JP4723140B2 - 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド - Google Patents

Description

【０００１】
本出願は、米国仮出願第６０／１３８，１３３号（１９９９年、６月８日出願）の優先権を主張する。本出願の全体に渡って、種々の出版物が参照される。これらの出版物の開示はその全体において、本出願の中に参考として本出願によって援用される。
【０００２】
（序文）
本発明の分野は、改善された薬物動態を有する改変されたポリペプチドである。特に、本発明の分野は、薬物動態のプロフィールを改善するような方法で改変されたＦｌｔ１レセプターポリペプチドに関する。本発明の分野はまた、その改変されたポリペプチドを作製および使用する方法に関し、その方法は、哺乳動物における血漿漏出および／または血管透過性を減少もしくは阻害するためにその改変されたポリペプチドを使用することを含むが、これに限定されない。
【０００３】
（背景）
細胞に結合し、それにより表現型応答（例えば、細胞増殖、生存、細胞産物の分泌または分化）を誘発するポリペプチドリガンドの能力は、細胞上の膜貫通レセプターによってしばしば媒介される。そのようなレセプターの細胞外ドメイン（すなわち、細胞表面上に提示されるレセプターの部分）は、タンパク質にそのリガンド結合特徴を提供するので、一般的に、その分子の最も特徴的な部分である。リガンドの細胞外ドメインへの結合は、一般的に、細胞内標的へ生物学的シグナルを伝達するシグナル伝達を生じる。しばしば、このシグナル伝達は、触媒的細胞内ドメインを介して作用する。この触媒的細胞内ドメインの配列モチーフの特定のアレイ（ａｒｒａｙ）は、潜在的キナーゼ基質へのその接近を決定する（Ｍｏｈａｍｍａｄｉら、１９９０、Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１１：５０６８−５０７８；Ｆａｎｔｌら、１９９２、Ｃｅｌｌ ６９：４１３−４１３）。触媒的細胞内ドメインを介してシグナルを伝達するレセプターの例としては、レセプターチロシンキナーゼ（ＲＴＫ）（例えば、神経系の細胞に一般的に限定されるＴｒｋファミリーのレセプター）、これもまた神経系の細胞に一般的に限定される３部（ｔｒｉｐａｒｔａｔｅ）から成るＣＮＴＦレセプター複合体（ＳｔａｈｌおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、１９９４、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｂｉｏ．２５：１４５４−１４６６）を含むサイトカインファミリーのレセプター、Ｇタンパク質結合レセプター（例えば、心筋細胞上に見出されるβ₂−アドレナリン作用性レセプター）ならびに大部分が肥満細胞および好塩基性細胞上に局在する多量体ＩｇＥ高親和性レセプターＦｃεＲＩ（ＳｕｔｔｏｎおよびＧｏｕｌｄ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：４２１−４２８）が挙げられる。
【０００４】
これまで同定された全てのレセプターは、二量体化、多量体化、またはリガンド結合後のいくつかの関連したコンホメーション変化を経験するようであり（Ｓｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ，Ｊ．，１９８８、Ｔｒｅｎｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｓｃｉ．１３：４４３−４４７；ＵｌｌｒｉｃｈおよびＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒ、１９９０、Ｃｅｌｌ ６１：２０３−２１２；ＳｃｈｌｅｓｓｉｎｇｅｒおよびＵｌｌｒｉｃｈ、１９９２、Ｎｅｕｒｏｎ ９：３８３−３９１）、そして二量体化した細胞内ドメイン間の分子相互作用は、触媒機能の活性化をもたらす。いくつかの場合において、例えば、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）のようなリガンドは、２つのレセプター分子と結合する二量体であるが（Ｈａｒｔら、１９８８、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４０：１５２９−１５３１；Ｈｅｌｄｉｎ、１９８９、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：８９０５−８９１２）、上皮増殖因子（ＥＧＦ）の場合において、このリガンドは、単量体である（Ｗｅｂｅｒら、１９８４、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５９：１４６３１−１４６３６）。ＦｃεＲＩレセプターの場合において、リガンド（ＩｇＥ）は、単量体の様式においてＦｃεＲＩと結合して存在し、そして抗原がＩｇＥ／ＦｃεＲＩ複合体と結合し、そして隣接するＩｇＥ分子と架橋する場合においてのみ、活性化する（ＳｕｔｔｏｎおよびＧｏｕｌｄ、１９９３、Ｎａｔｕｒｅ ３６６：４２１−４２８）。
【０００５】
しばしば、高等生物内の特定のレセプターの組織分布は、そのレセプターの生物学的機能に関する洞察を提供する。いくつかの増殖因子および分化因子（例えば、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ））に対するＲＴＫは、広範に発現され、そのため、組織増殖および組織維持においていくつかの一般的な役割を果たすようである。Ｔｒｋ ＲＴＫファミリーのメンバー（ＧｌａｓｓおよびＹａｎｃｏｐｏｕｌｏｓ、１９９３、Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．３：２６２−２６８）のレセプターは、より一般的に、神経系の細胞に限定され、そして神経成長因子ファミリーは、神経成長因子（ＮＧＦ）、脳誘導神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）およびニューロトロフィン−４／５（ＮＴ−４／５）から構成され、これらはＴｒｋ ＲＴＫファミリーレセプターと結合し、脳および末梢におけるニューロンの多様な群の分化を促進する（Ｌｉｎｄｓａｙ，Ｒ．Ｍ、１９９３、Ｎｅｕｒｏｔｒｏｐｈｉｃ Ｆａｃｔｏｒｓ，Ｓ．Ｅ．ＬｏｕｇｈｌｉｎおよびＪ．Ｈ．Ｆａｌｌｏｎ、編、２５７−２８４頁、Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）。ＦｃεＲＩは、非常に限られた数の型の細胞（例えば、肥満細胞および好塩基性細胞）に局在する。肥満細胞は、骨髄多能性造血幹細胞系統に由来するが、血流から移動した後に組織においてそれらの成熟を完了させ（ＪａｎｅｗａｙおよびＴｒａｖｅｒｓ、１９９６、Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ、第２版、Ｍ．ＲｏｂｅｒｔｓｏｎおよびＥ．Ｌａｗｒｅｎｃｅ、編、１：３−１：４頁、（発行元）Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｔｄ．，Ｌｏｎｄｏｎ，ＵＫ，を参照のこと）、そしてアレルギー性応答に関与する。
【０００６】
多くの研究は、レセプターの細胞外ドメインは、特定のリガンド結合特徴を提供するということを実証してきた。さらに、レセプターが発現される細胞環境は、リガンドがレセプターに結合する際に示される生物学的応答に影響を及ぼし得る。例えば、Ｔｒｋレセプターを発現するニューロン細胞が、そのレセプターに結合するニューロトロフィンに曝露される場合、ニューロンの生存および分化が生じる。同じレセプターが線維芽細胞により発現される場合、ニューロトロフィンへの曝露は、線維芽細胞の増殖を生じる（Ｇｌａｓｓら、１９９１、Ｃｅｌｌ ６６：４０５−４１３）。
【０００７】
血管内皮細胞に対する選択性を有する細胞誘導二量体マイトジェンのクラスが同定され、そして血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）と命名されている。ＶＥＧＦは、ラット神経膠腫細胞の馴化増殖培地［Ｃｏｎｎら、（１９９０）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，８７．２６２８−２６３２頁］；およびウシ下垂体小胞星細胞の馴化増殖培地［ＦｅｒｒａｒａおよびＨｅｎｚｅｌ、（１９８９）、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．，１６１、８５１−８５８頁；Ｇｏｚｐａｄｏｒｏｗｉｃｚら、（１９８９）、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８６、７３１１−７３１５頁］およびヒトＵ９３７細胞に由来する馴化増殖培地［Ｃｏｎｎｏｌｌｙ，Ｄ．Ｔ．ら、（１９８９）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２４６、１３０９−１３１２頁］から精製された。ＶＥＧＦは、約４６ｋＤａの見掛けの分子量を有する二量体（各サブユニットは、約２３ｋＤａの見掛けの分子量を有する）である。ＶＥＧＦは、血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）（これは、結合組織の細胞に対するマイトジェンであるが、大血管に由来する血管内皮細胞に対してはマイトジェンではない）に対していくつかの構造的な類似性を有する。
【０００８】
膜結合チロシンキナーゼレセプター（Ｆｌｔとして公知）は、ＶＥＧＦレセプターであることが示された［ＤｅＶｒｉｅｓ，Ｃ．ら、（１９９２）、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２５５、９８９−９９１頁］。Ｆｌｔレセプターは、有糸分裂誘発を誘導するＶＥＧＦと特異的に結合する。ＶＥＧＦレセプターの別の形態（ＫＤＲと命名される）もまた、ＶＥＧＦに結合し、そして有糸分裂誘発を誘導することが公知である。ＫＤＲの部分的なｃＤＮＡ配列およびほぼ全長のタンパク質配列もまた同様に公知である［Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉら、（１９９１）Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ６、１６７７−１６８３頁；Ｔｅｒｍａｎ，Ｂ．Ｉ．ら、（１９９２）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍ．１８７、１５７９−１５８６頁］。
【０００９】
持続性新脈管形成は、特定の疾患（例えば、乾癬、慢性関節リウマチ、血管腫、血管線維腫、糖尿病性網膜症および血管新生緑内障）を引き起こし得るか、または悪化させ得る。ＶＥＧＦ活性のインヒビターは、そのような疾患および他のＶＥＧＦ誘導の病的新脈管形成ならびに血管透過性状態（例えば、腫瘍血管新生）に対する処置として有用である。本発明は、ＶＥＧＦレセプターＦｌｔ１に基づくＶＥＧＦインヒビターに関する。
【００１０】
血漿漏出（炎症の重要な構成要素）は、微小血管の異なるサブセットにおいて生じる。具体的には、ほとんどの器官において、血漿漏出は特に小静脈において生じる。小動脈および毛細管とは異なり、小静脈は、多数の炎症性メディエーター（ヒスタミン、ブラジキニン、およびセロトニンを含む）に応じて漏出性になる。炎症の１つの特徴は、小静脈の内皮において形成する細胞間間隙から生じる血漿漏出である。炎症の最も実験的なモデルは、これらの細胞間間隙は、後毛細管小静脈の内皮細胞と集合小静脈の内皮細胞との間に生じるということを示す（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐａｔｈｏｌ．１９９８ １５２：１４６３−７６）。特定のレクチンを使用して、炎症性小静脈内の内皮細胞境界における血漿漏出、内皮の間隙、および指様突起の限局的部位の特徴を明らかにし得るということが示されてきた（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．ら、Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９９６、２７１：Ｈ２５４７−６２）。特に、植物レクチンは、例えば、ラット気管の炎症性小静脈内の内皮細胞境界における形態学的変化を可視化するために使用されてきた。炎症性小静脈に限局的に結合するレクチン（例えば、コンカナバリンＡおよびリシン）は、血漿漏出部位に対応する間隙により露出された内皮下血管壁の領域を明らかにする（Ｔｈｕｒｓｔｏｎ，Ｇ．ら、Ａｍ Ｊ Ｐｈｙｓｉｏｌ、１９９６、２７１：Ｈ２５４７−６２）。
【００１１】
微小血管の特性は、動的である。例えば、慢性炎症疾患は、微小血管リモデリング（新脈管形成および微小血管拡大を含む）に関連する。微小血管はまた、異常表現型の特性を獲得することによってリモデリングされ得る。慢性気道炎症のマウスモデルにおいて、気道毛細管は、小静脈の特性（広げられた血管直径、フォン・ビルブラント因子に対する増加した免疫反応性、およびＰ−セレクチンに対する増加した免疫反応性を含む）を獲得する。さらに、これらのリモデリングされた血管は、炎症性メディエーターに応じて漏出するが、正常マウスの気道の同じ位置における血管は、漏出しない。
【００１２】
特定の物質は、血管透過性および／または血漿漏出を減少させるか、または阻害することを示してきた。例えば、ミスチキン（ｍｙｓｔｉｘｉｎ）は、内皮間隙形成をブロックすることを伴わずに血漿漏出を阻害することが報告されている合成ポリペプチドである（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．ら、Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．，１９９８、２８４：６９３−９）。また、β２−アドレナリン作用性レセプターアゴニスト（フォルモテロール）は、内皮間隙形成を阻害することによって微小血管漏出を減少させる（Ｂａｌｕｋ，Ｐ．およびＭｃＤｏｎａｌｄ，Ｄ．Ｍ．，Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．，１９９４、２６６：Ｌ４６１−８）。
【００１３】
アンジオポイエチン（ａｎｇｉｏｐｏｉｅｔｉｎ）および血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）ファミリーのメンバーは、主に血管内皮細胞に対して特異的であると考えられる唯一の増殖因子である。マウスにおける標的遺伝子不活性化研究は、ＶＥＧＦは血管発生の初期段階に不可欠であり、そしてＡｎｇ−１は血管リモデリングの後期段階に必要とされるということを示している。
【００１４】
米国特許第６，０１１，００３号（２０００年、１月４日発行）は、Ｍｅｔｒｉｓ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ Ｌｉｍｉｔｅｄの名において、ＦＬＴポリペプチドの改変された可溶性形態は、ＶＥＧＦを結合し得、それによりＶＥＧＦに対して阻害効果を及ぼし、そのポリペプチドは、５つ以下の完全免疫グロブリンドメインを含むということを開示している。
【００１５】
米国特許第５，７１２，３８０号（１９９８年、１月２７日発行され、そしてＭｅｒｃｋ＆Ｃｏ．に譲渡されている）は、天然に存在しているか、またはＶＥＧＦに対するレセプターのＣ末端膜貫通領域を伴うかもしくは伴わない組換え操作された可溶性形態である血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）インヒビターを開示している。
【００１６】
また、ＰＣＴ公開番号ＷＯ９８／１３０７１（１９９８年、４月２日公開）は、ＭｅｒｃｋおよびＣｏ．に譲渡されており、これは、ＶＥＧＦと結合する可溶性レセプタータンパク質をコードするヌクレオチド配列の遺伝子転移によって、原発性腫瘍増殖および転移を阻害するための遺伝子治療方法論を開示している。
【００１７】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／４４４５３（１９９７年、１１月２７日公開）は、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．の名において、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）レセプターＦｌｔ１およびＫＤＲ（ヒトＫＤＲレセプターＦＬＫ１に対するマウスホモログを含む）に由来するアミノ酸配列を含む新規なキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質を開示しており、ここでそのキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質は、ＶＥＧＦに結合し、そしてその内皮細胞増殖および脈管形成活性をアンタゴナイズする。
【００１８】
ＰＣＴ公開番号ＷＯ９７／１３７８７（１９９７年、４月１７日公開）は、Ｔｏａ Ｇｏｓｅｉ Ｃｏ．，ＬＴＤの名において、新生血管形成（例えば、固体腫瘍）が付随する疾患の処置において有効な低分子量ＶＥＧＦインヒビターを開示している。ＶＥＧＦレセプターＦＬＴの細胞外領域において、第１の免疫グロブリン様ドメインおよび第２の免疫グロブリン様ドメインを含むが、その第６の免疫グロブリン様ドメインおよび第７の免疫グロブリン様ドメインを含まないポリペプチドは、ＶＥＧＦ阻害活性を示す。
【００１９】
Ｓｈａｒｉｆｉ，Ｊ．ら、１９９８、Ｔｈｅ Ｑｕａｒｔｅｒｌｙ Ｊｏｕｒ．ｏｆ Ｎｕｃｌ．Ｍｅｄ．４２：２４２−２４９は、モノクローナル抗体（ＭＡｂ）は塩基性で正に荷電したタンパク質あり、そして哺乳動物細胞は負に荷電しているという理由により、その２者の間の静電気的相互作用は、より高いレベルのバックグランド結合を生成し得、腫瘍対正常器官の比率が低くなるということを開示している。この影響を克服するために、研究者らは、種々の方法（例えば、第２の薬剤ならびにＭＡｂそれ自体の化学改変および荷電改変）を使用することによってＭＡｂクリアランスを改善することを試みた。
【００２０】
Ｊｅｎｓｅｎ−Ｐｉｐｐｏら、１９９６、Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １３：１０２−１０７は、治療タンパク質のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）（組換えヒト顆粒球コロニー刺激因子（ＰＥＧ−Ｇ−ＣＳＦ））は、十二指腸内の経路により投与される場合、インビボ生物活性の安定性および維持の増加を生じるということを開示している。
【００２１】
Ｔｓｕｔｓｕｍｉら、１９９７、Ｔｈｒｏｍｂ Ｈａｅｍｏｓｔ．７７：１６８−７３は、ポリエチレングリコール改変化インターロイキン−６（ＭＰＥＧ−ＩＬ−６）（ＩＬ−６の５４％の１４リジンアミノ基をＰＥＧと結合させた）のインビボ血小板新生活性を、ネイティブＩＬ−６のインビボ血小板新生活性と比較した実験を開示している。
【００２２】
Ｙａｎｇら、１９９５、Ｃａｎｃｅｒ ７６：６８７−９４、は、ポリエチレングリコールの組換えヒトインターロイキン−２（ＩＬ−２）への結合は、化合物のポリエチレングリコール改変化ＩＬ−２（ＰＥＧ−ＩＬ−２）を生じ、この化合物は、ＩＬ−２のインビトロ活性およびインビボ活性を維持するが、著しく延長された循環半減期を示す、ということを開示している。
【００２３】
Ｒ．ＤｕｎｃａｎおよびＦ．Ｓｐｒｅａｆｉｃｏ、Ｃｌｉｎ．Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔ．２７：２９０−３０６、２９６（１９９４）は、ポリエチレングリコールを結合させることによってアスパラギナーゼの血漿半減期を改善する試みを再検討している。
【００２４】
ＰＣＴ国際公開番号ＷＯ９９／０３９９６（１９９９年１月２８日公開）は、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．およびＴｈｅ Ｒｅｇｅｎｔｓ ｏｆ Ｔｈｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａの名において、塩基性アミノ酸の領域が欠失されている改変されたヒトノジン（ｎｏｇｇｉｎ）ポリペプチドを記載している。この改変されたヒトノジンポリペプチドは、改変されていないヒトノジンと比べてヘパリンに対する減少した親和性および動物血清においてより優れた薬物動態を有しながら、生物学的活性を維持するものとして記載される。
【００２５】
（発明の要旨）
本発明は、改善された薬物動態の特性を有するＶＥＧＦアンタゴニストに関する。好ましい実施形態は、ＶＥＧＦポリペプチドと結合し得る融合ポリペプチドをコードする単離された核酸分子であり、その核酸分子は、（ｂ）多量体化（ｍｕｌｔｉｍｅｒｉｚｉｎｇ）成分をコードするヌクレオチド配列に（ａ）作動可能に連結されたＶＥＧＦレセプター成分をコードするヌクレオチド配列を含み、ここで、ＶＥＧＦレセプター成分は、融合ポリペプチドの唯一のＶＥＧＦレセプター成分であり、そしてここで、（ａ）のヌクレオチド配列は、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列および第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から本質的に構成される。
【００２６】
さらなる実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターの単離された核酸は、Ｆｌｔ１である。
【００２７】
さらなる実施形態において、第２のＶＥＧＦレセプターの単離された核酸は、Ｆｌｋ１である。
【００２８】
また別の実施形態において、第２のＶＥＧＦレセプターの単離された核酸は、Ｆｌｔ４である。
【００２９】
別の好ましい実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２をコードするヌクレオチド配列は、第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の上流にある。
【００３０】
さらなる別の好ましい実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２をコードするヌクレオチド配列は、第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の下流である。
【００３１】
本発明の好ましい実施形態において、多量体化成分は、免疫グロブリンドメインを含む。
【００３２】
別の実施形態において、免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖からなる群から選択される。
【００３３】
好ましい実施形態は、改変されたＦｌｔ１レセプター融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を含み、ここで核酸分子のコード領域は、以下：
（ａ）図１３Ａ−１３Ｄに示されるヌクレオチド配列；
（ｂ）図１４Ａ−１４Ｃに示されるヌクレオチド配列；
（ｃ）図１５Ａ−１５Ｃに示されるヌクレオチド配列；
（ｄ）図１６Ａ−１６Ｄに示されるヌクレオチド配列；
（ｅ）図２１Ａ−２１Ｃに示されるヌクレオチド配列；
（ｆ）図２２Ａ−２２Ｃに示されるヌクレオチド配列；
（ｇ）図２４Ａ−２４Ｃに示されるヌクレオチド配列；および
（ｈ）遺伝暗号の縮重の結果として、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、または（ｇ）のヌクレオチド配列とは異なり、そして改変されたＦｌｔ１レセプター融合ポリペプチドの生物学的活性を有する融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列、
からなる群から選択されるヌクレオチド配列から構成される。
【００３４】
本発明のさらなる実施形態において融合ポリペプチドは、上記の単離された核酸分子によりコードされる。
【００３５】
好ましい実施形態は、融合ポリペプチドの多量体を含む非機能性複合体を形成するようにＶＥＧＦ分子と結合し得る組成物である。
【００３６】
多量体が二量体である、組成物もまた好ましい。
【００３７】
さらに別の実施形態において、その組成物はキャリア内に存在する。
【００３８】
別の実施形態は、上記の核酸分子を含むベクターであり、このベクターとしては、記載される核酸分子を含む発現ベクターが挙げられ、ここでその核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結される。
【００３９】
他に含まれる実施形態は、適切な宿主細胞において、発現ベクターを含む融合ポリペプチドを産生するための宿主−ベクター系であり；適切な宿主細胞が細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である宿主−ベクター系であり；適切な宿主細胞がＥ．Ｃｏｌｉである宿主−ベクター系であり；適切な宿主細胞がＣＯＳ細胞である宿主−ベクター系であり；適切な宿主細胞がＣＨＯ細胞である宿主−ベクター系である。
【００４０】
本発明の別の実施形態は、融合ポリペプチドの産生およびこのように産生された融合ポリペプチドの回収を可能にする条件下で宿主−ベクター系の増殖細胞を含む、融合ポリペプチドを産生する方法である。
【００４１】
さらなる実施形態は、図１０Ａ〜１０Ｄまたは図２４Ａ〜２４Ｃに記載される核酸配列によってコードされる融合ポリペプチドを含み、これは、アセチル化またはペグ化によって改変され、ここでこのアセチル化は、少なくとも約１００倍モル過剰（ｍｏｌａｒ ｅｘｃｅｓｓ）のアセチル化剤を用いて達成されるか、またはアセチル化は、少なくとも約１０倍のモル過剰〜約１００倍のモル過剰の範囲のモル過剰アセチル化剤を用いて達成され得るか、あるいは、ペグ化は１０Ｋまたは２０ＫのＰＥＧである。
【００４２】
好ましい実施形態は、哺乳動物における血漿の漏出（ｌｅａｋａｇｅ）を減少または阻害する方法を含み、この方法は、哺乳動物に上記の融合ポリペプチドを投与する工程を包含し、ここで哺乳動物がヒトであり、融合ポリペプチドがアセチル化されているかまたはこの融合ポリペプチドがペグ化されている実施形態を含む。
【００４３】
