JP2003501089A - 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド - Google Patents

改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド

Info

Publication number
JP2003501089A
JP2003501089A JP2001502582A JP2001502582A JP2003501089A JP 2003501089 A JP2003501089 A JP 2003501089A JP 2001502582 A JP2001502582 A JP 2001502582A JP 2001502582 A JP2001502582 A JP 2001502582A JP 2003501089 A JP2003501089 A JP 2003501089A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
flt1
fusion polypeptide
domain
vegf
receptor
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2001502582A
Other languages
English (en)
Other versions
JP4723140B2 (ja
JP2003501089A5 (ja
Inventor
ニコラス ジェイ． パパドパウロス，
サミュエル デイビス，
ジョージ ディー． ヤンコパウロス，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22480568&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=JP2003501089(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals Inc filed Critical Regeneron Pharmaceuticals Inc
Publication of JP2003501089A publication Critical patent/JP2003501089A/ja
Publication of JP2003501089A5 publication Critical patent/JP2003501089A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4723140B2 publication Critical patent/JP4723140B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

(57)【要約】 改善された薬物動態を有する改変キメラポリペプチドが開示される。詳細には、その薬物動態プロフィールが改善されるように改変された、改変Ｆｌｔ１レセプターポリペプチドが開示される。この改変ポリペプチドを作製および使用する方法がまた開示され、この改変ポリペプチドには、哺乳動物において血漿の漏出および／または透過性を減少または阻害する改変ポリペプチドが挙げられるが、これに限定されない。また、ＶＥＧＦポリペプチドに結合し得る融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本出願は、米国仮出願第６０／１３８，１３３号（１９９９年、６月８日出願
）の優先権を主張する。本出願の全体に渡って、種々の出版物が参照される。こ
れらの出版物の開示はその全体において、本出願の中に参考として本出願によっ
て援用される。
【０００２】 （序文） 本発明の分野は、改善された薬物動態を有する改変されたポリペプチドである
。特に、本発明の分野は、薬物動態のプロフィールを改善するような方法で改変
されたＦｌｔ１レセプターポリペプチドに関する。本発明の分野はまた、その改
変されたポリペプチドを作製および使用する方法に関し、その方法は、哺乳動物
における血漿漏出および／または血管透過性を減少もしくは阻害するためにその
改変されたポリペプチドを使用することを含むが、これに限定されない。
【０００３】 （背景） 細胞に結合し、それにより表現型応答（例えば、細胞増殖、生存、細胞産物の
分泌または分化）を誘発するポリペプチドリガンドの能力は、細胞上の膜貫通レ
セプターによってしばしば媒介される。そのようなレセプターの細胞外ドメイン
（すなわち、細胞表面上に提示されるレセプターの部分）は、タンパク質にその
リガンド結合特徴を提供するので、一般的に、その分子の最も特徴的な部分であ
る。リガンドの細胞外ドメインへの結合は、一般的に、細胞内標的へ生物学的シ
グナルを伝達するシグナル伝達を生じる。しばしば、このシグナル伝達は、触媒
的細胞内ドメインを介して作用する。この触媒的細胞内ドメインの配列モチーフ
の特定のアレイ（ａｒｒａｙ）は、潜在的キナーゼ基質へのその接近を決定する
（Ｍｏｈａｍｍａｄｉら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５０
６８−５０７８；Ｆａｎｔｌら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６９：４１３−４１３）
。触媒的細胞内ドメインを介してシグナルを伝達するレセプターの例としては、
レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（例えば、神経系の細胞に一般的に限定
されるＴｒｋファミリーのレセプター）、これもまた神経系の細胞に一般的に限
定される３部（ｔｒｉｐａｒｔａｔｅ）から成るＣＮＴＦレセプター複合体（Ｓ
ｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、１９９４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏ．２
５：１４５４−１４６６）を含むサイトカインファミリーのレセプター、Ｇタン
パク質結合レセプター（例えば、心筋細胞上に見出されるβ2−アドレナリン作
用性レセプター）ならびに大部分が肥満細胞および好塩基性細胞上に局在する多
量体ＩｇＥ高親和性レセプターＦｃεＲＩ（ＳｕｔｔｏｎおよびＧｏｕｌｄ、１
９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：４２１−４２８）が挙げられる。
【０００４】 これまで同定された全てのレセプターは、二量体化、多量体化、またはリガン
ド結合後のいくつかの関連したコンホメーション変化を経験するようであり（Ｓ
ｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．，１９８８、Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃ
ｉ．１３：４４３−４４７；ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、
１９９０、Ｃｅｌｌ ６１：２０３−２１２；Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよび
Ｕｌｌｒｉｃｈ、１９９２、Ｎｅｕｒｏｎ ９：３８３−３９１）、そして二量
体化した細胞内ドメイン間の分子相互作用は、触媒機能の活性化をもたらす。い
くつかの場合において、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のようなリガ
ンドは、２つのレセプター分子と結合する二量体であるが（Ｈａｒｔら、１９８
８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１５２９−１５３１；Ｈｅｌｄｉｎ、１９８９、
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９０５−８９１２）、上皮増殖因子（ＥＧ
Ｆ）の場合において、このリガンドは、単量体である（Ｗｅｂｅｒら、１９８４
、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１４６３１−１４６３６）。ＦｃεＲＩレ
セプターの場合において、リガンド（ＩｇＥ）は、単量体の様式においてＦｃε
ＲＩと結合して存在し、そして抗原がＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体と結合し、そし
て隣接するＩｇＥ分子と架橋する場合においてのみ、活性化する（Ｓｕｔｔｏｎ
およびＧｏｕｌｄ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：４２１−４２８）。
【０００５】 しばしば、高等生物内の特定のレセプターの組織分布は、そのレセプターの生
物学的機能に関する洞察を提供する。いくつかの増殖因子および分化因子（例え
ば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ））に対するＲＴＫは、広範に発現され、その
ため、組織増殖および組織維持においていくつかの一般的な役割を果たすようで
ある。Ｔｒｋ ＲＴＫファミリーのメンバー（ＧｌａｓｓおよびＹａｎｃｏｐｏ
ｕｌｏｓ、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２６２−
２６８）のレセプターは、より一般的に、神経系の細胞に限定され、そして神経
成長因子ファミリーは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮ
Ｆ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン−４／５
（ＮＴ−４／５）から構成され、これらはＴｒｋ ＲＴＫファミリーレセプター
と結合し、脳および末梢におけるニューロンの多様な群の分化を促進する（Ｌｉ
ｎｄｓａｙ，Ｒ．Ｍ、１９９３、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ，
Ｓ．Ｅ．ＬｏｕｇｈｌｉｎおよびＪ．Ｈ．Ｆａｌｌｏｎ、編、２５７−２８４頁
、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。ＦｃεＲＩは
、非常に限られた数の型の細胞（例えば、肥満細胞および好塩基性細胞）に局在
する。肥満細胞は、骨髄多能性造血幹細胞系統に由来するが、血流から移動した
後に組織においてそれらの成熟を完了させ（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒ
ｓ、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｍ．Ｒｏｂｅｒｔｓｏｎ
およびＥ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ、編、１：３−１：４頁、（発行元）Ｃｕｒｒｅｎ
ｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，を参照のこと）、そして
アレルギー性応答に関与する。
【０００６】 多くの研究は、レセプターの細胞外ドメインは、特定のリガンド結合特徴を提
供するということを実証してきた。さらに、レセプターが発現される細胞環境は
、リガンドがレセプターに結合する際に示される生物学的応答に影響を及ぼし得
る。例えば、Ｔｒｋレセプターを発現するニューロン細胞が、そのレセプターに
結合するニューロトロフィンに曝露される場合、ニューロンの生存および分化が
生じる。同じレセプターが線維芽細胞により発現される場合、ニューロトロフィ
ンへの曝露は、線維芽細胞の増殖を生じる（Ｇｌａｓｓら、１９９１、Ｃｅｌｌ
６６：４０５−４１３）。
【０００７】 血管内皮細胞に対する選択性を有する細胞誘導二量体マイトジェンのクラスが
同定され、そして血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と命名されている。ＶＥＧ
Ｆは、ラット神経膠腫細胞の馴化増殖培地［Ｃｏｎｎら、（１９９０）、Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８７．２６２８−２６３２頁］；
およびウシ下垂体小胞星細胞の馴化増殖培地［ＦｅｒｒａｒａおよびＨｅｎｚｅ
ｌ、（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１
６１、８５１−８５８頁；Ｇｏｚｐａｄｏｒｏｗｉｃｚら、（１９８９）、Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６、７３１１−７３１５
頁］およびヒトＵ９３７細胞に由来する馴化増殖培地［Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｄ．
Ｔ．ら、（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、１３０９−１３１２頁］から
精製された。ＶＥＧＦは、約４６ｋＤａの見掛けの分子量を有する二量体（各サ
ブユニットは、約２３ｋＤａの見掛けの分子量を有する）である。ＶＥＧＦは、
血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（これは、結合組織の細胞に対するマイトジェ
ンであるが、大血管に由来する血管内皮細胞に対してはマイトジェンではない）
に対していくつかの構造的な類似性を有する。
【０００８】 膜結合チロシンキナーゼレセプター（Ｆｌｔとして公知）は、ＶＥＧＦレセプ
ターであることが示された［ＤｅＶｒｉｅｓ，Ｃ．ら、（１９９２）、Ｓｃｉｅ
ｎｃｅ、２５５、９８９−９９１頁］。Ｆｌｔレセプターは、有糸分裂誘発を誘
導するＶＥＧＦと特異的に結合する。ＶＥＧＦレセプターの別の形態（ＫＤＲと
命名される）もまた、ＶＥＧＦに結合し、そして有糸分裂誘発を誘導することが
公知である。ＫＤＲの部分的なｃＤＮＡ配列およびほぼ全長のタンパク質配列も
また同様に公知である［Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉら、（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎ
ｅ ６、１６７７−１６８３頁；Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ら、（１９９２）Ｂｉ
ｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７、１５７９−１５８６
頁］。
【０００９】 持続性新脈管形成は、特定の疾患（例えば、乾癬、慢性関節リウマチ、血管腫
、血管線維腫、糖尿病性網膜症および血管新生緑内障）を引き起こし得るか、ま
たは悪化させ得る。ＶＥＧＦ活性のインヒビターは、そのような疾患および他の
ＶＥＧＦ誘導の病的新脈管形成ならびに血管透過性状態（例えば、腫瘍血管新生
）に対する処置として有用である。本発明は、ＶＥＧＦレセプターＦｌｔ１に基
づくＶＥＧＦインヒビターに関する。
【００１０】 血漿漏出（炎症の重要な構成要素）は、微小血管の異なるサブセットにおいて
生じる。具体的には、ほとんどの器官において、血漿漏出は特に小静脈において
生じる。小動脈および毛細管とは異なり、小静脈は、多数の炎症性メディエータ
ー（ヒスタミン、ブラジキニン、およびセロトニンを含む）に応じて漏出性にな
る。炎症の１つの特徴は、小静脈の内皮において形成する細胞間間隙から生じる
血漿漏出である。炎症の最も実験的なモデルは、これらの細胞間間隙は、後毛細
管小静脈の内皮細胞と集合小静脈の内皮細胞との間に生じるということを示す（
Ｂａｌｕｋ，Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９８ １５２：１４６３−
７６）。特定のレクチンを使用して、炎症性小静脈内の内皮細胞境界における血
漿漏出、内皮の間隙、および指様突起の限局的部位の特徴を明らかにし得るとい
うことが示されてきた（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ
、１９９６、２７１：Ｈ２５４７−６２）。特に、植物レクチンは、例えば、ラ
ット気管の炎症性小静脈内の内皮細胞境界における形態学的変化を可視化するた
めに使用されてきた。炎症性小静脈に限局的に結合するレクチン（例えば、コン
カナバリンＡおよびリシン）は、血漿漏出部位に対応する間隙により露出された
内皮下血管壁の領域を明らかにする（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐ
ｈｙｓｉｏｌ、１９９６、２７１：Ｈ２５４７−６２）。
【００１１】 微小血管の特性は、動的である。例えば、慢性炎症疾患は、微小血管リモデリ
ング（新脈管形成および微小血管拡大を含む）に関連する。微小血管はまた、異
常表現型の特性を獲得することによってリモデリングされ得る。慢性気道炎症の
マウスモデルにおいて、気道毛細管は、小静脈の特性（広げられた血管直径、フ
ォン・ビルブラント因子に対する増加した免疫反応性、およびＰ−セレクチンに
対する増加した免疫反応性を含む）を獲得する。さらに、これらのリモデリング
された血管は、炎症性メディエーターに応じて漏出するが、正常マウスの気道の
同じ位置における血管は、漏出しない。
【００１２】 特定の物質は、血管透過性および／または血漿漏出を減少させるか、または阻
害することを示してきた。例えば、ミスチキン（ｍｙｓｔｉｘｉｎ）は、内皮間
隙形成をブロックすることを伴わずに血漿漏出を阻害することが報告されている
合成ポリペプチドである（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘ
ｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９８、２８４：６９３−９）。また、β２−アドレナリン
作用性レセプターアゴニスト（フォルモテロール）は、内皮間隙形成を阻害する
ことによって微小血管漏出を減少させる（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．およびＭｃＤｏｎａ
ｌｄ，Ｄ．Ｍ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９４、２６６：Ｌ４６１−
８）。
【００１３】 アンジオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）および血管内皮増殖因子（
ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーは、主に血管内皮細胞に対して特異的であると
考えられる唯一の増殖因子である。マウスにおける標的遺伝子不活性化研究は、
ＶＥＧＦは血管発生の初期段階に不可欠であり、そしてＡｎｇ−１は血管リモデ
リングの後期段階に必要とされるということを示している。
【００１４】 米国特許第６，０１１，００３号（２０００年、１月４日発行）は、Ｍｅｔｒ
ｉｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄの名において、ＦＬＴポリペ
プチドの改変された可溶性形態は、ＶＥＧＦを結合し得、それによりＶＥＧＦに
対して阻害効果を及ぼし、そのポリペプチドは、５つ以下の完全免疫グロブリン
ドメインを含むということを開示している。
【００１５】 米国特許第５，７１２，３８０号（１９９８年、１月２７日発行され、そして
Ｍｅｒｃｋ＆Ｃｏ．に譲渡されている）は、天然に存在しているか、またはＶＥ
ＧＦに対するレセプターのＣ末端膜貫通領域を伴うかもしくは伴わない組換え操
作された可溶性形態である血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）インヒビターを開
示している。
【００１６】 また、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１３０７１（１９９８年、４月２日公開）は
、ＭｅｒｃｋおよびＣｏ．に譲渡されており、これは、ＶＥＧＦと結合する可溶
性レセプタータンパク質をコードするヌクレオチド配列の遺伝子転移によって、
原発性腫瘍増殖および転移を阻害するための遺伝子治療方法論を開示している。
【００１７】 ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４４４５３（１９９７年、１１月２７日公開）は、
Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の名において、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レ
セプターＦｌｔ１およびＫＤＲ（ヒトＫＤＲレセプターＦＬＫ１に対するマウス
ホモログを含む）に由来するアミノ酸配列を含む新規なキメラＶＥＧＦレセプタ
ータンパク質を開示しており、ここでそのキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質
は、ＶＥＧＦに結合し、そしてその内皮細胞増殖および脈管形成活性をアンタゴ
ナイズする。
【００１８】 ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／１３７８７（１９９７年、４月１７日公開）は、Ｔ
ｏａ Ｇｏｓｅｉ Ｃｏ．，ＬＴＤの名において、新生血管形成（例えば、固体
腫瘍）が付随する疾患の処置において有効な低分子量ＶＥＧＦインヒビターを開
示している。ＶＥＧＦレセプターＦＬＴの細胞外領域において、第１の免疫グロ
ブリン様ドメインおよび第２の免疫グロブリン様ドメインを含むが、その第６の
免疫グロブリン様ドメインおよび第７の免疫グロブリン様ドメインを含まないポ
リペプチドは、ＶＥＧＦ阻害活性を示す。
【００１９】 Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．ら、１９９８、Ｔｈｅ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｊｏｕｒ
．ｏｆ Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４２：２４２−２４９は、モノクローナル抗体（Ｍ
Ａｂ）は塩基性で正に荷電したタンパク質あり、そして哺乳動物細胞は負に荷電
しているという理由により、その２者の間の静電気的相互作用は、より高いレベ
ルのバックグランド結合を生成し得、腫瘍対正常器官の比率が低くなるというこ
とを開示している。この影響を克服するために、研究者らは、種々の方法（例え
ば、第２の薬剤ならびにＭＡｂそれ自体の化学改変および荷電改変）を使用する
ことによってＭＡｂクリアランスを改善することを試みた。
【００２０】 Ｊｅｎｓｅｎ−Ｐｉｐｐｏら、１９９６、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒ
ｅｓｅａｒｃｈ １３：１０２−１０７は、治療タンパク質のペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｉｏｎ）（組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ））
は、十二指腸内の経路により投与される場合、インビボ生物活性の安定性および
維持の増加を生じるということを開示している。
【００２１】 Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、１９９７、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１６
８−７３は、ポリエチレングリコール改変化インターロイキン−６（ＭＰＥＧ−
ＩＬ−６）（ＩＬ−６の５４％の１４リジンアミノ基をＰＥＧと結合させた）の
インビボ血小板新生活性を、ネイティブＩＬ−６のインビボ血小板新生活性と比
較した実験を開示している。
【００２２】 Ｙａｎｇら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ ７６：６８７−９４、は、ポリエチレ
ングリコールの組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）への結合は、化合
物のポリエチレングリコール改変化ＩＬ−２（ＰＥＧ−ＩＬ−２）を生じ、この
化合物は、ＩＬ−２のインビトロ活性およびインビボ活性を維持するが、著しく
延長された循環半減期を示す、ということを開示している。
【００２３】 Ｒ．ＤｕｎｃａｎおよびＦ．Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃ
ｏｋｉｎｅｔ．２７：２９０−３０６、２９６（１９９４）は、ポリエチレング
リコールを結合させることによってアスパラギナーゼの血漿半減期を改善する試
みを再検討している。
【００２４】 ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９９／０３９９６（１９９９年１月２８日公開）は、
Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．およびＴｈｅ
Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏ
ｒｎｉａの名において、塩基性アミノ酸の領域が欠失されている改変されたヒト
ノジン（ｎｏｇｇｉｎ）ポリペプチドを記載している。この改変されたヒトノジ
ンポリペプチドは、改変されていないヒトノジンと比べてヘパリンに対する減少
した親和性および動物血清においてより優れた薬物動態を有しながら、生物学的
活性を維持するものとして記載される。
【００２５】 （発明の要旨） 本発明は、改善された薬物動態の特性を有するＶＥＧＦアンタゴニストに関す
る。好ましい実施形態は、ＶＥＧＦポリペプチドと結合し得る融合ポリペプチド
をコードする単離された核酸分子であり、その核酸分子は、（ｂ）多量体化（ｍ
ｕｌｔｉｍｅｒｉｚｉｎｇ）成分をコードするヌクレオチド配列に（ａ）作動可
能に連結されたＶＥＧＦレセプター成分をコードするヌクレオチド配列を含み、
ここで、ＶＥＧＦレセプター成分は、融合ポリペプチドの唯一のＶＥＧＦレセプ
ター成分であり、そしてここで、（ａ）のヌクレオチド配列は、第１のＶＥＧＦ
レセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列をコードするヌク
レオチド配列および第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン
３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から本質的に構成される。
【００２６】 さらなる実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターの単離された核酸は、
Ｆｌｔ１である。
【００２７】 さらなる実施形態において、第２のＶＥＧＦレセプターの単離された核酸は、
Ｆｌｋ１である。
【００２８】 また別の実施形態において、第２のＶＥＧＦレセプターの単離された核酸は、
Ｆｌｔ４である。
【００２９】 別の好ましい実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイン
のＩｇドメイン２をコードするヌクレオチド配列は、第２のＶＥＧＦレセプター
の細胞外ドメインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の上流にある
。
【００３０】 さらなる別の好ましい実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外
ドメインのＩｇドメイン２をコードするヌクレオチド配列は、第２のＶＥＧＦレ
セプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の下
流である。
【００３１】 本発明の好ましい実施形態において、多量体化成分は、免疫グロブリンドメイ
ンを含む。
【００３２】 別の実施形態において、免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、
ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖からなる群から選択される。
【００３３】 好ましい実施形態は、改変されたＦｌｔ１レセプター融合ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含み、ここで核酸分子のコ
ード領域は、以下： （ａ）図１３Ａ−１３Ｄに示されるヌクレオチド配列； （ｂ）図１４Ａ−１４Ｃに示されるヌクレオチド配列； （ｃ）図１５Ａ−１５Ｃに示されるヌクレオチド配列； （ｄ）図１６Ａ−１６Ｄに示されるヌクレオチド配列； （ｅ）図２１Ａ−２１Ｃに示されるヌクレオチド配列； （ｆ）図２２Ａ−２２Ｃに示されるヌクレオチド配列； （ｇ）図２４Ａ−２４Ｃに示されるヌクレオチド配列；および （ｈ）遺伝暗号の縮重の結果として、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ
）、（ｆ）、または（ｇ）のヌクレオチド配列とは異なり、そして改変されたＦ
ｌｔ１レセプター融合ポリペプチドの生物学的活性を有する融合ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列、 からなる群から選択されるヌクレオチド配列から構成される。
【００３４】 本発明のさらなる実施形態において融合ポリペプチドは、上記の単離された核
酸分子によりコードされる。
【００３５】 好ましい実施形態は、融合ポリペプチドの多量体を含む非機能性複合体を形成
するようにＶＥＧＦ分子と結合し得る組成物である。
【００３６】 多量体が二量体である、組成物もまた好ましい。
【００３７】 さらに別の実施形態において、その組成物はキャリア内に存在する。
【００３８】 別の実施形態は、上記の核酸分子を含むベクターであり、このベクターとして
は、記載される核酸分子を含む発現ベクターが挙げられ、ここでその核酸分子は
、発現制御配列に作動可能に連結される。
【００３９】 他に含まれる実施形態は、適切な宿主細胞において、発現ベクターを含む融合
ポリペプチドを産生するための宿主−ベクター系であり；適切な宿主細胞が細菌
細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である宿主−ベクター系であり
；適切な宿主細胞がＥ．Ｃｏｌｉである宿主−ベクター系であり；適切な宿主細
胞がＣＯＳ細胞である宿主−ベクター系であり；適切な宿主細胞がＣＨＯ細胞で
ある宿主−ベクター系である。
【００４０】 本発明の別の実施形態は、融合ポリペプチドの産生およびこのように産生され
た融合ポリペプチドの回収を可能にする条件下で宿主−ベクター系の増殖細胞を
含む、融合ポリペプチドを産生する方法である。
【００４１】 さらなる実施形態は、図１０Ａ〜１０Ｄまたは図２４Ａ〜２４Ｃに記載される
核酸配列によってコードされる融合ポリペプチドを含み、これは、アセチル化ま
たはペグ化によって改変され、ここでこのアセチル化は、少なくとも約１００倍
モル過剰（ｍｏｌａｒ ｅｘｃｅｓｓ）のアセチル化剤を用いて達成されるか、
またはアセチル化は、少なくとも約１０倍のモル過剰〜約１００倍のモル過剰の
範囲のモル過剰アセチル化剤を用いて達成され得るか、あるいは、ペグ化は１０
Ｋまたは２０ＫのＰＥＧである。
【００４２】 好ましい実施形態は、哺乳動物における血漿の漏出（ｌｅａｋａｇｅ）を減少
または阻害する方法を含み、この方法は、哺乳動物に上記の融合ポリペプチドを
投与する工程を包含し、ここで哺乳動物がヒトであり、融合ポリペプチドがアセ
チル化されているかまたはこの融合ポリペプチドがペグ化されている実施形態を
含む。
【００４３】 さらなる実施形態は、ＶＥＧＦレセプターリガンドＶＥＧＦに特異的に結合す
る融合ポリペプチドである。
【００４４】 本発明の好ましい実施形態は、ヒトにおける血管増殖をブロックする方法であ
り、この方法は、上記の融合ポリペプチド有効量を投与する工程を包含する。
【００４５】 哺乳動物におけるＶＥＧＦレセプターリガンド活性を阻害する方法もまた好ま
しく、この方法は、上記の融合ポリペプチドの有効量を哺乳動物に投与する工程
を包含する。
【００４６】 これらの方法の好ましい実施形態は、哺乳動物がヒトである場合である。
【００４７】 本発明の方法のさらなる実施形態は、ヒトにおける腫瘍増殖の減弱または予防
；ヒトにおける水種の減弱または予防（特に、この水種は脳水種である）；ヒト
における腹水形成の減弱または予防（特に、この腹水は卵巣癌に関連する腹水で
ある）を含む。
【００４８】 本発明の好ましい実施形態は、（ｂ）多量体化成分に作動可能に連結した（ａ
）ＶＥＧＦレセプター成分を含むＶＥＧＦポリペプチドに結合し得る融合ポリペ
プチドを含み、ここでこのＶＥＧＦレセプター成分は、融合ポリペプチドにおけ
る単なるＶＥＧＦレセプター成分であり、そして本質的に、第１のＶＥＧＦレセ
プターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列、および第２のＶＥＧ
Ｆレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列からなる。
【００４９】 融合ポリペプチドのさらなる実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターは
Ｆｌｔ１である。
【００５０】 融合ポリペプチドのなおさらなる実施形態において、第２のＶＥＧＦレセプタ
ーはＦｌｋ１である。
【００５１】 融合ポリペプチドのさらなる別の実施形態は、第２のＶＥＧＦレセプターがＦ
ｌｔ４である融合ポリペプチドである。
【００５２】 好ましい実施形態は、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメ
イン２のアミノ酸配列が、第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇド
メイン３のアミノ酸配列の上流である融合ポリペプチド、および第１のＶＥＧＦ
レセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列が、第２のＶＥＧ
Ｆレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列の下流である融
合ポリペプチドを含む。
【００５３】 なお別の実施形態において、融合ポリペプチド多量体化成分は、免疫グロブリ
ンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖から
なる群から選択される実施形態を含む免疫グロブリンドメインを含む。
【００５４】 好ましい実施形態は、改変されたＦｌｔ１レセプターのアミノ酸配列を含む融
合ポリペプチドを含み、ここでこのアミノ酸配列は、以下からなる群から選択さ
れる：（ａ）図１３Ａ〜１３Ｄに記載のアミノ酸配列；（ｂ）図１４Ａ〜１４Ｃ
に記載のアミノ酸配列；（ｃ）図１５Ａ〜１５Ｃに記載のアミノ酸配列；（ｄ）
図１６Ａ〜１６Ｄに記載のアミノ酸配列；（ｅ）図２１Ａ〜２１Ｃに記載のアミ
ノ酸配列；（ｆ）図２２Ａ〜２２Ｃに記載のアミノ酸配列；および（ｇ）図２４
Ａ〜２４Ｃに記載のアミノ酸配列。
【００５５】 別の好ましい実施形態は、哺乳動物における血漿の漏出を減少または阻害する
方法であり、この方法は、上記の融合ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を
包含する。
【００５６】 代替の好ましい実施形態は、哺乳動物におけるＶＥＧＦレセプターリガンド活
性を阻害する方法であり、この方法は、上記の融合ポリペプチドの有効量を哺乳
動物に投与する工程を包含する。
【００５７】 （発明の詳細な説明） 治療候補物としてアンタゴニストの考察に適切である薬物動態プロフィールを
有する、レセプターに基づくＶＥＧＦアンタゴニストを生成することは、当該分
野で長い間常に問題であった。初めに出願者は、他の公知のレセプターベースの
ＶＥＧＦアンタゴニストと比較して改良された薬物動態特性を示すＶＥＧＦ活性
をアンタゴナイズし得るキメラポリペプチド分子を本明細書中に記載する。従っ
て、本明細書中に記載されるキメラポリペプチド分子は、最初に、治療における
使用のための適切な分子を提供する。ここでは、ＶＥＧＦのアンタゴニストは、
所望の結果である。
【００５８】 本発明は、Ｆｌｔ１レセプターの改変された細胞外リガンド結合ドメインをＩ
ｇＧのＦｃ領域に融合することにより形成される新規なキメラポリペプチド分子
を提供する。
【００５９】 この細胞外リガンド結合ドメインは、細胞膜における本来のコンフォメーショ
ンにおいて、それがその同族リガンドと接触し得る場合、細胞外へ配向されるレ
セプターの一部として規定される。細胞外リガンド結合ドメインは、レセプター
の膜貫通ドメインと関連する疎水性アミノ酸またはレセプターの細胞内ドメイン
と関連する任意のアミノ酸を含まない。一般に、レセプターの細胞内ドメインま
たは細胞質ドメインは、通常、正に荷電したアミノ酸または極性アミノ酸（すな
わち、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸）から
なる。前述の１５〜３０（主に、疎水性または非極性アミノ酸（すなわち、ロイ
シン、バリン、イソロイシンおよびフェニルアラニン））は、膜貫通ドメインを
含む。細胞外ドメインは、アミノ酸の疎水性膜貫通ストレッチの前方に位置する
アミノ酸を含む。通常、膜貫通ドメインは、正に荷電したアミノ酸または極性ア
ミノ酸（例えば、リジンまたはアルギニン）に隣接する。ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ
は、詳細な法則を公開した（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，１９９５，ＢｉｏＥｓｓａ
ｙｓ １７：２５−３０を参照のこと）。この結果は、所定のレセプターのどの
アミノ酸が、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインに属するか
