SK287332B6 - Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, fúzny polypeptid ňou kódovaný, vektor s jej obsahom, systém vektor-hostiteľ na reprodukciu fúzneho polypeptidu a spôsob jeho prípravy, antagonista dimérneho VEGF a použitie - Google Patents

Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, fúzny polypeptid ňou kódovaný, vektor s jej obsahom, systém vektor-hostiteľ na reprodukciu fúzneho polypeptidu a spôsob jeho prípravy, antagonista dimérneho VEGF a použitie Download PDF

Info

Publication number
SK287332B6
SK287332B6 SK1752-2001A SK17522001A SK287332B6 SK 287332 B6 SK287332 B6 SK 287332B6 SK 17522001 A SK17522001 A SK 17522001A SK 287332 B6 SK287332 B6 SK 287332B6
Authority
SK
Slovakia
Prior art keywords
flt1
domain
vegf
fcac1
vegf receptor
Prior art date
Application number
SK1752-2001A
Other languages
English (en)
Other versions
SK17522001A3 (sk
Inventor
Nicholas J. Papadopoulos
Samuel Davis
George D. Yancopoulos
Original Assignee
Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=22480568&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=SK287332(B6) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Regeneron Pharmaceuticals, Inc. filed Critical Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Publication of SK17522001A3 publication Critical patent/SK17522001A3/sk
Publication of SK287332B6 publication Critical patent/SK287332B6/sk

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/71—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for growth factors; for growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto

Abstract

Je opísaná izolovaná molekula nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje: (a) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu receptorovú zložku cievneho endotelového rastového faktora alebo VEGF skladajúci sa v podstate z imunoglobulínu alebo Ig podobnej domény 2 prvého VEGF receptora a Ig domény 3 druhého VEGF receptora, a (b) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu multimerizačnú zložku, kde prvým VEGF receptorom je Flt 1 a druhým VEGF receptorom je Flk 1 alebo Flk 4, a VEGF receptorová zložka je jediná VEGF receptorová zložka fúzneho polypeptidu. Ďalej je opísaný fúzny polypeptid kódovaný takouto molekulou a jeho použitie na výrobu liečiva, vektor, ktorý obsahuje takúto molekulu, systém vektor-hostiteľ na produkciu fúzneho polypeptidu a spôsob prípravy fúzneho polypeptidu, ako aj antagonista dimérneho cievneho endotelového rastového faktora, obsahujúceho dva fúzne polypeptidy, a jeho použitie na výrobu liečiva.

Description

Predkladaný vynález sa týka modifikovaných polypeptidov so zlepšenou farmakokinetikou. Presnejšie sa predkladaný vynález týka Fltl receptorových polypeptidov, ktoré boli modifikované tak, že majú lepší farmakokinetický profil. Predkladaný vynález sa tiež týka spôsobov prípravy a použitia modifikovaných polypeptidov, vrátane, napríklad, použitie modifikovaných polypeptidov na zníženie alebo inhibícii úniku plazmy a/alebo ievnej permeability u cicavcov.
Doterajší stav techniky
Schopnosť peptidových ligandov viazať sa na bunky a tak vyvolávať fenotypové reakcie, ako je rast buniek, ich prežívanie, sekrécia produktov bunkami alebo diferenciácia, je často sprostredkovaná transmembránovými receptormi na týchto bunkách. Extraceluláma doména takých receptorov (t. j. časť receptora vystavená na povrchu bunky) je zvyčajne najviac špecifickou časťou molekuly a dodáva proteínu charakteristické viazanie ligandov. Väzba ligandu na extracelulámu doménu zvyčajne vedie k prenosu signálu, ktorým sa prenášajú biologické signály na intraceluláme ciele. Často je prenos signálu vedený cez katalytickú intracelulámu doménu. Usporiadanie motívov v tejto katalytickej doméne určuje jej účinky na potenciálne kinázové substráty (Mohammadi et al., 1990, Mol. Celí Biol. 11: 5068-5078; Fantl et al., 1992, Celí, 69: 413-413). Príklady receptorov, ktoré prenášajú signály cestou katalytických intracelulámych domén, zahrnujú receptorové tyrozín kinázy (RTK), ako je Trk rodina receptorov, ktoré sú zvyčajne obmedzené na bunky nervového systému, cytokínová rodina receptorov vrátane trojdielneho CNTF receptorového komplexu (Stahl and Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25: 1454-1466), ktorá je tiež zvyčajne obmedzená na bunky nervového systému, receptory spriahnuté s G-proteínom, ako sú napríklad /32-adrenergné receptory, ktoré sa vyskytujú, napríklad, v bunkách srdcového svalu a multimémy IgE vysoko-afmitný receptor FcsRI, ktorý je lokalizovaný, napríklad, na žírnych bunkách a na bazofiloch (Sutton and Gould, 1993, Náture 366: 421-428).
Zdá sa, že všetky dosiaľ identifikované receptory podliehajú po väzbe ligandu dimerizácii, multimerizácii alebo niektorým konformačným zmenám (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem Sci., 13: 443-447; Ullrich and Schlessinger, 1990, Celí 61: 203-212 Schlessinger und Ulrich, 1992, Neurón 9: 383-391) a molekulová interakcia medzi dimerizujúcimi intracelulámymi doménami vedie k aktivácii katalytickej funkcie. V niektorých prípadoch, ako napríklad pri doštičkovom rastovom faktore (PDGF), je ligandom dimér, ktorý sa viaže na dve receptorové molekuly (Hart et al., 1988, Science, 240: 1529-1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905-8912), zatiaľ čo napríklad pri epidermálnom rastovom faktore (EGF) je ligandom monomér (Weber et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 14631-14636). V prípade Fc RI receptora existuje ligand, IgE, naviazaný na Fc RI vo forme monoméru a je aktivovaný iba vtedy, keď sa na komplex IgE/Fc RI naviaže antigén a dôjde k zosieteniu susedných molekúl IgE (Sutton and Gould, 1993, Náture 366: 421-428).
Často ukazuje tkanivová distribúcia určitého receptora vo vyšších organizmoch na biologickú funkciu receptora. RTK pre niektoré rastové a diferenciačné faktory, ako je fíbroblastový rastový faktor (FGF), sú exprimované v mnohých tkanivách a preto sa zdá, že majú nejakú úlohu pri raste tkanív a ich udržiavaní. Členovia Trk RTK rodiny (Glass and Yancopoulos, 1993, Trends in Celí Biol. 3: 262-268) sú zvyčajne obmedzené na bunky nervového systému a rodina nervového rastového faktora skladajúca sa z nervového rastového faktora (NGF), mozgového neurotrofného faktora (BDNF), neurotrofínu 3 (NT-3) a neurotrofínu-4/5 (NT-4/5), ktoré sa viažu na Trk rodinu RTK, podporuje diferenciáciu rôznych skupín neurónov v mozgu a na periférii (Lindsay, R.M., 1993, v Neurotrofic Factors, S.E. Loughlin and J.H.Fallon, ed., str. 257-284, San Diego, CA, Academic Press). Fc RI sa vyskytuje na veľmi obmedzenom počte typov buniek, ako sú žime bunky a bazofily. Žime bunky vznikajú z pluripotentných hematopoetických kmeňových buniek kostnej drene, ale dozrievajú v tkanivách po migrácii z krvného riečiska (pozri Janeway a Travers, 1996, Immunology, 2. vydanie, M. Robertson a E. Lawrence, ed., str. 1: 3-1: 4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher) a podieľajú sa na alergickej reakcii.
Veľa štúdií preukázalo, že extraceluláma doména receptora dodáva špecifické charakteristiky väzby ligandu. Ďalej, bunkové prostredie, v ktorom je receptor exprimovaný, môže ovplyvňovať biologickú reakciu vznikajúcu po väzbe ligandu na receptor. Napríklad, keď je neuronálna bunka exprimujúca Trk receptor vystavená pôsobeniu neurotrofínu, ktorý sa viaže na tento receptor, tak dôjde k prežívaniu bunky a diferenciácii. Keď je rovnaký receptor exprimovaný fíbroblastami, tak vedie vystavenie pôsobenia neurotrofínu k proliferácii fíbroblastov (Glass et al., 1991, Celí. 66: 405-413).
Bola identifikovaná trieda bunkových dimémych mitogénov so selektivitou pre cievne endotelové bunky a táto trieda bola označená ako cievny endotelový rastový faktor (VEGF). VEGF bol prečistený z kondiciovaného rastového média krysích gliómových buniek (Conn et al., (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, str. 2628-2632); a z kondicionovaného rastového média folikulámych hviezdicovitých buniek hovädzej hypofýzy (Ferrara and Henzel, 1989, Biochem. Biophys. Res. Comm. 161, str. 851-858 Gozpadorowicz et al., 1989,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 7311-7315); a z kondicionovaného média z ľudských U937 buniek (Connolly, D.T. et al., 1989, Science, 246: 1309-1312). VEGF je dimér so zreteľnou molekulovou hmotnosťou približne 46 kDa, kde každá podjednotka má zreteľnú molekulovú hmotnosť približne 23 kDa. VEGF má určitú štrukturálnu podobnosť s doštičkovým rastovým faktorom (PDGF), ktorý je mitogénom pre bunky spojivového tkaniva, ale ktorý nie je mitogénny pre cievne endotelové bunky z veľkých ciev.
Bolo zistené, že membránový tyrozín-kinázový receptor, známy ako Fit, je VEGF receptorom (DeVries, C. et al., 1992, Science 255, str. 989-991). Fit receptor špecificky viaže VEGF, ktorý indukuje mitogenézu. O inej forme VEGF receptora, označenej KDR, je tiež známe, že viaže VEGF a indukuje mitogenézu. Tiež je známa čiastočná cDNA sekvencia a temer kompletná proteínová sekvencia KDR (Terman, B.I. et al., 1991, Oncogene 6, str. 1677-1683; Terman, B.I. et al., 1992, Biochem Biophys. Res. Comm. 187, str. 1579-1586).
Perzistujúca angiogenéza môže spôsobovať alebo exacerbovať niektoré ochorenia, ako je psoriáza, reumatoidná artritída, hemangiómy, angiofibrómy, diabetická retinopatia a neovaskulámy glaukóm. Inhibítor aktivity VEGF by bol účinný v liečbe takých ochorení a tiež inej patologickej angiogenézy cievnej permeability indukovanej VEGF, ako je vaskularizácia nádorov. Predkladaný vynález sa týka VEGF inhibítora, ktorý je založený na VEGF receptore Fltl.
Únik plazmy, kľúčová zložka zápalu, sa vyskytuje v rôznych podskupinách mikrociev. Konkrétne, vo väčšine orgánov dochádza k úniku plazmy špecificky vo venulách. Na rozdiel od arteriol a kapilár sa venuly stávajú priepustnými v reakcii na rôzne zápalové mediátory, ako je histamín, bradykinín a serotonín. Jednou charakteristikou zápalu je únik plazmy, ku ktorému dochádza v dôsledku medzibunkových medzier v endoteli venúl. Väčšina experimentálnych modelov zápalu naznačuje, že tieto medzibunkové medzery sa vyskytujú medzi endotelovými bunkami postkapiláme v zberných venulách (Baluk, P. et al., Am. J. Pathol. 1998, 152: 1463-76). Bolo preukázané, že niektoré lektíny môžu byť použité na odhalenie lokálnych miest úniku plazmy, medzier v endoteli a fingerlike procesov na hraniciach endotelových buniek vo venulách v zápalovom ložisku (Thurston, G. et al., Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547-62). Konkrétne, rastlinné lektíny boli použité na vizualizáciu morfologických zmien v endotelových bunkách v zápalových venulách krysej priedušnice. Lektíny, ako je konkavalín A a ricín, ktoré sa viažu lokálne na zápalové venuly, ukázali regióny steny ciev pod medzerami v endoteli, ktoré zodpovedajú regiónom úniku plazmy (Thurston G. et al., Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547-62).
Vlastnosti mikrociev sú dynamické. Chronické zápalové ochorenia sú asociované s prestavbou mikrovaskulatúry vrátane angiogenézy a zväčšovania mikrociev. Mikrocievy môžu byť tiež prestavené tak, že majú abnormálne vlastnosti. V myšom modeli chronického zápalu dýchacích ciest získavajú kapiláry dýchacích ciest vlastnosti venúl vrátane zväčšenia priemeru ciev, zvýšenia reaktivity pre von Wilebrandov faktor a zvýšenia reaktivity pre P-selektín. Ďalej, tieto remodelované cievy sa stávajú priepustnými v reakcii na zápalové mediátory, zatiaľ čo cievy v rovnakej lokalizácii v dýchacích cestách normálnych myší nie.
Bolo preukázané, že niektoré substancie znižujú alebo inhibujú cievnu permeabilitu a/alebo unikanie plazmy. Napríklad mystixíny sú syntetické polypeptidy, ktoré inhibujú unikanie plazmy bez blokovania tvorby endotelových medzier (Baluk, P. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998, 284: 693-9). Tiež agonista beta-2-adrenergných receptorov formoterol redukuje priepustnosť mikrociev tým, že inhibuje tvorbu endotelových medzier (Baluk, P. and McDonald, D.M., Am. J. Physiol., 1994, 266: L461-8).
Angiopoetíny a členy rodiny cievneho endotelového rastového faktora (VEGF) sú jedinými rastovými faktormi, o ktorých sa súdi, že sú špecifické pre cievne endotelové bunky. Pokusy s cielenou inaktiváciou génov u myší ukázali, že VEGF je potrebný pre skoré štádia vývoja ciev a že pre neskoršie štádia remodelovania ciev je potrebný Ang-1.
US patent č. 6011003, udelený 4.1.2000 (Metris Therapeutics Limited), opisuje alterovanú, solubilnú formu FLT polypeptidu, ktorý je schopný väzby na VEGF, a preto má inhibičný efekt na VEGF, kde uvedený polypeptid sa skladá z piatich alebo menej kompletných imunoglobulínových domén.
US patent č. 5712380, udelený 27.1.1998 (Merck and Co.), opisuje inhibítory cievneho endotelového rastového faktora (VEGF), ktoré sú buď prirodzené alebo rekombinantné upravené solubilné formy s alebo bez C-koncového transmembránového regiónu receptora pre VEGF.
PCT prihláška č. WO 98/13071, publikovaná 2.4.1998 (Merck and Co.), opisuje techniku génovej terapie pre inhibíciu rastu primárneho nádoru a metastáz pomocou génového prenosu nukleotidovej sekvencie kódujúcej solubilný receptorový proteín, ktorý sa viaže na VEGF.
PCT prihláška č. WO 97/44453, publikovaná 27.11.1997 (Genetech, Inc.), opisuje nové chimérické VEGF receptorové proteíny obsahujúce aminokyselinové sekvencie odvodené od receptorov pre cievny endotelový rastový faktor (VEGF) Fltl a KDR vrátane myšieho homológu pre ľudský KDR receptor FLK1, kde uvedené chimérické VEGF receptorové proteíny sa viažu na VEGF a antagonizujú proliferačné a angiogénne aktivity endotelových buniek (pozri tiež Davis-Smyth et al., EMBO J., 1996, sv. 15, 4919-4927).
PCT prihláška č. WO 97/13787, publikovaná 17.4.1997 (Toa Gosei Co. Ltd.), opisuje inhibítor VEGF s nízkou molekulovou hmotnosťou použiteľný v liečbe ochorení spojených s neovaskularizáciou, ako sú solidné nádory. Polypeptid obsahujúci prvú imunoglobulínu podobnú doménu a druhú imunoglobulínu podobnú doménu v extracelulámom regióne VEGF receptora Fit, ale neobsahujúcu šiestu imunoglobulínu podobnú doménu a siedmu imunoglobulínu podobnú doménu, vykazuje inhibičnú aktivitu vzhľadom na VEGF.
Sharifi, J. et al., 1998, The Quarterly Jour, of Nucl. Med. 42: 242-249, opisujú, že v dôsledku toho, že monoklonálne protilátky (MAb) sú bázické proteíny s pozitívnym nábojom a cicavčie bunky majú negatívny náboj, môžu elektrostatické interakcie medzi nimi vytvárať vysoké hladiny základného viazania, ktoré vedú k nízkemu pomeru nádor vs. normálne orgány. Na vyriešenie tohto účinku sa výskumníci pokúsili zlepšiť klírens mAb pomocou rôznych metód, ako sú sekundárne činidlá alebo chemické modifikácie alebo modifikácie náboja MAb samotných.
Jensen-Pippo et al., 1996, Pharmaceutical Research 13: 102-107, opisujú, že pegylácia terapeutického proteínu, rekombinantného ľudského faktora stimulujúceho kolónie granulocytov (PEG-G-CSF), vedie k zvýšeniu jeho stability a k retencii biologickej aktivity in vivo, keď je tento proteín podaný intraduodenálne.
Tsutsumi et al., 1997, Thromb. Haemost. 77: 168-73, opisujú pokusy, pri ktorých bola in vivo trombopoetická aktivita interleukínu 6 modifikovaného polyetylénglykolom (MPEG-IL-6), v ktorom bolo 54 % zo 14 lyzínových amino skupín IL-6 viazané na PEG, porovnávaná s aktivitou prirodzeného IL-6.
Yang et al., 1995, Cancer 76: 687-94, opisujú, že konjugácia polyetylénglykolu na ľudský interleukín-2 (IL-2) vedie k zisku zlúčeniny (polyetylénglykolom modifikovaného IL-2 (PEG-IL-2)), ktorá si zachováva in vitro a in vivo aktivitu IL-2, ale ktorá má významne predĺžený cirkulačný polčas.
R. Duncan and F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290-306, 296 (1994) uvádzajú prehľad snáh o zlepšenie plazmatického polčasu asparaginázy pomocou konjugácie s polyetylénglykolom.
