HU229156B1 - Modifield chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties - Google Patents
Modifield chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties Download PDFInfo
- Publication number
- HU229156B1 HU229156B1 HU0201515A HUP0201515A HU229156B1 HU 229156 B1 HU229156 B1 HU 229156B1 HU 0201515 A HU0201515 A HU 0201515A HU P0201515 A HUP0201515 A HU P0201515A HU 229156 B1 HU229156 B1 HU 229156B1
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- flt1
- vegf
- protein
- domain
- receptor
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims description 61
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 61
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims description 61
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 83
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 43
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 43
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 37
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims description 34
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 34
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 31
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 9
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 9
- 101150009958 FLT4 gene Proteins 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 4
- 102000016663 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Human genes 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 claims description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 3
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 claims description 2
- 208000037259 Amyloid Plaque Diseases 0.000 claims 1
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims 1
- 230000003156 vasculitic effect Effects 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 148
- 101150048336 Flt1 gene Proteins 0.000 description 141
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 130
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 128
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 description 87
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 description 87
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 87
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 86
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 68
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 68
- 101100083342 Mus musculus Picalm gene Proteins 0.000 description 40
- 101100018718 Rattus norvegicus Il1rl1 gene Proteins 0.000 description 40
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 33
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 32
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 32
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 31
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 description 28
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 25
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 25
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 25
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 24
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 21
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 19
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 19
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 18
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 18
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 17
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 17
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 17
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 16
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 16
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 15
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 14
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 14
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 14
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 14
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 13
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 13
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 13
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 13
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 13
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 13
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 13
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 12
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 11
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 11
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 11
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 11
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 10
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 9
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 9
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 9
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 9
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 9
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 101150088608 Kdr gene Proteins 0.000 description 8
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 8
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 8
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 8
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 8
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 8
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 7
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 7
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 7
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 7
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 7
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 7
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 7
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 230000006870 function Effects 0.000 description 6
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 6
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 6
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 6
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 6
- 230000001603 reducing effect Effects 0.000 description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 6
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 5
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 5
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 5
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 5
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 5
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 5
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 5
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 4
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 4
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 description 4
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 description 4
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 description 4
- 102100025085 Zinc finger MYM-type protein 2 Human genes 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 3
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 3
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 3
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- JWPRTLPEVKPSEG-UHFFFAOYSA-N [6'-acetyloxy-6-[3-[3-[4-(1-methylindol-3-yl)-2,5-dioxopyrrol-3-yl]indol-1-yl]propylcarbamoyl]-3-oxospiro[2-benzofuran-1,9'-xanthene]-3'-yl] acetate Chemical compound C1=C(C=2C(NC(=O)C=2C=2C3=CC=CC=C3N(C)C=2)=O)C2=CC=CC=C2N1CCCNC(=O)C(C=C12)=CC=C2C(=O)OC21C1=CC=C(OC(C)=O)C=C1OC1=CC(OC(=O)C)=CC=C21 JWPRTLPEVKPSEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 3
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 3
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 3
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 3
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 101100445049 Caenorhabditis elegans elt-1 gene Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000581364 Clinitrachus argentatus Species 0.000 description 2
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000893493 Homo sapiens Protein flightless-1 homolog Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000976924 Inca Species 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 2
- 101150056950 Ntrk2 gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 102100040923 Protein flightless-1 homolog Human genes 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 2
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 2
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 2
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 230000002297 mitogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 2
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 230000002294 pubertal effect Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 201000011453 reproductive organ cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000028466 reproductive system neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004509 serum gonadotrophin Drugs 0.000 description 2
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 2
- 239000004575 stone Substances 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 2
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002525 vasculotropin inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 2
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- XWGJDUSDTRPQRK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O XWGJDUSDTRPQRK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N Asn-Thr-Ile Chemical group [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ala Chemical group [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100381481 Caenorhabditis elegans baz-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100489581 Caenorhabditis elegans par-5 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100408676 Caenorhabditis elegans pmt-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 201000005488 Capillary Leak Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006332 Choriocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000016989 Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010000063 Ciliary Neurotrophic Factor Receptor Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010010099 Combined immunodeficiency Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 101100298295 Drosophila melanogaster flfl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100036990 Fat storage-inducing transmembrane protein 1 Human genes 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 206010017472 Fumbling Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 206010018092 Generalised oedema Diseases 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N Gly-Pro-Gly Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 229920002527 Glycogen Polymers 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 102100026122 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Human genes 0.000 description 1
- 101710182312 High affinity immunoglobulin gamma Fc receptor I Proteins 0.000 description 1
- 101000878236 Homo sapiens Fat storage-inducing transmembrane protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000856513 Homo sapiens Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LLZLRXBTOOFODM-QSFUFRPTSA-N Ile-Asp-Val Chemical group CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N LLZLRXBTOOFODM-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 102100025509 Inactive N-acetyllactosaminide alpha-1,3-galactosyltransferase Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- 240000006240 Linum usitatissimum Species 0.000 description 1
- 235000004431 Linum usitatissimum Nutrition 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 102100035971 Molybdopterin molybdenumtransferase Human genes 0.000 description 1
- 101710119577 Molybdopterin molybdenumtransferase Proteins 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 101100494367 Mus musculus C1galt1 gene Proteins 0.000 description 1
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M Propionate Chemical compound CCC([O-])=O XBDQKXXYIPTUBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010037867 Rash macular Diseases 0.000 description 1
- 101100496572 Rattus norvegicus C6 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100372762 Rattus norvegicus Flt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 235000001537 Ribes X gardonianum Nutrition 0.000 description 1
- 235000001535 Ribes X utile Nutrition 0.000 description 1
- 235000016919 Ribes petraeum Nutrition 0.000 description 1
- 244000281247 Ribes rubrum Species 0.000 description 1
- 235000002355 Ribes spicatum Nutrition 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- 101100120142 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) FIR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N Ser-Asp-Thr Chemical group [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 208000031932 Systemic capillary leak syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 208000009443 Vascular Malformations Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 description 1
- 229940126157 adrenergic receptor agonist Drugs 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 150000001448 anilines Chemical class 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 1
- 210000000227 basophil cell of anterior lobe of hypophysis Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229940077737 brain-derived neurotrophic factor Drugs 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000000621 bronchi Anatomy 0.000 description 1
- 235000014121 butter Nutrition 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 1
- 238000004891 communication Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000002254 contraceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000002920 convulsive effect Effects 0.000 description 1
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 210000004207 dermis Anatomy 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 150000002019 disulfides Chemical class 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 201000003511 ectopic pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 230000009881 electrostatic interaction Effects 0.000 description 1
- 201000003914 endometrial carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 1
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 1
- 230000006203 ethylation Effects 0.000 description 1
- 238000006200 ethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 101150112906 fitm-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 229940096919 glycogen Drugs 0.000 description 1
- 125000003827 glycol group Chemical group 0.000 description 1
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 238000009499 grossing Methods 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 210000003958 hematopoietic stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 230000000938 luteal effect Effects 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 1
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000003607 modifier Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002107 myocardial effect Effects 0.000 description 1
- 108010065781 myosin light chain 2 Proteins 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004498 neuroglial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000006576 neuronal survival Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002611 ovarian Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000008823 permeabilization Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 1
- 230000028742 placenta development Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 108700001787 polyethylene glycol-modified interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000006259 progesterone secretion Effects 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- NIFIFKQPDTWWGU-UHFFFAOYSA-N pyrite Chemical compound [Fe+2].[S-][S-] NIFIFKQPDTWWGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052683 pyrite Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011028 pyrite Substances 0.000 description 1
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 1
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011808 rodent model Methods 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000009747 swallowing Effects 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002381 testicular Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940124598 therapeutic candidate Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 230000006492 vascular dysfunction Effects 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Toxicology (AREA)
Description
A jelen találmány tárgyát javított farmakokinetíkával rendelkező módosított poiipeptidek képezik. Pontosabban, a jelen találmány tárgyát olyan Flt1 receptor polipeptidek képezik, amiket ügy módosítottunk, hogy javítsuk a farmakokinetikai profiljukat, A jelen találmány tárgyát képezik továbbá a módosított polipeptidek előállítási és alkalmazási eljárásai, beleértve, de anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a módosított poiipepfldekvhasznáiatét a plazma-szivárgás és/vagy vaszkuláhs permeabiíitás kezelésére emlősben.
A polipeptíd Íigandumok sejtekhez való kötődésének képességét, és ezzel fenofipusos válasz, azaz például sejtnövekedés, túlélés, selttermék szekréció, vagy dlfferenciáció kiváltásét gyakran a sejteken levő transzmembrán receptorok közvetítik. Az ilyen receptorok extraeelluláris doménjeí (azaz a receptornak az a része, ami a sejt felszínén mutatkozik) általában a legjellegzetesebb részei a molekulának, mivel a fehérjét a ügandumkőtö jellemzőjével biztosiba. Egy ligandumnak az extraeelluláris doménhez való kötődése általában jelátvitelt eredményez, ami eljuttatja a biológiai jelet az Inlraceltuláhs célponthoz. Ez a jelátvitel gyakran egy katalitikus íniraceiíulárís döménen keresztel hat, E katalitikus iniraeeiiuláns dómén szekvencia-motívumainak adott elrendeződése meghatározza a potenciális kínáz szuhsztráfokhoz való hozzáférését [Mohammadi és mtsai: Molecular & Cellular Biology 11, 5068-5078 (1990); Fant! és mtsai: Celi 89, 413-413 (1992)). A jelet a katalitikus intrecel íulárls döménen keresztül továbbító receptorok közé tartoznak például a tlrozin kinéz receptorok (RTK), azaz például a receptorok Trk .családja,, amik általában az ideg rendszer sejtjeire korlátozódnak, a receptorok eítokin családja, beleértve a háromrészes CNTF receptor komplexet [Stahí & Yancopoulos: J, Neurobio, 25, 1454-1488 (1994)), ami szintén általában az idegrendszer sejtjeire korlátozódik, a G-fehérjéhez kapcsolt receptorok, azaz például a &2sdrenerg receptor, ami például a szívizomsejteken található, és az FcaRI multímer IgE magas affinitású receptor, ami például az árbocsejteken és a bazoáleken található (Sution & Gould; Natúré 388, 421-428 (1993»,
Az eddig definiált összes receptor dlmehzáeión, multlmerlzácíón. vagy néhány rokon konformációs változáson megy át a lígandum kötődése után (Schíessinger, J.; Trends Elochem. Sci. 13, 443-447 (1988); Ullhch & Sohlessingen Celi §1, 203-212 (1999); Sclessinger .& Ullhch: Neuron 9, 383-391 (1992)), és a dimerizálódó Intraceiluiárís döfnének közötti molekuláris kölcsönhatások a katalitikus funkció aktiválódásához vezetnek. Néhány esetben, azaz például a vérlemezke eredetű növekedési faktor (PDGF) esetében a ligandum egy dímer, ami két receptor molekulát köt meg (Hah és mtsai: Science 240, 1529-1531 (1988); Heldin: Journal of BioSogical Chemistry 284, 8905-8912 (1989)), míg például az epl♦ ♦·* »
derroálís növekedési faktor (EGF) esetében a ligandum egy monomer (Weber és fntsái: Journal of Bioiogicai Chemistry 259, 14831-14630 (1984)}. Az FcsRI receptor esetében a ligandum, az IgE az FceRi-hez kötődve létezik monomer módon, és csak aktiválódik, amikor az antigén az IgE/FcsRI recepforköroplexhez kötődik, és keresztkötést hoz létre a szomszédos IgE molekulával [Sution & Goufd.: Natúré 388, 421-428 (1993)}.
Egy adott receptor szöveti eloszlása egy raagasabbrandő szervezetben gyakran betekintést biztosit a receptor biológiai funkcióiába. Néhány növekedési és differenciálódási faktor, azaz például a fibroblaszt növekedési faktor (FGF) RTK-1 széles körben expresszálődnak, és ezért úgy tűnik, hogy valami általános szerepet játszanak a szövetek növekedésében és fenntartásában. A receptorok Trk RTK családjának tagjai sokkal Inkább az idegrendszer sejtjeire korlátozódnak, és az Idegnövekedési faktor család, amibe az idegnövekedési faktor, az agyi eredetű neurotróf faktor (BBNF), a neurotrofin-3 (NT-3) és a naurotrofin-4/5 (NT-4/5) tartozik, ami kötődik a Trk RTK család receptorokhoz, elősegíti a nauronofc különböző csoportjainak a differenciálódását az agyban és a periférián [Lindsay, R.M.: Neurotroph Facfors, 257-284. oldal, szerk.: SE. Loughiin &J,H. Falion, San Diego, CA, Academic Press (1993)]. Az FeaRI nagyon korlátozott számú sejttípusra Íokaiizáiödik, azaz például az árbocsejtekre és a bazofílekre. Az árbocsejtek a csontvelő plunpofsns hemalopoiefikus őssejt vonalából származnak, de érésüket a szövetben fejezik be, a véráramból való elvándorlás után [Janeway 8. Travers: Immunobioiogy, 2. kiadás, 1:3-1:4 oldal, szerk.: M. Robertson & E. Lawrence, Current Biology Ltd., London, UK Publlsber (1898)}, és az allergiás válaszban játszanak szerepet.
Számos vizsgáiban demonstrálták, hogy egy receptor extraceíiuíáris doménje biztosítja a specifikus ligandumkotő jellemzőket. Emellett, a ceiiulárls környezet, amiben a receptor expresszálódik, befolyásolhatja a biológiai választ, ami egy Iigandumnak a receptorhoz való kötődése során alakul ki. Ha például egy Trk receptort expresszálő neuronális sejtet egy neurotroflnnai hozunk érintkezésbe, ami kötődik ehhez a receptorhoz, ennek neuronális túlélés és différenoiáciő az eredménye. Ha ugyanezt a receptort egy fibroblaszt expresszáija, akkor a neurotroflnnai való érintkezés a fibroblaszt szaporodását eredményezheti (Glass és mtsai: Celi 88,405-413 (1991)].
Azonosították a sejt-eredetű dimer mitogének egy osztályát, ami a vaszkuláhs endoteliális sejtekre szelektív, ezek elnevezése endoteliális sejtnővekedési faktor (VEGE). A VEGF-et patkány gliőmasejtek kondicionált táptalajából IConn és mtsai: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 87, 2528-2832 (1990)], valamint szarvasmarha hipofízis tüsző csillagos sejtek kondicionált táptalajából [Ferrera és Hemzei: Bioehemicai and BiOphysical Research Communications 161, 851-858 (1989): Gozpadorowicy és mtsal: Proceedings of the National Academy of Sciences, USA 86, 7311-7315 (1989)}, valamint humán U937 sejtek kondicionált növekedési táptalajából tisztították [Connoliy, D.T. és mtsai: Science 248, 1308-1312 (1989)}, A VEGE egy dimer, látszólagos molekulasúlya körülbelül
kDa,. és az egyes- alegységek látszólagos molekulasúlya körülbelül 23 kDa. A VEGF-nak vannak bizonyos szerkezeti hasonlóságai a vérlemezke eredetű növekedést faktorral (PBGF), ami mitogén hatású a kötőszövet! sejtekre, de nem mitogén a nagy vérerekből származó vaszkuláris endoteiiális sejtekre.
A membránhoz kötött tirozin klnáz receptorról, ami Fit néven ismert, kimutatták, hogy egy VEGF receptor (DeVries, C. és mtsai: Science 255, 989-991 (1992)]- Az Fit receptor specifikusan· kötődik a VEGF-hez, ami mitogenezist Indukál. A VEGF receptor egy másik formájáról, ennek jele KDR, szintén ismert, hogy kötődik a VEGF-hez, és mitogenezist indukál, A KOR részleges cDNS szekvenciája és közei teljes fehérjeszekvenciája is ismert (Termán,
B. és mtsai: Oncogene 8, 1877-1883 (1991); Termán, 8. I, és mtsai: Bíoohemical and Biophysicai Research Communications 187, 1579-1588 (1982)].
Az állandó anglogenezís okozhat vagy súlyosbíthat bizonyos betegségeket, azaz például a pszoriázist, a reumás arthritist, a hemangiomákat az angiofibromákal, a dlabeleszes refinopátiát és a neovaszkuláris glaukómát. A VEGF aktivitás egy inhibitora jói használható lehet az ilyen betegségek kezelésében, valamint más VEGF-fei indukált patológiás engiogenezisekben és vaszkuláris permeabilltásí állapotokban, azaz például a tumor vaszkularizáclöban. A jelen találmány tárgyát egy olyan VEGF Inhibitor képezi, ami az Fitt VEGE receptoron alapul.
A plazma-szivárgás, ami a gyulladás egy kuicskomponense, a mikroetek egy alcsoportjában fordul elő. Pontosabban, a legtöbb szervben a plazma-szivárgás specifikusan a vékony erekben lép fel, A kis ütőerektől és kapillárisoktól eltérően a vékony erek számos különböző gyulladás médiatárra - beleértve a hlsztamlnt, brsdikinint és szerotonint - adott válaszként kezdenek szivárogni. A gyulladás egyik jellemzője a plazma-szivárgás, ami a kis erek endotéiiumán kialakuló intercellüiáris lukakbói származik. A gyulladás legtöbb kísérleti modellje azt mutatja, hogy ezek az intercelíuiáris Iukak a posztkapiHaris és gyűjtő kis erek endoteiiális sejtjei között alakul ki (Baiuk, P. és mtsai: Am. J. Pathol, 152, 1463-1478 (1998)], Kimutatták, hogy néhány Iektin arra használható, hogy a plazma-szivárgás pontjainak, az endoteiiális lukaknak és az ujj-szerű folyamatoknak a tulajdonságait ki lehessen mutatni a gyulladt kis erek endoteiiális sejthatáraín (Thurston, G. és mtsai: Am. J. Physioi. 271. H254782 (1998)]. Pontosabban, növényi léktineket használtak például a patkány hörgők gyulladásos kis ereinek endoteiiális sejthatáraín levő morfológiai változások láthatóvá tételére. A iektinek, mint például a konkanavalin A és a hóin, amik fokáiisan kötődnek a gyulladásos kis erekhez, megmutatják a szub-endotetiáils érfalnak a iukak által kitakart régiéit, amik megfelelnek a plazma-szivárgás pontjainak [Thurston; G. és mtsai: Am. J. Physioi. 271, R2547-82 (199811
A míkroerek tulajdonságai dinamikusak, A krónikus gyulladásos betegségek például a mikrovaszkuláris átrendeződéshez kapcsolódnak, beleértve az angiogenezist és a mikroér megnagyobbodást. A mikroerek úgy is átrendeződhetnek, hogy abnormális fenofípusos tu~ ♦ *'·♦· « ** < ♦ ♦♦ íajdonságokkal rendelkezzenek. A krónikus légúti gyulladás egy rágcsáló modelljében a légűt kapillárisai felveszik a kis erek tulajdonságait, beleértve a kiszélesedett ér-átmérői, a von Willebrand faktorral szembeni megnőtt immupreaktivitásf, és a P-selecíinnel szembeni megnőtt ímmunreaktivitásí. Emellett ezek az átrendeződött erek a gyulladásos medlátorok hatására szivárogni kezdenek, míg a normális egerek légútiénak azonos pozíciójában levő erek nem kezdenek szivárogni.
Néhány anyagról kimutatták, hogy csökkenti vagy gátolja a vaszkuláris permeabiíítást és/vagy plazma-szivárgást. A mystixinek például szintetikus polípeptidek, amikről leírták, hogy gátolják a plazma-szivárgást, anélkül hogy blokkolnák az endoteiiálís luk kialakulását (Saluk, P. és mtsaí: Journal of Pharmaeology and Experimental Therapeutíos 284, 683-839 (I998ij. Emellett a béta-2-adrenerg receptor agonista termőiéről csökkenti a mikrovaszkuiáris szivárgást, azáltal, hogy gátolja az endoteiiálís luk képződését [Belük, P. és McDonald, DM: Am. A Physioi. 266, L461-8 (1994)].
Az angsodosefinek és a vaszkuláris endoteiiálís növekedési faktor (VEGE) család tagjai az egyedüli növekedési faktorok, amikről azt gondolják, hogy nagymértékben specifikusak a vaszkuláris endoteiiálís sejtekre. Az egerekben végzett célzott gén inaktíválási vizsgálatok kimutatták, hogy a VEGE szükséges a vaszkuláris fejlődés korai állapotaihoz, és az Ang-1 szükséges a vaszkuláris átrendeződés későbbi állapotaihoz.
A 6,011,803 számú Amerikai Egyesült Áliamok-belí szabadalmi leírásben (Metris
Therapeutíos Limited, 2080. január 4.) leírják az ELI polipeptid egy megváltoztatott, oldható formáját, ami képes a VEGE-hez kötődni, ás ezáltal képes arra gátló hatást gyakorolni, és a polipeptid öt vagy kevesebb komplett immunglobulin domént tartalmaz.
Az 5,712,380 számú Amerikai Egyesült Áliamok-belí szabadalmi leírásban (Merck &
Co., 1998. január 27.) leírnak olyan vaszkuláris endoteiiálís növekedési faktor (VEGE) Inhibitorokat, amik előfordulnak a természetben, vagy rekombináns módszerekkel előállított oldható formák, a VEGE receptor C-terminálls transzmembrán régiójával vagy anélkül.
Szintén a Merck & Co. szabadalma a WO 98/13071 számú szabadalmi leírás (1998. április 2.), amiben egy génterápiás módszert írnak le a primer tumornövekedés és áttét gátlására, egy olyan nukleotid szekvencia átvitelével, ami a VEGF-hez kötődő oldható receptoiíehéhét kódol.
A WO 97/44453 számú szabadalmi leírásban (Genentech, Inc., 1997. november 27.) új klméra VEGE receptor fehérjéket írnak le, amik az Eltl és KDR vaszkuláris endoteiíáiis növekedési faktorokból (VEGE) - beleértve az FLK1 humán KDR receptor rágcsáló homológját - származó aminosav szekvenciákat tartalmaznak, és az említett kimére VEGE receptor fehérjék kötődnek a VEGF-hez, és antagonizálják az endoteiiálís sejt szaporodási és angiogenikus aktivitását, (lásd továbbá Davís-Smyth és mtsaí, EMBG 1, 1996, vol. 15, 49194927. old.)
A WO 97/13787 publikációs számú PCT szabadalmi leírásban (Toa Gosei Co. ttd„ 1997, április 17.) egy alacsony molekulasúlyú VEGF inhibitort ismertetnek, ami használható olyan betegségek kezelésére, amiket neüvaszkuíahzáeió kísér, mint például a szilárd tumorok kezelésére. Egy poiipeptid, ami az. FLT VEGF receptor extracelbláris régiójának első irnmunglobuiin-szerö doménjét és a második immunglobulin-szerű doménjét tartalmazza, de nem· tartalmazza a hatodik immunglobulin-szerű dómént és a hetedik immunglobulin-szerű domént, VEGF gátló aktivitását.
Sharifs, d. és munkatársai leírják, hogy mivel a monoklonális ellenanyagok bázikus, pozitív töltésű fehérjék, és az emlős sejtek negatív töltésűek, a kettő közötti elektrosztatikus kölcsönhatások magasabb háttér kötődési szinteket eredményezhetnek, ami alacsony tumor - normális szerv arányt eredményez [Shahfí, d. és mtsai; The Quarterly dour. of Nucl., Med, 42, 242-249 (1998)]. Ennek a hatásnak a leküzdésére a kutatók megpróbálták javítani a monoklonális ellenanyag kiürülését, különböző módszerek, azaz például szekunder ágensek használatával, valamint a monoklonális ellenanyagnak magénak a kémlel és töltés-módosításával.
Jensen-Pippo és munkatársai leírják, hogy egy terápiás fehérje, a rekomfelnáns humán granuiocita telepserkentő faktor pegilezése (PEG-G-CSF) a stabilitás növekedését és az m v/vo biológiai aktivitás megtartását eredményezi, ha Intrad-uodenáfis úton adják be f Jensen-Pippo és mtsai; Pharmaceutíoal Research 13 162-107 (1996)],
Tsufsumi és munkatársai olyan kísérleteket írnak le, amikben a polletiiénglikoilsl módosított íníerleukin-6 (MPEG-IL-6) - amiben az interisukin-8 14 llzinesoporljának 54%-a polietiléngilkolhoz kapcsolódik - m wo trombopolefskus aktivitása összehasonlítható· a természetes inferleokin-6-éval ffsutsumí és mtsai; Thromb. Haemost. 77,. 168-73 (1997)],
Yang és munkatársai leírják, hogy a polietilénglikol rekombínáns humán ínferieukín-2höz (IL-2) való konjugálása olyan vegyöletet eredményez, a polietílénglikollai módosított ínterieukin-2-t (PEG-IL-2), ami megtartja az ínterieukin-2 /n váró és m vr'vo aktivitását, de jelentősen megnőtt keringési felezési idővel rendelkezik (Yang és mtsai; Cancer 76, 687-694 (1995))
R. Duncanés F. Spreafico publikációjukban összefoglalják azokat az erőfeszítéseket, amikkel az aszparagioáz plazmában való felezési idejét akarták növelni, polietiléngliköllsi való konjugáció révén {R. Duncan és F. Spreafico; Clln, Pharmacokinet. 27, 296-306 296 (1994)].