を決定する場合に、当業者により通常参照される。あるいは、インターネット上
のウェブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｕｌｒｅｃ３．ｕｎｉｌ．ｃｈ／ｓｏ
ｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）は、利用可能となっており
、タンパク質ドメインについて推定することについての情報をタンパク質化学者
に提供する。
【００６０】 本発明は、適切な宿主細胞へ導入される場合、キメラポリペプチド分子を発現
し得るベクターへ挿入されるキメラポリペプチド分子をコードする核酸分子の構
築物を提供する。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞およ
び哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターへのＤＮＡフ
ラグメントの挿入について、当業者に公知である方法のいずれかを使用して、転
写／翻訳の制御シグナルの制御下でキメラポリペプチド分子をコードする発現ベ
クターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロでの組換えＤＮＡおよ
び合成技術、ならびにインビボでの組換え（遺伝子組換え）（Ｓａｍｂｒｏｏｋ
ら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕ
ｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ
，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−
Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）が挙げられ得る。
【００６１】 キメラポリペプチド分子をコードする核酸分子の発現は、キメラポリペプチド
分子が、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現されるように、第
２の核酸配列により調節され得る。例えば、本明細書中に記載されるキメラポリ
ペプチド分子の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエ
レメントにより制御され得る。キメラポリペプチド分子の発現を制御するために
使用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない
：Ｓｑｕｉｎｔｏら（１９９１，Ｃｅｌｌ ６５：１−２０）において記載され
るような末端反復配列；ＳＶ４０初期プロモーター領域（Ｂｅｒｎｏｉｓｔおよ
びＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ＣＭ
Ｖプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含まれる、Ｍ−Ｍ
ｕＬＶ ５’末端反復のプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌ
ｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇ
ｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７
８：１４４−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅ
ｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロ
モーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）またはｔａｃプロ
モーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ
．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，
１９８０，２４２：７４−９４の「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」をもまた参照のこと）などの原
核生物発現ベクター、酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント（例え
ば、Ｇａｌ４プロモーター）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモー
ター、ＰＫＧ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファ
ターゼプロモーターおよび以下の動物の転写制御領域（これは、組織特異性を示
し、そしてトランスジェニック動物において利用されてきた）：膵臓腺房細胞に
おいて活性であるエステラーゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃ
ｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒ
ｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０
９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１
５）；膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａ
ｎ，１９８５，Ｎａｒｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、リンパ球において活
性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，
Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ
３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ
．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４），精巣、胸、リンパ球および肥満細胞に
おいて活性であるマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃ
ｅｌｌ ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制
御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：
２６８−２７６）、肝臓において活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領
域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３
９−１６４８；Ｈａｍｍａｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５
８）；肝臓において活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌ
ｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、
骨髄性細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，
１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８
６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳内の稀突起神経膠細胞において活性であ
るミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，
Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−
２遺伝子制御領域（Ｓｈａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２
８６）および視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域
（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。
【００６２】 従って、本発明に従って、本明細書中に記載されるようなキメラポリペプチド
分子をコードする核酸を含む細菌または真核生物の宿主において複製され得る発
現ベクターは、宿主をトランスフェクトし、それにより、キメラポリペプチド分
子を産生するためにそのような核酸を直接発現するために使用され、次いでこれ
は、生物学的に活性な形態で回収され得る。本明細書中で使用される場合、生物
学的に活性な形態は、ＶＥＧＦに結合し得る形態を含む。
【００６３】 本明細書中に記載されるキメラ核酸分子を含む発現ベクターは、以下の３つの
一般的アプローチにより同定され得る：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼー
ション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入
された配列の発現。第１のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外来
遺伝子の存在は、挿入されたキメラポリペプチド分子配列に対して相同である配
列を含むプローブを使用するＮＤＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出
され得る。第２のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクター中
の外来遺伝子の挿入により引き起こされる特定の「マーカー」遺伝子機能（例え
ば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロ
ウイルスにおける閉塞体の形成など）の存在または非存在に基づいて同定されか
つ選択され得る。例えば、キメラポリペプチド分子のＤＮＡ配列がベクターのマ
ーカー遺伝子配列内に挿入される場合、挿入物を含む組換え体は、マーカー遺伝
子機能の非存在により同定され得る。第３のアプローチにおいて、組換え発現ベ
クターは、組換え体により発現される外来遺伝子産物をアッセイすることにより
同定され得る。このようなアッセイは、例えば、キメラポリペプチド分子の物理
的特性または機能的特性に基づき得る。
【００６４】 本発明の細胞は、キメラポリペプチド分子を、一過性、または好ましくは連続
的かつ持続的に発現し得る。
【００６５】 キメラポリペプチド分子は、任意の技術により精製され得、この技術は、引き
続く安定で生物学的に活性なキメラポリペプチド分子の形成を可能にする。例え
ば、そして限定のためではなく、この因子は、これらが８Ｍグアニジウム塩酸塩
および透析により定量的に抽出され得る、可溶性タンパク質としてかまたは封入
体としてのいずれかで細胞から回収され得る（例えば、Ｂｕｉｌｄｅｒら，米国
特許第５，６６３，３０４号を参照のこと）。この因子をさらに精製するために
、従来のイオン交換フロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、
逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が使用され得る。
【００６６】 本発明の１つの実施形態では、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、
第２の成分をコードするヌクレオチド配列の上流である。本発明の別の実施形態
では、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、第２の成分をコードするヌ
クレオチド配列の下流である。本発明のさらなる実施形態は、調製され得、ここ
で第１、第２および第３の融合ポリペプチド成分の順序は、再配列される。例え
ば、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、１と指定される場合、第２の
成分をコードするヌクレオチド配列は、２と指定され、そして第３の成分のヌク
レオチド配列は、３と指定され、次いで５’から３’へ読み取る場合、本発明の
単離された核酸におけるその成分の順序は、以下の６つの組み合わせのいずれか
であり得る：１、２、３；１、３、２；２、１、３；２、３、１；３、１、２ま
たは３、２、１。
【００６７】 本発明はまた、診断的および治療的用途を有する。本発明の特定の実施形態で
は、本明細書中に記載されるキメラポリペプチド分子の機能または発現における
異常を検出する方法は、障害の診断において使用され得る。他の実施形態では、
キメラポリペプチド分子またはキメラポリペプチド分子と結合するアゴニストも
しくはアンタゴニストの操作は、疾患の処置において使用され得る。さらなる実
施形態では、キメラポリペプチド分子は、その標的に対する結合因子の結合をブ
ロックする因子として使用される。
【００６８】 制限ではなく例えの目的で、本発明の方法は、血管透過性、水腫または感染（
例えば、傷害に関連する脳水腫、発作または腫瘍）；感染性疾患と関連する水腫
（例えば、乾癬または関節炎（慢性関節リウマチが挙げられる））；喘息；火傷
に関連する全身性水腫；腫瘍、感染または外傷に関連する腹水および胸水；慢性
気道感染；毛細血管漏出症候群（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｌｅａｋ ｓｙｎｄｒｏ
ｍｅ）；セプシス；タンパク質の増加した漏出と関連する腎臓疾患；および眼の
疾患（例えば、年齢が関連する黄斑変性および糖尿病網膜症）により特徴付けら
れる臨床的状態を処置する際に有用であり得る。
【００６９】 Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのアミノ酸配列分析は、塩基性アミノ酸残基（リジ
ン）の異常に高い数（４６）の存在を明らかにした。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ
のＩＥＦ分析は、このタンパク質が９．３を超えるｐＩを有することを示し、こ
のことは、このタンパク質が、非常に塩基性であるという推測を確認する。Ｆｌ
ｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の塩基性の性質が、そのタンパク質に細胞外マ
トリクス成分に結合させるということを生じ、およびマウスに注入される場合、
その相互作用が、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃにより示される極端に短い検出可能
な循環血清の半減期の要因であるということを仮定する。この仮定を試験するた
めに、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、塩基の荷電を減少するために、
リジン残基でアセチル化した。次いで、アセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆ
ｃを、下記に記載されるアッセイにおてい試験した。
【００７０】 以下の実施例は、限定の目的ではなく、例示の目的で提供される。
【００７１】 （実施例） （実施例１：ＣＨＯ Ｋ１細胞におけるＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質
の発現） 標準的な分子生物学技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔ
ｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら（
編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅ
ｎｃｅ，ＮＹ）を参照のこと）を使用して、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃをコード
する遺伝子を、ＣＭＶプロモーターの下流の多重クローニング部位で発現ベクタ
ーｐＥＥ１４．１（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ｐＩｃ）に挿入した。リ
ポフェクタミン（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ＣＨＯ Ｋ１細
胞をｐＥＥ１４．１／Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ ＤＮＡ構築物でトランスフェ
クトした。トランスフェクトしたＣＨＯ Ｋ１細胞を、グルタミンを含まないＤ
ＭＥＭ（ＪＲＨ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）（Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．，Ｓ
ｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製の２５μＭ メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を
含有する）中で増殖させ、そして高組換えタンパク質発現因子を、標準的なイム
ノアッセイ（これはヒトＦｃを捕捉および検出する）を用いて精選した１００を
超えるコロニー単離物からＣＨＯ Ｋ１細胞上清をスクリーニングすることによ
り得た。選択した精選クローンを、１００μＭ ＭＳＸの存在下で増幅し、次い
で増幅したクローンを２回スクリーニングした。最も高い産生性のクローンは、
５５ｐｇ／細胞／日の組換えＦｌｔ（１−３）−Ｆｃタンパク質の特異的生産性
を有した。
【００７２】 選択したクローンを、上記の細胞培養培地を用いて、２２５ｃｍ2 Ｔ−フラ
スコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中に展開し、次いで８．５Ｌローラ
ーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中に展開した。標準的なトリプ
シン処理によって細胞をローラーボトルから取り出し、そして３．５Ｌの懸濁培
地に入れた。この懸濁培地は、５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ，
Ｌｏｇａｎ，ＵＴ製のＦＢＳ）、１００μＭ ＭＳＸおよび５Ｌ Ｃｅｌｌｉｇ
ｅｎバイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，
Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）中、０．３×１０6細胞／ｍＬの密度での
ＧＳ補充（ＪＲＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を
含む、グルタミンを含まないＩＳＣＨＯ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）から構成される。細胞が３．６×１０6／ｍ
Ｌの密度に達し、そして懸濁液に適応した後、６０Ｌバイオリアクター（ＡＢＥ
Ｃ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）に、５％ウシ胎仔血清を含む２０ＬのＩＳＣＨ
Ｏ培地中、０．５×１０6細胞／ｍＬの密度で細胞を移した。２日後、さらに２
０ＬのＩＳＣＨＯ＋５％ウシ胎仔血清をこのバイオリアクターに加えた。細胞を
さらに２日間増殖させると、３．１×１０6細胞／ｍＬの最終濃度に達し、そし
て収集時の最終Ｆｌｏｔ１（１−３）−Ｆｃ濃度は９５ｍｇ／Ｌであった。収集
時に、０．４５μｍ Ｐｒｏｓｔａｋ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉ
ｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いるタンジェンシャルフローフィルトレー
ション（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって細
胞を取り出した。
【００７３】 （実施例２：ＣＨＯ Ｋ１から得たＦｌｔｌ（１−３）−Ｆｃタンパク質の精
製） Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、まずアフィニティークロマトグラフ
ィーにより精製した。プロテインＡカラムを使用して、高い特異性でこの分子の
Ｆｃ部分を結合させた。次いで、このアフィニティー精製タンパク質を濃縮し、
そしてＳＥＣカラムを通した。次いで、このタンパク質を処方緩衝液に溶出した
。以下は、これらの手順を詳細に記載する。
【００７４】 （材料および方法） ＰＢＳ（これは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂ
ｕｒｇ，ＭＤから１０×濃度で入手した）を除くすべての化学薬品は、Ｊ．Ｔ．
Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪから入手した。Ｐｒｏｔｅｉｎ
Ａ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００調製グレード樹脂は、Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手した。タンパク質濃縮
のための装置および膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡから入手
した。
【００７５】 Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を含有する約４０Ｌの０．４５μｍ濾過
したＣＨＯ馴化培地を、ＰＢＳで平衡化した２９０ｍＬ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ
Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（１０ｃｍ直径）に適用した。このカラムを、３５０
ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳで洗浄し、そして結
合タンパク質を、１０ｍＭ Ｎａ2ＨＰＯ4を含む２０ｍＭクエン酸で溶出した。
溶出物中の単一ピークを集め、そしてそのｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨを用いて中性
まで上昇させた。１０Ｋ再生セルロース膜を用いて、タンジェンシャルフローフ
ィルトレーションおよび攪拌細胞濃縮の両方によって、溶出画分を約９ｍｇ／ｍ
Ｌまで濃縮した。凝集物および他の混入物を除去するために、濃縮したタンパク
質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００調製グレード樹脂を充填したカラム（１０ｃｍ
×５５ｃｍ）に適用し、そして５％グリセロール含有ＰＢＳ中で行った。主要ピ
ーク画分をプールし、滅菌濾過し、アリコートし、そして−８０℃で保存した。
【００７６】 （実施例３：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のアセチル化） ２ミリグラムのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、スルホ−ＮＨＳ−ア
セテート改変キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ，ＩＬ，カタログ＃２６７７７）とともに提供される使用説明書に記載され
るようにアセチル化した。
【００７７】 （実施例４：アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の特徴付け） （（ａ．）ＩＥＦ分析）：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよびアセチル化Ｆｌｔ
１ （１−３）−Ｆｃを、標準的なＩＥＦ分析により分析した。図１に示される
ように、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質はゲル中に移動し得ず、従って標
準における最も高いｐＩである９．３よりも大きいｐＩを有するにちがいない。
しかし、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃはゲル内に移動し得、そして約５
．２のｐＩで平衡になる。この結果は、アセチル化がタンパク質の正味の正電荷
を減少させ、従ってそのｐＩをかなり減少させることを示す。
【００７８】 （（ｂ．）細胞外マトリックス成分への結合） 細胞外マトリックス成分への結合について試験するために、Ｆｌｔ１（１−３
）−Ｆｃおよびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、細胞外マトリックス成
分との相互作用を模倣するように設計されたアッセイにおいて試験した。このア
ッセイにおいて、９６−ウェル組織培養プレートをＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｉｏｃ
ｏａｔ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックス薄層９６ウェルプレート、
カタログ＃４０６０７，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，
Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）でコートする。このプレートを種々の濃度のＦｌｔ１（
１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのいずれかとインキュー
ベートするか、またはｒＴｉｅ２−Ｆｃ（無関係なコントロール）タンパク質を
ウェルに加える。このプレートを、室温または３７℃のいずれかで１〜２時間イ
ンキュベートし、次いで結合タンパク質の検出を、二次的なアルカリホスファタ
ーゼ結合抗ヒトＦｃ抗体をこのウェルに加えることによって達成する。最後に、
アルカリホスファターゼ基質をこのウェルに加え、そして光学密度を測定する。
図２は、このアッセイの結果を示す。無関係なコントロールタンパク質ｒＴｉｅ
２−Ｆｃと同様に、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、Ｍａｔｒｉｇｅｌ
コートしたプレートへのいかなる結合も示さないが、非アセチル化Ｆｌｔ１（１
−３）−Ｆｃタンパク質は有意な結合を示す。この結果は、塩基性アミノ酸残基
のアセチル化は、正に荷電したタンパク質とインビボにさらされた負に荷電した
細胞外マトリックス成分との間に存在する電荷相互作用を妨げるための有効な方
法であることを示す。
【００７９】 （実施例５：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔ
ｉｏｎ）） タンパク質のペグ化（ポリエチレングリコール−ＰＥＧ）は、安定性およびバ
イオアベイラビリティーを増強することによってそれらのインビボでの効力を増
加させ、一方で免疫原性を最小化することが示されてきた（上記で引用された参
考文献を参照のこと）が、大きすぎて腎糸球体により濾過できないペグ化分子が
、それらの薬物動態学的特性を高めることは、反対の直観である。理論に拘束さ
れることなく、本出願人は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ分子のペグ化が、多分、
その正電荷を変化させたり、Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃのｐＩを減少させること
によるのではなく、むしろ正電荷が細胞外マトリックスと相互作用することを物
理的に遮蔽することによって、薬物動態学的特性を高め得ることを想定した。本
出願人は、上記のように２０Ｋ ＰＥＧの鎖を結合することによって、Ｆｌｔ１
（１−３）−Ｆｃ分子の薬物動態学的特性を向上させるように試みることを決定
した。
【００８０】 （材料および方法） ＣＨＯ細胞由来の精製Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（上記を参照のこと）を以下
のペグ化実験において使用した。官能化ＰＥＧは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏ
ｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから；ビシンは、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ
Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，
Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから；ＰＢＳは、１０×濃縮物としてＬｉｆｅ Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから；グリセロール
はＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪから；およびビス−Ｔ
ｒｉｓプレキャストゲルはＮｏｖｅｘ，ＣＡから入手した。
【００８１】 アミン特異的末端部分で官能化した２０Ｋ ＰＥＧ鎖を、小スケール反応研究
において使用した。この研究は、ＰＥＧ：タンパク質化学量論を変化させる異な
る反応条件を評価するために設定した。これらの反応および標準的なＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥ上でのサンプル分析に基づいて、１．５ ｍｇ／ｍＬの濃度のＦｌｔ１（
１−３）−Ｆｃを、２０Ｋ ＳＰＡ−ＰＥＧ（ＰＥＧスクシンイミジルプロピオ
ネート）分子と、１：６のＰＥＧ対Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃモノマー比でｐＨ
８．１で反応させた。この反応を８℃、終夜で進行させた。最初の精製のために
、反応生成物を、５％グリセロール含有ＰＢＳで平衡化した１０ｍｍ×３０ｃｍ
Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムに適用した。このカラムは、ペグ化の程度に基づい
てペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ分子を分離するようであった。主にモノ
ペグ化およびジペグ化した二量体Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃであると思われる画
分（還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのバンド形成パターンにより判
断した場合）に対応する画分を、プールした。タンパク質濃度は、２８０ｎｍで
の吸収を測定することによって決定した。ペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ
タンパク質は、滅菌濾過し、アリコートし、そして−４０℃で保存した。
【００８２】 （実施例６：Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおける非改変、アセチル化、
およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合） 非改変、アセチル化、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質
を、Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおいて試験して、Ｆｌｔ１リガンド（Ｖ
ＥＧＦ）に結合するそれらの能力を評価した。このアッセイにおいて、非改変Ｆ
ｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質をＢｉａｃｏｒｅチップ（標準的な手順のた
めのＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪを参照のこと）の表面に固定し、
そして０．２μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦを含むサンプルと、非改変Ｆｌｔ１（１−３
）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃまたはペグ化したＦｌｔ１（１
−３）−Ｆｃ（各々２５μｇ／ｍｌ）のいずれかとを含むサンプルに、Ｆｔ１（
１−３）−Ｆｃでコートしたチップ上を通過させた。非特異的結合の効果を最小
化するために、結合サンプルを０．５Ｍ ＮａＣｌ洗浄液で洗浄した。１つのサ
ンプルにおいては、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃをヘパリンと混合した。ヘ
パリンは負に荷電した分子であり、そしてＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質
は正に荷電した分子であるので、２つの分子が一緒に混合される場合、これらは
それぞれの電荷を介して相互作用するべきである。このことは、その電荷および
電荷相互作用を介して結合するその傾向を減少させるために化学的または遺伝的
に改変されているかのように分子に振る舞わさせる、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ
の固有の正電荷を、基本的に中和する。図３に示されるように、アセチル化Ｆｌ
ｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム１３〜１６）、ペグ化したＦｌｔ１（１−３）−
Ｆｃ（カラム１７〜２０）、およびヘパリン処理Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カ
ラム２１〜２４）は、コントロール（カラム１〜４）および無関係のタンパク質
（カラム５〜８）と比較した場合、Ｂｉａｃｏｒｅチップ結合Ｆｌｔ１（１−３
）−ＦｃとＶＥＧＦ結合について完全に競合する。非改変Ｆｌｔ１（１−３）−
Ｆｃ（カラム５〜６）は、ＶＥＧＦ結合についてＢｉａｃｏｒｅチップ結合Ｆｌ
ｔ１（１−３）−Ｆｃと部分的にのみ競合するようであった。しかし、結合サン
プルを０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄する（カラム７〜８）ことによって、Ｆｌｔ１
（１−３）−Ｆｃの改変形態と類似の結合プロフィールを生じ、これは非改変タ
ンパク質が、チップへの非特異的結合（これは塩洗浄によって排除され得る）を
示していたことを示す。
【００８３】 （実施例７：ＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおける非改変、アセチル化、およ
びペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合） 非改変、アセチル化、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質
を、標準的なＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおいて試験し、Ｆｌｔ１レセプター
リガンドＶＥＧＦに結合するそれらの能力を評価した。図４に示されるように、
ペグ化およびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の両方は、ＶＥＧ
Ｆに結合し得、これは、ペグ化またはアセチル化のいずれかによってタンパク質
を改変することは、そのリガンドに結合するその能力を破壊しないことを示す。
【００８４】 （実施例８：非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３
）−Ｆｃ、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的分析） インビボ実験を、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１
−３）−Ｆｃ、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の薬物動
態プロフィールを評価するために設計した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ
；３マウス／グループ）に、４ｍｇ／ｋｇの非改変、アセチル化、またはペグ化
したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを皮下注射した。タンパク質の注射の１、２、４
、６、２４時間後、２日後、および３日後に、マウスの尾から採血した。Ｆｌｔ
１（１−３）Ｆｃタンパク質を検出するために設計された、標準的なＥＬＩＳＡ
に基づくアッセイにおいて、血清をアッセイした。手短には、このアッセイは、
ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦでコートする工程、非改変、アセチル化、または
ペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ含有血清を結合させる工程、およびアルカ
リホスファターゼに結合した抗Ｆｃ抗体を用いて報告する工程を包含する。図５
に示されるように、すべてのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質についてのＴ
ｍａｘは、６時間と２４時間の間の時点であった。異なるタンパク質についての
Ｃｍａｘは、以下の通りであった：非改変：０．０６μ／ｍｌ〜０．１５μ／ｍ
ｌ；アセチル化：１．５μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍｌ；およびペグ化：約５μ
