定義
別途定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学用語および技術用語は、この技術が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるものと同じ意味を有する。
アデノ随伴ウイルスは、エンベロープを有しない20面体キャプシド内の4.7kbの一本鎖DNAゲノムからなる非病原性パルボウイルスである。このゲノムは、複製およびパッケージングシグナルのウイルス起源として機能する逆位末端反復配列(ITR)に隣接する3つの翻訳領域(ORF)を含む。rep ORFは、ウイルス複製、転写調節、部位特異的組み込み、およびビリオン組み立てにおいて役割を果たす4つの非構造タンパク質をコードする。cap ORFは、60量体のウイルスキャプシドを形成するように組み立てられる3つの構造タンパク質(VP1~3)をコードする。最後に、cap遺伝子内の代替読み枠として存在するORFは、AAVキャプシドタンパク質を核小体に局在させ、キャプシド組み立てプロセスにおいて機能するウイルスタンパク質である、組み立て活性化タンパク質(AAP)を産生する。
いくつかの天然に存在する(「野生型」)血清型、および100個以上のAAVの既知の変異体が存在し、その各々が、特にキャプシドタンパク質の超可変領域内のアミノ酸配列、したがってその遺伝子送達特性において異なる。AAVはいずれのヒト疾患にも関連していないため、組換えAAVは臨床用途にとって魅力的である。
本明細書の開示の目的のために、「AAV」という用語は、アデノ随伴ウイルスの略称であり、ウイルス自体およびその誘導体を含むが、これらに限定されない。別途示されない限り、この用語は、全てのサブタイプまたは血清型ならびに複製可能形態および組換え形態の両方を指す。「AAV」という用語には、1型AAV(AAV-1またはAAV1)、2型AAV(AAV-2またはAAV2)、3A型AAV(AAV-3AまたはAAV3A)、3B型AAV(AAV-3BまたはAAV3B)、4型AAV(AAV-4またはAAV4)、5型AAV(AAV-5またはAAV5)、6型AAV(AAV-6またはAAV6)、7型AAV(AAV-7またはAAV7)、8型AAV(AAV-8またはAAV8)、9型AAV(AAV-9またはAAV9)、10型AAV(AAV-10またはAAV10またはAAVrh10)、トリAAV、ウシAAV、イヌAAV、ヤギAAV、ウマAAV、霊長類AAV、非霊長類AAV、およびヒツジAAVが含まれるが、これらに限定されない。「霊長類AAV」は霊長類に感染するAAVを指し、「非霊長類AAV」は非霊長類哺乳動物に感染するAAVを指し、「ウシAAV」はウシ哺乳動物に感染するAAVを指す。
AAVの様々な血清型のゲノム配列、ならびに天然末端反復配列(TR)、Repタンパク質、およびキャプシドサブユニットの配列は、当該技術分野で既知である。そのような配列は、文献またはGenBankなどの公開データベースに見出すことができる。例えば、GenBank受託番号NC_002077.1(AAV1)、AF063497.1(AAV1)、NC_001401.2(AAV2)、AF043303.1(AAV2)、J01901.1(AAV2)、U48704.1(AAV3A)、NC_001729.1(AAV3A)、AF028705.1(AAV3B)、NC_001829.1(AAV4)、U89790.1(AAV4)、NC_006152.1(AA5)、AF085716.1(AAV-5)、AF028704.1(AAV6)、NC_006260.1(AAV7)、AF513851.1(AAV7)、AF513852.1(AAV8)NC_006261.1(AAV-8)、AY530579.1(AAV9)、AAT46337(AAV10)、およびAAO88208(AAVrh10)を参照されたい。これらの開示は、AAV核酸およびアミノ酸配列の教示について、参照により本明細書に組み込まれる。また、例えば、Srivistava et al.(1983)J.Virology45:555、Chiorini et al.(1998)J.Virology71:6823、Chiorini et al.(1999)J.Virology73:1309;Bantel-Schaal et al.(1999)J.Virology 73:939;Xiao et al.(1999)J.Virology 73:3994;Muramatsu et al.(1996)Virology 221:208;Shade et. al.(1986)J.Virol.58:921、Gao et al.(2002)Proc.Nat.Acad.Sci.USA99:11854、Moris et al.(2004)Virology33:375-383、国際特許公開第WO00/28061号、同第WO99/61601号、同第WO98/11244号、および米国特許第6,156,303号を参照されたい。
AAV血清型に関連する天然に存在するcap(キャプシド)タンパク質の配列は、当該技術分野で既知であり、AAV1(配列番号1)、AAV2(配列番号2)、AAV3A(配列番号3)、AAV3B(配列番号4)、AAV4(配列番号5)、AAV5(配列番号6)、AAV6(配列番号7)、AAV7(配列番号8)、AAV8(配列番号9)、AAV9(配列番号10)、AAV10(配列番号11)、およびAAVrh10(配列番号12)として本明細書に開示されるものを含む。「変異AAVキャプシドタンパク質」または「AAV変異体」という用語は、天然に存在するまたは「野生型」AAVキャプシドタンパク質配列、例えば、本明細書において配列番号1~12に示されるものに対して、少なくとも1つの修飾または置換(欠失、挿入、点変異などを含む)を含むアミノ酸配列を含む、AAVキャプシドタンパク質を指す。変異AAVキャプシドタンパク質は、野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して約80%の同一性、例えば、野生型キャプシドタンパク質のアミノ酸配列に対して85%以上の同一性、90%以上の同一性、または95%以上の同一性、例えば、野生型キャプシドタンパク質に対して98%または99%の同一性を有し得る。変異AAVキャプシドタンパク質は、野生型キャプシドタンパク質ではない場合がある。
本明細書の開示の目的のために、「AAVビリオン」または「AAVウイルス粒子」は、少なくとも1つのAAVキャプシドタンパク質およびキャプシド形成したAAVポリヌクレオチドからなる、ウイルス粒子を指す。
本明細書の開示の目的のために、「rAAV」という用語は、組換えアデノ随伴ウイルスを指す略称である。ポリヌクレオチドに適用される「組換え」は、ポリヌクレオチドが、クローニング、制限、またはライゲーションステップ、および天然に見出されるポリヌクレオチドとは異なる構築物をもたらす他の手順の様々な組み合わせの産物であることを意味する。組換えウイルスは、組換えポリヌクレオチドを含むウイルス粒子である。これらの用語は、それぞれ、元のポリヌクレオチド構築物の複製物および元のウイルス構築物の子孫を含む。
「rAAVベクター」という用語は、定義上rAAVポリヌクレオチドを含むrAAVビリオン(すなわち、rAAVウイルス粒子)(例えば、感染性rAAVビリオン)を包含し、また、rAAVをコードするポリヌクレオチド(例えば、rAAVをコードする一本鎖ポリヌクレオチド(ss-rAAV)、rAAVをコードする二本鎖ポリヌクレオチド(ds-rAAV)、例えばrAAVをコードするプラスミドなど)も包含する。
AAVビリオンは、異種ポリヌクレオチド(すなわち、野生型AAVゲノム以外のポリヌクレオチド、例えば、標的細胞に送達される導入遺伝子、標的細胞に送達されるRNAi剤またはCRISPR剤など)を含む場合、典型的には、「組換えAAV(rAAV)ビリオン」または「rAAVウイルス粒子」と称される。一般に、異種ポリヌクレオチドは、少なくとも1つ、一般には2つのAAV末端逆位反復配列(ITR)に隣接している。
「パッケージング」という用語は、AAV粒子の組み立ておよびキャプシド形成をもたらす一連の細胞内事象を指す。AAV「rep」および「cap」遺伝子は、アデノ随伴ウイルスの複製およびキャプシド形成タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列を指す。AAV repおよびcapは、本明細書ではAAV「パッケージング遺伝子」と称される。
AAVに関する「ヘルパーウイルス」という用語は、AAV(例えば、野生型AAV)の哺乳動物細胞による複製およびパッケージングを可能にするウイルスを指す。アデノウイルス、ヘルペスウイルス、およびポックスウイルス(ワクシニアなど)を含む、AAVに関するそのような多様なヘルパーウイルスが、当該技術分野で既知である。サブグループCのアデノウイルス5型が最も一般的に使用されるが、アデノウイルスはいくつかの異なるサブグループを包含する。ヒト、非ヒト哺乳動物、およびトリ由来の多数のアデノウイルスが知られており、ATCCなどの預託機関から入手可能である。ヘルペスファミリーのウイルスには、例えば、単純ヘルペスウイルス(HSV)およびエプスタイン・バーウイルス(EBV)、ならびにサイトメガロウイルス(CMV)および仮性狂犬病ウイルス(PRV)が含まれ、これらもATCCなどの預託機関から入手可能である。
「ヘルパーウイルス機能(複数可)」という用語は、(本明細書に記載の複製およびパッケージングのための他の要件と併せて)AAVの複製およびパッケージングを可能にする、ヘルパーウイルスゲノムにコードされた機能(複数可)を指す。本明細書に記載されるように、「ヘルパーウイルス機能」は、トランスの産生細胞に、ヘルパーウイルスを提供すること、または例えば、必要な機能(複数可)をコードするポリヌクレオチド配列を提供することを含む、いくつかの方法で提供され得る。例えば、1つ以上のアデノウイルスタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドまたは他の発現ベクターを、rAAVベクターとともに産生細胞にトランスフェクトする。
「感染性」ウイルスまたはウイルス粒子という用語は、コンピテントに組み立てられたキャプシドを含み、かつそのウイルス種が向性である細胞にポリヌクレオチド構成成分を送達することができるものである。この用語は、ウイルスの任意の複製能力を必ずしも意味するものではない。感染性ウイルス粒子を計数するためのアッセイは、本開示の他箇所および当該技術分野において説明されている。ウイルス感染性は、感染性ウイルス粒子対全ウイルス粒子の比として表すことができる。感染性ウイルス粒子対全ウイルス粒子の比を決定する方法は、当該技術分野で既知である。例えば、Grainger et al.(2005)Mol.Ther.11:S337(TCID50感染性価アッセイを説明する)、およびZolotukhin et al.(1999)Gene Ther.6:973を参照されたい。実施例も参照されたい。
本明細書で使用される場合、「向性」という用語は、特定の宿主種の細胞または宿主種内の特定の細胞型のウイルス(例えば、AAV)による優先的な標的化を指す。例えば、心臓、肺、肝臓、および筋肉の細胞に感染することができるウイルスは、肺細胞および筋肉細胞のみに感染することができるウイルスと比較して、より広範な(すなわち、増加した)向性を有する。向性はまた、宿主の特定の種類の細胞表面分子に対するウイルスの依存性を含み得る。例えば、いくつかのウイルスは、表面グリコサミノグリカンを有する細胞のみに感染することができる一方、他のウイルスは、シアル酸を有する細胞のみに感染することができる(そのような依存性は、ウイルス感染の潜在的な宿主細胞として特定のクラスの分子を欠く様々な細胞株を使用して試験することができる)。いくつかの事例では、ウイルスの向性は、ウイルスの相対的選好を説明する。例えば、第1のウイルスは、全ての細胞型に感染することができる可能性があるが、表面グリコサミノグリカンを有する細胞を感染させる上ではるかに大きな成功を収める。第2のウイルスも同じ特徴を選好する場合(例えば、第2のウイルスも、表面グリコサミノグリカンを有する細胞を感染させる上でより大きな成功を収める場合)、絶対的形質導入効率は類似していないとしても、第2のウイルスは、第1のウイルスと類似の(または同一の)向性を有するとみなすことができる。例えば、第2のウイルスは、試験した全ての所定の細胞型を感染させる上で、第1のウイルスよりも効率的である可能性があるが、相対的選好が類似している(または同一である)場合、第2のウイルスは、依然として第1のウイルスと類似の(または同一の)向性を有するとみなすことができる。いくつかの実施形態では、主題の変異AAVキャプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、天然に存在するビリオンと比較して、改変されていない。いくつかの実施形態では、主題の変異AAVキャプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、天然に存在するビリオンと比較して、拡大されている(すなわち、広範になっている)。いくつかの実施形態では、主題の変異AAVキャプシドタンパク質を含むビリオンの向性は、天然に存在するビリオンと比較して、低下している。
「複製コンピテントな」ウイルス(例えば、複製コンピテントなAAV)という用語は、感染性であり、また感染した細胞内で(すなわち、ヘルパーウイルスまたはヘルパーウイルス機能の存在下で)複製されることができる、表現型的に野生型のウイルスを指す。AAVの場合、複製コンピテンスは一般に、機能的AAVパッケージング遺伝子の存在を必要とする。一般に、本明細書に記載のrAAVベクターは、1つ以上のAAVパッケージング遺伝子の欠如のために、哺乳動物細胞(特にヒト細胞)内で複製不能である。典型的には、そのようなrAAVベクターは、AAVパッケージング遺伝子と移入されるrAAVベクターとの間の組換えによって複製コンピテントなAAVが生成される可能性を最小化するために、一切のAAVパッケージング遺伝子配列を欠如している。多くの実施形態では、本明細書に記載のrAAVベクター調製物は、あったとしてもわずかな複製コンピテントなAAV(rcAAV、RCAとも称される)をほとんど含まないものである(例えば、rAAV粒子102個当たり約1個未満のrcAAV、rAAV粒子104個当たり約1個未満のrcAAV、rAAV粒子10個当たり約1個未満のrcAAV、rAAV粒子1012個当たり約1個未満のrcAAV、またはrcAAVなし)。
「ポリヌクレオチド」という用語は、デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチドまたはその類似体を含む、任意の長さのヌクレオチドの多量体形態を指す。ポリヌクレオチドは、メチル化ヌクレオチドおよびヌクレオチド類似体などの修飾されたヌクレオチドを含んでもよく、非ヌクレオチド成分によって中断されてもよい。存在する場合、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの組み立ての前または後に付与され得る。ポリヌクレオチドという用語は、本明細書で使用される場合、二本鎖および一本鎖分子を同義に指す。別途特定されない限り、または必要とされない限り、ポリヌクレオチドを含む本明細書の任意の実施形態は、二本鎖形態、および二本鎖形態を構成することが既知であるかまたは予測される2つの相補的一本鎖形態の各々の両方を包含する。
ポリヌクレオチドまたはポリペプチドは、別のポリヌクレオチドまたはポリペプチドに対してある特定の「配列同一性」パーセントを有し、これは、整列したときに、これらの2つの配列を比較すると、塩基またはアミノ酸のパーセンテージが同じであることを意味する。配列類似性は、いくつかの異なる様式で決定することができる。配列同一性を決定するために、配列は、ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/のウェブ上で入手可能なBLASTを含む方法およびコンピュータープログラムを使用して整列させることができる。他のアラインメントアルゴリズムは、Oxford Molecular Group,Inc.の完全所有子会社であるMadison,Wisconsin,USAのGenetics Computing Group(GCG)パッケージで利用可能なFASTAである。アラインメントのための他の技術は、Methods in Enzymology,vol.266:Computer Methods for Macromolecular Sequence Analysis(1996),ed.Doolittle,Academic Press,Inc.(Harcourt Brace&Co.,San Diego,California,USAの一部門)に記載されている。特に興味深いのは、配列内のギャップを許容するアライメントプログラムである。Smith-Watermanは、配列アライメントにおけるギャップを許容するアルゴリズムの一種である。Meth.Mol.Biol.70:173-187(1997)を参照されたい。また、Needleman-Wunschアラインメント法を使用したGAPプログラムを利用して、配列を整列させることができる。J.Mol.Biol.48:443-453(1970)を参照されたい。
「遺伝子」という用語は、細胞内で何らかの機能を果たすポリヌクレオチドを指す。例えば、遺伝子は、遺伝子産物をコードすることができる翻訳領域を含み得る。遺伝子産物の一例は、遺伝子から転写され翻訳されるタンパク質である。遺伝子産物の別の例は、転写されているが翻訳されていないRNA、例えば、機能的RNA産物、例えば、アプタマー、干渉RNA、リボソームRNA(rRNA)、トランスファーRNA(tRNA)、非コードRNA(ncRNA)、ヌクレアーゼのためのガイドRNAなどである。
「遺伝子発現産物」または「遺伝子産物」という用語は、上記に定義した特定の遺伝子の発現から生じる分子である。遺伝子発現産物には、例えば、ポリペプチド、アプタマー、干渉RNA、メッセンジャーRNA(mRNA)、rRNA、tRNA、非コードRNA(ncRNA)などが含まれる。
「siRNA剤」(「低分子干渉」もしくは「短鎖干渉RNA」(またはsiRNA))は、遺伝子目的(「標的遺伝子」)に標的化されるヌクレオチドのRNA二重鎖である。「RNA二重鎖」は、RNA分子の2つの領域間の相補的対形成によって形成され、二本鎖RNA(dsRNA)の領域を形成する構造を指す。siRNAの二重鎖部分のヌクレオチド配列が標的化遺伝子のヌクレオチド配列に相補的であるという点で、siRNAは遺伝子に「標的化」される。いくつかの実施形態では、siRNAの二本鎖の長さは、30ヌクレオチド未満である。いくつかの実施形態では、二重鎖は、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、または10ヌクレオチド長であり得る。いくつかの実施形態では、二本鎖の長さは、19~25ヌクレオチド長である。いくつかの実施形態では、siRNA媒介性遺伝子標的化は、DNA構築物を利用して動物細胞の内因性RNA干渉(RNAi)経路を活性化する遺伝子サイレンシング技術である、DNA指向性RNA干渉(ddRNAi)の使用によって達成される。そのようなDNA構築物は、処理されると、標的遺伝子(複数可)のサイレンシングを引き起こす、自己相補的な二本鎖RNA、典型的には短鎖ヘアピンRNA(shRNA)を発現するように設計される。内因性mRNAまたはウイルスRNAを含むいずれのRNAも、所望のmRNA標的に相補的な二本鎖RNAを発現する構築物を設計することによってサイレンシングされ得る。したがって、siRNA剤のRNA二本鎖部分は、shRNAと称される短鎖ヘアピン構造の一部であり得る。二重鎖部分に加えて、ヘアピン構造は、二本鎖を形成する2つの配列の間に位置するループ部分を含んでもよい。ループの長さは、変化し得る。いくつかの実施形態では、ループは、5、6、7、8、9、10、11、12、または13ヌクレオチド長である。ヘアピン構造は、3’突出部分または5’突出部分も含み得る。いくつかの実施形態では、突出部分は、0、1、2、3、4、または5ヌクレオチド長の3’または5’突出である。一般に、標的遺伝子の発現産物(例えば、mRNA、ポリペプチドなど)のレベルは、5’非翻訳(UT)領域、ORF、または3’UT領域を含む、標的遺伝子転写産物の少なくとも19~25ヌクレオチド長のセグメント(例えば、20~21ヌクレオチド配列)に相補的である特定の二本鎖ヌクレオチド配列を含むsiRNA剤(例えば、siRNA、shRNAなど)によって低下する。いくつかの実施形態では、短鎖干渉RNAは、約19~25ヌクレオチド長である。siRNA技術の説明については、例えば、PCT出願WO00/44895、WO99/32619、WO01/75164、WO01/92513、WO01/29058、WO01/89304、WO02/16620、およびWO02/29858、ならびに米国特許出願公開第2004/0023390号を参照されたい。siRNAおよび/またはshRNAは、核酸配列によってコードされてもよく、この核酸配列はまた、プロモーターを含んでもよい。核酸配列はまた、ポリアデニル化シグナルを含んでもよい。いくつかの実施形態では、ポリアデニル化シグナルは、合成最小ポリアデニル化シグナルである。
「アンチセンスRNA」という用語は、遺伝子発現産物に相補的なRNAを包含する。例えば、特定のmRNAに標的化されるアンチセンスRNAは、アンチセンスRNAのmRNAへのハイブリダイゼーションがmRNAの発現を改変する(例えば、RNAの安定性を改変すること、RNAの翻訳を改変することなどを介して)、mRNAに相補的なRNAベースの作用物質である(か、または修飾RNAであり得る)。「アンチセンスRNA」には、アンチセンスRNAをコードする核酸も含まれる。
「CRISPR/Cas9剤」に関して、「CRISPR」という用語は、CRISPR RNA(crRNA)を使用して、侵入してくる核酸のサイレンシングをガイドすることにより、ウイルスおよびプラスミドに対する適応免疫を細菌および古細菌に提供するように進化した、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート/CRISPR関連(Cas)システムを包含する。Cas9タンパク質(またはその機能的等価物および/もしくは変異体、すなわち、Cas9様タンパク質)は、crRNAおよびtracrRNAと呼ばれる2つの天然に存在するかまたは合成のRNA分子(ガイドRNAとも呼ばれる)とのタンパク質の会合に依存する、DNAエンドヌクレアーゼ活性を天然に含む。いくつかの事例では、2つの分子が共有結合して、単一分子(単一ガイドRNA(「sgRNA」)とも呼ばれる)を形成する。したがって、Cas9またはCas9様タンパク質は、Cas9またはCas9様タンパク質を活性化し、タンパク質を標的核酸配列にガイドする、DNA標的化RNA(この用語は、二分子ガイドRNA構成および単一分子ガイドRNA構成の両方を包含する)と会合する。
Cas9またはCas9様タンパク質がその天然の酵素機能を保持する場合、それは、標的DNAを切断して、ゲノムの改変(すなわち、編集:欠失、挿入(ドナーポリヌクレオチドが存在する場合)、置換など)をもたらすことができる二本鎖破断を創出し、それによって遺伝子発現を改変する。Cas9のいくつかの変異体(この変異体は、Cas9様という用語によって包含される)は、DNA切断活性が低下するように改変されている(いくつかの事例では、それらは、標的DNAの両方の鎖の代わりに単一の鎖を切断するが、他の事例では、それらは、DNA切断活性がなくなるまで著しく縮小している)。DNA切断活性が減少した(さらにはDNA切断活性がない)Cas9様タンパク質は、それでも標的DNAにガイドされて、RNAポリメラーゼ活性を阻止し得る。あるいは、Cas9またはCas9様タンパク質は、VP64転写活性化ドメインをCas9タンパク質に融合させ、融合タンパク質をテトラループおよびステムループでMS2-P65-HSF1ヘルパータンパク質およびMS2 RNAアプタマーを含む単一ガイドRNAとともに共同輸送して、転写を活性化する細胞内に相乗活性化メディエーター(Cas9-SAM)複合体を形成させることによって、修飾されてもよい。したがって、酵素的に不活性なCas9様タンパク質は、標的DNAの転写を阻止または活性化するために、DNA標的化RNAによって標的DNA中の特定の位置を標的化することができる。本明細書で使用される場合、「CRISPR/Cas9剤」という用語は、上記のような、または当該技術分野で既知であるCRISPR/Cas9の全ての形態を包含する。
CRISPR剤に関する詳細な情報は、例えば、(a)Jinek et.al.,Science.2012Aug17;337(6096):816-21:”A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity”、(b)Qi et al.,Cell.2013Feb28;152(5):1173-83:”Repurposing CRISPR as an RNA-guided platform for sequence-specific control of gene expression”、ならびに(c)米国特許出願第13/842,859号およびPCT出願第PCT/US13/32589に見出すことができ、これらの全ての全体が、参照により本明細書に組み込まれる。したがって、本明細書で使用される場合、「CRISPR剤」という用語は、Cas9系システム(例えば、Cas9またはCas9様タンパク質;DNA標的化RNAの任意の構成成分、例えば、crRNA様RNA、tracrRNA様RNA、単一ガイドRNAなど;ドナーポリヌクレオチドなど)において使用することができる、天然に存在する配列および/または合成配列を含む、任意の作用物質(またはそのような作用物質をコードする核酸)を包含する。
「ジンクフィンガーヌクレアーゼ」(ZFN)は、ジンクフィンガーDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合することによって生成される人工DNAエンドヌクレアーゼを意味する。ZFNは、所望のDNA配列を標的化するように操作することができ、これによりジンクフィンガーヌクレアーゼが固有の標的配列を切断することが可能になる。細胞に導入された場合、ZFNを使用して、二本鎖破断を誘導することにより、細胞(例えば、細胞のゲノム)内の標的DNAを編集することができる。ZFNの使用に関するさらなる詳細については、例えば、Asuri et al.,Mol Ther.2012Feb;20(2):329-38、Bibikova et al.Science.2003May2;300(5620):764、Wood et al.Science.2011Jul15;333(6040):307、Ochiai et al.Genes Cells.2010Aug;15(8):875-85、Takasu et.al.,Insect Biochem Mol Biol.2010Oct;40(10):759-65、Ekker et al,Zebrafish2008Summer;5(2):121-3、Young et al,Proc Natl Acad Sci USA.2011Apr26;108(17):7052-7、Goldberg et al,Cell.2010Mar5;140(5):678-91、Geurts et al,Science.2009Jul24;325(5939):433、Flisikowska et al,PLoS One.2011;6(6):e21045.doi:10.1371/journal.pone.0021045.Epub2011Jun13、Hauschild et al,Proc Natl Acad Sci USA.2011Jul19;108(29):12013-7、およびYu et al,Cell Res.2011Nov;21(l1):1638-40を参照されたい。これらの全ては、ZFNに関連するそれらの教示について、参照により本明細書に組み込まれる。「ZFN剤」という用語は、ジンクフィンガーヌクレアーゼおよび/またはジンクフィンガーヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
「転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ」または「TALEN」剤という用語は、TAL(転写活性化因子様)エフェクターDNA結合ドメインをDNA切断ドメインに融合させることによって生成される人工DNAエンドヌクレアーゼである転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)を指す。TALENは、事実上いずれの所望のDNA配列にも結合するように迅速に操作することができ、細胞に導入された場合、TALENを使用して、二本鎖破断を誘導することによって細胞内の標的DNA(例えば、細胞のゲノム)を編集することができる。TALENの使用に関するさらなる情報については、例えば、Hockemeyer et al.Nat Biotechnol.2011Jul7;29(8):731-4、Wood et al.Science.2011Jul15;333(6040):307、Tesson et al.Nat Biotechnol.2011Aug5;29(8):695-6、およびHuang et.al.,Nat Biotechnol.2011Aug5;29(8):699-700を参照されたい。これらの全ては、TALENに関連するそれらの教示について、参照により本明細書に組み込まれる。「TALEN剤」という用語は、TALENおよび/またはTALENをコードするヌクレオチド配列を含むポリヌクレオチドを包含する。
「制御要素」または「制御配列」という用語は、ポリヌクレオチドの複製、重複、転写、スプライシング、翻訳、または分解を含む、ポリヌクレオチドの機能的調節に寄与する分子の相互作用に関与するヌクレオチド配列を指す。この調節は、プロセスの頻度、速度、または特異性に影響を及ぼす可能性があり、性質が増強性または阻害性である可能性がある。当該技術分野で既知の制御要素には、例えば、プロモーターおよびエンハンサーなどの転写調節配列が含まれる。プロモーターは、ある特定の条件下では、RNAポリメラーゼに結合し、通常はプロモーターの下流(3’方向)に位置するコード領域の転写を開始することができるDNA領域である。プロモーターは、普遍的作用性、すなわち、多くの細胞型において活性、例えば、CAGまたはCMVプロモーターであってもよく、または組織もしくは細胞特異性、例えば、桿体で活性なrhoプロモーター、または錐体で活性なオプシンプロモーターであってもよい。