さらなる実施形態は、ＶＥＧＦレセプターリガンドＶＥＧＦに特異的に結合する融合ポリペプチドである。
【００４４】
本発明の好ましい実施形態は、ヒトにおける血管増殖をブロックする方法であり、この方法は、上記の融合ポリペプチド有効量を投与する工程を包含する。
【００４５】
哺乳動物におけるＶＥＧＦレセプターリガンド活性を阻害する方法もまた好ましく、この方法は、上記の融合ポリペプチドの有効量を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００４６】
これらの方法の好ましい実施形態は、哺乳動物がヒトである場合である。
【００４７】
本発明の方法のさらなる実施形態は、ヒトにおける腫瘍増殖の減弱または予防；ヒトにおける水種の減弱または予防（特に、この水種は脳水種である）；ヒトにおける腹水形成の減弱または予防（特に、この腹水は卵巣癌に関連する腹水である）を含む。
【００４８】
本発明の好ましい実施形態は、（ｂ）多量体化成分に作動可能に連結した（ａ）ＶＥＧＦレセプター成分を含むＶＥＧＦポリペプチドに結合し得る融合ポリペプチドを含み、ここでこのＶＥＧＦレセプター成分は、融合ポリペプチドにおける単なるＶＥＧＦレセプター成分であり、そして本質的に、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列、および第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列からなる。
【００４９】
融合ポリペプチドのさらなる実施形態において、第１のＶＥＧＦレセプターはＦｌｔ１である。
【００５０】
融合ポリペプチドのなおさらなる実施形態において、第２のＶＥＧＦレセプターはＦｌｋ１である。
【００５１】
融合ポリペプチドのさらなる別の実施形態は、第２のＶＥＧＦレセプターがＦｌｔ４である融合ポリペプチドである。
【００５２】
好ましい実施形態は、第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列が、第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列の上流である融合ポリペプチド、および第１のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン２のアミノ酸配列が、第２のＶＥＧＦレセプターの細胞外ドメインのＩｇドメイン３のアミノ酸配列の下流である融合ポリペプチドを含む。
【００５３】
なお別の実施形態において、融合ポリペプチド多量体化成分は、免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、およびＩｇＧの軽鎖からなる群から選択される実施形態を含む免疫グロブリンドメインを含む。
【００５４】
好ましい実施形態は、改変されたＦｌｔ１レセプターのアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドを含み、ここでこのアミノ酸配列は、以下からなる群から選択される：（ａ）図１３Ａ〜１３Ｄに記載のアミノ酸配列；（ｂ）図１４Ａ〜１４Ｃに記載のアミノ酸配列；（ｃ）図１５Ａ〜１５Ｃに記載のアミノ酸配列；（ｄ）図１６Ａ〜１６Ｄに記載のアミノ酸配列；（ｅ）図２１Ａ〜２１Ｃに記載のアミノ酸配列；（ｆ）図２２Ａ〜２２Ｃに記載のアミノ酸配列；および（ｇ）図２４Ａ〜２４Ｃに記載のアミノ酸配列。
【００５５】
別の好ましい実施形態は、哺乳動物における血漿の漏出を減少または阻害する方法であり、この方法は、上記の融合ポリペプチドを哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００５６】
代替の好ましい実施形態は、哺乳動物におけるＶＥＧＦレセプターリガンド活性を阻害する方法であり、この方法は、上記の融合ポリペプチドの有効量を哺乳動物に投与する工程を包含する。
【００５７】
（発明の詳細な説明）
治療候補物としてアンタゴニストの考察に適切である薬物動態プロフィールを有する、レセプターに基づくＶＥＧＦアンタゴニストを生成することは、当該分野で長い間常に問題であった。初めに出願者は、他の公知のレセプターベースのＶＥＧＦアンタゴニストと比較して改良された薬物動態特性を示すＶＥＧＦ活性をアンタゴナイズし得るキメラポリペプチド分子を本明細書中に記載する。従って、本明細書中に記載されるキメラポリペプチド分子は、最初に、治療における使用のための適切な分子を提供する。ここでは、ＶＥＧＦのアンタゴニストは、所望の結果である。
【００５８】
本発明は、Ｆｌｔ１レセプターの改変された細胞外リガンド結合ドメインをＩｇＧのＦｃ領域に融合することにより形成される新規なキメラポリペプチド分子を提供する。
【００５９】
この細胞外リガンド結合ドメインは、細胞膜における本来のコンフォメーションにおいて、それがその同族リガンドと接触し得る場合、細胞外へ配向されるレセプターの一部として規定される。細胞外リガンド結合ドメインは、レセプターの膜貫通ドメインと関連する疎水性アミノ酸またはレセプターの細胞内ドメインと関連する任意のアミノ酸を含まない。一般に、レセプターの細胞内ドメインまたは細胞質ドメインは、通常、正に荷電したアミノ酸または極性アミノ酸（すなわち、リジン、アルギニン、ヒスチジン、グルタミン酸、アスパラギン酸）からなる。前述の１５〜３０（主に、疎水性または非極性アミノ酸（すなわち、ロイシン、バリン、イソロイシンおよびフェニルアラニン））は、膜貫通ドメインを含む。細胞外ドメインは、アミノ酸の疎水性膜貫通ストレッチの前方に位置するアミノ酸を含む。通常、膜貫通ドメインは、正に荷電したアミノ酸または極性アミノ酸（例えば、リジンまたはアルギニン）に隣接する。ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅは、詳細な法則を公開した（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎｅ，１９９５，ＢｉｏＥｓｓａｙｓ １７：２５−３０を参照のこと）。この結果は、所定のレセプターのどのアミノ酸が、細胞外ドメイン、膜貫通ドメインまたは細胞内ドメインに属するかを決定する場合に、当業者により通常参照される。あるいは、インターネット上のウェブサイト（例えば、ｈｔｔｐ：／／ｕｌｒｅｃ３．ｕｎｉｌ．ｃｈ／ｓｏｆｔｗａｒｅ／ＴＭＰＲＥＤ＿ｆｏｒｍ．ｈｔｍｌ）は、利用可能となっており、タンパク質ドメインについて推定することについての情報をタンパク質化学者に提供する。
【００６０】
本発明は、適切な宿主細胞へ導入される場合、キメラポリペプチド分子を発現し得るベクターへ挿入されるキメラポリペプチド分子をコードする核酸分子の構築物を提供する。適切な宿主細胞としては、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞および哺乳動物細胞が挙げられるが、これらに限定されない。ベクターへのＤＮＡフラグメントの挿入について、当業者に公知である方法のいずれかを使用して、転写／翻訳の制御シグナルの制御下でキメラポリペプチド分子をコードする発現ベクターを構築し得る。これらの方法としては、インビトロでの組換えＤＮＡおよび合成技術、ならびにインビボでの組換え（遺伝子組換え）（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）が挙げられ得る。
【００６１】
キメラポリペプチド分子をコードする核酸分子の発現は、キメラポリペプチド分子が、組換えＤＮＡ分子で形質転換された宿主において発現されるように、第２の核酸配列により調節され得る。例えば、本明細書中に記載されるキメラポリペプチド分子の発現は、当該分野で公知の任意のプロモーター／エンハンサーエレメントにより制御され得る。キメラポリペプチド分子の発現を制御するために使用され得るプロモーターとしては、以下が挙げられるがこれらに限定されない：Ｓｑｕｉｎｔｏら（１９９１，Ｃｅｌｌ ６５：１−２０）において記載されるような末端反復配列；ＳＶ４０初期プロモーター領域（ＢｅｒｎｏｉｓｔおよびＣｈａｍｂｏｎ，１９８１，Ｎａｔｕｒｅ ２９０：３０４−３１０）、ＣＭＶプロモーター、ラウス肉腫ウイルスの３’末端反復配列中に含まれる、Ｍ−ＭｕＬＶ ５’末端反復のプロモーター（Ｙａｍａｍｏｔｏら，１９８０，Ｃｅｌｌ ２２：７８７−７９７）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモーター（Ｗａｇｎｅｒら、１９８１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７８：１４４−１４４５）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Ｂｒｉｎｓｔｅｒら，１９８２，Ｎａｔｕｒｅ ２９６：３９−４２）；β−ラクタマーゼプロモーター（Ｖｉｌｌａ−Ｋａｍａｒｏｆｆら，１９７８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．７５：３７２７−３７３１）またはｔａｃプロモーター（ＤｅＢｏｅｒら，１９８３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８０：２１−２５、Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ａｍｅｒｉｃａｎ，１９８０，２４２：７４−９４の「Ｕｓｅｆｕｌ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｆｒｏｍ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｂａｃｔｅｒｉａ」をもまた参照のこと）などの原核生物発現ベクター、酵母または他の真菌由来のプロモーターエレメント（例えば、Ｇａｌ４プロモーター）、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモーター、ＰＫＧ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモーター、アルカリホスファターゼプロモーターおよび以下の動物の転写制御領域（これは、組織特異性を示し、そしてトランスジェニック動物において利用されてきた）：膵臓腺房細胞において活性であるエステラーゼＩ遺伝子制御領域（Ｓｗｉｆｔら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６３９−６４６；Ｏｒｎｉｔｚら，１９８６，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．５０：３９９−４０９；ＭａｃＤｏｎａｌｄ，１９８７，Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ ７：４２５−５１５）；膵臓β細胞において活性であるインスリン遺伝子制御領域（Ｈａｎａｈａｎ，１９８５，Ｎａｒｕｒｅ ３１５：１１５−１２２）、リンパ球において活性である免疫グロブリン遺伝子制御領域（Ｇｒｏｓｓｃｈｅｄｌら，１９８４，Ｃｅｌｌ ３８：６４７−６５８；Ａｄａｍｅｓら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１８：５３３−５３８；Ａｌｅｘａｎｄｅｒら，１９８７，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．７：１４３６−１４４４），精巣、胸、リンパ球および肥満細胞において活性であるマウス乳腺癌ウイルス制御領域（Ｌｅｄｅｒら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４５：４８５−４９５）、肝臓において活性であるアルブミン遺伝子制御領域（Ｐｉｎｋｅｒｔら，１９８７，Ｇｅｎｅｓ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：２６８−２７６）、肝臓において活性であるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Ｋｒｕｍｌａｕｆら，１９８５，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：１６３９−１６４８；Ｈａｍｍａｒら，１９８７，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５：５３−５８）；肝臓において活性であるα１−アンチトリプシン遺伝子制御領域（Ｋｅｌｓｅｙら，１９８７，Ｇｅｎｅ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌ．１：１６１−１７１）、骨髄性細胞において活性であるβ−グロビン遺伝子制御領域（Ｍｏｇｒａｍら，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１５：３３８−３４０；Ｋｏｌｌｉａｓら，１９８６，Ｃｅｌｌ ４６：８９−９４）；脳内の稀突起神経膠細胞において活性であるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Ｒｅａｄｈｅａｄら，１９８７，Ｃｅｌｌ ４８：７０３−７１２）；骨格筋において活性であるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Ｓｈａｎｉ，１９８５，Ｎａｔｕｒｅ ３１４：２８３−２８６）および視床下部において活性である性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Ｍａｓｏｎら，１９８６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３４：１３７２−１３７８）。
【００６２】
従って、本発明に従って、本明細書中に記載されるようなキメラポリペプチド分子をコードする核酸を含む細菌または真核生物の宿主において複製され得る発現ベクターは、宿主をトランスフェクトし、それにより、キメラポリペプチド分子を産生するためにそのような核酸を直接発現するために使用され、次いでこれは、生物学的に活性な形態で回収され得る。本明細書中で使用される場合、生物学的に活性な形態は、ＶＥＧＦに結合し得る形態を含む。
【００６３】
本明細書中に記載されるキメラ核酸分子を含む発現ベクターは、以下の３つの一般的アプローチにより同定され得る：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の存在または非存在、および（ｃ）挿入された配列の発現。第１のアプローチにおいて、発現ベクターに挿入された外来遺伝子の存在は、挿入されたキメラポリペプチド分子配列に対して相同である配列を含むプローブを使用するＮＤＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションにより検出され得る。第２のアプローチにおいて、組換えベクター／宿主系は、ベクター中の外来遺伝子の挿入により引き起こされる特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける閉塞体の形成など）の存在または非存在に基づいて同定されかつ選択され得る。例えば、キメラポリペプチド分子のＤＮＡ配列がベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、挿入物を含む組換え体は、マーカー遺伝子機能の非存在により同定され得る。第３のアプローチにおいて、組換え発現ベクターは、組換え体により発現される外来遺伝子産物をアッセイすることにより同定され得る。このようなアッセイは、例えば、キメラポリペプチド分子の物理的特性または機能的特性に基づき得る。
【００６４】
本発明の細胞は、キメラポリペプチド分子を、一過性、または好ましくは連続的かつ持続的に発現し得る。
【００６５】
キメラポリペプチド分子は、任意の技術により精製され得、この技術は、引き続く安定で生物学的に活性なキメラポリペプチド分子の形成を可能にする。例えば、そして限定のためではなく、この因子は、これらが８Ｍグアニジウム塩酸塩および透析により定量的に抽出され得る、可溶性タンパク質としてかまたは封入体としてのいずれかで細胞から回収され得る（例えば、Ｂｕｉｌｄｅｒら，米国特許第５，６６３，３０４号を参照のこと）。この因子をさらに精製するために、従来のイオン交換フロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィーまたはゲル濾過が使用され得る。
【００６６】
本発明の１つの実施形態では、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の上流である。本発明の別の実施形態では、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、第２の成分をコードするヌクレオチド配列の下流である。本発明のさらなる実施形態は、調製され得、ここで第１、第２および第３の融合ポリペプチド成分の順序は、再配列される。例えば、第１の成分をコードするヌクレオチド配列は、１と指定される場合、第２の成分をコードするヌクレオチド配列は、２と指定され、そして第３の成分のヌクレオチド配列は、３と指定され、次いで５’から３’へ読み取る場合、本発明の単離された核酸におけるその成分の順序は、以下の６つの組み合わせのいずれかであり得る：１、２、３；１、３、２；２、１、３；２、３、１；３、１、２または３、２、１。
【００６７】
本発明はまた、診断的および治療的用途を有する。本発明の特定の実施形態では、本明細書中に記載されるキメラポリペプチド分子の機能または発現における異常を検出する方法は、障害の診断において使用され得る。他の実施形態では、キメラポリペプチド分子またはキメラポリペプチド分子と結合するアゴニストもしくはアンタゴニストの操作は、疾患の処置において使用され得る。さらなる実施形態では、キメラポリペプチド分子は、その標的に対する結合因子の結合をブロックする因子として使用される。
【００６８】
制限ではなく例えの目的で、本発明の方法は、血管透過性、水腫または感染（例えば、傷害に関連する脳水腫、発作または腫瘍）；感染性疾患と関連する水腫（例えば、乾癬または関節炎（慢性関節リウマチが挙げられる））；喘息；火傷に関連する全身性水腫；腫瘍、感染または外傷に関連する腹水および胸水；慢性気道感染；毛細血管漏出症候群（ｃａｐｉｌｌａｒｙ ｌｅａｋ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；セプシス；タンパク質の増加した漏出と関連する腎臓疾患；および眼の疾患（例えば、年齢が関連する黄斑変性および糖尿病網膜症）により特徴付けられる臨床的状態を処置する際に有用であり得る。
【００６９】
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのアミノ酸配列分析は、塩基性アミノ酸残基（リジン）の異常に高い数（４６）の存在を明らかにした。Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃのＩＥＦ分析は、このタンパク質が９．３を超えるｐＩを有することを示し、このことは、このタンパク質が、非常に塩基性であるという推測を確認する。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の塩基性の性質が、そのタンパク質に細胞外マトリクス成分に結合させるということを生じ、およびマウスに注入される場合、その相互作用が、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃにより示される極端に短い検出可能な循環血清の半減期の要因であるということを仮定する。この仮定を試験するために、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、塩基の荷電を減少するために、リジン残基でアセチル化した。次いで、アセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、下記に記載されるアッセイにおてい試験した。
【００７０】
以下の実施例は、限定の目的ではなく、例示の目的で提供される。
【００７１】
（実施例）
（実施例１：ＣＨＯ Ｋ１細胞におけるＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の発現）
標準的な分子生物学技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら（編）Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹ）を参照のこと）を使用して、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃをコードする遺伝子を、ＣＭＶプロモーターの下流の多重クローニング部位で発現ベクターｐＥＥ１４．１（Ｌｏｎｚａ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ，ｐＩｃ）に挿入した。リポフェクタミン（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）を用いて、ＣＨＯ Ｋ１細胞をｐＥＥ１４．１／Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ ＤＮＡ構築物でトランスフェクトした。トランスフェクトしたＣＨＯ Ｋ１細胞を、グルタミンを含まないＤＭＥＭ（ＪＲＨ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）（Ｓｉｇｍａ Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ製の２５μＭ メチオニンスルホキシイミン（ＭＳＸ）を含有する）中で増殖させ、そして高組換えタンパク質発現因子を、標準的なイムノアッセイ（これはヒトＦｃを捕捉および検出する）を用いて精選した１００を超えるコロニー単離物からＣＨＯ Ｋ１細胞上清をスクリーニングすることにより得た。選択した精選クローンを、１００μＭ ＭＳＸの存在下で増幅し、次いで増幅したクローンを２回スクリーニングした。最も高い産生性のクローンは、５５ｐｇ／細胞／日の組換えＦｌｔ（１−３）−Ｆｃタンパク質の特異的生産性を有した。
【００７２】
選択したクローンを、上記の細胞培養培地を用いて、２２５ｃｍ² Ｔ−フラスコ（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中に展開し、次いで８．５Ｌローラーボトル（Ｃｏｒｎｉｎｇ，Ａｃｔｏｎ，ＭＡ）中に展開した。標準的なトリプシン処理によって細胞をローラーボトルから取り出し、そして３．５Ｌの懸濁培地に入れた。この懸濁培地は、５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｌａｂｓ，Ｌｏｇａｎ，ＵＴ製のＦＢＳ）、１００μＭ ＭＳＸおよび５Ｌ Ｃｅｌｌｉｇｅｎバイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ，ＮＪ）中、０．３×１０⁶細胞／ｍＬの密度でのＧＳ補充（ＪＲＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｋａｎｓａｓ Ｃｉｔｙ，ＭＯ）を含む、グルタミンを含まないＩＳＣＨＯ培地（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｓａｎｔａ Ａｎａ，ＣＡ）から構成される。細胞が３．６×１０⁶／ｍＬの密度に達し、そして懸濁液に適応した後、６０Ｌバイオリアクター（ＡＢＥＣ，Ａｌｌｅｎｔｏｗｎ，ＰＡ）に、５％ウシ胎仔血清を含む２０ＬのＩＳＣＨＯ培地中、０．５×１０⁶細胞／ｍＬの密度で細胞を移した。２日後、さらに２０ＬのＩＳＣＨＯ＋５％ウシ胎仔血清をこのバイオリアクターに加えた。細胞をさらに２日間増殖させると、３．１×１０⁶細胞／ｍＬの最終濃度に達し、そして収集時の最終Ｆｌｏｔ１（１−３）−Ｆｃ濃度は９５ｍｇ／Ｌであった。収集時に、０．４５μｍ Ｐｒｏｓｔａｋ Ｆｉｌｔｅｒ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｉｎｃ．，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）を用いるタンジェンシャルフローフィルトレーション（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）によって細胞を取り出した。
【００７３】
（実施例２：ＣＨＯ Ｋ１から得たＦｌｔｌ（１−３）−Ｆｃタンパク質の精製）
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、まずアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。プロテインＡカラムを使用して、高い特異性でこの分子のＦｃ部分を結合させた。次いで、このアフィニティー精製タンパク質を濃縮し、そしてＳＥＣカラムを通した。次いで、このタンパク質を処方緩衝液に溶出した。以下は、これらの手順を詳細に記載する。
【００７４】
（材料および方法）
ＰＢＳ（これは、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから１０×濃度で入手した）を除くすべての化学薬品は、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪから入手した。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｆａｓｔ ＦｌｏｗおよびＳｕｐｅｒｄｅｘ２００調製グレード樹脂は、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから入手した。タンパク質濃縮のための装置および膜は、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡから入手した。
【００７５】