PCT medzinárodná prihláška č. WO 99/03996, publikovaná 28.1.1999 (Regeneron Pharmaceuticals, Inc. a The Reagents of The University of Califomia), opisuje modifikované ľudské podporné polypeptidy obsahujúce delécie regiónov s bázickými aminokyselinami. Je opísané, že modifikované ľudské podporné polypeptidy si zachovávajú biologickú aktivitu a zároveň majú redukovanú afinitu pre heparín a lepšiu farmakokinetiku vo zvieracom sére v porovnaní s nemodifikovaným ľudským podporným polypeptidom.
Podstata vynálezu
Predkladaný vynález je zameraný na izolovanú molekulu nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje:
(a) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu receptorovú zložku cievneho endotelového rastového faktora čiže VEGF skladajúcu sa v podstate z imunoglobínu čiže Ig podobnej domény 2 prvého VEGF receptora a Ig domény 3 drahého VEGF receptora, a (b) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu multimerizačnú zložku, kde prvým VEGF receptorom je Fltl a druhým VEGF receptorom je Flkl alebo Flt4 a zložkou VEGF receptora je len VEGF receptorová zložka fuzneho polypeptidu.
Pri výhodnom uskutočnení nukleotidovou sekvenciou kódujúcou Ig doménu 2 extracelulámej domény prvého VEGF receptora je pred nukleotidovou sekvenciou kódujúcou Ig doménu 3 extracelulámej domény druhého VEGF receptora.
Pri inom výhodnom uskutočnení nukleotidovej sekvencie kódujúcej Ig doménu 2 extracelulámej domény prvého VEGF receptora je za nukleotidovou sekvenciou kódujúcou Ig doménu 3 extracelulámej domény drahého VEGF receptora.
Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu multimerizačná zložka obsahuje imunoglobulínovú doménu.
V inom uskutočnení imunoglobulínová doména je vybraná zo skupiny zahrnujúcej Fc doménu IgG , ťažký reťazec IgG a ľahký reťazec IgG.
Výhodné uskutočnenie zahrnuje izolovanú molekulu nukleovej kyseliny obsahujúcu nukleotidovú sekvenciu kódujúcu modifikovaný Fltl receptorový fuzny polypeptid, kde kódujúci región molekuly nukleovej kyseliny sa skladá z nukleotidovej sekvencie vybranej zo skupiny zahrnujúcej:
(a) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 21A až 21 C, (b) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 22A až 22C, (c) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 24A až 24C a (d) nukleotidové sekvencie, ktoré sa v dôsledku degenerácie genetického kódu líšia od nukleotidovej sekvencie (a), (b) alebo (c), a ktorá kóduje molekulu fuzneho polypeptidu majúceho biologickú aktivitu modifikovaného Fltl receptorového fuzneho polypeptidu.
Ďalším uskutočnením tohto vynálezu je fuzny polypeptid, ktorý je kódovaný izolovanou molekulou nukleovej kyseliny opísanej skôr.
Iným uskutočnením je vektor, ktorý obsahuje molekuly nukleovej kyseliny opísanej skôr, zahrnujúcej expresný vektor obsahujúci molekuly nukleovej kyseliny opísanej skôr, kde molekula nukleovej kyseliny je operatívne naviazaná na sekvenciu riadiacu expresiu.
Iným zahrnutým uskutočnením je systém vektor-hostiteľ na produkciu fúzneho polypeptidu, ktorý obsahuje expresný vektor vo vhodnej hostiteľskej bunke, systém hostiteľ-vektor , v ktorom vhodnou hostiteľskou bunkou je bakteriálna bunka, kvasinka, hmyzia bunka alebo cicavčia bunka, systém hostiteľ-vektor, v ktorom vhodnou hostiteľskou bunkou je E. coli, systém hostiteľ-vektor, v ktorom vhodnou hostiteľskou bunkou je COS bunka alebo systém hostiteľ-vektor, v ktorom vhodnou hostiteľskou bunkou je CHO bunka.
Iným uskutočnením tohto vynálezu je spôsob prípravy fúzneho polypeptidu, ktorý zahŕňa kultiváciu buniek systému hostiteľ-vektor za podmienok umožňujúcich produkciu fuzneho polypeptidu a odber takto produkovaného fuzneho polypeptidu.
Ďalšie uskutočnenie zahŕňa antagonistu dimémeho cievneho endotelového rastového faktora VEGF, ktorý obsahuje dva fúzne polypeptidy, pričom fúzny polypeptid obsahuje:
(a) VEGF receptorovú zložku obsahujúcu v podstate imunoglobulínu čiže Ig podobnú doménu 2 VEGF receptora Fltl a Ig doménu 3 VEGF receptora Flkl a Flt4 a (b) multimerizačnú zložku, kde VEGF receptorovou zložkou je jediný VEGF receptor každého fuzneho proteínu.
Takýto antagonista môže byť modifikovaný acetyláciou alebo pegyláciou.
Fúzny proteín podľa tohto vynálezu môže byť používaný na zníženie alebo inhibíciu úniku plazmy u cicavcov, podaním fuzneho polypeptidu, opísaného skôr, cicavcovi, pričom zahŕňa uskutočnenie, v ktorom cicavcom je človek, fúzny polypeptid je acetylovaný alebo fúzny polypeptid je pegylovaný. Fúzny polypeptid môže byť tiež používaný na blokovanie rastu krvných ciev u človeka.
Ďalšie použitie podľa tohto vynálezu zahŕňa zmiernenie alebo prevenciu rastu nádorov u človeka, zmiernenie alebo prevenciu vzniku opuchov u človeka, najmä ak opuchom je opuch mozgu, zmiernenie alebo prevenciu ascitov vzniknutých u človeka, najmä ak ascitom je ascites asociovaný s karcinómom ovária.
Tento vynález ďalej poskytuje fúzny polypeptid, ktorý obsahuje:
(a) VEGF receptorovú zložku skladajúcu sa v podstate z imunoglobulínu podobnej (Ig) domény 2 Fltl VEGF receptora a Ig domény 3 Flkl a Flk4 VEGF receptora a (b) multimerizačnú zložku, kde VEGF receptorovou zložkou je jediná VEGF receptorová zložka vo fuznom polypeptide.
Výhodné uskutočnenie zahŕňa fúzny polypeptid, kde aminokyselinová sekvencia Ig domény 2 extracelulámej domény prvého VEGF receptora je pred aminokyselinovou sekvenciou Ig domény 3 extracelulámej domény druhého VEGF receptora a fúzny polypeptid, kde aminokyselinová sekvencia Ig domény 2 extracelulámej domény prvého VEGF receptora je za aminokyselinovou sekvenciou Ig domény 3 extracelulámej domény druhého VEGF receptora.
V ešte inom uskutočnení je fúzny polypeptid, kde multimerizačná zložka obsahuje imunoglobulínovú doménu vrátane uskutočnenia, kde imunoglobulínová doména je vybraná zo skupiny zahrnujúcej Fc doménu IgG a ťažký reťazec IgG a ľahký reťazec IgG.
Výhodné uskutočnenie zahŕňa fúzny polypeptid, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu modifikovaného Fltl receptora, kde aminokyselinová sekvencia je vybraná zo skupiny zahrnujúcej:
(a) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 21A až 21 C, (b) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 22A až 22C a (c) aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 24A až 24C.
Iným výhodným uskutočnením je použitie fúzneho polypeptidu alebo dimémeho antagonistu podľa tohto vynálezu na výrobu liečiva na použitie pri zmierňovaní alebo prevencii rastu nádorov; zmierňovaní alebo prevencii edému, zmierňovaní alebo prevencii vzniku ascitu, na znižovanie alebo inhibíciu úniku plazmy alebo na blokovanie rastu krvných ciev u človeka.
Prehľad obrázkov na výkresoch
Obr. 1. IEF gélová analýza nemodiftkovaných a acetylovaných Fltl(l-3)-Fc proteínov. Nemodifikovaný Fit 1 (1 -3)-Fc proteín nie je schopný prenikať gélom v dôsledku svojho pH >9,3, zatiaľ čo acetylovaný Fit 1 (1 -3)-Fc proteín je schopný prestupovať gélom a dosahuje rovnováhu pri pi 5,2.
Obr. 2. Väzba nemodifíkovaného Fltl(l-3)-Fc a acetylovaného Fltl(l-3)-Fc proteínu na platni potiahnutej Matrigelom®. Nemodifíkované Fltl(l-3)-Fc proteíny sa výrazne viažu na zložky extracelulámej matrice v Matrigeli , zatiaľ čo acetylované Fltl(l-3)-Fc proteíny sa neviažu.
Obr. 3. Väzba nemodifikovaných Fltl(l-3)-Fc proteínov, acetylovaných Fltl(l-3)-Fc proteínov a pegylovaných Fltl(l-3)-Fc proteínov v teste na báze Biacore. Acetylované (stĺpce 13-16), pegylované (stĺpce 17-20) a heparínom spracované Fltl(l-3)-Fc (stĺpce 21-24) boli každý schopný úplne kompetovať s Fltl(l-3)Fc naviazaným na Biacore čip o väzbu na VEGF v porovnaní s kontrolnými (stĺpce 1-4) a irelevantnými proteínmi (stĺpce 5-8). Nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc (stĺpce 5-6) ako jediný čiastočne kompetuje s Fltl(l-3)-Fc naviazaným na Biacore čip s väzbou VEGF. Ale, premytie naviazaných vzoriek 0,5 M NaCl (stĺpce 7-8) viedlo k zisku väzbového profilu podobného väzbovému profilu modifikovaných foriem Fltl(1 -3)-Fc, čo naznačuje, že nemodifikovaný proteín vykazuje nešpecifickú väzbu na čip, ktorá môže byť eliminovaná premy5 tím roztokom soli.
Obr. 4. Väzba nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, acetylovaného Fltl(l-3)-Fc a pegylovaného Fltl(l-3)-Fc na VEGF v teste na báze ELISA. Tak pegylovaný, ako i acetylovaný Fltl(l-3)-Fc sa viaže na VEGF s afinitami blížiacimi sa nemodifikovanému Fltl(l-3)-Fc.
Obr. 5. Farmakokinetické profily nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, acetylovaného Fltl(l-3)-Fc a pegylovaného Fltl(l-3)-Fc. Balb/c myšiam (23-28 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fltl(l-3)-Fc. Myšiam sa odoberala krv z chvosta za 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni a 3 dni po injekcii proteínu a sérum sa testovalo v štandardnom ELISA teste určenom na detekciu Fltl(l-3)-Fc proteínu. TnMX pre všetky Fltl(l-3)-Fc proteíny boli medzi 6 hodinami a 24 hodinami. Cmax pre rôzne proteíny boli nasledujúce: nemodifikovaný - 0,06 pg/ml - 0,15 pg/ml; acetylovaný - 1,5 pg/ml - 4,0 pg/ml; a pegylovaný - približne 5 pg/ml.
Obr. 6A-6B. IEF gélová analýza nemodifikovaných a postupne acetylovaných Fltl(l-3)-Fc proteínov. Nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc proteín nie je schopný prestupovať gélom v dôsledku svojho pH > 9,3, zatiaľ čo väčšina postupne acetylovaných Fltl(l-3)-Fc (30-100-násobný nadbytok vzoriek) boli schopné migrovať gélom a dosahovali rovnováhu pri pl v rozmedzí od 4,55-8,43, podľa stupňa acetylácie.
Obr. 7. Väzba nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc a postupne acetylovaných Fltl(l-3)-Fc proteínov na platni potiahnutej Matrigelom®. Rovnako ako irelevantný kontrolný proteín nevykazujú postupne acetylované Fltl(l-3)-Fc (20 a 30-násobné vzorky) akúkoľvek väzbu na platni potiahnutej Matrigelom®, zatiaľ čo neacetylovaný Fltl(l-3)-Fc proteín vykazuje významnú väzbu. 10-násobné vzorky vykazujú redukovanú väzbu, ale stupeň acetylácie nie je dostatočný na úplné blokovanie väzby na zložky extracelulámej matrice.
Obr. 8. Väzba nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc a postupne acetylovaného Fltl(l-3)-Fc v teste na báze Biacore. V substechiometrickom pomere (0,5 pg/ml buď nemodifikovaného Fltl( 1-3) alebo postupne acetylovaného Fltl(l-3)-Fc vs. 0,2 pg/ml VEGF) nie je v roztoku dostatok Fit i (1 -3)-Fc (nemodifikovaného alebo acetylovaného) na úplnú väzbu VEGF. Pri 1,0 pg/ml, čo je približne 1: 1 stechiometrický pomer, sú tak nemodifikovaný, ako aj postupne acetylovaný Fltl(l-3)-Fc lepšie schopné kompetovať o väzbu VEGF, ale stále ešte nie je dostatok Fltl(l-3)-Fc proteínu (nemodifikovaného alebo postupne acetylovaného) pre kompletnú saturáciu dostupného VEGF. Ale, pri 5,0 pg/ml, čo je niekoľkokrát viac, ako je stechiometrický pomer 1: 1, sú tak Fltl(1 -3)-Fc, ako i postupne acetylovaný Fltl(l-3)-Fc proteíny schopné saturovať VEGF, bez ohľadu na stupeň acetylácie.
Obr. 9. Farmakokinetické profily nemodifikovaného Fltl(1 -3)-Fc a postupne acetylovaného Fltl(l-3)-Fc. Balb/c myšiam (23-28 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného alebo 10, 20, 40, 60 a 100-násobné vzorky postupne acetylovaného Fltl(l-3)-Fc (3 myši pre nemodifikovaný, 10, 20 a 40-násobné vzorky a 2 myši pre 60 a 100-násobné vzorky). Myšiam sa odoberala krv z chvosta za 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni a 3 dni po injekcii proteínu a sérum sa testovalo v ELISA teste určenom na detekciu Fltl(l-3)-Fc proteínu. Tmax pre všetky testované Fltl(l-3)-Fc proteíny boli 6 hodín, ale Cmax boli nasledujúce: nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc - 0,06 pg/ml; 10-násobný nadbytok - 0,7 pg/ml; 20-násobný nadbytok - 2,0 pg/ml; 40-násobný nadbytok - 4,0 pg/ml; 60-násobný nadbytok - 2,0 pg/ml; 100-násobný nadbytok - 1,0 pg/ml.
Obr. 10A-10D. Sekvencie nukleových kyselín a odvodené aminokyselinové sekvencie Fltl(l-3)-Fc.
Obr. 11. Schematický diagram štruktúry Fltl.
Obr. 12A a 12B. Analýza hydrofilnosti aminokyselinových sekvencií Ig domény 2 a Ig domény 3 Fltl.
Obr. 13A-13D. Sekvencie nukleových kyselín a odvodené aminokyselinové sekvencie Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc.
Obr. 14A-14C. Sekvencie nukleových kyselín a odvodené aminokyselinové sekvencie Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc.
Obr. 15A-15C. Sekvencie nukleových kyselín a odvodené aminokyselinové sekvencie Mut3: Fltl(2-3)-Fc.
Obr. 16A-16D. Sekvencie nukleových kyselín a odvodené aminokyselinové sekvencie Mut4: Fltl (1-SR^Nj-Fc.
Obr. 17. Väzba nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, mutantného Fltl(l-3)-Fc s deléciou bázického regiónu a mutantného proteínu Fltl(1 -3)R^N v teste na báze Biacore. Pri substechiometrickom pomere (0,25 pg/ml Fltl(l-3)-Fc nemodifikovaných, acetylovaných alebo geneticky modifikovaných vzoriek vs. 0,1 pg/ml VEGF) je nedostatok Fltl(l-3)-Fc proteínu na blokovanie väzby VEGF na Fltl(l-3)-Fc imobilizovaný na Biacore čipu. Pri 0,5 pg/ml nemodifikovaných, acetylovaných alebo geneticky modifikovaných Fltl(l-3)-Fc proteínov je stechiometrický pomer približne 1 : 1 a je zrejmá zvýšená schopnosť blokovania väzby VEGF na Biacore čip. Pri 1,0 pg/ml nemodifikovaných, acetylovaných alebo geneticky modifikovaných Fltl(1-3)Fc proteínov je stechiometrický pomer približne 10 : 1 a Fltl(l-3)-Fc proteíny sú schopné blokovať väzbu VEGF na Biacore čip, ale nie sú rovnocenné. Nemodifikovaný, acetylovaný a Mutl: Fltl( 1-3AB)-Fc sú v podstate rovnocenné v schopnosti blokovať väzbu VEGF, zatiaľ čo Mut4: Fltl(l-3R^N)-Fc je o niečo menej účinný v blokovaní väzby.
Obr. 18. Väzba nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc a Fltl(2-3) mutantných proteínov na platne potiahnuté Matrigelom®. Nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc proteín sa viaže dobre na tieto jamky, Mut3: Fltl(2-3)-Fc proteín sa viaže o niečo slabšie a Mutl(2-3AB)-Fc proteín má najlepší profil s väzbou slabšou ako ktorýkoľvek iný mutantný proteín. Mut4: Fltl(l-3R^N)-Fc glykozylovaný mutantný proteín je v tomto teste iba o niečo lepší.
Obr. 19. Väzba nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl (2-3 AB)-Fc a Fltl(2-3) mutantných proteínov v teste na báze ELISA. Pri testovaných koncentráciách sa viaže nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl (2-3AB)-Fc a Fltl(2-3) mutantné proteíny na VEGF podobne.
Obr. 20 Farmakokinetické profily pre nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3ab)-Fc a Fltl(2-3) mutantné proteíny. Cmax pre všetky tieto činidlá boli nasledujúce: nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc - 0,15 pg/ml; 40-násobný molámy nadbytok acetylovaného Fltl(l-3)-Fc - 1,5 pg/ml; a Mutl: Fltl(l-3ÁB)-Fc - 0,7 pg/ml.
Obr. 21A-21C. Sekvencia nukleovej kyseliny a odvodená aminokyselinová sekvencia modifikovaného Fltl receptora označeného FltlD2.FlklD3.FcACl(a).
Obr. 22A-22C. Sekvencia nukleovej kyseliny a odvodená aminokyselinová sekvencia modifikovaného Fltl receptora označeného FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a).
Obr. 23. Test na extracelulámej matrici (ECM). Výsledky tohto testu ukazujú, že FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a), proteíny sú významne menej lepivé na ECM v porovnaní s Fltl(l-3)-Fc proteínom.