ｇ／ｍｌ。
【００８５】 （実施例９：Ｆｌｔｌ（１−３）−Ｆｃの段階的アセチル化） 細胞外マトリックス成分への結合を排除するために必要なアセチル化の最小量
を決定するために、アセチル化反応混合物中に漸増する量のモル過剰のアセチル
化試薬を用いることによって、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を段階的様
式でアセチル化する実験を設計した。モル過剰の範囲は以下の通りであった：１
モルのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃモノマー当たり０、１０、２０、３０、４０、
５０、６０、７０、８０、９０、および１００モルのアセチル化試薬。反応は、
スルホ−ＮＨＳ−アセテート改変キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃ
ｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，カタログ＃２６７７７）とともに提供される使
用説明書に詳細に記載されるように行った。
【００８６】 （実施例１０：段階的にアセチル化されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの特徴付
け） （（ａ．）ＩＥＦ分析）非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的にアセ
チル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、標準的なＩＥＦ分析によっ
て分析した。図６Ａ〜６Ｂに示されるように、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ
タンパク質は、その非常に高いｐＩ（９．３より大きい）のためにゲル内に移動
し得なかった。しかし、段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃサン
プル（３０〜１００倍モル過剰サンプル）のほとんどはゲル内に移動し得、そし
てタンパク質のアセチル化の程度に依存して、４．５５〜８．４３の間にわたる
ｐＩで平衡になった。この結果は、アセチル化が、用量依存様式でタンパク質の
正電荷を変化させ得ること、およびｐＩの減少が、アセチル化の程度を制御する
ことによって制御され得ることを示す。
【００８７】 （（ｂ．）段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの細胞外マトリ
ックス成分への結合） 細胞外マトリックス成分への結合について試験するために、Ｆｌｔ１（１−３
）−Ｆｃおよび段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、細胞外マ
トリックス成分との相互作用を模倣するように設計された上記のアッセイにおい
て試験した。種々の濃度の、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、段階的にアセチ
ル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（１０、２０、および３０倍モル過剰サンプ
ル）、またはｒＴｉｅ２−Ｆｃ（無関係なコントロール）タンパク質のいずれか
をウェルに加えた。プレートを室温または３７℃で１〜２時間インキュベートし
、次いで結合タンパク質の検出を、ウェルに２次アルカリホスファターゼ結合抗
ヒトＦｃ抗体を加えることによって行った。アルカリホスファターゼ基質を引き
続いてウェルに加え、そして光学密度を測定した。図７は、このアッセイの結果
を示す。無関係なコントロールタンパク質ｒＴｉｅ２−Ｆｃと同様に、段階的に
アセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（２０および３０倍モル過剰サンプル
）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプレートに対するいかなる有意な結合も示さ
なかったが、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は有意な結合を
示した。結合は飽和であり、これは、飽和にならかいかもしれないより一般的な
電荷媒介相互作用ではなく、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質が、特定の部
位に結合し得ることを示す。１０倍モル過剰サンプルは減少した結合を示したが
、アセチル化の程度は、細胞外マトリックス成分への結合を完全にブロックする
ためには十分ではなかった。ＩＥＦ分析（図６Ａおよび６Ｂ）による事実にも関
わらず、２０倍モル過剰以上のサンプルは、検出可能な結合を示さず、低いモル
過剰のサンプルはなお大きい正味の正電荷を有した。この結果は、細胞外マトリ
ックス成分への結合を排除するためにすべての入手可能な塩基性アミノ酸を完全
にアセチル化することは、必要ではないということを示す。
【００８８】 （（ｃ．）Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおける段階的にアセチル化した
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合） 非改変および段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を
、Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおいて試験し、Ｆｌｔ１リガンド（ＶＥＧ
Ｆ）に結合するそれらの能力を評価した。このアッセイにおいて、非改変Ｆｌｔ
１（１−３）−Ｆｃタンパク質（０．５、１．０または５．０μｇ／ｍｌ）を、
Ｂｉａｃｏｒｅチップの表面に固定（標準的な手順のためのＢｉａｃｏｒｅ Ｉ
ｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓ
ｃａｔａｗａｙ，ＮＪを参照のこと）し、そして０．２μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦと
、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（０．５、１．０、または５．０μｇ／ｍｌ
のいずれかで）または段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの１０
の異なるサンプル（各々０．５、１．０、または５．０μｇ／ｍｌで）のいずれ
かとを含む溶液を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃコートしたチップの上を通過させ
た。図８に示されるように、準化学量論比（０．５μｇ／ｍｌの非改変Ｆｌｔ１
（１−３）または段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃのいずれか
対 ０．２μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）において、ＶＥＧＦを完全に結合するため
に十分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（非改変または段階的アセチル化のいずれか
）は溶液中に存在しなかった。１．０μｇ／ｍｌ（これは、約１：１の化学量論
比である）において、非改変および段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）
−Ｆｃの両方は、ＶＥＧＦ結合に対してよりよく競合し得るが、利用可能なＶＥ
ＧＦを完全に結合するためにはなお不十分なＦｌｔ（１−３）−Ｆｃタンパク質
（非改変または段階的アセチル化のいずれか）が存在する。しかし、５．０μｇ
／ｍｌ（これは、１：１の化学量論比よりも数倍大きい）においては、Ｆｌｔ（
１−３）−Ｆｃおよび段階的にアセチル化したＦｌｔ（１−３）−Ｆｃタンパク
質の両方が、アセチル化の程度に関わらずＶＥＧＦに結合し得る。このことは、
アセチル化は、ＶＥＧＦに結合するＦｌｔ（１−３）−Ｆｃの能力を変更しない
ことを明らかに示す。
【００８９】 （（ｄ）段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的分析） インビボでの実験を、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的アセチル
化（ｓｔｅｐ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の
薬物動態プロフィールを評価するために設計した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜
２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、または段階的ア
セチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの１０、２０、４０、６０および１００倍モ
ル過剰のサンプルを皮下注射した（非改変、１０、２０および４０倍モル過剰の
サンプルについては３匹のマウス、そして６０および１００倍モル過剰のサンプ
ルについては２匹のマウス）。注射後１、２、４、６、２４時間、２日目および
３日目に、これらのマウスの尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆ
ｃを検出するように設計されたＥＬＩＳＡに基づくアッセイ（前出に記載される
）においてアッセイした。図９は、本研究の結果を詳述する。試験した全てのＦ
ｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質についてのＴｍａｘは６時間の時点であった
が、Ｃｍａｘは以下の通りであった：非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ：０．０
６μｇ／ｍｌ；１０倍モル過剰のサンプル：−０．７μｇ／ｍｌ、２０倍モル過
剰のサンプル−２μｇ／ｍｌ、４０倍モル過剰のサンプル−４μｇ／ｍｌ、６０
倍モル過剰のサンプル−２μｇ／ｍｌ、１００倍モル過剰のサンプル−１μｇ／
ｍｌ。この結果は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのアセチル化またはペグ化（ｐｅ
ｇｙｌａｔｉｏｎ）が、その薬物動態プロフィールを有意に改善することを実証
する。
【００９０】 （実施例１１：Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃと称されるＦｌｔ１
（１−３）−Ｆｃの基本領域欠失変異体の構築） アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（これは、６未満のｐＩを有する）が、
非常にポジティブな非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（ｐＩ＞９．３）よりもず
っと優れた薬物動態を有するという観察に基づいて、薬物動態における相違が、
このタンパク質の正味の電荷に寄与し得るか否か、このことがこのタンパク質を
負に荷電した細胞外マトリックス成分に固着させるか、または細胞外マトリック
ス成分についての特異的結合部位を構成するＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク
質表面におそらく特異的な位置が存在するか否かが問われた。例えば、多くのタ
ンパク質は、ヘパリン結合部位（しばしば、塩基性残基のクラスターからなる）
を有することが公知である。時々、これらの残基は、タンパク質の一次配列にお
いてクラスター中で見出される；いくつかの文献は、このようなヘパリン結合部
位についての「コンセンサス配列」を同定した（例えば、Ｈｉｌｅｍａｎら，１
９９８，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２０（２）：１５６−６７を参照のこと）。他の
場合には、タンパク質の公知の結晶構造が、タンパク質表面上の正に荷電した残
基のクラスターを示すが、この残基は、一次配列のうちの異なる領域に由来し、
そしてタンパク質がその三次構造に折り畳まれたときにのみ一緒になる。従って
、単離されたアミノ酸残基がタンパク質表面の塩基性残基のクラスターの一部を
形成するか否かを予測することは困難である。しかし、正に荷電したアミノ酸残
基のクラスターが一次配列中に存在する場合、これらの残基が互いに空間的に近
く、それゆえ、細胞外マトリックス成分結合部位の一部であり得ると推測するこ
とは非現実的ではない。Ｆｌｔ１レセプターは、広範囲に研究されており、そし
て種々のドメインが記載されている（例えば、Ｔａｎａｋａら，１９９７，Ｊｐ
ｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８８：８６７−８７６を参照のこと）。本出願
の図１０Ａ〜図１０Ｄに示す核酸およびアミノ酸の配列を参照して、その配列の
開始部に存在し、そしてヌクレオチド７６〜７８によってコードされるグリシン
にまで伸びる分泌のためのシグナル配列を同定し得る。成熟タンパク質は、核酸
配列のヌクレオチド７９で始まり、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓで始まる。
Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン１は、ヌクレオチド７９から３９３に及び、アミノ酸Ｓ
ｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒで終わる。Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン２は、ヌクレオチド３
９４〜６８７（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰｒｏからＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅをコードす
る）に及び、そしてＦｌｔ１ Ｉｇドメイン３は、ヌクレオチド６８８〜９９６
（Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ＶａｌからＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａをコードする）に及ぶ。
ヌクレオチド９９７〜１００５によってコードされる架橋アミノ酸配列Ｇｌｙ−
Ｐｒｏ−Ｇｌｙが存在し、これには、ヒトＦｃをコードするヌクレオチド配列（
ヌクレオチド１００６〜１７０１、すなわちアミノ酸Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ〜
Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−停止）が続く。
【００９１】 Ｆｌｔ１アミノ酸配列のより詳細な分析は、クラスター、すなわち、図１０Ａ
〜１０Ｄのアミノ酸残基２７２〜２８１（ＫＮＫＲＡＳＶＲＲ）（ここでは、１
０アミノ酸残基のうちの６個が塩基性である）が存在することを示す。この配列
は、このレセプターのＦｌｔ１ Ｉｇドメイン３（図１１を参照のこと）に存在
し、これは、それ自体はＶＥＧＦリガンドの結合に必須ではないが、これは、リ
ガンドに対するより高い親和性結合を付与する。Ｉｇドメイン３の配列の、Ｉｇ
ドメイン２の配列との整列は、この領域において、この２つのＩｇドメインの間
では整列が非常に乏しいこと、およびＩｇドメイン３中に約１０個のさらなるア
ミノ酸が存在することを示す。これらの２つのドメインの親水性プロフィール（
ＭａｃＶｅｃｔｏｒコンピューターソフトウェア）の分析は、このタンパク質に
おける親水性領域の存在を明らかに示す（図１２Ａ〜１２Ｂ）。これらの観察は
、Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン３の実際の三次元コンホメーションが、Ｆｌｔ１ Ｉ
ｇドメイン２中に存在しないいくつかの型の突出を可能にする可能性を高めた。
この仮定を試験するために、１０個のさらなるアミノ酸を欠失し、そして得られ
たタンパク質を試験して、欠失が、レセプターのＶＥＧＦ親和性を深刻に損なわ
ずに薬物動態に好適に影響を与えたか否かをみた。このＤＮＡ構築物は、標準的
な分子生物学技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂ
ｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ
Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ
ｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅ
ｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎ
Ｙを参照のこと）を用いて哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ
Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中で構築された
。このＤＮＡ構築物をＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃという。Ｍｕｔ
１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ構築物を、ヌクレオチド８１４〜８４３（図
１０Ａ〜１０Ｄに示す）の欠失（これは、非常に塩基性の１０アミノ酸残基配列
Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−
ＡｒｇをＦｌｔ１ Ｉｇドメイン３から欠失する）によってＦｌｔ１（１−３）
−Ｆｃから誘導した。
【００９２】 最終的なＤＮＡ構築物を、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーおよびＴ
ａｑ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉ
ｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅ
ｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列を確認した。Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３Δ B ）−Ｆｃの配列を図１３Ａ〜１３Ｄに示す。
【００９３】 （実施例１２：Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃと称されるＦｌｔ１
（１−３）−Ｆｃ塩基性領域欠失変異体の構築） Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃと称される第２の欠失変異体構築物
を、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ構築物からヌクレオチド７９〜３
９３（図１０Ａ〜１０Ｄを参照のこと）によってコードされるＦｌｔ１ Ｉｇド
メイン１の欠失によって誘導した；便宜のために、ヌクレオチド７３〜７８（Ｔ
ＣＡ ＧＧＴ）を、ＴＣＣ ＧＧＡに変更した。これによって、関連したアミノ
酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙを変更することなく、制限部位（ＢｓｐＥ１）が導入され
た。このＤＮＡ構築物は、標準的な分子生物学技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏ
ｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃ
ｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇ
ｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ
−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）を用いて哺乳動物発現ベクタ
ーｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ，ＭＡ）中で構築され、これはまた、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシーク
エンサーおよびＴａｑ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ
Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎ
ｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列が確認された。Ｍｕｔ２：
Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃの配列を、図１４Ａ〜１４Ｃに示す。
【００９４】 （実施例１３：Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃと称されるＦｌｔ１（１
−３）−Ｆｃ欠失変異体の構築） 第３の欠失変異体構築物は、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃと称され、
これを、Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン３がインタクトなままである（塩基性領域のア
ミノ酸を欠失しなかった）こと以外はＭｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃ
構築物と同様にして構築した。この構築物を、標準的な分子生物学技術を用いて
構築し、そして最終的な構築物を、前出に記載されるとおりに配列を確認した。
Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃの配列を図１５Ａ〜１５Ｃに示す。
【００９５】 （実施例１４：Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆｃと称されるＦｌｔ（
１−３）−Ｆｃ塩基性領域Ｎグリコシル化変異体の構築） Ｎ−グリコシル化部位がＦｌｔ１ Ｉｇドメイン３の塩基性領域の真ん中に導
入されている最終的な構築物を作製した。この構築物はＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１
−３R->N）−Ｆｃと称され、そしてこれを、ヌクレオチド８２４〜８２５をＧＡ
からＡＣへと変更し、その結果、コードされるＡｒｇ残基（ＡＧＡ）をＡｓｎ残
基（ＡＡＣ）へと変更することによって作製した（図１０Ａ〜図１０Ｄを参照の
こと）。それゆえ、得られるアミノ酸配列は、Ａｒｇ−Ａｌａ−ＳｅｒからＡｓ
ｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒへと変更され、これは、Ａｓｎ残基でのＮ−グリコシル化部
位の付加のための規範シグナル（Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）と一致する
。Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆｃの配列を図１６Ａ〜図１６Ｄに示す
。
【００９６】 （実施例１５：アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ変異体、Ｍｕｔ１：Ｆｌ
ｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ変異体およびＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆ
ｃ変異体の特徴付け） （ａ）細胞外マトリックス成分への結合 ３つの改変されたタンパク質が改善された薬物動態学的特性を有する可能性が
高いようであるかまたは低いようであるかを決定するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌ
でコーティングした９６ウェルディッシュ（前出に記載の通り）を、種々の濃度
の変異タンパク質とともにインキュベートし、そして抗ヒトＦｃ／アルカリホス
ファターゼ結合体化抗体を用いて検出した。図１８に示すように、この実験は、
非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質がこれらのウェルに対して強く結合
し得るとはいえ、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃタンパク質はいくらかよ
り弱く結合し、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃタンパク質はさらにな
お弱く結合し、そしてＭｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃタンパク質は最
良のプロフィールを示し、その結合は、他の変異タンパク質のどれよりも弱いこ
とを示した。Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆｃグリコシル化変異タンパ
ク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイにおいて下限に近い利益しか示さなかった。
これらの結果は、ポジティブアミノ酸の直鎖配列が一次配列から欠失されて、細
胞外マトリックス成分との電荷相互作用における減少をもたらし得るという仮定
を確認する。
【００９７】 （（ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおけるＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−
３ΔB）−ＦｃおよびＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）：Ｆｃの結合） 非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびアセチル化Ｆｌｏｔ１（１
−３）−Ｆｃタンパク質、ならびに遺伝子改変されたＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−
３ΔB）−Ｆｃタンパク質およびＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆｃタン
パク質を、Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおいて試験して、Ｆｌｔ１リガン
ドであるＶＥＧＦに対するそれらの結合能力を評価した。このアッセイでは、非
改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／
ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌ）を、Ｂｉａｃｏｒｅチップの表面に固定し（標準
的な手順についてはＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，
Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪを参照のこと）、
そして０．１μｇ／ｍ ＶＥＧＦおよび精製した非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆ
ｃまたは非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを含有するＣＯＳ細胞上清（約０．２
５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌで）、精製したアセチ
ル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは
１．０μｇ／ｍｌで）、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃを含むＣＯＳ
細胞上清（約０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌで
）、あるいはＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆｃを含むＣＯＳ細胞上清（
約０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌ）のいずれか
を含む溶液を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃでコーティングしたチップに通過させ
た。図１７に示すように、化学量論未満の比で（未改変、アセチル化または遺伝
子改変されたサンプルの０．２５μｇ／ｍｌ Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ対０１
．μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定されたＦｌｔ１（１
−３）−Ｆｃに対するＶＥＧＦの結合をブロックするには不十分なＦｌｔ１（１
−３）−Ｆｃタンパク質が存在する。０．５μｇ／ｍｌの未改変Ｆｌｔ１（１−
３）−Ｆｃタンパク質、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質または
遺伝子改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質では、化学量論比は１：１に近
づき、そしてＢｉａｃｏｒｅチップに対するＶＥＧＦ結合をブロックする能力の
増加が存在する。１．０μｇ／ｍｌの非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク
質、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質または遺伝子改変Ｆｌｔ１
（１−３）−Ｆｃタンパク質（これは、ほぼ１０：１の化学量論比である）では
、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、Ｂｉａｃｏｒｅチップに対するＶＥ
ＧＦの結合をブロックし得るが、これらは等価ではない。非改変Ｍｕｔ１：Ｆｌ
ｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ、アセチル化Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ
およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃは、ＶＥＧＦ結合をブロックす
るその能力が本質的に等しく、一方、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆｃ
は結合をブロックする際にいくらか効率が低い。これらの結果は、主に負に荷電
したアミノ酸の直鎖配列を遺伝的に除去することによって、正に荷電した分子の
非特異的結合を低減することが可能であるという仮定を確認する。
【００９８】 （（ｃ）Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２
−３ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃの結合およびＥＬＩＳ
Ａに基づくアッセイにおける結合） ３つの変異タンパク質がＦｌｔ１リガンドＶＥＧＦを結合し得るか否かを決定
するために、ＶＥＧＦでプレーティングした９６ウェルプレートを種々の濃度の
それぞれの変異タンパク質と共にインキュベートし、そして洗浄後、アルカリホ
スファターゼ結合体化抗ヒトＦｃ抗体と共にインキュベートし、そして適切なア
ルカリホスファターゼ基質の添加によって比色的に定量することによって結合量
を検出した結合実験を行った。図１９に示すように、この実験は、全ての変異タ
ンパク質が、試験した濃度でＶＥＧＦを同様に結合し得ることを示した。
【００９９】 （実施例１６：アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（
１−３ΔB）−Ｆｃおよび非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的分析
） インビボでの実験を、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、Ｍｕｔ１
：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃタンパク質および４０倍モル過剰のアセチル化
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の薬物動態的プロフィールを評価するよう
に設計した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの非改変Ｆ
ｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１
−３）−Ｆｃタンパク質およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃタンパ
ク質（各々４匹のマウス）を皮下注射した。注射後１、２、４、６、２４時間、
２日目、３日目および５日目に、これらのマウスの尾から採血した。血清を、Ｆ
ｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を検出するように設計したＥＬＩＳＡにおい
てアッセイした。このＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦでコーティ
ングする工程、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを結合する工程およびアルカリホスフ
ァターゼに連結した抗Ｆｃ抗体を報告する工程を含む。図２０に示すように、こ
れらの試薬についてＣｍａｘは、以下の通りであった：非改変Ｆｌｔ１（１−３
）−Ｆｃ、０．１５μｇ／ｍｌ；４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３
）−Ｆｃ、１．５μｇ／ｍｌ；およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ
、０．７μｇ／ｍｌ。
【０１００】 （実施例１７：改変Ｆｌｔ１レセプターベクター構築） 改変版のＦｌｔ１レセプター（ＶＥＧＦＲ１としても公知）を構築するための
理論的根拠は、Ｆｌｔ１のタンパク質配列が非常に塩基性であり、それゆえ、細
胞外マトリックス（ＥＣＭ）に固着するようであるという観察に基づいていた。
Ｆｌｔ１の非常に塩基性の性質は、なぜ非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（前出
に記載される）が、これを治療的薬剤として使用することを困難にする乏しい薬
物動態を有するかをおそらく説明する。前出に記載されるように、化学的に改変
された形態の４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（本明細書
中以後、Ａ４０と名付ける）は、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃに対し
て大いに改善された薬物動態（ＰＫ）プロフィールを示した。それゆえ、Ａ４０
によって示される改善されたＰＫプロフィールを保有し、そしてＶＥＧＦに強固
に結合する能力をなお保持する、改変された形態のＦｌｔ１レセプター分子を組
換え発現するために用いられ得るＤＮＡ分子を操作する試みを行った。
【０１０１】 Ｆｌｔ１の第１のＩｇドメイン（これは、中性ｐＨで＋５という正味の電荷を
有する）は、ＶＥＧＦに対する強固な結合のために必須でないことが文献におい
て公知であるので、このドメインを欠失させた。第３のＩｇドメイン（＋１１と
いう正味の電荷を有する）は、結合に必須ではないが、第２のＩｇドメインより
も高いＶＥＧＦ親和性を付与するので、その全体を欠失する代わりに、第３のＩ
ｇドメインを、Ｆｌｔ１レセプターの同系物（ｒｅｌａｔｉｖｅ）Ｆｌｋ１（Ｖ
ＥＧＦＲ２としても公知）およびＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３としても公知）の等価
なドメインで置換した。これらのキメラ分子（Ｒ１Ｒ２（Ｆｌｔ１．Ｄ２．Ｆｌ
ｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）および
Ｒ１Ｒ３（それぞれ、Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）およ
びＶＥＧＦＲ１Ｒ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、ここで、Ｒ１およびＦｌｔ１Ｄ２＝Ｆ
ｌｔ１（ＶＥＧＦＲ１）のＩｇドメイン２；Ｒ２およびＦｌｋ１Ｄ３＝Ｆｌｋ１
（ＶＥＧＦＲ２）のＩｇドメイン３；ならびにＲ３およびＶＥＧＦＲ３Ｄ３＝Ｆ
ｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３）のＩｇドメイン３と示される）は、以下に記載されるよ
うに、インビトロＥＣＭ結合アッセイによって判断した場合、ＥＣＭに対してず
っと粘性が低く、以下に記載されたように非常に改善されたＰＫを有した。さら
に、これらの分子は、以下に記載されるようにＶＥＧＦに強固に結合し得、そし
て以下に記載されるように、内皮細胞において発現されたネイティブなＦｌｋ１
レセプターのリン酸化をブロックし得た。
