CN103349781B - 具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽 - Google Patents
具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103349781B CN103349781B CN201310118971.1A CN201310118971A CN103349781B CN 103349781 B CN103349781 B CN 103349781B CN 201310118971 A CN201310118971 A CN 201310118971A CN 103349781 B CN103349781 B CN 103349781B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- flt1
- flt1d2
- vegf
- receptor
- flk1d3
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Abstract
本发明涉及具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽。具体地讲,本发明披露了为了改善其药物动力学特征而作过修饰的嵌合Flt1受体多肽。还披露了制备和使用所述修饰过的多肽的方法,包括,但不限于使用修饰过的多肽降低或抑制哺乳动物的血浆渗漏和/或血管通透性。
Description
本申请是申请日为2000年5月23日,申请号为200810109355.9,发明名称为“具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽”的发明专利申请的分案申请。
本申请要求申请日为1999年6月8日的美国临时申请号60/138133的优先权。在本申请中引用了各种文献。这些文献所披露的内容以其全文形式收作本申请的参考。
简介
本发明的领域是具有改善了的药物动力学的修饰过的多肽。具体地讲,本发明的领域涉及为了改善其药物动力学特征而作过修饰的Flt1受体多肽。本发明的领域还涉及制备和使用所述修饰过的多肽的方法,包括,但不限于用这种修饰过的多肽减弱或抑制哺乳动物的血浆渗漏和/或血管通透性。
背景
多肽配体结合细胞的能力,以及由此引起诸如细胞生长、存活、细胞产物分泌或分化的表型反应通常是通过细胞上的跨膜受体介导的。所述受体的胞外结构域(即展现在细胞表面上的受体部分)通常是该分子的最独特的部分,因为它能提供具有配体结合特征的蛋白。配体和胞外结构域的结合,通常会导致信号传导,由此将一种生物学信号传递到胞内目标。通常,这种信号传导是通过催化性的胞内结构域起作用。这种催化性胞内结构域的序列基序的特殊排列决定了它接触潜在的激酶底物的能力(Mohammadi等,1990,分子细胞生物学11:5068-5078;Fantl等,1992,细胞69:413-413)。通过催化性胞内结构域传导信号的受体的例子包括受体酪氨酸激酶(RTKs),如受体的Trk家族,它通常局限于神经系统细胞,受体的细胞因子家族,包括三联CNTF受体复合体(Stahl&Yancopoulos,1994,神经生物学杂志25:1454-1466),它一般也局限于神经系统的细胞,G-蛋白偶联受体,如存在于心肌细胞上的β2-肾上腺素能受体,以及位于肥大细胞和嗜碱性粒细胞的大部分上的多聚IgE高亲和力受体FcεRI(Sutton&Gould,1993,自然366:421-428)。
到目前为止所鉴定的所有受体在配体结合之后似乎都要发生二聚化、多聚化、或某些相关的构象变化(Schlessinger,J.,1988,TrendBiochem.Sci.13:443-447;Ullrich&Schlessinger1990,细胞61:203-212;Schlessinger&Ullrich,1992,Neuron9:383-391),并且发生在二聚化分子内结合域之间的分子间的相互作用会导致催化功能的激活。在某些场合下,如血小板衍生的生长因子(PDGF),所述配体是与两种受体分子结合的二聚体(Hart等,1988,科学240:1529-1531;Heldin,1989,生物学化学杂志264:8905-8912),而,举例来说,对于表皮生长因子(EGF)来说,所述配体是单聚体(Weber等,1984,生物学化学杂志259:14631-14636)。对于FcεRI受体来说,结合于FcεRI上的配体IgE以单聚体形式存在,并且只有在抗原结合于IgE/FcεRI复合体上之后并与相邻的IgE分子交联之后才被激活(Sutton&Gould,1993,自然366:421-428)。
通常,一种特定受体在高等生物体内的组织分布提供了该受体的生物学功能的线索。诸如成纤维细胞生长因子(FGF)的某些生长和分化因子的RTKs是广泛表达的,因此在组织生长和维持中似乎起着某种一般作用。更常见的是,受体的Trk RTK家族的成员(Glass&Yancopoulos,1993,细胞生物学趋势,3:262-268)局限于神经系统细胞,而神经生长因子家族包括神经生长因子(NGF)、脑衍生的神经营养因子(BDNF)、神经营养蛋白-3(NT-3)和神经营养蛋白-4/5(NT-4/5),它能结合Trk RTK家族受体,促进大脑中和外周的各种神经原的分化(Lindsay,R.M,1993,参见神经营养因子,S.E.Loughlin&J.H.Fallon著,257-284页,SanDiego,CA,学术出版社)。FcεRI局限于数量非常有限的类型的细胞,如肥大细胞和嗜碱性粒细胞。肥大细胞源于骨髓多能造血干细胞系,但是在离开血液之后在组织中完成其成熟(参见Janeway&Travers,1996,免疫生物学,第2版,M.Robertson&E.Lawrence著,1:3-1:4页,当代生物学有限公司,伦敦,英国,出版人),并且与过敏反应有关。
很多研究已经证实,受体的胞外结合域提供了特殊的配体结合特性。另外,表达受体的细胞环境可能影响配体与受体结合时所表现出的生物学反应。例如,当表达Trk受体的神经原细胞接触神经营养蛋白时,该蛋白能结合所述受体,导致神经原的存活和分化。当成纤维细胞表达相同的受体时,接触神经营养蛋白会导致成纤维细胞的增殖(Glass等,1991,细胞66:405-413)。
业已鉴定了一种由细胞衍生的对血管内皮细胞具有选择性的二聚体促细胞分裂剂,并被命名为血管内皮细胞生长因子(VEGF)。业已从以下条件生长培养基中纯化了VEGF:大鼠神经胶质瘤细胞的条件生长培养基[Conn等,1990,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,87:2628-2632页],和牛垂体滤泡心形细胞的条件生长培养基[Ferrara和Henzel,1989,生物化学生物物理学研究通讯161:851-858页;Gozpadorowicz等,1989,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,86:7311-7315页]和来自人U937细胞的条件生长培养基[Connolly,D.T.等,1989,科学,246,1309-1312页]。VEGF是表观分子量为大约46kDa的二聚体,每一个亚基的表观分子量大约23kDa。VEGF与血小板衍生的生长因子(PDGF)具有某些结构相似性,后者是结缔组织细胞的促细胞分裂剂,但不能促进来自大的血管的血管内皮细胞的分裂。
被称为Flt的膜结合酪氨酸激酶受体被证实为VEGF受体(DeVries,C.等,1992,科学,255,989-991页)。能特异性结合VEGF的Flt受体能诱导细胞分裂。被称为KDR的另一种形式的VEGF受体也能结合VEGF并诱导细胞分裂。KDR的部分cDNA序列以及几乎完整的蛋白序列是众所周知的[Terman,B.I.等,1991,Oncogene6,1677-1683页;Terman,B.I.等,1992生物化学生物物理学研究通讯187,1579-1586页]。
持续的血管形成可以导致或加重某些疾病,如牛皮癣、类风湿性关节炎,血管瘤、血管纤维瘤、糖尿病性视网膜病和新生血管青光眼。VEGF活性抑制剂可以用作所述疾病和其他VEGF诱导的病理性血管形成和血管通透性症状的治疗剂,如肿瘤血管化。本发明涉及一种基于VEGF受体Flt1的抑制剂。
血浆渗出是发炎的一个关键因素,它发生在一种特殊类型的微细血管中。具体地讲,在大多数器官中,血浆渗出特别发生在小静脉中。与动脉血管和毛细血管不同,小静脉会因为各种炎性介体的出现而发生渗漏,所述介体包括组胺、缓激肽和血清紧张素。发炎的一个特征是血浆渗漏,它是由于在小静脉的内皮细胞中所形成的细胞间隙所导致的。大多数发炎实验模型证实,所述细胞间隙出现在后毛细血管和集中小静脉的内皮细胞之间(Baluk,P.,等,美国病理学杂志1998,152:1463-76)。业已证实,某些凝集素可用于揭示发炎的小静脉中内皮细胞边界上的血浆渗漏、内皮细胞间隙和指状过程的集中部位(Thurston,G.等,美国生理学杂志,1996,271:H2547-62)。具体地讲,业已将植物凝集素用于观察诸如大鼠气管的炎性小静脉中的内皮细胞边界处的形态学改变。诸如conconavalinA和蓖麻毒蛋白的凝集素能局部结合发炎的小静脉,发现了由间隙所暴露的亚内皮细胞血管壁的部位,它相当于血浆渗漏部位(Thurston,G.等,美国生理学杂志,1996,271:H2547-62)。
微细血管的特征是动态的。例如,慢性炎性疾病与包括血管形成和微细血管变大在内的微细血管再造相关。微细血管还可以通过获得异常表型特征而再造。在慢性呼吸道炎症的鼠类模型上,呼吸道毛细血管获得了小静脉的特征,包括变宽了的血管直径,增强了的对von Willebrand因子的免疫反应性,以及增强了的对P-选择蛋白的免疫反应性。另外,所述再造的血管在炎性介体的作用下会渗漏,而位于正常小鼠的呼吸道中的同一部位的血管不会发生渗漏。
业已证实某些物质能够减弱或抑制血管通透性和/或血管渗漏。例如,mystixins是合成的多肽,业已报导它能抑制血浆渗漏而不会阻止内皮间隙的形成(Baluk,P.等,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1998,284:693-9)。另外,β2-肾上腺素能受体拮抗剂福莫特罗能通过抑制内皮细胞的间隙形成减轻微细血管渗漏(Baluk,P.和McDonald,D.M.,美国生理学杂志1994,266:L461-8)。
血管形成蛋白和血管内皮细胞生长因子(VEGF)家族的成员被认为是对血管内皮细胞具有很高专一性的仅有的生长因子。在小鼠上进行的定向基因失活研究业已证实,VEGF是血管发育早期所必需的,Ang-1是血管再造后期所需要的。
于2000年1月4日授予Metris治疗剂有限公司的US6011003披露了一种改变过的可溶形式的Flt多肽,这种多肽能够与VEGF结合,并因此产生对它的抑制作用,这种多肽包括5个或更少的完整的免疫球蛋白结合域。于1998年1月27日授权并转让给Merck&Co.的US5712380披露了血管内皮细胞生长因子(VEGF)抑制剂,该抑制剂是天然存在的或者通过重组方法工程改造成可溶形式,有或者没有VEGF受体的C-末端跨膜区。
同样转让给Merck&Co.的还有1998年4月2日公开的PCT公开号WO98/13071,该申请披露了抑制原发性肿瘤生长和转移的基因治疗方法,该方法是通过基因转移转入编码能结合VEGF的可溶性受体蛋白的核苷酸序列而实现的。
于1997年11月27日公开的以Genentech公司的名义申请的PCT公开号WO97/44453披露了新型嵌合VEGF受体蛋白,该蛋白包括源于血管内皮生长因子(VEGF)受体Flt1和KDR的氨基酸序列,包括人KDR受体FLK1的鼠类同源物,其中,所述嵌合VEGF受体蛋白结合于VEGF上,并拮抗内皮细胞增殖及其血管形成活性。
于1997年4月17日公开的以Toa Gosei有限公司的名义申请的PCT公开号WO97/13787披露了一种可用于治疗与诸如固体肿瘤的新生血管化相伴的疾病的低分子量VEGF抑制剂。一种含有VEGF受体Flt的胞外区的第一个免疫球蛋白样结构域和第二个免疫球蛋白样结构域但不含有它的第六个免疫球蛋白样结构域和第七个免疫球蛋白样结构域的多肽表现出VEGF抑制活性。
Sharifi,J.等(1998,The Quarterly Jour.of Nucl.Med.42:242-249)披露说由于单克隆抗体(Mabs)是碱性的带正电荷的蛋白,而哺乳动物细胞是带负电荷的,这两者之间的静电相互作用能产生较高水平的背景结合,导致低的肿瘤与正常器官的比例。为了克服这一影响,研究人员试图通过使用各种方法改善Mab清除率,如次级试剂和对Mab本身进行化学和电荷修饰。
Jensen-Pippo等(1996,药物学研究13:102-107)披露了一种治疗蛋白-重组人粒细胞集落刺激因子(PEG-G-CSF)的聚乙二醇化,能导致在通过十二指肠途径服用时能导致体内生物活性的稳定性和保留时间的增加。Tsutsumi等(1997,Thromb Haemost.77:168-73)披露了一些实验,其中,聚乙二醇修饰过的白介素-6(MPEG-IL-6)的体内血小板生成活性(其中,IL-6的14个赖氨酸氨基中的54%与PEG偶联)与天然IL-6相当。
Yang等(1995,Cancer76:687-94)披露了聚乙二醇与重组人白介素-2(IL-2)缀合能产生一种化合物-聚乙二醇修饰过的IL-2(PEG-IL-2),它保留了IL-2的体外和体外活性,但具有明显延长了的循环半衰期。
R.Duncan和F.Spreafico(临床药物动力学27:290-306,296,1994)对为了通过缀合聚乙二醇改善天冬酰胺酶的血浆半衰期所作的尝试作了综述。
与1999年1月28日公开的以Regeneron制药公司和加利弗尼亚大学的董事会的名义申请的PCT国际公开号WO99/03996披露了修饰过的人头蛋白多肽,它具有碱性氨基酸区的缺失。所披露的这种修饰过的人头蛋白多肽与未修饰过的人头蛋白相比保留了生物学活性,同时具有对肝素的降低了的亲和力,以及在动物血清中出色的药物动力学。
发明概述
本发明涉及具有改善了的药物动力学特性的VEGF拮抗剂。一种优选的实施方案是编码能够结合一种VEGF多肽的融合多肽的分离的核酸分子,它包括(a)编码VEGF受体成分的核苷酸序列,该序列可操作地连接于(b)编码一种多聚成分的核苷酸序列上,其中,所述VEGF受体成分是这种融合多肽的唯一的VEGF受体成分,并且,其中,(a)的核苷酸序列主要包括编码第一种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域2的氨基酸序列的核苷酸序列和编码第二种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域3的氨基酸序列的核苷酸序列。
在另一种实施方案中,所述第一种VEGF受体的分离的核酸是Flt1。
在另一种实施方案中,所述第二种VEGF受体的分离的核酸是Flk1。
在另一种实施方案中,所述第二种VEGF受体的分离的核酸是Flt4。
在另一种优选实施方案中,编码所述第一种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域2的核苷酸序列是编码第二种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域3的核苷酸序列的上游。
在另一种优选实施方案中,编码第一种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域2的核苷酸序列是编码第二种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域3的核苷酸序列的下游。
在本发明的一种优选实施方案中,所述多聚化成分包括一个免疫球蛋白结构域。
在另一种实施方案中,所述免疫球蛋白结构域选自下列一组:IgG的Fc结构域、IgG的重链和IgG的轻链。
优选的实施方案包括一种分离的核酸分子,它包括编码一种修饰过的Flt1受体融合多肽的核苷酸序列,其中,所述核酸分子的编码区包括选自下列一组的核苷酸序列
(a)图13A-13D所示的核苷酸序列;
(b)图14A-14c所示的核苷酸序列;
(c)图15A-15c所示的核苷酸序列;
(d)图16A-16D所示的核苷酸序列;
(e)图21A-21c所示的核苷酸序列;
(f)图22A-22c所示的核苷酸序列;
(g)图24A-24c所示的核苷酸序列;和
(h)由于遗传密码的简并性而不同于(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)的核苷酸序列的核苷酸序列,并且它能编码具有修饰过的Flt1受体融合多肽的生物学活性的融合多肽分子。
在本发明的另一种实施方案中,一种融合多肽是由上述分离的核酸分子编码的。
一种优选的实施方案是一种能够结合VEGF分子形成无功能的复合体的组合物,该组合物含有所述融合多肽的多聚体。
同样优选的是这样一种组合物,其中的多聚体是二聚体。
在另一种实施方案中,所述组合物存在于一种载体中。
另一种实施方案是含有上述核酸分子的载体,包括含有上述核酸分子的表达载体,其中,所述核酸分子可操作地连接于一种表达控制序列上。
所包括的其他实施方案是用于生产一种融合多肽的宿主-载体系统,它包括存在于一种合适宿主细胞中的表达载体;所述宿主-载体系统中的合适的宿主细胞是细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。所述宿主-载体系统中的合适的宿主细胞是大肠杆菌;所述宿主-载体系统中的合适的宿主细胞是COS细胞;所述宿主-载体系统中的合适的宿主细胞是CHO细胞。
本发明的另一种实施方案是一种生产融合多肽的方法,该方法包括在能够产生所述融合多肽的条件下生长所述宿主-载体系统的细胞,和回收所产生的融合多肽。
另一种实施方案包括一种由图10A-10D或图24A-24C所示核酸序列所编码的融合多肽,所述多肽通过酰化或聚乙二醇化修饰过,其中,酰化是以超出至少大约100倍摩尔的酰化试剂完成的,或者其中,酰化是以超出至少大约10倍摩尔-至少大约100倍摩尔的酰化试剂完成的,或者其中的聚乙二醇化是10K或20K PEG。
一种优选实施方案包括一种减弱或抑制哺乳动物血浆渗漏的方法,该方法包括给所述哺乳动物服用上述融合多肽,包括以下实施方案:其中的哺乳动物是人,融合多肽是酰化的或融合多肽是聚乙二醇化的。
另一种实施方案是一种融合多肽,它能专一性地结合VEG受体配体VEGF。
本发明的一种优选实施方案是抑制人类血管生长的方法,包括服用有效量的上述融合多肽。
另外,还优选一种抑制哺乳动物体内VEGF受体配体活性的方法,包括给所述哺乳动物服用有效量的上述融合多肽。
上述方法的优选实施方案是,其中的哺乳动物是人类。
本发明方法的另一种实施方案包括在人体内减缓或预防肿瘤生长;减缓或预防人体水肿,特别是其中的水肿是大脑水肿;减缓或预防人体腹水形成,特别是其中的腹水是与卵巢癌相关的腹水。
本发明的优选实施方案包括能够结合VEGF多肽的融合多肽,它包括(a)VEGF受体成分,可操作地连接于(b)一种多聚化成分上,其中,所述VEGF受体成分是所述融合多肽上唯一的VEGF受体成分,并且主要包括第一种VEGF受体的胞外结构域Ig结构域2的氨基酸序列和第二种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域3的氨基酸序列。
在所述融合多肽的另一种实施方案中,所述第一种VEGF受体是Flt1。
在所述融合多肽的另一种实施方案中,所述第二种VEGF受体是Flk1。
所述融合多肽的另一种实施方案是这样的,其中,所述第二种VEGF受体是Flt4。
优选的实施方案包括一种融合多肽,其中,第一种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域2的氨基酸序列是第二种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域3的氨基酸序列的上游,还包括一种融合多肽,其中,第一种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域2的氨基酸序列是第二种VEGF受体的胞外结构域的Ig结构域3的氨基酸序列的下游。
在另一种实施方案中,所述融合多肽的多聚化成分包括一个免疫球蛋白结构域,包括这样一种实施方案,其中,所述免疫球蛋白结构域选自下列一组:IgG的Fc结构域、IgG的重链和IgG的轻链。
优选的实施方案包括一种融合多肽,该多肽包括修饰过的Flt1受体的氨基酸序列,其中,该氨基酸序列选自下列一组:(a)图13A-13D所示氨基酸序列;(b)图14A-14c所示的氨基酸序列;(c)图15A-15c所示的氨基酸序列;(d)图16A-16D所示的氨基酸序列;(e)图21A-21c所示的氨基酸序列;(f)图22A-22c所示的氨基酸序列;和(g)图24A-24c所示的氨基酸序列。
另一种优选实施方案是一种减轻或防止哺乳动物血浆渗漏的方法,包括给所述哺乳动物服用上述融合多肽。
另一种优选实施方案是一种抑制哺乳动物体内VEGF受体配体活性的方法,包括给所述哺乳动物服用有效量的上述融合多肽。
附图简述
图1.未修饰过的和酰化的Flt1(1-3)-Fc蛋白的IEF凝胶分析。
未修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白不能够进入凝胶,因为它的pI大于9.3,而酰化的Flt1(1-3)-Fc能够进入凝胶并在pI5.2处平衡。
图2.将未修饰过Flt1(1-3)-Fc的和酰化的Flt1(1-3)-Fc蛋白结合在包被的平板上,未修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白能与中的胞外基质成分充分结合,而酰化的Flt1(1-3)-Fc不能结合。
图3.未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、酰化的Flt1(1-3)-Fc、和聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc在BIAcore-基测定中的结合。与对照(柱1-4)和不相关的蛋白(柱5-8)相比,酰化的(柱13-16)、聚乙二醇化的(柱17-20)、和肝素处理过的Flt1(1-3)-Fc(柱21-24)都能完全与Biacor芯片结合的Flt1(1-3)-Fc竞争结合VEGF。未修饰过的Flt1(1-3)-Fc(柱5-6)似乎只能部分与Biacor芯片结合的Flt1(1-3)-Fc竞争结合VEGF。用0.5M氯化钠(柱7-8)洗涤结合的样品会得到类似于Flt1(1-3)-Fc的修饰形式的结合特征,这表明所述未修饰过的蛋白对所述芯片具有非专一性结合,这种结合可以通过盐洗涤消除。