Obr. 24A-24C. Sekvencia nukleovej kyseliny a odvodená aminokyselinová sekvencia modifikovaného Fltl receptora označeného VEGFRlR2.FcACl(a).
Obr. 25A-25C. Fosforylačný test. Pri 1,5 molámom nadbytku buď Fltl(l-3)-Fc alebo Fltl(l-3)-Fc (A40) alebo dočasného FltlD2FlklD3.FcACl(a) dochádza ku kompletnej blokáde receptorovej stimulácie týchto troch modifikovaných Fltl receptorov v porovnaní s expozíciou kontrolnému médiu. Naopak, dočasný FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) nevykazuje pri tomto molámom nadbytku žiadnu blokádu, v porovnaní s VEGF pozitívnou kontrolou. Podobné výsledky sú uvedené na obr. 25B, kde sú modifikované Fit receptory v 3-násobnom molámom nadbytku vzhľadom na VEGF165 ligandu. Na obr. 25C, kde sú modifikované Fltl receptory v 6-násobnom molámom nadbytku k VEGF165 ligandu, je uvedené, že dočasný FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) čiastočne blokuje VEGF-165 indukovanú stimuláciu bunkových povrchových receptorov.
Obr. 26A-26B. Fosforylačný test. Westemová hybridizácia na tyrozíne fosforylovaných VEGFR2 (Flkl) VEGF 165 ligandom ukazuje, že povrchové bunkové receptory nie sú fosforylované expozíciou so vzorkami, ktoré obsahovali VEGF 165 preinkubovaný v 1- a 2-násobnom molámom nadbytku (obr. 26A) alebo 3- alebo 4-násobnom molámom nadbytku (obr. 26B) buď s dočasným FltlD2FlklD3.FcACl(a) alebo stabilným FltlD2FlklD3.FcACl(a) alebo s dočasným VEGFRlR2-FcACl(a). Pri všetkých testovaných koncentráciách modifikovaného Fltl receptora je zrejmá kompletná väzba VEGF165 ligandu v priebehu inkubácie, čo vedie k nedetekovateľnej stimulácii povrchových bunkových receptorov neviazaným VEGF v porovnaní s kontrolným médiom.
Obr. 27. MG/R2 bunkový proliferačný test. Nasledujúce modifikované Fit receptory Fltl(l-3)-Fc, FltlD2FlklD3.FcACl(a) a FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) a irelevantný receptor označený Tie2-Fc ako negatívna kontrola, boli titrované od 40 nM do 20 pM a boli inkubované na bunkách počas 1 hodiny pri 37 °C. Ľudský rekombinantný VEGF 165 v definovanom médiu sa potom pridal do všetkých jamiek v koncentrácii 1,56 nM. Negatívny kontrolný receptor Tie2-Fc neblokoval proliferáciu buniek indukovanú VEGF165 v žiadnej koncentrácii, zatiaľ čo FltlD2FlklD3.FcACl(a) blokoval 1,56 nM VEGF165 pri polovičnej maximálnej dávke 0,8 nM. Fltl(l-3)-Fc a FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) boli menej účinné v blokovaní VEGF165 v tomto teste s polovičnou maximálnou dávkou približne 2 nM. VEGF 165 sám mal pri odpočítaní absorbanciu 1,2 jednotky a pozadie je 0,38 absorbačných jednotiek.
Obr. 28. Biacore analýza väzbovej stechiometrie. Väzbová stechiometria bola vypočítaná ako molámy pomer naviazaného VEGF165 k imobilizovanému FltlD2FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2FcACl(a), s použitím konverzného faktora 1000 RU ekvivalentných 1 ng/ml. Výsledky ukazujú väzbovú stechiometriu jednej VEGF165 dimémej molekuly na jednu molekulu FltlD2FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2FcACl(a).
Obr. 29 a obr. 30. Stechiometria chromatografie s vylučovaním podľa veľkosti. FltlD2FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2FcACl(a) v koncentrácii 1 nM (čo by malo byť 1000-krát viac ako KD interakcia FltlD2FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2FcACl(a)/VEGF165) sa zmiešali s rôznymi koncentráciami VEGF165. Po inkubácii sa merali koncentrácie voľného FltlD2FlklD3.FcACl(a) v roztoku. Údaje ukazujú, že adícia VEGF165 do roztoku FltlD2FlklD3.FcACl(a) úplne blokuje väzbu FltlD2FlklD3.FcACl(a) na povrch VEGF165. Tento výsledok ukazuje na väzbovú stechiometriu jednej molekuly VEGF165 na jednu molekulu FltlD2FlklD3.FcACl(a).
Obr. 31. Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti (SEC) pri natívnych podmienkach. Pík 1 predsta vuje komplex FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165 a pík 2 predstavuje nenaviazaný VEGF165. Frakcie eluované medzi 1,1 a 1,2 ml sa kombinovali a pridal sa guanidínium hydrochlorid (GuHCl) v konečnej koncentrácii 4,5 M na disociáciu komplexu.
Obr. 32. Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti (SEC) pri disociačných podmienkach. Na separovanie zložiek komplexu receptor-ligand a na určenie ich molámeho pomeru sa 50 pl disociovaného komplexu vnieslo do Superosa 12 PC 3.2/30 uvedené do rovnováhy v 6M GuHCl a uskutočnila sa elúcia. Pík 1 predstavuje FltlD2FlklD3.FcACl(a) a pík 2 predstavuje VEGF165.
Obr. 33, 34 a 35. Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc (SEC) s detektorom rozptylu svetla. Kolóna na chromatografiu s vylučovaním podľa veľkosti častíc s MiniDawn on-line detektorom rozptylu svetla (Wyatt Technology, Šanta Barbara, Califomia) a detektory indexu lomu (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japan) sa použili na určenie molekulovej hmotnosti (mol. hmotn.) komplexu ligand-receptor. Ako je uvedené na obr. 33, ukazuje elučný profil dva piky. Pík 1 predstavuje komplex ligand-receptor a pík 2 predstavuje nenaviazaný VEGF 165. Mol. hmotnosť bola vypočítaná z LS a RI signálov. Rovnaký postup bol použitý na určenie molekulovej hmotnosti jednotlivých zložiek komplexu ligand-receptor. Výsledky týchto pokusov sú nasledujúce: molekulová hmotnosť komplexu FltlD2FlklD3.FcACl(a)/VEGF165 v pikovej pozícii je 157300 (obr. 33), molekulová hmotnosť VEGF165 v pikovej pozícii je 44390 (obr. 34) a molekulová hmotnosť R1R2 v piku 113300 (obr. 35).
Obr. 36. Mapovanie peptidu a analýza glykozylácie. Disulfidové štruktúry a glykozylačné miesta FltlD2.FlklD3.FcACl(a) boli určené metódou peptidového mapovania. Vo FltlD2.FlklD3.FcACl(a) existuje celkom 10 cysteínov; šesť z nich patrí k Fc regiónu. Cys27 je disulfidovo viazaný na Cys76. Cysl21 je disulfidovo viazaný na Cysl82. Prvé dva cysteíny v Fc regióne (Cys211 a Cys214) tvoria intermolekulovú disulfidovú väzbu s rovnakými dvoma cysteínmi v inom Fc reťazci. Ale, nemôže byť stanovené, či sa disulfidová väzba vyskytuje medzi rovnakými cysteínmi (Cys211 a Cys211, napríklad) alebo medzi Cys211 a Cys214. Cys216 je disulfidovo viazaný na Cys306. Cys352 je disulfidovo viazaný na Cys410.
Vo FltlD2.FlklD3.FcACl(a) existuje 5 možných N-viazaných glykozylačných miest a tieto miesta sú glykozylované v rôznom stupni. Kompletná glykozylácia je pozorovaná na Asn33, Asnl93 a Asn282. Čiastočná glykozylácia je pozorovaná na Asn65 a Asnl20. Miesta glykozylácie sú na obr. podčiarknuté.
Obr. 37. Farmakokinetiky Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a VEGFRlR2-FcACl(a). Balb/c myšiam boli injekčné podkožné podané 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), CHO dočasne exprimujúce FltlD2.FlklD3.FcACl(a), CHO stabilne exprimujúce FltlD2.FlklD3.FcACl(a) A CHO dočasne exprimujúce VEGFRlR2-FcACl(a). Myšiam bola z chvostu odobratá krv za 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni, 3 dni a 6 dní po injekcii. Sérum sa testovalo pomocou ELISA testu navrhnutého na detekciu Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2-FcACl(a). pre Fltl(l-3)-Fc (A40) bol 6 hodín, zatiaľ čo Tmax pre prechodný a stabilný FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a prechodný VEGFRlR2-FcACl(a) bol 24 hodín. Cmax pre Fltl(l-3)-Fc (A40) bola 8 pg/ml, pre obidva dočasné (FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a VEGFR1R2FcACl(a)) bola 18 pg/ml a Cmax pre stabilné VEGFRlR2-FcACl(a) bola 30 pg/ml.
Obr. 38. Farmakokinetiky Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltD2.VEGR3R3-Fc C2 (a). Balb/c myšiam boli injekčné podkožné podané 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), CHO dočasne exprimujúce FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a CHO dočasne exprimujúce FltlD2VEGFR3R3-FcACl(a). Myšiam bola z chvostu odobratá krv za 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 a 20 dní po injekcii. Sérum sa testovalo pomocou ELISA testu navrhnutého na detekciu Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo FltlD2.VEGFR3R3-FcACl(a). Fltl(l-3)-Fc (A40) nebol detekovaný v sére po 5 dňoch, zatiaľ čo FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltD2.VEGFR3R3-FcACl(a) boh detekovateľné aj po 15 dňoch.
Obr. 39. Schopnosť FltlD2.FlklD3.FcACl(a) inhibovať rast fibrosarkómu HT-1080 in vivo. Liečba SCID myší každý druhý deň alebo 2-krát týždenne 25 mg/kg FltlD2.FlklD3.FcACl(a) signifikantne znižuje rast podkožných fibrosarkómov HT-1080.
Obr. 40. Schopnosť FltlD2.FlklD3.FcACl(a) inhibovať rast gliómu C6 in vivo. Liečba SCID myší každý druhý deň alebo 2-krát týždenne 2,5 mg/kg FltlD2.FlklD3.FcACl(a) signifikantne znižuje rast podkožných gliómov C6.
Obr. 41. Maternicová hyperpermeabilita indukovaná VEGF. PMSG injikovaný podkožné (5 IU) na indukciu ovulácie prepubertálnym myším samiciam spôsobil prudkú zmenu estradiolu po 2 dňoch, čo nakoniec spôsobilo indukciu VEGF v maternici. Táto indukcia spôsobila hyperpermeabilitu maternice a zvýšila obsah kvapaliny v maternici. Podkožná injekcia Fltl(l-3)-Fc (A40), FltD2.FlklD3.FcACl(a) a FltlD2.VEGFR3R3.FcACl(a) v dávkach 25 mg/kg 1 hodinu po injekcii PMSG viedla k približne 50 % inhibícii zvýšenia vlhkej hmotnosti maternice.
Obr. 42A-42B. Hodnotenie angiogenézy v corpus luteum s použitím progesterónu ako sledovanej hodnoty. PMSG bol injikovaný podkožné (5 IU) na indukciu ovulácie u prepubertálnych myších samíc, čo viedlo ku vzniku úplne funkčného corpus luteum obsahujúceho hustú sieť krvných ciev, kde toto corpus luteum secemovalo do krvi progesterónu na účely prípravy maternice na implantáciu. Indukcia angiogenézy v corpus luteum vyžaduje VEGF. Pokojové koncentrácie progesterónu sú približne 5 ng/ml a PMGS môže indukovať hodnoty až 25-40 ng/ml. Podkožné injekcie Fltl(l-3)-Fc (A40) alebo FltD2.FlklD3.FcACl(a) v dávke 25 mg/kg alebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekcii PMSG vedie ku kompletnej inhibícii indukcie progesterónu v deň 4.
Opis vynálezu
V odbore dlho pretrvávali problémy pri produkcii receptorového antagonistu VEGF s farmakokinetickým profilom, ktorý by bol vhodný na použitie antagonistmi ako možného terapeutiká. Predkladatelia vynálezu tu prvýkrát opisujú chimérický polypeptid schopný antagonizovania VEGF, ktorý má lepšie farmakokinetické vlastnosti v porovnaní s inými antagonistmi VEGF na báze receptora. Chimérické polypeptidy podľa predkladaného vynálezu sú teda prvými molekulami vhodnými na liečbu, pri ktorej je žiaduce dosiahnutie antagonizovania VEGF.
Predkladaný vynález poskytuje nové chimérické polypeptidy vytvorené fuzovaním modifikovanej extracelulámej väzbovej domény pre ligand Fltl receptora a Fc regiónu IgG.
Extraceluláma väzbová doména pre ligand je definovaná ako časť receptora, ktorá - vo svojej prirodzenej konformácii v bunkovej membráne - je orientovaná extraceluláme, takže môže kontaktovať svoj ligand. Extraceluláma väzbová doména pre ligand neobsahuje hydrofóbne aminokyseliny asociované s transmembránovou doménou receptora ani žiadne aminokyseliny asociované s intracelulámou doménou receptora. Všeobecne je intraceluláma alebo cytoplazmatická doména receptora zložená zvyčajne z pozitívne nabitých alebo polárnych aminokyselín (t. j. lyzínu, arginínu, histidínu, kyseliny glutámovej, kyseliny asparágovej). Predchádzajúcich 15-30, predovšetkým hydrofóbnych alebo apolámych aminokyselín (ako je leucín, valín, izoleucín a fenylalanín), tvorí transmembránovú doménu. Extraceluláma doména obsahuje aminokyseliny, ktoré predchádzajú hydrofóbnemu transmembránovému reťazcu aminokyselín. Zvyčajne je transmembránová doména obklopená pozitívne nabitými alebo polárnymi aminokyselinami, ako je lyzín alebo arginín. Von Heijne publikoval podrobné pravidlá, ktoré používajú odborníci v odbore na stanovenie toho, či daný receptor patrí k extracelulámej, transmembránovej alebo intracelulámej doméne (pozri von Heijne, 1995, BioEssays 17: 25-30). Alternatívne, na internete sú dostupné stránky, ako napríklad http.7/ulrec3.unil.ch/software/TMPRED_form.html, ktoré umožnia odborníkom v proteínovej chémii predikciu týkajúcu sa proteínových domén.
Predkladaný vynález umožňuje konštrukciu molekúl nukleovej kyseliny kódujúcej chimérické polypeptidy, ktoré sú vložené do vektora, ktorý exprimuje molekuly chimérických polypeptidov po vložení do vhodnej hostiteľskej bunky. Vhodnými hostiteľskými bunkami sú, napríklad, bakteriálne bunky, kvasinky, hmyzie bunky a cicavčie bunky. Akákoľvek metóda známa odborníkom v odbore na inzerciu DNA fragmentov do vektora môže byť použitá na konštrukciu expresných vektorov kódujúcich chimérické polypeptidové molekuly pod kontrolou transkripčných/ translačných kontrolných signálov. Medzi tieto metódy patria rekombinantné DNA a syntetické techniky in vitro a in vivo rekombinácie (genetické rekombinácie) (pozri Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY).
Expresia molekúl nukleovej kyseliny kódujúcich chimérické polypeptidové molekuly môže byť regulovaná druhou sekvenciou nukleovej kyseliny tak, že chimérická polypeptidová molekula je exprimovaná v hostiteľovi transformovanom rekombinantnou DNA molekulou. Napríklad, expresia chimérických polypeptidových molekúl, ako je tu opísaná, môže byť riadená akýmkoľvek promótorom/zosilňovačom transkripcie známym v odbore. Promótory, ktoré môžu byť použité na riadenie expresie chimérických polypeptidových molekúl, sú napríklad: dlhá koncová repetícia, ako je opísaná v Squinto et al. (1991, Celí 65: 1-20); skorý promótorový región SV40 (Bemoist and Chambon, 1981, Náture 290: 304-310), CMV promótor, M-MuLV 5' koncový repetitívny promótor obsiahnutý v 3' dlhej koncovej repetitívnej sekvencií vírusu Rousovho sarkómu (Yamamoto et al., 1980, Celí, 22: 787-797), promótor herpetickej timidín kinázy) Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78. 144-1445), regulačná sekvencia metalotionínového génu (Brinster et al., 1982, Náture 296: 39-42); prokaryotické expresné vektory, ako je beta-laktamázový promótor (VillaKamaroff et al, 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 75: 3727-3731) alebo tac promótor (DeBoer et al., 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 21-25, pozri tiež „Useful proteins fŕom recombinant bacteria“, v Scientific Američan, 1980, 242: 74-94); promótorove elementy z kvasiniek alebo iných húb, ako je Gal4 promótor, ADH (alkohol dehydrogenázový) promótor, PGK (fosfoglycerolkinázový) promótor, promótor alkalickej fosfatázy a nasledujúce zvieracie transkripčné kontrolné regióny, ktoré vykazujú tkanivovú špecificitu a ktoré boli použité u transgénnych zvierat: kontrolný región génu na elastázu I, ktorý je aktívny v acinámych bunkách podžalúdkovej žľazy (Swift et al., 1984, Celí, 38: 639-646; Omitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425-515); kontrolný región inzulínového génu, ktorý je aktívny v beta-bunkách podžalúdkovej žľazy (Hanahan, 1985, Náture 315: 115-122), kontrolný región imunoglobulínového génu, ktorý je aktívny v lymfoidných bunkách (Grosschedl et al., 1984, Celí
38. 647-658; Adames et al., 1985, Náture 318: 533-538; Alexander et al., 1987, Mol. Celí. Biol. 7: 1436-1444), kontrolný región vírusu myších nádorov mliečnej žľazy, ktorý je aktívny v testikulámych prsných, lymfoidných a žírnych bunkách (Leder et al., 1986, Celí 45: 485-495), kontrolný región albumínového génu, ktorý je aktívny v pečeni (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268-276), kontrolný región alfafetoproteínového génu, ktorý je aktívny v pečeni (Krumlauf et al., 1985, Mol. Celí. Biol. 5: 1639-1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53-58); kontrolný región génu pre alfa-l-antitrypsín, ktorý je aktívny v pečeni (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1: 161-171), kontrolný región génu pre beta-globín, ktorý je aktívny v myeloidných bunkách (Mogram et al., 1985, Náture 315: 338-340, Kollias et al., 1986, Celí 46: 89-94); kontrolný región génu pre myelínový bázický proteín, ktorý je aktívny v oligodendrocytoch v mozgu (Readhead et al., 1987, Celí 48: 703-712); kontrolný región génu pre ľahký reťazec 2 myozínu, ktorý je aktívny v kostrovom svale (Shani, 1985, Náture 314: 283-286) a kontrolný región génu pre hormón uvoľňujúci gonadotropín, ktorý je aktívny v hypotalame (Mason et al., 1986, Science 234: 1372-1378).