【０１０２】 （（ａ）発現プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の
構築） 発現プラスミドｐＭＴ２１．Ｆｌｔ１（１−３）．Ｆｃ（６５１９ｂｐ）およ
びｐＭＴ２１．Ｆｌｋ−１（１−３）．Ｆｃ（５２３０ｂｐ）は、アンピシリン
耐性、ならびにそれぞれ、ヒトＦｌｔ１およびヒトＦｌｋ１のＦｃタグ化版のＩ
ｇドメイン１〜３をコードするプラスミドである。これらのプラスミドを用いて
、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２とＦｌｋ１のＩｇドメイン３との融合体からなるＤ
ＮＡフラグメントを、それぞれのＩｇドメインのＰＣＲ増幅、続いてさらなる回
のＰＣＲを用いて２つのドメインの単一のフラグメントへの融合を達成して構築
した。Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２については、５’増幅プライマーおよび３’増
幅プライマーは以下の通りであった：
【０１０３】
【化１】 ５’増幅プライマーは、アミノ酸配列ＧＲＰＦＶＥＭ（図２１Ａ〜２１Ｃのア
ミノ酸２７〜３３に対応する）によって規定される、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２
の上流のＢｓｐＥ１制限酵素部位をコードする。３’プライマーは、Ｆｌｋ１
Ｉｇドメイン３の５’開始部に直接融合された、Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン２の３
’末端の逆相補体をコードし、融合点は、Ｆｌｔ１のＴＩＩＤ（図２１Ａ〜２１
Ｃのアミノ酸１２３〜１２６に対応する）として規定され、そしてＦｌｋ１のＶ
ＶＬＳ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸１２７〜１３０に対応する）に続く。
【０１０４】 Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３について、５’増幅プライマーおよび３’増幅プラ
イマーは以下の通りであった：
【０１０５】
【化２】 ５’増幅プライマーは、上記のようにＦｌｋ１ Ｉｇドメイン３の開始部に直
接融合されたＦｌｔ１ Ｉｇドメイン２の末端をコードする。３’増幅プライマ
ーは、アミノ酸ＶＲＶＨＥＫ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸２２３〜２２８に対
応する）によって規定されるＦｌｋ１ Ｉｇドメイン３の末端をコードし、続い
て、制限酵素Ｓｒｆ１に対する認識配列を含む架橋配列をコードし、そしてアミ
ノ酸ＧＰＧをコードする。架橋配列は、図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸２２９〜２
３１に対応する。
【０１０６】 個々のドメインを産生するための１回のＰＣＲ増幅の後に、産物をチューブ内
で合わせ、そしてプライマーｂｓｐ／ｆｌｔ１Ｄ２およびＦｌｋ１Ｄ３／ａｐａ
／ｓｒｆ．ａｓ（上記）を用いてさらなる回のＰＣＲに供し、融合産物を産生し
た。このＰＣＲ産物を引き続いて制限酵素ＢｓｐＥＩおよびＳｍａＩで消化し、
そして得られた６１４ｂｐフラグメントを、ベクターｐＭＴ２１／ΔＢ２．Ｆｃ
のＢｓｐＥＩ〜ＳｒｆＩの制限部位にサブクローン化し、プラスミドｐＭＴ２１
／Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．Ｆｃを作製した。Ｆｌｔ１Ｄ２−Ｆｌｋ１Ｄ３
遺伝子融合挿入物のヌクレオチド配列を、標準的な配列分析によって確認した。
次いで、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｒｆＩで消化し、得られ
た７０２ｂｐのフラグメントを、プラスミドｐＦｌｔ１（１−３）Ｂ２−ＦｃΔ
Ｃ１（ａ）のＥｃｏＲＩ〜ＳｒｆＩの制限部位に移し、プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ
２．ＦｌｋＤ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．
ＦｃΔＣ１（ａ）キメラ分子の完全ＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を、図２１Ａ
〜２１Ｃに示す。
【０１０７】 （（ｂ）発現プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３ＦｃΔＣ１（ａ）の
構築） 発現プラスミドｐＭＴ２１．Ｆｌｔ１（１−３）．Ｆｃ（６５１９ｂｐ）は、
ヒトＦｌｔ１レセプターのＩｇドメイン１〜３のアンピシリン耐性およびＦｃタ
グ化型をコードする。このプラスミドを使用して、ＰＣＲによってＦｌｔ１のＩ
ｇドメイン２を含むＤＮＡフラグメントを産生した。細胞株ＨＥＬ９２１．７由
来のＲＮＡを使用して、標準的なＲＴ−ＰＣＲ方法論を使用して、Ｆｌｋ１のＩ
ｇドメイン３を産生した。さらなる回のＰＣＲ増幅を使用して、２つのＩｇドメ
インの単一の融合フラグメントへの融合を達成した。Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２
について、５’増幅プライマーおよび３’増幅プライマーは、以下の通りであっ
た：
【０１０８】
【化３】 ５’増幅プライマーは、アミノ酸配列ＧＲＰＦＶＥＭ（図２２Ａ〜２２Ｃのア
ミノ酸２７〜３３に対応する）によって規定される、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２
の上流のＢｓｐＥ１制限部位をコードする。３’増幅プライマーは、Ｆｌｔ１の
ＴＩＩＤ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸１２３〜１２６に対応する）として規定
される融合点を有し、そしてＶＥＧＦＲ３のＩＱＬＬ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミ
ノ酸１２７〜１３０に対応する）に続く、ＶＥＧＦＲ３ Ｉｇドメイン３の開始
部に直接融合されたＦｌｔ１ Ｉｇドメイン２の末端の逆相補体をコードする。
【０１０９】 ＶＥＧＦＲ３のＩｇドメイン３について、ＲＴ−ＰＣＲに使用される５’プラ
イマーおよび３’プライマーは、以下の通りであった：
【０１１０】
【化４】 ５’増幅プライマーと３’増幅プライマーの両方がＶＥＧＦＲ３の配列に一致
する。このＲＴ−ＰＣＲ反応の２９６ｂｐの増幅産物を標準的な技術によって単
離し、そして第２回のＰＣＲに供して、Ｆｌｋ１Ｄ３ドメインとのＦｌｔ１Ｄ２
の融合およびＧＰＧ架橋を介するＦｌｋ１Ｄ３とＦｃドメインとの融合を可能に
するための適切な配列を加えた（以下を参照のこと）。増幅プライマーは、以下
の通りであった：
【０１１１】
【化５】 ５’増幅プライマーは、上記のように、ＶＥＧＦＲ３ Ｉｇドメイン３の開始
部（５’末端）に直接融合されたＦｌｔ１ Ｉｇドメイン２の３’末端をコード
する。３’増幅プライマーは、アミノ酸ＶＩＶＨＥＮ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミ
ノ酸２２１〜２２６に対応する）によって規定されるＶＥＧＦＲ３ Ｉｇドメイ
ン３の３’末端をコードし、続いてＳｒｆ１に対する認識配列を含む架橋配列を
コードし、そしてアミノ酸ＧＰＧをコードする。架橋配列は、図２２Ａ〜２２Ｃ
のアミノ酸２２７〜２２９に対応する。
【０１１２】 個々のＩｇドメインを産生するための１回（Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン２につい
て）または２回（Ｆｌｔ４ Ｉｇドメイン３について）のＰＣＲの後に、ＰＣＲ
産物をチューブ内で合わせ、上記の増幅プライマーｂｓｐ／ｆｌｔ１Ｄ２および
ＶＥＧＦＲ３Ｄ３／ｓｒｆ．ａｓを用いたさらなる回のＰＣＲ増幅に供して、融
合産物を産生した。このＰＣＲ産物を引き続いて制限酵素ＢｓｐＥＩおよびＳｍ
ａＩで消化し、そして得られた６２５ｂｐのフラグメントを、ベクターｐＭＴ２
１／Ｆｌｔ１ΔＢ２．Ｆｃ（上記）のＢｓｐＥＩ〜ＳｒｆＩ制限部位にサブクロ
ーン化し、プラスミドｐＭＴ２１／Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．Ｆｃを産
生した。Ｆｌｔ１Ｄ２−ＶＥＧＦＲ３Ｄ３遺伝子融合挿入物の配列を、標準的な
配列分析によって確認した。次いで、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよ
びＳｒｆＩで消化し、そして得られた６９３ｂｐのフラグメントをプラスミドｐ
Ｆｌｔ１（１−３）ΔＢ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のＥｃｏＲＩ〜ＳｒｆＩの制限部
位にサブクローン化してｐＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）
と称されるプラスミドを産生した。Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ
１（ａ）キメラ分子の完全なＤＮＡ推定アミノ酸配列を図２２Ａ〜２２Ｃに記載
する。
【０１１３】 （実施例１８：細胞外マトリクス結合（ＥＣＭ）結合アッセイ） ＥＣＭでコートされたプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ
番号３５−４６０７）を、サンプルを加える前に、グルタミン（２ｍＭ）、１０
０Ｕペニシリン、１００Ｕストレプトマイシン、および１０％のＢＣＳで補充さ
れた温かいＤＭＥを用いて少なくとも１時間再水和した。次いで、プレートを、
種々の濃度の１０ｎＭで始めて、続いてＰＢＳ＋１０％ＢＣＳ中に２倍希釈した
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦ
Ｒ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）とともに、室温で１時間インキュベートした。次い
で、プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いて３回洗浄し、アルカ
リホスファターゼ結合体化抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＰＢＳ＋１０％Ｂ
ＣＳ中１：４０００）を用いて室温で１時間インキュベートした。次いでプレー
トをＰＢＳ ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いて４回洗浄し、そしてアルカリホ
スファターゼ緩衝液／ｐＮＰＰ溶液（Ｓｉｇｍａ）を発色のために加えた。プレ
ートをＩ＝４０５〜５７０ｎｍで読んだ。この実験の結果を図２３で示し、これ
は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥ
ＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のタンパク質は、ＥＣＭに対する粘着性が、Ｆ
ｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質と比較してかなり少ないことを示す。
【０１１４】 （実施例１９：ＣＨＯ−Ｋ１（Ｅ１Ａ）細胞中のｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ
３．ＦｃΔＣ１（ａ）の一過性発現） 実施例１７（ａ）において上記されるｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔ
Ｃ１（ａ）プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞の大規模（２Ｌ
）培養物を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）＋１００μｇ／ｍｌアンピ
シリン中で一晩増殖させた。次の日に、製造業者のプロトコルに従って、プラス
ミドＤＮＡをＱＩＡｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｍｅｇａｐｒｅｐキットを使用
して抽出した。精製されたプラスミドＤＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計および蛍
光計を使用して標準的技術によって決定した。プラスミドＤＮＡを、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ＋ＮｏｔＩおよびＡｓｅＩを使用して、アリコートの標準的な制限酵素
消化によって確認した。全ての制限酵素消化フラグメントは、１％アガロースゲ
ルで分析した場合に予期される大きさに対応した。
【０１１５】 ４０個の１５ｃｍペトリプレートに、４×１０６細胞／プレートの密度でＣＨ
Ｏ−Ｋ１／Ｅ１Ａ細胞を播種した。プレーティング培地は、１０％ Ｈｙｃｌｏ
ｎｅ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、１００Ｕ ペニシリ
ン／１００Ｕ ストレプトマイシンおよびグルタミン（２ｍＭ）を補充したＧｉ
ｂｃｏ Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２であった。翌日、それぞれのプレートの細胞を、
製造業者のプロトコルに従って、１２ｍｌ容積中のＧｉｂｃｏ Ｏｐｔｉｍｅｍ
およびＧｉｂｃｏ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して６μｇのｐＦｌｔ１
Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）プラスミドＤＮＡを用いてトランスフェ
クトした。トランスフェクション混合物を細胞に加えた４時間後に、１０％ＦＢ
Ｓを補充したＯｐｔｉｍｅｍを１２ｍｌ／プレートで加えた。プレートを５％Ｃ
Ｏ2インキュベーター中で一晩３７℃でインキュベートした。翌日、培地をそれ
ぞれのプレートから除去し、２５ｍｌの発現培地（グルタミン（２ｍＭ）および
１ｍＭ酪酸ナトリウムを補充したＧｉｂｃｏ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ）を加
えた。プレートを３７℃で３日間インキュベートした。３日間のインキュベーシ
ョン後、培地をそれぞれのプレートから吸引し、そしてスインギングバケットロ
ーター（ｓｗｉｎｇｉｎｇ ｂｕｃｋｅｔ ｒｏｔｏｒ）中、４００ｒｐｍで遠
心分離し、細胞をペレット化した。上清を滅菌１Ｌボトルにデカンテーションし
、発現されたタンパク質の精製を以下に記載のように実施した。
【０１１６】 （実施例２０：ｐＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）発現ベクターの構築） ｐＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）発現プラスミドを、図２１Ａ〜２１Ｃ
のＦｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）アミノ酸２６と２７（ＧＧ）
との間にアミノ酸ＳＤＴ（図２４Ａ〜２４Ｃのアミノ酸２７〜２９に対応する）
をコードするＤＮＡの挿入および図のアミノ酸２２９〜２３１に対応するアミノ
酸ＧＰＧをコードするＤＮＡの除去によって構築した。ＳＤＴアミノ酸配列は、
Ｆｌｔ１レセプターに対してネイティブであり、異種Ｎ末端プロセシングの可能
性を減少させるために後に加えられた。ＧＰＧ（架橋配列）が除去され、その結
果、Ｆｌｔ１およびＦｌｋ１ Ｉｇドメインが互いに直接融合される。ｐＶＥＧ
ＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）キメラ分子の完全なＤＮＡおよび推定のアミノ酸
の配列を、図２４Ａ〜２４Ｃに記載する。
【０１１７】 （実施例２１：改変Ｆｌｔ１レセプターを産生するために使用される細胞培養
プロセス） （ａ）Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生するために使用
される細胞培養プロセス） 実施例１において上記される発現プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．
ＦｃΔＣ１（ａ）を使用するＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タ
ンパク質の産生のためのプロセスは、タンパク質産物を構成的に発現する組換え
チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ Ｋ１／Ｅ１Ａ）細胞の懸濁培養を含む。
この細胞をバイオリアクター中で増殖させ、そしてタンパク質産物を単離し、ア
フィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって
精製する。このプロセスは、以下に、より詳細に提供される。
【０１１８】 （細胞増殖） Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）発現細胞株を含む２つのコン
フルエントなＴ−２２５ｃｍ2フラスコを、細胞を培地（ＧＭＥＭ＋１０％血清
、ＧＩＢＣＯ）中で８つのＴ−２２５ｃｍ2フラスコに継代させることによって
増殖させ、３７℃および５％ＣＯ2でインキュベートした。フラスコがコンフル
エンスに近づいたとき（約３〜４日）、細胞をトリプシンを使用して剥離した。
新鮮な培地を、トリプシンに対するさらなる曝露から細胞を保護するために加え
た。細胞を遠心分離し、そして新鮮な培地に再懸濁し、次いで、８つの８５０ｃ
ｍ2ローラーボトルに移し、３７℃および５％ＣＯ2でコンフルエントになるまで
インキュベートした。
【０１１９】 （バイオリアクターにおける懸濁培養） ローラーボトルにおいて増殖させた細胞を、トリプシン処理し、それらを表面
から剥離し、そして懸濁培養培地で洗浄した。細胞を、５Ｌのバイオリアクター
（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｃｅｌｌｉｇｅｎ Ｐｌｕｓ）に無菌的に移し
、ここで、細胞を３．５Ｌの懸濁培養物中で増殖させる。懸濁培養培地は、グル
タミンを含まない低グルコース改変のＩＳ−ＣＨＯ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎ
ｔｉｆｉｃ）であり、これに、５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＧＳ補充
物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２５μＭメチオニンスルホキ
シイミン（Ｓｉｇｍａ）を加えた。ｐＨを、入口ガスへの二酸化炭素の添加によ
ってか、またはバイオリアクターへの炭酸ナトリウムの液体溶液の添加によって
、７．２に制御した。溶存酸素レベルを入口ガスへの酸素または窒素の添加によ
って３０％飽和に維持し、そして温度を３７℃に制御した。４×１０6細胞／ｍ
Ｌの密度に達したとき、細胞を、４０Ｌのバイオリアクター（同じ培地およびバ
イオリアクターを制御するための設定値を含む）に移した。温度の設定値を３４
℃に下げて、細胞増殖を遅くし、そしてタンパク質発現の相対的な速度を増加さ
せる。
【０１２０】 （（ｂ）Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生するため
に使用される細胞培養プロセス） Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）についての上記のと同じ方法
論を使用してＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生した。
【０１２１】 （実施例２２：改変Ｆｌｔ１レセプターの収集および精製） （（ａ）Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の収集および精製） 産物タンパク質を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｓｔａｋ接線方向流れ濾過モ
ジュールおよび低せん断メカニカルポンプ（Ｆｒｉｓｔａｍ）を使用して、細胞
を保持しながらバイオリアクターから無菌的に収集した。新鮮な培地を、収集濾
過の間に除去される培地と置きかえるためにバイオリアクターに加えた。次いで
、約４０Ｌの収集濾液を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を含有
する４００ｍＬのカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にローディ
ングした。ローディングした後、樹脂を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍ
Ｍ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２を含む緩衝液を用いて洗浄して、結合していない
混入タンパク質を全て除去した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ
）タンパク質をｐＨ３．０クエン酸緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質をＴ
ｒｉｓ塩基の添加によって中和し、−２０℃で凍結させた。
【０１２２】 上記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ工程からのいくつかの凍結したロットのＦｌｔ１Ｄ２
．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質を解凍し、プールし、そしてＭｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ ３０ｋＤ名目分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）接線方向流れ濾
過膜を使用して濃縮した。このタンパク質を攪拌細胞濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒ
ｅ）に移し、そしてさらに３０ｋＤ ＮＭＷＣＯ膜を使用して３０ｍｇ／ｍＬに
濃縮した。濃縮タンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水＋５％グリセロールで平
衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃ
ｉａ）を充填したサイズ排除カラムにローディングした。同じ緩衝液をカラムに
流すために使用した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）ダイマー
に対応する画分をプールし、０．２２ミクロンフィルターを通して滅菌濾過し、
アリコートし、凍結させた。
【０１２３】 （ｂ）Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の収集および精製
） Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）についての上記のｐと同じ方
法論を使用してＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を収集およ
び精製した。
【０１２４】 （実施例２３：一過性発現されたＶＥＧＦＲ２についてのリン酸化アッセイ） ４〜６回継代した初代ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、血清を含まない
ＤＭＥ高グルコース培地中で２時間、飢餓させた。４０ｎｇ／ｍｌ（１ｎＭ）ヒ
トＶＥＧＦ１６５（これは、ＶＥＧＦレセプターＦｌｔ１、Ｆｌｋ１およびＦｌ
ｔ４（ＶＥＧＦＲ３）に対するリガンドである）を含むサンプルを調製し、０．
１％ＢＳＡを含み、血清を含まないＤＭＥ高グルコース培地において、種々の量
の改変Ｆｌｔ１レセプターＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆ
ｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ
２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を用いて、室温で１時間プレインキュベ
ートした。細胞を上記のように調製された試料＋／−ＶＥＧＦ１６５を用いて５
分間抗原投与し、続いて完全な溶解緩衝液を使用して細胞全体を溶解させた。細
胞溶解物をＶＥＧＦＲ２レセプターのＣ末端に対して指向された抗体を用いて免
疫沈降させた。免疫沈降された溶解産物を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｎｏｖ
ｅｘゲル上にローディングし、次いで、標準的な転写方法論を使用してＰＶＤＦ
膜に転写した。リン酸化したＶＥＧＦＲ２の検出を、４Ｇ１０（ＵＢＩ）と呼ば
れる抗ホスホチロシンｍＡｂを用いて免疫ブロットし、そしてＥＣＬ試薬（Ａｍ
ｅｒｓｈａｍ）を使用して発色させることによって行った。
【０１２５】 図２５Ａ〜２５Ｃおよび２６Ａ〜２６Ｂは、この実験の結果を示す。図２５Ａ
〜２５Ｃは、ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激によるチロシンリン酸化されたＶＥＧ
ＦＲ２（Ｆｌｋ１）のウエスタンブロットによる検出が、改変Ｆｌｔ１レセプタ
ーがＶＥＧＦでのプレインキュベーションの間に使用されることに依存して、細
胞表面レセプターが多様なレベルまでリン酸化されることを示すことを表す。図
２５Ａに示されるように、１．５モル濃度過剰のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆ
ｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）または一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．
ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかで、これらの３つの改変Ｆｌｔ１レセプターによる
レセプター刺激を、コントロール培地のチャレンジと比較して、完全にブロック
する。対照的に、一過性のＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は
、ＶＥＧＦ陽性コントロールチャレンジと比較して、このモル濃度過剰では顕著
なブロックを示さない。類似の結果を図２５Ｂに示す。ここで、改変Ｆｌｔレセ
プターは、ＶＥＧＦ１６５リガンドに対して３倍のモル濃度過剰である。改変Ｆ
ｌｔ１レセプターがＶＥＧＦ１６５リガンドに対して６倍のモル濃度過剰である
図２５Ｃにおいて、一過性のＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）
は、細胞表面レセプターのＶＥＧＦ１６５誘導性刺激を部分的にブロックするこ
とがここで示され得る。
【０１２６】 図２６Ａ〜２６Ｂにおいて、ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激によってチロシンリ
ン酸化されたＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）のウエスタンブロットによる検出は、１
および２倍モル濃度過剰（図２６Ａ）または３および４倍モル濃度過剰（図２６
Ｂ）の一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、安定的なＦｌｔ
１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、または一過性のＶＥＧＦＲ１Ｒ２−Ｆ
ｃΔＣ１（ａ）のいずれかでプレインキュベートされたＶＥＧＦ１６５を有する
チャレンジサンプルによって、細胞表面レセプターがリン酸化されないことを示
す。試験された改変Ｆｌｔ１レセプターの濃度の全てにおいて、プレインキュベ
ーションの間にＶＥＧＦ１６５リガンドは完全に結合し、コントロール培地のチ
ャレンジと比較して、未結合ＶＥＧＦ１６５による細胞表面レセプターの検出可
能な刺激を生じない。
【０１２７】 （実施例２４：細胞増殖バイオアッセイ） 試験細胞集団はＭＧ８７細胞であり、この細胞は、ＴｒｋＢ細胞内キナーゼド
メインに融合されたＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）細胞外ドメインをコードするＤＮ
Ａ挿入物を含む発現プラスミドで安定にトランスフェクトされ、従って、キメラ
分子を産生する。ネイティブなＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）細胞内キナーゼドメイ
ンよりもＴｒｋＢ細胞内キナーゼドメインが使用された理由は、これらの細胞に
おいてＶＥＧＦ１６５によって刺激された場合に、ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）の
細胞内キナーゼドメインは強い増殖性応答を引き起こさないからである。全長Ｔ
ｒｋＢレセプターを含むＭＧ８７細胞が、ＢＤＮＦで刺激された場合に強い増殖
性応答を提供することは公知である。従って、ＴｒｋＢ細胞内キナーゼドメイン
を操作して、この増殖性応答能を利用するようにＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）の細
胞内キナーゼドメインを置換する。
【０１２８】 ９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり５×１０3細胞をプレートし、
そして３７℃で２時間静置した。以下の改変Ｆｌｔレセプター（Ｆｌｔ１（１−
３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ
２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））、および陰性コントロールとしての
Ｔｉｅ２−Ｆｃと呼ばれる無関係なレセプターを、２０ｐＭ〜４０ｎＭで滴定し
、そして３７℃で１時間細胞上でインキュベートした。次いで、規定された培地
中のヒト組換えＶＥＧＦ１６５を、１．５６ｎＭの濃度で全てのウェルに添加し
た。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、次いで、ＭＴＳ（オーエン
試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、そしてプレートをさらに４時間インキュベー
トした。最終的に、このプレートを４５０／５７０ｎｍで分光光度計において読
んだ。この実験の結果を図２７に示す。コントロールレセプターＴｉｅ２−Ｆｃ
は、いずれの濃度でもＶＥＧＦ１６５誘導性細胞増殖をブロックしないが、Ｆｌ
ｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、０．８ｎＭの半分最大用量で１
．５６ｎＭのＶＥＧＦ１６５をブロックする。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび
Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、このアッセイにおいて
、約２ｎＭの半分最大用量でＶＥＧＦ１６５のブロックに効果的ではない。ＶＥ
ＧＦ１６５単独では、１．２吸収単位の読み取りを提供し、そしてバックグラウ
ンドは０．３８吸収単位である。
【０１２９】 （実施例２５：改変ＦｌｔレセプターのＶＥＧＦ１６５に対する結合化学量論
） （ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ分析 Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−Ｆｃ
ΔＣ１（ａ）のヒトＶＥＧＦ１６５との相互作用の化学量論を、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆ
ｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）表面もしくはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ
）表面に対するＶＥＧＦ飽和結合のレベルを測定するか、またはＦｌｔ１Ｄ２Ｆ
ｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）もしくはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の
ＶＥＧＦ ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面に対する結合を完全に妨げるために必要な
ＶＥＧＦ１６５の濃度を測定するかのいずれかで決定した。改変Ｆｌｔレセプタ
ーであるＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２
−ＦｃΔＣ１（ａ）を、Ｂｉａｃｏｒｅチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ）上にアミン結
合化学を使用して第一に固定化した抗Ｆｃ特異的抗体で捕獲した。ブランクの抗
体表面を、陰性コントロールとして使用した。ＶＥＧＦ１６５を、毎分１０μｌ
で１時間、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）表面およびＶＥＧＦＲ
１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）表面にわたって、１ｎＭ、１０ｎＭおよび５０ｎＭの
濃度で注入した。リアルタイムの結合シグナルを記録し、そしてそれぞれの注入
の最後に飽和結合に達成した。結合化学量論を、１ｎｇ／ｍｌに等価な１０００
ＲＵの転換因子を使用して、結合ＶＥＧＦ１６５と固定化Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１
Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）とのモル比
として計算した。この結果は、１分子のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１
（ａ）、または1分子のＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）当たりの，１分子
のＶＥＧＦ１６５二量体の結合化学量論を示した（図２８）。
【０１３０】 溶液中で、１ｎＭの濃度のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）また
はＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ
１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用
のＫＤよりも１０００倍高いと推定される）を、多様な濃度のＶＥＧＦ１６５で
混合した。１時間のインキュベーション後に、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ
１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を、アミン結合ＶＥＧＦ１６５表面に対する結
合シグナルとして測定した。較正曲線を使用して、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．
ＦｃΔＣ１（ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ結合シグナルをそのモル濃度に変換した。デー
タにより、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液への１ｎＭのＶＥ
ＧＦ１６５の添加がＶＥＧＦ１６５表面へのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔ
Ｃ１（ａ）の結合を完全にブロックしたことが示された。この結果により、１分
子のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）当たり１分子のＶＥＧＦ１６
５の結合化学量論が示唆された（図２９および図３０）。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１
Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を添加したＶＥＧＦ１６５の濃度の画分としてプ
ロットした場合、直線部分の傾きは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（
ａ）に対して−１．０６であり、そしてＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）に
対して−１．０７であった。傾きの大きさ（−１に非常に近い）によって、１分
子のＶＥＧＦ１６５がＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥ
ＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれか１分子に結合したことが示された。
【０１３１】 （ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を、３倍過剰のＶＥＧＦ１６５
と混合し、そしてレセプター−リガンド複合体を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐ
ｅｒｏｓｅ ６ サイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して精製した。次
いで、レセプター−リガンド複合体を、その成分タンパク質に分離するために６
