PL208247B1 - Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca składnik receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), wektor ekspresji zawierający tą wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, dimeryczny antagonista receptora VEGF, polipeptyd fuzyjny i zastosowanie polipeptydu fuzyjnego - Google Patents
Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca składnik receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), wektor ekspresji zawierający tą wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, dimeryczny antagonista receptora VEGF, polipeptyd fuzyjny i zastosowanie polipeptydu fuzyjnegoInfo
- Publication number
- PL208247B1 PL208247B1 PL352246A PL35224600A PL208247B1 PL 208247 B1 PL208247 B1 PL 208247B1 PL 352246 A PL352246 A PL 352246A PL 35224600 A PL35224600 A PL 35224600A PL 208247 B1 PL208247 B1 PL 208247B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- flt1
- domain
- receptor
- vegf
- fcδc1
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 90
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 89
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 89
- 208000030533 eye disease Diseases 0.000 claims abstract description 6
- 206010012689 Diabetic retinopathy Diseases 0.000 claims abstract description 5
- 206010064930 age-related macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 208000002780 macular degeneration Diseases 0.000 claims abstract description 4
- 101150048336 Flt1 gene Proteins 0.000 claims description 389
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 108
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 108
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 97
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 64
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 59
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 59
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 58
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 claims description 58
- 108091008605 VEGF receptors Proteins 0.000 claims description 53
- 102000009484 Vascular Endothelial Growth Factor Receptors Human genes 0.000 claims description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 46
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 37
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 36
- 102000016549 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Human genes 0.000 claims description 34
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 29
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 29
- 101150088608 Kdr gene Proteins 0.000 claims description 26
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 claims description 22
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 claims description 21
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 18
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 15
- 108010053099 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-2 Proteins 0.000 claims description 13
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 claims description 12
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 claims description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 9
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 9
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 8
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 claims description 7
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 6
- 102000016844 Immunoglobulin-like domains Human genes 0.000 claims description 6
- 108050006430 Immunoglobulin-like domains Proteins 0.000 claims description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 claims description 6
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 6
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 claims description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 claims description 6
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 claims description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 5
- 229940124676 vascular endothelial growth factor receptor Drugs 0.000 claims description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 4
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 claims description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 158
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 143
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 141
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 107
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 95
- 101000808011 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor A Proteins 0.000 description 86
- 102000058223 human VEGFA Human genes 0.000 description 86
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 56
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 46
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 46
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 44
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 41
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 32
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 30
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 27
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 27
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 21
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 20
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 19
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 18
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 17
- 102100033177 Vascular endothelial growth factor receptor 2 Human genes 0.000 description 16
- 125000002485 formyl group Chemical group [H]C(*)=O 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 16
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 15
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 15
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 15
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 14
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 14
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 14
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 13
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 13
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 13
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 12
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101000851007 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 2 Proteins 0.000 description 12
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 12
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 12
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 12
- 108010082117 matrigel Proteins 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 10
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 10
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 10
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 10
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 10
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 9
- 108010021466 Mutant Proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000008300 Mutant Proteins Human genes 0.000 description 9
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 9
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 8
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 8
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 8
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 8
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 8
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 7
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 210000004246 corpus luteum Anatomy 0.000 description 7
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 7
- 230000006870 function Effects 0.000 description 7
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 7
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 7
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 7
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 7
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 7
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000000844 Cell Surface Receptors Human genes 0.000 description 6
- 108010001857 Cell Surface Receptors Proteins 0.000 description 6
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 6
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 6
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- 101150009958 FLT4 gene Proteins 0.000 description 5
- 102000009438 IgE Receptors Human genes 0.000 description 5
- 108010073816 IgE Receptors Proteins 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 5
- 102000016663 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-3 Human genes 0.000 description 5
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 5
- 238000000149 argon plasma sintering Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 5
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 5
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 5
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 5
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 5
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000851018 Homo sapiens Vascular endothelial growth factor receptor 1 Proteins 0.000 description 4
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 4
- 108010038512 Platelet-Derived Growth Factor Proteins 0.000 description 4
- 102000010780 Platelet-Derived Growth Factor Human genes 0.000 description 4
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 4
- 230000000397 acetylating effect Effects 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 4
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 210000004088 microvessel Anatomy 0.000 description 4
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 4
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 4
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 4
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 4
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical group CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 4
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 4
- 210000003556 vascular endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 4
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 3
- 201000008808 Fibrosarcoma Diseases 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 3
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 101150056950 Ntrk2 gene Proteins 0.000 description 3
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 3
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 3
- 102100033178 Vascular endothelial growth factor receptor 1 Human genes 0.000 description 3
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 description 3
- 210000001736 capillary Anatomy 0.000 description 3
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L disodium;(4-nitrophenyl) phosphate;hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Na+].[Na+].[O-][N+](=O)C1=CC=C(OP([O-])([O-])=O)C=C1 KAKKHKRHCKCAGH-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 3
- 108020001756 ligand binding domains Proteins 0.000 description 3
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 3
- 239000003226 mitogen Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 3
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 3
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000012510 peptide mapping method Methods 0.000 description 3
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 3
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 3
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 3
- 108091008598 receptor tyrosine kinases Proteins 0.000 description 3
- 102000027426 receptor tyrosine kinases Human genes 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002993 trophoblast Anatomy 0.000 description 3
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 3
- 210000000264 venule Anatomy 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- MDUQWFYJHRLNRN-UHFFFAOYSA-N 1-acetyloxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound CC(=O)ON1C(=O)CC(S(O)(=O)=O)C1=O MDUQWFYJHRLNRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 17β-estradiol Chemical compound OC1=CC=C2[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 VOXZDWNPVJITMN-ZBRFXRBCSA-N 0.000 description 2
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004219 Brain-derived neurotrophic factor Human genes 0.000 description 2
- 108090000715 Brain-derived neurotrophic factor Proteins 0.000 description 2
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 2
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 2
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 208000032612 Glial tumor Diseases 0.000 description 2
- 206010018338 Glioma Diseases 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 108090001090 Lectins Proteins 0.000 description 2
- 102000004856 Lectins Human genes 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 102000007072 Nerve Growth Factors Human genes 0.000 description 2
- 102000004230 Neurotrophin 3 Human genes 0.000 description 2
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 2
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical group N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 2
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000002491 angiogenic effect Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 2
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000009295 crossflow filtration Methods 0.000 description 2
- 125000002228 disulfide group Chemical group 0.000 description 2
- 210000003989 endothelium vascular Anatomy 0.000 description 2
- 229960005309 estradiol Drugs 0.000 description 2
- 229930182833 estradiol Natural products 0.000 description 2
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 2
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000002523 lectin Substances 0.000 description 2
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 2
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 2
- 102000045246 noggin Human genes 0.000 description 2
- 108700007229 noggin Proteins 0.000 description 2
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 2
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 2
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960004509 serum gonadotrophin Drugs 0.000 description 2
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 102000027257 transmembrane receptors Human genes 0.000 description 2
- 108091008578 transmembrane receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 210000005166 vasculature Anatomy 0.000 description 2
- 239000002525 vasculotropin inhibitor Substances 0.000 description 2
- AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) propanoate Chemical compound CCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O AASBXERNXVFUEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]propane-1-sulfonate Chemical compound C([C@H]1C[C@H]2O)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(=O)NCCC[N+](C)(C)CCCS([O-])(=O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 UMCMPZBLKLEWAF-BCTGSCMUSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 208000003120 Angiofibroma Diseases 0.000 description 1
- 102000009840 Angiopoietins Human genes 0.000 description 1
- 108010009906 Angiopoietins Proteins 0.000 description 1
- GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N Arg-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N GIVATXIGCXFQQA-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- XWGJDUSDTRPQRK-ZLUOBGJFSA-N Asn-Ala-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O XWGJDUSDTRPQRK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N Asn-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N Asp-Lys-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O LIVXPXUVXFRWNY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 210000002237 B-cell of pancreatic islet Anatomy 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 102100039705 Beta-2 adrenergic receptor Human genes 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101800004538 Bradykinin Proteins 0.000 description 1
- 206010048962 Brain oedema Diseases 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108010005939 Ciliary Neurotrophic Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100031614 Ciliary neurotrophic factor Human genes 0.000 description 1
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010057649 Endometrial sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 201000009273 Endometriosis Diseases 0.000 description 1
- 241001302160 Escherichia coli str. K-12 substr. DH10B Species 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 102000003688 G-Protein-Coupled Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000045 G-Protein-Coupled Receptors Proteins 0.000 description 1
- 108010001515 Galectin 4 Proteins 0.000 description 1
- 102100039556 Galectin-4 Human genes 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 208000010412 Glaucoma Diseases 0.000 description 1
- BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N Glu-Pro-Lys Chemical compound C1C[C@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O BFEZQZKEPRKKHV-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N Gly-Arg-Pro Chemical compound NC(N)=NCCC[C@H](NC(=O)CN)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O VXKCPBPQEKKERH-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N Gly-Arg-Pro Natural products NCC(=O)NC(CCNC(=N)N)C(=O)N1CCCC1C(=O)O KKBWDNZXYLGJEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N Gly-Pro-Gly Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O NSVOVKWEKGEOQB-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH Natural products NC(N)=NCCCC(N)C(=O)N1CCCC1C(=O)N1C(C(=O)NCC(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CO)C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC=2C=CC=CC=2)C(=O)NC(CCCN=C(N)N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- 101000746367 Homo sapiens Granulocyte colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101100372765 Homo sapiens KDR gene Proteins 0.000 description 1
- 206010062767 Hypophysitis Diseases 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- LLZLRXBTOOFODM-QSFUFRPTSA-N Ile-Asp-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N LLZLRXBTOOFODM-QSFUFRPTSA-N 0.000 description 1
- 108700005091 Immunoglobulin Genes Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102100035792 Kininogen-1 Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000043136 MAP kinase family Human genes 0.000 description 1
- 108091054455 MAP kinase family Proteins 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 1
- 101710107068 Myelin basic protein Proteins 0.000 description 1
- FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N N,N-bis(2-hydroxyethyl)glycine Chemical compound OCCN(CCO)CC(O)=O FSVCELGFZIQNCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010029113 Neovascularisation Diseases 0.000 description 1
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 1
- 208000022873 Ocular disease Diseases 0.000 description 1
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 1
- 206010033266 Ovarian Hyperstimulation Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 102000008212 P-Selectin Human genes 0.000 description 1
- 108010035766 P-Selectin Proteins 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 1
- 208000034038 Pathologic Neovascularization Diseases 0.000 description 1
- 102000000447 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Human genes 0.000 description 1
- 108010055817 Peptide-N4-(N-acetyl-beta-glucosaminyl) Asparagine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 108010089814 Plant Lectins Proteins 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 1
- 241001415846 Procellariidae Species 0.000 description 1
- 101100496572 Rattus norvegicus C6 gene Proteins 0.000 description 1
- 102000004278 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Human genes 0.000 description 1
- 108090000873 Receptor Protein-Tyrosine Kinases Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108010039491 Ricin Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 238000011579 SCID mouse model Methods 0.000 description 1
- 101000573530 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Myosin light chain 1 Proteins 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N Ser-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 1
- WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N Ser-Gly Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O WOUIMBGNEUWXQG-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000006011 Stroke Diseases 0.000 description 1
- 108010008125 Tenascin Proteins 0.000 description 1
- 102100038126 Tenascin Human genes 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010053096 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000016548 Vascular Endothelial Growth Factor Receptor-1 Human genes 0.000 description 1
- 208000032594 Vascular Remodeling Diseases 0.000 description 1
- 206010071989 Vascular endothelial growth factor overexpression Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 239000004015 abortifacient agent Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 239000000048 adrenergic agonist Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 1
- 208000037883 airway inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 1
- 108010026331 alpha-Fetoproteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 239000002870 angiogenesis inducing agent Substances 0.000 description 1
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 1
- 230000001772 anti-angiogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 210000002565 arteriole Anatomy 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- 230000003305 autocrine Effects 0.000 description 1
- 108010014499 beta-2 Adrenergic Receptors Proteins 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 1
- 102000014974 beta2-adrenergic receptor activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040006828 beta2-adrenergic receptor activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000007998 bicine buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008512 biological response Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002981 blocking agent Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N bradykinin Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)CCC1 QXZGBUJJYSLZLT-FDISYFBBSA-N 0.000 description 1
- 208000006752 brain edema Diseases 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 210000004413 cardiac myocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 210000001608 connective tissue cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 229940124558 contraceptive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003433 contraceptive agent Substances 0.000 description 1
- 230000001276 controlling effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000006471 dimerization reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000447 dimerizing effect Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 229940000406 drug candidate Drugs 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 201000003511 ectopic pregnancy Diseases 0.000 description 1
- 230000032692 embryo implantation Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000010932 epithelial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000027948 extracellular matrix binding Effects 0.000 description 1
- 210000004996 female reproductive system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000000834 fixative Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- BPZSYCZIITTYBL-UHFFFAOYSA-N formoterol Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1CC(C)NCC(O)C1=CC=C(O)C(NC=O)=C1 BPZSYCZIITTYBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002848 formoterol Drugs 0.000 description 1
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 230000001456 gonadotroph Effects 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 201000011066 hemangioma Diseases 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 1
- 102000055277 human IL2 Human genes 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 210000003016 hypothalamus Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 1
- 230000004968 inflammatory condition Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 1
- 230000009545 invasion Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000009401 metastasis Effects 0.000 description 1
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 1
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 230000004001 molecular interaction Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 1
- 210000000066 myeloid cell Anatomy 0.000 description 1
- 201000003142 neovascular glaucoma Diseases 0.000 description 1
- 229940097998 neurotrophin 4 Drugs 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004248 oligodendroglia Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 230000009120 phenotypic response Effects 0.000 description 1
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010079892 phosphoglycerol kinase Proteins 0.000 description 1
- 238000003566 phosphorylation assay Methods 0.000 description 1
- 210000003635 pituitary gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000002826 placenta Anatomy 0.000 description 1
- 230000028742 placenta development Effects 0.000 description 1
- 230000003169 placental effect Effects 0.000 description 1
- 239000003726 plant lectin Substances 0.000 description 1
- 201000010065 polycystic ovary syndrome Diseases 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 201000011461 pre-eclampsia Diseases 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000009465 prokaryotic expression Effects 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 108020001580 protein domains Proteins 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 1
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 239000003488 releasing hormone Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 description 1
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 1
- 230000019491 signal transduction Effects 0.000 description 1
- 210000002027 skeletal muscle Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 238000010512 small scale reaction Methods 0.000 description 1
- MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M sodium butyrate Chemical compound [Na+].CCCC([O-])=O MFBOGIVSZKQAPD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011008 sodium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 210000004500 stellate cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 210000002536 stromal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 1
- 230000036964 tight binding Effects 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000030968 tissue homeostasis Effects 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000015534 trkB Receptor Human genes 0.000 description 1
- 108010064880 trkB Receptor Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000006459 vascular development Effects 0.000 description 1
- 230000006492 vascular dysfunction Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 1
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
- C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
- A61P11/06—Antiasthmatics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
Description
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca składnik receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), wektor ekspresji zawierający tą wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, dimeryczny antagonista receptora VEGF, polipeptyd fuzyjny i zastosowanie polipeptydu fuzyjnego.
Ogólnie wynalazek opisuje zmodyfikowane polipeptydy o poprawionych właściwościach farmakokinetycznych. A zwłaszcza tych polipeptydów receptora Flt1, które zostały zmodyfikowane w taki sposób aby polepszyć profil farmakokinetyczny tego receptora. W wynalazku opisuje się także sposoby wytwarzania oraz zastosowania zmodyfikowanych polipeptydów do zmniejszania lub hamowania wycieku osocza i/lub przepuszczalności naczyń u ssaka, a zwłaszcza do zastosowania w leczeniu chorób oczu.
Tło wynalazku
Zdolność ligandów polipeptydowych do wiązania się z komórkami i poprzez to do wywoływania odpowiedzi fenotypowe], takiej jak wzrost komórek, przeżycie, wydzielanie produktów komórkowych lub różnicowanie, jest często wynikiem pośredniczenia przez receptory transbłonowe na komórkach. Domena zewnątrzkomórkowa takich receptorów (czyli ta część receptora, która jest widoczna na powierzchni komórki) jest generalnie najbardziej charakterystyczną częścią cząsteczki, ponieważ dostarcza ona białka z jego charakterystyką wiążącą ligand. Wiązanie liganda z domeną zewnątrzkomórkową powoduje generalnie przewodzenie sygnału, który przenosi sygnał biologiczny do celów wewnątrz komórki. Często, to przenoszenie sygnału zachodzi poprzez katalityczną domenę wewnątrzkomórkową. Szczególny szereg motywów sekwencji tej katalitycznej domeny wewnątrzkomórkowej determinuje jej dostęp do potencjalnych substratów kinazy (Mohammadi, i inni,1990, Mol. Cell. Biol. 11:5068-5078; Fantl, i inni, 1992, Cell 69.:413-413). Przykłady receptorów, które przewodzą sygnały przez katalityczne domeny wewnątrzkomórkowe, obejmują receptor kinazy tyrozynowej (RTK), tak jak rodzina receptorów Trk, które generalnie ograniczają się do komórek układu nerwowego, rodzina receptorów cytokinowych, włączając kompleks potrójnego receptora CNTF (Stahl i Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25.: 1454-1466), który także generalnie ogranicza się do komórek układu nerwowego, sprzężone receptory białka G, takie jak receptor adrenergiczny β2 znajdujący się np. na komórkach mięśnia sercowego, oraz multimeryczny receptor FcεRI o wysokim powinowactwie do IgE, który po większej części umiejscowiony jest, na komórkach tucznych i bazofilach (Sutton i Gould, 1993, Nature
366:421-428).
Okazuje się, że wszystkie dotychczas zidentyfikowane receptory przechodzą dimeryzację, multimeryzację lub pewne pokrewne zmiany konformacyjne w następstwie wiązania liganda (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sci. 13:443-447; Ullrich i Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212; Schlessinger i Ullrich, 1992, Neuron 9:383-391) oraz interakcje cząsteczkowe między dimeryzującymi domenami wewnątrzkomórkowymi, prowadzące do aktywacji funkcji katalitycznej. W pewnych przypadkach, takich jak czynnik wzrostu pochodzący od płytek (PDGF), ligand jest dimerem, który wiąże dwie cząsteczki receptora (Hart, i inni, 1988, Science, 240:1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264:8905-8912), podczas gdy np. w przypadku czynnika wzrostu naskórka (EGF), ligand jest monomerem (Weber, i inni, 1984, J. Biol. Chem. 259:14631-14636). W przypadku receptora FcεRI, ligand, IgE istnieje w postaci związanej z FcεRI w sposób monomeryczny i ulega aktywacji jedynie gdy antygen wiąże się z kompleksem IgE/FcεRI oraz sieciuje sąsiednie cząsteczki IgE (Sutton i Gould, 1993, Nature 366:421-428).
Często, dystrybucja tkankowa danego receptora w organizmach wyższych zapewnia wgląd w funkcję biologiczną receptora. RTK dla pewnych czynników wzrostu i różnicowania, takich jak czynnik wzrostu fibroblastu (FGF), ulegają szerokiej ekspresji, a zatem jak się okazuje, odgrywają pewną ogólną rolę we wzroście i utrzymaniu tkanki. Członkowie rodziny receptorów Trk RTK (Glass i Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3.:262-268) są bardziej ogólnie ograniczeni do komórek układu nerwowego, a rodzina czynnika wzrostu nerwu zawierająca czynnik wzrostu nerwu (NGF), czynnik neurotroficzny pochodzący od mózgu (BDNF), neurotrofina-3 (NT-3) i neurotrofina-4/5 (NT-4/5), które wiążą się z receptorami rodziny Trk RTK, pobudzają różnicowanie różnych grup neuronów w mózgu i na obwodzie (Lindsay, R. M, 1993, w Neurotrophic Factors, S.E. Loughlin i J.H. Fallen, wydawcy, strony 257-284, San Diego, CA, Academic Press), FcεRI jest zlokalizowany w bardzo ograniczonej liczbie rodzajów komórek, takich jak komórki tuczne i bazofile. Komórki tuczne pochodzą od wielozadanioPL 208 247 B1 wego rodu krwiotwórczych komórek zrębowych szpiku kostnego, lecz kończą swe dojrzewania w tkance, po migracji ze strumienia krwi (See Janeway i Travers, 1996, w Immunobiology, drugie wydanie, M. Robertson i E. Lawrence, wydawcy, strony 1:3-1:4, Current Biology Ltd., Londyn, UK, publikacja) i są związane z odpowiedzią alergiczną.
Liczne badania pokazały, że domena zewnątrzkomórkowa receptora zapewnia specyficzną cechę wiązania liganda. Ponadto, środowisko komórkowe, w którym receptor ulega ekspresji, może wpływać na odpowiedź biologiczną mającą miejsce po związaniu liganda z receptorem. Przykładowo, gdy neuron wykazujący ekspresję receptora Trk zostanie poddany ekspozycji wobec neutrofiny, która wiąże się z tym receptorem, powoduje to przeżycie i różnicowanie neuronu. Gdy ten sam receptor ulega ekspresji na fibroblaście, ekspozycja wobec neutrofiny powoduje proliferację fibroblastu (Glass, i inni, 1991, Cell 66.:405-413).
Zidentyfikowano klasę dimerycznych mitogenów pochodzących od komórek, wykazujących selektywność wobec naczyniowych komórek śródbłonka i oznaczono je jako czynnik wzrostu śródbłonka komórki naczyniowej (VEGF). VEGF oczyszczono z kondycjonowanych pożywek wzrostowych komórek glejaka szczura [Conn i inni, (1990), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87, strony 2628-2632]; i kondycjonowanych poż ywek wzrostowych komórek gwiaździstych przysadki bydlęcej [Eerrara i Henzel, (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, strony 851-858; Gozpadorowicz i inni, (1989), Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 86, strony 7311-7315] oraz kondycjonowanej pożywki wzrostowej ludzkich komórek U937 [Connolly, D. T. i inni (1989), Science, 246, strony 1309-1312]. VEGF jest dimerem o widocznej masie cząsteczkowej, wynoszącej około 46 kDa, przy czym każda podjednostka posiada widoczną masę cząsteczkową wynoszącą około 23 kDa. VEGF posiada pewne podobieństwa strukturalne do czynnika wzrostu pochodzącego od płytek (PDGF), który jest mitogenem dla komórek tkanki łącznej lecz nie jest mitogenem dla komórek śródbłonka naczyniowego większych naczyń.
Receptor kinazy tyrozynowej związanej z błoną, znany jako Flt, okazał się być receptorem VEGF [DeVries, C. i inni, (1992), Science, 255, strony 989-991]. Receptor Flt specyficznie wiąże VEGF, który indukuje mitogenezę. Inna postać receptora VEGF, oznaczona jako KDR, jest także znana z wiązania VEGF i indukowania mitogenezy. Znana jest także częściowa sekwencja cDNA i prawie pełnej długości sekwencja białkowa KDR [Terman, B. I. i inni, (1991) Oncogene 6, strony 1677-1683; Terman, B. I. i inni, (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, strony 1579-1586]. Uporczywa angiogeneza może spowodować lub zaostrzyć pewne choroby, takie jak łuszczyca, reumatoidalne zapalenie stawów, naczyniak krwionośny, naczyniakowłókniaki, retynopatia cukrzycowa oraz jaskra z nowounaczynieniem. Inhibitor aktywności VEGF byłby użyteczny przy leczeniu takich chorób oraz innych indukowanych przez VEGF patologicznych angiogenez i stanów przepuszczalności naczyń, takich jak unaczynienie nowotworu. Niniejszy wynalazek odnosi się do inhibitora VEGF, na bazie receptora Flt1 VEGF.
Wyciek osocza, kluczowy składnik zapalenia, zachodzi w oddzielnym podzbiorze mikronaczyń. W szczególności, w większoś ci narządów wyciek osocza zachodzi konkretnie w żyłkach. W przeciwieństwie do tętniczek i włośniczek, żyłki stają się nieszczelne w odpowiedzi na liczne mediatory zapalne, włączając histaminę, bradykininę, i serotoninę. Jedną z cech zapalenia jest wyciek osocza, będący rezultatem szczelin międzykomórkowych, tworzących się w śródbłonku żyłek. Większość doświadczalnych modeli zapalenia pokazuje, że te szczeliny międzykomórkowe występują między komórkami śródbłonka żyłek postkapilarnych i zbiorczych (Baluk, P., i inni, Am. J. Pathol. 1998 152:1463-76). Wykazano, że pewne lektyny można stosować do ujawniania cech miejsc ogniskowych wycieku osocza, szczelin śródbłonkowych oraz procesów podobnych do palca na granicach komórek śródbłonka w żyłkach z zapaleniem (Thurston, G., i inni, Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547-62). W szczególnoś ci, do wizualizacji zmian morfologicznych na granicach komórek ś ródbł onkowych w ż y ł kach z zapaleniem, np. szczurzej tchawicy, zastosowano lektyny roślinne. Lektyny, takie jak konkawalina A i rycyna, które wiążą się ogniskowo z zapalnymi żyłkami, ujawniają regiony ścianki podśródbłonkowej naczynia, uwodocznione jako szczeliny, które odpowiadają miejscom wycieku osocza (Thurston, G., i inni, Am J Physiol, 1996, 271: H2547-62).