图4.在基于ELISA测定中未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、酰化的Flt1(1-3)-Fc、和聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc在ELISA-基测定中的结合。聚乙二醇化的和酰化Flt1(1-3)-Fc蛋白能够结合VEGF,其亲和力接近未修饰过的Flt1(1-3)-Fc。
图5.未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、酰化的Flt1(1-3)-Fc、和聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc的药物动力学曲线。用4毫克/千克未修饰过的酰化或聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc皮下注射Balb/c小鼠(23-28克)。在注射蛋白1、2、4、6、24小时、2天和3天之后,从小鼠尾部放血,并在为了检测Flt1(1-3)-Fc蛋白而设计的标准的基于ELISA测定中测定血清。所有Flt1(1-3)-Fc蛋白的Tmax都出现在6小时和24小时的时间点之间。不同蛋白的Cmax如下:未修饰过的:0.06-0.15微克/毫升;酰化的:1.5-4.0微克/毫升和聚乙二醇化的:大约5微克/毫升。
图6A-6B.未修饰过的和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc蛋白的IEF凝胶分析。未修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白不能进入凝胶,因为其pI大于9.3,而大多数逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc样品(超出30-100倍的样品)能够转移到凝胶中,并根据酰化的程度在4.55-8.43pI范围内平衡。
图7.将未修饰过Flt1(1-3)-Fc的和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc蛋白结合在包被的平板上,与不相关的对照蛋白rTie2-Fc相比,逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc(超出20-30倍的样品)没有表现出对包被的平板的任何结合,而非酰化Flt1(1-3)-Fc蛋白表现出明显结合。超出10倍的样品表现出减弱了的结合,但酰化的程度不足于完全抑制与胞外基质成分的结合。
图8.未修饰过的Flt1(1-3)-Fc和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc在BIAcore-基测定中的结合。在亚化学计量比例下(0.5微克/毫升的未修饰过的Flt1(1-3)-Fc和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc与0.2微克/毫升VEGF),在溶液中没有足够的Flt1(1-3)-Fc(未修饰过的或逐步酰化的)完全结合VEGF。在接近1:1的化学计量比例的1.0微克/毫升的浓度下,未修饰过的和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc能更好地竞争结合VEGF,但是仍然没有足够的Flt1(1-3)-Fc蛋白(未修饰过的或逐步酰化的)来完全饱和现有的VEGF。不过,在高于1:1的化学计量比例若干倍的5.0微克/毫升的浓度下,Flt1(1-3)-Fc和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc蛋白能够饱和VEGF,而与酰化的的程度无关。
图9.未修饰过的Flt1(1-3)-Fc和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc的药物动力学曲线。用4毫克/千克未修饰过或超出10、20、40、60和100倍的逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc皮下注射Balb/c小鼠(23-28克)(3只小鼠注射未修饰过的超出10、20和40倍的样品,2只小鼠注射超出60和100倍的样品)。在注射1、2、4、6、24小时,2天和3天之后,从小鼠尾部放血。在为了检测Flt1(1-3)-Fc蛋白而设计的基于ELISA测定中测定血清。所测定的所有Flt1(1-3)-Fc蛋白的Tmax都出现在6小时的时间点上,而Cmax如下:未修饰过的Flt1(1-3)-Fc:0.06微克/毫升;超出10倍的样品:-0.7微克/毫升,超出20倍的样品-2微克/毫升,超出40倍的样品-4微克/毫升,超出60倍的样品-2微克/毫升,超出100倍的样品-1微克/毫升。
图10A-10D.Flt1(1-3)-Fc的核酸和推测的氨基酸序列。
图11.Flt1的结构示意图。
图12A和12B.Flt1的Ig结构域2和Ig结构域3的氨基酸序列的亲水性分析。
图13A-13D.Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc核酸和推测的氨基酸序列。
图14A-14C.Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc核酸和推测的氨基酸序列。
图15A-15C.Mut3:Flt1(2-3)-Fc核酸和推测的氨基酸序列。
图16A-16D.Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc核酸和推测的氨基酸序列。
图17.未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、碱性区域缺失突变型Flt1(1-3)-Fc和Flt(1-3R→N)突变型蛋白在基于BIAcore测定中的结合。在亚化学计量比例下(0.25微克/毫升未修饰过的、酰化的或遗传修饰过的Flt1(1-3)-Fc样品与01.微克/毫升VEGF),没有足够的Flt1(1-3)-Fc蛋白抑制VEGF固定在BIAcore芯片上的Flt1(1-3)-Fc结合。在0.5微克/毫升未修饰过的、酰化的或遗传学修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白的浓度下,其化学计量比例为大约1:1,抑制VEGF结合BIAcore芯片的能力增强。在1.0微克/毫升未修饰过的、酰化的或遗传学修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白的浓度下,其化学计量比例大约为10:1,Flt1(1-3)-Fc蛋白能够抑制VEGF与BIAcore芯片的结合,但它们的作用不相同。未修饰过的、酰化的和Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc在抑制VEGF结合的能力方面基本上相同,而Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc在抑制结合方面的效率略低。
图18.未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc、Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc和Flt1(2-3)突变蛋白与包被的平板的结合。未修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白能很好地结合这些孔,Mut3:Flt1(2-3)-Fc蛋白的结合稍差一些,Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc蛋白的结合更差一些,Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc蛋白表现出最佳的特征,它比任何其他突变蛋白的结合都弱。Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc糖基化突变蛋白在Matrigel测定中仅表现出微弱的优点。
图19.未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc、Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc和Flt1(2-3)突变蛋白在基于ELISA测定中的结合。在测定的浓度下,未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc、Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc和Flt1(2-3)突变蛋白与VEGF的结合相似。
图20.未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc、Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc和Flt1(2-3)突变蛋白的药物动力学特征。这些试剂的Cmax如下:未修饰过的Flt1(1-3)-Fc-0.15微克/毫升;超出40倍摩尔的酰化Flt1(1-3)-Fc-1.5微克/毫升;和Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc-0.7微克/毫升。
图21A-21C.被称为Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的修饰过的Flt1受体的核苷酸和推测的氨基酸序列。
图22A-22C.被称为Flt1D2.VEGFR3D.FcΔC1(a)的修饰过的Flt1受体的核苷酸和推测的氨基酸序列。
图23.胞外基质(ECM)测定。该测定的结果表明,与Flt1(1-3)-Fc蛋白相比,Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR3D.FcΔC1(a)蛋白对ECM的粘性明显较低。
图24A-24C.被称为VEGFR1R2-FcΔC1(a)的修饰过的Flt1受体的核苷酸和推测的氨基酸序列。
图25.磷酸化测定。在超出1.5摩尔的Flt1(1-3)-Fc、Flt1(1-3)-Fc(A40)或瞬时Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的条件下,与对照介质刺激相比,这三种修饰过的Flt1受体都能完全抑制受体刺激。相反,在这种超出的摩尔倍数下,与VEGF阳性对照刺激相比,瞬时Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)不表现出明显的抑制。从图25B中可以看到类似结果,其中,修饰过的Flt受体超过VEGF165配体3倍摩尔。在图25C中,其中的修饰过的Flt1受体超过VEGF165配体的摩尔数6倍,现在可以证实瞬时Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)能够部分抑制VEGF165诱导的细胞表面受体的刺激。
图26A-26B.磷酸化测定。通过Western印迹检测由VEGF165配体刺激的酪氨酸磷酸化VEGFR2(Flk1)发现,细胞表面受体不能被具有VEGF165的刺激样品磷酸化,该样品与超出1和2倍摩尔(图26A)和超出3和4倍摩尔(图26B)的瞬时Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)、稳定的Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)或瞬时VEGFR1R2-FcΔC1(a)一起预培养过。在所测试过的所有修饰过的Flt1受体浓度下,在预培养期间存在VEGF165配体的完全结合,与对照介质刺激相比,得到了不可检测的非结合VEGF165对细胞表面受体的刺激。
图27.MG/R2细胞增殖测定。将下列修饰过的Flt受体Flt1(1-3)-Fc、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)和一种被称为Tie2-Fc的作为负对照的不相关的受体从40nM滴定到20pM,并在37℃下在细胞上培养1小时。然后以1.56nM的浓度将存在于确定培养基中的人重组VEGF165添加到所有的孔中。负对照受体Tie2-Fc任何浓度都不能抑制VEGF165-诱导的细胞增殖,而Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)能抑制1.56nM的VEGF165,1/2最大剂量为0.8nM。Flt1(1-3)-Fc和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)在该测定中在抑制VEGF165方面效果较差,1/2最大剂量为大约2nM。VEGF165本身能产生1.2吸收单位的读数,而背景为0.38个吸收单位。
图28.结合剂量学的BIAcore分析。结合剂量学是作为结合的VEGF165与固定的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)的摩尔比计算的,使用相当于1ng/ml的1000RU的转换系数。结果证实每一个Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)分子具有一个VEGF165二聚体分子的结合计量学。
图29和图30.大小排阻层析计量学。将浓度为1nM的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)(估计比Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)/VEGF165相互作用的KD高1000倍)与各种浓度的VEGF165混合。在培养之后,测定溶液中游离Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的浓度。数据显示,将1nMVEGF165添加到Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)的溶液中能完全抑制Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)与VEGF165表面结合。这一结果表明了每一个Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)分子具有一个VEGF165分子的结合计量学。
图31.在自然条件下的大小排阻层析(SEC)。1号峰表示Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165复合体,而2号峰表示未结合的VEGF165。合并在1.1和1.2毫升之间洗脱的级份,并添加盐酸胍到4.5M的最终浓度,以便解离该复合体。
图32.在解离条件下的大小排阻层析(SEC)。为了分离受体-配体复合体的成分,并测定其摩尔比例,将50微升解离的复合体加样到用6摩尔盐酸胍平衡过的Superose12PC3.2/30中并洗脱。1号峰表示Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a),而2号峰表示VEGF165。
图33、图34和图35.具有联机光学散射的大小排阻层析(SEC)。用具有MiniDawn联机光学散射探测器(Wyatt Technology,SnataBarbara,California)和折射指数(RI)探测器(Shimadzu,Kyoto,日本)的大小排阻层析柱测定受体-配体复合体的分子量(MW)。如图33所示,洗脱曲线出现了两个峰。1号峰表示受体-配体复合体,而2号峰表示未结合的VEGF165。MW是根据LS和RI信号计算的。用相同方法测定受体-配体复合体的单一成分的MW。上述测定的结果如下:Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165复合体的MW在峰值位置上为157300(图33),VEGF165在峰值位置上的的分子量为44390(图34),而R1R2在峰值位置上的分子量为113300(图35)。
图36.肽作图和糖基化分析。通过肽作图方法测定Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)上面的二硫键结构和糖基化位点。在Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)上面总共有10个半胱氨酸;其中的6个属于Fc区。Cys27和Cys76通过二硫键结合。Cys121和Cys182通过二硫键结合。Fc区上的头两个半胱氨酸(Cys211和Cys214)与另一个Fc链上的相同位置上的两个相同的半胱氨酸形成分子间二硫链。不过,不能够确定二硫链是存在于相同的半胱氨酸(例如Cys211和Cys211)之间或存在于Cys211和Cys214之间。Cys216与Cys306通过二硫键连接。Cys352与Cys410通过二硫键连接。
在Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)有5个可能的N-连接的糖基化位点,并且发现它们以不同的程度糖基化。在Asn33、Asn193和Asn282上观察到了彻底的糖基化。在Asn65和Asn120上观察到了部分糖基化。糖基化位点通过在附图中加下划线突出。
图37.Flt1(1-3)-Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)的药物动力学。给Balb/C小鼠皮下注射4毫克/千克Flt1(1-3)-Fc(A40)、CHO瞬时表达的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)、CHO稳定表达的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)、和CHO瞬时表达的VEGFR1R2-FcΔC1(a)。在注射之后1、2、4、6、24小时,2天、3天和6天之后从小鼠尾部放血。在为了检测Flt1(1-3)-Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)而设计的ELISA中测定血清。Flt1(1-3)-Fc(A40)的Tmax出现在6小时,而瞬时和稳定Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的Tmax和瞬时VEGFR1R2-FcΔC1(a)出现在24小时。Flt1(1-3)-Fc(A40)的Cmax为8微克/毫升,瞬时Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)的Cmax为18微克/毫升,而稳定VEGFR1R2-FcΔC1(a)的Cmax为30微克/毫升。
图38.Flt1(1-3)-Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a)的药物动力学。给Balb/C小鼠皮下注射4毫克/千克Flt1(1-3)-Fc(A40)、CHO瞬时表达的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和CHO瞬时表达的Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a)。在注射之后1、2、5、6、7、8、12、15和20天之后从小鼠尾部放血。在为了检测Flt1(1-3)-Fc、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a)而设计的ELISA中测定血清。Flt1(1-3)-Fc(A40)在5天之后在血清中不再能检测到,而Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a)在15天或更长时间内可以检测到。
图39.Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)在体内抑制HT-1080纤维肌瘤肿瘤生长的能力。每隔1天或每周2次用25毫克/千克的HT-1080处理SCID小鼠能明显降低皮下HT-1080纤维肌瘤肿瘤的生长。
图40.Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)在体内抑制C6神经胶质瘤的能力。每隔1天或每周2次用剂量低至2.5毫克/千克的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)处理SCID的小鼠能明显减弱皮下C6神经胶质瘤的生长。
图41.VEGF诱导的子宫通透性过高。皮下注射PMSG(5IU)诱导青春期前的雌性大鼠排卵,导致在2天之后雌二醇发生波动,进而导致在子宫中诱导VEGF。这种诱导会导致子宫的通透性过高,并增加子宫的湿度。在注射PMSG1小时之后,皮下注射25毫克/千克的Flt1(1-3)-Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a)会导致对子宫湿重量增加50%的抑制作用。
图42A-42B.用孕酮作为输出评估黄体血管形成。皮下注射PMSG(5IU)诱导青春期前的雌性大鼠排卵,导致一种完全有功能的黄体,它含有血管的密集的网络,它能向血液中分泌孕酮,以便准备好子宫受孕。黄体中的血管形成诱导需要VEGF。孕酮的一般水平为5纳克/毫升,而在注射PMSG后可以诱导至25-40纳克/毫升。在注射PMSG1小时之后皮下注射25毫克/千克或5毫克/千克的Flt1(1-3)-Fc(A40)或Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)会导致在第4天孕酮诱导的完全抑制。
发明详述
本领域长期以来一直存在的问题是生产以VEGF拮抗剂为基础的受体,这种受体具有适于作为治疗候选拮抗剂的药物动力学特征。申请人在这里首次披露了一种能够拮抗VEGF活性的嵌合多肽分子,与其他已知的基于受体的VEGF拮抗剂相比,它具有改善了的药物动力学特征。因此,本文所披露的嵌合多肽分子首次提供了适用于治疗的合适分子,其中,VEGF的拮抗作用是一种理想的结果。
本发明提供了通过将Flt1受体的修饰过的胞外配体结合结构域和IgG的Fc区融合所形成的新型嵌合多肽分子。
