SK17522001A3 - Modifikované chimérické polypeptidy so zlepšenými farmakokinetickými vlastnosťami - Google Patents

Modifikované chimérické polypeptidy so zlepšenými farmakokinetickými vlastnosťami Download PDF

Info

Publication number
SK17522001A3
SK17522001A3 SK1752-2001A SK17522001A SK17522001A3 SK 17522001 A3 SK17522001 A3 SK 17522001A3 SK 17522001 A SK17522001 A SK 17522001A SK 17522001 A3 SK17522001 A3 SK 17522001A3
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
flt1
fusion polypeptide
domain
vegf
amino acid
Prior art date
Application number
SK1752-2001A
Other languages
English (en)
Other versions
SK287332B6 (sk
Inventor
Nicholas J. Papadopoulos
Samuel Davis
George D. Yancopoulos
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22480568&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK17522001(A3) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Publication of SK17522001A3 publication Critical patent/SK17522001A3/sk
Publication of SK287332B6 publication Critical patent/SK287332B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Toxicology (AREA)

Description

Oblasť techniky
Predkladaný vynález sa týka modifikovaných polypeptidov so zlepšenou farmakokinetikou. Presnejšie sa predkladaný vynález týka Flt1 receptorových polypeptidov, ktoré boli modifikované tak, že majú lepší farmakokinetický profil. Predkladaný vynález sa tiež týka spôsobov prípravy a použitia modifikovaných polypeptidov, vrátane, napríklad, použitie modifikovaných polypeptidov pri znížení alebo inhibícii úniku plazmy a/alebo cievnej permeability u cicavcov.
Doterajší stav techniky
Schopnosť peptidových ligandov viazať sa na bunky a tak vyvolávať fenotypové reakcie, ako je rast buniek, ich prežívanie, sekrécia produktov bunkami alebo diferenciácia, je často sprostredkovaná transmembránovými receptormi na týchto bunkách. Extracelulárna doména takých receptorov (t.j. časť receptora vystavená na povrchu bunky) je zvyčajne najviac špecifickou časťou molekuly a dodáva proteínu charakteristické väzbové charakteristiky. Väzba ligandu na extracelulárnu doménu zvyčajne vedie k prenosu signálu, ktorým sa prenášajú biologické signály na intracelulárne ciele. Často je prenos signálu vedený cez katalytickú intracelulárnu doménu. Usporiadanie motívov v tejto katalytickej doméne určuje jej účinky na potenciálne kinázové substráty (Mohammadi et al., 1990, Mol. Celí Biol. 11: 5068-5078; Fantl et al., 1992, Celí, 69: 413-413). Príklady receptorov, ktoré prenášajú signály cestou katalytických intracelulárnych domén, zahrňujú receptorové tyrozín kinázy (RTK), ako je Trk rodina receptorov, ktoré sú zvyčajne obmedzené na bunky nervového systému, cytokinová rodina receptorov, vrátane trojdielneho CNTF receptorového komplexu (Stahl and Yancopoulos, 1994, J.
Neurobio. 25: 1454-1466), ktorá je tiež zvyčajne obmedzená na bunky nervového systému, receptory spriahnuté s G-proteínom, ako sú napríklad p2-adrenergné receptory, ktoré sa vyskytujú, napríklad, v bunkách srdcového svalu a multimérny IgE vysoko-afinitný receptor FcsRI, ktorý je lokalizovaný, napríklad, na žírnych bunkách a na bazofiloch (Sutton and Gould, 1993, Náture 366: 421-428).
Zdá sa, že všetky doposiaľ identifikované receptory podliehajú po väzbe ligandu dimerizácii, multimerizácii alebo niektorým konformačným zmenám (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem Sci., 13: 443-447; Ullrich and Schlessinger, 1990, Celí 61: 203-212 Schlessinger und Ulrich, 1992, Neurón 9: 383-391) a molekulová interakcia medzi dimerizujúcimi intracelulárnymi doménami vedie k aktivácii katalytickej funkcie. V niektorých prípadoch, ako napríklad u doštičkového rastového faktora (PDGF), je ligandom dimér, ktorý sa viaže na dve receptorové molekuly (Hart et al., 1988, Science, 240: 1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905-8912), zatiaľ čo napríklad u epidermálneho rastového faktora (EGF) je ligandom monomér (Weber et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 14631-14636). V prípade Fc RI receptora existuje ligand, IgE, naviazaný na Fc RI vo forme monoméru a je aktivovaný iba vtedy, keď sa na komplex IgE/Fc RI naviaže antigén a dôjde k zosieteniu susedných molekúl IgE (Sutton and Gould, 1993, Náture 366: 421-428)
Často ukazuje tkanivová distribúcia určitého receptora vo vyšších organizmoch na biologickú funkciu receptora. RTK pre niektoré rastové a diferenciačné faktory, ako je fibroblastový rastový faktor (FGF), sú exprimované v mnohých tkanivách a preto sa zdá, že majú nejakú úlohu pri raste tkanív a ich udržiavaní. Členovia Trk RTK rodiny (Glass and Yancopoulos, 1993, Trends in Celí Biol. 3: 262-268) sú zvyčajne obmedzené na bunky nervového systému a rodina nervového rastového faktora skladajúca sa z nervového rastového faktora (NGF), mozgového neurotrofného faktora (BDNF), neurotrofínu 3 (NT-3) a neurotrofínu-4/5 (NT-4/5), ktoré sa viažu na Trk rodinu RTK, podporuje diferenciáciu rôznych skupín neurónov v mozgu a na periférii (Lindsay, R.M., 1993, v Neurotrofic Factors, S.E. Loughlin and J.H.Fallon, ed., str. 257-284, San Diego, CA, Academic Press). Fc RI sa vyskytuje na veľmi obmedzenom počte typov buniek, ako sú žírne bunky a bazofily. Žírne bunky vznikajú z pluripotentných hematopoetických kmeňových buniek kostnej drene, ale dozrievajú v tkanivách po migrácii z krvného riečiska (pozri Janeway a Travers, 1996, Immunology, 2. vydanie, M. Robertson a E. Lawrence, ed., str. 1: 3-1: 4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher) a podieľajú sa na alergickej reakcii.
Veľa štúdií preukázalo, že extracelulárna doména receptora dodáva špecifické charakteristiky väzby ligandu. Ďalej, bunkové prostredie, v ktorom je receptor exprimovaný, môže ovplyvňovať biologickú reakciu vznikajúcu po väzbe ligandu na receptor. Napríklad, keď je neuronálna bunka exprimujúca Trk receptor vystavená pôsobeniu neurotrofínu, ktorý sa viaže na tento receptor, tak dôjde k prežívaniu bunky a diferenciácii. Keď je rovnaký receptor exprimovaný fibroblastami, tak vedie vystavenie pôsobenia neurotrofínu k proliferácii fibroblastov (Glass et al., 1991, Celí. 66: 405-413).
Bola identifikovaná trieda bunkových dimérnych mitogénov so selektivitou pre cievne endotelové bunky a táto trieda bola označená ako cievny endotelový rastový faktor (VEGF). VEGF bol prečistený z kondiciovaného rastového média krysích gliómových buniek (Conn et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, str. 26282632); a z kondicionovaného rastového média folikulárnych hviezdicovitých buniek hovädzej hypofýzy (Ferrara and Henzel, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161, str. 851-858 Gozpadorowicz et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7311-7315); a z kondicionovaného média z ľudských U937 buniek (Connolly, D.T. et al., 1989, Science, 246: 1309-1312). VEGF je dimér so zreteľnou molekulovou hmotnosťou približne 46 kDa, kde každá podjednotka má zreteľnú molekulovú hmotnosť približne 23 kDa. VEGF má určitú štrukturálnu podobnosť s doštičkovým rastovým faktorom (PDGF), ktorý je mitogénom pre bunky spojivového tkaniva, ale ktorý nie je mitogénny pre cievne endotelové bunky z veľkých ciev. ‘
Bolo zistené, že membránový tyrozín-kinázový receptor, známy ako Fit, je VEGF receptorom (DeVries, C. et al., 1992, Science 255, str. 989-991). Fit receptor špecificky viaže VEGF, ktorý indukuje mitogenézu. O inej forme VEGF receptora, označenej KDR, je tiež známe, že viaže VEGF a indukuje mitogenézu. Tiež je známa čiastočná cDNA sekvencia a temer kompletná proteínová sekvencia KDR (Terman, B.I. et al., 1991, Oncogene 6, str. 1677-1683; Terman, B.I. et al., 1992, Biochem
Biophys. Res. Comm. 187, str. 1579-1586).
Perzistujúca angiogenéza môže spôsobovať alebo exacerbovať niektoré ochorenia, ako je psoriáza, reumatoidná artritída, hemangiómy, angiofibrómy, diabetická retinopatia a neovaskulámy glaukóm. Inhibítor aktivity VEGF by bol účinný v liečbe takých ochorení a tiež inej patologickej angiogenézy cievnej permeability indukovanej VEGF, ako je vaskularizácia nádorov. Predkladaný vynález sa týka VEGF inhibítora, ktorý je založený na VEGF receptore Flt1.
Únik plazmy, kľúčová zložka zápalu, sa vyskytuje v rôznych podskupinách mikrociev. Konkrétne, vo väčšine orgánov dochádza k úniku plazmy špecificky vo venulách. Na rozdiel od arteriol a kapilár sa venuly stávajú priepustnými v reakcii na rôzne zápalové mediátory, ako je histamín, bradykinín a serotonín. Jednou charakteristikou zápalu je únik plazmy, ku ktorému dochádza v dôsledku medzibunkových medzier v endoteli venúl. Väčšina experimentálnych modelov zápalu naznačuje, že tieto medzibunkové medzery sa vyskytujú medzi endotelovými bunkami postkapilárne v zberných venulách (Baluk, P. et al., Am. J. Pathol. 1998, 152: 1463-76). Bolo preukázané, že niektoré lektíny môžu byť použité na odhalenie lokálnych miest úniku plazmy, medzier v endoteli a finger-like procesov na hraniciach endotelových buniek vo venulách v zápalovom ložisku (Thurston, G. et al., Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547-62). Konkrétne, rastlinné lektíny boli použité na vizualizáciu morfologických zmien v endotelových bunkách v zápalových venulách krysej priedušnice. Lektíny, ako je konkavalín A a ricín, ktoré sa viažu lokálne na zápalové venuly, ukázali regióny steny ciev pod medzerami v endoteli, ktoré zodpovedajú regiónom úniku plazmy (Thurston G. et al., Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547-62).
Vlastnosti mikrociev sú dynamické. Chronické zápalové ochorenia sú asociované s prestavbou mikrovaskulatúry, vrátane angiogenézy a zväčšovania mikrociev. Mikrocievy môžu byť tiež prestavené tak, že majú abnormálne vlastnosti. V myšom modeli chronického zápalu dýchacích ciest získavajú kapiláry dýchacích ciest vlastnosti venúl, vrátane zväčšenia priemeru ciev, zvýšenia reaktivity pre von Wilebrandov faktor a zvýšenia reaktivity pre P-selektín. Ďalej, tieto remodelované cievy sa stávajú priepustnými v reakcii na zápalové mediátory, zatiaľ čo cievy v rovnakej lokalizácii v dýchacích cestách normálnych myší nie.
Bolo preukázané, že niektoré substancie znižujú alebo inhibujú cievnu permeabilitu a/alebo unikanie plazmy. Napríklad mystixíny sú syntetické polypeptidy, ktoré inhibujú unikanie plazmy bez blokovania tvorby endotelových medzier (Baluk, P. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998, 284; 693-9). Tiež agonista beta-2adrenergných receptorov formoterol redukuje priepustnosť mikrociev tým, že inhibuje tvorbu endotelových medzier (Baluk, P. and McDonald, D.M., Am. J. Physiol., 1994, 266; L461-8).
Angiopoetíny a členy rodiny cievneho endotelového rastového faktora (VEGF) sú jedinými rastovými faktormi, o ktorých sa súdi, že sú špecifické pre cievne endotelové bunky. Pokusy s cielenou inaktiváciou génov u myší ukázali, že VEGF je potrebný pre skoré štádia vývoja ciev a že pre neskoršie štádia remodelovania ciev je potrebný Ang-1.
US patent č. 6011003, udelený 4.1.2000 (Metris Therapeutics Limited), opisuje alterovanú, solubilnú formu FLT polypeptidu, ktorý je schopný väzby na VEGF a preto má inhibičný efekt na VEGF, kde uvedený polypeptid sa skladá z piatich alebo menej kompletných imunoglobulínových domén.
US patent č. 5712380, udelený 27.1.1998 (Merck and Co.) opisuje inhibítory cievneho endotelového rastového faktora (VEGF), ktoré sú buď prirodzené alebo rekombinantne upravené solubilné formy s alebo bez C-koncového transmembránového regiónu receptora pre VEGF.
PCT prihláška č. WO 98/13071, publikovaná 2.4.1998 (Merck and Co.) opisuje techniku génovej terapie pre inhibíciu rastu primárneho nádoru a metastáz pomocou génového prenosu nukleotidovej sekvencie kódujúcej solubilný receptorový protein, ktorý sa viaže na VEGF.
PCT prihláška č. WO 97/44453, publikovaná 27.11.1997 (Genetech, Inc.) opisuje nové chimérické VEGF receptorové proteíny obsahujúce aminokyselinové sekvencie odvodené od receptorov pre cievny endotelový rastový faktor (VEGF) Flt1 a KDR, vrátane myšieho homológu pre ľudský KDR receptor FLK1, kde uvedené chimérické VEGF receptorové proteíny sa viažu na VEGF a antagonizujú proliferačné a angiogénne aktivity endotelových buniek.
PCT prihláška č. WO 97/13787, publikovaná 17.4.1997 (Toa Gosei Co. Ltd.), opisuje inhibítor VEGF s nízkou molekulovou hmotnosťou použiteľný v liečbe ochorení spojených s neovaskularizáciou, ako sú solidné nádory. Polypeptid obsahujúci prvú imunoglobulínu podobnú doménu a druhú imunoglobulínu podobnú doménu v extracelulárnom regióne VEGF receptora Fit, ale neobsahujúcu šiestu imunoglobulínu podobnú doménu a siedmu imunoglobulínu podobnú doménu, vykazuje inhibičnú aktivitu vzhľadom na VEGF.
Sharifi, J. et al., 1998, The Quarterly Jour. of Nucl. Med. 42: 242-249, opisujú, že v dôsledku toho, že monoklonálne protilátky (MAb) sú bázické proteíny s pozitívnym nábojom a cicavčie bunky majú negatívny náboj, môžu elektrostatické interakcie medzi nimi vysoké základné interakcie vedúce k nízkemu pomeru nádor vs. normálne orgány. Na vyriešenie tohto dôsledku sa výskumníci pokúsili zlepšiť clearanciu mAb pomocou rôznych metód, ako sú sekundárne činidlá alebo chemické alebo elektrické modifikácie mAb samotných.
Jensen-Pippo et al., 1996, Pharmaceutical Research 13: 102-107, opisujú, že pegylácia terapeutického proteínu, rekombinantného ľudského faktora stimulujúceho kolónie granulocytov (PEG-G-CSF), vedie k zvýšeniu jeho stability a k retencii biologickej aktivity in vivo, keď je tento proteín podaný intraduodenálne.
Tsutsumi et al., 1997, Thromb. Haemost. 77: 168-73, opisujú pokusy, pri ktorých bola in vivo trombopoetická aktivita interleukínu 6 modifikovaného polyetylénglykolom (MPEG-IL-6), v ktorom bolo 54 % zo 14 lyzínových amino skupín IL-6 viazané na PEG, porovnávaná s aktivitou prirodzeného IL-6.
Yang et al., 1995, Cancer 76: 687-94, opisujú, že konjugácia polyetylénglykolu na ľudský interleukin-2 (IL-2) vedie k zisku zlúčeniny (polyetylén-glykolom modifikovaného IL-2 (PEG-IL-2)), ktorá si zachováva in vitro a in vivo aktivitu IL-2, ale ktorá má významne predĺžený cirkulačný polčas.
R. Duncan and F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306, 296 (1994) uvádzajú prehľad snáh o zlepšenie plazmatického polčasu asparaginázy pomocou konjugácie s polyetylénglykolom.
PCT medzinárodná prihláška č. WO 99/03996, publikovaná 28.1.1999 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc. a The Reagents of The University of California) opisuje modifikované ľudské podporné polypeptidy obsahujúce delécie regiónov s bázickými aminokyselinami. Je opísané, že modifikované ľudské podporné polypeptidy si zachovávajú biologickú aktivitu a zároveň majú redukovanú afinitu pre heparín a lepšiu farmakokinetiku vo zvieracom sére v porovnaní s nemodifikovaným ľudským podporným polypeptidom.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález je zameraný na antagonisty VEGF so zlepšenými farmakokinetickými vlastnosťami. Výhodným uskutočnením je izolovaná molekula nukleovej kyseliny kódujúca fúzny polypeptid schopný väzby na VEGF polypeptid obsahujúci: (a) nukleotidovú sekvenciu kódujúci zložku VEGF receptora operatívne naviazanú na (b) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu multimerizačnú zložku, kde VEGF receptorová zložka je jediná VEGF receptorová zložka fúzneho polypeptidu a kde sa nukleotidová sekvencia (a) skladá v podstate z nukleotidovej sekvencie kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu Ig domény 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora a nukleotidovej sekvencie kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu Ig domény 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
V prvom uskutočnení je izolovanou nukleotidovou kyselinou prvého VEGF receptora Fit 1.
V ďalšom uskutočnení je izolovanou nukleotidovou kyselinou druhého VEGF receptora Flk1.
V ešte ďalšom uskutočnení je izolovanou nukleotidovou kyselinou druhého VEGF receptora Flt4.
V ďalšom výhodnom uskutočnení je nukleotidová sekvencia kódujúca Ig doménu 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora pred nukleotidovou sekvenciou kódujúcou Ig doménu 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
V ďalšom výhodnom uskutočnení je nukleotidová sekvencia kódujúca Ig doménu 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora za nukleotidovou sekvenciou kódujúcou Ig doménu 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
Vo výhodnom uskutočnení vynálezu obsahuje multimerizačná zložka imunoglobulínovú doménu.
V inom uskutočnení je imunoglobulínová doména vybraná zo skupiny zahrňujúcej Fc doménu IgG, ťažký reťazec IgG a ľahký reťazec IgG.
Medzi výhodné uskutočnenia patrí izolovaná molekula nukleovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúca modifikovaný Flt1 receptorový fúzny polypeptid, kde kódujúci región molekuly nukleovej kyseliny sa skladá z nukleotidovej sekvencie vybranej zo skupiny zahrňujúcej:
(a) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 13A-13D;
(b) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 14A-14C;
(c) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 15A-15C;
(d) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 16A-16D;
(e) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 21A-21C;
(f) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 22A-22C;
(g) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 24A-24C; a (h) nukleotidové sekvencie, ktoré sa - v dôsledku degenerácie genetického kódu 9 líšia od nukleotidovej sekvencie (a), (b), (c), (d), (e), (f) alebo (g) a ktoré kódujú molekulu fúzneho polypeptidu majúceho biologické aktivity Flt1 receptorového fúzneho polypeptidu.
V ďalšom uskutočnení vynálezu je fúzny polypeptid kódovaný izolovanou molekulou nukleovej kyseliny opísanou vyššie.
Výhodným uskutočnením je prípravok schopný väzby VEGF molekuly za vzniku nefunkčného komplexu obsahujúceho multimér fúzneho polypeptidu.
Výhodný je tiež prípravok, v ktorom je multimérom dimér.
V ešte inom uskutočnení obsahuje prípravok nosič.
Iným uskutočnením je vektor, ktorý obsahuje molekulu nukleovej kyseliny opísanú vyššie, vrátane expresného vektora obsahujúceho opísané molekuly nukleovej kyseliny, v ktorých je molekula nukleovej kyseliny operatívne naviazaná na sekvenciu riadiacu expresiu.
Ďalšími uskutočneniami sú systémy vektor-hostiteľ na produkciu fúzneho polypeptidu, ktoré obsahujú expresný vektor, vo vhodnej hostiteľskej bunke; systémy hostiteľ-vektor, v ktorých je vhodnou hostiteľskou bunkou bakteriálna bunka, kvasinka, hmyzia bunka alebo cicavčia bunka; systémy hostiteľ-vektor, v ktorých je vhodnou hostiteľskou bunkou E. coli', systémy hostiteľ-vektor, v ktorých je vhodnou hostiteľskou bunkou COS bunka; systémy hostiteľ-vektor, v ktorých je vhodnou hostiteľskou bunkou CHO bunka.
Iným uskutočnením vynálezu je spôsob prípravy fúzneho polypeptidu, ktorý zahŕňa kultiváciu buniek systému vektor-hostiteľ za podmienok umožňujúcich produkciu fúzneho polypeptidu a odber takto produkovaného fúzneho polypeptidu.
Ďalšie uskutočnenia zahrňujú fúzny polypeptid kódovaný sekvenciou nukleovej kyseliny uvedenej na obr. 10A-10D alebo na obr. 24A-24C, ktorý bol modifikovaný acetyláciou alebo pegyláciou, kde acetylácia je uskutočnená s aspoň 100-násobným molárnym nadbytkom acetylačného činidla alebo kde je acetylácia uskutočnená s molárnym nadbytkom acetylačného činidla v rozmedzí od aspoň približne 10-násobku do približne 100-násobku, alebo kde pegylácia je 10K alebo 22 PEG.
Výhodným uskutočnením je spôsob na zníženie alebo inhibiciu úniku plazmy u cicavcov, ktorý zahŕňa podanie fúzneho polypeptidu opísaného vyššie cicavcovi, vrátane uskutočnení, v ktorých je cicavcom človek a fúzny polypeptid acetylovaný alebo pegylovaný.
Ďalším uskutočnením je fúzny polypeptid, ktorý sa špecificky viaže na ligand VEGF receptora, ktorým je VEGF.
Výhodným uskutočnením vynálezu je spôsob na blokovanie rastu krvných ciev u človeka, ktorý zahŕňa podanie účinného množstva fúzneho polypeptidu opísaného vyššie.
Výhodným uskutočnením vynálezu je tiež spôsob na inhibiciu aktivity ligandu VEGF receptora u človeka, ktorý zahŕňa podanie účinného množstva fúzneho polypeptidu opísaného vyššie.
Výhodnými uskutočneniami týchto metód sú tie uskutočnenia, v ktorých je cicavcom človek.
Ďalšie uskutočnenie spôsobov podľa predkladaného vynálezu zahrňujú spôsob na zmiernenie alebo prevenciu rastu nádorov u človeka; zmiernenie alebo prevenciu vzniku opuchov u človeka, najmä edému mozgu; zmiernenie alebo prevenciu vzniku ascitu u človeka, najmä vtedy, keď ide o ascites spojený s karcinómom ovaria.
Výhodnými uskutočneniami vynálezu sú fúzne polypeptidy schopné väzby na VEGF polypeptid obsahujúci (a) zložku VEGF receptora operatívne naviazanú na (b) multimerizačnú zložku, kde VEGF receptorová zložka je jediná VEGF receptorová zložka fúzneho polypeptidu a skladá sa v podstate z aminokyselinovej sekvencie Ig domény 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora a aminokyselinovej sekvencie Ig domény 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
V ďalšom uskutočnení fúzneho polypeptidu je prvým VEGF receptorom Flt1.
V ešte ďalšom uskutočnení fúzneho polypeptidu je druhým VEGF receptorom
Flk1.
V ešte ďalšom uskutočnení fúzneho polypeptidu je druhým VEGF receptorom
Flt4.