Ｍの塩酸グアニジンを含有する緩衝液中でインキュベートした。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆ
ｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を、６Ｍの塩酸グアニジンを通すＳｕｐｅｒｏｓ
ｅ ６ サイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用してＶＥＧＦ１６５から分
離した。複合体の化学量論を決定するために、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．Ｆｃ
ΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦ１６５の数回の注入を行い、そしてピークの高さま
たは積算したピークの強度を、注入したタンパク質の濃度の画分としてプロット
した。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ複合体の成分を
分離した際に使用した条件と同一の条件下で、較正を行った。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌ
ｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ複合体組成物の定量は、較正曲線に基い
た。この実験の結果を図２８に示す。これは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．Ｆｃ
ΔＣ１（ａ）に対するＶＥＧＦ１６５の比が、この複合体において１：１である
ことを示す。
【０１３２】 （実施例２６：サイズ排除クロマトグラフィーによるＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１
Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の結合化学量論の決定） （Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の調
製） ＶＥＧＦ１６５（濃度＝３．６１ｍｇ／ｍｌ）を、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ
３．ＦｃΔＣ１（ａ）（濃度＝０．９ｍｇ／ｍｌ）を一過性に発現するＣＨＯ細
胞と３：１（ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）
）のモル比で混合し、４℃で一晩インキュベートした。
【０１３３】 （ａ）ネイティブな条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ） 過剰な未結合のＶＥＧＦ１６５から複合体を分離するために、５０μｌの複合
体を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２
ＰＣ ３．２／３０にロードした。室温で毎分４０μｌの流速にて、サンプル
を、同一の緩衝液で溶出した。このＳＥＣの結果を図３１に示す。ピーク＃１は
複合体を、そしてピーク＃２は未結合のＶＥＧＦ１６５を示す。１．１ｍｌと１
．２ｍｌとの間で溶出された画分を合わせ、そして塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ
）を最終濃度４．５Ｍで添加して、この複合体を分離した。
【０１３４】 （ｂ）分離条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ） レセプター−リガンド複合体の成分を分離するため、そしてこれらのモル比を
決定するために、上記のような５０μｌの分離した複合体を、６ＭのＧｕＨＣｌ
で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＰＣ ３．２／３０にロードし、そして
室温で毎分４０μｌの流速にて、同一の溶液で溶出した。このＳＥＣの結果を図
３２に示す。ピーク＃１はＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を、そ
してピーク＃２はＶＥＧＦ１６５を示す。
【０１３５】 （ｃ）Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）：ＶＥＧＦ１６５複合体
の化学量論の算出 レセプター−リガンド複合体の化学量論を、これらの成分のピークの面積また
はピークの高さから決定した。ピークの高さまたはピークの面積に対応するＶＥ
ＧＦ１６５およびＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度をそれぞ
れ、ＶＥＧＦ１６５およびＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）に関す
る標準曲線より得た。標準曲線を得るために、４つの異なる濃度（０．０４ｍｇ
／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ）のいずれかの成分を、６Ｍ 塩酸グアニジンで平衡
化したＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＰＣ ３．２／３０カラ
ムに注入し、そして室温で毎分４０μｌの流速にて、同一の溶液で溶出した。ピ
ークの面積またはピークの高さ 対 タンパク質濃度のプロットによって、標準
曲線を得た。成分のピークの面積から決定したＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆ
ｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のモル濃度比は、１．１６であった。成分のピー
クの高さから決定したＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１
（ａ）のモル比は、１．１０であった。
【０１３６】 （実施例２７：オンライン光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによ
るＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の化学
量論の決定） （複合体調製） ＶＥＧＦ１６５を、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク
質を一過性に発現するＣＨＯと３：１（ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１
Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））のモル比で混合し、そして４℃で一晩インキュベート
した。
【０１３７】 （ａ）オンライン光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ） ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ
）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用いるサイズ排除ク
ロマトグラフィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（Ｍ
Ｗ）を決定した。サンプルをＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２
ＨＲ １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入し、そして室温で毎分
０．５ｍｌの流速にて、同一の緩衝液で溶出した。図３３に示されるように、溶
出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク＃１はレセプター−リガンド複合
体を、そしてピーク＃２は未結合ＶＥＧＦ１６５を示す。ＭＷをＬＳおよびＲＩ
のシグナルより計算した。同一の手順を使用して、レセプター−リガンド複合体
の個々の成分のＭＷを決定した。これらの決定の結果は以下である：ピーク位置
でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭ
Ｗは、１５７ ３００（図３３）であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷ
は４４ ３９０（図３４）であり、そしてピークでのＲ１Ｒ２のＭＷは１１３
３００（図３５）である。
【０１３８】 これらのデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ
１６５複合体の化学量論がＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）および
ＶＥＧＦ１６５の分子量の合計に対応して１：１であることを示した。重要なこ
とに、この方法は、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１
６５複合体が実はＶＥＧＦ１６５リガンドの１分子のみとＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１
Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の１分子のみから構成されたことを最終的に証明した。
【０１３９】 （実施例２８：Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のペプチドマ
ッピング） Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のジスフィルド構造およびグ
ルコシル化部位を、ペプチドマッピング法によって決定した。この方法において
は、タンパク質をまずトリプシンで切断した。トリプシン処理のフラグメントを
、Ｎ末端配列決定技術に加えて、質量分析法と連結したＨＰＬＣで分析および同
定した。トリプシン消化の還元を、ジスフィルド結合含有フラグメントの同定を
補助するために利用した。ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ
）でのトリプシン消化の処理を、Ｎ連結グリコシル化部位を有するフラグメント
の同定を補助するために利用した。これらの結果を添付する図３６に要約する。
【０１４０】 Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）に合計１０のシステインが存
在し；これらの６つはＦｃ領域に属する。Ｃｙｓ２７は、Ｃｙｓ７６にジスフィ
ルド結合することが確認された。Ｃｙｓ１２１は、Ｃｙｓ１８２にジスフィルド
結合することが確認された。Ｆｃ領域の最初の２つのシステイン（Ｃｙｓ２１１
およびＣｙｓ２１４）は、別のＦｃ鎖における同一の２つのシステインと分子間
ジスフィルド結合を形成する。しかし、これらの２つのシステインは酵素的に互
いを分離し得ないので、ジスフィルド結合が同一のシステインの間（例えば、Ｃ
ｙｓ２１１とＣｙｓ２１１）またはＣＹ２１１とＣｙｓ２１４との間に生じるか
否かは決定し得ない。Ｃｙｓ２１６は、Ｃｙｓ３０６にジスフィルド結合するこ
とが確認される。Ｃｙｓ３５２は、Ｃｙｓ４１０にジスフィルド結合することが
確認される。
【０１４１】 Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）に５つの可能性のあるＮ連結
グリコシル化部位が存在する。これら５つの全ては、多様な程度にグリコシル化
されることが見出される。完全なグリコシル化が、Ａｓｎ３３（アミノ酸配列Ｎ
ＩＴ）、Ａｓｎ１９３（アミノ酸配列ＮＳＴ）およびＡｓｎ２８２（アミノ酸配
列ＮＳＴ）で観察された。さらに、部分的グリコシル化がＡｓｎ６５およびＡｓ
ｎ１２０で観察される。グリコシル化の部位を、図３６で下線によって強調する
。
【０１４２】 （実施例２９：改変Ｆｌｔレセプターの薬物動態分析） （ａ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．
ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態分析 Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）
−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を一過性に
発現したＣＨＯ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を安定的に発
現したＣＨＯ、およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を一過性に発現した
ＣＨＯを用いて皮下注射した。注射後１、２、４、６、２４時間、２日、３日お
よび６日に、マウスを尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ
４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ
２−ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するように設計したＥＬＩＳＡでアッセイした。Ｅ
ＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦ１６５でコーティングする工程、検
出Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔ
Ｃ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を結合させる工程および
西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗Ｆｃ抗体でレポートする工程を包含
する。この実験の結果を図３７に示す。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）に
ついてのＴmaxは、６時間であったが、一過性Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．Ｆ
ｃΔＣ１（ａ）および安定的なＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）
ならびに一過性ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＴmaxは、２４
時間であった。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）についてのＣmaxは、８μ
ｇ／ｍｌであった。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥ
ＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の両方の一過性について、Ｃmaxは、１８μｇ
／ｍｌであり、安定的なＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）について、Ｃmax
は、３０μｇ／ｍｌであった。
【０１４３】 （ｂ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．
ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の
薬物動態分析 Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）
−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を一過性に
発現したＣＨＯおよびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を一
過性に発現したＣＨＯを用いて皮下注射した。注射後１、２、５、６、７、８、
１２、１５および２０日に、マウスを尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−
３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＦｌｔ１Ｄ
２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するように設計したＥＬＩＳＡ
でアッセイした。ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートを１６５でコーティングす
る工程、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１
（ａ）またはＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を結合させる
工程および西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗Ｆｃ抗体でレポートする
工程を包含する。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）は、もはや５日後に血清
中で検出され得ないが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）および
Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、１５日以上検出可能で
あった。この実験の結果を図３８に示す。
【０１４４】 （実施例３０：インビボで腫瘍増殖を阻害するＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．
ＦｃΔＣ１（ａ）の能力の評価） インビボで腫瘍増殖を阻害するＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ
）の能力の評価するために、雄の重篤複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの右脇腹
に腫瘍細胞懸濁液を皮下移植するモデルが利用した。２つの細胞株（それぞれが
明確に異なる形態および増殖特性を示す、ヒトＨＴ−１０８０線維肉腫細胞株（
ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１２１）およびラットＣ６神経膠腫細胞株（ＡＴＣＣ
受託番号ＣＣＬ−１０７））を、アッセイに使用した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１
Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の第一の用量（２５ｍｇ／Ｋｇでかまたは図３９および
４０に示されるように）を、腫瘍移植の日に提供した。動物に、続いてＦｌｔ１
（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）
またはビヒクルの皮下注射を、一日おき（ＥＯＤ）か１週間に２回（２×／ｗｋ
）のいずれかで２週間にわたって受けさせた。２週間後、動物を固定液で灌流し
、腫瘍を取り外し、そしてサンプルを盲目検定した。可視の皮下腫瘍の長さおよ
び幅を測定することによって、腫瘍体積を決定した。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ
（Ａ４０）およびＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の両方は、Ｈ
Ｔ−１０８０細胞およびＣ６細胞によって形成された腫瘍の増殖を顕著に減少し
た。これらの実験の結果を図３９および図４０に示す。
【０１４５】 （実施例３１：雌性生殖系におけるＶＥＧＦ１６５および改変Ｆｌｔレセプタ
ーの効果） 生殖周期の経過にわたる子宮および卵巣で生じる血管リモデリングの通念的な
パターンは、十分に特徴付けられており、これらの組織を、新脈管形成、血管リ
モデリングおよび血管退化を調節する機構の研究へ格別十分に最適にする。実際
に、生殖組織のインサイチュハイブリダイゼーション研究によって、ＶＥＧＦが
、成熟したげっ歯類ならびにヒトおよび非ヒト霊長類において、生理的新脈管形
成のメディエーターとして作用する最初の明確な証拠が提供された（Ｐｈｉｌｌ
ｉｐｓら、１９９０；Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈら、１９９２；Ｓｈｗｅｉｋｉ
ら、１９９３；Ｋａｍａｔら、１９９５）。周期性の新脈管形成および血管リモ
デリングは、正常な卵巣および子宮の顕著な特徴であるので、異常な血管増殖お
よび／または血管機能不全が、これらの器官に影響を与える多くの病理状態を特
徴付けることが見出されたことは、驚くべきことではない。さらに、これらの病
原性の血管異常性は、１つ以上の脈管形成因子または抗脈管形成因子、最も顕著
にはＶＥＧＦの発現の調節不全な発現によって、引起されるかまたは不滅化され
ると考えられる。
【０１４６】 例えば、異常な新脈管形成は、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症および子宮内膜
癌腫に特徴的であり、そして各場合において、ＶＥＧＦは、発症組織において過
剰発現している（Ｋａｍａｔら、１９９５；Ｓｈｉｆｒｅｎら、１９９６；Ｇｕ
ｉｄｉら、１９９６；Ｄｏｎｎｅｚら、１９９８）。ＶＥＧＦの過剰発現はまた
、卵巣過剰刺激症候群（ＭｃＣｌｕｒｅら、１９９４；Ｌｅｖｉｎら、１９９８
）および子癇前症（Ｂａｋｅｒら、１９９５；Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９６）に
おける全身性の血管の透過性亢進（ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）の確
立に病原性の役割を果たすと考えられている。さらに、ＶＥＧＦは、卵巣癌およ
び他の腫瘍と関連する腹水の生成の原因である透過性因子として関連している（
Ｓｅｎｇｅｒら、１９８３；Ｂｏｏｃｏｃｋら、１９９５）。ＶＥＧＦの生物学
的活性を効果的に中和する薬剤は、上記の状態および関連する状態において治療
的に有用であるものとして合理的に予測され得る。
【０１４７】 新脈管形成および血管リモデリングはまた、未分化胚芽細胞の着床および胎盤
の発達の特徴である（Ｆｉｎｄｌａｙ、１９８６）。ＶＥＧＦは、母体脱落膜中
および胚のトロホブラスト中の両方において強く発現し、ここで、これはまず着
床期辺りの間に、子宮脈環構造の発現および透過性亢進を刺激し、続いて、母性
成分の胎盤血管構造と胚成分の胎盤血管構造との両方の形成を媒介すると考えら
れる（Ｓｈｗｅｉｋｉら、１９９３；Ｃｕｌｌｉｎａｎ−ＢｏｖｅおよびＫｏｏ
ｓ、１９９３；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら、１９９５；Ｄａｓら、１９９７）。
ＶＥＧＦはまた、黄体の新脈管形成に必要であり、そして、着床のための子宮の
準備に必要であるプロゲステロン分泌と関連する（Ｆｅｒｒａｒａら、１９９８
）。従って、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害する薬剤は、（着床を妨げることに
よって）避妊剤として有用であるか、または妊娠の初期段階における流産を促す
物質として有用であることが証明され得る。後者の適用は、異所性妊娠の終結の
ための非外科的介入としての特定の用途が見出され得る。
【０１４８】 ＶＥＧＦレセプターの発現は、正常な生殖組織中の血管内皮に広く確認された
が、Ｆｌｔ１はまた、ヒトおよび動物の両方の胎盤中のトロホブラストに発現し
（Ｃｌａｒｋら、１９９６；Ｈｅら、１９９９）、これによって、トロホブラス
ト浸潤に役割を果たすことが提案される。興味深いことに、Ｆｌｔ１およびＫＤ
Ｒ（Ｆｌｋ１）の両方は、絨毛癌細胞株のＢｅＷｏに発現し（Ｃｈａｒｎｏｃｋ
−Ｊｏｎｅｓら、１９９４）、そしてＶＥＧＦは、これらの細胞中のＤＮＡ合成
およびＭＡＰキナーゼのチロシンリン酸化を促進することが示された。さらに、
原発性卵巣癌および転移性卵巣癌は、高レベルのＶＥＧＦを発現するだけでなく
、血管内皮に加えて、さらにこの腫瘍細胞自身が、ＫＤＲおよび／またはＦｌｔ
１を発現する（Ｂｏｏｃｏｃｋら、１９９５）。これらの知見によって、ＶＥＧ
Ｆは腫瘍血管構造の生成および維持に決定的に関与し得るのみでなく、少なくと
もいくつかの生殖腫瘍起源のＶＥＧＦは、腫瘍細胞の生存および増殖を直接支持
することによってオートクラインの役割を促進し得る。従って、ＶＥＧＦの作用
を阻害する薬剤は、生殖起源の腫瘍の処置に対する特に有益な適用を有し得る。
【０１４９】 （方法および結果） （（ａ）ＶＥＧＦ誘導の子宮透過性亢進の評価） 妊娠した雌馬の血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を、皮下注射し（５ＩＵ）、
思春期前の雌のラットに排卵を誘導した。これは、２日後にエストラジオールの
急増を引き起こし、次に、子宮中のＶＥＧＦの誘導を引き起こした。この誘導が
子宮の透過性亢進を引き起こし、ゆえに、６時間後に子宮の湿重量における増加
を生じ、従ってこれは、改変ＦｌｔレセプターのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ
４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．
ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）によって強力に阻害され得たことが、報告
された。このインビボモデルにおいて、ラットの子宮の通常の重量は、約５０ｍ
ｇであり、そしてこれは、ＰＭＳＧによって３００〜３５０ｍｇに誘導され得る
。組織の乾燥によって、これが全て水の重量であることが明らかとなる。ＰＭＳ
Ｇ注射の１時間後のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌ
ｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ
１（ａ）の２５ｍｇ／ｋｇでの皮下注射は、子宮湿重量における増加の約５０％
の阻害を引き起こした。改変Ｆｌｔレセプターの用量における増加は、湿重量に
おける増加をさらに減少せず、このモデルに対するＶＥＧＦ独立の成分が存在す
ることを示唆する。この実験の結果を、図４１に示す。
【０１５０】 （（ａ）プロゲステロンを読取った情報として用いる黄体新脈管形成の評価） 妊娠した雌馬の血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を皮下注射（５ＩＵ）し、思
春期前の雌のラットに排卵を誘導する。これは、４日後に密集した血管のネット
ワークを含む完全に機能する黄体を引き起こし、これは、着床のために子宮を準
備するために、血流へのプロゲステロンの分泌を可能にする。黄体における新脈
管形成の誘導は、ＶＥＧＦを必要とする；従って、ＶＥＧＦのブロックは、新規
の血管の不足を引起こし、ゆえに血流へのプロゲステロンの分泌の不足を引起す
。このインビボモデルにおいて、生じたプロゲステロンのレベルは、約５ｎｇ／
ｍｌであり、そして、これは、ＰＭＳＧ注射の１時間後に２５〜４０ｎｇ／ｍｌ
のレベルまで誘導し得た。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）またはＦｌｔ１
Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の、２５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇ
での皮下注射は、４日目にプロゲステロン誘導の完全な阻害を引起した。この実
験の結果は、図４２Ａ〜４２Ｂに示す。
【０１５１】 （実施例３３：Ｆｌｔｌ（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）およびペグ化（ｐｅｇｙ
ｌａｔｅ）されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態分析） Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、１０ｋＤまたは２０ｋＤのいずれかのＰＥＧを
用いてペグ化し（ＰＥＧｙｌａｔｅ）、そして、ｂａｌｂ／ｃマウス中でその薬
物動態プロフィールに対して試験した。両方のペグ化形態のＦｌｔ１（１−３）
−Ｆｃが、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）よりも、非常に良好なＰＫプロ
フィールを有し、これらのペグ化分子に対して、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ
４０）の６時間と対照的に２４時間でＴmaxを伴った。
【０１５２】 （実施例３４：改変Ｆｌｔ１レセプター改変体の親和性を試験するためのＶＥ
ＧＦ１６５ ＥＬＩＳＡ） １０ｐＭのＶＥＧＦ１６５を、一晩室温で、改変Ｆｌｔ１レセプター改変体を
１６０ｐＭ〜０．１ｐＭの範囲で用いてインキュベートした。この実験に使用さ
れた改変Ｆｌｔ１レセプター改変体は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（
１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、一過性に発現されるＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．Ｆ
ｃΔＣ１（ａ）、一過性に発現されるＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＦＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔ
Ｃ１（ａ）、Ｆｌｔ１−（１−３NAS）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３R->C）−Ｆｃ
およびＴｉｅ２−Ｆｃであった。Ｆｌｔ１（１−３NAS）−Ｆｃは、高い塩基性
アミノ酸配列ＫＮＫＲＡＳＶＲＲＲがＮＡＳＶＮＧＳＲによって置換されるＦｌ
ｔ（１−３）−Ｆｃの改変バージョンであり、２つの新規なグリコシル化部位の
組み込みおよび５つの正の電荷の正味の減少を引起す（この両方は、ＰＫに対す
るこの配列の所望されない効果を減少する目的を伴う）。Ｆｌｔ１（１−３R->c ）−Ｆｃは、同じ塩基性アミノ酸配列中の単一のアルギニン（Ｒ）残基が、シス
テイン（Ｃ）に変化する改変であり（ＫＮＫＲＡＳＶＲＲＲ−＞ＫＮＫＣＡＳＶ
ＲＲＲ）、その残基のペグ化を可能にし、次いでこれは、ＰＫに対するその所望
されない効果の発揮から塩基性領域を保護し得る。インキュベーションの後、こ
の溶液を、ＶＥＧＦ１６５に対する捕獲抗体（Ｒ＆Ｄ）を含むプレートに移した
。次いで、遊離のＶＥＧＦ１６５の量を、抗体を用いて測定し、遊離のＶＥＧＦ
１６５を報告した。これは、ＶＥＧＦ１６５に対して最も高い親和性を有する改
変Ｆｌｔ１レセプター改変体（遊離のＶＥＧＦ１６５の最も少ない量として測定
される）が、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）であり、Ｆｌｔ１（
１−３）−ＦｃおよびＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）が続き、次いでＦｌ
ｔ１（１−３R->C）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３NAS）−ＦｃおよびＦｌｔ１Ｄ２
ＶＥＦＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）が続くことを示した。Ｔｉｅ２Ｆｃは、
ＶＥＧＦ１６５に対する親和性を有さない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、未改変およびアセチル化されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質
のＩＥＦゲル分析である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、その
ｐＩが９．３より大きいため、ゲルに侵入できない。一方、アセチル化Ｆｌｔ１
（１−３）−Ｆｃは、ゲルに侵入し得、そしてｐＩ５．２で平衡化する。
【図２】 図２は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングしたプレートへの、未改
変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−
Ｆｃタンパク質の結合である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、
Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）における細胞外マトリックス成分に広範に結合し
、一方、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、結合しない。
【図３】 図３は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−
Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッ
セイにおける結合である。アセチル化（カラム１３〜１６）、ペグ化（カラム１
７〜２０）、およびヘパリン処理したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム２１〜
２４）の各々は、コントロール（カラム１〜４）および無関係のタンパク質（カ
ラム５〜８）と比較して、ＶＥＧＦ結合について、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合
したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと完全に競合し得る。未改変Ｆｌｔ１（１−３）
−Ｆｃ（カラム５〜６）は、ＶＥＧＦ結合について、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結
合したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと部分的にのみ競合するようである。しかし、
この結合サンプルの０．５Ｍ ＮａＣｌでの洗浄（カラム７〜８）は、Ｆｌｔ１
（１−３）−Ｆｃの改変形態と類似の結合プロフィールを生じ、これは未改変タ
ンパク質が、塩洗浄によって除去され得るチップに対する非特異的結合を示すこ
とを示す。
【図４】 図４は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−
Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、ＥＬＩＳＡベースのアッセイ
におけるＶＥＧＦへの結合である。ペグ化およびアセチル化されたＦｌｔ１（１
−３）−Ｆｃタンパク質の両方は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの親和性に
匹敵する親和性を伴ってＶＥＧＦに結合する。
【図５】 図５は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−
Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的なプロフィールで
ある。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの未改変、アセチ
ル化、またはペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを皮下注射した。タンパク質
注射の１、２、４、６、２４時間、２日、および３日後に、このマウスの尾を出
血させ、そして血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を検出するよう設
計された標準的なＥＬＩＳＡベースのアッセイでアッセイした。全てのＦｌｔ１
（１−３）−Ｆｃタンパク質 のＴmaxは、６時間と２４時間との間の時点であ
った。異なるタンパク質のＣmaxは以下のようであった：未改変：０．０６μｇ
／ｍｌ〜０．１５μｇ／ｍｌ；アセチル化：１．５μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍ
ｌ；およびペグ化：約５μｇ／ｍｌ。
【図６】 図６Ａ〜６Ｂは、未改変および段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタン
パク質のＩＥＦゲル分析である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は
、そのｐＩが９．３より大きいために、ゲルに侵入できない。一方、大部分の段
階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃサンプル（３０〜１００倍過剰のサンプ
ル）は、ゲル中に移動し得、そしてアセチル化の程度に依存して、４．５５と８
．４３とのの範囲のｐＩで平衡化する。
【図７】 図７は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１
−３）−Ｆｃタンパク質の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングしたプ
レートへの結合である。無関係のコントロールタンパク質（ｒＴｉｅ２−Ｆｃ）
を用いる場合、段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（２０および３０倍過
剰のサンプル）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングしたプレートへのいずれの結
