore-Chip-gebundenen Flt1(1-3)-Fc vollständig um die VEGF-Bindung zu kompetieren, im Vergleich zur Kontrolle (Säulen 1–4) und irrelevantem Protein (Säulen 5–8). Unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc (Säulen 5–6) scheint lediglich partiell mit Biacore-Chip-gebundenem Flt1(1–3)-Fc um die VEGF-Bindung zu kompetieren.
Allerdings führt das Waschen der gebundenen Proben mit 0,5 M NaCl (Säulen 7–8) zu einem Bindungsprofil, ähnlich zu den modifizierten Formen von Flt1(1-3)-Fc, was anzeigt, dass das unmodifizierte Protein eine nicht-spezifische Bindung an den Chip aufzeigt, welche durch die Salzwaschung eliminiert werden kann.
4. Bindung von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc, acetyliertem Flt1(1-3)-Fc und pegyliertem Flt1(1-3)-Fc an VEGF in einem ELISA-basierenden Assay. Sowohl pegy lierte als auch acetylierte Flt1(1-3)-Fc-Proteine binden an VEGF mit Affinitäten, welche jenen von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc nahekommen.
5. Pharmakokinetische Profile von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc, acetyliertem Flt1(1-3)-Fc und pegyliertem Flt1(1-3)-Fc. Balb/c-Mäuse (23–28 g) erhielten subkutan eine Injektion mit 4 mg/kg unmodifiziertem, acetyliertem oder pegyliertem Flt1(1-3)-Fc. Den Mäusen wurde am Schwanz Blut entnommen 1, 2, 4, 6, 24 Stunden, 2 Tage und 3 Tage nach der Injektion von Protein, und die Seren wurden in einem standardmäßigen ELISA-basierenden Assay getestet, welcher ausgelegt war, um Flt1(1-3)-Fc-Protein nachzuweisen. Die T_max für alle der Flt1(1-3)-Fc-Proteine lag zwischen den Zeitpunkten von 6 Stunden und 24 Stunden. Die C_max für die unterschiedlichen Proteine war wie folgend: unmodifiziert: 0,06 μg/ml – 0,15 μg/ml; acetyliert: 1,5 μg/ml – 4,0 μg/ml; und pegyliert: ungefähr 5 μg/ml.
6A–6B. IEF-Gelanalyse von unmodifizierten und Stufen-acetylierten Flt1(1-3)-Fc-Proteinen. Unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc-Protein ist aufgrund seines >9,3 pl nicht in der Lage, in das Gel einzutreten, wohingegen die meisten der Stufen-acetylierten Flt1(1–3)-Fc-Proben (Proben bei 30–100fachem Überschuß) in der Lage waren, in das Gel zu wandern und sich bei pls im Bereich zwischen 4,55–8,43, abhängig vom Grad der Acetylierung, zu äquilibrieren.
7. Bindung von unmodifizierten Flt1(1-3)-Fc- und Stufen-acetylierten Flt1(1-3)-Fc-Proteinen an Matrigel^®-beschichtete Platten. Wie bei dem irrelevanten Kontrollprotein, rTie2-Fc, zeigt Stufen-acetyliertes Flt1(1-3)-Fc (Proben bei 20- und 30fachem Überschuß) keinerlei Bindung an die Matrigel-beschichtete Platte, wohingegen das nicht-acetylierte Fit1(1-3)-Fc-Protein eine signifikante Bindung zeigt. Die Probe bei 10fachem Überschuß zeigt eine reduzierte Bindung, aber der Grad der Acetylierung ist nicht genügend, um die Bindung an Komponenten der extrazellulären Matrix vollständig zu blockieren.
8. Bindung von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc und Stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc in einem Biacore-basierenden Assay. Bei einem substöchiometrischen Verhältnis (0,5 μg/ml von entweder unmodifiziertem Flt1(1-3) oder Stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc gegenüber 0,2 μg/ml VEGF) gibt es nicht genügend Flt1(1-3)-Fc (entweder unmodifiziert oder Stufen-acetyliert) in der Lösung, um das VEGF vollständig zu binden. Bei 1,0 μg/ml, was einem stöchiometrischen Verhältnis von 1:1 nahekommt, sind sowohl unmodifiziertes als auch Stufen-acetyliertes Flt1(1-3)-Fc besser in der Lage, um VEGF-Bindung zu kompetieren, aber es liegt immer noch ungenügend Flt1(1-3)-Fc-Protein (entweder unmodifiziert oder Stufen-acetyliert) vor, um das verfügbare VEGF vollständig abzusättigen. Bei 5,0 μg/ml jedoch, was mehrere Male größer als ein stöchiometrisches 1:1-Verhältnis ist, sind sowohl das Flt1(1-3)-Fc- als auch das Stufen-acetylierte Flt1(1-3)-Fc-Protein in der Lage, das VEGF abzusättigen, ungeachtet des Acetylierungsgrades.
9. Pharmakokinetische Profile von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc und Stufenacetyliertem Flt1(1-3)-Fc. Balb/c-Mäuse (23–28 g) erhielten eine subkutane Injektion mit 4 mg/kg unmodifiziertem oder Proben bei einem 10-, 20-, 40-, 60- und 100fachen Überschuß an Stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc (3 Mäuse für unmodifizierte, 10-, 20- und 40-fach-Überschuß-Proben, und 2 Mäuse für die 60- und 100-fach-Überschuß-Proben). Den Mäusen wurde 1, 2, 4, 6, 24 Stunden, 2 Tage und 3 Tage nach der Injektion Blut am Schwanz entnommen. Die Seren wurden in einem ELISA-basierenden Assay getestet, der zum Nachweisen von Flt1(1-3)-Fc ausgelegt war. Die T_max für alle der Flt1(1-3)-Fc-Proteine wurde am Zeitpunkt von 6 Stunden getestet, aber die C_max war wie folgend: Unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc: 0,06 μg/ml; 10fach-Überschuß-Probe: – 0,7 μg/ml, 20fach-Überschuß-Probe – 2 μg/ml, 40fach-Überschuß-Probe – 4 μg/ml, 60fach-Überschuß-Probe – 2 μg/ml, 100fach-Überschuß-Probe – 1 μg/ml.
10A–10D. Nukleinsäure- und abgeleitete Aminosäuresequenz von Flt1(1-3)-Fc.
11. Schematisches Diagramm der Struktur von Flt1.
12A und 12B. Hydrophilizitäts-Analyse der Aminosäuresequenzen von Ig-Domäne 2 und Ig-Domäne 3 von Flt1.
13A–13D. Nukleinsäure- und abgeleitete Aminosäuresequenz von Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc.
14A–14C. Nukleinsäure- und abgeleitete Aminosäuresequenz von Mut2: Flt1(2-3_ΔB)-Fc.
15A–15C. Nukleinsäure- und abgeleitete Aminosäuresequenz von Mut3: Flt1(2-3)-Fc.
16A–16D. Nukleinsäure- und abgeleitete Aminosäuresequenz von Mut4: Flt1(1-3_R->N)-Fc.
17. Bindung von unmodifizierten Flt1(1-3)-Fc-, Basischen-Regions-Deletionsmutanten-Flt1(1-3)-Fc- und Flt1(1-3)_R->N-Mutanten-Proteinen in einem Biacorebasierenden Assay. Bei dem substöchiometrischen Verhältnis (0,25 μg/ml Flt1(1-3)-Fc von unmodifizierten, acetylierten oder genetisch modifizierten Proben gegenüber 0,1 μg/ml VEGF) liegt ungenügend Flt1(1-3)-Fc-Protein vor, um die Bindung von VEGF an das Flt1(1-3)-Fc, das auf dem Biacore-Chip immobilisiert ist, zu blockieren. Bei 0,5 μg/ml unmodifizierten, acetylierten oder genetisch modifizierten Flt1(1-3)-Fc-Proteinen nähert sich das stöchiometrische Verhältnis 1:1 an, und es besteht ein erhöhtes Vermögen, VEGF-Bindung an den Biacore-Chip zu blockieren. Bei 1,0 μg/ml unmodifizierten, acetylierten oder genetisch modifizierten Flt1(1-3)-Fc-Proteinen, was ungefähr ein stöchiometrischens Verhältnis von 10:1 ist, sind die Flt1(1-3)-Fc-Proteine fähig, die Bindung von VEGF an den Biacore-Chip zu blockieren, aber sie sind nicht äquivalent. Unmodifizierte, Acetylierte und Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc sind im wesentlichen gleichwertig hinsichtlich ihrer Fähigkeit, VEGF-Bindung zu blockieren, wohingegen Mut4:Flt1(1-3_R->N)-Fc etwas weniger effizient bei der Blockierung der Bindung ist.
18. Bindung von unmodifizierten Flt1(1-3)-Fc-, Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc-, Mut2:Flt1(2-3Δg)-Fc- und Flt1(2-3)-Mutanten-Proteinen an Matrigel^®-beschichtete Platten. Unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc-Protein bindet stark an diese Vertiefungen, das Mut3:Flt1(2-3)-Fc-Protein bindet etwas schwächer, das Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc-Protein bindet noch schwächer, und das Mut2:Flt1(2-3_ΔB)-Fc-Protein zeigt das beste Profil, wobei es schwächer als irgendeines der anderen mutanten Proteine bindet. Das Mut4:Flt1(1-3_R->N)-Fc-Glycosylierungs-Mutantenprotein zeigt einen nur marginalen Vorteil im Matrigel-Assay.
19. Bindung von unmodifizierten Flt1(1-3)-Fc-, Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc-, Mut2:Flt1(2-3_ΔB)-Fc- und Flt1(2-3)-Mutanten-Proteinen in einem ELISA-basierten Assay. Bei den getesteten Konzentrationen binden unmodifizierte Flt1(1-3)-Fc-, Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc-, Mut2:Flt1(2-3_ΔB)-Fc- und Flt1(2-3)-Mutanten-Proteine auf ähnliche Weise an VEGF.
20. Pharmakokinetische Profile von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc, Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc-, Mut2:Flt1(2-3_ΔB)-Fc- und Flt1(2-3)-Mutantenproteinen. Die C_max für diese Reagenzien war wie folgend: Unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc – 0,15 μg/ml; bei 40fachem molaren Überschuß acetyliertes Flt1(1-3)-Fc – 1,5 μg/ml; und Mut1: Flt1(1-3Δg)-Fc – 0,7 μg/ml.
21A–21C. Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des modifizierten Flt1-Rezeptors, welcher als Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) bezeichnet wird.
22A–22C. Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des modifizierten Flt1-Rezeptors, der als Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) bezeichnet wird.
23. Extrazelluläre-Matrix(ECM)-Assay. Die Ergebnisse dieses Assays demonstrieren, dass die Proteine Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔ C1(a) beträchtlich weniger haftfähig an die ECM im Vergleich zu dem Flt1(1-3)-Fc-Protein sind.
24A–24C. Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenz des modifizierten Flt1-Rezeptors, bezeichnet als VEGFR1R2-FcΔC1(a).
25A–25C. Phosphorylierungsassay. Bei einem 1,5 molaren Überschuß entweder von Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40) oder transientem Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) besteht eine vollständige Blockierung der Rezeptorstimulierung durch diese drei modifizierten Flt1-Rezeptoren im Vergleich zu einer Herausforderung mit Kontrollmedien. Im Gegensatz dazu zeigt transientes Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) keine signifikante Blockierung bei diesem molaren Überschuß im Vergleich zu einer VEGF-Positivkontrollen-Herausforderung. Ähnliche Ergebnisse sind in der 25B ersichtlich, worin die modifizierten Flt1-Rezeptoren in einem 3fachen molaren Überschuß zu VEGF165-Ligand vorliegen. In der 25C, worin die modifizierten Flt1-Rezeptoren in einem 6fachen molaren Überschuß zu VEGF165-Ligand vorliegen, kann von dem transienten Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) nun gezeigt werden, dass er die VEGF165-induzierte Stimulierung von Zelloberflächenrezeptoren teilweise blockiert.
26A–26B. Phosphorylierungsassay. Der Nachweis von Tyrosinphosphoryliertem VEGFR2(Flk1) bei VEGF165-Ligandenstimulierung durch Western-Blot zeigt, dass Zelloberflächenrezeptoren nicht durch Hersausforderungs-Proben phosphoryliert werden, bei welchen VEGF165 mit einem 1- und 2fachen molaren Überschuß (26A) oder 3- und 4fachen molaren Überschuß (26B) von entweder transientem Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), stabilem Flt1D2Flk1D3.FcΔ C1(a), oder transientem VEGFR1R2-FcΔC1(a) präinkubiert wurde. Bei allen getesteten Konzentrationen von modifiziertem Flt1-Rezeptor besteht eine vollständige Bindung von VEGF165-Ligand während der Präinkubation, weshalb es zu keiner nachweisbaren Stimulation von Zelloberflächenrezeptoren durch ungebundenes VEGF165, im Vergleich zur Herausforderung mit Kontrollmedium, kommt.
27. MG/R2-Zellproliferations-Assay. Die folgenden modifizierten Flt1-Rezeptoren, Flt1(13)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a), plus ein als Tie2-Fc bezeichneter irrelevanter Rezeptor als eine Negativkontrolle, wurden von 40 nM bis 20 pM titriert und auf den Zellen 1 Stunden lang bei 37°C inkubiert. Humaner rekombinanter VEGF165 in definiertem Medium wurde dann zu allen Vertiefungen bei einer Konzentration von 1,56 nM zugesetzt. Der Negativkontrollrezeptor Tie2-Fc bei jedweder Konzentration blockiert VEGF165-induzierte Zellproliferation nicht, wohingegen Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) 1,56 nM VEGF165 bei einer halbmaximalen Dosis von 0,8 nM blockiert. Flt1(1-3)-Fc und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) sind weniger effektiv bei der Blockierung von VEGF165 in diesem Assay mit einer halbmaximalen Dosis von ~ 2nM. VEGF165 allein ergibt eine Ablesung von 1,2 Extinktionseinheiten, und der Hintergund beläuft sich auf 0,38 Extinktionseinheiten.
28. Biacore-Analyse der Bindungsstöchiometrie. Die Bindungsstöchiometrie wurde als ein Molverhältnis von gebundenem VEGF165 zu dem immobilisierten Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) oder VEGFR1R2-FcΔC1(a) unter Verwendung des Umwandlungsfaktors von 1000 RU, äquivalent zu 1 ng/ml, berechnet. Die Ergebnisse zeigten eine Bindungsstöchiometrie von einem dimeren VEGF165-Molekül pro einem Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)- oder VEGFR1R2-FcΔC1(a)-Molekül.
29 und 30. Größenausschlußchromatographie-Stöchiometrie. Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) oder VEGFR1R2-FcΔC1(a) bei einer Konzentration von 1 nM (geschätzterweise 1000 mal höher als die KD der Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)- oder VEGFR1R2-FcΔC1(a)/VEGF165-Wechselwirkung) wurden mit verschiedenen Konzentrationen von VEGF165 gemischt. Nach der Inkubation wurden die Konzentrationen des freien Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) in Lösung gemessen. Die Daten zeigen, dass die Zugabe von 1 nM VEGF165 in die Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)-Lösung die Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)-Bindung an die VEGF165-Oberfläche vollständig blockiert. Dieses Ergebnis legt die Bindungsstöchiometrie von einem VEGF165-Molekül pro einem Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)-Molekül nahe.
31. Größenausschlußchromatographie (SEC, "Size Exclusion Chromatography") unter nativen Bedingungen. Der Peak #1 repräsentiert den Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165-Komplex und der Peak #2 repräsentiert ungebundenes VEGF165. Fraktionen, die zwischen 1,1 und 1,2 ml eluiert waren, wurden vereinigt, und Guanidiniumhydrochlorid (GuHCl) wurde zu einer Endkonzentration von 4,5 M zugesetzt, um den Komplex zu dissoziieren.
32. Größenausschlußchromatographie (SEC) unter dissoziativen Bedingungen. Um die Komponenten des Rezeptor-Ligand-Komplexes zu trennen und deren Molverhältnis zu bestimmen, wurde 50 μl dissoziierter Komplex auf eine Superose 12 PC 3.2/30, die in 6 M GuHCl äquilibriert worden war, aufgetragen und eluiert. Der Peak #1 repräsentiert Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), und der Peak #2 repräsentiert VEGF165.
33, 34 und 35. Größenausschlußchromatographie (SEC) mit Online-Lichtstreuung. Eine Größenausschlußchromatographiesäule mit einem Mini-Dawn-Online-Lichtstreuungsdetektor (Wyatt Technology, Santa Barbara, Californien) und Brechungsindex(RI)-Detektoren (Shimadzu, Kyoto, Japan) wurde verwendet, um das Molekulargewicht (MG) des Rezeptor-Ligand-Komplexes zu bestimmen. Wie in der 33 gezeigt, zeigt das Elutionsprofil zwei Peaks. Der Peak #1 repräsentiert den Rezeptor-Ligand-Komplex und Peak #2 repräsentiert das ungebundene VEGF165. Das MG wurde aus LS- und RI-Signalen berechnet. Das gleiche Vorgehen wurde angewandt, um das MG der individuellen Komponenten des Rezeptor-Ligand-Komplexes zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind wie folgend: MG des Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165-Komplexes an der Peak-Position beläuft sich auf 157300 (33), das MG von VEGF165 an der Peak-Position beträgt 44390 (34), und das MG von R1R2 am Peak beträgt 113300 (35).
36. Peptidkartierung und Glycosylierungsanalyse. Die Disulfidstrukturen und Glycosylierungsstellen in Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) wurden durch ein Peptidkartierungsverfahren bestimmt. Es gibt insgesamt zehn Cysteine in Flt1D2.Flk1D3.FcΔ C1(a); sechs von ihnen gehören der Fc-Region an. Cys27 geht eine Disulfidbindung mit Cys76 ein. Cys121 geht eine Disulfidbindung mit Cys182 ein. Die ersten zwei Cysteine in der Fc-Region (Cys211 und Cys214) bilden eine intermolekulare Disulfidbindung mit den gleichen zwei Cysteinen in einer anderen Fc-Kette. Es kann je doch nicht bestimmt werden, ob eine Disulfidbindung zwischen gleichen Cysteinen (zum Beispiel Cys211 an Cys211) oder zwischen Cys211 und Cys214 stattfindet. Cys216 geht eine Disulfidbindung mit Cys306 ein. Cys352 geht eine Disulfidbindung mit Cys410 ein.