Podľa predkladaného vynálezu sú teda expresné vektory replikovateľné v bakteriálnych alebo eukaryotických hostiteľoch obsahujúce nukleové kyseliny kódujúce chimérické polypeptidy podľa predkladaného vynálezu použité na transfekciu hostiteľa a tak na riadenie expresie takých nukleových kyselín tak, že produkujú chimérické polypeptidy, ktoré môžu byť potom získané v biologicky aktívnej forme. Termín biologicky aktívne formy označuje formy schopné väzby na VEGF.
Expresné vektory obsahujúce chimérické molekuly nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu môžu byť identifikované tromi všeobecnými postupmi: (a) DNA-DNA hybridizáciou; (b) podľa prítomnosti alebo neprítomnosti funkcie „markerového“ génu; a (c) podľa expresie inzertovaných sekvencii. V prvom spôsobe môže byť prítomnosť cudzorodého génu inzertovaného v expresnom vektore detekovaná DNA-DNA hybridizáciou s použitím sond obsahujúcich sekvencie, ktoré sú homológne so sekvenciami inzertovanej chimérickej polypeptidovej molekuly. V druhom spôsobe môže byť systém rekombinantný vektor/hostiteľ identifikovaný a selektovaný podľa prítomnosti alebo neprítomnosti niektorých funkcií „markerového“ génu (napríklad podľa aktivity tymidín-kinázy, podľa rezistencie na antibiotiká, podľa transformačného fenotypu, podľa tvorby oklúznych teliesok v bakulovíruse atď.), ktoré sú spôsobené inzerciou cudzorodých génov do vektora. Napríklad, keď je DNA sekvencia pre chimérický polypeptid vložená do vektora do sekvencie markerového génu, tak môžu byť rekombinanty obsahujúce inzert identifikované podľa absencie funkcie markerového génu. V treťom spôsobe môžu byť rekombinantné expresné vektory identifikované testovaním produktu cudzorodého génu exprimovaného rekombinantom. Také testy môžu byť založené, napríklad, na fyzikálnych alebo funkčných vlastnostiach chimérických polypeptidov.
Bunky podľa predkladaného vynálezu môžu dočasne alebo lepšie konštitutívne a permanentne, exprimovať chimérické polypeptidy.
Chimérické polypeptidy môžu byť prečistené akoukoľvek technikou, ktorá umožňuje následnú tvorbu stabilných, biologicky aktívnych chimérických polypeptidov. Napríklad môžu byť faktory získané z buniek vo forme solubilných proteínov alebo vo forme inklúznych teliesok, z ktorých môžu byť extrahované kvantitatívne 8M guanidínium hydrochloridom a dialýzou (pozri napríklad Builder et al., US patent č. 5663304). Na ďalšie prečistenie faktorov môže byť použitá bežná iónomeničová chromatografia, chromatografia s reverznou fázou alebo gélová filtrácia.
V jednom uskutočnení vynálezu je nukleotidová sekvencia kódujúca prvú zložku pred nukleotidovou sekvenciou kódujúcou druhú zložku. V inom uskutočnení vynálezu je nukleotidová sekvencia kódujúca prvú zložku za nukleotidovou sekvenciou kódujúcou druhú zložku. Môžu byť pripravené ďalšie uskutočnenia vynálezu, v ktorých je poradie prvej, druhej a tretej zložky iné. Napríklad, pokiaľ je nukleotidová sekvencia kódujúca prvú zložku označená č. 1, nukleotidová sekvencia kódujúca druhú zložku označená č. 2 a nukleotidová sekvencia kódujúca tretiu zložku označená č. 3, tak môže byť poradie zložiek izolovanej nukleovej kyseliny podľa predkladaného vynálezu v smere 5' - 3'jedno z nasledujúcich poradí: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; alebo 3,2,1.
Predkladaný vynález má tiež diagnostické a terapeutické použitie. V konkrétnych uskutočneniach vynálezu môžu byť spôsoby na detekciu aberancií vo funkcii alebo expresii molekúl chimérických polypeptidov tu opísané môžu byť použité na diagnostiku ochorení. Úprava molekúl chimérických polypeptidov alebo agonisty alebo antagonisty, ktoré sa viažu na molekuly chimérických polypeptidov, môžu byť použité na liečbu ochorení. V ďalších uskutočneniach sú molekuly chimérických polypeptidov použité ako činidlá na blokovanie väzby väzbového činidla na cieľ.
Ako neobmedzujúci príklad sa uvádza, že tento vynález môže byť vhodný na klinickú liečbu ochorení, ktoré sú charakterizované cievnou permeabilitou, edémom alebo zápalom, ako je edém mozgu asociovaný s poranením, mŕtvicou alebo nádorom; edémom asociovaným so zápalmi, ak je psoriáza alebo artritída vrátane reumatoidnej artritídy; astma; generalizovaný edém spojený s popáleninami; ascites a pleurálne výpotky asociované s nádormi, zápalmi alebo úrazmi; chronické zápaly dýchacích ciest, syndróm zvýšenej priepustnosti kapilár; sepsa; ochorenie obličiek asociované s vyššími stratami proteínov; a očné ochorenie, ako je makulárna degenerácia asociovaná s vekom a diabetická retinopatia.
Analýza aminokyselinovej sekvencie Fltl(l-3)-Fc ukázala prítomnosť nezvyčajne vysokého počtu (46) bázickej aminokyseliny lyzínu. IEF analýza Fltl(l-3)-Fc ukázala, že tento protein má pl vyššie ako 9,3, čo potvrdzuje predpoklad, že tento protein je veľmi bázický. Predpokladá sa, že bázický charakter Fltl(l-3)-Fc spôsobuje jeho väzbu na zložky medzibunkovej hmoty a táto interakcia môže spôsobiť extrémne krátky cirkulačný sérový polčas Fltl( 1 -3)-Fc, keď je injekčné podaný myšiam. Na testovanie tejto hypotézy bol Fltl (1 -3)-Fc protein acetylovaný na lyzíne na účely redukcie tejto bazicity. Acetylovaný Fltl(l-3)-Fc bol potom testovaný v teste opísanom ďalej.
Nasledujúce príklady ilustrujú predkladaný vynález a nijako ho neobmedzujú.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1: Expresia Fltl(l-3)-Fc proteínu v CHO KÍ bunkách
S použitím štandardných techník molekulárnej biológie (pozri napr. Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY), sa gén kódujúci Fltl(l-3)-Fc inzertoval do expresného vektora pEE14.1 (Lonza Biologics, plc) v mnohonásobnom klonovacom mieste za CMV promótorom. CHO KÍ bunky sa transfektovali pEE14.1/Fltl(l-3)-Fc DNA konštruktom s použitím lipofektamínu (Gaithersburg, MD). Transfektované CHO KÍ bunky sa kultivovali v bezglutamínovom DMEM (JRH, Kansas City, MO) obsahujúcom 25 pm metionín sulfoxímu (msx) od Sigma Inc., St. Louis, MO a bunky exprimujúce vysoké kvantity rekombinantného proteínu sa získali testovaním supematantov CHO KÍ buniek z viac ako 100 ručne odobratých kolónií izolátov s použitím štandardného imunotestu, ktorý zachycuje a detekuje ľudský Fc. Selektované ručne odobraté kolónie sa amplifikovali v prítomnosti 100 μΜ MSX a potom sa uskutočnilo druhé kolo skríningu amplifíkovaných kolónií. Kloň s najvyššou produkciou mal špecifickú produktivitu rekombinantného Fit 1 (1 -3)-Fc proteínu 55 pg/bunku/deň.
Selektovaný kloň bol expandovaný v T-banke s objemom 225 cm2 (Coming, Acton, MA) a potom sa preniesol do 8,5 1 valcových skúmaviek (Coming, Acton, MA) s použitím bunkového kultivačného média opísaného skôr. Bunky sa odstránili z valcových skúmaviek pomocou štandardnej trypsinizácie a vniesli sa do 3,5 litra suspenzného média. Suspenzné médium sa skladalo z bezglutaminového ISCHO média (Irvine Scientific, Šanta Ana, CA) obsahujúceho 5 % fetálne hovädzie sérum (FBS od Hyclone Labs, Logan, UT), 100 μΜ MSX a GS doplnok (JRH Scientific, Kansas City, MO) v 5 1 Cellingen bioreaktora (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) v hustote 0,3 x 106buniek/ml. Potom, čo bunky dosiahli denzitu 3,6 x 106/ml a adaptovali sa na suspenziu, boli prenesené do 60 1 bioreaktora (ABEC, Allentown, PA) v hustote 0,5 x 106 buniek/ml v 20 1 ISCHO média s 5 % fetálnym hovädzím sérom. Po 2 dňoch sa do bioreaktora pridalo ďalších 20 1 ISCHO + 5 % fetálne hovädzie sérum. Bunky sa nechali rásť počas ďalších dvoch dní na dosiahnutie konečnej hustoty 3,1 x 106 buniek/ml a konečná koncentrácia Fltl(l-3)-Fc pri zbere bola 95 mg/ml. Pri odbere boli bunky odstránené filtráciou s tangenciálnym tokom s použitím 0,45 μηι Prostak filtrov (Millipore, Inc., Bedford, MA).
Príklad 2: Prečistenie Fltl(l-3)-Fc proteínu získaného z CHO KÍ buniek
Fit 1 (1 -3)-Fc protein bol najskôr prečistený afinitnou chromatografiou. Kolóna s proteínom A bola použitá na naviazanie, s vysokou špecifitou, Fc časti molekuly. Tento afinitne prečistený protein bol potom zahustený a nechal sa prejsť SEC-kolónou. Protein bol potom eluovaný do formulačného pufra. Ďalej je tento postup opísaný podrobne.
Materiály a metódy
Všetky chemikálie boli získané od J.T.Baker, Phillipsburg, NJ, s výnimkou PBS, ktorý bol získaný ako lOx koncentrát od Life Technologies, Gaithersburg, MD. Protein A Fast Flow a Superdex 200 prípravky živíc boli získané od Pharmacia, Piscataway, NJ. Vybavenie a membrány na zahustenie proteínu boli získané od Millipore, Bedford, MA.
Približne 40 1 0,45 pm-filtrovaného CHO kondicionovaného média obsahujúceho Fltl(l-3)-Fc protein sa aplikovalo do 290 ml Protein A Fast Flow kolóny (priemer 10 cm), ktorá sa uviedla do rovnováhy v PBS. Kolóna sa premyla PBS obsahujúcom 350 mM NaCl a 0,02 % CHAPS a naviazaný protein sa eluoval 20 mM kyseliny citrónovej obsahujúcimi 10 mM Na2HPO4. Jediný pík v eluáte sa odobral a jeho pH sa zvýšilo na neutrálnu hodnotu pomocou IM NaOH. Frakcie eluátu sa zahustili na približne 9 mg/ml s použitím 10K regenerovaných celulózových membrán s použitím tak filtrácie s tangenciálnym tokom, ako aj zahustením buniek miešaním. Na odstránenie agregátov a iných kontaminujúcich zložiek sa zahustený protein aplikoval do kolóny naplnenej Superdex 200 živicou (10 cm x 55 cm) a uskutočnila sa elúcia PBS obsahujúcom 5 % glycerol. Hlavné piky sa odobrali, sterilné sa prefiltrovali, rozdelili sa do podielov a uskladnili sa pri teplote -80 °C.
Príklad 3: Acetylácia Fltl(l-3)-Fc proteínu mg Fltl(l-3)-Fc proteínu sa acetylovali spôsobom opísaným v návode na použitie sulfo-NHS-acetátového modifikačného kitu (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, kat. č. 26777).
Príklad 4: Charakterizácia acetylovaného Fltl(l-3)-Fc proteínu (a) IEF analýza: Fltl(l-3)-Fc a acetylovaný Fltl(l-3)-Fc sa analyzovali štandardnou IEF analýzou. Ako je uvedené na obr. 1, Fltl(l-3)-Fc proteín nie je schopný migrovať do gélu a preto musí mať pi vyššie ako 9,3, čo je najvyššie pi v štandarde. Ale, acetylovaný Fltl(l-3)-Fc je schopný migrovať do gélu a dosahuje rovnováhu pri pi približne 5,2. Tento výsledok demonštruje, že acetylácia významne redukuje pozitívny náboj pratému a tak jeho pi.
(b) Väzba na zložky medzibunkovej hmoty
Na testovanie väzby na zložky medzibunkovej hmoty sa Fltl(l-3)-Fc a acetylovaný Fltl(l-3)-Fc testovali v teste napodobujúcom interakcie so zložkami medzibunkovej hmoty. V tomto teste sú 96-jamkové tkanivové kultivačné platne potiahnuté Matrigelom® (Biocat MATRIGEL® 96-jamková platňa s tenkou vrstvou matrice, katalóg, č. 40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA). Platne sa inkubovali s rôznymi koncentráciami Fltl(l-3)-Fc, acetylovaného Fltl(l-3)-Fc alebo rTie2-Fc (irelevantná kontrola) proteínu, ktoré sa pridali do jamiek. Platne sa inkubovali počas 1-2 hodín buď pri teplote miestnosti alebo pri 37 °C a potom sa detekcia naviazaných proteínov uskutočnila pomocou pridania druhej protilátky oproti ľudskému Fc konjugované s alkalickou fosfatázou do jamiek. Nakoniec sa do jamiek pridal substrát na alkalickú fosfatázu a merala sa optická denzita. Obr. 2 ukazuje výsledky tohto testu. Podobne ako irelevantný kontrolný proteín rTie2-Fc, nevykazoval acetylovaný Fltl(l-3)-Fc akúkoľvek väzbu na platňu potiahnutú Matrigelom, zatiaľ čo neacetylovaný Fltl(l-3)-Fc proteín vykazoval významnú väzbu. Tento výsledok naznačuje, že acetylácia bázických aminokyselinových zvyškov je účinnou cestou pre interferenciu s elektrickými interakciami, ktoré existujú medzi proteínmi s pozitívnym nábojom a negatívne nabitými zložkami extracelulámej hmoty, ktoré sa odohrávajú in vivo.
Príklad 5: Pegylácia Fltl(l-3)-Fc proteínu
Aj keď bolo preukázané, že pegylácia (polyetylénglykol = PEG) proteínu zvyšuje jeho účinnosť in vivo tým, že zvyšuje jeho stabilitu a biologickú dostupnosť za minimalizácie imunogenicity (pozri odkazy citované skôr), je intuitívne nevhodné pegylovať molekuly, ktoré sú príliš veľké na glomerulárnu filtráciu s cieľom zlepšenia ich farmakokinetických vlastností. Bez väzby na konkrétnu teóriu predkladatelia vynálezu preštudovali teóriu, že pegylácia Fltl(l-3)-Fc molekúl môže zlepšiť ich farmakokinetické vlastnosti, pravdepodobne nie zmenou pozitívneho náboja alebo zníženín pi Fltl(l-3)-Fc, ale skôr fyzikálnym odstránením pozitívneho náboja z interakcie s extracelulámou hmotou. Predkladatelia vynálezu sa rozhodli urobiť pokus na zlepšenie farmakokinetických vlastností Fltl(I-3)-Fc molekúl tak, že naviažu reťazec 20K PEG, ako je opísané ďalej.
Materiály a metódy
Prečistenie Fltl(l-3)-Fc získaný z CHO buniek (pozri skôr) bol použitý v nasledujúcich pegylačných pokusoch. Funkcionalizované PEG boli získané od Shearwater Polymers, Huntsville, AL; Bicin od Sigma, St. Louis, MO; Superose 6 kolóna od Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS ako lOx koncentrát od Life Technologies, Gaithersburg, MD; Glycerol od J.T. Baker, Phillipsburg, NJ; a Bis-Tris vopred odliate gély od Novex, CA.
20K PEG reťazce funkcionalizované amín-špecifickými koncovými skupinami boli použité v reakčných pokusoch v malom rozsahu, ktoré boli uskutočnené na hodnotenie rôznych reakčných podmienok, v ktorých sa líšila stechiometria PEG : proteín. Na základe týchto reakcií a analýzy vzoriek na štandardné SDS-PAGE reagoval Fltl(l-3)-Fc v koncentrácii 1,5 ng/ml pri pH 8,1 s 20K SPA-PEG (PEG-sukcínimidylpropionát) molekulami pri molámom pomere PEG : Fltl(l-3)-Fc monomér 1 : 6. Reakcia sa nechala prebiehať pri 8 °C cez noc. Na počiatočné prečistenie sa reakčné produkty aplikovali do 10 mm x 30 cm Superose 6 kolóny uvedenej do rovnováhy PBS obsahujúcim 5 % glycerol. Zdá sa, že kolóna separovala pegylované Fltl(1 -3)-Fc molekuly podľa rozsahu pegylácie. Boli odobraté frakcie zodpovedajúce primáme monopegylovaným a dipegylovaným dimerickým Fltl(l-3)-Fc, ako boli potvrdené charakterom prúžkov na redukujúcich a neredukujúcich SDS-PAGE géloch. Koncentrácia proteínu bola určená meraním absorbancie pri 280 nm. Pegylovaný Fltl(l-3)-Fc proteín bol sterilné prefiltrovaný, rozdelený do podielov a uskladnený pri -40 °C.