胞外配体结合结构域被定义为受体的一部分,它在细胞膜中的天然构象中,是朝着细胞外定向的,其中,它可以接触它的同源配体。所述胞外配体结合结构域不包括与受体跨膜结构域相关的疏水性氨基酸或与受体胞内结构域相关的任何氨基酸。一般,一种受体的胞内或细胞质结构域通常由带正电荷的或极性氨基酸(即赖氨酸、精氨酸、组氨酸、谷氨酸、天冬氨酸)组成。前面的15-30个氨基酸主要是疏水性或非极性氨基酸(即亮氨酸、缬氨酸、异亮氨酸和苯丙氨酸)构成所述跨膜结构域。所述胞外结构域包括位于疏水性跨膜氨基酸片段前面的氨基酸。通常,所述跨膜结构域的两侧是带正电荷的或极性氨基酸,如赖氨酸或精氨酸。Von Heijone公开了被本领域技术人员经常引用的用于测定一种特定受体的氨基酸是属于胞外、跨膜或胞内结构域的详细规则(参见Von Heijone,1995,BioEssays17:25-30)。另外,互联网上的网站如http://ulrec3.unil.ch/software/TMPRED_form.html.能够向蛋白质化学家提供有关制备蛋白结构域的先决条件的信息。
本发明提供了构建编码嵌合多肽分子的核酸的方法,该核酸分子被插入一种载体上,该载体在导入合适的宿主细胞之后能够表达所述嵌合多肽分子。合适的宿主细胞包括,但不限于细菌细胞、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。本领域技术人员所公知的任何用于将DNA片段插入载体中的方法都可用于构建编码所述嵌合多肽分子的受转录/翻译控制信号控制的表达载体。所述方法可以包括体外重组DNA和合成技术和体内重组(遗传重组)(参见Sambrook等,分子克隆,实验室手册,冷泉港实验室;当代分子生物学方法,Ausubel等著,Greene出版协会,Wiley-Interscience,NY)。
编码所述嵌合多肽分子的核酸分子的表达可以受第二种核酸序列的调控,以便该嵌合多肽分子是在用所述重组DNA分子转化过的宿主中表达。例如,本文所披露的嵌合多肽的表达可以受本领域所公知的任一种启动子/增强子的控制。可用于嵌合多肽分子表达的启动子包括,但不限于Squinto等(1991,细胞65:1-20)所披露的长末端重复;SV40早期启动子片段(Bernoist和Chambon,1981,自然290:304-310),CMV启动子、M-MuLV5’末端重复、含有Rous肉瘤病毒的3’长末端重复的启动子(Yamamoto等,1980,细胞22:787-797)、疱疹胸苷激酶启动子(Wagner等,1981,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78:144-1445)、金属硫蛋白基因的调控序列(Brinster等,1982,自然296:39-42);原核表达载体,如β-内酰胺酶启动子(Villa-Kamaroff等,1978,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75:3727-3731),或tac启动子(DeBoer等,1983,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80:21-25,还可以参见发表在美国科技上的“源于重组细菌的有用蛋白”1980,242:74-94);源于酵母或其他真菌的启动子,如Gal4启动子、ADH启动子、PGK启动子、碱性磷酸酶启动子、和以下动物转录控制区,这些控制区具有组织专一性并且已经被用于转基因动物上:弹性蛋白酶I基因控制区,它是在胰腺泡细胞中起作用的(Swift等,1984,细胞38老:39-646;Ornitz等,1986,Cold SpringHarbor Symp.Quant.Biol.50:399-409;MacDonald,1987,Hepatology7:425-512);胰岛素基因控制区,它是在胰腺β细胞中起作用的(Hanahan,1985,自然315:115-122),免疫球蛋白基因控制区,它是在淋巴细胞中起作用的(Grosschedl等,1984,细胞38:647-658;Adames等,1985自然318:533-538;Alexander等,1987,分子细胞生物学7:1436-1444),小鼠乳腺肿瘤病毒控制区,它是在睾丸、胸腺、淋巴和肥大细胞中起作用的(Leder等,1986,细胞45:485-495),白蛋白基因控制区,它是在肝脏中起作用的(Binkert等,1987,基因和发育1:268-276),α胎蛋白基因控制区,它是肝脏中起作用的(Krumlauf等,1985,分子细胞生物学5:1639-1648;Hammer等,1987,科学235:53-58);α1-抗胰蛋白酶基因控制区,它是在肝脏中起作用的(Keley等,1987,基因和发育1:161-171),β-珠蛋白基因控制区,它是在骨髓细胞中起作用的(Mogram等,1985,自然315:338-340;Kollias等,1986,细胞46:89-94);髓鞘质碱性蛋白基因控制区,它是在大脑的少突胶质细胞中起作用的(Readhead等,1987,细胞48:703-712);肌球蛋白轻链-2基因控制区,它是在骨骼肌中起作用的(Shani,1985,自然314:283-286),和促性腺释放激素基因控制区,它是在下丘脑中起作用的(Mason等,1986,科学234:1372-1378)。
因此,根据本发明用含有本文所披露的编码嵌合多肽分子的核酸的能够在细菌或真菌宿主中复制的表达载体转染所述宿主,并因此控制所述核酸的表达,以便产生所述嵌合多肽分子,然后以生物学活性形式回收该多肽分子。在本文中,生物学活性形式包括能够与VEGF结合的形式。
含有本文所述嵌合核酸分子的表达载体可以通过三种一般方法鉴定:(a)DNA-DNA杂交,(b)“标记”基因功能的有和无,和(c)插入序列的表达。在第一种方法中,插入一种表达载体的外源基因的存在可以用含有与插入的嵌合多肽分子序列同源的序列的探针进行DNA-DNA杂交进行检测。在第二种方法中,可以根据由于在所述载体上插入外源基因所导致的某些“标记”基因功能(例如,腺苷激酶活性、对抗生素的抗性、转化表型、在杆状病毒中包含体的形成等)的有或无鉴定并选择重组载体/宿主系统。例如,如果所述嵌合多肽分子DNA序列被插入所述载体的标记基因序列之内,可以通过该标记基因功能的缺乏鉴定含有该插入片段的重组体。在第三种方法中,可以通过检测由重组体所表达的外源基因产物鉴定重组表达载体。例如,所述检测可以基于所述嵌合多肽分子的物理特性或功能特性。
本发明的细胞可以瞬时或优选组成型地并且永久地表达所述嵌合多肽分子。
所述嵌合多肽分子可以用任何方法纯化,以便能够随后制成稳定的、有生物学活性的嵌合多肽分子。例如,但并非是限定,所述因子可以可溶蛋白形式从细胞中回收,或者作为包含体形式回收,然后可以通过8M盐酸胍和透析从包含体中定量提取(例如,参见Builder等,US5663304)。为了进一步纯化所述因子,可以使用常规的离子交换层析、疏水性相互作用层析、反相层析或凝胶过滤。
在本发明的一种实施方案中,编码第一种成分的核苷酸序列是编码第二种成分的核苷酸序列的上游。在本发明的另一种实施方案中,编码第一种成分的核苷酸序列是编码第二种成分的核苷酸序列的下游。本发明的其他实施方案可以这样制备,其中,第一、第二和第三种融合多肽成分的顺序可以进行重组。例如,如果编码第一种成分的核苷酸序列被称为1,编码第二种成分的核苷酸序列被称为2、而编码第三种成分的核苷酸序列被称为3的话,本发明的分离的核酸上的这些成分顺序从5’到3’看可以是下列六种组合的任一种形式:1、2、3;1、3、2;2、1、3;2、3、1;3、1、2;或3、2、1。
本发明还具有诊断和治疗用途。在本发明的具体实施方案中,本文所披露的检测嵌合多肽分子的功能或表达异常的方法可用于疾病的诊断。在另一种实施方案中,对所述嵌合多肽分子或结合于该嵌合多肽分子上的拮抗剂或兴奋剂的操作可用于治疗疾病。在另一种实施方案中,所述嵌合多肽分子被用作抑制结合剂与其目标结合的制剂。
举例来说,但不是限定,本发明的方法可用于治疗以血管通透性、水肿或发炎为特征的临床疾病,如与外伤、中风或肿瘤相关的脑水肿;与诸如牛皮癣、关节炎,包括类风湿关节炎的炎性疾病相关的水肿;哮喘;与烧伤相关的常见水肿;与肿瘤、发炎或创伤相关的腹水和胸膜渗漏;慢性呼吸道发炎;毛细血管渗综合症;败血病;与蛋白渗漏增加相关的肾病;和眼病,如与年龄相关的斑状衰退和糖尿病性视网膜病。
对Flt1(1-3)-Fc所作的氨基酸序列分析发现了异常大数量(46)碱性氨基酸残基赖氨酸的存在。对Flt1(1-3)-Fc所作的IEF分析发现,该蛋白的pI大于9.3,证实了该蛋白是强碱性的预测。有人假设,Flt1(1-3)-Fc蛋白的碱性性质是它能够与胞外基质成分结合的原因,并且这种相互作用会导致在注射到小鼠体内后由Flt1(1-3)-Fc所表现出的极短时间的可检测的循环血清半衰期。为了验证这种假设,在赖氨酸残基上对Flt1(1-3)-Fc蛋白进行酰化,以便降低其碱性电荷。然后按上述检测方法检测酰化的Flt1(1-3)-Fc。
提供以下实施例是为了说明,而不是为了限定。
实施例
例1:Flt1(1-3)-Fc蛋白在CHO K1细胞中的表达
用标准分子生物学技术(例如,参见分子克隆,实验室手册,Sambrook等,冷泉港实验室;当代分子生物学方法,Ausubel等著,Greene出版协会,Wiley-Interscience,NY)将编码Flt1(1-3)-Fc的基因插入表达载体pEE14.1(Lonza Biologics,plc)上的CMV启动子下游的多克隆位点。通过脂转染胺试剂(Gaithersburg,MD)用pEE14.1/Flt1(1-3)-Fc DNA结构转染CHO K1细胞。在含有250微摩尔购自Sigma公司(St.Louis,MO)的甲硫氨酸sulfoximine(MSX)的不含谷氨酰胺的DMEM(JRH,Kansas市,MO)中生长转染过的CHO K1细胞,并通过能捕获并检测人Fc的标准免疫检测从超过100个手工挑选的菌落分离物中筛选CHO K1细胞上清液获得高重组蛋白表达体。在有100微摩尔MSX的条件下扩增所筛选的手工挑选的克隆,然后对所扩增的克隆进行第二轮筛选。最高产的克隆的重组Flt1(1-3)-Fc蛋白的比产率为55pg/细胞/天。
用上述细胞培养基在225平方厘米的T-烧瓶(Corning,Acton,MA)中扩增所选择的克隆,然后转移到8.5升滚瓶(Corning,Acton,MA)中。通过标准的胰蛋白酶化从滚瓶中除去细胞,并放入3.5升悬浮介质中。悬浮介质由不含谷氨酰胺的ISCHO培养基组成(IrvineScientific,Santa Ana,CA),它含有5%胎牛血清(购自Hyclone实验室,Logan,UT的FBS)、100微摩尔MSX和GS添加剂(JRHScientific,Kansas City,MO),该培养基装在5升Cellign生物反应器(New Bruswick Scientific,New Bruswick,NJ)中,密度为0.3×106细胞/毫升。在细胞达到3.6×106/毫升的密度并且适合悬浮之后,将其转移到装有20升含有5%胎牛血清的ISCHO培养基的60升的生物反应器(ABEC,Allentown,PA)中,其密度为0.5×106细胞/毫升。2天之后,将另外20升ISCHO+5%胎牛血清添加到该生物反应器中。让细胞再生长2天,达到3.×106细胞/毫升的最终密度,在收获时Flt1(1-3)-Fc的最终浓度为95毫克/升。在收获时,用0.45微米Prostak过滤器(Millipore公司,Bedford,MA)通过切向流过滤除去细胞。
例2:纯化从CHO K1细胞中获得的Flt1(1-3)-Fc蛋白
首先通过亲和层析纯化Flt1(1-3)-Fc蛋白。用蛋白A柱以高的专一性结合该分子Fc部分。然后对亲和纯化的蛋白进行浓缩,并通过SEC柱。然后将该蛋白洗脱到制剂缓冲液中。下面详细披露这些方法。
材料和方法
所有化合物都获自J.T.Baker,Phillipsburg,NJ,只有PBS例外,它是以10倍浓缩液形式从生命技术公司(gaithersburg,MD)获得的。蛋白A速流和Superdex200制备级树脂是从Pharmacia(Piscataway,NJ)获得的。用于蛋白浓缩的设备和膜是从Millipore,Bedford,MA获得的。
将大约40升经过0.45微米过滤的含有Flt1(1-3)-Fc蛋白的CHO条件培养基加样到用PBS平衡过的290毫升蛋白A速流柱(直径10厘米)上。用含有350mM氯化钠和0.02%CHAPS的PBS洗涤该柱,并用含有10mM磷酸氢二钠的20mM柠檬酸洗脱结合的蛋白。收集该洗脱液中的单一的峰,并用1M氢氧化钠将其pH提高到中性。用10K再生纤维素膜通过切向流过滤和搅拌细胞浓缩将洗脱级份浓缩到大约9毫克/毫升。为了清除聚合体和其他污染物,将浓缩过的蛋白加样到用Superdex200制备级树脂填装的柱上(10厘米×55厘米),并且用含有5%甘油的PBS洗脱。收集主要的峰级份,无菌过滤、分装并在-80℃下保存。
例3:Flt1(1-3)-Fc蛋白的酰化
用硫代NHS乙酸酯改性试剂盒(Pierce化学公司,Rockford,IL,目录号26777)所提供的指导手册对2毫克Flt1(1-3)-Fc蛋白进行酰化。
例4:酰化Flt1(1-3)-Fc蛋白的鉴定
(a)IEF分析:通过标准IEF分析Flt1(1-3)-Fc和酰化Flt1(1-3)-Fc。如图1所示,Flt1(1-3)-Fc蛋白不能够转移到凝胶中,因而必然具有超过9.3的pI,这是在该标准物中最大的pI。不过,酰化的Flt1(1-3)-Fc能够转移到凝胶中,并且在大约5.2pI处平衡。该结果表明,酰化能降低该蛋白的净正电荷,并因此明显降低其pI。
(b)与胞外基质成分的结合
为了检测与胞外基质成分的结合,Flt1(1-3)-Fc和酰化Flt1(1-3)-Fc用为了模拟胞外基质成分相互作用而设计的测定进行测试。在该测定中,用Matrigel对96孔组织培养平板进行包被(基质宝层96孔平板,目录号40607,Becton Dickinson Labware,Bedford,MA)。用各种浓度的Flt1(1-3)-Fc、酰化Flt1(1-3)-Fc、或rTie2-Fc(一种不相关的对照)蛋白与所述平板一起培养,将其添加到孔中。在室温或者37℃下培养所述平板1-2小时,然后通过向孔中添加二级碱性磷酸酶缀合的抗人Fc抗体检测结合的蛋白。最后,将碱性磷酸酶底物添加到所述孔中,并检测光学密度。图2表示该测定的结果。与不相关的对照蛋白rTie2-Fc一样,酰化Flt1(1-3)-Fc没有表现出与Matrigel包被的平板有任何结合,而非酰化Flt1(1-3)-Fc蛋白表现出明显的结合。这一结果表明,碱性氨基酸残基的酰化是影响存在于带正电荷的蛋白和它在体内所接触到的带负电荷的胞外基质成分之间的电荷相互作用的有效方法。
例5:Flt1(1-3)-Fc蛋白的聚乙二醇化
尽管已经证实蛋白的聚乙二醇化(聚乙二醇-P1)能通过增强其稳定性和生物可利用性同时降低免疫原性而提高其体内效力(参见上面所引用的文献),但违反直觉的是,聚乙二醇化的分子太大,以至于不能通过肾小球过滤,这会改善其药物动力学特征。在不受理论约束的前提下,申请人推测,Flt1(1-3)-Fc分子的聚乙二醇化可以改善其药物动力学特性,这可能不是由于改变了它的正电荷或者是降低了Flt1(1-3)-Fc的pI,而是由于对正电荷的物理屏蔽,使其不能与胞外基质相互作用。申请人决定按下述方法通过连接20K PEGs链来改善Flt1(1-3)-Fc分子的药物动力学特性。
材料和方法
将来自CHO细胞的纯化的Flt1(1-3)-Fc(见上文)用于下面的聚乙二醇化实验中。官能化PEGs购自Shearwater Polymers,Huntsville,AL;Bicine购自Sigma,St Louis,MO;Superose6柱购自Pharmacia,Piscataway,NJ;10倍浓度的PBS购自生命技术公司,Gaithersburg,MD;甘油购自J.T.Baker,Phillipsburg,NJ;而Bis-Tris预制凝胶购自Novex,CA。
将用胺特异性末端部分官能化的20K PEG链用于小规模反应研究中,建立这种研究是为了评估在不同的反应条件中PEG:蛋白化学计量学的变化。根据上述反应和在标准SDS-PAGE上对样品进行的分析,在pH8.1下浓度为1.5毫克/毫升的Flt1(1-3)-Fc与20K SPA-PEG(PEG琥珀酰亚胺丙酸酯)分子的PEG:Flt1(1-3)-Fc单体的摩尔比为1:6。让该反应在8℃下进行一夜。为了进行初步纯化,将该反应产物加样到用含有5%甘油的PBS平衡过的10毫米×30厘米SUPEROSE6柱上。该柱似乎根据聚乙二醇化的程度分离聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc分子。合并相当于主要是单聚乙二醇化的和双聚乙二醇化的二聚体Flt1(1-3)-Fc的级份,上述级份的性质是根据在还原性和非还原性SDS-PAGE凝胶上的带形判断的。通过测定在280nm下的吸收值测定蛋白浓度。对聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc蛋白进行消毒过滤,分装并在-40℃下保存。
例6:在基于BIAcore测定中未修饰过的、酰化的、和聚乙二醇化的
Flt1(1-3)-Fc的结合
在基于BIAcore的测定中检测未修饰过的、酰化的、和聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc蛋白,以便评估其结合Flt1配体VEGF的能力。在该测定中,将未修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白固定在BIAcore芯片表面(有关标准方法参见BIAcore指导手册,Pharmacia公司,Piscataway,NJ)并且让含有0.2微克/毫升VEGF和未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、酰化Flt1(1-3)-Fc或聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc(各为25微克/毫升)的样品通过Flt1(1-3)-Fc-包被的芯片。为了降低非专一结合的影响,用0.5M氯化钠洗涤结合样品。在一个样品中,将未修饰过的Flt1(1-3)-Fc与肝素混合。肝素是带负电荷的分子,而Flt1(1-3)-Fc蛋白是带正电荷的分子,因此当这两种分子混合在一起时,它们会通过其相应的电荷相互作用。这会显著中和Flt1(1-3)-Fc所固有的正电荷,使得该分子的性能象是进行过化学或遗传学修饰一样,以便降低其电荷,并降低其通过电荷相互作用进行结合的倾向。如图3所示,与对照(柱1-4)和不相关的蛋白(柱5-8)相比,酰化的(柱13-16)、聚乙二醇化的(柱17-20)、和肝素处理过的Flt1(1-3)-Fc(柱21-24)都能够完全与BIAcore芯片结合的Flt1(1-3)-Fc竞争结合VEGF。未修饰过的Flt1(1-3)-Fc(柱5-6)似乎只能与BIAcore芯片结合的Flt1(1-3)-Fc部分竞争结合VEGF。不过,用0.5M氯化钠洗涤结合的样品(柱7-8)会得到类似于Flt1(1-3)-Fc的修饰形式的结合曲线,表明未修饰过的蛋白对芯片的结合是非专一性的,这种结合可以通过盐洗涤消除。
例7:在基于ELISA测定中未修饰过的、酰化的或聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc结合。
在标准的基于ELISA的测定中测定未修饰过的、酰化的或聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc蛋白,评估其结合Flt1受体配体VEGF的能力。如图4所示,聚乙二醇化的和酰化的Flt1(1-3)-Fc蛋白能够结合VEGF,表明通过聚乙二醇化或酰化修饰该蛋白不会破坏其结合其配体的能力。
例8:未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、酰化的Flt1(1-3)-Fc或聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc的药物动力学分析
设计体内实验,评估未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、酰化的Flt1(1-3)-Fc或聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc蛋白的药物动力学特征。用4毫克/千克未修饰过的、酰化的或聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc皮下注射Balb/C小鼠(23-28克;3只小鼠/组)。在注射蛋白1、2、4、6、24小时,2天和3天之后从小鼠尾部放血。在为了检测Flt1(1-3)-Fc蛋白而设计的标准的基于ELISA的测定中测定血清。简单地讲,该测定包括用VEGF对ELISA平板进行包被,结合含有未修饰过的、酰化的或聚乙二醇化的Flt1(1-3)-Fc的血清,并用与碱性磷酸酶连接的抗Fc抗体报导。如图5所示,所有Flt1(1-3)-Fc蛋白的Tmax在6小时和24小时时间点之间。不同蛋白的Cmax如下:未修饰过的:0.06-0.15微克/毫升;酰化的:1.5-4.0微克/毫升;而聚乙二醇化的:大约5微克/毫升。
例9:Flt1(1-3)-Fc的逐步酰化
为了确定消除与胞外基质成分结合所必需的最低酰化程度,设计了通过增加酰化反应混合物中酰化试剂超出的摩尔量以逐步的方式酰化Flt1(1-3)-Fc蛋白的实验。所超出的摩尔范围如下:每1摩尔Flt1(1-3)-Fc单体使用0、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100摩尔酰化试剂。反应是按照在硫代-NSH-乙酸酯修饰试剂盒(Pierce化学公司,Rockford,IL,目录号26777)所提供的指导手册中的详细说明进行的。
例10:逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc的鉴定
(a)IEF分析:通过标准IEF分析未修饰过的Flt1(1-3)-Fc和逐步酰化Flt1(1-3)-Fc蛋白。如图6A、6B所示,未修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白由于其具有极高的pI(大于9.3)而不能转移到凝胶中。不过,大多数逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc样品(超出30-100倍摩尔的样品)能够转移到凝胶中,并且根据该蛋白的酰化程度在4.55-8.43pI的范围内达到平衡。这一结果表明,酰化作用可以依赖于剂量的方式改变该蛋白的正电荷,并且pI的降低可以通过控制酰化程度进行操纵。