「作動的に連結された」または「作動可能に連結された」という用語は、遺伝要素の並置を指し、要素は、それらが予想される様式で作動することを可能にする関係にある。例えば、プロモーターがコード配列の転写の開始を助ける場合、プロモーターはコード領域に作動可能に連結されている。この機能的関係が維持される限り、プロモーターとコード領域との間に介在残基が存在してもよい。
「発現ベクター」という用語は、目的のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド領域を含むベクターを包含し、意図された標的細胞内でのタンパク質の発現をもたらすために使用される。発現ベクターはまた、標的中のタンパク質の発現を促進するために、コード領域に作動可能に連結された制御要素を含んでもよい。制御要素と、それらが発現のために作動可能に連結されている遺伝子(複数可)との組み合わせは、「発現カセット」と呼ばれることもあり、その多くは、当該技術分野で既知かつ入手可能であるか、または当該技術分野で入手可能な構成要素から容易に構築することができる。
「異種」という用語は、それが比較されている残りの実体とは遺伝子型が異なる実体に由来することを意味する。例えば、遺伝子操作技術によって異なる種に由来するプラスミドまたはベクターに導入されるポリヌクレオチドは、異種ポリヌクレオチドである。天然コード配列から除去され、天然には結合していないコード配列に作動可能に連結されたプロモーターは、異種プロモーターである。したがって、例えば、異種遺伝子産物をコードする異種核酸配列を含むrAAVは、天然に存在する野生型AAVに通常は含まれないポリヌクレオチドを含むrAAVであり、コードされた異種遺伝子産物は、天然に存在する野生型AAVによって通常はコードされない遺伝子産物である。
「遺伝子改変」および「遺伝子修飾」(ならびにその文法上の変化形)は、遺伝要素(例えば、ポリヌクレオチド)が有糸分裂または減数分裂以外によって細胞に導入されるプロセスを指すように本明細書では同義に使用される。要素は、細胞に対して異種であってもよく、またはそれは、細胞に既に存在する要素の追加のコピーまたは改善バージョンであってもよい。遺伝子改変は、例えば、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、またはポリヌクレオチド-リポソーム複合体との接触などの、当該技術分野で既知である任意のプロセスによって、細胞を組換えプラスミドまたは他のポリヌクレオチドでトランスフェクトすることによってもたらすことができる。遺伝子改変はまた、例えば、DNAまたはRNAウイルスまたはウイルスベクターを用いた形質導入または感染によってもたらすことができる。一般に、遺伝要素は、細胞内の染色体またはミニ染色体に導入されるが、この用語には、細胞およびその子孫の表現型および/または遺伝子型を変化させる任意の改変が含まれる。
細胞修飾に関して、外因性DNAによって(例えば、組換えウイルスを介して)「遺伝子修飾された」または「形質転換された」または「トランスフェクトされた」または「形質導入された」という用語は、そのようなDNAが細胞の内部に導入される場合を指す。外因性DNAの存在により、永続的または一時的な遺伝子変化がもたらされる。形質転換DNAは、細胞のゲノムに組み込まれる(共有結合している)場合もそうでない場合もある。「クローン」は、有糸分裂によって単一細胞または共通の祖先に由来する細胞の集団である。「細胞株」は、多くの世代にわたってインビトロで安定して増殖することができる初代細胞のクローンである。
本明細書で使用される場合、配列がインビトロでの延長した細胞培養中および/またはインビボで長期間その機能を果たすために利用可能である場合、細胞は遺伝子配列によって「安定して」改変、形質導入、遺伝子修飾、または形質転換されると言われる。一般に、そのような細胞は、改変された細胞の子孫によっても継承可能である遺伝子改変が導入されるという点で、「遺伝的に」改変(遺伝子修飾)される。
「ポリペプチド」、「ペプチド」、および「タンパク質」という用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すように本明細書では同義に使用される。これらの用語は、修飾されたアミノ酸ポリマー、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、または標識化成分との抱合も包含する。哺乳動物対象に遺伝子産物を送達する観点から考察される場合、抗血管新生ポリペプチド、神経保護ポリペプチドなどのポリペプチド、およびそのための組成物は、それぞれのインタクトなポリペプチド、またはインタクトなタンパク質の所望の生化学的機能を保持するその任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体を指す。同様に、抗血管新生ポリペプチドをコードする核酸、神経保護ポリペプチドをコードする核酸、および哺乳動物対象への遺伝子産物の送達に使用するための他のそのような核酸(レシピエント細胞に送達されることになる「導入遺伝子」と称されることもある)への言及は、インタクトなポリペプチドまたは所望の生化学的機能を保有する任意の断片もしくは遺伝子操作された誘導体をコードするポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用される場合、「単離された」プラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、ビリオン、宿主細胞、タンパク質、または他の物質は、物質または類似の物質が天然に存在するか、または最初に調製される、存在し得る他の構成成分の少なくともいくつかが欠如した物質の調製物を指す。したがって、例えば、単離された物質は、精製技術を使用して、それを源混合物から富化することによって調製されてもよい。濃縮は、溶液の体積当たりの重量などの絶対的な基準で測定することができ、または源混合物中に存在する干渉する可能性のある第2の物質との関連で測定することができる。本開示の実施形態のますますの濃縮は、ますますのさらなる単離である。単離されたプラスミド、核酸、ベクター、ウイルス、宿主細胞、または他の物質は、いくつかの実施形態では、例えば、約80%~約90%純粋、少なくとも約90%純粋、少なくとも約95%純粋、少なくとも約98%純粋、または少なくとも約99%以上純粋に精製される。
本明細書で使用される場合、「治療」、「治療する」などの用語は、所望の薬理学的および/または生理学的効果を得ることを指す。この効果は、疾患もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防する観点で予防的であり得、かつ/または疾患および/もしくは疾患に起因する有害作用の部分的または完全な治癒の観点で治療的であり得る。本明細書で使用される場合、「治療」は、哺乳動物、特にヒトにおける疾患の任意の治療を網羅し、これには、(a)疾患(および/または疾患によって引き起こされる症状)が、疾患にかかりやすいかまたは疾患に罹患する危険性があるが、それを有するとまだ診断されていない対象において発生するのを予防すること、(b)疾患(および/または疾患によって引き起こされる症状)を阻害すること、すなわち、その発症を停止させること、ならびに(c)疾患(および/または疾患によって引き起こされる症状)を軽減すること、すなわち、疾患(および/または疾患によって引き起こされる症状)の退行を引き起こすこと、すなわち、疾患および/または疾患の1つ以上の症状を緩和することが含まれる。例えば、主題の組成物および方法は、網膜疾患の治療を対象とし得る。網膜疾患およびその治療を評価するための非限定的な例には、網膜の機能およびその変化、例えば、視力(例えば、最良矯正視力[BCVA]、歩行、ナビゲーション、物体検知、および識別)の変化、視野(例えば、静的および動的視野計測)の変化、臨床検査(例えば、前眼部および後眼部の細隙灯検査)、明暗の全波長に対する電気生理学的応答(例えば、あらゆる形態の網膜電図写真(ERG)[全視野、多焦点、およびパターン]、あらゆる形態の視覚誘発電位(VEP)、電気眼球図記録(EOG)、色覚、暗順応、および/または対比感度)の測定;解剖学的測定および/または写真による測定、例えば、光干渉断層撮影(OCT)、眼底撮影、補償光学走査レーザー検眼鏡、蛍光法、および/または自己蛍光法を使用する生体構造または健康の変化の測定;眼球運動および眼の動き(例えば、眼振、凝視、選択、および安定性)の測定、報告された結果(患者報告による視覚および非視覚誘導挙動および活動の変化、患者報告結果[PRO]、生活の質のアンケート評価、日常活動の測定、ならびに神経機能の測定(例えば、機能的磁気共鳴画像法(MRI))が含まれる。
「個体」、「宿主」、「対象」、および「患者」という用語は、本明細書では同義に使用され、ヒト;サルを含む非ヒト霊長類;哺乳動物の競技動物(例えば、ウマ);哺乳動物の家畜(例えば、ヒツジ、ヤギなど);哺乳動物の愛玩動物(イヌ、ネコなど)、および齧歯動物(例えば、マウス、ラットなど)を含むがこれらに限定されない、哺乳動物を指す。
いくつかの実施形態では、個体は、以前に自然にAAVに曝露されており、その結果、抗AAV抗体(すなわち、AAV中和抗体)を保有するヒトである。いくつかの実施形態では、個体は、以前にAAVベクターを投与されており(その結果、抗AAV抗体を保有し得る)、異なる病態の治療または同じ病態のさらなる治療のためにベクターの再投与を必要とするヒトである。このビヒクルに対する中和抗体によって影響される全ての組織、例えば、肝臓、筋肉、および網膜へのAAV遺伝子送達を伴う臨床試験における陽性結果に基づいて、そのような治療的用途/疾患標的が多数存在する。
本明細書で使用される場合、「有効量」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果をもたらすのに十分な量である。有効量は、1回以上の投与で投与することができる。本開示の目的のために、有効量の化合物(例えば、感染性rAAVビリオン)は、特定の病状(例えば、網膜疾患)(および/またはその病状と関連付けられる症状)の進行を、軽減、緩和、安定化、逆転、予防、減速、または遅延するのに十分な量である。したがって、有効量の感染性rAAVビリオンは、異種核酸を個体の標的細胞(複数可)に効果的に送達することができる感染性rAAVビリオンの量である。有効量は、当該技術分野において十分に理解されている技術、例えば、RT-PCR、ウエスタンブロット法、ELISA、蛍光法、または他のレポーター読み出しなどを使用して、異種核酸配列によってコードされる遺伝子産物(RNA、タンパク質)を細胞内または組織中で検出することによって、前臨床的に決定することができる。有効量は、本明細書に記載されているようにまたは当該技術分野で既知であるように、当該技術分野で既知の方法、例えば、眼底自発蛍光、フルオレセイン血管造影法、OCT、微小視野計測、補償光学などを使用して、疾患の発症または進行の変化を検出することによって臨床的に決定されてもよい。
「網膜細胞」という用語は、本明細書では、網膜を構成する細胞型、例えば、非限定的に、網膜神経節(RG)細胞、アマクリン細胞、水平細胞、双極細胞、光受容細胞、ミュラーグリア細胞、ミクログリア細胞、および網膜色素上皮(RPE)などのいずれかを指す。「光受容細胞」という用語は、本明細書では、非限定的に、桿体細胞または「桿体」および錐体細胞または「錐体」を指す。「ミュラー細胞」または「ミュラーグリア」という用語は、脊椎動物網膜のニューロンを支持するグリア細胞を指す。
「定向進化」という用語は、遺伝的多様化および選択プロセスの反復ラウンドを通して自然進化を模倣し、それによって生体分子の機能を漸進的に改善する有益な突然変異を蓄積する、インビトロおよび/またはインビボでのキャプシド操作方法論を指す。定向進化は、変異体が目的の細胞または組織型のより効率的なレベルの感染性を保有するライブラリからAAV変異体を選択するための「バイオパニング」と称されるインビボ法を伴うことが多い。
(詳細な説明)
アデノ随伴ウイルス(AAV)は、エンベロープを有しないキャプシドの内部に含まれる4.7kbの一本鎖DNAゲノムを有するパルボウイルスのファミリーである。天然に存在するAAVのウイルスゲノムは、2つの主要な翻訳領域(ORF)であるrep(ウイルス複製、転写制御、部位特異的組み込み、およびビリオン組み立てにおいて機能を果たすコードタンパク質)ならびにcapに隣接する、複製およびパッケージングシグナルのウイルス起源として機能する2つの逆位末端反復配列(ITR)を有する。cap ORFは、60量体のウイルスキャプシドを形成するように組み立てられる3つの構造タンパク質をコードする。多くの天然に存在するAAV変異体および血清型が単離されており、いずれもヒト疾患に関連付けられていない。
AAVの組換え型は遺伝子送達ベクターとして使用することができ、この場合、目的のマーカー遺伝子または治療用遺伝子をrepおよびcapの代わりにITRの間に挿入する。これらのベクターは、インビトロおよびインビボで分裂細胞および非分裂細胞の両方に形質導入することが示されており、有糸分裂後の組織内で何年も安定した導入遺伝子発現をもたらすことができる。例えば、Knipe DM,Howley PM.Fields’Virology.Lippincott Williams&Wilkins,Philadelphia,PA,USA,2007、Gao G-P,Alvira MR,Wang L,Calcedo R,Johnston J,Wilson JM.Novel adeno-associated viruses from rhesus monkeys as vectors for human gene therapy.Proc Natl Acad Sci USA2002;99:11854-9、Atchison RW,Casto BC,Hammon WM.Adenovirus-Associated Defective Virus Particles.Science1965;149:754-6、Hoggan MD,Blacklow NR,Rowe WP.Studies of small DNA viruses found in various adenovirus preparations:physical,biological,and immunological characteristics.Proc Natl Acad Sci USA1966;55:1467-74、Blacklow NR,Hoggan MD,Rowe WP.Isolation of adenovirus-associated viruses from man.Proc Natl Acad Sci USA1967;58:1410-5、Bantel-Schaal U,zur Hausen H.Characterization of the DNA of a defective human parvovirus isolated from a genital site.Virology1984;134:52-63、Mayor HD,Melnick JL.Small deoxyribonucleic acid-containing viruses(picodnavirus group).Nature1966;210:331-2、Mori S,Wang L,Takeuchi T,Kanda T.Two novel adeno-associated viruses from cynomolgus monkey:pseudotyping characterization of capsid protein.Virology2004;330:375-83、Flotte TR.Gene therapy progress and prospects:recombinant adeno-associated virus(rAAV)vectors.Gene Ther2004;11:805-10を参照されたい。
組換えAAV(本明細書では単に「AAV」と称する)は、益々増えている臨床試験数において有望な結果をもたらしている。しかし、抗キャプシド免疫応答、ある特定の組織の形質導入の低下、特定の細胞型への標的送達不能、および比較的低い運搬能など、AAVの有用性を制限し得る遺伝子送達の障害が存在する。多くの状況において、AAVを改善する能力を有する合理的設計を効果的に力づけるためには、機構的知識が十分ではない。代替として、定向進化が、特定の生物医学的ニーズを満たす新規のAAV変異体を創出する戦略として出現している。定向進化戦略は、生物分子の機能を漸進的に改善する有益な突然変異の蓄積を可能にする遺伝的多様化および選択プロセスを利用する。このプロセスでは、野生型AAV cap遺伝子をいくつかのアプローチによって多様化して、ウイルス粒子のライブラリを生成するようにパッケージングされている大きな遺伝子ライブラリを創出し、次いで選択圧を適用して、遺伝子送達障壁を克服することができる新規の変異体を単離する。重要なことに、機能の定向進化のために、遺伝子送達問題の根底にある基本機構は既知である必要はないため、増強されたベクターの開発を加速することができる。
典型的には、本明細書に開示される変異体は、AAVライブラリ(複数可)の使用によって生成された。そのようなAAVライブラリ(複数可)は、AAVキャプシドの構造タンパク質をコードする遺伝子であるcap遺伝子を、ウイルスゲノム操作の分野における当業者にとって既知かつ容易に利用可能である様々な定向進化技術によって突然変異させることによって生成される。例えば、Bartel et al.Am.Soc.Gene Cell Ther.15th Annu.Meet.20,S140(2012)、Bowles,D.et al.J.Virol.77,423-432(2003)、Gray et al.Mol.Ther.18,570-578(2010)、Grimm,D.et al.J.Virol.82,5887-5911、Koerber,J.T.et al.Mol.Ther.16,1703-1709(2008)、Li W.et al.Mol.Ther.16,1252-1260(2008)、Koerber,J.T.et al.Methods Mol.Biol.434,161-170(2008)、Koerber,J.T.et al.Hum.Gene Ther.18,367-378(2007)、およびKoerber,J.T.et al.Mol.Ther.17,2088-2095(2009)を参照されたい。そのような技術は、非限定的に、以下の通りである:i)ランダム点突然変異をAAV cap翻訳領域(ORF)に所定の変更可能な速度で導入するためのエラープローンPCR、ii)AAV cap遺伝子のランダムキメラを生成して、複数のAAV血清型を有する遺伝子ライブラリを得るためのインビトロまたはインビボウイルス組換えまたは「DNAシャッフリング」、iii)cap ORF中の縮重オリゴヌクレオチドのライゲーションによるキャプシドの定義された部位におけるランダムペプチド挿入、iv)トランスポゾン突然変異誘発を使用したAAV cap ORFのランダムな位置へのペプチドコード配列の定義された挿入、v)「ループスワップ」ライブラリを生成するための天然のAAV血清型および変異体における各アミノ酸位置の保存レベルに基づくバイオインフォマティクスによって設計されたペプチド配列のライブラリによるAAVキャプシドの表面ループの代置、vi)祖先変異体のライブラリを生成するためのAAV血清型間の縮重の位置におけるランダムなアミノ酸置換(Santiago-Ortizら、2015)、ならびにそれらのそのような技術の組み合わせ。
DNAシャフリングは、親の特性を、固有かつ多くの場合に有益な方法で組み合わせるキメラを生成するが、パッケージングすることができないものもあり、これは事実上、ライブラリの多様性を低下させる。ライブラリの多様性の集中は、非限定的に、上記のiii)~iv)などのペプチド挿入技術によって達成される。ライブラリの多様性もまた、上記のv)などの技術に集中しており、そのような集中は、AAVキャプシドの表面が露出したループ上にある複数の超可変領域を対象とする。多くの技術が、キャプシドの小さな領域のみが変異した変異キャプシドを生成するが、これらの技術は、完全なキャプシドを修飾するための追加の突然変異誘発戦略と対形成させることができる。
AAVライブラリ(複数可)が生成されると、各AAV粒子がそのキャプシドをコードするcap遺伝子を囲む突然変異キャプシドで構成され、精製されるように、次いでウイルスがパッケージングされる。次いで、ライブラリの変異体は、AAVの分野の当業者にとって既知かつ容易に利用可能であるインビトロおよび/またはインビボの選択圧技術に供される。例えば、Maheshri,N.et al.Nature Biotech.24,198-204(2006)、Dalkara,D.et al.Sci.Transl.Med.5,189ra76(2013)、Lisowski,L.et al.Nature.506,382-286(2013)、Yang,L.et al.PNAS.106,3946-3951(2009)、Gao,G.et al.Mol.Ther.13,77-87(2006)、およびBell,P.et al.Hum.Gene.Ther.22,985-997(2011)を参照されたい。例えば、非限定的に、AAV変異体は、i)異なる画分の溶出が変更された結合特性を有する変異体をもたらす親和性カラム、ii)効率および/または組織特異性が増加したAAV変異体をもたらす、ヒト体内の細胞の挙動を模倣する組織試料または不死化細胞株から単離される初代細胞、iii)標的組織の感染に成功したAAV変異体をもたらす、臨床的遺伝子療法環境を模倣する動物モデル、iv)感染した移植ヒト細胞を有するAAV変異体をもたらすヒト異種移植モデル、ならびに/またはそれらの選択技術の組み合わせを使用して選択され得る。
ウイルスが選択されると、それらは、非限定的に、アデノウイルス媒介性複製、PCR増幅、次世代シークエンシングおよびクローニングなどの既知の技術によって回収され得る。次いで、ウイルスクローンを選択技術の反復ラウンドにより濃縮し、AAV DNAを単離して、目的の選択された変異cap遺伝子を回収する。そのような選択された変異体は、さらなる修飾または突然変異に供され得るため、AAVウイルス適合性を反復的に増加させるさらなる選択ステップのための新たな出発点として機能する。しかしながら、ある特定の事例では、追加の突然変異なしにキャプシドの生成が成功している。
本明細書に開示されるAAV変異体は、少なくとも部分的に、硝子体内投与後の霊長類網膜スクリーンの使用を伴う、上記の技術などのインビボ定向進化方法論の使用によって生成された。したがって、本明細書に開示されるAAV変異キャプシドは、対応する親AAVキャプシドタンパク質よりも効率的な霊長類網膜細胞の形質導入を付与するアミノ酸配列内の1つ以上の修飾を含む。本明細書で使用される場合、「対応する親AAVキャプシドタンパク質」は、対象の変異AAVキャプシドタンパク質と同じ野生型または変異AAV血清型であるが、対象の変異AAVキャプシドタンパク質の1つ以上のアミノ酸配列修飾を含まない、AAVキャプシドタンパク質を指す。
いくつかの実施形態では、主題の変異AAVキャプシドタンパク質は、対応する親AAVキャプシドタンパク質に対して、AAVキャプシドタンパク質のGHループまたはループIVに共有結合によって挿入された約5アミノ酸~約20アミノ酸の異種ペプチドを含む。AAVキャプシドタンパク質の「GHループ」またはループIVは、当該技術分野では、AAVキャプシドタンパク質のGHループまたはループIVと称される溶媒露出部分を意味する。AAVキャプシドのGHループ/ループIVについては、例えば、van Vliet et al.(2006)Mol.Ther.14:809、Padron et al.(2005)J.Virol.79:5047、およびShen et al.(2007)Mol.Ther.15:1955を参照されたい。したがって、例えば、挿入部位は、AAV VP1キャプシドタンパク質のおよそアミノ酸411~650内にあり得る。例えば、挿入部位は、AAV1 VP1のアミノ酸571~612、AAV2 VP1のアミノ酸570~611、AAV3A VP1のアミノ酸内571~612、AAV3B VP1のアミノ酸571~612内、AAV4 VP1のアミノ酸569~610内、AAV5 VP1のアミノ酸560~601内、AAV6 VP1のアミノ酸571~612内、AAV7 VP1のアミノ酸572~613内、AAV8 VP1のアミノ酸573~614内、AAV9 VP1のアミノ酸571~612内、もしくはAAV10 VP1のアミノ酸573~614内、またはそれらの任意の変異体の対応するアミノ酸内にあり得る。当業者は、様々なAAV血清型のキャプシドタンパク質のアミノ酸配列の比較に基づいて、「AAV2のアミノ酸に対応する」挿入部位が任意の所与のAAV血清型のキャプシドタンパク質に存在することを理解するであろう。野生型(天然に存在する)血清型AAV1、AAV2、AAV3A、AAV3B、およびAAV4-10の間のおよびそれらに渡るアミノ酸位置を提供する野生型AAV配列番号1~11のアラインメントについては、図6も参照されたい。
ある特定の実施形態では、挿入部位は、任意の野生型AAV血清型またはAAV変異体のVP1のアミノ酸570~614の間に位置する2つの隣接アミノ酸間の単一の挿入部位であり、例えば、挿入部位は、任意のAAV血清型または変異体のVP1のアミノ酸570~610、アミノ酸580~600、アミノ酸570~575、アミノ酸575~580、アミノ酸580~585、アミノ酸585~590、アミノ酸590~600、またはアミノ酸600~614に位置する2つの隣接アミノ酸間にある。例えば、挿入部位は、アミノ酸580と581、アミノ酸581と582、アミノ酸583と584、アミノ酸584と585、アミノ酸585と586、アミノ酸586と587、アミノ酸587と588、アミノ酸588と589、またはアミノ酸589と590との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸575と576、アミノ酸576と577、アミノ酸577と578、アミノ酸578と579、またはアミノ酸579と580との間にあり得る。挿入部位は、アミノ酸590と591、アミノ酸591と592、アミノ酸592と593、アミノ酸593と594、アミノ酸594と595、アミノ酸595と596、アミノ酸596と597、アミノ酸597と598、アミノ酸598と599、またはアミノ酸599と600との間にあり得る。例えば、挿入部位は、AAV2のアミノ酸587と588との間、AAV1のアミノ酸590と591との間、AAV3Aのアミノ酸588と589との間、AAV3Bのアミノ酸588と589との間、AAV4のアミノ酸584と585との間、AAV5のアミノ酸575と576との間、AAV6のアミノ酸590と591との間、AAV7のアミノ酸589と590との間、AAV8のアミノ酸590と591との間、AAV9のアミノ酸588と589との間、またはAAV10のアミノ酸588と589との間にあり得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるペプチド挿入は、長さが、5アミノ酸、6アミノ酸、7アミノ酸、8アミノ酸、9アミノ酸、10アミノ酸、11アミノ酸、12アミノ酸、13アミノ酸、14アミノ酸、15アミノ酸、16アミノ酸、17アミノ酸、18アミノ酸、19アミノ酸、または20アミノ酸である。別の実施形態では、本明細書に開示されるペプチド挿入は、本明細書に開示されるペプチド挿入のうちのいずれか1つのアミノ末端(N末端)および/またはカルボキシル末端(C末端)に1~4個のスペーサーアミノ酸を含む。例示的なスペーサーアミノ酸には、ロイシン(L)、アラニン(A)、グリシン(G)、セリン(S)、トレオニン(T)、およびプロリン(P)が含まれるが、これらに限定されない。ある特定の実施形態では、ペプチド挿入は、N末端に2個のスペーサーアミノ酸を含み、C末端に2個のスペーサーアミノ酸を含む。他の実施形態では、ペプチド挿入は、N末端に2個のスペーサーアミノ酸を含み、C末端に1個のスペーサーアミノ酸を含む。
本明細書に開示されるペプチド挿入は、以前に説明されておらず、かつ/またはAAVキャプシドに挿入されていない。理論によって拘束されることを意図するものではないが、開示されるペプチド挿入のうちのいずれかの存在は、霊長類網膜の前面の細胞外マトリックスへの結合を低下させる可能性のあるヘパリン硫酸に対する変異キャプシドの親和性を低下させるように作用し得る。加えて、本明細書に開示されるペプチド挿入モチーフは、細胞表面受容体結合ドメインの添加による霊長類網膜細胞の形質導入の増強を付与し得る。
いくつかの好ましい実施形態では、挿入ペプチドは、以下の式のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含む。
いくつかの態様では、挿入ペプチドは、式1aの7~10アミノ酸長のペプチドであり得、
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3
式中、Y1~Y3の各々は、存在する場合、独立して、Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、Proから選択され、
X1は、Gln、Asn、His、Ile、およびAlaから選択され、
X2は、Ala、Gln、Asp、Ser、Lys、およびProから選択され、
X3は、Asp、Ile、Thr、およびAsnから選択され、
X4は、Thr、Ser、Tyr、Gln、Glu、およびAlaから選択され、
X5は、Thr、Lys、およびAsnから選択され、
X6は、Lys、Asn、およびGluから選択され、
X7は、Asn、Thr、Ile、His、Asp、およびAlaから選択される。
ある特定の実施形態では、式1aの挿入ペプチドは、QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、ASDSTKA(配列番号15)、NQDYTKT(配列番号16)、HDITKNI(配列番号17)、HPDTTKN(配列番号18)、HQDTTKN(配列番号19)、NKTTNKD(配列番号20)、ISNENEH(配列番号21)、およびQANANEN(配列番号22)から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、挿入ペプチドは、式1bの7~10アミノ酸長のペプチドであり得、
Y1Y2X1X2X3X4X5X6X7Y3
式中、Y1~Y3の各々は、存在する場合、独立して、Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、Proから選択され、