Es gibt fünf mögliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen in Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), und von ihnen wird festgestellt, in variablen Ausmaßen glycosyliert zu sein. Eine vollständige Glycosylierung wird an Asn33, Asn193 und Asn282 beobachtet. Eine teilweise Glycosylierung wird auf Asn65 und Asn120 beobachtet. Die Stellen der Glycosylierung sind in der Figur durch Unterstreichung hervorgehoben.
37. Pharmakokinetik von Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und VEGFR1R2-FcΔC1(a). Balb/c-Mäuse erhielten eine subkutane Injektion mit 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), von CHO transient exprimiertem Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), von CHO stabil exprimiertem Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und von CHO transient exprimiertem VEGFR1R2-FcΔC1(a). Den Mäusen wurde 1, 2, 4, 6, 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage und 6 Tage nach Injektion Blut am Schwanz entnommen. Die Seren wurden in einem ELISA geassayed, der zum Nachweis von Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) oder VEGFR1R2-FcΔC1(a) entworfen war. Die T_max für Flt1(1-3)-Fc (A40) belief sich auf 6 Stunden, während die T_max für das transiente und stabile Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und das transiente VEGFR1R2-FcΔC1(a) 24 Stunden betrug. Die C_max für Flt1(1-3)-Fc (A40) belief sich auf 8 μg/ml. Für beide Transienten (Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und VEGFR1R2-FcΔC1(a)) belief sich die C_max auf 18 μg/ml, und die C_max für das stabile VEGFR1R2-FcΔC1(a) belief sich auf 30 μg/ml.
38. Pharmakokinetik von Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). Balb/c-Mäuse erhielten eine subkutane Injektion mit 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), CHO-transient exprimiertem Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und CHO-transient exprimiertem Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). Den Mäusen wurde am Schwanz Blut entnommen nach 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 und 20 Tagen nach der Injektion. Die Seren wurden in einem ELISA geassayed, der zum Nachweis von Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) entworfen war. Flt1(1-3)-Fc (A40) konnte nach 5 Tagen nicht länger im Serum nachgewiesen werden, wohingegen Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) 15 Tage oder mehr nachweisbar waren.
39. Die Fähigkeit von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), das Wachstum von HT-1080-Fibrosarcom-Tumor in vivo zu inhibieren. Tägliche oder zweimal pro Woche erfolgende Behandlung von SCID-Mäusen mit Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) bei 25 mg/kg verringert das Wachstum von subkutanen HT-1080 Fibrosarcom-Tumoren signifikant.
40. Die Fähigkeit von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), das Wachstum von C6-Gliom-Tumor in vivo zu Inhibieren. Tägliche oder zweimal pro Woche erfolgende Behandlung von SCID-Mäusen mit Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) verringert das Wachstum von subkutanen C6-Gliom-Tumoren bei so niedrigen Dosierungen wie 2,5 mg/kg signifikant.
41. VEGF-induzierte Uterus-Hyperpermeabilität. Subkutan injiziertes PMSG (5 IU) zur Induzierung der Ovulation in präpubertären weiblichen Ratten führt zu einem Anstieg von Östradiol nach 2 Tagen, welches seinerseits eine Induktion von VEGF im Uterus verursacht. Diese Induktion führt zur Hyperpermeabilität des Uterus und zu einem Zuwachs des Uterus-Nass[gewichts]. Die subkutane Injektion von Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) bei 25 mg/kg 1 Stunde nach der PMSG-Injektion führt zu einer etwa 50%igen Inhibition der Erhöhung des Uterus-Nassgewichts.
42A–42B. Untersuchung der Angiogenese des Corpus Luteum unter Verwendung von Progesteron als Ablesung. PMSG wurde subkutan injiziert (5 IU), um die Ovulation in präpubertären weiblichen Ratten zu induzieren, was zu einem vollständig funktionierenden Corpus Luteum mit einem dichten Netzwerk von Blutgefäßen führte, welches Progesteron in den Blutstrom sezerniert, um den Uterus für eine Einnistung vorzubereiten. Die Induktion von Angiogenese im Corpus Luteum erfordert VEGF. Die Ruhezustands-Spiegel von Progesteron betragen etwa 5 ng/ml und können nach PMSG auf 25–40 ng/ml induziert werden. Eine subkutane Injektion von Flt1(1-3)-Fc (A40) oder Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) bei 25 mg/kg oder 5 mg/kg 1 Stunde nach der PMSG-Injektion führte zu einer vollständigen Inhibition der Progesteroninduktion am Tag 4.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Im Fachgebiet war es ein lange bestehendes Problem, einen Rezeptor-basierenden VEGF-Antagonisten herzustellen, der ein pharmakokinetisches Profil besitzt, welches für die Erwägung des Antagonisten als therapeutischen Kandidaten geeignet ist. Die Anmelder beschreiben hierin erstmalig ein chimäres Polypeptidmolekül, das zum Antagonisieren von VEGF-Aktivität in der Lage ist, welches verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften im Vergleich zu anderen bekannten Rezeptorbasierenden VEGF-Antagonisten aufzeigt. Die hierin beschriebenen chimären Polypeptidmoleküle sehen somit zum ersten Mal geeignete Moleküle zur Verwendung in Therapien vor, in welchen der Anatgonismus von VEGF ein gewünschtes Ergebnis ist.
Die vorliegende Erfindung sieht neue chimäre Polypeptidmoleküle vor, welche durch Fusionieren einer modifizierten extrazellulären Liganden-bindenden Domäne des Flt1-Rezeptors an die Fc-Region von IgG gebildet werden.
Die extrazelluläre Liganden-bindende Domäne ist als der Teil eines Rezeptors definiert, welcher in seiner nativen Konformation in der Zellmembran extrazellulär orientiert ist, wo er mit seinem kognaten Ligand in Kontakt treten kann. Die extrazelluläre Ligandenbindungsdomäne schließt nicht die hydrophoben Aminosäuren ein, welche mit der Transmembrandomäne des Rezeptors assoziiert sind, oder jedwede Aminosäuren, welche mit der intrazellulären Domäne des Rezeptors assoziiert sind. Im allgemeinen ist die intrazelluläre oder cytoplasmatische Domäne eines Rezeptors üblicherweise aus positiv geladenen oder polaren Aminosäuren aufgebaut (d.h. Lysin, Arginin, Histidin, Glutaminsäure, Asparaginsäure). Die vorausgehenden 15–30 vorwiegend hydrophoben oder apolaren Aminosäuren (d.h. Leucin, Valin, Isoleucin und Phenylalanin) machen die Transmembrandomäne aus. Die extrazelluläre Domäne umfasst die Aminosäuren, welche dem hydrophoben Transmembran-Abschnitt von Aminosäuren vorausgehen. Üblicherweise ist die Transmembrandomäne von positiv geladenen oder polaren Aminosäuren, wie Lysin oder Arginin, flankiert. von Heijne hat ausführliche Regeln veröffentlicht, welche vom Fachmann gängigerweise herangezogen werden bei der Bestimmung, welche Aminosäuren eines gegebenen Rezeptors zu der extrazellulären, Transmembran- oder intrazellulären Domäne gehören (siehe: von Heijne, 1995, BioEssays 17: 25–30). Alternativ dazu sind Websites im Internet, wie http://ulrec3.unil.ch/software/TMPRED_form.html. verfügbar geworden, um dem Proteinchemiker Informationen über die Aufstellung von Vorhersagen über Proteindomänen zu geben.
Die vorliegende Erfindung sieht die Konstruktion von Nukleinsäuremolekülen vor, die chimäre Polypeptidmoleküle codieren, welche in einen Vektor inseriert werden, der fähig ist, die chimären Polypeptidmoleküle bei Einbringung in eine geeignete Wirts zelle zu exprimieren. Geeignete Wirtszellen schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, bakterielle Zellen, Hefezellen, Insektenzellen und Säugerzellen ein. Jedes der Verfahren für die Insertion von DNA-Fragmenten in einen Vektor, welche dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind, kann angewandt werden, um Expressionsvektoren zu konstruieren, welche die chimären Polypeptidmoleküle unter Steuerung von transkriptionalen/translationalen Regulierungssignalen codieren. Diese Verfahren können in vitro rekombinante DNA- und synthetische Techniken und in vivo-Rekombinationen (genetische Rekombination) einschließen (siehe Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg.: Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY).
Die Expression von die chimären Polypeptidmoleküle codierenden Nukleinsäuremolekülen kann durch eine zweite Nukleinsäuresequenz so reguliert werden, dass das chimäre Polypeptidmolekül in einem mit dem rekombinanten DNA-Molekül transformierten Wirt exprimiert wird. Beispielsweise kann die Expression der hierin beschriebenen chimären Polypeptidmoleküle durch jedwedes Promotor/Enhancer-Element gesteuert werden, das im Fachgebiet bekannt ist. Promotoren, welche verwendet werden können, um die Expression der chimären Polypeptidmoleküle zu steuern, schließen, ohne jedoch darauf eingeschränkt zu sein, den "Long Terminal-Repeat", wie beschrieben in Sqinto et al., (1991, Cell 65: 1–20); die SV40-"Early"-Promotorregion (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), den CMV-Promotor, den M-MuLV-5'-Terminal-Repeat, den Promotor, der enthalten ist im 3'-Long-Terminal-Repeat des Rous-Sarkom-Virus (Yamamoto, et al., 1980, Cell 22: 787–797), den Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 144–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionin-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42); prokaryotische Expressionsvektoren, wie den β-Lactamase-Promotor (Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75: 3727–3731), oder den tac-Promotor (DeBoer, et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80: 21–25, siehe auch "Useful proteins from recombinant bacteria" in Scientific American. 1980, 242: 74–94); Promotorelemente aus Hefe oder anderen Pilzen, wie den Gal-4-Promotor, den ADH(Alkoholdehydrogenase)-Promotor, PGK-(Phosphoglycerolkinase)-Promotor, Alkalische-Phosphatase-Promotor, und die folgenden transkriptionellen Steuerungsregionen aus Tieren, welche Gewebespezifität aufzeigen und in transgenen Tieren verwendet worden sind, ein: Elastase-I-Genkontrollregion, welche in pankreatischen Acinarzellen aktiv ist (Swift et al., 1984, Cell 38: 639–646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399– 409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425–515); Insulin-Gensteuerungsregion, welche in pankreatischen beta-Zellen aktiv ist (Hanahan, 1985, Nature 315: 115–122), Immunoglobulin-Gensteuerungsregion, welche in lymphoiden Zellen aktiv ist (Grosschedl et al., 1984, Cell 38: 647–658; Adames et al., 1985, Nature 318: 533–538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436–1444), "Mouse Mammary Tumor Virus"-Steuerungsregion, welche aktiv in Hoden-, Brust-, Lymphoid- und Mastzellen ist (Leder et al., 1986, Cell 45: 485–495), Albumin-Gensteuerungsregion, welche in der Leber aktiv ist (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268–276), alpha-Fetoprotein-Gensteuerungsregion, welche in der Leber aktiv ist (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639–1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53–58); alpha-1-Antitrypsin-Gensteuerungsregion, welche in der Leber aktiv ist (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161–171), beta-Globin-Gensteuerungsregion, welche in Myeloid-Zellen aktiv ist (Mogram et al., 1985, Nature 315: 338–340; Kollias et al., 1986, Cell 46: 89–94); die Gensteuerungsregion des basischen Myelinproteins, welche in Oligodendrozyten-Zellen im Gehirn aktiv ist (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703–712); die Steuerungsregion des Gens für die leichte Myosinkette-2, welche in Skelettmuskel aktiv ist (Shani, 1985, Nature 314: 283–286), und die Steuerungsregion des Gens für gonadotropes Releasing-Hormon, welche im Hypothalamus aktiv ist (Mason et al., 1986, Science 234: 1372–1378).
Gemäß der Erfindung werden somit Expressionsvektoren, welche in der Lage sind, in einem bakteriellen oder eukaryotischen Wirt repliziert zu werden, die ein chimäres Polypeptidmolekül codierende Nukleinsäure, wie hierin beschrieben, umfassen, verwendet, um den Wirt zu transfizieren und dadurch die Expression solcher Nukleinsäuren zur Herstellung der chimären Polypeptidmoleküle zu lenken, welche dann in einer biologisch aktiven Form gewonnen werden können. Wie hierin verwendet, schließt eine biologisch aktive Form eine Form ein, die in der Lage zur Bindung an VEGF ist.
Expressionsvektoren, welche die hierin beschriebenen chimären Nukleinsäuremoleküle enthalten, können durch drei allgemeine Vorgehensweisen identifiziert werden: (a) DNA-DNA-Hybridisierung, (b) Gegenwart oder Abwesenheit von "Marker"-Genfunktionen und (c) Expression von inserierten Sequenzen. Im ersten Vorgehen kann die Gegenwart eines Fremdgens, das in einen Expressionsvektor inseriert ist, durch DNA-DNA-Hybridisierung unter Verwendung von Sonden nachgewiesen werden, welche Sequenzen umfassen, die homolog zu den inserierten chimären Polypeptidmolekül-Sequenzen sind. Im zweiten Vorgehen kann das rekombinante Vek tor/Wirts-System basierend auf der Gegenwart oder Abwesenheit von bestimmten "Marker"-Genfunktionen (z. B. Thymidinkinaseaktivität, Resistenz gegen Antibiotika, Transformationsphänotyp, Bildung von Einschlusskörperchen in Baculovirus etc.), welche durch die Insertion von Fremdgenen in dem Vektor verursacht werden, identifiziert und selektiert werden. Wenn zum Beispiel die DNA-Sequenz für das chimäre Polypeptidmolekül innerhalb der Marker-Gensequenz des Vektors inseriert ist, können Rekombinanten, welche das Insert enthalten, durch die Abwesenheit der Marker-Genfunktion identifiziert werden. Im dritten Vorgehen können rekombinante Expressionsvektoren identifiziert werden durch Assay hinsichtlich des Fremdgenprodukts, das von der Rekombinante exprimiert wird. Derartige Assays können beispielsweise auf den physikalischen oder funktionellen Eigenschaften der chimären Polypeptidmoleküle basieren.
Zellen der vorliegenden Erfindung können die chimären Polypeptidmoleküle transient oder, vorzugsweise, konstitutiv und permanent exprimieren.
Die chimären Polypeptidmoleküle können durch jedwede Technik gereinigt werden, welche die anschließende Bildung eines stabilen, biologisch aktiven chimären Polypeptidmoleküls gestattet. Beispielsweise, und nicht auf dem Wege der Einschränkung, können die Faktoren aus Zellen entweder als lösliche Proteine oder als Einschlusskörperchen, aus welchen sie quantitativ durch 8 M Guanidiniumhydrochlorid und Dialyse extrahiert werden können (siehe zum Beispiel Builder et al., U.S.-Patent-Nr. 5 663 304), gewonnen werden. Um die Faktoren weiter zu reinigen, kann herkömmliche Ionenaustausch-Chromatographie, hydrophobe Wechselwirkungs-Chromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie oder Gelfiltration angewandt werden.
In einer Ausführungsform der Erfindung liegt die Nukleotidsequenz, die die erste Komponente codiert, stromaufwärts der Nukleotidsequenz, welche die zweite Komponente codiert. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung liegt die Nukleotidsequenz, codierend die erste Komponente, stromabwärts der Nukleotidsequenz, welche die zweite Komponente codiert. Weitere Ausführungsformen der Erfindung können hergestellt werden, in welchen die Reihenfolge der ersten, zweiten und dritten Fusionspolypeptid-Komponenten rearrangiert ist. Wenn beispielsweise die Nukleotidsequenz, codierend die erste Komponente, mit 1 bezeichnet wird, die Nukleotidsequenz, codierend die zweite Komponente, mit 2 bezeichnet wird, und die Nukleotidsequenz der dritten Komponente mit 3 bezeichnet wird, dann kann die Rei henfolge der Komponenten in der isolierten Nukleinsäure der Erfindung, gelesen von 5' nach 3', jedwede der folgenden sechs Kombinationen sein: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; oder 3,2,1.
Die vorliegende Erfindung besitzt auch diagnostische und therapeutische Anwendbarkeiten. Verfahren zum Nachweisen von Abweichungen in Funktion oder Expression der hierin beschriebenen chimären Polypeptidmoleküle können in der Diagnose von Krankheiten angewandt werden. Die Manipulation der chimären Polypeptidmoleküle oder Agonisten oder Antagonisten, welche die chimären Polypeptidmoleküle binden, kann bei der Behandlung von Krankheiten angewandt werden. In weiteren Ausführungsformen wird das chimäre Polypeptidmolekül als ein Mittel verwendet, um die Bindung eines bindenden Agens an sein Ziel zu blockieren.
Auf beispielhaftem Wege, jedoch nicht zur Einschränkung, kann die Erfindung bei der Behandlung klinischer Zustände, welche gekennzeichnet sind durch Gefäßdurchlässigkeit, Ödem oder Entzündung, wie Gehirnödem, welche mit Verletzung, Schlaganfall oder Tumor assoziiert sind; Ödem, das assoziiert ist mit Entzündungskrankheiten, wie Psoriasis oder Arthritis, einschließlich rheumatoider Arthritis; Asthma; generalisiertem Ödem, das mit Verbrennungen assoziiert ist; Aszites und Pleuraleffusion, assoziiert mit Tumoren, Entzündung oder Trauma; chronischer Luftwegsentzündung; dem "Capillary Leakage"-Syndrom; Sepsis; Nierenkrankheit, welche mit erhöhtem Ausströmen von Protein assoziiert ist; und Augenkrankheiten, wie mit dem Alter zusammenhängender Macula-Degeneration und diabetischer Retinopathie, nützlich sein.