(b)逐步酰化Flt1(1-3)-Fc与胞外基质成分的结合
为了检测与胞外基质成分的结合,在上述为了模拟与胞外基质成分的相互作用而设计的测定中测定Flt1(1-3)-Fc和逐步酰化Flt1(1-3)-Fc。将各种浓度的未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc(超出10、20、和30倍摩尔的样品)或rTie2-Fc(一种不相关的对照)蛋白添加到孔中。在室温或者37℃下培养所述平板1-2小时,然后通过向孔中添加二抗碱性磷酸酶缀合的抗人Fc抗体检测结合的蛋白。然后,将碱性磷酸酶底物添加到所述孔中,并检测光学密度。图7表示该测定的结果。与不相关的对照蛋白rTie2-Fc相似,逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc(超出20和30倍摩尔的样品)没有表现出与Matrigel包被的平板有任何明显结合,而非酰化Flt1(1-3)-Fc蛋白表现出明显结合。这种结合是可以饱和的,表明Flt1(1-3)-Fc蛋白可以与特殊位点结合,而不是以一种不能够饱和的更常见的电荷介导的相互作用结合。超出10倍摩尔的样品表现出减弱的结合,但其酰化程度不足于完全抑制与胞外基质成分的结合。超出20倍摩尔的样品没有表现出可检测的结合,尽管事实上通过IEF分析证实(图6A和6B)超出较低摩尔的样品仍然具有大的净正电荷。这一结果表明,没有必要将所有碱性氨基酸完全酰化来消除与胞外基质成分的结合。
(c)在基于BIAcore测定中逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc的结合
在基于BIAcore的测定中测定未修饰过的和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc蛋白,评估其结合Flt1配体VEGF的能力。在该测定中,将未修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白(0.5、1.0或5.0微克/毫升)固定在BIAcore芯片表面(有关标准方法参见BIAcore指导手册,Pharmacia公司,Piscataway,NJ),并让含有0.2微克/毫升VEGF和未修饰过的Flt1(1-3)-Fc(0.5、1.0或5.0微克/毫升)或10种不同的逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc样品(各0.5、1.0或5.0微克/毫升)通过Flt1(1-3)-Fc-包被的芯片。如图8所示,在亚化学计量比例下(0.5微克/毫升未修饰过的Flt1(1-3)-Fc或逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc与0.2微克/毫升VEGF),溶液中没有足够的Flt1(1-3)-Fc(未修饰过的或逐步酰化的)来完全结合VEGF。在接近1:1化学计量比例的1.0微克/毫升的浓度下,未修饰过的或逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc能更好地竞争结合VEGF,但仍然没有足够的Flt1(1-3)-Fc蛋白(未修饰过的或逐步酰化的)完全结合所有VEGF。不过,在高于1:1化学计量比例若干倍的5.0微克/毫升的浓度下,Flt1(1-3)-Fc和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc蛋白能够结合VEGF,而与酰化程度无关。这清楚地表明,酰化作用不会改变Flt1(1-3)-Fc结合VEGF的能力。
(d)逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc的药物动力学分析
设计评估未修饰过的Flt1(1-3)-Fc和逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc蛋白的药物动力学特征的体内实验。用4毫克/千克未修饰过的或超出10、20、40、60和100倍摩尔的逐步酰化的Flt1(1-3)-Fc样品皮下注射Balb/C小鼠(23-28克)(未修饰过的,超出10、20和40倍摩尔的样品3只小鼠,超出60和100倍摩尔的样品2只小鼠)。在注射1、2、4、6、24小时,2天和3天之后从小鼠尾部放血。在为了检测Flt1(1-3)-Fc而设计的基于ELISA的测定中测定血清(如上文所述)。图9详细给出了该研究的结果。所测定过的所有Flt1(1-3)-Fc蛋白的Tmax出现在6小时时间点上,而Cmax如下:未修饰过的Flt1(1-3)-Fc:0.06微克/毫升;超出10倍摩尔的样品:-0.7微克/毫升,超出20倍的样品:-2微克/毫升,超出40倍的样品:-40微克/毫升,超出60倍的样品:-2微克/毫升,超出100倍的样品:-1微克/毫升。这一结果表明,Flt1(1-3)-Fc的酰化或聚乙二醇化能明显改善其药物动力学特征。
例11:构建被称为Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc的Flt1(1-3)-Fc碱性区缺失突变体
根据这样的观察结果,即酰化Flt1(1-3)-Fc的pI低于6,它具有好于带有高的正电荷的未修饰过的Flt1(1-3)-Fc(pI大于9.3)的药物动力学,人们会提出这样的问题,在药物动力学方面的差异是否是由于该蛋白的净正电荷,这种电荷使得它能够与带负电荷的胞外基质成分结合,或者在Flt1(1-3)-Fc蛋白表面是否有可能存在构成胞外基质成分专一性结合位点的特殊部位。例如,已知许多蛋白具有肝素结合位点,该位点通常由一组碱性残基构成。有时候,这些残基存在于该蛋白的一级序列上的一组中;某些文献业已鉴定了这些肝素结合位点的“共有序列”(例如,参见Hileman等,1998,Bioessays20(2):156-67)。在另一种情况下,一种蛋白的已知晶体结构揭示出一组位于该蛋白表面上的带正电荷的残基,但这些残基来自其一级序列的不同部位,并且只有当该蛋白折叠成三级结构时才聚集在一起。因此,要判断一个分离的氨基酸残基是否构成位于该蛋白表面的一组碱性残基的一部分是困难的。不过,如果在一级序列存在一组带正电荷的氨基酸残基的话,推测这些残基在空间上彼此接近并且有可能是构成胞外基质成分结合位点的一部分是合理的。已经对Flt1受体进行了深入研究,并且披露了各种结构(例如,参见Tanaka等,1997,Jpn.J.Cancer Res88:867-876)。通过参考在图10A-10D中所示核酸和氨基酸序列,人们可以确定分泌信号序列,该序列位于所述序列的开始位置到由76-78号核苷酸所编码的甘氨酸之间。成熟蛋白始于Ser-Lys-Leu-Lys,从核酸序列的79号核苷酸开始。Flt1Ig结构域1从79号核苷酸延伸到393号核苷酸(编码氨基酸,其末端是氨基酸Ser-Asp-Thr)。Flt1Ig结构域2从394号核苷酸延伸到687号核苷酸(编码Gly-Arg-Pro至Asn-Thr-Ile),Flt1Ig结构域3从688号核苷酸延伸到996号核苷酸(编码Ile-Asp-Val至Asp-Lys-Ala)。有一个由997-1005号核苷酸编码的桥氨基酸序列Gly-Pro-Gly,其后是编码人Fc的核苷酸序列(1006-1701号核苷酸或氨基酸Glu-Pro-Lys至Pro-Gly-Lys-终止)。
对Flt1氨基酸序列所作的更详细的分析发现存在一个簇,即是图10A-10D中的272-281号氨基酸(KNKRASVRR)残基,其中,10个氨基酸残基中有6个是碱性的。该序列位于受体的Flt1Ig结构域3中(参见图11),它本身并不是VEGF配体结合所必需的,但它能产生结合配体的较高的亲和力。对Ig结构域3的序列和Ig结构域2的序列所作的排比发现,在该部分在这两种Ig结构域之间存在很差的相同性,在Ig结构域3中存在多出大约10个的氨基酸。对这两个结构域所作的亲水性特征分析(MacVector计算机软件)清楚地表明了在所述蛋白中亲水性区的存在(图12A-12B)。上述观察增加了Flt1Ig结构域3的实际三维构象产生某种类型的突出的可能性,这种突出不存在于Flt1Ig结构域2中。为了验证这一假设,将所述10个多余的氨基酸去掉,并对所得到的蛋白进行测定,看是否这种缺失会对药物动力学产生正面影响,而不会严重损害该受体对VEGF的亲和力。用标准分子生物学技术(例如,参见分子克隆,实验室手册,Sambrook等,冷泉港实验室;当代分子生物学方法,Ausubel等著,Greene出版协会,Wiley-Interscience,NY)在哺乳动物表达载体Pmt21(遗传学研究所公司,剑桥,MA)中构建的这种DNA结构被称为Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc。Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc结构是通过缺失814-843号核苷酸由Flt1(1-3)-Fc产生的(如图10A-10D所示),这种缺失去掉了Flt1Ig结构域3中的强碱性的10个氨基酸残基序列Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg。
用ABI373A DNA测序仪和Taq双脱氧终止循环测序试剂盒(应用生物系统公司,Foster市,CA)对最终的DNA结构进行序列验证。Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc的序列如图13A-13D所示。
例12:构建被称为Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc的Flt1(1-3)-Fc碱性区缺失突变体
被称为Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc的第二种缺失突变体结构是通过去掉由79-393号核苷酸所编码的Flt1Ig结构域1由Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc结构产生的;为方便起见,将73-78号核苷酸(TCA GGT)换成TCCGGA。这样可以引入一个限制位点(BspE1)而又不会改变相关的氨基酸序列Ser-Gly。用标准分子生物学技术(例如,参见分子克隆,实验室手册,Sambrook等,冷泉港实验室;当代分子生物学方法,Ausubel等著,Greene出版协会,Wiley-Interscience,NY)在哺乳动物表达载体pMT21(遗传学研究所公司,剑桥,MA)中构建的这种DNA结构同样用ABI373A DNA测序仪和Taq双脱氧终止循环测序试剂盒(应用生物系统公司,Foster市,CA)对最终的DNA结构进行序列验证。Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc的序列如图14A-14C所示。
例13:构建被称为Mut3:Flt1(2-3)-Fc的Flt1(1-3)-Fc缺失突变体
以与Mut2:Flt1(2-3ΔB)结构相同的方法构建被称为Mut3:Flt1(1-3ΔB)-Fc的第三种缺失突变结构。所不同的是Flt1Ig结构域3保持完好(碱性区氨基酸没有缺失)。用标准分子生物学方法构建该结构,并按上述方法对最终结构进行序列验证。Mut3:Flt1(2-3)-Fc的序列如图15A-15C所示。
例14:构建被称为Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc的Flt1(1-3)-Fc碱性区N-糖基化突变体。
制备一种最终结构,其中将N-糖基化位点引入Flt1Ig结构域3的碱性区的中央。该结构被称为Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc,并且通过将824-825号核苷酸GA换成AC而制成的,并因此将所编码的Arg残基(AGA)换成了Asn残基(AAC)(参见图10A-10D)。因此,所得到的氨基酸序列从Arg-Ala-Ser换成了Asn-Ala-Ser,它与在Asn残基上添加N-糖基化位点的规范信号(Asn-Xxx-Ser/Thr)吻合。Mut4:Flt1(1-3R→ N)-Fc的序列如图16A-16D所示。
例15:酰化Flt1(1-3)-Fc、Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc和Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc突变体的鉴定
(a)与胞外基质成分的结合
为了确定这三种修饰过的蛋白是否有可能具有改善了的药物动力学特性,将用Matrigel包被过的96孔平皿(如上文所述)与各种浓度的突变蛋白一起培养,并检测抗人Fc/碱性磷酸酶缀合的抗体。如图18所示,该实验表明,尽管未修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白能够有效结合所述孔,但Mut3:Flt1(2-3ΔB)-Fc蛋白的结合更弱一些,Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc蛋白结合还要弱一些,而Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc蛋白表现出最佳的特征,其结合比其他突变蛋白中的任一种都弱。Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc糖基化突变蛋白在Matrigel测定中仅表现出微弱的优点。上述结果证实了有关假说,即可以从一级序列中去掉带正电荷的氨基酸的线性序列,导致与胞外基质成分的电荷成分的相互作用的减弱。
(b)在基于Matrigel的测定中Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc和Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc的结合。
在基于BIAcore的测定中测定未修饰过的和酰化的Flt1(1-3)-Fc和遗传修饰过的Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc和Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc蛋白,评估其结合Flt1配体VEGF的能力。在该测定中,将未修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白(0.25、0.5、或1.0克/毫升)固定在BIAcore芯片表面(有关标准方法参见BIAcore指导手册,Pharmacia公司,Piscataway,NJ),并让含有0.1微克/毫升VEGF的溶液和纯化的或含有未修饰过的Flt1(1-3)-Fc(大约0.25、0.5、1.0微克/毫升)的COS细胞上清液,纯化的酰化Flt1(1-3)-Fc(0.25、0.5或1.0微克/毫升)、含有Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc的COS细胞上清液(大约0.25、0.5、1.0微克/毫升)或含有Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc的COS细胞上清液(大约0.25、0.5、1.0微克/毫升)通过用Flt1(1-3)-Fc包被的芯片。如图17所示,在亚化学计量比例下(0.25微克/毫升未修饰过的、酰化的或遗传修饰过的Flt1(1-3)-Fc样品与01.微克/毫升VEGF),没有足够的Flt1(1-3)-Fc蛋白来抑制VEGF与固定在芯片上的Flt1(1-3)-Fc结合。在化学计量比例接近1:1的0.5微克/毫升未修饰过的、酰化的或遗传修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白的浓度下,抑制VEGF与芯片结合的能力增强。在接近10:1的化学计量比例的1.0微克/毫升修饰过的、酰化的或遗传修饰过的Flt1(1-3)-Fc蛋白的浓度下,Flt1(1-3)-Fc蛋白能够抑制VEGF与BIAcore芯片结合,但它们的作用相同。未修饰过的、酰化的和Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc在其抑制VEGF结合的能力方面基本上相同,而Mut4:Flt1(1-3R→N)-Fc在抑制结合方面效果较差。上述结果证实了这样的假说,即通过遗传学方法除去主要为带负电荷的氨基酸的线性序列可以减弱带正电荷的分子的非专一性结合。
(c)在基于ELISA测定中Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc、Mut2:Flt1(2-3ΔB)-Fc、Mut3:Flt1(2-3)-Fc的结合
为了确定这三种突变蛋白是否能够结合Flt1配体VEGF,进行了结合实验,其中,将用VEGF包被的96孔平板与各种浓度的相应的突变蛋白一起培养,并且在洗涤之后,通过与碱性磷酸酶缀合的抗人Fc抗体培养检测其结合量,通过添加合适的碱性磷酸酶底物通过比色方法进行定量,如图19所示,该实验表明,在测试的浓度下,所有突变蛋白都能够以相似的方式结合VEGF。
例16:酰化Flt1(1-3)-Fc、Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc和未修饰过的Flt1(1-3)-Fc的药物动力学分析
设计体内实验以便评估未修饰过的Flt1(1-3)-Fc、Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc和超出40倍摩尔的酰化Flt1(1-3)-Fc蛋白的药物动力学特征。用4毫克/千克Flt1(1-3)-Fc、超出40倍摩尔的酰化的Flt1(1-3)-Fc和Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc蛋白皮下注射Balb/C小鼠(25-30克)(每一种处理4只小鼠)。在注射1、2、4、6、24小时,2天、3天和5天之后从小鼠尾部放血。在为了检测Flt1(1-3)-Fc蛋白而设计的ELISA中测定血清,该测定包括让VEGF接触ELISA平板,结合Flt1(1-3)-Fc,并用与碱性磷酸酶连接的Fc抗体报导。如图20所示,这些试剂的Cmax如下:未修饰过的Flt1(1-3)-Fc-0.15微克/毫升;超出40倍摩尔的酰化Flt1(1-3)-Fc-1.5微克/毫升;而Mut1:Flt1(1-3ΔB)-Fc-0.7微克/毫升。
例17:修饰过的Flt1受体载体构建
用于构建修饰形式的Flt1受体(又被称作VEGFR1)的原理基于以下观察,即Flt1的蛋白序列是强碱性的,因此有可能结合在胞外基质(ECM)上。Flt1的强碱性性质可以解释为什么未修饰过的Flt1(1-3)-Fc(如上文所述)具有较差的药物动力学,这使得它很难被用作治疗剂。如上文所述,Flt1(1-3)-Fc的化学修饰形式(以下称之为A40)与非酰化的Flt1(1-3)-Fc相比具有大大改善了的药物动力学(PK)特征。因此,试图制备工程DNA分子,该分子可用于重组表达修饰形式的Flt1受体分子,该分子具有由A40所表现出的改善了的PK特征,而仍然保留了与VEGF紧密结合的能力。
从文献中得知,Flt1的第一个Ig结构域(在中性pH下它的净电荷为+5)不是与VEGF紧密结合所必须的,因此将该结构域去掉。第三个Ig结构域(净电荷为+11)不是结合所必须的,但能产生比第二个Ig结构域高的对VEGF的亲和力,因此不是将它完全去掉,而是用Flt1受体家族的Flk1(又被称作VEGFR2)和Flt4(又被称作VEGFR3)的等同的结构域取代它。这些嵌合分子(被称为R1R2(Flt1.D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)和R1R3(Flt1D2.VEGFR3D3-FcΔC1(a)和VEGFR1R3-FcΔC1(a),其中,R1和Flt1D2=Flt1(VEGFR1)Ig结构域2;R2和Flk1D3=Flk1(VEGFR2)的Ig结构域3;而R3和VEGFR3D3=Flt4(VEGFR3)Ig结构域3)与ECM的结合力较低,这一结论是通过下文所述的体外ECM结合测定判断的,如下文所述,它具有明显改善了的PK。另外,如下文所述,这些分子能够紧密结合VEGF,并且抑制在内皮细胞中所表达的Flk1受体的磷酸化,如下文所述。
(a)表达质粒pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的构建
表达质粒pMT21.Flt1(1-3)-Fc(6519bp)和pMT21.Flk-1(1-3)-Fc(5230bp)分别是编码氨苄青霉素抗性和Fc抗性标记形式的人Flt1和人Flk1的Ig结构域1-3的质粒。用所述质粒构建包括Flt1的Fc结构域2与Flk1的Ig结构域3的融合的DNA片段,通过PCR扩增相应的Ig结构域,然后再进行一轮PCR实现将这两个结构域融合成一个片段。对于Flt1的Ig结构域2来说,5’和3’扩增引物如下:
5’:bsp/slt1D2(5’-
GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3’)
3’:Flt1D2Flk1D3.as(5’-
CGGACTACAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3’)
编码Flt1的Ig结构域2上游的BspE1限制酶位点的5’扩增引物,由氨基酸序列GRPFVEM限定(相当于图21A-21C的27-33号氨基酸)。3’引物编码直接与Flk1的Ig结构域3的5’末端融合的Flt1Ig结构域2的3’末端的反向补体,融合点被确定为Flt1的TIID(相当于图21A-21C的123-126号氨基酸),并延续到Flk1的VVLS(相当于图21A-21C的127-130号氨基酸)。
对于Flk1的Ig结构域3来说,5’和3’扩增引物如下:5’:Flt1D2-Flk1D3.S(5’-ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG-3’)。
3’:Flk1D3/apa/srf.as(5’-
GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3’)