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を含有する約４０Ｌの０．４５μｍ濾過したＣＨＯ馴化培地を、ＰＢＳで平衡化した２９０ｍＬ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラム（１０ｃｍ直径）に適用した。このカラムを、３５０ｍＭ ＮａＣｌおよび０．０２％ ＣＨＡＰＳを含むＰＢＳで洗浄し、そして結合タンパク質を、１０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄を含む２０ｍＭクエン酸で溶出した。溶出物中の単一ピークを集め、そしてそのｐＨを、１Ｍ ＮａＯＨを用いて中性まで上昇させた。１０Ｋ再生セルロース膜を用いて、タンジェンシャルフローフィルトレーションおよび攪拌細胞濃縮の両方によって、溶出画分を約９ｍｇ／ｍＬまで濃縮した。凝集物および他の混入物を除去するために、濃縮したタンパク質を、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００調製グレード樹脂を充填したカラム（１０ｃｍ×５５ｃｍ）に適用し、そして５％グリセロール含有ＰＢＳ中で行った。主要ピーク画分をプールし、滅菌濾過し、アリコートし、そして−８０℃で保存した。
【００７６】
（実施例３：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のアセチル化）
２ミリグラムのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、スルホ−ＮＨＳ−アセテート改変キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，カタログ＃２６７７７）とともに提供される使用説明書に記載されるようにアセチル化した。
【００７７】
（実施例４：アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の特徴付け）
（（ａ．）ＩＥＦ分析）：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよびアセチル化Ｆｌｔ１ （１−３）−Ｆｃを、標準的なＩＥＦ分析により分析した。図１に示されるように、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質はゲル中に移動し得ず、従って標準における最も高いｐＩである９．３よりも大きいｐＩを有するにちがいない。しかし、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃはゲル内に移動し得、そして約５．２のｐＩで平衡になる。この結果は、アセチル化がタンパク質の正味の正電荷を減少させ、従ってそのｐＩをかなり減少させることを示す。
【００７８】
（（ｂ．）細胞外マトリックス成分への結合）
細胞外マトリックス成分への結合について試験するために、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、細胞外マトリックス成分との相互作用を模倣するように設計されたアッセイにおいて試験した。このアッセイにおいて、９６−ウェル組織培養プレートをＭａｔｒｉｇｅｌ（Ｂｉｏｃｏａｔ ＭＡＴＲＩＧＥＬ（登録商標）マトリックス薄層９６ウェルプレート、カタログ＃４０６０７，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）でコートする。このプレートを種々の濃度のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのいずれかとインキューベートするか、またはｒＴｉｅ２−Ｆｃ（無関係なコントロール）タンパク質をウェルに加える。このプレートを、室温または３７℃のいずれかで１〜２時間インキュベートし、次いで結合タンパク質の検出を、二次的なアルカリホスファターゼ結合抗ヒトＦｃ抗体をこのウェルに加えることによって達成する。最後に、アルカリホスファターゼ基質をこのウェルに加え、そして光学密度を測定する。図２は、このアッセイの結果を示す。無関係なコントロールタンパク質ｒＴｉｅ２−Ｆｃと同様に、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプレートへのいかなる結合も示さないが、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は有意な結合を示す。この結果は、塩基性アミノ酸残基のアセチル化は、正に荷電したタンパク質とインビボにさらされた負に荷電した細胞外マトリックス成分との間に存在する電荷相互作用を妨げるための有効な方法であることを示す。
【００７９】
（実施例５：Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ））
タンパク質のペグ化（ポリエチレングリコール−ＰＥＧ）は、安定性およびバイオアベイラビリティーを増強することによってそれらのインビボでの効力を増加させ、一方で免疫原性を最小化することが示されてきた（上記で引用された参考文献を参照のこと）が、大きすぎて腎糸球体により濾過できないペグ化分子が、それらの薬物動態学的特性を高めることは、反対の直観である。理論に拘束されることなく、本出願人は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ分子のペグ化が、多分、その正電荷を変化させたり、Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃのｐＩを減少させることによるのではなく、むしろ正電荷が細胞外マトリックスと相互作用することを物理的に遮蔽することによって、薬物動態学的特性を高め得ることを想定した。本出願人は、上記のように２０Ｋ ＰＥＧの鎖を結合することによって、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ分子の薬物動態学的特性を向上させるように試みることを決定した。
【００８０】
（材料および方法）
ＣＨＯ細胞由来の精製Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（上記を参照のこと）を以下のペグ化実験において使用した。官能化ＰＥＧは、Ｓｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｐｏｌｙｍｅｒｓ，Ｈｕｎｔｓｖｉｌｌｅ，ＡＬから；ビシンは、Ｓｉｇｍａ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯから；Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムは、Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪから；ＰＢＳは、１０×濃縮物としてＬｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤから；グリセロールはＪ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ，Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ，ＮＪから；およびビス−ＴｒｉｓプレキャストゲルはＮｏｖｅｘ，ＣＡから入手した。
【００８１】
アミン特異的末端部分で官能化した２０Ｋ ＰＥＧ鎖を、小スケール反応研究において使用した。この研究は、ＰＥＧ：タンパク質化学量論を変化させる異なる反応条件を評価するために設定した。これらの反応および標準的なＳＤＳ−ＰＡＧＥ上でのサンプル分析に基づいて、１．５ ｍｇ／ｍＬの濃度のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、２０Ｋ ＳＰＡ−ＰＥＧ（ＰＥＧスクシンイミジルプロピオネート）分子と、１：６のＰＥＧ対Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃモノマー比でｐＨ８．１で反応させた。この反応を８℃、終夜で進行させた。最初の精製のために、反応生成物を、５％グリセロール含有ＰＢＳで平衡化した１０ｍｍ×３０ｃｍ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ６カラムに適用した。このカラムは、ペグ化の程度に基づいてペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ分子を分離するようであった。主にモノペグ化およびジペグ化した二量体Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃであると思われる画分（還元および非還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でのバンド形成パターンにより判断した場合）に対応する画分を、プールした。タンパク質濃度は、２８０ｎｍでの吸収を測定することによって決定した。ペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、滅菌濾過し、アリコートし、そして−４０℃で保存した。
【００８２】
（実施例６：Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおける非改変、アセチル化、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合）
非改変、アセチル化、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおいて試験して、Ｆｌｔ１リガンド（ＶＥＧＦ）に結合するそれらの能力を評価した。このアッセイにおいて、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質をＢｉａｃｏｒｅチップ（標準的な手順のためのＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪを参照のこと）の表面に固定し、そして０．２μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦを含むサンプルと、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃまたはペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（各々２５μｇ／ｍｌ）のいずれかとを含むサンプルに、Ｆｔ１（１−３）−Ｆｃでコートしたチップ上を通過させた。非特異的結合の効果を最小化するために、結合サンプルを０．５Ｍ ＮａＣｌ洗浄液で洗浄した。１つのサンプルにおいては、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃをヘパリンと混合した。ヘパリンは負に荷電した分子であり、そしてＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は正に荷電した分子であるので、２つの分子が一緒に混合される場合、これらはそれぞれの電荷を介して相互作用するべきである。このことは、その電荷および電荷相互作用を介して結合するその傾向を減少させるために化学的または遺伝的に改変されているかのように分子に振る舞わさせる、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの固有の正電荷を、基本的に中和する。図３に示されるように、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム１３〜１６）、ペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム１７〜２０）、およびヘパリン処理Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム２１〜２４）は、コントロール（カラム１〜４）および無関係のタンパク質（カラム５〜８）と比較した場合、Ｂｉａｃｏｒｅチップ結合Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃとＶＥＧＦ結合について完全に競合する。非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム５〜６）は、ＶＥＧＦ結合についてＢｉａｃｏｒｅチップ結合Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃと部分的にのみ競合するようであった。しかし、結合サンプルを０．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄する（カラム７〜８）ことによって、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの改変形態と類似の結合プロフィールを生じ、これは非改変タンパク質が、チップへの非特異的結合（これは塩洗浄によって排除され得る）を示していたことを示す。
【００８３】
（実施例７：ＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおける非改変、アセチル化、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合）
非改変、アセチル化、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、標準的なＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおいて試験し、Ｆｌｔ１レセプターリガンドＶＥＧＦに結合するそれらの能力を評価した。図４に示されるように、ペグ化およびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の両方は、ＶＥＧＦに結合し得、これは、ペグ化またはアセチル化のいずれかによってタンパク質を改変することは、そのリガンドに結合するその能力を破壊しないことを示す。
【００８４】
（実施例８：非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的分析）
インビボ実験を、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の薬物動態プロフィールを評価するために設計した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ；３マウス／グループ）に、４ｍｇ／ｋｇの非改変、アセチル化、またはペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを皮下注射した。タンパク質の注射の１、２、４、６、２４時間後、２日後、および３日後に、マウスの尾から採血した。Ｆｌｔ１（１−３）Ｆｃタンパク質を検出するために設計された、標準的なＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおいて、血清をアッセイした。手短には、このアッセイは、ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦでコートする工程、非改変、アセチル化、またはペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ含有血清を結合させる工程、およびアルカリホスファターゼに結合した抗Ｆｃ抗体を用いて報告する工程を包含する。図５に示されるように、すべてのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質についてのＴｍａｘは、６時間と２４時間の間の時点であった。異なるタンパク質についてのＣｍａｘは、以下の通りであった：非改変：０．０６μ／ｍｌ〜０．１５μ／ｍｌ；アセチル化：１．５μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍｌ；およびペグ化：約５μｇ／ｍｌ。
【００８５】
（実施例９：Ｆｌｔｌ（１−３）−Ｆｃの段階的アセチル化）
細胞外マトリックス成分への結合を排除するために必要なアセチル化の最小量を決定するために、アセチル化反応混合物中に漸増する量のモル過剰のアセチル化試薬を用いることによって、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を段階的様式でアセチル化する実験を設計した。モル過剰の範囲は以下の通りであった：１モルのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃモノマー当たり０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、および１００モルのアセチル化試薬。反応は、スルホ−ＮＨＳ−アセテート改変キット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，カタログ＃２６７７７）とともに提供される使用説明書に詳細に記載されるように行った。
【００８６】
（実施例１０：段階的にアセチル化されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの特徴付け）
（（ａ．）ＩＥＦ分析）非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、標準的なＩＥＦ分析によって分析した。図６Ａ〜６Ｂに示されるように、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、その非常に高いｐＩ（９．３より大きい）のためにゲル内に移動し得なかった。しかし、段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃサンプル（３０〜１００倍モル過剰サンプル）のほとんどはゲル内に移動し得、そしてタンパク質のアセチル化の程度に依存して、４．５５〜８．４３の間にわたるｐＩで平衡になった。この結果は、アセチル化が、用量依存様式でタンパク質の正電荷を変化させ得ること、およびｐＩの減少が、アセチル化の程度を制御することによって制御され得ることを示す。
【００８７】
（（ｂ．）段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの細胞外マトリックス成分への結合）
細胞外マトリックス成分への結合について試験するために、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、細胞外マトリックス成分との相互作用を模倣するように設計された上記のアッセイにおいて試験した。種々の濃度の、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（１０、２０、および３０倍モル過剰サンプル）、またはｒＴｉｅ２−Ｆｃ（無関係なコントロール）タンパク質のいずれかをウェルに加えた。プレートを室温または３７℃で１〜２時間インキュベートし、次いで結合タンパク質の検出を、ウェルに２次アルカリホスファターゼ結合抗ヒトＦｃ抗体を加えることによって行った。アルカリホスファターゼ基質を引き続いてウェルに加え、そして光学密度を測定した。図７は、このアッセイの結果を示す。無関係なコントロールタンパク質ｒＴｉｅ２−Ｆｃと同様に、段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（２０および３０倍モル過剰サンプル）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌコートしたプレートに対するいかなる有意な結合も示さなかったが、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は有意な結合を示した。結合は飽和であり、これは、飽和にならかいかもしれないより一般的な電荷媒介相互作用ではなく、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質が、特定の部位に結合し得ることを示す。１０倍モル過剰サンプルは減少した結合を示したが、アセチル化の程度は、細胞外マトリックス成分への結合を完全にブロックするためには十分ではなかった。ＩＥＦ分析（図６Ａおよび６Ｂ）による事実にも関わらず、２０倍モル過剰以上のサンプルは、検出可能な結合を示さず、低いモル過剰のサンプルはなお大きい正味の正電荷を有した。この結果は、細胞外マトリックス成分への結合を排除するためにすべての入手可能な塩基性アミノ酸を完全にアセチル化することは、必要ではないということを示す。
【００８８】
（（ｃ．）Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおける段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの結合）
非改変および段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおいて試験し、Ｆｌｔ１リガンド（ＶＥＧＦ）に結合するそれらの能力を評価した。このアッセイにおいて、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（０．５、１．０または５．０μｇ／ｍｌ）を、Ｂｉａｃｏｒｅチップの表面に固定（標準的な手順のためのＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪを参照のこと）し、そして０．２μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦと、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（０．５、１．０、または５．０μｇ／ｍｌのいずれかで）または段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの１０の異なるサンプル（各々０．５、１．０、または５．０μｇ／ｍｌで）のいずれかとを含む溶液を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃコートしたチップの上を通過させた。図８に示されるように、準化学量論比（０．５μｇ／ｍｌの非改変Ｆｌｔ１（１−３）または段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃのいずれか 対 ０．２μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）において、ＶＥＧＦを完全に結合するために十分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（非改変または段階的アセチル化のいずれか）は溶液中に存在しなかった。１．０μｇ／ｍｌ（これは、約１：１の化学量論比である）において、非改変および段階的にアセチル化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの両方は、ＶＥＧＦ結合に対してよりよく競合し得るが、利用可能なＶＥＧＦを完全に結合するためにはなお不十分なＦｌｔ（１−３）−Ｆｃタンパク質（非改変または段階的アセチル化のいずれか）が存在する。しかし、５．０μｇ／ｍｌ（これは、１：１の化学量論比よりも数倍大きい）においては、Ｆｌｔ（１−３）−Ｆｃおよび段階的にアセチル化したＦｌｔ（１−３）−Ｆｃタンパク質の両方が、アセチル化の程度に関わらずＶＥＧＦに結合し得る。このことは、アセチル化は、ＶＥＧＦに結合するＦｌｔ（１−３）−Ｆｃの能力を変更しないことを明らかに示す。
【００８９】
（（ｄ）段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的分析）
インビボでの実験を、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階的アセチル化（ｓｔｅｐ−ａｃｅｔｙｌａｔｅｄ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の薬物動態プロフィールを評価するために設計した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、または段階的アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの１０、２０、４０、６０および１００倍モル過剰のサンプルを皮下注射した（非改変、１０、２０および４０倍モル過剰のサンプルについては３匹のマウス、そして６０および１００倍モル過剰のサンプルについては２匹のマウス）。注射後１、２、４、６、２４時間、２日目および３日目に、これらのマウスの尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを検出するように設計されたＥＬＩＳＡに基づくアッセイ（前出に記載される）においてアッセイした。図９は、本研究の結果を詳述する。試験した全てのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質についてのＴｍａｘは６時間の時点であったが、Ｃｍａｘは以下の通りであった：非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ：０．０６μｇ／ｍｌ；１０倍モル過剰のサンプル：−０．７μｇ／ｍｌ、２０倍モル過剰のサンプル−２μｇ／ｍｌ、４０倍モル過剰のサンプル−４μｇ／ｍｌ、６０倍モル過剰のサンプル−２μｇ／ｍｌ、１００倍モル過剰のサンプル−１μｇ／ｍｌ。この結果は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのアセチル化またはペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｉｏｎ）が、その薬物動態プロフィールを有意に改善することを実証する。
【００９０】
（実施例１１：Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃと称されるＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの基本領域欠失変異体の構築）
アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（これは、６未満のｐＩを有する）が、非常にポジティブな非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（ｐＩ＞９．３）よりもずっと優れた薬物動態を有するという観察に基づいて、薬物動態における相違が、このタンパク質の正味の電荷に寄与し得るか否か、このことがこのタンパク質を負に荷電した細胞外マトリックス成分に固着させるか、または細胞外マトリックス成分についての特異的結合部位を構成するＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質表面におそらく特異的な位置が存在するか否かが問われた。例えば、多くのタンパク質は、ヘパリン結合部位（しばしば、塩基性残基のクラスターからなる）を有することが公知である。時々、これらの残基は、タンパク質の一次配列においてクラスター中で見出される；いくつかの文献は、このようなヘパリン結合部位についての「コンセンサス配列」を同定した（例えば、Ｈｉｌｅｍａｎら，１９９８，Ｂｉｏｅｓｓａｙｓ ２０（２）：１５６−６７を参照のこと）。他の場合には、タンパク質の公知の結晶構造が、タンパク質表面上の正に荷電した残基のクラスターを示すが、この残基は、一次配列のうちの異なる領域に由来し、そしてタンパク質がその三次構造に折り畳まれたときにのみ一緒になる。従って、単離されたアミノ酸残基がタンパク質表面の塩基性残基のクラスターの一部を形成するか否かを予測することは困難である。しかし、正に荷電したアミノ酸残基のクラスターが一次配列中に存在する場合、これらの残基が互いに空間的に近く、それゆえ、細胞外マトリックス成分結合部位の一部であり得ると推測することは非現実的ではない。Ｆｌｔ１レセプターは、広範囲に研究されており、そして種々のドメインが記載されている（例えば、Ｔａｎａｋａら，１９９７，Ｊｐｎ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ８８：８６７−８７６を参照のこと）。本出願の図１０Ａ〜図１０Ｄに示す核酸およびアミノ酸の配列を参照して、その配列の開始部に存在し、そしてヌクレオチド７６〜７８によってコードされるグリシンにまで伸びる分泌のためのシグナル配列を同定し得る。成熟タンパク質は、核酸配列のヌクレオチド７９で始まり、Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−Ｌｙｓで始まる。Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン１は、ヌクレオチド７９から３９３に及び、アミノ酸Ｓｅｒ−Ａｓｐ−Ｔｈｒで終わる。Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン２は、ヌクレオチド３９４〜６８７（Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＰｒｏからＡｓｎ−Ｔｈｒ−Ｉｌｅをコードする）に及び、そしてＦｌｔ１ Ｉｇドメイン３は、ヌクレオチド６８８〜９９６（Ｉｌｅ−Ａｓｐ−ＶａｌからＡｓｐ−Ｌｙｓ−Ａｌａをコードする）に及ぶ。ヌクレオチド９９７〜１００５によってコードされる架橋アミノ酸配列Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙが存在し、これには、ヒトＦｃをコードするヌクレオチド配列（ヌクレオチド１００６〜１７０１、すなわちアミノ酸Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ〜Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−停止）が続く。
【００９１】
Ｆｌｔ１アミノ酸配列のより詳細な分析は、クラスター、すなわち、図１０Ａ〜１０Ｄのアミノ酸残基２７２〜２８１（ＫＮＫＲＡＳＶＲＲ）（ここでは、１０アミノ酸残基のうちの６個が塩基性である）が存在することを示す。この配列は、このレセプターのＦｌｔ１ Ｉｇドメイン３（図１１を参照のこと）に存在し、これは、それ自体はＶＥＧＦリガンドの結合に必須ではないが、これは、リガンドに対するより高い親和性結合を付与する。Ｉｇドメイン３の配列の、Ｉｇドメイン２の配列との整列は、この領域において、この２つのＩｇドメインの間では整列が非常に乏しいこと、およびＩｇドメイン３中に約１０個のさらなるアミノ酸が存在することを示す。これらの２つのドメインの親水性プロフィール（ＭａｃＶｅｃｔｏｒコンピューターソフトウェア）の分析は、このタンパク質における親水性領域の存在を明らかに示す（図１２Ａ〜１２Ｂ）。これらの観察は、Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン３の実際の三次元コンホメーションが、Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン２中に存在しないいくつかの型の突出を可能にする可能性を高めた。この仮定を試験するために、１０個のさらなるアミノ酸を欠失し、そして得られたタンパク質を試験して、欠失が、レセプターのＶＥＧＦ親和性を深刻に損なわずに薬物動態に好適に影響を与えたか否かをみた。このＤＮＡ構築物は、標準的な分子生物学技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）を用いて哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中で構築された。このＤＮＡ構築物をＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃという。Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃ構築物を、ヌクレオチド８１４〜８４３（図１０Ａ〜１０Ｄに示す）の欠失（これは、非常に塩基性の１０アミノ酸残基配列Ｌｙｓ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−ＡｒｇをＦｌｔ１ Ｉｇドメイン３から欠失する）によってＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃから誘導した。
【００９２】
最終的なＤＮＡ構築物を、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーおよびＴａｑ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列を確認した。Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃの配列を図１３Ａ〜１３Ｄに示す。
【００９３】
（実施例１２：Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_{Δ B}）−Ｆｃと称されるＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ塩基性領域欠失変異体の構築）
Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_{Δ B}）−Ｆｃと称される第２の欠失変異体構築物を、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃ構築物からヌクレオチド７９〜３９３（図１０Ａ〜１０Ｄを参照のこと）によってコードされるＦｌｔ１ Ｉｇドメイン１の欠失によって誘導した；便宜のために、ヌクレオチド７３〜７８（ＴＣＡ ＧＧＴ）を、ＴＣＣ ＧＧＡに変更した。これによって、関連したアミノ酸配列Ｓｅｒ−Ｇｌｙを変更することなく、制限部位（ＢｓｐＥ１）が導入された。このＤＮＡ構築物は、標準的な分子生物学技術（例えば、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ａｕｓｕｂｅｌら編，Ｇｒｅｅｎｅ Ｐｕｂｌ．Ａｓｓｏｃ．，Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，ＮＹを参照のこと）を用いて哺乳動物発現ベクターｐＭＴ２１（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｉｎｃ．，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ）中で構築され、これはまた、ＡＢＩ ３７３Ａ ＤＮＡシークエンサーおよびＴａｑ Ｄｉｄｅｏｘｙ Ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ Ｃｙｃｌｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ Ｋｉｔ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｉｎｃ．，Ｆｏｓｔｅｒ Ｃｉｔｙ，ＣＡ）を用いて配列が確認された。Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_{Δ B}）−Ｆｃの配列を、図１４Ａ〜１４Ｃに示す。
【００９４】
（実施例１３：Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃと称されるＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ欠失変異体の構築）
第３の欠失変異体構築物は、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃと称され、これを、Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン３がインタクトなままである（塩基性領域のアミノ酸を欠失しなかった）こと以外はＭｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_{Δ B}）−Ｆｃ構築物と同様にして構築した。この構築物を、標準的な分子生物学技術を用いて構築し、そして最終的な構築物を、前出に記載されるとおりに配列を確認した。Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃの配列を図１５Ａ〜１５Ｃに示す。
【００９５】
（実施例１４：Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R->N）−Ｆｃと称されるＦｌｔ（１−３）−Ｆｃ塩基性領域Ｎグリコシル化変異体の構築）
Ｎ−グリコシル化部位がＦｌｔ１ Ｉｇドメイン３の塩基性領域の真ん中に導入されている最終的な構築物を作製した。この構築物はＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R->N）−Ｆｃと称され、そしてこれを、ヌクレオチド８２４〜８２５をＧＡからＡＣへと変更し、その結果、コードされるＡｒｇ残基（ＡＧＡ）をＡｓｎ残基（ＡＡＣ）へと変更することによって作製した（図１０Ａ〜図１０Ｄを参照のこと）。それゆえ、得られるアミノ酸配列は、Ａｒｇ−Ａｌａ−ＳｅｒからＡｓｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒへと変更され、これは、Ａｓｎ残基でのＮ−グリコシル化部位の付加のための規範シグナル（Ａｓｎ−Ｘｘｘ−Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）と一致する。Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R->N）−Ｆｃの配列を図１６Ａ〜図１６Ｄに示す。
【００９６】
（実施例１５：アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ変異体、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃ変異体およびＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R->N）−Ｆｃ変異体の特徴付け）
（ａ）細胞外マトリックス成分への結合
３つの改変されたタンパク質が改善された薬物動態学的特性を有する可能性が高いようであるかまたは低いようであるかを決定するために、Ｍａｔｒｉｇｅｌでコーティングした９６ウェルディッシュ（前出に記載の通り）を、種々の濃度の変異タンパク質とともにインキュベートし、そして抗ヒトＦｃ／アルカリホスファターゼ結合体化抗体を用いて検出した。図１８に示すように、この実験は、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質がこれらのウェルに対して強く結合し得るとはいえ、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃタンパク質はいくらかより弱く結合し、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃタンパク質はさらになお弱く結合し、そしてＭｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_{Δ B}）−Ｆｃタンパク質は最良のプロフィールを示し、その結合は、他の変異タンパク質のどれよりも弱いことを示した。Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R->N）−Ｆｃグリコシル化変異タンパク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイにおいて下限に近い利益しか示さなかった。これらの結果は、ポジティブアミノ酸の直鎖配列が一次配列から欠失されて、細胞外マトリックス成分との電荷相互作用における減少をもたらし得るという仮定を確認する。
【００９７】
（（ｂ）Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおけるＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−ＦｃおよびＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R->N）：Ｆｃの結合）
非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびアセチル化Ｆｌｏｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、ならびに遺伝子改変されたＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃタンパク質およびＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R->N）−Ｆｃタンパク質を、Ｂｉａｃｏｒｅに基づくアッセイにおいて試験して、Ｆｌｔ１リガンドであるＶＥＧＦに対するそれらの結合能力を評価した。このアッセイでは、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌ）を、Ｂｉａｃｏｒｅチップの表面に固定し（標準的な手順についてはＢｉａｃｏｒｅ Ｉｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ Ｍａｎｕａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｉｎｃ．，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，ＮＪを参照のこと）、そして０．１μｇ／ｍ ＶＥＧＦおよび精製した非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃまたは非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを含有するＣＯＳ細胞上清（約０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌで）、精製したアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌで）、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃを含むＣＯＳ細胞上清（約０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌで）、あるいはＭｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R->N）−Ｆｃを含むＣＯＳ細胞上清（約０．２５μｇ／ｍｌ、０．５μｇ／ｍｌまたは１．０μｇ／ｍｌ）のいずれかを含む溶液を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃでコーティングしたチップに通過させた。図１７に示すように、化学量論未満の比で（未改変、アセチル化または遺伝子改変されたサンプルの０．２５μｇ／ｍｌ Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ対０１．μｇ／ｍｌ ＶＥＧＦ）、Ｂｉａｃｏｒｅチップ上に固定されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃに対するＶＥＧＦの結合をブロックするには不十分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質が存在する。０．５μｇ／ｍｌの未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質または遺伝子改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質では、化学量論比は１：１に近づき、そしてＢｉａｃｏｒｅチップに対するＶＥＧＦ結合をブロックする能力の増加が存在する。１．０μｇ／ｍｌの非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質または遺伝子改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（これは、ほぼ１０：１の化学量論比である）では、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、Ｂｉａｃｏｒｅチップに対するＶＥＧＦの結合をブロックし得るが、これらは等価ではない。非改変Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃ、アセチル化Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−ＦｃおよびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃは、ＶＥＧＦ結合をブロックするその能力が本質的に等しく、一方、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R->N）−Ｆｃは結合をブロックする際にいくらか効率が低い。これらの結果は、主に負に荷電したアミノ酸の直鎖配列を遺伝的に除去することによって、正に荷電した分子の非特異的結合を低減することが可能であるという仮定を確認する。
【００９８】
（（ｃ）Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_{Δ B}）−Ｆｃ、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃの結合およびＥＬＩＳＡに基づくアッセイにおける結合）
３つの変異タンパク質がＦｌｔ１リガンドＶＥＧＦを結合し得るか否かを決定するために、ＶＥＧＦでプレーティングした９６ウェルプレートを種々の濃度のそれぞれの変異タンパク質と共にインキュベートし、そして洗浄後、アルカリホスファターゼ結合体化抗ヒトＦｃ抗体と共にインキュベートし、そして適切なアルカリホスファターゼ基質の添加によって比色的に定量することによって結合量を検出した結合実験を行った。図１９に示すように、この実験は、全ての変異タンパク質が、試験した濃度でＶＥＧＦを同様に結合し得ることを示した。
【００９９】
（実施例１６：アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃおよび非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的分析）
インビボでの実験を、非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃタンパク質および４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の薬物動態的プロフィールを評価するように設計した。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質、４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃタンパク質（各々４匹のマウス）を皮下注射した。注射後１、２、４、６、２４時間、２日目、３日目および５日目に、これらのマウスの尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を検出するように設計したＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。このＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦでコーティングする工程、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを結合する工程およびアルカリホスファターゼに連結した抗Ｆｃ抗体を報告する工程を含む。図２０に示すように、これらの試薬についてＣｍａｘは、以下の通りであった：非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、０．１５μｇ／ｍｌ；４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、１．５μｇ／ｍｌ；およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_{Δ B}）−Ｆｃ、０．７μｇ／ｍｌ。
【０１００】
（実施例１７：改変Ｆｌｔ１レセプターベクター構築）
改変版のＦｌｔ１レセプター（ＶＥＧＦＲ１としても公知）を構築するための理論的根拠は、Ｆｌｔ１のタンパク質配列が非常に塩基性であり、それゆえ、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）に固着するようであるという観察に基づいていた。Ｆｌｔ１の非常に塩基性の性質は、なぜ非改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（前出に記載される）が、これを治療的薬剤として使用することを困難にする乏しい薬物動態を有するかをおそらく説明する。前出に記載されるように、化学的に改変された形態の４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（本明細書中以後、Ａ４０と名付ける）は、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃに対して大いに改善された薬物動態（ＰＫ）プロフィールを示した。それゆえ、Ａ４０によって示される改善されたＰＫプロフィールを保有し、そしてＶＥＧＦに強固に結合する能力をなお保持する、改変された形態のＦｌｔ１レセプター分子を組換え発現するために用いられ得るＤＮＡ分子を操作する試みを行った。
【０１０１】
Ｆｌｔ１の第１のＩｇドメイン（これは、中性ｐＨで＋５という正味の電荷を有する）は、ＶＥＧＦに対する強固な結合のために必須でないことが文献において公知であるので、このドメインを欠失させた。第３のＩｇドメイン（＋１１という正味の電荷を有する）は、結合に必須ではないが、第２のＩｇドメインよりも高いＶＥＧＦ親和性を付与するので、その全体を欠失する代わりに、第３のＩｇドメインを、Ｆｌｔ１レセプターの同系物（ｒｅｌａｔｉｖｅ）Ｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ２としても公知）およびＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３としても公知）の等価なドメインで置換した。これらのキメラ分子（Ｒ１Ｒ２（Ｆｌｔ１．Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）およびＲ１Ｒ３（それぞれ、Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、ここで、Ｒ１およびＦｌｔ１Ｄ２＝Ｆｌｔ１（ＶＥＧＦＲ１）のＩｇドメイン２；Ｒ２およびＦｌｋ１Ｄ３＝Ｆｌｋ１（ＶＥＧＦＲ２）のＩｇドメイン３；ならびにＲ３およびＶＥＧＦＲ３Ｄ３＝Ｆｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３）のＩｇドメイン３と示される）は、以下に記載されるように、インビトロＥＣＭ結合アッセイによって判断した場合、ＥＣＭに対してずっと粘性が低く、以下に記載されたように非常に改善されたＰＫを有した。さらに、これらの分子は、以下に記載されるようにＶＥＧＦに強固に結合し得、そして以下に記載されるように、内皮細胞において発現されたネイティブなＦｌｋ１レセプターのリン酸化をブロックし得た。
【０１０２】
（（ａ）発現プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の構築）
発現プラスミドｐＭＴ２１．Ｆｌｔ１（１−３）．Ｆｃ（６５１９ｂｐ）およびｐＭＴ２１．Ｆｌｋ−１（１−３）．Ｆｃ（５２３０ｂｐ）は、アンピシリン耐性、ならびにそれぞれ、ヒトＦｌｔ１およびヒトＦｌｋ１のＦｃタグ化版のＩｇドメイン１〜３をコードするプラスミドである。これらのプラスミドを用いて、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２とＦｌｋ１のＩｇドメイン３との融合体からなるＤＮＡフラグメントを、それぞれのＩｇドメインのＰＣＲ増幅、続いてさらなる回のＰＣＲを用いて２つのドメインの単一のフラグメントへの融合を達成して構築した。Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２については、５’増幅プライマーおよび３’増幅プライマーは以下の通りであった：