Výhodnými uskutočneniami sú fúzne polypeptidy, v ktorých je aminokyselinová sekvencia Ig domény 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora pred aminokyselinovou sekvenciou Ig domény 2 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora a fúzne polypeptidy, v ktorých je aminokyselinová sekvencia Ig domény 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora za aminokyselinovou sekvenciou Ig domény 2 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
V ešte inom uskutočnení obsahuje multimerizačná zložka fúzneho polypeptidu imunoglobulínovú doménu a sem patrí tiež uskutočnenie, v ktorom je imunoglobulínová doména vybraná zo skupiny zahrňujúcej Fc doménu IgG, ťažký reťazec IgG a ľahký reťazec IgG.
• ,1
Medzi výhodné uskutočnenia patrí fúzny polypeptid obsahujúci aminokyselinovú sekvenciu modifikovaného Flt1 receptora, kde aminokyselinová sekvencia je vybraná zo skupiny zahrňujúcej:
(a) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 13A-13D;
(b) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 14A-14C;
(c) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 15A-15C;
(d) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 16A-16D;
(e) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 21A-21C;
(f) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 22A-22C; a (g) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 24A-24C.
Iným výhodným uskutočnením je spôsob na zníženie alebo inhibíciu úniku plazmy u cicavca, ktorý zahŕňa podanie polypeptidu opísaného vyššie uvedenému cicavcovi.
Iným výhodným uskutočnením je spôsob inhibície aktivity ligandu VEGF receptora u cicavca, ktorý zahŕňa podanie polypeptidu opísaného vyššie uvedenému cicavcovi.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1. IEF gélová analýza nemodifikovaných a acetylovaných Flt1(1-3)-Fc proteínov. Nemodifikovaný Flt1 (1 -3)-Fc proteín nie je schopný prenikať gélom v dôsledku svojho pH >9,3, zatiaľ čo acetylovaný Flt1 (1 -3)-Fc proteín je schopný prestupovať gélom a dosahuje rovnováhu pri pl 5,2.
Obr. 2. Väzba nemodifikovaného Flt1 (1-3)-Fc a acetylovaného Flt1(1-3)-Fc proteínu na platni potiahnutej Matrigelom®. Nemodifikované Flt1(1-3)-Fc proteíny sa výrazne viažu na zložky extracelulárnej matrice v Matrigeli®, zatiaľ čo acetylované Flt1(1-3)-Fc proteíny sa neviažu.
Obr. 3. Väzba nemodifikovaných Flt1(1-3)-Fc proteínov, acetylovaných Flt1(1-3)-Fc proteínov a pegylovaných Flt1(1-3)-Fc proteínov v teste na báze Biacore. Acetylované (stĺpce 13-16), pegylované (stĺpce 17-20) a heparínom spracované Flt1(1-3)-Fc (stĺpce 21-24) boli každý schopný úplne kompetovať s Flt1(1-3)-Fc naviazaným na Biacore čip o väzbu na VEGF v porovnaní s kontrolnými (stĺpce 1-4) a irelevantnými proteínmi (stĺpce 5-8). Nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc (stĺpce 5-6) ako jediný čiastočne kompetuje s Flt1(1-3)-Fc naviazaným na Biacore čip s väzbou VEGF. Avšak, premytie naviazaných vzoriek 0,5 M NaCl (stĺpce 7-8) viedlo k zisku väzbového profilu podobného väzbovému profilu modifikovaných foriem Flt1 (1 -3)-Fc, čo naznačuje, že nemodifikovaný proteín vykazuje nešpecifickú väzbu na čip, ktorá môže byť eliminovaná premytím roztokom soli.
Obr. 4. Väzba nemodifikovaného Flt1 (1 -3)-Fc, acetylovaného Flt1(1-3)-Fc a pegylovaného Flt1(1-3)-Fc na VEGF v teste na báze ELISA. Ako pegylovaný, tak acetylovaný Flt1(1-3)-Fc sa viaže na VEGF s afinitami blížiacimi sa nemodifikovanému Flt1 (1 -3)-Fc.
Obr. 5. Farmakokinetické profily nemodifikovaného Flt1 (1-3)-Fc, acetylovaného Flt1(1-3)-Fc a pegylovaného Flt1 (1 -3)-Fc. Balb/c myšiam (23-28 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fit1(1-3)Fc. Myšiam sa odoberala krv z chvosta za 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni a 3 dni po injekcii proteínu a sérum sa testovalo v štandardnom ELISA teste určenom na detekciu Flt1(1-3)-Fc proteínu. Tmax pre všetky Flt1(1-3)-Fc proteíny boli medzi 6 hodinami a 24 hodinami. Cmax pre rôzne proteíny boli nasledujúce: nemodifikovaný 0,06 pg/ml - 0,15 pg/ml; acetylovaný - 1,5 pg/ml - 4,0 ng/ml; a pegylovaný - približne 5 pg/ml.
Obr. 6A-6B. IEF gélová analýza nemodifikovaných a postupne acetylovaných Flt1 (13)-Fc proteínov. Nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc proteín nie je schopný prestupovať gélom v dôsledku svojho pH > 9,3, zatiaľ čo väčšina postupne acetylovaných Flt1 (13)-Fc (30-100 násobný nadbytok vzoriek) boli schopné migrovať gélom a dosahovali rovnováhu pri pl v rozmedzí od 4,55-8,43, podľa stupňa acetylácie.
Obr. 7. Väzba nemodifikovaného Flt1 (1-3)-Fc a postupne acetylovaných Flt1(1-3)-Fc proteínov na platni potiahnutej Matrigelom®. Rovnako ako irelevantný kontrolný proteín nevykazujú postupne acetylované FIt1(1-3)-Fc (20 a 30-násobné vzorky) akúkoľvek väzbu na platni potiahnutej Matrigelom®, zatiaľ čo neacetylovaný Flt1 (1 -3)Fc proteín vykazuje významnú väzbu. 10-násobné vzorky vykazujú redukovanú väzbu, ale stupeň acetylácie nie je dostatočný na úplné blokovanie väzby na zložky extracelulárnej matrice.
Obr. 8. Väzba nemodifikovaného Flt1(1-3)-Fc a postupne acetylovaného Flt1 (1-3)-Fc v teste na báze Biacore. V sub-stechiometrickom pomere (0,5 μg/ml buď nemodifikovaného Flt1 (1 -3) alebo postupne acetylovaného Flt1 (1-3)-Fc vs. 0,2 pg/ml VEGF) nie je v roztoku dostatok Flt1(1-3)-Fc (nemodifikovaného alebo acetylovaného) na úplnú väzbu VEGF. Pri 1,0 pg/ml, čo je približne 1: 1 stechiometrický pomer, sú ako nemodifikovaný, tak postupne acetylovaný Flt1 (1-3)Fc lepšie schopné kompetovať o väzbu VEGF, ale stále ešte nie je dostatok Flt1 (1 3)-Fc proteínu (nemodifikovaného alebo postupne acetylovaného) pre kompletnú saturáciu dostupného VEGF. Avšak, pri 5,0 pg/ml, čo je niekoľkokrát viac, ako je stechiometrický pomer 1: 1, sú ako Flt1 (1 -3)-Fc, tak postupne acetylovaný Flt1(1-3)Fc proteíny schopné saturovať VEGF, bez ohľadu na stupeň acetylácie.
Obr. 9. Farmakokinetické profily nemodifikovaného Flt1(1-3)-Fc a postupne acetylovaného Flt1 (1 -3)-Fc. Balb/c myšiam (23-28 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného alebo 10, 20, 40, 60 a 100-násobné vzorky postupne acetylovaného Flt1(1-3)-Fc (3 myši pre nemodifikovaný, 10, 20 a 40-násobné vzorky a 2 myši pre 60 a 100-násobné vzorky). Myšiam sa odoberala krv z chvosta za 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni a 3 dni po injekcii proteínu a sérum sa testovalo v ELISA teste, určenom na detekciu Flt1(1-3)-Fc proteínu. Tmax pre všetky testované Flt1(1-3)-Fc proteíny boli 6 hodín, ale Cmax boli nasledujúce: nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc - 0,06 pg/ml; 10-násobný nadbytok - 0,7 pg/ml; 20-násobný nadbytok - 2,0 pg/ml; 40násobný nadbytok - 4,0 pg/ml; 60-násobný nadbytok - 2,0 pg/ml; 100-násobný nadbytok - 1,0 pg/ml.
Obr. 10A-10D. Sekvencie nukleových kyselín a odvodené aminokyselinové sekvencie Flt1 (1 -3)-Fc.
Obr. 11. Schematický diagram štruktúry Flt1.
Obr. 12A a 12B. Analýza hydrofilnosti aminokyselinových sekvencií Ig domény 2 a Ig domény 3 Flt1.
Obr. 13A-13D. Sekvencie nukleových kyselín a odvodené aminokyselinové sekvencie Mut1: Fit1 (1-3ab)-Fc.
Obr. 14A-14C. sekvencie Mut2: Sekvencie nukleových Flt1 (2-3AB)-Fc. kyselín a odvodené aminokyselinové ~
Obr. 15A-15C. sekvencie Mut3: Sekvencie nukleových Flt1(2-3)-Fc. kyselín a odvodené aminokyselinové
Obr. 16A-16D. sekvencie Mut4: Sekvencie nukleových Flt1 (1-3r^n)-Fc. kyselín a odvodené aminokyselinové
Obr. 17. Väzba nemodifikovaného Flt1 (1-3)-Fc, mutantného Flt1(1-3)-Fc s deléciou bázického regiónu a mutantného proteínu Flt1 (1-3)r^n v teste na báze Biacore. Pri sub-stechiometrickom pomere (0,25 pg/ml Flt1 (1-3)-Fc nemodifikovaných, acetylovaných alebo geneticky modifikovaných vzoriek vs. 0,1 pg/ml VEGF) je nedostatok Flt1(1-3)-Fc proteínu na blokovanie väzby VEGF na Flt1(1-3)-Fc imobilizovaný na Biacore čipu. Pri 0,5 pg/ml nemodifikovaných, acetylovaných alebo geneticky modifikovaných Flt1 (1-3)-Fc proteinov je stechiometrický pomer približne 1:. 1 a je zrejmá zvýšená schopnosť blokovania väzby VEGF na Biacore čip. Pri 1,0 pg/ml nemodifikovaných, acetylovaných alebo geneticky modifikovaných Flt1 (1-3)-Fc proteinov je stechiometrický pomer približne 10: 1 a Flt1(1-3)-Fc proteíny sú schopné blokovať väzbu VEGF na Biacore čip, ale nie sú rovnocenné. Nemodifikovaný, acetylovaný a Mut1: Flt1(1-3AB)-Fc sú v podstate rovnocenné v schopnosti, blokovať väzbu VEGF, zatiaľ čo Mut4: Flt1 (1 -3R^N)-Fc je o niečo menej účinný v blokovaní väzby.
Obr. 18. Väzba nemodifikovaného Flt1 (1-3)-Fc, Múti: Flt1 (1 -3ab)-Fc, M,ut2: Flt1(23δΒ)-Ρο a Flt1(2-3) mutantných proteinov na platne potiahnuté Matrigelom®. Nemodifikovaný Flt1 (1-3)-Fc proteín sa viaže dobre na tieto jamky, Mut3: Flt1 (2-3)-Fc proteín sa viaže o niečo slabšie a Mut1(2-3úB)-Fc proteín má najlepší profil s väzbou slabšou ako ktorýkoľvek iný mutantný proteín. Mut4: FU1(1-3r^n)-Fc glykozylovaný mutantný proteín je v tomto teste iba o niečo lepší.
Obr. 19. Väzba nemodifikovaného Flt1 (1 -3)-Fc, Mut1: Flt1 (1-3ab)-Fc, Mut2: Flt1(216
3áB)-Fc a Flt1 (2-3) mutantných proteínov v teste na báze ELISA. Pri testovaných koncentráciách sa viaže nemodifikovaný Flt1 (1 -3)-Fc, Mut1: Flt1 (1 -3ab)-Fc, Mut2: Flt1 (2-3ab)-Fc a Flt1 (2-3) mutantné proteíny na VEGF podobne.
Obr. 20 Farmakokinetické profily pre nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc, Muťl: Flt1 (1 -3δΒ)Fc, Mut2; Flt1 (2-3ab)-Fc a Flt1 (2-3) mutantné proteíny. Cmax pre všetky tieto činidlá boli nasledujúce: nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc - 0,15 pg/ml; 40-násobný molárny nadbytok acetylovaného Flt1(1-3)-Fc -1,5 μς/πιΙ; a Mut1: Flt1(1-3áB)-Fc - 0,7 pg/ml.
Obr. 21A-21C. Sekvencia nukleovej kyseliny a odvodená aminokyselinová sekvencia modifikovaného Flt1 receptora označeného Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a).
Obr. 22A-22C. Sekvencia nukleovej kyseliny a odvodená aminokyselinová sekvencia modifikovaného Flt1 receptora označeného Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a).
Obr. 23. Test na extracelulárnej matrici (ECM). Výsledky tohto testu ukazujú, že Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a), proteíny sú významne menej lepivé na ECM v porovnaní s Flt1 (1 -3)-Fc proteínom.
Obr. 24A-24C. Sekvencia nukleovej kyseliny a odvodená aminokyselinová sekvencia modifikovaného Flt1 receptora označeného VEGFR1R2.FcAC1(a).
Obr. 25A-25C. Fosforylačný test. Pri 1,5 molárnom nadbytku buď Flt1 (1-3)-Fc alebo Flt1 (1-3)-Fc (A40) alebo dočasného Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) dochádza ku kompletnej blokáde receptorovej stimulácie týchto troch modifikovaných Flt1 receptorov v porovnaní s expozíciou kontrolnému médiu. Naopak, dočasný Flt1D2VEGFR3D3.FcAC1(a) nevykazuje pri tomto molárnom nadbytku žiadnu blokádu, v porovnaní s VEGF pozitívnou kontrolou. Podobné výsledky sú uvedené na obr. 25B, kde sú modifikované Fit receptory v 3-násobnom molárnom nadbytku vzhľadom na VEGF165 ligandu. Na obr. 25C, kde sú modifikované Flt1 receptory v
6-násobnom molárnom nadbytku k VEGF165 ligandu, je uvedené, že dočasný Flt1D2VEGFR3D3.FcAC1(a) čiastočne blokuje VEGF-165 indukovanú stimuláciu bunkových povrchových receptorov.
Obr. 26A-26B. Fosforylačný test. Westernová hybridizácia na tyrozíne fosforylovaných VEGFR2 (Flk1) VEGF165 ligandom ukazuje, že povrchové bunkové receptory nie sú fosforylované expozíciou so vzorkami, ktoré obsahovali VEGF165 preinkubovaný v 1 a 2-násobnom molárnom nadbytku (obr. 26A) alebo 3- alebo 4násobnom molárnom nadbytku (obr. 26B) buď s dočasným Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) alebo stabilným Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) alebo s dočasným VEGFR1R2-FcAC1(a). Pri všetkých testovaných koncentráciách modifikovaného Flt1 receptora je zrejmá kompletná väzba VEGF165 ligandu v priebehu inkubácie, čo vedie k nedetekovateľnej stimulácii povrchových bunkových receptorov neviazaným VEGF v porovnaní s kontrolným médiom.
Obr. 27. MG/R2 bunkový proliferačný test. Nasledujúce modifikované Fit receptory Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) a Flt1D2VEGFR3D3.FcAC1(a) a irelevantný receptor označený Tie2-Fc ako negatívna kontrola, boli titrované od 40 nM do 20 pM a boli inkubované na bunkách počas 1 hodiny pri 37 °C. Ľudský rekombinantný VEGF165 v definovanom médiu sa potom pridal do všetkých jamiek v koncentrácii
1,56 nM. Negatívny kontrolný receptor Tie2-Fc neblokoval proliferáciu buniek indukovanú VEGF165 v žiadnej koncentrácii, zatiaľ čo Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) blokoval 1,56 nM VEGF165 pri polovičnej maximálnej dávke 0,8 nM. Flt1(1-3)-Fc a Flt1D2VEGFR3D3.FcAC1(a) boli menej účinné v blokovaní VEGF165 v tomto teste s polovičnou maximálnou dávkou približne 2 nM. VEGF165 sám mal pri odpočítaní absorbanciu 1,2 jednotky a pozadie je 0,38 absorbačných jednotiek.
Obr. 28. Biacore analýza väzbovej stechiometrie. Väzbová stechiometria bola vypočítaná ako molárny pomer naviazaného VEGF165 k imobilizovanému Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2FcAC1(a), s použitím konverzného faktora 1000 RU ekvivalentných 1 ng/ml. Výsledky ukazujú väzbovú stechiometriu jednej VEGF165 dimérnej molekuly na jednu molekulu Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2FcAC1(a).
Obr. 29 a Obr. 30. Stechiometria chrómatografie s vylučovaním podľa veľkosti. Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2FcAC1(a) v koncentrácii 1 nM (čo by malo byť 1000-krát viac ako KD interakcia Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2FcAC1(a)/VEGF165) sa zmiešali s rôznymi koncentráciami VEGF165. Po inkubácii sa merali koncentrácie voľného Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) v roztoku. Údaje ukazujú, že adícia VEGF165 do roztoku Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) úplne blokuje väzbu Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) na povrch VEGF165. Tento výsledok ukazuje na väzbovú stechiometriu jednej molekuly VEGF165 na jednu molekulu Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a).
Obr. 31. Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti (SEC) pri natívnych podmienkach. Pík 1 predstavuje komplex Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a)/VEGF165 a pík 2 predstavuje nenaviazaný VEGF165. Frakcie eluované medzi 1,1 a 1,2 ml sa kombinovali a pridal sa guanidínium hydrochlorid (GuHCI) v konečnej koncentrácii 4,5 M na disociáciu komplexu.
Obr. 32. Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti (SEC) pri disociačných podmienkach. Na separovanie zložiek komplexu receptor-ligand a na určenie ich molárneho pomeru sa 50 μΙ disociovaného komplexu vnieslo do Superosa 12 PC 3.2/30 uvedené do rovnováhy v 6M GuHCI a uskutočnila sa elúcia. Pík 1 predstavuje Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) a pík 2 predstavuje VEGF165.
Obr. 33, 34 a 35. Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc (SEC) s detektorom rozptylu svetla. Kolóna na chromatografiu s vylučovaním podľa veľkosti častíc s MiniDawn on-line detektorom rozptylu svetla (Wyatt Technology, Santa Barbara, California) a detektory indexu lomu (Rl) (Shimadzu, Kyoto, Japan) sa použili na určenie molekulovej hmotnosti (mol. hmôt.) komplexu ligand-receptor. Ako je uvedené na obr. 33, ukazuje elučný profil dva piky. Pík 1 predstavuje komplex ligandreceptor a pík 2 predstavuje nenaviazaný VEGF165. Mol. hmotnosť bola vypočítaná z LS a Rl signálov. Rovnaký postup bol použitý na určenie molekulovej hmotnosti jednotlivých zložiek komplexu ligand-receptor. Výsledky týchto pokusov sú nasledujúce: molekulová hmotnosť komplexu Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a)/VEGF165 v pikovej pozícii je 157300 (obr. 33), molekulová hmotnosť VEGF165 v pikovej pozícii je 44390 (obr. 34) a molekulová hmotnosť R1R2 v piku 113300 (obr. 35).
Obr. 36. Mapovanie peptidu a analýza glykozylácie. Disulfidové štruktúry a glykozylačné miesta Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) boli určené metódou peptidového mapovania. Vo Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) existuje celkom 10 cysteínov; šesť z nich patrí k Fc regiónu. Cys27 je disulfidovo viazaný na Cys76. Cys121 je disulfidovo viazaný na Cys182. Prvé dva cysteiny v Fc regióne (Cys211 a Cys214) tvoria intermolekulovú disulfidovú väzbu s rovnakými dvoma cysteínmi v inom Fc reťazci. Avšak, nemôže byť stanovené, či sa disulfidová väzba vyskytuje medzi rovnakými cysteínmi (Cys211 a Cys211, napríklad) alebo medzi Cys211 a Cys214. Cys216 je disulfidovo viazaný na Cys306. Cys352 je disulfidovo viazaný na Cys410.
Vo Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) existuje 5 možných N-viazaných glykozylačných miest a tieto miesta sú glykozylované v rôznom stupni. Kompletná glykozylácia je pozorovaná na Asn33, Asn 193 a Asn282. Čiastočná glykozylácia je pozorovaná na Asn65 a Asn 120. Miesta glykozylácie sú na obr. podčiarknuté.
Obr. 37. Farmakokinetiky Flt1 (1-3)-Fc (A40), Flt1 D2.Flk1 D3.FcAC1 (a) a VEGFR1R2FcAC1(a). Balb/c myšiam boli injekčné podkožné podané 4 mg/kg Flt1 (1 -3)-Fc (A40), CHO dočasne exprimujúce Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a), CHO stabilne exprimujúce Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) A CHO dočasne exprimujúce VEGFR1R2-FcAC1(a). Myšiam bola z chvostu odobratá krv za 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni, 3 dni a 6 dní po injekcii. Sérum sa testovalo pomocou ELISA testu navrhnutého na detekciu Flt1 (1-3)Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2-FcAC1(a). Tmax pre Flt1(1-3)-Fc (A40) bol 6 hodín, zatiaľ čo Tmax pre prechodný a stabilný Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a prechodný VEGFR1R2-FcAC1(a) bol 24 hodín. Cmax pre Flt1(1-3)-Fc (A40) bola 8 pg/ml, pre obidva dočasné (Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a VEGFR1R2-FcAC1(a)) bola 18 pg/ml a Cmax pre stabilné VEGFR1R2-FcAC1(a) bola 30 pg/ml.
Obr. 38. Farmakokinetiky Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a
FltD2.VEGR3R3-Fc C2 (a). Balb/c myšiam boli injekčné podkožné podané 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), CHO dočasne exprimujúce Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a CHO dočasne exprimujúce Flt1D2VEGFR3R3-FcAC1(a). Myšiam bola z chvostu odobratá krv za 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 a 20 dní po injekcii. Sérum sa testovalo pomocou ELISA testu navrhnutého na detekciu Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(ä) alebo Flt1D2.VEGFR3R3-FcAC1(a). Flt1(1-3)-Fc (A40) nebol detekovaný v sére po 5 dňoch, zatiaľ čo Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a FltD2.VEGFR3R3-FcAC1(a) boli detekovateľné aj po 15 dňoch.
Obr. 39. Schopnosť Flt1D2.Flk1D3.FcAC1 (a) inhibovať rast fibrosarkómu HT-1080 in vivo. Liečba SCID myší každý druhý deň alebo 2-krát týždenne 25 mg/kg Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) signifikantne znižuje rast podkožných fibrosarkómov HT1080.
Obr. 40. Schopnosť Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) inhibovať rast gliómu C6 in vivo. Liečba SCID myší každý druhý deň alebo 2-krát týždenne 2,5 mg/kg Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) signifikantne znižuje rast podkožných gliómov C6.
Obr. 41. Maternicová hyperpermeabilita indukovaná VEGF. PMSG injikovaný podkožné (5 IU) na indukciu ovulácie prepubertálnym myším samiciam spôsobil prudkú zmenu estradiolu po 2 dňoch, čo nakoniec spôsobilo indukciu VEGF y maternici. Táto indukcia spôsobila hyperpermeabilitu maternice a zvýšila obsah kvapaliny v maternici. Podkožná injekcia Flt1 (1 -3)-Fc (A40), FltD2.FIk1D3.FcAC1(a) a Flt1D2.VEGFR3R3.FcAC1(a) v dávkach 25 mg/kg 1 hodinu po injekcii PMSG viedla k približne 50 % inhibícii zvýšenia vlhkej hmotnosti maternice.
Obr. 42A-42B. Hodnotenie angiogenézy v corpus luteum s použitím progesterónu ako sledovanej hodnoty. PMSG bol injikovapý podkožné (5 IU) na indukciu ovulácie u prepubertálnych myších samíc, čo viedlo ku vzniku úplne funkčného corpus luteum obsahujúceho hustú sieť krvných ciev, kde toto corpus luteum secernovalo do krvi progesterónu za účelom prípravy maternice na implantáciu. Indukcia angiogenézy v corpus luteum vyžaduje VEGF. Pokojové koncentrácie progesterónu sú približne 5 ng/ml a PMGS môže indukovať hodnoty až 25-40 ng/ml. Podkožné injekcie Flt1(1-3)Fc (A40) alebo FltD2.Flk1D3.FcAC1(a) v dávke 25 mg/kg alebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekcii PMSG vedie ku kompletnej inhibícii indukcie progesterónu v deň 4.
Podrobný opis vynálezu
V odbore dlho pretrvávali problémy pri produkcii receptorového antagonistu VEGF s farmakokinetickým profilom, ktorý by bol vhodný na použitie antagonistami ako možného terapeutika. Predkladatelia vynálezu tu prvýkrát opisujú chimérický polypeptid schopný antagonizovania VEGF, ktorý má lepšie farmakokinetické vlastnosti v porovnaní s inými antagonistami VEGF na báze receptora. Chimérické polypeptidy podľa predkladaného vynálezu sú teda prvými molekulami vhodnými na liečbu, pri ktorej je žiaduce dosiahnutie antagonizovania VEGF.
Predkladaný vynález poskytuje nové chimérické polypeptidy vytvorené fúzovaním modifikovanej extracelulárnej väzbovej domény pre ligand Flt1 receptora a Fc regiónu lgG.