合も示さないが、一方、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、
有意な結合を示す。１０倍過剰のサンプルは、減少した結合を示すが、アセチル
化の程度は、細胞外マトリックス成分への結合を完全にブロックするために十分
ではない。
【図８】 図８は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１
−３）−Ｆｃの、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける結合である。準化学
量論的な比で（０．５μｇ／ｍｌの未改変Ｆｌｔ１（１−３）または段階アセチ
ル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのいずれか対０．２μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）、Ｖ
ＥＧＦに完全に結合するためのに十分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（未改変また
は段階アセチル化のいずれか）は、溶液中には存在しない。１．０μｇ／ｍｌ（
これは、約１：１の化学量論比である）において、未改変および段階アセチル化
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの両方は、ＶＥＧＦ結合についてより良く競合し得る
が、依然として利用可能なＶＥＧＦを完全に飽和するために充分なＦｌｔ１（１
−３）−Ｆｃタンパク質（未改変または段階アセチル化のいずれか）が存在しな
い。しかし、５．０μｇ／ｍｌ（これは、１：１の化学量論比よりも数倍高い）
において、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）
−Ｆｃタンパク質の両方は、アセチル化の程度にかかわらず、ＶＥＧＦを飽和し
得る。
【図９】 図９は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１
−３）−Ｆｃの薬物動態学的なプロフィールである。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３
〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの未改変または段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）
−Ｆｃの１０、２０、４０、６０および１００倍過剰なサンプルを皮下注射した
（未改変、１０、２０および４０倍過剰のサンプルについて３匹のマウス、なら
びに６０および１００倍過剰のサンプルについて２匹のマウス）。注射の１、２
、４、６、２４時間、２日および３日後に、このマウスの尾を出血させた。この
血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを検出するために設計されたＥＬＩＳＡベー
スのアッセイでアッセイした。試験したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質に
ついての全てのＴmaxは、６時間の時点であったが、Ｃmaxは以下のようであった
：未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ：０．０６μｇ／ｍｌ；１０倍過剰サンプル
：−０．７μｇ／ｍｌ、２０倍過剰サンプル−２μｇ／ｍｌ、４０倍過剰サンプ
ル−４μｇ／ｍｌ、６０倍過剰サンプル−２μｇ／ｍｌ、１００倍過剰サンプル
−１μｇ／ｍｌ。
【図１０】 図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの核酸および推定されたアミ
ノ酸配列である。
【図１１】 図１１は、Ｆｌｔ１の構造の概略図である。
【図１２】 図１２Ａおよび１２Ｂは、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２およびＩｇドメイン３の
アミノ酸配列の親水性分析である。
【図１３】 図１３Ａ〜１３Ｄは、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃの核酸および
推定されたアミノ酸配列である。
【図１４】 図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃの核酸および
推定されたアミノ酸配列である。
【図１５】 図１５Ａ〜１５Ｃは、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃの核酸および推定
されたアミノ酸配列である。
【図１６】 図１６Ａ〜１６Ｄは、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆｃの核酸および
推定されたアミノ酸配列である。
【図１７】 図１７は、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける、未改変Ｆｌｔ１（１−
３）−Ｆｃ、塩基性領域欠失変異体Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１
（１−３）R->N変異体タンパク質の結合である。準化学量論的な比で（０．２５
μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的に改変されたサンプルのＦｌｔ（
１−３）−Ｆｃ対０１．μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）、Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定
化されたＦｌｔ１（１−３）−ＦｃへのＶＥＧＦの結合をブロックするための充
分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質が存在しない。０．５μｇ／ｍｌの未
改変、アセチル化または遺伝的に改変されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク
質において、化学量論比は約１：１であり、そしてＢｉａｃｏｒｅチップへのＶ
ＥＧＦ結合をブロックする増大した能力が存在する。１．０μｇ／ｍｌの未改変
、アセチル化または遺伝的に改変されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（
これは、約１０：１の化学量論比である）において、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ
タンパク質は、ＢｉａｃｏｒｅチップへのＶＥＧＦの結合をブロックし得るが、
これらは等価ではない。未改変、アセチル化、およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−
３ΔB）−Ｆｃは、ＶＥＧＦ結合をブロックする能力において本質的に等しいが
、一方で、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆｃは、結合のブロックにおい
て幾分効率が低い。
【図１８】 図１８は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３Δ B ）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３
）変異体タンパク質のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングしたプレート
への結合である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、これらのウェ
ルに強く結合し、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃタンパク質は幾分弱く結
合し、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃタンパク質はさらにより弱く結
合し、そしてＭｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃタンパク質は、最良のプ
ロフィールを示し、他の任意の変異体タンパク質よりもより弱く結合する。Ｍｕ
ｔ４：Ｆｌｔ１（１−３R->N）−Ｆｃグリコシル化変異体タンパク質は、Ｍａｔ
ｒｉｇｅｌアッセイ上で最低限の利点のみを示す。
【図１９】 図１９は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３Δ B ）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３
）変異体タンパク質の、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおける結合である。試験
した濃度において、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１
−３ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（
２−３）変異体タンパク質は、同様にＶＥＧＦに結合する。
【図２０】 図２０は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３Δ B ）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３
）変異体タンパク質の薬物動態学的なプロフィールである。これらの試薬につい
てのＣｍａｘは以下のようであった：未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ −０．
１５μｇ／ｍｌ；４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）Ｆｃ -１．
５μｇ／ｍｌ；およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３ΔB）−Ｆｃ −０．７μｇ
／ｍｌ。
【図２１】 図２１Ａ〜２１Ｃは、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）といわ
れる改変されたＦｌｔ１レセプターのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配
列である。
【図２２】 図２２Ａ〜２２Ｃは、Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と
いわれる改変されたＦｌｔ１レセプターのヌクレオチドおよび推論されたアミノ
酸配列である。
【図２３】 図２３は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）アッセイである。このアッセイの結
果は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．Ｖ
ＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質が、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタ
ンパク質と比較して、ＥＣＭに対してかなり粘着性が低いことを実証する。
【図２４】 図２４Ａ〜２４Ｃは、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）といわれる改変さ
れたＦｌｔ１レセプターのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列である。
【図２５】 図２５Ａ〜２５Ｃは、リン酸化アッセイである。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）または一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３
．ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかの１．５モル過剰において、コントロール培地の
チャレンジと比較して、これらの３つの改変されたＦｌｔ１レセプターによるレ
セプター刺激の完全なブロックが存在する。対照的に、一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｖ
ＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ＶＥＧＦ陽性コントロールのチャレンジ
と比較して、このモル過剰では有意なブロックを示さなかった。同様の結果が図
２５Ｂにおいて見られ、改変されたＦｌｔレセプターはＶＥＧＦ１６５リガンド
の３倍モル過剰である。図２５Ｃにおいて、改変されたＦｌｔ１レセプターは、
ＶＥＧＦ１６５リガンドの６倍モル過剰であり、一過性のＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦ
Ｒ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ここで、細胞表面レセプターのＶＥＧＦ１６５
誘導刺激を部分的にブロックすることを示し得る。
【図２６】 図２６Ａ〜２６Ｂは、リン酸化アッセイである。ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激
によるチロシンリン酸化ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）のウエスタンブロットによる
検出は、細胞表面レセプターが、１および２倍モル過剰（図２６Ａ）または３お
よび４倍モル過剰（図２６Ｂ）の、一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔ
Ｃ１（ａ）、安定なＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、または一過
性のＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかでプレインキュベートした
ＶＥＧＦ１６５を有するチャレンジサンプルによってリン酸化されないことを示
す。試験された全ての改変Ｆｌｔ１レセプター濃度において、プレインキュベー
ションの間にＶＥＧＦ１６５リガンドの完全な結合があり、これは、コントロー
ル培地チャレンジと比較して、未結合ＶＥＧＦ１６５による細胞表面レセプター
の検出可能な刺激を生じない。
【図２７】 図２７は、ＭＧ／Ｒ２細胞増殖アッセイである。以下の改変Ｆｌｔレセプター
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）お
よびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ならびに陰性コント
ロールとしてＴｉｅ２−Ｆｃといわれる無関係のレセプターを、４０ｎＭ〜２０
ｐＭから滴定し、そしてこの細胞上で１時間、３７℃でインキュベートした。次
いで、規定培地中のヒト組換えＶＥＧＦ１６５を、１．５６ｎＭの濃度で全ての
ウェルに添加した。陰性コントロールレセプターＴｉｅ２−Ｆｃは、いずれの濃
度でもＶＥＧＦ１６５誘導細胞増殖をブロックしなかったが、一方、Ｆｌｔ１Ｄ
２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、０．８ｎＭの最大値の半分の用量で１
．５６ｎＭ ＶＥＧＦ１６５をブロックする。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび
Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、約２ｎＭの最大の半分
の用量を用いるこのアッセイにおけるＶＥＧＦ１６５のブロックにおいて低効率
である。ＶＥＧＦ１６５単独は、１．２の吸光度単位を読み取り、そしてバック
グラウンドは０．３８吸光度単位である。
【図２８】 図２８は、結合化学量論のＢｉａｃｏｒｅ分析である。結合化学量論は、１ｎ
ｇ／ｍｌと等価の１０００ＲＵの転換因子を使用して、固定されたＦｌｔ１Ｄ２
Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）に
対する結合したＶＥＧＦ１６５のモル比として計算された。この結果は、１つの
Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔ
Ｃ１（ａ）分子当たりの１つのＶＥＧＦ１６５ダイマー分子の結合化学量論を示
した。
【図２９】 図２９は、サイズ排除クロマトグラフィーの化学量論である。１ｎＭの濃度の
Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔ
Ｃ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１
Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤよりも１０００倍高い
と推定した）を、変化する濃度のＶＥＧＦ１６５と混合した。インキュベーショ
ンの後、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を測
定した。このデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液への
１ｎＭのＶＥＧＦ１６５の添加が、ＶＥＧＦ１６５表面へのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ
１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全にブロックすることを示す。この結果は
、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たりの１つのＶＥ
ＧＦ１６５分子の結合化学量論を示唆した。
【図３０】 図３０は、サイズ排除クロマトグラフィーの化学量論である。１ｎＭの濃度の
Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔ
Ｃ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１
Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤよりも１０００倍高い
と推定した）を、変化する濃度のＶＥＧＦ１６５と混合した。インキュベーショ
ンの後、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を測
定した。このデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液への
１ｎＭのＶＥＧＦ１６５の添加が、ＶＥＧＦ１６５表面へのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ
１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全にブロックすることを示す。この結果は
、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たりの１つのＶＥ
ＧＦ１６５分子の結合化学量論を示唆した。
【図３１】 図３１は、ネイティブ条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）で
ある。ピーク＃１はＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１
６５複合体を表し、そしてピーク＃２は未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。１．１ｍ
ｌと１．２ｍｌとの間の溶出した画分を合わせ、そしてこの複合体を解離させる
ためにグアニジウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）を添加して、４．５Ｍの最終濃度にし
た。
【図３２】 図３２は、解離条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。
レセプター−リガンド複合体の成分を分離するため、およびそのモル比を決定す
るために、５０μｌの解離複合体を、６ＭのＧｕＨＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅ
ｒｏｓｅ １２ ＰＣ ３．２／３０にロードし、そして溶出した。ピーク＃１
はＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を表し、そしてピーク＃２はＶ
ＥＧＦ１６５を表す。
【図３３】 図３３は、オンライン光散乱（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ
ｉｎｇ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ＭｉｎｉＤ
ａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔ
ａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓ
ｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えるサイズ排除クロマトグラフ
ィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定し
た。図３３に示すように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク番号
１は、レセプター−リガンド複合体を表し、そしてピーク番号２は、未結合ＶＥ
ＧＦ１６５を表す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルから算出した。同じ手順を
使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これら
の決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３
．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７３００（図３３）
であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４３９０（図３４）であり
、そしてピーク位置でのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３３００である（図３５）。
【図３４】 図３４は、オンライン光散乱（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ
ｉｎｇ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ＭｉｎｉＤ
ａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔ
ａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓ
ｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えるサイズ排除クロマトグラフ
ィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定し
た。図３３に示すように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク番号
１は、レセプター−リガンド複合体を表し、そしてピーク番号２は、未結合ＶＥ
ＧＦ１６５を表す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルから算出した。同じ手順を
使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これら
の決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３
．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７３００（図３３）
であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４３９０（図３４）であり
、そしてピーク位置でのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３３００である（図３５）。
【図３５】 図３５は、オンライン光散乱（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒ
ｉｎｇ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ＭｉｎｉＤ
ａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔ
ａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓ
ｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えるサイズ排除クロマトグラフ
ィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定し
た。図３３に示すように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク番号
１は、レセプター−リガンド複合体を表し、そしてピーク番号２は、未結合ＶＥ
ＧＦ１６５を表す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルから算出した。同じ手順を
使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これら
の決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３
．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７３００（図３３）
であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４３９０（図３４）であり
、そしてピーク位置でのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３３００である（図３５）。
【図３６】 図３６は、ペプチドマッピングおよびグリコシル化分析である。Ｆｌｔ１Ｄ２
．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のジスルフィド構造およびグリコシル化部位
を、ペプチドマッピング法により決定した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．Ｆｃ
ΔＣ１（ａ）中に合計１０のシステインが存在する；それらのうちの６つは、Ｆ
ｃ領域に属する。Ｃｙｓ２７はＣｙｓ７６とジスルフィド結合する。Ｃｙｓ１２
１は、Ｃｙｓ１８２とジスルフィド結合する。Ｆｃ領域中の始めの２つのシステ
イン（Ｃｙｓ２１１およびＣｙｓ２１４）は、別のＦｃ鎖中の同じ２つのシステ
インと分子間ジスルフィド結合を形成する。しかし、ジスルフィド結合が同じシ
ステイン間（例えば、Ｃｙｓ２１１とＣｙｓ２１１）で、またはＣｙｓ２１１と
Ｃｙｓ２１４との間で生じるか否かは、決定され得ない。Ｃｙｓ２１６は、Ｃｙ
ｓ３０６とジスルフィド結合する。Ｃｙｓ３５２は、Ｃｙｓ４１０とジスルフィ
ド結合する。 Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中に、５つの可能なＮ結合す
るグリコシル化部位が存在し、そしてそれらは種々の程度までグリコシル化され
ることが見出される。完全なグリコシル化は、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ１９３および
Ａｓｎ２８２において観察される。部分的なグリコシル化は、Ａｓｎ６５および
Ａｓｎ１２０上で観察される。グリコシル化の部位は、図において下線により強
調される。
【図３７】 図３７は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ
３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態で
ある。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４
０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を一過性に発現したＣＨ
Ｏ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を安定に発現したＣＨＯお
よびＣＨＯ一過性発現されるＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）で皮下的に注
射した。マウスを、注射の１、２、４、６、２４時間、２日、３日、６日後に尾
部出血した。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ
３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するた
めに設計されたＥＬＩＳＡにおいて、血清をアッセイした。Ｆｌｔ１（１−３）
−Ｆｃ（Ａ４０）のＴｍａｘは６時間であり、一方、一過性および安定なＦｌｔ
１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）および一過性ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−Ｆｃ
ΔＣ１（ａ）についてのＴｍａｘは２４時間であった。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆ
ｃ（Ａ４０）についてのＣｍａｘは８μｇ／ｍｌであり、両方の一過性物（Ｆｌ
ｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ
１（ａ））について、Ｃｍａｘは、１８μｇ／ｍｌであり、そして安定なＶＥＧ
ＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＣｍａｘは、３０μｇ／ｍｌであった
。
【図３８】 図３８は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ
３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ
）の薬物動態である。Ｂａｌｂ／ｃマウスを、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３
）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を一過性
に発現したＣＨＯおよびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を
一過性に発現したＣＨＯで皮下的に注射した。マウスを注射の１、２、５、６、
７、８、１２、１５および２０日後に尾部出血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３
）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦ
ｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するために設計された
ＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）は、５
日後には、もはや血清中で検出され得ないが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．Ｆ
ｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、
１５日間以上検出可能であった。
【図３９】 図３９は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のインビボでＨＴ
−１０８０線維肉腫腫瘍増殖を阻害する能力である。隔日または１週間に２回の
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）でのＳＣＩＤマウスの処置（２
５ｍｇ／Ｋｇ）は、皮下ＨＴ−１０８０線維肉腫腫瘍の増殖を有意に減少した。
【図４０】 図４０は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のインビボでＣ６
神経膠腫腫瘍増殖を阻害する能力である。隔日または１週間に２回のＦｌｔ１Ｄ
２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）でのＳＣＩＤマウスの処置は、２．５ｍｇ
／Ｋｇ程度に低い用量で、皮下Ｃ６神経膠腫腫瘍の増殖を有意に減少した。
【図４１】 図４１は、ＥＶＧＦ誘導性の子宮の透過性亢進である。思春期前の雌ラットに
おいて排卵を誘導するために皮下注射されたＰＭＳＧ（５ＩＵ）は、２日後にエ
ストラジオールのサージを生じ、これは、次に子宮においてＶＥＧＦの誘導を引
き起こした。この誘導は、子宮の透過性亢進を生じ、そして子宮の濡れを増加し
た。ＰＭＳＧ注射の１時間後における２５ｍｇ／ｋｇでのＦｌｔ１（１−３）−
Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ
１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射は、子宮の湿重量の増
加の約５０％の阻害を生じた。
【図４２】 図４２Ａ〜４２Ｂは、読み出し情報としてプロゲステロンを使用する黄体新脈
管形成の評価である。ＰＭＳＧを皮下注射（５ＩＵ）して、思春期前の雌ラット
において排卵を誘導し、これは、移植のために子宮を調製するために血流中にプ
ロゲステロンを分泌する血管の高密度なネットワークを含む、十分に機能する黄
体を生じる。黄体中の新脈管形成の誘導は、ＶＥＧＦを必要とする。得られたプ
ロゲステロンのレベルは、約５ｎｇ／ｍｌであり、そしてＰＭＳＧ後には２５〜
４０ｎｇ／ｍｌまで誘導され得る。ＰＭＳＧ注射の１時間後における２５ｍｇ／
ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）またはＦｌｔ
１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射は、４日目におけるプロゲ
ステロン誘導の完全な阻害を生じた。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 11/06 Ａ６１Ｐ 17/02 13/12 19/02 17/00 １０１ 27/02 17/02 29/00 19/02 １０１ 27/02 31/00 29/00 35/00 １０１ 43/00 １０５ 31/00 １１１ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/71 43/00 １０５ 16/00 １１１ 19/00 Ｃ０７Ｋ 14/71 Ｃ１２Ｎ 1/19 16/00 1/21 19/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 1/21 5/00 Ｂ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 37/24 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ， ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，Ｃ Ｎ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ， ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｃ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ， ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，Ｔ Ｊ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 デイビス， サミュエル アメリカ合衆国 ニューヨーク 10024， ニュー ヨーク， ダブリュー． 88テ ィーエイチ ストリート ナンバービー２ 332 (72)発明者 ヤンコパウロス， ジョージ ディー． アメリカ合衆国 ニューヨーク 10598， ヨークタウン ハイツ， バプティスト チャーチ ロード 1519 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 CA07 DA02 DA05 DA06 DA12 EA02 EA03 EA04 FA02 GA11 HA01 HA03 4B064 AG20 CA02 CA06 CA10 CA19 CC24 DA01 4B065 AA26X AA79X AA90X AA90Y AB01 BA01 CA24 CA44 4C084 AA02 AA06 AA07 BA01 BA02 BA08 BA22 BA23 CA53 CA56 CA59 DB52 NA14 ZA332 ZA362 ZA512 ZA592 ZA812 ZA892 ZA902 ZA962 ZB112 ZB152 ZB212 ZB262 ZB312 ZC022 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 BA41 CA40 DA51 EA20 FA72 FA74 GA21