Właściwości mikronaczyń są dynamiczne. Przewlekłe choroby zapalne np. są związane z przemodelowywaniem unaczynienia, włączają c angiogenezę i powię kszenie mikronaczyń . Mikronaczynia mogą także ulec przemodelowaniu przez nabycie nieprawidłowych cech fenotypowych. W mysim modelu przewlekłego zapalenia dróg oddechowych, włośniczki dróg oddechowych nabywają cech żyłek, łącznie z poszerzeniem średnicy naczynia, zwiększeniem immunoreaktywności wobec czynnika von Willebranda, i zwiększeniem immunoreaktywności wobec P-selektyny. Oprócz tego, te przemode4
PL 208 247 B1 lowane naczynia ciekną w odpowiedzi na mediatory zapalenia, podczas gdy naczynia w tym samym miejscu w drogach oddechowych normalnej myszy, nie zachowują się tak.
Okazało się, że pewne substancje zmniejszają lub inhibitują przepuszczalność naczyń i/lub wyciek osocza. Przykładowo, mistyksyny są syntetycznymi polipeptydami, które opisywano jako inhibitujące wyciek osocza bez blokowania tworzenia się szczelin śródbłonkowych (Baluk, P., i inni, J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998, 284: 693-9). Także, agonista receptora beta 2-adrenergicznego, formoterol, redukuje wyciek mikronaczyniowy przez inhibitowanie tworzenia szczelin śródbłonkowych (Baluk, P. i McDonald, D.M., Am. J. Physiol., 1994, 266:1461-8).
Angiopoetyny oraz członkowie rodziny czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) są jedynymi czynnikami wzrostu uznanymi w dużej mierze za specyficzne wobec komórek śródbłonka naczyniowego. Badania nad inaktywacją ukierunkowanego genu u myszy pokazały, że VEGF jest niezbędny dla wczesnych etapów rozwoju unaczynienia oraz że Ang-1 jest wymagany dla późniejszych etapów przemodelowywania naczyń.
Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 6,011,003, opublikowany 4 stycznia 2000, w imieniu Metris Therapeutics Limited, ujawnia zmienioną, rozpuszczalną formę polipeptydu FLT będącą zdolną do wiązania z VEGF i przez to wywierającą na niego wpływ hamujący, przy czym polipeptyd obejmuje pięć lub mniej pełnych domen immunoglobulinowych.
Opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5,712,380, opublikowany 27 stycznia 1998 i przypisany Merck i Co., ujawnia inhibitory czynnika wzrostu komórki śródbłonka naczyniowego (VEGF), które występują naturalnie lub wytwarza się je rekombinacyjnie w postaciach rozpuszczalnych, z C-terminalnym transbłonowym regionem receptora dla VEGF, lub bez.
Także przypisana Merck i Co. jest publikacja PCT nr WO 98/13071, opublikowana 2 kwietnia, 1998, która ujawnia metodologię terapii genowej do hamowania wzrostu guza pierwotnego oraz przerzutu, przez transfer genu o sekwencji nukleotydowej kodującej rozpuszczalne białko receptora, który wiąże się z VEGF.
Publikacja PCT nr WO 97/44453, opublikowana 27 listopada 1997, w imieniu Genentech, Inc., ujawnia nowe chimeryczne białka receptora VEGF obejmujące sekwencje aminokwasowe pochodzące od receptorów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego (VEGF) Flt1 i KDR, włączając mysi homolog w stosunku do ludzkiego receptora KDR FLK1, przy czym wymienione chimeryczne białka receptora VEGF wiążą się z VEGF i antagonizują jego aktywność proliferacyjną i angiogeniczną wobec komórki śródbłonka.
Publikacja PCT nr WO 97/13787, opublikowana 17 kwietnia 1997, w imieniu Toa Gosei Co., LTD., ujawnia inhibitor VEGF o niskim ciężarze cząsteczkowym stosowany przy leczeniu chorób, którym towarzyszy nowounaczynienie, takich jak guzy lite. Polipeptyd, zawierający pierwszą domenę podobną do immunoglobuliny i drugą domenę podobną do immunoglobuliny w regionie zewnątrzkomórkowym receptora VEGF FLT, lecz nie zawierający szóstej domeny podobnej do immunoglobuliny oraz siódmej domeny podobnej do immunoglobuliny, wykazuje aktywność hamującą VEGF.
Sharifi, J. i inni, 1998, The Quarterly Jour, of Nucl. Med. 42:242-249, ujawnia, że ponieważ przeciwciała monoklonalne (MAbs) są białkami zasadowymi, dodatnio naładowanymi, a komórki ssaków są naładowane ujemnie, interakcje elektrostatyczne między nimi mogą wytworzyć wyższy poziom wiązania naturalnego powodując niski stosunek nowotworu do normalnego narządu. Aby obejść ten efekt, wynalazcy próbowali poprawić klirens Mab, stosując różne metody, takie jak czynniki wtórne jak również modyfikacje chemiczne i pod względem ładunku samego MAb.
Jensen-Pippo, i inni, 1996, Pharmaceutical Research 13:102-107, ujawnia, że traktowanie PEG białka terapeutycznego, rekombinowanego ludzkiego czynnika stymulacji kolonii granulocytów (PEG-G-CSF), powoduje zwiększenie stabilności oraz retencji bioaktywności in vivo, po podaniu drogą do dwunastnicy.
Tsutsumi, i inni 1997, Thromb Haemost. 77:168-73, ujawniają doświadczenia, w których aktywność tworzenia skrzepu in vivo zmodyfikowanej glikolem polietylenowym interleukiny-6 (MPEG-IL-6), w której 54% z 14 grup aminowych lizyny IL-6 sprz ężono z PEG, porównywano z natywną IL-6.
Yang, i inni, 1995, Cancer 76:687-94, ujawniają, że koniugacja glikolu polietylenowego z rekombinowaną ludzką interleukiną-2 (IL-2) daje związek, zmodyfikowaną glikolem polietylenowym IL-2 (PEG-IL-2), która zachowuje aktywność in vitro oraz in vivo IL-2, lecz wykazuje znacznie wydłużony okres półtrwania w układzie krążenia.
PL 208 247 B1
R. Duncan i F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306, 296 (1994) przytaczają wysiłki w celu poprawy okresu półtrwania w osoczu asparaginazy, przez sprzężenie z glikolem polietylenowym.
Międzynarodowa publikacja PCT nr WO 99/03996 opublikowana 28 stycznia 1999 w imieniu Regeneron Pharmaceuticals, Inc., oraz The Regents of The University of California, opisuje zmodyfikowane polipeptydy ludzkiej nogginy posiadające delecje regionów aminokwasów zasadowych. Modyfikowane polipeptydy ludzkiej nogginy są opisane jako zachowujące aktywność biologiczną, posiadając zmniejszone powinowactwo do heparyny i lepsze właściwości farmakokinetyczne w surowicach zwierzęcych w porównaniu z niemodyfikowaną ludzką nogginą.
Niniejszy wynalazek opisuje zatem antagonistów VEGF z poprawionymi właściwościami farmakokinetycznymi
Przedmiotem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca:
(a) sekwencję nukleotydową, kodującą składnik receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń VEGF, składający się z immunoglobulino-podobnej (Ig) domeny 2 pierwszego receptora VEGF i domeny 3 Ig drugiego receptora VEGF.
(b) sekwencję nukleotydową, kodującą składnik multimeryzujący, przy czym ten pierwszy receptor VEGF jest Flt1 i drugi receptor VEGF jest FLk1 lub FLk4 a składnik receptora VEGF jest jedynym składnikiem receptora VEGF polipeptydu fuzyjnego.
W korzystnej postaci wynalazku w wyizolowanej cząsteczce kwasu nukleinowego sekwencja nukleotydowa kodująca domenę 2 Ig zewnątrzkomórkowej domeny pierwszego receptora VEGF, znajduje się w górę od sekwencji nukleotydowej kodującej domenę 3 Ig zewnątrzkomórkowej domeny drugiego receptora VEGF.
W innej korzystnej postaci wynalazku w wyizolowanej czą steczce kwasu nukleinowego sekwencja nukleotydowa kodująca domenę 2 Ig zewnątrzkomórkowej domeny pierwszego receptora VEGF znajduje się w dół od sekwencji nukleotydowej kodującej domenę 3 Ig zewnątrzkomórkowej domeny drugiego receptora VEGF.
W bardziej korzystnej postaci wyizolowana czą steczka kwasu nukleinowego wedł ug charakteryzuje się tym, że składnik multimeryzujący obejmuje domenę immunoglobulinową.
Zgodnie z wynalazkiem, w następnej, również korzystnej postaci, wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego charakteryzuje się tym, że domenę immunogobulinową wybiera się z grupy składającej się z domeny Fc IgG i łańcucha ciężkiego IgG.
Następnym korzystnym wykonaniem wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, która zawiera sekwencję nukleotydową, wybraną z grupy składającej się z:
(a) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 21A-21C;
(b) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 22A-22C;
(c) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 24A-24C; oraz (c) sekwencji nukleotydowej która, w wyniku degeneracji kodu genetycznego, różni się od sekwencji nukleotydowej (a), (b) lub (c).
Następną korzystną postacią wynalazku jest wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego, w której składniki polipeptydu fuzyjnego są uł o ż one jako 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 lub 3,2,1, gdzie 1 oznacza składnik pierwszego receptora VEGF, 2 oznacza składnik drugiego receptora VEGF i 3 oznacza czynnik multimeryzują cy.
Przedmiotem wynalazku jest także wektor, który obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną powyżej w jej wszystkich postaciach wykonania. Korzystnie, wektor ekspresji obejmuje taką cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną powyżej, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z sekwencją kontrolną ekspresji.
Następnym przedmiotem wynalazku jest układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, charakteryzujący się tym, że obejmuje wektor ekspresji tak jak zdefiniowano go powyżej, w odpowiedniej komórce gospodarza.
W układzie gospodarz-wektor według wynalazku, korzystną odpowiednią komórką gospodarza jest komórka bakteryjna, komórka drożdżowa, komórka owada, lub komórka ssaka, a najbardziej korzystnie jest gdy odpowiednią komórką gospodarza jest komórka E. coli lub CHO.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, charakteryzujący się tym, że obejmuje hodowlę komórek układu gospodarz-wektor jak zdefiniowano powyżej, w warunkach pozwalających na wytworzenie polipeptydu fuzyjnego i odzyskanie tak wytworzonego polipeptydu fuzyjnego.
PL 208 247 B1
Przedmiotem wynalazku jest także dimeryczny antagonista receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VGEF), zawierający dwa fuzyjne polipeptydy, każdy polipeptyd zawierający:
(a) składnik receptora VGEF składający się z immunglobulino-podobnej (Ig) domeny 2 receptora Flt1 VGEF i domeny 3 Ig receptora Flk-1 lub FLk-4 VGEF; i (b) składnik multimeryzujący, przy czym składnik receptora VGEF jest jedynym składnikiem receptora VGEF każdego białka fuzyjnego.
Dimeryczny antagonista według wynalazku, w korzystnym wykonaniu, charakteryzuje się tym, że jest zmodyfikowany przez acetylację lub pegylację.
Przedmiotem wynalazku jest również polipeptyd fuzyjny zawierający:
(a) składnik receptora VGEF składający się z immunglobulino-podobnej (Ig) domeny 2 receptora Flt1 VGEF i domeny 3 Ig receptora Flk-1 lub FLk-4 VGEF; i (b) składnik multimeryzujący, przy czym składnik receptora VGEF jest jedynym składnikiem receptora VGEF tego białka fuzyjnego.
W korzystnej postaci polipeptyd fuzyjny wedł ug wynalazku zawiera domenę immunoglobulino-podobną, a w jeszcze bardziej korzystnej postaci polipeptydu fuzyjnego domenę immunoglobulinową wybiera się spośród grupy obejmującej domenę Fc IgG i łańcuch ciężki IgG.
W najbardziej korzystnej postaci polipeptyd fuzyjny obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 21A-21C; fig. 22A-22C; lub fig. 24A-24C.
Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie polipeptydu fuzyjnego zdefiniowanego powyżej lub dimerycznego antagonisty według wynalazku również zdefiniowanego powyżej do produkcji leku do spowolniania lub zapobiegania wzrostu nowotworu, do osłabiania lub zapobiegania obrzękowi, osłabiania lub zapobiegania tworzenia się puchliny brzusznej, do zmniejszania lub zapobiegania wycieku osocza lub blokowania wzrostu naczynia krwionośnego u człowieka.
Bardziej korzystnym jest zastosowanie takie, że wspomniany lek jest do leczenia chorób oczu charakteryzujących się przepuszczalnością naczyń.
Zgodnie z zastosowaniem według wynalazku, korzystnie składniki polipeptydu fuzyjnego są uporządkowane jako 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 albo 3,2,1, przy czym 1 stanowi pierwszy składnik receptora VEGF, 2 stanowi drugi składnik receptora VEGF, a 3 stanowi składnik multimeryzujący.
W następnym korzystnym rozwiązaniu w zastosowaniu według wynalazku polipeptyd fuzyjny jest kodowany przez sekwencję nukleotydową wybraną z grupy złożonej z:
(a) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 21A-21C (b) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 22A-22C;
(c) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 24A-24C; i (d) sekwencji nukleotydowej która, z powodu degeneracji kodu genetycznego, różni się od sekwencji nukleotydowej z (a), (b) lub (c).
Bardziej korzystnie w zastosowaniu według wynalazku polipeptyd fuzyjny obejmuje sekwencję aminokwasową przedłożoną w fig. 24A-24C.
Zgodnie z inną korzystną postacią zastosowania według wynalazku chorobę oczu stanowi zwyrodnienie plamki związane z wiekiem lub retinopatia cukrzycowa.
Dodatkowe postacie realizacji obejmują polipeptyd fuzyjny kodowany przez sekwencję kwasu nukleinowego przedłożoną w fig. 10A-10D lub fig. 24A-24C, która została zmodyfikowana przez acetylowanie lub traktowanie PEG, gdzie acetylowanie uzyskuje się z co najmniej około 100-krotnym nadmiarem molowym odczynnika acetylującego lub gdzie acetylowanie uzyskuje się z molowym nadmiarem odczynnika acetylującego w zakresie od co najmniej około 10-krotnego molowego nadmiaru do około 100-krotnego nadmiaru molowego, lub gdzie traktowanie PEG oznacza 10K lub 20K PEG.
Zalecana postać realizacji obejmuje sposób zmniejszania lub hamowania wycieku osocza u ssaka, obejmujący podawanie ssakowi polipeptydu fuzyjnego opisanego powyżej, włączając postacie realizacji, w których ssakiem jest człowiek, polipeptyd fuzyjny jest acetylowany lub polipeptyd fuzyjny jest traktowany PEG. Polipeptyd fuzyjny może być stosowany do blokowania wzrostu naczyń krwionośnych u człowieka. W korzystnej postaci wynalazku polipeptyd fuzyjny stosuje się do leczenia chorób oczu u człowieka.
Dalsze postacie realizacji to polipeptyd fuzyjny, który specyficznie wiąże ligand VEGF receptora VEGF.
W wynalazku opisuje się sposób blokowania wzrostu naczynia krwionoś nego u czł owieka, obejmujący podawanie skutecznej ilości polipeptydu fuzyjnego opisanego powyżej.
PL 208 247 B1
W wynalazku opisuje się również sposób hamowania aktywności liganda receptora VEGF u ssaka, obejmujący podawanie ssakowi skutecznej ilości polipeptydu fuzyjnego opisanego powyżej, korzystnie ssakiem jest człowiek.
Dalsze również możliwe realizacje wynalazku obejmują osłabianie lub zapobieganie wzrostowi nowotworu u człowieka; osłabianie lub zapobieganie obrzękowi u człowieka, zwłaszcza gdy obrzękiem jest obrzęk mózgu; osłabianie lub zapobieganie tworzenia płynu puchlinowego u człowieka, zwłaszcza gdy płynem puchlinowym jest płyn puchlinowy związany z rakiem jajnika.
Zalecane postacie realizacji wynalazku obejmują polipeptyd fuzyjny zdolny do wiązania polipeptydu VEGF obejmujący (a) składnik receptora VEGF operacyjnie połączony z (b) składnikiem multimeryzującym, przy czym składnik receptora VEGF jest jedynym składnikiem receptora VEGF w polipeptydzie fuzyjnym i obejmuje zasadniczo sekwencję aminokwasową domeny 2 Ig zewnątrzkomórkowej domeny pierwszego receptora VEGF i sekwencję aminokwasową domeny 3 Ig zewnątrzkomórkowej domeny drugiego receptora VEGF.
W dalszej postaci realizacji polipeptydu fuzyjnego, pierwszym receptorem VEGF jest Flt1.
W jeszcze dalszej postaci realizacji polipeptydu fuzyjnego, drugim receptorem VEGF jest FLk1.
Jeszcze inną postacią realizacji polipeptydu fuzyjnego jest ta, w której drugim receptorem VEGF jest Flt4.
Zalecane postacie realizacji obejmują polipeptyd fuzyjny, w którym sekwencja aminokwasowa domeny 2 Ig zewnątrzkomórkowej domeny pierwszego receptora VEGF, znajduje się w górę od sekwencji aminokwasowej domeny 3 Ig zewnątrzkomórkowej domeny drugiego receptora VEGF i polipeptyd fuzyjny, w którym sekwencja aminokwasowa domeny 2 Ig zewnątrzkomórkowej domeny pierwszego receptora VEGF, znajduje się w dół od sekwencji aminokwasowej domeny 3 Ig zewnątrzkomórkowej domeny drugiego receptora VEGF.
W jeszcze innej postaci realizacji, składnik multimeryzujący polipeptydu fuzyjnego obejmuje domenę immunoglobuliny, włączając postać realizacji, w której domenę immunogobulinową wybiera się z grupy, składającej się z domeny Ec IgG, łańcucha ciężkiego IgG i łańcucha lekkiego IgG.
Zalecane postacie realizacji obejmują polipeptyd fuzyjny obejmujący sekwencję aminokwasową zmodyfikowanego receptora Flt1, gdzie sekwencję aminokwasową wybiera się z grupy składającej się z (a) sekwencji aminokwasowej przedłożonej w fig. 13A-13D; (b) sekwencji aminokwasowej przedłożonej w fig. 14A-14C; (c) sekwencji aminokwasowej przedłożonej w fig. 15A-15C; (d) sekwencji aminokwasowej przedłożonej w fig. 16A-16D; (e) sekwencji aminokwasowej przedłożonej w fig. 21A-21C; (f) sekwencji aminokwasowej przedłożonej w fig. 22A-22C; i (g) sekwencji aminokwasowej przedłożonej w fig. 24A-24C.
Inną zalecaną postacią realizacji jest sposób zmniejszania lub hamowania wycieku osocza u ssaka, obejmujący podawanie ssakowi polipeptydu fuzyjnego opisanego powyżej.
Krótki opis rysunków
Fig. 1. Analiza żelowa IEF niezmodyfikowanych i acetylowanych białek Flt1(1-3)-Fc. Niezmodyfikowane białko Flt1(1-3)-Fc jest niezdolne do wejścia w żel z powodu jego pl >9,3, podczas gdy acetylowany Flt1(1-3)-Fc jest zdolny do wejścia w żel i równowagi przy pl 5,2.
Fig. 2. Wiązanie niezmodyfikowanych białek Flt1(1-3)-Fc i acetylowanych Flt1(1-3)-Fc z płytkami powleczonymi Matrigel®. Niezmodyfikowane białka Flt1(1-3)-Fc wiążą się szeroko z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi w Matrigel®, podczas gdy acetylowane Flt1(1-3)-Fc nie wiążą.
Fig. 3. Wiązanie niezmodyfikowanych Flt1(1-3)-Fc, acetylowanych Flt1(1-3)-Fc, i traktowanych PEG Flt1(1-3)-Fc, w teście na bazie Biacore. Acetylowane (kolumny 13-16), traktowane PEG (kolumny 17-20), i traktowane heparyną Flt1(1-3)-Fc (kolumny 21-24) są wszystkie zdolne do pełnego współzawodnictwa ze związanym z płytką Biacore Flt1(1-3)-Fc w celu związania VEGF w porównaniu z kontrolą (kolumny 1-4) i białkiem nie istotnym (kolumny 5-8). Niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc (kolumny 5-6) okazują się współzawodniczyć jedynie częściowo z Flt1(1-3)-Fc związanym z płytką Biacore, w celu związania VEGF.
Jednakże, przemycie związanych próbek 0,5 M NaCl (kolumny 7-8) daje w wyniku profil wiązania podobny do form zmodyfikowanych Flt1(1-3)-Fc, pokazując, że niezmodyfikowane białko wykazuje niespecyficzne wiązanie z płytką, które można wyeliminować przez przemywanie solą.
Fig. 4. Wiązanie niezmodyfikowanych Flt1(1-3)-Fc, acetylowanych Flt1(1-3)-Fc, i traktowanych PEG Flt1(1-3)-Fc z VEGF w teście na bazie ELISA. Zarówno traktowane PEG jak i acetylowane białka Flt1(1-3)-Fc wiążą się z VEGF z powinowactwem, dochodzącym do tego z niezmodyfikowanych Flt1(1-3)-Fc.
PL 208 247 B1
Fig. 5. Profile farmakokinetyczne niezmodyfikowanych Flt1(1-3)-Fc, acetylowanych Flt1(1-3)-Fc, i traktowanych PEG Flt1(1-3)-Fc. Myszom Balb/c (23-28 g) wstrzykiwano podskórnie 4 mg/kg niezmodyfikowanych, acetylowanych lub traktowanych PEG Flt1(1-3)-Fc. Myszom pobierano krew z ogona w 1, 2, 4, 6, 24 godzin, 2 dni, i 3 dni po iniekcji bia ł ka i surowice testowano w standardowym teś cie na bazie ELISA przeznaczonym do wykrywania białka Flt1(1-3)-Fc. Tmax dla wszystkich białek Flt1(1-3)Fc był między punktami czasowymi 6 godzin i 24 godzin. Cmax dla różnych białek był następujący:
niezmodyfikowane: 0,06 μg/ml - 0,15 μg/ml; acetylowane: 1,5 μg/ml - 4,0 μg/ml; i traktowane PEG: około 5 μg/ml.
Fig. 6A-6B. Analiza żelowa IEF niezmodyfikowanych i acetylowanych etapowo białek Flt1(1-3)Fc. Niezmodyfikowane białko Flt1(1-3)-Fc jest niezdolne do wejścia w żel z powodu jego pl >9.3, podczas gdy większość acetylowanych etapowo próbek Flt1(1-3)-Fc (próbki o 30-100 krotnym nadmiarze) były zdolne do migracji do żelu i równowagi przy pl w zakresie między 4,55 - 8,43, w zależności od stopnia acetylowania.
Fig. 7. Wiązanie niezmodyfikowanych białek Flt1(1-3)-Fc i acetylowanych etapowo Flt1(1-3)-Fc z płytkami powlekanymi Matrigel®. Jak dla nie istotnego białka kontrolnego rTie2-Fc, etapowo acetylowane Flt1(1-3)-Fc (próbki o nadmiarze 30-krotnym) nie wykazują żadnego wiązania z płytką powleczoną Matrigel, podczas gdy nie acetylowane białko Flt1(1-3)-Fc wykazuje istotne wiązanie. Próbka o 10-krotnym nadmiarze wykazuje zmniejszone wiązanie lecz stopień acetylowania jest nie wystarczający do pełnego zablokowania wiązania z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi.
Fig. 8. Wiązanie niezmodyfikowanych białek Flt1(1-3)-Fc i acetylowanych etapowo Flt1(1-3)-Fc w teście na bazie Biacore. Przy stosunku substechiometrycznym (0,5 μg/ml albo niezmodyfikowanego Flt1(1-3) albo etapowo acetylowanego Flt1(1-3)-Fc przeciwko 0,2 μg/ml VEGF), nie ma wystarczającej ilości Flt1(1-3)-Fc (albo niezmodyfikowanego albo etapowo acetylowanego) w roztworze, związanego w pełni z VEGF. W ilości 1,0 μg/ml, co zbliża się do stosunku stechiometrycznego 1:1, zarówno niezmodyfikowane jak i etapowo acetylowane Flt1(1-3)-Fc są bardziej zdolne do współzawodniczenia pod względem wiązania VEGF lecz wciąż istnieje niewystarczająca ilość białka Flt1(1-3)-Fc (albo niezmodyfikowanego albo etapowo acetylowanego) aby w pełni nasycić dostępny VEGF. Jednakże, przy 5,0 μg/ml, co oznacza kilkakrotnie więcej niż stosunek stechiometryczny 1:1, zarówno Flt1(1-3)-Fc jak i etapowo acetylowane białka Flt1(1-3)-Fc są zdolne do nasycenia VEGF, bez względu na stopień acetylowania.
Fig. 9. Profile farmakokinetyczne niezmodyfikowanych Flt1(1-3)-Fc, acetylowanych Flt1(1-3)-Fc, i traktowanych PEG Flt1(1-3)-Fc. Myszom Balb/c (23-28 g) wstrzykiwano podskórnie 4 μg/kg niezmodyfikowanych, lub próbek o 10, 20, 40, 60 i 100-krotnym nadmiarze etapowo acetylowanego Flt1(1-3)Fc (3 myszy dla niezmodyfikowanych próbek o 10, 20 i 40-krotnym nadmiarze i 2 myszy dla próbek o 60 i 100-krotnym nadmiarze). Myszom pobierano krew z ogona w 1, 2, 4, 6, 24 godzin, 2 dni, i 3 dni po iniekcji białka. Surowice testowano w teście na bazie ELISA przeznaczonym do wykrywania białka Flt1(1-3)-Fc. Tmax dla wszystkich białek Flt1(1-3)-Fc był w punkcie czasowym 6 godzin lecz Cmax był następujący: niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc: 0,06 μg/ml - 0,15 ng/ml; próbki z 10-krotnym nadmiarem: - 0,7 μg/ml, próbki z 20-krotnym nadmiarem: - 2 μg/ml, próbki z 40-krotnym nadmiarem: - 4 μg/ml, próbki z 60-krotnym nadmiarem: - 2 μg/ml, próbki ze 100-krotnym nadmiarem: - 1 μg/ml.