Extracelulárna väzbová doména pre ligand je definovaná ako časť receptora, ktorá - vo svojej prirodzenej konformácii v bunkovej membráne - je orientovaná extracelulárne, takže môže kontaktovať svoj ligand. Extracelulárna väzbová doména pre ligand neobsahuje hydrofóbne aminokyseliny asociované s transmembránovou doménou receptora ani žiadne aminokyseliny asociované s intracelulámou doménou receptora. Všeobecne je intracelulárna alebo cytoplazmatická doména receptora zložená zvyčajne z pozitívne nabitých alebo polárnych aminokyselín (t.j. lyzínu, argininu, histidínu, kyseliny glutámovej, kyseliny asparágovej). Predchádzajúcich 1530, predovšetkým hydrofóbnych alebo apolárnych aminokyselín (ako je leucín, valín, izoleucín a fenylalanín), tvorí transmembránovú doménu. Extracelulárna doména obsahuje aminokyseliny, ktoré predchádzajú hydrofóbnemu transmembránovému reťazcu aminokyselín. Zvyčajne je transmembránová doména obklopená pozitívne nabitými alebo polárnymi aminokyselinami, ako je lyzín alebo arginín. Von Heijne publikoval podrobné pravidlá, ktoré používajú odborníci v odbore na stanovenie toho, či daný receptor patrí k extracelulárnej, transmembránovej alebo intracelulárnej doméne (pozri von Heijne, 1995, BioEssays 17: 25-30). Alternatívne, na Internete sú dostupné stránky, ako napríklad http://ulrec3.unil.ch/software/TMPRED_form.html, ktoré umožnia odborníkom v proteínovej chémii predikciu týkajúcu sa proteínových domén.
Predkladaný vynález umožňuje konštrukciu molekúl nukleovej kyseliny kódujúcej chimérické polypeptidy, ktoré sú vložené do vektora, ktorý exprimuje molekuly chimérických polypeptidov po vložení do vhodnej hostiteľskej bunky. Vhodnými hostiteľskými bunkami sú, napríklad, bakteriálne bunky, kvasinky, hmyzie bunky a cicavčie bunky. Akákoľvek metóda známa odborníkom v odbore na inzerciu DNA fragmentov do vektora môže byť použitá na konštrukciu expresných vektorov kódujúcich chimérické polypeptidové molekuly pod kontrolou transkripčných/ translačných kontrolných signálov. Medzi tieto metódy patria rekombinantné DNA a syntetické techniky in vitro a in vivo rekombinácie (genetické rekombinácie) (pozri Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-lnterscience, NY).
Expresia molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich chimérické polypeptidové molekuly môže byť regulovaná druhou sekvenciou nukleovej kyseliny tak, že chimérické polypeptidové molekula je exprimovaná v hostiteľovi transformovanom rekombinantnou DNA molekulou. Napríklad, expresia chimérických polypeptidových molekúl, ako je tu opísaná, môže byť riadená akýmkoľvek promótorom/zosilňovačom transkripcie známym v odbore. Promótory, ktoré môžu byť použité na riadenie expresie chimérických polypeptidových molekúl, sú napríklad: dlhá koncová repetícia, ako je opísaná v Squinto et al. (1991, Celí 65: 1-20); skorý promótorový región SV40 (Bernoist and Chambon, 1981, Náture 290: 304-310), CMV promótor, M-MuLV 5' koncový repetitívny promótor obsiahnutý v 3' dlhej koncovej repetitívnej sekvencii vírusu Rousovho sarkómu (Yamamoto et al., 1980, Celí, 22: 787-797), promótor herpetickej timidín kinázy) Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78. 1441445), regulačná sekvencia metalotionínového génu (Brinster et al., 1982, Náture 296: 39-42); prokaryotické expresné vektory, ako je beta-laktamázový promótor (Villa-Kamaroff et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) alebo tac promótor (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25, pozri tiež „Useful proteins from recombinant bacteria“, v Scientific American, 1980, 242: 7423
94); promótorove elementy z kvasiniek alebo iných húb, ako je Gal4 promótor, ADH (alkohol dehydrogenázový) promótor, PGK (fosfoglycerolkinázový) promótor, promótor alkalickej fosfatázy a nasledujúce zvieracie transkripčné kontrolné regióny, ktoré vykazujú tkanivovú špecificitu a ktoré boli použité u transgénnych zvierat: kontrolný región génu na elastázu I, ktorý je aktívny v acinárnych bunkách podžalúdkovej žľazy (Swift et al., 1984, Celí, 38: 639-646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); kontrolný región inzulínového génu, ktorý je aktívny v beta-bunkách podžalúdkovej žľazy (Hanahan, 1985, Náture 315: 115-122), kontrolný región imunoglobulínového génu, ktorý je aktívny v lymfoidných bunkách (Grosschedl et al.,
1984, Celí 38. 647-658; Adames et al., 1985, Náture 318: 533-538; Alexander et al., 1987,-Mol. Celí. Biol. 7: 1436-1444), kontrolný región vírusu myších nádorov mliečnej žľazy, ktorý je aktívny v testikulárnych prsných, lymfoidných a žírnych bunkách (Leder et al., 1986, Celí 45: 485-495), kontrolný región albumínového génu, ktorý je aktívny v pečeni (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), kontrolný región alfafetoproteínového génu, ktorý je aktívny v pečeni (Krumlauf et al., 1985, Mol. Celí. Biol. 5: 1639-1648; Hammeret al., 1987, Science 235: 53-58); kontrolný región génu pre alfa-1-antitrypsín, ktorý je aktívny v pečeni (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), kontrolný región génu pre beta-globín, ktorý je aktívny v myeloidných bunkách (Mogram et al., 1985, Náture 315: 338-340, Kollias et al., 1986, Celí 46: 8994); kontrolný región génu pre myelínový bázický proteín, ktorý je aktívny v oligodendrocytoch v mozgu (Readhead et al., 1987, Celí 48: 703-712); kontrolný región génu pre ľahký reťazec 2 myozínu, ktorý je aktívny v kostrovom svale (Shani,
1985, Náture 314: 283-286) a kontrolný región génu pre hormón uvoľňujúci gonadotropín, ktorý je aktívny v hypotalame (Mason et al., 1986, Science 234: 13721378).
Podľa predkladaného vynálezu sú teda expresné vektory replikovateľné v bakteriálnych alebo eukaryotických hostiteľoch obsahujúce nukleové kyseliny kódujúce chimérické polypeptidy podľa predkladaného vynálezu použité na transfekciu hostiteľa a tak na riadenie expresie takých nukleových kyselín tak, že produkujú chimérické polypeptidy, ktoré môžu byť potom získané v biologicky aktívnej forme. Termín biologicky aktívne formy označuje formy schopné väzby na
VEGF.
Expresné vektory obsahujúce chimérické molekuly nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu môžu byť identifikované tromi všeobecnými postupmi: (a) DNA-DNA hybridizáciou; (b) podľa prítomnosti alebo neprítomnosti funkcie „markerového“ génu; a (c) podľa expresie inzertovaných sekvencií. V prvom spôsobe môže byť prítomnosť cudzorodého génu inzertovaného v expresnom vektore detekovaná DNA-DNA hybridizáciou s použitím sond obsahujúcich sekvencie, ktoré sú homológne so sekvenciami inzertovanej chimérickej polypeptidovej molekuly. V druhom spôsobe môže byť systém rekombinantný vektor/hostiteľ identifikovaný a selektovaný podľa prítomnosti alebo neprítomnosti niektorých funkcií „markerového génu (napríklad podľa aktivity tymidín-kinázy, podľa rezistencie na antibiotiká, podľa transformačného fenotypu, podľa tvorby oklúznych teliesok v bakulovíruse atď.), ktoré sú spôsobené inzerciou cudzorodých génov do vektora. Napríklad, keď je DNA sekvencia pre chimérický polypeptid vložená do vektora do sekvencie markerového génu, tak môžu byť rekombinanty obsahujúce inzert identifikované podľa absencie funkcie markerového génu. V treťom spôsobe môžu byť rekombinantné expresné vektory identifikované testovaním produktu cudzorodého génu exprimovaného rekombinantom. Také testy môžu byť založené, napríklad, na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach chimérických polypeptidov.
Bunky podľa predkladaného vynálezu môžu dočasne alebo lepšie konštitutívne a permanentne, exprimovať chimérické polypeptidy.
Chimérické polypeptidy môžu byť prečistené akoukoľvek technikou, ktorá umožňuje následnú tvorbu stabilných, biologicky aktívnych chimérických polypeptidov. Napríklad môžu byť faktory získané z buniek vo forme solubilných proteínov alebo vo forme inklúznych teliesok, z ktorých môžu byť extrahované kvantitatívne 8M guanidínium hydrochloridom a dialýzou (pozri napríklad Builder et al., US patent č. 5663304). Na ďalšie prečistenie faktorov môže byť použitá bežná iónomeničová chromatografia, chromatografia s reverznou fázou alebo gélová filtrácia.
V jednom uskutočnení vynálezu je nukleotidová sekvencia kódujúca prvú zložku pred nukleotidovou sekvenciou kódujúcou druhú zložku. V inom uskutočnení vynálezu je nukleotidová sekvencia kódujúca prvú zložku za nukleotidovou sekvenciou kódujúcou druhú zložku. Môžu byť pripravené ďalšie uskutočnenia vynálezu, v ktorých je poradie prvej, druhej a tretej zložky iné. Napríklad, pokiaľ je nukleotidová sekvencia kódujúca prvú zložku označená č. 1, nukleotidová sekvencia kódujúca druhú zložku označená č. 2 a nukleotidová sekvencia kódujúca tretiu zložku označená č. 3, tak môže byť poradie zložiek izolovanej nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu v smere 5' - 3' jedno z nasledujúcich poradí: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; alebo 3,2,1.
Predkladaný vynález má tiež diagnostické a terapeutické použitie. V konkrétnych uskutočneniach vynálezu môžu byť spôsoby pre detekciu aberancií vo funkcii alebo expresii chimérických polypeptidov podľa predkladaného vynálezu použité na diagnostiku ochorenia. V iných uskutočneniach môže byť úprava chimérických polypeptidov alebo agonisty alebo antagonisty, ktoré sa viažu na chimérické polypeptidy, použité na liečbu ochorení. V ďalších uskutočneniach sú chimérické polypeptidy použité ako činidlá na blokovanie väzby väzbového činidla na cieľ.
Spôsob podľa predkladaného vynálezu môže byť použitý napríklad na liečbu ochorení, ktoré sú charakterizované cievnou permeabilitou, edémom alebo zápalom, ako je edém mozgu asociovaný s poranením, mŕtvicou alebo nádorom; edémom asociovaným so zápalmi ak je psoriáza alebo artritída, vrátane reumatoidnej artritídy; astma; generalizovaný edém spojený s popáleninami; ascites a pleurálne výpotky asociované s nádormi, zápalmi alebo úrazmi; chronické zápaly dýchacích ciest, syndróm zvýšenej priepustnosti kapilár; sepsa; ochorenie obličiek asociované s vyššími stratami proteínov; a očné ochorenie, ako je makulárna degenerácia asociovaná s vekom a diabetická retinopatia.
Analýza aminokyselinovej sekvencie Flt1(1-3)-Fc ukázala prítomnosť nezvyčajne vysokého počtu (46) bázickej aminokyseliny lyzínu. IEF analýza Flt1(1-3)Fc ukázala, že tento proteín má pl vyššie ako 9,3, čo potvrdzuje predpoklad, že tento proteín je veľmi bázický. Predpokladá sa, že bázický charakter Flt1 (1 -3)-Fc spôsobuje jeho väzbu na zložky medzibunkovej hmoty a táto interakcia môže spôsobiť extrémne krátky cirkulačný sérový polčas Flt1 (1 -3)-Fc, keď je injekčné podaný myšiam. Na testovanie tejto hypotézy bol Flt1 (1 -3)-Fc proteín acetylovaný na lyzíne za účelom redukcie tejto bazicity. Acetylovaný Flt1(1-3)-Fc bol potom testovaný v teste opísanom ďalej.
Nasledujúce príklady ilustrujú predkladaný vynález a nijako ho neobmedzujú.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Expresia Flt1 (1-3)-Fc proteínu v CHO K1 bunkách
S použitím štandardných techník molekulárnej biológie (pozri napr. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-lnterscience, NY), sa gén kódujúci Flt1(1-3)-Fc inzertoval do expresného vektora pEE14.1 (Lonza Biologics, plc) v mnohonásobnom klonovacom mieste za CMV promótorom. CHO K1 bunky sa transfektovali pEE14.1/Flt1 (1-3)-Fc DNA konštruktom s použitím lipofektamínu (Gaithersburg, MD). Transfektované CHO K1 bunky sa kultivovali v bezglutamínovom DMEM (JRH, Kansas City, MO) obsahujúcom 25 μιτι metionín sulfoxímu (msx) od Sigma Inc., St. Louis, MÓ a bunky exprimujúce vysoké kvantity rekombinantného proteínu sa získali testovaním supernatantov CHO K1 buniek z viac ako 100 ručne odobratých kolónií izolátov s použitím štandardného imunotestu, ktorý zachycuje a detekuje ľudský Fc. Selektované ručne odobraté kolónie sa amplifikovali v prítomnosti 100 μΜ MSX a potom sa uskutočnilo druhé kolo skríningu amplifikovaných kolónií. Kloň s najvyššou produkciou mal špecifickú produktivitu rekombinantného Flt1(1-3)-Fc proteínu 55 pg/bunku/deň.
Selektovaný kloň bol expandovaný v T-banke s objemom 225 cm2 (Corning,
Acton, MA) a potom sa preniesol do 8,5 I valcových skúmaviek (Corning, Acton, MA) s použitím bunkového kultivačného média opísaného vyššie. Bunky sa odstránili z valcových skúmaviek pomocou štandardnej trypsinizácie a vniesli sa do 3,5 litra ~ suspenzného média. Suspenzné médium sa skladalo z bezglutamínového ISCHO média (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) obsahujúceho 5 % fetálne hovädzie sérum (FBS od Hycione Labs, Logan, UT), 100 μΜ MSX a GS doplnok (JRH Scientific, Kansas City, MO) y 5 I Cellingen bioreaktora (New Brunswick Scientific, New Brunswick, N J) v hustote 0,3 x 106 buniek/ml. Potom, čo bunky dosiahli denzitu 3,6 x 106/ml a adaptovali sa na suspenziu, boli prenesené do 60 I bioreaktora (ABEC, Allentown, PA) v hustote 0,5 x 106 buniek/ml v 20 I ISCHO média s 5 % fetálnym hovädzím sérom. Po 2 dňoch sa do bioreaktora pridalo ďalších 20 I ISCHO + 5 % fetálne hovädzie sérum. Bunky sa nechali rásť počas ďalších dvoch dní na dosiahnutie konečnej hustoty 3,1 x 106 buniek/ml a konečná koncentrácia Flt1(1-3)Fc pri zbere bola 95 mg/ml. Pri odbere boli bunky odstránené filtráciou s tangenciálnym tokom s použitím 0,45 pm Prostak filtrov (Millipore, Inc., Bedford, MA).
Príklad 2: Prečistenie Flt1 (1 -3)-Fc proteínu získaného z CHO K1 buniek
Flt1 (1 -3)-Fc proteín bol najskôr prečistený afinitnou chromatografiou. Kolóna s proteínom A bola použitá na naviazanie, s vysokou špecifitou, Fc časti molekuly. Tento afinitne prečistený proteín bol potom zahustený a nechal sa prejsť SECkolónou. Proteín bol potom eluovaný do formulačného pufra. Ďalej je tento postup . opísaný podrobne.
Materiály a metódy
Všetky chemikálie boli získané od J.T.Baker, Phillipsburg, NJ, s výnimkou PBS, ktorý bol získaný ako 10x koncentrát od Life Technologies, Gaithersburg, MD. Proteín A Fast Flow a Superdex 200 prípravky živíc boli získané od Pharmacia, Piscataway, NJ. Vybavenie a membrány na zahustenie proteínu boli získané od Millipore, Bedford, MA.
Približne 40 I 0,45 pm-filtrovaného CHO kondicionovaného média obsahujúceho Flt1(1-3)-Fc proteín sa aplikovalo do 290 ml Proteín A Fast Flow kolóny (priemer 10 cm), ktorá sa uviedla do rovnováhy v PBS. Kolóna sa premyla
PBS obsahujúcom 350 mM NaCl a 0,02 % CHAPS a naviazaný proteín sa eluoval 20 mM kyseliny citrónovej obsahujúcimi 10 mM Na2HPO4. Jediný pík v eluáte sa odobral a jeho pH sa zvýšilo na neutrálnu hodnotu pomocou 1M NaOH. Frakcie eluátu sa zahustili na približne 9 mg/ml s použitím 10K regenerovaných celulózových membrán s použitím ako filtrácie s tangenciálnym tokom, tak zahustením buniek miešaním. Na odstránenie agregátov a iných kontaminujúcich zložiek sa zahustený proteín aplikoval do kolóny naplnenej Superdex 200 živicou (10 cm x 55 cm) a uskutočnila sa elúcia PBS obsahujúcom 5 % glycerol. Hlavné piky sa odobrali, sterilné sa prefiltrovali, rozdelili sa do podielov a uskladnili sa pri teplote -80 °C.
Príklad 3: Acetylácia Flt1 (1 -3)-Fc proteínu mg Flt1(1-3)-Fc proteínu sa acetylovali spôsobom opísaným v návode na použitie sulfo-NHS-acetátového modifikačného kitu (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, kat. č. 26777).
Príklad 4: Charakterizácia acetylovaného Flt1 (1 -3)-Fc proteínu (a) IEF analýza: Flt1 (1-3)-Fc a acetylovaný Flt1 (1-3)-Fc sa analyzovali štandardnou IEF analýzou. Ako je uvedené na obr. 1, Flt1 (1-3)-Fc proteín nie je schopný migrovať do gélu a preto musí mať pl vyššie ako 9,3 čo je najvyššie pl v štandarde. Avšak, acetylovaný Flt1 (1-3)-Fc je schopný migrovať do gélu a dosahuje rovnováhu pri pl približne 5,2. Tento výsledok demonštruje, že acetylácia významne redukuje pozitívny náboj proteínu a tak jeho pl.
(b) Väzba na zložky medzibunkovej hmoty
Na testovanie väzby na zložky medzibunkovej hmoty sa Flt1(1-3)-Fc a acetylovaný Flt1(1-3)-Fc testovali v teste napodobujúcom interakcie so zložkami medzibunkovej hmoty. V tomto teste sú 96-jamkové tkanivové kultivačné platne potiahnuté Matrigelom® (Biocat MATRIGEL® 96-jamková platňa s tenkou vrstvou matrice, katalóg, č. 40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA). Platne sa inkubovali s rôznymi koncentráciami Flt1 (1-3)-Fc, acetylovaného Flt1(1-3)-Fc alebo rTie2-Fc (irelevantná kontrola) proteínu, ktoré sa pridali do jamiek. Platne sa inkubovali počas 1-2 hodín buď pri teplote miestnosti alebo pri 37 °C a potom sa detekcia naviazaných proteinov uskutočnila pomocou pridania druhej protilátky oproti ľudskému Fc konjugované s alkalickou fosfatázou do jamiek. Nakoniec sa do jamiek pridal substrát na alkalickú fosfatázu a merala sa optická denzita. Obr. 2 ukazuje výsledky tohto testu. Podobne ako irelevantný kontrolný proteín rTie2'Fc, nevykazoval acetylovaný Flt1(1-3)-Fc akúkoľvek väzbu na platňu potiahnutú Matrigelom, zatiaľ čo neacetylovaný Flt1 (1-3)-Fc proteín vykazoval významnú väzbu. Tento výsledok naznačuje, že acetylácia bázických aminokyselinových zvyškov je účinnou cestou pre interferenciu s elektrickými interakciami, ktoré existujú medzi proteínmi s pozitívnym nábojom a negatívne nabitými zložkami extracelulárnej hmoty, ktoré sa odohrávajú in vivo.
Príklad 5: Pegylácia Flťl (1 -3)-Fc proteínu
Aj keď bolo preukázané, že pegylácia (polyetylénglykol = PEG) proteínu zvyšuje jeho účinnosť in vivo tým, že zvyšuje jeho stabilitu a biologickú dostupnosť za minimalizácie imunogenicity (pozri odkazy citované vyššie), je intuitívne nevhodné pegylovať molekuly, ktoré sú príliš veľké na glomerulárnu filtráciu s cieľom zlepšenia ich farmakokinetických vlastností. Bez väzby na konkrétnu teóriu predkladatelia vynálezu preštudovali teóriu, že pegylácia Flt1(1-3)-Fc molekúl môže zlepšiť ich farmakokinetické vlastnosti, pravdepodobne nie zmenou pozitívneho náboja alebo zníženín pl Flt1(1-3)-Fc, ale skôr fyzikálnym odstránením pozitívneho náboja z interakcie s extracelulárnou hmotou. Predkladatelia vynálezu sa rozhodli urobiť pokus na zlepšenie farmakokinetických vlastnosti Flt1(1-3)-Fc molekúl tak, že naviažu reťazec 20K PEG, ako je opísané ďalej.
Materiály a metódy
Prečistenie Flt1(1-3)-Fc získaný z CHO buniek (pozri vyššie) bol použitý v nasledujúcich pegylačných pokusoch. Funkcionalizované PEG boli získané od
Shearwater Polymers, Huntsville, AL; Bicin od Sigma, St. Louis, MO; Superose 6 kolóna od Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS ako 10x koncentrát od Life
Technologies, Gaithersburg, MD; Glycerol od J.T. Baker, Phillipsburg, NJ; a Bis-Tris vopred odliate gély od Novex, CA.
20K PEG reťazce funkcionalizované amín-špecifickými koncovými skupinami boli použité v reakčných pokusoch v malom rozsahu, ktoré boli uskutočnené na hodnotenie rôznych reakčných podmienok, v ktorých sa líšila stechiometria PEG : proteín. Na základe týchto reakcií a analýzy vzoriek na štandardné SDS-PAGE reagoval Flt1(1-3)-Fc v koncentrácii 1,5 ng/ml pri pH 8,1 s 20K SPA-PEG (PEGsukcínimidylpropionát) molekulami pri molárnom pomere PEG : Flt1(1-3)-Fc monomér 1 : 6. Reakcia sa nechala prebiehať pri 8 °C cez noc. Na počiatočné prečistenie sa reakčné produkty aplikovali do 10 mm x 30 cm Superose 6 kolóny uvedenej do rovnováhy PBS obsahujúcim 5 % glycerol. Zdá sa, že kolóna separovala pegylované Flt1(1-3)-Fc molekuly podľa rozsahu pegylácie. Boli odobraté frakcie zodpovedajúce primárne monopegylovaným a dipegylovaným dimerickým Flt1 (1 -3)-Fc, ako boli potvrdené charakterom prúžkov na redukujúcich a neredukujúcich SDS-PAGE géloch. Koncentrácia proteínu bola určená meraním absorbancie pri 280 nm. Pegylovaný Flt1(1-3)-Fc proteín bol sterilné prefiltrovaný, rozdelený do podielov a uskladnený pri -40 °C.
Príklad 6: Väzba nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Flt1(1-3)-Fc v teste na báze Biacore
Nemodifikované, acetylované a pegylované Flt1(1-3)-Fc proteíny boli testované v teste na báze Biacore na hodnotenie ich schopnosti väzby na Flt1 ligand, VEGF. V tomto teste sa nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc proteín imobilizuje na povrchu Biacore čipu (pozri Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, kde je uvedený štandardný postup) a vzorka obsahujúca 0,2 pg/ml VEGF a buď nemodifikovaný Flt1 (1 -3)-Fc, acetylovaný Flt1(1-3)-Fc alebo pegylovaný Flt1(1-3)-Fc (vždy pri 25 pg/ml) sa prelial cez čip potiahnutý Flt1(1-3)-Fc. Na minimalizáciu vplyvu nešpecifickej väzby sa naviazané vzorky premyli 0,5 M NaCl. V jednej vzorke sa nemodifikovaný Flt1 (1 -3)-Fc zmiešal s heparínom. Heparín je molekula s negatívnym nábojom a Flt1 (1 -3)-Fc proteín je molekula s pozitívnym nábojom, takže keď sú tieto dve molekuly zmiešané dohromady, mali by interagovať v dôsledku svojich príslušných nábojov. Toto v podstate neutralizuje vlastný pozitívny náboj Flt1 (1 -3)-Fc, čo spôsobí, že sa molekula chová ako chemicky alebo geneticky modifikovaná tak, že je redukovaný jej náboj a jej tendencie k väzbe prostredníctvom elektrických interakcií. Ako je uvedené na obr. 3, acetylované (stĺpce 13-16), pegylované (stĺpce 17-20) a heparínom spracované Flt1 (1-3)-Fc (stĺpce 21-24) sú každý schopný úplne inhibovať s Flt1 (1-3)-Fc naviazaným na Biacore čip s väzbou VEGF v porovnaní s kontrolným (stĺpce 1-4) a irelevantným (stĺpce 5-8) proteínom. Nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc (stĺpce 5-6) iba čiastočne súťažil s Flt1(1-3)-Fc naviazaným na Biacore čip s väzbou VEGF. Avšak, premytie naviazaných vzoriek 0,5 M NaCl (stĺpce 7-8) viedlo k dosiahnutiu väzbového profilu podobného profilu modifikovaných foriem Flt1 (1 -3)-Fc, čo naznačuje, že modifikovaný proteín vykazuje nešpecifickú väzbu na čip, ktorá môže byť eliminovaná premytím soľným roztokom.