Claims (37)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 ＶＥＧＦポリペプチドに結合し得る融合ポリペプチドをコー
    ドする単離された核酸分子であって、以下： （ｂ）多量体化成分をコードするヌクレオチド配列に（ａ）作動可能に連結さ
    れたＶＥＧＦレセプター成分をコードするヌクレオチド配列、 を含み、ここで、該ＶＥＧＦレセプター成分は該融合ポリペプチドの唯一のＶＥ
    ＧＦレセプター成分であり、そして、該（ａ）のヌクレオチド配列は、本質的に
    、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列
    をコードするヌクレオチド配列および第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメイ
    ンのＩｇドメイン３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列からなる、 単離された核酸分子。
  2. 【請求項２】 前記第１のＶＥＧＦレセプターがＦｌｔ１である、請求項１
    に記載の単離された核酸。
  3. 【請求項３】 前記第２のＶＥＧＦレセプターがＦｌｋ１またはＦｌｔ４で
    ある、請求項１に記載の単離された核酸。
  4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された核酸分子で
    あって、ここで前記第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン
    ２をコードするヌクレオチド配列が、前記第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ド
    メインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の上流にある、単離され
    た核酸分子。
  5. 【請求項５】 請求項１〜３のいずれか１項に記載の単離された核酸分子で
    あって、ここで前記第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン
    ２をコードするヌクレオチド配列が、前記第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ド
    メインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の下流にある、単離され
    た核酸分子。
  6. 【請求項６】 前記多量体化成分が、免疫グロブリンドメインを含む、請求
    項１〜５のいずれか１項に記載の単離された核酸分子。
  7. 【請求項７】 前記免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメイン、Ｉ
    ｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖からなる群より選択される、請求項６に記載の
    単離された核酸分子。
  8. 【請求項８】 改変Ｆｌｔ１レセプター融合ポリペプチドをコードするヌク
    レオチド配列を含む単離された核酸分子であって、ここで、該核酸分子のコード
    領域が、本質的に以下： （ａ）図２１Ａ〜２１Ｃに示されるヌクレオチド配列 （ｂ）図２２Ａ〜２２Ｃに示されるヌクレオチド配列； （ｃ）図２４Ａ〜２４Ｃに示されるヌクレオチド配列；および （ｄ）遺伝暗号の縮重の結果として、該（ａ）、（ｂ）または（ｃ）のヌクレ
    オチド配列とは異なり、かつ該改変Ｆｌｔ１レセプター融合ポリペプチドの生物
    学的活性を有する融合ポリペプチド分子をコードする、ヌクレオチド配列、 からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子。
  9. 【請求項９】 改変Ｆｌｔ１レセプター融合ポリペプチドをコードするヌク
    レオチド配列を含む単離された核酸分子であって、ここで、該核酸分子のコード
    領域が、本質的に以下： （ａ）図１３Ａ〜１３Ｄに示されるヌクレオチド配列； （ｂ）図１４Ａ〜１４Ｃに示されるヌクレオチド配列； （ｃ）図１５Ａ〜１５Ｃに示されるヌクレオチド配列； （ｄ）図１６Ａ〜１６Ｄに示されるヌクレオチド配列；および （ｅ）遺伝暗号の縮重の結果として、該（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）
    のヌクレオチド配列とは異なり、かつ該改変Ｆｌｔ１レセプター融合ポリペプチ
    ドの生物学的活性を有する融合ポリペプチド分子をコードする、ヌクレオチド配
    列、 からなる群より選択されるヌクレオチド配列からなる、単離された核酸分子。
  10. 【請求項１０】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の単離された核酸分子
    によってコードされる、融合ポリペプチド。
  11. 【請求項１１】 ＶＥＧＦレセプターリガンドＶＥＧＦに特異的に結合する
    、請求項１０に記載の融合ポリペプチド。
  12. 【請求項１２】 ＶＥＧＦ分子に結合して、請求項１０または１１に記載の
    融合ポリペプチドの多量体を含む非機能性複合体を形成し得る、組成物。
  13. 【請求項１３】 前記多量体が二量体である、請求項１２に記載の組成物。
  14. 【請求項１４】 キャリアをさらに含む薬学的組成物である、請求項１３に
    記載の組成物。
  15. 【請求項１５】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子を含む、ベ
    クター。
  16. 【請求項１６】 請求項１〜９のいずれか１項に記載の核酸分子を含む発現
    ベクターであって、ここで、該核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結され
    る、発現ベクター。
  17. 【請求項１７】 適切な宿主細胞中で、請求項１６に記載の発現ベクターを
    含む融合ポリペプチドを産生するための、宿主−ベクター系。
  18. 【請求項１８】 前記適切な宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、
    または哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の宿主−ベクター系。
  19. 【請求項１９】 前記適切な宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１７
    に記載の宿主−ベクター系。
  20. 【請求項２０】 前記適切な宿主細胞が、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞であ
    る、請求項１７に記載の宿主−ベクター系。
  21. 【請求項２１】 融合ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、請
    求項１７〜２０のいずれか１項に記載の宿主−ベクター系の細胞を、該融合ポリ
    ペプチドの産生を可能にする条件下で増殖させる工程、およびそのようにして産
    生された該融合ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
  22. 【請求項２２】 請求項２１に記載の方法によって産生される、融合ポリペ
    プチド。
  23. 【請求項２３】 図１０Ａ〜１０Ｄ、図２１Ａ〜２１Ｃ、図２２Ａ〜２２Ｃ
    、または図２４Ａ〜２４Ｃに示された核酸配列によってコードされる、アセチル
    化またはペグ化によって改変された、融合ポリペプチド。
  24. 【請求項２４】 前記改変がアセチル化であり、該アセチル化が、少なくと
    も約１００倍過剰のモル濃度のアセチル化試薬を用いて達成される、請求項２３
    に記載の融合ポリペプチド。
  25. 【請求項２５】 前記改変がアセチル化であり、該アセチル化が、少なくと
    も約１０倍過剰のモル濃度〜約１００倍過剰のモル濃度の範囲の、過剰なモル濃
    度のアセチル化試薬を用いて達成される、請求項２３に記載の融合ポリペプチド
    。
  26. 【請求項２６】 前記改変が１０Ｋ ＰＥＧまたは２０Ｋ ＰＥＧを用いる
    ペグ化である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
  27. 【請求項２７】 ＶＥＧＦポリペプチドに結合し得る融合ポリペプチドであ
    って、該融合ポリペプチドは、以下： （ｂ）多量体化成分に（ａ）作動可能に連結されるＶＥＧＦレセプター成分、
    を含み、ここで、該ＶＥＧＦレセプター成分は、該融合ポリペプチドにおいて唯
    一のＶＥＧＦレセプター成分であり、そして、本質的に、第１のＶＥＧＦレセプ
    ターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列および第２のＶＥＧＦレ
    セプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列からなる、 融合ポリペプチド。
  28. 【請求項２８】 本質的に改変Ｆｌｔ１レセプターのアミノ酸配列からなる
    融合ポリペプチドであって、ここで、該アミノ酸配列が、以下： （ａ）図２１Ａ〜２１Ｃに示されるアミノ酸配列 （ｂ）図２２Ａ〜２２Ｃに示されるアミノ酸配列；および （ｃ）図２４Ａ〜２４Ｃに示されるアミノ酸配列； からなる群より選択される、融合ポリペプチド。
  29. 【請求項２９】 改変Ｆｌｔ１レセプターのアミノ酸配列を含む融合ポリペ
    プチドであって、ここで、該アミノ酸配列が、以下： （ａ）図１３Ａ〜１３Ｄに示されるアミノ酸配列； （ｂ）図１４Ａ〜１４Ｃに示されるアミノ酸配列；および （ｃ）図１５Ａ〜１５Ｃに示されるアミノ酸配列；および （ｄ）図１６Ａ〜１５Ｄに示されるアミノ酸配列； からなる群より選択される、融合ポリペプチド。
  30. 【請求項３０】 哺乳動物における血漿漏出を減少または阻害する方法にお
    ける使用のための医薬の製造における、請求項１０、１１もしくは２２〜２９の
    いずれか１項に記載の哺乳動物融合ポリペプチド、または請求項１２、１３もし
    くは１４に記載の組成物の使用。
  31. 【請求項３１】 前記哺乳動物がヒトである、請求項３０に記載の使用。
  32. 【請求項３２】 ヒトにおける血管増殖をブロックする方法に使用するため
    の医薬の製造における、請求項１０、１１もしくは２２〜２９のいずれか１項に
    記載の融合ポリペプチド、または請求項１２、１３もしくは１４に記載の組成物
    の使用。
  33. 【請求項３３】 哺乳動物におけるＶＥＧＦレセプターリガンド活性を阻害
    する方法における使用のための医薬の製造における、請求項１０、１１もしくは
    ２２〜２９のいずれか１項に記載の融合ポリペプチド、または請求項１２、１３
    もしくは１４に記載の組成物の使用。
  34. 【請求項３４】 前記哺乳動物がヒトである、請求項３３に記載の使用。
  35. 【請求項３５】 ヒトにおいて、腫瘍増殖を減弱もしくは予防するため、水
    腫を減弱もしくは予防するため、または腹水形成を減弱もしくは予防するための
    、請求項３４に記載の使用。
  36. 【請求項３６】 前記水腫が、脳水腫である、請求項３５に記載の使用。
  37. 【請求項３７】 前記腹水が、卵巣癌関連腹水である、請求項３５に記載の
    使用。
JP2001502582A 1999-06-08 2000-05-23 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド Expired - Lifetime JP4723140B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13813399P 1999-06-08 1999-06-08
US60/138,133 1999-06-08
PCT/US2000/014142 WO2000075319A1 (en) 1999-06-08 2000-05-23 Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010226970A Division JP5273746B2 (ja) 1999-06-08 2010-10-06 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2003501089A true JP2003501089A (ja) 2003-01-14
JP2003501089A5 JP2003501089A5 (ja) 2011-04-28
JP4723140B2 JP4723140B2 (ja) 2011-07-13