A WO 99/03996 számú PCT nemzetközi szabadalmi leírásban (Regeneron Pharmaceuticals, Inc,, és The Regents of The University of Califomsa, 1999. január 26.) leírják a módosított humán noggin polipeptideket, amik a bázikus aminosavak régióiban deléciőkat tartalmaz. A módosított humán noggin poiípeptidek a leírás szerint megtartják a biológiai aktivitásukat, miközben csökken az affinitásuk a heparínhoz, és farmakokinetíkájuk sokkal jobb az állati szérumban, mint a módosítatlan humán noggínban, ♦ Μ «
♦ X*
A jelen találmány tárgyát az 1, igénypontban meghatározott izolált nutóeinsavmolekuláR képezik, melyek az alábbiakat tartalmazzák:
a) egy vaszkuláris endotéí növekedési factor (VEGF) receptor komponenst kódoló nukieotídszekvenciát, amely lényegében egy első VEGF receptor immunogiobulirt-szerö 2-es lg doménjéből, és egy második VEGF receptor 3-as lg doménjéből éli, és
b) egy muitimerizáló komponenst kódoló nukleotld szekvencia, ahol az első VEGF receptor az Fii 1 és a második VEGF receptor az Fik 1 vagy az Fit 4, és ahol a VEGF receptor komponens a fúziós polipeptíd egyetlen VEGF receptor komponense.
Egy megvalósítási mód szerint az első VEGF receptor extraceltuíáris doménje 2-es lg doménjét kódoló nukleotld szekvencia a második VEGF receptor extracellulárls doménje 3as lg dcménjét kódoló nukleotld szekvencia előtt, azaz ahhoz viszonyítva upsíream helyezek el.
Egy másik előnyben részesített megvalósítási mód szerint az első VEGF receptor extracellulárts doménje 2-es lg doméniét kódoló nukleotld szekvencia a második VEGF receptor extraceííuláris doménje 3-as lg doménjét kódoló nukleotld szekvencia után, azaz ahhoz viszonyítva downstream helyezkedik el
A jelen találmány egy előnyben részesített megvalósítási módja szerint a multimenzáié komponens egy Immunglobulin domént tartalmaz.
Egy másik megvalósítási mód szerint az immunglobulin domént az alábbi csoportból választjuk meg: az IgG Fo doménje, és az. IgG nehéz lánca.
Az előnyben részesített megvalósítási módok közé tartozik egy izolált nukleinsav molekula, ami egy módosított FIM receptor fúziós polipeptidet kódolo nukleotld szekvenciát tartalmaz, és a nukleinsav molekula egy, az alábbi csoportból választható nukleotld szekvenciát tartalmaz
s) A 21A-21C., ábrán bemutatott nukleotld szekvencia;
bi A 22A-22C. ábrán bemutatott nukleotld szekvencia:
c) A 24A-24C. ábrán bemutatott nukleolíd szekvencia; és dj egy nukleotld szekvencia, ami a genetikai kód degenerációja következtében eltér az a), b) vagy cponthan említett nukleotld szekvenciától, és a módosított Flt1 receptor fúziós polipeptíd biológiai aktivitásával rendelkező fúziós pollpeptidet kódol.
A jelen találmány egy további megvalósítási módja szerint egy fúziós polipeptidet az előzőkben ismertetett Izolált nukleinsav molekulák kódolnak.
Egy további megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgya egy vektor, ami tartalmazza az előzőkben Ismertetett, nukleinsav molekulákat, beleértve egy expressziős vektort,
ami tartalmas itt ismertetett nukieinsav molekulákat, amikben a nukieinsav molekula működés szempontjából egy expressziós kontroli szekvenciához kapcsolódik.
A többi megvalósítási mód szerint a jelen találmány tárgyát egy gazda-vektor rendszer képezi egy fúziós polipeptid előállítására, ami egy expressziós vektorból, és az ennek megfelelő gezdasejtbői áll; a gazda-vektor rendszerben a megfelelő gazdasejt Esc.öertcrtfe oo/í; a gazda-vektor rendszerben a megfelelő gazdasejt egy COS sejt; a gazda-vektor rendszerben a megfelelő gazdasejt egy CHO sejt.
A jelen találmány egy további megvalósítási módja szerint a jelen találmány tárgya eljárás fúziós polipeptid előállítására, ami abból ált, begy a gazda-vektor rendszer sejtjeit olyan körülmények között szaporítjuk, amik lehetővé teszik a fúziós polipeptid előállítását és az így előállított fúziós polipeptid kinyerését.
A jelen találmány további megvalósítási módjai közé tartozik egy dirner vaszkuiárís endotél növekedési faktor (VEGF) sntagonlsta, amely két fúziós polpeptidet tartalmaz, ahol az egyes fúziós fehérjék az alábbiakat tartalmazzák;
a) egy VEGF receptor komponens, amely lényegében egy Fitt VFGF receptor ímmunglobuiín-jellegű 2-es doménjéböi, és egy Fik 1 vagy egy Fit 4 VEGF receptor 3~as lg doménjéböi áll, és bj egy mulfimerlzálö komponenst, ahol a VEGF receptor komponens a fúziós polipeptid egyetlen VEGF receptor komponense,
A találmány szerinti fúziós protein alkalmazható egy emlősben a plazma szivárgásának csökkentésére vagy gátlására, ami abból áll, hogy az emlősnek az előzőkben ismertetett fúziós polipeptidet adjuk be, beleértve azokat a megvalósítási módokat is, amikben az emlős ember, a fúziós polipepfió acetilezve van, vagy a fúziós polipeptid pegílezve van. Ugyancsak alkalmazható a fúziós polipeptid emberben vérerek növekedésének gátlására.
A jelen találmány további alkalmazásai területe emberben egy tumor növekedésének gyengítése vagy gátlása; emberben ödéma gyengítése vagy megakadályozása, főleg akkor, ha az ödéma agyi ödéma; emberben aszcltesz képződésnek gyengítése vagy megelőzése, főleg akkor, ha az aszcitesz petefészek-rákhoz kapcsolódó aszcitesz,
A jelen találmány továbbá egy olyan fúziós polipeptidet nyújt, amely az alábbiakat tartalmazza;
a) egy VEGE receptor komponens, amely lényegében egy F111 VFGF receptor immunglobuiin-jellsgű 2-es doménjéböi, és egy Fik 1 vagy egy Fit 4 VEGF receptor 3-as lg doménjéböi áll, és bj egy multimerizáló komponenst, ahol a VEGF receptor komponens a fúziós polipeptid egyetlen VEGF receptor komponense.
Az előnyben részesített megvalósítási módok közé tartozik egy fúziós polipeptid, amiben az első VEGF receptor extraceituláris »* «»
doménje lg 2~es doménjének aminosav szekvenciája a második VEGF receptor extraeeliuláris doménje lg 3-as doménjének aminosav szekvenciája előtt (upstream) áll, valamint egy olyan fúziós polipeptid, amiben az első VEGF receptor extracelluláns doménje lg 2-es .doménjének aminosav szekvenciája a második VEGF receptor exfracettuíáns doménje lg 3as doménjének aminosav szekvenciája után (downstream) áll.
Egy még: további megvalósítási mód szerint a fúziós polipeptid multimenzáié komponense tartalmaz egy immunglobulin domént, beleértve azt a megvalósítási módot, amiben az immunglobulin domént az alábbi csoportból választhatjuk ki; az IgO Fc doménje és az IgG nehéz lánca.
Az előnyben részesített megvalósítási módok közé tartozik egy fúziós polipeptid, ami egy módosított Flt1 receptor aminosav szekvenciáját tartalmazza, és az aminosav szekvenciát az alábbi csoportból választhatjuk ki; a) a 21A-21C, ábrán bemutatott aminosav szekvencia; b) a 22A-22C. ábrán bemutatott aminosav szekvencia; és os a 24A-24C. ábrán bemutatott aminosav szekvencia.
Egy további előnyben részesített megvalósítási: mód a találmány szerinti valamely fúziós polipeptid vagy dimer antagonísta alkalmazása tumornövekedés csillapítására- vagy megelőzésére, ödéma vagy hasvízkór csillapítására vagy megelőzésére, piazmaszivárgás csökkentésére vagy gátlására vagy véredények növekedésének blokkolására alkalmas emberi gyógyszerkészítmény előállítására.
Az alábbiakban röviden ismertetjük a mellékelt ábrákat,
1, ábra
A módosítatlan és acetilezett FHí(1~3)~Ec fehérjék ÍEF gél elemzése.
A módosítatlan Fitt (1 -3)-Fc fehérje nem képes belépni a gélbe, mivel pl értéke nagyobb 9,3-nái, míg az acetilezett Fit1(1:~3) be tud lepni a gélbe, és pí~5,2~nél kerül egyensúlyba.
A módosítatlan Flfl(1~3)~Fc és az aoetílezett Fll1(1~3)~Fc fehérjék kötődése a Matrígel '-rel borított lemezekhez.
A módosítstlso Flt1(1-3)-Fc fehérjék erősen kötődnek a Matrigél ’^-ben. levő extraceíluiárls mátrix komponensekhez, míg az acetilezett Rt(1 -3)-Fc nem kötődik.
A módoeitatien Fít1(1-3)-Fc, az acetilezett Fitt(1 -3j-Fc és a pegüezeít Flt1(1-3)-Fc kötődése egy Bíacore-aíapó esszében.
Az acetilezett (13-18-os oszlopok), a pegilezeö (17-2ö-as oszlopok), és a heparinnal kezeit Fitt (t -3)-Fc (21-24-es oszlopok) képes teljesen versengeni a Biacore ohiphez kötött ** ♦«» ♦ » *X Μ
Flt1.(1-3)-Fc-vei a VEGF-hez való kötődésben, a kontrollal (1-4-es oszlopok) és irreleváns fehérjével (5-8-as oszlopok) összehasonlítva. Úgy tűnik, hogy a módosítatlan Flt1(1-3)-Fc (58-os oszlopok) csak részlegesen verseng a Biacore chíphez kötődő Flt1(1-3)-Fc-hez a VEGF-hez való kötődésben. Azonban a megkötött minták 0,5 mol/l nátríum-kiohddaí való mosása (7-8-as- oszlopok) az Fltí(1-3)-Fc módosított formáira hasonlító kötési profilt eredményez, ami azt matatja, hogy a módosítatlan fehérje aspecifikus kötődést mutat a chip-hez, ami a sóoldattal való mosással éllminálható.
A módosítatlan Rí1(1-3}-Fc, az acetilezett Ffit(1~3)~Fc és a pegiiezeft Fltl (1 -3)-Fc kötődése a VEGF-hez egy ELISA-aiapú esszében.
Mind a pegíiezett. mind az acetilezett Fltí(t-3)-Fc fehérjék kötődnek a VEGF-hez, olyan affinitással, amik megközelítik a módosítatlan Rt1(1-3)-Fc affinitását.
A módosítatlan R17(1-3)~Fc, az acetilezett Flf'1(7-3)-Fc és a pegíiezett Fltl(1-3)-Fc farmakokinetikai profiljai.
Baib/c egereket (23-28 gramm) szubbután injekciózunk 4 mg/kg módosítatlan, acetilezett vagy pegíiezett Rt1(1-3)-Fc-veL Az egereket 1, 2, 4, 8, 24 órával, 2 nappal és 3 nappal a fehérje ínjekciózása után a farkukon véreztefjök meg, majd a szérumot standard ELISA~alapú esszében vizsgáljuk, amit arra terveztünk, hogy kimutassuk az Fit1(Í-3}-Fc fehérjét, Az összes Rtí (1-3)-Fc fehérje Tma>; értéke a hatórás és a 24-őrás időpont között van. A különböző fehérjék értéke az alábbi: módosítatlan: 0,08 pg/ml - 0,15 gg/ml; acetilezett: 1,5 ug/ml - 4,0 pg/ml; és pegíiezett: körülbelül 5 pg/mi.
A módosítatlan és lépésekben acetilezett Rt1(1-3)-Fc fehérjék lEF gél elemzése.
A módosításán Fíf1 (1-3)-Fo fehérje nem képes belépni a gélbe, mivel pl értéke >9,3, míg a legtöbb, tépésenként acetilezett Fit1(1-3)-Fc minta (30-100-szoros fölöslegben levő minták) képes a gélbe vándoroíni, és 4,55-8,43 pl értékek között kerül egyensúlyba, az acetilezés mértékétől függően.
A módosítatlan Fltl (1-3)~Fe és lépésekben acetilezett Rt1 (1 -3)-Fc fehérjék kötődése a Matrigei ^-iei borított lemezekhez.
Ugyanúgy, mint az irreleváns kontroll fehérje, az rTie2-Fc, a lépésenként acetilezett Flt1(1-3)-Fe (20 és 30-szoros fölöslegben levő minták) sem gátol semmilyen kötődést a Matrigeí®-iei borított lemezekhez, míg: a nem-acefílezett Fit1(1-3)-Fc fehérje szignifikáns kő10 tődést mutat. A 10-szeres fölöslegben levő minták csökkent kötődést mutatnék, de az-acafi» ieződés mértéke nem elég ahhoz, hegy teljesen gátolja az exfracetíulérís. mátrix komponensekhez való kötődést.
A módosítatlan Flt1(1-3)-Fc és a lépésekben acetilezett Flt1(1-3)-Fc kötődése egy Bíaccre alapú esszében.
Szuö-sztöchiomethkus arányban (0,5 pg/ml, vagy módosítatlan Fítl(1-3)-Fc vagy lépésekben acetilezetf Flt1(1-3>-Fc, vs 0,2 pg/mí VEGF) nincs elég Flt1 (1-3)-Fo (akár módosítatlan, akár lépésekben acetilezett} az oldatban ahhoz, hogy teljesen megkösse a VEGF-et 1,0 pg/ml koncentrációban, ami egy körülbelül 1:1 sztöehiometrikus aránynak felel meg, mind a módosítatlan, mint a lépésekben acetilezett Fltl (1 -3}-Fc jobban képes versengeni a VEGF-hez való kötődésben, de még: mindig nincs elegendő Fitt .(1 -3)~Fc fehérje (módosítatlan vagy lépésekben acetilezett) ahhoz, hogy teljesen telítse a hozzáférhető VEGF-et, Azonban 5,0 pg/ml koncentrációban, ami sokszor nagyobb az 1:1 sztöehiometrikus aránynál, mind az Fit1(1-3)~Fc, mind a lépésekben acetiíezett Rt1(l -3}-Fc fehérjék képesek telíteni a VEGF-et, függetlenül az aóetiezés mértékétől.
§. ábra
A módosítatlan Fltl(1 -3)-Fc és a lépésekben acetilezett Fitt (1-3)-Fc farmakokinetíkai profiljai.
Baíb./c egereket (23-28 gramm) injekciózunk szubkután 4 mg/kg módosítatlan, vagy 10, 20, 40, 60 és 100-szoros fölöslegben levő lépésekben acetiíezett Flt1(1-3)-Fc mintákkal (3 egér a módosítatlan, 10., 20 és 4ö-szeres fölöslegben levő mintákhoz, és 2 egér a 60 és 100-szoros fölöslegben levő mintákhoz). Az egereket az injekcíózás után 1, 2, 4, 6, 24 érával, 2 és 3 nappal a farkukon megvéreztetjük, A szérumokat ELI8.A alapú esszében vizsgáljuk, amivel az. Flt1(í-3)-Fc fehérje kimutatására terveztünk. Az összes vizsgáit Fít1(1 -3>Fc fehérje Tmax értéke a hatórás időpontban volt, de a Cm3>; értékek a következők voltak: módosítatlan Fltl(1 -3)-Fc 0,06· ug/ml; 10-szeres fölöslegben levő minta: - 0,7 pg/ml, 20-szoros fölöslegben levő minta: - 2 pg/ml, 40-szsres fölöslegben levő minta: - 4 pg/ml, 6Ö-szoros fölöslegben levő minta: - 2 pg/ml, lOO-szoros fölöslegben levő minta: - 1 pg/ml.
Az Flt1(1-3)-Fc nukíelnsav és kikövetkeztetett aminosav szekvenciája.
11. ábra
Az Fitt struktúrájának sematikus diagrammja.
'·»·* * «
Az Fltl 2-es lg doménj© és az lg :3-as doménje aminosav- szekvenciájának hídroííiítási elemzése.
13Á-13D, ábra
A Műt) : Fiö{1-'3&g>-Fc nukieínsav és kikövetkeztetett aminosav szekvenciája.
14A-14C, ábra
A Mut2: Fit1(2-3,vs)-Fc nukteinsav és· kikövetkeztetett aminosav szekvenciája.
15A-15C. ábra
A Mut3: Flt1(2-3)-Fc nukieínsav és kikövetkeztetett aminosav szekvenciája.
A M'ut4: Fitl (1-3R_>N)~Fc nuklemsav és kikövetkeztetett aminosav szekvenciája.
17. ábra
A módosítatlan Flti(1-3)-Fc, az Fít1(1~3)~Fe bázíkus régió deléciós mutáns, és az Fltl (1 -3)r>h mutáns fehérjék kötődése egy Biacore alapú esszében.
Szub-sztöchiometrikus aránynál (0,25 pg/ml Fít1{1-3)-Fc módosítatlan, acetiiezett vagy genetikailag módosított minták, vs. 0,1 p.g/ml VEGF) nincs elég Flt1(1-3)-Fo fehérje ahhoz, hogy blokkoljuk e VEGF-nak a Biacore chlpre immobilizáit FitT(1-3)~Fc-hez való kötődését. 0,5 pg/ml módosítatlan, acetiiezett vagy genetikailag módosított Fltl (1 -3)-Fo fehérje esetében a sztőchíomethkus arány megközelíti az 1:1 '-et., és megnő a képességük, hogy blokkolják a VEGF-nek a Biacore ohíphez való kötődését. 1,0 pg/ml módosítatlan, acetiiezett vagy genetikailag módosított Fít1(1~3)~Fc fehérje esetében a sztöchiometrikus arány megközelíti a. W:1-et< az Flt1(1-3)-Fc fehérjék képesek blokkolni a VEGF-nek a Biacore cbiphez való kötődését, de nem ekvivalensek, A módosítatlan, acetiiezett és Mut1; Fit1(1-3,iB)-Fc lényegében ugyanúgy képes blokkolni a VEGF kötődését, míg a Mut4: ΕΙΐ1(1-3κ.^)-Εο valamivel kevésbé hatékonyan blokkolja a kötődést.
A módosítatlan Fltl(1 -3)-Fo, a k&tl: Flt1(1~3A8)-Fc, a Mut2; F1I1<2-3ab>Fc és az FIG (1-3) mutáns fehérjék kötődése a Mathgei''-lel borított lemezekhez.
A módosított Flt1(1-3)-Fc fehérjék erősen kötődnek ezekhez a iukakhoz, a Muf3: Flt1(1~3)~Fc fehérjék valamivel gyengébben kötődnek, a M-utt: Fltl (1 ~3as)-Fo fehérje még gyengébben kötődik, és a Mul2; FSt1(2~3AS)~Fc mutatja a legjobb profilt, ami sokkal gyen-gébben kötődik, mint bármelyik előzőkben említett mutáns fehérje. A Mut4; Fit1(1~3R.>f<)-Fc glíkozíiezési mutáns fehérje csak marginális előnyt matat a Matrigei4 esszében.
A. módosítatlan Rt1£1-3}~Fc, a- Mull; Flt1(1-3ÁS)-Fc, a Mut2; Flt1{2-3AS)-Fc és az Flt1 (1--3) mutáns fehérjék kötődése egy ELISA alapé esszében.
A használt koncentrációkban a módosítatlan Flt1(1-3)~Fc: Mull: Fít1(1 ~3.w)“Fc, Mut2: Fit1(2~3ás)~Fe és Fitt (1-3) mutáns fehérjék hasonlóképpen kötődnek a VEGF-bez.
A módosítatlan Ai1<1-3)~Fc: a Mut1: Flt1(1-3áS)-Fc, a Mut2: Fít1(2-3xS)-Fc és az Fltl (1-3) mutáns fehérjék farmekokinetíkai profiljai.
Ezeknek a reagenseknek a Cmax értéke a kővetkező: módosítatlan Hf1(1-3)-Fc 0,1-5 pg/ml; éö-szeres möifóíösíegben levő acetílezett Fít1(1-3)-Fc * 1,5 pg/mi; és Mut1: Ht1(1-3.A.Í?.)-Fc- 0,7 pg/ml.
21Á-21C, ábra
Az Flf1D2.Flk1D3.FcACl(a) nevű módosított Fitt receptor nukleotid- és- kikövetkeztetett aminosav szekvenciája.
22Á-22C. ábra
Az Flt1D2.VEGFR3D3.EoAC1(a) nevű módosítóit Fltl receptor nukleotid- és kikövetkeztetett aminosav szekvenciája.
Extraceilulárls mátrix (ECM) esszé.
Ennek az esszének az eredményei azt mutatják, hogy az Flt1D2.Fik1D3.FcAC1(a) és az Rt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a) fehérjék lényegesen kevésbé tapadnak az ECM-hez. mint az Fit1(1-3)-Fe fehérje.
A VEGFR1R2-FcACl(a) nevű módosított Fltl receptor nukleotid- és kikövetkeztetett aminosav szekvenciája.
25A-2SC. ábra Foszfohiezésí esszé.
Az Flt1(1-3)-Fc, Flt1{1~3)~Fc (A40) vagy a tranziens Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) 1,5szeres móifölősiegben esetében a receptor sfímoiálását teljesen blokkolja ez a bárom módosilóit Ftt1 receptor, a kontroll közeggel összehasonlítva. Ezzel szemben, a tranziens Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a) nem mutat, szignifikáns- blokkolást ebben a mólfőlösiegben, a VEGF pozitív kontroll ingerléssel összehasonlítva. Hasonló -eredmények láthatók a 258. ábrán, ahol a módosított Fit receptorok a VEGF185 Ugandámhoz viszonyítva háromszoros mcifclöslegben vannak. A 25C. ábrán, ahol a módosított Fltl receptorok hatszoros mölfőlőslegben vannak a VEGF185 ligandumhoz viszonyítva, a tranziens Fit1D2.VEGFR3D3.FcÁ Cl (a)-rói kimutatható, hogy részlegesen blokkolja a sejtfelszíni receptorok VEGP185-tel Indukált stimuláíásár.
Foszíorilezési esszé.
A tsrozin-íoszfohíezeti VEGFR2(Flk1) kimutatása Western bíotta! BEGF1S5 ligandum stimuláiással azt mutatja,, hogy a sejtfelszíni receptorokat nem foszfcriiezík azok az ingerő minták, amikben a VEGF185 1 és kétszeres mőlfölöslegben levő (28A. ábra) vagy háromnégyszeres móíföiösiegben levő (288. ábra) tranziens Fit1D2.Fik1D3.FcAC1(a)~vaJ, egy stabil Fit1D2.Flk1O3,FcÁCl(a)-val vagy tranziens VEGFR1R2-FcAC1(a)-val vannak eloinkubálva. Mindegyik vizsgáit módosított Fltl receptor koncentráció esetében a VEGF165 Ugandám teljesen kötődik az eiöinkubálás során, aminek az az. eredménye, hogy nem mutatható ki a sejtfelszíni receptorok stimulálása a megkótelíen VEGF185-feí, a kontroli közeggel való ingerléshez viszonyítva.
27. ábra
MG/R2 sejtszaporodásí esszé.
Az alábbi módosított Fit receptorokat: Flt1(1~3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(e) és Flt1D2,VEGFR3D3.FcAC1(aX valamint negatív kontrollként egy irreleváns Tie2~Fc receptort 40 nM~rói 20 pM-re bírálunk, majd a 1 óra hosszat 3-7 °C<-on inkubáljuk a sejteken. Ezután az összes lukhoz humán rekombináns VEGEI 85-öt adunk definiált közegben, 1,56 nM koncentrációban. A Tie2~Fc negatív kontroll receptor egyik koncentrációban sem blokkolja a VEGF185-tel írtdukált sejtszaporodást, míg az Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) az 1,56 nM VEGF185-őt a maximális dózis felénél, 0,8 nM-néí blokkolja. Az Fltl(1-3)-Fc és az Fit1D2.VEGFR3G3.FcAC1(a) ebben a vizsgálatban kevésbé hatékonyan blokkolja a VE6F185-öt, ~2 nM fél maximális dózisban, A VEGFÍ85 önmagában 1,2 elnyelési egység leolvasási értéket ad, és a háttér 0,38 elnyelés! egység.
A kötési szlöcbiometrta Biacore elemzése.
A kötési sztöcbiometriát a megkötött VEGF165-nek az immobillzáif Flt1D2.Flk1D3,Fc AC1(a}-bcz, vagy a VEGFR1R2-FcACí(a)-hoz viszonyított mólarányaként számítjuk ki, az » »· *« 4 »»*♦ *♦ ** Χ«44 **
4 X »·Χ 4 * * 4 4 < 4 4 *»« **« * 4 » * « 4 4 4 «44 *»< »« «»« « 4« ί«4 4«
1000· RU ekvivalens 1 ng/ml-re konverziós faktort használva. Az eredmények sztöehiomalhát mutatnak,, egy VEGEI65· elmer molekula per egy Rt1D2.Rk1D3.FoAC1(a} vagy
V£GFR1R2~FcAC1(a) molekula arányban.
Méretkizárásos kromatográfiás szföchiometha nM: koncentrációjú Rt1D2.FlkW3,FcÁG1(a)-t vagy VEGFR1R2~FcAC-1(a)-f (ami a becslések szerint körülbelül ezerszer nagyobb, mint az Fit1D2.Flk1D3.Fc.AC1(a) vagy VEGFR1R2~FeAC1{a)/VEGF185 kölcsönhatás KD értéke)., különböző koncentrációjú
VEGF135-tel keverünk össze. Az inkubálás után az oldatban megmérjük a szabad Fit1D2.Rk1D3,FcAC1(a} koncenfráolöját. Az adatok azt mutatják, hogy 1 n.M VEGF16S hozzáadása az Fit1D2.Fik1D3.FcAC1(a) oldathoz teljesen .gátolja az FíttD2.Fik1D3.FcAC1(a) kötődését a VEGF165 felszínhez. Ezek az eredmények sejttetlk az egy VEGF185 molekula per egy Flt1D2.Fik1D3.FcÁC1(a} molekula sztöchlometriaí arányt.