Príklad 7: Väzba nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Flt1(1-3)-Fc v teste na báze ELISA
Nemodifikované, acetylované a pegylované Flt1(1-3)-Fc proteíny boli testované v teste na báze ELISA na hodnotenie ich schopnosti väzby na ligand Flt1 receptora VEGF. Ako je uvedené na obr, 4, ako pegylované, tak acetylované Flt1 (13)-Fc proteíny sa môžu viazať na VEGF, čo dokazuje, že modifikácia proteínu buď pegyláciou alebo acetyláciou, neničí ich schopnosť viazať sa na ligand.
Príklad 8: Farmakokinetické analýzy nemodifikovaného Flt1 (1 -3)-Fc, acetylovaného Flt1 (1 -3)-Fc a pegylovaného Flt1 (1 -3)-Fc í 1 ' .
Pokusy in vivo boli navrhnuté na hodnotenie farmakokinetických profilov nemodifikovaného Flt1 (1 -3)-Fc, acetylovaného Flt1(1-3)-Fc a pegylovaného Flt1 (1 -3)Fc proteínu. Balb/c myšiam (23-28 g; 3 myši na skupinu) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného, acetylovaného alebo pegylovaného Flt1 (1 -3)-Fc. Myšiam sa odobrala krv z chvosta 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni a 3 dni po injekcii proteínu. Sérum sa testovalo štandardným ELISA testom navrhnutým na detekciu Flt1(1-3)-Fc proteínu. Stručne, test zahrňoval potiahnutie ELISA platne VEGF, väzbu séra obsahujúceho nemodifikovaný, acetylovaný alebo pegylovaný Flt1(1-3)-Fc a detekciu anti-Fc protilátkou naviazanou na alkalickú fosfatázu. Ako je uvedené na obr. 5, Tmax pre všetky Flt1 (1 -3)-Fc proteíny bolo medzi 6 hodinami a 24 hodinami. Cmax pre rôzne proteíny boli nasledujúce: nemodifikovaný: 0,06 pg/ml - 0,15 pg/ml; acetylovaný: 1,5 pg/ml -4,0 pg/ml; a pegylovaný: približne 5 pg/ml.
Príklad 9: Postupná acetylácia Flt1 (1-3)-Fc
Na stanovenie toho, aké minimálne množstvo acetylácie je nutné na elimináciu väzby na zložky extracelulárnej matrice, bol navrhnutý pokus, v ktorom bola uskutočnená postupná acetylácia Flt1(1-3)-Fc proteínu s použitím postupne sa zvyšujúcich molárnych nadbytkov acetylačného činidla v acetylačnej reakčnej zmesi. Rozmedzie molárnych nadbytkov bolo nasledujúce: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 a 100 molov acetylačného činidla na 1 mol Flt1(1-3)-Fc monoméru. Reakcie sa uskutočnili podľa návodu dodaného k sulfo-NHS-acetát modifikačnému kitu (Pierce Chemical Co., Rocford, IL, kat. č. 26777).
Príklad 10: Charakterizácia postupne acetylovaného Flt1(1-3)-Fc (a) IEF analýza: Nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc a postupne acetylované Flt1(1-3)-Fc proteíny sa analyzovali štandardnou IEF analýzou. Ako je uvedené na obr. 6A-6B, nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc proteín nie je schopný migrovať do gélu v dôsledku extrémne vysokého pl (vyššieho ako 9,3). Avšak, väčšina z postupne acetylovaných Flt1 (1-3)-Fc vzoriek bola schopná migrovať do gélu a dosahovali rovnováhu pri pl približne 4,55-8,43, podľa stupňa acetylácie proteínu. Tento výsledok demonštruje, že acetylácia môže meniť pozitívny náboj proteínu v závislosti od veľkosti acetylácie a že redukcia pl môže byť riadená ovplyvnením stupňa acetylácie.
(b) Väzba postupne acetylovaného Flt1 (1 -3)-Fc na zložky medzibunkovej hmoty
Na testovanie väzby na zložky medzibunkovej hmoty sa Flt1(1-3)-Fc a postupne acetylovaný Flt1 (1-3)-Fc testovali v teste opísanom vyššie napodobujúcom interakcie so zložkami medzibunkovej hmoty. Rôzne koncentrácie nemodifikovaného
Flt1 (1 -3)-Fc, postupne acetylovaného Flt1(1-3)-Fc (vzorky s molárnym nadbytkom
10, 20 a 30-násobným) alebo rTie2-Fc (irelevantná kontrola) proteínu sa pridali do jamiek. Platne sa inkubovali počas 1-2 hodín buď pri teplote miestnosti alebo pri 37 °C a potom sa detekcia naviazaných proteínov uskutočnila pomocou pridania druhej protilátky oproti ľudskému Fc konjugovanej s alkalickou fosfatázou do jamiek. Nakoniec sa do jamiek pridal substrát pre alkalickú fosfatázu a merala sa optická denzita. Obr. 7 ukazuje výsledky tohto testu. Podobne ako irelevantný kontrolný proteín rTie2-Fc, nevykazoval postupne acetylovaný Flt1(1-3)-Fc (20 a 30-násobný molárny nadbytok) akúkoľvek významnú väzbu na platni potiahnutej Matrigelom, zatiaľ čo neacetylovaný Flt1(1-3)-Fc proteín vykazoval významnú väzbu. Táto väzba je saturovateľná, čo naznačuje, že Flt1(1-3)-Fc proteín sa môže viazať na špecifické miesta a nie prostredníctvom všeobecnejších interakcií sprostredkovaných nábojom, ktoré by neboli saturovateľné. Vzorka s 10-násobným molárnym nadbytkom vykazovala redukovanú väzbu, ale stupeň acetyláčie nebol dostatočný pre úplný blok väzby na zložky medzibunkovej hmoty. Vzorky s 20-násobným a vyšším molárnym nadbytkom nevykazovali žiadnu detekovateľnú väzbu, aj napriek skutočnosti, že IEF analýza (obr. 6A a 6B) vzoriek s nižším molárnym nadbytkom stále mala veľký pozitívny náboj. Tento výsledok demonštruje, že nie je nutné kompletne acetylovať všetky dostupné bázické aminokyseliny kvôli eliminácii väzby na zložky extracelulárnej matrice.
(c) Väzba postupne acetyiovaného Flt1 (1 -3)-Fc v teste na báze Biacore
Nemodifikované a postupne acetylované Flt1 (1-3)-Fc proteíny boli testované v teste na báze Biacore na hodnotenie ich schopnosti väzby na Flt1 ligand, VEGF. V tomto teste sa nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc proteín (0,5, 1,0 alebo 5,0 pg/ml) imobilizuje na povrchu Biacore čipu (pozri Biacore Instruction Manual, Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, kde je uvedený štandardný postup) a roztok obsahujúci 0,2 pg/ml VEGF a buď nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc (v koncentrácii 0,5, 1,0 alebo 5,0 pg/ml) alebo 10 rôzne acetylovaných Flt1(1-3)-Fc (v koncentrácii 0,5, 1,0 alebo 5,0 pg/ml) sa prelial cez čip potiahnutý Flt1 (1 -3)-Fc. Ako je uvedené na obr. 8, v substechiometrickom pomere (0,5 pg/ml nemodifikovaného Flt(1-3) alebo postupne acetyiovaného Flt1(1-3)-Fc vs. 0,2 pg/ml VEGF) nie je prítomné dostatočné množstvo Flt1 (1-3)-Fc (nemodifikovaného alebo postupne acetyiovaného) v roztoku na úplnú inhibíciu väzby VEGF. Pri 1,0 pg/ml, čo je približne stechiometrický pomer 1 : 1, sú ako nemodifikovaný, tak postupne acetylovaný Flt1(1-3)-Fc lepšie schopné súťažiť o väzbu VEGF, ale nie je stále ešte prítomný dostatok Flt1(1-3)-Fc proteínu (nemodifikovaného alebo postupne acetylovaného) na úplnú väzbu dostupného VEGF. Avšak, pri 5,0 Mg/ml, čo je niekoľkokrát viac ako je stechiometrický pomer 1 : 1, sú ako Flt1 (1 -3)-Fc, tak postupne acetylovaný Flt1(1-3)-Fc proteíny schopné viazať VEGF, bez ohľadu na stupeň acetylácie. Toto jasne demonštruje, že acetylácia neovplyvňuje schopnosť Flt1 (1 -3)-Fc viazať VEGF.
(d) Farmakokinetické analýzy postupne acetylovaného Flt1 (1 -3)-Fc
Pokusy in vivo boli navrhnuté na hodnotenie farmakokinetických profilov nemodifikovaného Flt1(1-3)-Fc a postupne acetylovaného Flt1(1-3)-Fc proteínu. Balb/c myšiam (23-28 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného alebo vzorky s 10, 20, 40, 60 a 100 násobným molárnym nadbytkom postupne acetylovaného Flt1(1-3)-Fc (3 myši pre nemodifikovaný, 10, 20 a 40 násobný molárny nadbytok a 2 myši pre 60 a 100-násobný molárny nadbytok). Myšiam sa odoberala krv z chvosta 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni a 3 dni po injekcii proteínu. Sérum sa testovalo štandardným ELISA testom navrhnutým na detekciu Flt1(1-3)-Fc proteínu, ako bol opísaný vyššie. Obr. 9 zahŕňa výsledky tohto pokusu. Tmax pre všetky Flt1(1-3)-Fc proteíny bol 6 hodín, ale Cmax pre rôzne proteíny boli nasledujúce: nemodifikovaný: 0,06 pg/ml; 10-násobný molárny nadbytok - 0,7 gg/ml, 20-násobný molárny nadbytok - 2 pg/ml, 40-násobný molárny nadbytok - 4 pg/ml, 60násobný molárny nadbytok - 2 pg/ml, 100-násobný molárny nadbytok -1 Mg/ml. Tieto výsledky ukazujú, že acetylácia alebo pegylácia Flt1(1-3)-Fc významne zlepšuje jeho farmakokinetícký profil.
Príklad 11: Konštrukcia mutantného Flt1(1-3)-Fc s deléciou bázického regiónu označeného ako Mut1: Flt1 (1 -3óB)-Fc
Na základe zistenia, že acetylovaný Flt1 (1-3)-Fc, ktorý má pl nižšie ako 6, má omnoho lepšiu farmakokinetiku ako vysoko pozitívny nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc (pl > 9,3), sa zisťovalo, či rozdiely vo farmakokinetike môžu byť prisúdené náboju proteínu, ktorý sa viaže na negatívne nabité zložky extracelulárnej matrice alebo či existujú špecifické regióny na povrchu Flt1(1-3)-Fc proteínu, ktoré tvoria špecifické väzbové miesta pre zložky extracelulárnej matrice. Napríklad, o mnohých proteínoch je známe, že majú väzbové miesta pre heparín, ktoré sa často skladajú zo zoskupení bázických zvyškov. Niekedy sa tieto zvyšky vyskytujú v zoskupení na primárnej sekvencií proteínu; v literatúre boli identifikované „konsenzuálne sekvencie“ pre také väzbové miesta pre heparín (pozri napr. Hileman et al., 1998, Bioessays 20(2): 15667). V iných prípadoch ukazuje známa kryštalická štruktúra proteínu zoskupenie pozitívne nabitých zvyškov na povrchu proteínu, ale zvyšky pochádzajú z rôznych regiónov primárnej sekvencie a dostávajú sa do kontaktu iba po zložení proteínu do terciárnej štruktúry. Tak je ťažké zistiť, či je izolovaný aminokyselinový zvyšok súčasťou zoskupenia bázických zvyškov na povrchu proteínu. Avšak, pokiaľ existuje zoskupenie pozitívne nabitých aminokyselinových zvyškov v primárnej sekvencií, nie je neopodstatnené predpokladať, že tieto zvyšky sú si priestorovo blízke a môžu byť preto súčasťou väzbového miesta pre medzibunkovú hmotu. Flt1 receptor bol dôkladne skúmaný a boli opísané rôzne jeho domény (pozri napríklad Tanaka et al., 1997, Jpn. J. Cancer Res. 88: 867-876). Podľa sekvencií nukleových kyselín a aminokyselinových sekvencií uvedených na obr. 10A-10D tohto vynálezu možno identifikovať signálne sekvencie na sekréciu, ktoré sú lokalizované na začiatku sekvencie a končia glycínom kódovaným nukleotidmi 76-78. Zrelý proteín začína sekvenciou Ser-Lys-Leu-Lys, začínajúci nukleotidom 79 sekvencie nukleovej kyseliny. Flt1 Ig doména 1 je kódovaná nukleotidmi 79-393 a končí aminokyselinami Ser-Asp-Thr. Flt1 Ig doména 2 je kódovaná nukleotidmi 394 až 687 (kódujúcimi GlyArg-Pro až Asn-Thr-lle) a Flt1 Ig doména 3 je kódovaná nukleotidmi 688 až 996 (kódujúcimi Ile-Asp-Val až Asp-Lys-Ala). Je tu prítomná premosťujúca aminokyselinová sekvencia Gly-Pro-Gly, kódovaná nukleotidmi 997-1005, po ktorej nasleduje nukleotidová sekvencia kódujúca ľudský Fc (nukleotidy 1006-1701 alebo aminokyseliny Glu-Pro-Lys až Pro-Gly-Lys-stop).
Podrobnejšia analýza Flt1 aminokyselinovej sekvencie ukázala, že tu existuje zoskupenie, konkrétne aminokyselinové zvyšky 272-281 (KNKRASVRR) obr. 10A10D, v ktorom je 6 z 10 aminokyselín bázických. Táto sekvencia je lokalizovaná vo
Flt1 Ig doméne 3 receptora (pozri obr. 11), ale nie je sama esenciálna pre väzbu VEGF Ugandu, ale spôsobuje vysokú afinitu väzby pre ligand. Porovnanie sekvencie Ig domény 3 so sekvenciou Ig domény 2 ukazuje, že v tomto regióne je veľmi slabá zhoda medzi dvoma Ig doménami a že v doméne 3 existuje približne 10 ďalších aminokyselín. Analýza profilov hydrofilnosti (MacVector počítačový Software) týchto dvoch domén jasne ukazuje prítomnosť hydrofilného regiónu v proteíne (obr. 12A12B). Tieto zistenia ukazujú na možnosť, že skutočná trojrozmerná konformácia Flt1 Ig domény 3 umožňuje určitú protrúziu, ktorá nie je prítomná vo Flt1 Ig doméne 2. Na testovanie tejto hypotézy sa deletovalo 10 ďalších aminokyselín a vzniknutý proteín sa testoval za účelom zistenia toho, či delécia bude priaznivo ovplyvňovať farmakokinetiku bez narušenia afinity receptora pre VEGF. Tento DNA konštrukt, ktorý bol pripravený s použitím štandardných techník molekulárnej biológie (pozri napríklad Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-lnterscience, NY) v cicavčom expresnom vektore pMT21 (Genetics Inštitúte, Inc. Cambridge, MA), je označovaný ako Mut1: Flt1 (1 -3úB)-Fc. Mut1: Flt1(1-3óB)-Fc konštrukt bol získaný z Flt1(1-3)-Fc deléciou nukleotidov 814843 (podľa obr. 10A-10D), čo znamená deléciu vysoko bázických 10 aminokyselinových zvyškov sekvencie Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg z Flt1 Ig domény 3.
Sekvencia konečného DNA konštruktu bola verifikovaná s použitím ABI 373A DNA sekvenátora a Taq Dedeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekvencia Mut1: Flt1 (1 -3ab)-Fc je uvedená na obr. 13A-13D.
Príklad 12: Konštrukcia mutantného Flt1(1-3)-Fc s deléciou bázického regiónu označeného ako Mut2: Fit 1 (2-3ab)-Fc
Druhý deiečný mutantný konštrukt, označený Mut2: Flt1 (2-3AB)-Fc, bol získaný z Mut1: Flt1 (1 -3aB)-Fc konštruktu deléciou Flt1 Ig domény 1 kódovanej nukleotidmi 79-393 (pozri obr. 10A-10D); presnejšie, nukleotidy 73-78 (TCA GGT) boli zmenené na TCC GGA. Týmto sa vložilo reštrikčné miesto (BspE1) bez alterácie asociovanej aminokyselinovej sekvencie, Ser-Gly. Tento DNA konštrukt, ktorý bol pripravený s použitím štandardných techník molekulárnej biológie (pozri napríklad Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-lnterscience, NY) v cicavčom expresnom vektore pMT21. (Genetics Inštitúte, Inc. Cambridge, MA), bol tiež verifikovaný z hľadiska sekvencie s použitím ABI 373A DNA sekvenátora a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems, Inc., FosterCity, CA). Sekvencia Mut2: Flt1(2-3AB)-Fc je uvedená na obr. 14A-14C.
Príklad 13: Konštrukcia mutantného Flt1 (1-3)-Fc s deléciou označeného ako Mut3:
I
Flt1(2-3úB)-Fc
Tretí delečný mutantný konštrukt, označený Mut3: Flt1 (2-3ab)-Fc, bol získaný rovnako ako Mut2: Flt1 (2-3AB)-Fc konštrukt, s tou výnimkou, že Flt1 Ig doména 3 bola ponechaná intaktná (bázický aminokyselinový región nebol deletovaný). Konštrukt bol pripravený technikou molekulárnej biológie a sekvencia konečného konštruktu bola verifikovaná spôsobom opísaným vyššie. Sekvencia Mut3: Flt1(2-3)-Fc je uvedená na obr. 15A-15C.
Príklad 14: Konštrukcia mutantného Flt(1 -3)-Fc s N-glykozyláciou bázického regiónu označeného Mut4: Flt1(1-3R^N)-Fc
Bol pripravený konštrukt, v ktorom bolo N-glykozylačné miesto vložené do stredu bázického regiónu Flt1 Ig domény 3. Tento konštrukt bol označený ako Mut4: Flt1(1-3R4N)-Fc a bol pripravený zmenou nukleotidov 824-825 z GA na AC, čo zmenilo kódovaný Arg zvyšok (AGA) na Asn zvyšok (AAC) (pozri obr. 10A-10D). Vzniknutá aminokyselinová sekvencia je teda zmenená z Arg-Ala-Ser na Asn-AlaSer, čo zodpovedá kanonickému signálu (Asn-Xxx-Ser/Thr) na adíciu Nglykozylačného miesta v Asn zvyšku. Sekvencia Mut4: Flt1(1-3R^N)-Fc je uvedená na obr. 16A-16D.
Príklad 15: Charakterizácia acetylovaného Flt1 (1 -3)-Fc, Mut1: Flt(1 -3äB)-Fc a Mut4:
Flt1(1-3R^N)-Fc mutantov (a) Väzba na zložky medzibunkovej hmoty
Na stanovenie toho, či tri modifikované proteíny majú viac alebo menej zlepšené farmakokinetické vlastnosti sa 96-jamkové platne potiahnuté Matrigelom (ako sú opísané vyššie inkubovali s rôznymi koncentráciami mutantných proteínov a detekovali sa protilátkami proti ľudskému Fc konjugovanými s alkalickou fosfatázou. Ako je uvedené na obr. 18, tento pokus ukázal, že zatiaľ čo nemodifikovaný Flt1(13)-Fc proteín sa dobre viaže na tieto jamky, Mut3: Flt1(2-3)-Fc proteín sa viaže o niečo slabšie, Mut1: Flt(1-3lB)-Fc sa viaže ešte slabšie a Mut2: Flt1 (2-3ab)-Fc proteín má najlepší profil a viaže sa slabšie ako akýkoľvek iný mutantný proteín. Mut4: Flt1 (1-3r^n)-Fc glykozylačný mutantný proteín vykazoval iba marginálny benefit v Matrigel teste. Tieto výsledky potvrdzujú hypotézu, že lineárna sekvencia pozitívnych aminokyselín môže byť deletovaná z primárnej sekvencie, čo vedie ku zníženiu elektrických interakcií so zložkami extracelulárnej hmoty.
(b) Väzba Mut1: Flt(1-3óB)-Fc a Mut4: Flt1(1-3R^N)-Fc v teste na báze Biacore
Nemodifikované a acetylované Flt1(1-3)-Fc proteíny a geneticky modifikované Mut1: Fit (1-3^b)-Fc a Mut4: Flt1 (1-3R^N)-Fc proteíny boli testované v teste na báze Biacore na hodnotenie ich schopnosti väzby na Flt1 ligand, VEGF. V tomto teste sa nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc proteín (0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml) imobilizuje na povrchu Biacore čipu (pozri Biacore Instruction Manual, Pharmacia, inc., Piscataway, NJ, kde je uvedený štandardný postup) a roztok obsahujúci 0,1 pg/ml VEGF a buď prečistený alebo supernatant COS buniek obsahujúci nemodifikovaný Flt1 (1-3)-Fc (v koncentrácii 0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml), prečistený acetylovaný Flt1(1-3)-Fc (v koncentrácii 0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml), supernatant COS buniek obsahujúci Mut1: FIí(1-3ab)-Fc (v koncentrácii 0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml), alebo supernatant COS buniek obsahujúci Mut4: Flt1 (1-3R^N)-Fc (v koncentrácii 0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml), sa prelial cez čip potiahnutý Flt1 (1 -3)-Fc. Ako je uvedené na obr. 17, v sub39 stechiometrickom pomere (0,25 gg/ml nemodifikovanej, acetylovanej alebo geneticky ~ modifikovanej vzorky vs. 0,1 pg/ml VEGF) nie je prítomné dostatočné množstvo Flt1(1-3)-FC proteínu v roztoku na blokovanie väzby VEGF na Flt1(1-3)-Fc imobilizovaný na Biacore čipe. Pri 0,5 μg/ml nemodifikovaného, acetylovaného alebo geneticky modifikovaného Flt1 (1 -3)-Fc proteínu, čo jé približne stechiometrický pomer 1 : 1, je zrejme zlepšená schopnosť blokovať väzbu VEGF na Biacore čip. Pri koncentrácii 1,0 pg/ml nemodifikovaného, acetylovaného alebo geneticky modifikovaného Flt1 (1-3)-Fc proteínu, čo je približne stechiometrický pomer 10: 1, sú Flt1(1-3)-Fc proteíny schopné blokovať väzbu VEGF na Biacore čip, ale nie sú ekvivalentné. Nemodifikovaný, acetylovaný a Mut1: Flt(1-3AB)-Fc sú v podstate rovnocenné vo svojej schopnosti blokovať väzbu VEGF, zatiaľ čo Mut4: Flt1 (1-3R^N)Fc je o niečo menej účinný v blokovaní väzby. Tieto výsledky potvrdzujú hypotézu, že je možné redukovať nešpecifickú väzbu molekuly genetickým odstránením lineárnej sekvencie predominantne negatívne nabitých aminokyselín.
(c) Väzba Mut1: Flt1 (1 -3úB)-Fc, Mut2: Flt1 (2-3úB)-Fc, Mut3: Flt1 (1-3aB)-Fc v teste na. báze ELISA
Na stanovenie toho, či sa môžu tri mutantné proteíny viazať na Flt1 ligand VEGF sa uskutočnili väzbové experimenty, v ktorých sa 96-jamkové platne potiahnuté VEGF inkubovali s rôznymi koncentráciami príslušného mutantného proteínu a po premytí sa úroveň väzby detekovala inkubáciou s protilátkou proti ľudskému Fc konjugovanou s alkalickou fosfatázou a kvantifikovala sa kolorimetricky pridaním vhodného substrátu na alkalickú fosfatázu. Ako je uvedené na obr. 19, pokus ukázal, že v testovaných koncentráciách sa môžu všetky mutantné proteíny podobne viazať na VEGF.
Príklad 16: Farmakokinetická analýza acetylovaného Flt1 (1 -3)-Fc, Mut1: Flt(1-3yB)Fc a nemodifikovaného Flt1(1-3)-Fc
Pokusy in vivo boli navrhnuté na hodnotenie farmakokinetických profilov nemodifikovaného Flt1 (1 -3)-Fc, Mut1: Flt1 (1 -3aB)-Fc a pri 40-násobnom molárnom nadbytku acetylovaného Flt1(1-3)-Fc proteínu. Balb/c myšiam (25-30 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného Flt1 (1 -3)-Fc, pri 40násobnom molárnom nadbytku acetylovaného Flt1(1-3)-Fc a Mut1: Flt1 (1 -3ab)-Fc proteínu (vždy 4 myši). Myšiam sa odoberala krv z chvosta 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni, 3 dni a 5 dní po injekcii proteínu. Sérum sa testovalo štandardným ELISA testom navrhnutým na detekciu Flt1 (1-3)-Fc proteínu, ktorý zahŕňa potiahnutie ELISA platne VEGF, väzbu Flt1 (1-3)-Fc a detekciu anti-Fc protilátkou naviazanou na alkalickú fosfatázu. Ako je uvedené na obr. 20, boli Cmax pre tieto činidlá nasledujúce: nemodifikovaný Flt1(1-3)-Fc - 0,15 pg/ml; pri 40-násobnom molárnom nadbytku acetylovaný Flt1 (1-3)-Fc -1,5 pg/ml; a Mut1: Flt(1 -3ab)-Fc - 0,7 pg/ml.
Príklad 17: Konštrukcia vektora pre modifikovaný Flt1 receptor
Konštrukcia modifikovanej verzie Flt1 receptora (tiež známeho ako VEGFR1) bola uskutočnená na základe pozorovania, že proteínová sekvencia Flt1 je značne bázická a preto je pravdepodobné, že sa bude viazať na extracelulárnu hmotu (ECM). Vysoko bázický charakter Flt1 pravdepodobne vysvetľuje to, prečo má nemodifikovaný Flt1 (1-3)-Fc (opísaný vyššie) zlé farmakokinetické vlastnosti, ktoré spôsobujú ťažkosti pri jeho použití ako terapeutického činidla. Ako bolo opísané vyššie, chemicky modifikovaná forma pri 40-násobnom molárnom nadbytku acetylovaného Flt1 (1 -3)-Fc, ktorá je tu označená ako A40, vykazuje značne vylepšenú farmakokinetiku vzhľadom na neacetylovaný Flt1 (1 -3)-Fc. Preto boli uskutočnené pokusy prípravy upravených DNA molekúl, ktoré môžu byť použité na rekombinantnú expresiu modifikovaných foriem Flt1 receptora, ktoré by mali mať lepší farmakokinetický profil A40 a zároveň by si zachovávali schopnosť väzby VEGF.
Z literatúry je známe, že prvá Ug doména Flt1 (ktorá má náboj +5 pri neutrálnom pH) nie je zásadná pre tesnú väzbu na VEGF, preto je táto doména deletovaná. Tretia Ig doména (majúca náboj +11) nie je zásadná pre väzbu, ale dodáva vyššiu afinitu pre VEGF ako druhá Ig doména, takže namiesto úplného deletovania bola nahradená ekvivalentnými doménami receptora príbuzného Flt1, ktorým bol Flk1 (tiež známy ako VEGFR2) a Flt4 (tiež známy ako VEGFR3). Tieto chimérické molekuly (označené R1R2 (Flt1.D2.Flk1D3.FcAC1(a) a VEGFR1R2-FcAC1(a) a VEGFR1R3-Fc-ÁC1(a), v príslušnom poradí, kde R1 a Flt1 D2 = Ig doména 2 Flt1 (VEGFR1); R2 a Flk1D3 = Ig doména 3 Flk1 (VEGFR2); a R3 a VEGFR3D3 = Ig doména 3 Flt4 (VEGFR3)) majú oveľa menšiu väzbu na ECM, ako bolo potvrdené in vitro testom väzby na ECM, ako je opísaný ďalej, mali značne zlepšenú farmakokinetiku, ako je opísané ďalej. Ďalej, tieto molekuly boli schopné pevne sa viazať na VEGF, ako je opísané ďalej a blokovať fosforyláciu prirodzeného Flk1 receptora exprimovaného v endotelových bunkách, ako je opísané ďalej.