5’扩增引物编码直接与Flk1Ig结构域3的开始部分融合的Flt1Ig结构域2的末端,如上文所述。3’扩增引物编码Flk1Ig结构域3的末端,该末端由氨基酸VRVHEK形成(相当于图21A-21C的223-228号氨基酸),其后是一个连接序列,该序列包括一个限制酶Srf1的识别序列,并且编码氨基酸GPG。所述连接序列相当于图21A-21C的229-231号氨基酸。
进行一轮PCR扩增,产生所述单一的结构域,然后在试管中混合该产物,并用引物bsp/Flt1D2和Flk1D3/apa/srf.as(如上文所述)进行另一轮PCR,以便产生融合产物。然后用限制酶BspEI和SmaI消化该PCR产物,并将所得到的614bp的片段克隆到载体pMT21/ΔB2.Fc的BspEI至SrfI限制位点上,形成质粒pMT21/Flt1D2.Flk1D3.Fc。通过标准序列分析方法证实Flt1D2-Flk1D3基因融合插入片段的核苷酸序列。然后用限制酶EcoRI和SrfI消化该质粒,并将所得到的702bp的片段转移到质粒pFlt1(1-3)B2-FcΔC1(a)的EcoRI至SrfI限制位点上,以便产生质粒pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)。Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)嵌合的完整的DNA和推测的氨基酸序列如图21A-21C所示。
(b)表达质粒pFlt1D2VEGFRD3FcΔC1(a)的构建
表达质粒pMT21.Flt1(1-3)Fc(6519bp)编码氨苄青霉素抗性和人Flt1受体的Fc标记形式的Ig结构域1-3。将该质粒用于通过PCR生产含有Flt1的Ig结构域2的DNA片段。通过标准RT-PCR方法用来自细胞系HEL921.7的RNA生产Flk1的Ig结构域3。通过另一轮PCR扩增实现将两个Ig结构域融合为单一的融合片段。对于Flt1Ig结构域2来说,其5’和3’扩增引物如下:
5’:bsp/Flt1D2(5’-
GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3’)
3’:Flt1D2.VEGFR3D3.as
(TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT)
5’扩增引物编码Flt1的Ig结构域2的上游BspE1限制位点,由氨基酸序列GRPFVEM限定(相当于图22A-22C的27-33号氨基酸)。3’扩增引物编码直接与VEGFR3Ig结构域3的开始部分融合的Flt1Ig结构域2的末端的反向互补体。融合位点被确定为Flt1的TIID(相当于图22A-22C的123-126号氨基酸),并且延续到VEGFR3的IQLL(相当于图22A-22C的127-130号氨基酸)。
对于VEGFR3的Ig结构域3来说,用于RT-PCR的5’和3’引物如下:
5’:R3D3.s
(ATCCAGCTGTTGCCCAGGAATTCGCTGGAGCTGCTGGTA)
3’:R3D3.as
(ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)
5’和3’扩增引物能与VEGFR3的序列配对。通过标准方法分离该RT-PCR反应的296bp的扩增产物,并进行第二轮PCR,以便增加合适的序列来实现Flt1D2与Flk1D3结构域的融合,以及Flk1D3和Fc结构域通过GPG桥的融合(参见下文)。扩增引物如下:
5’:Flt1D2.VEGFR3D3.as
(TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG)
3’:VEGFR3D3/srf.as
(GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT)
5’扩增引物编码直接与VEGFR3Ig结构域3的开始部分(5’末端)融合的Flt1Ig结构域2的3’末端,如上文所述。3’扩增引物编码VEGFR3Ig结构域3的3’末端,由氨基酸VIVHEN限定(相当于图22A-22C的221-226号氨基酸),其后是连接序列,该序列包括Srf1的识别序列,并且编码氨基酸GPG。该连接序列相当于图22A-22C的227-229号氨基酸。
进行一轮(Flt1Ig结构域2)或两轮(Flt4Ig结构域3)PCR,以便形成单一的Ig结构域,然后在试管中合并该PCR产物,并用扩增引物bsp/Flt1D2和VEGFR3D3/srf.as进行另一轮PCR,如上文所述,以便产生融合产物。然后用限制酶BspEI和SmaI消化该PCR产物,并将所得到的625bp的片段亚克隆到载体pMT21/Flt1ΔB2.Fc的BspEI至SrfI限制位点上(如上文所述),以便产生质粒pMT21/Flt1D2.VEGFR3D3.Fc。通过标准序列分析证实Flt1D2.VEGFR3D3基因融合插入片段的序列。然后用限制酶EcoRI和SrfI消化该质粒,并将所得到的693bp片段亚克隆到质粒pFlt1(1-3)ΔB2-FcΔC1(a)的EcoRI至SrfI位点上,以便产生质粒pFlt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)。Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)嵌合分子的完整DNA和推测的氨基酸序列如图22A-22C所示。
例18:胞外基质结合(ECM)结合测定
在添加样品之前,用含有谷氨酰胺(2mM),100单位青霉素,100单位链霉素和10%BCS加热的DME对ECM包被的平板(BectonAickinson目录号35-4607)进行再水合至少1小时。然后在室温下用各种浓度的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)培养平板1小时,开始浓度为10nM,然后用添加10%BCS的PBS的2倍稀释液。然后用添加了0.1%Triton-X的PBS洗涤平板3次,在室温下与碱性磷酸酶缀合的抗人Fc抗体(Promega,在含有10%BCS的PBS中的1:4000的稀释液)培养1小时。然后用添加了0.1%Triton-X的PBS洗涤平板4次,并添加碱性磷酸酶缓冲液/pNPP(Sigma)进行显色。然后在I=405-570nm下对平板进行读数。该实验的结果如图23所示,并且证实了Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)蛋白对ECM的结合力明显低于Flt1(1-3)-Fc蛋白的结合力。
例19:pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)在CHO-K1(E1A)细胞中的瞬时表达
在含有100微克/毫升氨苄青霉素TB营养液中过夜培养含有在例17(a)中所述的pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的大肠杆菌DH10B细胞的大规模(2升)培养物。次日,用QIAgen Endofree Megapreb试剂盒按照生产商的方法提取质粒DNA。用UV分光光度计和荧光光度计通过标准技术测定纯化质粒DNA的浓度。通过用限制酶EcoRI和NotI和AseI对等份试样进行标准限制酶消化证实所述质粒DNA。在1%琼脂糖凝胶上分析时,所有限制酶消化片段相当于其预测的大小。
用CHO-K1/E1A细胞接种40个15厘米的培养皿,其密度为4X106细胞/皿。铺平板的培养基是补充了10%Hyclone胎牛血清(FBS)、100单位青霉素/100单位链霉素和谷氨酰胺(2mM)的Gibco Ham’sF-12。第二天,用6微克pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)质粒DNA在12毫升的体积中用Gibco Optimem和Gibco脂转染胺进行转染,按照生产商的方案进行。在向细胞中添加转染混合物4小时之后,添加10毫升/皿补充了10%FBS的Optimem。在37℃下在5%二氧化碳的培养箱中培养平皿过夜。次日,从每一个培养皿上除去培养基,并添加25毫升表达培养基(补充了谷氨酰胺(2mM)和1mM丁酸钠的Gibco CHO-S-SF II)。在37℃下培养所述培养皿3天。在培养3天之后,从每一个培养皿中吸出培养基,并以400rpm的速度在挂篮转子上离心,使细胞沉淀。将上清液浸入无菌的1升瓶中,并按下文所述方法纯化表达的蛋白。
例20:pVEGFR1R2-FcΔC1(a)表达载体的构建
通过以下方法构建pVEGFR1R2-FcΔC1(a)表达质粒:插入编码位于图21A-21C的Flt1d2-Flk1d3-FcΔC1(a)的26和27号氨基酸之间(GG)的氨基酸STD(相当于图24A和图24C的27-29号氨基酸)的DNA,并除去编码相当于图的229-231号氨基酸的氨基酸GPG的DNA。STD氨基酸序列是Flt1受体所固有的,并且将它重新添加上去以便降低异源N-末端加工的可能性。除去GPG(连接序列),以便Flt1和Flk1Ig结构域能彼此直接融合。pVEGFR1R2-FcΔC1(a)嵌合分子的完整DNA和推测的氨基酸序列如图24A-24C所示。
例21:用于生产修饰过的Flt1受体的培养方法
(a)用于生产Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的细胞培养方法
用例1中所披露的表达质粒p Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)生产Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)蛋白的方法包括对能组成型地表达该蛋白产物的重组中国仓鼠卵(CHO K1/E1A)细胞的悬浮培养。在生物反应器中生长该细胞,并且通过亲和和大小排阻层析分离和纯化该蛋白产物。在下面将更详细地描述该方法。
细胞扩增
通过将细胞传代到8个T-225平方厘米烧瓶里的培养基中(GMEM+10%血清,GIBCO),并在37℃和5%二氧化碳下培养,扩增含有表达Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的细胞系的两个铺满的T-225平方厘米烧瓶。当所述烧瓶达到铺满时(大约3-4天),用胰蛋白酶分离细胞。添加所述培养基,以便使细胞不再接触胰蛋白酶。对细胞进行离心,并重新悬浮在新的培养基中,然后转移到850平方厘米的滚瓶中,并在37℃和5%二氧化碳下培养到铺满。
在生物反应器中悬浮培养
对生长在滚瓶中的细胞进行胰蛋白酶化,使其从表面上分离,并用悬浮培养基洗涤。在无菌条件下将细胞转移到5升的生物反应器(NewBrunswick Celligen Plus),在这里让细胞在3.5升悬浮培养基中生长。悬浮培养基是IS-CHO(Irvine Scientific)的不含谷氨酰胺的低葡萄糖改进形式,其中添加了5%胎牛血清(Hyclone),GS添加剂(生命技术公司)和25微摩尔甲硫氨酸sulfoximine(Sigma)。通过向输入的气体添加二氧化碳或者通过向生物反应器中添加碳酸钠的液体溶液将pH控制在7.2。通过向输入气体中添加氧气或氮气将溶解氧气的水平保持在30%的饱和度,并将温度控制在37℃。当细胞密度达到4X106细胞/毫升时,将细胞转移到装有相同培养基的40升的生物反应器中,并设定点,以便控制该生物反应器。将温度设定值降低到34℃,以便延缓细胞生长,并提高蛋白表达的相对速度。
(b)用于生产Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)的细胞培养方法
用与上述生产Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)相同的方法生产Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)。
例22:收获并纯化修饰过的Flt1受体
(a)收获并纯化Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)
在无菌条件下从生物反应器中收获蛋白产物,同时用MilliporeProstak切向流过滤组件和低剪切机械泵(Fristam)保留细胞。将新的培养基添加到所述生物反应器中,以便取代在收获过滤期间除去的培养基。然后将大约40升收获的滤液加样到装有蛋白A Sepharose树脂(Amersham Pharmacia)的400毫升柱上)。在对树脂加样之后,用含有10mM磷酸钠、500mM氯化钠,pH7.2的缓冲液洗涤,以便除去任何未结合的污染蛋白。用pH3.0的柠檬酸缓冲液洗脱Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)。通过添加Tris碱中和洗脱的蛋白,并在-20℃下冷藏。
将来自上述蛋白A步骤的若干批冷冻的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)蛋白解冻,合并并用Millpore30kD标称分子量截断(NMWCO)切向流过滤膜浓缩。将蛋白转移到一个搅拌细胞浓缩器(Millpore)中,并用30kD NMWCO进一步浓缩至30毫克/毫升。将浓缩的蛋白加样到装有Superdem200树脂(Amersham Pharmacia)的大小排阻柱中,该柱用添加了5%甘油的磷酸缓冲的盐溶液平衡过。让相同的缓冲液通过该柱。收集相当于Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)二聚体的级份,通过0.22微米的滤膜进行消毒过滤,分装并冷冻。
(b)收获并纯化Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)
用与上述生产Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)相同的方法收获并纯化Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)。
例23:瞬时表达的VEGFR2磷酸化测定
在无血清DME高葡萄糖介质中将传代4-6代的原代人脐静脉内皮细胞(HUVECs)饥饿2小时。制备含有40钠克/毫升(1nM)人VEGF165的样品,它是VEGF受体Flt1、Flk1和Flt4(VEGFR3)的配体,并在室温下与各种浓度的修饰过的Flt1受体Flt1(1-3)-Fc、Flt1(1-3)-Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)一起在含有0.1%BSA的无血清高葡萄糖培养基中预培养1小时。用上面所制备的+/-VEGF165样品刺激细胞5分钟,然后用完全裂解缓冲液裂解完整细胞。用抗VEGFR2受体的C-末端的抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀。将免疫沉淀的裂解物加样到4-12%SDS-PAGE Novex凝胶上,然后用标准转移方法转移到PVDF膜上。磷酸化VEGFR2的检测是通过用被称为4G10(UBI)的抗磷酸酪氨酸mAb进行免疫吸印完成的,并用ECL-试剂(Vmersham)显影。图25A-25C和26A-26B表示该实验的结果。图25A-25C表示通过对用VEGF165配体刺激进行的酪氨酸磷酸化进行的VEGFR2(Flk1)的Western印迹进行的检测,表明细胞表面受体被以不同的程度磷酸化,其磷酸化程度取决于在与VEGF预培养期间所使用的修饰过的Flt1受体。如图25A所示,在超出1.5M的Flt1受体Flt1(1-3)-Fc、Flt1(1-3)-Fc(A40)或瞬时Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的浓度下,与对照培养基刺激相比,这三种修饰过的Flt1受体能完全抑制受体刺激。相反,在这种超出的摩尔量下,瞬时Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)与VEGF阳性对照刺激相比没有表现出明显的抑制作用。从图25B中可以看到类似结果,其中,修饰过的Flt受体的摩尔量超过VEGF165配体3倍。在图25C中,修饰过的Flt1受体的摩尔量超过VEGF165配体6倍,现在可以看出瞬时Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)能够部分抑制由VEGF165-诱导的对细胞表面受体的刺激。
在图26A-26B中,通过Western印迹检测VEGF165配体对酪氨酸磷酸化VEGFR2(Flk1)的刺激发现,具有与超过1和2倍摩尔(图26A)或3和4倍摩尔(图26B)瞬时Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)、稳定的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)、或瞬时VEGFR1R2-FcΔC1(a)一起预培养过的VEGF165的样品刺激不能将细胞表面受体磷酸化。在所实验过的所有修饰过的Flt1受体的浓度下,在预培养期间都有VEGF165配体的完全结合,导致与对照培养基刺激相比,未结合的VEGF165对细胞表面受体没有任何可检测的刺激作用。
例24:细胞增殖生物测定
测试的细胞群体是MG87细胞,该细胞业已用一种表达质粒稳定转染过,该质粒含有编码与TrkB胞内激酶结构域融合的VEGFR2(Flk1)胞外结构域的DNA插入片段。使用TrkB胞外激酶结构域而不使用天然VEGFR2(Flk1)胞外激酶结构域的原因是,VEGFR2(Flk1)的胞内激酶结构域在所述细胞中用VEGF165刺激时不能导致强的增殖反应。众所周知,MG87细胞含有完整长度的TrkB受体,在用BDNF刺激时能产生强的增殖反应,因此工程产生TrkB胞内激酶结构域,以便取代VEGFR2(Flk1)的胞内激酶结构域,从而利用该增殖反应能力。
将5X103细胞/孔铺平板到96孔平板上,并在37℃下让其沉降2小时。将以下修饰过的Flt受体Flt1(1-3)-Fc、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)和作为负对照的被称为Tie2-Fc的一种不相关的受体从40nM滴定到20pM,并在37℃下在细胞上培养1小时。然后以1.56nM的浓度将存在于确定培养基中的人重组VEGF165添加到所有孔中。在37℃下培养所述平板72小时,然后添加MTS(Owen’s试剂,Promega),并将平板再培养4小时。最后,在分光光度计上在450/570nm波长下对该平板读数。该实验的结果示于图27中。对照受体Tie2-Fc在任何浓度下都不能抑制VEGF165诱导的细胞增殖,而Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)能以0.8nM的1/2最大剂量抑制1.6nM的VEGF165。在该测定中,Flt1(1-3)-Fc和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)对VEGF165的抑制效果较差,1/2最大剂量为大约2nM。VEGF165本身能产生1.2吸收单位的读数,而背景为0.38吸收单位。
例25:修饰过的Flt受体对VEGF165的结合化学剂量学
(a)BIAcore分析
通过测定VEGF结合Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)表面的饱和水平或测定完全抑制Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)结合VEGF BIAcore芯片表面所需要的VEGF165的浓度,测定Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)与人VEGF165相互作用的化学剂量。
修饰过的Flt受体Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)被首先用胺偶联化学方法固定在BIAcore芯片(BIACORE)上的抗Fc专一性抗体所固定。用空白抗体表面作负对照,以10微升/分钟的速度用1小时将VEGF165以1nM、10nM和50nM注射在Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)的表面。记录实时结合信号,并在每一次注射结束时达到饱和结合。结合化学计量是以结合的VEGF165与固定的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)的摩尔比计算的,使用相当于1ng/ml的1000RU的换算系数。该结果表明,每一个Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)的分子具有结合一个VEGF165二聚体分子的化学计量(图28)。
在溶液中,将浓度为1nM的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)(估计比Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)/VEGF165相互作用的KD高1000倍)与各种浓度的VEGF165混合。在培养1小时之后,以与胺结合的VEGF165表面结合信号形式测定溶液中游离的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的浓度。利用校正曲线将Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)BIAcore结合信号转换成它的摩尔浓度。数据表明,向Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)溶液中添加1nMVEGF165能完全抑制Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)与VEGF165表面结合。这一结果表明了每一个Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)分子具有一个VEGF165分子的结合化学计量(图29和30)。当将Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的浓度作为所添加VEGF165的函数进行作图时,直线部分Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的斜率为-1.06,而VEGFR1R2-FcΔC1(a)为-1.07。所述斜率的大小非常接近负数,这表明有一个VEGF165分子结合在Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)的一个分子上。