【０１０３】
【化１】

５’増幅プライマーは、アミノ酸配列ＧＲＰＦＶＥＭ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸２７〜３３に対応する）によって規定される、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２の上流のＢｓｐＥ１制限酵素部位をコードする。３’プライマーは、Ｆｌｋ１ Ｉｇドメイン３の５’開始部に直接融合された、Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン２の３’末端の逆相補体をコードし、融合点は、Ｆｌｔ１のＴＩＩＤ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸１２３〜１２６に対応する）として規定され、そしてＦｌｋ１のＶＶＬＳ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸１２７〜１３０に対応する）に続く。
【０１０４】
Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３について、５’増幅プライマーおよび３’増幅プライマーは以下の通りであった：
【０１０５】
【化２】

５’増幅プライマーは、上記のようにＦｌｋ１ Ｉｇドメイン３の開始部に直接融合されたＦｌｔ１ Ｉｇドメイン２の末端をコードする。３’増幅プライマーは、アミノ酸ＶＲＶＨＥＫ（図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸２２３〜２２８に対応する）によって規定されるＦｌｋ１ Ｉｇドメイン３の末端をコードし、続いて、制限酵素Ｓｒｆ１に対する認識配列を含む架橋配列をコードし、そしてアミノ酸ＧＰＧをコードする。架橋配列は、図２１Ａ〜２１Ｃのアミノ酸２２９〜２３１に対応する。
【０１０６】
個々のドメインを産生するための１回のＰＣＲ増幅の後に、産物をチューブ内で合わせ、そしてプライマーｂｓｐ／ｆｌｔ１Ｄ２およびＦｌｋ１Ｄ３／ａｐａ／ｓｒｆ．ａｓ（上記）を用いてさらなる回のＰＣＲに供し、融合産物を産生した。このＰＣＲ産物を引き続いて制限酵素ＢｓｐＥＩおよびＳｍａＩで消化し、そして得られた６１４ｂｐフラグメントを、ベクターｐＭＴ２１／ΔＢ２．ＦｃのＢｓｐＥＩ〜ＳｒｆＩの制限部位にサブクローン化し、プラスミドｐＭＴ２１／Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．Ｆｃを作製した。Ｆｌｔ１Ｄ２−Ｆｌｋ１Ｄ３遺伝子融合挿入物のヌクレオチド配列を、標準的な配列分析によって確認した。次いで、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｒｆＩで消化し、得られた７０２ｂｐのフラグメントを、プラスミドｐＦｌｔ１（１−３）Ｂ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のＥｃｏＲＩ〜ＳｒｆＩの制限部位に移し、プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２．ＦｌｋＤ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）キメラ分子の完全ＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を、図２１Ａ〜２１Ｃに示す。
【０１０７】
（（ｂ）発現プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３ＦｃΔＣ１（ａ）の構築）
発現プラスミドｐＭＴ２１．Ｆｌｔ１（１−３）．Ｆｃ（６５１９ｂｐ）は、ヒトＦｌｔ１レセプターのＩｇドメイン１〜３のアンピシリン耐性およびＦｃタグ化型をコードする。このプラスミドを使用して、ＰＣＲによってＦｌｔ１のＩｇドメイン２を含むＤＮＡフラグメントを産生した。細胞株ＨＥＬ９２１．７由来のＲＮＡを使用して、標準的なＲＴ−ＰＣＲ方法論を使用して、Ｆｌｋ１のＩｇドメイン３を産生した。さらなる回のＰＣＲ増幅を使用して、２つのＩｇドメインの単一の融合フラグメントへの融合を達成した。Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２について、５’増幅プライマーおよび３’増幅プライマーは、以下の通りであった：
【０１０８】
【化３】

５’増幅プライマーは、アミノ酸配列ＧＲＰＦＶＥＭ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸２７〜３３に対応する）によって規定される、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２の上流のＢｓｐＥ１制限部位をコードする。３’増幅プライマーは、Ｆｌｔ１のＴＩＩＤ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸１２３〜１２６に対応する）として規定される融合点を有し、そしてＶＥＧＦＲ３のＩＱＬＬ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸１２７〜１３０に対応する）に続く、ＶＥＧＦＲ３ Ｉｇドメイン３の開始部に直接融合されたＦｌｔ１ Ｉｇドメイン２の末端の逆相補体をコードする。
【０１０９】
ＶＥＧＦＲ３のＩｇドメイン３について、ＲＴ−ＰＣＲに使用される５’プライマーおよび３’プライマーは、以下の通りであった：
【０１１０】
【化４】

５’増幅プライマーと３’増幅プライマーの両方がＶＥＧＦＲ３の配列に一致する。このＲＴ−ＰＣＲ反応の２９６ｂｐの増幅産物を標準的な技術によって単離し、そして第２回のＰＣＲに供して、Ｆｌｋ１Ｄ３ドメインとのＦｌｔ１Ｄ２の融合およびＧＰＧ架橋を介するＦｌｋ１Ｄ３とＦｃドメインとの融合を可能にするための適切な配列を加えた（以下を参照のこと）。増幅プライマーは、以下の通りであった：
【０１１１】
【化５】

５’増幅プライマーは、上記のように、ＶＥＧＦＲ３ Ｉｇドメイン３の開始部（５’末端）に直接融合されたＦｌｔ１ Ｉｇドメイン２の３’末端をコードする。３’増幅プライマーは、アミノ酸ＶＩＶＨＥＮ（図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸２２１〜２２６に対応する）によって規定されるＶＥＧＦＲ３ Ｉｇドメイン３の３’末端をコードし、続いてＳｒｆ１に対する認識配列を含む架橋配列をコードし、そしてアミノ酸ＧＰＧをコードする。架橋配列は、図２２Ａ〜２２Ｃのアミノ酸２２７〜２２９に対応する。
【０１１２】
個々のＩｇドメインを産生するための１回（Ｆｌｔ１ Ｉｇドメイン２について）または２回（Ｆｌｔ４ Ｉｇドメイン３について）のＰＣＲの後に、ＰＣＲ産物をチューブ内で合わせ、上記の増幅プライマーｂｓｐ／ｆｌｔ１Ｄ２およびＶＥＧＦＲ３Ｄ３／ｓｒｆ．ａｓを用いたさらなる回のＰＣＲ増幅に供して、融合産物を産生した。このＰＣＲ産物を引き続いて制限酵素ＢｓｐＥＩおよびＳｍａＩで消化し、そして得られた６２５ｂｐのフラグメントを、ベクターｐＭＴ２１／Ｆｌｔ１ΔＢ２．Ｆｃ（上記）のＢｓｐＥＩ〜ＳｒｆＩ制限部位にサブクローン化し、プラスミドｐＭＴ２１／Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．Ｆｃを産生した。Ｆｌｔ１Ｄ２−ＶＥＧＦＲ３Ｄ３遺伝子融合挿入物の配列を、標準的な配列分析によって確認した。次いで、このプラスミドを制限酵素ＥｃｏＲＩおよびＳｒｆＩで消化し、そして得られた６９３ｂｐのフラグメントをプラスミドｐＦｌｔ１（１−３）ΔＢ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のＥｃｏＲＩ〜ＳｒｆＩの制限部位にサブクローン化してｐＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）と称されるプラスミドを産生した。Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）キメラ分子の完全なＤＮＡ推定アミノ酸配列を図２２Ａ〜２２Ｃに記載する。
【０１１３】
（実施例１８：細胞外マトリクス結合（ＥＣＭ）結合アッセイ）
ＥＣＭでコートされたプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎカタログ番号３５−４６０７）を、サンプルを加える前に、グルタミン（２ｍＭ）、１００Ｕペニシリン、１００Ｕストレプトマイシン、および１０％のＢＣＳで補充された温かいＤＭＥを用いて少なくとも１時間再水和した。次いで、プレートを、種々の濃度の１０ｎＭで始めて、続いてＰＢＳ＋１０％ＢＣＳ中に２倍希釈したＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）とともに、室温で１時間インキュベートした。次いで、プレートをＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いて３回洗浄し、アルカリホスファターゼ結合体化抗ヒトＦｃ抗体（Ｐｒｏｍｅｇａ、ＰＢＳ＋１０％ＢＣＳ中１：４０００）を用いて室温で１時間インキュベートした。次いでプレートをＰＢＳ ０．１％Ｔｒｉｔｏｎ−Ｘを用いて４回洗浄し、そしてアルカリホスファターゼ緩衝液／ｐＮＰＰ溶液（Ｓｉｇｍａ）を発色のために加えた。プレートをＩ＝４０５〜５７０ｎｍで読んだ。この実験の結果を図２３で示し、これは、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のタンパク質は、ＥＣＭに対する粘着性が、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質と比較してかなり少ないことを示す。
【０１１４】
（実施例１９：ＣＨＯ−Ｋ１（Ｅ１Ａ）細胞中のｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の一過性発現）
実施例１７（ａ）において上記されるｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）プラスミドを保有するＥ．ｃｏｌｉ ＤＨ１０Ｂ細胞の大規模（２Ｌ）培養物を、Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ（ＴＢ）＋１００μｇ／ｍｌアンピシリン中で一晩増殖させた。次の日に、製造業者のプロトコルに従って、プラスミドＤＮＡをＱＩＡｇｅｎ Ｅｎｄｏｆｒｅｅ Ｍｅｇａｐｒｅｐキットを使用して抽出した。精製されたプラスミドＤＮＡの濃度を、ＵＶ分光光度計および蛍光計を使用して標準的技術によって決定した。プラスミドＤＮＡを、制限酵素ＥｃｏＲＩ＋ＮｏｔＩおよびＡｓｅＩを使用して、アリコートの標準的な制限酵素消化によって確認した。全ての制限酵素消化フラグメントは、１％アガロースゲルで分析した場合に予期される大きさに対応した。
【０１１５】
４０個の１５ｃｍペトリプレートに、４×１０６細胞／プレートの密度でＣＨＯ−Ｋ１／Ｅ１Ａ細胞を播種した。プレーティング培地は、１０％ Ｈｙｃｌｏｎｅ Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ（ＦＢＳ）、１００Ｕ ペニシリン／１００Ｕ ストレプトマイシンおよびグルタミン（２ｍＭ）を補充したＧｉｂｃｏ Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２であった。翌日、それぞれのプレートの細胞を、製造業者のプロトコルに従って、１２ｍｌ容積中のＧｉｂｃｏ ＯｐｔｉｍｅｍおよびＧｉｂｃｏ Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅを使用して６μｇのｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）プラスミドＤＮＡを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション混合物を細胞に加えた４時間後に、１０％ＦＢＳを補充したＯｐｔｉｍｅｍを１２ｍｌ／プレートで加えた。プレートを５％ＣＯ₂インキュベーター中で一晩３７℃でインキュベートした。翌日、培地をそれぞれのプレートから除去し、２５ｍｌの発現培地（グルタミン（２ｍＭ）および１ｍＭ酪酸ナトリウムを補充したＧｉｂｃｏ ＣＨＯ−Ｓ−ＳＦＭ ＩＩ）を加えた。プレートを３７℃で３日間インキュベートした。３日間のインキュベーション後、培地をそれぞれのプレートから吸引し、そしてスインギングバケットローター（ｓｗｉｎｇｉｎｇ ｂｕｃｋｅｔ ｒｏｔｏｒ）中、４００ｒｐｍで遠心分離し、細胞をペレット化した。上清を滅菌１Ｌボトルにデカンテーションし、発現されたタンパク質の精製を以下に記載のように実施した。
【０１１６】
（実施例２０：ｐＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）発現ベクターの構築） ｐＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）発現プラスミドを、図２１Ａ〜２１ＣのＦｌｔ１ｄ２−Ｆｌｋ１ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）アミノ酸２６と２７（ＧＧ）との間にアミノ酸ＳＤＴ（図２４Ａ〜２４Ｃのアミノ酸２７〜２９に対応する）をコードするＤＮＡの挿入および図のアミノ酸２２９〜２３１に対応するアミノ酸ＧＰＧをコードするＤＮＡの除去によって構築した。ＳＤＴアミノ酸配列は、Ｆｌｔ１レセプターに対してネイティブであり、異種Ｎ末端プロセシングの可能性を減少させるために後に加えられた。ＧＰＧ（架橋配列）が除去され、その結果、Ｆｌｔ１およびＦｌｋ１ Ｉｇドメインが互いに直接融合される。ｐＶＥＧＦＲ１Ｒ２．ＦｃΔＣ１（ａ）キメラ分子の完全なＤＮＡおよび推定のアミノ酸の配列を、図２４Ａ〜２４Ｃに記載する。
【０１１７】
（実施例２１：改変Ｆｌｔ１レセプターを産生するために使用される細胞培養プロセス）
（ａ）Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生するために使用される細胞培養プロセス）
実施例１において上記される発現プラスミドｐＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を使用するＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質の産生のためのプロセスは、タンパク質産物を構成的に発現する組換えチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ Ｋ１／Ｅ１Ａ）細胞の懸濁培養を含む。この細胞をバイオリアクター中で増殖させ、そしてタンパク質産物を単離し、アフィニティークロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーによって精製する。このプロセスは、以下に、より詳細に提供される。
【０１１８】
（細胞増殖）
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）発現細胞株を含む２つのコンフルエントなＴ−２２５ｃｍ²フラスコを、細胞を培地（ＧＭＥＭ＋１０％血清、ＧＩＢＣＯ）中で８つのＴ−２２５ｃｍ²フラスコに継代させることによって増殖させ、３７℃および５％ＣＯ₂でインキュベートした。フラスコがコンフルエンスに近づいたとき（約３〜４日）、細胞をトリプシンを使用して剥離した。新鮮な培地を、トリプシンに対するさらなる曝露から細胞を保護するために加えた。細胞を遠心分離し、そして新鮮な培地に再懸濁し、次いで、８つの８５０ｃｍ²ローラーボトルに移し、３７℃および５％ＣＯ₂でコンフルエントになるまでインキュベートした。
【０１１９】
（バイオリアクターにおける懸濁培養）
ローラーボトルにおいて増殖させた細胞を、トリプシン処理し、それらを表面から剥離し、そして懸濁培養培地で洗浄した。細胞を、５Ｌのバイオリアクター（Ｎｅｗ Ｂｒｕｎｓｗｉｃｋ Ｃｅｌｌｉｇｅｎ Ｐｌｕｓ）に無菌的に移し、ここで、細胞を３．５Ｌの懸濁培養物中で増殖させる。懸濁培養培地は、グルタミンを含まない低グルコース改変のＩＳ−ＣＨＯ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）であり、これに、５％ウシ胎仔血清（Ｈｙｃｌｏｎｅ）、ＧＳ補充物（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）および２５μＭメチオニンスルホキシイミン（Ｓｉｇｍａ）を加えた。ｐＨを、入口ガスへの二酸化炭素の添加によってか、またはバイオリアクターへの炭酸ナトリウムの液体溶液の添加によって、７．２に制御した。溶存酸素レベルを入口ガスへの酸素または窒素の添加によって３０％飽和に維持し、そして温度を３７℃に制御した。４×１０⁶細胞／ｍＬの密度に達したとき、細胞を、４０Ｌのバイオリアクター（同じ培地およびバイオリアクターを制御するための設定値を含む）に移した。温度の設定値を３４℃に下げて、細胞増殖を遅くし、そしてタンパク質発現の相対的な速度を増加させる。
【０１２０】
（（ｂ）Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生するために使用される細胞培養プロセス）
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）についての上記のと同じ方法論を使用してＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を産生した。
【０１２１】
（実施例２２：改変Ｆｌｔ１レセプターの収集および精製）
（（ａ）Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の収集および精製）
産物タンパク質を、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｒｏｓｔａｋ接線方向流れ濾過モジュールおよび低せん断メカニカルポンプ（Ｆｒｉｓｔａｍ）を使用して、細胞を保持しながらバイオリアクターから無菌的に収集した。新鮮な培地を、収集濾過の間に除去される培地と置きかえるためにバイオリアクターに加えた。次いで、約４０Ｌの収集濾液を、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を含有する４００ｍＬのカラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にローディングした。ローディングした後、樹脂を、１０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ塩化ナトリウム、ｐＨ７．２を含む緩衝液を用いて洗浄して、結合していない混入タンパク質を全て除去した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質をｐＨ３．０クエン酸緩衝液で溶出した。溶出したタンパク質をＴｒｉｓ塩基の添加によって中和し、−２０℃で凍結させた。
【０１２２】
上記Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ工程からのいくつかの凍結したロットのＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質を解凍し、プールし、そしてＭｉｌｌｉｐｏｒｅ ３０ｋＤ名目分子量カットオフ（ＮＭＷＣＯ）接線方向流れ濾過膜を使用して濃縮した。このタンパク質を攪拌細胞濃縮器（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）に移し、そしてさらに３０ｋＤ ＮＭＷＣＯ膜を使用して３０ｍｇ／ｍＬに濃縮した。濃縮タンパク質を、リン酸緩衝化生理食塩水＋５％グリセロールで平衡化されたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００樹脂（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）を充填したサイズ排除カラムにローディングした。同じ緩衝液をカラムに流すために使用した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）ダイマーに対応する画分をプールし、０．２２ミクロンフィルターを通して滅菌濾過し、アリコートし、凍結させた。
【０１２３】
（ｂ）Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の収集および精製）
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）についての上記のｐと同じ方法論を使用してＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を収集および精製した。
【０１２４】
（実施例２３：一過性発現されたＶＥＧＦＲ２についてのリン酸化アッセイ）
４〜６回継代した初代ヒト臍静脈内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）を、血清を含まないＤＭＥ高グルコース培地中で２時間、飢餓させた。４０ｎｇ／ｍｌ（１ｎＭ）ヒトＶＥＧＦ１６５（これは、ＶＥＧＦレセプターＦｌｔ１、Ｆｌｋ１およびＦｌｔ４（ＶＥＧＦＲ３）に対するリガンドである）を含むサンプルを調製し、０．１％ＢＳＡを含み、血清を含まないＤＭＥ高グルコース培地において、種々の量の改変Ｆｌｔ１レセプターＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を用いて、室温で１時間プレインキュベートした。細胞を上記のように調製された試料＋／−ＶＥＧＦ１６５を用いて５分間抗原投与し、続いて完全な溶解緩衝液を使用して細胞全体を溶解させた。細胞溶解物をＶＥＧＦＲ２レセプターのＣ末端に対して指向された抗体を用いて免疫沈降させた。免疫沈降された溶解産物を４〜１２％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ Ｎｏｖｅｘゲル上にローディングし、次いで、標準的な転写方法論を使用してＰＶＤＦ膜に転写した。リン酸化したＶＥＧＦＲ２の検出を、４Ｇ１０（ＵＢＩ）と呼ばれる抗ホスホチロシンｍＡｂを用いて免疫ブロットし、そしてＥＣＬ試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ）を使用して発色させることによって行った。
【０１２５】
図２５Ａ〜２５Ｃおよび２６Ａ〜２６Ｂは、この実験の結果を示す。図２５Ａ〜２５Ｃは、ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激によるチロシンリン酸化されたＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）のウエスタンブロットによる検出が、改変Ｆｌｔ１レセプターがＶＥＧＦでのプレインキュベーションの間に使用されることに依存して、細胞表面レセプターが多様なレベルまでリン酸化されることを示すことを表す。図２５Ａに示されるように、１．５モル濃度過剰のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）または一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかで、これらの３つの改変Ｆｌｔ１レセプターによるレセプター刺激を、コントロール培地のチャレンジと比較して、完全にブロックする。対照的に、一過性のＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ＶＥＧＦ陽性コントロールチャレンジと比較して、このモル濃度過剰では顕著なブロックを示さない。類似の結果を図２５Ｂに示す。ここで、改変Ｆｌｔレセプターは、ＶＥＧＦ１６５リガンドに対して３倍のモル濃度過剰である。改変Ｆｌｔ１レセプターがＶＥＧＦ１６５リガンドに対して６倍のモル濃度過剰である図２５Ｃにおいて、一過性のＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、細胞表面レセプターのＶＥＧＦ１６５誘導性刺激を部分的にブロックすることがここで示され得る。
【０１２６】
図２６Ａ〜２６Ｂにおいて、ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激によってチロシンリン酸化されたＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）のウエスタンブロットによる検出は、１および２倍モル濃度過剰（図２６Ａ）または３および４倍モル濃度過剰（図２６Ｂ）の一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、安定的なＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、または一過性のＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかでプレインキュベートされたＶＥＧＦ１６５を有するチャレンジサンプルによって、細胞表面レセプターがリン酸化されないことを示す。試験された改変Ｆｌｔ１レセプターの濃度の全てにおいて、プレインキュベーションの間にＶＥＧＦ１６５リガンドは完全に結合し、コントロール培地のチャレンジと比較して、未結合ＶＥＧＦ１６５による細胞表面レセプターの検出可能な刺激を生じない。
【０１２７】
（実施例２４：細胞増殖バイオアッセイ）