Príklad 6: Väzba nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fltl(l-3)-Fc v teste na báze Biacore
Nemodifikované, acetylované a pegylované Fltl(l-3)-Fc proteiny boli testované v teste na báze Biacore na hodnotenie ich schopnosti väzby na Fltl ligand, VEGF. V tomto teste sa nemodifikovaný Fit 1(1-3)-Fc proteín imobilizuje na povrchu Biacore čipu (pozri Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, kde je uvedený štandardný postup) a vzorka obsahujúca 0,2 pg/ml VEGF a buď nemodifikovaný Fit 1 (1 -3)-Fc, acetylovaný Fltl(l-3)-Fc alebo pegylovaný Fltl(l-3)-Fc (vždy pri 25 pg/ml) sa prelial cez čip potiah nutý Fltl(l-3)-Fc. Na minimalizáciu vplyvu nešpecifickej väzby sa naviazané vzorky premyli 0,5 M NaCl. V jednej vzorke sa nemodifikovaný Fltl(1 -3)-Fc zmiešal s heparínom. Heparín je molekula s negatívnym nábojom a Fltl(l-3)-Fc proteín je molekula s pozitívnym nábojom, takže keď sú tieto dve molekuly zmiešané dohromady, mali by interagovať v dôsledku svojich príslušných nábojov. Toto v podstate neutralizuje vlastný pozitívny náboj Fltl(l-3)-Fc, čo spôsobí, že sa molekula správa ako chemicky alebo geneticky modifikovaná tak, že je redukovaný jej náboj a jej tendencie k väzbe prostredníctvom elektrických interakcií. Ako je uvedené na obr. 3, acetylované (stĺpce 13-16), pegylované (stĺpce 17-20) a heparínom spracované Fltl(l-3)-Fc (stĺpce 21-24) sú každý schopný úplne inhibovať s Fit 1 (1 -3)-Fc naviazaným na Biacore čip s väzbou VEGF v porovnaní s kontrolným (stĺpce 1-4) a irelevantným (stĺpce 5-8) proteínom. Nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc (stĺpce 5-6) iba čiastočne súťažil s Fltl(l-3)-Fc naviazaným na Biacore čip s väzbou VEGF. Ale, premytie naviazaných vzoriek 0,5 M NaCl (stĺpce 7-8) viedlo k dosiahnutiu väzbového profilu podobného profilu modifikovaných foriem Fltl(l-3)-Fc, čo naznačuje, že modifikovaný proteín vykazuje nešpecifickú väzbu na čip, ktorá môže byť eliminovaná premytím soľným roztokom.
Príklad 7: Väzba nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fit 1 (1 -3)-Fc v teste na báze ELISA
Nemodifikované, acetylované a pegylované Fltl(l-3)-Fc proteíny boli testované v teste na báze ELISA na hodnotenie ich schopnosti väzby na ligand Fltl receptora VEGF. Ako je uvedené na obr. 4, tak pegylované, ako aj acetylované Fltl(l-3)-Fc proteíny sa môžu viazať na VEGF, čo dokazuje, že modifikácia proteínu buď pegyláciou alebo acetyláciou, neničí ich schopnosť viazať sa na ligand.
Príklad 8: Farmakokinetické analýzy nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, acetylovaného Fltl(l-3)-Fc a pegylovaného Fltl(l-3)-Fc
Pokusy in vivo boli navrhnuté na hodnotenie farmakokinetických profilov nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, acetylovaného Fltl(l-3)-Fc a pegylovaného Fltl(l-3)-Fc proteínu. Balb/c myšiam (23-28 g; 3 myši na skupinu) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného, acetylovaného alebo pegylovaného Fltl(l-3)-Fc. Myšiam sa odobrala krv z chvosta 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni a 3 dni po injekcii proteínu. Sérum sa testovalo štandardným ELISA testom navrhnutým na detekciu Fltl(l-3)-Fc proteínu. Stručne, test zahrňoval potiahnutie ELISA platne VEGF, väzbu séra obsahujúceho nemodifikovaný, acetylovaný alebo pegylovaný Fltl(l-3)-Fc a detekciu anti-Fc protilátkou naviazanou na alkalickú fosfatázu. Ako je uvedené na obr. 5, Tmax pre všetky Fltl(l-3)-Fc proteíny bolo medzi 6 hodinami a 24 hodinami. Cmax pre rôzne proteíny boli nasledujúce: nemodifikovaný: 0,06 pg/ml - 0,15 pg/ml; acetylovaný: 1,5 pg/ml - 4,0 pg/ml; a pegylovaný: približne 5 pg/ml.
Príklad 9: Postupná acetylácia Fltl(l-3)-Fc
Na stanovenie toho, aké minimálne množstvo acetylácie je nutné na elimináciu väzby na zložky extracelulámej matrice, bol navrhnutý pokus, v ktorom bola uskutočnená postupná acetylácia Fit 1 (1 -3)-Fc proteínu s použitím postupne sa zvyšujúcich molámych nadbytkov acetylačného činidla v acetylačnej reakčnej zmesi. Rozmedzie molámych nadbytkov bolo nasledujúce: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 a 100 molov acetylačného činidla na 1 mol Fltl(1-3)-Fc monoméru. Reakcie sa uskutočnili podľa návodu dodaného k sulfoNHS-acetát modifikačnému kitu (Pierce Chemical Co., Rocford, IL, kat. č. 26777).
Príklad 10: Charakterizácia postupne acetylovaného Fltl(1 -3)-Fc (a) IEF analýza: Nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc a postupne acetylované Fltl(l-3)-Fc proteíny sa analyzovali štandardnou IEF analýzou. Ako je uvedené na obr. 6A-6B, nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc proteín nie je schopný migrovať do gélu v dôsledku extrémne vysokého pi (vyššieho ako 9,3). Ale, väčšina z postupne acetylovaných Fltl(l-3)-Fc vzoriek bola schopná migrovať do gélu a dosahovali rovnováhu pri pi približne 4,55-8,43, podľa stupňa acetylácie proteínu. Tento výsledok demonštruje, že acetylácia môže meniť pozitívny náboj proteínu v závislosti od veľkosti acetylácie a že redukcia pi môže byť riadená ovplyvnením stupňa acetylácie.
(b) Väzba postupne acetylovaného Fltl(1 -3)-Fc na zložky medzibunkovej hmoty
Na testovanie väzby na zložky medzibunkovej hmoty sa Fltl(l-3)-Fc a postupne acetylovaný Fltl(l-3)-Fc testovali v teste opísanom skôr napodobujúcom interakcie so zložkami medzibunkovej hmoty. Rôzne koncentrácie nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, postupne acetylovaného Fltl(l-3)-Fc (vzorky s molámym nadbytkom 10-, 20- a 30-násobným) alebo rTie2-Fc (irelevantná kontrola) proteínu sa pridali do jamiek. Platne sa inkubovali počas 1-2 hodín buď pri teplote miestnosti alebo pri 37 °C a potom sa detekcia naviazaných proteínov uskutočnila pomocou pridania druhej protilátky oproti ľudskému Fc konjugovanej s alkalickou fosfatäzou do jamiek. Nakoniec sa do jamiek pridal substrát na alkalickú fosfatázu a merala sa optická denzita. Obr. 7 ukazuje výsledky tohto testu. Podobne ako irelevantný kontrolný proteín rTie2-Fc, nevykazoval postupne acetylovaný Fltl(l-3)-Fc (20- a 30-násobný molámy nadbytok) akúkoľvek významnú väzbu na platni potiahnutej Matrigelom, zatiaľ čo neacetylovaný Fltl(l-3)-Fc proteín vykazoval významnú väzbu. Táto väzba je saturovateľná, čo naznačuje, že Fltl(l-3)-Fc proteín sa môže viazať na špecifické miesta a nie prostredníctvom všeobecnejších interakcií sprostredkovaných nábojom, ktoré by neboli saturovateľné. Vzorka s 10-násobným molámym nadbytkom vykazovala redukovanú väzbu, ale stupeň acetylácie nebol dostatočný na úplný blok väzby na zložky medzibunkovej hmoty. Vzorky s 20-násobným a vyšším molámym nadbytkom nevykazovali žiadnu detekovateľnú väzbu, aj napriek skutočnosti, že IEF analýza (obr. 6A a 6B) vzoriek s nižším molámym nadbytkom stále mala veľký pozitívny náboj. Tento výsledok demonštruje, že nie je nutné kompletne acetylovať všetky dostupné bázické aminokyseliny kvôli eliminácii väzby na zložky extracelulárnej matrice.
(c) Väzba postupne acetylovaného Fit 1 (1 -3)-Fc v teste na báze Biacore
Nemodifikované a postupne acetylované Fltl(l-3)-Fc proteíny boli testované v teste na báze Biacore na hodnotenie ich schopnosti väzby na Fltl ligand, VEGF. V tomto teste sa nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc proteín (0,5, 1,0 alebo 5,0 pg/ml) imobilizuje na povrchu Biacore čipu (pozri Biacore Instruction Manual, Pharmacia Inc., Piscataway, NJ, kde je uvedený štandardný postup) a roztok obsahujúci 0,2 pg/ml VEGF a buď nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc (v koncentrácii 0,5, 1,0 alebo 5,0 pg/ml) alebo 10 rôzne acetylovaných Fltl(l-3)-Fc (v koncentrácii 0,5, 1,0 alebo 5,0 pg/ml) sa prelial cez čip potiahnutý Fltl(l-3)-Fc. Ako je uvedené na obr. 8, v substechiometrickom pomere (0,5 pg/ml nemodifikovaného Flt(l-3) alebo postupne acetylovaného Fltl(l-3)-Fc vs. 0,2 pg/ml VEGF) nie je prítomné dostatočné množstvo Fltl(l-3)-Fc (nemodifikovaného alebo postupne acetylovaného) v roztoku na úplnú inhibíciu väzby VEGF. Pri 1,0 pg/ml, čo je približne stechiometrický pomer 1 : 1, sú ako nemodifikovaný, tak postupne acetylovaný Fltl(l-3)-Fc lepšie schopné súťažiť o väzbu VEGF, ale nie je stále ešte prítomný dostatok Fltl(l-3)-Fc proteínu (nemodifikovaného alebo postupne acetylovaného) na úplnú väzbu dostupného VEGF. Ale, pri 5,0 pg/ml, čo je niekoľkokrát viac, ako je stechiometrický pomer 1 : 1, sú tak Fit 1 (1 -3)-Fc, ako aj postupne acetylovaný Fit 1 (1 -3)-Fc proteíny schopné viazať VEGF, bez ohľadu na stupeň acetylácie. Toto jasne demonštruje, že acetylácia neovplyvňuje schopnosť Fltl(l-3)-Fc viazať VEGF.
(d) Farmakokinetické analýzy postupne acetylovaného Fltl(l-3)-Fc
Pokusy in vivo boli navrhnuté na hodnotenie farmakokinetických profilov nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc a postupne acetylovaného Fltl(l-3)-Fc proteínu. Balb/c myšiam (23-28 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného alebo vzorky s 10-, 20-, 40-, 60- a 100-násobným molámym nadbytkom postupne acetylovaného Fltl(l-3)-Fc (3 myši pre nemodifikovaný, 10-, 20- a40-násobný molámy nadbytok a 2 myši pre 60- a 100-násobný molámy nadbytok). Myšiam sa odoberala krv z chvosta 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni a 3 dni po injekcii proteínu. Sérom sa testovalo štandardným ELISA testom navrhnutým na detekciu Fltl(l-3)-Fc proteínu, ako bol opísan. Obr. 9 zahŕňa výsledky tohto pokusu. Tmax pre všetky Fltl(l-3)-Fc proteíny bol 6 hodín, ale Cmax pre rôzne proteíny boli nasledujúce: nemodifikovaný: 0,06 pg/ml; 10-násobný molámy nadbytok - 0,7 pg/ml, 20-násobný molámy nadbytok - 2 pg/ml, 40-násobný molámy nadbytok - 4 pg/ml, 60-násobný molámy nadbytok - 2 pg/ml, 100-násobný molámy nadbytok - 1 pg/ml. Tieto výsledky ukazujú, že acetylácia alebo pegylácia Fit 1 (1 -3)-Fc významne zlepšuje jeho farmakokinetický profil.
Príklad 11: Konštrukcia mutantného Fltl(l-3)-Fc s deléciou bázického regiónu označeného ako Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc
Na základe zistenia, že acetylovaný Fltl(l-3)-Fc, ktorý má pl nižšie ako 6, má omnoho lepšiu farmakokinetiku ako vysoko pozitívny nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc (pl > 9,3), sa zisťovalo, či rozdiely vo farmakokinetike môžu byť prisúdené náboju proteínu, ktorý sa viaže na negatívne nabité zložky extracelulámej matrice alebo či existujú špecifické regióny na povrchu Fltl(l-3)-Fc proteínu, ktoré tvoria špecifické väzbové miesta pre zložky extracelulámej matrice. Napríklad, o mnohých proteínoch je známe, že majú väzbové miesta pre heparín, ktoré sa často skladajú zo zoskupení bázických zvyškov. Niekedy sa tieto zvyšky vyskytujú v zoskupení na primárnej sekvencii proteínu; v literatúre boli identifikované „konsenzuálne sekvencie“ pre také väzbové miesta pre heparín (pozri napr. Hileman et al., 1998, Bioessays 20(2): 156-67). V iných prípadoch ukazuje známa kryštalická štruktúra proteínu zoskupenie pozitívne nabitých zvyškov na povrchu proteínu, ale zvyšky pochádzajú z rôznych regiónov primárnej sekvencie a dostávajú sa do kontaktu iba po zložení proteínu do terciámej štruktúry. Tak je ťažké zistiť, či je izolovaný aminokyselinový zvyšok súčasťou zoskupenia bázických zvyškov na povrchu proteínu. Ale, pokiaľ existuje zoskupenie pozitívne nabitých aminokyselinových zvyškov v primárnej sekvencii, nie je neopodstatnené predpokladať, že tieto zvyšky sú si priestorovo blízke a môžu byť preto súčasťou väzbového miesta pre medzibunkovú hmotu. Fltl receptor bol dôkladne skúmaný a boli opísané rôzne jeho domény (pozri napríklad Tanaka et al., 1997, Jpn. J. Cancer Res. 88: 867-876). Podľa sekvencii nukleových kyselín a aminokyselinových sekvencii uvedených na obr. 10A-10D tohto vynálezu možno identifikovať signálne sekvencie na sekréciu, ktoré sú lokalizované na začiatku sekvencie a končia glycínom kódovaným nukleotidmi 76-78. Zrelý proteín začína sekvenciou Ser-Lys-Leu
-Lys, začínajúci nukleotidom 79 sekvencie nukleovej kyseliny. Fltl Ig doména 1 je kódovaná nukleotidmi 79-393 a končí aminokyselinami Ser-Asp-Thr. Fltl Ig doména 2 je kódovaná nukleotidmi 394 až 687 (kódujúcimi Gly-Arg-Pro až Asn-Thr-Ile) a Fltl Ig doména 3 je kódovaná nukleotidmi 688 až 996 (kódujúcimi Ile-Asp-Val až Asp-Lys-Ala). Je tu prítomná premosťujúca aminokyselinová sekvencia Gly-Pro-Gly, kódovaná nukleotidmi 997-1005, po ktorej nasleduje nukleotidová sekvencia kódujúca ľudský Fc (nukleotidy 1006-1701 alebo aminokyseliny Glu-Pro-Lys až Pro-Gly-Lys-stop).
Podrobnejšia analýza Fltl aminokyselinovej sekvencie ukázala, že tu existuje zoskupenie, konkrétne aminokyselinové zvyšky 272-281 (KNKRASVRR) obr. 10A-10D, v ktorom je 6 z 10 aminokyselín bázických. Táto sekvencia je lokalizovaná vo Fltl Ig doméne 3 receptora (pozri obr. 11), ale nie je sama esenciálna pre väzbu VEGF ligandu, ale spôsobuje vysokú afinitu väzby pre ligand. Porovnanie sekvencie Ig domény 3 so sekvenciou Ig domény 2 ukazuje, že v tomto regióne je veľmi slabá zhoda medzi dvoma Ig doménami a že v doméne 3 existuje približne 10 ďalších aminokyselín. Analýza profilov hydrofilnosti (MacVector počítačový softvér) týchto dvoch domén jasne ukazuje prítomnosť hydrofílného regiónu v proteíne (obr. 12A-12B). Tieto zistenia ukazujú na možnosť, že skutočná trojrozmerná konformácia Fltl Ig domény 3 umožňuje určitú protrúziu, ktorá nie je prítomná vo Fltl Ig doméne 2. Na testovanie tejto hypotézy sa deletovalo 10 ďalších aminokyselín a vzniknutý proteín sa testoval na účely zistenia toho, či delécia bude priaznivo ovplyvňovať farmakokinetiku bez narušenia afinity receptora pre VEGF. Tento DNA konštrukt, ktorý bol pripravený s použitím štandardných techník molekulárnej biológie (pozri napríklad Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) v cicavčom expresnom vektore pMT21 (Genetics Inštitúte, Inc. Cambridge, MA), je označovaný ako Mutl: Fit 1 (1-3AB)-Fc. Mutl: Fltl( 1-3AB)-Fc konštrukt bol získaný z Fltl(l-3)-Fc deléciou nukleotidov 814-843 (podľa obr. 10A-10D), čo znamená deléciu vysoko bázických 10 aminokyselinových zvyškov sekvencie Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg z Fltl Ig domény 3.
Sekvencia konečného DNA konštruktu bola verifikovaná s použitím ABI 373A DNA sekvenátora a Taq Dedeoxy Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekvencia Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc je uvedená na obr. 13A-13D.