(b)大小排阻层析
将Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)与超出3倍摩尔的VEGF165混合,并用Pharmacia Superose6大小排阻层析柱纯化受体-配体复合体。然后在含有6摩尔盐酸胍缓冲液中培养所述受体-配体复合体,以便将其解离成成分蛋白。用Pharmacia Superose6大小排阻层析柱从VEGF165上分离Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a),用6摩尔盐酸胍过柱。为了测定复合体化学计量,制备若干Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGF165的注射液,并以注射蛋白浓度的函数形式将峰的高度或峰的级份强度作图。在与用于分离/VEGF复合体的成分的相同条件下进行校正。根据该校正曲线对Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165复合体组成进行定量。该实验的结果如图28所示,图中示出了在该复合体中VEGF165与Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的比例为1:1。
例26:通过大小排阻层析测定Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165复合体的结合计量
Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165复合体的制备
将VEGF165(浓度=3.61毫克/毫升)与CHO细胞瞬时表达的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)(浓度=0.9毫克/毫升)以3:1的摩尔比(Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a):VEGF165)混合,并在4℃下培养过夜。
(a)在天然条件下进行大小排阻层析(SEC)
为了从多余的未结合的VEGF165中分离复合体,将50微升复合体加样到用PBS缓冲液平衡的Pharmacia Superose12PC3.2/30柱上。在室温下用相同缓冲液以40微升/分钟的流速洗脱该样品。该SEC的结果如图31所示。1号峰表示复合体,2号峰表示未结合的VEGF165。合并在1.1和1.2毫升之间洗脱的级份并以4.5摩尔的最终浓度添加盐酸胍,以便使该复合体解离。
(b)在解离条件下进行大小排阻层析(SEC)
为了分离受体-配体复合体的成分,并测定其摩尔比,将上述50微升解离的复合体加样到用6摩尔盐酸胍平衡的Superose12PC3.2/30柱上,并在室温下用相同的溶液以40微升/分钟的流速洗脱。该SEC的结果如图32所示。1号峰表示Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a),而2号峰表示VEGF165。
(c)计算Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a):VEGF165复合体的化学计量
根据所述成分的峰面积或峰高测定受体-配体复合体的化学计量。分别相当于峰高或峰面积的VEGF165和Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的浓度是从VEGF165和Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)标准曲线获得的。为了获得标准曲线,将每一种成分的四种不同浓度(0.04-0.3毫克/毫升)加样到用6摩尔盐酸胍平衡的Superose12PC3.2/30柱上,并在室温下用相同的溶液以40微升/分钟的流速洗脱。标准曲线是通过将峰面积或峰高对蛋白浓度进行作图获得的。根据成分的峰面积测定的VEGF165:Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的摩尔比为1.16。根据成分的峰高测定的VEGF165:Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的摩尔比为1.10。
例27:通过具有联机光学散射的大小排阻层析测定Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165复合体的化学计量
复合体制备
将VEGF165与CHO细胞瞬时表达的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)蛋白以3:1的摩尔比混合(Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a):VEGF165),并在4℃下培养过夜。
(a)具有联机光学散射的大小排阻层析(SEC)
用装配有MiniDawn联机光学散射探测仪(Wyatt技术,SantaBarbara,California)和折射指数(RI)探测仪(Shimadz,Kyoto,日本)的大小排阻层析柱测定受体-配体复合体的分子量。将样品加样到用PBS平衡过的Superose12HR10/30柱(Pharmacia)上,并在室温下用相同的缓冲液以0.5毫升/分钟的流速洗脱。如图33所示,洗脱曲线上出现了两个峰。1号峰表示受体-配体复合体,而2号峰表示未结合VEGF165。根据LS和RI信号计算分子量。用相同方法测定受体-配体复合体的每一种成分的分子量。该测定的结果如下:Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165复合体在峰值位置上的分子量为157300(图33),VEGF165在峰值位置上的分子量为44390(图34),R1R2在峰值位置上的分子量为113300(图35)。
以上结果表明Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF复合物的化学计量为1:1,相当于Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGF165的分子量的总和。重要的是,该方法结论性地证实了Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165复合体确实是由一个VEGF165配体分子和一个Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)分子组成。
例28:Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)的肽作图
通过肽作图方法测定Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)中的二硫键结构和糖基化位点。在该方法中,先用胰蛋白酶裂解蛋白。除了利用N-末端测序技术之外,通过与质谱仪连接的HPLC分析并鉴定胰化片段。利用胰化消化产物的还原来帮助鉴定含有二硫键的片段。通过用PNGaseF(Glyko,Novato,CA)处理胰化消化物来鉴定具有N-连接的糖基化位点的片段,其结果归纳在附图36中。
在Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)中共有10个半胱氨酸;其中的6个属于Fc区。业已证实Cys27通过二硫键与Cys76连接。业已证实Cys201通过二硫键与Cys182连接。Fc区中的头两个半胱氨酸(Cys211和Cys214)与另一个Fc链上的相同的两个半胱氨酸形成分子间二硫键。不过,由于这两个半胱氨酸不能通过酶促方法彼此分开,不能够确定二硫键连接是出现在相同的半胱氨酸之间(例如Cys211与Cys211)或者是在出现在Cys211和Cys214之间。业已证实Cys216通过二硫键与Cys306连接,Cys352通过二硫键与Cys410连接。
在Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)中有5个可能的N-连接的糖基化位点。发现所有这5个糖基化位点都以不同的程度糖基化。完全的糖基化出现在Asn33(氨基酸序列NIT)、Asn193(氨基酸序列NST)、和Asn282(氨基酸序列NST)。另外,在Asn65和Asn120上出现部分糖基化。在图36中通过加下划线的形式突出糖基化位点。
例29:修饰过的Flt受体的药物动力学分子
(a)Flt1(1-3)Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)的药物动力学分析
用4毫克/千克Flt1(1-3)Fc(A40)、CHO瞬时表达的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)、CHO稳定表达的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)、和CHO瞬时表达的Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a)皮下注射Balb/c小鼠(25-30克)。在注射之后1、2、4、6、24小时,2天、3天和6天之后从小鼠尾部放血。在为了检测Flt1(1-3)Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a)而设计的ELISA中测定血清。ELISA包括用VEGF165对ELISA平板进行包被,结合检测的Flt1(1-3)Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或VEGFR1R2-FcΔC1(a),并用与辣根过氧化物酶连接的抗Fc的抗体报导。该实验的结果如图37所示。Flt1(1-3)Fc(A40)的Tmax出现在6小时,而瞬时和稳定Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)以及瞬时VEGFR1R2-FcΔC1(a)的Tmax出现在24小时。Flt1(1-3)Fc(A40)的Cmax为8微克/毫升。瞬时Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和VEGFR1R2-FcΔC1(a)的Cmax为18微克/毫升,而稳定的VEGFR1R2-FcΔC1(a)的Cmax为30微克/毫升。
(b)Flt1(1-3)Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a)的药物动力学分析
用4毫克/千克Flt1(1-3)Fc(A40)、CHO瞬时表达的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)、和CHO瞬时表达的VEGFR1R2-FcΔC1(a)皮下注射bALB/c小鼠(25-30克)。在注射1、2、5、6、7、8、12、15和20天之后从小鼠尾部放血。在为了检测Flt1(1-3)Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a)而设计的ELISA中测定血清。ELISA包括用165对ELISA平板进行包被,结合Flt1(1-3)Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a),并用与辣根过氧化物酶连接的抗Fc抗体报导。5天之后,在血清中不再能够检测到Flt1(1-3)Fc(A40),而Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或Flt1D2.VEGFR1R2-FcΔC1(a)在15天或更长时间内都可检测到。该实验的结果如图38所示。
例30:评估Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)在体内抑制肿瘤生长的能力
为了评估Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)在体内抑制肿瘤生长的能力,采用了一种模型,其中,将肿瘤细胞悬浮液皮下移植雄性严重合并性免疫缺陷(SCID)小鼠的右侧。在该测定使用两种细胞系,人HT-1080显微肌瘤细胞系(ATCC保藏号CCL-121)和大鼠C6胶质细胞系(ATCC保藏号CCL-107),这两个细胞系各自表现出明显不同的形态学和生长特征。在肿瘤移植的当天使用第一种剂量的Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)(剂量为25毫克/千克或如图39和40所示)。然后每隔1天(EOD)或每周2次(2X/wk)给动物皮下注射Flt1(1-3)Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)或媒介物,持续2周时间。2周之后,用固定剂灌注动物,取出肿瘤并封闭样品。通过测定可见的皮下肿瘤的长度和宽度确定肿瘤体积。Flt1(1-3)Fc(A40)和Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)能明显减弱由HT-1080和C6细胞所形成的肿瘤的生长。上述实验的结果如图39和40所示。
例31:VEGF165和修饰过的Flt受体在雌性生殖系统中的作用
业已对在生殖周期过程中发生子宫和卵巢中的血管再造的立体形式进行了充分的鉴定,使得这些组织特别适用于研究调控血管形成,血管再造和血管退化的机制。实际上,在生殖组织中进行的原位杂交研究首次提供了VEGF在成熟的啮齿类动物和人和非人灵长类动物中起着生理学血管形成的介体作用的证据(Phillips等,1990;Ravindranath等,1992;Shweiki等,1993;Kamat等,1995)。周期性地血管形成和血管再造是正常卵巢和子宫的突出特征。将异常血管生长和/或血管病变作为影响所述器官的很多病理学症状的特征并不奇怪。另外,上述病理学血管异常被认为是由于一种或多种血管形成或抗血管形成因子,主要是VEGF的异常调控的表达所导致或引起的。
例如,异常血管形成是多发性囊性卵巢病变、子宫内膜异位和子宫内膜癌的特征。在每一种情况下,VEGF在受影响的组织中都超量表达(Kamat等,1995;Shifren等,1996;Guidi等,1996;Donnez等,1998)。VEGF的超量表达还被认为在卵巢过度刺激综合症中系统性血管通透性过高方面起着致病作用(McClure等,1994;Levin等,1998)并在子痫前期中起着致病作用(Baker等,1995;Sharkey等,1996)。另外,VEGF还被认为是决定产生与卵巢癌和其他肿瘤相关的腹水的渗透性因子(Senger等,1983;Boocock等,1995)。能有效中和VEGF的生物学作用的制剂可以被合理地认为具有对上述相关症状的治疗作用。
血管形成和血管再造还是胚泡移植和胎盘发育的特征(Findlay,1986)。VEGF在母体退膜和胚胎滋养层中能高水平表达,其中,它被认为首先在外周移植期间刺激子宫脉管系统膨大和通透性增强,然后介导母体和胎盘脉管系统的胚胎成分形成(Shweiki等,1993;Cullinan-Bove和KOOS,1993;Chakraborty等,1995;Das等,1997)。VEGF还是黄体血管形成和相关的孕酮分泌所需要的,它是子宫准备受孕所必需的(Ferrara等,1998)。因此,能抑制VEGF的生物学作用的试剂可以被证明能用作避孕剂(抑制受孕)或在妊娠的早期阶段作为堕胎药。后一种用途特别适用于作为终止异常怀孕的非手术介入方法。
尽管VEGF受体的表达主要局限于正常生殖组织的血管内皮细胞中,Flt1还能在人和动物的胎盘滋养层中表达(Clark等,1996;He等,1999),其中,它被认为在滋养层入侵中起作用。有趣的是,Flt1和KDR(Flk1)是由绒膜细胞系BeWo表达的(Charnock-Jones等,1994),而已经证实VEGF能在这些细胞中促进DNA合成和MAP激酶的酪氨酸磷酸化。另外,原发性和转移性卵巢癌不仅能表达高水平的VEGF,而且-除了血管内皮细胞之外-肿瘤细胞本身也能表达KDR和/或Flt1(Boocock等,1995)。以上发现表明,VEGF不仅在肿瘤血管系统的形成和保持中起着关键作用,而且至少在来自生殖系统的某些肿瘤中VEGF可以增强自分泌作用,直接支持肿瘤细胞的存活和繁殖。因此,能够抑制VEGF作用的试剂特别适用于治疗生殖来源的肿瘤。
方法和结果
(a)VEGF诱导的子宫通透性过高
皮下注射(5IU)怀孕母体血清促性腺激素(PMSG),诱导青春期前的雌性大鼠排卵。这会导致雌激素在2天之后升高,从而进一步导致在子宫中诱导VEGF。据报导,这种诱导会导致6小时之后子宫通透性过高和子宫湿重量增加,因此有可能通过修饰过的Flt受体Flt1(1-3)Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)阻断。在该活体模型中,大鼠子宫的正常重量大约为50毫克,并且可以通过PMSG将其诱导至300-350毫克。组织解剖发现,这些重量全都是水的重量。在注射PMSG1小时之后注射25毫克/千克Flt1(1-3)Fc(A40)、Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)和Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a),可导致子宫湿重量增加大约50%的抑制。提高修饰过的FTL受体的剂量不会进一步降低湿重量的增加,这表明该模型存在一种不取决于VEGF的因子。该实验的结果如图41所示。
(a)用孕酮作为输出结果评估黄体血管生成
皮下注射(5IU)怀孕母体血清促性腺激素(PMSG),诱导青春期前的雌性大鼠排卵。这会导致在4天之后形成含有密集的血管网络的有完整功能的黄体,这样可以将孕酮分泌到血液中,以便使子宫作好受孕的准备。黄体中血管形成的诱导需要VEGF;因此,抑制VEGF可以导致新血管的缺乏,并因此导致分泌到血液中的孕酮的缺乏。在该活体模型中,孕酮的正常水平大约为5纳克/毫升,在PMSG诱导之后可以达到25-40钠克/毫升的水平。在注射PMSG1小时之后皮下注射25毫克/千克或5毫克/千克的Flt1(1-3)Fc(A40)或Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a),会导致在第四天对孕酮诱导的完全抑制。该实验的结果如图42A-42B所示。
例33:Flt1(1-3)Fc(A40)和聚乙二醇化的Flt1(1-3)Fc的药物动力学分析
用10kD或20kD PEG对Flt1(1-3)-Fc进行聚乙二醇化,并在Balb/c小鼠中测试其药物动力学特征。发现这两种聚乙二醇化形式的Flt1(1-3)-Fc都具有优于Flt1(1-3)Fc(A40)的PK曲线,聚乙二醇化的分子的Tmax出现在24小时,而Flt1(1-3)Fc(A40)出现在6小时。
例34:通过VEGF165ELISA测定修饰过的Flt1受体变体的亲和力
在室温下将10pM的VEGF165与160-0.1pM的修饰过的Flt1受体变体一起培养过夜。用于该实验中的修饰过的Flt1受体变体是Flt1(1-3)-Fc、Flt1(1-3)Fc(A40)、瞬时表达的Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)、瞬时表达的Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)、Flt1(1-3NAS)-Fc、Flt1(1-3R→C)-Fc和Tie2-Fc。Flt1(1-3NAS)-Fc是Flt1(1-3)-Fc的修饰形式,其中,强碱性氨基酸序列KNKRASVRRR被NASVNGSR所取代,导致两个新的糖基化位点的插入和5个正电荷的净减少,这样做的目的是为了降低该序列对PK的不利影响。Flt1(1-3R→C)-Fc是一种修饰形式,其中,相同碱性氨基酸序列中的单一的精氨酸(R)残基被换成半胱氨酸(C)(KNKRASVRRR→KNKCASVRRR),以便在该残基上可以进行聚乙二醇化,这样就可以使得该碱性区不对PK产生不利影响。在培养之后,将该溶液转移到含有VEGF165的捕获抗体的平板上(R&D)。然后用一种抗体测定游离VEGF165的量,以便报导游离的VEGF165。结果表明,对VEGF165具有最高亲和力的修饰过的Flt1受体变体(根据游离VEGF165的最低量确定)是Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a),其次是Flt1(1-3)-Fc和Flt1(1-3)-Fc(A40),随后是Flt1(1-3R→C)和Flt1(1-3NAS)-Fc以及Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)。Tie2Fc对VEGF165没有亲和力。
Claims (3)
1.一种融合多肽在制备用于减缓或预防肿瘤生长的药物中的用途,所述融合多肽具有与多聚化成分连接的VEGF受体成分,其中:
(a)所述血管内皮细胞生长因子(VEGF)受体成分是第一种VEGF受体的免疫球蛋白样(Ig)结构域2和第二种VEGF受体的Ig结构域3,并且不包括任何其他VEGF受体结构域;和
(b)所述多聚化成分是免疫球蛋白结构域;并且
(c)所述肿瘤是易受VEGF抑制影响的肿瘤;并且
(d)所述融合多肽的氨基酸序列显示于图21A-21C、图22A-22C或图24A-24C。
2.权利要求1的用途,其中所述融合多肽由选自下列的核酸序列编码:
(a)图21A-21C所示的核苷酸序列;和
(b)图24A-24C所示的核苷酸序列。
3.权利要求1的用途,其中所述融合多肽具有与多聚化成分连接的VEGF受体成分,并且所述融合多肽的氨基酸序列显示于图21A-21C或图24A-24C。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US13813399P | 1999-06-08 | 1999-06-08 | |
US60/138133 | 1999-06-08 | ||
US60/138,133 | 1999-06-08 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB008115443A Division CN100523187C (zh) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | 具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN103349781A CN103349781A (zh) | 2013-10-16 |