Fig. 10A-10D. Sekwencja kwasu nukleinowego i wnioskowana aminokwasowa Flt1(1-3)-Fc.
Fig. 11. Schematyczny rysunek struktury Flt1.
Fig. 12A i 12B. Analiza hydrofilności sekwencji aminokwasowej domeny 2 Ig i domeny 3 Ig Flt1.
Fig. 13A-13D. Sekwencja kwasu nukleinowego i wnioskowana aminokwasowa Mut1:Flt1(1-3^)-Fc.
Fig. 14A-14C. Sekwencja kwasu nukleinowego i wnioskowana aminokwasowa Mut2: Flt1(2-3δ8)-Ι=ο.
Fig. 15A-15C. Sekwencja kwasu nukleinowego i wnioskowana aminokwasowa Mut3: Flt1(2-3)-Fc.
Fig. 16A-16D. Sekwencja kwasu nukleinowego i wnioskowana aminokwasowa Mut4: Flt1(1-3r ,n)-Fc.
Fig. 17. Wiązanie niezmodyfikowanych Flt1(1-3)-Fc, mutanta z delecją regionu zasadowego Flt1(1-3)-Fc i zmutowanych białek Flt1(1-3)R ,N w teście na bazie Biacore. W stosunku substechiometrycznym (0,25 μg/ml Flt1(1-3)-Fc niezmodyfikowanych, acetylowanych lub genetycznie zmodyfikowanych próbek przeciwko 01. μg/ml VEGF), występuje nie wystarczająca ilość białka Flt1 (1-3)-Fc aby zablokować wiązanie VEGF z Flt1(1-3)-Fc unieruchomionym na płytce Biacore. Przy 0,5 μg/ml niezmodyfikowanych, acetylowanych lub genetycznie zmodyfikowanych białek Flt1(1-3)-Fc, stosunek stechiometryczny zbliża się do 1:1 i występuje zwiększona zdolność do blokowania wiązania VEGF
PL 208 247 B1 z pł ytką Biacore. Przy 1,0 μ g/ml niezmodyfikowanych, acetylowanych lub genetycznie zmodyfikowanych białek Flt1(1-3)-Fc, która wynosi około 10:1 stosunku stechiometrycznego, białka Flt1(1-3)-Fc są zdolne do blokowania wiązania VEGF z płytką Biacore, lecz nie są one równoważne. Niezmodyfikowane, acetylowane i Mut1:Flt1(1-3^)-Fc są zasadniczo równe pod względem zdolności do blokowania wiązania VEGF, podczas gdy Mut4: Flt1(1-3R ,N)-Fcjest nieco mniej skuteczne w blokowaniu wiązania
Fig. 18. Wiązanie niezmodyfikowanych zmutowanych białek Flt1(1-3)-Fc, Mut1:Flt1(1 -3^)-Fc, Mut2: Flt1 (2-3^)-Fc, i Flt1(2-3) z płytkami powleczonymi Matrigel®. Niezmodyfikowane białko Flt1(1-3)-Fc wiąże się chciwie z tymi studzienkami, białko Mut3: Flt1(2-3)-Fc wiąże się nieco słabiej, białko Mut1:Flt1(1-3^)-Fc wiąże się jeszcze słabiej, a białko Mut2: Flt1(2-3^)-Fc wykazuje najlepszy profil, wiążąc się słabiej niż każde z innych zmutowanych białek. Zmutowane pod względem glikozylacji białko Mut4: Flt1(1-3R ,N)-Fc wykazuje tylko marginalną korzyść w teście Matrigel.
Fig. 19. Wiązanie niezmodyfikowanych zmutowanych białek Flt1(1-3)-Fc, Mut1:Flt1(1 -3^)-Fc, Mut2: Flt1(2-3^)-Fc, i Flt1(2-3) w teście na bazie ELISA. Przy testowanych stężeniach, niezmodyfikowane zmutowane białka Flt1(1-3)-Fc, Mut1:Flt1(1-3^)-Fc, Mut2: Flt1(2-3^)-Fc, i Flt1(2-3) wiążą VEGF podobnie.
Fig. 20. Profile farmakokinetyczne niezmodyfikowanych zmutowanych białek Flt1(1-3)-Fc, Mut1:Flt1(1-3^)-Fc, Mut2: Flt1 (2-3;B)-Fc, i Flt1(2-3), Cmax dla tych odczynników był następujący: niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc - 0,15 μg/ml; 40 krotny nadmiar molowy acetylowanych Flt1(1-3)-Fc - 1,5 μg/ml; i Mut1:Flt1(1-3^)-Fc - 0,7 μg/ml.
Fig. 21A-21C. Nukleotydowa i wywnioskowana sekwencja aminokwasowa zmodyfikowanego receptora Flt1 określonego jako Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a).
Fig. 22A-22C. Nukleotydowa i wywnioskowana sekwencja aminokwasowa zmodyfikowanego receptora Flt1 określonego jako Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a).
Fig. 23. Test matrycy zewnątrzkomórkowej (ECM). Wyniki tego testu pokazują, że białka Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) są istotnie mniej przylegające do ECM w porównaniu z białkiem Flt1(1-3)-Fc.
Fig. 24A-24C. Nukleotydowa i wywnioskowana sekwencja aminokwasowa zmodyfikowanego receptora Flt1 określonego jako VEGFR1R2-FcΔC1(a).
Fig. 25A-25C. Test fosforylacji. Przy 1,5 molowym nadmiarze albo Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40) albo krótkotrwałego Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) występuje pełna blokada stymulacji receptora przez te trzy zmodyfikowane receptory Flt1y w porównaniu z obciążeniem pożywką kontrolną. Przeciwnie, krótkotrwałe Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) nie wykazuje istotnej blokady przy tym molowym nadmiarze, w porównaniu z obciążeniem kontrolą dodatnią pod względem VEGF. Podobne wyniki są widoczne w fig. 25B, gdzie zmodyfikowane receptory Flt występują w 3-krotnym nadmiarze molowym z ligandem VEGF165. W fig. 25C, gdzie zmodyfikowane receptory Flt1 występują w 6-krotnym nadmiarze molowym z ligandem VEGF165, krótkotrwałe Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) może się teraz okazać jako częściowo blokujące stymulację receptorów powierzchniowo-komórkowych indukowaną VEGF165.
Fig. 26A-26B. Test fosforylacji. Wykrywanie przez Western blot fosforylowanego tyrozyną VEGFR2(Flk1) przez stymulację ligandem VEGF165 wykazuje, że receptory powierzchniowo-komórkowe nie są fosforylowane przez obciążenie próbek, które posiadają wstępnie inkubowany VEGF165 z 1 i 2 krotnym nadmiarem molowym (fig. 26A) lub 3 i 4 krotnym nadmiarem molowym (fig. 26B) albo krótkotrwałego Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), stabilnego Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), lub krótkotrwałego VEGFR1R2-FcΔC1(a). Przy wszystkich testowanych stężeniach zmodyfikowanego receptora Flt1 występuje pełne wiązanie liganda VEGF165 podczas wstępnej inkubacji, dając w wyniku brak wykrywalnej stymulacji receptorów powierzchniowo-komórkowych przez nie związany VEGF165, w porównaniu z obciążeniem pożywką kontrolną.
Fig. 27. Test proliferacji komórek MG/R2. Następujące zmodyfikowane receptory Flt Flt1(1-3)Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a), plus nieistotny receptor określony Tie2Fc, jako kontrola ujemna, miareczkowano od 40 nM do 20 pM i inkubowano na komórkach przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie ludzki rekombinowany VEGF165 w określonych pożywkach dodawano do wszystkich studzienek przy stężeniu wynoszącym 1,56 nM. Kontrolny receptor ujemny Tie2-Fc nie blokuje proliferacji komórek indukowanej VEGF165 przy żadnym stężeniu, podczas gdy Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) blokuje 1,56 nM VEGF165 połową maksymalnej dawki, wynoszącą ~2 nM. Flt1(1-3)-Fc i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) mniej skutecznie blokują VEGF165 w tym teście, połową
PL 208 247 B1 maksymalnej dawki, wynoszącą ~ 2 nM. Sam VEGF165 daje odczyt wynoszący 1,2 jednostki absorbancji, a tło wynosi 0,38 jednostki absorbancji.
Fig. 28. Analiza Biacore stechiometrii wiązania. Stechiometrię wiązania obliczano jako stosunek molowy związanego VEGF165 z unieruchomionym Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2FcΔC1(a), stosując współczynnik konwersji wynoszący 1000 RU równoważny 1 ng/ml. Wyniki pokazywały stechiometrię wiązania, wynoszącą jedną dimeryczną cząsteczkę VEGF165 na jedną cząsteczkę Flt1D2Flk1 D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2-FcΔC1(a).
Fig. 29 i fig. 30. Stechiometria chromatografii rozdziału pod względem wielkości. Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2-FcΔC1(a) przy stężeniu wynoszącym 1 nM (szacowanym jako 1000 razy wyższe niż KD Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub interakcja VEGFR1R2-FcΔC1(a)/VEGF165), mieszano ze zmiennymi stężeniami VEGF165. Po inkubacji, mierzono stężenia wolnego Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) w roztworze. Dane pokazują, że dodanie 1 nM VEGF165 do roztworu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) całkowicie blokuje wiązanie Flt1D2Flk1D3.-FcΔC1(a) z powierzchnią VEGF165. Wynik ten sugerował stechiometrię wiązania jako jedną cząsteczkę VEGF165 na jedną cząsteczkę Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a).
Fig. 31. Chromatografia rozdziału pod względem wielkości (SEC) w warunkach rodzimych. Pik #1 przedstawia kompleks Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165, a pik #2 przedstawia nie związany VEGF165. Frakcje wymyte między 1,1 i 1,2 ml łączono i dodawano chlorowodorek guanidyny (GuHCl do stężenia końcowego 4,5M, aby zdysocjować kompleks.
Fig. 32. Chromatografia rozdziału pod względem wielkości (SEC) w warunkach dysocjacyjnych. Aby rozdzielić składniki kompleksu receptor-ligand i aby określić ich stosunek molowy, załadowano 50 μl zdysocjowanego kompleksu na Superose 12 PC 3,2/30 zrównoważonego w 6M GuHCl i wymywano. Pik #1 przedstawia Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), a pik #2 przedstawia VEGF165.
Fig. 33, fig. 34 i fig. 35. Chromatografia rozdziału pod względem wielkości (SEC) z podłączonym rozpraszaniem światła. Stosowano kolumnę do chromatografii rozdziału pod względem wielkości z podłączonym detektorem rozpraszania światła MiniDawn (Wyatt Technology, Santa Barbara, Kalifornia) i detektory wskaźnika załamania (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japan), aby określić ciężar molowy (MW) kompleksu receptor-ligand. Jak pokazano w fig. 33, profil elucji wykazuje dwa piki. Pik #1 przedstawia kompleks receptor-ligand, a pik #2 przedstawia niezwiązany VEGF165. MW obliczano na podstawie sygnałów LS i RI. Taką samą procedurę stosowano aby określić MW poszczególnych składników kompleksu receptor-ligand. Wyniki tych określeń są następujące:
MW kompleksu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165 przy pozycji piku wynosi 157 300 (fig. 33), MW VEGF165 przy pozycji piku wynosi 44 390 (fig. 34), a MW R1R2 przy piku wynosi 113 300 (fig. 35).
Fig. 36. Mapowanie peptydu i analiza glikozylacji. Określano struktury disiarczkowe i miejsca glikozylacji w Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) metodą mapowania peptydu. W Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) jest całkowita ilość dziesięciu cystein; sześć z nich należy do regionu Fc. Cys27 jest związana z Cys76 wiązaniem disiarczkowym. Cys121 jest związana wiązaniem disiarczkowym z Cys182. Pierwsze dwie cysteiny w regionie Fc (Cys211 i Cys214) tworzą wewnątrzcząsteczkowe wiązanie disiarczkowe z tymi samymi dwoma cysteinami w drugim łańcuchu Fc. Jednakże, nie można określić, czy wiązanie disiarczkowe występuje między tymi samymi cysteinami (np.Cys211 do Cys211) czy między Cys211 i Cys214. Cys216 jest połączona wiązaniem disiarczkowym z Cys306. Cys352 jest połączona wiązaniem disiarczkowym z Cys410.
W Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) istnieje pięć możliwych miejsc glikozylacji połączonych przez N, i odkryto, że ulegają glikozylacji do zmiennego stopnia. Pełną glikozylację obserwuje się przy Asn33, Asn193, i Asn282. Częściową glikozylację obserwuje się na Asn65 i Asn120. Miejsca glikozylacji są naświetlone przez podkreślenie w fig.
Fig. 37. Właściwości farmakokinetyczne Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i VEGFR1R2-FcΔC1(a). Myszom Balb/c wstrzykiwano podskórnie 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), CHO krótkotrwale wykazujące ekspresję Flt1D2.Flk1D3.FcΔCl (a), CHO stabilnie wykazujące ekspresję Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), i CHO krótkotrwale wykazujące ekspresję VEGFR1R2-FcΔC1(a). Myszom pobierano krew w 1, 2, 4, 6, 24 godziny, 2 dni, 3 dni i 6 dni po iniekcji. Surowice testowano w ELISA przeznaczonym do wykrywania Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2-FcΔC1(a). Tmax dla Flt1(1-3)-Fc (A40) miał miejsce po 6 godzinach, podczas gdy Tmax dla krótkotrwałego i stabilnego Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) oraz krótkotrwałego VEGFR1R2-FcΔC1(a) wynosił 24 godziny. Cmax dla Flt1(1-3)-Fc (A40) wynosił 8 mg/ml. Zarówno dla krótkotrwałego (Flt1D2.Flk1 D3.FcΔC1 (a) jak
PL 208 247 B1 i VEGFR1R2-FcΔC1(a)) Cmax wynosił 18 μg/ml i Cmax dla stabilnego VEGFR1R2-FcΔC1(a) wynosił mg/ml.
Fig. 38. Właściwości farmakokinetyczne Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1 D2.Flk1 D3. cΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). Myszom Balb/c wstrzykiwano podskórnie 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), CHO krótkotrwale wykazujące ekspresję Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i CHO krótkotrwale wykazujące ekspresję Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). Myszom pobierano krew z ogona po 1,2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 i 20 dni po iniekcji. Surowice testowano w ELISA przeznaczonym do wykrywania Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). Flt1(1-3)-Fc (A40) nie był dłużej wykrywany w surowicy po dniu 5, podczas gdy Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) były wykrywalne przez 15 dni lub więcej.
Fig. 39. Zdolność Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) do hamowania czynnika wzrostu włókniakomięsaka HT-1080 in vivo. Traktowanie co dwa dni lub 2 razy na tydzień myszy SCID Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) w ilości 25 mg/kg istotnie zmniejsza wzrost podskórnych guzów włókniakomięsaka HT-1080.
Fig. 40. Zdolność Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) do hamowania czynnika wzrostu glejaka C6 in vivo. Traktowanie co dwa dni lub 2 razy na tydzień myszy SCID Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) istotnie zmniejsza wzrost podskórnych guzów glejaka C6 przy dawkach tak niskich jak 2,5 mg/kg.
Fig. 41. Nadmierna przepuszczalność macicy indukowana VEGF. PMSG wstrzykiwany podskórnie (5 jednostek) aby indukować owulację u samic szczurów przed okresem dojrzałości, daje w wyniku nagły wzrost estradiolu po 2 dniach, co na odwrót powoduje indukcję VEGF w macicy. Indukcja ta daje w wyniku nadmierną przepuszczalność macicy i zwiększenie wilgoci w macicy. Podskórne wstrzyknięcie Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) w ilości 25 mg/kg w 1 godzinę po wstrzyknięciu PMSG daje w wyniku około 50% inhibicję zwiększenia masy wilgotnej macicy.
Fig. 42A-42B. Oszacowanie angiogenezy ciałka żółtego przy użyciu progesteronu jako odczytu. PMSG wstrzykiwano podskórnie (5 jednostek) aby indukować owulację u samic szczura przed okresem dojrzałości, uzyskując w pełni działające ciałko żółte zawierające gęstą sieć naczyń krwionośnych, wydzielających progesteron do strumienia krwi, przygotowując macicę do wszczepienia. Indukcja angiogenezy w ciałku żółtym wymaga VEGF. Spoczynkowy poziom progesteronu wynosi około 5 ng/ml i można go indukować do 25-40 ng/ml po PMSG. Podskórne wstrzyknięcie Flt1(1-3)-Fc (A40) lub Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) w ilości 25 mg/kg lub 5 mg/kg po 1 godzinie, po wstrzyknięciu PMSG spowodowało kompletną inhibicję indukcji progesteronu w dniu 4.
Szczegółowy opis wynalazku
Długotrwałym problemem w technice było wytworzenie antagonisty VEGF na bazie receptora, który posiada profil farmakokinetyczny odpowiedni do wzięcia pod uwagę antagonisty jako kandydata na lek. Zgłaszający opisują w niniejszym, po raz pierwszy, chimeryczną cząsteczkę polipeptydu, zdolną do antagonizowania aktywności VEGF, która wykazuje poprawione właściwości farmakokinetyczne, w porównaniu z innymi znanymi antagonistami VEGF na bazie receptorów. Chimeryczne cząsteczki polipeptydu opisane w niniejszym zgłoszeniu zapewniają więc, po raz pierwszy, odpowiednie cząsteczki do stosowania w terapii, w której pożądanym wynikiem jest antagonizm VEGF.
Niniejszy wynalazek zapewnia nowe chimeryczne cząsteczki polipeptydu utworzone przez fuzję zmodyfikowanej zewnątrzkomórkowej domeny wiązania liganda receptora Flt1 z regionem Fc IgG.
Zewnątrzkomórkową domenę wiązania liganda określa się jako część receptora, która, w swej natywnej konformacji w błonie komórkowej, jest zorientowana zewnątrzkomórkowo, gdzie może się stykać ze swym pokrewnym ligandem.
Zewnątrzkomórkowa domena wiązania liganda nie obejmuje hydrofobowych aminokwasów związanych z transbłonową domeną receptora, ani żadnych aminokwasów związanych z domeną wewnątrzkomórkową receptora. Generalnie, domena wewnątrzkomórkowa lub cytoplazmatyczna receptora składa się zwykle z dodatnio naładowanych lub polarnych aminokwasów (czyli lizyny, argininy, histydyny, kwasu glutamowego, kwasu asparaginowego). Pierwsze 15-30, przede wszystkim hydrofobowych lub apolarnych aminokwasów (czyli leucyny, waliny, izoleucyny, i fenyloalaniny) obejmują domenę transbłonową. Zewnątrzkomórkowa domena obejmuje aminokwasy, które poprzedzają hydrofobowy transbłonowy zasięg aminokwasów. Zwykle domena transbłonowa jest oskrzydlona przez dodatnio naładowane lub polarne aminokwasy, takie jak lizyna lub arginina. von Heijne opublikował szczegółowe zasady, które są powszechnie przytaczane przez fachowców, przy określaniu, które aminokwasy danego receptora należą do domeny zewnątrzkomórkowej, transbłonowej, lub wewnątrzkomórkowej (zobacz von Heijne, 1995, BioEssays 1Z:25-30). Alternatywnie, dostępne stały się strony
PL 208 247 B1 internetowe, takie jak http://ulreq3.unil.ch/poftware/TMPRED_form.html. dostarczające chemikom zajmującym się białkami informacji o założeniach dotyczących domen białkowych.
Niniejszy wynalazek zapewnia budowę cząsteczki kwasu nukleinowego, kodującą chimeryczne cząsteczki polipeptydowe, które wprowadza się do wektora zdolnego do ekspresji chimerycznej cząsteczki polipeptydowej, po wprowadzeniu do odpowiedniej komórki gospodarza. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują, lecz nie ograniczając, komórki bakteryjne, komórki drożdżowe, komórki owadzie, oraz komórki ssaków. Każdą ze znanych fachowcom metod wprowadzania fragmentów DNA do wektora, można użyć do konstrukcji wektorów ekspresji kodujących chimeryczne cząsteczki polipeptydowe pod kontrolą transkrypcyjnych/translacyjnych sygnałów kontrolnych. Metody te mogą obejmować techniki rekombinacji i syntezy DNA in vitro oraz rekombinacji in vivo (rekombinacji genetycznej) (patrz Sambrook, i inni, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, wydawcy Ausubel, i inni, Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY).
Ekspresja cząsteczek kwasu nukleinowego kodującego chimeryczne cząsteczki polipeptydu może być regulowana przez drugą sekwencję kwasu nukleinowego, tak że ekspresja chimerycznej cząsteczki polipeptydu zachodzi w gospodarzu transformowanym rekombinowaną cząsteczką DNA. Przykładowo, ekspresję chimerycznej cząsteczki polipeptydu opisywanej niniejszym, można kontrolować każdym znanym w technice elementem promotor/wzmacniacz. Promotory, które można stosować do kontroli chimerycznej cząsteczki polipeptydowej obejmują, lecz nie ograniczając, długie powtórzenie końcowe, jakie jest opisane u Squinto i inni, (1991, Cell 65.:1-20); region wczesnego promotora SV40 (Bernoist i Chambon, 1981, Nature 290:304-310), promotor CMV, promotor z powtórzeniem końcowym 5' M-MuLV zawarty w długim powtórzeniu końcowym 3' wirusa mięsaka Rous'a (Yamamoto, i inni, 1980, Cell 22:787-797), promotor kinazy tymidynowej opryszczki (Wagner i inni, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 144-1445), sekwencje regulatorowe genu metalotioneiny (Brinster i inni,
1982, Nature 296:39-42); prokariotyczne wektory ekspresji, takie jak promotor β-laktamazy (VillaKamaroff, i inni, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731), lub promotor tac (DeBoer, i inni,
1983, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25, zobacz także „Useful proteins from recombinant bacteria w Scientific American, 1980, 242:74-94): elementy promotorowe z drożdży lub innych grzybów, takie jak promotor Gal 4, promotor ADH (dehydrogenazy alkoholowej), promotor PGK (kinazy fosfoglicerolowej), promotor fosfatazy alkalicznej, oraz następujące zwierzęce regiony kontroli transkrypcji, które wykazują specyficzność tkankową i były wykorzystywane w zwierzętach transgenicznych: region kontrolny genu elastazy I, który jest aktywny w komórkach groniastych trzustki (Swift i inni, 1984, Cell 38:639-646; Ornitz i inni, 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); region kontrolny genu insuliny, który jest aktywny w komórkach beta trzustki (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), region kontrolny genu immunoglobuliny, który jest aktywny w komórkach limfoidalnych (Grosschedi i inni, 1984, Cell 38:647-658: Adames i inni, 1985, Nature 318:533-538; Alexander i inni, 1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444), region kontrolny wirusa mysiego nowotworu sutka, który jest aktywny w komórkach jądrowych, sutkowych, limfoidalnych i tucznych (Leder i inni, 1986, Cell 45:485-495), region kontrolny genu albuminy, który jest aktywny w wątrobie (Pinkert i inni, 1987, Genes i Devel. 1:268-276), region kontrolny genu alfa-fetoproteiny, który jest aktywny w wątrobie (Krumlauf i inni, 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Hammer i inni, 1987, Science 235:53-58); region kontrolny genu antytrypsyny alfa 1, który jest aktywny w wątrobie (Kelsey i inni, 1987, Genes i Devel. 1:161-171), region kontrolny genu beta globiny, który jest aktywny komórkach mieloidowych (Mogram i inni, 1985, Nature 315:338-340; Kollias i inni, 1986, Cell 46:89-94); region kontrolny genu zasadowego białka mieliny, który jest aktywny w komórkach oligodendrocytowych mózgu (Readhead i inni, 1987, Cell 48:703-712); region kontrolny genu łańcucha lekkiego 2 miozyny, który jest aktywny w mięśniach szkieletowych (Shani, 1985, Nature 314:283-286), i region kontrolny genu gonadotropowego hormonu uwalniającego, który jest aktywny w podwzgórzu (Mason i inni, 1986, Science 234:1372-1378).
Tak więc, według wynalazku, wektory ekspresji zdolne do replikacji w bakteryjnym lub eukariotycznym gospodarzu, obejmujące kwas nukleinowy kodujący chimeryczną cząsteczkę polipeptydu, jakie opisano w niniejszym, stosuje się do transfekcji gospodarza i przez to kierowania ekspresji takich kwasów nukleinowych na wytwarzanie chimerycznej cząsteczki polipeptydowej, którą następnie odzyskuje się w postaci biologicznie aktywnej. Jak stosuje się w niniejszym, postać biologicznie aktywna obejmuje postać zdolną do wiązania z VEGF.