試験細胞集団はＭＧ８７細胞であり、この細胞は、ＴｒｋＢ細胞内キナーゼドメインに融合されたＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）細胞外ドメインをコードするＤＮＡ挿入物を含む発現プラスミドで安定にトランスフェクトされ、従って、キメラ分子を産生する。ネイティブなＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）細胞内キナーゼドメインよりもＴｒｋＢ細胞内キナーゼドメインが使用された理由は、これらの細胞においてＶＥＧＦ１６５によって刺激された場合に、ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）の細胞内キナーゼドメインは強い増殖性応答を引き起こさないからである。全長ＴｒｋＢレセプターを含むＭＧ８７細胞が、ＢＤＮＦで刺激された場合に強い増殖性応答を提供することは公知である。従って、ＴｒｋＢ細胞内キナーゼドメインを操作して、この増殖性応答能を利用するようにＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）の細胞内キナーゼドメインを置換する。
【０１２８】
９６ウェルプレートにおいて、１ウェル当たり５×１０³細胞をプレートし、そして３７℃で２時間静置した。以下の改変Ｆｌｔレセプター（Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））、および陰性コントロールとしてのＴｉｅ２−Ｆｃと呼ばれる無関係なレセプターを、２０ｐＭ〜４０ｎＭで滴定し、そして３７℃で１時間細胞上でインキュベートした。次いで、規定された培地中のヒト組換えＶＥＧＦ１６５を、１．５６ｎＭの濃度で全てのウェルに添加した。プレートを３７℃で７２時間インキュベートし、次いで、ＭＴＳ（オーエン試薬、Ｐｒｏｍｅｇａ）を添加し、そしてプレートをさらに４時間インキュベートした。最終的に、このプレートを４５０／５７０ｎｍで分光光度計において読んだ。この実験の結果を図２７に示す。コントロールレセプターＴｉｅ２−Ｆｃは、いずれの濃度でもＶＥＧＦ１６５誘導性細胞増殖をブロックしないが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、０．８ｎＭの半分最大用量で１．５６ｎＭのＶＥＧＦ１６５をブロックする。Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃおよびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、このアッセイにおいて、約２ｎＭの半分最大用量でＶＥＧＦ１６５のブロックに効果的ではない。ＶＥＧＦ１６５単独では、１．２吸収単位の読み取りを提供し、そしてバックグラウンドは０．３８吸収単位である。
【０１２９】
（実施例２５：改変ＦｌｔレセプターのＶＥＧＦ１６５に対する結合化学量論）
（ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ分析
Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のヒトＶＥＧＦ１６５との相互作用の化学量論を、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）表面もしくはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）表面に対するＶＥＧＦ飽和結合のレベルを測定するか、またはＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）もしくはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のＶＥＧＦ ＢＩＡｃｏｒｅチップ表面に対する結合を完全に妨げるために必要なＶＥＧＦ１６５の濃度を測定するかのいずれかで決定した。改変ＦｌｔレセプターであるＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を、Ｂｉａｃｏｒｅチップ（ＢＩＡＣＯＲＥ）上にアミン結合化学を使用して第一に固定化した抗Ｆｃ特異的抗体で捕獲した。ブランクの抗体表面を、陰性コントロールとして使用した。ＶＥＧＦ１６５を、毎分１０μｌで１時間、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）表面およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）表面にわたって、１ｎＭ、１０ｎＭおよび５０ｎＭの濃度で注入した。リアルタイムの結合シグナルを記録し、そしてそれぞれの注入の最後に飽和結合に達成した。結合化学量論を、１ｎｇ／ｍｌに等価な１０００ＲＵの転換因子を使用して、結合ＶＥＧＦ１６５と固定化Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）とのモル比として計算した。この結果は、１分子のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、または1分子のＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）当たりの，１分子のＶＥＧＦ１６５二量体の結合化学量論を示した（図２８）。
【０１３０】
溶液中で、１ｎＭの濃度のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤよりも１０００倍高いと推定される）を、多様な濃度のＶＥＧＦ１６５で混合した。１時間のインキュベーション後に、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を、アミン結合ＶＥＧＦ１６５表面に対する結合シグナルとして測定した。較正曲線を使用して、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）ＢＩＡｃｏｒｅ結合シグナルをそのモル濃度に変換した。データにより、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液への１ｎＭのＶＥＧＦ１６５の添加がＶＥＧＦ１６５表面へのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全にブロックしたことが示された。この結果により、１分子のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）当たり１分子のＶＥＧＦ１６５の結合化学量論が示唆された（図２９および図３０）。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を添加したＶＥＧＦ１６５の濃度の画分としてプロットした場合、直線部分の傾きは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）に対して−１．０６であり、そしてＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）に対して−１．０７であった。傾きの大きさ（−１に非常に近い）によって、１分子のＶＥＧＦ１６５がＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれか１分子に結合したことが示された。
【０１３１】
（ｂ）サイズ排除クロマトグラフィー
Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を、３倍過剰のＶＥＧＦ１６５と混合し、そしてレセプター−リガンド複合体を、Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ ６ サイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して精製した。次いで、レセプター−リガンド複合体を、その成分タンパク質に分離するために６Ｍの塩酸グアニジンを含有する緩衝液中でインキュベートした。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を、６Ｍの塩酸グアニジンを通すＳｕｐｅｒｏｓｅ ６ サイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用してＶＥＧＦ１６５から分離した。複合体の化学量論を決定するために、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦ１６５の数回の注入を行い、そしてピークの高さまたは積算したピークの強度を、注入したタンパク質の濃度の画分としてプロットした。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ複合体の成分を分離した際に使用した条件と同一の条件下で、較正を行った。Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ複合体組成物の定量は、較正曲線に基いた。この実験の結果を図２８に示す。これは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）に対するＶＥＧＦ１６５の比が、この複合体において１：１であることを示す。
【０１３２】
（実施例２６：サイズ排除クロマトグラフィーによるＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の結合化学量論の決定）
（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の調製）
ＶＥＧＦ１６５（濃度＝３．６１ｍｇ／ｍｌ）を、ＣＨＯ細胞で一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）（濃度＝０．９ｍｇ／ｍｌ）と３：１（ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））のモル比で混合し、４℃で一晩インキュベートした。
【０１３３】
（ａ）ネイティブな条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
過剰な未結合のＶＥＧＦ１６５から複合体を分離するために、５０μｌの複合体を、ＰＢＳ緩衝液で平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＰＣ ３．２／３０にロードした。室温で毎分４０μｌの流速にて、サンプルを、同一の緩衝液で溶出した。このＳＥＣの結果を図３１に示す。ピーク＃１は複合体を、そしてピーク＃２は未結合のＶＥＧＦ１６５を示す。１．１ｍｌと１．２ｍｌとの間で溶出された画分を合わせ、そして塩酸グアニジン（ＧｕＨＣｌ）を最終濃度４．５Ｍで添加して、この複合体を分離した。
【０１３４】
（ｂ）分離条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
レセプター−リガンド複合体の成分を分離するため、そしてこれらのモル比を決定するために、上記のような５０μｌの分離した複合体を、６ＭのＧｕＨＣｌで平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＰＣ ３．２／３０にロードし、そして室温で毎分４０μｌの流速にて、同一の溶液で溶出した。このＳＥＣの結果を図３２に示す。ピーク＃１はＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を、そしてピーク＃２はＶＥＧＦ１６５を示す。
【０１３５】
（ｃ）Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）：ＶＥＧＦ１６５複合体の化学量論の算出
レセプター−リガンド複合体の化学量論を、これらの成分のピークの面積またはピークの高さから決定した。ピークの高さまたはピークの面積に対応するＶＥＧＦ１６５およびＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度をそれぞれ、ＶＥＧＦ１６５およびＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）に関する標準曲線より得た。標準曲線を得るために、４つの異なる濃度（０．０４ｍｇ／ｍｌ〜０．３ｍｇ／ｍｌ）のいずれかの成分を、６Ｍ 塩酸グアニジンで平衡化したＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＰＣ ３．２／３０カラムに注入し、そして室温で毎分４０μｌの流速にて、同一の溶液で溶出した。ピークの面積またはピークの高さ 対 タンパク質濃度のプロットによって、標準曲線を得た。成分のピークの面積から決定したＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のモル濃度比は、１．１６であった。成分のピークの高さから決定したＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のモル比は、１．１０であった。
【０１３６】
（実施例２７：オンライン光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィーによるＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の化学量論の決定）
（複合体調製）
ＶＥＧＦ１６５を、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質と３：１（ＶＥＧＦ１６５：Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ））のモル比で混合し、そして４℃で一晩インキュベートした。
【０１３７】
（ａ）オンライン光散乱を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）
ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ、Ｋｙｏｔｏ、Ｊａｐａｎ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。サンプルをＰＢＳ緩衝液で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＨＲ １０／３０カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に注入し、そして室温で毎分０．５ｍｌの流速にて、同一の緩衝液で溶出した。図３３に示されるように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク＃１はレセプター−リガンド複合体を、そしてピーク＃２は未結合ＶＥＧＦ１６５を示す。ＭＷをＬＳおよびＲＩのシグナルより計算した。同一の手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これらの決定の結果は以下である：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７ ３００（図３３）であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは４４ ３９０（図３４）であり、そしてピークでのＲ１Ｒ２のＭＷは１１３ ３００（図３５）である。
【０１３８】
これらのデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体の化学量論がＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦ１６５の分子量の合計に対応して１：１であることを示した。重要なことに、この方法は、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体が実はＶＥＧＦ１６５リガンドの１分子のみとＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の１分子のみから構成されたことを最終的に証明した。
【０１３９】
（実施例２８：Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のペプチドマッピング）
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のジスフィルド構造およびグルコシル化部位を、ペプチドマッピング法によって決定した。この方法においては、タンパク質をまずトリプシンで切断した。トリプシン処理のフラグメントを、Ｎ末端配列決定技術に加えて、質量分析法と連結したＨＰＬＣで分析および同定した。トリプシン消化の還元を、ジスフィルド結合含有フラグメントの同定を補助するために利用した。ＰＮＧａｓｅ Ｆ（Ｇｌｙｋｏ，Ｎｏｖａｔｏ，ＣＡ）でのトリプシン消化の処理を、Ｎ連結グリコシル化部位を有するフラグメントの同定を補助するために利用した。これらの結果を添付する図３６に要約する。
【０１４０】
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）に合計１０のシステインが存在し；これらの６つはＦｃ領域に属する。Ｃｙｓ２７は、Ｃｙｓ７６にジスフィルド結合することが確認された。Ｃｙｓ１２１は、Ｃｙｓ１８２にジスフィルド結合することが確認された。Ｆｃ領域の最初の２つのシステイン（Ｃｙｓ２１１およびＣｙｓ２１４）は、別のＦｃ鎖における同一の２つのシステインと分子間ジスフィルド結合を形成する。しかし、これらの２つのシステインは酵素的に互いを分離し得ないので、ジスフィルド結合が同一のシステインの間（例えば、Ｃｙｓ２１１とＣｙｓ２１１）またはＣＹ２１１とＣｙｓ２１４との間に生じるか否かは決定し得ない。Ｃｙｓ２１６は、Ｃｙｓ３０６にジスフィルド結合することが確認される。Ｃｙｓ３５２は、Ｃｙｓ４１０にジスフィルド結合することが確認される。
【０１４１】
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）に５つの可能性のあるＮ連結グリコシル化部位が存在する。これら５つの全ては、多様な程度にグリコシル化されることが見出される。完全なグリコシル化が、Ａｓｎ３３（アミノ酸配列ＮＩＴ）、Ａｓｎ１９３（アミノ酸配列ＮＳＴ）およびＡｓｎ２８２（アミノ酸配列ＮＳＴ）で観察された。さらに、部分的グリコシル化がＡｓｎ６５およびＡｓｎ１２０で観察される。グリコシル化の部位を、図３６で下線によって強調する。
【０１４２】
（実施例２９：改変Ｆｌｔレセプターの薬物動態分析）
（ａ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態分析
Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ＣＨＯで安定的に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、およびＣＨＯで一過性に発現させたＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下注射した。注射後１、２、４、６、２４時間、２日、３日および６日に、マウスを尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するように設計したＥＬＩＳＡでアッセイした。ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートをＶＥＧＦ１６５でコーティングする工程、検出Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を結合させる工程および西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗Ｆｃ抗体でレポートする工程を包含する。この実験の結果を図３７に示す。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）についてのＴ_maxは、６時間であったが、一過性Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）および安定的なＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）ならびに一過性ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＴ_maxは、２４時間であった。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）についてのＣ_maxは、８μｇ／ｍｌであった。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の両方の一過性について、Ｃ_maxは、１８μｇ／ｍｌであり、安定的なＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）について、Ｃ_maxは、３０μｇ／ｍｌであった。
【０１４３】
（ｂ）Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態分析
Ｂａｌｂ／ｃマウス（２５〜３０ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下注射した。注射後１、２、５、６、７、８、１２、１５および２０日に、マウスを尾から採血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するように設計したＥＬＩＳＡでアッセイした。ＥＬＩＳＡは、ＥＬＩＳＡプレートを１６５でコーティングする工程、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を結合させる工程および西洋ワサビペルオキシダーゼに連結された抗Ｆｃ抗体でレポートする工程を包含する。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）は、もはや５日後に血清中で検出され得ないが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、１５日以上検出可能であった。この実験の結果を図３８に示す。
【０１４４】
（実施例３０：インビボで腫瘍増殖を阻害するＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の能力の評価）
インビボで腫瘍増殖を阻害するＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の能力の評価するために、雄の重篤複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスの右脇腹に腫瘍細胞懸濁液を皮下移植するモデルが利用した。２つの細胞株（それぞれが明確に異なる形態および増殖特性を示す、ヒトＨＴ−１０８０線維肉腫細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１２１）およびラットＣ６神経膠腫細胞株（ＡＴＣＣ受託番号ＣＣＬ−１０７））を、アッセイに使用した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の第一の用量（２５ｍｇ／Ｋｇでかまたは図３９および４０に示されるように）を、腫瘍移植の日に提供した。動物に、続いてＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはビヒクルの皮下注射を、一日おき（ＥＯＤ）か１週間に２回（２×／ｗｋ）のいずれかで２週間にわたって受けさせた。２週間後、動物を固定液で灌流し、腫瘍を取り外し、そしてサンプルを盲目検定した。可視の皮下腫瘍の長さおよび幅を測定することによって、腫瘍体積を決定した。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）およびＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の両方は、ＨＴ−１０８０細胞およびＣ６細胞によって形成された腫瘍の増殖を顕著に減少した。これらの実験の結果を図３９および図４０に示す。
【０１４５】
（実施例３１：雌性生殖系におけるＶＥＧＦ１６５および改変Ｆｌｔレセプターの効果）
生殖周期の経過にわたる子宮および卵巣で生じる血管リモデリングの通念的なパターンは、十分に特徴付けられており、これらの組織を、新脈管形成、血管リモデリングおよび血管退化を調節する機構の研究へ格別十分に最適にする。実際に、生殖組織のインサイチュハイブリダイゼーション研究によって、ＶＥＧＦが、成熟したげっ歯類ならびにヒトおよび非ヒト霊長類において、生理的新脈管形成のメディエーターとして作用する最初の明確な証拠が提供された（Ｐｈｉｌｌｉｐｓら、１９９０；Ｒａｖｉｎｄｒａｎａｔｈら、１９９２；Ｓｈｗｅｉｋｉら、１９９３；Ｋａｍａｔら、１９９５）。周期性の新脈管形成および血管リモデリングは、正常な卵巣および子宮の顕著な特徴であるので、異常な血管増殖および／または血管機能不全が、これらの器官に影響を与える多くの病理状態を特徴付けることが見出されたことは、驚くべきことではない。さらに、これらの病原性の血管異常性は、１つ以上の脈管形成因子または抗脈管形成因子、最も顕著にはＶＥＧＦの発現の調節不全な発現によって、引起されるかまたは不滅化されると考えられる。
【０１４６】
例えば、異常な新脈管形成は、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症および子宮内膜癌腫に特徴的であり、そして各場合において、ＶＥＧＦは、発症組織において過剰発現している（Ｋａｍａｔら、１９９５；Ｓｈｉｆｒｅｎら、１９９６；Ｇｕｉｄｉら、１９９６；Ｄｏｎｎｅｚら、１９９８）。ＶＥＧＦの過剰発現はまた、卵巣過剰刺激症候群（ＭｃＣｌｕｒｅら、１９９４；Ｌｅｖｉｎら、１９９８）および子癇前症（Ｂａｋｅｒら、１９９５；Ｓｈａｒｋｅｙら、１９９６）における全身性の血管の透過性亢進（ｈｙｐｅｒｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ）の確立に病原性の役割を果たすと考えられている。さらに、ＶＥＧＦは、卵巣癌および他の腫瘍と関連する腹水の生成の原因である透過性因子として関連している（Ｓｅｎｇｅｒら、１９８３；Ｂｏｏｃｏｃｋら、１９９５）。ＶＥＧＦの生物学的活性を効果的に中和する薬剤は、上記の状態および関連する状態において治療的に有用であるものとして合理的に予測され得る。
【０１４７】