(a) Konštrukcia expresného plazmidu pFlt1.D2.Flk1D3.FcÁC1(a)
Expresné plazmidy pMT21.Flt1(1-3)-Fc (6519 bp) a pMT21.Flt1(1-3)-Fc (5230 bp) sú plazmidy, ktoré kódujú rezistenciu na ampicilín a Ig domény 1-3 ľudského Flt1 a ľudského Flt1 s naviazaným Fc, v príslušnom poradí. Tieto plazmidy boli použité na konštrukciu DNA fragmentu skladajúceho sa z fúzie Ig domény 2 Flt1 s Ig doménou 3 Flk1, s použitím PCR amplifikácie príslušných Ig domén, po ktorej nasledovalo ďalšie kolo PCR na uskutočnenie fúzie dvoch domén do jediného fragmentu. Pre Ig doménu 2 Flt1 boli 5' a 3' amplifikačné priméry nasledujúce:
5': bsp/flt1 D2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')
3': Flt1d2-Flk1d3.as (5'-CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3')
5' amplifikačné priméry kódujú reštrikčné miesto na BspE1 enzým pred Ig doménou 2 Flt1, ktoré je definované aminokyselinovou sekvenciou GRPFVEM (zodpovedajúce aminokyselinám 27-33 obr. 21A-21C). 3' primér kóduje reverzný komplement 3' konca Flt1 Ig domény 2 fúzovaný priamo na 5’ začiatok Flk1 Ig domény 3, s fúziou v mieste definovanom ako Flt1 (zodpovedajúcim aminokyselinám 123-126 obr. 21A-21C) a pokračujúcim do WLS (zodpovedajúcim aminokyselinám 127-130 obr. 21A-21C) Flk1.
Pre Ig doménu 3 Flk1 boli 5' a 3' amplifikačné priméry nasledujúce:
5': Flt1D2-Flk1D3.s (5'-ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG- 3')
3'; Flk1D3/apa/srf.as (5 '-GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG- 3')
5' amplifikačný primér kóduje koniec Flt1 Ig domény 2 fúzovaný priamo na začiatok Flk1 Ig domény 3, ako bolo opísané vyššie. 3' amplifikačný primér kóduje koniec Flk1 Ig domény 3, definovaný aminokyselinami VRVHEK (zodpovedajúcimi aminokyselinám 223-228 obr. 21A-21C), po ktorých nasleduje premosťujúca sekvencia, ktorá zahŕňa rozpoznávaciu sekvenciu pre reštrikčný enzým Srf 1 a ktorá kóduje aminokyseliny GPG. Premosťujúca sekvencia zodpovedá aminokyselinám 229-231 obr. 21A-21C.
Po kole PCR amplifikácie na produkciu jednotlivých domén sa produkty zmiešali v skúmavke a podrobili sa ďalšiemu kolu PCr s primérmi bsp/flt1D2 a Flk1D3/apa/srf.as (opísanými vyššie) za získania fúzneho produktu. Tento PCR produkt bol potom trávený reštrikčnými enzýmami BspEl a Smal a získaný 614 bp fragment bol subklonovaný do BspEl až Srfl reštrikčných miest vektora pMT21/B2Fc, za získania plazmidu pMT21/Flt1D2.FlkD3.Fc. Nukleotidová sekvencia Flt1 D2Flk1D3 génového fúzneho inzertu bola verifikovaná štandardnou analýzou sekvencie. Tento plazmid bol potom trávený reštrikčnými enzýmami EcoRI až Srfl a získaný 702 bp fragment bol prenesený do EcoRI až Srfl reštrikčných miest plazmidu pFlt1(1-3)B2-FcAC1(a) za získania plazmidu pFlt1D2.Flk1D3.FcAC1(a). Kompletná DNA a odvodená aminokyselinová sekvencia chimérickej molekuly Flt1D2.Flk1D3.Fc.AC1(a) sú uvedené na obr. 21A-21C.
(b) Konštrukcia expresného plazmidu pFlt1D2VEGFRD3FcÁC1(a)
Expresný plazmid pMT21.Flt1(1-3)-Fc (6519 bp) je plazmid, ktorý kóduje rezistenciu na ampicilín a Ig domény 1-3 ľudského Flt1 receptora s naviazaným Fc. Tento plazmid bol použitý na konštrukciu DNA fragmentu obsahujúceho Ig doménu 2 Flt1 s použitím PCR. RNA z bunkovej línie HEL921.7 bola použitá na produkciu Ig domény 3 Flk1, s použitím štandardného PCR. Ďalšie kolo PCR amplifikácie bolo použité na uskutočnenie fúzie dvoch Ig domén do jediného fragmentu. Pre Ig doménu 2 Flt1 boli 5' a 3' amplifikačné priméry nasledujúce:
5': bsp/flt1D2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')
3': Flt1D2.VEGFR3D3.as (5'-TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT)
5' amplifikačný primér kóduje reštrikčné miesto na BspE1 enzým pred Ig doménou 2 Flt1, ktoré je definované aminokyselinovou sekvenciou GRPFVEM (zodpovedajúce aminokyselinám 27-33 obr. 21A-21C). 3' primér kóduje reverzný komplement konca Flt1 Ig domény 2 fúzovaný priamo na 5' začiatok VEGFR3 Ig domény 3, s fúziou v mieste definovanom ako TIID Flt1 (zodpovedajúcim aminokyselinám 123-126 obr. 22A-22C) a pokračujúcim do IQLL VEGFR3 (zodpovedajúcim aminokyselinám 127-130 obr. 22A-22C).
Pre Ig doménu 3 VEGFR3 boli 5' a 3' amplifikačné priméry nasledujúce:
5': R3D3.S (5'-ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTGGTA)
3': R3D3.as (5'-ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)
5' a 3' amplifikačné priméry zodpovedajú sekvencií VEGFR3. 296 bp produkt amplifikácie tejto RT-PCR reakcie bol izolovaný štandardnými technikami a bol spracovaný druhým kolom PCR na pridanie vhodných sekvencií na umožnenie fúzie FLT1D2 s Flk1D3 doménami a fúzie Flk1D3 a Fc domén prostredníctvom GPC mostíka (pozri ďalej). Amplifikačné priméry boli nasledujúce:
5': Flt1D2.VEGFR3D3.as (TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG)
3': VEGFR3D3/srf.as (GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT)
5' amplifikačný primér kóduje 3' koniec Flt1 Ig domény 2 fúzovaný priamo na začiatok (5' koniec) VEGFR3 Ig domény 3, ako bolo opísané vyššie. 3' amplifikačný primér kóduje 3' koniec VEGFR3 Ig domény 3, definovaný aminokyselinami VIVHEN (zodpovedajúcimi aminokyselinám 221-226 obr. 22A-221C), po ktorých nasleduje premosťujúca sekvencia, ktorá zahŕňa rozpoznávaciu sekvenciu pre reštrikčný enzým Srf1 a ktorá kóduje aminokyseliny GPG. Premosťujúca sekvencia zodpovedá aminokyselinám 227-229 obr. 22A-22C.
Po jednom kole (pre Flt1 Ig doménu 2) alebo dvoch kolách (pre Flt4 Ig doménu 3) PCR amplifikácia na produkciu jednotlivých Ig domén sa produkty PCR zmiešali v skúmavke a podrobili sa ďalšiemu kolu PCR amplifikácie s amplifikačnými primérmi bsp/flt1D2 a VEGFR3D3/srf.as (opísanými vyššie) za získania fúzneho produktu. Tento PCR produkt bol potom trávený reštrikčnými enzýmami BspEl a Smal a získaný 625 bp fragment bol subklonovaný do BspEl až Srfl reštrikčných miest vektora pMT21/Flt1 B2.Fc (opísaného vyššie), za získania plazmidu pMT21/Flt1D2.VEGFR3D3.Fc. Nukleotidová sekvencia Flt1D2-VEGFR3D3 génového fúzneho inzertu bola verifikovaná štandardnou analýzou sekvencie. Tento plazmid bol potom trávený reštrikčnými enzýmami EcoRI a Srfl a získaný 693 bp fragment bol subklonovaný do EcoRI až Srfl reštrikčných miest plazmidu pFlt1(1-3)AB2-FcAC1(a) za získania plazmidu pFlt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a). Kompletné DNA a odvodená aminokyselinové sekvencia chimérickej molekuly Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a) sú uvedené na obr. 22A-22C.
Príklad 18: Test väzby na medzibunkovú hmotu (ECM)
Platne potiahnuté ECM (Becton Dickinson katalógovej č. 35-4607) boli rehydratované teplým DME doplneným glutamínom (2 mM), 100 U penicilínu, 100 U streptomycínu a 10 % BCS počas aspoň 1 hodiny pred pridaním vzoriek. Platne sa potom inkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti s rôznymi koncentráciami Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a) s prvou hodnotou 10 nM a potom s 2-násobným riedením v PBS plus 10 % BCS. Platne sa potom premyli 3-krát PBS plus 0,1 % Tritón-X a inkubovali sa s protilátkou proti ľudskému Fc konjugovanou s alkalickou fosfatázou (Promega, 1: 4000 v PBS plus 10 % BCS) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Platne sa potom premyli 4-krát PBS s 0,1 % Tritón-X a pridal sa pufor na alkalickú fosfatázu/pNPP roztok (Sigma) na vývoj sfarbenia. Platne sa odčítali pri I = 405-507 nm. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 23 a demonštrujú, že Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a) proteíny sa významne menej viažu na ECM v porovnaní s Flt1 (1 -3)-Fc proteínom.
Príklad 19: Dočasná expresia Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) v CHO-K1 (E1A) bunkách
Veľkoobjemová (2 I) kultúra E.coli DH10B nesúcich pFlt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) plazmid opísaný vyššie v príklade 17 (a) sa kultivovala cez noc v Terrific Broth (TB) plus 100 pg/ml ampicilínu. Ďalší deň sa plazmidová DNA extrahovala s použitím QIAgen Endofree Megaprep kitu podľa návodu výrobcu. Koncentrácia prečistenej plazmidovej DNA sa určila štandardnými technikami s použitím UV spektrofotometra a fluorometra. Plazmidová DNA sa verifikovala štandardným trávením podielov reštrikčnými enzýmami s použitím reštrikčných enzýmov EcoRI plus Notl a Asel. Všetky fragmenty získané trávením reštrikčnými enzýmami mali predpokladanú veľkosť pri analýze na 1 % agarózovom gély.
i
V 14 15 cm Petriho miskách sa kultivovali CHO-K1/E1A bunky s hustotou 4x106 buniek/platňa. Kultivačným médiom bolo Gibco Ham's F-12 doplnené 10 % Hyclone fetálnym hovädzím sérom (FBS), 100 U peniciltnu/100 U streptomycínu a glutamínom (2 mM). Nasledujúci deň bola každá platňa buniek transfektovaná 6 μg pFlt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) plazmidové DNA s použitím Gibco Optimom a Gibco Lipofectamine v objeme 12 ml, podľa návodu výrobcu. 4 hodiny po pridaní transfekčnej zmesi k bunkám sa pridalo 12 ml/platňa Optimom doplneného 10 % FBS. Platne sa inkubovali pri teplote 37 °C v inkubátore s 5 % CO2 cez noc. Nasledujúci deň sa z každej platne odstránilo médium a pridalo sa 25 μΙ expresného média (Gibco CHO-S-SFM-II doplnené glutamínom (2 mM) a 1 mM nátriumbutyrátom). Platne sa inkubovali pri teplote 37 °C počas 3 dní. Po 3 dňoch inkubácie sa z každej platne ašpirovalo médium, ktoré sa odstredilo pri 400 rpm v odstredivke s húpajúcou sa komorou za účelom peletovania buniek. Supernatant sa dekantoval do sterilných 1 litrových baniek a prečistenie exprimovaného proteínu sa uskutočnilo spôsobom opísaným ďalej.
Príklad 20: Konštrukcia pVEGFR1R2-FcAC1(a) expresného vektora
Expresný plazmid pVEGFR1R2-FcAC1(a) bol konštruovaný inzerciou DNA kódujúci aminokyseliny SDT (zodpovedajúci aminokyselinám 27-29 na obr. 24A-24C) medzi Flt1d2-Flk1d3-FcAC1(a) aminokyseliny 26 a 27 podľa obr. 21A-21C (GG) a odstránením DNA kódujúcej aminokyseliny GPG zodpovedajúce aminokyselinám 229-231 obr. SDT aminokyselinová sekvencia je prirodzená pre Flt1 receptor a bola vrátená na zníženie pravdepodobnosti heterogénneho N-koncového spracovania. GPG (premosťujúce sekvencie) bola odstránená, takže Flt1 a Flk1 Ig domény boli fúzované priamo jedna na druhú. Kompletné DNA a odvodená aminokyselinová sekvencia pVEGFR1R2-FcAC1(a) chimérickej molekuly sú uvedené na obr. 24A24C.
Príklad 21: Kultivácia buniek použitá na produkciu modifikovaných Flt1 receptorov (a) Kultivácia buniek použitá na produkciu Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a)
Proces na produkciu Flt1 D2.Flk1 D3.FcAC1 (a) proteínu s použitím expresného plazmidu pFlt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) opísaného vyššie v príklade 1 zahrňoval suspenznú kultiváciu rekombinantných ovariálnych buniek čínskeho škrečka (CHOK1/E1A), ktoré konštitutívne exprimujú proteínový produkt. Bunky sa kultivovali v bioreaktoroch a proteínový produkt sa izoloval a prečistil afinitnou chromatografiou a chromatografiou s vylučovaním podľa veľkosti. Proces je podrobne opísaný ďalej.
Expanzia buniek
Dve konfluentné T-225 cm2 skúmavky obsahujúce bunkovú líniu exprimujúcu Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) sa expandovali pasážovaním buniek do 8 T-225 cm2 skúmaviek v médiu (GMEM + 10 % sérum, GIBCO) a inkubovaním pri 37 °C a 5 %
C02. Keď bola dosiahnutá požadovaná konfluencia (približne za 3 až 4 dni), tak sa bunky oddelili s použitím trypsínu. Čerstvé médium sa pridalo na chránenie buniek pred ďalším pôsobením trypsínu. Bunky sa odstredili a resuspendovali sa v čerstvom médiu a potom sa preniesli do 8 850 cm2 valcových skúmaviek a inkubovali sa pri 37 °C a 5 % CO2 na dosiahnutie konfluencie.
Suspenzná kultúra v bioreaktoroch
Bunky kultivované vo valcovitých skúmavkách sa trypsinizovali na uvoľnenie od povrchu a premyli sa suspenziou kultivačného média. Bunky sa aseptický preniesli do 5 I bioreaktora (New Brunswick Celligen Plus), kde sa kultivovali v 3,5 litrovej suspenznej kultúre. Suspenzným kultivačným médiom boli bezglutamínové IS-CHO s nízkym obsahom glukózy (Irvine Scientific), do ktorého sa pridalo 5 % fetálne hovädzie sérum (Hyclone), GS doplnok (Life Technologies) a 25 μΜ metionín sulfoximínu (Sigma). pH sa udržovalo na 7,2 pomocou pridávania oxidu uhličitého'do dodávaného plynu alebo pridaním kvapalného roztoku uhličitanu sodného do bioreaktora. Koncentrácia rozpusteného kyslíka sa udržovala na 30 % saturácie pomocou pridávania kyslíka alebo dusíka do dodávaného plynu a teplota sa udržovala na 37 °C. Keď sa dosiahla hustota buniek 4 x 106 buniek/ml, tak sa bunky preniesli do 40 I bioreaktora obsahujúceho rovnaké médium a rovnaké nastavenie hodnôt. Teplota sa znížila na 34 °C na spomalenie rastu a zvýšenie relatívnej rýchlosti expresie proteínu.
(b) Kultivácia buniek použitá na produkciu Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a)
Rovnaký postup ako je postup opísaný vyššie pre Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) sa použil na produkciu Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a).
Príklad 22: Odber a prečistenie modifikovaných Flt1 receptorov (a) Odberá prečistenie Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a)
Proteínový produkt bol aseptický odoberaný z bioreaktora za zachytávania buniek s použitím Millipore Prostec filtračných modulov s tangenciálnym tokom a mechanickej pumpy s nízkym strihom (Fristam). Čerstvé médium sa pridalo do bioreaktora na nahradenie média odstráneného pri filtrácii. Približne 40 I získaného filtrátu sa potom vnieslo do 400 ml kolóny obsahujúcej Proteín A Sepharose živicu (Amersham Pharmacia). Po vložení sa živica premyla pufrom'obsahujúcim 10 mM fosforečnan sodný, 500 mM chlorid sodný, pH 7,2, na odstránenie akýchkoľvek nenaviazaných kontaminujúcich proteínov. Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) proteín sa eluoval citrátovým pufrom s pH 3,0. Eluovaný proteín sa neutralizoval pridaním Tris bázy a zmrazil sa pri -20 °C.
Niekoľko zmrazených šarží Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) proteínu z kroku s Proteínom A sa rozmrazilo, zmiešalo a zahustilo s použitím Millipore filtračnej membrány s tangenciálnym tokom s limitom molekulovej hmotnosti (NMWCO) 30 kD. Proteín sa preniesol do zariadenia na zahustenie buniek (Millipore) a ďalej sa zahustil na 30 mg/ml s použitím 30 kD NMWCO membrány. Zahustený proteín sa vniesol do kolóny s vylučovaním podľa veľkosti častíc naplnenej Superdex 200 živicou (Amersham Pharmacia), ktorá bola uvedená do rovnováhy fosfátom pufrovaným salinickým roztokom plus 5 % glycerolom. Rovnaký pufor bol použitý na elúciu kolóny. Frakcie zodpovedajúce Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) diméru sa zmiešali, sterilné sa prefiltrovali cez 0,22 mikrónový filter, rozdelili sa do podielov a zmrazili sa.
(b) Odberá prečistenie Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a)
Rovnaký postup ako je postup opísaný vyššie pre Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) sa použil na odberá prečistenie Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a).
Príklad 23: Fosforylačný test pre dočasne exprimovaný VEGFR2
Primárne ľudské endotelové bunky pupočníkovej žily (HUVEC), pasáž 4-6, sa nechali počas 2 hodín v bezsérovom DME médiu s vysokou koncentráciou glukózy. Pripravili sa vzorky obsahujúce 40 ng/mi (1 nM) ľudského VEGF165, čo je ligand pre VEGF receptory Flt1, Flk 1 a Flt4 (VEGFR3) a tieto vzorky sa preinkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti s rôznymi množstvami Flt1 receptorov Flt1 (1-3)-Fc, Fit (1-3)-Fc (A40), Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) a Flt1D2VEGFR3D3.FcAC1(a) v bezsérovom DME s vysokou koncentráciou glukózy obsahujúcom 0,1 % BSA. Bunky sa počas 5 minút vystavili pôsobeniu vzoriek pripravených vyššie +/- VEGF165 a potom sa uskutočnila kompletná lýza buniek s použitím pufra pre kompletnú lýzu buniek. Bunkové lyzáty sa imunoprecipitovali protilátkou namierenou proti C-koncu VEGFR2 receptora. Imunoprecipitované lyzáty sa vniesli na 4-12 % SDS-PAGE Novex gél a potom sa preniesli na PVDF membránu s použitím štandardnej techniky. Detekcia fosforylovaného VEGFR2 bola uskutočnená imunoprenosom s anti-fosfo-tyrozín mAb označenou 4G10 (UBI) a vývoj sa uskutočnil s použitím ECL-činidla (Amersham). Obr. 25A-25C a 26A-26B ukazujú výsledky tohto pokusu. Obr. 25A-25C ukazujú, že detekcia westernovým prenosom VEGFR2 (Flk1) s fosforylovaným tyrozínom pomocou stimulácie VEGF16 ligandom ukazuje, že povrchové bunkové receptory sú fosforylované v rôznej miere podľa toho, ktorý modifikovaný Flt1 receptor je použitý v priebehu preinkubácie s VEGF. Ako je vidieť na obr. 25A, pri 1,5 násobnom molárnom nadbytku buď Flt1(1-3)-Fc alebo Flt1 (1-3)-Fc (A40) alebo dočasného Flt1D2Flk1D3.FcAG1(a) je prítomná kompletná blokáda stimulácie receptora týmito troma modifikovanými Flt1 receptormi v porovnaní s pôsobením kontrolného média. Naopak, dočasný Flt1D2VEGFR3D3.FcAC1(a) nevykazuje pri tomto molárnom nadbytku žiadnu významnú blokádu, v porovnaní s pozitívnou kontrolou, ktorou je VEGF. Podobné výsledky sú vidieť na obr. 25B, kde sú modifikované Fit receptory v
3-násobnom molárnom nadbytku vzhľadom na VEGF165 ligand. Na obr. 25C, kde sú modifikované Flt1 receptory v 6-násobnom molárnom nadbytku vzhľadom na VEGF165 ligand, blokuje Flt1D2VEGFR3D3.FcAC1(a) čiastočne stimuláciu bunkových povrchových receptorov indukovanú VEGF165.
Na obr. 26A-26B ukazuje detekcia westernovým prenosom VEGFR2 (Flk1) fosforylovaného na tyrozíne v dôsledku stimulácie VEGF165 ligandom, že bunkové povrchové receptory nie sú stimulované vzorky, ktoré majú VEGF165 preinkubovaný s 1 a 2-násobným molárnym nadbytkom (obr. 26A) alebo 3 a 4-násobným molámym nadbytkom (obr. 26B) dočasného Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a), stabilného Flt1D2Flk1D3.FcAC1(a) alebo dočasného VEGFR1R2-FcAC1(a). Pri všetkých testovaných koncentráciách modifikovaného Flt1 receptora bola pozorovaná kompletná väzba VEGF165 ligandu v priebehu preinkubácie, čo viedlo k nedetekovateľnej stimulácii bunkových povrchových receptorov pomocou nenaviazaného VEGF165 v porovnaní s pôsobením kontrolného média.
Príklad 24: Test bunkovej proliferácie
Na testovanie bunkovej populácie boli MG87 bunky stabilne transfektované expresným plazmidom obsahujúcim DNA inzert kódujúci extracelulárnu doménu VEGFR2 (Flk1) fúzovanú na TrkB intracelulárnu kinázovú doménu, za získania chimérickej molekuly. Dôvodom použitia TrkB intracelulárnej kinázovej domény namiesto prirodzenej VEGFR2 (Flk1) intracelulárnej kinázovej domény bolo to, že intracelulárna kinázová doména VEGFR2 (Flk1) nespôsobuje silnú proliferačnú odpoveď týchto buniek po stimulácii VEGF165. Je známe, že MG87 bunky obsahujúce kompletný TrkB receptor majú silnú proliferatívnu odpoveď po stimulácii BDNF a preto bola Trkb intracelulárna kinázová doména použitá na nahradenie intracelulárnej kinázovej domény VEGFR (Flk1) za účelom získania výhody tejto proliferačnej reakcie.
x 103 buniek sa umiestnilo do 96-jamkovej platne a bunky sa nechali usadiť v priebehu 2 hodín pri 37 °C. Nasledujúce modifikované Fit receptory, Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a Flt1D2.VEGFR3D3.FcňC1(a) a irelévantný receptor Tie2Fc ako negatívna kontrola, sa titrovali od 40 nM do 20 pM a inkubovali sa s bunkami počas 1 hodiny pri teplote 37 °C. Ľudský rekombinantný VEGF165 v definovanom médiu sa potom pridal do všetkých jamiek v koncentrácii 1,56 nM. Platne sa inkubovali počas 72 hodín pri teplote 37 °C a potom sa pridalo MTS (Owenové
I činidlo, Promega) a platne sa inkubovali počas ďalších 4 hodín. Nakoniec sa platne odčítali na spektrofotometri pri 450/570 nm. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 27. Kontrolný receptor Tie2-Fc neblokuje proliferáciu buniek indukovanú VEGF165 v žiadnej koncentrácii, zatiaľ čo Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) blokuje proliferáciu pri 1,56 nM VEGF165 s polovicou maximálnej dávky rovnej 0,8 nM. Flt1 (1-3)-Fc a Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a) sú menej účinné v blokovaní VEGF165 v tomto teste, s polovicou maximálnej dávky rovnej približne 2 nM. VEGF165 sám o sebe vedie na dosiahnutie absorbancie 1,2 jednotiek a pozadie je 0,38 absorbančných jednotiek.
Príklad 25: Väzbová stechiometria modifikovaných Fit receptorov pre VEGF165 (a) Biacore analýza
Stechiometria Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a VEGFR1R2-FcAC1(a) interakcie s ľudským VEGF165 sa určila meraním buď úrovne saturačnej väzby VEGF na Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2-FcAC1(a) povrchy alebo meranie koncentrácie VEGF165 nutné pre kompletné blokovanie väzby Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2-FcAC1(a) na povrch VEGF BIAcore čipu.
Modifikované Fit receptory Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a VEGFR1R2-FcAC1(a) boli zachytené pomocou protilátky špecifickej pre Fc, ktorá bola najskôr imobilizovaná na Biacore čipe (BIACORE) s použitím amínových kopulačných činidiel. Povrch bez protilátky bol použitý ako negatívna kontrola. VEGF165 bol injikovaný v koncentrácii 1 nM, 10 nM a 50 nM na Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a VEGFR1R2-FcAC1(a) povrchy v dávke 10 μΙ/min počas jednej hodiny. Väzbový signál v reálnom čase bol meraný a na konci každej injekcie bola dosiahnutá saturačná väzba. Väzbová stechiometria bola vypočítaná ako molárny pomer naviazaného VEGF165 k imobilizovanému Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2-FcAC1(a), s použitím konverzného faktora 1000 RU ekvivalentných 1 ng/ml. Výsledky ukazujú na väzbovú stechiometriu jednej VEGF165 dimérnej molekuly na jednu molekulu Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2-FcAC1(a) (obr.28).