Eine Aminosäuresequenz-Analyse von Flt1(1-3)-Fc enthüllte die Gegenwart einer ungewöhnlich hohen Anzahl (46) des basischen Aminosäurerests Lysin. Eine IEF-Analyse von Flt1(1-3)-Fc zeigte, dass dieses Protein einen größeren pl als 9,3 besitzt, was die Vorhersage bestätigt, dass das Protein sehr basisch ist. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass die basische Natur des Flt1(1-3)-Fc-Proteins selbiges veranlasst, an Komponenten der extrazellulären Matrix zu binden, und dass diese Wechselwirkung, die Ursache der äußerst kurzen nachweisbaren Halbwertszeit im Kreislaufserum ist, welche von Flt1(1-3)-Fc aufgezeigt wird, wenn es in Mäuse injiziert wird. Um diese Hypothese zu testen, wurde das Flt1(1-3)-Fc-Protein an den Lysinresten acetyliert, um die basische Ladung zu verringern. Acetyliertes Flt1(1-3)-Fc wurde dann in den nachstehend beschriebenen Assays getestet.
Die folgenden Beispiele sind zur Veranschaulichung und nicht in einschränkender Weise angegeben.
Beispiele
Beispiel 1: Expression von Flt1(1-3)-Fc -Protein in CHO-K1-Zellen.
Unter Anwendung von standardmäßigen molekularbiologischen Techniken (siehe z. B. Moleculan Cloning, A Laboratory Manual (Sambnook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg.: Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) wurde das Flt1(1-3)-Fc codierende Gen in den Expnessionsvektor pEE14.1 (Lonza Biologics, plc) an einer Mehrfach-Klonierungsstelle stromabwärts des CMV-Promotons inseriert. CHO-K1-Zellen wurden mit dem pEE14.1/Flt1(1-3)-Fc-DNA-Konstrukt unter Verwendung von Lipofectamin (Gaithensburg, MD) tnansfiziert. Die transfizierten CHO-K1-Zellen wurden in glutaminfreiem DMEM (JRH, Kansas City, MO), enthaltend 25 μM Methioninsulfoximin (MSX) von Sigma Inc., St. Louis, MO, wachsen gelassen, und hohe Expressoren des rekombinanten Proteins wurden durch Screening der CHO-K1-Zellüberstände von über 100 handverlesenen Kolonie-Isolaten unter Anwendung eines Standard-Immunoassays erhalten, welcher humanes Fc einfängt und nachweist. Der selektierte, von Hand abgepickte Klon wurde in Gegenwart von 100 μM MSX amplifiziert, woran sich eine zweite Screening-Runde der amplifizierten Klone anschloss. Der am stärksten produzierende Klon besaß eine spezifische Produktivität für rekombinantes Flt1(1-3)-Fc-Protein von 55 pg/Zelle/Tag.
Der selektierte Klon wurde in 225-cm²-T-Kolben (Corning, Acton, MA) und dann in 8,5 Liter große Rollenflaschen (Corning, Acton, MA) unter Verwendung der obenstehend beschriebenen Zellkulturmedien expandiert. Die Zellen wurden aus den Rollenflaschen durch Standard-Trypsinisierung entfernt und in 3,5 Liter Suspensionsmedium eingebracht. Das Suspensionsmedium besteht aus glutaminfreiem ISCHO-Medium (Irvine Scientific, Santa Ana, CA), enthaltend 5 % fötales Rinderserum (FBS von Hyclone Labs, Logan, UT), 100 μM MSX und GS-Supplement (JRH Scientific, Kansas City, MO) in einem 5-Liter-Celligen-Bioreaktor (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) bei einer Dichte von 0,3 × 10⁶ Zellen/ml. Nachdem die Zellen eine Dichte von 3,6 × 10⁶/ml erreicht hatten und an die Suspension adaptiert waren, wurden sie in einen 60-Liter-Bioreaktor (ABEC, Allentown, PA) bei einer Dichte von 0,5 × 10⁶ Zellen/ml in 20 Litern ISCHO-Medium mit 5 % fötalem Rinderserum über führt. Nach zwei Tagen wurden zusätzliche 20 Liter ISCO + 5 % fötales Rinderserum in den Bioreaktor zugegeben. Die Zellen wurden weitere zwei Tage lang wachsen gelassen, wobei sie eine Enddichte von 3,1 × 10⁶ Zellen/ml erreichten, und die letztendliche Flt1(1-3)-Fc-Konzentration bei der Ernte belief sich auf 95 mg/l. Bei der Ernte wurden die Zellen durch Tangentialströmungs-Filtration unter Verwendung von 0,45-μm-Prostak-Filtern (Millipore, Inc., Bedford, MA) entfernt.
Beispiel 2: Reinigung von aus CHO-K1-Zellen erhaltenem Flt1(1-3)-Fc-Protein
Flt1(1-3)-Fc-Protein wurde anfänglich mittels Aftinitäts-Chromatographie gereinigt. Eine Protein-A-Säule wurde verwendet, um den Fc-Anteil des Moleküls mit hoher Spezifität zu binden. Dieses affinitätsgereinigte Protein wurde dann konzentriert und über eine SEC-Säule geleitet. Das Protein wurde dann in den Formulierungspuffer eluiert. Im Nachfolgenden werden diese Vorgehensweisen ausführlich beschrieben.
Materialien und Methoden
Alle Chemikalien wurden von J. T. Baker, Phillipsburg, NJ erhalten, außer PBS, welches als ein 10X-Konzentrat von Life Technologies, Gaithersburg, MD, erhalten wurde. Die Harze "Protein A Fast Flow" und "Superdex 200" von präparativer Güte wurde von Pharmacia, Piscataway, NJ, erhalten. Gerätschaften und Membranen für die Proteinkonzentration wurden von Millipore, Bedford, MA, erhalten.
Ungefähr 40 l 0,45-μm-filtriertes CHO-konditioniertes Medium, welches Flt1(1-3)-Fc-Protein enthielt, wurden auf eine 290 ml große "Protein A Fast Flow"-Säule (Durchmesser 10 cm), welche mit PBS äquilibriert worden war, aufgetragen. Die Säule wurde mit PBS, enthaltend 350 mM NaCl und 0,02 % CHAPS, gewaschen, und das gebundene Protein wurde mit 20 mM Zitronensäure, enthaltend 10 mM Na₂HPO₄, eluiert. Der Einzelpeak in der Elution wurde aufgefangen, und sein pH-Wert mit 1 M NaOH bis zur Neutralität erhöht. Die Eluatfraktionen wurden unter Verwendung von 10K-regenerierten Zellulosemembranen sowohl durch Tangential-Strömungsfiltration als auch durch Rührzellen-Konzentrierung auf ungefähr 9 mg/ml konzentriert. Um Aggregate und andere Kontaminanten zu entfernen, wurde das konzentrierte Protein auf eine Säule aufgetragen, welche mit Superdex-200-Harz von präparativer Güte (10 cm × 55 cm) gepackt war und in PBS mit 5 % Glycerol laufen gelassen wurde. Die Haupt-Peak-Fraktionen wurden vereinigt, sterilfiltriert, aliquotiert und bei –80 °C aufbewahrt.
Beispiel 3: Acetylierung von Flt1(1-3)-Fc-Protein.
Zwei Milligramm Flt1(1-3)-Fc-Protein wurden acetyliert, wie beschrieben im Anweisungs-Handbuch, das mit dem Sulfo-NHS-Acetat-Modifikations-Kit geliefert wurde (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat. # 26777).
Beispiel 4: Charakterisierung von acetyliertem Flt1(1-3)-Fc-Protein.
(a.) IEF-Analyse:
Flt1(1-3)-Fc und acetyliertes Flt1(1-3)-Fc wurden durch Standard-IEF-Analyse analysiert. Wie in der 1 gezeigt, ist Flt1(1-3)-Fc-Protein nicht in der Lage, in das Gel zu wandern, und muss deswegen einen größeren pl als 9,3 aufweisen, den höchsten pl im Standard. Allerdings ist acetyliertes Flt1(1-3)-Fc in der Lage, in das Gel zu wandern und sich bei einem pl von ungefähr 5,2 zu äquilibrieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass eine Acetylierung die positive Netto-Ladung des Proteins und deshalb seinen pl beträchtlich verringert.
(b.) Bindung an extrazelluläre Matrix-Komponenten.
Um hinsichtlich Bindung an extrazelluläre Matrixkomponenten zu testen, wurden Flt1(1-3)-Fc und acetyliertes Flt1(1-3)-Fc in einem Assay getestet, der zur Nachahmung der Wechselwirkung mit Komponenten der extrazellulären Matrix ausgelegt war. In diesem Assay werden 96-Vertiefungs-Gewebekulturplatten mit Matrigel beschichtet (Biocoat MATRIGEL^®-Matrix-Dünnschicht-96-Vertiefungsplatte, Katalog # 40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA). Die Platten werden mit variierenden Konzentrationen von entweder Flt1(1-3)-Fc oder acetyliertem Flt1(1-3)-Fc inkubiert, oder rTie2-Fc-Protein (eine irrelevante Kontrolle) wird den Vertiefungen zugesetzt. Die Platten werden 1 – 2 Stunden entweder bei Raumtemperatur oder 37°C inkubiert, und dann wird der Nachweis von gebundenen Proteinen durch Zugeben eines sekundären, an alkalische Phosphatase konjugierten, Anti-Mensch-Fc-Antikörper zu den Vertiefungen bewerkstelligt. Schließlich wird das Substrat für alkalische Phosphatase in die Vertiefungen zugesetzt, und die optische Dichte wird gemessen. Die 2 zeigt die Ergebnisse dieses Assays. Wie das irrelevante Kontrollprotein rTie2-Fc, zeigt acetyliertes Flt1(1-3)-Fc keinerlei Bindung an die Matrigelbeschichtete Platte, wohingegen das nicht-acetylierte Flt1(1-3)-Fc-Protein eine signifikante Bindung aufzeigt. Dieses Ergebnis zeigt, dass die Acetylierung von basischen Aminosäureresten ein effektiver Weg ist, um die Ladungswechselwirkungen zu stö ren, welche zwischen positiv geladenen Proteinen und den negativ geladenen extrazellulären Matrixkomponenten, an welche sie in vivo ausgesetzt sind, existieren.
Beispiel 5: Pegylierung von Flt1(1-3)-Fc-Protein.
Obwohl die Pegylierung (Polyethylenglycol – PEG) von Proteinen gezeigtermaßen ihr in vivo-Potenzial durch Erhöhen der Stabilität und biologischen Verfügbarkeit unter Minimieren der Immunogenität erhöht (siehe obenstehend zitierte Bezugsstellen), ist es widersinnig, dass die Pegylierung von Molekülen, welche zu groß sind, um von den Nieren-Glomeruli filtriert zu werden, deren pharmakokinetische Eigenschaften verbessern würde. Ohne durch die Theorie gebunden zu sein, haben die Anmelder der vorliegenden Erfindung postuliert, dass die Pegylierung der Flt1(13)-Fc-Moleküle die pharmakokinetischen Eigenschaften verbessern könnte, möglicherweise nicht durch Änderung der positiven Ladung oder durch Verringerung des pl von Flt1(1-3)-Fc, sondern vielmehr durch physikalisches Abschirmen der positiven Ladungen vor der Wechselwirkung mit der extrazellulären Matrix. Die Anmelder entschieden sich, zu versuchen, die pharmakokinetischen Eigenschaften von Flt1(1-3)-Fc-Molekülen durch Anheften von Strängen von 20 K-PEGs, wie nachstehend beschrieben, zu verbessern.
Materialien und Methoden
Aus CHO-Zellen abgeleitetes, gereinigtes Flt1(1-3)-Fc (siehe oben) wurde in den folgenden Pegylierungs-Experimenten verwendet. Funktionalisierte PEGs wurden von Shearwater Polymers, Huntsville, AL; Bicine von Sigma, St. Louis, MO; Superose-6-Säulen von Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS als ein 10fach-Konzentrat von Life Technologies, Gaithersburg, MD; Glycerol von J.T. Baker, Phillipsburg, NJ; und Bis-Tris-vorgegossene Gele von Novex, CA, erhalten.
20K-PEG-Stränge, funktionalisiert mit aminspezifischen Endeinheiten, wurden in Reaktionsuntersuchungen im kleinen Maßstab verwendet, welche eingerichtet waren, um unterschiedliche Reaktionsbedingungen auszuwerten, bei welchen die PEG:Protein-Stöchiometrie variiert wurde. Basierend auf diesen Reaktionen und den Analysen von Proben auf standardmäßiger SDS-Page, wurde Flt1(1-3)-Fc bei einer Konzentration von 1,5 mg/ml bei pH 8,1 mit 20K-SPA-PEG(PEG-Succinimidylpropionat)-Molekülen bei einem PEG-zu-Flt1(1-3)-Fc-Monomer-Molverhältnis von 1 : 6 umgesetzt. Die Reaktion wurde bei 8°C über Nacht voranschreiten gelassen.
Für die anfängliche Reinigung wurden die Reaktionsprodukte auf eine 10 mm × 30 cm große Superose-6-Säule aufgetragen, welche mit 5 % Glycerol enthaltendem PBS äquilibriert worden war. Die Säule schien pegylierte Flt1(1-3)-Fc-Moleküle auf der Basis des Ausmaßes der Pegylierung zu trennen. Fraktionen, welche demjenigen entsprachen, was vorwiegend mono-pegyliertes und di-pegyliertes dimeres Flt1(1–3)-Fc zu sein schien, wie beurteilt durch die Bandenmuster auf reduzierenden und nicht-reduzierenden SDS-Page-Gelen, wurden vereinigt. Die Proteinkonzentration wurde durch Messen der Extinktion bei 280 nm bestimmt. Das pegylierte Flt1(1-3)-Fc-Protein wurde sterilfiltriert, aliquotiert und bei –40°C aufbewahrt.
Beispiel 6: Bindung von unmodifiziertem, acetyliertem und pegyliertem Flt1(1-3)-Fc in einem Biacore-basierenden Assay.
Unmodifizierte, acetylierte und pegylierte Flt1(1-3)-Fc-Proteine wurden in einem Biacore-basierenden Assay getestet, um ihr Vermögen auszuwerten, an den Flt1-Liganden, VEGF, zu binden. In diesem Assay wurde unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc-Protein auf der Oberfläche eines Biacore-Chips immobilisiert (siehe Biacore-Anweisungshandbuch, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, für Standardvorgehensweisen), und eine Probe, welche 0,2 μg/ml VEGF und entweder unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc, acetyliertes Flt1(1-3)-Fc oder pegyliertes Flt1(1-3)-Fc (jeweils bei 25 μg/ml) enthielt, wurde über den Flt1(1-3)-Fc-beschichteten Chip geleitet. Um die Effekte von nicht-spezifischer Bindung zu minimieren, wurden die gebundenen Proben mit einer 0,5-M-NaCl-Waschung gewaschen. In einer Probe wurde unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc mit Heparin gemischt. Heparin ist ein negativ geladenes Molekül, und das Flt1(1-3)-Fc-Protein ist ein positiv geladenes Molekül, so dass, wenn die zwei Moleküle miteinander vermischt werden, sie durch ihre jeweiligen Ladungen wechselwirken sollten. Dies neutralisiert im Wesentlichen die dem Flt1(1-3)-Fc innewohnende positive Ladung, was das Molekül sich so verhalten lässt, als ob es chemisch oder genetisch modifiziert worden wäre, um seine Ladung und seine Neigung, über Ladungswechselwirkungen zu binden, zu verringern. Wie in der 3 gezeigt, sind acetyliertes (Säulen 13 – 16), pegyliertes (Säulen 17 – 20) und Heparin-behandeltes Flt1(1-3)-Fc (Säulen 21 – 24) jeweils in der Lage, mit dem Biacore-Chip-gebundenen Flt1(1-3)-Fc vollständig um die VEGF-Bindung zu kompetieren, im Vergleich zur Kontrolle (Säulen 1 – 4) und irrelevantem Protein (Säulen 5 – 8). Unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc (Säulen 5 – 6) schien nur partiell mit Biacore-Chip-gebundenem Flt1(-3)-Fc um die VEGF-Bindung zu kompetieren. Allerdings führte das Waschen der gebundenen Proben mit 0,5 M NaCl (Säulen 7 – 8) zu einem Bindungsprofil, das ähn lich zu den modifizierten Formen von Flt1(1-3)-Fc war, was anzeigt, dass das unmodifizierte Protein eine nicht-spezifische Bindung an den Chip aufzeigte, die durch die Salzwaschung eliminiert werden konnte.
Beispiel 7: Bindung von unmodifizierten, acetylierten und pegylierten Flt1(1-3)-Fc in einem ELISA-basierenden Assay.
Unmodifizierte, acetylierte und pegylierte Flt1(1-3)-Fc-Proteine wurden in einem standardmäßigen ELISA-basierenden Assay getestet, um ihre Fähigkeit auszuwerten, an den Flt1-Rezeptor-Liganden VEGF zu binden. Wie in der 4 gezeigt, sind sowohl pegylierte als auch acetylierte Flt1(1-3)-Fc-Proteine in der Lage, an VEGF zu binden, was zeigt, dass die Modifizierung des Proteins entweder durch Pegylierung oder durch Acetylierung seine Fähigkeit, an seinen Liganden zu binden, nicht zerstört.
Beispiel 8: Pharmakokinetische Analyse von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc, acetyliertem Flt1(1-3)-Fc und pegyliertem Flt1(1-3)-Fc.