Príklad 12: Konštrukcia mutantného Fltl(l-3)-Fc s deléciou bázického regiónu označeného ako Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc
Druhý delečný mutantný konštrukt, označený Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc, bol získaný z Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc konštruktu deléciou Fltl Ig domény 1 kódovanej nukleotidmi 79-393 (pozri obr. 10A-10D); presnejšie, nukleotidy 73-78 (TCA GGT) boli zmenené na TCC GGA. Týmto sa vložilo reštrikčné miesto (BspEl) bez alterácie asociovanej aminokyselinovej sekvencie, Ser-Gly. Tento DNA konštrukt, ktorý bol pripravený s použitím štandardných techník molekulárnej biológie (pozri napríklad Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) v cicavčom expresnom vektore pMT21. (Genetics Inštitúte, Inc. Cambridge, MA), bol tiež verifikovaný z hľadiska sekvencie s použitím ABI 373A DNA sekvenátora a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA). Sekvencia Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc je uvedená na obr. 14A-14C.
Príklad 13: Konštrukcia mutantného Fltl(l-3)-Fc s deléciou označeného ako Mut3: Fltl(2-3ÁB)-Fc
Tretí delečný mutantný konštrukt, označený Mut3: Fltl(2-3AB)-Fc, bol získaný rovnako ako Mut2: Fltl(2-3ÁB)-Fc konštrukt s tou výnimkou, že Fltl Ig doména 3 bola ponechaná intaktná (bázický aminokyselinový región nebol deletovaný). Konštrukt bol pripravený technikou molekulárnej biológie a sekvencia konečného konštruktu bola verifikovaná spôsobom opísaným skôr. Sekvencia Mut3: Fltl(2-3)-Fc je uvedená na obr. 15A-15C.
Príklad 14: Konštrukcia mutantného Flt(l-3)-Fc s N-glykozyláciou bázického regiónu označeného Mut4: Fltl(l-3R^N)-Fc
Bol pripravený konštrukt, v ktorom bolo N-glykozylačné miesto vložené do stredu bázického regiónu Fltl Ig domény 3. Tento konštrukt bol označený ako Mut4: Fit 1 (1 -3R^N)-Fc a bol pripravený zmenou nukleotidov 824-825 z GA na AC, čo zmenilo kódovaný Arg zvyšok (AGA) na Asn zvyšok (AAC) (pozri obr. 10A-10D). Vzniknutá aminokyselinová sekvencia je teda zmenená z Arg-Ala-Ser na Asn-Ala-Ser, čo zodpovedá kanonickému signálu (Asn-Xxx-Ser/Thr) na adíciu N-glykozylačného miesta v Asn zvyšku. Sekvencia Mut4: Fltl(l-3R^N)-Fc je uvedená na obr. 16A-16D.
Príklad 15: Charakterizácia acetylovaného Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Flt(l-3AB)-Fc a Mut4: Fltl(l-3R^N)-Fc mutantov (a) Väzba na zložky medzibunkovej hmoty
Na stanovenie toho, či tri modifikované proteíny majú viac alebo menej zlepšené farmakokinetické vlastnosti sa 96-jamkové platne potiahnuté Matrigelom (ako sú opísané) inkubovali s rôznymi koncentráciami mutantných proteinov a detekovali sa protilátkami proti ľudskému Fc konjugovanými s alkalickou fosfatázou. Ako je uvedené na obr. 18, tento pokus ukázal, že zatiaľ čo nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc proteín sa dobre viaže na tieto jamky, Mut3: Fltl(2-3)-Fc proteín sa viaže o niečo slabšie, Mutl: Flt(l-3AB)-Fc sa viaže ešte slabšie a Mut2: Fltl(2-3AD)-Fc proteín má najlepší profil a viaže sa slabšie ako akýkoľvek iný mutantný proteín. Mut4: Fit 1(1 -3R^N)-Fc glykozylačný mutantný proteín vykazoval iba marginálny benefit v Matrigel teste. Tieto výsledky potvrdzujú hypotézu, že lineárna sekvencia pozitívnych aminokyselín môže byť deletovaná z primárnej sekvencie, čo vedie ku zníženiu elektrických interakcií so zložkami extracelulámej hmoty.
(b) Väzba Mutl: Flt(l-3AB)-Fc a Mut4: Fltl(l-3R^N)-Fc v teste na báze Biacore
Nemodifikované a acetylované Fltl(l-3)-Fc proteíny a geneticky modifikované Mutl: Fit (1-3AB)-Fc a Mut4: Fltl (1-3R^N)-Fc proteíny boli testované v teste na báze Biacore na hodnotenie ich schopnosti väzby na Fltl ligand, VEGF. V tomto teste sa nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc proteín (0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml) imobilizuje na povrchu Biacore čipu (pozri Biacore Instruction Manual, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, kde je uvedený štandardný postup) a roztok obsahujúci 0,1 pg/ml VEGF a buď prečistený alebo supematant COS buniek obsahujúci nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc (v koncentrácii 0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml), prečistený acetylovaný Fltl(l-3)-Fc (v koncentrácii 0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml), supematant COS buniek obsahujúci Mutl: Flt(l-3AB)-Fc (v koncentrácii 0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml), alebo supematant COS buniek obsahujúci Mut4: Fltl (1-3R^N)-Fc (v koncentrácii 0,25, 0,5 alebo 1,0 pg/ml), sa prelial cez čip potiahnutý Fltl(l-3)-Fc. Ako je uvedené na obr. 17, v substechiometrickom pomere (0,25 pg/ml nemodifikovanej, acetylovanej alebo geneticky modifikovanej vzorky vs. 0,1 pg/ml VEGF) nie je prítomné dostatočné množstvo Fltl(l-3)-FC proteínu v roztoku na blokovanie väzby VEGF na Fltl (1 -3)-Fc imobilizovaný na Biacore čipe. Pri 0,5 pg/ml nemodifikovaného, acetylovaného alebo geneticky modifikovaného Fltl(l-3)-Fc proteínu, čo je približne stechiometrický pomer 1 : 1, je zrejme zlepšená schopnosť blokovať väzbu VEGF na Biacore čip. Pri koncentrácii 1,0 pg/ml nemodifikovaného, acetylovaného alebo geneticky modifikovaného Fltl(l-3)-Fc proteínu, čo je približne stechiometrický pomer 10 : 1, sú Fltl(l-3)-Fc proteíny schopné blokovať väzbu VEGF na Biacore čip, ale nie sú ekvivalentné. Nemodifikovaný, acetylovaný a Mutl: Flt( 1-3AB)-Fc sú v podstate rovnocenné vo svojej schopnosti blokovať väzbu VEGF, zatiaľ čo Mut4: Fltl (1-3R^N)-Fc je o niečo menej účinný v blokovaní väzby. Tieto výsledky potvrdzujú hypotézu, že je možné redukovať nešpecifickú väzbu molekuly genetickým odstránením lineárnej sekvencie predominantne negatívne nabitých aminokyselín.
(c) Väzba Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc, Mut2: Fltl(2-3AB)-Fc, Mut3: Fltl(l-3AB)-Fc v teste na báze ELISA
Na stanovenie toho, či sa môžu tri mutantné proteíny viazať na Fltl ligand VEGF sa uskutočnili väzbové experimenty, v ktorých sa 96-jamkové platne potiahnuté VEGF inkubovali s rôznymi koncentráciami príslušného mutantného proteínu a po premytí sa úroveň väzby detekovala inkubáciou s protilátkou proti ľudskému Fc konjugovanou s alkalickou fosfatázou a kvantifikovala sa kolorimetricky pridaním vhodného substrátu na alkalickú fosfatázu. Ako je uvedené na obr. 19, pokus ukázal, že v testovaných koncentráciách sa môžu všetky mutantné proteíny podobne viazať na VEGF.
Príklad 16: Farmakokinetická analýza acetylovaného Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Flt(l-3AB)-Fc a nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc
Pokusy in vivo boli navrhnuté na hodnotenie farmakokinetických profilov nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc a pri 40-násobnom molámom nadbytku acetylovaného Fltl(l-3)-Fc proteínu. Balb/c myšiam (25-30 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, pri 40-násobnom molámom nadbytku acetylovaného Fltl(l-3)-Fc a Mutl: Fltl(l-3AB)-Fc proteínu (vždy 4 myši). Myšiam sa odoberala krv z chvosta 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni, 3 dni a 5 dní po injekcii proteínu. Sérum sa testovalo štandardným ELISA testom navrhnutým na detekciu Fltl(l-3)-Fc proteínu, ktorý zahŕňa potiahnutie ELISA platne VEGF, väzbu Fltl (l-3)-Fc a detekciu anti-Fc protilátkou naviazanou na alkalickú fosfatázu. Ako je uvedené na obr. 20, boli C1Tlax pre tieto činidlá nasledujúce: nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc - 0,15 pg/ml; pri 40-násobnom molámom nadbytku acetylovaný Fltl (1 -3)-Fc -1,5 pg/ml; a Mutl: Flt( 1 -3ab)-Fc - 0,7 pg/ml.
Príklad 17: Konštrukcia vektora pre modifikovaný Fltl receptor
Konštrukcia modifikovanej verzie Fltl receptora (tiež známeho ako VEGFR1) bola uskutočnená na základe pozorovania, že proteínová sekvencia Fltl je značne bázická, a preto je pravdepodobné, že sa bude via zať na extracelulámu hmotu (ECM). Vysoko bázický charakter Fltl pravdepodobne vysvetľuje to, prečo má nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc (opísaný skôr) zlé farmakokinetické vlastnosti, ktoré spôsobujú ťažkosti pri jeho použití ako terapeutického činidla. Ako bolo opísané, chemicky modifikovaná forma pri 40-násobnom molámom nadbytku acetylovaného Fltl(l-3)-Fc, ktorá je tu označená ako A40, vykazuje značne vylepšenú farmakokinetiku vzhľadom na neacetylovaný Fltl(l-3)-Fc. Preto boli uskutočnené pokusy prípravy upravených DNA molekúl, ktoré môžu byť použité na rekombinantnú expresiu modifikovaných foriem Fltl receptora, ktoré by mali mať lepší farmakokinetický profil A40 a zároveň by si zachovávali schopnosť väzby VEGF.
Z literatúry je známe, že prvá Ug doména Fltl (ktorá má náboj +5 pri neutrálnom pH) nie je zásadná pre tesnú väzbu na VEGF, preto je táto doména deletovaná. Tretia Ig doména (majúca náboj +11) nie je zásadná pre väzbu, ale dodáva vyššiu afinitu pre VEGF ako druhá Ig doména, takže namiesto úplného deletovania bola nahradená ekvivalentnými doménami receptora príbuzného Fltl, ktorým bol Flkl (tiež známy ako VEGFR2) a Flt4 (tiež známy ako VEGFR3). Tieto chimérické molekuly (označené R1R2 (Fltl.D2.FlklD3.FcACl(a) a VEGFRlR2-Fc-ACl(a) a VEGFRlR3-Fc-ACl(a), v príslušnom poradí, kde R1 a FltlD2 = Ig doména 2 Fltl (VEGFR1); R2 a FlklD3 = Ig doména 3 Flkl (VEGFR2); a R3 a VEGFR3D3 = Ig doména 3 Flt4 (VEGFR3)) majú oveľa menšiu väzbu na ECM, ako bolo potvrdené in vitro testom väzby na ECM, ako je opísaný ďalej, mali značne zlepšenú farmakokinetiku, ako je opísané ďalej. Ďalej, tieto molekuly boli schopné pevne sa viazať na VEGF, ako je opísané ďalej a blokovať fosforyláciu prirodzeného Flkl receptora exprimovaného v endotelových bunkách, ako je opísané ďalej.
(a) Konštrukcia expresného plazmidu pFltl.D2.FlklD3.FcACl(a)
Expresné plazmidy pMT21.Fltl(l-3)-Fc (6519 bp) a pMT21.Fltl(l-3)-Fc (5230 bp) sú plazmidy, ktoré kódujú rezistenciu na ampicilín a Ig domény 1-3 ľudského Fltl a ľudského Fltl s naviazaným Fc, v príslušnom poradí. Tieto plazmidy boli použité na konštrukciu DNA fragmentu skladajúceho sa z fúzie Ig domény 2 Fltl s Ig doménou 3 Flkl, s použitím PCR amplifíkácie príslušných Ig domén, po ktorej nasledovalo ďalšie kolo PCR na uskutočnenie fúzie dvoch domén do jediného fragmentu. Pre Ig doménu 2 Fltl boli 5' a 3' amplifikačné priméry nasledujúce;
5': bsp/fltlD2 (5 -GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')
3': Fltld2-Flkld3.as (5'-CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3')
5' amplifikačné priméry kódujú reštrikčné miesto na BspEl enzým pred Ig doménou 2 Fltl, ktoré je definované aminokyselinovou sekvenciou GRPFVEM (zodpovedajúce aminokyselinám 27-33 obr. 21A-21C). 3' primér kóduje reverzný komplement 3' konca Fltl Ig domény 2 fuzovaný priamo na 5' začiatok Flkl Ig domény 3, s fúziou v mieste definovanom ako Fltl (zodpovedajúcim aminokyselinám 123-126 obr. 21A-21C) a pokračujúcim do VVLS (zodpovedajúcim aminokyselinám 127-130 obr. 21A-21C) Flkl.
Pre Ig doménu 3 Flkl boli 5' a 3' amplifikačné priméry nasledujúce:
5': FltlD2-FlklD3.s (5'-ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG- 3')
3': FlklD3/apa/srf.as (5 '-GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG- 3')
5' amplifikačný primér kóduje koniec Fltl Ig domény 2 fuzovaný priamo na začiatok Flkl Ig domény 3, ako bolo opísané. 3' amplifikačný primér kóduje koniec Flkl Ig domény 3, definovaný aminokyselinami VRVHEK (zodpovedajúcimi aminokyselinám 223-228 obr. 21A-21C), po ktorých nasleduje premosťujúca sekvencia, ktorá zahŕňa rozpoznávaciu sekvenciu pre reštrikčný enzým Srfl a ktorá kóduje aminokyseliny GPG. Premosťujúca sekvencia zodpovedá aminokyselinám 229-231 obr. 21A-21C.
Po kole PCR amplifíkácie na produkciu jednotlivých domén sa produkty zmiešali v skúmavke a podrobili sa ďalšiemu kolu PCr s primérmi bsp/fltlD2 a FlklD3/apa/srf.as (opísanými skôr) za získania fuzneho produktu. Tento PCR produkt bol potom trávený reštrikčnými enzýmami BspEl a Smal a získaný 614 bp fragment bol subklonovaný do BspEl až Srfl reštrikčných miest vektora pMT21/B2Fc, za získania plazmidu pMT21/FltlD2.FlkD3.Fc. Nukleotidová sekvencia FltlD2-FlklD3 génového fuzneho inzertu bola verifikovaná štandardnou analýzou sekvencie. Tento plazmid bol potom trávený reštrikčnými enzýmami EcoRI až Srfl a získaný 702 bp fragment bol prenesený do EcoRI až Srfl reštrikčných miest plazmidu pFltl(l-3)B2-FcACl(a) za získania plazmidu pFltlD2.FlklD3.FcACl(a). Kompletná DNA a odvodená aminokyselinová sekvencia chimérickej molekuly FltlD2.FlklD3.Fc.ACl(a) sú uvedené na obr. 21A-21C.
(b) Konštrukcia expresného plazmidu pFltlD2VEGFRD3FcACl(a)
Expresný plazmid pMT21.Fltl(l-3)-Fc (6519 bp) je plazmid, ktorý kóduje rezistenciu na ampicilín a Ig domény 1-3 ľudského Fltl receptora s naviazaným Fc. Tento plazmid bol použitý na konštrukciu DNA fragmentu obsahujúceho Ig doménu 2 Fltl s použitím PCR. RNA z bunkovej línie HEL921.7 bola použitá na produkciu Ig domény 3 Flkl, s použitím štandardného PCR. Ďalšie kolo PCR amplifikácie bolo použité na uskutočnenie fúzie dvoch Ig domén do jediného fragmentu. Pre Ig doménu 2 Fltl boli 5' a 3' amplifíkačné priméry nasledujúce:
5': bsp/fltlD2 (5 '-GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3')
3': FltlD2.VEGFR3D3.as (5'-TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT)
5' amplifikačný primér kóduje reštrikčné miesto na BspEl enzým pred Ig doménou 2 Fltl, ktoré je definované aminokyseíinovou sekvenciou GRPFVEM (zodpovedajúce aminokyselinám 27-33 obr. 21A-21C). 3' primér kóduje reverzný komplement konca Fltl Ig domény 2 fuzovaný priamo na 5' začiatok VEGFR3 Ig domény 3, s fúziou v mieste definovanom ako TIID Fltl (zodpovedajúcim aminokyselinám 123-126 obr. 22A-22C) a pokračujúcim do IQLL VEGFR3 (zodpovedajúcim aminokyselinám 127-130 obr. 22A-22C).
Pre Ig doménu 3 VEGFR3 boli 5' a 3' amplifíkačné priméry nasledujúce:
5': R3D3.S (5'-ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTGGTA)
3': R3D3.as (5'-ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)
5' a 3' amplifíkačné priméry zodpovedajú sekvencií VEGFR3. 296 bp produkt amplifikácie tejto RTPCR reakcie bol izolovaný štandardnými technikami a bol spracovaný druhým kolom PCR na pridanie vhodných sekvencií na umožnenie fúzie FLT1D2 s FlklD3 doménami a fúzie FlklD3 a Fc domén prostredníctvom GPC mostíka (pozri ďalej). Amplifíkačné priméry boli nasledujúce:
5': FltlD2.VEGFR3D3.as (TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG)
3': VEGFR3D3/srf.as (GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT)
5' amplifikačný primér kóduje 3' koniec Fltl Ig domény 2 fuzovaný priamo na začiatok (5' koniec) VEGFR3 Ig domény 3, ako bolo opísané. 3' amplifikačný primér kóduje 3' koniec VEGFR3 Ig domény 3, definovaný aminokyseiinami VIVHEN (zodpovedajúcimi aminokyselinám 221-226 obr. 22A-221C), po ktorých nasleduje premosťujúca sekvencia, ktorá zahŕňa rozpoznávaciu sekvenciu pre reštrikčný enzým Srfl a ktorá kóduje aminokyseliny GPG. Premosťujúca sekvencia zodpovedá aminokyselinám 227-229 obr. 22A-22C.