< ábra
Méretkizárásos kromatográfia (SEC) natív körülmények között
Az 1. csúcs a Flt1D2.Flk1D3.FcACl(apVEGF185 komplex, a 2. csúcs a megkötetlen
VEGF185, Áz 1,1 és 1,2 ml között eiuáiödotf frakciókat egyesítjük, és guanidlumbidrokioridot (.GuHCI) adunk hozzá 4,5 M végkoncentrációban, hegy a komplexet dísszocláljuk.
Méretkizárásos kromatográfia (SEC) dlsszocistiv körülmények között
Ahhoz,, hogy elválasszuk a receptor-ligandum komplex komponenseit, és meghatározzuk mólarányukat, 50 ul disszociált komplexet viszünk a Supsross 12 PC 3.2/30-ra, amit 6 M GuHCI-lel hoztunk egyensúlyba, majd eluáijuk. Az 1, csúcs a Fit1D2.Flk1D3.FcÁC1(a)/, a 2. csúcs a VEGF185.
Máretklzárásos kromatográfia (SEC) Ön-llne fényszórással
Méretkizárásos kromatográfiás oszlopot használunk egy MínlDawn on~iine fényszórás! detektorral (Wyait Technology, Santa Barbara, Kalifornia) és fénytörési index (Rí) detektorokkal (Shimadza, Kyoto, Japán), hogy meghatározzuk a reoeptonilgandum komplex molekulasúlyát. Amint az a 33. ábrán látható, az elúoiós profilban két csúcs van. Az 1, csúcs a receptor-ligandum komplex, a 2. csúcs a megkötetlen VEGF165. A molekulasúlyt az LS és az RÍ jelekből határozzuk meg. Ugyanazt az eljárást használjuk a receptor-ligandum komplex egyes komponensei molekulasúlyának meghatározására. Ezeknek a meghatáÍ5 '* Φ**Φ ♦ * φ φ φ φ ί « φ ♦
Φ ·Χ X Φ Φ rozásoknak az eredményei a következők.· az Fít1D2.FlkW3.FcáC1(a,WEGF185 komplex molekulasúlya a csúcs pozíciójában. 1573ÜÖ (33. ábra), a VEGF 165 molekulasúlya a csúcs pozíciójában 44390 (34. ábra), és az R1R2 molekulasúlya a csúcs pozíciójában 113300 (35. ábra).
36, ábra
Peptid-térképezés és gllkozilezésl elemzés
Az Flt1D2.FlkW3.FcAG1(aj-ben a diszulfid struktúrákat és a glikozllezésl pontokat egy pepfid-térképezésl módszerrel határozzuk meg. összesen tíz clszteln van az Fif1D2.Fík1D3.FcÁC1(a) molekulában; ezek közöl hat az Fc régióhoz tartozik. A Cys27 a Cys76-hoz kötődő diszulfrd-bid. A Cys121 a Cysl 82-höz kötődő diszeífid-hid. Az Fc régióban az első két cisztein (Cys21;1 és Cys214) intermolekuláris dlszulfid-hídat képez ugyanezekkel a ciszteinekkel, egy másik Fc láncban. Az azonban nem határozható meg, hogy a diszuifidok kötődése az azonos ciszteinek között (azaz például a Cys211 - Cys211 között) jelenik-e meg, vagy a Cys21I és a Cys214 között. A Cys218 a Cys308-hcz kötődő diszuífid-hid. A Cys352 a Cys4TÖ-hez kötődő diszoífid-bs'd.
Öt lehetséges H-kapcsolt glikozllezésl hely van az FiíW2.FÍk1D3.FcAC1(s}-ban: és ezekről úgy találtuk, hogy különböző mértékben gllkozíiezodnek. Teljes giikozilezés figyelhető meg az Asn33, Asn 193 és Asn282 pozícióban. Részleges giikozilezés figyelhető meg az AsnbS és Asn12ö pozícióban, A giikozilezés! pozíciókat az ábrán aláhúzással emeljük ki
Az Fit1(I-3)-Fc (A4Ö), az Rt1B2.FlklO3.FcAC1(e) és a VEGFR1R2-FoAC1(a) farmakokinetíkája.
Balb/c egereket injekciózunk szubkotán 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A48)-nel, CHO-ban tranziensen expresszálódó Fit1D2.Flk1D3.FcACl(a)-vaí, CHO-ban stabilan expresszálódó Fltl D2.FIR1 DS.FcACI (a)-val és CHO-ban tranziensen expresszálódó VEGFR1R2-FcAC1 (a)val. Az egereket az injekciózás után 1, 2,4, 6, 24 órával, 2, 3 és 3 nappal a farkukon megvéreztetjük, A szérumokat olyan ELISÁ-val vizsgáljuk, amit arra terveztünk, hogy kimutassuk az Fif1(1~3)~Fc (A40>-ét, az FltW2.RkW3.FcÁC1(a)-L vagy a VEGFR1R2~FcAC1(e)-t. Az Fül(1 -3)~Fc (40) Tmax értéke 8 óránál van, mig a tranziens és stabil Flt.1D2.FlkW3.FcA C1(a), valamint a tranziens VEGFR1R2~FcÁC1(a) Tmax értéke 24 óránál van. Az Fitl(1-3)Fc (A4Ö) Crnax értéke 8 pg/mk mig a tranziens FítW2.Flk1D3.FcAC1(a) és VEGFR1R2~Fc
Crnax értéke 18 pg/'mí, és a stabil VEGFR1R2~FcAC1(a) Cmax értéke 30 ug/ml.
Az Fltl (1 ~3)~Fc az Flt1;D2.Fík1D3.Fc.ACl(a> és a Fit1D2.VEGFR3D3.FoAC1(a) farmakokinetikája.
* 000 » V «*«« «««« «Κ00 ¢¢.
»♦ ♦ ♦ χ ♦ ·: > * * « » « **« «Φ» Φ ♦ *0*00 0 000 00 0 0 0 00 0 V 0 0 0*0 0»
Balb/c egereket injekciózunk szubkután 4 mg/kg F!t1{l-3}-Fc (A40)~nel.( CH-O-ban tranziensen expresszálódö Fltl D2.Flk1D3.FcAC1(a)-val, ás CHO-ban tranziensen expresszálödó RtíD2.VEGFR3D3.FcAC1(a)-vai, Az egereket az injekciózás után 1, 2, 5, 8, 7, 8, 12, 15 és 20 nappal a farkukon megvéreztetjuk. A szérumokat olyan ELI'SA-val vizsgáljuk, amit arra terveztünk, hogy kimutassuk az Fit1(1-3)-Fc (AAÖ'pet az Flt1D2.Flk1D3.FoACi(a)i. vagy a VEGFRlR2-FcAC1(a)-t. Az Fltl (1 -3)--Fc (A40) 5 nap múlva már nem mutatható ki a szérumból, míg az Flt1D2,Flk1D3,FcAC4(a) és FltW2.V£GFR3D3.FcAC1.(a) még 15 nap múlva, és később is kimutatható,
Az FltlD2.Rk1D3.FcAC1(a) képessége a HT-1G80 fíbroszarkóma tumor növekedésének /.n wo gátlására.
Ha a SCIB egereket minden másnap, vagy hetente kétszer 25 mg/kg ?lt1D2,Fik1D3.FcÁCí(a)”Val kezeljük, akkor ez szignifikánsan csökkenti a szubkután HT1030 fíbroszarkóma tumorok növekedését..
Az Flt1D2.Fík1D3.FcAC1(a) képessége a CS giiőma tumor növekedésének «? v/vo
Ha a SGID egereket minden másnap, vagy hetente kétszer csak 2,5 mg/kg Fií1D2.Fík1D3.FoAC1(apval kezeljük, akkor ez szignifikánsan csökkenti a szubkután C8 gíiöma tumorok növekedését.
VEGF-fel indukált méh hiperpermeabiiitás
Prepubertás nőstény patkányokban 5 NE szubkután PMSG injekció 2 nap múlva az ösztradloi kiáramlását eredményezi, ami viszont a VEGF indukálását okozza a méhben. Ez az indukció a méh híperpermeabiiitását eredményezi, valamint a méh nedvesedésének növekedését. Az Fit1(1-3PFc (A40), az F!t1D2.FlkW3.FcAC1(a) és az Flt1D2.VEGPR3D3.PcA C1(a) szubkután injekciézása 25 mg/kg-han, a PMSG injekció után 1 órával, a méh nedves súlya növekedésének körülbelül 50%-os csökkenését eredményezi.
A Corpus Luteum angiogenezís becslése, kimenő adatként progeszíeront használva. A szubkután injekciózott 5 NE PMSG. ami ovulációt indukál prepubertás nőstény patkányokban, teljesen működőképes corpus luteumot eredményez, ami vérerek sűrű hálózatát tartalmazza, ami progeszíeront szekretál a véráramba, amivel előkészíti a mehet a beültetéshez. Az angiogenezisnek a corpus luteumban való índukáíásáboz VEGF~re van szükség.
* *00* * 4»Χ« *0>« 0.000 0.0.
♦« ♦ «« 0 β 0 « 0 .* Α « « 0Χ« »0 0 0 0 ♦ * Λ * * V 0*0 **« 00 0»χ * 00 0 X X 00
A progeszteron nyugalmi szintje körülbelül S ng/ml, és PMSG után 25-40 ng/ml-re indukálható. Az Elt1(1-3)-Fc (A4Ö) vagy az F1f1D2.Flk1D3.EcAC1(a) 25 mg/kg vagy 5 mg/kg szubkután ínjekciézása a PMSG ínjekclózás után 1 órával a 4, napon a progeszteron indukció teljes gátlásét eredményezi.
A szakterületen régen megoldatlan probléma olyan receptor alapú VEGE anlagonísta előállítása, aminek olyan a- farmakokinetikai profilja, hogy az lehetővé teszi, hogy az antagonístát terápiás jelöltnek tekintsük, A jelen találmány szerzői először Írnak le egy Rimára polipeptid molekulát, ami képes antagonlzáinl a VEGE aktivitását, javított farmskokinetíkai tulajdonságokkal rendelkezik, más ismert, receptor-alapú VEGE anlagonistákkal összehasonlítva. Az itt ismertetett kiméra polipeptid molekulák tehát először biztosítanak megfelelő molekulákat a terápiában való alkalmazáshoz, amiben a VEGE antagonizmusa a kívánt eredmény.
A jelén találmány tárgyát új klméra polipeptid molekulák képezik, amik úgy jönnek létre, hogy az EI11 receptor egy módosított sxtrsceliularís iígandum-kötő dománjét az IgG Ec régiójához kapcsoljuk.
Az extraoellulárls ligandumot kötő domént ügy definiáljuk, mint a receptornak azt a részét, ami természetes konformációjában a sejtmembránban extraceíiuíárisan orientálódik, ahol érintkezésbe léphet a neki megfelelő iigandummal, Az extracelluláris iigandum-koto dómén nem tartalmazza a hídroíób aminosavakat, amik a receptor transzmembrán doménjeivei állnak kapcsolatban, vagy semmilyen olyan amínosavai, ami a receptor íníraceiluiárís doménjével áll kapcsolatban. Általában egy receptor intraoeíiuláris vagy cítopíazmatlkus doménje pozitív töltésű vagy poláros amínosavakboi (azaz például iizínbdl, argínínbői, hiszíidinbőí, giutaminsavböl, aszparaginsavbói) áll, Az ezeket megelőző 15-30, túlnyomd részt hidroföb vagy apoíáros aminosav (azaz például a leucin, a vaiin, az izoleucin és a fenilaianin! képezi a transzmembrán domént. Az extracelluláris dómén azokat az aminosavakat tartalmazza, amik megelőzik az amínosavak hidroföb transzmembrán szakaszát. A Íranszmembrán domént általában pozitívan töltött vagy poláros amínosavak, azaz például lízin vagy arginín határolják, von Heijne részletes szabályokat publikált, amikre a képzett szakemberek általában hivatkoznak, ha meghatározzák, hogy egy adott receptornak mely amínosavai tartoznak az extraoélíeiáris, transzmembrán vagy íntraceiiuíárís doménekhez [von Heijne: BioEssays 17. 25-30 (1995)], Egy másik változat szerint az Internet honlapjai, például e http://u1rec3,unli.ch/software/TMPRED_form,hfmi hozzáférhetőek, és ezek biztosítják a vegyészeknek az információt arról, hogy a fehérje doménekről milyen predikcíókat lehet tenni.
A jelen találmány tárgyát klméra polipeptideket kódoló nukleinsav molekulák konstruálása képezi, amik egy olyan vektorba vannak építve, ami megfelelő gazdasejtbe juttatva képes a kiméra polipeptid molekulák expresszáiására. A megfelelő gazdasejtek közé tartoznak, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a bakteriális sejtek, az élesztősejtek, a .' 18 *« AAA * * Α χ ♦ » A W * * « » » A Α * V * * » » V- χ. α < X «»« ΑΑ ·>*< Α «« ♦*» * ·>
rovarsejtek, és az emlőssejtek. A szakterületen jártas szakember számára ismert bármelyik módszer, ami alkalmas DNS fragmenseknek egy vektorba való építésére, használható a kimára polipeptíd molekulákat expressziős vektorok konstruálására, amikben az expresszáiódö szakasz transzkripciósAranszlácIős kontroli jelek szabályozása alatt áll. Ezek közé a módszerek közé tartoznak az ín vítiO rekombináns DNS és szintetikus technikák, valamint az ín vivő rekombinációk (genetikai rekombináció) (Sambrook és mtsai: Molecular Cloning: A Laboratory Manuál; 2. kiadás, Goid Boring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Current Protocoís ín Molecular Biology, szerk.: Ausubel és mtsai, Greene Pubiishing és Wiiey-lnfersclence: New York (1987)).
A kiméra poilpeptid: molekulákat kódoló nukleinsav molekulák expressziója egy második nukleinsav szekvenciával szabályozható, oly módon, hogy a kiméra poilpeptid molekula a rekombináns DNS molekulával transzformált gazdasejtben expresszáiódik. Például az Itt ismertetett poilpeptid: molekulák expressziőie bármelyik, a szakterületen jártas szakember számára Ismert promoter/fokozó elemmel szabályozható. A kiméra poilpeptid molekulák expresszíójának szabályozására használható promoterek közé tartozik, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a Squinto és munkatársai által teirt. hosszú terminális ismétlődés Squinto és mtsai: Celi 55, 1-20 (1991)(, az SV4G korai promoter régió (Bernoist és Chambon; Natúré 290. 304-310 (1981)), a CMV promoter, a M~MuLV 8' terminális ismétlődés, a Rous szarkóma vírus 3' hosszú terminális ismétlődésében levő promoter lYamamoto és mtsai: Celi 22, 787-797 (1989)), a herpesz tlmidln kinéz promoter (Wagner és mtsai: Prooeedings of the National Academy of Sciences, USA 78, 144-1445 (1981), a metailofloneln gén szabályozó-szekvenciái jBhnster és mtsai: Natúré 296, 39-42 (1982)1, a prokariőta expressziós vektorok, azaz például a béta-iaktamáz promoter pYiiia-Kamaroff és mtsai: Prooeedings of the National Academy of Sciences, USA 75, 3727-3781 (1973)), vagy a tac promoter [DeBoer és mtsai: Prooeedings of the National Academy of Sciences, USA 80, 2125 (1983): lásd még: „Usefui protelns from reoomblnant 'bacteria’, Sdenfífsc American 242, 74-94 (1980)), promoter elemek élesztőből és más gombákból, azaz például: a Gál 4 promoter, az ADH (slk©höi-dehidrogenáz) promoter, a PGK (foszíoglicerokináz) promoter, az alkaiikus foszfatáz promoter, és ez alábbi állati transzkripciós kontroli régiók, amik szövet-specífitást mutatnak, és transzgenikus állatokban használták őket: áz elasztáz I gén kontroli régiója, ami a hasnyálmirigy aoináris sejtjeiben aktív jSwift és mtsai: Celi 38, 839-848 (1984)): Oraitz és mtsai: Cold Spring Harbor Symp. Quant, Bioi. Symp. Guant. Bioi. 50, 399-409 (1988); MacDonald: Hepatology 7, 425-515 (1987)), az inzulin gén kontroll régiója, ami a hasnyálmirigy béta sejtjeiben aktív [Hanahan; Natúré 315, 115-122 (1885)), az immunglobulin gén kontroll régiója, ami a limfoid sejtekben aktív [Grosscbedl és mtsai: Celi 38. 847-858 (1984); Adames és mtsai: Natúré 318, 533-588 (198S)' Alexander és mtsai: Molecular & Cellular Biology 7, 1438-1444 (1987)):, az egér emlőtumor vírus kontroli régiója, ami a here, emlő, limfoid és árbocsejtekben aktív (Ledet és mtsai: Celi 45, 485-495 (1988)), az albumin
X *♦ gén kontroll régiója, ami a májban aklv (Pinkart és mtsai: Genes and Development 1., 268278 (1887)}, az aifa-fetoprotein gén kontroll régiója, ami a májban aktív (Krumlaüf és mtsai: Molecular & Gelluiar Biology 5, 1639-1848 (1985); Hammer és mtsai: Science 235, 53-58 (1987)], az alfa 1-antitripszin gén kontroll régiója, ami a májban aktív [Kelsey és mtsai: Genes and Development χ 181-171 (1987)], a feéta-globln gén kontroll régiója, ami a mieloid sejtekben aktiv [Magiam és mtsai; Natúré 315, 336-340 (1985); Kollias és mtsal: Celi 48, 89-94 (1986)], a mielln bázíkus fehérje kontroli régiója, ami az agy oiígodendrocíta sejtjeiben aktív [Readhead és mtsai: Celi 48, 703-712 (1987)}, a miozin könnyű .lánc-2 gén kontroli régiója, ami a vázlzomban aktív [Shani; Natúré 314, 283-288 (1965)}, és a gonadotróp felszabadító hormon génjének kontroll régiója, ami a hipoiaiamuszban aktív (Mason és mtsai: Science 234, 1372-1378 (1988)].
Tehát a a jelen találmány tárgyát olyan expresszlós vektorok képezik, amik képesek egy bakteriális vagy eukarióta gazdaszervezetben replikáiődni, egy, itt ismertetett, kimére polipeptid molekulát kódoló nukleinsavat tartalmaznak, a gazdaszervezetet ezzel transzfektáini lehet, és ezzel az ilyen nukleinsavak expresszióját úgy lehet szabályozni, hogy a kimára polipeptid molekulák expresszlöját eredményezze, amiket -azután biológiailag aktív formában ki lehet nyerni, A továbbiakban a biológiailag aktív forma olyan forma, hogy a molekula képes a VEGF-hez kötődni.
Az itt ismertetett kiméta nukielnsav molekulákat tartalmazó expresszlós vektorokat három általános megközelítési mód: szerint lehet azonosítani; a) DNS-DNS hibridizáció, b) egy „markor gén” működésének megléte vagy hiánya, és o) az ínszertálf szekvenciák expressziója. Az első megközelítési mód szerint egy expresszlós vektorba beépített idegen gén jelenlétét DNS-DNS hibridizációval lehet kimutatni, olyan próbákat használva, amik olyan szekvenciákat tartalmaznak, amik homológok a bevitt kimére polipeptid molekula szekvenciájával, A második megközelítési mód szerint a rekombínáns gazda/vektor rendszer bizonyos „markef gén funkcióinak (azaz például timídln kínáz aktivitás, antibiotikum rezisztencia, transzformációs fenotípus, zárványtest képződés bakuiovírusban) megléte vagy hiánya alapján azonosítható, amit idegen géneknek a vektorba való beépítése okoz. Például, ha a kimére polipeptid molekula DNS szekvenciáját a vektor markor gén szekvenciájába építjük be, akkor az Inszertet tartalmazó rekömbinánsokat a markor gén funkciók megléte vagy hiánya alapján azonosíthatjuk. A harmadik megközelítési mód szerint a rekombínáns expresszlós vektorok ügy azonosíthatók, ha vizsgáljuk a rekombínáns által expresszáit idegen génterméket. Ezek a vizsgálatok például a kimére polipeptid molekulák funkcionális tulajdonságaim alapulnak.
A jelen találmány szerinti sejtek tranziensen, vagy előnyösen konstitutíven és állandóan expresszélják a kimére polipeptid: molekulákat.
A kimére polipeptid: molekulákat bármelyik technikával azonosíthatjuk, ami lehetővé teszi egy stabil, biológiailag aktív kírnéra polipeptid molekula későbbi kialakulását, Például, :?ö *«** «*«« φφχ« 4 • Χ ♦ Φ * Φ*χ Φ * 9 9 9
Α «Φ ΦΦΧ X anélkül· hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a faktorok a sejtekből vagy oldható fehérjék, vagy zárványtestek formájában nyerhetők ki, amikből teljesen extrahálhafók 8M hidroklorid és dialízis segítségével {lásd például Builder és munkatársai, 5,863,304 számú Amerikai Egyesült Államok-belí szabadalmi leírás). Ahhoz, hogy a faktorokat tovább tisztítsuk, hagyományos ioncserés kromafográfiát, bídrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiai, fordított fázisú kromatográfiai vagy géiszűrést használhatunk.
A jelen találmány egyik megvalósítási módja szerint az eísö komponenst kódoló nukleotid szekvencia a második komponenst kódoló nukleotid szekvencia előtt (upstream) van. A jelen találmány egy másik megvalósítási módja szerint az első komponenst kódoló nukleotid szekvencia a második komponenst kódoló nukleotid szekvencia után (downstream) van. A jelen találmány további megvalósítási módjai szerint olyan molekulák is előállíthatok, amikben az első, a második és a harmadik fúziós polipeptid komponensek át vannak rendezve. Ha például az első komponenst kódoló nukleotid szekvenciát 1~gyei jelöljük, a második komponenst kódoló nukleotid szekvenciát 2-vel jelöljük, és a harmadik komponenst kódoló nukleotid szekvenciát 3-mal jelöljük, akkor a találmány szerint Izolált nukleínsavban a komponsek sorrendje, 5-3' Irányban leolvasva, az alábbi hat kombináció bármelyike lehet; 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; vagy 3,2,1.
A jelen találmánynak diagnosztikai és terápiás hasznosíthatósága is van. Az itt ismertetett klméra polipeptid molekulák működésének vagy expresszlojának a kimutatására szolgáló módszerek használhatók a rendellenességek diagnosztizálásában. A kimére polipeptid molekulák, vagy az agonísták vagy antagoníslák, amik kötődnek a kimére polipeptid molekulákhoz, használhatók a betegségek kezelésében. További megvalósítási módok szerint a kiméra polipeptid molekulát olyan ágensként használjuk, ami blokkolja egy kötő ágensnek a célpontjához való kötődését.
Például, anélkül, hogy ezekre korlátoznánk magunkat, a jelen találmány jól használható olyan klinikai állapotok kezelésére, amiket vaszkuláris permeablíitás, ödéma vagy gyulladás jellemez, azaz például agyi ödéma, ami sérüléshez, sztrökhoz vagy tumorhoz kapcsolódik; ödéma, ami gyulladásos rendellenességhez, azaz például pszoriázlshoz vagy arthritishez kapcsolódik, beleértve a reumás arthritist; asztma, generalizált ödéma, ami égésekhez kapcsolódik; aszcilesz és melíhártya Izzadmány, ami tumorokhoz, gyulladáshoz vagy traumához kapcsolódik; krónikus légúti gyulladás; kapilláris szivárgás szindróma; szepszís; vesebetegség, ami fehérje megnőve-kedett szivárgásához kapcsolódik; és szem-rendellenességek, azaz például korhoz kötődő foltos degenerálodás és dlabeteszes reíinopáiia.
Az Flf1(t-3)-Fc aminosav szekvencia-elemzéséből kiderült, hogy szokatlanul nagy számú (46) bázikus lizin aminosav van benne. Az Rf1(1-3)-Fc IEF elemzése kimutatta, hogy ennek a fehérjének a pl értéke nagyobb 9,3-nái, Igazolva azt a predlkoíót, hogy a fehérje nagyon bázikus. Azt feltételezték, hogy az Fltí(1-3)~Fe fehérje bázikus természete okozza, hogy az extracetluláhs mátrix komponenshez kötődik, és ez a kölcsönhatás lehet az oka az * Φ » Μ 4> Α » * * * * » * * » » # «
·.♦< V * φ «·« ««* Α :<·
Flt1:(1-3)-Fc keringési szérumban mért rendkívül rövid felezési idejének, ha egérbe injekciózzák. Ahhoz, hogy ezt az elképzelést ellenőrizzük, az Fit1(1 -3)~Fc fehérjét a liztn-csoportokon acetileztűk, hogy csökkentsük a. bázikus töltést. Az acetllezétt Fití(1:-3)-Fc-í azután az alábbiakban ismerteteti esszében vizsgáljuk.
Az alábbi példákat illusztrálás céljából adjuk meg, nem célunk ezekkel a találmány oltalmi körét korlátozni.