V roztoku sa Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2-FcAC1(a) v koncentrácii 1 nM (čo je koncentrácia predpokladane 1000-krát vyššia ako KD Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2-FcAC1(a)/VEGF165 interakcie) zmiešali s rôznymi koncentráciami VEGF165. Po jednej hodine inkubácie sa voľný Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) v roztoku stanovil ako väzbový signál na VEGF165amínovom povrchu. Kalibračná krivka sa použila na konverziu
Flt1 D2. Flk1 D3.FcAC 1 (a) BIACORE väzbového signálu na jeho molárnu koncentráciu. Dáta ukazujú, že pridanie 1 nM VEGF165 do roztoku Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) úplne blokujE väzbu Flt1D2-Flk1D3.FcAC1(a) na VEGF165 povrch. Tento výsledok ukazuje na väzbovú stechiometriu jednej VEGF165 molekuly na jednu molekulu Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) (obr. 29 a obr. 30). Keď sa koncentrácia Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) vniesla do grafu ako funkcia pridanej koncentrácie VEGF165, tak bol sklon lineárnej časti -1,06 pre Flt1D2.Flk1D3-FcAC1(a) a -1,07 pre VEGFR1R2-FcAC1(a). Veľkosť sklonu, veľmi blízka mínus jednej, ukazovala na väzbu jednej molekuly VEGF165 na jednu molekulu buď Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a), alebo VEGFR1R2-FcAC1(a).
(b) Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc
Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) sa zmiešal s 3-násobným nadbytkom VEGF165 a komplex ligand-receptor sa prečistil s použitím Pharmacia Superose 6 chromatografickej kolóny s vylučovaním podľa veľkosti častíc. Komplex ligandreceptor sa potom inkuboval v pufri obsahujúcom 6M guanidínium hydrochlorid pre disociáciu do jednotlivých proteínových zložiek. Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) sa separoval od VEGF165 s použitím Superose 6 chromatografickej kolóny s vylučovaním podľa veľkosti častíc eluované 6M guanidínium chloridom. Na určenie stechiometrie komplexu sa uskutočnilo niekoľko injekcií Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a VEGF165 a výška piku alebo integrovaná intenzita piku sa vniesla do grafu ako funkcia koncentrácie injikovaného proteínu. Kalibrácia sa uskutočnila za podmienok identických podmienkam použitým na separovanie zložiek komplexu Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a)/VEGF. Kvantifikácia zloženia komplexu
Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a)/VEGF sa uskutočnila podľa kalibračných kriviek. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 28, ktorý ukazuje, že pomer VEGF165 k Flt1 D2.Flk1 D3.FcAC1 (a) v komplexe je 1: 1.
Príklad 26: Určenie väzbovej stechiometrie komplexu Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a)/ VEGF165 pomocou chromatografie s vylučovaním podľa veľkosti častíc
Príprava komplexu Flt1D2.Flk1D3.FcÁC1(a)/VEGF165
VEGF165 (koncentrácia = 3,61 mg/ml) sa zmiešal s CHO bunkami dočasne exprimujúcimi Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) (koncentrácia = 0,9 mg/ml) v molárnom pomere 3 : 1 (VEGF165 : Flt1D2.Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a)) a uskutočnila sa inkubácia cez noc pri teplote 4 °C.
(a) Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc (SEC) pri natívnych podmienkach.
Na separovanie komplexu od nadbytku nenaviazaného VEGF165 sa 50 μΙ komplexu vnieslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolóny, ktorá sa uviedla do rovnováhy v PBS pufri. Vzorka sa eluovala rovnakým pufrom pri prietoku 40 μΙ/min pri teplote miestnosti. Výsledky tejto SEC sú uvedené na obr. 31. Pík 1 predstavuje komplex a pík 2 predstavuje nenaviazaný VEGF165. Frakcie eluované medzi 1,1 a 1,2 ml sa zmiešali a guanidínium chlorid (GuHCI) sa pridal v konečnej koncentrácii 4,5 M na disociovanie komplexu.
(b) Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc (SEC) pri disociačných podmienkach
Na separovanie zložiek komplexu receptor-ligand a na určenie ich molárneho pomeru sa 50 μΙ disociovaného komplexu opísaného vyššie vnieslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolóny, ktorá sa uviedla do rovnováhy pomocou 6M GuHCI a eluovala sa rovnakým roztokom pri prietoku 40 μΙ/min pri teplote miestnosti. Výsledky tejto SEC sú uvedené na obr. 32. Pík 1 predstavuje Flt1 D2.Flk1 D3.FcAC1 (a) a pík 2 predstavuje VEGF165.
(c) Výpočet stechiometrie komplexu Flt1D2.Flk1D3.FcúC1(a)/VEGF165
Stechiometria komplexu receptor-ligand sa určila z plochy piku alebo výšky piku zložiek. Koncentrácie VEGF165 alebo Flt1D2.Flk1D3.FcÁC1(a) zodpovedajúce výške piku alebo ploche piku, v príslušnom poradí, sa získali zo štandardných kriviek pre VEGF165 a Flt1 D2.Flk1D3.FcAC1(a). Na získanie štandardnej krivky sa 4 rôzne koncentrácie (0,04 mg/ml - 0,3 mg/ml) jednej zo zložiek injikovali do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolóny, ktorá sa uviedla do rovnováhy pomocou 6M GuHCI a eluovala sa rovnakým roztokom pri prietoku 40 μΙ/min pri teplote miestnosti. Štandardná krivka sa získala zostrojením grafu plocha piku alebo výška piku vs koncentrácia proteínu. Molárny pomer VEGF165 : Flt1D3.FcAC1(a) určený z výšky piku zložiek bol 1,10.
Príklad 27: Určenie väzbovej stechiometrie komplexu Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a)/ VEGF165 pomocou chromatografie s vylučovaním podľa veľkosti častíc s on-line detektorom rozptylu svetla
Príprava komplexu
VEGF165 sa zmiešal s CHO bunkami dočasne exprimujúcimi Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) v molárnom pomere 3 1 (VEGF165
Fit 1D2.Flk 1 D3.FcAC1 (a)) a uskutočnila sa inkubácia cez noc pri teplote 4 °C.
(a) Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc (SEC) s on-line detektorom rozptylu svetla
Chromatografická kolóna s vylučovaním podľa veľkosti častíc s Mini-Dawn online detektorom rozptylu svetla (Wyatt Technology, Santa Barbara, California) a detektory indexu lomu (Rl) (Shimadzu, Kyoto, Japan) sa použila na stanovenie molekulovej hmotnosti (MW) komplexu receptor-ligand. Vzorky sa injikovali do Superose 12 HR 10/30 kolóny, ktorá sa uviedla do rovnováhy v PBS pufri a eluovali sa rovnakým pufrom pri prietoku 0,5 ml/min pri teplote miestnosti. Ako je uvedené na obr. 33, vykazoval elučný profil dva piky. Pík 1 predstavuje komplex ligand-receptor a pík 2 predstavuje nenaviazaný VEGF165. Mol. hmôt. bola vypočítaná z LS a Rl signálov. Rovnaký postup sa použil na stanovenie mol. hmôt. jednotlivých zložiek komplexu ligand-receptor. Výsledky týchto meraní sú nasledujúce: mol. hmôt.
komplexu Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a)/VEGF165 v pikovej pozícii je 157300 (obr. 33), mol. hmôt. VEGF165 v pikovej pozícii je 44390 (obr. 34) a mol. hmôt. R1R2 v piku je 113300 (obr. 35).
Tieto dáta ukazujú, že stechiometria komplexu Flt1D2.Flk1D3.FcóC1(a)/VEGF je 1 1, pretože to zodpovedá súčtu molekulových hmotností pre
Flt1D2.Flk1D3.FcÁC1(a) a VEGF165. Dôležité je to, že táto metóda overila, že komplex Flt1D2.Flk1D3.FcÁC1(a)/VEGF165 sa skladá z iba jednej molekuly VEGF165 ligandu a iba jednej molekuly Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a).
Príklad 28: Peptidové mapovanie Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a)
Disulfidové štruktúry a glykozylačné miesta vo Flt1D2.Flk1D3.FcÁC1(a) sa určili metódou peptidového mapovania. V tejto metóde sa proteín najskôr štiepil trypsínom. Získané fragmenty sa analyzovali a identifikovali HPLC spoločne s hmotnostnou spektrometriou a ďalej tiež technikou N-terminálneho sekvenovania. Redukcia trávenia trypsínom sa použila na identifikáciu fragmentov obsahujúcich disulfidové väzby. Spracovanie produktov trávenia trypsínom PNGázou (Glyko, Novato, Ca) sa použilo na identifikáciu fragmentov s N-viazanými glykozylačnými miestami. Výsledky sú zhrnuté na obr. 36.
Vo Flt1D2.Flk1D3.FcňC1(a) existuje celkom 10 cysteínov; 6 z nich je prítomné v Fc regióne. Bolo potvrdené, že Cys27 je disulfidovo viazaný na Cys76. Bolo potvrdené, že cys121 je disulfidovo viazaný na Cys182. Prvé dva cysteíny vo Fc regióne (Cys211 a Cys214) tvoria intermolekulovú disulfidovú väzbu s rovnakými dvoma cysteínmi v inom Fc reťazci. Avšak, pretože tieto dva cysteíny nemôžu byť od seba enzýmovo separované, nemôže byť určené, či existuje disulfidové väzba medzi rovnakými cysteínmi (napríklad Cys211-Cys211) alebo medzi Cys211 a Cys214. Bolo potvrdené, že Cys216 je disulfidovo viazaný na Cys306. Bolo potvrdené, že Cys352 je disulfidovo viazaný na Cys410.
Vo Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) existuje 5 potenciálnych N-glykozylačných miest.
Všetkých 5 miest je v rôznom rozsahu glykozylovaných. Kompletná glykozylácia bola zistená na Asn33 (aminokyselinové sekvencia NIT), Asn193 (aminokyselinové sekvencia NST) a Asn282 (aminokyselinové sekvencia NST). Ďalej bola zistená čiastočná glykozylácia na Asn65 a Asn120. Miesta glykozylácie sú podčiarknuté na obr. 36.
Príklad 29: Farmakokinetická analýza modifikovaných Fit receptorov (a) Farmakokinetická analýza Flt(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a VEGFR1R2-FcAC1(a)
Balb/c myšiam (25-30 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), CHO dočasne exprimujúcich Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a), CHO stabilne exprimujúcich Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a CHO dočasne exprimujúcich VEGFR1R2FcAC1 (a). Myšiam sa odoberala krv z chvosta 1,2,4, 6, 24 hodín, 2 dni, 3 dni a 6 dní po injekcii. Sérum sa testovalo v ELISA navrhnutom na detekciu Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo VEGFR1R2-FcAC1(a). ELISA test zahŕňa potiahnutie ELISA platne VEGF165, väzbu Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1 D2.Flk1 D3.FcAC1 (a) alebo VEGFR1R2-FcAC1(a) a zobrazenie anti-Fc protilátkou naviazanou na chrenovú peroxidázu. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 37. Tmax pre Flt1(1-3)-Fc (A40) bol 6 hodín, zatiaľ čo Tmax pre dočasne a stabilne exprimovaný Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a dočasne exprimovaný Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) boli 24 hodín. Cmax pre Flt1(1-3)-Fc (A40) bola 8 μg/ml. Pre dočasne exprimované peptidy (Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a VEGFR1R2-FcAC1(a)) boli Cmax 18 μg/ml a pre stabilne exprimovaný VEGFR1R2-FcAC1(a) bola Cmax 30 μg/ml.· (b) Farmakokinetická analýza Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a Flt1 D2.VEGFR3D3.FcAC1 (a)
Balb/c myšiam (25-30 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), CHO dočasne exprimujúcich Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a CHO dočasne exprimujúcich Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a). Myšiam sa odoberala krv z chvosta 1, 2,
5, 6, 7, 8, 12, 15 a 20 dní po injekcii. Sérum sa testovalo v ELISA navrhnutom na detekciu Flt1 (1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a). ELISA test zahŕňa potiahnutie ELISA platne VEGF165, väzbu Flt1 (1 -3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo Flt1D2,VEGFR3D3.FcAC1(a) a zobrazenie anti-Fc protilátkou naviazanou na chrenovú peroxidázu. Flt1(1-3)-Fc (A40) nemohol byť detekovaný v sére po 5. dni, zatiaľ čo Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a) boli detekovateľné po 15 dňoch a dlhšie. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 38.
Príklad 30: Hodnotenie schopnosti Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) inhibovať rast nádoru in vivo
Na hodnotenie schopnosti Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) inhibovať rast nádoru in vivo sa použil model, v ktorom je suspenzia nádorových buniek implantovaná podkožné do pravej labky samcov myší s ťažkou kombinovanou imunodeficienciou (SCID). V tomto teste sa použili dve bunkové línie, ľudská HT-1080 fibrosarkómová bunková línia (ATCC prírastkové č. CCL-121) a potkania C6 gliómová bunková línia (ATCC prírastkové č. CCL-107), ktoré majú značne odlišné morfologické a rastové charakteristiky. Prvá dávka Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) (25 mg/kg alebo v dávke uvedenej na obr. 39 a 40) sa podala v deň implantácie nádoru. Zvieratám sa potom podávali podkožnou injekciou Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) alebo vehikulum buď každý druhý deň (EOD) alebo dvakrát týždenne (2x/týždenne) počas 2 týždňov. Po 2 týždňoch sa zvieratá fixovali, odobrali sa nádory a vzorky sa zaslepili. Objem nádorov sa meral pomocou merania dĺžky a šírky viditeľných podkožných nádorov. Ako Flt1(1-3)-Fc (A40), tak Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) významne redukovali rast nádorov tvorených HT-1080 a C6 bunkami. Výsledky týchto pokusov sú uvedené na obr. 39 a 40.
Príklad 31: Efekt VEGF165 a modifikovaných Fit receptorov na samičí reprodukčný systém
Stereotypný charakter cievnej prestavby, ku ktorej dochádza v maternici a ováriu v priebehu reprodukčného cyklu, bol dobre charakterizovaný, čo robí toto tkanivo veľmi vhodné na testovanie mechanizmov, ktoré regulujú angiogenézu, cievnu prestavbu a regresiu ciev. Ďalej, pokusy s hybridizáciou reprodukčných tkanív in situ poskytli jasné dôkazy, že EVGF pôsobí ako mediátor fyziologickej angiognézy pri zdravých hlodavcoch, rovnako ako u človeka a ostatných primátov (Phillips et al., 1990; Ravindranath et al., 1992; Shweiki et al., 1993; Kamat et al., 1995). Pretože sú cyklická angiogenéza a cievna prestavba význačnými rysmi normálnych vaječníkov a maternice, nie je prekvapivé, že abnormálny rast ciev a/alebo dysfunkcie ciev charakterizujú mnohé patologické stavy, ktoré postihujú tieto orgány. Ďalej, sa predpokladá, že tieto patogénne cievne abnormality sú spôsobené alebo podporované dysregulovanou expresiou jedného alebo viac angiogénnych alebo anti-angiogénnych faktorov, hlavne VEGF.
Napríklad je abnormálna angiogenéza charakteristická pre polycystické ovária, endometriózu a karcinóm endometria a pri každom z týchto ochorení je VEGF nadmerne exprimovaný v postihnutom tkanive (Kamat et al., 1995; Shifren et al., 1996; Guidi et al., 1996; Donnez et al., 1998). Predpokladá sa, že nadmerná expresia VEGF hrá patogénnu úlohu pri vzniku cievnej hyperpermeability pri ovariálnom hyperstimulačnom syndróme (McCIure et al., 1994; Levin et al., 1998) a preeklampsii (Baker et al., 1995; Sharkey et al., 1996). Ďalej, VEGF sa považuje za faktor permeability zodpovedný za produkciu ascitu asociovaného s karcinómom ovária a inými nádormi (Senger et al., 1983; Boocock et al., 1995). Činidlá, ktoré účinne neutralizujú biologické účinky VEGF, môžu mať terapeutický prínos pri vyššie uvedených a podobných stavoch.
Angiogenéza a cievna prestavba sú tiež charakteristikami implantácie blastocystov a vývoja placenty (Findlay, 1986). VEGF je silne exprimovaný ako v maternálnej lamina decidua, tak v embryonálnom trofoblaste, kde sa predpokladá, že najskôr stimuluje expanziu a hyperpermeabilitu cievnej vaskulatúry v priebehu periimplantačného obdobia, a potom sprostredkuje tvorbu materských a embryonálnych zložiek placentárnej vaskulatúry (Schweiki et al., 1993; Cullinan-Bove and Koos, 1993; Chakraborty et al., 1995; Das et al., 1997). VEGF je tiež nutné pre luteálnu angiogenézu a s ňou spojenú sekréciu progesterónu nutnú na prípravu maternice na implantáciu (Ferrara et al., 1998). Preto môžu byť činidlá inhibujúce biologické účinky VEGF použiteľné ako antikoncepčné činidlá (tým, že bránia implantácii), alebo ako činidlá spôsobujúce potraty v skorých štádiách gestácie. Druhé uvedené použitie môže byť najmä významné pri nechirurgickom ukončení
I ektopických tehotenstiev.
Hoci je expresia VEGF receptorov obmedzená najmä na cievny endotel v normálnom reprodukčnom tkanive, je Flt1 exprimovaný tiež trofoblastami v placente ako ľudí, tak iných zvierat (Clark et al., 1996; He et al., 1999), kde sa predpokladá, že sa podieľa na invázii trofoblastu. Zaujímavé je, že ako Flt1, tak KDR (Flk1) sú exprimované choriokarcinómovou bunkovou líniou BeWo (Charnock-Jones et al., 1994) a bolo preukázané, že VEGF podporuje syntézu DNA a fosforyláciu tyrozínu MAP kinázy v týchto bunkách. Ďalej, metastázujúce ovariálne karcinómy nielen exprimujú vysoké koncentrácie VEGF, ale - okrem cievneho endotelu - nádorové bunky exprimujú KDR a/alebo Flt1 (Boocock et al., 1995). Tieto zistenia naznačujú, že VEGF sa môže nielen zásadne podieľať na tvorbe a udržiavaní cievnej vaskulatúry, ale že aspoň pri niektorých nádoroch môže mať VEGF samotnú autokrinnú úlohu a môže priamo podporovať prežívanie a proliferáciu nádorových buniek. Preto môžu mať činidlá blokujúce účinky VEGF najmä výhodné účinky pri liečbe nádorov reprodukčných orgánov.
Metódy a výsledky (a) Hodnotenie maternicovej hyperpermeability indukovanej VEGF
Sérový gonadotropín žrebných kobýl (PMSG) sa podkožnou injekciou (5 IU) aplikoval za účelom indukcie ovulácie u prepubertálnych krysích samíc. Toto viedlo k vzostupu estradiolu po 2 dňoch, čo nakoniec spôsobilo indukciu VEGF v maternici. Je opísané, že táto indukcia vedie k hyperpermeabilite maternice a zvyšuje hmotnosť maternice o 6 hodín neskôr a tento účinok môže byť potenciálne blokovaný modifikovanými Fit receptormi Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcňC1(a) a Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a). V tomto modeli in vivo je normálna hmotnosť krysej maternice približne 50 mg a PMSG môže indukovať zvýšenie hmotnosti na 350 mg.
Sušením tkaniva sa ukáže, že toto zvýšenie hmotnosti je úplne spôsobené vodou.
Podkožná injekcia Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a) a
Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a) v dávke 25 mg/kg za 1 hodinu po injekcii PMSG vedie k približne 50 % inhibícii zvýšenia hmotnosti maternice. Zvýšenie dávky modifikovaných Fit receptorov ďalej neredukuje zvýšenie maternice, čo naznačuje, že v tomto modeli existuje zložka nezávislá od VEGF. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 41.
(b) Hodnotenie angiogenézy v corpus luteum s použitím progesterónu ako sledovanej hodnoty
Sérový gonadotropín žrebných kobýl (PMSG) sa podkožnou injekciou (5 IU) aplikoval za účelom indukcie ovulácie u prepubertálnych krysích samíc. Toto viedlo po 4 dňoch k vzniku úplne funkčného corpus luteum obsahujúceho hustú sieť ciev, ktorá umožňovala sekréciu progesterónu do krvného riečiska za účelom prípravy maternice na implantáciu. Indukcia angiogenézy v corpus luteum vyžaduje VEGF; blokovanie VEGF teda povedie k chýbaniu nových krvných ciev a tak k nedostatku progesterónu secernovaného do krvného riečiska. V tomto modeli in vivo sú pokojové hladiny progesterónu približne 5 ng/ml a pomocou PMSG môžu byť indukované hodnoty 25-40 ng/ml. Podkožná injekcia Flt1(1-3)-Fc (A40) alebo Flt1 D2Flk1D3.FcAC1(a) v dávke 25 mg/kg alebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekcii PMSG vedie ku kompletnej inhibícii indukcie progesterónu v deň 4. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 42A-42B.
I
Príklad 33: Farmakokinetické analýzy Flt1(1-3)-Fc (A40) a pegylovaného Flt1(1-3)Fc
Flt1 (1-3)-Fc bol PEGylovaný buď pomocou 10 kD PEG, alebo 20 kD PEG a bol testovaný na Balb/c myšiach na zistenie jeho farmakokinetického profilu. Bolo zistené, že obidve pegylované formy Flt1(1-3)-Fc majú oveľa lepšie farmakokinetické profily ako Flt1 (1-3)-Fc (A40), s Tmax v 24 hodinách pre pegylované molekuly oproti 6 hodinám pre Flt1(1-3)-Fc (A40).
Príklad 34: VEGF165 ELISA na testovanie afinity modifikovaných variantov Flt1 receptorov pM VEGF165 sa inkubovalo cez noc pri teplote miestnosti s modifikovanými variantmi Fit receptorov v koncentráciách od 160 pM do 0,1 pM. Modifikovanými variantmi Flt1 receptorov použitými v tomto pokuse boli Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40), dočasne exprimovaný Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a), dočasne exprimovaný Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a), Flt1 (1-3NAS)-Fc, Flt1(1-3R^C)-Fc a Tie2Fc. Flt1 (1 -3NAS)-Fc je modifikovanou verziou Flt1(1-3)-Fc, v ktorej je vysoko bázická aminokyselinová sekvencia KNKRASVRRR nahradená sekvenciou NASVNGSR, čo vedie k inkorporácii dvoch nových glykozylačných miest a k redukcii piatich pozitívnych nábojov, oboje s cieľom zníženia nežiadúcich vplyvov tejto sekvencie na farmakokinetiku. Flt1(1-3R^c)-Fc je modifikáciou, v ktorej je jeden arginínový (R) zvyšok v rovnakej bázickej aminokyselinovej sekvencii zmenený na cysteín (C) (KNKRASVRRR -> KNKCASVRRR) na umožnenie pegylácie na tomto zvyšku, ktorá môže potom odlíšiť bázický región tak, že nemôže vykazovať nežiaduce účinky na farmakokinetiku. Po inkubácii sa roztok prenesie na platňu obsahujúcu zachytávaciu protilátku na VEGF165 (RandD). Množstvo voľného VEGF165 sa potom určí s použitím protilátky na zobrazenie voľného VEGF165. Toto ukazuje, že modifikovaným variantom Flt1 receptora s najvyššou afinitou pre VEGF165 (podľa najnižšieho množstva voľného VEGF165) bola Flt1D2.Flk1D3.FcAC1(a), potom Flt1(1-3)-Fc a Flt1(1-3)-Fc (A40) a potom Flt1 (1 -3R^C)-Fc, Flt1(1-3NAS)-Fc a Flt1D2.VEGFR3D3.FcAC1(a). Tie2-Fc nemal žiadnu afinitu pre VEGF165.