X1は、Gln、Asn、His、およびIleから選択され、
X2は、Ala、Gln、Asp、およびSerから選択され、
X3は、AspおよびIleから選択され、
X4は、Thr、Tyr、およびGlnから選択され、
X5は、ThrおよびLysから選択され、
X6は、LysおよびAsnから選択され、
X7は、Asn、Thr、Ile、およびHisから選択される。
ある特定の実施形態では、式1bの挿入ペプチドは、QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、NQDYTKT(配列番号16)、HDITKNI(配列番号17)、およびHQDTTKN(配列番号19)から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、挿入ペプチドは、式1cの7~10アミノ酸長のペプチドであり得、
Y1Y2X1X2AspX3ThrLysX4Y3
式中、Y1~Y3の各々は、存在する場合、独立して、Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、Proから選択され、
X1は、Gln、Asn、His、およびIleから選択され、
X2は、Ala、Gln、およびSerから選択され、
X3は、Thr、Tyr、およびGlnから選択され、
X4は、Asn、Thr、およびHisから選択される。
ある特定の実施形態では、式1cの挿入ペプチドは、QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、NQDYTKT(配列番号16)、およびHQDTTKN(配列番号19)から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、挿入ペプチドは、式1dの7~10アミノ酸長のペプチドであり得、
Y1Y2X1X2AspX3ThrThrX4Y3
式中、Y1~Y3の各々は、存在する場合、独立して、Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、Proから選択され、
X1は、GlnおよびIleから選択され、
X2は、AlaおよびSerから選択され、
X3は、ThrおよびGlnから選択され、
X4は、AsnおよびHisから選択される。
ある特定の実施形態では、式1dの挿入ペプチドは、QADTTKN(配列番号13)およびISDQTKH(配列番号14)から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の態様では、挿入ペプチドは、式Ieの7~11アミノ酸長のペプチドであり得、
Y1Y2X1X2AsnX3AsnGluX4Y3
式中、Y1~Y3の各々は、存在する場合、独立して、Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、Proから選択され、
X1は、GlnおよびIleから選択され、
X2は、AlaおよびSerから選択され、
X3は、GluおよびAlaから選択され、
X4は、AsnおよびHisから選択される。
他の実施形態では、式1eの挿入ペプチドは、ISNENEH(配列番号21)およびQANANEN(配列番号22)から選択されるアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施形態では、挿入ペプチドは、式IIaの7~11アミノ酸長のペプチドであり得、
Y1Y2X1X2DX3TKX4Y3
式中、Y1~Y3の各々は、存在する場合、独立して、Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、Proから選択され、
X1は、Q、N、A、H、およびIから選択され、
X2は、Q、A、P、およびSから選択され、
X3は、T、Y、S、およびQから選択され、
X4は、T、N、A、およびHから選択される。
式X1X2DX3TKX4のアミノ酸配列のペプチド挿入のさらなる実施形態では、ペプチド挿入は、QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、ASDSTKA、NQDYTKT(配列番号16)、HQDTTKN(配列番号19)、およびHPDTTKN(配列番号18)からなる群から選択される。
いくつかのそのような実施形態では、挿入ペプチドは、式IIbの7~11アミノ酸長のペプチドであり得、
Y1Y2X1X2DX3TKX4Y3
式中、Y1~Y3の各々は、存在する場合、独立して、Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、Proから選択され、
X1は、N、A、およびHから選択され、
X2は、Q、P、およびSから選択され、
X3は、T、Y、およびSから選択され、
X4は、T、N、およびAから選択される。
式X1X2DX3TKX4のアミノ酸配列のペプチド挿入のさらなる実施形態では、ペプチド挿入は、ASDSTKA、NQDYTKT(配列番号16)、HQDTTKN(配列番号19)、およびHPDTTKN(配列番号18)からなる群から選択される。
他の実施形態では、挿入ペプチドは、KDRAPST(配列番号26)、TNRTSPD(配列番号24)、PNSTHGS(配列番号25)、およびGKSKVID(配列番号23)から選択されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、挿入ペプチドは、ASDSTKA(配列番号15)、QANANEN(配列番号22)、QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、NQDYTKT(配列番号16)、HDITKNI(配列番号17)、HPDTTKN(配列番号18)、HQDTTKN(配列番号19)、NKTTNKD(配列番号20)、ISNENEH(配列番号21)、GKSKVID(配列番号23)、TNRTSPD(配列番号24)、PNSTHGS(配列番号25)、およびKDRAPST(配列番号26)から選択されるアミノ酸配列を含む。
他の好ましい実施形態では、挿入ペプチドは、QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、ASDSTKA(配列番号15)、NQDYTKT(配列番号16)、HDITKNI(配列番号17)、HPDTTKN(配列番号18)、HQDTTKN(配列番号19)、NKTTNKD(配列番号20)、ISNENEH(配列番号21)、QANANEN(配列番号22)、GKSKVID(配列番号23)、TNRTSPD(配列番号24)、PNSTHGS(配列番号25)、およびKDRAPST(配列番号26)から選択されるアミノ酸配列のアミノ末端および/またはカルボキシル末端に1~3個のスペーサーアミノ酸(Y1~Y3)を有する。ある特定のそのような実施形態では、挿入ペプチドは、LAQADTTKNA(配列番号27)、LAISDQTKHA(配列番号28)、LGISDQTKHA(配列番号29)、LAASDSTKAA(配列番号30)、LANQDYTKTA(配列番号31)、LAHDITKNIA(配列番号32)、LAHPDTTKNA(配列番号33)、LAHQDTTKNA(配列番号34)、LANKTTNKDA(配列番号35)、LPISNENEHA(配列番号36)、LPQANANENA(配列番号37)、LAGKSKVIDA(配列番号38)、LATNRTSPDA(配列番号39)、LAPNSTHGSA(配列番号40)、およびLAKDRAPSTA(配列番号41)からなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、主題の変異AAVキャプシドタンパク質は、GHループまたはループIVにおける約5アミノ酸~約20アミノ酸のペプチド挿入以外、いずれの他のアミノ酸配列修飾も含まない。例えば、いくつかの実施形態では、主題の変異AAVキャプシドタンパク質は、QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、ASDSTKA(配列番号15)、NQDYTKT(配列番号16)、HDITKNI(配列番号17)、HPDTTKN(配列番号18)、HQDTTKN(配列番号19)、NKTTNKD(配列番号20)、ISNENEH(配列番号21)、QANANEN(配列番号22)、GKSKVID(配列番号23)、TNRTSPD(配列番号24)、PNSTHGS(配列番号25)、KDRAPST(配列番号26)、LAQADTTKNA(配列番号27)、LAISDQTKHA(配列番号28)、LGISDQTKHA(配列番号29)、LAASDSTKAA(配列番号30)、LANQDYTKTA(配列番号31)、LAHDITKNIA(配列番号32)、LAHPDTTKNA(配列番号33)、LAHQDTTKNA(配列番号34)、LANKTTNKDA(配列番号35)、LPISNENEHA(配列番号36)、LPQANANENA(配列番号37)、LAGKSKVIDA(配列番号38)、LATNRTSPDA(配列番号39)、LAPNSTHGSA(配列番号40)、およびLAKDRAPSTA(配列番号41)からなる群から選択されるアミノ酸配列を含むペプチド挿入を含み、いずれの他のアミノ酸置換、挿入、または欠失も含まない(すなわち、変異AAVキャプシドタンパク質は、該挿入部を含み、他の点では対応するAAVキャプシドタンパク質と同一である)。換言すれば、該挿入を含む変異AAVキャプシドタンパク質は、他の点では、ペプチドが挿入された親AAVキャプシドタンパク質と同一である。別の例として、主題の変異AAVキャプシドタンパク質は、QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、ASDSTKA(配列番号15)、NQDYTKT(配列番号16)、HDITKNI(配列番号17)、HPDTTKN(配列番号18)、HQDTTKN(配列番号19)、NKTTNKD(配列番号20)、ISNENEH(配列番号21)、QANANEN(配列番号22)、GKSKVID(配列番号23)、TNRTSPD(配列番号24)、PNSTHGS(配列番号25)、KDRAPST(配列番号26)、LAQADTTKNA(配列番号27)、LAISDQTKHA(配列番号28)、LGISDQTKHA(配列番号29)、LAASDSTKAA(配列番号30)、LANQDYTKTA(配列番号31)、LAHDITKNIA(配列番号32)、LAHPDTTKNA(配列番号33)、LAHQDTTKNA(配列番号34)、LANKTTNKDA(配列番号35)、LPISNENEHA(配列番号36)、LPQANANENA(配列番号37)、LAGKSKVIDA(配列番号38)、LATNRTSPDA(配列番号39)、LAPNSTHGSA(配列番号40)、およびLAKDRAPSTA(配列番号41)から選択されるアミノ酸配列を有するペプチド挿入を含み、ペプチド挿入は、AAV2キャプシドのVP1のアミノ酸587と588との間または別の親AAVのVP1の対応するアミノ酸間、例えば、AAV1、AAV3A、AAV3B、AAV6、またはAAV9のVP1のアミノ酸588と589との間、AAV4のVP1のアミノ酸586と587との間、AAV5のVP1のアミノ酸577と578との間、AAV7のVP1のアミノ酸589と590との間、AAV8またはAAV10のVP1のアミノ酸590と591との間などに位置し、変異AAVキャプシドタンパク質配列は、他の点では、対応する親AAVキャプシドタンパク質配列、例えば、配列番号1~12のうちのいずれかと同一である。
他の実施形態では、本明細書に開示されているかまたは当該技術分野で既知であるように、ペプチド挿入をGHループに含むことに加えて、主題の変異AAVキャプシドタンパク質は、親AAVキャプシドタンパク質と比較して、約1~約100個のアミノ酸置換または欠失、例えば、1~約5、約2~約4、約2~約5、約5~約10、約10~約15、約15~約20、約20~約25、約25~50、約50~100個のアミノ酸置換または欠失を含む。したがって、いくつかの実施形態では、主題の変異キャプシドタンパク質は、対応する親AAVキャプシド、例えば、配列番号1~12に示される野生型キャプシドタンパク質に対して、85%以上、90%以上、95%以上、または98%以上、例えばまたは99%の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらなる実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換は、ペプチドの挿入前の付番により、AAV2 VP1キャプシドタンパク質のアミノ酸残基(複数可)1、15、34、57、66、81、101、109、144、164、176、188、196、226、236、240、250、312、363、368、449、456、463、472、484、524、535、551、593、698、708、719、721、および/もしくは735、または別のAAVキャプシドタンパク質の対応するアミノ酸残基(複数可)にある。いくつかのそのような実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換は、ペプチドの挿入前の付番により、AAV2 VP1キャプシドタンパク質のM1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、およびL735Q、または別のAAVキャプシドタンパク質の対応するアミノ酸残基(複数可)からなる群から選択される。
好ましい実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、ISDQTKH(配列番号14)、LGISDQTKHA(配列番号29)、およびLAISDQTKHA(配列番号28)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、1つ以上のアミノ酸置換は、M1L+L15P+P535S、P34A、P34A+S721L、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、Q164K+V708I、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、N312K、N312K+N449D+D472N+N551S+I698V+L735Q、P363L、R484C+V708I、T456K、およびV708Iからなる群から選択される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。
特に好ましい実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列ISDQTKH(配列番号14)を含むか、またはAAV2のVP1のアミノ酸587と588との間もしくは別のAAVキャプシドの対応するアミノ酸間のアミノ酸配列LAISDQTKHA(配列番号28)もしくはLGISDQTKHA(配列番号29)を含むか、本質的にそれらからなるか、もしくはそれらからなる、ペプチド挿入物を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)に対する残基34または別のAAVキャプシドの対応する残基にP34Aアミノ酸置換をさらに含む。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列または対応する親AAVキャプシドの全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。特に好ましい実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の特に好ましい実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列ISDQTKH(配列番号14)を含むか、またはAAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸587と588との間、もしくは別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列LAISDQTKHA(配列番号28)もしくはLGISDQTKHA(配列番号29)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、AAV2キャプシド(配列番号2)のアミノ酸配列と比較したN312Kアミノ酸置換、または別のAAV親血清型における対応する置換を含み、任意選択で、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したN449D、D472N、N551S、I698V、および/またはL735Qアミノ酸置換、または別のAAV親血清型における対応する置換をさらに含む。別の特に好ましい実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列ISDQTKH(配列番号14)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間、もしくは別のAAV血清型のキャプシドタンパク質における対応する位置のアミノ酸配列LAISDQTKHA(配列番号28)またはLGISDQTKHA(配列番号29)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれらからなる、ペプチド挿入物を含み、AAV2キャプシド(配列番号2)のアミノ酸配列と比較した、N312K、N449D、D472N、N551S、I698V、およびL735Qアミノ酸置換、または別のAAV親血清型の対応する残基における置換を含む。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。特に好ましい実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の実施形態では、a)AAV1、AAV3A、AAV3B、AAV6、またはAAV9のVP1のアミノ酸588と589、AAV4のアミノ酸586と587、AAV5のアミノ酸577と578、AAV7のアミノ酸589と590、またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸590と591との間に位置し、ISDQTKH(配列番号14)、LGISDQTKHA(配列番号29)、およびLAISDQTKHA(配列番号28)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV3AまたはAAV3Bのアミノ酸709におけるバリンからイソロイシンへの置換、AAV1またはAAV6の709位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、AAV4のアミノ酸707またはAAV9のアミノ酸709におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはAAV7のアミノ酸710またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸711におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはAAV5のアミノ酸697におけるグルタミンからイソロイシンへの置換とを含み、任意選択で、他の点では、配列番号1および3~12のうちのいずれか1つと同一である、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、a)アミノ酸配列ISDQTKH(配列番号14)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LAISDQTKHA(配列番号28)もしくはLGISDQTKHA(配列番号29)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物と、b)AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸708におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドタンパク質は、2~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、a)アミノ酸配列ISDQTKH(配列番号14)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LAISDQTKHA(配列番号28)もしくはLGISDQTKHA(配列番号29)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物と、b)AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸708におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換とを含み、他の点では、配列番号2のアミノ酸配列と同一である。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、a)アミノ酸配列ISDQTKH(配列番号14)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LAISDQTKHA(配列番号28)もしくはLGISDQTKHA(配列番号29)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物を含み、他の点では、配列番号2のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
好ましい実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、QADTTKN(配列番号13)およびLAQADTTKNA(配列番号27)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせ(好ましくはS109T、P250S、A524T、A593E、I698V、V708I、および/もしくはV719Mから選択される)のうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。ペプチド挿入部位は、好ましくは、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。特に好ましい実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列QADTTKN(配列番号13)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間、もしくは別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列LAQADTTKNA(配列番号27)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したI698Vアミノ酸置換、または別のAAV親血清型における対応する置換を含み、置換されたアミノ酸(複数可)は対応する位置において天然に存在しない。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、対応するアミノ酸置換は、AAV3A、AAV3B、またはAAV9キャプシドのアミノ酸配列と比較したI699Vアミノ酸置換、AAV5キャプシドのアミノ酸配列と比較したI687V置換、AAV7のアミノ酸配列と比較したI700V置換、AAV8またはAAV10のアミノ酸配列と比較したI701V置換である。特に好ましい実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
他の好ましい実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列QADTTKN(配列番号13)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間、もしくは別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列LAQADTTKNA(配列番号27)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、AAV2のアミノ酸配列と比較したV719Mアミノ酸置換および任意選択のV708I置換、または別のAAV親血清型における対応する置換を含み、置換されたアミノ酸(複数可)は対応する位置において天然に存在しない。
別の実施形態では、a)AAV1、AAV3A、AAV3B、AAV6、またはAAV9のVP1のアミノ酸588と589、AAV4のアミノ酸586と587、AAV5のアミノ酸577と578、AAV7のアミノ酸589と590、またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸590と591との間に位置し、QADTTKN(配列番号13)およびLAQADTTKNA(配列番号27)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV3AまたはAAV3Bのアミノ酸709におけるバリンからイソロイシンへの置換、AAV1またはAAV6の709位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、AAV4のアミノ酸707またはAAV9のアミノ酸709におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはAAV7のアミノ酸710またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸711におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはAAV5のアミノ酸697におけるグルタミンからイソロイシンへの置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。別の実施形態では、a)AAV1、AAV3A、AAV3B、AAV6、またはAAV9のVP1のアミノ酸588と589、AAV4のアミノ酸586と587、AAV5のアミノ酸577と578、AAV7のアミノ酸589と590、またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸590と591との間に位置し、QADTTKN(配列番号13)およびLAQADTTKNA(配列番号27)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV1、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV7、AAV8、AAV9、もしくはAAV10のアミノ酸配列と比較して109位における、またはAAV5もしくはAAV6のアミノ酸配列と比較して108位におけるセリンからトレオニンへのアミノ酸置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましい実施形態では、変異AAVキャプシド質は、アミノ酸配列QADTTKN(配列番号13)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LAQADTTKNA(配列番号27)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入物を含み、b)AAV2のアミノ酸配列と比較した、アミノ酸109におけるセリンからトレオニンへの置換(S109T)またはアミノ酸708におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換(V708I)を含み、変異キャプシドタンパク質は、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含み、好ましくは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上アミノ酸配列同一性である。他の好ましい実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列QADTTKN(配列番号13)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間、もしくは別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置のアミノ酸配列LAQADTTKNA(配列番号27)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸109でのセリンからトレオニンへの置換およびアミノ酸708でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含む。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、アミノ酸配列QADTTKN(配列番号13)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LAQADTTKNA(配列番号27)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、b)少なくとも1つのアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドのアミノ酸配列は、AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸708でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含まず、AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸109でのセリンからトレオニンへの置換を含まない。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列QADTTKN(配列番号13)を含むか、またはアミノ酸配列LAQADTTKNA(配列番号27)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2のアミノ酸配列と同一である。