新脈管形成および血管リモデリングはまた、未分化胚芽細胞の着床および胎盤の発達の特徴である（Ｆｉｎｄｌａｙ、１９８６）。ＶＥＧＦは、母体脱落膜中および胚のトロホブラスト中の両方において強く発現し、ここで、これはまず着床期辺りの間に、子宮脈環構造の発現および透過性亢進を刺激し、続いて、母性成分の胎盤血管構造と胚成分の胎盤血管構造との両方の形成を媒介すると考えられる（Ｓｈｗｅｉｋｉら、１９９３；Ｃｕｌｌｉｎａｎ−ＢｏｖｅおよびＫｏｏｓ、１９９３；Ｃｈａｋｒａｂｏｒｔｙら、１９９５；Ｄａｓら、１９９７）。ＶＥＧＦはまた、黄体の新脈管形成に必要であり、そして、着床のための子宮の準備に必要であるプロゲステロン分泌と関連する（Ｆｅｒｒａｒａら、１９９８）。従って、ＶＥＧＦの生物学的活性を阻害する薬剤は、（着床を妨げることによって）避妊剤として有用であるか、または妊娠の初期段階における流産を促す物質として有用であることが証明され得る。後者の適用は、異所性妊娠の終結のための非外科的介入としての特定の用途が見出され得る。
【０１４８】
ＶＥＧＦレセプターの発現は、正常な生殖組織中の血管内皮に広く確認されたが、Ｆｌｔ１はまた、ヒトおよび動物の両方の胎盤中のトロホブラストに発現し（Ｃｌａｒｋら、１９９６；Ｈｅら、１９９９）、これによって、トロホブラスト浸潤に役割を果たすことが提案される。興味深いことに、Ｆｌｔ１およびＫＤＲ（Ｆｌｋ１）の両方は、絨毛癌細胞株のＢｅＷｏに発現し（Ｃｈａｒｎｏｃｋ−Ｊｏｎｅｓら、１９９４）、そしてＶＥＧＦは、これらの細胞中のＤＮＡ合成およびＭＡＰキナーゼのチロシンリン酸化を促進することが示された。さらに、原発性卵巣癌および転移性卵巣癌は、高レベルのＶＥＧＦを発現するだけでなく、血管内皮に加えて、さらにこの腫瘍細胞自身が、ＫＤＲおよび／またはＦｌｔ１を発現する（Ｂｏｏｃｏｃｋら、１９９５）。これらの知見によって、ＶＥＧＦは腫瘍血管構造の生成および維持に決定的に関与し得るのみでなく、少なくともいくつかの生殖腫瘍起源のＶＥＧＦは、腫瘍細胞の生存および増殖を直接支持することによってオートクラインの役割を促進し得る。従って、ＶＥＧＦの作用を阻害する薬剤は、生殖起源の腫瘍の処置に対する特に有益な適用を有し得る。
【０１４９】
（方法および結果）
（（ａ）ＶＥＧＦ誘導の子宮透過性亢進の評価）
妊娠した雌馬の血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を、皮下注射し（５ＩＵ）、思春期前の雌のラットに排卵を誘導した。これは、２日後にエストラジオールの急増を引き起こし、次に、子宮中のＶＥＧＦの誘導を引き起こした。この誘導が子宮の透過性亢進を引き起こし、ゆえに、６時間後に子宮の湿重量における増加を生じ、従ってこれは、改変ＦｌｔレセプターのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）によって強力に阻害され得たことが、報告された。このインビボモデルにおいて、ラットの子宮の通常の重量は、約５０ｍｇであり、そしてこれは、ＰＭＳＧによって３００〜３５０ｍｇに誘導され得る。組織の乾燥によって、これが全て水の重量であることが明らかとなる。ＰＭＳＧ注射の１時間後のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の２５ｍｇ／ｋｇでの皮下注射は、子宮湿重量における増加の約５０％の阻害を引き起こした。改変Ｆｌｔレセプターの用量における増加は、湿重量における増加をさらに減少せず、このモデルに対するＶＥＧＦ独立の成分が存在することを示唆する。この実験の結果を、図４１に示す。
【０１５０】
（（ａ）プロゲステロンを読取った情報として用いる黄体新脈管形成の評価）
妊娠した雌馬の血清ゴナドトロピン（ＰＭＳＧ）を皮下注射（５ＩＵ）し、思春期前の雌のラットに排卵を誘導する。これは、４日後に密集した血管のネットワークを含む完全に機能する黄体を引き起こし、これは、着床のために子宮を準備するために、血流へのプロゲステロンの分泌を可能にする。黄体における新脈管形成の誘導は、ＶＥＧＦを必要とする；従って、ＶＥＧＦのブロックは、新規の血管の不足を引起こし、ゆえに血流へのプロゲステロンの分泌の不足を引起す。このインビボモデルにおいて、生じたプロゲステロンのレベルは、約５ｎｇ／ｍｌであり、そして、これは、ＰＭＳＧ注射の１時間後に２５〜４０ｎｇ／ｍｌのレベルまで誘導し得た。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）またはＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の、２５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでの皮下注射は、４日目にプロゲステロン誘導の完全な阻害を引起した。この実験の結果は、図４２Ａ〜４２Ｂに示す。
【０１５１】
（実施例３３：Ｆｌｔｌ（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）およびペグ化（ｐｅｇｙｌａｔｅ）されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態分析）
Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを、１０ｋＤまたは２０ｋＤのいずれかのＰＥＧを用いてペグ化し（ＰＥＧｙｌａｔｅ）、そして、ｂａｌｂ／ｃマウス中でその薬物動態プロフィールに対して試験した。両方のペグ化形態のＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃが、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）よりも、非常に良好なＰＫプロフィールを有し、これらのペグ化分子に対して、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）の６時間と対照的に２４時間でＴ_maxを伴った。
【０１５２】
（実施例３４：改変Ｆｌｔ１レセプター改変体の親和性を試験するためのＶＥＧＦ１６５ ＥＬＩＳＡ）
１０ｐＭのＶＥＧＦ１６５を、一晩室温で、改変Ｆｌｔ１レセプター改変体を１６０ｐＭ〜０．１ｐＭの範囲で用いてインキュベートした。この実験に使用された改変Ｆｌｔ１レセプター改変体は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、一過性に発現されるＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、一過性に発現されるＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＦＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）、Ｆｌｔ１−（１−３_NAS）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３_R->C）−ＦｃおよびＴｉｅ２−Ｆｃであった。Ｆｌｔ１（１−３_NAS）−Ｆｃは、高い塩基性アミノ酸配列ＫＮＫＲＡＳＶＲＲＲがＮＡＳＶＮＧＳＲによって置換されるＦｌｔ（１−３）−Ｆｃの改変バージョンであり、２つの新規なグリコシル化部位の組み込みおよび５つの正の電荷の正味の減少を引起す（この両方は、ＰＫに対するこの配列の所望されない効果を減少する目的を伴う）。Ｆｌｔ１（１−３_R->c）−Ｆｃは、同じ塩基性アミノ酸配列中の単一のアルギニン（Ｒ）残基が、システイン（Ｃ）に変化する改変であり（ＫＮＫＲＡＳＶＲＲＲ−＞ＫＮＫＣＡＳＶＲＲＲ）、その残基のペグ化を可能にし、次いでこれは、ＰＫに対するその所望されない効果の発揮から塩基性領域を保護し得る。インキュベーションの後、この溶液を、ＶＥＧＦ１６５に対する捕獲抗体（Ｒ＆Ｄ）を含むプレートに移した。次いで、遊離のＶＥＧＦ１６５の量を、抗体を用いて測定し、遊離のＶＥＧＦ１６５を報告した。これは、ＶＥＧＦ１６５に対して最も高い親和性を有する改変Ｆｌｔ１レセプター改変体（遊離のＶＥＧＦ１６５の最も少ない量として測定される）が、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）であり、Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃおよびＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）が続き、次いでＦｌｔ１（１−３_R->C）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３_NAS）−ＦｃおよびＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＦＧＦＲ３Ｄ３−ＦｃΔＣ１（ａ）が続くことを示した。Ｔｉｅ２Ｆｃは、ＶＥＧＦ１６５に対する親和性を有さない。
【図面の簡単な説明】
【図１】 図１は、未改変およびアセチル化されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のＩＥＦゲル分析である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、そのｐＩが９．３より大きいため、ゲルに侵入できない。一方、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、ゲルに侵入し得、そしてｐＩ５．２で平衡化する。
【図２】 図２は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングしたプレートへの、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質およびアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の結合である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）における細胞外マトリックス成分に広範に結合し、一方、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃは、結合しない。
【図３】 図３は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける結合である。アセチル化（カラム１３〜１６）、ペグ化（カラム１７〜２０）、およびヘパリン処理したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム２１〜２４）の各々は、コントロール（カラム１〜４）および無関係のタンパク質（カラム５〜８）と比較して、ＶＥＧＦ結合について、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと完全に競合し得る。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（カラム５〜６）は、ＶＥＧＦ結合について、Ｂｉａｃｏｒｅチップに結合したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃと部分的にのみ競合するようである。しかし、この結合サンプルの０．５Ｍ ＮａＣｌでの洗浄（カラム７〜８）は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの改変形態と類似の結合プロフィールを生じ、これは未改変タンパク質が、塩洗浄によって除去され得るチップに対する非特異的結合を示すことを示す。
【図４】 図４は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおけるＶＥＧＦへの結合である。ペグ化およびアセチル化されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の両方は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの親和性に匹敵する親和性を伴ってＶＥＧＦに結合する。
【図５】 図５は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびペグ化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的なプロフィールである。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの未改変、アセチル化、またはペグ化したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃを皮下注射した。タンパク質注射の１、２、４、６、２４時間、２日、および３日後に、このマウスの尾を出血させ、そして血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質を検出するよう設計された標準的なＥＬＩＳＡベースのアッセイでアッセイした。全てのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質 のＴ_maxは、６時間と２４時間との間の時点であった。異なるタンパク質のＣ_maxは以下のようであった：未改変：０．０６μｇ／ｍｌ〜０．１５μｇ／ｍｌ；アセチル化：１．５μｇ／ｍｌ〜４．０μｇ／ｍｌ；およびペグ化：約５μｇ／ｍｌ。
【図６】 図６Ａ〜６Ｂは、未改変および段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質のＩＥＦゲル分析である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、そのｐＩが９．３より大きいために、ゲルに侵入できない。一方、大部分の段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃサンプル（３０〜１００倍過剰のサンプル）は、ゲル中に移動し得、そしてアセチル化の程度に依存して、４．５５と８．４３とのの範囲のｐＩで平衡化する。
【図７】 図７は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングしたプレートへの結合である。無関係のコントロールタンパク質（ｒＴｉｅ２−Ｆｃ）を用いる場合、段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（２０および３０倍過剰のサンプル）は、Ｍａｔｒｉｇｅｌコーティングしたプレートへのいずれの結合も示さないが、一方、非アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、有意な結合を示す。１０倍過剰のサンプルは、減少した結合を示すが、アセチル化の程度は、細胞外マトリックス成分への結合を完全にブロックするために十分ではない。
【図８】 図８は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける結合である。準化学量論的な比で（０．５μｇ／ｍｌの未改変Ｆｌｔ１（１−３）または段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃのいずれか対０．２μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）、ＶＥＧＦに完全に結合するためのに十分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（未改変または段階アセチル化のいずれか）は、溶液中には存在しない。１．０μｇ／ｍｌ（これは、約１：１の化学量論比である）において、未改変および段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの両方は、ＶＥＧＦ結合についてより良く競合し得るが、依然として利用可能なＶＥＧＦを完全に飽和するために充分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（未改変または段階アセチル化のいずれか）が存在しない。しかし、５．０μｇ／ｍｌ（これは、１：１の化学量論比よりも数倍高い）において、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質の両方は、アセチル化の程度にかかわらず、ＶＥＧＦを飽和し得る。
【図９】 図９は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃおよび段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの薬物動態学的なプロフィールである。Ｂａｌｂ／ｃマウス（２３〜２８ｇ）に、４ｍｇ／ｋｇの未改変または段階アセチル化Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの１０、２０、４０、６０および１００倍過剰なサンプルを皮下注射した（未改変、１０、２０および４０倍過剰のサンプルについて３匹のマウス、ならびに６０および１００倍過剰のサンプルについて２匹のマウス）。注射の１、２、４、６、２４時間、２日および３日後に、このマウスの尾を出血させた。この血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃを検出するために設計されたＥＬＩＳＡベースのアッセイでアッセイした。試験したＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質についての全てのＴ_maxは、６時間の時点であったが、Ｃ_maxは以下のようであった：未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ：０．０６μｇ／ｍｌ；１０倍過剰サンプル：−０．７μｇ／ｍｌ、２０倍過剰サンプル−２μｇ／ｍｌ、４０倍過剰サンプル−４μｇ／ｍｌ、６０倍過剰サンプル−２μｇ／ｍｌ、１００倍過剰サンプル−１μｇ／ｍｌ。
【図１０】 図１０Ａ〜１０Ｄは、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１１】 図１１は、Ｆｌｔ１の構造の概略図である。
【図１２】 図１２Ａおよび１２Ｂは、Ｆｌｔ１のＩｇドメイン２およびＩｇドメイン３のアミノ酸配列の親水性分析である。
【図１３】 図１３Ａ〜１３Ｄは、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_ΔB）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１４】 図１４Ａ〜１４Ｃは、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_ΔB）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１５】 図１５Ａ〜１５Ｃは、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１６】 図１６Ａ〜１６Ｄは、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R- >_N）−Ｆｃの核酸および推定されたアミノ酸配列である。
【図１７】 図１７は、Ｂｉａｃｏｒｅベースのアッセイにおける、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、塩基性領域欠失変異体Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（１−３）_R- >_N変異体タンパク質の結合である。準化学量論的な比で（０．２５μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的に改変されたサンプルのＦｌｔ（１−３）−Ｆｃ対０１．μｇ／ｍｌのＶＥＧＦ）、Ｂｉａｃｏｒｅチップに固定化されたＦｌｔ１（１−３）−ＦｃへのＶＥＧＦの結合をブロックするための充分なＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質が存在しない。０．５μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的に改変されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質において、化学量論比は約１：１であり、そしてＢｉａｃｏｒｅチップへのＶＥＧＦ結合をブロックする増大した能力が存在する。１．０μｇ／ｍｌの未改変、アセチル化または遺伝的に改変されたＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質（これは、約１０：１の化学量論比である）において、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、ＢｉａｃｏｒｅチップへのＶＥＧＦの結合をブロックし得るが、これらは等価ではない。未改変、アセチル化、およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_ΔB）−Ｆｃは、ＶＥＧＦ結合をブロックする能力において本質的に等しいが、一方で、Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R- >_N）−Ｆｃは、結合のブロックにおいて幾分効率が低い。
【図１８】 図１８は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質のＭａｔｒｉｇｅｌ（登録商標）コーティングしたプレートへの結合である。未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質は、これらのウェルに強く結合し、Ｍｕｔ３：Ｆｌｔ１（２−３）−Ｆｃタンパク質は幾分弱く結合し、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_ΔB）−Ｆｃタンパク質はさらにより弱く結合し、そしてＭｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_ΔB）−Ｆｃタンパク質は、最良のプロフィールを示し、他の任意の変異体タンパク質よりもより弱く結合する。Ｍｕｔ４：Ｆｌｔ１（１−３_R- >_N）−Ｆｃグリコシル化変異体タンパク質は、Ｍａｔｒｉｇｅｌアッセイ上で最低限の利点のみを示す。
【図１９】 図１９は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質の、ＥＬＩＳＡベースのアッセイにおける結合である。試験した濃度において、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質は、同様にＶＥＧＦに結合する。
【図２０】 図２０は、未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｍｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_ΔB）−Ｆｃ、Ｍｕｔ２：Ｆｌｔ１（２−３_ΔB）−Ｆｃ、およびＦｌｔ１（２−３）変異体タンパク質の薬物動態学的なプロフィールである。これらの試薬についてのＣｍａｘは以下のようであった：未改変Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ −０．１５μｇ／ｍｌ；４０倍モル過剰のアセチル化Ｆｌｔ１（１−３）Ｆｃ -１．５μｇ／ｍｌ；およびＭｕｔ１：Ｆｌｔ１（１−３_ΔB）−Ｆｃ −０．７μｇ／ｍｌ。
【図２１】 図２１Ａ〜２１Ｃは、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）といわれる改変されたＦｌｔ１レセプターのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列である。
【図２２】 図２２Ａ〜２２Ｃは、Ｆｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）といわれる改変されたＦｌｔ１レセプターのヌクレオチドおよび推論されたアミノ酸配列である。
【図２３】 図２３は、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）アッセイである。このアッセイの結果は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）タンパク質が、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃタンパク質と比較して、ＥＣＭに対してかなり粘着性が低いことを実証する。
【図２４】 図２４Ａ〜２４Ｃは、ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）といわれる改変されたＦｌｔ１レセプターのヌクレオチドおよび推定されたアミノ酸配列である。
【図２５】 図２５Ａ〜２５Ｃは、リン酸化アッセイである。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）または一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかの１．５モル過剰において、コントロール培地のチャレンジと比較して、これらの３つの改変されたＦｌｔ１レセプターによるレセプター刺激の完全なブロックが存在する。対照的に、一過性のＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ＶＥＧＦ陽性コントロールのチャレンジと比較して、このモル過剰では有意なブロックを示さなかった。同様の結果が図２５Ｂにおいて見られ、改変されたＦｌｔレセプターはＶＥＧＦ１６５リガンドの３倍モル過剰である。図２５Ｃにおいて、改変されたＦｌｔ１レセプターは、ＶＥＧＦ１６５リガンドの６倍モル過剰であり、一過性のＦｌｔ１Ｄ２ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、ここで、細胞表面レセプターのＶＥＧＦ１６５誘導刺激を部分的にブロックすることを示し得る。