In vivo-Experimente wurde entworfen, um die pharmakokinetischen Profile von unmodifizierten Flt1(1-3)-Fc-, acetyliertem Flt1(1-3)-Fc- und pegyliertem Flt1(1-3)-Fc-Protein zu untersuchen. Balb/c-Mäuse (23 – 28 g; 3 Mäuse/Gruppe) erhielten subkutan eine Injektion mit 4 mg/kg unmodifiziertem, acetyliertem oder pegyliertem Flt1(1-3)-Fc. Man entnahm den Mäusen, 1, 2, 4, 6, 24 Stunden, 2 Tage und 3 Tage nach der Injektion von Protein, am Schwanz Blut. Die Seren wurden in einem standardmäßigen ELISA-basierenden Assay getestet, der zum Nachweis von Flt1(1-3)-Fc-Protein ausgelegt war. Kurz gesagt, beinhaltet der Assay das Beschichten einer ELISA-Platte mit VEGF, Binden der unmodifiziertes, acetyliertes oder pegyliertes Flt1(1-3)-Fc enthaltenden Seren, und das Berichten bzw. Ablesen mit einem Anti-Fc-Antikörper, der an alkalische Phosphatase verknüpft ist. Wie gezeigt in der 5, lag die T_max für alle der Flt1(1-3)-Fc-Proteine zwischen den Zeitpunkten von 6 Stunden und 24 Stunden. Die C_max für die verschiedenen Proteine war wie folgend: unmodifiziert: 0,06 μg/ml – 0,15 μg/ml; acetyliert: 1,5 μg/ml – 4,0 μg/ml; und pegyliert: ungefähr 5 μg/ml.
Beispiel 9: Stufen-Acetylierung von Flt1(1-3)-Fc
Um zu bestimmen, welche Minimalmenge an Acetylierung notwendig ist, um Bindung an Komponenten der extrazellulären Matrix zu eliminieren, wurde ein Experiment entworfen, welches das Flt1(1-3)-Fc-Protein durch Verwendung steigender Mengen eines molaren Überschusses an Acetylierungsreagenz in der Acetylierungs-Reaktionsmischung in einer stufenartigen Weise acetylierte. Der Bereich des molaren Überschusses belief sich wie folgend: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 und 100 Mol Acetylierungsreagenz je 1 Mol Flt1(1-3)-Fc-Monomer. Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie ausführlich in dem Anweisungshandbuch angegeben, welches mit dem Sulfo-NHS-Acetat-Modifikations-Kit (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat. # 26777) geliefert wurde.
Beispiel 10: Charakterisierung von stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc.
(a.) IHF-Analyse
Unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc und stufen-acetylierte Flt1(1-3)-Fc-Proteine wurden durch Standard-IEF-Analyse analysiert. Wie in der 6A – 6B, war unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc-Protein aufgrund seines extrem hohen pl (größer als 9,3) nicht in der Lage, in das Gel zu wandern. Allerdings waren die meisten der stufen-acetylierten Flt1(1-3)-Fc-Proben (30- – 100-fach-Molüberschuss-Proben) in der Lage, in das Gel einzuwandern und sich bei pls im Bereich zwischen 4,55 – 8,43, abhängig vom Acetylierungsgrad des Proteins, zu äquilibrieren. Dieses Ergebnis zeigt, dass Acetylierung die positive Ladung des Proteins in einer dosisabhängigen Weise ändern kann, und dass die Verringerung des pl durch Steuern des Acetylierungsgrads reguliert werden kann.
(b.) Bindung von stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc an extrazelluläre Matrix-Komponenten
Um hinsichtlich Bindung an Komponenten der extrazellulären Matrix zu testen, wurden Flt1(1-3)-Fc und stufen-acetyliertes Flt1(1-3)-Fc in dem obenstehend beschriebenen Assay getestet, der ausgelegt war, um die Wechselwirkung mit Komponenten der extrazellulären Matrix nachzuahmen. Variierende Konzentrationen von entweder unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc-, stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc- (10-, 20- und 30-fach-Molüberschuss-Proben) oder rTie2-Fc (eine irrelevante Kontrolle) -Protein wurden in die Vertiefungen gegeben. Die Platten wurden 1 – 2 Stunden lang bei Raumtemperatur oder 37°C inkubiert, und dann wurde der Nachweis von gebundenen Proteinen durch Zusetzen eines sekundären, an alkalische Phosphatase konjugierten, Anti-Mensch-Fc-Antikörper zu den Vertiefungen bewerkstelligt. Anschließend wurde das Substrat für alkalische Phosphatase in die Vertiefungen gegeben, und die optische Dichte wurde gemessen. Die 7 zeigt die Ergebnisse dieses Assays. Wie das irrelevante Kontrollprotein rTie2-Fc, zeigte stufen-acetyliertes Flt1(1-3)-Fc (20- und 30-fach-Mol-Überschuss-Proben) keinerlei signifikante Bindung an die Matrigelbeschichtete Platte, wohingegen das nicht-acetylierte Flt1(1-3)-Fc-Protein eine signifikante Bindung zeigte. Die Bindung lässt sich sättigen, was darauf hinweist, dass das Flt1(1-3)-Fc-Protein eher an spezifische Stellen bindet, anstatt einer allgemeineren ladungsvermittelten Wechselwirkung, welche sich nicht sättigen ließe. Die 10-fach-Molüberschuss-Probe zeigte eine verringerte Bindung, aber der Acetylierungsgrad war nicht genügend, um die Bindung an extrazelluläre Matrix-Komponenten vollständig zu blockieren. Die Proben bei 20-fachem und höherem molaren Überschuss zeigten keine nachweisbare Bindung, trotz der Tatsache, dass in der IEF-Analyse (6A und 6B) die Proben von niedrigerem molaren Überschuss noch eine große positive Nettoladung besaßen. Dieses Ergebnis zeigt, dass es nicht notwendig ist, alle verfügbaren basischen Aminosäuren vollständig zu acetylieren, um die Bindung an Komponenten der extrazellulären Matrix zu eliminieren.
(c.) Bindung von stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc in einem Biacorebasierenden Assay.
Unmodifizierte und stufen-acetylierte Flt1(1-3)-Fc-Proteine wurden in einem Biacorebasierenden Assay getestet, um ihre Fähigkeit auszuwerten, an den Flt1-Liganden, VEGF, zu binden. In diesem Assay wurde unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc-Protein (0,5, 1,0 oder 5,0 μg/ml) auf der Oberfläche eines Biacore-Chips immobilisiert (siehe Biacore-Anweisungshandbuch, Pharmacia, Inc. Piscataway, NJ, für Standard-Vorgehensweisen), und eine Lösung, welche 0,2 μg/ml VEGF und entweder unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc (bei entweder 0,5, 1,0 oder 5,0 μg/ml) oder 10 unterschiedliche stufen-acetylierte Flt1(1-3)-Fc-Proben (jeweils bei 0,5, 1,0 oder 5,0 μg/ml) enthielt, wurde über den Flt1(1-3)-Fc-beschichteten Chip geleitet. Wie in der 8 gezeigt, liegt bei einem sub-stöchiometrischen Verhältnis (0,5 μg/ml von entweder unmodifizierten Flt1(1–3) oder stufen-acetylierten Flt1(1-3)-Fc gegenüber 0,2 μg/ml VEGF) nicht genügend Flt1(1-3)-Fc (entweder unmodifiziert oder stufen-acetyliert) in der Lösung vor, um das VEGF vollständig zu binden. Bei 1,0 μg/ml, was einem stöchiometrischen 1:1-Verhältnis nahekommt, sind sowohl unmodifiziertes als auch stufenacetyliertes Flt1(1-3)-Fc besser in der Lage, um die VEGF-Bindung zu kompetieren, aber es liegt immer noch ungenügend Flt1(1-3)-Fc-Protein (entweder unmodifiziert oder stufen-acetyliert) vor, um das verfügbare VEGF vollständig zu binden. Bei 5,0 μg/ml jedoch, was mehrmals größer als ein stöchiometrisches 1:1-Verhältnis ist, sind sowohl das Flt1(1-3)-Fc als auch die stufen-acetylierten Flt1(1-3)-Fc-Proteine in der Lage, den VEGF ungeachtet des Acetylierungsgrads zu binden. Dies zeigt deutlich, dass eine Acetylierung die Fähigkeit von Flt1(1-3)-Fc, VEGF zu binden, nicht verändert.
(d.) Pharmakokinetische Analyse von stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc
In vivo-Experimente wurden entworfen, um die pharmakokinetischen Profile von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc- und stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc-Protein zu untersuchen. Balb/c-Mäuse (23 – 28 g) erhielten eine subkutane Injektion mit 4 mg/kg von unmodifizierten oder 10-, 20-, 40-, 60- und 100-fach-Molüberschuss-Proben von stufen-acetyliertem Flt1(1-3)-Fc (3 Mäuse für unmodifizierte, 10-, 20- und 40-fach-Molüberschuss-Proben, und 2 Mäuse für die Proben bei 60- und 100-fachem molaren Überschuss). Den Mäusen wurde 1, 2, 4, 6, 24 Stunden, 2 Tage und 3 Tage nach der Injektion am Schwanz Blut entnommen. Die Seren wurden in einem ELISA-basierenden Assay, welcher ausgelegt war, um Flt1(1-3)-Fc nachzuweisen (obenstehend beschrieben), getestet. Die 9 gibt ausführlich die Ergebnisse dieser Untersuchung wieder. Die T_max für alle getesteten Flt1(1-3)-Fc-Proteine lag am Zeitpunkt von 6 Stunden, aber die C_max war wie folgend: Unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc: 0,06 μg/ml; Probe bei 10-fachem molarem Überschuss: – 0,7 μg/ml; Probe bei 20-fachem molarem Überschuss – 2 μg/ml, Probe bei 40-fachem molarem Überschuss – 4 μg/ml, Probe bei 60-fachem molarem Überschuss – 2 μg/ml, Probe bei 100-fachem molarem Überschuss – 1 μg/ml. Dieses Ergebnis zeigt, dass Acetylierung oder Pegylierung von Flt1(1-3)-Fc dessen pharmakokinetisches Profil signifikant verbessert.
Beispiel 11: Konstruktion einer Flt1(1-3)-Fc-Mutante mit Deletion der basischen Region, welche als Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc bezeichnet wird.
Auf Grundlage der Beobachtung, dass acetyliertes Flt1(1-3)-Fc, welches einen pl unter 6 besitzt, eine viel bessere Pharmakokinetik aufweist als das hoch-positive, unmodifizierte Flt1(1-3)-Fc (pl > 9,3), ergab sich die Frage, ob der Unterschied hinsichtlich der Pharmakokinetik der Nettoladung des Proteins zugeschrieben werden konnte, welche es dazu brachte, an negativ geladene extrazelluläre Matrixkompo nenten zu haften, oder ob es vielleicht spezifische Stellen auf der Oberfläche des Flt1(1-3)-Fc-Proteins gab, welche spezifische Bindungsstellen für extrazelluläre Matrixkomponenten bildeten. Zum Beispiel besitzen viele Proteine bekannterweise Heparinbindungsstellen, welche oft aus einer Anhäufung bzw. einem Cluster basischer Reste bestehen. Manchmal finden sich diese Reste in einem Cluster auf der Primärsequenz des Proteins; gewisse Literaturstellen haben "Konsensussequenzen" für solche Heparinbindungsstellen identifiziert (siehe zum Beispiel Hileman et al., 1998, Bioessays 20 (2): 156 – 67). In anderen Fällen enthüllt die bekannte Kristallstruktur eines Proteins einen Cluster von positiv geladenen Resten auf der Oberfläche eines Proteins, aber die Reste stammen aus verschiedenen Regionen der Primärsequenz und werden nur zusammengebracht, wenn sich das Protein zu seiner Tertiärstruktur faltet. Daher ist es schwierig abzuleiten, ob ein isolierter Aminosäurerest ein Teil eines Clusters von basischen Resten auf der Oberfläche des Proteins ist. Falls jedoch ein Cluster von positiv geladenen Aminosäureresten in der Primärsequenz vorliegt, ist es nicht abwegig, zu vermuten, dass die Reste räumlich nahe zueinander stehen und deswegen Teil einer Bindungsstelle für eine Komponente der extrazellulären Matrix sein könnten. Der Flt1-Rezeptor ist umfassend untersucht worden, und verschiedene Domänen sind beschrieben worden (siehe zum Beispiel Tanaka et al., 1997, Jpn. J. Cancer Res. 88: 867 – 876). Unter Bezugnahme auf die in 10A – 10D dieser Patentanmeldung dargestellte Nukleinsäure- und Aminosäuresequenz kann man die Signalsequenz für die Sekretion identifizieren, welche am Beginn der Sequenz gelegen ist und bis zu dem Glycin reicht, welches durch die Nukleotide 76 – 78 codiert ist. Das reife Protein beginnt mit Ser-Lys-Leu-Lys, beginnend am Nukleotid 79 der Nukleinsäuresequenz. Die Flt1-Ig-Domäne 1 reicht von Nukleotid 79 bis 393, wobei sie mit den Aminosäuren Ser-Asp-Thr endet. Die Flt1-Ig-Domäne 2 reicht von Nukleotid 394 bis 687 (codierend Gly-Arg-Pro bis Asn-Thr-Ile), und die Flt1-Ig-Domäne 3 erstreckt sich von Nukleotid 688 bis 996 (codierend Ile-Asp-Val bis Asp-Lys-Ala). Es gibt eine Brücken-Aminosäuresequenz, Gly-Pro-Gly, welche von den Nukleotiden 997 – 1005 codiert wird, gefolgt von der Nukleotidsequenz, welche humanes Fc codiert (Nukleotide 1006 – 1701 oder Aminosäuren Glu-Pro-Lys bis Pro-Gly-Lys-stop).
Eine ausführlichere Analyse der Flt1-Aminosäuresequenz enthüllt, dass es einen Cluster gibt, nämlich Aminosäurereste 272 – 281 (KNKRASVRR) von 10A – 10D, in welchem 6 von 10 Aminosäureresten basisch sind. Diese Sequenz ist in der Flt1-Ig-Domäne 3 des Rezeptors lokalisiert (siehe 11), welche selbst nicht wesentlich für die Bindung des VEGF-Liganden ist, aber welche eine Höher-Affinitäts- Bindung an Ligand vermittelt. Eine Alignierung der Sequenz von Ig-Domäne 3 mit derjenigen von Ig-Domäne 2 enthüllt, dass in dieser Region ein sehr schlechtes Alignment zwischen den zwei Ig-Domänen vorliegt, und dass es etwa 10 zusätzliche Aminosäuren in der Ig-Domäne 3 gibt. Eine Analyse der Hydrophilie-Profile (Computersoftware MacVector) dieser zwei Domänen zeigt deutlich die Gegenwart einer hydrophilen Region in dem Protein (12A – 12B). Diese Beobachtungen erweckten die Möglichkeit, dass die tatsächliche dreidimensionale Konformation von Flt1-Ig-Domäne 3 einen gewissen Typ von Protrusion bzw. Hervorragung zuließ, welcher nicht in Flt1-Ig-Domäne 2 vorliegt. Um diese Hypothese zu testen, wurden die 10 zusätzlichen Aminosäuren deletiert, und das resultierende Protein wurde getestet, um ersichtlich zu machen, ob die Deletion die Pharmakokinetik günstig beeinflussen würde, ohne die Affinität des Rezeptors für VEGF zu ernsthaft kompromitieren. Dieses DNA-Konstrukt, welches unter Anwendung von standardmäßigen molekularbiologischen Techniken (siehe z. B. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg.: Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY)) in dem Säuger-Expressionsvektor pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA) konstruiert wurde, wird als Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc bezeichnet. Das Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc-Konstrukt wurde aus Flt1(1-3)-Fc durch Deletion der Nukleotide 814–843 (dargestellt in 10A – 10D) abgeleitet, was die hochbasische 10-Aminosäure-Rest-Sequenz Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg aus der Flt1-Ig-Domäne 3 deletiert.
Die Sequenz des letztendlichen DNA-Konstrukts wurde unter Verwendung eines ABI 373A DNA-Sequencers und des Taq-Dideoxy-Terminator-Cycle-Sequenzier-Kits (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) bestätigt. Die Sequenz von Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc wird in der 13A – 13D angegeben.
Beispiel 12: Konstruktion einer Flt1(1-3)-Fc-Mutante mit Deletion der basischen Region, welche als Mut2: Flt1(2-3_ΔB)-Fc bezeichnet wird.
Ein zweites Deletionsmutanten-Konstrukt, welches als Mut2: Flt1(2-3_ΔB)-Fc bezeichnet wird, wurde aus dem Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc-Konstrukt durch Deletion der Flt1-Ig-Domäne 1, welche von den Nukleotiden 79 – 393 codiert wird, abgeleitet (siehe 10A – 10D); aus Gründen der Zweckmäßigkeit wurden die Nukleotide 73 – 78 (TCA GGT) zu TCC GGA verändert. Dies führte eine Restriktionsstelle (BspE1) ein, ohne die assoziierte Aminosäuresequenz, Ser-Gly, zu verändern. Dieses DNA-Konstrukt, welches unter Verwendung von standardmäßigen Molekularbiologie-Techniken (sie he z.B. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Hrsg.: Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) in dem Säuger-Expressionsvektor pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA) konstruiert wurde, wurde ebenfalls hinsichtlich der Sequenz unter Verwendung eines ABI 373A DNA-Sequencers und des Taq-Dideoxy-Terminator-Cycle-Sequenzier-Kits (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) verifiziert. Die Sequenz von Mut2: Flt1(2-3_ΔB)-Fc wird in der 14A – 14C angegeben.
Beispiel 13: Konstruktion einer Flt1(1-3)-Fc-Deletionsmutante, welche als Mut3: Flt1(2-3)-Fc bezeichnet wird.
Ein drittes Deletionsmutanten-Konstrukt, das als Mut3: Flt1(2-3)-Fc bezeichnet wurde, wurde auf dem gleichen Wege wie das Mut2: Flt1(2-3_ΔB)-Fc-Konstrukt konstruiert, außer dass die Flt1-Ig-Domäne 3 Intakt gelassen wurde (die Aminosäuren der basischen Region wurden nicht deletiert). Das Konstrukt wurde unter Verwendung von standardmäßigen molekularbiologischen Techniken konstruiert, und die Sequenz des letztendlichen Konstrukts wurde, wie obenstehend beschrieben, verifiziert. Die Sequenz von Mut3: Flt1(2-3)-Fc wird in der 15A – 15C angegeben.