Példák
1. Példa
Az Flt1(1-3)-Fo fehérje expressziőja CHO KI sejtekben
Standard molekuláris biológiai technikák használatával [Sambrook és mtsai: Moleeular Cloning: A Laboratory Manual; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Current Protocols in Moleeular Blology, szerk.: Ausubel és mtsai, Greene Publishing- és Wiley-Interseienee: New York (1.S87)j az Rí1(1-3)~Fe-t kódoló gént a pEE14.1 expressziós vektorba (Lonza Bloioglcs, plc) Inszertáljuk, a CMV promofer után levő többszörös klónozó helybe. CHO KI sejteket transzfektálunk pEE14.1/Flt1(1-3)~Fe DNS konstrukcióval, Ilpofektamln (Gaíthersburg, MD) alkalmazásával. A transzfektáit CHO K1 sejteket giufamín-mentes DMEM-ben (JRH, Kansas City, Mö) szaporítjuk, ami 25 p.moi/1 metionin-szulfoximint (MSX) (Sigma, Inc,, St, Louís, MO) tartalmaz, majd a rekomblnáns fehérjét magas szinten expresszálö sejteket úgy kapjuk meg, hogy standard immunesszével, ami a humán Fc-t befogja és kimutatja, átvizsgálunk több mint 100, kézzel izolált telepből készített CHO KI sejt feiüíúszót A kiválasztott, kézzel Izolált klőnt 100 gmol/l MSX jelenlétében ampiífikáljuk, majd az ampllflkálf telepeken egy második szűrővizsgálatot hajtunk végre. A legjobban termelő klón specifikus Fit1(1-3}-Fc fehérje-termelő képessége 55 pg/sejb'nap,
A kiválasztott kiónt 225 cm'-es T-palackokban (Corning, Adón, MA) szaporítjuk, majd 8,5 literes forgatott palackokban (Corning, Adón, MA) szaporítjuk tovább, az előzőkben ismertetett sejttenyésztő közeget használva. A sejteket standard trípszinizáiással eltávolítjuk a forgatott palackokból, majd 3,5 liter szuszpenziós közegbe tesszük. A szuszpenziós táptalaj glutamln-mentes ISCHO táptalaj (Irvine SclentiSc, Santa Ana, CA), ami tartalmaz 5% borjúmagzat szérumot (FBS, Hyclone Labs, tógán, UT), 100 pmoi/l MSX és GS kiegészítőt (JRH Seienflfic, Kansas City, Mö) 5 literes Ceíligen bioreaktorban (New Brunswick Scientffic, New Brunswick, NJ), 0,3 * fö* sejt/ml sűrűségben. Miután a sejtek elérték a 3,8x10e/mi sűrűséget, és adaptálódtak a szuszpenziohoz, 60 literes bioreaktorba visszük át (ABEC, Aiientown, PA).. 0,5x10° sejt/mí sűrűségben, 20 liter, ISCHO + 5% borjúmagzat szérum öszszetételű táptalajba. Két nappal később további ISCHO + 5% borjúmagzat szérum táptalajt adunk a bioreaktorhoz. A sejteket további két napig hagyjuk növekedni, míkoris eléri a 3,1x10® sejt/mí sűrűséget, majd a végleges Flt1(1~3)~Fc koncentráció a begyűjtésnél 95 * <.«.♦·♦ * *»»»*>* *Λ V χ* Φ Φ ♦ * * * Φ*Φ * X Φ » Φ »« < < χ- ΦΦΦ φ » χ mg/í. A begyűjtésnél a sejteket tangenciátis..áramlási szűréssel távoiitjuk el, 0,45 pm Prostak Fiiters (Miilipore, Inc., Bedford, MA) használatával.
2,. Példa
GHO.Kl.selfekből..kapott.Fít1.(1.-3)-Fc,fehéne tisztítása
Az Fld(1--3)-Fc fehérjét először aíőnításkromatográfíávaí tisztítjuk. Protein A oszlopot használunk, hogy nagy speeíhiásssi megkössük a molekula Fc részét. Ezt az affinitás-tisztított fehérjét azután koncentráljuk, és SEC oszlopon bocsátjuk át. A fehérjét azután formulációs pufferbe eluáljuk. Az alábbiakban részletesen ismertetjük ezeket az eljárásokat.
Anyagok és módszerek
Minden vegyszert a ű.T. Baker-loi (Prtiillpsburg, NJ) szerzünk be, a PBS kivételével, amit 10* koncentrátum formájában a Life Teehnologies-tól (Gaithersburg, MD) szerzünk be. A Protein A Fást Flow és Superdex 200 preparativ minőségű gyantákat a Pharmacia-töl szerezzük be (Plscataway, NJ). A fehérje tömény késéhez a berendezést és a membránokat a Miiílpore-tól szerezzük be (Bedford, MA).
Körülbelül 40 liter, 0,4.5 pm-es szűrövei megszűrt kondicionáií CHO táptalajt, ami tartalmazza az Fíd(1-3)-Fc fehérjét, 290 mi Protein A Fást Flow oszlopra (10 cm átmérőjű) visszük fel, amit foszfáttál puffereit sóoldattal hoztunk egyensúlyba. Az oszlopot azután foszfáttal puffereit sóoldattal mossuk, ami 350 mmol/1 náthum-kiohdof és 0,02% CHAPS-t tartalmaz, majd a megkötöd fehérjét 10 mmol/1 Na2HP04-et tartalmazó 20 mmol/i citromsawai aiuáijuk. Az eluátumban levő egyetlen csúcsot összegyűjtjük, és pH-ját 1 mol/l nátrium-hídwxiddal semlegesítjük. Az eluáfum frakcióit körülbelül 9 mg/ml-re töményítjük, 1ÖK regenerált cellulóz membránokat használva, mind fanoenciális áramlási szűréssel, mind kevertetek cella töményitéssai Az aggregátumok és más szennyezők eltávolítására a tőményített fehérjét Superdex 200 preparativ minőségű gyantával töltött oszlopra visszük (10 cm x 55 cm), és 5% glicerint tartalmazó foszfáttal puffereit sőoldatban futtatjuk. A fő· csúcs frakciókat egeysitjük, sterilre szögük, alikvof részekre osztjuk és -80 cC-on tároljuk.
Az.Flf1(1-3hFcfehéóe^cetllezése
Két milligramm Flt'1(1-3)-Fc fehérjét acebiezünk, a szuifo-IMHS-acetát modifikációs kithez adott kezelési utasítás leírása szerint (Pieree Chemical Co., Rockford, ÍL,
CAT,#26777).
APélda
Az acefilezett Hfl (1 ~3)~Fc fehérje jellemzése (a) EF elemzés
Az FltíG-Sj-Fc-t és az acetüezett Fitt (l-Sj-Fc-l standard ÍEF elemzéssel elemezzük. Amint az az 1. ábrán látható, az Fltt(í-3)-Fc fehérje nem képes belépni a gélbe, ezért pl ér lékének 9,3-nál nagyobbnak kall lennie, ami a legmagasabb standard. Az acetilezett Flt1(13}-Fc azonban képes vándorolni a gélben, és körülbelül 5.2-es pl értéknél kerül egyensúlyba. Ez az eredmény azt demonstrálja, hogy az eceíiiezés jelentősen csökkenti a fehérje nettó pozitív töltését, és ezzel pl értékét.
(tel Azextraceliaiéris mátnx komponensekhez való kötődés
Ahhoz, hogy az extraceíiulárts mátrix komponensekhez való kötődést vizsgáljuk·, az Fitt (1 -3)-Fc-t és az aoetilezett Flt1(1~3)~Fe-t egy olyan vizsgálatban teszteljük, amit úgy terveztünk, hogy utánozza az extraeeiiuláhs mátrix komponensekkel való kölcsönhatást. Ebben az esszében 96-lukas szövettenyésztő lemezeket borítunk Mathgei-íel (Bíocoet Matrigel® mátrix vékonyréteg S6-iukes lémez;. Catalog #46607, Becton Dickinson tabware, Bedford, MA}·. A lemezeket különböző koncentrációjú F!t1(1-3)~Fc, acetilezett Fíí1(1-3)-Fo vagy rTie2~ Fc (egy irreleváns kontroll) fehérjével ínkubáljuk, a tokákhoz adva. A lemezeket 1-2 óra hosszat vagy szobahőmérsékleten Ínkubáljuk, vagy 3? aC-on, majd a megkötött fehérjék kimutatását úgy hajtjuk végre, hogy egy szekunder alkalikus foszfatázzal konjugált anti-humán Fo ellenanyagot adunk a Inkákhoz. Végezetül alkalikus foszfaiáz szubsztrátot adunk a lukakhoz, és mérjük az optikai sűrűséget. Ugyanúgy, mint az irreleváns kontroli rTie2-Fc fehérje, az aeetilezeít Fit1(1-3}-Fc sem mutat semmilyen kötődést a Matrígelíel borított lemezhez, míg a nem-aoetilszeít Flí1(1-3)-Fo fehérje szignifikáns kötődést mutat. Ez az eredmény azt sugallja, hogy a bázikus aminosav csoportok aeetilezése hatékony módja annak, hogy zavarjuk azokat a tőitéses kölcsönhatásokat, amik a pozitív töltésű fehérje és az fe wo hozzáférhető, negatív töltésű extraeeiiuláhs mátrix, komponensek között léteznek.
Bár a fehérjék pegiíezésérői (polieíilénglikoi - PEG) kimutatták, hogy fokozza fe v/vo potenciáljukat, fokozva stabilitásukat és biológiai hozzáférhetőségüket, miközben minimalizálja az ímmunogenitásukat (lásd az előzőkben idézett referenciákat), az intuíció ellen szól, hegy azoknak a molekuláknak a pegllezése, amik túl nagyok ahhoz, hogy a vese glomerulusai kiszűrjék, javítja a farmakokinetikai tulajdonságaikat. Anélkül hogy bármilyen elmélethez kötődnénk, azt állítjuk, hogy az Flt1(1-3}-Fe molekulák pegllezése javíthatja a farmakokinetíkai tulajdonságokat, valószínűleg nem úgy, hogy megváltoztatja a pozitív töltést, vagy csökkenti az Fltl<1 -3)-Fc pl értékét, hanem úgy, hogy fizikailag árnyékolja a pozitív töltéseket, és nem hagyja, hogy kölcsönhatása lépjenek az extraceííulárís máfíxszal. A feltalálók elhatározták, hogy megpróbálják megjavítani az Flt1(1-3)-Fc molekulák farmakokinetikai tulajdonságait, oly módon, hogy az alábbiakban ismertetett módon 20K polielíléngííkol láncokat kapcsolnak hozzájuk.
Anyagok és módszerek
CHO sejtekből származó tisztított Flt1(1-3)-Fc (lásd az. előzőkben) használunk az alábbi pegilezés! kísérletekben. A funkcionaiizsll pölieiílénglikoíokat a Shearwater Poiymerstol (Huntsviile, AL), a Bíclne-t a Sigma-tól (St. Louis, MO>. a Superose 6 oszlopot a Pharmacia-fól (Piscataway, hU), a foszfáttal puffereit sóoidatot 10* koncentrálom formájában a Life Technologies-től (Galthersburg, MD), a glicerint a J.T. Baker-tőt (Phitlipsburg, NJ) és az előre kiöntött Bis-Trls géleket a Novex-tői (CA) szerezzük be.
Amin-specifikus terminális egységekkel funkció na iizált 2ÖK-s PEG láncokat használunk kisméretű feakcióetegyekben végzett vizsgálatokban, amiket azért állítottunk össze, hogy kiértékeljük a különböző reakciókörülményeket, amikben a PEG:fehérje sztöchiometrlás arányt variáltok. Ezeknek a reakcióknak, és a minták standard SDS-PAGE-val végzett elemzésének alapján az Flt1(1-3)-Fc-t 1,5 mg/ml koncentrációban reagáltatjuk pH~8,1 értéken 20K SPA-PEG (PEG szakcinimidíl propionát) molekulákkal, 1:8-os PEG - Piti (1 -3)-Fc monomer mólarányban, A reakciót éjszakán át 8 űC-ors hagyjuk lejátszódni. A kiindulási tisztításhoz a reakcíótermékeket egy 10 mm x 30 cm-es Superose 6 oszlopra visszük, amit 5% glicerint tartalmazó foszfáttal puffereit sóoidattai hoztunk egyensúlyba. Úgy tűnt, hogy az oszlop a pegilezés mértéke alapján szétválasztja a pegilezett Fit1(1“3)-Fc molekulákat. Azokat a frakciókat szedjük, amik megfelelnek annak, amikről a redukáló és nem-redukáió SDSPAGE gélek csíkozottsága alapján úgy tűnik, hogy főleg mono-pegilezett és dí-pegílezett átmér Flt1(1-3)-Fe, A fehérje-koncentrációt a 280 nm-en mért elnyelés alapján határozzuk meg. A pegilezett Flt1(1~3)~Fc fehérjét sterilre szűrjük, alikvot részekre osztjuk, majd -40 °Con tároljuk.
A módosítatlan, acetiiezett és pegilezett Fitt (1-3)-Fc kötődése egy Blacore-aíapú esszében
A módosítatlan, acetiiezett és pegilezett Flt1(1~3)~Fc fehérjéiét egy Biacöre-aiapü esszében vizsgáljuk, hogy kiértékeljük az Fitt Ugandámhoz, a VEGF-hez való kötődésük képességét, Ebben az esszében a módosítatlan Flt1 (1 -3)-Fc fehérjét egy Biacore chlp-re immobilizáljuk (lásd Biacore Instruction, Manual, Pharmacia, Inc., Piscafaway, NJ, a standard eljárásokhoz), és egy mintát, ami 0,2 pg/ml VEGF-et, és 25 pg/ml módosítatlan Fif1(1-3)-Fct, acetiiezett Fitt(1 -3)~Fe~t vagy pegilezett Ftit(1-3)-Fc-í tartalmaz, bocsátunk át az Flt1(1-3)Fc-vel borított chíp fölött, Ahhoz, hogy minimalizáljuk az aspeclfikus kötődés hatásait, a megkötött mintákat 0,5 mol/i náfnum-kloriddal mossuk. Az egyik mintában a módosítatlan Fltf(t-3)~Fc-t hepahnnal keverjük. A heparin negatív töltésű molekula, és az Flt1(1-3)-Fc fehérje egy pozitív töltésű molekula, így ha a két molekulát összekeverjük, akkor a megfelelő **·
«.X töltésük alapján kölcsönhatásba lépnek, Ez lényegében neutrallzálja az Fit1(1-3)~Fc saját pozitív töltését, ezáltal a molekula úgy viselkedik, mintha kémiailag vagy genetikailag módosítva lenne, töltése ennek következtében csökkenne és csökkenne az a hajlama is, hogy a töltés-kölcsönhatások alapján kötődjön, Amint az a 3, ábrán látható, az. acetilezett (13- 16-os oszlopok), a pegiiezett (17-20-as oszlopok) és bepannna! kezelt fordított fázisú (21-24-es oszlopok) mind képesek teljesen versengeni: a Bíaccre chlphez kötött Rt1(1-3)-Fc-vel a VEGF-hez való kötődésben, a kontrollal (1-4-es oszlop) és az Irreleváns fehérjével (5-8. oszlop) összehasonlítva. Ügy tűnt, hogy a módosítatlan F!t1(1-3)-Fc (5-6-os oszlop) csak részlegesen verseng a Blacore chlphez kötött Fil1(1-3)-Fc-vei a VEGF-hez való kötődésért. Azonban a megkötött minták 0,5 moi/l nátdum-kloriddal való mosása (7-8-as oszlopok) a módosítóit formához hasonló kötési: profilt eredményeztek, jelezve ezzel, hogy a módosítatlan fehérje aspeclfikus kötődést matat a chlphez, ami a sóoldattal való mosással eliminátható,
7. Példa
A módosítatlan, acetilezett és pegiiezett Flt1(1-3?-Fc kötődése egy ELISA alapú esszében
A módosítatlan, acetilezett és pegiiezett Fit1(1~3)-Fc fehérjéket standard: ELISA-aiapú esszében teszteljük, hogy kiértékeljük a VEGF Fltl receptor ügandumhoz való kötődési képességüket. Amint az a 4. ábrán látható, mind a pegiiezett, mind az acetilezett Flt1(1-3)~Fc fehérje képes kötődni a VEGF-hez, demonstrálva, hogy a fehérje pegiiezéssel vagy acetiiezéssel való módosítása nem teszi tőnkre a llgandumához, való kötődési képességét.
8. Példa
1-3)-Fc farmakoA módosítatlan Fltt(1~3)-Fc, az acetilezett Rttí1-3)-Fc és a
Ö&®etemzése /o ν/vő kísérleteket terveztünk, hogy megbecsüljük a módosítatlan Flft(1-3)~Fc, az acetilezett Flt1(1-3)-Fc és a pegiiezett Flti:(1-3)-Fc fehérje farmakokinetíkai profiljait. Baib/c egereket (23-28· g; 3 egér per csoport) injekciózunk szubkután 4 mg/kg módosítatlan, aceíliezeft vagy pegiiezett Fltt(1~3)-Fc-vel. A fehérje injekdözása után 1, 2, 4, 6, 24 órával, 2 nappal és 3 nappal az egereket a farkukon véreztetiük. A szérumokat standard ELISA alapú esszében vizsgáljuk, amit arra terveztünk, hogy az Rí1(1~3}~Fc fehérjét kimutassa. Röviden, az esszében egy ELISA lemezt VEGF-fet borítunk, hozzákötjük a módosítatlan, acetilezett vagy pegiiezett FltT(1-3)-Fc-t tartalmazó szérumot, és alkalikus foszfatázhoz kötött anfi-Fc ellenanyaggal értékeljük ki. Amint az az 5. ábrán látható, az összes Rt1(1-3)-Ec fehérje Tmax értéke a hatórás és 24 órás időpont között van, A különböző fehérjék Cmax értéke az alábbi'. Módosítatlan; 0,06 pg/ml - 0,15 pg/ml; acetilezett: 1,5 pg/ml - 4,0 pg/ml; és pegiiezett: körülbelül 5 pg/ml.
9. Példa
Az Rt t rf :^}^
Annak meghatározására, hogy mekkora minimális mennyiségű acefiiezésre van szükség az extraceíluláris mátrix komponensekhez való kötődés eliminálására, olyan kísérletei terveztünk, aminek során sz Flii(1-3)-Fo fehérjét lépésekben aceöfezzük, növekvő mólfölöslegben használva az acetiiezési reagenst az acetiiezési reakeióelegyben. A mólfőíösieg tartománya a kővetkező volt 0, 10, 20, 30, 40, 50, 80, 70, 50, 90 és 100 mól acetiiezési reagens per 1 mól Rt1(1-3)-Fc monomer. A reakciókat a sulfo-NHS-Acetaíe modifikációs kit (Plerce- Chemical Co., Rockford, IL, Cat. #25777} mellé adott használati utasítás szerint hajtjuk végre.
10. Példa
A lépésenként -Fc jellemzése ja) IEF elemzés
A módosítatlan és lépésekben acetiiezett Rt1(1-3)-Fc fehérjéket standard IEF elemzéssel elemezzük. Amint az a 8A-6B. ábrán látható, a módosítatlan Fltl (1-3)~Fc fehérje nem képes belépni a gélbe, mivel pl értéke rendkívül magas (nagyobb mint 9,3). Azonban a legtöbb, lépésekben acetiiezett Rl1(1~3}~Fc minta (30-1 öö-szoros mólfőíösieg) képes a gélbe vándorolni, és 4,55-8,43 pl érték között egyensúlyba kerül, a fehérje acafiiezetisége mértékétől függően. Ez az eredmény azt demonstrálja, hogy az acefílezés öózisfüggő módon megváltoztathatja a fehérje pozitív töltését, és a pl csökkentése szabályozható, az acetilezés mértékének szabályozásávalfb) A lépésekben acetiiezett Fit 1(1-3)-Fo kötődése az extracelluláns mátrix komponensekhez
Ahhoz, hogy az extraceliulárís mátrix komponenseinek kötődését vizsgáljuk, az Fltl (1 -3)-Fc-t és a lépésekben acetiiezett Fil1(1-3)-Fc vizsgáljak az előzőkben említett eszszében, amit úgy terveztünk, hogy utánozza az extraceliulárís mátrix komponensekkel velő kölcsönhatást. A módosítatlan Rt1(1-3)-Fo és a lépésekben acetiiezett Fit1(1~3)~Fc (10, 20 és 30-szoros mölfölösleges minták) vagy rTie2-Fc (irreleváns kontroli) fehérjék különböző koncentrációit adjak a íukakhoz. Á lemezeket 1-2 óra hosszat szobahőmérsékleten vagy 37 °C-on inkubáljuk, majd a megkötött fehérjék kimutatását úgy hajtjuk végre, hogy szekunder alkaiikus foszfatázzal konjugált anti-humán Fo ellenanyagot adunk a lukakhoz. Ezt követően alkaiikus foszfatáz szubsztrátet adunk a lukakhoz, és megmérjük az optikai sűrűségüket. A 7, ábrán mutatjuk be ennek az esszének az. eredményeit. Ugyanúgy, mint az irreleváns rTie2-Fc fehérje, a lépésekben acetiiezett Flt1(1-3)-Fc (20 és 30-szoros möifőlösleges minták) sem mutat semmilyen szignifikáns kötődést a Matrigel-lel borított lemezhez, míg a nemacetiiezett Fltl (1 -3)-Fo fehérje szignifikáns kötődést mutat. A kötődés telíthető, jelezve ezzel, hogy az Fltl (1-3}~Pe fehérje specifikus pontokhoz kötődhet, és nem egy sokkal általánosabb • y't
-** * χ* * 4 * « «.
*4*4 «χχ ·» « .*.»♦'·« * «χ >
·*♦ «« 44« 4 ·»♦ »4« X · töltések révén közvetített kölcsönhatás játszódik !©,. ami -esetleg nem telíthető. A tízszeres mölíőlösleges minta csökkent kötődést mutat, de az acetliezés mértéke nem elég ahhoz, hogy teljesen blokkolja az extracelluiárís mátrix komponensekhez való kötődést. A 20-szoros és magasabb rmífölösfeges minták nem mutattak kimutatható kötődést, annak ellenére, hogy az IEF elemzéssel (SA. és SB. ábra) az alacsonyabb molekulasúlyú mintáknak még nagy nettó pozitív töltése mutatható ki. Ezek az eredmények azt demonstrálják, hogy nem kell feltétlenül teljesen aoetíiezní az összes hozzáférhető bázikus aminosavat, azért, hogy elimínáljuk az extráceí Máris mátrix komponenshez való kötődést, fc) A lépésekben acetilezett Fitt ; t-3j-Fo kötődése egy Blaccre alapé esszében
A módosítatlan és lépésekben ecet!lezetf Rtl (1 -3)-Fc fehérjéket egy Biacore alapú esszében teszteljük, hogy kiértékeljük azt a képességüket, hogy mennyire képesek az Fitt Ugandáméhoz, a VEGF-hez kötődni. Ebben az esszében a módosítatlan Flí1(1-3)~Fc fehérjét (0,.5, 1,0 vagy 0,5 pg/ml) immcbilszáijuk egy Biacore chip felszínére (lásd Biacore Instructíon Manual, Pharmacia, Inc., Plscataway, MJ, a standard eljárásokhoz), majd egy oldatot, ami 0,2 ug/ml VEGF-et és módosítatlan Flt1(1-3)-Fc-t ¢0.,.5-, 1,0 vagy 5,0 pg/ml koncentrációban) vagy 10 különböző lépésekben acetilezett Flt1(1-3j-Fc mintát (0,5, 1,0 vagy 5,0 pg/ml koncentrációban) tartalmaz, bocsátunk át az Fif1(1-3)~Fc~vei borított chíp fölött. Amint ez a 8, ábrán látható, szub-sztöchiometrikus arányban (0,5 ug/mi módosítatlan Fitl (1-3)-Fc vagy lépésekben acetilezett Flt1(1-3)-Fc vs. 0,2 pgfmi VEGF) nincs elég Fít1(1 -3)-Fc (módosítatlan vagy lépésekben acetilezett) az oldatban ahhoz, hogy teljesen megkösse a VEGF-et. 1,0 μ g/mi koncentrációban, ami megközelíti az 1:1 sztöchiometrikus arányt, mind a módosítatlan, mind a lépésekben acetilezett Flt1(1-3)-Fc jobban képes versengeni a VEGF-hez való kötődésért, de még mindig nincs elég Fit1(1-3)~Fc fehérje (módosítatlan vagy lépésekben aoefílezett) az oldatban ahhoz, hogy teljesen megkösse a hozzáférhető VEGF-et, Azonban 5,0 μ g/m! koncentrációban, ami többször magasabb, mint az 1:1 szlöchiometrial arány, mind az Flt1fl~3)~Fc, mind a lépésekben acetilezett Fítf(1-3)-Fc fehérje képes megkötni a VEGF-et, az acefílezés mértékétől függetlenül. Ez világosan demonstrálja, hogy az aeeilíezés nem változtatja meg az Flf1(1-3)-Fc-nek a VEGF-hez való kötődési képességét.
(d) A lépésekben acetilezett Fitl (1 -31-Fo farmakokinetlkaí elemzése fe v/vo kísérleteket terveztünk, hogy megbecsüljük a módosítatlan Flt1(1-3)-Fc és a lépésekben acetilezett Flí1(1-3)-Fc fehérje farmaköklnetíkai tulajdonságait. Baib/c egereket (23-28 g) injekciózunk szubkután 4 mg/kg módosítatlan, vagy 10, 20, 40, 60 és 1ö0~szoros möifölöslegű, lépésekben acetilezett Flt1 (1 ~3)~Fc mintával (3 egér a módosítatlan, 10, 20 és 4ö~szeres mólfölösleges mintához és 2 egér a 80 és 100-szoros móifőlösíeges mintához). . A fehérje Injekeíózása után 1, 2, 4, 8, 24 órával, 2 nappal ás 3 nappal az egereket a farkukon vérezteíjük. A szérumokat standard ELISA alapú esszében vizsgáljuk, amit arra tervez28 tünk, hogy az Fít1 (1 -3)-Fc fehérjét kimutassa. A 9. ábrán mutatjuk be ennek a vizsgálatnak az eredményeit Az összes vizsgált Flt1(i-3)-Fc fehérje Tmax értéke a hatórás időpontban van, de a Cmax értékek az alábbiak: Mödcsitatían Fitt (1 ~3)~Fc: 0,Ö6 pg/mi; iö~szeres mólföíősleges minta: 07 p.g/ml; 2ö-szoros mőlfölcsleges minta: 2 pg/ml; 40-szeres mólfölösleges minta: 4 pg/mí: 80-szoros móífölösieges minta: 2 pg/mi; 100-szoros móífölösieges minta: 1 pg/mi. Ezek az eredmények demonstráljak, hogy az Flf1(í-3)~Fc acetilezés© vagy pegilezése szignifikánsan javítja a fehérje farmakokinetikai profilját.