別の好ましい実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、HDITKNI(配列番号17)、IAHDITKNIA(配列番号60)、およびLAHDITKNIA(配列番号32)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、R389S、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換と、を含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、AAVキャプシドタンパク質は、S109T、R389S、A593E、および/またはV708Iから選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。好ましい一実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列HDITKNI(配列番号17)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列IAHDITKNIA(配列番号60)またはLAHDITKNIA(配列番号32)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したS109Tアミノ酸置換、または別のAAV親血清型における対応する置換を含む。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列HDITKNI(配列番号17)を含むか、またはアミノ酸配列IAHDITKNIA(配列番号60)もしくはLAHDITKNIA(配列番号32)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
他の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LAHDITKNIAを含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入と、b)少なくとも1つのアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドのアミノ酸配列は、AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸708でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含まない。さらに他の実施形態では、変異キャプシドは、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列DITKNIA(配列番号61)を含むか、またはアミノ酸配列IAHDITKNIA(配列番号60)もしくはLAHDITKNIA(配列番号32)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列と比較したV708Iとを含む。他の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LAHDITKNIA(配列番号32)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入と、b)2つ以上のアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドのアミノ酸配列は、AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸708でのバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換を含む。
別の好ましい実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、NQDYTKT(配列番号16)およびLANQDYTKTA(配列番号31)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。いくつかの実施形態では、AAVキャプシドタンパク質は、S109T、S109T+S463Y、D368H、およびV708Iから選択される1つ以上のアミノ酸置換を含む。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。好ましい一実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列NQDYTKT(配列番号16)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LANQDYTKTA(配列番号31)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したV708Iアミノ酸置換、または別のAAV親血清型における対応する置換を含む。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列NQDYTKT(配列番号16)を含むか、またはアミノ酸配列LANQDYTKTA(配列番号31)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
他の実施形態では、変異キャプシドは、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列NQDYTKT(配列番号16)を含むか、またはアミノ酸配列LANQDYTKTA(配列番号31)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、b)配列番号2の配列と比較したS109Tアミノ酸置換、および任意選択のS463Yアミノ酸置換とを含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長と、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%同一である。関連する実施形態では、変異キャプシドは、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列NQDYTKT(配列番号16)を含むか、またはアミノ酸配列LANQDYTKTA(配列番号31)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入と、b)配列番号2のアミノ酸配列と比較したS109Tアミノ酸置換とを含み、他の点では、配列番号2のアミノ酸配列と同一である。
別の実施形態では、a)AAV1、AAV3A、AAV3B、AAV6、またはAAV9のVP1のアミノ酸588と589、AAV4のアミノ酸586と587、AAV5のアミノ酸577と578、AAV7のアミノ酸589と590、またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸590と591との間に位置し、NQDYTKT(配列番号16)およびLANQDYTKTA(配列番号31)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV1またはAAV6のアミノ酸配列と比較した313位もしくはAAV9のアミノ酸配列と比較した314位におけるアスパラギンからリジンへのアミノ酸置換、あるいはAAV3AもしくはAAV3Bの312位またはAAV8もしくはAAV10の315位におけるセリンからリジンへの置換、あるいはAAV4もしくはAAV5の303位またはAAV7の314位におけるアルギニンからリジンへの置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、a)NQDYTKT(配列番号16)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LANQDYTKTA(配列番号31)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入物と、b)N312Kアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドタンパク質は、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。
別の実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、PNSTHGS(配列番号25)およびLAPNSTHGSA(配列番号40)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。好ましい一実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列PNSTHGS(配列番号25)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LAPNSTHGSA(配列番号40)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したV708Iアミノ酸置換、または別のAAV親血清型における対応する置換を含む。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列PNSTHGS(配列番号25)を含むか、またはアミノ酸配列LAPNSTHGSA(配列番号40)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の好ましい実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、NKTTNKDA(配列番号62)およびLANKTTNKDA(配列番号35)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。好ましい一実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列NKTTNKDA(配列番号62)を含むか、またはAAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LANKTTNKDA(配列番号35)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したN449Dアミノ酸置換、または別のAAV親血清型における対応する置換を含む。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列NKTTNKDA(配列番号62)を含むか、またはアミノ酸配列LANKTTNKDA(配列番号35)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、TNRTSPD(配列番号24)およびLATNRTSPDA(配列番号39)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。関連する実施形態では、a)AAV1、AAV3A、AAV3B、AAV6、またはAAV9のVP1のアミノ酸588と589、AAV4のアミノ酸586と587、AAV5のアミノ酸577と578、AAV7のアミノ酸589と590、またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸590と591との間に位置し、TNRTSPD(配列番号24)およびLATNRTSPDA(配列番号39)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV3AまたはAAV3Bのアミノ酸709におけるバリンからイソロイシンへの置換、AAV1またはAAV6の709位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、AAV4のアミノ酸707またはAAV9のアミノ酸709におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはAAV7のアミノ酸710またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸711におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはAAV5のアミノ酸697におけるグルタミンからイソロイシンへの置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LATNRTSPDA(配列番号39)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入物と、b)AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸708におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換とを含み、変異キャプシドタンパク質は、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列TNRTSPD(配列番号24)を含むペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸708におけるバリンからイソロイシンへのアミノ酸置換とを含む。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。
さらに別の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列TNRTSPD(配列番号24)を含むか、またはアミノ酸配列LATNRTSPDA(配列番号39)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2のアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、GKSKVID(配列番号23)およびLAGKSKVIDA(配列番号38)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、アミノ酸配列GKSKVID(配列番号23)を含むか、またはアミノ酸配列LAGKSKVIDA(配列番号38)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に位置するペプチド挿入を含み、他の点では配列番号2のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異AAVキャプシドは、a)AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間のアミノ酸配列LAGKSKVIDA(配列番号38)を含むか、本質的にそれからなるか、またはそれからなる、ペプチド挿入物を含み、かつ少なくとも1つのアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、ASDSTKA(配列番号15)およびLAASDSTKAA(配列番号30)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列ASDSTKA(配列番号15)を含むか、またはアミノ酸配列LAASDSTKAA(配列番号30)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、KDRAPST(配列番号26)およびLAKDRAPTSA(配列番号41)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列KDRAPST(配列番号26)を含むか、またはアミノ酸配列LAKDRAPTSA(配列番号41)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、HQDTTKN(配列番号19)およびLAHQDTTKNA(配列番号34)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置のうちの1つ以上において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列HQDTTKN(配列番号19)を含むか、またはアミノ酸配列LAHQDTTKNA(配列番号34)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、ISNENEH(配列番号21)およびLPISNENEHA(配列番号36)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置のうちの1つ以上において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列ISNENEH(配列番号21)を含むか、またはアミノ酸配列LPISNENEHA(配列番号36)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、QANANEN(配列番号22)およびLPQANANENA(配列番号37)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列QANANEN(配列番号22)を含むか、またはアミノ酸配列LPQANANENA(配列番号37)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
別の実施形態では、a)キャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入であって、HPDTTKN(配列番号18)およびLAHPDTTKNA(配列番号33)から選択されるアミノ酸配列を含む、ペプチド挿入と、b)AAV2のアミノ酸配列(配列番号2)と比較して、以下のアミノ酸置換:M1L、L15P、P34A、N57D、N66K、R81Q、Q101R、S109T、R144K、R144M、Q164K、T176P、L188I、S196Y、G226E、G236V、I240T、P250S、N312K、P363L、D368H、N449D、T456K、S463Y、D472N、R484C、A524T、P535S、N551S、A593E、I698V、V708I、V719M、S721L、L735Q、およびそれらの組み合わせのうちの1つ以上、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)における対応する置換であって、置換されたアミノ酸(複数可)が対応する位置において天然に存在しない、置換とを含む、変異AAVキャプシドタンパク質が提供される。好ましくは、ペプチド挿入部位は、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質の対応する位置に位置する。変異AAVキャプシドは、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%以上のアミノ酸配列同一性を有し得る。さらに別の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2キャプシドのアミノ酸587と588との間に、アミノ酸配列HPDTTKN(配列番号18)を含むか、またはアミノ酸配列LAHPDTTKNA(配列番号33)を含むか、本質的にそれからなるか、もしくはそれからなる、ペプチド挿入を含み、他の点では、配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、以下のアミノ酸配列に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%の配列同一性を有するか、またはそれと100%同一である:
いくつかの態様では、対応する親AAVキャプシドタンパク質に対して1つ以上のアミノ酸置換を含む変異AAVキャプシドタンパク質が提供され、本変異キャプシドタンパク質は、AAVビリオン中に存在する場合に、対応する親AAVキャプシドタンパク質を含むAAVビリオンによる網膜細胞の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。
いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したP34Aアミノ酸置換、またはAAV5キャプシドのアミノ酸配列(配列番号6)と比較したP33Aアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2または配列番号6に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、それぞれAAV2またはAAV5キャプシドのアミノ酸配列と比較したP34AまたはP33Aアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列と比較したP34Aアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2のアミノ酸配列と比較したP34Aアミノ酸置換を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるAAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸164、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸164におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、rAAVビリオンは、AAV1、AAV2、もしくはAAV6のアミノ酸配列と比較したアミノ酸164、またはAAV7、AAV8、もしくはAAV10のアミノ酸配列と比較したアミノ酸165におけるグルタミンからリジンへのアミノ酸置換を含むか、あるいはAAV5のアミノ酸160におけるセリンからリジンへの置換を含むか、あるいはAAV9のアミノ酸164におけるアラニンからリジンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸164におけるアミノ酸置換(例えば、Q164K)を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるAAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列と比較したQ164Kアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したQ164KおよびV708Iアミノ酸置換、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)中の対応する置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性である。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸698、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸698におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、rAAVビリオンは、AAV2のアミノ酸配列と比較したアミノ酸698、またはAAV3A、AAV3B、もしくはAAV9のアミノ酸配列と比較したアミノ酸699、またはAAV5のアミノ酸687、またはAAV7のアミノ酸700、またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸701における、イソロイシンからバリンへのアミノ酸置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸699におけるアミノ酸置換(例えば、I698V)を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるAAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列と比較したI698Vアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸109、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)の対応する位置におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸109におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV1、AAV3A、AAV3B、AAV4、AAV7、AAV8、AAV9、もしくはAAV10のアミノ酸配列と比較した109位、またはAAV5もしくはAAV6のアミノ酸配列と比較した108位における、セリンからトレオニンへのアミノ酸置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、アミノ酸配列AAV2と比較したS109Tアミノ酸置換を含み、変異キャプシドタンパク質は、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。他の関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2のアミノ酸配列と比較したS109Tアミノ酸置換およびA593Eアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したS109TおよびA493Vならびに任意選択のA593Eおよび/もしくはV708Iアミノ酸置換、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)中の対応する置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有する。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したS109T、A493V、A593E、およびV708Iアミノ酸置換、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)中の対応する置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性である。他の好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したS109TおよびV708Iアミノ酸置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有し、他の点では、配列番号2のアミノ酸配列と同一である。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸593、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)の対応する位置におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸593におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV1、AAV3A、AAV6、もしくはAAV9のアミノ酸配列と比較したアミノ酸594、またはAAV5のアミノ酸583、またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸596におけるグリシンからグルタミン酸塩へのアミノ酸置換、あるいはAAV3Bのアミノ酸594におけるアルギニンからグルタミン酸塩へのアミノ酸置換、あるいはAAV4のアミノ酸592におけるアスパラギン酸塩からグルタミン酸塩へのアミノ酸置換、あるいはAAV7の595位におけるグルタミンからグルタミン酸塩へのアミノ酸置換を含む。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2のアミノ酸配列と比較したA593Eアミノ酸置換を含み、AAV2のアミノ酸配列と比較した以下のアミノ酸置換のうちの1つ以上を含まない:I19V、V369A、K26R、N215D、G355S、V46A、およびS196P。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2のアミノ酸配列と比較したA593EおよびN596Dアミノ酸置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の同一性を有する。他の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2のアミノ酸配列と比較したA593EおよびN596Dアミノ酸置換を含み、他の点では、AAV2のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2のアミノ酸配列と比較したA593EおよびV708Iアミノ酸置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%の同一性を有する。他の実施形態では、変異キャプシドは、AAV2のアミノ酸配列と比較したA593EおよびV708Iアミノ酸置換を含み、他の点では、AAV2のアミノ酸配列と同一である。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸708、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。好ましくは、rAAVビリオンは、AAV2と比較したアミノ酸250、または別のAAV親血清型中の対応するアミノ酸におけるプロリンからセリンへの置換を含まない。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸708におけるアミノ酸置換を含む。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したアミノ酸708におけるバリンからイソロイシン(V708I)への置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号2のアミノ酸配列と同一であり、P250Sアミノ酸置換を含まない。いくつかの実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV3AまたはAAV3Bのアミノ酸709におけるバリンからイソロイシンへの置換、AAV1またはAAV6の709位におけるアラニンからイソロイシンへの置換、AAV4のアミノ酸707またはAAV9のアミノ酸709におけるアスパラギンからイソロイシンへの置換、あるいはAAV7のアミノ酸710またはAAV8もしくはAAV10のアミノ酸711におけるトレオニンからイソロイシンへの置換、あるいはAAV5のアミノ酸697におけるグルタミンからイソロイシンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2のアミノ酸配列と比較したV708Iアミノ酸置換を含み、変異キャプシドタンパク質は、2~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含み、P250Sアミノ酸置換を含まない。