Po jednom kole (pre Fltl Ig doménu 2) alebo dvoch kolách (pre Flt4 Ig doménu 3) PCR amplifikácia na produkciu jednotlivých Ig domén sa produkty PCR zmiešali v skúmavke a podrobili sa ďalšiemu kolu PCR amplifikácie s amplifikačnými primérmi bsp/fltiD2 a VEGFR3D3/srf.as (opísanými skôr) za získania fuzneho produktu. Tento PCR produkt bof potom trávený reštrikčnými enzýmami BspEl a Smal a získaný 625 bp fragment boi subkionovaný do BspEl až Srfl reštrikčných miest vektora pMT2f/Fltf B2.Fc (opísaného skôr), za získania plazmidu pMT21/FltlD2.VEGFR3D3.Fc. Nukleotidová sekvencia FltlD2-VEGFR3D3 génového fuzneho inzertu bola verifikovaná štandardnou anaiýzou sekvencie. Tento plazmid bol potom trávený reštrikčnými enzýmami EcoRI a Srfl a získaný 693 bp fragment bol subkionovaný do EcoRI až Srfl reštrikčných miest plazmidu pFltl(l-3)AB2-FcACl(a) za získania plazmidu pFltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Kompletné DNA a odvodená aminokyselinová sekvencia chimérickej molekuly FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) sú uvedené na obr. 22A-22C.
Príklad 18: Test väzby na medzibunkovú hmotu (ECM)
Platne potiahnuté ECM (Becton Dickinson katalógovej č. 35-4607) boli rehydratované teplým DME doplneným glutamínom (2 mM), 100 U penicilínu, 100 U streptomycínu a 10 % BCS počas aspoň 1 hodiny pred pridaním vzoriek. Platne sa potom inkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti s rôznymi koncentráciami FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) s prvou hodnotou 10 nM a potom s 2-násobným riedením v PBS plus 10 % BCS. Platne sa potom premyli 3-krát PBS plus 0,1 % Tritón-X a inku bovali sa s protilátkou proti ľudskému Fc konjugovanou s alkalickou fosfatázou (Promega, 1: 4000 v PBS plus 10 % BCS) počas 1 hodiny pri teplote miestnosti. Platne sa potom premyli 4-krát PBS s 0,1 % Tritón-X a pridal sa pufer na alkalickú fosfatázu/pNPP roztok (Sigma) na vývoj sfarbenia. Platne sa odčítali pri I = = 405-507 nm. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 23 a demonštrujú, že FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) proteíny sa významne menej viažu na ECM v porovnaní s Fltl(1 -3)-Fc proteínom.
Príklad 19: Dočasná expresia FltlD2.FlklD3.FcACl(a) v CHO-K1 (E1 A) bunkách
Veľkoobjemová (2 1) kultúra E.coli DH10B nesúcich pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) plazmid opísaný v príklade 17 (a) sa kultivovala cez noc v Terrific Broth (TB) plus 100 pg/ml ampicilínu. Ďalší deň sa plazmidová DNA extrahovala s použitím QIAgen Endofree Megaprep kitu podľa návodu výrobcu. Koncentrácia prečistenej plazmidovej DNA sa určila štandardnými technikami s použitím UV spektrofotometra a fluorometra. Plazmidová DNA sa verifikovala štandardným trávením podielov reštrikčnými enzýmami s použitím reštrikčných enzýmov EcoRI plus Nôti a Asel. Všetky fragmenty získané trávením reštrikčnými enzýmami mali predpokladanú veľkosť pri analýze na 1 % agarózovom géli.
V 14 15 cm Petriho miskách sa kultivovali CHO-K1/E1A bunky s hustotou 4xl06 buniek/platňa. Kultivačným médiom bolo Gibco Ham's F-12 doplnené 10 % Hyclone fetálnym hovädzím sérom (FBS), 100 U penicilínu/100 U streptomycínu a glutamínom (2 mM). Nasledujúci deň bola každá platňa buniek transfektovaná 6 pg pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) plazmidové DNA s použitím Gibco Optimom a Gibco Lipofectamine v objeme 12 ml, podľa návodu výrobcu. 4 hodiny po pridaní transfekčnej zmesi k bunkám sa pridalo 12 ml/platňa Optimom doplneného 10 % FBS. Platne sa inkubovali pri teplote 37 °C v inkubátore s 5 % CO2 cez noc. Nasledujúci deň sa z každej platne odstránilo médium a pridalo sa 25 μΐ expresného média (Gibco CHO-S-SFM-II doplnené glutamínom (2 mM) a 1 mM nátrium-butyrátom). Plame sa inkubovali pri teplote 37 °C počas 3 dní. Po 3 dňoch inkubácie sa z každej platne ašpirovalo médium, ktoré sa odstredilo pri 400 rpm v odstredivke s húpajúcou sa komorou na účely peletovania buniek. Supematant sa dekantoval do sterilných 1 litrových baniek a prečistenie exprimovaného proteínu sa uskutočnilo spôsobom opísaným ďalej.
Príklad 20: Konštrukcia pVEGFRlR2-FcACl(a) expresného vektora
Expresný plazmid pVEGFRlR2-FcACl(a) bol konštruovaný inzerciou DNA kódujúci aminokyseliny SDT (zodpovedajúci aminokyselinám 27-29 na obr. 24A-24C) medzi Fltld2-Flkld3-FcACl(a) aminokyseliny 26 a 27 podľa obr. 21A-21C (GG) a odstránením DNA kódujúcej aminokyseliny GPG zodpovedajúce aminokyselinám 229-231 obr. SDT aminokyselinová sekvencia je prirodzená pre Fltl receptor a bola vrátená na zníženie pravdepodobnosti heterogénneho N-koncového spracovania. GPG (premosťujúce sekvencie) bola odstránená, takže Fltl a Flkl Ig domény boli fuzované priamo jedna na druhú. Kompletné DNA a odvodená aminokyselinová sekvencia pVEGFRlR2-FcACl (a) chimérickej molekuly sú uvedené na obr. 24A-24C.
Príklad 21: Kultivácia buniek použitá na produkciu modifikovaných Fltl receptorov (a) Kultivácia buniek použitá na produkciu FltlD2.FlklD3.FcACl(a)
Proces na produkciu FltlD2.FlklD3.FcACl(a) proteínu s použitím expresného plazmidu pFltlD2.FlklD3.FcACl(a) opísaného v príklade 1 zahrňoval suspenznú kultiváciu rekombinantných ovariálnych buniek čínskeho škrečka (CHO-K1/E1A), ktoré konštitutívne exprimujú proteínový produkt. Bunky sa kultivovali v bioreaktoroch a proteínový produkt sa izoloval a prečistil afinitnou chromatografiou a chromatografiou s vylučovaním podľa veľkosti. Proces je podrobne opísaný ďalej.
Expanzia buniek
Dve konfluentné T-225 cm2 skúmavky obsahujúce bunkovú líniu exprimujúcu FltlD2.FlklD3.FcACl(a) sa expandovali pasážovaním buniek do 8 T-225 cm2 skúmaviek v médiu (GMEM + 10 % sérum, GIBCO) a inkubovaním pri 37 °C a 5 % CO2. Keď bola dosiahnutá požadovaná konfluencia (približne za 3 až 4 dni), tak sa bunky oddelili s použitím trypsínu. Čerstvé médium sa pridalo na chránenie buniek pred ďalším pôsobením trypsínu. Bunky sa odstredili a resuspendovali sa v čerstvom médiu a potom sa preniesli do 8 850 cm2 valcových skúmaviek a inkubovali sa pri 37 °C a 5 % CO2 na dosiahnutie konfluencie.
Suspenzná kultúra v bioreaktoroch
Bunky kultivované vo valcovitých skúmavkách sa trypsinizovali na uvoľnenie od povrchu a premyli sa suspenziou kultivačného média. Bunky sa aseptický preniesli do 5 1 bioreaktora (New Brunswick Celligen Plus), kde sa kultivovali v 3,5 litrovej suspenznej kultúre. Suspenzným kultivačným médiom boli bezglutamínové IS-CHO s nízkym obsahom glukózy (Irvine Scientific), do ktorého sa pridalo 5 % fetálne hovädzie sérum (Hyclone), GS doplnok (Life Technologies) a 25 μΜ metionín sulfoximínu (Sigma). pH sa udržovalo na 7,2 pomocou pridávania oxidu uhličitého do dodávaného plynu alebo pridaním kvapalného roztoku uhličitanu sodného do bioreaktora. Koncentrácia rozpusteného kyslíka sa udržovala na 30 % saturácie pomocou pridávania kyslíka alebo dusíka do dodávaného plynu a teplota sa udržovala na 37 °C. Keď sa dosiahla hustota buniek 4 x 106 buniek/ml, tak sa bunky preniesli do 40 1 bioreaktora obsahujúceho rovnaké médium a rovnaké nastavenie hodnôt. Teplota sa znížila na 34 °C na spomalenie rastu a zvýšenie relatívnej rýchlosti expresie proteínu.
(b) Kultivácia buniek použitá na produkciu FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)
Rovnaký postup, ako je postup opísaný pre FltlD2.FlklD3.FcACl(a) sa použil na produkciu FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a).
Príklad 22: Odber a prečistenie modifikovaných Fltl receptorov (a) Odber a prečistenie FltlD2.FlklD3.FcACl(a)
Proteínový produkt bol aseptický odoberaný z bioreaktora za zachytávania buniek s použitím Millipore Prostec filtračných modulov s tangenciálnym tokom a mechanickej pumpy s nízkym strihom (Fristam). Čerstvé médium sa pridalo do bioreaktora na nahradenie média odstráneného pri filtrácii. Približne 40 1 získaného filtrátu sa potom vnieslo do 400 ml kolóny obsahujúcej Proteín A Sepharose živicu (Amersham Pharmacia). Po vložení sa živica premyla pufrom obsahujúcim 10 mM fosforečnan sodný, 500 mM chlorid sodný, pH 7,2, na odstránenie akýchkoľvek nenaviazaných kontaminujúcich proteínov. FltlD2.FlklD3.FcACl(a) proteín sa eluoval citrátovým pufrom s pH 3,0. Eluovaný proteín sa neutralizoval pridaním Tris bázy a zmrazil sa pri -20 °C.
Niekoľko zmrazených šarží FltlD2.FlklD3.FcACl(a) proteínu z kroku s Proteínom A sa rozmrazilo, zmiešalo a zahustilo s použitím Millipore filtračnej membrány s tangenciálnym tokom s limitom molekulovej hmotnosti (NMWCO) 30 kD. Proteín sa preniesol do zariadenia na zahustenie buniek (Millipore) a ďalej sa zahustil na 30 mg/ml s použitím 30 kD NMWCO membrány. Zahustený proteín sa vniesol do kolóny s vylučovaním podľa veľkosti častíc naplnenej Superdex 200 živicou (Amersham Pharmacia), ktorá bola uvedená do rovnováhy fosfátom pufrovaným salinickým roztokom plus 5 % glycerolom. Rovnaký pufer bol použitý na elúciu kolóny. Frakcie zodpovedajúce FltlD2.FlklD3.FcACl(a) diméru sa zmiešali, sterilné sa prefiltrovali cez 0,22 mikrónový filter, rozdelili sa do podielov a zmrazili sa.
(b) Odber a prečistenie FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)
Rovnaký postup, ako je postup opísaný pre FltlD2.FlklD3.FcACl(a) sa použil na odber a prečistenie Fltl D2. VEGFR3D3 .FcAC 1 (a).
Príklad 23: Fosforylačný test pre dočasne exprimovaný VEGFR2
Primáme ľudské endotelové bunky pupočníkovej žily (HUVEC), pasáž 4-6, sa nechali počas 2 hodín v bezsérovom DME médiu s vysokou koncentráciou glukózy. Pripravili sa vzorky obsahujúce 40 ng/ml (1 nM) ľudského VEGF165, čo je ligand pre VEGF receptory Fltl, Flkl a Flt4 (VEGFR3) a tieto vzorky sa preinkubovali počas 1 hodiny pri teplote miestnosti s rôznymi množstvami Fltl receptorov Fit 1 (1 -3)-Fc, Fit (l-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3.FcACl(a) a FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) v bezsérovom DME s vysokou koncentráciou glukózy obsahujúcom 0,1 % BSA. Bunky sa počas 5 minút vystavili pôsobeniu vzoriek pripravených vyššie +/- VEGF 165 a potom sa uskutočnila kompletná lýza buniek s použitím pufŕa pre kompletnú lýzu buniek. Bunkové lyzáty sa imunoprecipitovali protilátkou namierenou proti C-koncu VEGFR2 receptora. Imunoprecipitované lyzáty sa vniesli na 4-12 % SDS-PAGE Novex gél a potom sa preniesli na PVDF membránu s použitím štandardnej techniky. Detekcia fosforylovaného VEGFR2 bola uskutočnená imunoprenosom s anti-fosfo-tyrozín mAb označenou 4G10 (UBI) a vývoj sa uskutočnil s použitím ECL-činidla (Amersham). Obr. 25A-25C a 26A-26B ukazujú výsledky tohto pokusu. Obr. 25A-25C ukazujú, že detekcia westemovým prenosom VEGFR2 (Flkl) s fosforylovaným tyrozínom pomocou stimulácie VEGF 16 ligandom ukazuje, že povrchové bunkové receptory sú fosforylované v rôznej miere podľa toho, ktorý modifikovaný Fltl receptor je použitý v priebehu preinkubácie s VEGF. Ako je vidieť na obr. 25A, pri 1,5-násobnom molámom nadbytku buď Fltl(l-3)-Fc alebo Fltl(l-3)-Fc (A40) alebo dočasného FltlD2FlklD3.FcACl(a) je prítomná kompletná blokáda stimulácie receptora týmito troma modifikovanými Fltl receptormi v porovnaní s pôsobením kontrolného média. Naopak, dočasný FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) nevykazuje pri tomto molámom nadbytku žiadnu významnú blokádu, v porovnaní s pozitívnou kontrolou, ktorou je VEGF. Podobné výsledky sú vidieť na obr. 25B, kde sú modifikované Fit receptory v 3-násobnom molámom nadbytku vzhľadom na VEGF165 ligand. Na obr. 25C, kde sú modifikované Fltl receptory v 6-násobnom molámom nadbytku vzhľadom na VEGF165 ligand, blokuje FltlD2VEGFR3D3.FcACl(a) čiastočne stimuláciu bunkových povrchových receptorov indukovanú VEGF 165.
Na obr. 26A-26B ukazuje detekcia westemovým prenosom VEGFR2 (Flkl) fosforylovaného na tyrozíne v dôsledku stimulácie VEGF 165 ligandom, že bunkové povrchové receptory nie sú stimulované vzorky, ktoré majú VEGF165 preinkubovaný s 1- a 2-násobným molámym nadbytkom (obr. 26A) alebo 3- a 4-násobným molámym nadbytkom (obr. 26B) dočasného FltlD2FlklD3.FcACl(a), stabilného FltlD2FlklD3.FcACl(a) alebo dočasného VEGFRlR2-FcACl(a). Pri všetkých testovaných koncentráciách modifikovaného Fltl receptora bola pozorovaná kompletná väzba VEGF 165 ligandu v priebehu preinkubácie, čo viedlo k nedetekovateľnej stimulácii bunkových povrchových receptorov pomocou nenaviazaného VEGF 165 v porovnaní s pôsobením kontrolného média.
Príklad 24: Test bunkovej proliferácie
Na testovanie bunkovej populácie boli MG87 bunky stabilne transfektované expresným plazmidom obsahujúcim DNA inzert kódujúci extracelulámu doménu VEGFR2 (Flkl) fuzovanú na TrkB intracelulámu kinázovú doménu, za získania chimérickej molekuly. Dôvodom použitia TrkB intracelulámej kinázovej domény namiesto prirodzenej VEGFR2 (Flkl) intracelulámej kinázovej domény bolo to, že intraceluláma kinázová doména VEGFR2 (Flkl) nespôsobuje silnú proliferačnú odpoveď týchto buniek po stimulácii VEGF165. Je známe, že MG87 bunky obsahujúce kompletný TrkB receptor majú silnú proliferatívnu odpoveď po stimulácii BDNF, a preto bola Trkb intraceluláma kinázová doména použitá na nahradenie intracelulámej kinázovej domény VEGFR (Flkl) na účely získania výhody tejto proliferačnej reakcie.
x 103 buniek sa umiestnilo do 96-jamkovej platne a bunky sa nechali usadiť v priebehu 2 hodín pri 37 °C. Nasledujúce modifikované Fit receptory, Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) a irelevantný receptor Tie2-Fc ako negatívna kontrola, sa titrovali od 40 nM do 20 pM a inkubovali sa s bunkami počas 1 hodiny pri teplote 37 °C. Ľudský rekombinantný VEGF165 v definovanom médiu sa potom pridal do všetkých jamiek v koncentrácii 1,56 nM. Platne sa inkubovali počas 72 hodín pri teplote 37 °C a potom sa pridalo MTS (Owenové činidlo, Promega) a platne sa inkubovali počas ďalších 4 hodín. Nakoniec sa platne odčítali na spektrofotometri pri 450/570 nm. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 27. Kontrolný receptor Tie2-Fc neblokuje proliferáciu buniek indukovanú VEGF165 v žiadnej koncentrácii, zatiaľ čo FltlD2.FlklD3.FcACl(a) blokuje proliferáciu pri 1,56 nM VEGF165 s polovicou maximálnej dávky rovnejúcej sa 0,8 nM. Fltl (l-3)-Fc a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) sú menej účinné v blokovaní VEGF165 v tomto teste, s polovicou maximálnej dávky rovnajúcej sa približne 2 nM. VEGF165 sám osebe vedie na dosiahnutie absorbancie 1,2 jednotiek a pozadie je 0,38 absorbančných jednotiek.