Beispiel 14: Konstruktion einer N-Glycosylierungsmutante der basischen Region von Flt1(1-3)-Fc, welche als Mut4: Flt1(1-3_R->N)-Fc bezeichnet wird.
Ein Endkonstrukt wurde hergestellt, in welchem eine N-Glycosylierungsstelle in der Mitte der basischen Region der Flt-Ig-Domäne 3 eingeführt wurde. Dieses Konstrukt wurde als Mut4: Flt1(1-3_R->N)-Fc bezeichnet und wurde durch Ändern der Nukleotide 824 – 825 von GA zu AC hergestellt, was folglich den codierten Arg-Rest (AGA) zu einem Asn-Rest (AAC) veränderte (siehe 10A – 10D). Die resultierende Aminosäuresequenz ist deshalb von Arg-Ala-Ser zu Asn-Ala-Ser verändert, was dem kanonischen Signal (Asn-Xxx-Ser/Thr) für die Addition einer N-Glycosylierungsstelle am Asn-Rest entspricht. Die Sequenz von Mut4: Flt1(1-3_R->N)-Fc ist in der 16A – 16D dargestellt.
Beispiel 15: Charakterisierung von acetylierten Flt1(1-3)-Fc-, Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc- und Mut4: Flt1(1-3_R->N)-Fc-Mutanten.
(a.) Bindung an extrazelluläre Matrixkomponenten
Um zu bestimmen, ob die drei modifizierten Proteine mit einer mehr oder minder großen Wahrscheinlichkeit verbesserte pharmakokinetische Eigenschaften aufweisen, wurden Matrigel-beschichtete 96-Vertiefungsschalen (wie obenstehend beschrieben) mit variierenden Konzentrationen der mutanten Proteine inkubiert, und es wurde ein Nachweis mit Anti-Mensch-Fc/Alkalische-Phosphatase-konjugierten Antikörpern vorgenommen. Wie in der 18 gezeigt, zeigte dieses Experiment, dass, während das unmodifizierte FLt1(1-3)-Fc-Protein stark an diese Vertiefungen binden konnte, das Mut3:Flt1(2-3)-Fc-Protein etwas schwächer bindete, das Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc-Protein noch schwächer band, und das Mut2: FLt1(2-3_ΔB)-Fc-Protein das beste Profil zeigte, wobei es schwächer als irgendeines der anderen Mutantenproteine bindete. Das Mut4:FLt1(1-3_R->N)-Fc-Glycosylierungs-Mutantenprotein zeigte einen nur marginalen Vorteil im Matrigel-Assay. Diese Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass eine lineare Sequenz von positiven Aminosäuren aus der Primärsequenz deletiert werden kann, was zu einer Verringerung der Ladungswechselwirkung mit Komponenten der extrazellulären Matrix führt.
(b.) Bindung von Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc und Mut4:Flt1(1-3_R->N)-Fc in einem Biacore-basierenden Assay.
Unmodifizierte und acetylierte Flt1(1-3)-Fc- und genetisch modifizierte Mut1:Flt1(1-3_ΔB)-Fc- und Mut4:Flt1(1-3_R->N)-Fc-Proteine wurden in einem Biacore-basierenden Assay getestet, um ihre Fähigkeit, an den Flt1-Ligand, VEGF, zu binden, zu untersuchen. In diesem Assay wurde unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc-Protein (0,25, 0,5 oder 1,0 μg/ml) auf der Oberfläche eines Biacore-Chips immobilisiert (siehe Biacore Anweisungshandbuch, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, für Standardvorgehensweisen), und eine Lösung, welche 0,1 μg/ml VEGF und entweder gereinigtes oder COS-Zellüberstand, enthaltend unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc (bei ungefähr 0,25, 0,5 oder 1,0 μg/ml), gereinigtes acetyliertes Flt1(1-3)-Fc (bei 0,25, 0,5 oder 1,0 μg/ml), COS-Zellüberstand, enthaltend Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc (bei ungefähr 0,25, 0,5 oder 1,0 μg/ml), oder COS-Zellüberstand, enthaltend Mut4: Flt1(1-3_R->N)-Fc (bei ungefähr 0,25, 0,5 oder 1,0 μg/ml), enthielt, wurde über den mit Flt1(1-3)-Fc beschichteten Chip geleitet. Wie in der 17 gezeigt, liegt bei dem sub-stöchiometrischen Ver hältnis (0,25 μg/ml Flt1(1-3)-Fc von unmodifizierten, acetylierten oder genetisch modifizierten Proben gegenüber 0,1 μg/ml VEGF) ungenügend Flt1(1-3)-Fc-Protein vor, um die Bindung von VEGF an das Flt1(1-3)-Fc zu blockieren, welches auf dem Biacore-Chip immobilisiert ist. Bei 0,5 μg/ml unmodifizierten, acetylierten oder genetisch modifizierten Flt1(1-3)-Fc-Proteinen nähert sich das stöchiometrische Verhältnis an 1:1 an, und es liegt eine erhöhte Fähigkeit vor, die VEGF-Bindung an den Biacore-Chip zu blockieren. Bei 1,0 μg/ml unmodifizierten, acetylierten oder genetisch modifizierten Flt1(1-3)-Fc-Proteinen, was ungefähr ein stöchiometrisches 10:1-Verhältnis ist, sind die Flt1(1-3)-Fc-Proteine in der Lage, die Bindung von VEGF an den Biacore-Chip zu blockieren, aber sie sind nicht äquivalent. Unmodifiziertes, acetyliertes und Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc sind im Wesentlichen gleichwertig hinsichtlich ihrer Fähigkeit, die VEGF-Bindung zu blockieren, wohingegen Mut4: Flt1(1-3_R->N)-Fc etwas weniger effizient bei der Blockierung der Bindung ist. Diese Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass es möglich ist, die nicht-spezifische Bindung eines positiv geladenen Moleküls durch genetisches Entfernen einer linearen Sequenz von vorwiegend negativ geladenen Aminosäuren zu verringern.
(c.) Bindung von Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc, Mut2: Flt1(2-3_ΔB)-Fc und Mut3: Flt1(2-3)-Fc in einem Assay auf ELISA-Basis.
Um zu bestimmen, ob die drei Mutantenproteine den Flt1-Liganden VEGF binden konnten, wurden Bindungsexperimente durchgeführt, in welchen 96-Vertiefungs-Platten, welche mit VEGF beschichtet waren, mit variierenden Konzentrationen des jeweiligen Mutantenproteins inkubiert wurden, und nach dem Waschen wurde die gebundene Menge durch Inkubieren mit einem an alkalische Phosphatase konjugierten Anti-Mensch-Fc-Antikörper nachgewiesen und colorimetrisch durch die Zugabe eines passenden Substrates für alkalische Phosphatase quantifiziert. Wie in der 19 gezeigt, zeigte dieses Experiment, dass alle Mutantenproteine, bei den getesteten Konzentrationen, VEGF in ähnlicher Weise binden konnten.
Beispiel 16: Pharmakokinetische Analyse von acetyliertem Flt1(1-3)-Fc, Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc und unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc.
In vivo-Experimente wurden entworfen, um die pharmakokinetischen Profile von unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc, Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc und bei 40-fachem molaren Überschuss acetyliertem Flt1(1-3)-Fc-Protein zu untersuchen. Balb/c-Mäuse (25 – 30 g) erhielten eine subkutane Injektion mit 4 mg/kg unmodifiziertem Flt1(1-3)-Fc, bei 40- fachem molarem Überschuss acetyliertem Flt1(1-3)-Fc- und Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc-Protein (jeweils 4 Mäuse). Diesen Mäusen wurde am Schwanz 1, 2, 4, 6, 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage und 5 Tage nach der Injektion Blut entnommen. Die Seren wurden in einem zum Nachweis von Flt1(1-3)-Fc-Protein entworfenen ELISA geassayt, welcher das Beschichten einer ELISA-Platte mit VEGF, Binden des Flt1(1-3)-Fc und das Berichten mit einem an alkalische Phosphatase verknüpften Anti-Fc-Antikörper beinhaltet. Wie in der 20 gezeigt, war die C_max für diese Reagenzien wie folgend: unmodifiziertes Flt1(1-3)-Fc – 0,15 μg/ml; bei 40-fachem molarem Überschuss acetyliertes Flt1(1-3)-Fc- 1,5 μg/ml; und Mut1: Flt1(1-3_ΔB)-Fc – 0,7 μg/ml.
Beispiel 17: Vektorkonstruktion für modifizierten Flt1-Rezeptor
Die Leitlinie für das Konstruieren modifizierter Versionen des Flt1-Rezeptors (ebenfalls bekannt als VEGFR1) beruhte auf der Beobachtung, dass die Proteinsequenz von Flt1 in hohem Maße basisch war, und bei ihr deswegen die Wahrscheinlichkeit bestand, an die extrazelluläre Matrix (ECM) zu haften. Die in hohem Maße basische Natur von Flt1 erklärt wahrscheinlich, weshalb unmodifziertes Flt1(1-3)-Fc (obenstehend beschrieben) eine schlechte Pharmakokinetik aufweist, welche es schwierig macht, es als ein therapeutisches Mittel zu verwenden. Wie obenstehend beschrieben, zeigte die chemisch modifizierte Form eines bei 40-fachem molarem Überschuss acetylierten Flt1(1-3)-Fc, hierin nachstehend bezeichnet als A40, ein in großem Maße verbessertes Pharmakokinetik(PK)-Profil gegenüber dem nicht-acetylierten Flt1(1-3)-Fc. Deswegen wurden Versuche unternommen, DNA-Moleküle zu konstruieren, welche verwendet werden konnten, um modifizierte Formen eines Flt1-Rezeptormoleküls rekombinant zu exprimieren, welche das von A40 aufgezeigte, verbesserte PK-Profil besitzen und dennoch die Fähigkeit, fest an VEGF zu binden, beibehalten würden.
In der Literatur ist es bekannt, dass die erste Ig-Domäne von Flt1 (welche eine Nettoladung von +5 bei neutralem pH besitzt) nicht essentiell für die feste Bindung an VEGF ist, weswegen diese Domäne deletiert wurde. Die dritte Ig-Domäne (mit einer Nettoladung von +11) ist nicht wesentlich für die Bindung, vermittelt jedoch eine höhere Affinität für VEGF als die zweite Ig-Domäne, so dass sie, anstatt vollständig deletiert zu werden, mit den äquivalenten Domänen der Flt1-Rezeptor-Verwandten Flk1 (auch bekannt als VEGFR2) und Flt4 (auch bekannt als VEGFR3) ersetzt wurde. Diese chimären Moleküle (bezeichnet als R1R2 (Flt1.D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und VEGFR1R2-FcΔC1(a) und R1R3 (Flt1D2.VEGFR3D3-FcΔC1(a) bzw. VEGFR1R3- FcΔC1(a), worin R1 und Flt1D2 = Ig-Domäne 2 von Flt1 (VEGFR1); R2 und Flk1D3 = Ig-Domäne 3 von Flk1 (VEGFR2); und R3 und VEGFR3D3 = Ig-Domäne 3 von Flt4 (VEGFR3)) waren wesentlich weniger klebefähig an die ECM, wie durch einen in vitro-ECM-Bindungs-Assay, wie nachstehend beschrieben, beurteilt wurde, und besaßen eine stark verbesserte PK, wie nachstehend beschrieben wird. Darüber hinaus waren diese Moleküle in der Lage, VEGF fest zu binden, wie nachstehend beschrieben wird, und die Phosphorylierung des nativen Flk1-Rezeptors, welcher in Endothelzellen exprimiert wird, zu blockieren, wie nachstehend beschrieben.
(a) Konstruktion des Expressionsplasmids pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)
Die Expressionsplasmide pMT21.Flt1(1-3).Fc (6519 bp) und pMT21.Flk-1(1-3).Fc (5230 bp) sind Plasmide, welche Ampicillinresistenz und Fc-markierte bzw. "Fc-tagged" Versionen der Ig-Domänen 1 – 3 von humanem Flt1 bzw. humanem Flk1 codieren. Diese Plasmide wurden verwendet, um ein DNA-Fragment zu konstruieren, das aus einer Fusion der Ig-Domäne 2 von Flt1 mit der Ig-Domäne 3 von Flk1 besteht, und zwar unter Verwendung von PCR-Amplifikation der jeweiligen Ig-Domänen, gefolgt von weiteren PCR-Runden, um die Fusion der zwei Domänen zu einem Einzelfragment zu erzielen. Für die Ig-Domäne 2 von Flt1 waren die 5'- und 3'-Amplifikationsprimer wie folgend:
5': bsp/flt1 D2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')
3': Flt1D2-Flk1D3.as (5'-CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3')
Der 5'-Amplifikationsprimer codiert eine BspE1-Restriktionsenzym-Stelle stromaufwärts der Ig-Domäne 2 von Flt1, welche durch die Aminosäuresequenz GRPFVEM (entsprechend den Aminosäuren 27 – 33 von 21A – 21C) definiert ist. Der 3'-Primer codiert das reverse Komplement des 3'-Endes der Flt1-Ig-Domäne 2, direkt fusioniert an den 5'-Beginn der Flk1-Ig-Domäne 3, wobei der Fusionspunkt als TIID von Flt1 (entsprechend den Aminosäuren 123 – 126 von 21A – 21C) definiert ist und sich fortsetzt in WLS (was den Aminosäuren 127 – 130 von 21A – 21C entspricht) von Flk1.
Für die Ig-Domäne 3 von Flk1 waren die 5'- und 3'-Amplifikationsprimer wie folgend:
5': Flt1D2-Flk1D3.s (5'-ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG-3')
3': Flk1D3/apa/srf.as (5'-GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3')
Der 5'-Amplifikations-Primer codiert das Ende der Flt1-Ig-Domäne 2, welches direkt an den Anfang der Flk1-Ig-Domäne 3 fusioniert ist, wie obenstehend beschrieben. Der 3'-Amplifikationsprimer codiert das Ende der Flk1-Ig-Domäne 3, das definiert wird durch die Aminosäuren VRVHEK (entsprechend den Aminosäuren 223 – 228 von 21A – 21C), gefolgt von einer Brückensequenz, die eine Erkennungssequenz für das Restriktionsenzym Srf1 einschließt und die Aminosäuren GPG codiert. Die Brückensequenz entspricht den Aminosäuren 229 – 231 von 21A – 21C.
Nach einer Runde der PCR-Amplifikation zur Herstellung der individuellen Domänen werden die Produkte in einem Röhrchen vereinigt und einer weiteren PCR-Runde mit den Primern bsp/flt1D2 und Flk1D3/apa/srf.as (obenstehend beschrieben) zur Erzeugung des Fusionsprodukts unterzogen. Dieses PCR-Produkt wurde anschließend mit den Restriktionsenzymen BspEI und SmaI verdaut, und das resultierende 614 bp große Fragment wurde in die BspEI- bis SrfI-Restriktionsstellen des Vektors pMT21/ΔB2.Fc subkloniert, um das Plasmid pMT21/Flt1D2.Flk1D3.Fc zu erzeugen. Die Nukleotidsequenz des Flt1D2-Flk1D3-Genfusions-Inserts wurde durch standardmäßige Sequenzanalyse bestätigt. Dieses Plasmid wurde dann mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SrfI verdaut, und das resultierende 702 bp große Fragment wurde in die EcoRI- bis SrfI-Restriktionsstellen des Plasmids pFlt1(1-3)B2-FcΔC1(a) transferiert, um das Plasmid pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) herzustellen. Die vollständige DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenz des chimären Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)-Moleküls wird in der 21A – 21C dargestellt.
(b) Konstruktion des Expressionsplasmids pFlt1D2VEGFR3D3FcΔC1(a)
Das Expressionsplasmid pMT21.Flt1(1-3).Fc (6519 bp) codiert Ampicillinresistenz und eine Fc-markierte Version der Ig-Domänen 1 – 3 des humanen Flt1-Rezeptors. Dieses Plasmid wurde verwendet, um ein DNA-Fragment, das die Ig-Domäne 2 von Flt1 enthält, durch PCR herzustellen. RNA aus der Zelllinie HEL921.7 wurde verwendet, um die Ig-Domäne 3 von Flk1 unter Anwendung von Standard-RT-PCR-Methodik herzustellen. Eine weitere PCR-Amplifikations-Runde wurde angewandt, um eine Fusion der zwei Ig-Domänen zu einem einzelnen fusionierten Fragment zu erzielen. Für die Ig-Domäne 2 von Flt1 waren die 5'- und 3'-Amplifikationsprimer wie folgend:
5': bsp/flt1D2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')
3': Flt1D2.VEGFR3D3.as(TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT)
Der 5'-Amplifikations-Primer codiert eine BspE1-Restriktionsstelle stromaufwärts der Ig-Domäne 2 von Flt1, definiert durch die Aminosäuresequenz GRPFVEM (was den Aminosäuren 27 – 33 von 22A – 22C entspricht). Der 3'-Amplifikationsprimer codiert das reverse Komplement des Endes der Flt1-Ig-Domäne 2, das direkt an den Beginn der VEGFR3-Ig-Domäne 3 fusioniert ist, wobei der Fusionspunkt definiert ist als TIID von Flt1 (was den Aminosäuren 123 – 126 von 22A – 22C entspricht) und sich fortsetzt in IQLL von VEGFR3 (was den Aminosäuren 127 – 130 von 22A – 22C entspricht).