PL 208 247 B1
Wektory ekspresji, zawierające chimeryczne cząsteczki kwasu nukleinowego opisane w niniejszym, można identyfikować stosując trzy ogólne podejścia: (a) hybrydyzację DNA-DNA, (b) obecność lub brak „markerowych funkcji genu, i (c) ekspresja wprowadzonych sekwencji. W pierwszym podejściu, obecność obcego genu wprowadzonego do wektora ekspresji, można wykrywać przez hybrydyzację DNA-DNA, stosując sondy obejmujące sekwencje homologiczne w stosunku do wprowadzonych chimerycznych sekwencji cząsteczki polipeptydu. W drugim podejściu, układ rekombinowany wektor/gospodarz można identyfikować i selekcjonować na podstawie obecności lub braku pewnych „markerowych funkcji genu (np. aktywności kinazy tymidynowej, oporności wobec antyblotyków, fenotypu transformacji, tworzenia ciał okluzyjnych w bakulowirusie, itd.) powodowanych przez insercję obcego genu do wektora. Przykładowo, jeśli sekwencję DNA chimerycznej cząsteczki polipeptydu wprowadza się wewnątrz sekwencji genu markerowego wektora, rekombinanty zawierające insert można identyfikować przez brak funkcji genu markerowego. W trzecim podejściu, rekombinowane wektory ekspresji można identyfikować, testując produkt obcego genu, którego ekspresja zachodzi w rekombinancie. Takie testy mogą być np. na bazie fizycznych lub funkcjonalnych wł a ś ciwości chimerycznej cząsteczki polipeptydowej.
Komórki według niniejszego wynalazku mogą krótkotrwale lub, korzystnie, konstytutywnie i w sposób stały, wykazywać ekspresję chimerycznej cząsteczki polipeptydowej.
Chimeryczne cząsteczki polipeptydu można oczyszczać każdą techniką, która pozwala na późniejsze tworzenie stabilnej, biologicznie aktywnej chimerycznej cząsteczki polipeptydu. Przykładowo, i nie ograniczając, czynniki można odzyskać z komórek albo w postaci rozpuszczalnych białek albo w postaci ciałek inkluzyjnych, z których można je ekstrahować ilościowo, stosując 8M chlorowodorek guanidyny i dializę (zobacz np. Builder, i inni, opis patentowy Stanów Zjednoczonych nr 5,663,304). W celu dodatkowego oczyszczenia czynników, można stosować konwencjonalną chromatografię jono-wymienną, chromatografię interakcji hydrofobowych, chromatografię z odwrotną fazą lub filtrację żelową.
W jednej postaci realizacji wynalazku, sekwencja nukleotydowa kodująca pierwszy składnik, znajduje się w górę od sekwencji nukleotydowej kodującej drugi składnik. W innej postaci realizacji wynalazku, sekwencja nukleotydowa kodująca pierwszy składnik, znajduje się w dół od sekwencji nukleotydowej kodującej drugi składnik. Można wykonywać dodatkowe postacie realizacji wynalazku, w których porządek pierwszego, drugiego i trzeciego składnika polipeptydu fuzyjnego są przeszeregowane.
Przykładowo, jeśli sekwencja nukleotydowa kodująca pierwszy składnik jest oznaczona 1, sekwencja nukleotydowa kodująca drugi składnik jest oznaczona 2, i sekwencja nukleotydową trzeciego składnika jest oznaczona 3, wtedy porządek składników w izolowanym kwasie nukleinowym według wynalazku odczytywany od 5' do 3' może być którąkolwiek z następujących sześciu kombinacji: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; lub 3,2,1.
Niniejszy wynalazek posiada także diagnostyczne i terapeutyczne zastosowanie w poszczególnych postaciach realizacji wynalazku, metody wykrywania aberracji w funkcji lub ekspresji chimerycznych cząsteczek polipeptydu opisane niniejszym, można stosować w diagnozowaniu schorzeń.
W innych postaciach realizacji, manipulowanie chimerycznymi cząsteczkami polipeptydu lub agonistami albo antagonistami, które wiążą chimeryczne cząsteczki polipeptydu, można wykorzystać przy leczeniu chorób. W dodatkowych postaciach realizacji, chimeryczne cząsteczki polipeptydu wykorzystuje się jako czynnik blokujący wiązania czynnika wiążącego z jego celem.
Przykładowo, lecz nie ograniczając, sposób według wynalazku może być użyteczny przy leczeniu stanów klinicznych, charakteryzujących się przepuszczalnością naczyń, obrzękiem lub zapaleniem, tak jak obrzęk mózgu związany z uszkodzeniem, udar lub nowotwór; obrzęk związany ze schorzeniami zapalnymi, takimi jak łuszczyca lub zapalenie stawów, włączając reumatoidalne zapalenie stawów; astmę; obrzęk ogólny związanych z oparzeniami; płyn puchlinowy i wysięk opłucnej związany z nowotworami, zapaleniem lub urazem; przewlekłe zapalenie dróg oddechowych; zespół wyciekania kapilarnego; posocznica; choroby nerek związane ze zwiększonym wyciekiem białka; i schorzenia oczu, takie jak degeneracja plamki związana z wiekiem i retinopatia cukrzycowa.
Analiza sekwencji aminokwasowej Flt1(1-3)-Fc ujawniła obecność niezwykle wysokiej liczby (46) reszt aminokwasu zasadowego, lizyny. Analiza IEF Flt1(1-3)-Fc wykazała, że to białko posiada pl ponad 9,3, potwierdzając założenie, że białko jest bardzo zasadowe. Zakładano, że zasadowy charakter białka Flt1(1-3)-Fc powodował wiązanie z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi i że ta interakcja mogła być powodem niezwykle krótkiego wykrywanego w krążącej surowicy okresu półtrwania wykazywanego przez Flt1(1-3)-Fc, po wstrzyknięciu myszom. Aby przetestować tę hipotezę,
PL 208 247 B1 białko Flt1(1-3)-Fc acetylowano przy resztach lizyny, aby zmniejszyć ładunek zasadowy. Acetylowane Flt1(1-3)-Fc testowano następnie w testach opisanych poniżej.
Następujące przykłady przedstawia się w celu zilustrowania, a nie w celu ograniczenia.
P r z y k ł a d y
P r z y k ł a d 1: Ekspresja białka Flt1(1-3)-Fc w komórkach CHO K1.
Stosując standardowe techniki biologii molekularnej (zobacz np. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, i inni, Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (wydawcy Ausubel, i inni, Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY), gen kodujący Flt1(1-3)-Fc wprowadzano do wektora ekspresji pEE14.1 (Lonza Biologics, plc) w miejscach wielokrotnego kloningu w dół od promotora CMV. Komórki K1 CHO transfekowano konstrukcją DNA pEE14,1/Flt1(1-3)-Fc przy użyciu lipofektaminy (Gaithersburg, MD). Transfekowane komórki CHO K1 hodowano DMEM pozbawionym glutaminy (JRH, Kansas City, MO) zawierającym 25 μM sulfoksyiminy metioniny (MSX) od Sigma Inc., St.Louis, MO, i otrzymywano komórki wykazujące ekspresję wysoce rekombinowanego białka, przez skrining supernatantów komórek OHO K1 od ponad 100 ręcznie zbieranych izolatów kolonii, przy użyciu standardowego testu immunologicznego, który chwyta i wykrywa ludzki Fc.
Wyselekcjonowany, ręcznie zebrany klon powielano w obecności 100 μM MSX po czym następowało drugie okrążenie skriningu powielonych klonów. Najbardziej produktywny klon miał specyficzną produktywność rekombinowanego białka Flt1(1-3)-Fc wynoszącą 55 pg/komórkę/dzień.
Wybrany klon namnażano w kolbach T o objętości 225 cm2 (Corning, Acton, MA) i następnie do 8,5 litrowych butelek obrotowych (Corning, Acton, MA), stosując pożywki hodowlane opisywane powyżej. Komórki usuwano z obrotowych butelek przez standardową trypsynizację i wkładano do 3,5 litrowych z pożywką w zawiesinie. Pożywka w zawiesinie składa się z pozbawionej glutaminy pożywki ISCHO (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) zawierającej 5% surowicę płodu bydlęcego (FBS od Hyclone Labs, Logan, UT), 100 μM MSX i suplement GS (JRH Scientific, Kansas City, MO) w 5 litrowym bioreaktorze Celligen (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ), przy gęstości wynoszącej 0,3 x 106 komórek/ml. Po osiągnięciu przez komórki gęstości wynoszącej 3,6 x 106/ml i dostosowaniu do zawiesiny, zostały one przeniesione do 60 litrowego bioreaktora (ABEC, Allentown, PA) przy gęstości wynoszącej 0,5 x 106 komórek/ml w 20 litrach pożywki ISCHO z 5% płodowej surowicy bydlęcej. Po dwóch dniach do bioreaktora dodawano dodatkowe 20 litrów ISCHO + 5% płodowej surowicy bydlęcej. Komórki pozostawiono do wzrostu na dodatkowe dwa dni, osiągając gęstość końcową wynoszącą 3,1 x 106 komórek/ml, a końcowe stężenie Flt1(1-3)-Fc przy zbiorze wnosiło 95 mg/L. Przy zbiorze komórki usuwano przez filtrację z przepływem stycznym, stosując Prostak Filters (Millipore, Inc., Bedford, MA) o średnicy 0,45 nm.
P r z y k ł a d 2: Oczyszczanie białka Flt1(1-3)-Fc otrzymanego z komórek CHO K1
Białko Flt1(1-3)-Fc oczyszczano początkowo przez chromatografię powinowactwa. Do wiązania części Fc cząsteczki z wysoką specyficznością, stosowano kolumnę Protein A. To oczyszczone przez pownowactwo białko zatężano następnie i przepuszczano przez kolumnę SEC. Białko wymywano potem do buforu preparatu. To, co następuje opisuje szczegółowo te procedury.
Materiały i metody
Wszystkie substancje chemiczne pochodzą od J.T. Baker, Phillipsburg, NJ z wyjątkiem PBS, którą otrzymano w postaci 10X koncentratu od Life Technologies, Gaithersburg, MD. Żywice Protein A Fast Flow i Superdex 200 klasy przygotowawczej otrzymywano od Pharmacia, Piscataway, NJ. Sprzęt i błony do zatężania białka otrzymywano od Millipore, Bedford, MA.
Około 40 litrów filtrowanych przez 0,45 μm kondycjonowanych pożywek CHO zawierających białko Flt1(1-3)-Fc, nakładano na 290 ml kolumnę Protein A Fast Flow (10 cm średnicy), którą zrównoważono PBS. Kolumnę przemywano PBS zawierającą 350 mM NaCl i 0,02% CHAPS, związane białko wymywano 20 mM Citric Acid zawierającym 10 mM Na2HPO4. Zbierano pojedynczy pik elucji i jego pH podnoszono do zobojętnienia, stosując 1M NaOH. Wymyte frakcje zatężano do około 9 mg/ml przy użyciu 10K regenerowanych błon celulozowych, zarówno przez filtrację z przepływem stycznym, jak i przez zatężanie komórek z mieszaniem. Aby usunąć agregaty i inne zanieczyszczenia, zatężone białko nakładano na kolumnę upakowaną żywicą Superdex 200 klasy przygotowawczej (10 cm x 55 cm) i uruchamiano w PBS zawierającej 5% glicerol. Frakcje głównego piku zlewano, filtrowano jałowo, dzielono na równe objętości i przechowywano w temperaturze -80°C.
P r z y k ł a d 3: Acetylowanie białka Flt1(1-3)-Fc.
Dwa miligramy białka Flt1(1-3)-Fc poddano acetylowaniu jak opisano w podręczniku dostarczonym z zestawem do modyfikacji sulfo-NHS-octan (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, nr katalogowy 26777).
PL 208 247 B1
P r z y k ł a d 4: Charakteryzacja acetylowanego białka Flt1(1-3)-Fc.
(a.) Analiza IEF: Flt1(1-3)-Fc i acetylowane Flt1(1-3)-Fc analizowano w standardowej analizie IEF. Jak widać w fig. 1, białko Flt1(1-3)-Fc nie jest zdolne do migracji do żelu, a zatem musi posiadać pl ponad 9,3, najwyższe pl) w standardzie. Jednakże, acetylowane Flt1(1-3)-Fc jest zdolne do migracji do żelu i równowagi przy pl wynoszącym około 5,2. Ten wynik pokazuje, że acetylacja zmniejsza dodatni ładunek sieciowy białka, a zatem jego pl, w sposób istotny.
(b.) Wiązanie z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi
Aby przetestować wiązanie z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi, Flt1(1-3)-Fc i acetylowane Flt1(1-3)-Fc testowano w teście zaplanowanym do naśladowania interakcji z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi. W tym teście, 96-studzienkowe płytki do hodowli tkankowej powleka się Matrigel (Biocoat MATRIGEL® 96-studzienkową płytkę z cienką warstwą matrycy, numer katalogowy 40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA). Płytki inkubuje się z różnymi stężeniami albo białka Flt1(1-3)-Fc, acetylowanego Flt1(1-3)-Fc, albo rTie2-Fc (nie istotna kontrola) dodawanymi do studzienek. Płytki inkubuje się przez 1-2 godziny albo w temperaturze pokojowej albo w temperaturze 37°C stopni i następnie wykrywanie związanych białek uzyskuje się przez dodawanie do studzienek wtórnego przeciwciała przeciw ludzkiemu Fc, sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Na koniec, do studzienek dodaje się substrat fosfatazy alkalicznej i mierzy gęstość optyczną. Fig. 2 pokazuje wyniki tego testu. Jako nieistotna kontrola, białko rTie2-Fc, acetylowane Flt1(1-3)-Fc nie wykazuje żadnego wiązania z płytką powleczoną Matrigel, podczas gdy nieacetylowane białko Flt1(1-3)-Fc wykazuje istotne wiązanie. Ten wynik pokazuje, że acetylowanie reszt aminokwasu zasadowego jest skutecznym sposobem zakłócenia interakcji ładunków, które występują między dodatnio naładowanymi białkami i ujemnie naładowanymi składnikami matrycy zewnątrzkomórkowej, wobec których są eksponowane in vivo.
P r z y k ł a d 5: Traktowanie PEG białka Flt1(1-3)-Fc.
Choć traktowanie PEG (glikol polietylenowy - PEG) białek zwiększa, jak się okazało, ich moc in vivo przez wzmocnienie stabilności i biodostępności, minimalizując jednocześnie immunogeniczność (zobacz odniesienia cytowane wyżej), jest sprzeczne z intuicją, że cząsteczki traktowane PEG, które są zbyt duże aby być filtrowane przez kłębuszki nerkowe, poprawiałyby ich właściwości farmakokinetyczne. Bez wiązania się z jakąkolwiek teorią, Zgłaszający uznał, że traktowanie PEG cząsteczek Flt1(1-3)-Fc mogłoby poprawić właściwości farmakokinetyczne, możliwie nie przez zmianę dodatniego ładunku lub zmniejszanie pl Flt1(1-3)-Fc, lecz raczej przez fizyczne osłonięcie ładunków dodatnich przed interakcją z zewnątrzkomórkową matrycą. Zgłaszający zdecydował się na próbę poprawienia właściwości farmakokinetycznych cząsteczek Flt1(1-3)-Fc przez dołączenie nici o 20K PEG jak opisano poniżej.
Materiały metody
Oczyszczone Flt1(1-3)-Fc otrzymane z komórek CHO (patrz powyżej) stosowano w następujących doświadczeniach traktowania PEG. PEG z grupami funkcyjnymi otrzymano od Shearwater Polymers, Huntsville, AL; Bicine od Sigma, St Louis, MO; kolumnę Superose 6 od Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS w postaci 10X koncentratu od Life Technologies, Gaithersburg, MD; Glycerol od J.T. Baker, Phillipsburg, NJ; i żele wstępnego odlewu Bis-Tris od Novex, CA.
Nici 20K PEG funkcjonalizowane z użyciem terminalnych cząstek specyficznych dla amin, stosowano w badaniach nad reakcjami na małą skalę, które podjęto w celu oceny różnych warunków reakcji, w jakiej stechiometria PEG:białko była różnorodna. Na podstawie tych reakcji i analiz próbek na standardowym SDS-PAGE, Flt1(1-3)-Fc przy stężeniu wynoszącym 1,5 mg/ml był poddany reakcji przy pH 8,1 z cząsteczkami 20K SPA-PEG (sukcynoimidylopropionian PEG) przy stosunku molowym PEG do monomeru Flt1(1-3)-Fc, wynoszącym 1:6. Reakcję pozostawiono do przebiegu w temperaturze 8°C przez noc. W celu początkowego oczyszczenia, produkty reakcji nałożono na kolumnę Superose 6 10 mm x 30 cm zrównoważoną PBS zawierającą 5% Glycerol. Kolumna rozdzielała, jak się okazało, cząsteczki Flt1(1-3)-Fc traktowane PEG na podstawie stopnia potraktowania PEG. Frakcje odpowiadające temu, co okazało się być przede wszystkim pojedynczo traktowanym PEG i podwójnie traktowanym PEG dimerycznym Flt1(1-3)-Fc, co oceniono przez wzory prążków na redukujących i nie redukujących żelach SDS-PAGE, zlewano. Stężenie białka określano przez pomiar absorbancji przy 280 nm. Białko Flt1(1-3)-Fc traktowane PEG poddawano jałowej filtracji, dzielono na równe objętości i przechowywano w temperaturze -40°C.
PL 208 247 B1
P r z y k ł a d 6: Wiązanie niezmodyfikowanych, acetylowanych, i traktowanych PEG Flt1(1-3)Fc w teście na bazie Biacore.
Niezmodyfikowane, acetylowane, i traktowane PEG białka Flt1(1-3)-Fc testowano w teście na bazie Biacore, aby ocenić ich zdolność do wiązania z ligandem Flt1, VEGF. W tym teście, niezmodyfikowane białko Flt1(1-3)-Fc unieruchamiano na powierzchni płytki Biacore (patrz Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, pod względem procedur standardowych) i próbkę zawierającą 0,2 μg/ml VEGF i albo niezmodyfikowanego Flt1(1-3)-Fc, acetylowanego Flt1(1-3)-Fc lub traktowanego PEG Flt1(1-3)-Fc (każde w ilości 25 μg/ml) przepuszczano przez płytkę powleczoną Flt1(1-3)Fc. Aby zminimalizować wpływ niespecyficznego wiązania, związane próbki przemywano 0,5 M NaCl. W jednej próbce, niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc wymieszano z heparyną. Heparyna jest cząsteczką ujemnie naładowaną, a białko Flt1(1-3)-Fc jest cząsteczką naładowaną dodatnio, więc gdy dwie cząsteczki miesza się razem, powinny oddziaływać przez swe odpowiednie ładunki. To zasadniczo zobojętnia właściwy ładunek dodatni Flt1(1-3)-Fc powodując, że cząsteczka zachowuje się jakby była chemicznie lub genetycznie zmodyfikowana, tak aby zredukować jej ładunek i jej tendencję do wiązania poprzez interakcje ładunkowe. Jak widać w fig. 3, wszystkie acetylowane (kolumny 13-16), traktowane PEG (kolumny 17-20), i traktowane heparyną Flt1(1-3)-Fc (kolumny 21-24) są zdolne do pełnego współzawodnictwa ze związanym z płytką Biacore Flt1(1-3)-Fc, w celu związania VEGF w porównaniu z białkiem kontrolnym (kolumny 1-4) i nieistotnym (kolumny 5-8). Niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc (kolumny 5-6), jak się okazało, tylko częściowo współzawodniczyły ze związanym z płytką Biacore Flt1(1-3)-Fc w celu wiązania VEGF. Jednakże, przemycie związanych próbek 0,5M NaCl (kolumny 7-8) dało w wyniku profil wiązania podobny do zmodyfikowanych postaci Flt1(1-3)-Fc, pokazując, że niezmodyfikowane białko wykazywało nie specyficzne wiązanie z płytką, które możnabyło wyeliminować przez przemycie solą.
P r z y k ł a d 7: Wiązanie niezmodyfikowanego, acetylowanego, i traktowanego PEG Flt1(1-3)Fc w teście na bazie ELISA.
Niezmodyfikowane, acetylowane, i traktowane PEG białka Flt1(1-3)-Fc testowano w standardowym teście na bazie ELISA, aby ocenić ich zdolność do wiązania liganda receptora Flt1, VEGF. Jak widać w fig. 4, zarówno traktowane PEG jak i acetylowane białka Flt1(1-3)-Fc są zdolne do wiązania z VEGF, pokazując, że modyfikując białko albo przez traktowanie PEG lub acetylowanie nie niszczy jej zdolności do wiązania jej liganda.
P r z y k ł a d 8: Farmakokinetyczna analiza niezmodyfikowanych Flt1(1-3)-Fc, acetylowanych Flt(1-3)-Fc i traktowanych PEG Flt1(1-3)-Fc.
Zaplanowano doświadczenia in vivo, aby oszacować farmakokinetyczne profile niezmodyfikowanego Flt1(1-3)-Fc, acetylowanego Flt1(1-3)-Fc, i traktowanego PEG białko Flt1(1-3)-Fc. Myszom Balb/c (23-28 g; 3 myszy/grupę) wstrzykiwano podskórnie 4 mg/kg niezmodyfikowanego, acetylowanego lub traktowanego PEG Flt1(1-3)-Fc. Myszom pobierano krew z ogona po 1, 2, 4, 6, 24 godzinach, 2 dniach i 3 dniach po iniekcji białka. Surowice testowano w standardowym teście na bazie ELISA przeznaczonym do wykrywania białka Flt1(1-3)-Fc. W skrócie, test obejmuje powlekanie płytki ELISA VEGF, wiązanie surowic zawierających niezmodyfikowane, acetylowane, lub traktowane PEG Flt1(1-3)-Fc- i łączenie z przeciwciałem anty-Fc sprzężonym z fosfatazą alkaliczną. Jak widać w fig. 5, Tmax dla wszystkich białek Flt1(1-3)-Fc znajdował się między 6 godzinami i 24 godzinami. Cmax dla różnych białek był następujący: niezmodyfikowane: 0,06 μ/ml - 0,15 μg/ml; acetylowane: 1,5 μg/ml - 4,0 μg/ml; i traktowane PEG: około 5 μg/ml,
P r z y k ł a d 9: Etapowe acetylowanie Flt1(1-3)-Fc
Aby określić jaka minimalna ilość acetylowania jest konieczna do eliminacji wiązania z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi, zaplanowano doświadczenie, które podowało acetylowanie białka Flt1(1-3)-Fc w sposób etapowy, z użyciem zwiększających się ilości molowego nadmiaru odczynnika acetylującego w acetylującej mieszaninie reakcyjnej. Zakres nadmiaru molowego był następujący: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, i 100 moli odczynnika acetylującego na 1 mol monomeru Flt1(1-3)-Fc. Reakcje przeprowadzano, tak jak wyszczególniono w instrukcji dostarczonej z zestawem do modyfikacji sulfo-NHS-Acetate (Pierce Chemical Co., Rockford, II, numer katalogowy 26777).
P r z y k ł a d 10: Charakteryzacja etapowo acetylowanego Flt1(1-3)-Fc.
(a.) Analiza IEF. Niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc i etapowo acetylowane białka Flt1(1-3)-Fc analizowano standardową analizę IEF. Jak widać w fig. 6A-6B, niezmodyfikowane białko Flt1(1-3)-Fc nie było zdolne do migracji do żelu, z powodu jego niezwykle wysokiego pl (ponad 9,3). Jednakże, więkPL 208 247 B1 szość etapowo acetylowanych próbek Flt1(1-3)-Fc (próbki 30-100-krotnym nadmiarze molowym) były zdolne do migracji do żelu i do równowagi przy pl w zakresie między 4,55 - 8,43, w zależności od stopnia acetylowania białka. Ten wynik pokazuje, że acetylowanie może zmienić dodatni ładunek białka w sposób zależny od dawki i że redukcja pl może być kontrolowana przez kontrolę stopnia acetylowania.
(b.) Wiązanie etapowo acetylowanego Flt1(1-3)-Fc ze składnikami matrycy zewnątrzkomórkowej
Aby przetestować wiązanie z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi, Flt1(1-3)-Fc i etapowo acetylowane Flt1(1-3)-Fc testowano w wyżej opisanym teście zaplanowanym do naśladowania interakcji ze składnikami matrycy zewnątrzkomórkowej. Do studzienek dodawano zmieniające się stężenia albo niezmodyfikowanego białka Flt1(1-3)-Fc, etapowo acetylowanego Flt1(1-3)-Fc (próbki z 10, 20, i 30-krotnym nadmiarem molowym), albo rTie2-Fc (nieistotna kontrola). Płytki inkubowano przez 1-2 godziny w temperaturze pokojowej lub w temperaturze 37°C i następnie wykrywanie związanego białka uzyskiwano przez dodanie do studzienek wtórnego przeciwciała przeciw ludzkiemu Fc, sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Następnie do studzienek dodawano substrat fosfatazy alkalicznej i mierzono gęstość optyczną. Fig. 7 pokazuje wyniki tego testu. Podobnie jak nieistotna kontrola białko rTie2-Fc, etapowo acetylowane Flt1(1-3)-Fc (próbki z 20 i 30-krotnym nadmiarem molowym) nie wykazywały żadnego istotnego wiązania z płytką powlekaną Matrigel, podczas gdy nieacetylowane białko Flt1(1-3)-Fc wykazywało istotne wiązanie. Wiązanie jest możliwe do wysycenia, wskazując, że wiązanie białka Flt1(1-3)-Fc może być wiązaniem raczej ze specyficznymi miejscami, niż bardziej ogólną interakcją za pośrednictwem ładunku, która może nie być możliwa do wysycenia. Próbka z 10-krotnym nadmiarem molowym wykazała zredukowane wiązanie, lecz stopień acetylowania nie był wystarczający do całkowitego zablokowania wiązania z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycy. Próbki z 20 krotnym nadmiarem molowym i wyżej obrazowały brak wykrywalnego wiązania, mimo faktu, że w analizie IEF (fig. 6A i 6B) próbki z niższym nadmiarem molowym wciąż miały wielki dodatni ładunek sieciowy. Ten wynik pokazuje, że nie jest konieczne całkowite acetylowanie wszystkich dostępnych aminokwasów zasadowych w celu eliminacji wiązania z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi.