Family

ID=22480568

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2001502582A Expired - Lifetime JP4723140B2 (ja) 1999-06-08 2000-05-23 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド
JP2010226970A Expired - Lifetime JP5273746B2 (ja) 1999-06-08 2010-10-06 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2010226970A Expired - Lifetime JP5273746B2 (ja) 1999-06-08 2010-10-06 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド

Country Status (33)

Country Link
EP (2) EP1544299B1 (ja)
JP (2) JP4723140B2 (ja)
KR (1) KR100659477B1 (ja)
CN (3) CN101433715B (ja)
AT (2) ATE417928T1 (ja)
AU (2) AU779303B2 (ja)
BE (1) BE2013C029I2 (ja)
BR (2) BRPI0011407B8 (ja)
CA (1) CA2376379C (ja)
CY (2) CY1108883T1 (ja)
CZ (2) CZ303656B6 (ja)
DE (2) DE60019415T2 (ja)
DK (2) DK1544299T3 (ja)
ES (2) ES2319305T3 (ja)
FR (1) FR13C0028I2 (ja)
HK (3) HK1043388A1 (ja)
HR (1) HRP20010908B1 (ja)
HU (3) HU230159B1 (ja)
IL (3) IL146890A0 (ja)
LT (1) LTC1183353I2 (ja)
LU (1) LU92195I2 (ja)
ME (2) ME00024B (ja)
MX (1) MXPA01012630A (ja)
NO (3) NO330775B1 (ja)
NZ (1) NZ515913A (ja)
PL (1) PL208247B1 (ja)
PT (2) PT1183353E (ja)
RS (1) RS50073B (ja)
RU (1) RU2265661C2 (ja)
SK (1) SK287332B6 (ja)
UA (1) UA74146C2 (ja)
WO (1) WO2000075319A1 (ja)
ZA (1) ZA200110068B (ja)

Cited By (19)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2006521397A (ja) * 2003-03-28 2006-09-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ媒介性活性を遮断することにより糖尿病を処置する方法
JP2006527198A (ja) * 2003-06-06 2006-11-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆインヒビターを用いる腫瘍退縮方法
JP2007500131A (ja) * 2003-07-25 2007-01-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆアンタゴニストおよび抗増殖性薬剤の組成物ならびに癌の処置のためのその使用
JP2007501239A (ja) * 2003-08-06 2007-01-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 放射線治療と組み合わせたｖｅｇｆアンタゴニストの使用
JP2007528708A (ja) * 2003-06-30 2007-10-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆトラップおよびその治療的使用
JP2008503481A (ja) * 2004-06-18 2008-02-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 悪性胸膜滲出液の処置のためのｖｅｇｆインヒビターの投与および使用の方法
JP2008508318A (ja) * 2004-07-30 2008-03-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ媒介性活性をブロックすることによるｉ型糖尿病を処置する方法
JP2008521866A (ja) * 2004-12-03 2008-06-26 アバンテイス・フアルマ・エス・アー Ｖｅｇｆ阻害剤および５ｆｕまたはこの誘導体の１つを含有する抗腫瘍組合せ物
JP2010532335A (ja) * 2007-07-05 2010-10-07 アバンテイス・フアルマ・エス・アー Ｖｅｇｆ阻害剤とイリノテカンとを含有する抗腫瘍性の組み合わせ
JP2012067116A (ja) * 2004-06-10 2012-04-05 Regeneron Pharmaceuticals Inc ヒトの癌を処置するための、ｖｅｇｆインヒビターの使用
WO2012093704A1 (ja) * 2011-01-07 2012-07-12 中外製薬株式会社 抗体の物性を改善させる方法
JP2012520661A (ja) * 2009-03-18 2012-09-10 嘉和生物▲薬▼▲業▼有限公司 抗血管新生融合タンパク質
JP2016036322A (ja) * 2014-08-11 2016-03-22 日本化薬株式会社 血管新生因子と結合するキメラタンパク質
JP2018530344A (ja) * 2015-10-15 2018-10-18 アルテオジェン・インコーポレイテッド ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の生産方法
US10501523B2 (en) 2014-07-18 2019-12-10 Sanofi IL-8 level based method of predicting the outcome of colon cancer treatment
JP2021503914A (ja) * 2017-11-27 2021-02-15 ４ディー モレキュラー セラピューティクス インコーポレイテッド アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用
JP2021506566A (ja) * 2017-12-13 2021-02-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． クロマトグラフィーカラム床支持体の管理のための装置及びシステム、ならびに関連する方法
US11033606B2 (en) 2011-04-26 2021-06-15 Sanofi Composition comprising aflibercept, folinic acid, 5-fluorouracil (5-FU) and irinotecan (FOLFIRI)
JP2022552052A (ja) * 2019-12-06 2022-12-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆタンパク質組成物及びその製造方法

Families Citing this family (79)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US7396664B2 (en) 1999-06-08 2008-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
US6833349B2 (en) * 1999-06-08 2004-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating inflammatory skin diseases
JP4669984B2 (ja) 2001-01-19 2011-04-13 ベジェニクス リミテッド 腫瘍画像化のターゲットとしてのＦ１ｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）および抗腫瘍療法
US6734017B2 (en) 2001-09-28 2004-05-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression
WO2004108069A2 (en) 2002-05-04 2004-12-16 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth
ES2616749T3 (es) 2003-05-16 2017-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Mutantes degradantes del proteoglucano para el tratamiento del SNC
US7959914B2 (en) 2003-05-16 2011-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of reducing extravasation of inflammatory cells
ES2831031T3 (es) * 2003-05-16 2021-06-07 Acorda Therapeutics Inc Proteínas de fusión para el tratamiento del CNS
WO2004106378A2 (en) * 2003-05-28 2004-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating corneal transplant rejection by using vegf antagonists
US7186699B2 (en) 2003-06-03 2007-03-06 Cell Genesys, Inc. Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes
US7399612B2 (en) 2003-06-30 2008-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
CA2566731C (en) 2004-05-18 2012-07-24 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of purifying chondroitinase and stable formulations thereof
CA2569108C (en) 2004-06-08 2012-08-21 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co. Ltd Angiogenesis-inhibiting chimeric protein and the use
PL2229956T3 (pl) 2004-09-13 2013-09-30 Genzyme Corp Konstrukty multimeryczne
US7303748B2 (en) 2005-02-02 2007-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating eye injury with local administration of a VEGF inhibitor
WO2006104852A2 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations
JP5189985B2 (ja) 2005-09-26 2013-04-24 アコーダ セラピューティクス、インク． コンドロイチナーゼａｂｃｉ変異体を用いた組成物およびその使用方法
PT1962895E (pt) † 2005-12-16 2013-03-28 Regeneron Pharma Utilização terapêutica de um antagonista dll4 e de um inibidor fcev para inibição de crescimento de tumores
FR2895258B1 (fr) 2005-12-22 2008-03-21 Aventis Pharma Sa Combinaison comprenant de la combretastatine et des agents anticancereux
CN100502945C (zh) * 2006-03-31 2009-06-24 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用
US8216575B2 (en) 2006-03-31 2012-07-10 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains
MX2008016124A (es) 2006-06-16 2009-01-20 Regeneron Pharma Formulaciones antagonistas de vegf adecuadas para la administracion intravitreal.
MX2009003229A (es) 2006-09-29 2009-06-18 Oncomed Pharm Inc Composiciones y metodos para diagnosticar y tratar cancer.
EP2450442B1 (en) 2006-10-10 2017-07-19 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants
CN101575379B (zh) * 2008-05-09 2012-05-30 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途
ES2836948T3 (es) 2008-11-03 2021-06-28 Molecular Partners Ag Proteínas de unión que inhiben la interacción del receptor de VEGF-A
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
AR081361A1 (es) * 2010-04-30 2012-08-29 Molecular Partners Ag Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a
EP3327032A1 (en) 2010-08-06 2018-05-30 Genzyme Corporation Vegf antagonist compositions and uses thereof
KR20190049934A (ko) 2011-01-13 2019-05-09 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 혈관신생 눈 장애를 치료하기 위한 vegf 길항제의 용도
KR101397088B1 (ko) 2011-06-10 2014-05-19 강원대학교산학협력단 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물
JO3370B1 (ar) * 2011-11-10 2019-03-13 Regeneron Pharma طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6
ES2651521T3 (es) * 2011-12-01 2018-01-26 Innovent Biologics, Inc. Inhibidores proteicos de las rutas del complemento y de VEGF y métodos de uso de los mismos
CN103304668B (zh) * 2012-03-12 2015-10-28 江苏健德生物药业有限公司 Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制备方法及其应用
DK2846836T3 (da) 2012-05-07 2019-11-11 Allergan Inc Fremgangsmåde til behandling af amd hos patienter, der er refraktære overfor anti-vegf-terapi
WO2014006113A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sanofi Method of treating cancer by effective amounts of aflibercept
AR093445A1 (es) 2012-11-14 2015-06-10 Regeneron Pharma Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4
CA2901226C (en) 2013-02-18 2020-11-17 Vegenics Pty Limited Vascular endothelial growth factor binding proteins
AR095196A1 (es) * 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
CN104193828B (zh) * 2013-09-12 2017-04-05 北京韩美药品有限公司 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白
EP3065761B1 (en) 2013-11-05 2020-01-08 Allergan, Inc. Method of treating conditions of the eye with an anti-vegf darpin
EP3143044A1 (en) 2014-05-12 2017-03-22 Formycon AG Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist
SI3230316T1 (sl) 2014-12-11 2022-05-31 Bayer Healthcare Llc Zdravljenje starostne degeneracije makule z majhno aktivno horoidalno neovaskularizacijsko lezijo
GB201503453D0 (en) 2015-03-01 2015-04-15 Jain Arjun Endothelin-1"sponge"
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
WO2017046140A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia
WO2017065559A1 (ko) 2015-10-15 2017-04-20 (주)알테오젠 Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
US20180326126A1 (en) 2015-11-18 2018-11-15 Formycon Ag Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist
KR102354198B1 (ko) 2015-11-18 2022-01-20 에스아이오2 메디컬 프로덕츠, 인크. Vegf-길항제의 액체 제제를 포함하는 사전-충전된 제약 패키지
US11654046B2 (en) 2015-11-18 2023-05-23 Sio2 Medical Products, Inc. Pharmaceutical package for ophthalmic formulations
CA3005391A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 Zhuhai Tairuishang Biopharm Ltd. Methods and compositions for binding vegf
LT3384049T (lt) 2015-12-03 2023-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetinių variacijų susiejimo su klinikiniais rezultatais būdai pacientams, sergantiems amžine geltonosios dėmės degeneracija, gydytiems anti-vegf
JP6953433B2 (ja) 2016-01-26 2021-10-27 フォーマイコン アーゲーＦｏｒｍｙｃｏｎ Ａｇ Ｖｅｇｆアンタゴニストを含む液体医薬組成物および同医薬組成物を含有する充填済みシリンジ
JPWO2018070390A1 (ja) 2016-10-12 2019-08-22 第一三共株式会社 抗ｒｏｂｏ４抗体と他剤を含む組成物
WO2018094316A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Just Biotherapeutics, Inc. Aflibercept formulations and uses thereof
EP3630062A2 (en) 2017-05-24 2020-04-08 SiO2 Medical Products, Inc. Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations
EP3630043A1 (en) 2017-05-24 2020-04-08 Formycon AG Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
WO2018215580A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist
TW201904610A (zh) 2017-06-14 2019-02-01 德商拜耳製藥公司 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑
WO2019020777A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Formycon Ag LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST
CA3067735A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Just Biotherapeutics, Inc. Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants
JP7183268B2 (ja) 2017-11-20 2022-12-05 ジャスト－エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド 等張化剤としてリジン塩を含有するアフリベルセプト製剤及びその使用
JP7339248B2 (ja) 2017-11-30 2023-09-05 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 血管形成眼障害を処置するためのｖｅｇｆアンタゴニストの使用
CN116059318A (zh) 2018-01-26 2023-05-05 加利福尼亚大学董事会 用于使用抗vegf剂治疗血管生成病症的方法和组合物
AU2019265005A1 (en) 2018-05-10 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High concentration vegf receptor fusion protein containing formulations
US11519020B2 (en) 2018-05-25 2022-12-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF
CN111378044B (zh) 2018-12-28 2022-07-15 长春金赛药业有限责任公司 抗体融合蛋白、制备方法及其应用
US20220204920A1 (en) 2019-05-16 2022-06-30 Formycon Ag Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins
CA3150481A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Amgen Inc. Injection device for drug delivery and packaging for the injection device
US20210077645A1 (en) 2019-09-16 2021-03-18 Amgen Inc. Method for external sterilization of drug delivery device
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2021108255A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 The Regents Of The University Of California Long-acting vegf inhibitors for intraocular neovascularization
JP2023505216A (ja) 2019-12-06 2023-02-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆミニトラップおよびそれらの使用方法
JP2023514325A (ja) 2020-02-24 2023-04-05 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの外部滅菌中に使用するための容器及びシステム
EP4145456A1 (en) 2021-09-06 2023-03-08 Bayer AG Prediction of a change related to a macular fluid
WO2024029876A1 (ko) * 2022-08-02 2024-02-08 주식회사 파노로스바이오사이언스 변형된 융합 단백질 및 이의 용도

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000502357A (ja) * 1996-05-07 2000-02-29 ジェネンテク・インコーポレイテッド 血管内皮増殖因子活性の新規阻害剤、それらの使用法および製造法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9506466D0 (en) * 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2000502357A (ja) * 1996-05-07 2000-02-29 ジェネンテク・インコーポレイテッド 血管内皮増殖因子活性の新規阻害剤、それらの使用法および製造法

Cited By (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4730909B2 (ja) * 2003-03-28 2011-07-20 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ媒介性活性を遮断することにより糖尿病を処置する方法
JP2006521397A (ja) * 2003-03-28 2006-09-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ媒介性活性を遮断することにより糖尿病を処置する方法
JP2006527198A (ja) * 2003-06-06 2006-11-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆインヒビターを用いる腫瘍退縮方法
JP2007528708A (ja) * 2003-06-30 2007-10-18 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆトラップおよびその治療的使用
JP2007500131A (ja) * 2003-07-25 2007-01-11 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆアンタゴニストおよび抗増殖性薬剤の組成物ならびに癌の処置のためのその使用
JP2007501239A (ja) * 2003-08-06 2007-01-25 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 放射線治療と組み合わせたｖｅｇｆアンタゴニストの使用
JP2012067116A (ja) * 2004-06-10 2012-04-05 Regeneron Pharmaceuticals Inc ヒトの癌を処置するための、ｖｅｇｆインヒビターの使用
JP2008503481A (ja) * 2004-06-18 2008-02-07 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 悪性胸膜滲出液の処置のためのｖｅｇｆインヒビターの投与および使用の方法
JP2008508318A (ja) * 2004-07-30 2008-03-21 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ媒介性活性をブロックすることによるｉ型糖尿病を処置する方法
JP4807802B2 (ja) * 2004-07-30 2011-11-02 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆ媒介性活性をブロックすることによるｉ型糖尿病を処置する方法
JP2008521866A (ja) * 2004-12-03 2008-06-26 アバンテイス・フアルマ・エス・アー Ｖｅｇｆ阻害剤および５ｆｕまたはこの誘導体の１つを含有する抗腫瘍組合せ物
JP2010532335A (ja) * 2007-07-05 2010-10-07 アバンテイス・フアルマ・エス・アー Ｖｅｇｆ阻害剤とイリノテカンとを含有する抗腫瘍性の組み合わせ
JP2014240422A (ja) * 2007-07-05 2014-12-25 アバンテイス・フアルマ・エス・アー Ｖｅｇｆ阻害剤とイリノテカンとを含有する抗腫瘍性の組み合わせ
US8926972B2 (en) 2009-03-18 2015-01-06 Genor Biopharma Co. Ltd Anti-angiogenesis fusion proteins
JP2012520661A (ja) * 2009-03-18 2012-09-10 嘉和生物▲薬▼▲業▼有限公司 抗血管新生融合タンパク質
WO2012093704A1 (ja) * 2011-01-07 2012-07-12 中外製薬株式会社 抗体の物性を改善させる方法
JPWO2012093704A1 (ja) * 2011-01-07 2014-06-09 中外製薬株式会社 抗体の物性を改善させる方法
JP6043629B2 (ja) * 2011-01-07 2016-12-14 中外製薬株式会社 抗体の物性を改善させる方法
JP2017071595A (ja) * 2011-01-07 2017-04-13 中外製薬株式会社 抗体の物性を改善させる方法
US11033606B2 (en) 2011-04-26 2021-06-15 Sanofi Composition comprising aflibercept, folinic acid, 5-fluorouracil (5-FU) and irinotecan (FOLFIRI)
US11208461B2 (en) 2014-07-18 2021-12-28 Sanofi Method for predicting the outcome of a treatment with aflibercept of a patient suspected to suffer from a cancer
US10501523B2 (en) 2014-07-18 2019-12-10 Sanofi IL-8 level based method of predicting the outcome of colon cancer treatment
JP2016036322A (ja) * 2014-08-11 2016-03-22 日本化薬株式会社 血管新生因子と結合するキメラタンパク質
JP2020114266A (ja) * 2015-10-15 2020-07-30 アルテオジェン・インコーポレイテッド ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の生産方法
JP2018530344A (ja) * 2015-10-15 2018-10-18 アルテオジェン・インコーポレイテッド ＩｇＧ Ｆｃドメインを有する融合タンパク質の生産方法
US11414476B2 (en) 2015-10-15 2022-08-16 Alteogen, Inc. Method for producing fusion protein having IgG Fc domain
JP2021503914A (ja) * 2017-11-27 2021-02-15 ４ディー モレキュラー セラピューティクス インコーポレイテッド アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用
JP7184894B2 (ja) 2017-11-27 2022-12-06 ４ディー モレキュラー セラピューティクス インコーポレイテッド アデノ随伴ウイルス変異キャプシドおよび血管新生の阻害のための使用
JP2021506566A (ja) * 2017-12-13 2021-02-22 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッドＲｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ， Ｉｎｃ． クロマトグラフィーカラム床支持体の管理のための装置及びシステム、ならびに関連する方法
JP7171724B2 (ja) 2017-12-13 2022-11-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド クロマトグラフィーカラム床支持体の管理のための装置及びシステム、ならびに関連する方法
JP7450005B2 (ja) 2017-12-13 2024-03-14 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド クロマトグラフィーカラム床支持体を特定のクロマトグラフィー操作の専用にする方法
JP2022552052A (ja) * 2019-12-06 2022-12-15 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 抗ｖｅｇｆタンパク質組成物及びその製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0201515A3 (en) 2004-12-28
EP1183353B1 (en) 2005-04-13
EP1544299A1 (en) 2005-06-22
HUP0201515A2 (en) 2002-08-28
CN103349781B (zh) 2015-04-01
HK1185798A1 (en) 2014-02-28
CA2376379C (en) 2007-08-07
NO2013010I1 (no) 2013-06-17
IL190234A0 (en) 2008-11-03
DK1544299T3 (da) 2009-03-23
CN101433715A (zh) 2009-05-20
NO330775B1 (no) 2011-07-11
DE60019415D1 (de) 2005-05-19
BRPI0011407B1 (pt) 2018-09-25
BR0011407A (pt) 2002-04-02
RS50073B (sr) 2009-01-22
HU230159B1 (hu) 2015-09-28
FR13C0028I1 (fr) 2013-06-14
HRP20010908B1 (en) 2006-05-31
RU2265661C2 (ru) 2005-12-10
HRP20010908A2 (en) 2005-04-30
HK1132653A1 (en) 2010-03-05
AU2005201365B2 (en) 2007-08-09
AU779303B2 (en) 2005-01-13
KR20020019070A (ko) 2002-03-09
CZ20014387A3 (cs) 2002-10-16
CY1108883T1 (el) 2014-07-02
NO20100656L (no) 2002-02-08
NO332559B1 (no) 2012-10-29
IL146890A (en) 2008-07-08
NO20016036L (no) 2002-02-08
EP1183353A1 (en) 2002-03-06
JP4723140B2 (ja) 2011-07-13
DE60041159D1 (de) 2009-01-29
NO2013010I2 (no) 2013-05-15
ATE417928T1 (de) 2009-01-15
AU5040400A (en) 2000-12-28
DK1183353T3 (da) 2005-08-08
JP2011024595A (ja) 2011-02-10
CY2013019I1 (el) 2015-11-04
CN101433715B (zh) 2013-04-17
ZA200110068B (en) 2002-12-06
LTPA2013009I1 (lt) 2013-06-25
LTC1183353I2 (lt) 2023-02-27
PL352246A1 (en) 2003-08-11
PT1183353E (pt) 2005-06-30
WO2000075319A1 (en) 2000-12-14
ES2319305T3 (es) 2009-05-06
MEP3208A (xx) 2010-02-10
DE60019415T2 (de) 2006-03-09
CZ302689B6 (cs) 2011-09-07
CY2013019I2 (el) 2015-11-04
UA74146C2 (uk) 2005-11-15
IL146890A0 (en) 2002-08-14
AU2005201365A1 (en) 2005-04-28
CN1369009A (zh) 2002-09-11
HK1043388A1 (en) 2002-09-13
SK17522001A3 (sk) 2003-04-01
PT1544299E (pt) 2009-03-18
MXPA01012630A (es) 2002-07-22
ATE293164T1 (de) 2005-04-15
PL208247B1 (pl) 2011-04-29
EP1544299B1 (en) 2008-12-17
CN100523187C (zh) 2009-08-05
SK287332B6 (sk) 2010-07-07
NO20016036D0 (no) 2001-12-10
NZ515913A (en) 2004-01-30
CN103349781A (zh) 2013-10-16
ME00024B (me) 2010-02-10
JP5273746B2 (ja) 2013-08-28
FR13C0028I2 (fr) 2014-05-16
CZ303656B6 (cs) 2013-01-30
HUS1300052I1 (hu) 2016-08-29
BE2013C029I2 (ja) 2019-03-06
LU92195I2 (fr) 2013-07-15
HU229156B1 (en) 2013-09-30
YU86901A (sh) 2004-05-12
BRPI0011407B8 (pt) 2021-05-25
KR100659477B1 (ko) 2006-12-20
ES2237429T3 (es) 2005-08-01
CA2376379A1 (en) 2000-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10392430B2 (en) Methods of making nucleic acid molecules encoding modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
JP5273746B2 (ja) 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド
CA2588221C (en) Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20070328

RD02 Notification of acceptance of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7422

Effective date: 20070328

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070404

RD04 Notification of resignation of power of attorney

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A7424

Effective date: 20070404

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100407

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100706

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100713

A524 Written submission of copy of amendment under article 19 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20101005

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101006

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20101206

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110304

A524 Written submission of copy of amendment under article 19 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A524

Effective date: 20110304

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110330

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20110407

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140415

Year of fee payment: 3

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 4723140

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

R153 Grant of patent term extension

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R153

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R153 Grant of patent term extension

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R153

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R153 Grant of patent term extension

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R153

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R153 Grant of patent term extension

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R153

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R153 Grant of patent term extension

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R153

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R153 Grant of patent term extension

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R153

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250