Für die Ig-Domäne 3 von VEGFR3 waren die 5'- und 3'-Primer, welche für die RT-PCR verwendet wurden, wie folgend:
5': R3D3.s (ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTGGTA)
3': R3D3.as (ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)
Sowohl die 5'- als auch 3'-Amplifikations-Primer entsprechen der Sequenz von VEGFR3. Das 296 bp große Amplifikationsprodukt dieser RT-PCR-Reaktion wurde durch Standardtechniken isoliert und einer zweiten PCR-Runde unterzogen, um geeignete Sequenzen anzufügen, um die Fusion der Flt1D2- mit den Flk1D3-Domänen und die Fusion der Flk1D3- und Fc-Domänen über eine GPG-Brücke (siehe nachstehend) zu ermöglichen. Die Amplifikations-Primer waren die folgenden:
5': Flt1D2.VEGFR3D3.s (TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG)
3': VEGFR3D3/srf.as (GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT)
Der 5'-Amplifikations-Primer codiert das 3'-Ende der Flt1-Ig-Domäne 2, welches direkt an den Beginn (5'-Ende) der VEGFR3-Ig-Domäne 3 fusioniert ist, wie obenstehend beschrieben. Der 3'-Amplifikations-Primer codiert das 3'-Ende der VEGFR3-Ig-Domäne 3, welches definiert ist von den Aminosäuren VIVHEN (was den Aminosäuren 221 – 226 von 22A – 22C entspricht), gefolgt von einer Brückensequenz, welche eine Erkennungsstelle für Srf1 einschließt und die Aminosäuren GPG codiert. Die Brückensequenz entspricht den Aminosäuren 227 – 229 von 22A – 22C.
Nach einer Runde (für Flt1-Ig-Domäne 2) oder zwei Runden (für Flt4-Ig-Domäne 3) der PCR zur Erzeugung der individuellen Ig-Domänen wurden die PCR-Produkte in einem Röhrchen vereinigt und einer weiteren PCR-Amplifikationsrunde mit den obenstehend beschriebenen Amplifikations-Primern bsp/flt1D2 und VEGFR3D3/srf.as unterzogen, um das Fusionsprodukt herzustellen. Dieses PCR-Produkt wurde anschließend mit den Restriktionsenzymen BspEI und SmaI verdaut, und das resultierende 625 bp große Fragment wurde in die BspEI- bis SrtI-Restriktionsstellen des Vektors pMT21/Flt1ΔB2.Fc (obenstehend beschrieben) subkloniert, um das Plasmid pMT21/Flt1D2.VEGFR3D3.Fc zu erzeugen. Die Sequenz des Flt1D2-VEGFR3D3-Genfusions-Inserts wurde durch standardmäßige Sequenzanalyse bestätigt. Dieses Plasmid wurde dann mit den Restriktionsenzymen EcoRI und SrfI verdaut, und das resultierende 693 bp große Fragment wurde in die EcoRI- bis SrtI-Restriktionsstellen des Plasmids pFlt1(1-3)ΔB2-FcΔC1(a) subkloniert, um das Plasmid zu erzeugen, welches als pFlt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) bezeichnet wird. Die vollständige DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenz des chimären Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)-Moleküls wird in 22A – 22C dargestellt.
Beispiel 18: Bindungsassay auf Bindung der extrazellulären Matrix (ECM)
ECM-beschichtete Platten (Becton Dickinson, Katalog # 35-4607) wurden mit warmem DME, welches mit Glutamin (2 mM), 100 U Penizillin, 100 U Streptomycin und 10 % BCS supplementiert war, mindestens eine Stunde lang, vor Zugeben der Proben, rehydratisiert. Die Platten wurden dann eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit variierenden Konzentrationen an Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a), beginnend bei 10 nM mit anschließenden zweifachen Verdünnungen in PBS plus 10 % BCS, inkubiert. Die Platten wurden dann dreimal mit PBS plus 0,1 % Triton-X gewaschen und mit an Alkalische Phosphatase konjugiertem Anti-Mensch-Fc-Antikörper (Promega, 1:4000 in PBS plus 10 % BCS) eine Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert. Dann wurden die Platten viermal mit PBS 0,1 % Triton-X, gewaschen, und Alkalische-Phosphatase-Puffer/pNPP-Lösung (Sigma) wurde für die Farbentwicklung zugesetzt. Die Platten wurden bei I = 405 – 570 nm abgelesen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der 23 gezeigt und demonstrieren, dass die Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)- und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)-Proteine, im Vergleich zum Flt1(1-3)-Fc-Protein, beträchtlich weniger an die ECM haften.
Beispiel 19: Transiente Expression von pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) in CHO-K1(E1A)-Zellen
Eine Kultur im Großmaßstab (2 Liter) von E. coli-DH10B-Zellen, welche das obenstehend in Beispiel 17(a) beschriebene Plasmid pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) tragen, wurde über Nacht in "Terrific Broth" (TB) plus 100 μg/ml Ampicillin wachsen gelassen. Am nächsten Tag wurde die Plasmid-DNA unter Verwendung eines "Endofree Megaprep"-Kits von QlAgen unter Befolgung des Protokolls des Herstellers extrahiert. Die Konzentration der gereinigten Plasmid-DNA wurde durch Standardtechniken unter Verwendung eines UV-Spektrophotometers und eines Fluorometers bestimmt. Die Plasmid-DNA wurde durch standardmäßigen Restriktionsenzym-Verdau von Aliquots unter Verwendung der Restriktionsenzyme EcoRI plus NotI und AseI verifiziert. Alle Restriktionsenzym-Verdau-Fragmente entsprachen den vorhergesagten Größen, als sie auf einem 1-%igen Agarosegel analysiert wurden.
Vierzig 15-cm-Petrischalen wurden mit CHO-K1/E1A-Zellen bei einer Dichte von 4 × 10⁶ Zellen/Platte angeimpft. Das Plattierungsmedium war Gibco Ham's F-12, welches mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS) von Hyclone, 100 U Penzillin/100 U Streptomyzin und Glutamin (2 mM) ergänzt worden war. Am folgenden Tag wurde jede Platte mit Zellen mit 6 μg der pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)-Plasmid-DNA unter Verwendung von Gibco-Optimem und Gibco-Lipofectamin in einem Volumen von 12 ml unter Befolgung des Herstellerprotokolls transfiziert. Vier Stunden nach Zugeben der Transfektionsmischung zu den Zellen wurden 12 ml/Platte an Optimem, welches mit 10 % FBS supplementiert war, zugesetzt. Die Platten wurden über Nacht bei 37°C in einem 5%CO₂-Inkubator inkubiert. Am folgenden Tag wurde das Medium von jeder Platte entfernt, und 25 ml Expressionsmedium (Gibco CHO-S-SFM II, welches mit Glutamin (2 mM) und 1 mM Natriumbutyrat ergänzt war) zugesetzt. Die Platten wurden bei 37°C 3 Tage lang inkubiert. Nach 3 Tagen Inkubation wurde das Medium von jeder Platte abgesaugt und bei 400 U/min in einem Ausschwingbecher-Rotor zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der Überstand wurde in sterile 1-Liter- Flaschen dekantiert, und die Reinigung des exprimierten Proteins wurde durchgeführt, wie nachstehend beschrieben.
Beispiel 20: Konstruktion des Expressionsvektors pVEGFR1R2-FcΔC1(a)
Das Expressionsplasmid pVEGFR1R2.FcΔC1(a) wurde durch Insertion von DNA, welche die Aminosäuren SDT (entsprechend den Aminosäuren 27 – 29 von 24A – 24C) codierte, zwischen die Flt1d2-Flk1d3-FcΔC1(a)-Aminosäuren 26 und 27 von 21A – 21C (GG) und Entfernen der DNA, welche die Aminosäuren GPG codiert, entsprechend den Aminosäuren 229 – 231 von Figur, konstruiert. Die SDT-Aminosäuresequenz liegt nativ in dem Flt1-Rezeptor vor, und wurde wieder eingefügt, um die Wahrscheinlichkeit einer heterogenen N-terminalen Prozessierung zu verringern. Das GPG (Brückensequenz) wurde entfernt, so dass die Flt1- und Flk1-Ig-Domänen direkt aneinander fusioniert wurden. Die vollständige DNA- und abgeleitete Aminosäuresequenz des chimären pVEGFR1R2.FcΔC1(a)-Moleküls sind in 24A – 24C angegeben.
Beispiel 21: Zur Herstellung modifizierter Flt1-Rezeptoren angewandtes Zellkulturverfahren
(a) Zur Herstellung von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) angewandtes Zellkulturverfahren
Das Verfahren zur Herstellung von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)-Protein unter Verwendung des obenstehend in Beispiel 1 beschriebenen Expressionsplasmids pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) beinhaltet die Suspensionskultur von rekombinanten Chinesischen-Hamster-Ovar(CHO K1/E1A)-Zellen, welche das Proteinprodukt konstitutiv exprimieren. Die Zellen werden in Bioreaktoren herangezüchtet und das Proteinprodukt wird isoliert und durch Affinitäts- und Größenausschluss-Chromatographie gereinigt. Das Verfahren wird nachstehend in größerer Ausführlichkeit angegeben.
Zellexpansion
Zwei konfluente T-225-cm²-Flaschen, welche die Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)-exprimierende Zelllinie enthielten, wurden durch Passagieren der Zellen in acht T-225-cm²-Flaschen in Medium (GMEM + 10 % Serum, GIBCO) expandiert und bei 37°C und 5 % CO₂ inkubiert. Als die Flaschen sich der Konfluenz näherten (ungefähr 3 bis 4 Ta ge), wurden die Zellen unter Verwendung von Trypsin abgelöst. Frisches Medium wurde zugegeben, um die Zellen vor einer weiteren Exposition an das Trypsin zu schützen. Die Zellen wurden zentrifugiert und in frischem Medium resuspendiert, dann in acht 850 cm² große Roller-Flaschen überführt und bei 37°C und 5 % CO₂ bis zur Konfluenz inkubiert.
Suspensionskultur in Bioreaktoren
In Roller-Flaschen herangezüchtete Zellen wurden trypsinisiert, um sie von der Oberfläche abzulösen, und mit Suspensionskulturmedium gewaschen. Die Zellen werden aseptisch in einen 5L-Bioreaktor (New Brunswick Celligen Plus) überführt, wo die Zellen in 3,5 Litern Suspensionskultur wachsen gelassen werden. Das Suspensionskulturmedium war eine glutaminfreie Niedrigglukose-Modifikation von IS-CHO (Irvine Scientific), zu welchem 5 % fötales Rinderserum (Hyclone), GS-Supplement (Life Technologies) und 25 μM Methionin-Sulfoximin (Sigma) zugegeben wurden. Der pH-Wert wurde durch Zugabe von Kohlendioxid in das Einlassgas oder durch Zugabe einer flüssigen Lösung von Natriumcarbonat in den Bioreaktor auf 7,2 reguliert. Der Spiegel an gelöstem Sauerstoff wurde bei 30 % Sättigung durch Zusetzen von Sauerstoff oder Stickstoff in das Einlassgas aufrechterhalten, und die Temperatur auf 37°C reguliert. Als eine Dichte von 4 × 10⁶ Zellen/ml erreicht war, wurden die Zellen in einen 40L-Bioreaktor überführt, welcher das gleiche Medium und Einstellpunkte zur Steuerung des Bioreaktors enthielt. Der Temperatur-Einstellpunkt wurde auf 34°C verringert, um das Zellwachstum zu verlangsamen und die relative Rate der Proteinexpression zu erhöhen.
(b) Zur Herstellung von Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) verwendetes Zellkulturverfahren
Dieselben Methodiken, wie obenstehend für Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) beschrieben, wurden angewandt, um Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) herzustellen.
Beispiel 22: Ernten und Reinigung von modifizierten Flt1-Rezeptoren
(a) Ernte und Reinigung von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)
Das Produktprotein wurde aseptisch aus dem Bioreaktor geerntet, während die Zellen unter Verwendung von Millipore-Prostak-Tangentialströmungs-Filtrationsmodulen und einer mechanischen Pumpe mit niedriger Scherung (Fristam) zurückgehalten wurden. Frisches Medium wurde in den Bioreaktor gegeben, um jenes zu ersetzen, welches während der Erntefiltration entfernt wurde. Dann wurden ungefähr 40 Liter Erntefiltrat auf eine 400-ml-Säule aufgetragen, welche Protein-A-Sepharose-Harz (Amersham Pharmacia) enthielt. Nach dem Auftragen wurde das Harz mit Puffer gewaschen, welcher 10 mM Natriumphosphat, 500 mM Natriumchlorid, pH 7,2, enthielt, um jedwede nicht-gebundenen kontaminierenden Proteine zu entfernen. Das Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)-Protein wurde mit einem Citratpuffer von pH 3,0 eluiert. Das eluierte Protein wurde durch Zusetzen von Tris-Base neutralisiert und bei –20 °C eingefroren.
Mehrere gefrorene Chargen von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)-Protein aus dem obenstehenden Protein-A-Schritt wurden aufgetaut, vereinigt und konzentriert, wobei eine Tangentialströmungs-Filtrationsmembran von Millipore mit einem nominalen Molekulargewichts-Ausschluss (NMWCO, nominal molecular weight cutoff) von 30 kD verwendet wurde. Das Protein wurde in einen Rührzellen-Konzentrator (Millipore) überführt und unter Verwendung einer 30kD-NMWCO-Membran weiter auf 30 mg/ml konzentriert. Das konzentrierte Protein wurde auf eine Größenausschlusssäule geladen, die mit Superdex-200-Harz (Amersham Pharmacia) gepackt war, welches mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung plus 5 % Glycerol äquilibriert worden war. Der gleiche Puffer wurde verwendet, um den Lauf der Säule durchzuführen. Die Fraktionen, welche dem Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)-Dimer entsprachen, wurden vereinigt, durch einen 0,22-Mikrometer-Filter sterilfiltriert, aliquotiert und eingefroren.
(b) Ernte und Reinigung von Fit1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)
Dieselben Methodiken, wie obenstehend für Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) beschrieben, wurden angewandt, um Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) zu ernten und zu renigen.
Beispiel 23: Phosphorylierungs-Assay hinsichtlich transient exprimiertem VEGFR2
Primäre humane Nabelvenen-Endothelzellen (HUVECs), Passage 4 – 6, wurden zwei Stunden lang in serumfreiem DME-Hochglukosemedium hungern gelassen. Proben, welche 40 ng/ml (1 nM) humanen VEGF165 enthielten, welcher ein Ligand für die VEGF-Rezeptoren Flt1, Flk1 und Flt4 (VEGFR3) ist, wurden hergestellt und wurden 1 Stunde lang bei Raumtemperatur mit variierenden Mengen der modifizier ten Flt1-Rezeptoren Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) in serumfreiem DME-Hochglukose-Medium, welches 0,1 % BSA enthielt, präinkubiert. Die Zellen wurden 5 Minuten lang mit den obenstehend hergestellten Proben +/– VEGF165 herausgefordert, gefolgt von Gesamtzell-Lyse unter Verwendung von komplettem Lysepuffer. Die Zelllysate wurden mit einem Antikörper immunpräzipitiert, der gegen den C-Terminus des VEGFR2-Rezeptors gerichtet ist. Die immunpräzipitierten Lysate wurden auf ein 4–12-%iges SDS-PAGE-Novex-Gel aufgetragen und dann unter Anwendung von standardmäßigen Transfermethodiken auf PVDF-Membran transferiert. Der Nachweis von phosphoryliertem VEGFR2 erfolgte durch Immunoblotting mit dem Anti-Phospho-Tyrosin-mAb, der bezeichnet wird als 4G10 (UBI), und die Entwicklung erfolgte unter Verwendung von ECL-Reagenz (Amersham). Die 25A – 25C und 26A – 26B zeigen die Ergebnisse dieses Experiments. 25A – 25C enthüllt, dass der Nachweis mittels Western-Blot von Tyrosin-phosphoryliertem VEGFR2(Flk1) durch VEGF165-Liganden-Stimulation zeigt, dass Zelloberflächenrezeptoren zu variierenden Spiegeln phosphoryliert sind, abhängig davon, welcher modifizierte Flt1-Rezeptor während den Präinkubationen mit VEGF verwendet wird. Wie in der 25A ersichtlich, besteht bei einem 1,5-molaren Überschuss von entweder Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40) oder transientem Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) eine vollständige Blockierung der Rezeptor-Stimulation durch diese drei modifizierten Flt1-Rezeptoren im Vergleich zur Herausforderung mit Kontrollmedium. Im Gegensatz dazu zeigt transientes Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) keine signifikante Blockierung bei diesem molaren Überschuss im Vergleich zu einer VEGF-Positivkontrollen-Herausforderung. Ähnliche Ergebnisse sind in 25B ersichtlich, worin die modifizierten Flt-Rezeptoren in einem dreifachen molaren Überschuss zum VEGF165-Liganden vorliegen. In der 25C, worin die modifizierten Flt1-Rezeptoren in einem 6-fachen molaren Überschuss zum VEGF165-Liganden vorliegen, kann von transientem Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) nun gezeigt werden, dass es die VEGF165-induzierte Stimulation von Zelloberflächenrezeptoren teilweise blockiert.
In 26A – 26B zeigt ein Nachweis mittels Western-Blot von Tyrosin-phosphoryliertem VEGFR2 (Flk1) durch VEGF165-Liganden-Stimulation, dass Zelloberflächenrezeptoren nicht durch Herausforderungs-Proben phosphoryliert werden, bei welchen VEGF165 mit einem 1- und 2-fachen molaren Überschuss (26A) oder 3- und 4-fachem molaren Überschuss (26B) von entweder transientem Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), stabilem Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) oder transientem VEGFR1R2-FcΔC1(a) präinkubiert wurde. Bei allen getesteten Konzentrationen an modifiziertem Flt1-Rezeptor besteht eine vollständige Bindung von VEGF165-Ligand während der Präinkubation, was dazu führt, dass es zu keiner nachweisbaren Stimulation von Zelloberflächenrezeptoren durch ungebundenes VEGF165, im Vergleich zur Kontrollmedium-Herausforderung, kommt.
Beispiel 24: Zellproliferations-Bioassay
Die Testzellpopulation besteht aus MG87-Zellen, welche mit einem Expressionsplasmid stabil transfiziert worden sind, das ein DNA-Insert enthält, welches die extrazelluläre VEGFR2(Flk1)-Domäne, fusioniert an die intrazelluläre TrkB-Kinase-Domäne, codiert, wodurch ein chimäres Molekül hergestellt wird. Der Grund dafür, dass die intrazelluläre TrkB-Kinase-Domäne eher verwendet wurde denn die native intrazelluläre VEGFR2(Flk1)-Kinase-Domäne, besteht darin, dass die intrazelluläre Kinasedomäne von VEGFR2(Flk1) keine starke proliferative Antwort bei Stimulation durch VEGF165 in diesen Zellen verursacht. Es ist bekannt, dass MG87-Zellen, welche Volllängen-TrkB-Rezeptor enthalten, eine robuste proliferative Antwort ergeben, wenn sie mit BDNF stimuliert werden, weshalb die intrazelluläre TrkB-Kinase-Domäne zur Konstruktion unter Ersetzung der intrazellulären Kinasedomäne von VEGFR2(Flk1) herangezogen wurde, um den Vorteil dieses proliferativen Antwortvermögens zu nutzen.