Claims (52)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny kódujúca fúzny polypeptid schopný väzby na VEGF polypeptid, ktorá obsahuje:
    (a) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu zložku VEGF receptora operatívne naviazanú na (b) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu multimerizačnú zložku, kde VEGF receptorová zložka je jediná VEGF receptorová zložka fúzneho polypeptidu a kde sa nukleotidová sekvencia (a) skladá v podstate z nukleotidovej sekvencie kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu Ig domény 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora a nukleotidovej sekvencie kódujúcej aminokyselinovú sekvenciu Ig domény 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
  2. 2. Izolovaná nukleotidová kyselina podľa nároku 1, kde prvým VEGF receptorom je Flťl.
  3. 3. Izolovaná nukleotidová kyselina podľa nároku 1, kde druhým VEGF receptorom je Flk1.
  4. 4. Izolovaná nukleotidová kyselina podľa nároku 1, kde druhým VEGF receptorom je Flt4.
  5. 5. Izolovaná nukleotidová kyselina podľa nároku 1, kde nukleotidová sekvencia kódujúca Ig doménu 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora je pred nukleotidovou sekvenciou kódujúcou Ig doménu 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
  6. 6. Izolovaná nukleotidová kyselina podľa nároku 1, kde nukleotidová sekvencia kódujúca Ig doménu 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora je za nukleotidovou sekvenciou kódujúcou Ig doménu 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
  7. 7. Izolovaná nukleotidová kyselina podľa nároku 1, kde multimerizačná zložka obsahuje imunoglobulínovú doménu.
  8. 8. Izolovaná nukleotidová kyselina podľa nároku 1, kde imunoglobulínová doména je vybraná zo skupiny zahrňujúcej Fc doménu IgG, ťažký reťazec IgG a ľahký reťazec IgG.
  9. 9. Izolovaná molekula nukleotidovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúcu modifikovaný Flt1 receptorový fúzny polypeptid, kde kódujúci región molekuly nukleovej kyseliny sa skladá v podstate z nukleotidovej sekvencie vybranej zo skupiny zahrňujúcej:
    (a) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 21A až 21 C, (b) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 22A až 22C, (c) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 24A až 24C a (d) nukleotidové sekvencie, ktoré sa v dôsledku degenerácie genetického kódu líšia od nukleotidovej sekvencie (a), (b) alebo (c) a ktorá kóduje molekulu fúzneho polypeptidu majúceho biologickú aktivitu modifikovaného Flt1 receptorového fúzneho polypeptidu.
  10. 10. Izolovaná molekula nukleotidovej kyseliny obsahujúca nukleotidovú sekvenciu kódujúca modifikovaný Flt1 receptorový fúzny polypeptid, kde kódujúci región molekuly nukleovej kyseliny sa skladá v podstate z nukleotidovej sekvencie vybranej zo skupiny zahrňujúcej:
    (a) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 13A až 13C, (b) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 14A až 14C, (c) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 15A až 15C, (d) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 16A až 16C a (e) nukleotidové sekvencie, ktoré sa v dôsledku degenerácie genetického kódu líšia od nukleotidovej sekvencie (a), (b), (c) alebo (d) a ktorá kóduje molekulu fúzneho polypeptidu majúceho biologickú aktivitu modifikovaného Flt1 receptorového fúzneho polypeptidu.
  11. 11. Fúzny polypeptid, ktorý je kódovaný izolovanou molekulou nukleovej kyseliny podľa nároku 1, 2, 3, 4, 9 alebo 10.
  12. 12. Prostriedok, vyznačujúci sa tým, že je schopný väzby VEGF molekuly za vzniku nefunkčného komplexu obsahujúceho multimér fúzneho polypeptidu podľa nároku 10.
  13. 13. Prostriedok podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že multimérom je dimér.
  14. 14. Prostriedok podľa nároku 13 a nosič.
  15. 15. Vektor, ktorý obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa nároku 1, 2, 3, 4, 9 alebo 10.
  16. 16. Expresný vektor obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa nároku 1, 2, 3, 4, 9 alebo 10, kde molekula nukleovej kyseliny je operatívne naviazaná na sekvenciu riadiacu expresiu.
  17. 17. Systém vektor-hostiteľ na produkciu fúzneho polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje expresný vektor podľa nároku 16, vo vhodnej hostiteľskej bunke.
  18. 18. Systém hostiteľ-vektor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že vhodnou hostiteľskou bunkou je bakteriálna bunka, kvasinka, hmyzia bunka alebo cicavčia bunka.
  19. 19. Systém hostiteľ-vektor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že vhodnou hostiteľskou bunkou je E. coli.
  20. 20. Systém hostiteľ-vektor podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že vhodnou hostiteľskou bunkou je COS bunka alebo CHO bunka.
  21. 21. Spôsob prípravy fúzneho polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa kultiváciu buniek systému vektor-hostiteľ podľa nároku 16 za podmienok umožňujúcich produkciu fúzneho polypeptidu a odber takto produkovaného fúzneho polypeptidu.
  22. 22. Fúzny polypeptid kódovaný sekvenciou nukleovej kyseliny uvedenej na obr. 10A až 10D, obr. 21A až 21 C, obr. 22A až 22C alebo na obr. 24A až 24C, ktorý bol modifikovaný acetyláciou alebo pegyláciou.
  23. 23. Fúzny polypeptid podľa nároku 22, kde modifikáciou je acetylácia.
  24. 24. Fúzny polypeptid podľa nároku 22, kde modifikáciou je pegylácia.
  25. 25. Fúzny polypeptid podľa nároku 23, kde acetylácia je uskutočnená s aspoň asi 100-násobným molárnym nadbytkom acetylačného činidla.
  26. 26. Fúzny polypeptid podľa nároku 23, kde acetylácia je uskutočnená s molárnym nadbytkom acetylačného činidla v rozmedzí od aspoň približne 10-násobku do približne 100-násobku.
  27. 27. Fúzny polypeptid podľa nároku 24, kde pegylácia je 10K alebo 20K PEG.
  28. 28. Spôsob na zníženie alebo inhibíciu úniku plazmy u cicavcov, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie fúzneho polypeptidu podľa nároku 11 cicavcovi.
  29. 29. Spôsob podľa nároku 28, vyznačujúci sa tým, že cicavcom je človek.
  30. 30. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že fúzny polypeptid je acetylovaný.
  31. 31. Spôsob podľa nároku 29, vyznačujúci sa tým, že fúzny polypeptid je pegylovaný.
  32. 32. Fúzny polypeptid podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že sa špecificky viaže na ligand VEGF receptora, ktorým je VEGF.
  33. 33. Spôsob na blokovanie rastu krvných ciev u človeka, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie účinného množstva fúzneho polypeptidu podľa nároku 11.
  34. 34. Spôsob na inhibíciu aktivity ligandu VEGF receptora u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie účinného množstva fúzneho polypeptidu podľa nároku 11.
  35. 35. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že cicavcom je človek.
  36. 36. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že sa použije na zmiernenie alebo prevenciu rastu nádorov u človeka.
  37. 37. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že sa použije na zmiernenie alebo prevenciu vzniku opuchov u človeka.
  38. 38. Spôsob podľa nároku 34, vyznačujúci sa tým, že sa použije na zmiernenie alebo prevenciu vzniku ascitu u človeka.
  39. 39. Spôsob podľa nároku 37, vyznačujúci sa tým, že opuchom je opuch mozgu.
  40. 40. Spôsob podľa nároku 38, vyznačujúci sa tým, že ascitom je ascites asociovaný s karcinómom ovária.
  41. 41. Fúzny polypeptid schopný väzby na VEGF polypeptid, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
    (a) zložku VEGF receptora operatívne naviazanú na (b) multimerizačnú zložku, kde VEGF receptorová zložka je jediná VEGF receptorová zložka fúzneho polypeptidu a skladá sa v podstate z aminokyselinovej sekvencie Ig domény 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora a aminokyselinovej sekvencie Ig domény 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
  42. 42. Fúzny polypeptid podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že prvým VEGF receptorom je Fit 1.
  43. 43. Fúzny polypeptid podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že druhým VEGF receptorom je Flk1.
  44. 44. Fúzny polypeptid podľa nároku 41, vyznačujúci sa tým, že druhým VEGF receptorom je Flt4.
  45. 45. Fúzny polypeptid podľa nároku 41, kde aminokyselinová sekvencia Ig domény 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora je pred aminokyselinovou sekvenciou Ig domény 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
  46. 46. Fúzny polypeptid podľa nároku 41, kde aminokyselinová sekvencia Ig domény 2 extracelulárnej domény prvého VEGF receptora je za aminokyselinovou sekvenciou Ig domény 3 extracelulárnej domény druhého VEGF receptora.
  47. 47. Fúzny polypeptid podľa nároku 41, kde multimerizačná zložka obsahuje imunoglobulínovú doménu.
  48. 48. Fúzny polypeptid podľa nároku 41, kde imunoglobulínová doména je vybraná zo skupiny zahrňujúcej Fc doménu IgG, ťažký reťazec IgG a ľahký reťazec IgG.
  49. 49. Fúzny polypeptid, ktorý obsahuje v podstate aminokyselinovú sekvenciu modifikovaného Flt1 receptora, kde aminokyselinová sekvencia je vybraná zo skupiny zahrňujúcej:
    (a) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 21A až 21 C, (b) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 22A až 22C a (c) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 24A až 24C.
  50. 50. Fúzny polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu modifikovaného Flt1 receptora, kde aminokyselinová sekvencia je vybraná zo skupiny zahrňujúcej:
    (a) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 13A až 13D, (b) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 14A až 14C, (c) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 15A až 15C a (d) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 16A až 16D.
  51. 51. Spôsob na zníženie alebo inhibíciu úniku plazmy u cicavca, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa podanie fúzneho polypeptidu podľa nároku 41, 42, 43, 44, 49 alebo 50 cicavcovi.
  52. 52. Spôsob na inhibíciu aktivity ligandu VEGF receptora u cicavca, vyznačujúci sa , tým, že zahŕňa podanie účinného množstva polypeptidu podľa nároku 41, 42, 43, 44, 49 alebo 50 cicavcovi.
SK1752-2001A 1999-06-08 2000-05-23 Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, fúzny polypeptid ňou kódovaný, vektor s jej obsahom, systém vektor-hostiteľ na reprodukciu fúzneho polypeptidu a spôsob jeho prípravy, antagonista dimérneho VEGF a použitie SK287332B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13813399P 1999-06-08 1999-06-08
PCT/US2000/014142 WO2000075319A1 (en) 1999-06-08 2000-05-23 Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK17522001A3 true SK17522001A3 (sk) 2003-04-01
SK287332B6 SK287332B6 (sk) 2010-07-07