ULPéída fitl(1.:3)-Fc.báziküS régié déisoíos mutáns.készítése,.amínek.jelzése Mutt :Fitt (t -3^)-Fc
Annak a megfigyelésnek az alapján, hogy az acetilezett Fitl(1-3)-Fc-nek., aminek pl értéke 8 alatt van, sokkal jobb a farmakokinetikája, mint az erősen pozitív, módosítatlan Rt1(1-3)-Fc-nek (pl > 8,3), azt kérdeztük, hogy a farmakökinefika különbsége a fehérje nettó töltése változásának tulajdonltható-e, aminek következtében a negatív töltésű extraceiluláris mátrix komponensekhez tapad, vagy esetleg vannak specifikus pontok az Fitf(1-3)~Fc fehérje felszínén, amik az exíraceiíuláhs mátrix komponensek specifikus kötődési pontjai. Például számos fehérjéről ismert, hogy heparln-kőíö helyekkel rendelkezik, ami gyakran bázikus csoportok klasztere. Ezek a csoportok néha egy kíaszíerben találhatók a fehérje primer szekvenciájában; a szakirodalom egy része «konszenzus szekvenciákat” azonosított az ilyen heparin-kötc helyek számára fiásd például Hileman és mtsai: Bioessays 20(2). 156-187 (t 988)), Más esetekben egy fehérje ismert kristály-struktúrájából derül ki pozitív töltésű csoportok klasztere a fehérje felszínén, de a csoportok a primer szekvencia különbőzé régióiból származnak, és csak akkor kerülnek egymás mellé, amikor a fehérje felveszi a tercier struktúráját. Ezért tehát nehéz kikövetkeztetni, hogy vajon egy izolált aminosav csoport részét képezi-e bázikus csoportok klaszíerének a fehérje felszínén. Azonban, ha van pozitív töltésű aminosav csoportok klasztere a primer szekvenciában, akkor nem ésszerűtlen feltételezni, hogy a csoportok térbellieg közel vannak egymáshoz, és ennek következtében részét képezik az extraeeiíuíáhs mátrix komponens kötési helyének Az Fltl receptor alaposan tanulmányozták. és különböző doméneket írtak le [lásd például Tanaka és mtsai: Jpn. J. Cancer Research 88, 887-878 (1997)]. A jelen találmány 1ÖA-10D. ábráin bemutatott nukleinsav és aminosav szekvenciákra hivatkozva meg lehet állapítani a szekréció szlgnálszekveneiájáf, ami a szekvencia elején található, és a 78-78-as nukleotidok által kódolt glicinig terjed. Az érett fehérje Ser-lys-íeu-Lys szekvenciával kezdődik, ami a nukleinsav szekvencia 79-es nukleotidjánál kezdődik. Az. Fltl lg 1-es dómén a 79-es nukleotídtól a 393-as nukleofldig terjed, és a Ser-Asp-Thr szekvenciával végződik. Az Fitt lg 2-es dómén a 394~es nukleotídtól a 687-es nukleotídig terjed (a Gíy-Arg-Ρτο szekvenciától az Asn-Thr-I le szekvenciáig kódol), és az Fitt lg 3-as dómén a 888-as nukleotídtól a 998-os nukleotídig terjed (az lle-Asp-Val szekvenciától az Asp-Lys-Ala szekvenciáig kódolva). Van egy áthidaló aminosav szekvencia Is (Giy-Pro-Giy), amit a 997-tööS~ös nukleotidok kódolnak, ezt követi a humán Fc-t kódoló nukleotid szekvencia (a 1ÖÖ5-1701-es nukleotidok, vagy a Glu-Pto-Lys aminosav szekvenciától a Pro-Gly-Lys-stop szekvenciáig).
Az Fltl aminosav szekvencia részletesebb elemzéséből kiderült, hogy ven egy kíaszter, nevezetesen a 272-281-es amínosavak (.KNKRASVRR) (1ÖA-1ÖD. ábra), amiben a 10 aminosavből 8 bázíkus aminosav. Ez a szekvencia a receptor Fltl lg 3-as doménjében található (lásd a 11. ábrát), ami önmagában nem esszenciális a VEGF Ugandámhoz való kötődéshez, de ami nagyobb affinitást biztosit a Ugandámhoz. Az lg 3-as dómén szekvenciájának az lg 2-es dómén szekvenciájához való Illesztéséből kiderült, hogy ebben a régióban a két ig dómén nagyon kis mértékben illeszkedik egymáshoz, és az lg 3-as doménben körülbelül tízzel több aminosav van, E két dómén hidrofliiiásí profiljainak elemzése (MacVector számítógép program) világosan mutatja, hogy a fehérjében egy hidrofil régió található (12A-128. ábra). Ezek a meg figyelések felvetik annak a lehetőségét, hogy az Fltl lg 3-as dómén aktuális háromdimenziós konformációja lehetővé fesz bizonyos típusú fcidudorodást, ami nem az Fltl lg 2-es doménben ven. Ennek az elméletnek az ellenőrzésére 10 további aminosavat vágtunk ki, és a kapott fehérjét megvizsgáltuk, hogy a deledé előnyösen érinti-e a farmakoklnefrkáf, anélkül, hogy súlyosan károsítaná a receptornak a VEGF-hez való kötődését. Ezt a DNS konstrukciót, amit standard molekuláris biológiai technikákkal állítottunk elő [Sambrook és mtsai: Moleeular Cioning: A Laboratory Manuai; 2. kiadás, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1989); Currant Protocols in Moleeular Bioiogy, szerk,: Ausubel és mtsai, Greene Publishíng és Wiley-Snterscience: New York (1987)1 a pMT21 emlős expressziós vektorban (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA), Mutl: FÍ11(1-3as)“Fc néven említjük, A Mutl: Fif1(1-3,x3}-Fc konstrukció a Flt1(1-3)-Fc-böi származik, a 814-343-as nukleotidok delécíójável (lásd: e 10A-10D. ábrát), amivel az erősen bázíkus, 10 aminosavből álló szekvenciát (Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg) vágjuk ki az Fít1 ig 3-as doménböí,
A végső DNS konstrukció szekvenciáját egy ABI 373A DNS szekvenálóvai és a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Ssquencíng Kit-tel (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) határozzuk meg. A Mutl : Flt1(1~3ás)-Fc szekvenciáját a 13A-13D. ábrán mutatjuk be,
12. Példa
Az Rf1(1-3)-Fc bázíkus régió deléciós mutánsának készítése, aminek a jelzése Mut2: Flt1(23Ag)-Fo
Egy második déiédós mutáns, jelzése Mut2: Fitt í 2-3 áS)-Fe a Mutl: Flt1(1-3^)-Fő konstrukcióból származik, oly módon, hogy a 73-393-as nukleotidok által kódolt Fltl ig 1~es domént (lásd: a 1QA-1GD ábrát) kivágjuk; az egyszerűség kedvéért e 73-78-as nukleotidokaf TCC GGA-ra változtatjuk. Ezzel egy BspE1 restrikciós hasítási helyet viszünk be, anélkül hogy megváltoztatnánk az. ehhez tartozó aminosav szekvenciát (Ser-Gly). Ennek a DNS . * »ΧΦφ Φ «»φ» *··♦* κκ ** V #· * Φ X ♦ φ *' Φ » ♦ ♦·♦'♦ φ κ« β * ♦ * Φ φ φ ♦ « X « ♦** X» ΦΦΦ » #« Χ«φ «« konstrukdőnak, -amit standard molekulám biológiai technikákkal állítottunk elő [Sarobrook és mtsai: Moiecular Cioning: A. Laboratory Maneai; 2. kiadás, Cold Spríng Harbor Press, Cold Spríng Harbor, N.Y. (1989); Current Protocols in Moiecular Siology, szerk.: Ausubel és mtsai, Greene Publishing és Wley-íntersclanee.' New York (1987)] a pMT21 emlős expressziós vektorban (Genetícs ínstltute, Inc., Cambridge, MA), is szekvenálással igazoljuk a szekvenciáiét, egy ABi 373A DNS szekvenáióval és a Tag Dldeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kii-teí (Applied Bíosystems, Inc., Foster City, CA). A Mut2: Rt1 (2-3Ab)~Fc szekvenciáját a 14A-14C. ábrán mutatjuk be.
ITPéida
Azf!tWz.3J;£cdeíé£fósjB4ánse^^
Egy harmadik deléciós mutáns konstrukciót, jelzése Muí3: Fíf1(2-3)~Fe, ugyanúgy állítunk elő, mint a Mut2: Flf1(2-3As)-Fc konstrukciót, azzal az eltéréssel, hogy az Fltl lg 3-as domént érintetlenül hagyjuk (a bázlkus régió aniínosavait nem vágjuk ki). A konstrukciót standard molekuláris biológiai technikákkal állítjuk elő, és a végső konstrukció szekvenciáját az előzőkben ismertetett módon Igazoljuk. A Mut3; FIt1<2-3)-Fc szekvenciáját a 15A-15C. ábrán mutatjuk be·.
14. Példa
Egy végső konstrukciót állítunk ele, amiben egy N-gilkozílezési helyet viszünk be az Fiíl lg 3-as dómén bázlkus régiójának közepébe. Ennek a konstrukciónak a jelzése Mut4: Fltl(l -3R.>W)-Fc, és úgy állítjuk elő, hegy a 824~S25-ős nukleotidokat megváltoztatjuk, GA-ról AC-re, ennek következtében az eredetileg kódolt Arg csoport (AGA) Asn csoportra (AAC) változik (lásd a 1GA-10D. ábrát). Ennek következtében az aminosav szekvencia Arg-Aia-Serrol Asn-Ala-Ser-re változik, ami megegyezik a kanonikus szekvenciával (Asn-Xxx-Ser/Thr), amibe az N-glIkozilezést be lehet vinni az Asn csoportban. A Mut4: Ft1(1-.3s^fi!)-Fc szekvenciáját a 18A-18D. ábrán mutatjuk be.
15. ábra
Az acetilezett Flt1(1-3)-Fc, Mut1:Flf1(1-3A&)~Fc és (a) Az extraceliuláns mátrix komponenseihez való kötődés
Annak meghatározására, hogy a három módosított fehérjének többé vagy kevésbé valószínűen javultak a farmakokinetikai tulajdonságai, Matrígeliel borított SS-lukas lemezeket (amint azt sz előzőkben ismertettük) inkubátunk különböző koncentrációjú mutáns fehérjével, és antl-humán Fc/aikalikus foszfatázzai konjugált ellenanyagokkal mutatjuk ki. Amint az- a 18 ábrán látható, ez a kísérlet igazolta, hogy miközben a módosítatlan Fltl (1-3)~Fo fehérje képes erősen kötődni ezekhez a Inkákhoz, a Mut3; Fíl1(2-3)-Fc valamivel gyengébben kötődik, a Mut1: Rí1(1-3as>Fc fehérje még ennél is gyengébben kötődik, és a Mui2; Fltl (2-3 asJ-Fo fehérje mutatja a legjobb profilt, sokkal gyengébben kötődve, mint bármelyik más mutáns fehérje. A Műié: Fít1(1-3R.>«)-Fc glikozlíezéai mutáns fehérje csak marginális előnyöket mutat a Mathgeí esszében. Ezek az eredmények igazolják azt az elméletet, hogy pozitív aminosavak lineáris szekvenciája kivágható a primer szekvenciából, ami az exíraceiíuláhs mátrix komponensekké! való töltés-kölcsönhatás csökkenését eredményezi.
A módosítatlan és acetílezett Fit 1(1 -3)-Fc és a genetikailag módosított Mutí: Fltl (1 -3 aB)-Fc és M.ut4: Flt1(1-3R.>si)-Fc fehérjéket egy Öiecore alapú esszében teszteljük, hogy kiértékeljük azt a tulajdonságukat, hogy mennyire képesek kötődni az Fltl lígandumhoz, a VEGF-hez. Ebben az esszében a módosítatlan Flf1(f-3)-Fc fehérjét (0,25, 0,5 vagy 1 pg/ml) egy Bíacore chíp felszínére ímmobiüzáljuk (lásd Bíacore Instruotion Manual, Pharmacia, inc,, Pisoataway, NJ, a standard eljárásokhoz), és egy ö,1 pg/mi VEGF~et és vagy tisztított vagy COS sejt feiüiúszőban levő módosítatlan Fit1(1-3)-Fo~t (körülbelül 0,25, 0,5 vagy 1,0 ug/mí), tisztított acetílezett Flt1(1~3)-Fc-t (0,25, 0,5 vagy 1,0 pg/ml), Mutí: Flt1(1-3ás)-Fc-f tartalmazó COS sejt felülüszőt (körülbelül 0,25, 0.5 vagy 1,0 pg/ml), vagy Mui4: Fltl(1 -Ss.^j-Fc-t tartalmazó COS sejt feiüiúszót (körülbelül 0,25, Ü..5 vagy 1,0 pg/mi) bocsátunk át az Fltl (1-3)Fc-vel borított chípen. Amint az a 17. ábrán látható, a szub-sztöchicmeihkus aránynál (0,25 pg/ml Flt1(1-3)-Fo a módosítatlan, acetílezett vagy genetikailag módosított mintákban, vs. G,1 pg/mi VEGF) nincs elegendő Fltt(1~3)-Fe fehérje ahhoz, hogy blokkolja a VEGF-nek a Síaccre chiphez ímmohllizált Fit1(1-3)-Fc~bez való kötődéséi. A módosítatlan, aceíiiezeít vagy genetikailag módosított Flt1(1~3)-Fc fehérjék 0,5 pg/ml koncentrációjánál a sztőchiomefrikus arány megközelíti az 1:1-et, és megnő a képességük arra, hogy blokkolják a VEGF-nek a Biacore chiphez való kötődését. A módosítatlan, acetílezett vagy genetikailag módosított Fit1(1-3)-Fc fehérjék 1,0 pg/ml koncentrációjánál a sztőchlometrlkus arány megközelíti a 10:1-et, ekkor az FÍt1(1~3)~Fc fehérjék képesek a VEGF-nek a Bíacore chiphez való kötődéséi gátolni, de ekkor nem egyenértékűek. A módosítatlan, acefiiezett és a Mull: Fltl (1-3as)-Fc fehérje lényegében ugyanúgy képes blokkolni a VEGF kötődését, míg a Mut4: Fít1(1-3?;-.>x)'Fc valamivel kévéséi hatékony a kötődés blokkolásában. Ezek Igazolják azt a hipotézist, hegy lehetséges gátolni egy pozitív töltésű molekula aspecifikus kötődését, ha genetikailag eltávolítunk egy lineáris szekvenciát, ami főleg negatív töltésű aminosavakat tartalmaz, (c) A Muí'1·. Rtí(1-3A«)-Fc, Mut2: ΓΙ11(2-3λ*)~Ρο. Mut3: Rt1 (2-3)--Fc Mut4: FltK1-3g^)-Fo kötődése ELISA alapú esszében . » A* «««* ♦♦ *< « *a M · » S «r * « * * *»* *** * e * * * * * * *' « * *** 99 »»ft << «* «Κ« »«
Annak meghatározására, hogy a három mutáns fehérje tud-e kötődni az Rtl VEGF iígandumához, kötési kísérleteket végeztünk, amikben VEGF-fel borított 96-lukas lemezeket ínkubálunk a megfelelő mutáns fehérje különböző koncentrációjával, majd mosás után a megkötött mennyiséget úgy mutatjuk ki, hegy alkalikus foszfatázzai konjugált anti-humán Fo ellenanyaggal Inkubáljuk, majd mennyiségét kolorimefriásan határozzuk meg, megfelelő alkaiikus foszfatáz szubsztrát hozzáadásával. Amint az a 19. ábrán látható, ez a kísérlet megmutatta, hogy a vizsgált koncentrációkban mindegyik mutáns fehérje hasonlóképpenképes kötődni a VEGF-hez.
M£§lda
AzacetiiezgttFli.líh31zF&„ a Mutí: Flt1(1-3Ag)-Fc és a módosítatlan Rf1 (1 -3)-Fo farmakokí?r? vívó kísérleteket terveztünk, hogy megbecsüljük a módosítatlan Fltl (l-Sj-Fo, a Mut1: Flt1(1-3.í,g}-Fo és a 40-szeres mólfőlösiegben levő aoetiiezett Fltl (1-3)-Fc fehérje farmakokinefíkal profilját. Balb/c egereket (25-30g) injekciózunk szubkután 4 mg/kg módosítatlan Flf1(1-3)-Fo, 48~szeres mőlfölöslegben levő aeeíilezetí Flt1(1~3)~Fc és Mutl: Fit1 (1-3^)Fc fehérjével (mindegyik esetben 4 egeret). Ezeket az egereket a farkukon véreztetjuk az injekció beadása után 1, 2, 4, 6, 24 órával. 2 nappal, 3 nappal és 5 nappal. A szérumokat olyan ELISA-val vizsgáljuk, amit arra terveztünk, hogy az Flt1(1~3)~Fc fehérjét ki lehessen mutatni vele, ami abból áll, hogy egy ELISA lemezt VEGF-fel borítunk, hozzákötjük az Flt1(1-3)-Fc~t, és mennyiségét alkalikus foszfatázhoz kapcsolt antí-Fc ellenanyaggal határozzuk meg. Amint az a 20. ábrán látható, ezeknek a reagenseknek a Cmax értéke az alábbi: módosítatlan Rt1(1-3)-Fc - 0,15 tug/ml; 40-szpres mőlfölöslegben levő aoetiiezett Fltl (1--3)Fc -1,5- pg/mi; és MuG: Rtt(í-3&s}~Fe - 0,7 ug/ml.
17. Példa
Módosított Fltl receptor vektor-konstrukció
Annak az oka, hogy elkészítettük az Fltl receptor (ami VEGFR1 néven ís ismert) módosított verzióit, azon a- megfigyelésen alapul, hogy az Fitt fehérjeszekvenciája erősen bázikus, és ennek következtében valószínűleg tapad az extraceííuláris mátrixhoz (ECM). Valószínűleg az Fltl erősen bázlkus természete a magyarázat arra, hogy a módosítatlan Flf1(1-3)-Fc~nek (amit az előzőkben ismertettünk) miért rossz a farmakokinetikéja, ami nehézzé teszi a terápiás ágensként való használatát. Amint azt az előzőkben ismertettük, a kémiailag módosított, 40-szeres móíföiösiegben levő aoetiiezett Fitt (1 -3)-Fc, amit a továbbiakban A40- néven említünk, sokkal jobb farmakokinetikai profilt (PK) mutatott, mint a nem-acetilezett Rt1(1-3)-Fc. Ennek következtében kísérleteket tettunk arra, hogy biotechnológiai módszerekkel megváltoztassuk azokat a DNS molekulákat, amik arra használhatók, hogy rekombináns módszerrel expresszáljuk egy Fli1 receptor molekula módosított formált, ami az A4Q által mutatott javított farmakokinetikai profillal rendelkezik, de még megtartja ezt a képességét, hogy erősen kötődik a VEGE -hez.
A szakirodalomból ismert, hogy az FIM első lg doménje (aminek a nettó töltése +5 semleges pH-η) nem esszenciális a VEGF-hez való erős kötődéshez, ezért ez a dómén kivágható. A harmadik lg dómén (aminek a nettó töltése +11) nem esszenciális a kötődés szempontjából, de nagyobb affinitást biztosít a VEGF-hez, mint a második lg dómén, tehát ahelyett, hogy fejesen kivágnánk, az Fltl receptorral rokon Fik1 (ami VEGPR2 néven is ismert) és Flt4 (ami VEGFR3 néven Is ismert) receptor ekvivalens doménjével helyettesítjük. Ezek a tóméra molekulák (jelzésük R1R2 (Flf1D2.Fík1D3.FcÁC1[a) és VEGFR1R2-FcÁ Cl (a), amikben R1 és FltQ2 jelentése az FIM (VEGFR1) 2-es lg doménje; R2. és Fik1D3 jelentése az Flk1 (VEGFR2) 3-as lg doménje; és R3 valamint VEGFR3D3 jelentése az Flt4 (VEGFR3) 3-as lg doménje)) az Itt ismertetett Áo vftto ECM kötési vizsgálat alapján megítélve sokkal kevésbé tapadnak az ECM-hez, és az ismertetett módon nagymértékben megjavult a farmakokinetikai profiljuk. Emellett ezek a molekulák az ismertetett módon képesek erősen kötődni a VEGF-hez, és blokkolják az endoteliális sejteken az ismertetett módon expresszáit természetes Flk1 receptor foszforilezését.
(sjApFk1D2,.FIkmTcAC1M expresszlós plazmíd készítése
A pMT1.Fit1(1-3)-Fo (8519 bázispár) és a pk1T2l .Flk1(1~3),Fc (5239 bázispár) expressziós piazmidok ampieiifin-razisztenciát kódoló piazmidok, amik kódolják a humán Fit 1 és humán FIR1 1~3~as lg deménjelnek Fc-jelzett verzióit. Ezeket a piazmidokat használjuk olyan DNS fragmens előállítására, ami tartalmazza az FIM 2-es ig doménjének az Flk1 3-as ig doménjéhez való fúzióját, a megfelelő lg doméneket polímeráz láncreakcióval ampiifikálva, majd további polímeráz láncreakciókat hajtva végre, amikkel a két dómén egyetlen fragmenssé való fúzióját kapjuk. Az FIM 2-es lg doménje esetében az 5' és 3' ampliíikáetós primerek a kővetkezők·.
5·: bsprtlt 1D2 (5'-GACTAGGAGTCCGAGGTAGACCTTTCGTAGA GATG-3')
3't Flt1D2-Flk1D3.es (S -CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3')
Az 5' ampiifikációs primer egy 8sp1 restrikciós hasítási helyet kódol az Fltl 2-es lg doménje előtt (upstream), amit a GRPFVEM amínosav szekvencia definiál (ez a 21Á-21C. ábra 27-33-as aminosavainak felel meg). A 3' primer az FIM 2-es ig dómén 3' végének reverz komplementjét kódolja, közvetlenül az Flk1 3-as lg doménje 5 kezdetéhez füzionáltatva, és a fúziós pontot az FIM THD-jeként lehet definiálni (ami megfelel a 21A-21C. ábra 123-125-os anfinosavainak), és folytatódik az Flk1 WLS~éhe (a megfelelő amincsavak; a 21A-21C. ábra 127-13ö~as amínosava;).
Az Flk1 3-as lg doménje esetében az 5 és 3' ampiifikációs primerek a következők:
κ «ΚΦ« * ****
5'; Fit1D2-F!k1D3.s <5'-ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG-3')
3'; Flk1D3/apa'srf.as <5'-GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3')
Az 5' ampiifikáeiós primer az Fitl 2-es lg dómén végét kódolja, közvetlenül az Rk1 3as lg doménje kezdetéhez fúzionáltatva, az előzőkben ismertetett módon A 3' ampiifikáeiós primer az Flk1 3-as tg dómén vegét kódolja, amit a VRVH.EK aminosavak definiálnak (ami megfelel a 21A-21C, ábra 223-223-as aminosavainak), amit egy áthidaló szekvencia követ, ami tartalmaz egy Srfl restrikciós hasítási helyet, és a GPG amínosavat kódolja. Az áthidaló szekvencia megfelel a 21A-21C. ábra 229-231-es amínosavaknak.
Az egyes domének előállítására végzett polimeráz láncreakció után a termékeket egy csőben kombináljuk, majd: újabb polimeráz láncreakciót hajtunk végre a bsp/fitW2 és Flk'ÍDS/epa/srf.as primerekkei (amiket az előzőkben Ismertettünk), hogy előállítsuk a fúziós terméket. Ezt a polimeráz láncreakció terméket azután BspEI és Srnal restrikciós enzimekkel emésztjük, és a kapott 814 bázispár méretű fragmenst a pMT21/AB2.Fc vektor BspEI és
Srfi restrikciós hasítási helyei közé szubklónozzuk, így kapjuk a pMT21ZFItD2.Flk1D3.Fo plazmidot. Az Flt1D2-Fík1D3 génfúziós inszert nukleotid szekvenciáját standard szekvenciaelemzéssel Igazoljuk. Ezt a plazmidot azután EcoRI és Srfi restrikciós enzimekkel emésztjük, majd a kapott 702 bázispár méretű fragmenst a pFlt1(1-3)B2-FcACl(a) piazmíd: EcoRI és Srfi restrikciós hasítási helyei közé visszük át, így állítjuk elő a pFlt1D2.Flk1D3,FoACí(a) expressziós plazmidot. Az. Flt1D2.F!:k1D3.FcAC1(a) kiméra molekula teljes DNS- és kikővetkeztetett aminosav szekvenciáját a 21A-21C. ábrán mutatjuk be.
fbj A oFlfíD2¥EGF3D3FcÁC't :fa) expressziós olazmid előállítása
A pMT21.Fif1(1-3),Fc expressziós plazmid (1513 bázispár) ampicillin-rezisztencíái kódol, és tartalmazza a humán FI11 receptor 1-3-as lg doménjének Fe-jelzett verzióját. Ezt a plazmidot használjuk olyan DNS fragmens polimeráz láncreakcióval való előállítására, ami az Fitl 2-es lg doménjét tartalmazza. A HEL921.7 sejtvonalból származó RNS-t használjuk az Fikl 3~as lg doménje előállítására, standard: RT-PCR módszer alkalmazásával:. Egy további polimeráz láncreakciót használunk arra, hogy megkapjuk a két tg dómén fúzióját egyetlen fuzionált fragmens formájában. Az Fitl 2-es lg doménje esetében az. 5' és 3' ampiifikációs primerek az alábbiak;
5': bsp/8í1D.2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')
3; FIND2.VEGFR3D3.as (TTCCTGGGCAACAGCTGGATÁTCTATGATTGTATTGGT)
Az 5‘ amplífikáeíös primer egy Bspt restrikciós hasítási helyet kódol az Fitt 2-es lg doménje előtt (upstream), amit a GRPFVEM aminosav szekvencia definiál (ez megfelel a > 4*X« » ♦♦·♦ »♦♦« ** «« .«» ·» - · ;
««» » · · 4 ♦ »x xx »♦* χ ** **
22A-22C. ábra 27-33-as aminosaveinak). A 3' amplifikációs primer az Piti 2-es lg dómén végének reverz komplementjét kódolja, közvetlenül a VEGFR3 3-as íg-doménjéhez füzionáltatva, amiben a fúziós pontot az Rtl TIID-jekánt definiáljuk (az a 22A-22C, ábra 123126-os aminosavainak felei meg), és ez folytatódik a VEGFR3 IQLL szakaszában (ami a 22A-22C. ábra 127-130-as aminosavainak felel meg).