5 × 10³ Zellen/Vertiefung wurden in einer 96-Vertiefungs-Platte ausplattiert und 2 Stunden lang bei 37°C absetzen gelassen. Die folgenden modifizierten Flt-Rezeptoren, Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a), plus ein irrelevanter Rezeptor, bezeichnet als Tie2-Fc, als eine Negativkontrolle, wurden von 40 nM bis 20 pM titriert und eine Stunde lang auf den Zellen bei 37°C inkubiert. Humaner rekombinanter VEGF165 in definiertem Medium wurde dann zu allen Vertiefungen bei einer Konzentration von 1,56 nM zugesetzt. Die Platten wurden 72 Stunden lang bei 37°C inkubiert, und dann wurde MTS (Owen's Reagenz, Promega) zugegeben, und die Platten wurden weitere 4 Stunden lang inkubiert. Schließlich wurden die Platten auf einem Spektrophotometer bei 450/570 nm abgelesen. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der 27 gezeigt. Der Kontrollrezeptor Tie2-Fc blockiert die VEGF165-induzierte Zellproliferation bei jedweder Konzentration nicht, wohingegen Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) 1,56 nM VEGF165 mit einer halbmaximalen Dosis von 0,8 nM blockiert. Flt1(1-3)-Fc und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) sind weniger effektiv beim Blockieren von VEGF165 in diesem Assay mit einer halbmaximalen Dosis von ~2 nM. VEGF165 allein ergibt eine Ablesung von 1,2 Extinktionseinheiten, und der Hintergrund beläuft sich auf 0,38 Extinktionseinheiten.
Beispiel 25: Bindungsstöchiometrie von modifizierten Flt-Rezeptoren an VEGF165
(a) BIAcore-Analyse
Die Stöchiometrie der Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)- und VEGFR1R2-FcΔC1(a)-Wechselwirkung mit humanem VEGF165 wurde durch Messen entweder des Spiegels der VEGF-Sättigungs-Bindung an die Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)- oder VEGFR1R2-FcΔC1(a)-Oberflächen oder durch Messen der Konzentration an VEGF165, welche benötigt wird, um die Bindung von Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) oder VEGFR1R2-FcΔC1(a) an eine VEGF-BIAcore-Chip-Oberfläche vollständig zu verhindern, bestimmt.
Die modifizierten Flt-Rezeptoren Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) und VEGFR1R2-FcΔC1(a) wurden mit einem Anti-Fc-spezifischen Antikörper eingefangen, welcher zuerst auf einem Biacore-Chip (BIACORE) unter Anwendung von Amin-Kopplungs-Chemie immobilisiert worden war. Eine Leerwert-Antikörperoberfläche wurde als eine Negativkontrolle verwendet. VEGF165 wurde eine Stunde lang bei einer Konzentration von 1 nM, 10 nM und 50 nM über die Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)- und VEGFR1R2-FcΔC1(a)-Oberflächen bei 10 μl/min injiziert. Ein Echtzeit-Bindungssignal wurde aufgezeichnet, und die Sättigungsbindung wurde am Ende jeder Injektion erreicht. Die Bindungsstöchiometrie wurde als ein Molverhältnis von gebundenem VEGF165 zu dem immobilisierten Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) oder VEGFR1R2-FcΔC1(a) berechnet, wobei der Umwandlungsfaktor von 1000 RU äquivalent zu 1 ng/ml verwendet wurde. Die Ergebnisse wiesen auf eine Bindungsstöchiometrie von einem dimeren VEGF165-Molekül pro einem Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)- oder VEGFR1R2-FcΔC1(a)-Molekül hin (28).
In Lösung wurden Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) oder VEGFR1R2-FcΔC1(a) bei einer Konzentration von 1 nM (schätzungsweise 1000mal höher als die KD der Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)- oder VEGFR1R2-FcΔC1(a)/VEGF165-Wechselwirkung) mit variierenden Konzentrationen von VEGF165 gemischt. Nach einstündiger Inkubation wurden die Konzentrationen des freien Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) in Lösung als ein Bindungssignal an eine amingekoppelte VEGF165-Oberfläche gemessen. Eine Eichkurve wurde verwendet, um das Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)-BIAcore-Bindungssignal in dessen molare Konzentration umzuwandeln. Die Daten zeigten, dass die Zugabe von 1 nM VEGF165 in die Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)-Lösung die Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)-Bindung an die VEGF165-Oberfläche vollständig blockierte. Dieses Ergebnis legte die Bindungsstöchiometrie von einem VEGF165-Molekül pro einem Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)-Molekül nahe (29 und 30). Als die Konzentration von Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) als eine Funktion der zugegebenen Konzentration an VEGF165 grafisch aufgetragen wurde, belief sich die Steigung des linearen Abschnitts auf –1,06 für Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) und –1,07 für VEGFR1R2-FcΔC1(a). Die Größe der Steigung, sehr nahe zu –1, wies darauf hin, dass ein Molekül VEGF165 an ein Molekül von entweder Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) oder VEGFR1R2-FcΔC1(a) gebunden hatte.
(b) Größenausschluss-Chromatographie
Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) wurde mit einem 3-fachen Überschuss von VEGF165 gemischt, und der Rezeptor-Ligand-Komplex wurde unter Verwendung einer Superose-6-Größenausschluss-Chromatographiesäule von Pharmacia gereinigt. Der Rezeptor-Ligand-Komplex wurde dann in einem Puffer, der 6M Guanidinhydrochlorid enthielt, inkubiert, um ihn in seine Komponentenproteine zu dissoziieren.
Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) wurde von VEGF165 unter Verwendung einer Superose-6-Größenausschluss-Chromatographie-Säule getrennt, welche in 6M Guanidiniumchlorid laufen gelassen wurde. Um die Komplex-Stöchiometrie zu bestimmen, wurden mehrere Injektionen von Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) und VEGF165 vorgenommen, und die Peakhöhe oder integrierte Peakintensität wurde als eine Funktion der Konzentration an injiziertem Protein grafisch aufgetragen. Die Kalibrierung wurde unter einer Bedingung vorgenommen, die identisch zu derjenigen war, welche bei der Trennung der Komponenten des Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)NEGF-Komplexes angewandt wurde. Die Quantifizierung der Zusammensetzung des Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)-Komplexes basierte auf den Kalibrierungskurven. Die Ergebnisse dieses Experimentes sind in 28 dargestellt, welche zeigt, dass sich das Verhältnis von VEGF165 zu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) in einem Komplex auf 1 : 1 beläuft.
Beispiel 26: Bestimmung der Bindungs-Stöchiometrie des Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165-Komplexes durch Größenausschluss-Chromatographie
Herstellung des Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/NEGF165-Komplexes
VEGF165 (Konzentration = 3,61 mg/ml) wurde mit von CHO-Zellen transient exprimiertem Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) (Konzentration = 0,9 mg/ml) in einem Molverhältnis von 3:1 (VEGF165 : Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)) gemischt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
(a) Größenausschlusschromatographie (SEC) unter nativen Bedingungen
Um den Komplex von einem Überschuss an ungebundenem VEGF165 zu trennen, wurden 50 μl des Komplexes auf eine Superose-12-PC 3.2/30 von Pharmacia, welche in PBS-Puffer äquilibriert worden war; aufgetragen. Die Probe wurde mit dem gleichen Puffer bei einer Fließrate von 40 μl/min bei Raumtemperatur eluiert. Die Ergebnisse dieser SEC sind in der 31 gezeigt. Der Peak #1 repräsentiert den Komplex, und Peak #2 repräsentiert ungebundenes VEGF165. Zwischen 1,1 und 1,2 ml eluierte Fraktionen wurden vereinigt, und Guanidiniumhydrochlorid (GuHCl) wurde zu einer Endkonzentration von 4,5 M zugesetzt, um den Komplex zu dissoziieren.
(b) Größenausschlusschromatographie (SEC) und dissoziativen Bedingungen
Um die Komponenten des Rezeptor-Ligand-Komplexes zu trennen und ihr Molverhältnis zu bestimmen, wurden 50 μl des dissoziierten Komplexes, wie obenstehend beschrieben, auf eine, in 6 M GuHCl äquilibrierte, Superose 12 PC 3.2/30 aufgetragen und mit der gleichen Lösung bei einer Fließrate von 40 μl/min bei Raumtemperatur eluiert. Die Ergebnisse dieser SEC sind in der 32 gezeigt. Der Peak #1 repräsentiert Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), und Peak #2 repräsentiert VEGF165.
(c) Berechnung der Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a):VEGF165-Komplex-Stöchiometrie
Die Stöchiometrie des Rezeptor-Ligand-Komplexes wurde aus der Peakfläche oder der Peakhöhe der Komponenten bestimmt. Konzentrationen von VEGF165 bzw. Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), welche der Peakhöhe oder Peakfläche entsprechen, wurden aus den Standardkurven für VEGF165 und Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) erhalten.
Um eine Standardkurve zu erhalten, wurden vier unterschiedliche Konzentrationen (0,04 mg/ml – 0,3 mg/ml) jeder Komponente auf eine Superose 12 PC 3.2/30-Säule von Pharmacia, welche in 6 M Guanidiniumchlorid äquilibriert worden war, injiziert und mit der gleichen Lösung bei einer Fließrate von 40 μl/min bei Raumtemperatur eluiert. Die Standardkurve wurde erhalten durch grafisches Auftragen von Peakfläche oder Peakhöhe gegen die Proteinkonzentration. Das Molverhältnis von VEGF165:Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), das aus der Peakfläche der Komponenten bestimmt wurde, belief sich auf 1,16. Das Molverhältnis von VEGF165:Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), welches aus der Peakhöhe der Komponenten bestimmt wurde, belief sich auf 1,10.
Beispiel 27: Bestimmung der Stöchiometrie des Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165-Komplexes durch Größenausschlusschromatographie mit On-Line-Lichtstreuung
Komplexherstellung
VEGF165 wurde mit von CHO transient exprimiertem Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)-Protein in einem Molverhältnis von 3:1 (VEGF165:Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)) gemischt und über Nacht bei 4 °C inkubiert.
(a) Größenausschlusschromatopraphie (SEC) mit On-Line-Lichtstreuung
Eine Größenausschluss-Chromatographiesäule mit einem MiniDawn-on-line-Lichtstreuungs-Detektor (Wyatt Technology, Santa Barbara, Californien) und Brechungsindex(RI)-Detektoren (Shimadzu, Kyoto, Japan) wurde verwendet, um das Molekulargewicht (MG) des Rezeptor-Ligand-Komplexes zu bestimmen. Die Proben wurden auf eine Superose 12 HR 10/30-Säule (Pharmacia), welche in PBS-Puffer äquilibriert worden war, aufgetragen und mit dem gleichen Puffer mit einer Fließrate von 0,5 ml/min bei Raumtemperatur eluiert. Wie in der 33 gezeigt, zeigt das Elutionsprofil zwei Peaks. Der Peak #1 repräsentiert den Rezeptor-Ligand-Komplex, und der Peak #2 repräsentiert das ungebundene VEGF165. Das MG wurde aus LS- und RI-Signalen berechnet. Die gleiche Vorgehensweise wurde angewandt, um das MG der individuellen Komponenten des Rezeptor-Ligand-Komplexes zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind wie folgend: Das MG des Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165-Komplexes an der Peakposition beträgt 157 300 (33), das MG von VEGF165 an der Peakposition beträgt 44 390 (34) und das MG von R1R2 am Peak beträgt 113 300 (35).
Diese Daten wiesen darauf hin, dass die Stöchiometrie des Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF-Komplexes sich auf 1:1 beläuft, da sie der Summe der Molekulargewichte für Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) und VEGF165 entspricht. Bedeutenderweise bewies dieses Verfahren schlüssig, dass der Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165-Komplex tatsächlich aus lediglich einem Molekül VEGF165-Ligand und lediglich einem Molekül des Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) bestand.
Beispiel 28: Peptidkartierung von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)
Die Disulfidstrukturen und Glycosylierungsstellen in Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) wurden durch ein Peptid-Kartierungsverfahren bestimmt. In diesem Verfahren wurde das Protein zuerst mit Trypsin gespalten. Tryptische Fragmente wurden mittels HPLC, gekoppelt mit Massenspektrometrie, zusätzlich zu einer N-terminalen Sequenzierungstechnik, analysiert und identifiziert. Eine Reduktion des tryptischen Verdaus wurde verwendet, um bei der Identifizierung von Disulfidbrücken enthaltenden Fragmenten zu helfen. Die Behandlung des tryptischen Verdaus mit PNGase F (Glyko, Novato, CA) wurde eingesetzt, um bei der Identifizierung von Fragmenten mit N-verknüpften Glycosylierungsstellen zu helfen. Die Ergebnisse sind in der anhängigen 36 zusammengefasst.
Es gibt insgesamt zehn Cysteine in Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a); sechs von ihnen gehören der Fc-Region an. Es ist bestätigt worden, dass Cys27 eine Disulfidbrücke zu Cys76 bildet. Es ist bestätigt, dass Cys121 eine Disulfidbrücke zu Cys182 ausbildet. Die ersten zwei Cysteine in der Fc-Region (Cys211 und Cys214) bilden eine intermolekulare Disulfidbrücke mit den selben zwei Cysteinen in einer anderen Fc-Kette. Weil diese zwei Cysteine jedoch nicht enzymatisch voneinander getrennt werden können, kann es nicht bestimmt werden, ob die Disulfidbindung zwischen den selben Cysteinen (zum Beispiel Cys211 zu Cys211) oder zwischen Cys211 und Cys214 auftritt. Es ist bestätigt, dass Cys216 eine Disulfidbrücke zu Cys306 bildet. Es ist bestätigt, dass Cys352 eine Disulfidbrücke zu Cys410 bildet.
Es gibt fünf mögliche N-verknüpfte Glycosylierungs-Stellen in Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a). Alle fünf von ihnen sind festgestelltermaßen zu variierenden Graden glycosyliert. Eine vollständige Glycosylierung wurde an Asn33 (Amino säuresequenz NIT), Asn193 (Aminosäuresequenz NST) und Asn282 (Aminosäuresequenz NST) beobachtet. Darüber hinaus wird eine partielle Glycosylierung auf Asn65 und Asn120 beobachtet. Die Stellen der Glycosylierung sind in der 36 durch Unterstreichung hervorgehoben.
Beispiel 29: Pharmakokinetische Analyse von modifizierten Flt-Rezeptoren
(a) Pharmakokinetische Analyse von Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und VEGFR1R2-FcΔC1(a)
Balb/c-Mäuse (25 – 30 g) erhielten eine subkutane Injektion mit 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), von CHO transient exprimiertem Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), von CHO stabil exprimiertem Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und von CHO transient exprimiertem VEGFR1R2-FcΔC1(a). Den Mäusen wurde am Schwanz 1, 2, 4, 6, 24 Stunden, 2 Tage, 3 Tage und 6 Tage nach der Injektion Blut entnommen. Die Seren wurden in einem ELISA geassayt, welcher zum Nachweis von Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) oder VEGFR1R2-FcΔC1(a) ausgelegt war. Der ELISA beinhaltet das Beschichten einer ELISA-Platte mit VEGF165, das Binden des nachzuweisenden Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) oder VEGFR1R2-FcΔC1(a) und das Berichten mit einem Anti-Fc-Antikörper, welcher an Meerettichperoxidase verknüpft ist. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der 37 gezeigt. Die T_max für Flt1(1-3)-Fc (A40) belief sich auf 6 Stunden, während die T_max für das transiente und stabile Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und das transiente VEGFR1R2-FcΔC1(a) sich auf 24 Stunden belief. Die C_max für Flt1(1-3)-Fc (A40) betrug 8 μg/ml. Für beide Transienten (Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und VEGFR1R2-FcΔC1(a)) belief sich die C_max auf 18 μg/ml, und die C_max für das stabile VEGFR1R2-FcΔC1(a) betrug 30 μg/ml.
(b) Pharmakokinetische Analyse von Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)
Balb/c-Mäuse (25 – 30 g) erhielten eine subkutane Injektion mit 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), von CHO transient exprimiertem Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und von CHO transient exprimierten Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). Den Mäusen wurde am Schwanz 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 und 20 Tage nach der Injektion Blut entnommen. Die Seren wurden in einem ELISA geassayt, der zum Nachweis von Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) ausgelegt war. Der ELI SA beinhaltet die Beschichtung einer ELISA-Platte mit 165, das Binden des Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) oder Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) und das Berichten mit einem Anti-Fc-Antikörper, der an Meerettichperoxidase verknüpft ist. Flt1(1-3)-Fc (A40) konnte im Serum nach dem Tag 5 nicht länger nachgewiesen werden, wohingegen Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) 15 oder mehr Tage lang nachweisbar waren. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der 38 gezeigt.
Beispiel 30: Auswertung der Fähigkeit von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) zur Inhibierung von Tumorwachstum in vivo
Um die Fähigkeit von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), Tumorwachstum in vivo zu inhibieren, auszuwerten, wurde ein Modell angewandt, in welchem Tumorzellsuspensionen subkutan auf die rechte Flanke von männlichen "Severe combined immunodeficiency"(SCID)-Mäusen implantiert werden. Zwei Zelllinien, die humane HT1080-Fibrosarkom-Zelllinie (ATCC-Zugangs-Nr. CCL-121) und die Ratten-C6-Gliom-Zelllinie (ATCC-Zugangs-Nr. CCL-107), von denen jede deutlich unterschiedliche Morphologien und Wachstumsmerkmale aufzeigt, wurden in dem Assay verwendet. Die erste Dosis von Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) (bei 25 mg/kg, oder wie in den 39 und 40 angegeben) wurde am Tag der Tumorimplantierung gegeben. Die Tiere erhielten anschließend subkutane Injektionen von Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) oder Vehikel entweder jeden aufeinanderfolgenden Tag (EOD) oder zweimal pro Woche (2X/wk) während einer Dauer von 2 Wochen. Nach 2 Wochen erhielten die Tiere eine Perfusion mit Fixativ, die Tumoren wurden entfernt und die Proben wurden versiegelt. Das Tumorvolumen wurde durch Messen der Länge und Breite von sichtbaren subkutanen Tumoren bestimmt. Sowohl Flt1(1-3)-Fc (A40) als auch Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) verringerten das Wachstum von Tumoren, welche von HT-1080 und C6-Zellen gebildet wurden, signifikant. Die Ergebnisse dieser Experimente sind in der 39 und 40 gezeigt.