(c.) Wiązanie etapowo acetylowanych Flt1(1-3)-Fc w teście na bazie Biacore.
Niezmodyfikowane i etapowo acetylowane białka Flt1(1-3)-Fc testowano w teście na bazie Biacore, aby ocenić ich zdolność do wiązania z ligandem Flt1, VEGF. W tym teście, niezmodyfikowane białko Flt1(1-3)-Fc (0,5, 1,0 lub 5,0 μg/ml) unieruchamiano na powierzchni płytki Biacore (patrz Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, pod względem procedur standardowych) i roztwór zawierający 0,2 μg/ml VEGF oraz albo niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc (w ilości albo 0,5, 1,0 albo 5,0 μg/ml) albo 10 różnych próbek etapowo acetylowanego Flt1 (1 -3)-Fc (w ilości 0,5, 1,0 lub 5,0 μg/ml każda) przepuszczano przez płytkę powleczoną Flt1 (1-3)-Fc. Jak widać w fig. 8, przy stosunku sub-stechiometrycznym (0,5 μg/ml albo niezmodyfikowanego Flt1 (1-3) albo etapowo acetylowanego Flt1(1-3)-Fc przeciwko 0,2 μg/ml VEGF), występuje nie wystarczająco dużo Flt1(1-3)-Fc (albo niezmodyfikowane albo etapowo acetylowane) w roztworze, do pełnego związania VEGF. Przy ilości 1,0 μg/ml, która zbliża się do stosunku stechiometrycznego 1:1, zarówno niezmodyfikowane jak i etapowo acetylowane Flt1(1-3)-Fc są bardziej zdolne do współzawodniczenia pod względem wiązania VEGF, lecz wciąż jest nie wystarczająco dużo białka Flt1(1-3)-Fc (albo niezmodyfikowanego lub etapowo acetylowanego) do całkowitego związania dostępnego VEGF. Jednakże, w ilości 5,0 μg/ml, która jest kilka razy większa niż stosunek stechiometryczny 1:1, zarówno Flt1(1-3)-Fc jak i etapowo acetylowane białka Flt1(1-3)-Fc są zdolne do wiązania VEGF, bez względu na stopień acetylowania. Pokazuje to wyraźnie, że acetylacja nie zmienia zdolności Flt1(1-3)-Fc's do wiązania VEGF.
(d.) Analiza farmakokinetyczna etapowo acetylowanego Flt1(1-3)-Fc
Zaplanowano doświadczenia in vivo aby oszacować profil farmakokinetyczny niezmodyfikowanego Flt1(1-3)-Fc i etapowo acetylowanego białka Flt1(1-3)-Fc. Myszom Balb/c (23-28 g) wstrzykiwano podskórnie 4 mg/kg niezmodyfikowanego lub próbek etapowo acetylowanych Flt1(1-3)-Fc z 10, 20, 40, 60 i 100-krotnym nadmiarem molowym (3 myszy dla próbek niezmodyfikowanego, z 10, 20 i 40krotnym nadmiarem molowym i 2 myszy dla próbek z 60 i 100-krotnego nadmiaru molowego). Myszom pobierano krew z ogona po 1, 2, 4, 6, 24 godzinach, 2 dniach i 3 dniach po iniekcji. Surowice testowano w teście na bazie ELISA przeznaczonym do wykrywania Flt1(1-3)-Fc (opisane powyżej). Fig. 9 wyszczególnia wyniki tego badania. Tmax dla wszystkich testowanych białek Flt1(1-3)-Fc był w 6 godzinie lecz Cmax był następujący: niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc: 0,06 μg/ml; próbka z 10-krotnym nadmiarem molowym: - 0,7 μg/ml, próbka z 20 krotnym nadmiarem molowym - 2 g/ml, próbka
PL 208 247 B1 z 40-krotnym nadmiarem molowym - 4 μg/ml, próbka z 60-krotnym nadmiarem molowym - 2 μg/ml, próbka ze 100-krotnym nadmiarem molowym - 1 μg/ml. Wyniki te pokazują, że acetylowanie lub traktowanie PEG Flt1(1-3)-Fc istotnie poprawia jego profil farmakokinetyczny.
P r z y k ł a d 11: Konstrukcja mutanta Flt1(1-3)-Fc z delecją regionu zasadowego oznaczonego Mut1: Fltk1-3'..B)-Fc.
Na podstawie obserwacji, że acetylowane Flt1(1-3)-Fc, które posiada pl poniżej 6, posiada znacznie lepsze właściwości farmakokinetyczne niż wysoce dodatnie niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc (pl > 9,3), powstało pytanie, czy różnicę we właściwościach farmakokinetycznych możnaby przypisać ładunkowi sieci białka, która czyniła je lepkim w stosunku do ujemnie naładowanych zewnątrzkomórkowych składników matrycowych, lub czy może istniały specyficzne położenia na powierzchni białka Flt1(1-3)-Fc, co stanowiło specyficzne miejsca wiązania dla zewnątrzkomórkowych składników matrycowych. Przykładowo, o wielu białkach wiadomo, że posiadają miejsca wiązania heparyny, często składające się z ugrupowania reszt zasadowych. Czasami reszty te znajdują się w ugrupowaniu w pierwszorzędowej sekwencji białka; niektóre publikacje zidentyfikowały „sekwencje konsensusowe dla takich miejsc wiązania heparyny (patrz np. Hileman, i inni, 1998, Bioessays 20(2):156-67). W innych przypadkach, znana struktura kryształu białka ujawnia ugrupowanie dodatnio naładowanych reszt na powierzchni białka, lecz reszty pochodzą z różnych regionów sekwencji pierwszorzędowej i tylko zbliżają się podczas fałdowania białka do jego struktury trzeciorzędowej. Tak więc, trudno jest wywnioskować, czy izolowana reszta aminokwasowa tworzy część ugrupowania reszt zasadowych na powierzchni białka. Jednakże, jeśli występuje ugrupowanie dodatnio naładowanych reszt aminokwasowych w sekwencji pierwszorzędowej, jest nierozsądnie przypuszczać, że reszty występują przestrzennie blisko siebie i mogłyby być zatem częścią miejsca wiązania zewnątrzkomórkowych składników matrycowych. Receptor Flt1 został gruntownie przebadany i opisane zostały różne domeny (patrz np. Tanaka i inni, 1997, Jpn. J. Cancer Res 88:867-876). Odnośnie sekwencji kwasu nukleinowego i aminokwasowej przedłożonej w fig. 10A-10D tego zgłoszenia, można zidentyfikować sekwencję wydzielniczą, która położona na początku sekwencji i rozciąga się do glicyny kodowanej przez nukleotydy 76-78. Dojrzałe białko rozpoczyna się Ser-Lys-Leu-Lys, zaczynając przy nukleotydzie 79 sekwencji kwasu nukleinowego. Domena 1 Flt1 Ig rozciąga się od nukleotydu 79 do 393, kończąc się na aminokwasach Ser-Asp-Thr. Domena 2 Flt1 Ig rozciąga się od nukleotydu 394 do 687 (kodując Gly-Arg-Pro do Asn-Thr-Ile), i domena 3 Flt1 Ig rozciąga się od nukleotydów 688 do 996 (kodując Ile-Asp-Val do Asp-Lys-Ala). Występuje mostkująca sekwencja aminokwasowa, Gly-Pro-Gly, kodowana przez nukleotydy 997-1005, po niej następuje sekwencja nukleodytowa kodująca ludzki Fc (nukleotydy 1006-1701 lub aminokwasy Glu-Pro-Lys do Pro-Gly-Lys-stop).
Bardziej szczegółowa analiza sekwencji aminokwasowej Flt1 ujawnia, że występuje ugrupowanie, mianowicie, reszty aminokwasowe 272-281 (KNKRASVRR) z fig. 10A-10D, w której 6 z 10 reszt aminokwasowych jest zasadowych. Ta sekwencja jest położona w domenie 3 Flt1 Ig receptora (patrz fig. 11), która sama nie jest zasadnicza dla wiązania liganda VEGF, lecz która przyczynia się do wyższego powinowactwa wiązania z ligandem. Uszeregowanie sekwencji domeny 3 Ig z tą domeny 2 Ig ujawnia, że w tym regionie, występuje bardzo słabe uszeregowanie między dwoma domenami Ig, i że istnieje około 10 dodatkowych aminokwasów w domenie 3 Ig. Analiza profili hydrofobowości (program komputerowy MacVector) tych dwóch domen, wyraźnie wskazuje obecność regionu hydrofilowego w białku (fig. 12A-12B). Obserwacje te podniosły możliwość, że rzeczywista trójwymiarowa konformacja domeny 3 Flt1 Ig pozwalała na pewien rodzaj uwypuklenia, którego nie ma w domenie 2 Flt1 Ig. Aby przetestować tę hipotezę, 10 dodatkowych aminokwasów deletowano i uzyskane białko testowano aby zobaczyć, czy delecja wpłynie na właściwości farmakokinetyczne, korzystnie bez poważnego narażania powinowactwa receptora względem VEGF. Tę konstrukcję DNA, którą skonstruowano stosując standardowe techniki biologii molekularnej (patrz np. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, i inni, Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (wydawcy Ausubel, i inni, Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY) w wektorze ekspresji ssaka pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA), cytuje się jako Mut1 :Flt1 (1-3',B)-Fc. Konstrukcję Mut1: Flt1(1-3^)-Fc otrzymano od Flt1 (1-3)-Fc, przez delecję nukleotydów 814-843 (przedłożonych w fig. 10A-10D), co usuwa wysoce zasadową 10-aminokwasową sekwencję reszt Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg z domeny 3 Flt1 Ig.
Końcową konstrukcję DNA weryfikowano pod względem sekwencji przy użyciu sekwenatora DNA ABI 373A i Taq Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekwencja Mut1:Flt1(1-3^)-Fc jest przedłożona w fig. 13A-13D.
PL 208 247 B1
P r z y k ł a d 12: Konstrukcja mutanta Flt1(1-3)-Fc z delecją regionu zasadowego, oznaczonego Mut2: Flt1(2-3 .B)-Fc
Drugą konstrukcję mutanta delecyjnego, oznaczonego Mut2: Flt1(2-3 .B)-Fc, otrzymano od konstrukcji Mut1:
Flt1(1-3 .B)-Fc przez delecję domeny 1 Flt1 Ig kodowanej przez nukleotydy 79-393 (patrz fig. 10A-10D); dla wygody, nukleotydy 73-78 (TCA GGT) zmieniono na TCC GGA. Wprowadziło to miejsce restrykcyjne (BspE1) bez zmiany towarzyszącej sekwencji aminokwasowej, Ser-Gly. Tę konstrukcję DNA, którą skonstruowano stosując standardowe techniki biologii molekularnej (patrz np. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, i inni, Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (wydawcy Ausubel, i inni, Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY) w wektorze ekspresji ssaka pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA), także poddano weryfikacji pod względem sekwencji przy użyciu sekwenatora DNA ABI 373A i Tag Dideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekwencja Mut2: Flt1(2-3^)-Fc jest przedłożona w fig. 14A-14C.
P r z y k ł a d 13: Konstrukcja mutanta delecyjnego Flt1(1-3)-Fc oznaczonego Mut3: Flt1(2-3)-Fc.
Skonstruowano trzecią konstrukcję mutanta delecyjnego, oznaczonego Mut3: Flt1(2-3)-Fc, w taki sam sposób jak konstrukcję Mut2: Flt1(2-3^)-Fc, z wyjątkiem tego, że domenę 3 Flt1 Ig pozostawiono nieuszkodzoną (region zasadowych aminokwasów nie został deletowany). Konstrukcję skonstruowano stosując standardowe techniki biologii molekularnej i końcową konstrukcję weryfikowano pod względem sekwencji, jak opisano powyżej. Sekwencja Mut3: Flt1(2-3)-Fc jest przedłożona w fig. 15A-15C.
P r z y k ł a d 14: Konstrukcja mutanta Flt(1-3)-Fc z N-glikozylacją regionu zasadowego, oznaczonego Mut4: Flt1(1-3R ,N)-Fc.
Wykonano końcową konstrukcję, w której wprowadzono miejsce N-glikozylacji do środka regionu zasadowego domeny 3 Ig Flt1. Konstrukcje tę oznaczono Mut4: Flt1 (1-3R ,N)-Fc i wykonano ją przez zmianę nukleotydów 824-825 z GA na AC, w konsekwencji zmieniając kodowaną resztę Arg (AGA) na resztę Asn (AAC) (patrz fig. 10A-10D). Otrzymana sekwencja aminokwasowa jest zatem zmieniona z Arg-Ala-Ser na Asn-Ala-Ser, która pasuje do kanonicznego sygnału (Asn-Xxx-Ser/Thr) pod względem dodania miejsca N-glikozylacji przy reszcie Asn. Sekwencja Mut4: Flt1(1-3R,N)-Fc jest przedłożona w fig. 16A-16D.
P r z y k ł a d 15: Charakteryzacja acetylowanych mutantów Flt1(1-3)-Fc, Mut1; Flt1(1-3^)-Fc i Mut4: Flt1(1-3R,N)-Fc (a.) Wiązanie z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi
Aby określić, czy trzy zmodyfikowane białka mniej lub bardziej prawdopodobnie posiadały poprawione właściwości farmakokinetyczne, 96-studzienkowe płytki powleczone Matrigel (jak opisano powyżej) inkubowano ze zmieniającymi się stężeniami zmutowanych białek i wykrywano z użyciem przeciwciał przeciw-ludzkiemu Fc/sprzężonego z fosfatazą alkaliczną. Jak widać w fig. 18, doświadczenie to pokazało, że gdy niezmodyfikowane białko Flt1(1-3)-Fc mogło wiązać się chciwie z tymi studzienkami, białko Mut3:Flt1(2-3)-Fc wiązało nieco słabiej, białko Mut1:Flt1(1-3^)-Fc wiązało jeszcze słabiej, a białko Mut2:Flt1(2-3^)-Fc wykazywało najlepszy profil, wiążąc słabiej niż każde z innych zmutowanych białek. Białko zmutowane pod względem glikozylacji Mut4: Flt1(1-3R,N)-Fc wykazywało tylko marginalną korzyść w teście Matrigel. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że liniowa sekwencja dodatnich aminokwasów może być deletowana z sekwencji pierwszorzędowej, dając w wyniku zmniejszenie interakcji ładunków z zewnątrzkomórkowymi składnikami matrycowymi.
(b.) Wiązanie Mut1:Flt1(1-3^)-Fc i Mut4: Flt1(1-3R ,N)-Fc w teście na bazie Biacore.
Niezmodyfikowane i acetylowane Flt1(1-3)-Fc i genetycznie zmodyfikowane białka Mut1:Flt1(1-3^)=Fc i Mut4: Flt1(1-3R ,N)-Fc testowano w teście na bazie Biacore aby ocenić ich zdolność do wiązania z ligandem Flt1, VEGF. W tym teście, niezmodyfikowane białko Flt1(1-3)-Fc (0,25, 0,5, lub 1,0 μg/ml) unieruchamiano na powierzchni płytki Biacore (patrz Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, pod względem procedur standardowych) i roztwór zawierający 0,1 μg/ml VEGF i supernatant albo oczyszczony albo z komórkami COS, zawierający niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc (w ilości około (0,25, 0,5, lub 1,0 μg/ml), oczyszczone acetylowane Flt1 (1-3)-Fc (w ilości (0,25, 0,5, lub 1,0 μg/ml), supernatant z komórkami COS zawierający Mut1 :Flt1 (1 -3^)-Fc (w ilości około (0,25, 0,5, lub 1,0 μg/ml), lub supernatant z komórkami COS zawierający Mut4: Flt1(1-3R ,N)-Fc (w ilości około (0,25, 0,5, lub 1,0 μg/ml) przepuszczano przez płytkę powlekaną Flt1(1-3)-Fc. Jak widać w fig. 17, w stosunku substechiometrycznym (0,25 μg/ml niezmodyfikowanych, acetylowanych lub
PL 208 247 B1 genetycznie zmodyfikowanych próbek Flt1(1-3)-Fc przeciwko 01. μg/ml VEGF), występuje nie wystarczająca ilość białka Flt1(1-3)-Fc do blokowania wiązania VEGF z Flt1(1-3)-Fc unieruchomionym na płytce Biacore. W ilości 0,5 μg/ml niezmodyfikowanego, acetylowanego lub genetycznie zmodyfikowanego białka Flt1(1-3)-Fc, stosunek stechiometryczny zbliża się do 1:1 i występuje zwiększona zdolność do blokowania wiązania VEGF z płytką Biacore. W ilości 1,0 μg/ml niezmodyfikowanych, acetylowanych lub genetycznie zmodyfikowanych białek Flt1(1-3)-Fc, która stanowi około 10:1 stosunku stechiometrycznego, białka Flt1(1-3)-Fc są zdolne do blokowania wiązanie VEGF z płytką Biacore, lecz nie są one równoważne. Niezmodyfikowane, acetylowane i Mut1 :Flt1(1-3AB)-Fc są zasadniczo równoważne pod względem zdolności do blokowania wiązania VEGF, podczas gdy Mut4: Flt1-(1-3R ,N)-Fc jest nieco mniej skuteczne przy blokowaniu wiązania. Wyniki te potwierdzają hipotezę, że możliwa jest redukcja niespecyficznego wiązania dodatnio naładowanej cząsteczki, przez genetyczne usunięcie liniowej sekwencji przede wszystkim ujemnie naładowanych aminokwasów.
(c.) Wiązanie Mut1:Flt1(1-3)^-Fc, Mut2: Flt1(2-3^)-Fc, Mut3: Flt1(2-3)-Fc i w teście na bazie ELISA.
Aby określić, czy trzy zmutowane białka mogłyby wiązać ligand Flt1, VEGF, przeprowadzano doświadczenia wiązania, w których 96-studzienkowe płytki powleczone VEGF inkubowano z rozmaitymi stężeniami odpowiedniego zmutowanego białka i po przemyciu, wykrywano związaną ilość, przez inkubację z przeciwciałem przeciw ludzkiemu Fc sprzężonym z fosfatazą alkaliczną i oceniano ilościowo kolorymetrycznie dodając odpowiedni substrat fosfatazy alkalicznej. Jak widać w fig. 19, doświadczenie to pokazało, że wszystkie zmutowane białka mogły wiązać VEGF podobnie, przy testowanych stężeniach.
P r z y k ł a d 16: Analiza farmakokinetyczna acetylowanego Flt1(1-3)-Fc, Mut1:Flt1(1-3^)-Fc i niezmodyfikowanego Flt1(1-3)-Fc.
Zaplanowano doświadczenia in vivo aby oszacować profile farmakokinetyczne niezmodyfikowanego białka Flt1(1-3)-Fc, Mut1:Flt1(1-3^)-Fc, i acetylowanego Flt1(1-3)-Fc o 40 krotnym nadmiarze molowym. Myszom Balb/c (25-30 g) wstrzykiwano podskórnie 4 mg/kg niezmodyfikowanych białek Flt1 (1 -3)-Fc, acetylowanych Flt1(1-3)-Fc z 40-krotnym nadmiarem molowym i Mut1 :Flt1(1-3AB)-Fc (4 myszy każde). Myszom tym pobierano krew z ogona po 1, 2, 4, 6, 24 godzinach, 2 dniach, 3 dniach i 5 dniach po iniekcji. Surowice testowano w ELISA przeznaczonym do wykrywania białka Flt1(1-3)-Fc, który obejmuje powlekanie na płytce ELISA VEGF, wiązanie Flt1(1-3)-Fc i kontaktowanie z przeciwciałem anty-Fc sprzężonym z fosfatazą alkaliczną. Jak widać w fig. 20, Cmax dla tych odczynników był następujący: niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc - 0,15 μg/ml; acetylowane Flt1(1-3)-Fc z 40-krotnym nadmiarem molowym - 1,5 μg/ml; i Mut1:Flt1(1-3^)-Fc - 0,7 μg/ml.
P r z y k ł a d 17: Konstruowanie wektora zmodyfikowanego receptora Flt1
Przesłanki do skonstruowania zmodyfikowanych wersji receptora Flt1 (znanego także jako VEGFR1) opierano o obserwacje, że sekwencja białkowa Flt1 jest wysoce zasadowa, a zatem prawdopodobnie przyklejała się do matrycy zewnątrzkomórkowej (ECM). Wysoce zasadowy charakter Flt1 prawdopodobnie tłumaczy, dlaczego niezmodyfikowane Flt1(1-3)-Fc (opisane powyżej) posiada słabe włsciwości farmakokinetyczne, które czynią go trudnym w użyciu jako środka terapeutycznego. Jak opisano powyżej, chemicznie zmodyfikowana postać acetylowanego z 40-krotnym nadmiarem molowym Flt1(1-3)-Fc, w niniejszym potem określanego jako A40, wykazywała w wielkim stopniu poprawiony profil właściwości farmakokinetycznych (PK) w stosunku do nie acetylowanego Flt1(1-3)-Fc. Zatem, przedsięwzięto próby wykonania cząsteczki DNA, którą możnaby stosować rekombinacyjnej ekspresji zmodyfikowanych postaci cząsteczki receptora Flt1, która posiadałaby ulepszony profil PK wykazywany przez A40 i wciąż zachowywałaby zdolność do ścisłego wiązania z VEGF.
Wiadomo z literatury, że pierwsza domena Ig Flt1 (która posiada ładunek sieciowy +5 przy obojętnym pH) nie jest zasadnicza dla ścisłego wiązania z VEGF, więc tę domenę deletowano. Trzecia domena Ig (mająca ładunek sieciowy wynoszący +11) nie jest zasadnicza dla wiązania, lecz przyczynia się do wyższego powinowactwa wobec VEGF niż druga domena Ig, więc zamiast deletowanie jej w całości, zastąpiono ją równoważnymi domenami pokrewnego receptora Flt1, Flk1 (znanego także jako VEGFR2) i Flt4 (znanego także jako VEGFR3). Te chimeryczne cząsteczki (oznaczone R1R2 (FH1.D2.Fik1D3.FoAC1(a) i VEGFR1R2-FcAC1(a) i R1R3 (Flt1D2.VEGFR3D3-FcΔC1(a) i VEGFR1R3-FcΔC1(a) odpowiednio, w niniejszym R1 i Flt1D2 = domena 2 Ig Flt1 (VEGFR1); R2 i Flk1D3 = domena 3 Ig Flk1 (VEGFR2); i R3 i VEGFR3D3 = domena 3 Ig Flt4 (VEGFR3)) znacznie mniej przylegały do ECM, co oceniono przez test wiązania ECM in vitro, jaki opisano poniżej, miały znacznie poprawione PK, jak opisano poniżej. Poza tym, te cząsteczki były zdolne do ścisłego wiązania VEGF,
PL 208 247 B1 jak opisano poniżej i blokowania fosforylacji natywnego receptora Flk1 o ekspresji w komórkach nabłonka, jak opisano poniżej.
(a) Konstrukcja plazmidu ekspresji pFlt1D2.Flk1D3.FcΔClfa)
Plazmidy ekspresji pMT21.Flt1(1-3).Fc (6519 bp) i pMT21.Flk-1(1-3).Fc (5230 bp) są plazmidami, które kodują oporność wobec ampicyliny oraz wersje znakowane Fc domen 1-3 Ig, odpowiednio ludzkiego Flt1 i ludzkiego Flk1. Plazmidy te stosowano do skonstruowania fragmentu DNA obejmującego fuzyjne domeny 2 Ig Flt1 z domeną 3 Ig FIK1, przy użyciu powielania PCR odpowiednich domen Ig po których następowały dalsze okrążenia PCR w celu uzyskania fuzji dwóch domen w pojedynczy fragment. Dla domeny 2 Ig Flt1, primery powielania 5' i 3' były następujące:
5': bsp/flt1D2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')
3': Flt1D2-Flk1D3.as (5'-CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3')
Primer powielania 5' koduje miejsce dla enzymu restrykcyjnego BspE1 w górę od domeny 2 Ig Flt1, określone przez sekwencję aminokwasową GRPFVEM (odpowiadającą aminokwasom 27-33 z fig. 21A-21C). Primer 3' koduje odwrotne uzupełnienie końca 3' domeny 2 Ig Flt1 połączone bezpośrednio z 5' rozpoczynającym domenę 3 Ig Flk1, z punktem fuzji określanym jako TIID Flt1 (odpowiadającym aminokwasom 123-126 z fig. 21A-21C) i ciągnącym się do VVLS (odpowiadając aminokwasom 127-130 z fig. 21A-21C) Flk1.
Dla domeny 3 Ig Flk1, primery powielania 5' i 3' były następujące:
5': Flt1D2-Flk1D3.s (5'-ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATG G-3')
3': Flk1D3/apa/srf.as (5'-GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3')
Primer powielania 5' koduje koniec domeny 2 Ig Flt1 połączony bezpośrednio z początkiem domeny 3 Flk1 Ig, jak opisano powyżej. Primer powielania 3' koduje koniec domeny 3 Ig Flk1, określany przez aminokwasy VRVHEK (odpowiadając aminokwasom 223-228 z fig. 21A-21C), po którym następuje sekwencja mostkująca, która obejmuje sekwencja rozpoznania dla enzymu restrykcyjnego Srfl, i koduje aminokwasy GPG. Sekwencja mostkująca odpowiada aminokwasom 229-231 z fig. 21A-21C.