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、V708Iアミノ酸置換を含み、またAAV2のアミノ酸配列と比較したA593Eおよび/またはS109Tアミノ酸置換も含む。他の関連する実施形態では、変異キャプシドは、AAV2のアミノ酸配列と比較したV708IおよびA593Eアミノ酸置換を含み、他の点では、AAV2のアミノ酸配列と同一である。他の関連する実施形態では、変異キャプシドは、AAV2のアミノ酸配列と比較したV708IおよびS109Tアミノ酸置換を含み、他の点では、AAV2のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したV708IおよびV719Mアミノ酸置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号2のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したV708IおよびR733Cアミノ酸置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号2のアミノ酸配列と同一である。他の実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列と比較したV708IおよびG727Dアミノ酸置換を含み、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するか、あるいは配列番号2のアミノ酸配列と同一である。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸196、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在せず、任意選択で、プロリン以外である。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸196におけるアミノ酸置換を含み、任意選択で、S196P置換以外である。好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2もしくはAAV9のアミノ酸196、またはAAV7、AAV8、もしくはAAV10のアミノ酸197、またはAAV5のアミノ酸186におけるセリンからチロシンへのアミノ酸置換、あるいはAAV1またはAAV6のアミノ酸196におけるアラニンからチロシンへの置換、あるいはAAV4のアミノ酸191におけるメチオニンからチロシンへの置換、あるいはAAV3AまたはAAV3Bのアミノ酸196におけるトレオニンからチロシンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列と比較したS196Yアミノ酸置換を含むアミノ酸配列を含み、他の点では配列番号2に示されるアミノ酸配列と同一である。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したS196P置換以外のアミノ酸196におけるアミノ酸置換を含み(例えば、S196Y置換を含み)、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるAAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸175、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸175におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、変異キャプシドは、配列番号2に示されるAAV2のアミノ酸配列と比較したQ175Hアミノ酸置換、または別のAAV親血清型の対応する位置におけるグルタミンからヒスチジンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸175におけるアミノ酸置換(例えば、Q175H)を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるAAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸64、または別のAAV親血清型(すなわち、AAV2以外)の対応する位置におけるアミノ酸置換を含み、置換されたアミノ酸は対応する位置において天然に存在しない。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸64におけるアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、rAAVビリオンは、配列番号2に示されるAAV2のアミノ酸配列と比較したP64Sアミノ酸置換、または別のAAV親血清型の対応する位置におけるプロリンからセリンへの置換を含む。関連する実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、AAV2キャプシドのアミノ酸配列(配列番号2)と比較したアミノ酸64におけるアミノ酸置換(例えば、P64S)を含み、変異キャプシドタンパク質は、配列番号2に示されるAAV2キャプシドタンパク質のアミノ酸配列と比較した、1~5個、5~10個、または10~15個のアミノ酸置換を含む。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、配列番号1、2、3、4、5、6、7、8、10、11、および12からなる群から選択される野生型AAVキャプシド配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含み、かつi)P34A、S109T+V708I、A593E+N596D、V708I+V719M、V708I+G727D、S109T+A493V+A593E+V708I、V708I+R733C、Q164K、およびI698Vからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換、ならびに/または(ii)QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、ASDSTKA(配列番号15)、NQDYTKT(配列番号16)、HDITKNI(配列番号17))、PQANANEN(配列番号63)、TNRTSPD(配列番号24)、PNSTHGS(配列番号25)、KDRAPST(配列番号26)、HQDTTKN(配列番号19)、HPDTTKN(配列番号18)、NKTTNKD(配列番号20)、GKSKVID(配列番号23)、PISNENEH(配列番号64)、LAQADTTKNA(配列番号27)、LAISDQTKHA(配列番号28)、LGISDQTKHA(配列番号29)、LAASDSTKAA(配列番号30)、LAHDITKNIA(配列番号32)、LPQANANENA(配列番号37)、LANQDYTKTA(配列番号31)、LATNRTSPDA(配列番号39)、LAPNSTHGSA(配列番号40)、LAKDRAPSTA(配列番号41)、LAHQDTTKNA(配列番号34)、LAHPDTTKNA(配列番号33)、LANKTTNKDA(配列番号35)、LAGKSKVIDA(配列番号38)、およびLPISNENEHA(配列番号36)からなる群から選択されるペプチド挿入も含む。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、特定の1つ以上のアミノ酸置換および/またはペプチド挿入を含み、他の点では配列番号1~12からなる群から選択される配列と同一である。
いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、祖先キャプシドタンパク質である。先祖キャプシドタンパク質は、今日天然に見出されるキャプシドタンパク質の進化的祖先、例えば、今日天然に見出されるAAVキャプシドタンパク質間の縮重の位置におけるランダムなアミノ酸置換によってインシリコで生成される、AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10、AAV11、AAV12、AAV13を意味する。祖先キャプシドの1つの非限定的な例が以下に提供され、縮重の位置(残基264、266、268、448、459、460、467、470、471、474、495、516、533、547、551、555、557、561、563、577、583、593、596、661、662、664、665、710、717、718、719、723)が「X」としてマークされる:
いくつかの実施形態では、祖先キャプシドタンパク質は、配列番号58に示されるアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、祖先キャプシドタンパク質は、例えば配列番号2に示されるAAV2のアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、祖先キャプシドタンパク質は、配列番号58または配列番号2に開示される祖先配列のアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を含み、264のアラニン(A)、266のアラニン(A)、268のセリン(S)、448のアラニン(A)、459のトレオニン(T)、460のアルギニン(R)、467のアラニン(A)、470のセリン(S)、471のアスパラギン(N)、474のアラニン(A)、495のセリン(S)、516のアスパラギン(D)、533のアスパラギン(D)、547のグルタミン(Q)、551のアラニン(A)、555のアラニネト(Alaninet)(A)、557のグルタミン酸(E)、561のメチオニン(M)、563のセリン(S)、577のグルタミン(Q)、583のセリン(S)、593のバリン(V)、596のトレオニン(T)、661のアラニン(A)、662のバリン(V)、664のトレオニン(T)、665のプロリン(P)、710のトレオニン(T)、717のアスパラギン酸(D)、718のアスパラギン(N)、719のグルタミン酸(E)、および723のセリン(S)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基を含む。いくつかの好ましい実施形態では、変異キャプシドタンパク質は、以下のアミノ酸配列の全長に対して、少なくとも約85%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上、いくつかの事例では、100%のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸を含み、264のアラニン(A)、266のアラニン(A)、268のセリン(S)、448のアラニン(A)、459のトレオニン(T)、460のアルギニン(R)、467のアラニン(A)、470のセリン(S)、471のアスパラギン(N)、474のアラニン(A)、495のセリン(S)、516のアスパラギン(D)、533のアスパラギン(D)、547のグルタミン(Q)、551のアラニン(A)、555のアラニン(A)、557のグルタミン酸(E)、561のメチオニン(M)、563のセリン(S)、577のグルタミン(Q)、583のセリン(S)、593のバリン(V)、596のトレオニン(T)、661のアラニン(A)、662のバリン(V)、664のトレオニン(T)、665のプロリン(P)、710のトレオニン(T)、717のアスパラギン酸(D)、718のアスパラギン(N)、719のグルタミン酸(E)、および723のセリン(S)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基を含む。
他の実施形態では、変異AAVキャプシドタンパク質は、配列番号58として本明細書に開示される先祖変異体からなる群から選択される野生型AAVキャプシド配列と少なくとも85%、少なくとも90%、少なくとも95%、または少なくとも98%同一のアミノ酸配列を含み、264のアラニン(A)、266のアラニン(A)、268のセリン(S)、448のアラニン(A)、459のトレオニン(T)、460のアルギニン(R)、467のアラニン(A)、470のセリン(S)、471のアスパラギン(N)、474のアラニン(A)、495のセリン(S)、516のアスパラギン(D)、533のアスパラギン(D)、547のグルタミン(Q)、551のアラニン(A)、555のアラニン(A)、557のグルタミン酸(E)、561のメチオニン(M)、563のセリン(S)、577のグルタミン(Q)、583のセリン(S)、593のバリン(V)、596のトレオニン(T)、661のアラニン(A)、662のバリン(V)、664のトレオニン(T)、665のプロリン(P)、710のトレオニン(T)、717のアスパラギン酸(D)、718のアスパラギン(N)、719のグルタミン酸(E)、および723のセリン(S)からなる群から選択される1つ以上のアミノ酸残基を含み、かつi)P34A、S109T+V708I、A593E+N596D、V708I+V719M、V708I+G727D、S109T+A493V+A593E+V708I、V708I+R733C、Q164K、およびI698Vからなる群から選択される1つ以上のアミノ酸置換、ならびに/または(ii)QADTTKN(配列番号13)、ISDQTKH(配列番号14)、ASDSTKA(配列番号15)、NQDYTKT(配列番号16)、HDITKNI(配列番号17)、PQANANEN(配列番号63)、TNRTSPD(配列番号24)、PNSTHGS(配列番号25)、KDRAPST(配列番号26)、HQDTTKN(配列番号19)、HPDTTKN(配列番号18)、NKTTNKD(配列番号20)、GKSKVID(配列番号23)、PISNENEH(配列番号64)、LAQADTTKNA(配列番号27)、LAISDQTKHA(配列番号28)、LGISDQTKHA(配列番号29)、LAASDSTKAA(配列番号30)、LAHDITKNIA(配列番号32)、LPQANANENA(配列番号37)、LANQDYTKTA(配列番号31)、LATNRTSPDA(配列番号39)、LAPNSTHGSA(配列番号40)、LAKDRAPSTA(配列番号41)、LAHQDTTKNA(配列番号34)、LAHPDTTKNA(配列番号33)、LANKTTNKDA(配列番号35)、LAGKSKVIDA(配列番号38)、およびLPISNENEHA(配列番号36)からなる群から選択されるペプチド挿入も含む。いくつかの実施形態では、変異AAVキャプシドは、特定の1つ以上のアミノ酸置換および/またはペプチド挿入を含み、他の点では配列番号59と同一である。
本明細書に開示されるAAV変異体は、硝子体内投与後の霊長類網膜スクリーンの使用を伴う、インビボの定向進化の使用によって生成された。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、AAVビリオンに存在する場合、対応する親AAVキャプシドタンパク質または野生型AAVを含むAAVビリオンによる網膜細胞の形質導入と比較して、網膜細胞の形質導入の増加を付与する。例えば、いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、AAVビリオンに存在する場合、対応する親AAVキャプシドタンパク質または野生型AAVキャプシドタンパク質を含むAAVビリオンよりも効率的な霊長類網膜細胞の形質導入を付与し、例えば、網膜細胞は、親AAVキャプシドタンパク質または野生型AAVを含むAAVビリオンよりも多い、主題の変異AAVキャプシドタンパク質を含むAAVビリオンを取り込む。いくつかのそのような実施形態では、AAV変異ビリオンまたは変異rAAVは、対応する親AAVキャプシドタンパク質を含む野生型AAVビリオンまたはrAAVによる網膜細胞の形質導入と比較して、少なくとも2倍、少なくとも5倍、少なくとも10倍、少なくとも15倍、少なくとも20倍、少なくとも25倍、少なくとも50倍、または50倍超増加した網膜細胞の形質導入を示す。ある特定のそのような実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、AAVビリオンに存在する場合、対応する親AAVキャプシドタンパク質または野生型AAVキャプシドタンパク質を含むAAVビリオンよりも広範な霊長類網膜細胞の形質導入を付与する。換言すれば、変異AAVビリオンは、対応する親AAVキャプシドタンパク質を含むビリオンによって形質導入されない細胞型、したがって、対応する親AAVビリオンよりも網膜内のより多くの細胞型を形質導入する。いくつかの実施形態では、AAV変異ビリオンは、網膜細胞を優先的に形質導入し、例えば、主題のrAAVビリオンは、網膜細胞を、別の網膜細胞または非網膜細胞、例えば、眼の外側の細胞と比較して、2倍、5倍、10倍、15倍、20倍、25倍、50倍、または50倍超の特異性で感染させる。いくつかの実施形態では、形質導入された網膜細胞は、光受容細胞(例えば、桿体、錐体)である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、網膜神経節細胞(RGC)である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、網膜上皮細胞(RPE細胞)である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ミュラーグリア細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、ミクログリア細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、アマクリン細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、双極細胞である。いくつかの実施形態では、網膜細胞は、水平細胞である。網膜細胞の形質導入の増加、例えば、形質導入の効率の増加、より広範な形質導入、より優先的な形質導入などは、遺伝子発現を測定するための当該技術分野における任意の数の方法によってインビトロまたはインビボで容易に評価され得る。例えば、AAVは、普遍的または組織特異的プロモーターの制御下で、レポーター遺伝子、例えば、蛍光タンパク質を含む発現カセットを含むゲノムとともにパッケージングされてもよく、形質導入の程度は、例えば、蛍光顕微鏡法によって蛍光タンパク質を検出することによって評価される。別の例として、AAVは、バーコード核酸配列を含むゲノムとともにパッケージングされてもよく、形質導入の程度は、例えば、PCRによって核酸配列を検出することによって評価される。別の例として、AAVは、網膜疾患の治療のための治療遺伝子を含む発現カセットを含むゲノムとともにパッケージングされてもよく、形質導入の程度は、AAVを投与した罹患患者における網膜疾患の治療を検出することによって評価される。
本明細書に開示される変異rAAVベクターもしくはビリオンおよび/または方法を使用して治療することができる眼疾患には、単一遺伝子疾患、複雑な遺伝性疾患、後天性疾患、および外傷性損傷が含まれるが、これらに限定されない。単一遺伝子疾患の例には、バルデー・ビードル症候群;バッテン病;ビエッティ結晶状ジストロフィー;全脈絡膜萎縮;網脈絡膜萎縮;網脈絡膜変性;錐体または錐体桿体ジストロフィー(常染色体優性、常染色体劣性、およびX連鎖);先天性停止性夜盲(常染色体優性、常染色体劣性、およびX連鎖);色覚異常(ACHM2、ACHM3、ACHM4、およびACHM5を含む)、第一色覚異常、第二色覚異常、および第三色覚異常を含む色覚の障害;フリードライヒ運動失調症;LCA1、LCA2、LCA3、LCA4、LCA6、LCA7、LCA8、LCA12、およびLCA15を非限定的に含む、レーバー先天性黒内障(常染色体優性および常染色体劣性);レーバー遺伝性視神経症;急性黄斑変性、ベスト卵黄様黄斑変性、パターンジストロフィー、ノースカロライナ黄斑変性、遺伝性ドルーゼン、ソースビー眼底変性、マラッティア・レベンティネース(Malattia Levantanese)、および遺伝的に決定される未熟児網膜症を非限定的に含む、黄斑変性(常染色体優性および常染色体劣性);眼網膜発達障害;眼白子症;視神経萎縮(常染色体優性、常染色体劣性、およびX連鎖);網膜色素変性(常染色体優性、常染色体劣性、X連鎖、およびミトコンドリア遺伝性形質)(その例には、RP1、RP2、RP3、RP10、RP20、RP38、RP40、およびRP43;X連鎖網膜分離症が含まれる);シュタルガルト病;ならびにUSH1B、USH1C、USH1D、USH1F、USH1G、USH2A、USH2C、USH2D、およびUSH3を非限定的に含む、アッシャー症候群が含まれるが、これらに限定されない。複雑な遺伝性疾患の例には、緑内障(開放隅角、閉塞隅角、低眼圧、正常眼圧、先天性、血管新生、色素性、偽落屑);急性黄斑変性、卵黄様黄斑変性などの、滲出性および非滲出性(常染色体優性および常染色体劣性)両方の加齢性および他の形態の黄斑変性;未熟児網膜症;ならびにフォークト・小柳・原田(VKH)症候群が含まれるが、これらに限定されない。後天性疾患の例には、急性黄斑視神経網膜症;前部虚血性視神経症および後部虚血性視神経症;ベーチェット病;膜静脈分枝閉塞;脈絡膜血管新生;増殖性糖尿病性網膜症および関連する合併症を含む、糖尿病性網膜症;糖尿病性ぶどう膜炎;黄斑浮腫、類嚢胞黄斑浮腫、および糖尿病性黄斑浮腫などの浮腫;網膜上膜疾患;黄斑毛細血管拡張症;多巣性脈絡膜炎;非網膜症糖尿病性網膜機能障害;眼腫瘍;視神経萎縮;網膜剥離;網膜中心静脈閉塞、増殖性硝子体網膜症(PVR)、網膜動脈および静脈の閉塞性疾患、血管閉塞、ぶどう膜網膜疾患などの網膜障害;ぶどう膜滲出;網膜感染症および浸潤性疾患;後天性視神経萎縮などの視神経疾患が含まれるが、これらに限定されない。外傷性損傷の例には、ヒストプラスマ症;視神経外傷;後眼部位または位置に影響を及ぼす眼の外傷;網膜外傷;眼のウイルス感染;視神経のウイルス感染;眼科用レーザー治療によって引き起こされるか、またはその影響を受ける後眼病態;光線力学療法によって引き起こされるか、またはその影響を受ける後眼病態;光凝固、放射線網膜症;および交感性眼炎が含まれるが、これらに限定されない。
別の実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドは、遺伝子産物、例えば、非限定的に、干渉RNA、長鎖非コードRNA、短鎖非コードRNA、アンチセンスRNA、アプタマー、ポリペプチド、分泌型抗体、一本鎖抗体、VHHドメイン、可溶性受容体、アフィボディ、ノッチン、DARPin、センチュリン、シャペロン、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼ、または転写の遺伝子特異的活性化を提供する修飾された部位特異的ヌクレアーゼをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
本明細書に開示されるrAAV変異ビリオンは、遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、干渉RNAである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、長鎖非コードRNAである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、短鎖非コードRNAである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アンチセンスRNAである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アプタマーである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、分泌型抗体である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、一本鎖抗体である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、VHHドメインである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、可溶性受容体である。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、アフィボディである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、ノッチンである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、DARPinである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、センチュリンである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、シャペロンである。いくつかの実施形態では、遺伝子産物は、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的ヌクレアーゼである。
遺伝子産物の使用には、細胞内の因子のレベルの増強、因子の分泌による隣接細胞内の因子のレベルの増強、細胞内の因子のレベルの減少、または因子の分泌による隣接細胞内の因子のレベルの減少が含まれるが、これらに限定されない。遺伝子産物は、欠損遺伝子産物の欠損のレベルの補充、欠損遺伝子産物の欠損のレベルの減少、新たな支持遺伝子産物の導入、支持遺伝子産物のレベルの補充、妨害遺伝子産物のレベルの減少、または妨害遺伝子産物のレベルの減少および支持遺伝子産物のレベルの補充の両方を行うように設計され得る。
主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物を使用して、網膜疾患および外傷に直接的または間接的に関連する遺伝子産物または遺伝子産物活性のレベルを改変することができる。遺伝子産物が遺伝性疾患に直接または間接的に関連する遺伝子には、例えば、ADP-リボシル化因子様6(ARL6)、BBSome相互作用タンパク質1(BBIP1)、BBSomeタンパク質1(BBS1)、BBSomeタンパク質2(BBS2)、BBSomeタンパク質4(BBS4)、BBSomeタンパク質5(BBS5)、BBSomeタンパク質7(BBS7)、BBSomeタンパク質9(BBS9)、BBSomeタンパク質10(BBS10)、BBSomeタンパク質12(BBS12)、中心体タンパク質290kDa(CEP290)、鞭毛内輸送タンパク質172(IFT172)、鞭毛内輸送タンパク質27(IFT27)、イノシトールポリリン酸-5-ホスファターゼE(INPP5E)、内向き整流性カリウムチャネルサブファミリーJメンバー13(KCNJ13)、ロイシンジッパー転写因子様-1(LZTFL1)、マキュージック・カウフマン症候群タンパク質(MKKS)、メッケル症候群1型タンパク質(MKS1)、ネフロン癆3タンパク質(NPHP1)、血清学的に定義された結腸がん抗原8(SDCCAG8)、三要素モチーフ含有タンパク質32(TRIM32)、テトラトリコペプチド反復配列ドメイン8(TTC8)、バッテン病タンパク質(CLN3)、Rabエスコートタンパク質1(CHM)、(Prdm13)、(RGR、(TEAD1)、アリール炭化水素相互作用受容体タンパク質様1(aipl1);錐体杆体otx様光受容体ホメオボックス転写因子(CRX)、グアニル酸シクラーゼ活性化タンパク質1a(GUCA1A)、網膜特異的グアニル酸トシクラーゼ(GUCY2D)、ホスファチジルイノシトールトランスファー膜関連ファミリーメンバー3(PITPNM3)、プロミニン1(PROM1)、ペリフェリン(PRPH)、ペリフェリン2(PRPH2)、制御シナプス膜エキソサイトーシスタンパク質1(RIMS1)、セマホリン4A(SEMA4A)、C.elegans unc119タンパク質のヒト相同体(UNC119)、ATP結合カセット輸送体-網膜(ABCA4)、ADAMメタロペプチダーゼドメイン9(ADAM9)、活性化転写因子6(ATF6)、染色体21翻訳領域2(C21orf2)、染色体8翻訳領域37(C8orf37)、カルシウムチャネル、電圧依存性、アルファ2/デルタサブユニット4(CACNA2D4)、カドヘリン関連ファミリーメンバー1(プロトカドヘリン21)(CDHR1)、セラミドキナーゼ様タンパク質(CERKL)、錐体光受容体cGMPゲート付きカチオンチャネルアルファサブユニット(CNGA3)、錐体環状ヌクレオチドゲート付きカチオンチャネルベータ3サブユニット(CNGB3)、サイクリンM4(CNNM4)、グアニンヌクレオチド結合タンパク質(Gタンパク質)、アルファ形質導入活性ポリペプチド2(GNAT2)、カリウムチャネルサブファミリーVメンバー2(KCNV2)、ホスホジエステラーゼ6C(PDE6C)、ホスホジエステラーゼ6H(PDE6H))、中心子1中心子タンパク質Bのプロテオーム(POC1B)、RASがん遺伝子ファミリーのRAB28メンバー(RAB28)、網膜および前部神経折畳みホメオボックス2転写因子(RAX2)、11シスレチノールデヒドロゲナーゼ5(RDH5)、RP GTPアーゼ制御相互作用タンパク質1(RPGRIP1)、チューブリンチロシンリガーゼ様ファミリーメンバー5(TTLL5)、L型電圧ゲート付きカルシウムチャネルアルファ-1サブユニット(CACNA1F)、網膜色素変性GTPアーゼ制御因子(RPGR)、(GNAT1)、(PDE6B)、(RHO)、CABP4)、GPR179)、(GRK1)、GRM6)、LRIT3)、SLC24A1)、TRPM1)、NYX)、OPN1LW)、OPN1MW)、青錐体オプシン(OPN1SW)、フラタキシン(FXN)、(IMPDH1)、(OTX2)、CRB1)、DTHD1GDF6)、IFT140)、IQCB1)、LCA5)、LRAT)、NMNAT1)、RD3)、RDH12)、RPE65)、SPATA7)、TULP1)、ミトコンドリア遺伝子(KSS、LHON、MT-ATP6、MT-TH、MT-TL1、MT-TP、MT-TS2、ミトコンドリアにコードされたNADH脱水素酵素[MT-ND])、(BEST1)、C1QTNF5EFEMP1)、ELOVL4)、FSCN2)、GUCA1B)、HMCN1)、IMPG1)、RP1L1)、TIMP3)、DRAM2)、MFN2)、NR2F1)、視神経萎縮1(OPA1)、TMEM126A)、TIMM8A)、CA4)、HK1)、KLHL7)、NR2E3)、NRL)、OR2W3)、PRPF3)、PRPF4)、PRPF6)、PRPF8)、PRPF31)、ROM1)、網膜色素変性タンパク質1(RP1)、RP9)、SNRNP200)、SPP2)、TOPORS)、ARL2BP)、C2orf71)、CLRN1)、CNGA1)、CNGB1)、CYP4V2)、DHDDS)、DHX38)、EMC1)、EYS)、FAM161A)、GPR125)、HGSNAT)、IDH3B)、IMPG2)、KIAA1549)、KIZ)、MAK)、MERTK)、MVK)、NEK2)、NEUROD1)、PDE6A)、PDE6G)、PRCD)、RBP3)、RLBP1)、SLC7A14)、USH2A)、ZNF408)、ZNF513)、OFD1)、RP2)、レチノスキシン(RS1)、ABHD12)、CDH23)、CEP250)、CIB2)、DFNB31)、GPR98)、HARS)、MYO7A)、PCDH15)、USH1C)、USH1G)、NDP)、PGK1)、CAPN5)、FZD4)、ITM2B)、LRP5)、MIR204)、RB1)、TSPAN12)、C12orf65)、CDH3)、MFRP)、OAT)、PLA2G5)、RBP4)、RGS9)、RGS9BP)、ARMS2、ERCC6)、FBLN5)、HTRA1)、TLR3)、およびTLR4)が含まれる。