Family

ID=22480568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1752-2001A SK287332B6 (sk) 1999-06-08 2000-05-23 Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, fúzny polypeptid ňou kódovaný, vektor s jej obsahom, systém vektor-hostiteľ na reprodukciu fúzneho polypeptidu a spôsob jeho prípravy, antagonista dimérneho VEGF a použitie

Country Status (33)

Country Link
EP (2) EP1544299B1 (sk)
JP (2) JP4723140B2 (sk)
KR (1) KR100659477B1 (sk)
CN (3) CN100523187C (sk)
AT (2) ATE293164T1 (sk)
AU (2) AU779303B2 (sk)
BE (1) BE2013C029I2 (sk)
BR (2) BR0011407A (sk)
CA (1) CA2376379C (sk)
CY (2) CY1108883T1 (sk)
CZ (2) CZ303656B6 (sk)
DE (2) DE60041159D1 (sk)
DK (2) DK1544299T3 (sk)
ES (2) ES2319305T3 (sk)
FR (1) FR13C0028I2 (sk)
HK (3) HK1043388A1 (sk)
HR (1) HRP20010908B1 (sk)
HU (3) HU229156B1 (sk)
IL (3) IL146890A0 (sk)
LT (1) LTC1183353I2 (sk)
LU (1) LU92195I2 (sk)
ME (2) MEP3208A (sk)
MX (1) MXPA01012630A (sk)
NO (4) NO330775B1 (sk)
NZ (1) NZ515913A (sk)
PL (1) PL208247B1 (sk)
PT (2) PT1183353E (sk)
RS (1) RS50073B (sk)
RU (1) RU2265661C2 (sk)
SK (1) SK287332B6 (sk)
UA (1) UA74146C2 (sk)
WO (1) WO2000075319A1 (sk)
ZA (1) ZA200110068B (sk)

Families Citing this family (101)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
US6833349B2 (en) * 1999-06-08 2004-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating inflammatory skin diseases
US7396664B2 (en) 1999-06-08 2008-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US7087411B2 (en) * 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
JP4669984B2 (ja) 2001-01-19 2011-04-13 ベジェニクス リミテッド 腫瘍画像化のターゲットとしてのＦ１ｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）および抗腫瘍療法
US6734017B2 (en) 2001-09-28 2004-05-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression
US8183350B2 (en) 2002-05-04 2012-05-22 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth
US7052691B2 (en) 2003-03-28 2006-05-30 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating diabetes by blocking VEGF-mediated activity
US7959914B2 (en) 2003-05-16 2011-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of reducing extravasation of inflammatory cells
AU2004247025B8 (en) * 2003-05-16 2011-06-30 Acorda Therapeutics, Inc. Fusion proteins for the treatment of CNS
EP2460881B1 (en) 2003-05-16 2017-05-03 Acorda Therapeutics, Inc. Proteoglycan degrading mutants for treatment of CNS
WO2004106378A2 (en) * 2003-05-28 2004-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating corneal transplant rejection by using vegf antagonists
US7186699B2 (en) 2003-06-03 2007-03-06 Cell Genesys, Inc. Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes
JP2006527198A (ja) * 2003-06-06 2006-11-30 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆインヒビターを用いる腫瘍退縮方法
US7399612B2 (en) 2003-06-30 2008-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
AR046510A1 (es) * 2003-07-25 2005-12-14 Regeneron Pharma Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo
CA2534197A1 (en) * 2003-08-06 2005-02-24 Thomas Jefferson University Use of a vegf antagonist in combination with radiation therapy
MXPA06013345A (es) 2004-05-18 2008-10-31 Acorda Therapeutics Inc Metodos para purificar condrointinasa y sus formulaciones estables.
US7750138B2 (en) * 2004-06-08 2010-07-06 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co. Ltd. Angiogenesis-inhibiting chimeric protein and the use
CN101102786A (zh) 2004-06-10 2008-01-09 瑞泽恩制药公司 施用并利用vegf抑制剂治疗人类癌症的方法
EP1755645A2 (en) * 2004-06-18 2007-02-28 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf inhibitors for the treatment of malignant pleural effusion
AU2005267741A1 (en) 2004-07-30 2006-02-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating type I diabetes by blocking VEGF-mediated activity
BRPI0515264B1 (pt) * 2004-09-13 2018-12-18 Genzyme Corp proteína de fusão de acordo com fórmula x-y-z, composição, molécula de ácido nucleico, seus usos e método de multimerização de um polipeptídeo x
FR2878749B1 (fr) * 2004-12-03 2007-12-21 Aventis Pharma Sa Combinaisons antitumorales contenant en agent inhibiteur de vegt et du 5fu ou un de ses derives
AU2006214658A1 (en) 2005-02-02 2006-08-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating eye injury with local administration of a VEGF inhibitor
PT2586459T (pt) 2005-03-25 2017-07-25 Regeneron Pharma Formulações antagonistas de fcev
WO2007038548A2 (en) 2005-09-26 2007-04-05 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants
ES2400666T5 (es) † 2005-12-16 2016-03-10 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Uso terapéutico de un antagonista de DII4 y un inhibidor de VEGF para inhibir el crecimiento tumoral
FR2895258B1 (fr) 2005-12-22 2008-03-21 Aventis Pharma Sa Combinaison comprenant de la combretastatine et des agents anticancereux
CN100502945C (zh) * 2006-03-31 2009-06-24 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用
US8216575B2 (en) 2006-03-31 2012-07-10 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains
EP3753548A1 (en) 2006-06-16 2020-12-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations suitable for intravitreal administration
EP2066694B1 (en) 2006-09-29 2015-11-04 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Compositions and methods for diagnosing and treating cancer
WO2008045970A2 (en) 2006-10-10 2008-04-17 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants
FR2918279B1 (fr) * 2007-07-05 2010-10-22 Aventis Pharma Sa Combinaisons antitumorales contenant un agent inhibiteur de vegf et de l'irinotecan
CN101575379B (zh) * 2008-05-09 2012-05-30 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途
RU2550258C2 (ru) 2008-11-03 2015-05-10 Молекьюлар Партнерс Аг Связывающие белки, ингибирующие взаимодействия vegf-a рецептора
CN101838329A (zh) * 2009-03-18 2010-09-22 嘉和生物药业有限公司 抗血管新生融合蛋白
ES2700450T3 (es) 2009-10-16 2019-02-15 Oncomed Pharm Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensores
TWI510246B (zh) 2010-04-30 2015-12-01 Molecular Partners Ag 抑制ｖｅｇｆ－ａ受體交互作用的經修飾結合性蛋白質
LT2601214T (lt) 2010-08-06 2018-02-26 Genzyme Corporation Vegf antagonistų kompozicijos ir jų panaudojimas
US20140080153A1 (en) * 2011-01-07 2014-03-20 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for improving physical properties of antibody
CA2824422A1 (en) 2011-01-13 2012-07-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of a vegf antagonist to treat angiogenic eye disorders
JO3283B1 (ar) 2011-04-26 2018-09-16 Sanofi Sa تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI)
KR101397088B1 (ko) 2011-06-10 2014-05-19 강원대학교산학협력단 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물
JO3370B1 (ar) * 2011-11-10 2019-03-13 Regeneron Pharma طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6
BR112014013205A2 (pt) 2011-12-01 2020-10-27 Protevobio, Inc. proteína de fusão, seu uso e seu método de produção, composição farmacêutica, ácido nucleico, e kit
CN103304668B (zh) * 2012-03-12 2015-10-28 江苏健德生物药业有限公司 Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制备方法及其应用
EP2846836B1 (en) 2012-05-07 2019-08-14 Allergan, Inc. Method of treating amd in patients refractory to anti-vegf therapy
WO2014006113A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sanofi Method of treating cancer by effective amounts of aflibercept
AR093445A1 (es) 2012-11-14 2015-06-10 Regeneron Pharma Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4
NZ710658A (en) 2013-02-18 2019-12-20 Vegenics Pty Ltd Ligand binding molecules and uses thereof
AR095196A1 (es) 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
CN104193828B (zh) * 2013-09-12 2017-04-05 北京韩美药品有限公司 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白
CA2927012A1 (en) 2013-11-05 2015-05-14 Allergan, Inc. Method of treating conditions of the eye with an anti-vegf darpin
KR20170003973A (ko) 2014-05-12 2017-01-10 포르미콘 아게 Ｖｅｇｆ 안타고니스트를 포함하는 사전충전형 플라스틱제 주사기
LT3170005T (lt) 2014-07-18 2019-07-10 Sanofi Paciento, įtariamo, kad serga vėžiu, gydymo afliberceptu rezultato prognozavimo būdas
JP2016036322A (ja) * 2014-08-11 2016-03-22 日本化薬株式会社 血管新生因子と結合するキメラタンパク質
PT3230316T (pt) 2014-12-11 2022-02-24 Bayer Healthcare Llc Ratamento de degenerescência macular relacionada com a idade com uma pequena lesão de neovascularização coroideia ativa
GB201503453D0 (en) 2015-03-01 2015-04-15 Jain Arjun Endothelin-1"sponge"
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
WO2017046140A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia
KR101936049B1 (ko) * 2015-10-15 2019-01-08 (주)알테오젠 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
WO2017065559A1 (ko) 2015-10-15 2017-04-20 (주)알테오젠 Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
MX2018006092A (es) 2015-11-18 2019-01-31 Formycon Ag Envase farmacéutico precargado que comprende una formulación líquida de un antagonista del vegf.
JP2019501687A (ja) 2015-11-18 2019-01-24 フォーマイコン アーゲーＦｏｒｍｙｃｏｎ Ａｇ Ｖｅｇｆ拮抗薬を収容したプレフィルドプラスチックシリンジ
US11654046B2 (en) 2015-11-18 2023-05-23 Sio2 Medical Products, Inc. Pharmaceutical package for ophthalmic formulations
EP3377101A4 (en) * 2015-11-19 2019-08-07 Zhuhai Tairuishang Biopharm Ltd. VEGF BINDING METHODS AND COMPOSITIONS
CN108474039B (zh) 2015-12-03 2022-06-07 雷杰纳荣制药公司 抗vegf剂在制备用于治疗新生血管性年龄相关性黄斑变性患者的药物中的用途
CA3011638C (en) 2016-01-26 2023-01-10 Formycon Ag Liquid formulation of a vegf antagonist
EP3527225A4 (en) 2016-10-12 2020-06-10 Daiichi Sankyo Company, Limited COMPOSITION CONTAINING ANTI-ROBO4 ANTIBODY AND OTHER AGENT
US11135266B2 (en) 2016-11-21 2021-10-05 Just-Evotec Biologics, Inc. Aflibercept formulations and uses thereof
WO2018215580A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist
WO2018217995A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
EP3630062A2 (en) 2017-05-24 2020-04-08 SiO2 Medical Products, Inc. Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations
TW201904610A (zh) 2017-06-14 2019-02-01 德商拜耳製藥公司 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑
WO2019020777A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Formycon Ag LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST
CA3067735A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Just Biotherapeutics, Inc. Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants
CN111356471A (zh) 2017-11-20 2020-06-30 济世发展生物药业有限公司 包含赖氨酸盐作为张力调节剂的阿柏西普制剂及其用途
CR20200282A (es) 2017-11-27 2021-02-18 4D Molecular Therapeutics Inc Cápsides variantes de virus adenoasociados y su uso para inhibir la angiogénesis
SG11202004268PA (en) 2017-11-30 2020-06-29 Regeneron Pharma Use of a vegf antagonist to treat angiogenic eye disorders
EA039731B1 (ru) * 2017-12-13 2022-03-04 Ридженерон Фармасьютикалз, Инк. Устройства и системы для управления опорой слоя сорбента хроматографической колонки и связанные с ними способы
EA202091786A1 (ru) * 2018-01-26 2020-10-20 Дзе Риджентс Оф Дзе Юниверсити Оф Калифорния Способы и композиции для лечения ангиогенных расстройств с применением агентов против фрэс
US12071476B2 (en) 2018-03-02 2024-08-27 Kodiak Sciences Inc. IL-6 antibodies and fusion constructs and conjugates thereof
CA3099551A1 (en) 2018-05-10 2019-11-14 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High concentration vegf receptor fusion protein containing formulations
US11519020B2 (en) 2018-05-25 2022-12-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF
CN111378044B (zh) 2018-12-28 2022-07-15 长春金赛药业有限责任公司 抗体融合蛋白、制备方法及其应用
WO2020229584A1 (en) 2019-05-16 2020-11-19 Formycon Ag Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins
TW202123988A (zh) 2019-09-03 2021-07-01 美商安進公司 用於藥物遞送之注入裝置及用於注入裝置之包裝物
AU2020348947A1 (en) 2019-09-16 2022-03-10 Amgen Inc. Method for external sterilization of drug delivery device
US11912784B2 (en) 2019-10-10 2024-02-27 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
JP2023502501A (ja) 2019-11-25 2023-01-24 ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア 眼内血管新生のための長時間作用型ｖｅｇｆ阻害剤
IL302538A (en) 2019-12-06 2023-07-01 Regeneron Pharma Anti-VEGF protein preparations and methods for their production
EP4069264A1 (en) 2019-12-06 2022-10-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf mini-traps and methods of use thereof
WO2021173603A1 (en) 2020-02-24 2021-09-02 Amgen Inc. Containers and systems for use during external sterilization of drug delivery devices
MX2022013812A (es) 2020-05-08 2022-12-15 Regeneron Pharma Trampas y mini-trampas de vegf y metodos para el tratamiento de trastornos oculares y cancer.
EP4145456A1 (en) 2021-09-06 2023-03-08 Bayer AG Prediction of a change related to a macular fluid
WO2023092324A1 (zh) 2021-11-24 2023-06-01 苏州光度生物科技有限公司 多特异性配体结合分子及其应用
WO2024029876A1 (ko) * 2022-08-02 2024-02-08 주식회사 파노로스바이오사이언스 변형된 융합 단백질 및 이의 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9506466D0 (en) * 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
US6100071A (en) * 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production

Also Published As

Publication number Publication date
DE60019415D1 (de) 2005-05-19
CN1369009A (zh) 2002-09-11
ATE417928T1 (de) 2009-01-15
EP1183353A1 (en) 2002-03-06
NO2013010I1 (no) 2013-06-17
LU92195I2 (fr) 2013-07-15
BRPI0011407B1 (pt) 2018-09-25
NO2022060I1 (no) 2022-12-21
LTPA2013009I1 (lt) 2013-06-25
BR0011407A (pt) 2002-04-02
KR20020019070A (ko) 2002-03-09
HRP20010908B1 (en) 2006-05-31
PT1183353E (pt) 2005-06-30
WO2000075319A1 (en) 2000-12-14
CZ303656B6 (cs) 2013-01-30
HUS1300052I1 (hu) 2016-08-29
FR13C0028I1 (fr) 2013-06-14
FR13C0028I2 (fr) 2014-05-16
HRP20010908A2 (en) 2005-04-30
CZ302689B6 (cs) 2011-09-07
ES2319305T3 (es) 2009-05-06
DE60041159D1 (de) 2009-01-29
AU2005201365B2 (en) 2007-08-09
PL208247B1 (pl) 2011-04-29
NZ515913A (en) 2004-01-30
AU779303B2 (en) 2005-01-13
BE2013C029I2 (sk) 2019-03-06
HK1132653A1 (en) 2010-03-05
ATE293164T1 (de) 2005-04-15
RS50073B (sr) 2009-01-22
CA2376379A1 (en) 2000-12-14
SK287332B6 (sk) 2010-07-07
PT1544299E (pt) 2009-03-18
NO20016036D0 (no) 2001-12-10
CN101433715A (zh) 2009-05-20
HK1043388A1 (en) 2002-09-13
ES2237429T3 (es) 2005-08-01
CY1108883T1 (el) 2014-07-02
HK1185798A1 (en) 2014-02-28
JP4723140B2 (ja) 2011-07-13
ME00024B (me) 2010-02-10
NO20100656L (no) 2002-02-08
YU86901A (sh) 2004-05-12
AU2005201365A1 (en) 2005-04-28
PL352246A1 (en) 2003-08-11
CN103349781A (zh) 2013-10-16
HUP0201515A3 (en) 2004-12-28
BRPI0011407B8 (pt) 2021-05-25
AU5040400A (en) 2000-12-28
DK1183353T3 (da) 2005-08-08
JP2011024595A (ja) 2011-02-10
NO332559B1 (no) 2012-10-29
EP1183353B1 (en) 2005-04-13
JP2003501089A (ja) 2003-01-14
HUP0201515A2 (en) 2002-08-28
CA2376379C (en) 2007-08-07
CZ20014387A3 (cs) 2002-10-16
CN100523187C (zh) 2009-08-05
NO20016036L (no) 2002-02-08
DK1544299T3 (da) 2009-03-23
HU229156B1 (en) 2013-09-30
IL146890A (en) 2008-07-08
CN103349781B (zh) 2015-04-01
DE60019415T2 (de) 2006-03-09
MEP3208A (xx) 2010-02-10
ZA200110068B (en) 2002-12-06
IL190234A0 (en) 2008-11-03
CY2013019I2 (el) 2015-11-04
EP1544299A1 (en) 2005-06-22
JP5273746B2 (ja) 2013-08-28
CN101433715B (zh) 2013-04-17
KR100659477B1 (ko) 2006-12-20
EP1544299B1 (en) 2008-12-17
CY2013019I1 (el) 2015-11-04
RU2265661C2 (ru) 2005-12-10
IL146890A0 (en) 2002-08-14
HU230159B1 (hu) 2015-09-28
NO2013010I2 (no) 2013-05-15
MXPA01012630A (es) 2002-07-22
LTC1183353I2 (lt) 2023-02-27
UA74146C2 (uk) 2005-11-15
NO330775B1 (no) 2011-07-11

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10392430B2 (en) Methods of making nucleic acid molecules encoding modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
JP5273746B2 (ja) 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド
CA2588221C (en) Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties

Legal Events

Date Code Title Description
SPCF Filing of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: AFLIBERCEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/12/797/001 - EU/1/12/797/002 20121122

Spc suppl protection certif: 5011-2013

Filing date: 20130513

SPCG Grant of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: AFLIBERCEPT; NAT. REGISTRATION NO/DATE: EU/1/12/797/001 - EU/1/12/797/002 20121122; FIRST REGISTRATION: EU EU/1/12/797/001 - EU /1/12/797/002 20121122

Spc suppl protection certif: 142 5011-2013

Filing date: 20130513

Extension date: 20250524

MK4A Patent expired

Expiry date: 20200523