【図２６】 図２６Ａ〜２６Ｂは、リン酸化アッセイである。ＶＥＧＦ１６５リガンド刺激によるチロシンリン酸化ＶＥＧＦＲ２（Ｆｌｋ１）のウエスタンブロットによる検出は、細胞表面レセプターが、１および２倍モル過剰（図２６Ａ）または３および４倍モル過剰（図２６Ｂ）の、一過性のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、安定なＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、または一過性のＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）のいずれかでプレインキュベートしたＶＥＧＦ１６５を有するチャレンジサンプルによってリン酸化されないことを示す。試験された全ての改変Ｆｌｔ１レセプター濃度において、プレインキュベーションの間にＶＥＧＦ１６５リガンドの完全な結合があり、これは、コントロール培地チャレンジと比較して、未結合ＶＥＧＦ１６５による細胞表面レセプターの検出可能な刺激を生じない。
【図２７】 図２７は、ＭＧ／Ｒ２細胞増殖アッセイである。以下の改変ＦｌｔレセプターＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ならびに陰性コントロールとしてＴｉｅ２−Ｆｃといわれる無関係のレセプターを、４０ｎＭ〜２０ｐＭから滴定し、そしてこの細胞上で１時間、３７℃でインキュベートした。次いで、規定培地中のヒト組換えＶＥＧＦ１６５を、１．５６ｎＭの濃度で全てのウェルに添加した。陰性コントロールレセプターＴｉｅ２−Ｆｃは、いずれの濃度でもＶＥＧＦ１６５誘導細胞増殖をブロックしなかったが、一方、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、０．８ｎＭの最大値の半分の用量で１．５６ｎＭ ＶＥＧＦ１６５をブロックする。Ｆｌｔ１（１−３）−ＦｃおよびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、約２ｎＭの最大の半分の用量を用いるこのアッセイにおけるＶＥＧＦ１６５のブロックにおいて低効率である。ＶＥＧＦ１６５単独は、１．２の吸光度単位を読み取り、そしてバックグラウンドは０．３８吸光度単位である。
【図２８】 図２８は、結合化学量論のＢｉａｃｏｒｅ分析である。結合化学量論は、１ｎｇ／ｍｌと等価の１０００ＲＵの転換因子を使用して、固定されたＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）に対する結合したＶＥＧＦ１６５のモル比として計算された。この結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たりの１つのＶＥＧＦ１６５ダイマー分子の結合化学量論を示した。
【図２９】 図２９は、サイズ排除クロマトグラフィーの化学量論である。１ｎＭの濃度のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤよりも１０００倍高いと推定した）を、変化する濃度のＶＥＧＦ１６５と混合した。インキュベーションの後、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を測定した。このデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液への１ｎＭのＶＥＧＦ１６５の添加が、ＶＥＧＦ１６５表面へのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全にブロックすることを示す。この結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たりの１つのＶＥＧＦ１６５分子の結合化学量論を示唆した。
【図３０】 図３０は、サイズ排除クロマトグラフィーの化学量論である。１ｎＭの濃度のＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）（Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５相互作用のＫＤよりも１０００倍高いと推定した）を、変化する濃度のＶＥＧＦ１６５と混合した。インキュベーションの後、溶液中の遊離Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の濃度を測定した。このデータは、Ｆｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）溶液への１ｎＭのＶＥＧＦ１６５の添加が、ＶＥＧＦ１６５表面へのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の結合を完全にブロックすることを示す。この結果は、１つのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）分子当たりの１つのＶＥＧＦ１６５分子の結合化学量論を示唆した。
【図３１】 図３１は、ネイティブ条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ピーク＃１はＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体を表し、そしてピーク＃２は未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。１．１ｍｌと１．２ｍｌとの間の溶出した画分を合わせ、そしてこの複合体を解離させるためにグアニジウム塩酸塩（ＧｕＨＣｌ）を添加して、４．５Ｍの最終濃度にした。
【図３２】 図３２は、解離条件下でのサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。レセプター−リガンド複合体の成分を分離するため、およびそのモル比を決定するために、５０μｌの解離複合体を、６ＭのＧｕＨＣｌ中で平衡化したＳｕｐｅｒｏｓｅ １２ ＰＣ ３．２／３０にロードし、そして溶出した。ピーク＃１はＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を表し、そしてピーク＃２はＶＥＧＦ１６５を表す。
【図３３】 図３３は、オンライン光散乱（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えるサイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。図３３に示すように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク番号１は、レセプター−リガンド複合体を表し、そしてピーク番号２は、未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルから算出した。同じ手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これらの決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７３００（図３３）であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４３９０（図３４）であり、そしてピーク位置でのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３３００である（図３５）。
【図３４】 図３４は、オンライン光散乱（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えるサイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。図３３に示すように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク番号１は、レセプター−リガンド複合体を表し、そしてピーク番号２は、未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルから算出した。同じ手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これらの決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７３００（図３３）であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４３９０（図３４）であり、そしてピーク位置でのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３３００である（図３５）。
【図３５】 図３５は、オンライン光散乱（Ｏｎ−Ｌｉｎｅ Ｌｉｇｈｔ Ｓｃａｔｔｅｒｉｎｇ）を用いるサイズ排除クロマトグラフィー（ＳＥＣ）である。ＭｉｎｉＤａｗｎオンライン光散乱検出器（Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）および屈折率（ＲＩ）検出器（Ｓｈｉｍａｄｚｕ，Ｋｙｏｔｏ，Ｊａｐａｎ）を備えるサイズ排除クロマトグラフィーカラムを使用して、レセプター−リガンド複合体の分子量（ＭＷ）を決定した。図３３に示すように、溶出プロフィールは２つのピークを示す。ピーク番号１は、レセプター−リガンド複合体を表し、そしてピーク番号２は、未結合ＶＥＧＦ１６５を表す。ＭＷを、ＬＳおよびＲＩシグナルから算出した。同じ手順を使用して、レセプター−リガンド複合体の個々の成分のＭＷを決定した。これらの決定の結果は、以下の通りである：ピーク位置でのＦｌｔ１Ｄ２Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）／ＶＥＧＦ１６５複合体のＭＷは、１５７３００（図３３）であり、ピーク位置でのＶＥＧＦ１６５のＭＷは、４４３９０（図３４）であり、そしてピーク位置でのＲ１Ｒ２のＭＷは、１１３３００である（図３５）。
【図３６】 図３６は、ペプチドマッピングおよびグリコシル化分析である。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のジスルフィド構造およびグリコシル化部位を、ペプチドマッピング法により決定した。Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中に合計１０のシステインが存在する；それらのうちの６つは、Ｆｃ領域に属する。Ｃｙｓ２７はＣｙｓ７６とジスルフィド結合する。Ｃｙｓ１２１は、Ｃｙｓ１８２とジスルフィド結合する。Ｆｃ領域中の始めの２つのシステイン（Ｃｙｓ２１１およびＣｙｓ２１４）は、別のＦｃ鎖中の同じ２つのシステインと分子間ジスルフィド結合を形成する。しかし、ジスルフィド結合が同じシステイン間（例えば、Ｃｙｓ２１１とＣｙｓ２１１）で、またはＣｙｓ２１１とＣｙｓ２１４との間で生じるか否かは、決定され得ない。Ｃｙｓ２１６は、Ｃｙｓ３０６とジスルフィド結合する。Ｃｙｓ３５２は、Ｃｙｓ４１０とジスルフィド結合する。
Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）中に、５つの可能なＮ結合するグリコシル化部位が存在し、そしてそれらは種々の程度までグリコシル化されることが見出される。完全なグリコシル化は、Ａｓｎ３３、Ａｓｎ１９３およびＡｓｎ２８２において観察される。部分的なグリコシル化は、Ａｓｎ６５およびＡｓｎ１２０上で観察される。グリコシル化の部位は、図において下線により強調される。
【図３７】 図３７は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）、ＣＨＯで安定的に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＣＨＯで一過性に発現させたＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下的に注射した。マウスを、注射の１、２、４、６、２４時間、２日、３日、６日後に尾部出血した。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）またはＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するために設計されたＥＬＩＳＡにおいて、血清をアッセイした。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）のＴｍａｘは６時間であり、一方、一過性および安定なＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）および一過性ＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＴｍａｘは２４時間であった。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）についてのＣｍａｘは８μｇ／ｍｌであり、両方の一過性物（Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ））について、Ｃｍａｘは、１８μｇ／ｍｌであり、そして安定なＶＥＧＦＲ１Ｒ２−ＦｃΔＣ１（ａ）についてのＣｍａｘは、３０μｇ／ｍｌであった。
【図３８】 図３８は、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の薬物動態である。Ｂａｌｂ／ｃマウスに、４ｍｇ／ｋｇのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、ＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＣＨＯで一過性に発現させたＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を皮下的に注射した。マウスを注射の１、２、５、６、７、８、１２、１５および２０日後に尾部出血した。血清を、Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）を検出するために設計されたＥＬＩＳＡにおいてアッセイした。Ｆｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）は、５日後には、もはや血清中で検出され得ないが、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）は、１５日間以上検出可能であった。
【図３９】 図３９は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のインビボでＨＴ−１０８０線維肉腫腫瘍増殖を阻害する能力である。隔日または１週間に２回のＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）でのＳＣＩＤマウスの処置（２５ｍｇ／Ｋｇ）は、皮下ＨＴ−１０８０線維肉腫腫瘍の増殖を有意に減少した。
【図４０】 図４０は、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）のインビボでＣ６神経膠腫腫瘍増殖を阻害する能力である。隔日または１週間に２回のＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）でのＳＣＩＤマウスの処置は、２．５ｍｇ／Ｋｇ程度に低い用量で、皮下Ｃ６神経膠腫腫瘍の増殖を有意に減少した。
【図４１】 図４１は、ＥＶＧＦ誘導性の子宮の透過性亢進である。思春期前の雌ラットにおいて排卵を誘導するために皮下注射されたＰＭＳＧ（５ＩＵ）は、２日後にエストラジオールのサージを生じ、これは、次に子宮においてＶＥＧＦの誘導を引き起こした。この誘導は、子宮の透過性亢進を生じ、そして子宮の濡れを増加した。ＰＭＳＧ注射の１時間後における２５ｍｇ／ｋｇでのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）、Ｆｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）およびＦｌｔ１Ｄ２．ＶＥＧＦＲ３Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射は、子宮の湿重量の増加の約５０％の阻害を生じた。
【図４２】 図４２Ａ〜４２Ｂは、読み出し情報としてプロゲステロンを使用する黄体新脈管形成の評価である。ＰＭＳＧを皮下注射（５ＩＵ）して、思春期前の雌ラットにおいて排卵を誘導し、これは、移植のために子宮を調製するために血流中にプロゲステロンを分泌する血管の高密度なネットワークを含む、十分に機能する黄体を生じる。黄体中の新脈管形成の誘導は、ＶＥＧＦを必要とする。得られたプロゲステロンのレベルは、約５ｎｇ／ｍｌであり、そしてＰＭＳＧ後には２５〜４０ｎｇ／ｍｌまで誘導され得る。ＰＭＳＧ注射の１時間後における２５ｍｇ／ｋｇまたは５ｍｇ／ｋｇでのＦｌｔ１（１−３）−Ｆｃ（Ａ４０）またはＦｌｔ１Ｄ２．Ｆｌｋ１Ｄ３．ＦｃΔＣ１（ａ）の皮下注射は、４日目におけるプロゲステロン誘導の完全な阻害を生じた。

Claims (42)

1. 多量体化成分に作動的に連結されたＶＥＧＦレセプター成分を含み、ＶＥＧＦポリペプチドに結合し得る融合ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子：
   ここで、該多量体化成分は、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＩｇＧの重鎖のいずれかの免疫グロブリンドメインであり、および
   該ＶＥＧＦレセプター成分は、Ｆｌｔ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン２と、Ｆｌｋ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン３若しくはＦｌｔ４の細胞外ドメインのＩｇドメイン３との融合体である。
2. 前記Ｆｌｔ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン２をコードするヌクレオチド配列が、前記Ｆｌｋ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン３若しくはＦｌｔ４の細胞外ドメインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の上流にある、請求項１記載の単離された核酸分子。
3. 前記Ｆｌｔ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン２をコードするヌクレオチド配列が、前記Ｆｌｋ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン３若しくはＦｌｔ４の細胞外ドメインのＩｇドメイン３をコードするヌクレオチド配列の下流にある、請求項１記載の単離された核酸分子。
4. 前記融合ポリペプチドが、配列番号１６に示される２７〜４５８位のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである請求項１または２に記載の核酸分子。
5. 前記融合ポリペプチドが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる融合ポリペプチドである請求項１、２または４に記載の核酸分子。
6. 前記核酸分子が、配列番号１５に示される１〜１３７４位のヌクレオチド配列を含む核酸分子である請求項１、２、４または５に記載の単離された核酸分子。
7. 多量体化成分に作動可能に連結されたＶＥＧＦレセプター成分を含み、ＶＥＧＦポリペプチドに結合し得る融合ポリペプチド：
   ここで、該多量体化成分は、ＩｇＧのＦｃドメインまたはＩｇＧの重鎖のいずれかの免疫グロブリンドメインであり、および
   該ＶＥＧＦレセプター成分は、Ｆｌｔ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン２と、Ｆｌｋ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン３若しくはＦｌｔ４の細胞外ドメインのＩｇドメイン３との融合体である。
8. 前記Ｆｌｔ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン２が、前記Ｆｌｋ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン３若しくはＦｌｔ４の細胞外ドメインのＩｇドメイン３の上流にある、請求項７記載の融合ポリペプチド。
9. 前記Ｆｌｔ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン２が、前記Ｆｌｋ１の細胞外ドメインのＩｇドメイン３若しくはＦｌｔ４の細胞外ドメインのＩｇドメイン３の下流にある、請求項７記載の融合ポリペプチド。
10. 前記融合ポリペプチドが、配列番号１６に示される２７〜４５８位のアミノ酸配列を含む融合ポリペプチドである請求項７または８に記載の融合ポリペプチド。
11. 前記融合ポリペプチドが、配列番号１６に示されるアミノ酸配列からなる融合ポリペプチドである請求項７、８または１０に記載の融合ポリペプチド。
12. 請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチドを含み、該融合ポリペプチドがＶＥＧＦ分子に結合して、該融合ポリペプチドの多量体を含む複合体を形成することによりＶＥＧＦのレセプターリガンド活性を阻害し得る、組成物。
13. 前記多量体が二量体である、請求項１２に記載の組成物。
14. キャリアをさらに含む薬学的組成物である、請求項１２または１３に記載の組成物。
15. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む、ベクター。
16. 請求項１〜６のいずれか一項に記載の核酸分子を含む発現ベクターであって、ここで、該核酸分子は、発現制御配列に作動可能に連結される、発現ベクター。
17. 適切な宿主細胞中に、請求項１６に記載の発現ベクターを含む、融合ポリペプチドを産生するための、宿主−ベクター系。
18. 前記適切な宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、または哺乳動物細胞である、請求項１７に記載の宿主−ベクター系。
19. 前記適切な宿主細胞が、Ｅ．ｃｏｌｉである、請求項１７に記載の宿主−ベクター系。
20. 前記適切な宿主細胞が、ＣＯＳ細胞またはＣＨＯ細胞である、請求項１７に記載の宿主−ベクター系。
21. 融合ポリペプチドを産生する方法であって、該方法は、請求項１７〜２０のいずれか一項に記載の宿主−ベクター系の細胞を、該融合ポリペプチドの産生を可能にする条件下で増殖させる工程、およびそのようにして産生された該融合ポリペプチドを回収する工程、を包含する、方法。
22. 請求項２１に記載の方法によって産生される、融合ポリペプチド。
23. アセチル化またはペグ化によって改変された、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド。
24. 前記改変がアセチル化であり、該アセチル化が、該融合ポリペプチド１モル当たり、少なくとも１００倍過剰のモル濃度のアセチル化試薬を用いて達成される、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
25. 前記改変がアセチル化であり、該アセチル化が、該融合ポリペプチド１モル当たり、少なくとも１０倍過剰のモル濃度〜１００倍過剰のモル濃度の範囲の、過剰なモル濃度のアセチル化試薬を用いて達成される、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
26. 前記改変が１０Ｋ ＰＥＧまたは２０Ｋ ＰＥＧを用いるペグ化である、請求項２３に記載の融合ポリペプチド。
27. 哺乳動物における血漿漏出を減少または阻害するための医薬の製造における、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
28. 前記哺乳動物がヒトである、請求項２７に記載の使用。
29. ヒトにおける血管増殖をブロックするための医薬の製造における、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
30. 哺乳動物におけるＶＥＧＦレセプターリガンド活性を阻害するための医薬の製造における、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
31. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３０に記載の使用。
32. ヒトにおいて、腫瘍増殖を減弱もしくは予防するため、水腫を減弱もしくは予防するため、または腹水形成を減弱もしくは予防するための医薬の製造における、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物の使用。
33. 前記水腫が、脳水腫である、請求項３２に記載の使用。
34. 前記腹水が、卵巣癌関連腹水である、請求項３２に記載の使用。
35. 哺乳動物における血漿漏出を減少または阻害するための、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を含む薬学的組成物。
36. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３５に記載の薬学的組成物。
37. ヒトにおける血管増殖をブロックするための、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を含む薬学的組成物。
38. 哺乳動物におけるＶＥＧＦレセプターリガンド活性を阻害するための、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を含む薬学的組成物。
39. 前記哺乳動物がヒトである、請求項３８に記載の薬学的組成物。
40. ヒトにおいて、腫瘍増殖を減弱もしくは予防するため、水腫を減弱もしくは予防するため、または腹水形成を減弱もしくは予防するための、請求項７〜１１のいずれか一項に記載の融合ポリペプチド、または請求項１２〜１４のいずれか一項に記載の組成物を含む薬学的組成物。
41. 前記水腫が、脳水腫である、請求項４０に記載の薬学的組成物。
42. 前記腹水が、卵巣癌関連腹水である、請求項４０に記載の薬学的組成物。

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