A VEGFR3 3-as lg doménjéhez az RT-PCR reakcióban az alábbi 5' és 3' primereket használjuk:
5’:R3D3.s (ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGGTGCT GGTA)
3': R3D3.as (ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAA TCG)
Mind sz 5\ mind a 3' amplifikációs primer megfelel a VEGFR3 szekvenciájának. Ennek az RT-PCR reakciónak a 296 bázispár mérető ampliflkáclós termékét standard technikákkal izoláljuk, majd egy második polimeráz láncreakciónak vetjük alá, amivel megfelelő szekvenciákat adunk hozzá, hogy az FitO2 fuzionálhasson az Fik1D3 doménekkel, és egy GPG hídon keresztül (lásd az alábbiakban) fuzionálhasson az Fik1D3 és Fc doménekkel. Az amplifikációs primerek az alábbiak:
5': FI11D2VEGFR3D3.S (TCATAGATATCCAGGTGTTGCCGAGGAAGTCGCTGGAG)
3': VEGFR3D3/ssf as (GA7AATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT)
Az 5 amplifikációs primer az Fitt 2-es lg dómén 3' végét kódolja, közvetlenül a VEGFR3 3-as lg dómén kezdetéhez (5' vég) füzionáltatva. A 3' ampliflkáclós primer a VEGFR3 3-as lg donién 3' vegét kódolja, amit a VIVHEN amlnosavak definiálnak (ami a 22Á-22C, ábra 221-226-os aminosavainak felel meg), ezt követi egy áthidaló szekvencia, ami tartalmaz egy Srfl restrikciós hasítási helyet, és a GPG aminosavakat kódolja. Az áthidaló szekvencia megfelel a 22A-22C. ábra 227-229-es aminosavainak.
Egy polimeráz láncreakció után (az Flt1 2-es lg doménje) vagy két polimeráz láncreakció után (az Fltá 3-as lg doniénje), amivel az egyes lg doméneket állítjuk elő, a polimeráz láncreakciók termékeit egy csőben egyesítjük, majd újabb polimeráz láncreakciónak vetjük alá, az előzőkben ismertetett bsp/fltí D2 és VEGFR3D3/srf.as primerek használatával, a fúziós termék előállítása céljából. Ezt a polimeráz láncreakció terméket azután a BspEi és Smal restrikciós enzimekkel emésztjük, és a kapott 825 bázispár méretű fragroenst a pMT21íFit1ÁB2Fc (az előzőkben ismertettük) vektor BspEi ás Srfl restrikciós hasítási helyei közé szubkiónozzuk, így kapjuk a pMT21/Plt1D2,VEGFR3D3.Fc piazmidof. Az FitíD2VEGFR3D3 génfúziős Inszert szekvenciáját standard: szekvencia-elemzéssel igazoljuk. Ezt a
3ő « * He » «0 « « «0 0» ♦
píazmidot azután EcoRi és Srtl restrikciós enzimekkel emésztjük, és a kapott 893 bázispár méretű fragmenst a pRí1(1-3>A82-FcÁCl(a) plazmid EooRI és Srfl restrikciós hasítási helyei közé szubkíőnozzuk, így kapjuk a pFlt1D2VEGF3D3FoAC1(a) plazmídot. Az Rí1(1~3)A B2-FcAC1(a) kiméra molekula komplett DNS- és kikövetkeztetett aminosav szekvenciáját a
22A-22C. ábrán mutatjuk be.
18. Példa
Extraoellulárls mátrix (ECM · kötési esszé
EGM-mél borított lemezeket (Becton Dickinson cataiog #35-4807) meleg, 1 mmol/i glutaminnai. 100 E penicillinnel, 100 E sztreptomicínnel és 10% BCS-sel kiegészített DMEben rehidrálunk, legalább 1 éra hosszat, szobahőmérsékleten, különböző koncentrációjú Fít1B2.Fík1D3.FcAC1(a) és Rt1Q2VEGF3D3FcAC1(a} alkalmazáséval, amely koncentrációk 10 nmoí/i-néi kezdődnek, és ebből kétszeres hígításokat készítünk foszfáttal puffereit söoldat plusz 18% összetételű oldatban. A lemezeket azután háromszor mossuk foszfáttal puffereit söoldat plusz 0,1% Thfon-X oldattal és aikeiikus foszfatáz puffer/pNPP oldatot (Sigma) adunk hozzá a szín előhívására. A lemezeket 1=405-407 nm-en mérjük, Ennek a kísérletnek az. eredményeit a 23. ábrán mutatjuk be, és ezek azt demonstrálják, hogy az Fít1D2.Flk1D3.FcAC1(a) és Fít1D2VEGF3D3FcÁCl(a) fehérjék lényegesen kevésbé tapadnak az ECM-hez, mint ez Flt1(1-3)-Fo fehérje.
19. Példa
A pFítt D2.PiktD3,FcAC t(a) tranziens expresszióla CHQ-kl (E1Á) sejtekben
Az előzőkben (17(a) példa) ismertetett pFlt1O2.Fík1D3.FcAC1(a) plazmídot hordozd Escrieocöfe co/f DH10B sejtek nagyméretű (kétliteres) tenyészetét éjszakán át lerrifie Brotb (TB) plusz 100 pg/mi ampiciíljn összetételű oldatban szaporítjuk. A következő napon a piazmíd DNS-t QIAGEN Endoíree Megaprep kittel extrabáljuk, a gyártó utasításai szerint, A tisztított píazmid DNS koncentrációját standard technikákkal határozzuk meg, UV spektrofotométert és fiuorimétert használva. A plazmid DNS-t alikvot részek standard restrikciós enzimes emésztésével határozzuk meg, az EcoRi plusz Notl és Asel restrikciós enzimek használatával. Mindegyik restrikciós enzimes emésztéssel kapott fragmens a várt méretnek felelt meg, ha 1%-os agaróz gélen elemezzük.
Negyven 15 cm-es Petri-osészét oltunk be CHÖ-K17E1Á sejttel, 4*10δ sejVIemez sűrűségben. A szélesztö táptalaj Gíbco Ham F-12 táptalaj, 10% Hyelone borjúmagzat szérummá! (FSSj, 100 E penidlílin/1Ö0 E sztreptomlcinnel és 2 mmoi/l glutaminnai kiegészítve, A következő napon minden egyes lemezen levő sejtet 8 pg pFií1D2,FikiD3.FcACt ja) plazmíd DNS-sel trenszfektáljuk, Gibco Optlmem és Gibco Lipofectamine 12 mi térfogatban való alkalmazásával, a gyártó utasításai szerint. A keveréknek a sejtekhez való hozzáadása után négy órával 12 ml/iemez Gptimem-ef (10¾ FBS-sel kiegészítve) adunk hozzá. A lemezeket ♦ Μ*
0»* « 0 0 00 000 X
éjszakán át 37 °C-on Inkubáljuk egy 5%. COa-os atmoszférájú inkubátorban. A kővetkező napon az egyes lemezekről eltávolítjuk a közeget, és 25 ml expressziős táptalajt (Glbco CHO-S-SFM II. 2 mmol/l giutaminnal és 1 rnmoi/l nátriom-butirátiai kiegészítve) adunk hozzá. A. lemezeket 3 napig 37 °C-on inkubáljuk. A háromnapos Inkubálás után a táptalajt leszívjuk az egyes lemezekről, majd 409 per pere forduiatszámmai centrifugáljuk, kilendülőfejes rotorban, hogy a sejteket ülepítsük, A feiűSúszőt steril egyliteres palackokba dekantáíjuk, és az expresszáit fehérje tisztítását az előzőkben ismertetett módon hajtjuk végre.
20. Példa
A pVEGFRIRZ-FcACItaj expressziős vektor készítése
A pVEGFR1R2.FcÁC1(a} expresszíós piazmidot úgy állítjuk elő, hogy az SDT aminosavakat kódoló DNS-t (ami a 24A-24C. ábra 27-29-es aminosavainak felei meg) beépítjük az Flt1D2-Fik1d3-FcACt(a) 23-27-es aminossvai közé (a 21A-21C, ábra, GG), majd eltávolítjuk az ábra 229-231-es aminosavainak megfelelő GPG aminosavakat kódoló DNS-t, Az SDT aminosav szekvencia a természetben is megtalálható sz Fltl receptorban, és ezt visszaviszszük, hogy csökkentsük a heterogén N-termináils processzálás valószínűségét. A GPG-t (áthidaló szekvencia) eltávolítjuk, így az Fltl és Flkl lg doménjei közvetlenül egymáshoz vannak fuzionálva. A pVEGFR1R2.FcAC1(a) klméra molekula komplett DNS- és kikövetkeztetett aminosav szekvenciáját a 24A-24C. ábrán mutatjuk be.
Példa
Módosított Flf1 receptorok előállítására használt selttenyésztési eljárások
Az Flf1D2,Fik1D3,FcAC1(a) fehérje előállítására használt eljárás, az előzőkben, az 1. példában Ismertetett pFlt1D2.FikTD3,FeáC1(a) expressziős plazmid használatával magában foglalja a íehérjeíerméket konstitutíve expresszáló rekombináns aranyhörcsög petefészek (CHO K1/E1A) sejtek szuszpenziós tenyésztését. A sejteket bioreaktorban szaporítjuk, majd a íehérjeíerméket affinitás- és méretkizárásos kromatográfiával izoláljuk és tisztítjuk. Az eljárás az alábbiakban részletesebben adjuk mag.
A sejtek szaporifása
Az Fit1D2.Fik1D3.FoAC1(a)~t expresszáló sejtvonalat tartalmazó két-két egybenőtt T~ 225 cm2 palackban levő sejteket szaporítunk sí, oly módon, hogy a sejteket nyolc darab T225 cm2 palackba visszük át táptalajban (GOEM + fö% szérum, GÍBCO), majd 37 c'C-on in3S * A « »'♦'♦»***♦ ♦ * * * * * * ΜΦΦ* *♦* kubaijuk 5% CÖ2~f tartalmazó atmoszférában. Amikor a palackokban a sejtek már majdnem összenőttek (körülbelül 3-4 nap), a sejteket tripszinnei leválasztjuk. Friss táptalajt adunk hozzá, hogy a sejteket megvédjük a frípszinnel való további érintkezéstől. A sejteket centrifugáljuk és friss táptalajban reszuszpendáljuk, majd nyolc 850 cm2 forgatott palackba transzferáljuk, majd 37 °C-on ínkubáljuk 5% Cöri tartalmazó atmoszférában, ameddig a sejtek öszszenőnek.
A forgatott palackokban szaporított sejteket íripszinezzük, hogy leválasszuk őket a felületről, majd szuszpenziös tenyészet táptalajban mossuk. A sejteket aszeptikusán visszük át ötliteres bioreaktorba (New Brunswick Celligen Plus), ahol a sejteket 3,5 literes szuszpenzlős tenyészetben szaporítjuk, A szuszpenziös tenyészet táptalaj glutamin-mentes, alacsony glükóztartaímű módosítása az IS-CHO-nak (Inrine Scientific), amihez 5% borjúmagzat szérumot (Hyclone), GS kiegészítőt (Life Technologies) és 25 ttmol/l meííooin-szuiíoximinf (Sigma) adtunk. A pH-t 7,2-re szabályozzuk széndioxid gáznak a bevezetett gázhoz való hozzáadásával, vagy nátrium-karbonát oldatnak a bioreaktorba való adagolásával. Az oldott oxigén szintjét 30%~os telítési értéken tartjuk, oxigénnek vagy nitrogénnek a bevezetett gázhoz való hozzáadásával, majd a hőmérsékletet 37 cC-on tartjuk. Amikor a 4x10° ssjt/mí sűrűséget elérjük, akkor a sejteket átvisszUk egy negyveníiteres bioreaktorba, ami ugyanazt a táptalajt tartalmazza, és ugyanúgy van szabályozva, mint a kisebb bioreakfor. A hőmérsékletet 34 °C-ra állítjuk, hogy lassítsuk a sejtek növekedését, és ezzel növeljük a fehérje expressziójának relatív arányát.
(b) Az Fit1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a) előállítására használt sejttenvészfésl eljárások
Az előzőkben ismertetett, az Flt1D2.Flk1D3.FoAC1(a) fehérje előállítására használt eljárást alkalmazzuk az FltW2.VE6FP3D3,FeAC1fa} előállítására.
A.módosjtott_Flf1..repepfprgkös^egyújtése.és tisztítása (ak.Az,.mD2,Fík1D3:FcAC1f^,összegvű Itése és tisztítása
A fehérjeterméket aszeptikusán gyűjtjük össze a bíoreaktorböi, Miiíipore Prosíak fangencíális áramlású szürömodülokkal, és gyenge nyírásű mechanikai szivattyú (Fostam) alkalmazásával. Foss táptalajt adunk a bioreaktorhoz, hogy helyettesítsük azt, amit eltávolítottunk a begyűjtő szűrés során. Körülbelül negyven liter összegyűjtött szűrletet viszünk fel egy 400 ml-es oszlopra, ami Protein A Sepharose gyantát tartalmaz (Amersham Pharmacia). A felvitel után a gyantát 10 mmol/1 nátriumfoszfátot, 500 mmol/1 nátrium-kíortdot (pH7,2) tartalmazó pufferrei mossuk, hogy az összes megkötetlen szennyező fehérjét eltávolítsuk. Az
Flt1D2.Fík1D3.FeÁC1(a) fehérjét egy pR~3,Q pR~jü cifrát pufferrel eluáljuk. Az eluált fehérjét TRISZ bázis hozzáadásával semlegesítjük, majd -20 °C~ra lefagyasztjuk,
Az előzőkben ismertetett Protein A lépésből származó, számos lefagyasztott Fit1D.2.Flk1D3.FcÁC1(ej fehérje sarzsof megolvasztunk, egyesítünk, majd egy Millipore 30RD névleges molekulasúly vágási értékű (NMWCO) tangenoiátis áramlású szörőmembránnal töményítjük, A fehérjét azután átvisszük egy bevehetett cella koncentrátorba (Millipore), majd tovább töményítjük 30 mg/mi-re, egy 30 kDa-os NMWCO membránt használva. A töményifett fehérjét egy méretkízárásos oszlopra visszük, amit Superdex 200 gyantával töltöttünk meg: (Amersham Pharmacia), és foszfáttal puffereit sóoldat plusz 5% glicerin összetételű oldattal hoztunk egyensúlyba. Ugyanezt a pufiért használjuk az oszlop futtatására. Az Fít1D2.Flk1D3.FcAC1(a} dimernek megfelelő frakciókat egyesítjük, egy 0,22 mikronos szűrővel sterilre szűrjük, alíkvot részekre osztjuk és lefagyasztjuk.
iszegyujfése és tisztítása
Ugyanazt az eljárást használjuk az. Fíf1D2.VEGFR3D3.FcÁC1(a) összegyűjtésére és tisztítására, mint amit az :Fít1D2,Rk1D3.FcAC1(a} összegyűjtésére és tisztítására használtunk.
eXPéida
A tranziensen expresszálódott..VEGFR2.foszfori:iezési esszéje
Primer humán köldökvéna endcteliálss sejteket (HUVEG-ek), 4-5-szor átoltva, 2 óra hosszat éhezleijük szérummentes, magas gíükózfartalmú DME táptalajban. A 40 ng/ml (1 nmoFI) VEGF1:85-őt - ami az Flt1, Flkl , és Flt4(VEGFR3) VEGF receptorok iiganduma - tartalmazó mintákat készítünk, majd 1 őre hosszat szérummentes DME táptalajban, ami magas gíükózfartalmú és 0,1% BSÁ-t tartalmaz, szobahőmérsékleten elöínkubáijuk különböző mennyiségű módosított Fitt receptorral: Flt1:(1-3)-Fc-mal, Flt1(1-3)-Fc (A40)-nei, FiílD2.V£GFR3:D3.FcÁG1(a)-vaí és Rt1D2,Fík1D3,FoAG1(a)-vaL A sejteket 5 percig ingereljük az előzőkben említett mintákkal *f~ VEGF165-tel, majd komplett iizis pufferrel teljessejt lizáltatásf végzünk. A sejtiizátumokat immunprecípitáljuk egy, a VEGFR2. receptor C-termináíisa ellen készített ellenanyaggal. Az immunprecípltált íizátumokat 4-12%-os SDS-PAGE Novex gélre visszük, majd standard transzfer-módszerekkel PVDF membránra visszük át. A foszforiiezett VEGFR2 kimutatását immunbíötfolássaí: végezzük, 4G1Ö jelű anti-foszfotífozín monokíonálís ellenanyaggal (UBI), majd ECU reagenssel (Amersham) hívjuk élő. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 28A-26B. ábrákon mutatjuk be. A 2SA-2SC ábráról kiderül, hogy a tírozlnon foszforiiezett VEGFR2(Flkl) VEGE 185 lígandum stimulálással végzett Western biot kimutatás azt mutatja, hogy a sejtfelszíni receptorok különböző mértékben foszforliezodnek, attól függően, hogy melyik módosított Fít1 receptort használjuk a VEGF-fei végzett előinkubálás során. Amint az a 25A. ábrán látható, az Fit1(1-3)-Fc, ez Fit1(1-3)-Fc (A4Ö) vagy a tranziens Rlt1D2.Fik1D3,FcAC1(a} 1,5-szeres mőiföíösiegánéi ez a három módosított Fltl receptor a receptor siimuiálá&ának teljes blokkolását mutatja, a kontroll táptalajjal való ingerléssel összehasonlítva. Ezzel ellentétben, a tranziens Flt1D2.VEGFR3D3.FcACt(a} nem mutat szignifikáns blokkolást ennél a móifolöslegnél, a VEGF pozitív kontroli ingerléssel összehasonlítva. Hasonló eredmények láthatók a 25S. ábrán, ahol a módosított Fit receptorok háromszoros móífölőslegben vannak a VEGFT65 lígandummal szemben, A 25€, ábrán, ahol a módosított Fltl receptorok hatszoros méltólösiegben vannak a VEGEI 65 Ugandámmal szemben, a tranziens Fii1O2.VEQFR3D3.FcAC1(a)~röi ki lehet mutatni, hogy részlegesen blokkolja a sejtfelszíni receptorok VEGEI 55-iel indukált sttmuiálasát.
A 26A-26B. ábrákon az látható, hogy a íirozíncn foszfor!lezett VEGFR2(Fikt1) VEGEI 65 síimuiáiásss! végzett Western biot kimutatás azt mutatja, hogy a sejtfelszíni receptorokat azok sz ingerlő minták nem íeszforilezik, amikben olyan VEGF18S van, amit 1-2szeres mólföiöslegü (26A. ábra) vagy 3-4-szeres mólíölösiegö (268. ábra) tranziens Fit1D2,VEGFR3D3.FcÁC1(a)-val, stabil Flt1D2.VEGFR3D3.FoÁC1(a)-vai vagy tranziens VEGFR1R2-FcACl(a)-val előinkubáltunk. Mindegyik vizsgált módosított Fitt receptor koncentráció kötődést mutat a VEGF165 íigandumhoz az eíőinkubálás során, ami azt eredményezi, hogy a sejtfelszíni receptorok nem mutatnak kimutatható síimulálásf a megkötetlen VEGF165 hatására, a kontroli táptalajjal való ingerléssel összehasonlítva.
24. Példa
A teszt sejtpopuláció MGS? sejtekből áíl, amiket stabilan transzfektáltunk egy olyan expressziós plazmiddal, amit egy olyan DNS ínszeríeí tartalmaz, ami a VEGFR2(Fik1) extraceiluláris domént tartalmazza, a TrkB íniraceliulárís kináz doménhez fúzionáltatva, ezzel kimére molekulát állítva elő. Az ok, amiért a természetes VEGFR2(Fik1) intracelíutáhs dómén helyett a TrkS Iníracelíuláris kinéz domént használjuk, az az, hogy a VEGFR2(Fik1) Intraceíiuláris kináz doménje nem eredményez erős szaporodási választ, ha ezekben a sejtekben a sllmuláiást VEGEI 65-tel végezzük. Az ismert, hogy a teljes hosszúságú TrkS receptort tartalmazó MGS? sejtek erős szaporodási választ adnak, ha BDNF-fel stimulálják őket, így a TrkB intraoelluláris kináz domént építettük be biotechnológiai módszerekkel, a ¥'EGFR2(Flk1) intraoelluláris kinéz doménje helyettesítésére, hogy ezzel kihasználjuk ezt a szaporodási válasz képességet.
5* IQ'5 sejt/luk sűrűségben szélesztjük a sejteket egy 96-lukas lemezre, majd hagyjuk, hogy 2 óra hosszat 27 öC-on ülepedjenek. Az alábbi módosított Fit receptorokat: Fltl (1 -3)Fc, Fitt D2.Flk1D3.FoÁC1 (a), Fif1D2.VEGFR3O3.FcÁC1(a) plusz egy irreleváns, Tle2-Fc receptort mint negatív kontrollt titrálunk 40 nM-ról 20 pM-ra, majd a sejteket egy óra hosszat 37 eC-on ínkubáljuk. Humán rekombináns VEGFlSS-öt adunk a lukakhoz definiált táptalajban, 1,56 nM koncentrációban. A lemezeket 72 óra hosszat 37 °C~on ínkubáljuk, majd ** »»»
MTS-t (Owen reagens, Promega) adunk hozzá, és a lemezeket további 4 óra hosszat inkubáljuk. Végezetül a lemezeket egy spektrofotométerrel olvassuk le-450/570 nm-en. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 27. ábrán mutatjuk be, A Tíe2-Fc kontroll receptor nem blokkolja a VEGF185 által Indukált sajtszaporodást, egyik koncentrációban sem, míg az Flt1D2.Fík1D3.FcAC1(a) blokkolja az 1,56 nM VEGF165~et, 0,8 nM fél maximális dózisnál. Az Fít1{1-3)-Fc és az Fíí1D2.VEGFR3Ö3.FcÁCl(a) ebben a vizsgálatban kevésbé hatékonyan blokkolja a VEGFt85-öí, ~2 nM fél maximális dózissal. A VEGF165 egyedül 1,2 elnyelési egységet mutat, a háttér 0,38 elnyelési egység.
A módosított Fit receptorok kötési sztöchiomefríája a VEGEI 65-böz (a) BIAoore elemzés
Az Fit1D2.Flk1D3.FoAC1(a) és a VEGFR1R2-FoAC1(a) humán VEGFISo-tel való kölcsönhatásának sztöehiometriáját ágy határoztuk meg, hogy vagy mértük a VEGF telítési kötődés szintjét az Fíi1D2.Pík1D3.FcAC1(a} vagy VEGFR1R2-FcAC1(a) felszínekhez, vagy mértük a VEGF165-nek azt a koncentrációját, ami ahhoz kell, hogy teljesen megakadályozzuk az RtW2,Fik1D3.FcAC1(a) vagy a VEGFR1R2-FcAC1(a) kötődését a VEGF BIAcore chíp felszínére. A módosított Flt1D2.Flk1D3,FcACí(a) és a VEGFRíR2~FcÁC1(a) Fit receptorokat egy anfí-Fo specifikus ellenanyaggal fogtuk be, amit először egy Biacore chipre ímmobiíizáltunk (BAICORE), amin-kaposolási technika alkalmazásával. Negatív kontrollként egy üres ellenanyag felszínt használtunk. A VEGE 165-of 1 nM. 10 nM, és 50 nM koncentrációban Injektáljuk az Fií1D2.Fík1D3.FcACl(a) és VEGFR1R2-FcÁC1(a) félszínek fölé, 10 μ l/perc sebességgel, 1 óra hosszat. Valós idejű kötési szignált jegyeztünk fel, és a telítési kötődést az egyes injekciózások végén értűk el. A kötési sztóchiometriát úgy számítjuk ki, mint a megkötött VEGF185-nek az Ímmobíiizáíl FiíW2.Fík1D3.FcAGíía}-hoz vagy VEGFR1R2FcAC1(a)~hoz viszonyított mólarányát, 1030 RU ekvivalens 1 ng/ml konverziós faktor alkalmazásával. Az eredmények által jelzett sztöchiomefria egy VEGF165 elmer molekula per egy Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(aj vagy VEGFR1R2-FcAC1(a) molekula (28. ábra).