遺伝子産物がアポトーシスを誘導または促進する遺伝子は、本明細書では「アポトーシス促進遺伝子」と称され、これらの遺伝子の産物(mRNA、タンパク質)は、「アポトーシス促進遺伝子産物」と称される。アポトーシス促進標的には、例えば、Bax遺伝子産物、Bid遺伝子産物、Bak遺伝子産物、Bad遺伝子産物、Bcl-2、Bcl-X1が含まれる。抗アポトーシス遺伝子産物には、アポトーシスのX連鎖阻害剤が含まれる。
遺伝子産物が血管新生を誘導または促進する遺伝子は、本明細書では「血管新生促進遺伝子」と称され、これらの遺伝子の産物(mRNA、タンパク質)は、「血管新生促進遺伝子産物」と称される。血管新生促進標的には、例えば、血管内皮成長因子(VEGFa、VEGFb、VEGFc、VEGFd)、血管内皮成長因子受容体1(VEGFR1)、血管内皮成長因子受容体2(VEGFR2)、Fms関連チロシンキナーゼ1(Flt1)、胎盤成長因子(PGF)、血小板由来成長因子(PDGF)、アンジオポエチン、ソニックヘッジホッグが含まれる。遺伝子産物が血管新生を阻害する遺伝子は、本明細書では「抗血管新生遺伝子」と称され、これらの遺伝子の産物(mRNA、タンパク質)は、「抗血管新生遺伝子産物」と称される。抗血管新生遺伝子産物には、エンドスタチン;タムスタチン;アンジオスタチン;色素上皮由来因子(PEDF)、ならびに血管新生促進標的および/またはそれらの受容体に特異的な融合タンパク質または抗体、例えば、抗VEGF融合タンパク質sFLT1またはEylea、VEGF特異的抗体Lucentis(商標)、およびAvastin(商標)などが含まれる。
いくつかの実施形態では、主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物(複数可)は、血管新生を阻害するように作用する。ある特定の好ましい実施形態では、主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物(複数可)は、VEGFa、VEGFb、VEGFc、VEGFd、およびPGFからなる群から選択される1つ以上の哺乳動物VEGFタンパク質の活性を阻害するように作用する。特に好ましい実施形態では、主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物(複数可)は、VEGFaの活性を阻害する。VEGFaは、代替スプライシングによって生成される9つのアイソフォームを有し、その中で最も生理学的に関連するのは、VEGF165である。VEGFaレベルは、滲出性加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、および網膜静脈閉塞を有する患者の硝子体内で上昇することが見出されている。眼内でのVEGFaの活性を阻害し、したがって硝子体VEGFaが上昇している患者の治療に有効な遺伝子産物には、アフリベルセプト、ラニビズマブ、ブロルシズマブ、ベバシズマブ、および可溶性fms様チロシンキナーゼ1(sFLT1)(GenBank受託番号U01134)が含まれるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、(i)本明細書に記載の変異AAVキャプシドタンパク質、および(ii)各々が異なるVEGFa阻害剤をコードする複数の配列を含む異種核酸を含む、感染性組換えAAV(rAAV)ビリオンが提供される。
好ましい一実施形態では、遺伝子産物は、アフリベルセプトである。アフリベルセプト(EYLEA(登録商標))は、ヒトIgG1のFc部分に融合したヒトVEGF受容体1および2の細胞外ドメインを含む、組換え融合タンパク質である。アフリベルセプトは、天然受容体よりも大きな親和性でVEGFaおよびPGFに結合する可溶性デコイ受容体として機能する。硝子体内アフリベルセプト注射の承認用量は、2.0mgであり、この投薬量は、適応症に応じて変化する。アフリベルセプトは、新生血管(滲出性)加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、および糖尿病性網膜症の治療に適応される。特に好ましい実施形態では、アフリベルセプトをコードする新規のコドン最適化核酸配列(図12Aに対応する)が提供され、これは、以下を含むか、または以下からなる。
いくつかの実施形態では、アフリベルセプトをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号65に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号65のヌクレオチド79~1377(Flt1シグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない)に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のAAV変異体(複数可)によって送達される遺伝子産物(複数可)は、配列番号65の核酸配列、またはそれと少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物(複数可)は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列を含む:
他の関連する実施形態では、AAV変異体(複数可)は、配列番号66のアミノ酸27~458と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列(下線付きシグナルペプチド配列を含まない、アフリベルセプトのアミノ酸配列に対応する)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の好ましい実施形態では、遺伝子産物は、ラニビズマブの一本鎖バージョン(sc-ラニビズマブ)である。ラニビズマブ(LUCENTIS(登録商標))は、VEGFaの全てのアイソフォームに結合し、それを遮断する、モノクローナルIgG1抗体断片(Fab)である。LUCENTIS(登録商標)は、定常軽(CL)ドメインと定常重1(CH1)ドメインとの間のジスルフィド結合によって接合された2つの別個の鎖(軽鎖および重鎖)として細菌内で発現する。硝子体内ラニビズマブの承認用量は、適応症に応じて0.05mL中0.3または0.5mgのいずれかである。ラニビズマブは、滲出性加齢黄斑変性、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性黄斑浮腫、および糖尿病性網膜症の治療に承認されている。特に好ましい実施形態では、図12Cに対応するラニビズマブの一本鎖重軽(HL)形態(sc-ラニビズマブHL)をコードする新規のコドン最適化核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる:
いくつかの実施形態では、sc-ラニビズマブHLをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号67に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号67のヌクレオチド58~1575(ヒトIGHV7-8シグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない)に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のAAV変異体(複数可)によって送達される遺伝子産物(複数可)は、配列番号67の核酸配列、またはそれと少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のAAV変異体(複数可)によって送達される遺伝子産物(複数可)は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列を含む:
他の関連する実施形態では、AAV変異体(複数可)は、配列番号68のアミノ酸20~524と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列(下線付きシグナルペプチド配列を含まない、sc-ラニビズマブHLのアミノ酸配列に対応する)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の特に好ましい実施形態では、図12Bに対応するラニビズマブの一本鎖軽重(LH)形態(sc-ラニビズマブLH)をコードする新規のコドン最適化核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる:
別の特に好ましい実施形態では、図12Bに対応するラニビズマブの一本鎖軽重(LH)形態(sc-ラニビズマブLH)をコードする新規のコドン最適化核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる:
いくつかの実施形態では、sc-ラニビズマブLHをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号69もしくは配列番号70に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号69もしくは配列番号70のヌクレオチド61~1578(Igカッパシグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない)に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のAAV変異体(複数可)によって送達される遺伝子産物(複数可)は、配列番号69もしくは配列番号70の核酸配列、またはそれと少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のAAV変異体(複数可)によって送達される遺伝子産物(複数可)は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列を含む:
他の関連する実施形態では、AAV変異体(複数可)は、配列番号71のアミノ酸21~525と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列(下線付きシグナルペプチド配列を含まない、sc-ラニビズマブLHのアミノ酸配列に対応する)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の好ましい実施形態では、図12Eに対応するヒトIgG1のFc領域に融合したラニビズマブの一本鎖軽重(LH)形態(sc-ラニビズマブ-Fc)をコードする新規の核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる:
いくつかの実施形態では、sc-ラニビズマブFcをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号72に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号72のヌクレオチド61~2277(Igカッパシグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない)に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物(複数可)は、配列番号72の核酸配列、またはそれと少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のAAV変異体(複数可)によって送達される遺伝子産物(複数可)は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列を含む:
他の関連する実施形態では、AAV変異体(複数可)は、配列番号73のアミノ酸21~752と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列(下線付きシグナルペプチド配列を含まない、sc-ラニビズマブ-Fcのアミノ酸配列に対応する)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の好ましい実施形態では、遺伝子産物は、ブロルシズマブである。ブロルシズマブ(RTH258)は、VEGFaの全てのアイソフォームに結合し、それを遮断する、一本鎖可変断片(scFv)である。ブロルシズマブは現在、滲出性加齢黄斑変性の治療のための3mgおよび6mgの用量を評価する第III相臨床研究中である。特に好ましい実施形態では、ブロルシズマブをコードする新規のコドン最適化核酸配列(図12Dに対応する)が提供され、核酸配列は、以下を含むか、または以下からなる。
いくつかの実施形態では、ブロルシズマブをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号74に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号74のヌクレオチド61~816(Igカッパシグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない)に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物(複数可)は、配列番号74の核酸配列、またはそれと少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物(複数可)は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列を含む:
他の関連する実施形態では、AAV変異体(複数可)は、配列番号75のアミノ酸21~271と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列(下線付きシグナルペプチド配列を含まない、ブロルシズマブのアミノ酸配列に対応する)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
別の好ましい実施形態では、図12Fに対応するヒトIgG1のFc領域に融合したブロルシズマブ(ブロルシズマブ-Fc)をコードする新規の核酸配列が提供され、核酸配列は、以下を含むか、またはそれからなる:
いくつかの実施形態では、ブロルシズマブ-Fcをコードする核酸配列が提供され、これは、配列番号76に示される核酸配列の全長に対して、または配列番号76のヌクレオチド61~1530(Igカッパシグナル配列をコードする下線付きヌクレオチドを含まない)に対して、少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、または少なくとも約99%以上の核酸同一性を有する核酸配列を含む。関連する実施形態では、主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物(複数可)は、配列番号76の核酸配列、またはそれと少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%同一の核酸からなるか、またはそれを含む核酸配列によってコードされる。他の関連する実施形態では、主題のAAV変異体によって送達される遺伝子産物(複数可)は、以下のアミノ酸配列と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列を含む:
他の関連する実施形態では、AAV変異体(複数可)は、配列番号77のアミノ酸21~498と少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、少なくとも約99%同一、または100%同一のアミノ酸配列(下線付きシグナルペプチド配列を含まない、ブロルシズマブ-Fcのアミノ酸配列に対応する)をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む。
特に好ましい実施形態では、対応する親AAVキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入を含む変異AAVキャプシドタンパク質を含む、感染性組換えAAV(rAAV)ビリオンが提供され、ペプチド挿入は、アミノ酸配列ISDQTKH(配列番号14)またはLAISDQTKHA(配列番号28)、およびVEGF、好ましくはVEGFaの活性を阻害するポリペプチドをコードする異種核酸を含み、変異キャプシドタンパク質は、網膜細胞に対する対応する親AAVキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。いくつかの実施形態では、挿入部位は、AAV2(配列番号2)のVP1のアミノ酸587および588に対応するアミノ酸の間、または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置にある。好ましくは、変異AAVキャプシドタンパク質は、AAV2(配列番号2)のVP1キャプシドに対するP34Aアミノ酸置換、または別のAAV血清型における対応する置換も含む。
いくつかの実施形態では、(i)AAV2(配列番号2)のVP1のアミノ酸587および588に対応するアミノ酸の間、または対応する親AAVキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質の別のAAV血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置におけるペプチド挿入、ならびに(ii)AAV2(配列番号2)のVP1キャプシドに対するP34Aアミノ酸置換、または別のAAV血清型における対応する置換、ならびにアフリベルセプトをコードする配列を含む異種核酸を含む、変異AAVキャプシドタンパク質を含むrAAVビリオンが提供される。好ましい実施形態では、アフリベルセプトをコードする核酸配列は、配列番号65の核酸配列、またはそれと少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%同一の核酸からなるか、またはそれを含む。特に好ましい実施形態では、配列番号42として示される配列と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を有する変異AAVキャプシドタンパク質、および配列番号65の核酸配列を含む異種核酸を含む、rAAVビリオンが提供され、変異キャプシドタンパク質は、網膜細胞に対する対応する親AAVキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。他の関連する実施形態では、異種核酸は、好ましくはラニビズマブ、sc-ラニビズマブHL、sc-ラニビズマブLH、sc-ラニビズマブ-Fc、ブロルシズマブ、およびブロルシズマブ-Fcから選択される追加のVEGFa阻害剤を各々コードする、1つ以上の配列をさらに含む。関連する実施形態では、そのようなrAAVを含む薬学的組成物が提供される。他の関連する実施形態では、VEGFa関連眼疾患を治療するための方法が提供され、この方法は、有効量のrAAVビリオンを、VEGFa関連眼疾患の治療を必要とする対象に投与することを含み、このrAAVビリオンは、配列番号42として示される配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する変異AAVキャプシドタンパク質、および配列番号65の核酸配列を含む異種核酸、および任意選択で、各々が異なるVEGFa阻害剤をコードする1つ以上の追加の核酸配列を含む。rAAVは、網膜下、脈絡膜上、局所、前房内、または硝子体内注射によって投与され得るが、好ましくは硝子体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、VEGFa関連眼疾患は、滲出型(新生血管、滲出性)加齢黄斑変性;網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫;網膜静脈閉塞に起因する網膜血管新生;糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症(非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全段階を含む)、近視性黄斑変性、網膜静脈分枝閉塞、半網膜静脈閉塞、および網膜中心静脈閉塞;未熟児網膜症;特発性脈絡膜新生血管;近視黄斑変性ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管;網膜毛細血管拡張症;血管新生緑内障;硝子体出血;ぶどう膜炎(uvetis)、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および/または脈絡膜疾患、眼腫瘍、角膜および虹彩血管新生を含むがこれらに限定されない、網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、VEGFa関連眼疾患は、滲出型(新生血管、滲出性)加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、および近視性脈絡膜血管新生から選択される。
いくつかの実施形態では、(i)AAV2(配列番号2)のVP1のアミノ酸587および588に対応するアミノ酸の間、または対応する親AAVキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質の別のAAV血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置におけるペプチド挿入、ならびに(ii)AAV2(配列番号2)のVP1キャプシドに対するP34Aアミノ酸置換、または別のAAV血清型における対応する置換、ならびにラニビズマブ、sc-ラニビズマブHL、sc-ラニビズマブLH、またはsc-ラニビズマブ-Fcをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、変異AAVキャプシドタンパク質を含むrAAVビリオンが提供される。好ましい実施形態では、sc-ラニビズマブをコードする核酸配列は、配列番号67、69、70、および72のうちのいずれか1つに示される核酸配列からなるか、もしくはそれを含むか、またはそれと少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%同一である。特に好ましい実施形態では、配列番号42として示される配列と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を有する変異AAVキャプシドタンパク質、ならびに配列番号67、69、70、および72のうちのいずれか1つの核酸配列を含む異種核酸を含む、rAAVビリオンが提供され、変異キャプシドタンパク質は、網膜細胞に対する対応する親AAVキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。他の関連する実施形態では、異種核酸は、好ましくはアフリベルセプト、ブロルシズマブ、およびブロルシズマブ-Fcから選択される異なるVEGFa阻害剤を各々コードする、1つ以上の追加の核酸配列をさらに含む。関連する実施形態では、そのようなrAAVを含む薬学的組成物が提供される。他の関連する実施形態では、眼内VEGFaの上昇に関連する眼疾患を治療するための方法が提供され、この方法は、有効量のrAAVビリオンを、眼内VEGFaの上昇に関連する眼疾患の治療を必要とする対象に投与することを含み、このrAAVビリオンは、配列番号42として示される配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する変異AAVキャプシドタンパク質、ならびに配列番号67、69、70、および72のうちのいずれか1つの核酸配列を含む異種核酸配列を含む。好ましくは、rAAVは、硝子体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、VEGFa関連眼疾患は、滲出型(新生血管、滲出性)加齢黄斑変性;網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫;網膜静脈閉塞に起因する網膜血管新生;糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症(非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全段階を含む)、近視性黄斑変性、網膜静脈分枝閉塞、半網膜静脈閉塞、および網膜中心静脈閉塞;未熟児網膜症;特発性脈絡膜新生血管;近視黄斑変性ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管;網膜毛細血管拡張症;血管新生緑内障;硝子体出血;ぶどう膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および/または脈絡膜疾患、眼腫瘍、角膜および虹彩血管新生を含むがこれらに限定されない、網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、VEGFa関連眼疾患は、滲出型(新生血管、滲出性)加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、および近視性脈絡膜血管新生から選択される。
いくつかの実施形態では、(i)AAV2(配列番号2)のVP1のアミノ酸587および588に対応するアミノ酸の間、または対応する親AAVキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質の別のAAV血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置におけるペプチド挿入、ならびに(ii)AAV2(配列番号2)のVP1キャプシドに対するP34Aアミノ酸置換、または別のAAV血清型における対応する置換、ならびにブロルシズマブまたはブロルシズマブ-Fcをコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、変異AAVキャプシドタンパク質を含むrAAVビリオンが提供される。好ましい実施形態では、ブロルシズマブまたはブロルシズマブ-Fcをコードするヌクレオチド配列は、配列番号74または配列番号76に示される核酸配列からなるか、もしくはそれを含むか、またはそれと少なくとも約90%、少なくとも約95%、少なくとも約96%、少なくとも約97%、少なくとも約98%、もしくは少なくとも約99%同一である。特に好ましい実施形態では、配列番号42として示される配列と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも99%同一のアミノ酸配列を有する変異AAVキャプシドタンパク質、および配列番号74または配列番号76の核酸配列を含む異種核酸を含む、rAAVビリオンが提供され、変異キャプシドタンパク質は、網膜細胞に対する対応する親AAVキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する。他の関連する実施形態では、異種核酸は、好ましくはアフリベルセプト、ラニビズマブ、sc-ラニビズマブHL、sc-ラニビズマブLH、およびsc-ラニビズマブ-Fcから選択される異なるVEGFa阻害剤を各々コードする、1つ以上のヌクレオチド配列をさらに含む。関連する実施形態では、そのようなrAAVを含む薬学的組成物が提供される。他の関連する実施形態では、眼内VEGFaの上昇に関連する眼疾患を治療するための方法が提供され、この方法は、有効量のrAAVビリオンを、眼内VEGFaの上昇に関連する眼疾患の治療を必要とする対象に投与することを含み、このrAAVビリオンは、配列番号42として示される配列と少なくとも90%同一のアミノ酸配列を有する変異AAVキャプシドタンパク質、および配列番号74または配列番号76の核酸配列を含む異種核酸配列を含む。好ましくは、rAAVは、硝子体内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、VEGFa関連眼疾患は、滲出型(新生血管、滲出性)加齢黄斑変性;網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫;網膜静脈閉塞に起因する網膜血管新生;糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症(非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全段階を含む)、近視性黄斑変性、網膜静脈分枝閉塞、半網膜静脈閉塞、および網膜中心静脈閉塞;未熟児網膜症;特発性脈絡膜新生血管;近視黄斑変性ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管;網膜毛細血管拡張症;血管新生緑内障;硝子体出血;ぶどう膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および/または脈絡膜疾患、眼腫瘍、角膜および虹彩血管新生を含むがこれらに限定されない、網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される。いくつかの好ましい実施形態では、VEGFa関連眼疾患は、滲出型(新生血管、滲出性)加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、および近視性脈絡膜血管新生から選択される。