Beispiel 31: Effekt von VEGF165 und modifizierten Flt-Rezeptoren im weiblichen Fortpflanzungssystem
Das stereotype Muster der Gefäß-Neumodellierung, welches im Uterus und im Eierstock über den Verlauf des Reproduktionszyklus hinweg auftritt, ist gut charakterisiert worden, was diese Gewebe besonders gut für die Untersuchung von Mechanismen geeignet sein lässt, welche Angiogenese, Gefäß-Neumodellierung und Gefäß- Regression regulieren. Tatsächlich lieferten in situ-Hybridisierungsuntersuchungen in reproduktiven Geweben den ersten klaren Beweis, dass VEGF als ein Mediator der physiologischen Angiogenese in ausgewachsenen Nagetieren sowie Menschen und nicht-menschlichen Primaten wirkt (Phillips et al., 1990; Ravindranath et al., 1992; Shweiki et al., 1993; Kamat et al., 1995). Da zyklische Angiogenese und Gefäß-Neumodellierung hervorstechende Merkmale des normalen Eierstocks und Uterus sind, ist es nicht überraschend, dass festgestellt wurde, dass abnormales Blutgefäßwachstum und/oder vaskuläre Dysfunktion viele pathologische Zustände kennzeichnen, welche diese Organe betreffen. Darüber hinaus wird angenommen, dass diese pathogenen Gefäßabnormalitäten durch die fehlregulierte Expression von einem oder mehreren gefäßbildenden oder anti-gefäßbildenden Faktoren, am herausragendsten VEGF, verursacht oder perpetuiert werden.
Zum Beispiel ist eine abnormale Angiogenese charakteristisch für polyzystische Eierstocks-Erkrankung, Endometriose und Endometrium-Karzinom, und in jedem Fall wird VEGF in dem betroffenen Gewebe überexprimiert (Kamat et al., 1995; Shifren et al., 1996; Guidi et al., 1996; Donnez et al., 1998). Die Überexpression von VEGF spielt angenommenerweise auch eine pathogene Rolle bei der Etablierung von systemischer vaskulärer Hyperpermeabilität im Eierstock-Hyperstimulations-Syndrom (McClure et al., 1994; Levin et al., 1998) und bei Präeclampsie (Baker et al., 1995; Sharkey et al. 1996). Darüber hinaus ist VEGF als der Permeabilitätsfaktor impliziert worden, welcher für die Hervorrufung von Aszites verantwortlich ist, welche mit Eierstock-Karzinom und anderen Tumoren assoziiert ist (Senger et al., 1983; Boocock et al., 1995). Agenzien, welche die biologischen Wirkungen von VEGF effektiv neutralisieren, können angemessenerweise als therapeutisch nützlich in den obenstehenden und verwandten Zuständen antizipiert werden.
Angiogenese und Gefäß-Neumodellierung sind ebenfalls Zeichen der Blastozysten-Implantation und plazentalen Entwicklung (Findlay, 1986). VEGF wird sowohl in der maternalen Decidua als auch in embryonalen Trophoblasten stark exprimiert, wobei von ihm angenommen wird, zuerst die Expansion und Hyperpermeabilität des uterinären Gefäßsystems während der Peri-Implantations-Periode zu stimulieren und anschließend die Bildung sowohl der maternalen als auch embryonalen Komponenten des plazentalen Gefäßsystems zu vermitteln (Shweiki et al., 1993; Cullinan-Bove und Koos, 1993; Chakraborty et al., 1995, Das et al., 1997). VEGF wird ebenfalls für Gelbkörper-Angiogenese und assoziierte Progesteron-Sekretion erfordert, welche notwendig ist, um den Uterus für die Einnistung vorzubereiten (Ferrara et al., 1998).
Somit können sich Mittel, welche die biologischen Wirkungen von VEGF inhibieren, nützlich als empfängnisverhütende Mittel (durch Verhindern der Einnistung) oder als Abtreibungsmittel in den frühen Stadien der Gestation erweisen. Die letztgenannte Anwendung könnte besondere Verwendung als eine nicht-chirurgische Intervention für die Beendigung von ektopischen Schwangerschaften finden.
Während die Expression von VEGF-Rezeptoren großteils auf das Gefäßendothel in normalen reproduktiven Geweben beschränkt ist, wird Flt1 auch von Trophoblasten in der Plazenta sowohl beim Menschen als auch bei Tieren exprimiert (Clark et al., 1996; He et al., 1999), wo es vorgeschlagenermaßen eine Rolle in der Trophoblasten-Invasion spielt. Interessanterweise werden sowohl Flt1 als auch KDR (Flk1) von der Choriokarzinom-Zelllinie BeWo exprimiert (Charnock-Jones et al., 1994), und VEGF fördert gezeigtermaßen die DNA-Synthese und Tyrosin-Phosphorylierung von MAP-Kinase in diesen Zellen. Weiterhin exprimieren primäre und metastatische Eierstock-Karzinome nicht nur hohe Spiegel an VEGF, sondern – zusätzlich zum Gefäßendothel – exprimieren die Tumorzellen selbst KDR und/oder Flt1 (Boocock et al., 1995). Diese Befunde legen nahe, dass VEGF nicht nur bei der Erzeugung und Aufrechthaltung der Tumorvaskulatur kritisch beteiligt sein kann, sondern dass wenigstens in manchen Tumoren von reproduktivem Ursprung VEGF einer autokrinen Rolle dienen kann, wobei es direkt das Überleben und die Proliferation der Tumorzellen unterstützt. Somit können Mittel, welche die Wirkungen von VEGF blockieren, besonders nützliche Anwendungen für die Behandlung von Tumoren von reproduktivem Ursprung besitzen.
Methoden und Ergebnisse
(a) Untersuchung von VEGF-induzierter Uterus-Hyperpermeabilität
Gonadotrophin aus dem Serum schwangerer Stuten (PMSG, Pregnant mare's serum gonadotrophin) wurde subkutan injiziert (5 IU), um die Ovulation in präpubertären weiblichen Ratten zu induzieren. Dies führt zu einem Anstieg von Östradiol nach zwei Tagen, welches seinerseits eine Induktion von VEGF im Uterus verursacht. Es wird berichtet, dass diese Induktion zur Hyperpermeabilität des Uterus und zu einer Erhöhung des Uterus-Nassgewichts 6 Stunden später führt und, deshalb, potenziell durch die modifizierten Flt-Rezeptoren Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) blockiert werden könnte. In diesem in-vivo-Modell beläuft sich das normale Gewicht des Ratten-Uterus auf etwa 50 mg, und dieses kann durch PMSG auf 300 – 350 mg induziert werden. Eine Austrocknung des Gewebes enthüllt, dass es sich hierbei vollständig um Wassergewicht handelt. Eine subkutane Injektion von Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) und Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) bei 25 mg/kg eine Stunde nach PMSG-Injektion führt zu einer etwa 50%igen Inhibition der Zunahme des Uterus-Nassgewichts. Eine Erhöhung der Dosis an modifiziertem Flt-Rezeptor verringert die Zunahme des Nassgewichts nicht weiter, was nahe legt, dass es eine VEGF-unabhängige Komponente bei diesem Modell gibt. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in der 41 gezeigt.
(a) Untersuchung der Gelbkörper-Angiogenese unter Verwendung von Progesteron als Ablesung
"Pregnant mare's serum gonadotrophin" (PMSG) wird subkutan injiziert (5 IU), um die Ovulation in präpubertären weiblichen Ratten herbeizuführen. Dies führt zu einem vollständig funktionierenden Corpus luteum, welches nach 4 Tagen ein dichtes Netzwerk von Blutgefäßen enthält, das die Sekretion von Progesteron in den Blutfluss gestattet, um den Uterus für die Implantation vorzubereiten. Die Induktion von Angiogenese im Corpus luteum erfordert VEGF; deshalb würde eine Blockierung von VEGF zu einem Mangel an neuen Blutgefäßen und somit einem Mangel an Progesteron, welches in den Blutstrom sezerniert wird, führen. In diesem in-vivo-Modell liegen die Ruhespiegel von Progesteron bei etwa 5 ng/ml, und dies kann auf einen Spiegel von 25 – 40 ng/ml nach PMSG induziert werden. Eine subkutane Injektion von Flt1(1-3)-Fc (A40) oder Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) bei 25 mg/kg oder 5 mg/kg 1 Stunde nach PMSG-Injektion führt zu einer vollständigen Inhibition der Progesteron-Induktion am Tag 4. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 42A – 42B gezeigt.
Beispiel 33: Pharmakokinetische Analyse von Flt1(1-3)-Fc (A40) und pegyliertem Flt1(1-3)-Fc
Flt1(1-3)-Fc wurde entweder mit 10-kD-PEG oder 20-kD-PEG PEGyliert und in Balb/c-Mäusen hinsichtlich seines pharmakokinetischen Profils getestet. Beide PE-Gylierten Formen von Flt1(1-3)-Fc besitzen festgestelltermaßen viel bessere PK-Profile als Flt1(1-3)-Fc (A40), wobei die T_max bei 24 Stunden für die PEGylierten Moleküle, im Gegensatz zu 6 Stunden für Flt1(1-3)-Fc (A40), auftritt.
Beispiel 34: VEGF165-ELISA zum Testen der Affinität von modifizierten Flt1-Rezeptor-Varianten
10 pM VEGF165 wurden über Nacht bei Raumtemperatur mit modifizierten Flt1-Rezeptorvarianten im Bereich von 160 pM bis 0,1 pM inkubiert. Die in diesem Experiment verwendeten, modifizierten Flt1-Rezeptorvarianten waren Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40), transient exprimiertes Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), transient exprimiertes Flt1D2VEFGFR3D3-FcΔC1(a), Flt1-(1-3_NAS)-Fc, Flt1(1-3_R->C)-Fc und Tie2-Fc. Flt1(1-3_NAS)-Fc ist eine modifizierte Version von Flt1(1-3)-Fc, in welcher die hochbasische Aminosäuresequenz KNKRASVRRR durch NASVNGSR ersetzt ist, was zur Einbindung von zwei neuen Glycosylierungsstellen und einer Nettoreduktion von fünf positiven Ladungen führt, beides in der Absicht, die ungünstigen Effekte dieser Sequenz auf die PK zu verringern. Flt1(1-3_R->C)-Fc ist eine Modifikation, bei welcher ein einzelner Arginin(R)-Rest innerhalb der gleichen basischen Aminosäuresequenz zu einem Cystein (C) geändert wird (KNKRASVRRR ->KNKCASVRRR), um die Pegylierung an diesem Rest zu gestatten, welche dann die basische Region von der Ausübung ihrer ungünstigen Auswirkungen auf die PK abschirmen könnte. Nach Inkubation wurde die Lösung auf eine Platte überführt, welche einen Einfang-Antikörper für VEGF165 (R & D) enthielt. Die Menge an freiem VEGF165 wurde dann unter Verwendung eines Antikörpers zum Berichten des freien VEGF165 bestimmt. Dies zeigte, dass die modifizierte Flt1-Rezeptorvariante mit der höchsten Affinität für VEGF165 (bestimmt als die geringste Menge an freiem VEGF165) Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) war, gefolgt von Flt1(1-3)-Fc und Flt1(1-3)-Fc (A40) und dann von Flt1(1-3_R->C)-Fc, Flt1(1-3_NAS)-Fc und Flt1D2VEFGFR3D3-FcΔC1(a). Tie2Fc besitzt keine Affinität für VEGF165.

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend (a) eine Nukleotidsequenz, die eine Rezeptorkomponente für den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF), bestehend im wesentlichen aus einer Immunoglobulin-artigen (Ig)-Domäne 2 eines ersten VEGF-Rezeptors und einer Ig-Domäne 3 eines zweiten VEGF-Rezeptors, codiert; und (b) eine Nukleotidsequenz, die eine multimerisierende Komponente codiert, worin der erste VEGF-Rezeptor Flt1 ist und der zweite VEGF-Rezeptor Flk1 oder Flt4 ist und die VEGF-Rezeptorkomponente die einzige VEGF-Rezeptorkomponente des Fusionspolypeptids ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz, welche die Ig-Domäne 2 der extrazellulären Domäne des ersten VEGF-Rezeptors codiert, stromaufwärts der Nukleotidsequenz, welche die Ig-Domäne 3 der extrazellulären Domäne des zweiten VEGF-Rezeptors codiert, liegt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, worin die Nukleotidsequenz, welche die Ig-Domäne 2 der extrazellulären Domäne des ersten VEGF-Rezeptors codiert, stromabwärts der Nukleotidsequenz, welche die Ig-Domäne 3 der extrazellulären Domäne des zweiten VEGF-Rezeptors codiert, liegt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die multimerisierende Komponente eine Immunoglobulin-Domäne umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 4, worin die Immunoglobulin-Domäne aus der Gruppe gewählt wird, die aus der Fc-Domäne von IgG und der schweren Kette von IgG besteht.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, umfassend eine Nukleotidsequenz, gewählt aus der Gruppe bestehend aus: (a) der in der 21 – 21C dargestellten Nukleotidsequenz; (b) der in der 22A – 22C dargestellten Nukleotidsequenz; (c) der in der 24A – 24C dargestellten Nukleotidsequenz; und (d) einer Nukleotidsequenz, welche sich als Ergebnis der Degeneriertheit des genetischen Codes von der Nukleotidsequenz (a), (b) oder (c) unterscheidet.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 1, worin die Komponenten des Fusionspolypeptids als 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; oder 3,2,1 angeordnet sind, wobei 1 die erste VEGF-Rezeptorkomponente ist, 2 die zweite VEGF-Rezeptorkomponente ist und 3 die multimerisierende Komponente ist.
Fusions-Polypeptid, codiert durch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül gemäß mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche.
Vektor, welcher ein Nukleinsäuremolekül gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7 umfasst.
Expressionsvektor, umfassend ein Nukleinsäuremolekül gemäß mindestens einem der Ansprüche 1 bis 7, worin das Nukleinsäuremolekül operativ an eine Expressions-Kontrollsequenz gebunden ist.
Wirts-Vektorsystem zur Herstellung eines Fusionspolypeptids, welches den Expressionsvektor von Anspruch 10 umfasst, in einer geeigneten Wirtszelle.
Wirts-Vektorsystem gemäß Anspruch 11, worin die geeignete Wirtszelle eine Bakterienzelle, eine Hefezelle, eine Insektenzelle oder eine Säugerzelle ist.
Wirts-Vektorsystem gemäß Anspruch 12, wobei die geeignete Wirtszelle eine E. coli- oder CHO-Zelle ist.
Verfahren der Herstellung eines Fusionspolypeptids, welches das Wachsen lassen von Zellen des Wirts-Vektorsystems gemäß mindestens einem der Ansprüche 11 bis 13 umfasst, und zwar unter Bedingungen, die die Herstellung des Fusionspolypeptids und das Gewinnen des so hergestellten Fusionspolypeptids ermöglichen.
Dimerer Antagonist des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF), umfassend zwei Fusionspolypeptide, wobei jedes Fusionspolypeptid folgendes umfasst: (a) eine VEGF-Rezeptorkomponente, bestehend im Wesentlichen aus einer Immunoglobulin-artigen (Ig)-Domäne 2 von einem Flt-1-VEGF-Rezeptor und einer Ig-Domäne 3 von einem Flk-1- oder Flk-4-VEGF-Rezeptor; und (b) eine multimerisierende Komponente, worin die VEGF-Rezeptorkomponente die einzige VEGF-Rezeptorkomponente jedes Fusionsproteins ist.
Dimerer Antagonist gemäß Anspruch 15, welcher durch Acetylierung oder Pegylierung modifiziert ist.
Fusionspolypeptid, umfassend: (a) eine VEGF-Rezeptorkomponente, bestehend im Wesentlichen aus einer Immunoglobulin-artigen (Ig)-Domäne 2 von einem Flt-1-VEGF-Rezeptor und einer Ig-Domäne 3 von einem Flk-1- oder Flk-4-VEGF-Rezeptor; und (b) eine multimerisierende Komponente, worin die VEGF-Rezeptorkomponente die einzige VEGF-Rezeptorkomponente des Fusionspolypeptids ist.
Fusionspolypeptid gemäß Anspruch 17, worin die multimerisierende Komponente eine Immunoglobulin-Domäne umfasst.
Fusionspolypeptid gemäß Anspruch 18, worin die Immunoglobulin-Domäne aus der Gruppe gewählt wird, die aus der Fc-Domäne von IgG und der schweren Kette von IgG besteht.
Fusionspolypeptid gemäß Anspruch 19, worin die Aminosäuresequenz in den 21A – 21C, der 22A – 22C oder der 24A – 24C dargestellt ist.
Verwendung eines Fusionspolypeptids gemäß mindestens einem der Ansprüche 17 bis 20 oder eines dimeren Antagonisten gemäß mindestens einem der Ansprüche 15 oder 16 bei der Herstellung eines Medikaments zur Verwendung zur Abschwächung oder Verhinderung des Tumorwachstums, zur Abschwächung oder Verhinderung von Ödeme, zur Abschwächung oder Verhinderung von Aszites-Bildung, zur Verringerung oder Inhibierung von Plasma-Ausströmung oder zur Hemmung des Blutgefäßwachstums beim Menschen.