CN103349781B true CN103349781B (zh) | 2015-04-01 |
Family
ID=22480568
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN201310118971.1A Expired - Lifetime CN103349781B (zh) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | 具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽 |
CNB008115443A Expired - Lifetime CN100523187C (zh) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | 具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽 |
CN2008101093559A Expired - Lifetime CN101433715B (zh) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | 具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽 |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CNB008115443A Expired - Lifetime CN100523187C (zh) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | 具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽 |
CN2008101093559A Expired - Lifetime CN101433715B (zh) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | 具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽 |
Country Status (33)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1183353B1 (zh) |
JP (2) | JP4723140B2 (zh) |
KR (1) | KR100659477B1 (zh) |
CN (3) | CN103349781B (zh) |
AT (2) | ATE417928T1 (zh) |
AU (2) | AU779303B2 (zh) |
BE (1) | BE2013C029I2 (zh) |
BR (2) | BR0011407A (zh) |
CA (1) | CA2376379C (zh) |
CY (2) | CY1108883T1 (zh) |
CZ (2) | CZ303656B6 (zh) |
DE (2) | DE60019415T2 (zh) |
DK (2) | DK1183353T3 (zh) |
ES (2) | ES2319305T3 (zh) |
FR (1) | FR13C0028I2 (zh) |
HK (3) | HK1043388A1 (zh) |
HR (1) | HRP20010908B1 (zh) |
HU (3) | HU229156B1 (zh) |
IL (3) | IL146890A0 (zh) |
LT (1) | LTC1183353I2 (zh) |
LU (1) | LU92195I2 (zh) |
ME (2) | ME00024B (zh) |
MX (1) | MXPA01012630A (zh) |
NO (3) | NO330775B1 (zh) |
NZ (1) | NZ515913A (zh) |
PL (1) | PL208247B1 (zh) |
PT (2) | PT1183353E (zh) |
RS (1) | RS50073B (zh) |
RU (1) | RU2265661C2 (zh) |
SK (1) | SK287332B6 (zh) |
UA (1) | UA74146C2 (zh) |
WO (1) | WO2000075319A1 (zh) |
ZA (1) | ZA200110068B (zh) |
Families Citing this family (98)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6710174B2 (en) | 2001-09-13 | 2004-03-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression |
US6100071A (en) | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
US7396664B2 (en) | 1999-06-08 | 2008-07-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same |
US7070959B1 (en) | 1999-06-08 | 2006-07-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
US7087411B2 (en) * | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
US6833349B2 (en) * | 1999-06-08 | 2004-12-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating inflammatory skin diseases |
DE60219419T2 (de) | 2001-01-19 | 2007-08-16 | Ludwig Institute For Cancer Research | Flt4 (vegfr-3) als ein ziel für krebsdarstellung und anti-krebs-behandlung |
US6734017B2 (en) | 2001-09-28 | 2004-05-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression |
ATE500842T1 (de) | 2002-05-04 | 2011-03-15 | Acorda Therapeutics Inc | Zusammensetzungen und verfahren zur förderung des neuronalen wachstums |
ATE354592T1 (de) * | 2003-03-28 | 2007-03-15 | Regeneron Pharma | Vegf-antagonisten zur behandlung von diabetes |
CA2525782C (en) * | 2003-05-16 | 2019-02-05 | Acorda Therapeutics, Inc. | Degradation of glycosaminoglycans in extracellular matrix to treat cns injury |
ES2887949T3 (es) | 2003-05-16 | 2021-12-29 | Acorda Therapeutics Inc | Mutantes degradantes de proteoglicanos para el tratamiento del SNC |
US7959914B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-06-14 | Acorda Therapeutics, Inc. | Methods of reducing extravasation of inflammatory cells |
US7300653B2 (en) | 2003-05-28 | 2007-11-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating corneal transplant rejection |
US7186699B2 (en) | 2003-06-03 | 2007-03-06 | Cell Genesys, Inc. | Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes |
WO2004110490A2 (en) * | 2003-06-06 | 2004-12-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of vegf inhibitors for tumor regression |
US7399612B2 (en) | 2003-06-30 | 2008-07-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same |
AR046510A1 (es) | 2003-07-25 | 2005-12-14 | Regeneron Pharma | Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo |
AU2004264891A1 (en) * | 2003-08-06 | 2005-02-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of a VEGF antagonist in combination with radiation therapy |
JP4926962B2 (ja) | 2004-05-18 | 2012-05-09 | アコーダ セラピューティクス、インク. | コンドロイチン分解酵素とその安定な製剤の精製法 |
PT1767546E (pt) * | 2004-06-08 | 2012-03-20 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co Ltd | Proteína quimérica inibidora da angiogénese e utilização |
CA2567686A1 (en) | 2004-06-10 | 2005-12-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of vegf inhibitors for the treatment of human cancer |
AU2005265071A1 (en) * | 2004-06-18 | 2006-01-26 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | VEGF inhibitors for the treatment of malignant pleural effusion |
CN1997386B (zh) | 2004-07-30 | 2012-05-30 | 瑞泽恩制药公司 | 通过阻断vegf介导的活性来治疗i型糖尿病的方法 |
DK2229956T3 (da) | 2004-09-13 | 2013-07-29 | Genzyme Corp | Multimere konstruktioner |
FR2878749B1 (fr) * | 2004-12-03 | 2007-12-21 | Aventis Pharma Sa | Combinaisons antitumorales contenant en agent inhibiteur de vegt et du 5fu ou un de ses derives |
US7303748B2 (en) | 2005-02-02 | 2007-12-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating eye injury with local administration of a VEGF inhibitor |
DK1861116T3 (en) | 2005-03-25 | 2015-11-09 | Regeneron Pharma | VEGF antagonist formulations |
AU2006294755B2 (en) | 2005-09-26 | 2012-04-19 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using chondroitinase ABCI mutants |
WO2007070671A2 (en) † | 2005-12-16 | 2007-06-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with dll4 antagonists |
FR2895258B1 (fr) | 2005-12-22 | 2008-03-21 | Aventis Pharma Sa | Combinaison comprenant de la combretastatine et des agents anticancereux |
US8216575B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-07-10 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. | Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains |
CN100502945C (zh) * | 2006-03-31 | 2009-06-24 | 成都康弘生物科技有限公司 | Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用 |
EP3753548A1 (en) | 2006-06-16 | 2020-12-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration |
DK2066694T3 (en) | 2006-09-29 | 2016-02-08 | Oncomed Pharm Inc | Compositions and Methods for Diagnosing and Treating Cancer |
CA2666536C (en) | 2006-10-10 | 2018-08-07 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants |
FR2918279B1 (fr) * | 2007-07-05 | 2010-10-22 | Aventis Pharma Sa | Combinaisons antitumorales contenant un agent inhibiteur de vegf et de l'irinotecan |
CN101575379B (zh) * | 2008-05-09 | 2012-05-30 | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 | 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途 |
JP5954990B2 (ja) | 2008-11-03 | 2016-07-20 | モレキュラー・パートナーズ・アーゲーMolecular Partners Ag | Vegf−aレセプター相互作用を阻害する結合タンパク質 |
CN101838329A (zh) * | 2009-03-18 | 2010-09-22 | 嘉和生物药业有限公司 | 抗血管新生融合蛋白 |
PT2488204E (pt) | 2009-10-16 | 2016-06-09 | Oncomed Pharm Inc | Combinação terapêutica e utilização de anticorpos antagonistas de dll4 e agentes anti-hipertensivos |
AR081361A1 (es) * | 2010-04-30 | 2012-08-29 | Molecular Partners Ag | Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a |
US9441029B2 (en) | 2010-08-06 | 2016-09-13 | Genzyme Corporation | VEGF antagonist compositions and uses thereof |
US20140080153A1 (en) * | 2011-01-07 | 2014-03-20 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Method for improving physical properties of antibody |
SG10201509193UA (en) | 2011-01-13 | 2015-12-30 | Regeneron Pharma | Use of a vegf antagonist to treat angiogenic eye disorders |
JO3283B1 (ar) | 2011-04-26 | 2018-09-16 | Sanofi Sa | تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI) |
KR101397088B1 (ko) | 2011-06-10 | 2014-05-19 | 강원대학교산학협력단 | 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물 |
JO3370B1 (ar) * | 2011-11-10 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6 |
DK2785744T3 (da) | 2011-12-01 | 2017-11-27 | Innovent Biologics Inc | Proteininhibitorer til komplement- og vegf-pathways og fremgangsmåder til anvendelse deraf |
CN103304668B (zh) * | 2012-03-12 | 2015-10-28 | 江苏健德生物药业有限公司 | Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制备方法及其应用 |
EP3646880A1 (en) | 2012-05-07 | 2020-05-06 | Allergan, Inc. | Method of treating amd in patients refractory to anti-vegf therapy |
WO2014006113A1 (en) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Sanofi | Method of treating cancer by effective amounts of aflibercept |
AR093445A1 (es) | 2012-11-14 | 2015-06-10 | Regeneron Pharma | Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4 |
WO2014124487A1 (en) | 2013-02-18 | 2014-08-21 | Vegenics Pty Limited | Ligand binding molecules and uses thereof |
AR095196A1 (es) * | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
CN104193828B (zh) * | 2013-09-12 | 2017-04-05 | 北京韩美药品有限公司 | 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白 |
CA2927012A1 (en) | 2013-11-05 | 2015-05-14 | Allergan, Inc. | Method of treating conditions of the eye with an anti-vegf darpin |
EP3492495A1 (en) | 2014-05-12 | 2019-06-05 | Formycon AG | Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist |
ES2732925T3 (es) | 2014-07-18 | 2019-11-26 | Sanofi Sa | Método para predecir el resultado de un tratamiento con aflibercept de un paciente que se sospecha que padece un cáncer |
JP2016036322A (ja) * | 2014-08-11 | 2016-03-22 | 日本化薬株式会社 | 血管新生因子と結合するキメラタンパク質 |
WO2016094673A1 (en) | 2014-12-11 | 2016-06-16 | Bayer Healthcare Llc | Treatment of age related macular degeneration with a small active choroidal neovascularization lesion |
GB201503453D0 (en) | 2015-03-01 | 2015-04-15 | Jain Arjun | Endothelin-1"sponge" |