Po okrążeniu powielania PCR w celu wytworzenia poszczególnych domen, produkty łączono w rurce i poddawano dodatkowemu okrążeniu PCR z primerami bsp/flt1D2 i Flk1D3/apa/srf.as (opisane powyżej) aby wytworzyć produkt fuzyjny. Ten produkt PCR trawiono następnie enzymami restrykcyjnymi BspE1 i Smal i otrzymany fragment o 614bp subklonowano do miejsc restrykcji BspE1 do Srfl wektora pMT21/AB2.Fc, aby utworzyć plazmid pMT21/Flt1D2.Flk1D3.Fc. Sekwencję nukleotydową fuzyjnego insertu genowego Flt1D2-Flk1D3 weryfikowano przez standardową analizę sekwencji. Plazmid ten trawiono następnie enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Srfl i otrzymany fragment o 702bp przenoszono do miejsc restrykcji EcoRI do Srfl plazmidu pFlt1(1-3)B2-FcΔC1(a), wytwarzając plazmid pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a). Pełne sekwencje DNA i wywnioskowane aminokwasowe chimerycznej cząsteczki Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) są przedłożone w fig. 21A-21C.
(b) Konstrukcja plazmidu ekspresji pFlt1D2VEGFR3D3FcΔC1(a)
Plazmid ekspresji pMT21.Flt1(1-3).Fc (6519bp) koduje oporność wobec ampicyliny oraz wersję znakowaną Fc domen 1-3 Ig ludzkiego receptora Flt1. Plazmid ten stosowano do wytworzenia fragmentu DNA zawierającego domenę 2 Ig Flt1 z użyciem PCR. Do wytworzenia domeny 3 Ig Flk1 używano RNA z linii komórkowej HEL921.7, stosując standardową metodologię RT-PCR. Dodatkowe okrążenie powielania PCR stosowano do uzyskania fuzji dwóch domen Ig do pojedynczego fragmentu fuzyjnego. Dla domeny 2 Ig Flt1, primery powielania 5' i 3' były następujące:
5': bsp/flt1D2 (5'-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')
3': Flt1D2.VEGFR3D3.as (TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT)
Primer powielania 5' koduje miejsce restrykcyjne BspE1 w górę od domeny 2 Ig Flt1, określone przez sekwencję aminokwasową GRPFVEM (odpowiadającą aminokwasom 27-33 z fig. 22A-22C). Primer powielania 3' koduje odwrotne uzupełnienie końca domeny 2 Ig Flt1 połączonego bezpośrednio z początkiem domeny 3 Ig VEGFR3, z miejscem fuzji określonym jako TIID Flt1(odpowiadając aminokwasom 123-126 z fig. 22A-22C) i ciągnącą się do IQLL VEGFR3 (odpowiadając aminokwasom 127-130 z fig. 22A-22C).
Dla domeny 3 Ig VEGFR3, primery 5' i 3' użyte do RT-PCR były następujące:
5': R3D3.S (ATCCAGCTGTTGCCCAGGMGTCGCTGGAGCTGCTGGTA)
PL 208 247 B1
3': R3D3.as (ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)
Zarówno primer powielania 5' jak i 3' pasują do sekwencji VEGFR3. Produkt powielenia o 296bp z tej reakcji RT-PCR izolowano standardowymi technikami i poddawano drugiemu okrążeniu PCR aby dodać odpowiednie sekwencje pozwalające na fuzję domen Flt1D2 z FIK1D3 i fuzję domen Flk1D3 i Fc poprzez mostek GPG (patrz poniżej). Primery powielania były następujące:
5': Flt1D2.VEGFR3D3.s (TCATAGATATCCAGCTGrTGCCCAGGMGTCGCTGGAG)
3': VEGFR3D3/srf.as (GATMTGCCCGGGCCATmCATGCACMTGACCTCGGT)
Primer powielania 5' koduje koniec 3' domeny 2 Ig Flt1 połączonym bezpośrednio z początkiem (koniec 5') domeny 3 Ig VEGFR3, jak opisano powyżej. Primer powielania 3' koduje koniec 3' domeny 3 Ig VEGFR3, określony przez aminokwasy VIVHEN (odpowiadające aminokwasom 221-226 z fig. 22A-22C), po których następuje sekwencja mostkująca, która obejmuje sekwencję rozpoznania dla Srfl, i koduje aminokwasy GPG. Sekwencja mostkująca odpowiada aminokwasom 227-229 z fig. 22A-22C.
Po jednym okrążeniu (dla domeny Ig 2 Flt1) lub dwóch okrążeniach (dla domeny 3 Ig Flt4) PCR w celu wytworzenia poszczególnych domen Ig, produkty PCR łączono w rurce i poddawano dodatkowym okrążeniom powieleniu PCR z primerami powielania bsp/flt1D2 i VEGFR3D3/srf.as opisanymi powyżej, aby utworzyć produkt fuzyjny. Ten produkt PCR trawiono następnie enzymami restrykcyjnymi BspE1 i Smal i otrzymany fragment o 625bp subklonowano do miejsc restrykcji BspE1 do Srfl wektora pMT21/Flt1AB2.Fc (opisane powyżej), aby utworzyć plazmid pMT21/Flt1D2.VEGFR3D3.Fc. Sekwencja fuzyjnego insertu genowego Flt1D2-VEGFR3D3, weryfikowano stosując standardowe analizy sekwencji. Plazmid ten trawiono następnie enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Srfl i otrzymany fragment o 693bp subklonowano do miejsc restrykcji EcoRI do Srfl plazmidu pFlt1(1-3)AB2-FcΔC1(a) do wytworzenia plazmid oznaczonego pFlt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). Pełna sekwencja DNA i wywnioskowana sekwencja aminokwasowa chimerycznej cząsteczki Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) jest przedłożona w fig. 22A-22C.
P r z y k ł a d 18: Test wiązania zewnątrzkomórkowej macierzy wiązania (ECM)
Płytki powleczone ECM (Becton Dickinson numer katalogowy 35-4607) uwodniono ciepłym DME uzupełnionym glutaminą (2 mM), 100 jednostkami penicyliny, 100 jednostkami streptomycyny, i 10% BCS przez co najmniej 1 godzinę przed dodaniem próbek. Płytki następnie inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej ze zmieniającymi się stężeniami Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a), zaczynając przy 10 nM z kolejnymi 2-krotnymi rozcieńczeniami w PBS plus 10% BCS. Płytki następnie przemywano 3 razy PBS plus 0,1% Triton-X i inkubowano z przeciwciałem przeciw ludzkiemu Fc sprzężonym z fosfatazą alkaliczną (Promega, 1:4000 w PBS plus 10% BCS) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Płytki przemywano następnie 4 razy PBS 0,1% Triton-X i dodawano mieszaninę bufor fosfatazy alkalicznej/roztwór pNPP (Sigma) w celu wywołania barwy. Płytki odczytywano przy I = 405-570 nm. Wyniki tego doświadczenia są pokazane w fig. 23 i pokazują, że białka Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) są istotnie mniej przylegające do ECM w porównaniu z białkiem Flt1(1-3)-Fc.
P r z y k ł a d 19: Krótkotrwała ekspresja pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) w komórkach CHO-K1 (E1A)
Hodowl ę na wielką skal ę (2 litry) komórek E. coli DH10B przenoszących plazmid pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) opisany powyżej w przykładzie 17(a) hodowano przez noc w Terrific Broth (TB) plus 100 μg/ml ampicyliny. Następnego dnia, plazmidowy DNA ekstrahowano, stosując zestaw QIAgen Endofree Megaprep, zgodnie z protokołem producenta. Stężenie oczyszczanego plazmidowego DNA określano standardowymi technikami z użyciem spektrofotometru UV i fluorometru. Plazmidowy DNA weryfikowano przez standardowe trawienie enzymem restrykcyjnym równych objętości przy użyciu enzymów restrykcyjnych EcoRI plus Notl i Asel. Wszystkie fragmenty trawienia restrykcyjnego odpowiadały przewidywanym wielkościom po przeanalizowaniu na 1% żelu agarozowym.
Na czterdzieści 15 cm płytek Petriego posiewano komórki CHO-K1/E1A przy gęstości wynoszącej 4 x 106 komórek/płytkę. Pożywką do powlekania była Gibco Ham's F-12 uzupełniona 10% Hyclone Fetal Bovine Serum (FBS), 100 jednostkami penicyliny/100 jednostek streptomycyny i glutaminy (2 mM). Następnego dnia każdą płytkę z komórkami transfekowano 6 μg plazmidowego DNA pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) stosując Gibco Optimem i Gibco Lipofectamine w 12 ml objętości, zgodnie z protokołem producenta. Cztery godziny po dodaniu mieszaniny transfekcyjnej do komórek, dodawaPL 208 247 B1 no 12 ml/płytkę Optimem uzupełnionego 10% FBS. Płytki inkubowano przez noc w temperaturze 37°C w inkubatorze o 5% CO2. Następnego dnia pożywki usuwano z każdej płytki i dodawano 25 ml pożywki do ekspresji (Gibco CHO-S-SFM II uzupełnionej glutaminą (2 mM) i 1 mM maślanem sodu). Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 3 dni. Po 3 dniach inkubacji, pożywki odciągnięto z każdej płytki i wirowano z prędkością 400 obrotów na minutę w wirniku z kołyszącym się koszem, w celu zgranulowania komórek. Supernatant dekantowano do jałowych 1 litrowych butelek i przeprowadzano oczyszczanie białka, które uległo ekspresji, jak opisano poniżej.
P r z y k ł a d 20: Konstrukcja wektora ekspresji pVEGFR1R2-FcΔC1(a)
Skonstruowano plazmid ekspresji pVEGFR1R2.FcΔC1(a) wprowadzając DNA kodujący aminokwasy SDT (odpowiadające aminokwasom 27-29 z fig. 24A-24C) między aminokwasów 26 i 27 Flt1d2-Flk1d3-FcΔC1(a) z fig. 21A-21C (GG) i usuwając DNA kodujący aminokwasy GPG odpowiadające aminokwasom 229-231 z fig. Sekwencja aminokwasowa SDT jest natywna w stosunku do receptora Flt1 i dodawano ją z powrotem aby zmniejszyć prawdopodobieństwo heterogenicznego obrabiania N-terminalnego. GPG (sekwencja mostkująca) została usunięta, tak że domeny Ig Flt1 i Flk1 połączono bezpośrednio ze sobą. Pełna sekwencja DNA i wywnioskowana aminokwasowa chimerycznej cząsteczki pVEGFR1 R2.FcΔC1(a) jest przedłożona w fig. 24A-24C.
P r z y k ł a d 21: Proces hodowli komórek stosowanych do wytworzenia zmodyfikowanych receptorów Flt1 (a) Proces hodowli komórek stosowanych do wytworzenia Flt1D2.Flk1 D3.FcΔC1 (a)
Proces wytwarzania białka Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) przy użyciu plazmidu ekspresji pFlt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) opisanego powyżej w przykładzie 1, obejmuje hodowlę w zawiesinie rekombinowanych komórek jajnika chomika chińskiego (CHO K1/E1A), które wykazują konstytutywną ekspresję produktu białkowego. Komórki hoduje się w bioreaktorach i produkt białkowy izoluje się i oczyszcza przez chromatografię powinowactwa i rozdziału ze względu na wielkość. Proces podaje się bardziej szczegółowo poniżej.
Rozprzestrzenianie komórek
Dwie konfluentne kolby T o objętości 225 cm2 zawierające linię komórkową, wykazującą ekspresję Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) namnażano przez pasażowanie komórek do ośmiu kolb T o objętości 225 cm2 w pożywce (GMEM + 10% surowicy, GIBCO) i inkubowano w temperaturze 37°C i 5% CO2. Gdy kolby doszły do konfluecji (około 3 do 4 dni) komórki oddzielono przy użyciu trypsyny. Świeżą pożywkę dodawano w celu zabezpieczenia komórek przed dalszym oddziaływaniem trypsyny. Komórki wirowano i ponownie zawieszano w świeżej pożywce, następnie przenoszono do ośmiu obrotowych butelek o objętości 850 cm2 i inkubowano w temperaturze 37°C i 5% CO2 do osiągnięcia stanu konfluencji.
Hodowla zawiesinowa w bioreaktorze
Komórki hodowane w obrotowych butelkach poddawano działaniu trypsyny aby oddzielić je od powierzchni i przemywano pożywką do hodowli w zawiesinie. Komórki przenosi się aseptycznie do 5 litrowego bioreaktora (New Brunswick Celligen Plus) gdzie komórki hoduje się w 3,5 litrach hodowli zawiesinowej. Pożywką do hodowli zawiesinowej była pozbawiona glutaminy modyfikacja IS-CHO o niskiej zawartości glukozy (Irvine Scientific), do której dodawano 5% płodowej surowicy bydlęcej (Hyclone), suplement GS (Life Technologies) i 25 μM sulfoksyiminy metioniny (Sigma). pH kontrolowano przy 7,2 dodając do gazu wlotowego ditlenek węgla lub dodając do bioreaktora płynny roztwór węglanu sodu. Poziom rozpuszczonego tlenu utrzymywano przy 30% nasycenia, przez dodanie do gazu wlotowego tlenu lub azotu, a temperaturę kontrolowano przy 37°C. Gdy osiągnięto gęstość wynoszącą 4x106 komórek/ml komórki przenoszono do 40 litrowego bioreaktora, zawierającego tę samą pożywkę i ustawienia do kontrolowania bioreaktora. Ustawienie temperatury zmniejszono do 34°C aby spowolnić wzrost komórek i zwiększyć względny współczynnik ekspresji białek.
(b) Proces hodowli komórek użytych do wytworzenia Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)
Taką samą metodologię, jaką opisano powyżej dla Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) stosowano do wytworzenia Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1 (a).
P r z y k ł a d 22: Zbiór i oczyszczanie zmodyfikowanych receptorów Flt1 (a) Zbiór i oczyszczanie Flt1D2.Flk1 D3.FcΔC1(a)
Produkt białkowy zbierano aseptycznie z bioreaktora, zachowując komórki, przy użyciu modułów filtracyjnych z przepływem stycznym Millipore Prostak i mechaniczną pompę o niskiej prędkości ścinającej (Fristam). Świeżą pożywkę dodawano do bioreaktora, w miejsce tej usuniętej podczas filtracji zbierającej. Około 40 litrów zebranego przesączu załadowano następnie na 400 ml kolumnę
PL 208 247 B1 zawierającą żywicę Protein A Sepharose (Amersham Pharmacia). Po załadowaniu żywicę przemywano buforem, zawierającym 10 mM fosforan sodu, 500 mM chlorek sodu, pH 7,2 aby usunąć jakiekolwiek niezwiązane, białka zanieczyszczające. Białko Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) wymywano stosując bufor cytrynianowy o pH 3,0. Wymyte białko zobojętniano przez dodanie zasady Tris i zamrażano w temperaturze -20°C.
Kilka zamrożonych partii białka Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) z powyższego etapu Protein A topiono, zlewano i zatężano przy użyciu błony filtracyjnej o przepływie stycznym Millipore o nominalnym ciężarze cząsteczkowm odcięcia (NMWCO), wynoszącym 30 kD. Białko przenoszono do urządzenia zatężającego przez mieszanie (Millipore) i dalej zatężano do 30 mg/ml przy użyciu błony o NMWCO 30 kD. Zatężone białko załadowano kolumnę rozdziału ze względu na wielkość upakowaną żywicą Superdex 200 (Amersham Pharmacia), która była zrównoważona solanką buforowaną fosforanem plus 5% glicerolem. Taki sam bufor stosowano do uruchomienia kolumny. Frakcje odpowiadające dimerowi Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) zlewano, filtrowano jałowo przez filtr o średnicy oczka 0,22 mikrona, dzielono na równe objętości i zamrażano.
(b) Zbiór i oczyszczanie Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)
Taką samą metodologię, jaką opisano powyżej dla Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), stosowano do zbioru i oczyszczenia Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔCl (a).
P r z y k ł a d 23: Test fosforylacji dla krótkotrwałej ekspresji VEGFR2
Pierwotne komórki śródbłonka ludzkiej żyły pępkowej (HUVEC), pasaż 4-6, głodzono przez 2 godziny w pożywkach pozbawionych surowicy DME o wysokiej zawartości glukozy. Wytworzono próbki zawierające 40 ng/ml (1 nM) ludzkiego VEGF165, który jest ligandem dla receptorów VEGF Flt1, Flk1 i Flt4(VEGFR3) i wstępnie inkubowano przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, przy zmieniających się ilościach zmodyfikowanego receptora Flt1y Flt1(1-3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) w pozbawionych surowicy pożywkach DME o wysokiej zawartości glukozy, zawierających 0,1% BSA. Komórki obciążono przez 5 minut z użyciem próbek wytworzonych powyżej +/- VEGF165, po czym całe komórki poddawano lizie przy użyciu buforu do pełnej lizy. Lizaty komórkowe poddawano immunoprecypitacji z użyciem przeciwciała skierowanego przeciw końcowi C receptora VEGFR2. Lizaty strącone immunologicznie załadowano na żel 4-12% SDS-PAGE Novex i następnie przenoszono na błonę PVDF, stosując standardową metodologię przenoszenia. Wykrywanie fosforylowanego VEGFR2 wykonywano przez odcisk immunologiczny z użyciem mAb przeciwko fosfotyrozynie, zwanego 4G10 (UBI) i wywoływano, stosując odczynnik ECL (Amersham).
Fig. 25A-25C i 26A-26B ukazują wyniki tego doświadczenia.
Fig. 25A-25C ujawniają, że wykrywanie przez Western blot fosforylowanego tyrozyną VEGFR2(Flk1) przez stymulację ligandem VEGF165 wykazuje, że receptory powierzchniowo-komórkowe są ufosforylowane w zmiennym stopniu w zależności od tego, który zmodyfikowany receptor Flt1 stosuje się podczas wstępnych inkubacji z VEGF. Jak widać w fig. 25A, przy 1,5 molowym nadmiarze albo Flt1 (1 -3)-Fc, Flt1 (1-3)-Fc (A40) albo krótkotrwałego Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), występuje pełna blokada stymulacji receptora przez te trzy zmodyfikowane receptory Flt1, w porównaniu z obciążeniem pożywką kontrolną. Przeciwnie, krótkotrwały Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) nie wykazuje istotnej blokady przy tym molowym nadmiarze, w porównaniu z obciążeniem kontrolną, dodatnią pod względem VEGF. Podobne wyniki są widoczne w fig. 25B, gdzie zmodyfikowane receptory Flt występują z 3-krotnym nadmiarem molowym z ligandem VEGF165. W fig. 25C, gdzie zmodyfikowane receptory Flt1 występują z 6-krotnym nadmiarem molowym wobec liganda VEGF165, może teraz okazać się, że krótkotrwały Flt1D2VEGFR3D3.FcΔC1(a) częściowo blokuje stymulację receptorów powierzchniowokomórkowych indukowaną przez VEGF165.
W fig. 26A-26B, wykrywanie przez Western blot fosforylowanego tyrozyną VEGFR2(Flk1) przez stymulację ligandem VEGF165 wykazuje, że receptory powierzchniowo-komórkowe nie są fosforylowane przez obciążenie próbek, które miały VEGF165 wstępnie inkubowany z 1 i 2-krotnym nadmiarem molowym (fig. 26A) lub 3 i 4-krotnym nadmiarem molowym (fig. 26B), albo krótkotrwałym Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), stabilnym Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub krótkotrwałym VEGFR1R2-FcΔC1(a). Przy wszystkich testowanych stężeniach zmodyfikowanego receptora Flt1, występuje pełne wiązanie liganda VEGF165 podczas wstępnej inkubacji, dając w wyniku brak wykrywalnej stymulacji receptorów powierzchniowo-komórkowych przez niezwiązany VEGF165, w porównaniu z obciążeniem pożywką kontrolną.
PL 208 247 B1
P r z y k ł a d 24: Próba biologiczna proliferacji komórek
Testowaną populacją komórkową są komórki MG87, które zostały stabilnie transfekowane plazmidem ekspresji, zawierającym insert DNA kodujący zewnątrzkomórkową domenę VEGFR2(Flk1) połączoną z wewnątrzkomórkową domenę kinazy TrkB, wytwarzając w ten sposób chimeryczną cząsteczkę. Powodem stosowania raczej wewnątrzkomórkowej domeny kinazy TrkB niż natywnej wewnątrzkomórkowej domeny kinazy VEGFR2(Flk1) jest to, że wewnątrzkomórkowa domena kinazy VEGFR2(Flk1) nie powoduje silnej odpowiedzi proliferacyjnej podczas stymulacji przez VEGF165 w tych komórkach. Wiadomo, że komórki MG87 zawierające pełnej długości receptor TrkB, dają silną odpowiedź proliferacyjną przy stymulacji BDNF, więc wewnątrzkomórkową domenę kinazy TrkB zbudowano tak aby zastąpić wewnątrzkomórkową domenę kinazy VEGFR2(Flk1), czerpiąc korzyść z tej zdolności odpowiedzi proliferacyjnej.
x 103 komórek/studzienkę powlekano w 96-studzienkowej płytce i pozostawiono do związania na 2 godziny w temperaturze 37°C. Następujące zmodyfikowane receptory Flt Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a), plus nieistotny receptor określony jako Tie2-Fc, jako kontrola ujemna, miareczkowano od 40 nM do 20 pM i inkubowano na komórkach przez 1 godzinę w temperaturze 37°C. Następnie do wszystkich studzienek dodawano ludzki rekombinowany VEGF165 w określonych pożywkach, przy stężeniu wynoszącym 1,56 nM. Płytki inkubowano przez 72 godzin w temperaturze 37°C i następnie dodawano MTS (odczynnik Owen's, Promega) i płytki inkubowano przez dodatkowe 4 godziny. Wreszcie, płytki odczytywano na spektofotometrze przy długości fali 450/570 nm. Wyniki tego doświadczenia widać w fig. 27. Kontrolny receptor Tie2-Fc nie blokuje indukowanej VEGF165 proliferacji komórek przy żadnym stężeniu, podczas gdy Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) blokuje 1,56 nM VEGF165 połową maksymalnej dawki, wynoszącą 0,8 nM. Flt1(1-3)-Fc i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) mniej skutecznie blokują VEGF165 w tym teście połową maksymalnej dawki, wynoszącą ~2 nM. Sam VEGF165 daje odczyt, wynoszący 1,2 jednostki absorbancji, a tło wynosi 0,38 jednostki absorbancji.
P r z y k ł a d 25: Stechiometria zmodyfikowanych receptorów Flt z VEGF165 (a) Analiza BIAcore
Określano stechiometrię interakcji Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) i VEGFR1R2-FcΔC1(a) z ludzkim VEGF165 albo przez pomiar poziomu nasycenia wiązania VEGF z powierzchniami Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2-FcΔC1(a) albo pomiar stężenia VEGF165 potrzebnego do całkowitego zapobieżenia wiązaniu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2-FcΔC1(a) z VEGF na powierzchni płytki BIAcore.
Modyfikowane receptory Flt Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) i VEGFR1R2-FcΔC1(a), były wychwytywane przez specyficzne przeciwciało anty-Fc, które było najpierw unieruchomione na płytce Biacore (BIACORE) przy użyciu chemii sprzęgania amin. Przeciwciało z czystą powierzchnią stosowano jako kontrolę ujemną. VEGF165 wstrzykiwano przy stężeniu wynoszącym 1 nM, 10 nM, i 50 nM nad powierzchniami Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) i VEGFR1R2-FcΔC1(a), w ilości 10 μl/minutę przez jedną godzinę. Zapisywano sygnał wiązania w prawidziwym czasie i uzyskiwano nasycanie wiązania na końcu każdego wstrzyknięcia. Stechiometrię wiązania obliczano jako stosunek molowy VEGF165 związanego z unieruchomionym Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2-FcΔC1(a), stosując współczynnik konwersji, wynoszący 1000 RU równoważne 1 ng/ml. Wyniki wskazywały stechiometrię wiązania jednej dimerycznej cząsteczki VEGF165 na jedną cząsteczkę Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2FcΔC1(a) (fig. 28).
W roztworze, Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2-FcΔC1(a) o stężeniu wynoszącym 1 nM (szacowanym na 1000 razy wyższe niż KD interakcji Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2FcΔC1(a)/VEGF165), mieszano ze zmiennymi stężeniami VEGF165. Po jednej godzinie inkubacji, mierzono stężenia wolnego Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) w roztworze jako sygnał wiązania z powierzchnią VEGF165 sprzężoną z aminą. Krzywą kalibracji stosowano przeniesienia sygnału wiązania BIAcore Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) na jego stężenie molowe. Dane pokazywały, że dodanie 1 nM VEGF165 do roztworu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) całkowicie blokowało wiązanie Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) z powierzchnią VEGF165. Ten wynik sugerował stechiometrię wiązania jednej cząsteczki VEGF165 na jedną cząsteczkę Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) (fig. 29 i fig. 30). Jeśli stężenie Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) nanoszono jako funkcję dodanego stężenia VEGF165, spadek części liniowej wynosił -1,06 dla Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) i -1,07 dla VEGFR1R2-FcΔC1(a). Wielkość spadku, bardzo bliska ujemnej, wskazywała, że jedna cząsteczka VEGF165 wiązała się z jedną cząsteczką albo Flt1D2FIk1D3.FcΔC1(a) albo VEGFR1R2-FcΔC1(a).