Oldatban az FltlD2.Flk1D3.FcAC1(a)-t vagy a VEGFR1R2-FcAC1(a)-t 1 nM koncentrációban (ami a becslések szerint ezerszer nagyobb, mint az Fíí1D2.Fík1D3.Fc.AC1(a) vagy a VEGFR1R2-FcACl<a) KD értéke) keverjük össze különböző koncentrációjú VEGF185-fei. Egyórás ínkubáíás után a szabad Rt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) oldatban való koncentrációját mértük az amin-kapesoit VEGF16S felszínhez való kötési szignálként. Kalibrációs görbét használunk az Fit1D2.Fík1D3.FcACl(a) BIAcore kötési szignálnak a moláris koncentrációvá való konvertálására. Az adatok azt mutatják, hogy 1 nM V'EGFt65 hozzáadása az Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) oldathoz teljesen blokkolja az Fít1D2.Fik1D3.FcAÜí(a) kötődését a VEGF165 felszínhez. Ez az eredmény azt sugallja, hogy hogy a kötési sztöchíometha egy VEGF185 molekula per egy Fit1D2.Fík1D3.FcÁC1(a) molekula (29. és 30. ábra). Ha az
Φ» X
ra és -1.07 a VEGFR1R2-FcAC1(a)-ra. A meredekség nagyságrendje, nagyon közel a negatívhoz, azt jeízi, hogy egy molekula VEGF185 kötődik egy molekula Flt1D2.Fík1D3.FcA C1(a}~hoz vagy VEGFR1R2-FcÁC1faJ-hoz.
(b'í Méretkizárásos kromatográfía
Az Rt1D2,Flk1D3.FcÁC1(a)-t háromszoros fölöslegben levő VEGF185-tel keverjük össze, és a receptor-iigandum komplexet Pharmacia Superose 8 méretkizárásos kromatográfiás oszlopon tisztítjuk. A receptor-iigandum komplexet azután 5 mol/l guanídint tartalmazó pufferben Inkubáljuk, hogy komponens fehérjéire disszociálódjon. Az Flt1D2.FikW3.FcÁ C1(a}-t a VEGF185-töl Superose 6 méretkizárás kromatográfiás oszlopon választjuk el, amit 8 mol/l guanidium-klohddal futtatunk. Ahhoz, hogy meghatározzuk a komplex sztöchiometnáját, számos Fit1ö2,Flk1D3.FoÁC1(aj és VFGF18S lojekclozsst hajtunk végre, és a csúcsmagasságot, vagy a csúcs alatti területet ábrázoljuk az injektált fehérje koncentrációjának függvényében, A kalibrálást olyan körülmények között hajtjuk végre, ami azonos azzal, amit az Flt1D2.Fik1D3,FcAC1(a)/VEGF komplex elválasztására használtunk. Az FiÜD2.FiklD3..FcA€1<a)/VEGF komplex összetételének mennyiségi meghatározása a kalibrációs görbék alapján történik. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 28, ábrán mutatjuk be, ami a VEGF155-nek az FittD2.Flk1D3,FcAC1 faihoz való arányát 1:1-nek mutatja egy komplexben.
25. Példa
3,81 mg/ml koncentrációjú VEGFt65~öt keverünk össze CHO sejtekben tranziensen expresszált Fit1D2.Flk1D3.FcÁG1(a}-vai (koncentrációja 0,9 mg/ml), 3:1 mólarányban (VEGF165; Flt1D2.Fik1D3,FcAC1(a)), majd éjszakán át 4 °C-on inkubáljuk.
fa) Méretkizárásos kromatopráfa (SEC) természetes körülmények között
Ahhoz, hogy a komplexet elválasszuk a megkötetlen VEGF185-től, a komplexből 50 μΐ-t viszünk fal agy Pharmacia Superose 12 PC 3,2/30 oszlopra, amit PBS pufferben hoztunk egyensúlyba. A puffért ugyanezzel a puffénál eluáljuk, 40 μΙ/perc áramlási sebességgel, szobahőmérsékleten. Ennek a SEC-nek az eredményeit a 31. ábrán mutatjuk be. A #1 csúcs reprezentálja a komplexet, míg a #2 csúcs reprezentálja a megkötetlen VEGF185öt. Az 1,1 és 1,2 mi között éluálódott frakciókat egyesítjük, majd guanldium-hídrokloridot (GuHCi) adunk hozzá 4,5 mol/l vég koncentrációban, hogy a komplexet disszocíáljuk.
fb) Méretkizárásos kromatográfa disszleelaíiv körülmények között
Ahhoz, hogy a recepfor-iigandum komplex komponenseit elválasszuk, és móiarányukat meghatározzuk, 50 pl disszociált komplexet az előzőkben ismertetett módon felviszünk egy Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 oszlopra, amit 8 mol/1 GuHCHei hoztunk egyensúlyba, majd ugyanezzel az oldattal eluáljuk, 40 μΙ/perc áramlási sebességgel, szobahőmérsékleten. Ennek a SEC-nek ez eredményeit a 32. ábrán mutatjuk be. A #1 csúcs reprezentálja az Rt1D2,Flk1D3.FcAC1(a)-t míg a #2 csúcs reprezentálja s VEGF165-öt.
(c) A Flf1D2.RklD3.FcÁG1(a).VEGF185 komplex szfóchiometriálenak számítása
A receptor-llgandum komplex sztochiomeíriájáí vagy a komponensek csúcsa alatti területből, vagy a csúcsok magasságából számítjuk ki. A csúcsmagasságnak vagy a csúcs alatti területnek megfelelő VEGF155 vagy a FiílD2.Flk1D3.FcACl(s) koncentrációkat VEGF155-tei és Fil1Q2.Flk1Q3.FcÁC1(a)-val készített standard görbékből kapjuk. A standard görbe előállításához az egyes komponensekből négy különböző koncentrációt (0,04 mg/ml - 0,3 mg/mí) injekciózunk egy Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 oszlopra, amit 6 mol/l GuHCl-iel hoztunk egyensúlyba, majd ugyanezzel az oldattal eluáljuk, 40 μΙ/perc áramlási sebességgel, szobahőmérsékleten. A standard görbét úgy kapjuk, hogy a csúcs alatti területet vagy a csúcs magasságát ábrázoljuk a fehérje-koncentráció függvényében. A csúcsok alatti területből meghatározott V£GF165:Eií1D2,FíkiD3.FcACi{a) mólarány 1,16. A csúcsok magassága alapján meghatározott VEGF1S5:Fit1Q2.Fík1D3.FcÁC1(a} mólarány
1,10..
Az Flt1D2.FiR1D3.FcAC1(a):VEGF1S5 komplex sztöchiometnájának meghatározása méretkizárásos krcmatooráflával, on-line fényszórással
A komplex előállítása
A ¥EGF18S-őt CHO-ban tranziensen expresszált RtW2.Flk1D3.FcAC1(a) fehérjével keverjük össze 3:1 (VEGF165: FltW2;Rk1D3.FcAC1(a)) mólarányban, majd éjszakán át 4 0 C-on Inkubáljuk.
Egy MlnlDawn on-line fényszörási detektorral (Wyatt Technology, Santa Barbara, Kalifornia) és fénytörési Index (Pl) detektorokkal (Shlmedzu, Kyoto, Japán) felszerelt méretkizárásos kromatográfiás oszlopot használunk, hogy meghatározzuk a receptor-tigandum komplex molekulasúlyét. A mintákat egy Superose 12 HR 10/30 oszlopra injekciózzuk (Pharmacia), amit PBS puffénál hoztunk egyensúlyba, és ugyanezzel a pufferre! eluáljuk 0,5 ml/perc áramlási sebességgel. Amint az a 33, ábrán látható, az eiúciös profilon két csúcs
X X van, A #1 csúcs reprezentálja a recepíor-ljgandum komplexet, a #2 csúcs reprezentálja a megkőtetien VEGF166~öf. A molekulasúlyt az LS és az Rl szignálokból számítjuk ki. Ugyanazt az eljárást használjuk a recéptor-ilgandum komplex egyes komponensei molekulasúlyának meghatározáséra. Ezeknek a meghatározásoknak az eredménye az alábbi: az Flt1D2,Flk1D3.FcAC1(a,WEGF185 komplex molekulasúlya a csúcs pozíció 157 300 (33. ábra), a VEGF18S molekulasúlya a csúcs pozícióban 44 390 (34. ábra), és az. R1R2 molekulasúlya a csúcs pozícióban 113 300 (35. ábra).
Ezek az adatok azt mutatják, hogy az Fif1D2.Fik1D3.FcAC1(a)AZEGF154 komplex sztcchíomethája 1.1, mivel megfelel az Fit1D2,FlkW3.FcÁC1(a) és a VEGF185 molekulasúlya összegének. Lényeges, hogy ez a módszer következetesen igazolta, hogy az Fit1D2.Fik1D3.FcAC1(a},A/ECF154 komplex valóban csak egy molekula VEGF185 ligándumoí és csak egy molekula F111 D2.Flk1 D3.FcAC1 (a}-t tartalmaz.
Az FltW2,FíklD3.FcACl(a) diszulfid struktúráját és gliközilezési helyeit peplid-lérképezési módszerrel határozzuk meg. Eszerint a módszer szerint a fehérjét először tnpszinnel hasítjuk. A triptlkus íragmensekeí elemezzük, majd tömegspektroszkőplával összekötött HPLC-vei azonosítjuk, az M-terminális szekvenálási technika mellett. A írietikus emésztmény redukcióját használjuk a diszulfid-hidaí tartalmazó íragmensek azonosításának segítésére, A triptlkus emésztmény PNGase F-fei (Glyko, Novaío, CA) való kezelését használjuk az Nkapcsoit gliközilezési helyekkel rendelkező íragmensek azonosítására.
Összesen tíz eiszteín van az FltlD2.FiktD3.FcACl(a}-ban; ezek közöl hat az Fc régióba tartozik, A Cys2?-ről igazoltuk, hogy a Cys78~íal alkot diszulfid hidat. A Cys121-röl igazoltuk, hogy a Cys182-vei alkot diszulfid hidat. Az Fo régió első két clszteinje (Cys211 és Cys214) Intermoiekuláns diszulfid-kötést képez egy másik Fo láncban levő, ugyanezen két clszíeinnel. Mivel azonban ezt a két ciszteint nem lehet enzimatlkusan elválasztani egymástól, nem határozható meg, hogy a díszulfid-kötés ugyanazon két eisztein (.Cys211 a Cys211bez, például), vagy a Cys 211 és a Cys214 között jön létre. A Cys218-rőí igazoltuk, hogy diszu ifid-kötési képez a Cys388-tai. A €ys352-rol igazoltuk, hogy a Cys410~zel képez dlszulfld-kötést.
Az Flt1D2.Fik1D3.FöACl(a)-ban öt lehetséges M-kapcsolt gliközilezési hely található. Kiderült, hogy mind az őt különböző mértékben glikozileződik. A komplett giikoziiezés az Asn33 (NIT aminosav szekvencia), Asn193 (NST aminosav szekvencia) és Asn282 (NST aminosav szekvencia) pontokon figyelhető meg. Emellett a részleges gliközilezési az Asn258-on és az Ásn128-on lehet megfigyelni. A gliközilezési helyeket a 38, ábrán aláhúzással emeljük ki.
* **
ΦΦ*
2&Rélda
A módosított Fit receptorok farmakokínetikai elemzése
M.M..£IÍíh3hfT...(A4g), 3z..SiDgai^£cACiM^..mi^
VEGFR1R2-FcAC1 fa) farmakokioeflkai elemzése
Saíb/c egereket (25-30 gramm) szubkután injekciózunk 4 mg/kg Fit1(1-3)-Fc (A40jnel a CHO-ban tranziensen expresszálódó Fit 1D2.Flk1D3.FcAC1(a)Vaí, a CHO-ban stabilan expresszálódó Flt1D2,Flk1D3.FcAC1(a)-val és a CHÖ-ban tranziensen expresszálódó VEGFR1R2-FcÁC1(a}~val. Az egereket az ínjekolózás után 1, 2, 4, 8, 24 órával, 2 nappal, 3 nappal és 6 nappal a farkukon yérezteljük. A szérumokét olyan ELISA-val elemezzük, amit az Fit1(1-3)-Fc (A40), az RÍ1O2 ,Flk1D3.FcACl7a) vagy a VFGFR1R2-FoAC1(a) kimutatására terveztünk. .Az FLlSA-ban egy ELISA lemezt VEGFI-SS-teí borítunk, e kimutatandó Plt1(1~3)~Fc (A4ö)-el, Flt1D2,Fík1D3.FcAC1(aVf vagy VEGFR1R2-FoACT(a)-t hozzákötjük, és a kiértékelést egy tormaperoxidázhoz. kapcsolt anfl-Fc ellenanyaggal végezzük. Ennek a kísérletnek az eredményei a 37, ábrán láthatók. Az Fif1(1~3)-Fc (A4Ö) Tmax értéke 6 óránál van, míg a tranziensen és stabilan expresszálódó Flí1ö2.Flk1D3.FcAC1ís) és a tranziensen expresszálódó VEGFR1R2-FcAC1ta) Tmax értéke 24 óránál van. Az Flt1(1-3)-Fc (A4G)
Cmax értéke 8 linókét tranziens (Flt1D2,Flk1D3,FoACl(a) és VEGFRíR2-FeA
C1(a)) esetében a Cmax 18 pg/ml, és a stabil VEGFR1R2-FeAC1 (a)} esetében 3Ü üg/ml.
az Flt1D2.FÍk1B<
LVEGFR3D3farffiahakMkeí.elemzése
Balb/c egereket injekciózunk szubkután 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fo (A4ö)-nel, CHÖ-ban tranziensen expresszálódó Flt1D2.Flk1D3.FoAC1(a)-vaÍ és CHÖ-ban tranziensen expresszálódó Flt1D2.VEGFR3D3-FGAG1fa)-val. Az egereket az iniekcíózás után 1, 2, S. 8, 7.
8, 12, 15 és 20 nappal a farkukon véreztetjük. A szérumokat olyan ELISA-val vizsgáljuk, amit sz Flf1{1-3)~Fc, az Flt1O2,EklD3,FcAClfa) és az Et1D2.VEGFR3D3-FcAC1(a) kimutatására terveztünk. Az. EUSA-ban egy ELISA lemezt VEGF185-tel borítunk, az Fit1(1-3)~Fct, az Flt1D2,FIK1 D3.FcAC1(a)-t és az Fit1O2.VEGFR3D3-FcAC1(a)-t hozzákötjük, és a kiértékelést egy tormaperoxidázhoz kapcsolt enti-Fc ellenanyaggal végezzük. 5 nap elteltével az Fitl(1~3)~Fc (A4Ö) nem mutatható ki a szérumban, míg az az Flt1D2,Fik1D3.FcAC1fa)-t és az Fií1D2.VEGFR3Ö3-FcACÍ(a)-i 15 vagy több nappal később Is ki lehet mutatni. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 38. ábrán mutatjuk be.
30, Példa
Az Flf1G2.FlklO3.FcAC1(a) in vivő tumornövekedést gátló képességének kiértékelése
Ahhoz, hogy kiértékeljük az Flf1D2.FifcíD3.FcAC1(a)~nak azt a képességét, hogy in vivő gátolja a tumornövekedést egy olyan modellben, amiben a tumorsaitok szuszpenziójái szubkután felnőtt, súlyos kombinált ímmundefioienciában (SCID) szenvedő egerek jobb bor46 paszába injekciózzuk. Két sejtvonalat használunk ebben a kísérletben, a humán HT-1080 fibroszarkóma sejtvonatat (ATCC letéti szám. CCL-121) és a patkány C6 glióma sejtvonalat (ATCC letéti szám CCL-197), amik élesen eltérő morfológiával és növekedési jellemzőkkel rendelkeznek. A Fit1D2,Flk1D3.FcAC1(a) első dózisát (25 rng/kg, amint az a 39. és 40·. ábrán látható) a tumor beültetésének napján adjuk be. Az allétok ezt követően két hétig minden másnap (EOD), vagy hetente kétszer (2X/wk) szubkután injekcióban Flt1(1-3)-Fc (A4Ö)-ef, Fif1D2.Flk1D3.FcAC1(a)-t vagy csak hordozót kapnak, 2 hét elteltével az állatokat fixálóval perfundáljuk, a tumorokat eltávolítjuk, és a mintákat lezárjuk. Meghatározzuk a tumor térfogatát, oly módon, hogy megmérjük a tátható szubkután tumorok hosszát és szélességét. Mind az Fltl (1 -3>Fc (A40)s mind a Flt1D2.Flk1Ö3.FcACl(a) szignifikánsan csökkenti a HT1080 és CS sejtek által képezett tumorok növekedését és méretét. Ezeknek a kísérleteknek az eredményeit a 39 és 40. ábrán mutatjuk be.
A.yEGg1^5.iis..a..rnóágÉ^I&J^^^5LM^LaL0^n^j^I^uW.v.rend^eréfe
A vaszkuláhs átrendeződésnek a reproduktív ciklus során a méhben és a petefészekben kialakuló sztereotipikus mintázatát alaposan jellemezték., ami ezeket a szöveteket különösen alkalmassá teszi azoknak a mechanizmusoknak a tanulmányozására, amik az angíogenezist, a vaszkuláhs átrendeződést és a vaszkuiáris regressziót szabályozzák. Valóban, a reproduktív szövetekben végzett /n síin hibridizációs vizsgálatok adták az első világos bizonyítékát annak, hogy a VEGE a fiziológiás angiogenezis mediátoraként működik felnőtt rágcsálókban, valamint emberekben és nem-humán főemlősökben (Phillips és munkatársai (1990); Ravindranath és munkatársai (1992); Shweiki és munkatársai (1993); Kamat és munkatársai (1995)). Mivel a ciklikus angiogenezis és a vaszkuiáris átrendeződés prominens tulajdonsága a normális méhnek és petefészeknek, ezért nem meglepő, hogy az abnormális vérér növekedésről és/vagy vaszkuláhs diszfunkcióröl kiderült, hogy számos olyan patológiás állapotot jellemez, amik ezeket a szerveket érintik. Emellett ezekről a vaszkuláhs aonormailiásökrói azt gondolják, hogy egy vagy több angiogén vagy antl-angiogén faktor leginkább a VEGF szabályozatlan expressziója okozza vagy állandósítja.
Az abnormális angiogenezis például jellemző a policisztás petefészek betegségekre, az endomeídözisra és az endometriálís karcinőmára, és minden esetben a VEGE fúlexpresszálödik az érintett szövetekben [Kamat és munkatársai (1995); Shifren és munkatársai (1996); Gaidi és munkatársai (1998); Donnez és munkatársai (1998)]. A VEGF iulexpresszíójáról is azt gondolják, hogy patogén szerepet játszik a szisztémás vaszkuiáris hiperpermeabilitásban, a petefészek hlpersfimulácíós szindrómában [McClure és munkatársai (1994); Levin és munkatársai (1998)]: és a rángógöros előtti állapotban [Baker és munkatársai (1995); Sharkey és munkatársai (1998)]. Emellett a VEGF-et egy permeabiiításí faktornak is tekintik, ami felelős a petefészek karoinómához kapcsolódó aszoitesz termeléshez és más tumorokhoz (Senger és munkatársai (1983); Boocock és munkatársai (1995)}. Azok az ágensek, amik hatékonyan semlegesítik a VEGF biológiai hatását, amikről ésszerűen elgondolható, hogy terápiás előnyt biztosítanak ez előzőkben említett és ezekkel rokon állapotokban.
Az angiogenezís és a vaszkuiáhs átrendeződés a bíasztociszta implantációban és a méhlepény fejlődésében is meghatározó szerepet játszik {Fíndlay (1986)}. A VEGF erősen éxpresszálódík mind a méhlepényben, mind az embrionális trofoblasztokban, ahol azt gondolják, hogy az implantáció előtti periódusban először stimulálja a méh vaszkulatúra expanzióját és hlperpermeahiíitésát majd ezt követően befolyásolja a méhlepény vaszkulatúra anyai és embrionális komponenseinek képződését {Shweíkí és munkatársai (1993); CollinánBove és Koos (1993); Chakraberty és munkatársai (1995); Das és munkatársai (1997)}, A VEGF-re a luteálís angiogenezishez is szükség van, és a kapcsolódó progeszteron szekréciö ahhoz szükséges, hogy a mehet előkészítsük' az implantációhoz (Ferrara és munkatársai (1998)1, Tehát azok az ágensek, amik gátolják a VEGE biológiai hatását, hasznosnak bizonyulhatnak fogamzásgátló szerként (az implantáció megakadályozásával), vagy magzatéihajtó szerként a gesztáeió korai fázisában. Az utóbbi alkalmazás különösen a méhen kívüli terhesség nem-műtéti megszüntetésében lehet rendkívül hasznos.
Miközben a VEGF receptorok expressziója a normális reproduktív szövetekben nagymértékben a vaszkuiáhs endotéliumra korlátozódik, ez Flt1~ei trofobíssztok expresszálják a méhlepényben mind emberekben, mind állatokban (Clark és munkatársai (1996); He és munkatársai (1999)}, ahol az elképzelések szerint a írofobiaszi Invázióban játszik szerepet. Érdekes módon mind az Fitl-et mind a KDR (F(k1)-et a BeVVo koriokarcinóma sejívonal expresszéka [Charnock-«Jones és munkatársai (1994)], és a VEGF-rői kimutatták, hogy ezekben a sejtekben elősegíti a MAP kinéz DNS szintézisét és tirozín-foszfohlezésél. Emellett, a primer vagy áttétes petefészek karcínómák nemcsak magas szinten expresszélják a VEGF-et, hanem - a vaszkuiáhs endotéiíum mellett - a tumorsejtek maguk is expresszálják a KDR-t és/vagy az Fltl-et {Boocock és munkatársai (1995)). Ezek az eredmények azt sugallják, hogy a VEGF nemcsak kritikus szerepet játszik a tumor vaszkulatúra létrehozásában és fenntartásában, hanem legalább néhány reproduktív eredetű tumorban a VEGF autóiéin szerepei is játszhat, közvetlenül támogatva a tumorsejtek túlélését és szaporodását. Tehát azok az ágensek, amik blokkolják a VEGF hatását, különösen jótékony hatású alkalmazások lehetnek a reproduktív eredetű tumorok kezelésében.
yóds^jel£éseredmények (a) A VEGF-fel Indukált méh hlperpermeabílltás becslése
Vemhes kancák szérum gonadotroplnjáf (PMSG) Injekciózzuk szubkután (5 NE), hogy ovulációt indukáljunk pubertás előtti nőstény patkányokban. Ez 2 nappal később ösztradioi hullámot eredményez, ami viszont a VEGF indukcióját okozza a méhben. Leírták, *
«φ .« φ *«Φ« »·«♦ ♦ ** φ ♦ * φ » * *· * # « «φφ *♦* * « φ ♦ * * φ * « ,φφφ φ *φ φ«* φ* hogy ez az indukció δ órával később a méh hiperpermeebilltását és a méh nedves súlyának növekedését eredményezi, és ennek következtében potenciálisan blokkolható a módosított Fit receptorokkal: Flt1(1-3)-Fe (AAOj-nel, Flt1D2.Fík1D3.FcAC1(a)-val és
Flí1D2.VEGFR3D3,FcAC1(a)-val. Ebben az. írt wo modellben a patkányméh normális súlya körülbelül 50 mg, és ez indukálható PMSG-vel 300-350 mg-ra. A szövet kiszárításából kiderül hogy ez mind víz. Az Flt1(1-3)-Fc (A4Ö), Fif1D2.Flk1D3.FcAC1(a) és
Flt1D2.VEGF'R3D3.FcACl(a) 25 mg/kg-ban 1 órával a PMSG injekció után beadott szubkután injekciója a méh nedves súlya növekedésének körülbelül 5ö%-cs gátlását eredményezi. A módosított Fit receptor növekvő dózisa nem csökkenti tovább a nedves súlyt, ami azt sugallja, hegy ebben van egy VEGF-íüggeilen komponens. Ennek a kísérletnek az eredményeit a 41. ábrán mutatjuk be.
(a) A sárgatest angiooenezls becslése, mérési eredményként progeszteronf használva
Vemhez kancák szérum gonadctroplnjáf (PMSG) injekciózzuk szubkután (5
NE), hogy ovulációt indukáljunk pubertás előtti nőstény patkányokban. Ez teljesen működőképes sárgatestet eredményez, ami vérerek sűrű hálózatát tartalmazza, ami progeszteronf szekretál a véráramba, amivel előkészítjük a mehet a beültetéshez. Az anglogenezlsnek a corpus luteumban való indukálásához VEGF~re van szükség, a VEGF blokkolása új vérerek hiányát eredményezi, és ezáltal hiányzik a véráramba szekretálődő progeszteron. Ebben az írt vívó mcdeilben a progeszteron nyugalmi szintje körülbelül 5 ng/ml, és PMSG után 25-40 ng/ml-re indukálható. Az FltT(1-3)-Fe (A4Q) vagy az Flt1D2,Fik1D3.FcAC1(a} 25 mg/kg vagy 5 mg/kg szubkután ínjefeciózása a PMSG injekciözás után 1 órával a 4, napon a progeszteron indukció teljes gátlását eredményezi. Ennek a kísérletnek az eredményei a 42A-42R. ébrén láthatók.