TW202330904A (zh) | 2015-08-04 | 2023-08-01 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
WO2017046140A1 (en) | 2015-09-18 | 2017-03-23 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia |
WO2017065559A1 (ko) | 2015-10-15 | 2017-04-20 | (주)알테오젠 | Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
KR101936049B1 (ko) * | 2015-10-15 | 2019-01-08 | (주)알테오젠 | IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
WO2017085253A1 (en) | 2015-11-18 | 2017-05-26 | Formycon Ag | Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist |
JP7430485B2 (ja) | 2015-11-18 | 2024-02-13 | エスアイオーツー・メディカル・プロダクツ・インコーポレイテッド | 眼科用製剤のための薬剤パッケージ |
RU2734958C2 (ru) | 2015-11-18 | 2020-10-26 | Формикон Аг | Предварительно заполненная фармацевтическая упаковка, содержащая жидкий состав на основе антагониста vegf |
CA3005391A1 (en) * | 2015-11-19 | 2017-05-26 | Zhuhai Tairuishang Biopharm Ltd. | Methods and compositions for binding vegf |
KR102343004B1 (ko) | 2015-12-03 | 2021-12-24 | 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 | 항-vegf로 치료된 연령-관련 황반 변성을 앓고 있는 환자에서의 임상 결과와 유전적 변이체를 연관시키는 방법 |
JP6953433B2 (ja) | 2016-01-26 | 2021-10-27 | フォーマイコン アーゲーFormycon Ag | Vegfアンタゴニストを含む液体医薬組成物および同医薬組成物を含有する充填済みシリンジ |
EP3527225A4 (en) | 2016-10-12 | 2020-06-10 | Daiichi Sankyo Company, Limited | COMPOSITION CONTAINING ANTI-ROBO4 ANTIBODY AND OTHER AGENT |
JP7116059B2 (ja) | 2016-11-21 | 2022-08-09 | ジャスト-エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド | アフリベルセプト製剤及びその使用 |
WO2018215580A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Formycon Ag | Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist |
EP3630043A1 (en) | 2017-05-24 | 2020-04-08 | Formycon AG | Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist |
CA3063995A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Sio2 Medical Products, Inc. | Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations |
TW201904610A (zh) | 2017-06-14 | 2019-02-01 | 德商拜耳製藥公司 | 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑 |
WO2019020777A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Formycon Ag | LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST |
EP3668985B1 (en) | 2017-08-17 | 2021-06-16 | Just-Evotec Biologics, Inc. | Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants |
JP7183268B2 (ja) | 2017-11-20 | 2022-12-05 | ジャスト-エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド | 等張化剤としてリジン塩を含有するアフリベルセプト製剤及びその使用 |
JP7184894B2 (ja) | 2017-11-27 | 2022-12-06 | 4ディー モレキュラー セラピューティクス インコーポレイテッド | アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用 |
EP4279135A3 (en) | 2017-11-30 | 2024-02-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of a vegf antagonist to treat diabetic retinopathy |
EA039731B1 (ru) | 2017-12-13 | 2022-03-04 | Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. | Устройства и системы для управления опорой слоя сорбента хроматографической колонки и связанные с ними способы |
CN116059318A (zh) | 2018-01-26 | 2023-05-05 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于使用抗vegf剂治疗血管生成病症的方法和组合物 |
MA52570A (fr) | 2018-05-10 | 2021-03-17 | Regeneron Pharma | Formulations contenant des protéines de fusion du récepteur vegf à haute concentration |
US11519020B2 (en) | 2018-05-25 | 2022-12-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF |
CN111378044B (zh) | 2018-12-28 | 2022-07-15 | 长春金赛药业有限责任公司 | 抗体融合蛋白、制备方法及其应用 |
US20220204920A1 (en) | 2019-05-16 | 2022-06-30 | Formycon Ag | Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins |
WO2021046070A1 (en) | 2019-09-03 | 2021-03-11 | Amgen Inc. | Injection device for drug delivery and packaging for the injection device |
WO2021056020A1 (en) | 2019-09-16 | 2021-03-25 | Amgen Inc. | Method for external sterilization of drug delivery device |
CN114786731A (zh) | 2019-10-10 | 2022-07-22 | 科达制药股份有限公司 | 治疗眼部病症的方法 |
BR112022010113A2 (pt) | 2019-11-25 | 2022-09-06 | Univ California | Inibidores de vegf de longa ação para neovascularização intraocular |
US20230063116A1 (en) | 2019-12-06 | 2023-03-02 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vegf mini-traps and method of use thereof |
AU2020397865C1 (en) * | 2019-12-06 | 2023-04-27 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Anti-VEGF protein compositions and methods for producing the same |
CA3167020A1 (en) | 2020-02-24 | 2021-09-02 | Amgen Inc. | Containers and systems for use during external sterilization of drug delivery devices |
EP4145456A1 (en) | 2021-09-06 | 2023-03-08 | Bayer AG | Prediction of a change related to a macular fluid |
KR20240019034A (ko) * | 2022-08-02 | 2024-02-14 | 주식회사 파노로스바이오사이언스 | 변형된 융합 단백질 및 이의 용도 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1158144A (zh) * | 1994-08-26 | 1997-08-27 | 赫彻斯特股份公司 | 利用内皮细胞特异性的、细胞周期依赖性的活性化合物对肿瘤进行基因治疗 |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6100071A (en) * | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
-
2000
- 2000-05-23 AT AT05001328T patent/ATE417928T1/de active
- 2000-05-23 BR BR0011407-3A patent/BR0011407A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 JP JP2001502582A patent/JP4723140B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 AU AU50404/00A patent/AU779303B2/en active Active
- 2000-05-23 UA UA2001128378A patent/UA74146C2/uk unknown
- 2000-05-23 EP EP00932721A patent/EP1183353B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 DK DK00932721T patent/DK1183353T3/da active
- 2000-05-23 CZ CZ20100386A patent/CZ303656B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 WO PCT/US2000/014142 patent/WO2000075319A1/en active Application Filing
- 2000-05-23 ME MEP-2008-32A patent/ME00024B/me unknown
- 2000-05-23 RS YUP-869/01A patent/RS50073B/sr unknown
- 2000-05-23 BR BRPI0011407A patent/BRPI0011407B8/pt unknown
- 2000-05-23 AT AT00932721T patent/ATE293164T1/de active
- 2000-05-23 PT PT00932721T patent/PT1183353E/pt unknown
- 2000-05-23 KR KR1020017015839A patent/KR100659477B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 PL PL352246A patent/PL208247B1/pl active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 PT PT05001328T patent/PT1544299E/pt unknown
- 2000-05-23 NZ NZ515913A patent/NZ515913A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 DK DK05001328T patent/DK1544299T3/da active
- 2000-05-23 CN CN201310118971.1A patent/CN103349781B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 ES ES05001328T patent/ES2319305T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 MX MXPA01012630A patent/MXPA01012630A/es active IP Right Grant
- 2000-05-23 CN CNB008115443A patent/CN100523187C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 ES ES00932721T patent/ES2237429T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 EP EP05001328A patent/EP1544299B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CZ CZ20014387A patent/CZ302689B6/cs unknown
- 2000-05-23 DE DE60019415T patent/DE60019415T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 IL IL14689000A patent/IL146890A0/xx unknown
- 2000-05-23 SK SK1752-2001A patent/SK287332B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 RU RU2002100071/13A patent/RU2265661C2/ru active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 HU HU0201515A patent/HU229156B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 HU HU1300086A patent/HU230159B1/hu unknown
- 2000-05-23 CA CA002376379A patent/CA2376379C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CN CN2008101093559A patent/CN101433715B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 ME MEP-32/08A patent/MEP3208A/xx unknown
- 2000-05-23 DE DE60041159T patent/DE60041159D1/de not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-12-03 IL IL146890A patent/IL146890A/en active Protection Beyond IP Right Term
- 2001-12-06 ZA ZA200110068A patent/ZA200110068B/xx unknown
- 2001-12-07 HR HR20010908A patent/HRP20010908B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-12-10 NO NO20016036A patent/NO330775B1/no active Protection Beyond IP Right Term
-
2002
- 2002-07-04 HK HK02105009A patent/HK1043388A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-03-31 AU AU2005201365A patent/AU2005201365B2/en not_active Expired
-
2008
- 2008-03-17 IL IL190234A patent/IL190234A0/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-03-16 CY CY20091100288T patent/CY1108883T1/el unknown
- 2009-11-05 HK HK09110323.8A patent/HK1132653A1/xx unknown
-
2010
- 2010-05-06 NO NO20100656A patent/NO332559B1/no not_active IP Right Cessation
- 2010-10-06 JP JP2010226970A patent/JP5273746B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-05-13 CY CY2013019C patent/CY2013019I1/el unknown
- 2013-05-13 BE BE2013C029C patent/BE2013C029I2/fr unknown
- 2013-05-14 LU LU92195C patent/LU92195I2/fr unknown
- 2013-05-14 FR FR13C0028C patent/FR13C0028I2/fr active Active
- 2013-05-14 LT LTPA2013009C patent/LTC1183353I2/lt unknown
- 2013-05-15 NO NO2013010C patent/NO2013010I1/no unknown
- 2013-09-17 HU HUS1300052C patent/HUS1300052I1/hu unknown
- 2013-11-26 HK HK13113191.5A patent/HK1185798A1/zh unknown
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN1158144A (zh) * | 1994-08-26 | 1997-08-27 | 赫彻斯特股份公司 | 利用内皮细胞特异性的、细胞周期依赖性的活性化合物对肿瘤进行基因治疗 |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN103349781B (zh) | 具有改善的药物动力学特性的修饰嵌合多肽 | |
US8343737B2 (en) | Cell culture compositions capable of producing a VEGF-binding fusion polypeptide | |
CA2588221C (en) | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
C06 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
C10 | Entry into substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: DE Ref document number: 1185798 Country of ref document: HK |
|
C14 | Grant of patent or utility model | ||
GR01 | Patent grant | ||
REG | Reference to a national code |
Ref country code: HK Ref legal event code: GR Ref document number: 1185798 Country of ref document: HK |
|
CX01 | Expiry of patent term |
Granted publication date: 20150401 |
|
CX01 | Expiry of patent term |