遺伝子産物が免疫調節因子、例えば、補体因子、Toll様受容体として機能する遺伝子は、「免疫調節遺伝子」と称される。例示的な免疫調節遺伝子には、サイトカイン、ケモカイン、ならびにそれらおよび/またはそれらの受容体に特異的な融合タンパク質または抗体、例えば、抗IL-6融合タンパク質Rilonacept(商標)、補体因子H特異的抗体ランパミズマブなどが含まれる。遺伝子産物が神経保護因子、例えば、血小板由来成長因子受容体(PDGFR)、グリア由来神経栄養因子(GDNF)、桿体由来錐体生存因子(RdCVF)、線維芽細胞成長因子(FGF)、ニュールツリン(NTN)、毛様体神経栄養因子(CNTF)、神経成長因子(NGF)、ニューロトロフィン-4(NT4)、脳由来神経栄養因子(BDNF)、表皮成長因子として機能する遺伝子。遺伝子産物が光応答性オプシン、例えば、オプシン、ロドプシン、チャネルロドプシン、ハロロドプシンとして機能する遺伝子。
いくつかの事例では、目的の遺伝子産物は、例えば、エンドヌクレアーゼが網膜疾患に関連する対立遺伝子をノックアウトする場合、遺伝子機能の部位特異的ノックダウンを提供する部位特異的エンドヌクレアーゼである。例えば、優性対立遺伝子が、野生型の場合に網膜構造タンパク質であり、かつ/または正常な網膜機能を提供する遺伝子の欠損コピーをコードする場合、部位特異的エンドヌクレアーゼは、欠損対立遺伝子を標的化し、欠損対立遺伝子をノックアウトすることができる。
欠損対立遺伝子をノックアウトすることに加えて、部位特異的ヌクレアーゼを使用して、欠損対立遺伝子によってコードされるタンパク質の機能的コピーをコードするドナーDNAによる相同的組換えを刺激することもできる。したがって、例えば、主題のrAAVビリオンを使用して、欠損対立遺伝子をノックアウトする部位特異的エンドヌクレアーゼの両方を送達することができ、またそれを使用して、欠損対立遺伝子の機能的コピーを送達し、欠損対立遺伝子の修復をもたらし、それによって機能的網膜タンパク質(例えば、機能的レチノスキシン、機能的RPE65、機能的ペリフェリンなど)の産生をもたらすことができる。例えば、Li et al.(2011)Nature475:217を参照されたい。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるrAAVビリオンは、部位特異的エンドヌクレアーゼをコードする異種ヌクレオチド配列、および機能的コピーが機能的網膜タンパク質をコードする場合、欠損対立遺伝子の機能的コピーをコードする異種ヌクレオチド配列を含む。機能的網膜タンパク質には、例えば、レチノスキシン、RPE65、網膜色素変性GTPアーゼ制御因子(RGPR)相互作用タンパク質-1、ペリフェリン、ペリフェリン-2などが含まれる。
使用に好適な部位特異的エンドヌクレアーゼには、例えば、メガヌクレアーゼ、ジンクフィンガーヌクレアーゼ(ZFN)、転写活性化因子様エフェクターヌクレアーゼ(TALEN)、およびそのような部位特異的エンドヌクレアーゼが天然に存在せず、特定の遺伝子を標的化するように修飾されている場合には、クラスター化して規則的な配置の短い回文配列リピート/CRISPR関連(Cas)が含まれる。そのような部位特異的ヌクレアーゼは、ゲノム内の特定の位置を切断するように操作することができ、次いで非相同末端接合により、いくつかのヌクレオチドを挿入または欠失させながら破断を修復することができる。そのような部位特異的エンドヌクレアーゼ(「INDEL」とも称される)は、次いでタンパク質を枠外に投げ出し、効果的に遺伝子をノックアウトする。例えば、米国特許出願公開第2011/0301073号を参照されたい。
本明細書に開示される変異rAAVベクターのいくつかの実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、構成的プロモーターに作動可能に連結される。好適な構成的プロモーターには、例えば、サイトメガロウイルスプロモーター(CMV)(Stinski et al.(1985)Journal of Virology55(2):431-441)、CMV早期エンハンサー/ニワトリβ-アクチン(CBA)プロモーター/ウサギβ-グロビンイントロン(CAG)(Miyazaki et al.(1989)Gene79(2):269-277、CBSB(Jacobson et al.(2006)Molecular Therapy13(6):1074-1084)、ヒト伸長因子1αプロモーター(EF1α)(Kim et al.(1990)Gene91(2):217-223)、ヒトホスホグリセレートキナーゼプロモーター(PGK)(Singer-Sam et al.(1984)Gene32(3):409-417、ミトコンドリア重鎖プロモーター(Loderio et al.(2012)PNAS109(17):6513-6518)、ユビキチンプロモーター(Wulff et al.(1990)FEBS Letters261:101-105)が含まれる。他の実施形態では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、誘導性プロモーターに作動可能に連結される。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、組織特異的または細胞型特異的制御要素に作動可能に連結される。例えば、いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、光受容体特異的制御要素(例えば、光受容体特異的プロモーター)、例えば、光受容細胞内の作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する制御要素に作動可能に連結される。好適な光受容体特異的制御要素には、例えば、ロドプシンプロモーター、ロドプシンキナーゼプロモーター(Young et al.(2003)Ophthalmol.Vis.Sci.44:4076)、ベータホスホジエステラーゼ遺伝子プロモーター(Nicoud et al.(2007)J.Gene Med.9:1015)、網膜色素変性遺伝子プロモーター(Nicoudら(2007)(上記))、光受容体間レチノイド結合タンパク質(IRBP)遺伝子エンハンサー(Nicoudら(2007)(上記))、IRBP遺伝子プロモーター(Yokoyama et al.(1992)Exp Eye Res.55:225)、オプシン遺伝子プロモーター(Tucker et al.(1994)PNAS91:2611-2615)、レチノスキシン遺伝子プロモーター(Park et al.(2009)Gene Therapy16(7):916-926)、CRXホメオドメインタンパク質遺伝子プロモーター(Furukawa et al.(2002)The Journal of Neuroscience22(5):1640-1647)、グアニンヌクレオチド結合タンパク質アルファ形質導入活性ポリペプチド1(GNAT1)遺伝子プロモーター(Lee et al.(2010)Gene Therapy17:1390-1399)、神経網膜特異的ロイシンジッパータンパク質(NRL)遺伝子プロモーター(Akimoto et al.(2006)PNAS103(10):3890-3895)、ヒト錐体アレスチン(hCAR)プロモーター(Li et al.(2002)Biochemistry and Molecular Biology43:1375-1383)、ならびにPR2.1、PR1.7、PR1.5、およびPR1.1プロモーター(Ye et al.(2016)Human Gene Therapy27(1):72-82))が含まれる。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、網膜色素上皮(RPE)細胞特異的制御要素(例えば、RPE特異的プロモーター)、例えば、RPE細胞内の作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する制御要素に作動可能に連結される。好適なRPE特異的制御要素には、例えば、RPE65遺伝子プロモーター(Meur et al.(2007)Gene Therapy14:292-303)、細胞レチンアルデヒド結合タンパク質(CRALBP)遺伝子プロモーター(Kennedy et al.(1998)Journal of Biological Chemistry273:5591-5598)、色素上皮由来因子(PEDF、別名セルピンF1)遺伝子プロモーター(Kojima et al.(2006)Molecular and Cellular Biochemistry293(1-2):63-69)、および卵黄様黄斑変性(VMD2)プロモーター(Esumi et al.(2004)The Journal of Biological Chemistry279(18):19064-19073)が含まれる。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、ミュラーグリア細胞特異的制御要素(例えば、グリア特異的プロモーター)、例えば、網膜グリア細胞内の作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する制御要素に作動可能に連結される。好適なグリア特異的制御要素には、例えば、グリア線維酸性タンパク質(GFAP)プロモーター(Besnard et al.(1991)Journal of Biological Chemistry266(28):18877-18883)が含まれる。いくつかの事例では、目的の遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列は、双極細胞特異的制御要素(例えば、双極特異的プロモーター)、例えば、双極細胞内の作動可能に連結された遺伝子の選択的発現を付与する制御要素に作動可能に連結される。好適な双極特異的制御要素には、例えば、GRM6プロモーター(Cronin et al.(2014)EMBO Molecular Medicine6(9):1175-1190)が含まれる。
本発明の目的のために、本明細書の開示は、上記の変異AAVキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸を提供する。単離された核酸は、AAVベクター、例えば、組換えAAVベクターであり得る。
本明細書の開示はまた、網膜疾患を治療する方法を提供し、この方法は、上記かつ本明細書に開示される目的の導入遺伝子を含む有効量のrAAV変異ビリオンを、網膜疾患の治療を必要とする個体に投与することを含む。当業者は、主題のrAAVビリオンの有効量と、1つ以上の機能的または解剖学的パラメータ、例えば、視力、視野、明暗に対する電気生理学的応答、色覚、対照感受性、生体構造、網膜の健康および脈管構造、眼球運動、凝視選択、ならびに安定性における変化について試験することによって疾患が治療されたこととを容易に決定することができる。
網膜機能およびその変化を評価するための非限定的な方法には、視力(例えば、最良矯正視力[BCVA]、歩行、ナビゲーション、物体検知、および識別)の評価、視野(例えば、静的および動的視野計測)の評価、臨床検査(例えば、前眼部および後眼部の細隙灯検査)の実施、明暗の全波長に対する電気生理学的応答(例えば、あらゆる形態の網膜電図写真(ERG)[全視野、多焦点、およびパターン]、あらゆる形態の視覚誘発電位(VEP)、電気眼球図記録(EOG)、色覚、暗順応、および/または対比感度)の評価が含まれる。生体構造および網膜の健康ならびにその変化を評価するための非限定的な方法には、光干渉断層撮影(OCT)、眼底撮影、補償光学走査レーザー検眼鏡(AO-SLO)、蛍光法、および/または自己蛍光法を使用する生体構造または健康の変化の測定;眼球運動および眼の動き(例えば、眼振、凝視、選択、および安定性)の測定、報告された結果(患者報告による視覚および非視覚誘導挙動および活動の変化、患者報告結果[PRO]、生活の質のアンケート評価、日常活動の測定、ならびに神経機能の測定(例えば、機能的磁気共鳴画像法(MRI))が含まれる。
いくつかの実施形態では、有効量の主題のrAAVビリオンにより、網膜機能、解剖学的一体性、または網膜の健康の喪失率の減少、例えば、2倍、3倍、4倍、または5倍以上の喪失率の減少、およびそれに従う疾患の進行の減少、例えば、喪失率の10倍以上の減少、およびそれに従う疾患の進行の減少がもたらされる。いくつかの実施形態では、有効量の主題のrAAVビリオンにより、視覚機能、網膜機能の増大、網膜の生体構造もしくは健康の改善、ならびに/または眼球運動の改善および/もしくは神経機能の改善、例えば、2倍、3倍、4倍、または5倍以上の網膜機能、網膜の生体構造もしくは健康の改善、および/または眼球運動の改善、例えば、10倍以上の網膜機能、網膜の生体構造もしくは健康の改善、および/または眼球運動の改善がもたらされる。当業者によって容易に理解されるように、所望の治療効果を達成するのに必要な用量は、典型的には、1×108~約1×1015の範囲内の組換えビリオンであり、これは、典型的には、当業者によって1×108~約1×1015「ベクターゲノム」と称される。
主題のrAAVビリオンは、眼内注射、例えば、硝子体内注射、網膜下注射、脈絡膜上注射、またはrAAVビリオンの眼への送達をもたらす任意の他の簡便な投与様式または投与経路によって、投与することができる。他の簡便な投与マンセストード(mancestode)または投与経路には、非限定的に、静脈内、動脈内、眼周囲、前房内、結膜下およびテノン下(sub-tenons)の注射、ならびに局所投与および鼻腔内が含まれる。硝子体内注射によって投与される場合、主題のrAAVビリオンは、硝子体を通過して移動し、内境界膜(本明細書では内部境界膜、または「ILM」とも称され、これは、星状細胞とミュラー細胞のエンドフィートとによって形成される、網膜と硝子体との間の境界を形成する網膜の表面にある薄く透明な無細胞性の膜である)を横断し、かつ/または対応する親AAVキャプシドタンパク質を含むAAVビリオンの能力と比較して、より効率的に網膜の層を通過して移動する。
本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、単離、例えば、精製される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される変異キャプシドタンパク質は、AAVベクターまたは組換えAAV(rAAV)ビリオンに含まれる。他の実施形態では、そのようなAAV変異体ベクターおよび/またはAAV変異体ビリオンは、霊長類網膜内の眼疾患を治療するインビボまたはエクスビボの方法において使用される。
本明細書の開示は、宿主細胞、例えば、非限定的に、主題の核酸を含む単離された(遺伝子修飾された)宿主細胞をさらに提供する。本明細書に開示される本発明に従う宿主細胞は、インビトロ細胞培養物由来の細胞などの単離された細胞であり得る。そのような宿主細胞は、本明細書に記載のように、主題のrAAV変異ビリオンを産生するために有用である。一実施形態では、そのような宿主細胞は、核酸によって安定的に遺伝子修飾される。他の実施形態では、宿主細胞は、核酸によって一過性に遺伝子修飾される。そのような核酸は、電気穿孔、リン酸カルシウム沈殿、リポソーム媒介性トランスフェクションなどを含むがこれらに限定されない確立された技術を使用して、宿主細胞に安定的にまたは一過性に導入される。安定した形質転換のために、核酸は一般に、選択マーカー、例えば、ネオマイシン耐性などのいくつかの周知の選択可能マーカーのいずれかをさらに含む。そのような宿主細胞は、多様な細胞、例えば、哺乳動物細胞(例えば、マウス細胞および霊長類細胞(例えば、ヒト細胞)を含む)のいずれかに核酸を導入することによって生成される。例示的な哺乳動物細胞には、初代細胞および細胞株が含まれるが、これらに限定されず、例示的な細胞株には、293細胞、COS細胞、HeLa細胞、Vero細胞、3T3マウス線維芽細胞、C3H10T1/2線維芽細胞、CHO細胞などが含まれるが、これらに限定されない。例示的な宿主細胞には、非限定的に、HeLa細胞(例えば、アメリカ合衆国培養細胞系統保存機関(ATCC)番号CCL-2)、CHO細胞(例えば、ATCC番号CRL9618、CCL61、CRL9096)、293細胞(例えば、ATCC番号CRL-1573)、Vero細胞、NIH 3T3細胞(例えば、ATCC番号CRL-1658)、Huh-7細胞、BHK細胞(例えば、ATCC番号CCL10)、PC12細胞(ATCC番号CRL1721)、COS細胞、COS-7細胞(ATCC番号CRL1651)、RAT1細胞、マウスL細胞(ATCC番号CCLI.3)、ヒト胎児腎臓(HEK)細胞(ATCC番号CRL1573)、HLHepG2細胞などが含まれる。宿主細胞は、AAVを産生するSf9細胞などの昆虫細胞に感染させるためにバキュロウイルスを使用して作製することもできる(例えば、米国特許第7,271,002号、米国特許出願第12/297,958号を参照されたい)。いくつかの実施形態では、遺伝子修飾された宿主細胞は、上記の変異AAVキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸に加えて、1つ以上のAAV repタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む核酸を含む。他の実施形態では、宿主細胞は、rAAV変異ベクターをさらに含む。そのような宿主細胞を使用して、rAAV変異ビリオンを生成することができる。rAAVビリオンを生成する方法は、例えば、米国特許出願公開第2005/0053922号および米国特許出願公開第2009/0202490号に記載されている。
本明細書の開示は、a)上記かつ本明細書に開示されるrAAV変異ビリオンと、b)薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤とを含む、薬学的組成物をさらに提供する。いくつかの実施形態では、薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、または緩衝剤は、ヒトまたは非ヒト患者における使用に好適である。そのような賦形剤、担体、希釈剤、および緩衝剤には、過度の毒性を伴わずに投与することができる任意の医薬品が含まれる。薬学的に許容される賦形剤には、水、生理食塩水、グリセロール、およびエタノールなどの液体が含まれるが、これらに限定されない。薬学的に許容される塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩などの無機酸塩;および酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などの有機酸の塩が含まれてもよい。加えて、補助物質、例えば、湿潤剤または乳化剤、界面活性剤、pH緩衝物質などが、そのようなビヒクル中に存在してもよい。多種多様な薬学的に許容される賦形剤が当該技術分野で既知であり、本明細書で詳細に考察する必要はない。薬学的に許容される賦形剤は、例えば、A.Gennaro(2000)“Remington:The Science and Practice of Pharmacy,”20th edition,Lippincott,Williams,&Wilkins、Pharmaceutical Dosage Forms and Drug Delivery Systems(1999)H.C.Ansel et al.,eds.,7th ed.,Lippincott,Williams,&Wilkins、およびHandbook of Pharmaceutical Excipients(2000)A.H.Kibbe et al.,eds.,3rd ed.Amer.Pharmaceutical Assocを含む、多様な刊行物に十分に記載されている。本発明のいくつかの態様では、本発明は、約1×108~約1×1015の組換えウイルスまたは1×108~約1×1015のベクターゲノムを含む薬学的組成物を提供し、該組換えウイルスの各々は、1つ以上の遺伝子産物をコードするゲノムを含む。
本発明のいくつかの実施形態は、以下の項目1~36に例示されている:
1.変異アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドタンパク質であって、対応する親AAVキャプシドタンパク質に対してキャプシドタンパク質のGHループにおけるペプチド挿入を含み、ペプチド挿入が、アミノ酸配列ISDQTKH(配列番号14)を含み、変異キャプシドタンパク質が、網膜細胞に対する対応する親AAVキャプシドタンパク質の感染性と比較して、網膜細胞の増加した感染性を付与する、変異アデノ随伴ウイルス(AAV)キャプシドタンパク質。
2.ペプチド挿入が、アミノ酸配列Y1Y2ISDQTKHY3を含み、Y1~Y3の各々が独立して、Ala、Leu、Gly、Ser、Thr、およびProから選択される、項目1に記載の変異AAVキャプシドタンパク質。
3.ペプチド挿入が、アミノ酸配列LAISDQTKHA(配列番号28)を含む、項目2に記載の変異AAVキャプシドタンパク質。
4.挿入部位が、AAV2(配列番号2)のVP1のアミノ酸587および588に対応するアミノ酸の間、または別のAAV血清型のキャプシドタンパク質中の対応する位置にある、項目1~3のいずれか1項に記載の変異AAVキャプシドタンパク質。
5.キャプシドタンパク質が、AAV2(配列番号2)のVP1キャプシドに対する1つ以上のアミノ酸置換、または別のAAV血清型における1つ以上の対応する置換を含む、項目1~4のいずれか1項に記載の変異AAVキャプシドタンパク質。
6.キャプシドタンパク質が、AAV2(配列番号2)のVP1キャプシドに対するP34Aアミノ酸置換、または別のAAV血清型における対応する置換を含む、項目1~5のいずれか1項に記載の変異AAVキャプシドタンパク質。
7.キャプシドタンパク質が、(i)アミノ酸配列ISDQTKH(配列番号14)および(ii)P34Aアミノ酸置換を含み、かつ配列番号42として示される配列と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも99%同一である、項目1~6のいずれか1項に記載の変異AAVキャプシドタンパク質。
8.キャプシドタンパク質が、配列番号42として示されるアミノ酸配列から本質的になる、項目7に記載の変異AAVキャプシドタンパク質。
9.項目1~8のいずれか1項に記載の変異AAVキャプシドタンパク質、および遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列を含む異種核酸を含む、組換えAAV(rAAV)ビリオン。
10.遺伝子産物が、ポリペプチドである、項目9に記載のrAAV。
11.異種核酸が、血管内皮成長因子(VEGF)の活性を阻害するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む、項目10に記載のrAAAV。
12.ヌクレオチド配列が、融合タンパク質をコードする、項目11に記載のrAAV。
13.ヌクレオチド配列が、アフリベルセプト(Eylea)をコードする、項目12に記載のrAAV。
14.ヌクレオチド配列が、配列番号65として示される核酸配列または配列番号65のヌクレオチド79~1377と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも99%同一であり、かつ好ましくは配列番号66として示されるアミノ酸配列または配列番号66のアミノ酸27~458をコードする、項目13に記載のrAAV。
15.ヌクレオチド配列が、モノクローナル抗体またはその抗原結合断片をコードする、項目11に記載のrAAV。
16.ヌクレオチド配列が、ラニビズマブ(Lucentis)をコードする、項目15に記載のrAAV。
17.ヌクレオチド配列が、(i)配列番号67の配列(sc-ラニビズマブHL)もしくは配列番号67のヌクレオチド58~1575と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、もしくは少なくとも99%同一の配列を含み、かつ配列番号68として示されるアミノ酸配列をコードするか、または(ii)配列番号68のアミノ酸20~524のアミノ酸配列をコードする、項目15に記載のrAAV。
18.ヌクレオチド配列が、(i)配列番号69(sc-ラニビズマブLH1)もしくは配列番号70(sc-ラニビズマブLH2)の配列、または配列番号69もしくは配列番号70のヌクレオチド61~1578と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも99%同一の配列を有し、かつ配列番号71として示されるアミノ酸配列をコードするか、あるいは(ii)配列番号71のアミノ酸21~525のアミノ酸配列をコードする、項目15に記載のrAAV。
19.ヌクレオチド配列が、(i)配列番号72の配列(sc-ラニビズマブ-Fc)もしくは配列番号72のヌクレオチド61~2277と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、もしくは少なくとも99%同一の配列を有し、かつ配列番号73として記載されるアミノ酸配列をコードするか、または(ii)配列番号73のアミノ酸配列21~752をコードする、項目15に記載のrAAV。
20.ヌクレオチド配列が、ブロルシズマブをコードする、項目15に記載のrAAV。
21.ヌクレオチド配列が、配列番号74として示される核酸配列または配列番号74のヌクレオチド61~816と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも99%同一の配列を有し、かつ好ましくは配列番号75として示されるアミノ酸配列または配列番号75のアミノ酸21~271のアミノ酸配列をコードする、項目20に記載のrAAV。
22.ヌクレオチド配列が、(i)配列番号76の配列(ブロルシズマブ-Fc)もしくは配列番号76のヌクレオチド61~1530と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、もしくは少なくとも99%同一の配列を有し、かつ配列番号77として示されるアミノ酸配列をコードするか、または(ii)配列番号77のアミノ酸21~498のアミノ酸配列をコードする、項目15に記載のrAAV。
23.異種核酸が、(i)アフリベルセプトをコードする配列であって、好ましくは配列番号65として示される核酸配列と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも99%同一であり、かつ配列番号66として示されるアミノ酸配列をコードする、アフリベルセプトをコードする配列と、(ii)ブロルシズマブをコードする配列であって、好ましくは配列番号74または配列番号76として示される核酸配列と少なくとも90%同一、少なくとも95%同一、または少なくとも99%同一であり、かつ好ましくは配列番号75または配列番号77として示されるアミノ酸配列をコードする、ブロルシズマブをコードする配列とを含む、項目11に記載のrAAV。
24.遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列が、発現制御配列に作動可能に連結される、項目9~23のいずれか1項に記載のrAAV。
25.項目11~24のいずれかに記載のrAAVおよび薬学的に許容される担体を含む、薬学的組成物。
26.対象の網膜細胞、脈絡膜細胞、レンズ細胞、毛様細胞、虹彩細胞、視神経細胞、および/または角膜細胞にVEGF阻害剤を送達するための方法であって、項目11~24のいずれか1項に記載のrAAVビリオンまたは項目24に記載の薬学的組成物を対象に投与することを含む、方法。
27.rAAVビリオンまたは薬学的組成物が、対象に硝子体内投与される、項目26に記載の方法。
28.有効量の項目11~24のいずれか1項に記載のrAAVまたは有効量の項目25に記載の組成物を対象に投与することによる、VEGFa関連眼疾患の治療を必要とする対象における、滲出型(新生血管、滲出性)加齢黄斑変性;網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫;網膜静脈閉塞に起因する網膜血管新生;糖尿病性黄斑浮腫、糖尿病性網膜症(非増殖性糖尿病性網膜症および増殖性糖尿病性網膜症の全段階を含む);近視性黄斑変性;網膜静脈分枝閉塞、半網膜静脈閉塞、および網膜中心静脈閉塞;未熟児網膜症;特発性脈絡膜新生血管;近視黄斑変性ならびに続発性網膜および脈絡膜新生血管;網膜毛細血管拡張症;血管新生緑内障;硝子体出血;ぶどう膜炎、外傷、網膜変性障害、遺伝性網膜および/または脈絡膜疾患、眼腫瘍、角膜および虹彩血管新生を含むがこれらに限定されない、網膜疾患に続発する網膜および脈絡膜新生血管から選択される、VEGFa関連眼疾患を治療するための方法。
29.VEGFa関連眼疾患が、滲出型(新生血管、滲出性)加齢黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、網膜静脈閉塞後の黄斑浮腫、糖尿病性網膜症、および近視性脈絡膜血管新生から選択される、項目28に記載の方法。
30.rAAVが、配列番号42として示されるアミノ酸配列から本質的になるキャプシドタンパク質、およびアフリベルセプトをコードする配列を含む異種核酸を含み、好ましくはアフリベルセプトをコードする配列が、配列番号65に示される配列を有する、項目26~29のいずれか1項に記載の方法。
31.rAAVが、配列番号42として示されるアミノ酸配列から本質的になるキャプシドタンパク質、およびラニビズマブ、sc-ラニビズマブHL、sc-ラニビズマブLH、またはsc-ラニビズマブ-Fcをコードする配列を含む異種核酸を含み、好ましくはsc-ラニビズマブHL、sc-ラニビズマブLH、またはsc-ラニビズマブ-Fcをコードする配列が、配列番号67、69、70、および72のうちのいずれか1つに示される配列を有する、項目26~29のいずれか1項に記載の方法。
32.rAAVが、配列番号42として示されるアミノ酸配列から本質的になるキャプシドタンパク質、およびブロリシズマブまたはブロリシズマブ-Fcをコードする配列を含む異種核酸を含み、好ましくはブロリシズマブまたはブロリシズマブ-Fcをコードする配列が、配列番号74または配列番号76に示される配列を有する、項目26~29のいずれか1項に記載の方法。