33. Példa
Az Fit1 (1 -3)-Fc (A40) és a peqliezett Flt1(l-3)-Fo farmakokinetikai elemzése
Az Flt1(1~3)~Fc-t vagy 10 kQa-os poiietiléngiíkoílal vagy 20 kDa-os políeliiénglikollál pegiíezzük, és bslb/c egerekben vizsgáljuk a farmakokinetikai profiljukat. Az Fli1(1~3)~Fc mindkét pegiiezefi formájáról kiderült, hogy sokkal jobb a PK profija mint az Fiil(1-3)-Fc (A40)-nek, a pegílezett molekulák Tmax értéke 24 óránál van, míg az Fif1(1-3)-Fc (A40) Tmax értéke 8 óránál van
34. Példa
Éjszakán át szobahőmérsékleten 10 pM VEGF185-őt inkubáiunk módosított Fit1 receptor variánsokkal, amiknek a koncentrációja 180 pM és 0,1 pM között van. Az ebben a kísérletben használt Flf1 variánsok a következők: Fit1(1-3)-Fc, Rt1(1-3)-Fc (A4ö), tranziensen « ♦ 0¼ * >0 X 0» « 0 k' * * β. * «Χ0 0 0 00 ¥·»:·*·* >* « «X XX <0 0 0 « * *
X X χ. 0 0« 4 0 * * 0 « < S 0« **0 ♦* expresszáit Fit1D2.Flk1D3.FcACl(a), tranziensen expresszáit Flt1D2.VEFGFR3D3.FcA C1(á), R1<1-W-Fc4 Flt1(1-3R^c)-Fc, Tie2-Fc. Az Fltl(1 -S^sí-Fc az Fíí1<1-3}-Fc módosított verziója, amiben az erősen báziks KNKRASVRRR aminosav szekvenciát a NASVNGSR aminosav szekvenciával helyettesítjük, ami két új giíkozllezési hely beépülését, és öt pozitív töltés nettó csökkenést eredményez, mindegyiket azzal a céllal, hogy csökkentsük ennek a szekvenciának a PK-ra gyakorolt kedvezőtlen hatását. .Az F#1(1-3R.»c}-Fc egy olyan módosítás, amiben ugyanabban a bázíkus aminosav szekvenciában egyetlen arginln (R) csoportot ciszíeínre (C) változtatunk (KNKRASVRRR -> KNKCASVRRR), ami lehetővé teszi ezen a ponton a pegiiszást ami azután árnyékolhatja a bázíkus régiót, és így nem fejti ki káros hatását a PK-ra. Inkubálás után az oldatot egy olyan lemezre visszük át, ami a VEGF 165 befogó ellenanyagát tartalmazza (R&O), Ezután meghatározzuk a szabad VEGF185 mennyiségét, olyan ellenanyagot használva, amivel a szabad VEGF 168 mennyiségét lehet meghatározni, Ez azt matatja, hogy a módosított Fltl receptor variánsok közül a VEGF155-höz legnagyobb affinitást (amit a legkisebb mennyiségű VAGF155 alapján lehet megítélni) az Flt1D2.Flk1D3,FcAC1(a) mutatja, ezt követi az Fitl(1-3)-Fc és az Flt1(1-3)-Fc (A4G), majd az Fit1(1-3s.,cFFc, az Fltl (1<W-Fc és az F!í1D2VEFGPR3D3-FoAC1(a). A Tle2Fc-nek nincs affinitása a VF.GF185-hőz.
Claims (8)
- Szabadalmi igénypontok1.. Vaszkniahs ondóiéi növekedési faktor (VEGF) kötésére alkalmas fúziós polipeptid alkalmazása vaszkufáris permeabiiitással jellemzett szembetegség kezelésére alkalmas gyógyszerkészítmény előállítására, ahol a fúziós protein az alábbiakat tartalmazza;a) egy VEGF receptor komponenst mely lényegében -egy első VEGF receptor lmmungiobulin-szerö (lg) 2-es dornénjéböl és egy második VEGF receptor 3-as lg dornénjéböl áll; ésb) egy mnltimerlzáló komponenst.ahol az első VEGF receptor Fitl, a második VEGF receptor Flki vagy Flt4, és ahol a VEGF komponens a fúziós polipeptid: egyetlen VEGF receptor komponense.
- 2. Az 1. igénypont szennti alkalmazás, ahol a fúziós polipeptid elrendezése 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 vagy 3,2,1, ahol az 1-es szám az első VEGF receptor komponenst, a 2-es szám a második VEGF receptor komponenst a 3-as szám a mohraenzáló komponenst jeleli,
- 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti alkalmazás, ahol a mukimerizáló komponens egy immunglobulin domént tartalmaz.
- 4. A 3. igénypont szerinti alkalmazás, ahol az immunglobulin dómén az Ig-G Fc doménje vagy az IgG nehéz lánca.
- 5. Az 1-4. igénypontok szerinti alkalmazás, ahol a fúziós polipeptldet az alábbi nukleotid-szekvenciák valamelyike kódolja:a) a 21Á-21C ábrán bemutatott nukieotid szekvencia,b) a 22A-22C ábrán bemutatott nukleotid szekvencia.,c) a 24A-24C ábrán bemutatott nukieotió szekvencia, vagyd) egy olyan nukiecéd szekvencia, amely a genetikai kód degenerációja miatt eltér az a), b) vagy c) szekvenciától.
- 6. Az 1-5, Igénypontok bármelyike szennti alkalmazás, ahol a fúziós polipeptid a 21 Á~ 21C ábrákon, a 22A-22C ábrákon, vagy 24A-24C ábrákon bemutatott aminosav szekvenciákat tartalmazza.
- 7. A 6. igénypont szerinti alkalmazás, ahöl a fúziós polipeptid a 24A-24C ábrákon bemutatott aminosav szekvenciákat tartalmazza.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti alkalmazás, ahol az emberi s öregkori foltos degeneráció vagy diabetikus retinopátra.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
HUS1300052C HUS1300052I1 (hu) | 1999-06-08 | 2013-09-17 | Módosított kiméra polipeptidek javított farmakokinetikai tulajdonságokkal |
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US13813399P | 1999-06-08 | 1999-06-08 | |
PCT/US2000/014142 WO2000075319A1 (en) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
HUP0201515A2 HUP0201515A2 (en) | 2002-08-28 |
HUP0201515A3 HUP0201515A3 (en) | 2004-12-28 |
HU229156B1 true HU229156B1 (en) | 2013-09-30 |
Family
ID=22480568
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU0201515A HU229156B1 (en) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | Modifield chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
HU1300086A HU230159B1 (hu) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | VEGF receptor kimérák alkalmazása vaszkuláris permeabilitással jellemzett szembetegség kezelésére |
HUS1300052C HUS1300052I1 (hu) | 1999-06-08 | 2013-09-17 | Módosított kiméra polipeptidek javított farmakokinetikai tulajdonságokkal |
Family Applications After (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
HU1300086A HU230159B1 (hu) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | VEGF receptor kimérák alkalmazása vaszkuláris permeabilitással jellemzett szembetegség kezelésére |
HUS1300052C HUS1300052I1 (hu) | 1999-06-08 | 2013-09-17 | Módosított kiméra polipeptidek javított farmakokinetikai tulajdonságokkal |
Country Status (33)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1183353B1 (hu) |
JP (2) | JP4723140B2 (hu) |
KR (1) | KR100659477B1 (hu) |
CN (3) | CN103349781B (hu) |
AT (2) | ATE293164T1 (hu) |
AU (2) | AU779303B2 (hu) |
BE (1) | BE2013C029I2 (hu) |
BR (2) | BR0011407A (hu) |
CA (1) | CA2376379C (hu) |
CY (2) | CY1108883T1 (hu) |
CZ (2) | CZ303656B6 (hu) |
DE (2) | DE60019415T2 (hu) |
DK (2) | DK1183353T3 (hu) |
ES (2) | ES2237429T3 (hu) |
FR (1) | FR13C0028I2 (hu) |
HK (3) | HK1043388A1 (hu) |
HR (1) | HRP20010908B1 (hu) |
HU (3) | HU229156B1 (hu) |
IL (3) | IL146890A0 (hu) |
LT (1) | LTC1183353I2 (hu) |
LU (1) | LU92195I2 (hu) |
ME (2) | MEP3208A (hu) |
MX (1) | MXPA01012630A (hu) |
NO (3) | NO330775B1 (hu) |
NZ (1) | NZ515913A (hu) |
PL (1) | PL208247B1 (hu) |
PT (2) | PT1183353E (hu) |
RS (1) | RS50073B (hu) |
RU (1) | RU2265661C2 (hu) |
SK (1) | SK287332B6 (hu) |
UA (1) | UA74146C2 (hu) |
WO (1) | WO2000075319A1 (hu) |
ZA (1) | ZA200110068B (hu) |
Families Citing this family (99)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6710174B2 (en) | 2001-09-13 | 2004-03-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression |
US6100071A (en) | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
US7087411B2 (en) * | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
US6833349B2 (en) * | 1999-06-08 | 2004-12-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating inflammatory skin diseases |
US7070959B1 (en) | 1999-06-08 | 2006-07-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
US7396664B2 (en) | 1999-06-08 | 2008-07-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same |
CN1494552A (zh) | 2001-01-19 | 2004-05-05 | ·��ά��֢�о�Ժ | Flt4(VEGFR-3)作为靶用于肿瘤成像和抗肿瘤治疗 |
US6734017B2 (en) | 2001-09-28 | 2004-05-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression |
AU2003304173A1 (en) | 2002-05-04 | 2005-01-04 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth |
ATE354592T1 (de) * | 2003-03-28 | 2007-03-15 | Regeneron Pharma | Vegf-antagonisten zur behandlung von diabetes |
EP2354155B1 (en) * | 2003-05-16 | 2017-05-03 | Acorda Therapeutics, Inc. | Fusion Proteins for Treatment of CNS |
US7959914B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-06-14 | Acorda Therapeutics, Inc. | Methods of reducing extravasation of inflammatory cells |
EP2460881B1 (en) | 2003-05-16 | 2017-05-03 | Acorda Therapeutics, Inc. | Proteoglycan degrading mutants for treatment of CNS |
JP2007529418A (ja) | 2003-05-28 | 2007-10-25 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Vegfアンタゴニストの使用による角膜移植拒絶を処置する方法 |
US7186699B2 (en) | 2003-06-03 | 2007-03-06 | Cell Genesys, Inc. | Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes |
WO2004110490A2 (en) * | 2003-06-06 | 2004-12-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of vegf inhibitors for tumor regression |
US7399612B2 (en) | 2003-06-30 | 2008-07-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same |
AR046510A1 (es) * | 2003-07-25 | 2005-12-14 | Regeneron Pharma | Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo |
EP1653992A1 (en) * | 2003-08-06 | 2006-05-10 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of a vegf antagonist in combination with radiation therapy |
JP4926962B2 (ja) | 2004-05-18 | 2012-05-09 | アコーダ セラピューティクス、インク. | コンドロイチン分解酵素とその安定な製剤の精製法 |
EP1767546B1 (en) | 2004-06-08 | 2012-03-07 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. | Angiogenesis-inhibiting chimeric protein and the use |
EP2583685A1 (en) | 2004-06-10 | 2013-04-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of administering and using VEGF inhibitors for the treatment of human cancer |
JP2008503481A (ja) * | 2004-06-18 | 2008-02-07 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 悪性胸膜滲出液の処置のためのvegfインヒビターの投与および使用の方法 |
MX2007001241A (es) * | 2004-07-30 | 2007-07-11 | Regeneron Pharma | Metodos para tratar diabetes tipo i mediante el bloqueo de la actividad mediada de vegf. |
ES2347340T3 (es) | 2004-09-13 | 2010-10-28 | Genzyme Corporation | Construcciones multimericas. |
FR2878749B1 (fr) * | 2004-12-03 | 2007-12-21 | Aventis Pharma Sa | Combinaisons antitumorales contenant en agent inhibiteur de vegt et du 5fu ou un de ses derives |
CA2621047A1 (en) | 2005-02-02 | 2006-08-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating eye injury with local administration of a vegf inhibitor |
DK1861116T3 (en) | 2005-03-25 | 2015-11-09 | Regeneron Pharma | VEGF antagonist formulations |
AU2006294755B2 (en) | 2005-09-26 | 2012-04-19 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using chondroitinase ABCI mutants |
CA2630839C (en) † | 2005-12-16 | 2017-01-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Therapeutic methods for inhibiting tumor growth with dll4 antagonists |
FR2895258B1 (fr) | 2005-12-22 | 2008-03-21 | Aventis Pharma Sa | Combinaison comprenant de la combretastatine et des agents anticancereux |
CN100502945C (zh) * | 2006-03-31 | 2009-06-24 | 成都康弘生物科技有限公司 | Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用 |
US8216575B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-07-10 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. | Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains |
CA2654510C (en) | 2006-06-16 | 2015-03-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration |
MX2009003229A (es) | 2006-09-29 | 2009-06-18 | Oncomed Pharm Inc | Composiciones y metodos para diagnosticar y tratar cancer. |
ES2473610T3 (es) | 2006-10-10 | 2014-07-07 | Acorda Therapeutics, Inc. | Composiciones y métodos de uso de mutantes de condroitinasa ABCI |
FR2918279B1 (fr) * | 2007-07-05 | 2010-10-22 | Aventis Pharma Sa | Combinaisons antitumorales contenant un agent inhibiteur de vegf et de l'irinotecan |
CN101575379B (zh) * | 2008-05-09 | 2012-05-30 | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 | 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途 |
WO2010060748A1 (en) | 2008-11-03 | 2010-06-03 | Molecular Partners Ag | Binding proteins inhibiting the vegf-a receptor interaction |
CN101838329A (zh) * | 2009-03-18 | 2010-09-22 | 嘉和生物药业有限公司 | 抗血管新生融合蛋白 |
DK2488204T3 (en) | 2009-10-16 | 2016-06-06 | Oncomed Pharm Inc | Therapeutic combination and use of DLL4 antagonist antibodies and blood pressure lowering agents |
AR081361A1 (es) | 2010-04-30 | 2012-08-29 | Molecular Partners Ag | Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a |
EP3327032A1 (en) | 2010-08-06 | 2018-05-30 | Genzyme Corporation | Vegf antagonist compositions and uses thereof |
EP2662385A4 (en) * | 2011-01-07 | 2015-11-11 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | METHOD FOR IMPROVING THE PHYSICAL PROPERTIES OF ANTIBODIES |
EP2663325A1 (en) | 2011-01-13 | 2013-11-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of a vegf antagonist to treat angiogenic eye disorders |
JO3283B1 (ar) | 2011-04-26 | 2018-09-16 | Sanofi Sa | تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI) |
KR101397088B1 (ko) | 2011-06-10 | 2014-05-19 | 강원대학교산학협력단 | 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물 |
JO3370B1 (ar) * | 2011-11-10 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6 |
CN104159926B (zh) * | 2011-12-01 | 2019-02-01 | 圆祥生命科技有限公司 | 补体和vegf途径的蛋白质抑制剂及其使用方法 |
CN103304668B (zh) * | 2012-03-12 | 2015-10-28 | 江苏健德生物药业有限公司 | Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制备方法及其应用 |
DK2846836T3 (da) | 2012-05-07 | 2019-11-11 | Allergan Inc | Fremgangsmåde til behandling af amd hos patienter, der er refraktære overfor anti-vegf-terapi |
WO2014006113A1 (en) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Sanofi | Method of treating cancer by effective amounts of aflibercept |
AR093445A1 (es) | 2012-11-14 | 2015-06-10 | Regeneron Pharma | Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4 |
EP2956476B1 (en) | 2013-02-18 | 2019-12-25 | Vegenics Pty Limited | Ligand binding molecules and uses thereof |
AR095196A1 (es) * | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
CN104193828B (zh) * | 2013-09-12 | 2017-04-05 | 北京韩美药品有限公司 | 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白 |
HUE047910T2 (hu) | 2013-11-05 | 2020-05-28 | Allergan Inc | Eljárás a szem állapotainak kezelésére anti-VEGF darpinnal |
EP3143044A1 (en) | 2014-05-12 | 2017-03-22 | Formycon AG | Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist |
SG11201700284UA (en) | 2014-07-18 | 2017-02-27 | Sanofi Sa | Method for predicting the outcome of a treatment with aflibercept of a patient suspected to suffer from a cancer |
JP2016036322A (ja) * | 2014-08-11 | 2016-03-22 | 日本化薬株式会社 | 血管新生因子と結合するキメラタンパク質 |
CN114306575A (zh) | 2014-12-11 | 2022-04-12 | 拜耳医药保健有限责任公司 | 具有小的活动性脉络膜新生血管病变的年龄相关性黄斑变性的治疗 |
GB201503453D0 (en) | 2015-03-01 | 2015-04-15 | Jain Arjun | Endothelin-1"sponge" |
TW202330904A (zh) | 2015-08-04 | 2023-08-01 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
WO2017046140A1 (en) | 2015-09-18 | 2017-03-23 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia |
WO2017065559A1 (ko) | 2015-10-15 | 2017-04-20 | (주)알테오젠 | Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
KR101936049B1 (ko) * | 2015-10-15 | 2019-01-08 | (주)알테오젠 | IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
US10925927B2 (en) | 2015-11-18 | 2021-02-23 | Formycon Ag | Pre-filled pharmaceutical package comprising a liquid formulation of a VEGF-antagonist |
RU2018121813A (ru) | 2015-11-18 | 2019-12-19 | Формикон Аг | Предварительно заполненный пластиковый шприц, содержащий антагонист vegf |
RU2751510C2 (ru) | 2015-11-18 | 2021-07-14 | Сио2 Медикал Продактс, Инк. | Фармацевтическая упаковка для офтальмологических составов |
WO2017084616A1 (en) * | 2015-11-19 | 2017-05-26 | Zhuhai Tairuishang Biopharm Ltd. | Methods and compositions for binding vegf |
AU2016364817B2 (en) | 2015-12-03 | 2020-05-07 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF |
EP3407868A1 (en) | 2016-01-26 | 2018-12-05 | Formycon AG | Liquid formulation of a vegf antagonist |
JPWO2018070390A1 (ja) | 2016-10-12 | 2019-08-22 | 第一三共株式会社 | 抗robo4抗体と他剤を含む組成物 |
WO2018094316A1 (en) | 2016-11-21 | 2018-05-24 | Just Biotherapeutics, Inc. | Aflibercept formulations and uses thereof |
CA3063995A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Sio2 Medical Products, Inc. | Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations |
US20200237997A1 (en) | 2017-05-24 | 2020-07-30 | Formycon Ag | Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist |
WO2018215580A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Formycon Ag | Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist |
TW201904610A (zh) | 2017-06-14 | 2019-02-01 | 德商拜耳製藥公司 | 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑 |
WO2019020777A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Formycon Ag | LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST |
CN111344410B (zh) | 2017-08-17 | 2023-09-15 | 济世易为生物有限公司 | 从宿主细胞半乳糖凝集素和其他污染物中纯化糖基化蛋白的方法 |
US20210170029A1 (en) | 2017-11-20 | 2021-06-10 | Just-Evotec Biologies, Inc. | Aflibercept formulations containing a lysine salt as tonicifying agent and uses thereof |
FI3717636T3 (fi) | 2017-11-27 | 2023-06-01 | 4D Molecular Therapeutics Inc | Adenoassosioidun viruksen kapsidivariantteja ja käyttö angiogeneesin estämisessä |
HRP20221335T1 (hr) | 2017-11-30 | 2022-12-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Upotreba antagonista vegf za liječenje angiogenih očnih poremećaja |
CA3084155A1 (en) | 2017-12-13 | 2019-06-20 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Devices and systems for chromatography column bed support management and related methods |
JP7517988B2 (ja) | 2018-01-26 | 2024-07-17 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 抗vegf剤を使用した血管新生障害の治療のための方法および組成物 |
KR20210021299A (ko) | 2018-05-10 | 2021-02-25 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 고농도 vegf 수용체 융합 단백질 함유 제제 |
US11519020B2 (en) | 2018-05-25 | 2022-12-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF |
CN111378044B (zh) | 2018-12-28 | 2022-07-15 | 长春金赛药业有限责任公司 | 抗体融合蛋白、制备方法及其应用 |
US20220204920A1 (en) | 2019-05-16 | 2022-06-30 | Formycon Ag | Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins |
EP4025272A1 (en) | 2019-09-03 | 2022-07-13 | Amgen Inc. | Injection device for drug delivery and packaging for the injection device |
US20210077645A1 (en) | 2019-09-16 | 2021-03-18 | Amgen Inc. | Method for external sterilization of drug delivery device |
EP4041312A4 (en) | 2019-10-10 | 2023-12-20 | Kodiak Sciences Inc. | METHOD FOR TREATING AN EYE DISORDER |
EP4065150A4 (en) | 2019-11-25 | 2023-12-06 | The Regents of the University of California | LONG-ACTING VEGF INHIBITORS FOR INTRAOCULAR NEOVASCULARIZATION |
JP2022548197A (ja) | 2019-12-06 | 2022-11-17 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 抗vegfタンパク質組成物及びその製造方法 |
AU2020397053A1 (en) | 2019-12-06 | 2022-06-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF mini-traps and methods of use thereof |
US20210261297A1 (en) | 2020-02-24 | 2021-08-26 | Amgen, Inc. | Containers and systems for use during external sterilization of drug delivery devices |
EP4145456A1 (en) | 2021-09-06 | 2023-03-08 | Bayer AG | Prediction of a change related to a macular fluid |
WO2023092324A1 (zh) | 2021-11-24 | 2023-06-01 | 苏州光度生物科技有限公司 | 多特异性配体结合分子及其应用 |
WO2024029876A1 (ko) * | 2022-08-02 | 2024-02-08 | 주식회사 파노로스바이오사이언스 | 변형된 융합 단백질 및 이의 용도 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9506466D0 (en) * | 1994-08-26 | 1995-05-17 | Prolifix Ltd | Cell cycle regulated repressor and dna element |
US6100071A (en) * | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
-
2000
- 2000-05-23 MX MXPA01012630A patent/MXPA01012630A/es active IP Right Grant
- 2000-05-23 DE DE60019415T patent/DE60019415T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 EP EP00932721A patent/EP1183353B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 DK DK00932721T patent/DK1183353T3/da active
- 2000-05-23 CZ CZ20100386A patent/CZ303656B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 DK DK05001328T patent/DK1544299T3/da active
- 2000-05-23 KR KR1020017015839A patent/KR100659477B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 HU HU0201515A patent/HU229156B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 BR BR0011407-3A patent/BR0011407A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 HU HU1300086A patent/HU230159B1/hu unknown
- 2000-05-23 AU AU50404/00A patent/AU779303B2/en active Active
- 2000-05-23 PT PT00932721T patent/PT1183353E/pt unknown
- 2000-05-23 RS YUP-869/01A patent/RS50073B/sr unknown
- 2000-05-23 EP EP05001328A patent/EP1544299B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 DE DE60041159T patent/DE60041159D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CA CA002376379A patent/CA2376379C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 ME MEP-32/08A patent/MEP3208A/xx unknown
- 2000-05-23 WO PCT/US2000/014142 patent/WO2000075319A1/en active Application Filing
- 2000-05-23 PT PT05001328T patent/PT1544299E/pt unknown
- 2000-05-23 ME MEP-2008-32A patent/ME00024B/me unknown
- 2000-05-23 UA UA2001128378A patent/UA74146C2/uk unknown
- 2000-05-23 PL PL352246A patent/PL208247B1/pl active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 SK SK1752-2001A patent/SK287332B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 ES ES00932721T patent/ES2237429T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 ES ES05001328T patent/ES2319305T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CN CN201310118971.1A patent/CN103349781B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 CN CN2008101093559A patent/CN101433715B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 RU RU2002100071/13A patent/RU2265661C2/ru active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 CN CNB008115443A patent/CN100523187C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 AT AT00932721T patent/ATE293164T1/de active
- 2000-05-23 CZ CZ20014387A patent/CZ302689B6/cs unknown
- 2000-05-23 AT AT05001328T patent/ATE417928T1/de active
- 2000-05-23 NZ NZ515913A patent/NZ515913A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 BR BRPI0011407A patent/BRPI0011407B8/pt unknown
- 2000-05-23 IL IL14689000A patent/IL146890A0/xx unknown
- 2000-05-23 JP JP2001502582A patent/JP4723140B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-12-03 IL IL146890A patent/IL146890A/en active Protection Beyond IP Right Term
- 2001-12-06 ZA ZA200110068A patent/ZA200110068B/xx unknown
- 2001-12-07 HR HR20010908A patent/HRP20010908B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-12-10 NO NO20016036A patent/NO330775B1/no active Protection Beyond IP Right Term
-
2002
- 2002-07-04 HK HK02105009A patent/HK1043388A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-03-31 AU AU2005201365A patent/AU2005201365B2/en not_active Expired
-
2008
- 2008-03-17 IL IL190234A patent/IL190234A0/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-03-16 CY CY20091100288T patent/CY1108883T1/el unknown
- 2009-11-05 HK HK09110323.8A patent/HK1132653A1/xx unknown
-
2010
- 2010-05-06 NO NO20100656A patent/NO332559B1/no not_active IP Right Cessation
- 2010-10-06 JP JP2010226970A patent/JP5273746B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-05-13 CY CY2013019C patent/CY2013019I1/el unknown
- 2013-05-13 BE BE2013C029C patent/BE2013C029I2/fr unknown
- 2013-05-14 LT LTPA2013009C patent/LTC1183353I2/lt unknown
- 2013-05-14 FR FR13C0028C patent/FR13C0028I2/fr active Active
- 2013-05-14 LU LU92195C patent/LU92195I2/fr unknown
- 2013-05-15 NO NO2013010C patent/NO2013010I1/no unknown
- 2013-09-17 HU HUS1300052C patent/HUS1300052I1/hu unknown
- 2013-11-26 HK HK13113191.5A patent/HK1185798A1/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
HU229156B1 (en) | Modifield chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties | |
US10392430B2 (en) | Methods of making nucleic acid molecules encoding modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties | |
US7303746B2 (en) | Methods of treating eye disorders with modified chimeric polypeptides | |
CA2588221C (en) | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
AA1S | Information on application for a supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: AFLIBERCEPT; REG. NO/DATE: EU/1/12/797/001-002 20121122 Spc suppl protection certif: S1300052 Filing date: 20130917 Expiry date: 20200523 |
|
FG4S | Grant of supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAME: AFLIBERCEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/12/797/001-002 20121126 Spc suppl protection certif: S1300052 Filing date: 20130917 Expiry date: 20200523 Extension date: 20250523 |