PL 208 247 B1
Chromatografia rozdziału pod względem wielkości Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) mieszano z 3-krotnym nadmiarem VEGF165 i kompleks receptor-ligand oczyszczano stosując kolumnę chromatografii rozdziału ze względu na wielkość Pharmacia Superose 6. Następnie kompleks receptor-ligand inkubowano w buforze zawierającym 6M chlorowodorku guanidyny, w celu zdysocjowania go do jego składowych białek. Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) oddzielano od VEGF165 przy użyciu kolumny chromatografii rozdziału ze względu na wielkość Superose 6 uruchomionej w 6M chlorku guanidyny. W celu określenia stechiometrii kompleksu, wykonano kilka wstrzyknięć Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) i VEGF165 i wysokość piku lub zintegrowaną intensywność piku nanoszono jako funkcję stężenia wstrzykiwanego białka. Kalibrację wykonywano w warunkach identycznych do stosowanych przy rozdzielaniu składników kompleksu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF. Ocenę ilościową składu kompleksu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF oparto o krzywe kalibracji. Wyniki tego doświadczenia są przedłożone w fig. 28, która wykazuje stosunek VEGF165 do Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) w kompleksie, jako 1:1.
P r z y k ł a d 26: Określanie stechiometrii wiązania kompleksu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165 przez chromatografię rozdziału pod względem wielkości.
Wytworzenie kompleksu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165
VEGF165 (stężenie = 3,61 mg/ml) mieszano z komórkami CHO krótkotrwale wykazującymi ekspresję Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) (stężenie = 0,9 mg/ml) w stosunku molowym wynoszącym 3:1 (VEGF165:Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)) i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C.
(a) Chromatografia rozdziału pod względem wielkości (SEC) w warunkach natywnych
Aby rozdzielić kompleks od nadmiaru nie związanego VEGF165, 50 μl kompleksu załadowano na Pharmacia Superose 12 PC 3,2/30, którą zrównoważono w buforze PBS. Próbkę wymywano tym samym buforem, przy prędkości przepływu 40 μl/minutę, w temperaturze pokojowej. Wyniki tej SEC są pokazane w fig. 31. Pik numer 1 przedstawia kompleks, a pik numer 2 przedstawia nie związany VEGF165. Frakcje wymyte między 1,1 i 1,2 ml łączono i dodawano chlorowodorek guanidyny (GuHCl) do końcowego stężenia 4,5 M aby zdysocjować kompleks.
(b) Chromatografia rozdziału pod względem wielkości (SEC) w warunkach dysocjacji
Aby rozdzielić składniki kompleksu receptor-ligand i aby określić ich stosunek molowy, 50 μl zdysocjowanego kompleksu, jaki opisano powyżej, załadowano na Superose 12 PC 3,2/30 zrównoważoną w 6M GuHCl i wymywano tym samym roztworem przy prędkości przepływu 40 μl/minutę w temperaturze pokojowej. Wyniki tej SEC są pokazane w fig. 32. Pik numer 1 przedstawia Flt1D2Flk1D3.EcΔC1(a), a pik numer 2 przedstawia VEGF165.
(c) Obliczanie stechiometrii kompleksu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a):VEGF165
Stechiometrię kompleksu receptor-ligand określano z obszaru piku lub wysokości składników piku. Stężenia VEGF165 i Flt1D2Flk1D3.EcΔC1(a) odpowiadające, odpowiednio, wysokości piku lub obszarowi piku, otrzymywano z krzywych standardowych dla VEGF165 i Flt1D2Flk1D3.EcΔC1(a). Aby otrzymać krzywą standardową, wstrzykiwano cztery różne stężenia (0,04 mg/ml -0,3 mg/ml) obu składników na kolumnę Pharmacia Superose 12 PC 3,2/30 zrównoważoną w 6M chlorku guanidyny i tym samym roztworem przy prędkości przepływu 40 μl/minutę, w temperaturze pokojowej. Krzywą standardową otrzymano przez naniesienie obszaru piku lub wysokości piku, przeciwko stężeniu białka. Stosunek molowy VEGF165:Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) określany z obszaru piku składników, wynosił 1,10.
P r z y k ł a d 27: Określanie stechiometrii wiązania kompleksu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165 przez chromatografię rozdziału pod względem wielkości z podłączonym rozpraszaniem światła
Wytwarzanie kompleksu
VEGF165 mieszano z CHO o krótkotrwałej ekspresji białka Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) w stosunku molowym wynoszącym 3:1 (VEGF165:Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)) i inkubowano przez noc w temperaturze 4°C.
(a) Chromatografia rozdziału pod względem wielkości z podłączonym rozpraszaniem światła
Kolumnę chromatografii rozdziału pod względem wielkości z podłączonym detektorem rozpraszania światła MiniDawn (Wyatt Technology, Santa Barbara, Kalifornia) oraz detektorami współczynnika załamania (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japonia), stosowano do określania ciężaru cząsteczkowego (MW) kompleksu receptor-ligand. Próbki wstrzykiwano na kolumnę Superose 12 HR 10/30 (Pharmacia) zrównoważoną w buforze PBS i wymywano tym samym buforem, z prędkością przepływu wynoszącą 0,5 ml/minutę w temperaturze pokojowej. Jak widać w fig. 33, profil elucji wykazuje dwa piki. Pik numer 1 przedstawia kompleks receptor-ligand, a pik numer 2 przedstawia nie związany VEGF165.
PL 208 247 B1
MW obliczano z sygnałów LS i RI. Taką samą procedurę stosowano, aby określić MW poszczególnych składników kompleksu receptor-ligand. Wyniki tych określeń są następujące: MW kompleksu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165 w pozycji piku, wynosi 157 300 (fig. 33), MW VEGF165 w pozycji piku, wynosi 44 390 (fig. 34) i MW R1R2 przy piku, wynosi 113 300 (fig. 35).
Dane te wskazywały, że stechiometria kompleksu Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF wynosi 1:1 jako, że odpowiada sumie ciężarów cząsteczkowych Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) i VEGF165. Co istotne, metoda ta dowiodła w sposób rozstrzygający, że kompleks Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a)/VEGF165 rzeczywiście zawierał tylko jedną cząsteczkę liganda VEGF165 i tylko jedną cząsteczkę Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a).
P r z y k ł a d 28: Mapowanie peptydu Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a)
Disiarczkowe struktury i miejsca glikozylacji w Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) określano metodą mapowania peptydu. W tej metodzie, najpierw rozszczepiano białko trypsyną. Fragmenty trypsynowe analizowano i identyfikowano przez HPLC sprzężoną ze spektrometrią masową, oprócz techniki sekwencjonowania N-terminalnego.
Wykorzystano redukcję produktów trawienia trypsyną, aby pomogła zidentyfikować fragmenty zawierające wiązania disiarczkowe. Stosowano traktowanie produktów trawienia trypsyną PNGazą F (Glyko, Novato, CA) pomocne przy identyfikacji fragmentów z miejscami glikozylacji połączonymi z N. Wyniki są omówione w towarzyszącej fig. 36.
Całkowita ilość cystein w Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) wynosi dziesięć; sześć z nich należy do regionu Fc. Potwierdzono, że Cys27 wiąże się przez disiarczek z Cys76. Potwierdzono, że Cys121 wiąże się przez disiarczek z Cys182. Pierwsze dwie cysteiny w regionie Fc (Cys211 i Cys214) tworzą wewnątrzcząsteczkowe wiązanie disiarczkowe z tymi samymi dwoma cysteinami w drugim łańcuchu Fc. Jednakże, ponieważ te dwie cysteiny nie mogą być rozdzielone od siebie enzymatycznie, nie można określić, czy wiązanie disiarczkowe występuje między tymi samymi cysteinami (np. Cys211 z Cys211) lub między Cys211 i Cys214. Potwierdzono, że Cys216 wiąże się przez disiarczek z Cys306. Potwierdzono, że Cys352 wiąże się przez disiarczek z Cys410. W Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) istnieje pięć możliwych miejsc glikozylacji połączonych z N. Okazało się, że wszystkie pięć ulegają glikozylacji w różnym stopniu. Pełną glikozylację obserwowano przy Asn33 (sekwencja aminokwasowa NIT), Asn193 (sekwencja aminokwasowa NST), i Asn282 (sekwencja aminokwasowa NST). Prócz tego, obserwuje się częściową glikozylację na Asn65 i Asn120. Miejsca glikozylacji są uwidocznione przez podkreślenie w fig. 36.
P r z y k ł a d 29: Analiza farmakokinetyczna zmodyfikowanych receptorów Flt (a) Analiza farmakokinetyczna Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i VEGFR1R2FcΔC1(a)
Myszom Balb/c (25-30 g) wstrzykiwano podskórnie 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), CHO krótkotrwale wykazujących ekspresję Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), CHO stabilnie wykazujących ekspresję Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a), i CHO krótkotrwale wykazujących ekspresję VEGFR1R2-FcΔC1(a). Myszom pobierano krew z ogona po 1, 2, 4, 6, 24 godzinach, 2 dniach, 3 dniach i 6 dniach po iniekcji. Surowice testowano w ELISA przeznaczonym do wykrywania Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) lub VEGFR1R2-FcΔC1(a). ELISA obejmuje powlekanie płytki ELISA VEGF165, wiązanie wykrywanego Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1 D2.Flk1 D3.FcΔC1 (a) lub VEGFR1 R2-FcΔC1 (a) i kontaktowanie z przeciwciałem anty-Fc połączonym z peroksydazą chrzanową. Wyniki tych doświadczeń są pokazane w fig. 37. Tmax dla Flt1(1-3)-Fc (A40) był po 6 godzinach podczas gdy Tmax dla krótkotrwałego i stabilnego Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i krótkotrwałego VEGFR1R2-FcΔC1(a) wynosił 24 godziny. Cmax dla Flt1(1-3)-Fc (A40) wynosił 8 μg/ml. Zarówno dla krótkotrwałego (Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) jak i VEGFR1R2-FcΔC1(a)) Cmax wynosił 18 μg/ml, a Cmax dla stabilnego VEGFR1R2-FcΔC1(a) wynosił 30 μg/ml.
(b) Analiza farmakokinetyczna Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1 D2.Flk1 D3.FCAC1 (a) i Flt1 D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a)
Myszom Balb/c (25-30 g) wstrzykiwano podskórnie 4 mg/kg Flt1(1-3)-Fc (A40), CHO krótkotrwale wykazujących ekspresję Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) oraz CHO krótkotrwale wykazujących ekspresję Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). Myszom pobierano krew z ogona 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 i 20 dni po iniekcji. Surowice testowano w ELISA przeznaczonym do wykrywania Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a). ELISA obejmuje powlekanie płytki ELISA 165, wiązanie Flt1(1-3)-Fc, Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) lub Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) i skontaktowanie z przeciwciałem anty-Fc połączonym z peroksydazą chrzanową. Flt1(1-3)-Fc (A40) nie mógł być dłu28
PL 208 247 B1 żej wykrywany w surowicy po dniu 5 podczas gdy Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) były wykrywalne przez 15 dni lub więcej. Wyniki tego doświadczenia są pokazane w fig. 38.
P r z y k ł a d 30: Ocena zdolności Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) do hamowania wzrostu nowotworu in vivo
Aby ocenić zdolność Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) do hamowania wzrostu nowotworu in vivo, wykorzystano model, w którym zawiesiny komórek nowotworu wszczepia się podskórnie na prawym boku samca myszy z zespołem ciężkiej niewydolności odporności (SCID). W teście wykorzystano dwie linie komórkowe, ludzką linię komórkową włókniakomięsaka HT-1080 (ATCC numer dostępu CCL-121) i szczurzą linię komórkową glejaka C6 (ATCC numer dostępu CCL-107), z których każda wykazuje różną morfologię i cechy wzrostu. Pierwszą dawkę Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1 (a) (w ilości 25 mg/kg lub jak zaznaczono w fig. 39 i 40), podano w dniu wszczepienia nowotworu. Następnie zwierzęta otrzymały podskórne iniekcje Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) lub nośnika, albo co drugi dzień (EOD) lub dwa razy na tydzień (2X/tydzień) przez okres 2 tygodni. Po 2 tygodniach, zwierzętom wykonano perfuzje utrwalaczem, guzy usuwano i próby uczyniono ślepymi. Określano objętość nowotworu przez pomiar długości i szerokości widocznych guzów podskórnych. Zarówno Flt1(1-3)-Fc (A40) jak i Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) istotnie redukowały wzrost nowotworów utworzonych przez HT-1080 i komórki C6. Wyniki tych doświadczeń są pokazane w fig. 39 i fig. 40.
P r z y k ł a d 31: Wpływ VEGF165 i zmodyfikowanych receptorów Flt na żeński układ rozrodczy
Stereotypowy wzór premodelowania naczyń, jaki występuje w macicy i jajniku podczas cyklu reprodukcyjnego został dobrze scharakteryzowany, czyniąc te tkanki szczególnie dobrze dopasowanymi do badania mechanizmów, jakie regulują angiogenezę, przemodelowanie naczyń i regresję naczyń. Rzeczywiście, badania hybrydyzacji in situ w tkankach rozrodczych dostarczyły pierwszego wyraźnego dowodu, że VEGF działa jako mediator fizjologicznej angiogenezy u dojrzałych gryzoni, a także ludzi i naczelnych nie będących ludźmi (Phillips i inni, 1990; Ravindranath i inni, 1992; Shweiki i inni, 1993; Kamat i inni, 1995). Jako, że cykliczna angiogeneza i przemodelowanie naczyń są szczególnymi cechami normalnego jajnika i macicy, nie jest zaskakujące, że nienormalny wzrost naczyń krwionośnych i/lub dysfunkcja naczyniowa, jak odkryto, charakteryzuje wiele stanów patologicznych, które wpływają na te narządy. Ponadto, uważa się, że te patogeniczne, nienormalne stany naczyniowe są powodowane lub uwieczniane przez rozregulowaną ekspresję jednego lub więcej czynników angiogenicznych lub antyangiogenicznych, najczęściej VEGF.
Przykładowo, nienormalna angiogeneza jest charakterystyczna dla zespołu wielotorbielowatości jajnika, endometriozy i mięsaka śluzówki macicy, i w każdym przypadku VEGF ulega nadekspresji w chorych tkankach (Kamat i inni, 1995; Shifren i inni, 1996; Guidi i inni, 1996; Donnez i inni, 1998). Uważa się także, że nadekspresja VEGF odgrywa patogenną rolę w ustalaniu nadmiernej przepuszczalności układu naczyniowego w zespole nadstymulacji jajnika (McClure i inni, 1994; Levin i inni, 1998) i stanie przedrzucawkowym (Baker i inni, 1995; Sharkey i inni, 1996). Poza tym, VEGF został skojarzony jako czynnik przepuszczalności odpowiedzialny za wytwarzanie płynów puchlinowych związanych z rakiem jajnika i innymi nowotworami (Senger i inni, 1983; Boocock i inni, 1995). Czynniki, które skutecznie neutralizują biologiczne działanie VEGF można rozsądnie uznać za korzystne z punktu widzenia terapii w powyższych i związanych stanach.
Angiogeneza i przemodelowywanie naczyń są także znamienne dla wszczepienia blastocysty i rozwoju łożyska (Findlay, 1986). VEGF ulega silnej ekspresji zarówno w błonie doczesnej macicy, jak i trofoblastach zarodkowych, gdzie jak się sądzi, najpierw stymuluje namnożenie i nadmierną przepuszczalność unaczynienia macicy podczas okresu okołowszczepiennego, a następnie pośredniczy w tworzeniu składników zarówno macicy jak i zarodkowych unaczynienia łożyska (Shweiki i inni, 1993; Cullinan-Bove i Koos, 1993; Chakraborty i inni 1995; Das i inni, 1997). VEGF jest także wymagany dla angiogenezy ciałka żółtego i towarzyszy sekrecji progesteronu, koniecznej do przygotowania macicy na wszczepienie (Ferrara i inni, 1998). Tak więc, czynniki które inhibitują czynności biologiczne VEGF mogą dowieść skuteczności jako środki antykoncepcyjne (zapobiegające wszczepieniu), lub jako środki poronne we wczesnych etapach ciąży. Ostatnie zastosowanie może znaleźć zastosowanie jako nie chirurgiczna interwencja terminacji ciąż pozamacicznych.
Podczas gdy ekspresja receptorów VEGF jest w większości ograniczona do śródbłonka naczyniowego w normalnych tkankach rozrodczych, Flt1 ulega także ekspresji w trofoblastach w łożysku, zarówno u ludzi jak i zwierząt (Clark i inni, 1996; He i inni, 1999) gdzie jak wnioskowano, odgrywa rolę
PL 208 247 B1 w inwazji trofoblastu. Co interesujące, zarówno Flt1 jak i KDR (Flk1) ulegają ekspresji w linii komórkowej nabłoniaka kosmówkowego BeWo (Charnock-Jones i inni, 1994), i wykazano, że VEGF pobudza syntezę DNA i fosforylację tyrozynową kinazy MAP w tych komórkach. Ponadto, pierwotne i przerzutowe raki jajnika nie tylko wykazują ekspresję wysokiego poziomu VEGF, lecz - oprócz śródbłonka naczyniowego - same komórki nowotworu wykazują ekspresję KDR i/lub Flt1 (Boocock i inni, 1995). Odkrycia te sugerują, że VEGF może nie tylko być w sposób krytyczny związany z tworzeniem i utrzymywaniem unaczynienia nowotworu, lecz że co najmniej w niektórych nowotworach pochodzenia rozrodczego, VEGF może odgrywać rolę autokrynową, bezpośrednio podtrzymując przeżycie i proliferację komórek nowotworu. Tak więc czynniki, które blokują działanie VEGF mogą mieć szczególnie korzystne zastosowanie w leczeniu nowotworów pochodzenia rozrodczego.
Metody i wyniki (a) Ocena nadmiernego przeciekania macicy indukowanego przez VEGF
Gonadotropinę surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) wstrzykiwano podskórnie (5 IU), w celu indukcji owulacji, samicy szczura przed okresem dojrzałości. Powoduje to gwałtowny napływ estradiolu po 2 dniach, co na odwrót powoduje indukcję VEGF w macicy. Donoszono, że ta indukcja daje w wyniku nadmierną przepuszczalność macicy i zwiększenie wilgotnej masy macicy 6 godzin później, a zatem, mogłaby być potencjalnie zablokowana przez zmodyfikowane receptory Flt Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔ01(a). W tym modelu in vivo, normalny ciężar macicy szczura wynosi około 50 mg i można go indukować do 300-350 mg przez PMSG. Desykacja tkanki ujawnia że jest to masa całkowitej wody. Podskórne wstrzyknięcie Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2.Flk1D3.FcΔ01(a) i Flt1D2.VEGFR3D3.FcΔC1(a) w ilości 25 mg/kg, po 1 godzinie po wstrzyknięciu PMSG, daje w wyniku około 50% inhibicję zwiększania wilgotnej masy macicy. Zwiększająca się dawka zmodyfikowanego receptora Flt nie redukuje dalej zwiększania wilgotnej masy, sugerując, że istnieje składnik niezależny od VEGF wobec tego modelu. Wyniki tego doświadczenia są pokazane w fig. 41.
(a) Ocena angiogenezy ciałka żółtego przy użyciu progesteronu jako odczytu
Gonadotropinę surowicy ciężarnej klaczy (PMSG) wstrzykuje się podskórnie (5 IU) w celu indukcji owulacji u samic szczura przed okresem dojrzałości. Powoduje to uzyskanie w pełni działającego ciałka żółtego, zawierającego gęstą sieć naczyń krwionośnych po 4 dniach, co pozwala na sekrecję progesteronu do krwi, w celu przygotowania macicy na wszczepienie. Indukcja angiogenezy w ciałku żółtym wymaga VEGF; zatem, blokowanie VEGF powodowałoby brak nowych naczyń krwionośnych, a więc brak progesteronu wydzielonego do krwi. W tym modelu in vivo, poziom spoczynkowy progesteronu wynosi około 5 ng/ml i można go indukować do poziomu wynoszącego 25-40 ng/ml po PMSG. Podskórne wstrzyknięcie Flt1(1-3)-Fc (A40) lub Flt1D2.Flk1D3.FcΔC1(a) w ilości 25 mg/kg lub 5 mg/kg po 1 godzinie po wstrzyknięciu PMSG, daje w wyniku pełną inhibicję indukcji progesteronu w dniu 4. Wyniki tego doświadczenia są pokazane w fig. 42A-42B.
P r z y k ł a d 33: Analiza farmakokinetyczna Flt1(1-3)-Fc (A40) i traktowanego PEG FltKl-3)-Fc
Flt1(1-3)-Fc traktowano PEG stosując albo 10 kD PEG lub 20 kD PEG oraz testowano na myszach balb/c pod względem ich profilu farmakokinetycznego. Obie postacie Flt1(1-3)-Fc traktowane PEG posiadały jak się okazało, znacznie lepsze profile PK niż Flt1(1-3)-Fc (A40), przy czym Tmax miał miejsce po 24 godzinach dla cząsteczki traktowanej PEG w przeciwieństwie do 6 godzin dla Flt1(1-3)Fc (A40).
P r z y k ł a d 34: ELISA VEGF165 w celu przetestowania powinowactwa zmodyfikowanych odmian receptora Flt1 pM VEGF165 inkubowano przez noc w temperaturze pokojowej z odmianami zmodyfikowanego receptora Flt1 w zakresie od 160 pM do 0,1 pM. Odmianami zmodyfikowanego receptora Flt1 stosowanego w tym doświadczeniu były Flt1 (1 -3)-Fc, Flt1(1-3)-Fc (A40), Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a) o krótkotrwałej ekspresji, Flt1D2VEFGFR3D3-FcΔC1(a) o krótkotrwałej ekspresji, Flt1-(1-3TNAS)-Fc, Flt1(1-3R ,C)-Fc i Tie2-Fc. Flt1 (1 -3NAS)-Fc jest zmodyfikowaną wersją Flt1 (1 -3)-Fc, w której wysoce zasadową sekwencję aminokwasową KNKRASVRRR zastępuje się NASVNGSR, czego wynikiem jest wprowadzenie dwóch nowych miejsc glikozylacji i redukcję sieci pięciu ładunków dodatnich, oba w celu zredukowania niekorzystnego wpływu tej sekwencji na PK. Flt1(1-3R ,C)-Fc jest modyfikacją, w której pojedyncza reszta argininy (R) w tej samej zasadowej sekwencji aminokwasowej jest zamieniana na cysteinę (C) (KNKEASVRRR > KNKCASVRRR), co pozwala na traktowanie PEG przy tej reszcie, która może następnie osłonić zasadowy region przed wywieraniem swego niekorzystnego wpływu na PK. Po inkubacji, roztwór przenoszono do płytki, zawierającej przeciwciało wychwytujące
PL 208 247 B1
VEGF165 (R & D). Ilość wolnego VEGF165 określano następnie przy użyciu przeciwciała do skontaktowania wolnego VEGF165. Pokazało to, że odmianą zmodyfikowanego receptora Flt1 z najwyższym powinowactwem wobec VEGF165 (określonym jako najniższa ilość wolnego VEGF165), była Flt1D2Flk1D3.FcΔC1(a), następnie Flt1(1-3)-Fc i Flt1(1-3)-Fc (A40), a następnie Flt1 (1 -3r <:)-Fc, Flt1(1-3NAS)-Fc i Flt1D2VEFGFR3D3-FcΔC1(a). Tie2Fc nie posiada powinowactwa wobec VEGF165.
Claims (25)
1. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego zawierająca:
(a) sekwencję nukleotydową, kodującą składnik receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń VEGF, składający się z immunoglobulino-podobnej (Ig) domeny 2 pierwszego receptora VEGF i domeny 3 Ig drugiego receptora VEGF.
(b) sekwencję nukleotydową, kodującą składnik multimeryzujący, przy czym ten pierwszy receptor VEGF jest Flt1 i drugi receptor VEGF jest Flk1 lub FLk4 a składnik receptora VEGF jest jedynym składnikiem receptora VEGF polipeptydu fuzyjnego.
2. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca domenę 2 Ig zewnątrzkomórkowej domeny pierwszego receptora VEGF, znajduje się w górę od sekwencji nukleotydowej kodującej domenę 3 Ig zewnątrzkomórkowej domeny drugiego receptora VEGF.
3. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że sekwencja nukleotydowa kodująca domenę 2 Ig zewnątrzkomórkowej domeny pierwszego receptora VEGF znajduje się w dół od sekwencji nukleotydowej kodującej domenę 3 Ig zewnątrzkomórkowej domeny drugiego receptora VEGF.
4. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, albo 2, albo 3, znamienna tym, że składnik multimeryzujący obejmuje domenę immunoglobulinową.
5. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 4, znamienna tym, że domenę immunogobulinową wybiera się z grupy składającej się z domeny Fc IgG i łańcucha ciężkiego IgG.
6. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, znamienna tym, że zawiera sekwencję nukleotydową, wybraną z grupy składającej się z:
(a) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 21A-21C;
(b) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 22A-22C;
(c) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 24A-24C; oraz (c) sekwencji nukleotydowej która, w wyniku degeneracji kodu genetycznego, różni się od sekwencji nukleotydowej (a), (b) lub (c).
7. Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, w której składniki polipeptydu fuzyjnego są ułożone jako 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 lub 3,2,1, gdzie 1 oznacza składnik pierwszego receptora VEGF, 2 oznacza składnik drugiego receptora VEGF i 3 oznacza czynnik multimeryzujący.
8. Wektor, który obejmuje cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowaną w zastrz. 1 do 7.
9. Wektor ekspresji obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego zdefiniowanego w zastrz. 1 do 7, przy czym cząsteczka kwasu nukleinowego jest operacyjnie połączona z sekwencją kontroln ą ekspresji.
10. Układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, znamienny tym, że obejmuje wektor ekspresji zdefiniowany w zastrz. 9, w odpowiedniej komórce gospodarza.
11. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 10, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest komórka bakteryjna, komórka drożdżowa, komórka owada, lub komórka ssaka.
12. Układ gospodarz-wektor według zastrz. 11, znamienny tym, że odpowiednią komórką gospodarza jest komórka E. coli lub CHO.
13. Sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, znamienny tym, że obejmuje hodowlę komórek układu gospodarz-wektor jak zdefiniowano w zastrz. 10 do 12, w warunkach pozwalających na wytworzenie polipeptydu fuzyjnego i odzyskanie tak wytworzonego polipeptydu fuzyjnego.
14. Dimeryczny antagonista receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VGEF), zawierający dwa fuzyjne polipeptydy, każdy polipeptyd zawierający:
PL 208 247 B1 (a) składnik receptora VGEE składający się z immunglobulino-podobnej (Ig) domeny 2 receptora Flt1 VGEF i domeny 3 Ig receptora Flk-1 lub FLk-4 VGEE; i (b) składnik multimeryzujący, przy czym składnik receptora VGEF jest jedynym składnikiem receptora VGEF każdego białka fuzyjnego.
15. Dimeryczny antagonista według zastrz. 14, znamienny tym, że jest zmodyfikowany przez acetylację lub pegylację.
16. Polipeptyd fuzyjny zawierający:
(a) składnik receptora VGEF składający się z immunglobulino-podobnej (Ig) domeny 2 receptora Flt1 VGEF i domeny 3 Ig receptora Flk-1 lub FLk-4 VGEF; i (b) składnik multimeryzujący, przy czym składnik receptora VGEF jest jedynym składnikiem receptora VGEF tego białka fuzyjnego.
17. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 16, znamienny tym, że składnik multimeryzujący zawiera domenę immunoglobulino-podobną.
18. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 17, znamienny tym, że domenę immunoglobulinową wybiera się spośród grupy obejmującej domenę Fc IgG i łańcuch ciężki IgG.
19. Polipeptyd fuzyjny według zastrz. 18, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną na fig. 21A-21C; fig. 22A-22C; lub fig. 24A-24C;
20. Zastosowanie polipeptydu fuzyjnego zdefiniowanego w zastrz. 16 do 19 lub dimerycznego antagonisty zdefiniowanego w zastrz. 14 lub 15 do produkcji leku do spowolniania lub zapobiegania wzrostu nowotworu, do osłabiania lub zapobiegania obrzękowi, osłabiania lub zapobiegania tworzenia się puchliny brzusznej, do zmniejszania lub zapobiegania wycieku osocza lub blokowania wzrostu naczynia krwionośnego u człowieka.
21. Zastosowanie według zastrz. 20, znamienne tym, że lek jest do leczenia chorób oczu charakteryzujących się przepuszczalnością naczyń.
22. Zastosowanie według zastrz. 20 lub 21, znamienne tym, że składniki polipeptydu fuzyjnego są uporządkowane jako 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 albo 3,2,1, przy czym 1 stanowi pierwszy składnik receptora VEGF, 2 stanowi drugi składnik receptora VEGF, a 3 stanowi składnik multimeryzujący.
23. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 20 do 22, znamienne tym, że polipeptyd fuzyjny jest kodowany przez sekwencję nukleotydową wybraną z grupy złożonej z:
(a) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 21A-21C;
(b) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 22A-22C;
(c) sekwencji nukleotydowej przedłożonej w fig. 24A-24C; i (d) sekwencji nukleotydowej która, z powodu degeneracji kodu genetycznego, różni się od sekwencji nukleotydowej z (a), (b) lub (c).
24. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 20 do 23, znamienne tym, że polipeptyd fuzyjny obejmuje sekwencję aminokwasową przedłożoną w fig. 24A-24C.
25. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrz. 20 do 24, znamienne tym, że chorobę oczu stanowi zwyrodnienie plamki związane z wiekiem lub retinopatia cukrzycowa.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US13813399P | 1999-06-08 | 1999-06-08 | |
PCT/US2000/014142 WO2000075319A1 (en) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL352246A1 PL352246A1 (en) | 2003-08-11 |
PL208247B1 true PL208247B1 (pl) | 2011-04-29 |
Family
ID=22480568
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL352246A PL208247B1 (pl) | 1999-06-08 | 2000-05-23 | Wyizolowana cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca składnik receptora czynnika wzrostu śródbłonka naczyń (VEGF), wektor ekspresji zawierający tą wyizolowaną cząsteczkę kwasu nukleinowego, układ gospodarz-wektor do wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, sposób wytwarzania polipeptydu fuzyjnego, dimeryczny antagonista receptora VEGF, polipeptyd fuzyjny i zastosowanie polipeptydu fuzyjnego |
Country Status (33)
Country | Link |
---|---|
EP (2) | EP1544299B1 (pl) |
JP (2) | JP4723140B2 (pl) |
KR (1) | KR100659477B1 (pl) |
CN (3) | CN101433715B (pl) |
AT (2) | ATE417928T1 (pl) |
AU (2) | AU779303B2 (pl) |
BE (1) | BE2013C029I2 (pl) |
BR (2) | BRPI0011407B8 (pl) |
CA (1) | CA2376379C (pl) |
CY (2) | CY1108883T1 (pl) |
CZ (2) | CZ303656B6 (pl) |
DE (2) | DE60019415T2 (pl) |
DK (2) | DK1544299T3 (pl) |
ES (2) | ES2319305T3 (pl) |
FR (1) | FR13C0028I2 (pl) |
HK (3) | HK1043388A1 (pl) |
HR (1) | HRP20010908B1 (pl) |
HU (3) | HU230159B1 (pl) |
IL (3) | IL146890A0 (pl) |
LT (1) | LTC1183353I2 (pl) |
LU (1) | LU92195I2 (pl) |
ME (2) | ME00024B (pl) |
MX (1) | MXPA01012630A (pl) |
NO (3) | NO330775B1 (pl) |
NZ (1) | NZ515913A (pl) |
PL (1) | PL208247B1 (pl) |
PT (2) | PT1183353E (pl) |
RS (1) | RS50073B (pl) |
RU (1) | RU2265661C2 (pl) |
SK (1) | SK287332B6 (pl) |
UA (1) | UA74146C2 (pl) |
WO (1) | WO2000075319A1 (pl) |
ZA (1) | ZA200110068B (pl) |
Families Citing this family (98)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6710174B2 (en) | 2001-09-13 | 2004-03-23 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression |
US6100071A (en) | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
US7070959B1 (en) | 1999-06-08 | 2006-07-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
US7396664B2 (en) | 1999-06-08 | 2008-07-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same |
US6833349B2 (en) * | 1999-06-08 | 2004-12-21 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of treating inflammatory skin diseases |
US7087411B2 (en) * | 1999-06-08 | 2006-08-08 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Fusion protein capable of binding VEGF |
JP4669984B2 (ja) | 2001-01-19 | 2011-04-13 | ベジェニクス リミテッド | 腫瘍画像化のターゲットとしてのF1t4(VEGFR−3)および抗腫瘍療法 |
US6734017B2 (en) | 2001-09-28 | 2004-05-11 | Isis Pharmaceuticals, Inc. | Antisense modulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression |
WO2004108069A2 (en) | 2002-05-04 | 2004-12-16 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth |
PL1608685T3 (pl) | 2003-03-28 | 2007-07-31 | Regeneron Pharma | Antagoniści VEGF do leczenia cukrzycy |
ES2616749T3 (es) | 2003-05-16 | 2017-06-14 | Acorda Therapeutics, Inc. | Mutantes degradantes del proteoglucano para el tratamiento del SNC |
US7959914B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-06-14 | Acorda Therapeutics, Inc. | Methods of reducing extravasation of inflammatory cells |
ES2831031T3 (es) * | 2003-05-16 | 2021-06-07 | Acorda Therapeutics Inc | Proteínas de fusión para el tratamiento del CNS |
WO2004106378A2 (en) * | 2003-05-28 | 2004-12-09 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating corneal transplant rejection by using vegf antagonists |
US7186699B2 (en) | 2003-06-03 | 2007-03-06 | Cell Genesys, Inc. | Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes |
WO2004110490A2 (en) * | 2003-06-06 | 2004-12-23 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of vegf inhibitors for tumor regression |
US7399612B2 (en) | 2003-06-30 | 2008-07-15 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same |
AR046510A1 (es) * | 2003-07-25 | 2005-12-14 | Regeneron Pharma | Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo |
WO2005016369A1 (en) * | 2003-08-06 | 2005-02-24 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of a vegf antagonist in combination with radiation therapy |
CA2566731C (en) | 2004-05-18 | 2012-07-24 | Acorda Therapeutics, Inc. | Methods of purifying chondroitinase and stable formulations thereof |
CA2569108C (en) | 2004-06-08 | 2012-08-21 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co. Ltd | Angiogenesis-inhibiting chimeric protein and the use |
AU2005254058A1 (en) | 2004-06-10 | 2005-12-29 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Use of VEGF inhibitors for the treatment of human cancer |
AU2005265071A1 (en) * | 2004-06-18 | 2006-01-26 | Memorial Sloan-Kettering Cancer Center | VEGF inhibitors for the treatment of malignant pleural effusion |
MX2007001241A (es) | 2004-07-30 | 2007-07-11 | Regeneron Pharma | Metodos para tratar diabetes tipo i mediante el bloqueo de la actividad mediada de vegf. |
PL2229956T3 (pl) | 2004-09-13 | 2013-09-30 | Genzyme Corp | Konstrukty multimeryczne |
FR2878749B1 (fr) * | 2004-12-03 | 2007-12-21 | Aventis Pharma Sa | Combinaisons antitumorales contenant en agent inhibiteur de vegt et du 5fu ou un de ses derives |
US7303748B2 (en) | 2005-02-02 | 2007-12-04 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Method of treating eye injury with local administration of a VEGF inhibitor |
WO2006104852A2 (en) | 2005-03-25 | 2006-10-05 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Vegf antagonist formulations |
JP5189985B2 (ja) | 2005-09-26 | 2013-04-24 | アコーダ セラピューティクス、インク. | コンドロイチナーゼabci変異体を用いた組成物およびその使用方法 |
PT1962895E (pt) † | 2005-12-16 | 2013-03-28 | Regeneron Pharma | Utilização terapêutica de um antagonista dll4 e de um inibidor fcev para inibição de crescimento de tumores |
FR2895258B1 (fr) | 2005-12-22 | 2008-03-21 | Aventis Pharma Sa | Combinaison comprenant de la combretastatine et des agents anticancereux |
CN100502945C (zh) * | 2006-03-31 | 2009-06-24 | 成都康弘生物科技有限公司 | Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用 |
US8216575B2 (en) | 2006-03-31 | 2012-07-10 | Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. | Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains |
MX2008016124A (es) | 2006-06-16 | 2009-01-20 | Regeneron Pharma | Formulaciones antagonistas de vegf adecuadas para la administracion intravitreal. |
MX2009003229A (es) | 2006-09-29 | 2009-06-18 | Oncomed Pharm Inc | Composiciones y metodos para diagnosticar y tratar cancer. |
EP2450442B1 (en) | 2006-10-10 | 2017-07-19 | Acorda Therapeutics, Inc. | Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants |
FR2918279B1 (fr) * | 2007-07-05 | 2010-10-22 | Aventis Pharma Sa | Combinaisons antitumorales contenant un agent inhibiteur de vegf et de l'irinotecan |
CN101575379B (zh) * | 2008-05-09 | 2012-05-30 | 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 | 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途 |
ES2836948T3 (es) | 2008-11-03 | 2021-06-28 | Molecular Partners Ag | Proteínas de unión que inhiben la interacción del receptor de VEGF-A |
CN101838329A (zh) * | 2009-03-18 | 2010-09-22 | 嘉和生物药业有限公司 | 抗血管新生融合蛋白 |
ES2895226T3 (es) | 2009-10-16 | 2022-02-18 | Mereo Biopharma 5 Inc | Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos |
AR081361A1 (es) * | 2010-04-30 | 2012-08-29 | Molecular Partners Ag | Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a |
EP3327032A1 (en) | 2010-08-06 | 2018-05-30 | Genzyme Corporation | Vegf antagonist compositions and uses thereof |
JP6043629B2 (ja) * | 2011-01-07 | 2016-12-14 | 中外製薬株式会社 | 抗体の物性を改善させる方法 |
KR20190049934A (ko) | 2011-01-13 | 2019-05-09 | 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. | 혈관신생 눈 장애를 치료하기 위한 vegf 길항제의 용도 |
JO3283B1 (ar) | 2011-04-26 | 2018-09-16 | Sanofi Sa | تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI) |
KR101397088B1 (ko) | 2011-06-10 | 2014-05-19 | 강원대학교산학협력단 | 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물 |
JO3370B1 (ar) * | 2011-11-10 | 2019-03-13 | Regeneron Pharma | طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6 |
ES2651521T3 (es) * | 2011-12-01 | 2018-01-26 | Innovent Biologics, Inc. | Inhibidores proteicos de las rutas del complemento y de VEGF y métodos de uso de los mismos |
CN103304668B (zh) * | 2012-03-12 | 2015-10-28 | 江苏健德生物药业有限公司 | Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制备方法及其应用 |
DK2846836T3 (da) | 2012-05-07 | 2019-11-11 | Allergan Inc | Fremgangsmåde til behandling af amd hos patienter, der er refraktære overfor anti-vegf-terapi |
WO2014006113A1 (en) | 2012-07-03 | 2014-01-09 | Sanofi | Method of treating cancer by effective amounts of aflibercept |
AR093445A1 (es) | 2012-11-14 | 2015-06-10 | Regeneron Pharma | Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4 |
CA2901226C (en) | 2013-02-18 | 2020-11-17 | Vegenics Pty Limited | Vascular endothelial growth factor binding proteins |
AR095196A1 (es) * | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Regeneron Pharma | Medio de cultivo celular libre de suero |
CN104193828B (zh) * | 2013-09-12 | 2017-04-05 | 北京韩美药品有限公司 | 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白 |
EP3065761B1 (en) | 2013-11-05 | 2020-01-08 | Allergan, Inc. | Method of treating conditions of the eye with an anti-vegf darpin |
EP3143044A1 (en) | 2014-05-12 | 2017-03-22 | Formycon AG | Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist |
ES2732925T3 (es) | 2014-07-18 | 2019-11-26 | Sanofi Sa | Método para predecir el resultado de un tratamiento con aflibercept de un paciente que se sospecha que padece un cáncer |
JP2016036322A (ja) * | 2014-08-11 | 2016-03-22 | 日本化薬株式会社 | 血管新生因子と結合するキメラタンパク質 |
SI3230316T1 (sl) | 2014-12-11 | 2022-05-31 | Bayer Healthcare Llc | Zdravljenje starostne degeneracije makule z majhno aktivno horoidalno neovaskularizacijsko lezijo |
GB201503453D0 (en) | 2015-03-01 | 2015-04-15 | Jain Arjun | Endothelin-1"sponge" |
TW202330904A (zh) | 2015-08-04 | 2023-08-01 | 美商再生元醫藥公司 | 補充牛磺酸之細胞培養基及用法 |
WO2017046140A1 (en) | 2015-09-18 | 2017-03-23 | Bayer Pharma Aktiengesellschaft | Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia |
WO2017065559A1 (ko) | 2015-10-15 | 2017-04-20 | (주)알테오젠 | Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
KR101936049B1 (ko) * | 2015-10-15 | 2019-01-08 | (주)알테오젠 | IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법 |
US20180326126A1 (en) | 2015-11-18 | 2018-11-15 | Formycon Ag | Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist |
KR102354198B1 (ko) | 2015-11-18 | 2022-01-20 | 에스아이오2 메디컬 프로덕츠, 인크. | Vegf-길항제의 액체 제제를 포함하는 사전-충전된 제약 패키지 |
US11654046B2 (en) | 2015-11-18 | 2023-05-23 | Sio2 Medical Products, Inc. | Pharmaceutical package for ophthalmic formulations |
CA3005391A1 (en) * | 2015-11-19 | 2017-05-26 | Zhuhai Tairuishang Biopharm Ltd. | Methods and compositions for binding vegf |
LT3384049T (lt) | 2015-12-03 | 2023-09-11 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Genetinių variacijų susiejimo su klinikiniais rezultatais būdai pacientams, sergantiems amžine geltonosios dėmės degeneracija, gydytiems anti-vegf |
JP6953433B2 (ja) | 2016-01-26 | 2021-10-27 | フォーマイコン アーゲーFormycon Ag | Vegfアンタゴニストを含む液体医薬組成物および同医薬組成物を含有する充填済みシリンジ |
JPWO2018070390A1 (ja) | 2016-10-12 | 2019-08-22 | 第一三共株式会社 | 抗robo4抗体と他剤を含む組成物 |
WO2018094316A1 (en) | 2016-11-21 | 2018-05-24 | Just Biotherapeutics, Inc. | Aflibercept formulations and uses thereof |
EP3630062A2 (en) | 2017-05-24 | 2020-04-08 | SiO2 Medical Products, Inc. | Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations |
EP3630043A1 (en) | 2017-05-24 | 2020-04-08 | Formycon AG | Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist |
WO2018215580A1 (en) | 2017-05-24 | 2018-11-29 | Formycon Ag | Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist |
TW201904610A (zh) | 2017-06-14 | 2019-02-01 | 德商拜耳製藥公司 | 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑 |
WO2019020777A1 (en) | 2017-07-26 | 2019-01-31 | Formycon Ag | LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST |
CA3067735A1 (en) | 2017-08-17 | 2019-02-21 | Just Biotherapeutics, Inc. | Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants |
JP7183268B2 (ja) | 2017-11-20 | 2022-12-05 | ジャスト-エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド | 等張化剤としてリジン塩を含有するアフリベルセプト製剤及びその使用 |
DK3717636T3 (da) | 2017-11-27 | 2023-05-30 | 4D Molecular Therapeutics Inc | Adeno-associeret-virus-variantcapsider og anvendelse til inhibering af angiogenese |
JP7339248B2 (ja) | 2017-11-30 | 2023-09-05 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | 血管形成眼障害を処置するためのvegfアンタゴニストの使用 |
CN117405806A (zh) * | 2017-12-13 | 2024-01-16 | 里珍纳龙药品有限公司 | 管理层析柱床支架的装置和系统及相关方法 |
CN116059318A (zh) | 2018-01-26 | 2023-05-05 | 加利福尼亚大学董事会 | 用于使用抗vegf剂治疗血管生成病症的方法和组合物 |
AU2019265005A1 (en) | 2018-05-10 | 2020-12-17 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | High concentration vegf receptor fusion protein containing formulations |
US11519020B2 (en) | 2018-05-25 | 2022-12-06 | Regeneron Pharmaceuticals, Inc. | Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF |
CN111378044B (zh) | 2018-12-28 | 2022-07-15 | 长春金赛药业有限责任公司 | 抗体融合蛋白、制备方法及其应用 |
US20220204920A1 (en) | 2019-05-16 | 2022-06-30 | Formycon Ag | Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins |
CA3150481A1 (en) | 2019-09-03 | 2021-03-11 | Amgen Inc. | Injection device for drug delivery and packaging for the injection device |
US20210077645A1 (en) | 2019-09-16 | 2021-03-18 | Amgen Inc. | Method for external sterilization of drug delivery device |
CA3157509A1 (en) | 2019-10-10 | 2021-04-15 | Kodiak Sciences Inc. | Methods of treating an eye disorder |
WO2021108255A1 (en) | 2019-11-25 | 2021-06-03 | The Regents Of The University Of California | Long-acting vegf inhibitors for intraocular neovascularization |
NZ781143A (en) * | 2019-12-06 | 2023-05-26 | Regeneron Pharma | Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same |
JP2023505216A (ja) | 2019-12-06 | 2023-02-08 | リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド | Vegfミニトラップおよびそれらの使用方法 |
JP2023514325A (ja) | 2020-02-24 | 2023-04-05 | アムジエン・インコーポレーテツド | 薬物送達デバイスの外部滅菌中に使用するための容器及びシステム |
EP4145456A1 (en) | 2021-09-06 | 2023-03-08 | Bayer AG | Prediction of a change related to a macular fluid |
WO2024029876A1 (ko) * | 2022-08-02 | 2024-02-08 | 주식회사 파노로스바이오사이언스 | 변형된 융합 단백질 및 이의 용도 |
Family Cites Families (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
GB9506466D0 (en) * | 1994-08-26 | 1995-05-17 | Prolifix Ltd | Cell cycle regulated repressor and dna element |
US6100071A (en) * | 1996-05-07 | 2000-08-08 | Genentech, Inc. | Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production |
-
2000
- 2000-05-23 RS YUP-869/01A patent/RS50073B/sr unknown
- 2000-05-23 CN CN2008101093559A patent/CN101433715B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 ME MEP-2008-32A patent/ME00024B/me unknown
- 2000-05-23 DE DE60019415T patent/DE60019415T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 DK DK05001328T patent/DK1544299T3/da active
- 2000-05-23 CN CNB008115443A patent/CN100523187C/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 JP JP2001502582A patent/JP4723140B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 ME MEP-32/08A patent/MEP3208A/xx unknown
- 2000-05-23 CA CA002376379A patent/CA2376379C/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 AU AU50404/00A patent/AU779303B2/en active Active
- 2000-05-23 MX MXPA01012630A patent/MXPA01012630A/es active IP Right Grant
- 2000-05-23 PL PL352246A patent/PL208247B1/pl active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 PT PT00932721T patent/PT1183353E/pt unknown
- 2000-05-23 HU HU1300086A patent/HU230159B1/hu unknown
- 2000-05-23 PT PT05001328T patent/PT1544299E/pt unknown
- 2000-05-23 AT AT05001328T patent/ATE417928T1/de active
- 2000-05-23 ES ES05001328T patent/ES2319305T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 AT AT00932721T patent/ATE293164T1/de active
- 2000-05-23 ES ES00932721T patent/ES2237429T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 EP EP05001328A patent/EP1544299B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 NZ NZ515913A patent/NZ515913A/xx not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 SK SK1752-2001A patent/SK287332B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 CZ CZ20100386A patent/CZ303656B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 CZ CZ20014387A patent/CZ302689B6/cs unknown
- 2000-05-23 DE DE60041159T patent/DE60041159D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 DK DK00932721T patent/DK1183353T3/da active
- 2000-05-23 KR KR1020017015839A patent/KR100659477B1/ko active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 BR BRPI0011407A patent/BRPI0011407B8/pt unknown
- 2000-05-23 EP EP00932721A patent/EP1183353B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 HU HU0201515A patent/HU229156B1/hu active Protection Beyond IP Right Term
- 2000-05-23 IL IL14689000A patent/IL146890A0/xx unknown
- 2000-05-23 BR BR0011407-3A patent/BR0011407A/pt not_active IP Right Cessation
- 2000-05-23 WO PCT/US2000/014142 patent/WO2000075319A1/en active Application Filing
- 2000-05-23 CN CN201310118971.1A patent/CN103349781B/zh not_active Expired - Lifetime
- 2000-05-23 UA UA2001128378A patent/UA74146C2/uk unknown
- 2000-05-23 RU RU2002100071/13A patent/RU2265661C2/ru active Protection Beyond IP Right Term
-
2001
- 2001-12-03 IL IL146890A patent/IL146890A/en active Protection Beyond IP Right Term
- 2001-12-06 ZA ZA200110068A patent/ZA200110068B/xx unknown
- 2001-12-07 HR HR20010908A patent/HRP20010908B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2001-12-10 NO NO20016036A patent/NO330775B1/no active Protection Beyond IP Right Term
-
2002
- 2002-07-04 HK HK02105009A patent/HK1043388A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-03-31 AU AU2005201365A patent/AU2005201365B2/en not_active Expired
-
2008
- 2008-03-17 IL IL190234A patent/IL190234A0/en not_active IP Right Cessation
-
2009
- 2009-03-16 CY CY20091100288T patent/CY1108883T1/el unknown
- 2009-11-05 HK HK09110323.8A patent/HK1132653A1/xx unknown
-
2010
- 2010-05-06 NO NO20100656A patent/NO332559B1/no not_active IP Right Cessation
- 2010-10-06 JP JP2010226970A patent/JP5273746B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2013
- 2013-05-13 BE BE2013C029C patent/BE2013C029I2/fr unknown
- 2013-05-13 CY CY2013019C patent/CY2013019I2/el unknown
- 2013-05-14 FR FR13C0028C patent/FR13C0028I2/fr active Active
- 2013-05-14 LU LU92195C patent/LU92195I2/fr unknown
- 2013-05-14 LT LTPA2013009C patent/LTC1183353I2/lt unknown
- 2013-05-15 NO NO2013010C patent/NO2013010I1/no unknown
- 2013-09-17 HU HUS1300052C patent/HUS1300052I1/hu unknown
- 2013-11-26 HK HK13113191.5A patent/HK1185798A1/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US10392430B2 (en) | Methods of making nucleic acid molecules encoding modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties | |
EP1183353B1 (en) | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties | |
CA2588221C (en) | Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
RECP | Rectifications of patent specification | ||
SPCF | Application for a supplementary protection certificate |
Free format text: PRODUCT NAMES: EYLEA - AFLIBERCEPT AND ZALTRAP - AFLIBERCEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/12/797/001-002 20121122, U/1/12/814 20130201 Spc suppl protection certif: 0229/0208247 Filing date: 20130429 |