33.rAAVまたは薬学的組成物が、対象に硝子体内投与される、項目28~32のいずれか1項に記載の方法。
34.対象が、ヒトである、項目26~33のいずれか1項に記載の方法。
35.項目1~8のいずれか1項に記載の変異AAVキャプシドタンパク質をコードするヌクレオチド配列を含む、単離された核酸。
36.項目35に記載の核酸を含む、単離され、遺伝子修飾された宿主細胞。
以下の実施例は、本発明を作製および使用する方法の完全な開示および説明を当業者に提供するために提示され、発明者が発明と見なすものの範囲を制限することを意図するものではなく、以下の実験が行われた全てまたは唯一の実験であると表すことを意図するものでもない。使用される数(例えば、量、温度など)に関して正確性を確保するための努力がなされているが、いくつかの実験誤差および偏差が考慮されるべきである。別途示されない限り、部は重量部であり、分子量は重量平均分子量であり、温度は摂氏であり、圧力は大気圧またはそれに近い圧力である。
分子生化学および細胞生化学における一般的な方法は、Molecular Cloning:A Laboratory Manual,3rd Ed.(Sambrook et al.,Harbor Laboratory Press2001)、Short Protocols in Molecular Biology,4th Ed.(Ausubel et al.eds.,John Wiley&Sons1999)、Protein Methods(Bollag et al.,John Wiley&Sons1996)、Nonviral Vectors for Gene Therapy(Wagner et al.eds.,Academic Press1999)、Viral Vectors(Kaplift&Loewy eds.,Academic Press1995)、Immunology Methods Manual(I.Lefkovits ed.,Academic Press1997)、およびCell and Tissue Culture:Laboratory Procedures in Biotechnology(Doyle&Griffiths,John Wiley&Sons1998)などの標準的な教本に見出すことができ、これらの開示は、参照により本明細書に組み込まれる。本開示で言及される遺伝子操作のための試薬、クローニングベクター、およびキットは、BioRad、Stratagene、Invitrogen、Sigma-Aldrich、およびClonTechなどの商用供給業者から入手可能である。
実施例1
硝子体内注射および組織採取。4~10歳で体重が少なくとも4kgの単体の雄のカニクイザル(macaca fascicularis)に、強膜を介した(ヒトでの使用に好適な手順および送達デバイスを使用して輪部の約3mm後ろの)硝子体内注射によって投薬した。動物を麻酔し、局所麻酔剤を与えた。100μLのライブラリを各眼に投与した。
14日目±3日に100mg/kgのペントバルビタールナトリウムの静脈内注射を使用して、訓練された獣医スタッフによって安楽死を行った。眼を核形成させ、解剖まで4℃で保存した。
組織解剖。眼をメスで鋸状縁に沿って切断し、前部を除去した。網膜の平らな取付けを可能にするために、中心窩周囲の網膜にレリーフカットを作製し、硝子体を除去した。図2に示されるように、各四半部(上側、下側、鼻側、および側頭側)から網膜の6つの試料を採取し、RPE細胞、光受容体、双極細胞、アマクリン細胞、水平細胞、および/または神経節細胞に対応する細胞物質を単離した。
定向進化。定向進化プロセスを図1A~1Eに示す。端的には、DNA突然変異技術とcap遺伝子との20以上の独自の組み合わせを含むウイルスキャプシドライブラリを創出する(図1A)。次いで、各粒子がそのキャプシドをコードするcap遺伝子を囲む突然変異キャプシドで構成され、精製されるように、ウイルスをパッケージングする(図1B)。キャプシドライブラリをインビボの選択圧下に置く。目的の組織または細胞物質を採取し、その標的の感染に成功したAAV変異体の単離し、成功したウイルスを回収する。成功したクローンを反復選択により富化する(段階I-図1D)。次いで、選択されたcap遺伝子に独自の再多様化を行い、さらなる選択ステップによって富化して、反復的にウイルスの適合度を反復的に増加させる(段階2-図1D)。ベクター選択段階1および2中に同定された変異体は、霊長類網膜細胞を形質導入する能力を実証する(図1E)。
AAVキャプシドゲノムの回収の成功:ラウンド1~6。各選択ラウンドから回収されたキャプシドを使用して、注入されたライブラリをパッケージングして、その後の選択ラウンドを開始した。組織からのキャプシド遺伝子の回収は、目的の組織へのライブラリベクターの内在化に成功したことを表す。ラウンド4の後、ラウンド5のライブラリパッケージングおよび注入の前に、ライブラリの追加の再多様化を組み込んだ。代表的な選択ラウンドからのRPE、PR、内顆粒層(INL)、および神経節細胞層(GCL)網膜組織由来のウイルスゲノムの回収を図3に示す。ボックス内のバンドは、ウイルスゲノムの回収に成功したことを表す。
シークエンシング分析:ラウンド3~6。ラウンド3~6では、ライブラリ内の個々のクローンについてシークエンシングを行って、集団内の変異体の頻度を決定した。変異体を、シークエンシングデータ内のモチーフの存在について評価した。変異体を、複数の配列で生じた統一的変異(例えば、キャプシド内の一貫した位置における特定の点突然変異または特異的なペプチド挿入配列)の存在に基づいてモチーフに分類した。2回以上の選択ラウンドでシークエンシングした集団の少なくとも5%、または1回以上の選択ラウンドでシークエンシングした集団の少なくとも10%を表すモチーフを、図4A(ラウンド3シークエンシング分析)、4B(ラウンド4シークエンシング分析)、4C(ラウンド5シークエンシング分析)、および4D(ラウンド6シークエンシング分析)に表す。
網膜細胞の増加した感染性を付与すると同定されたいくつかの代表的なクローンを、以下の表1に列挙する(各クローンは、同定された置換(複数可)および/またはペプチド挿入を含み、他の点では配列番号2と同一であり、各クローンについて、選択ラウンド、配列番号、および頻度(括弧内)を列挙する)。
1つ以上の網膜細胞の増加した感染性を有するキャプシドとして、以下の祖先VP1キャプシド配列を有するクローンも同定した:
この祖先のキャプシド変異体は、祖先キャプシド配列番号58から進化しており、ここでは、縮重の位置(残基264、266、268、448、459、460、467、470、471、474、495、516、533、547、551、555、557、561、563、577、583、593、596、661、662、664、665、710、717、718、719、723)が、264でアラニン(A)、266でアラニン(A)、268でセリン(S)、448でアラニン(A)、459でトレオニン(T)、460でアルギニン(R)、467でアラニン(A)、470でセリン(S)、471でアスパラギン(N)、474でアラニン(A)、495でセリン(S)、516でアスパラギン(D)、533でアスパラギン(D)、547でグルタミン(Q)、551でアラニン(A)、555でアラニネト(A)、557でグルタミン酸(E)、561でメチオニン(M)、563でセリン(S)、577でグルタミン(Q)、583でセリン(S)、593でバリン(V)、596でトレオニン(T)、661でアラニン(A)、662でバリン(V)、664でトレオニン(T)、665でプロリン(P)、710でトレオニン(T)、717でアスパラギン酸(D)、718でアスパラギン(N)、719でグルタミン酸(E)、および723でセリン(S)を含むように進化した。
本明細書に開示されるAAV変異ビリオンは、AAVウイルスベクター操作の技術分野の当業者には容易に明らかである、妥当な合理的設計パラメータ、特徴、修正、利点、および変形を組み込み得る。
実施例2
定向進化を用いて、ヒトの眼への他の遺伝子送達方法(実施例1)よりも有意な利点を有する投与経路である硝子体内(IVT)投与後の、網膜細胞への優れた遺伝子送達を有する新規のアデノ随伴ウイルス(AAV)変異体を発見した。P34A置換およびアミノ酸588に挿入されたペプチドLAISDQTKHA(配列番号28)を含む新規のAAV変異体(LAISDQTKHA+P34A、配列番号42)の硝子体内投与後の細胞向性を、ISDQTKH(配列番号14)含有AAV変異体が網膜細胞を形質導入する能力の代表例として、非ヒト霊長類(NHP)においてインビボで評価した。
AAV2キャプシドまたは新規の変異キャプシドLAISDQTKHA+P34Aのいずれか、およびCMVプロモーター(それぞれ、AAV2.CMV.GFPおよびLAISDQTKHA+P34A.CMV.GFP)またはCAGプロモーター(それぞれ、AAV2.CAG.EGFPおよびLAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP)に作動可能に連結された緑色蛍光タンパク質(GFP)導入遺伝子を含むゲノムを含む組換えAAVビリオンを、標準的な方法を使用して製造した。アフリカミドリザル(図7、8)またはカニクイザル(図9)に、1眼当たり4×1010vg~1×1012vgの範囲の様々な用量のベクターを硝子体内注射し(詳細については図の凡例を参照されたい)、網膜細胞の形質導入を、Heidelberg Spectralis(商標)を用いた眼底蛍光撮像により生存中に評価した。
新規の変異LAISDQTKHA+P34A(配列番号42)を含むAAVの硝子体内送達により、AAV2と比べてより広範かつより強固なNHP網膜にわたる導入遺伝子発現がもたらされた(図7~9)。画像により、新規のAAV変異キャプシドが、注射後2週間の早さで、中心窩の中央(錐体が豊富な領域)、傍中心窩リング(網膜神経節細胞が豊富な領域)、および末梢部(桿体、ミュラーグリア、アマクリン細胞、双極細胞を含む多くの細胞型が豊富な領域)において強固な発現を提供することが明らかとなる。対照的に、また他者によって報告された結果と一致して、野生型AAV2は、主に傍中心窩リングで起き、後の時点でしか検出することができないより弱い発現を提供する。注射の3週間後に行った網膜の様々な領域の免疫組織化学分析により、網膜色素上皮細胞、桿体および錐体光受容体、ならびに網膜神経節細胞を含む多くの網膜細胞型が、網膜全体にわたる形質導入に成功したことが確認された(図10A~10E)。
この研究により、臨床的に関連するAAV2と比較して、臨床的に好ましい投与経路の後のISDQTKH含有変異体による優れた遺伝子送達が図示される。類似の効力は、このペプチド挿入モチーフを含む他の変異体で達成可能である。同様に、同じ定向進化アプローチを使用して同定された本明細書に開示される他の変異体でも、類似の効力が達成可能である。
実施例3
網膜色素上皮(RPE)細胞および光受容体(PR)細胞に対する新規のAAV変異LAISDQTKHA+P34A(配列番号42)の細胞向性を、線維芽細胞由来ヒト誘導多能性幹細胞(FB-iPSC)またはヒト胚性幹細胞(ESC)から生成したRPE細胞およびPR細胞を使用してインビトロで評価した。
AAV2キャプシドまたは新規の変異キャプシドLAISDQTKHA+P34A(配列番号42)のいずれか、ならびにCAGプロモーター(それぞれ、AAV2.CAG.EGFPおよびLAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFP)に作動可能に連結された緑色蛍光タンパク質(EGFP)導入遺伝子を含むゲノムを含む組換えAAVビリオンを、標準的な方法を使用して製造した。45日間の分化プロトコルを使用して、ヒト胚性幹細胞株ESI-017またはヒト線維芽細胞由来誘導多能性幹細胞(FB-iPSC)からヒトRPE細胞培養物を生成した。RPE細胞への成熟は、RPE65およびBEST1を含む成熟RPEマーカーの発現、VEGFおよびPEDFの合成、ならびに桿体の外側部を貪食する能力を検出することによって確認した。PR培養物は、複数ステップの眼杯形成パラダイムによって生成し、培養の179日後にリカバリンおよびSオプシンの発現を検出することによってPRを含むことが確認された。
AAV2と比較して、LAISDQTKHA+P34A(配列番号42)は、免疫蛍光法(図11A~B)、フローサイトメトリー(2.7倍の増加、図11C~D)、およびウエスタンブロット分析(図11E~F)によって決定して、感染後7日のヒトRPE培養物の有意により高い形質導入効率およびヒトRPE培養物中の導入遺伝子発現を提供した。LAISDQTKHA+P34A.CAG.EGFPを使用した強固な形質導入および発現が、感染後32日までにヒトPR培養物中で同様に達成された。この研究により、ISDQTKH(配列番号14)含有変異体が網膜細胞に遺伝子を送達する優れた能力が図示される。
実施例4
抗VEGF発現ベクターの設計および構築アフリベルセプトのアミノ酸配列は、ヒトIgG1のFc領域に融合した、ヒトFlt1シグナルペプチド、VEGFR1ドメイン2、およびVEGFR2ドメイン3からなる(図12A、配列番号66)。ラニビズマブの軽鎖および重鎖のアミノ酸配列を可撓性タンパク質リンカーによって接合して、二本鎖抗原結合断片(Fab)を一本鎖Fab(scFab)に変換した。軽重(LH)形態は、可撓性ペプチドによって連結されたラニビズマブのヒトIgカッパ軽鎖シグナルペプチド、可変軽、定常軽、可変重、および定常重1ドメインからなる(図12B、配列番号71)。重軽(HL)形態は、シグナルペプチドがヒトIgG重鎖に由来し、重ドメインおよび軽ドメインがLH形態と比較してリンカーの反対側にあることを除いて類似している(図12C、配列番号68)。ブロルシズマブ設計は、可撓性ペプチドによって連結された可変軽ドメインおよび可変重ドメインを含み、ヒトIgカッパ軽鎖シグナルペプチドは、哺乳動物細胞から分泌される(図12D、配列番号75)。翻訳領域を、ヒト細胞からの改善した発現のためにコドン最適化し、GeneArtまたはGenScriptによって合成し、標準的なプラスミドクローニングベクターに提供した。目的のDNAを制限酵素PstIおよびBglIIでこのプラスミドから切除し、CAGプロモーターとSV 40ポリAシグナルとの間のpAAV-CAG-SV40 pAプラスミドに挿入した。sc-ラニビズマブ-Fc設計は、アフリベルセプト設計由来のヒトIgG1のFc領域に融合したsc-ラニビズマブのLH形態からなる(図12E、配列番号73)。ブロルシズマブ-Fc設計は、アフリベルセプト設計由来のヒトIgG1のFc領域に融合したブロルシズマブからなる(図12F、配列番号77)。sc-ラニビズマブLH、ブロルシズマブ、およびFc領域を、3’末端(sc-ラニビズマブLHおよびブロルシズマブ)または5’末端(Fc)にTypeIIS制限酵素BsmBIの部位を含む延長を有する初期クローニングベクターから、PCRによって増幅した。得られたPCR産物を、制限酵素PstIおよびBsmBI(sc-ラニビズマブLHおよびブロルシズマブ)またはBsmBIおよびBglII(Fc)で消化し、CAGプロモーターとSV40ポリAシグナルとの間のpAAV-CAG-SV40 pAプラスミドに挿入した。ライゲーション反応を使用して、E.coliを形質転換し、制限消化によって陽性クローンを同定した。次いで、クローンをより大きな規模で成長させ、Qiagen Endo-Free MaxiprepキットでプラスミドDNAを精製した。プラスミドの同一性を、制限消化およびシークエンシングによって検証した。pAAV-CAG-SV40ポリAプラスミドは、抗VEGF配列をAAVキャプシド内部にパッケージングし、硝子体内投与を介して網膜内の目的の細胞に送達することを可能にする、AAV2逆位末端反復配列(ITR)を含む。
HEK293T細胞を、2つの別個の実験において、FuGene6トランスフェクション試薬を使用して、CAGプロモーターの制御下にある、GFPまたは抗VEGF導入遺伝子(sc-RNBZ HL(配列番号67)、sc-RNBZ LH1(配列番号69)、およびsc-RNBZ-LH2(配列番号70)、AFLB(配列番号65)、BRO(配列番号74))のいずれかを含むプラスミドで模擬トランスフェクトまたはトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの48時間後に採取し、アフリベルセプトELISAキット(Eagle Biosciences、Immunoguide IG-AA115)でアッセイした。抗VEGFタンパク質を、キット(模擬、GFP、およびAFLB)またはHRP抗IgG H+L(sc-RNBZ HL、sc-RNBZ LH1、およびsc-RNBZ LH2)内の試薬として提供されるHRP-抗IgG Fcによって検出した。臨床Eylea(模擬、GFP、およびAFLB)またはLucentis(sc-RNBZ HL、sc-RNBZ LH1、sc-RNBZ LH2、およびBRO)に対する濃度を計算した。2つの実験のうちの第1の実験では、アフリベルセプト発現は約15ug/mlであり、sc-ラニビズマブ発現は1.6~2.8ug/mlの範囲であり、LH形態は類似の濃度を発現し、HL形態は約2倍より低い濃度を発現した(図13A)。第2の実験では、アフリベルセプト発現は約50ug/mlであり、sc-ラニビズマブLH1発現は約4.0ug/mlであった(図13B)。ブロルシズマブによるシグナルは非常に低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。模擬またはGFPトランスフェクション由来の培地中では、VEGF結合活性は検出されなかった。
実施例5
抗VEGFタンパク質を直接可視化し、タンパク質のサイズを確認するために、GFP、アフリベルセプト(配列番号65)、sc-ラニビズマブ(配列番号67、69、および70)、またはブロルシズマブ(配列番号74)発現プラスミドでトランスフェクトした細胞由来の培地のウエスタンブロット分析を行った(図14)。トランスフェクトしたHEK293T細胞由来の培地を、Bolt4~12%Bis-Tris Plusゲル(Invitrogenカタログ番号NW04122BOX)で実行し、分離したタンパク質をiBlot2デバイスでニトロセルロースに移した。ブロットを、iBind Flexデバイスを使用して、HRP共役ヤギ抗ヒトIgG Fc(Thermoカタログ番号31413、左パネル)またはヤギ抗ヒトIgG Fab(Thermoカタログ番号31482、右パネル)でプローブし、SuperSignal West Dura化学発光基質(Thermoカタログ番号34076)で可視化した。画像を、iBright FL1000撮像装置で撮像した。
アフリベルセプト試料は、臨床比較タンパク質Eyleaと同様に見える。陰性対照試料中にシグナルはなかった。臨床比較タンパク質Lucentisは、24kDの別個の軽鎖および重鎖に還元された一方、sc-ラニビズマブタンパク質は、軽鎖および重鎖を単一タンパク質に結合するポリペプチドリンカーの存在に起因して、約48kDで実行される。ELISAを通して得られるタンパク質定量化と一貫して、タンパク質のHL形態と比較して、より多くの量のタンパク質のLH形態が存在する(図13A)。ブロルシズマブシグナルは低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。タンパク質は、24kDの正しい分子量で移行する。
実施例6
VEGF結合活性を決定するための追加の方法として、VEGF競合ELISAを行った(図15)。臨床比較タンパク質EyleaまたはLucentis、およびトランスフェクトしたHEK293T細胞由来の培地を、室温で13pMのVEGFとともに一晩インキュベートした。試料を、Quantikine VEGF ELISAキット(R&D Systemsカタログ番号DVE00)を使用して、遊離VEGFについてアッセイした。2つの実験のうちの第1の実験では、トランスフェクトした試料由来の4つの抗VEGFタンパク質の阻害曲線は、臨床EyleaおよびLucentisと非常に類似していた。sc-ラニビズマブ変異体およびLucentisよりも、アフリベルセプトおよびEyleaがVEGFに対してより強く競合した(図15A)。sc-ラニビズマブの3つの形態(配列番号67、69、および70)は全て、ほぼ同一であった。第2の実験では、全ての抗VEGF構築物が、VEGFについて競合した(図15B)。GFP陰性対照試料からは、競合活性はなかった。
実施例7
トランスフェクトした細胞から発現する抗VEGFタンパク質が、VEGFのその受容体への結合、したがってその機能を遮断することを確認するために、等濃度の臨床比較タンパク質およびトランスフェクトしたHEK293T細胞由来の培地を、20ng/mlのVEGFと混合し、PathHunter KDR細胞上に置いた(DiscoverX 93-0996Y1)。これらの細胞は、VEGF結合時に活性ベータ-ガラクトシダーゼを産生する、VEGF受容体/ベータ-ガラクトシダーゼ融合タンパク質を発現する。細胞を22時間後に溶解し、ベータ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。トランスフェクトした試料由来の抗VEGFタンパク質の阻害曲線は、臨床比較タンパク質と等しく、発現タンパク質が細胞ベースのアッセイにおいてVEGF機能を遮断することを実証する(図16)。その後の2つの実験では、抗VEGF構築物でトランスフェクトしたHEK293T細胞由来の等体積の培地でも、細胞VEGF中和アッセイを行った。これらの実験の第1の実験では、GFP、アフリベルセプト(配列番号65)、sc-ラニビズマブHL(配列番号67)、またはsc-ラニビズマブLH1(配列番号69)発現プラスミドを評価した。評価した全ての抗VEGF構築物が、VEGFを中和した(図17A)。sc-ラニビズマブLH形態は、sc-ラニビズマブHL形態よりも強くVEGFを中和した。第2の実験では、GFP、アフリベルセプト(配列番号65)、sc-ラニビズマブLH1(配列番号69)、またはブロルシズマブ(配列番号74)発現プラスミドを、8ng/mlのVEGFと混合し、PathHunter KDR細胞上に置いた(DiscoverX 93-0996Y1)。細胞を18時間後に溶解し、ベータ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。再び、評価した全ての抗VEGF構築物が、VEGFを中和した(図17B)。アッセイした希釈度において、GFP対照試料からわずかなマトリックス効果が存在した。
実施例8
網膜色素上皮(RPE)細胞を、FuGeneHDトランスフェクション試薬を使用して、CAGプロモーターの制御下にある、GFPまたは抗VEGF導入遺伝子のいずれかを含むプラスミドで模擬トランスフェクトまたはトランスフェクトした。培地をトランスフェクションの48時間後に採取した。RPE細胞のトランスフェクション効率は、GFP発現細胞の数(データ示さず)によって証明されるように非常に低く、したがってこれらのトランスフェクション由来の培地中ではVEGF結合活性は検出不能であった。培地中のVEGFの総濃度を評価して、低濃度の抗VEGF剤がVEGFのRPE分泌を低下させることができるかどうかを決定した。培地をトランスフェクションの48時間後に採取し、Quantikine VEGF ELISAキット(R&D Systemsカタログ番号DVE00)でアッセイした。アフリベルセプト(配列番号65)発現後にVEGFレベルの大幅な低下、ならびにsc-ラニビズマブ(配列番号67、69、および70)発現後にVEGFレベルのわずかな低下が観察された(図18)。3つ全てのsc-ラニビズマブ形態によるVEGFレベルへの影響は、類似していた。より効率的なAAV形質導入によって送達されると、抗VEGF導入遺伝子は、より高濃度の抗VEGFタンパク質の産生をもたらし、これをアフリベルセプトELISAキットによって定量化した。
実施例9
アフリベルセプト(配列番号65)、sc-ラニビズマブ(配列番号67および69)、またはブロルシズマブ(配列番号74)の遺伝子を担持するAAV発現プラスミドを使用して、R100変異キャプシド(配列番号42として示されるアミノ酸配列を有する)中にウイルスDNAをパッケージングした。成熟RPE細胞を、1.0mlの体積のX-Vivo10培地中のこれらのベクターを用いて、12ウェルプレート中に感染効率5,000で播種した30日後に形質導入した。形質導入してから3日後に培地を変更し、形質導入してから6日後に採取および交換し、形質導入してから10日後に再び採取および交換した。
培地中のVEGFの総濃度を、Quantikine VEGF ELISAキット(R&D Systemsカタログ番号DVE00)でアッセイして、RPE細胞によって培地中に分泌される検出可能な遊離内因性VEGFのレベルに対する抗VEGFベクターでの形質導入の効果を決定した(図19)。GFP対照ベクターで形質導入された細胞によって示されるVEGFの内因性レベルは、6日目の試料中で4,500pg/ml、および10日目の試料中で8,300pg/mlであった。抗VEGFベクターの全てによる形質導入は、検出可能なVEGFを培地中にほとんどまたは全くもたらさなかった。RPE細胞によって分泌されるVEGFの量は変化しておらず、むしろ培地中のVEGFが抗VEGFタンパク質によって結合され、それがELISAによって検出不能であった可能性が高い。ウエスタンブロットを含む追加の実験を行って、結合および未結合のVEGFの総量を決定することができる。
RPE形質導入由来の培地も、アフリベルセプトELISAキット(Eagle Biosciences、 Immunoguide IG-AA115)でアッセイした。抗VEGFタンパク質を、HRP-抗IgG H+L抗体(ThermoFisherカタログ番号31410)で検出した。臨床Eylea(AFLBおよびGFP)またはLucentis(sc-RNBZ HL、sc-RNBZ LH1、およびBRO)に対する濃度を計算した。アフリベルセプト(配列番号65)発現は、6日目の試料中で約1,800ng/ml、10日目の試料中で2,800ng/mlであった。sc-ラニビズマブ発現は、HL(配列番号67)の6日目の試料の700ng/mlから、LH(配列番号69)の10日目の試料の1,700ng/mlまでの範囲であった(図20)。ブロルシズマブ(配列番号74)によるシグナルは非常に低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。GFP形質導入由来の培地中では、VEGF結合活性は検出されなかった。
実施例10
抗VEGFタンパク質を直接可視化し、タンパク質のサイズを確認するために、形質導入されたRPE細胞由来の培地のウエスタンブロット分析を行った(図21)。等体積の6日目および10日目の培地を、Bolt4~12%Bis-Tris Plusゲル(Invitrogenカタログ番号NW04122BOX)で実行し、分離したタンパク質をiBlot2デバイスでニトロセルロースに移した。ブロットを、iBind Flexデバイスを使用して、HRP共役ヤギ抗ヒトIgG Fc(Thermoカタログ番号31413、左パネル)またはヤギ抗ヒトIgG Fab(Thermoカタログ番号31482、右パネル)でプローブし、SuperSignal West Dura化学発光基質(Thermoカタログ番号34076)で可視化した。画像を、ChemiDoc MP撮像装置で撮像した。
アフリベルセプト(配列番号65)試料は、臨床比較タンパク質Eylea(黒色の矢印)と同様に見える。GFP陰性対照試料中には、正しい移動度のバンドは存在しなかった。臨床Lucentisは24kDの別個の軽鎖および重鎖に還元されるが、sc-ラニビズマブHL(配列番号67)およびLH(配列番号69)は分離されず、灰色の矢印によって示されるように、58kDの見かけ上の分子質量で移行する。ブロルシズマブ(配列番号74)によるシグナルは低く、これは検出抗体による認識不良に起因する可能性が高い。タンパク質は、点線矢印によって示されるように、26kDの正しい分子質量で移行する。タンパク質レベルは、6日目および10日目の試料中でかなり類似している。
実施例11
VEGF結合活性を決定するための追加の方法として、VEGF競合ELISAを行った(図22)。形質導入されたRPE細胞由来の等体積の培地を、室温で13pMのVEGFとともに1晩インキュベートした。試料を、Quantikine VEGF ELISAキット(R&D Systemsカタログ番号DVE00)を使用して、遊離VEGFについてアッセイした。全ての抗VEGF構築物で形質導入された細胞由来の培地が、VEGFについて競合した。6日目および10日目の試料中では、結果が類似していた。GFP陰性対照試料からは、競合活性はなかった。遊離VEGFレベルは、これはRPE細胞によって産生される内因性VEGFに起因して、最低の希釈度においてより高い。
実施例12
ウイルスベクター由来のRPE細胞中で発現する抗VEGFタンパク質のVEGF中和活性を比較するために、形質導入されたRPE細胞由来の等体積の培地を、8ng/mlのVEGFと混合し、PathHunter KDR細胞上に置いた(DiscoverX 93-0996Y1)(図23)。細胞を18時間後に溶解し、ベータ-ガラクトシダーゼ活性についてアッセイした。全ての抗VEGF構築物で形質導入された細胞由来の培地が、VEGFを中和した。GFP対照形質導入由来の培地では、VEGF中和は観察されなかった。
上記は、本発明の原理を例示するものでしかない。当業者であれば、本明細書に明示的に記載または示されていないが、本発明の原理を具体化し、その趣旨および範囲内に含まれる様々な構成を考案することができることが理解されよう。さらに、本明細書に列挙されている全ての例および条件付き言語は、主として、本発明の原理および当該技術の促進のために発明者らにより寄与される概念を理解する上で読者を助けることを意図するものであり、そのような具体的に列挙される例および条件に限定されないことが解釈されるべきである。
さらに、本発明の原理、態様、および実施形態、ならびにそれらの具体例を列挙する本明細書における全ての記述は、その構造的等価物および機能的等価物の両方を包含することが意図される。加えて、そのような等価物は、現在知られている等価物および今後開発される等価物の両方、すなわち、構造にかかわらず同じ機能を果たすいずれの開発される要素も含むことが意図される。したがって、本発明の範囲が、本明細書に示され記載される例示的な実施形態に限定されることは意図されない。むしろ、本発明の範囲および趣旨は、添付の特許請求の範囲によって具体化される。