Príklad 25: Väzbová stechiometria modifikovaných Fit receptorov pre VEGF 165 (a) Biacore analýza
Stechiometria FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a VEGFRlR2-FcACl(a) interakcie s ľudským VEGF165 sa určila meraním buď úrovne saturačnej väzby VEGF na FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2-FcACl(a) povrchy alebo meranie koncentrácie VEGF165 nutné pre kompletné blokovanie väzby FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2-FcACl(a) na povrch VEGF BIAcore čipu.
Modifikované Fit receptory FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a VEGFRlR2-FcACl(a) boli zachytené pomocou protilátky špecifickej pre Fc, ktorá bola najskôr imobilizovaná na Biacore čipe (BIACORE) s použitím amínových kopulačných činidiel. Povrch bez protilátky bol použitý ako negatívna kontrola. VEGF165 bol injikovaný v koncentrácii 1 nM, 10 nM a 50 nM na FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a VEGFRlR2-FcACl(a) povrchy v dávke 10 μΐ/min. počas jednej hodiny. Väzbový signál v reálnom čase bol meraný a na konci každej injekcie bola dosiahnutá saturačná väzba. Väzbová stechiometria bola vypočítaná ako molámy pomer naviazaného VEGF165 k imobilizovanému FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2-FcACl(a), s použitím konverzného faktora 1000 RU ekvivalentných 1 ng/ml. Výsledky ukazujú na väzbovú stechiometriu jednej VEGF165 dimérnej molekuly na jednu molekulu FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2-FcACl(a) (obr.28).
V roztoku sa FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2-FcACl(a) v koncentrácii 1 nM (čo je koncentrácia predpokladane 1000-krát vyššia ako KD FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2-FcACl(a)/VEGF165 interakcie) zmiešali s rôznymi koncentráciami VEGF165. Po jednej hodine inkubácie sa voľný FltlD2.FlklD3.FcACl(a) v roztoku stanovil ako väzbový signál na VEGF165-aminovom povrchu. Kalibračná krivka sa použila na konverziu FltlD2.FlklD3.FcACl(a) BIACORE väzbového signálu na jeho molámu koncentráciu. Dáta ukazujú, že pridanie 1 nM VEGF165 do roztoku FltlD2.FlklD3.FcACl(a) úplne blokujE väzbu FltlD2-FlklD3.FcACl(a) na VEGF165 povrch. Tento výsledok ukazuje na väzbovú stechiometriu jednej VEGF165 molekuly na jednu molekulu FltlD2.FlklD3.FcACl(a) (obr. 29 a obr. 30). Keď sa koncentrácia FltlD2.FlklD3.FcACl(a) vniesla do grafu ako funkcia pridanej koncentrácie VEGF165, tak bol sklon lineárnej časti -1,06 pre FltlD2.FlklD3-FcACl(a) a -1,07 pre VEGFRlR2-FcACl(a). Veľkosť sklonu, veľmi blízka mínus jednej, ukazovala na väzbu jednej molekuly VEGF165 na jednu molekulu buď FltlD2.FlklD3.FcACl(a), alebo VEGFRlR2-FcACl(a).
(b) Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc
FltlD2.FlklD3.FcACl(a) sa zmiešal s 3-násobným nadbytkom VEGF165 a komplex ligand-receptor sa prečistil s použitím Pharmacia Superose 6 chromatografickej kolóny s vylučovaním podľa veľkosti častíc. Komplex ligand-receptor sa potom inkuboval v pufri obsahujúcom 6M guanidínium hydrochlorid pre disociáciu do jednotlivých proteínových zložiek. FltlD2.FlklD3.FcACl(a) sa separoval od VEGF165 s použitím Superose 6 chromatografickej kolóny s vylučovaním podľa veľkosti častíc eluované 6M guanidínium chloridom. Na určenie stechiometrie komplexu sa uskutočnilo niekoľko injekcií FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a VEGF165 a výška piku alebo integrovaná intenzita piku sa vniesla do grafu ako funkcia koncentrácie injikovaného proteínu. Kalibrácia sa uskutočnila za podmienok identických podmienkam použitým na separovanie zložiek komplexu FltlD2.FlklD3.FcACl(a)/VEGF. Kvantifikácia zloženia komplexu FltlD2.FlklD3.FcACl(a)/VEGF sa uskutočnila podľa kalibračných kriviek. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 28, ktorý ukazuje, že pomer VEGFI65 kFltlD2.FlklD3.FcACl(a) vkomplexe je 1: 1.
Príklad 26: Určenie väzbovej stechiometrie komplexu FltlD2.FlklD3.FcACl(a)/ VEGF165 pomocou chromatografíe s vylučovaním podľa veľkosti častíc
Príprava komplexu FltlD2.FlklD3.FcACl(a)/VEGF165
VEGF165 (koncentrácia = 3,61 mg/ml) sa zmiešal s CHO bunkami dočasne exprimujúcimi FltlD2.FlklD3.FcACl(a) (koncentrácia = 0,9 mg/ml) v molámom pomere 3 :1 (VEGF165 : FltlD2.FltlD2.FlkID3.FcACl(a)) a uskutočnila sa inkubácia cez noc pri teplote 4 °C.
(a) Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc (SEC) pri natívnych podmienkach.
Na separovanie komplexu od nadbytku nenaviazaného VEGF165 sa 50 μΐ komplexu vnieslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolóny, ktorá sa uviedla do rovnováhy v PBS pufri. Vzorka sa eluovala rovnakým pufrom pri prietoku 40 μΐ/min. pri teplote miestnosti. Výsledky tejto SEC sú uvedené na obr. 31. Pík 1 predstavuje komplex a pík 2 predstavuje nenaviazaný VEGF165. Frakcie eluované medzi 1,1 a 1,2 ml sa zmiešali a guanidínium chlorid (GuHCl) sa pridal v konečnej koncentrácii 4,5 M na disociovanie komplexu.
(b) Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc (SEC) pri disociačných podmienkach
Na separovanie zložiek komplexu receptor-ligand a na určenie ich molárneho pomeru sa 50 μΐ disociovaného komplexu opísaného skôr vnieslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolóny, ktorá sa uviedla do rovnováhy pomocou 6M GuHCl a eluovala sa rovnakým roztokom pri prietoku 40 μΙ/mm. pri teplote miestnosti. Výsledky tejto SEC sú uvedené na obr. 32. Pík 1 predstavuje FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a pík 2 predstavuje VEGF 165.
(c) Výpočet stechiometrie komplexu FltlD2.FlklD3.FcACl(a)/VEGF165
Stehiometria komplexu receptor-ligand sa určila z plochy piku alebo výšky piku zložiek. Koncentrácie VEGF165 alebo FltlD2.FlklD3.FcACl(a) zodpovedajúce výške piku alebo ploche piku, v príslušnom poradí, sa získali zo štandardných kriviek pre VEGF165 a FltlD2.FlklD3.FcACl(a). Na získanie štandardnej krivky sa 4 rôzne koncentrácie (0,04 mg/ml - 0,3 mg/ml) jednej zo zložiek injikovali do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolóny, ktorá sa uviedla do rovnováhy pomocou 6M GuHCl a eluovala sa rovnakým roztokom pri prietoku 40 μΐ/min. pri teplote miestnosti. Štandardná krivka sa získala zostrojením grafu plocha piku alebo výška piku vs koncentrácia proteínu. Molámy pomer VEGF165 : FltlD3.FcACl(a) určený z výšky piku zložiek bol 1,10.
Príklad 27: Určenie väzbovej stechiometrie komplexu FltlD2.FlklD3.FcACl(a)/ VEGF 165 pomocou chromatografie s vylučovaním podľa veľkosti častíc s on-line detektorom rozptylu svetla
Príprava komplexu
VEGF165 sa zmiešal s CHO bunkami dočasne exprimujúcimi FltlD2.FlklD3.FcACl(a) v molárnom pomere 3 : 1 (VEGF165 : FltlD2.FlklD3.FcACl(a)) a uskutočnila sa inkubácia cez noc pri teplote 4 °C.
(a) Chromatografia s vylučovaním podľa veľkosti častíc (SEC) s on-line detektorom rozptylu svetla
Chromatografická kolóna s vylučovaním podľa veľkosti častíc s Mini-Dawn on-line detektorom rozptylu svetla (Wyatt Technology, Šanta Barbara, Califomia) a detektory indexu lomu (RI) (Shimadzu, Kyoto, Japan) sa použila na stanovenie molekulovej hmotnosti (MW) komplexu receptor-ligand. Vzorky sa injikovali do Su perose 12 HR 10/30 kolóny, ktorá sa uviedla do rovnováhy v PBS pufri a eluovali sa rovnakým pufrom pri prietoku 0,5 ml/min. pri teplote miestnosti. Ako je uvedené na obr. 33, vykazoval elučný profil dva piky. Pík 1 predstavuje komplex ligand-receptor a pík 2 predstavuje nenaviazaný VEGF165. Mol. hmotn. bola vypočítaná z LS a RI signálov. Rovnaký postup sa použil na stanovenie mol. hmotn. jednotlivých zložiek komplexu ligand-receptor. Výsledky týchto meraní sú nasledujúce: mol. hmotn. komplexu FltlD2.FlklD3.FcACl(a)/VEGF165 v pikovej pozícii je 157300 (obr. 33), mol. hmotn. VEGF165 v pikovej pozícii je 44390 (obr. 34) a mol. hmotn. R1R2 v piku je 113300 (obr. 35).
Tieto dáta ukazujú, že stechiometria komplexu FltlD2.FlklD3.FcACl(a)/VEGF je 1 : 1, pretože to zodpovedá súčtu molekulových hmotností pre FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a VEGF165. Dôležité je to, že táto metóda overila, že komplex FltlD2.FlklD3.FcACl(a)/VEGF165 sa skladá z iba jednej molekuly VEGF165 ligandu a iba jednej molekuly FltlD2.FlklD3.FcACl(a).
Príklad 28: Peptidové mapovanie FltlD2.FlklD3.FcACl(a)
Disulfidové štruktúry a glykozylačné miesta vo FltlD2.FlklD3.FcACl(a) sa určili metódou peptidového mapovania. V tejto metóde sa proteín najskôr štiepil trypsínom. Získané fragmenty sa analyzovali a identifikovali HPLC spoločne s hmotnostnou spektrometriou a ďalej tiež technikou N-terminálneho sekvenovania. Redukcia trávenia trypsínom sa použila na identifikáciu fragmentov obsahujúcich disulfidové väzby. Spracovanie produktov trávenia trypsínom PNGázou (Glyko, Novato, Ca) sa použilo na identifikáciu fragmentov s N-viazanými glykozylačnými miestami. Výsledky sú zhrnuté na obr. 36.
Vo FltlD2.FlklD3.FcACl(a) existuje celkom 10 cysteínov; 6 z nich je prítomné v Fc regióne. Bolo potvrdené, že Cys27 je disulfidovo viazaný na Cys76. Bolo potvrdené, že cysl21 je disulfidovo viazaný na Cys 182. Prvé dva cysteíny vo Fc regióne (Cys211 a Cys214) tvoria intermolekulovú disulfidovú väzbu s rovnakými dvoma cysteínmi v inom Fc reťazci. Ale, pretože tieto dva cysteíny nemôžu byť od seba enzýmovo separované, nemôže byť určené, či existuje disulfidová väzba medzi rovnakými cysteínmi (napríklad Cys211-Cys211) alebo medzi Cys211 a Cys214. Bolo potvrdené, že Cys216 je disulfidovo viazaný na Cys306. Bolo potvrdené, že Cys352 je disulfidovo viazaný na Cys410.
Vo FltlD2.FlklD3.FcACl(a) existuje 5 potenciálnych N-glykozylačných miest. Všetkých 5 miest je v rôznom rozsahu glykozylovaných. Kompletná glykozylácia bola zistená na Asn33 (aminokyselinová sekvencia NIT), Asnl93 (aminokyselinová sekvencia NST) a Asn282 (aminokyselinová sekvencia NST). Ďalej bola zistená čiastočná glykozylácia na Asn65 a Asnl20. Miesta glykozylácie sú podčiarknuté na obr. 36.
Príklad 29: Farmakokinetická analýza modifikovaných Fit receptorov (a) Farmakokinetická analýza Flt(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a VEGFRlR2-FcACl(a)
Balb/c myšiam (25-30 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), CHO dočasne exprimujúcich FltlD2.FlklD3.FcACl(a), CHO stabilne exprimujúcich FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a CHO dočasne exprimujúcich VEGFRlR2-FcACl(a). Myšiam sa odoberala krv z chvosta 1, 2, 4, 6, 24 hodín, 2 dni, 3 dni a 6 dní po injekcii. Sérum sa testovalo v ELISA navrhnutom na detekciu Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2-FcACl(a). ELISA test zahŕňa potiahnutie ELISA platne VEGF165, väzbu Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo VEGFRlR2-FcACl(a) a zobrazenie antiFc protilátkou naviazanou na chrenovú peroxidázu. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 37. Tniax pre Fltl(l-3)-Fc (A40) bol 6 hodín, zatiaľ čo Tniax pre dočasne a stabilne exprimovaný FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a dočasne exprimovaný FltlD2.FlklD3.FcACl(a) boli 24 hodín. Cniax pre Fltl(l-3)-Fc (A40) bola 8 pg/ml. Pre dočasne exprimované peptidy (FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a VEGFRlR2-FcACl(a)) boli Cniax 18 pg/ml a pre stabilne exprimovaný VEGFRlR2-FcACl(a) bola Clnax 30 pg/ml.
(b) Farmakokinetická analýza Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a)
Balb/c myšiam (25-30 g) sa podkožnou injekciou podali 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), CHO dočasne exprimujúcich FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a CHO dočasne exprimujúcich FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Myšiam sa odoberala krv z chvosta 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12,15 a 20 dní po injekcii. Sérum sa testovalo v ELISA navrhnutom na detekciu Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). ELISA test zahŕňa potiahnutie ELISA platne VEGF165, väzbu Fltl(l-3)-Fc, FltlD2.FlklD3.FcACl(a) alebo FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) a zobrazenie anti-Fc protilátkou naviazanou na chrenovú peroxidázu. Fltl (1 -3)-Fc (A40) nemohol byť detekovaný v sére po 5. dni, zatiaľ čo FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) boli detekovateľné po 15 dňoch a dlhšie. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 38.
Príklad 30: Hodnotenie schopnosti FltlD2.FlklD3.FcACl(a) inhibovať rast nádoru in vivo
Na hodnotenie schopnosti FltlD2.FlklD3.FcACl(a) inhibovať rast nádoru in vivo sa použil model, v ktorom je suspenzia nádorových buniek implantovaná podkožné do pravej labky samcov myší s ťažkou kombi novanou imunodeficienciou (SCID). V tomto teste sa použili dve bunkové línie, ľudská HT-1080 fibrosarkómová bunková línia (ATCC prírastkové č. CCL-121) a potkania C6 gliómová bunková línia (ATCC prírastkové č. CCL-107), ktoré majú značne odlišné morfologické a rastové charakteristiky. Prvá dávka FltlD2.FlklD3.FcACl(a) (25 mg/kg alebo v dávke uvedenej na obr. 39 a 40) sa podala v deň implantácie nádoru. Zvieratám sa potom podávali podkožnou injekciou Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.Flkl D3.FcACl(a) alebo vehikulum buď každý druhý deň (EOD) alebo dvakrát týždenne (2x/týždenne) počas 2 týždňov. Po 2 týždňoch sa zvieratá fixovali, odobrali sa nádory a vzorky sa zaslepili. Objem nádorov sa meral pomocou merania dĺžky a šírky viditeľných podkožných nádorov. Ako Fltl(l-3)-Fc (A40), tak FltlD2.FlklD3.FcACl(a) významne redukovali rast nádorov tvorených HT-1080 a C6 bunkami. Výsledky týchto pokusov sú uvedené na obr. 39 a 40.
Príklad 31: Efekt VEGF 165 a modifikovaných Fit receptorov na samičí reprodukčný systém
Stereotypný charakter cievnej prestavby, ku ktorej dochádza v maternici a ováriu v priebehu reprodukčného cyklu, bol dobre charakterizovaný, čo robí toto tkanivo veľmi vhodné na testovanie mechanizmov, ktoré regulujú angiogenézu, cievnu prestavbu a regresiu ciev. Ďalej, pokusy s hybridizáciou reprodukčných tkanív in situ poskytli jasné dôkazy, že EVGF pôsobí ako mediátor fyziologickej angiognézy pri zdravých hlodavcoch, rovnako ako u človeka a ostatných primátov (Phillips et al., 1990; Ravindranath et al., 1992; Shweiki et al., 1993; Kamat et al., 1995). Pretože sú cyklická angiogenéza a cievna prestavba význačnými rysmi normálnych vaječníkov a maternice, nie je prekvapivé, že abnormálny rast ciev a/alebo dysfúnkcie ciev charakterizujú mnohé patologické stavy, ktoré postihujú tieto orgány. Ďalej, sa predpokladá, že tieto patogénne cievne abnormality sú spôsobené alebo podporované dysregulovaňou expresiou jedného alebo viac angiogénnych alebo anti-angiogénnych faktorov hlavne VEGF.
Napríklad je abnormálna angiogenéza charakteristická pre polycystické ováriá, endometriózu a karcinóm endometria a pri každom z týchto ochorení je VEGF nadmerne exprimovaný v postihnutom tkanive (Kamat et al., 1995; Shifren et al., 1996; Guidi et al., 1996; Donnez et al., 1998). Predpokladá sa, že nadmerná expresia VEGF hrá patogénnu úlohu pri vzniku cievnej hyperpermeability pri ovariálnom hyperstimulačnom syndróme (McClure et al., 1994; Levin et al., 1998) a preeklampsii (Baker et al., 1995; Sharkey et al., 1996). Ďalej, VEGF sa považuje za faktor permeability zodpovedný za produkciu ascitu asociovaného s karcinómom ovária a inými nádormi (Senger et al., 1983; Boocock et al., 1995). Činidlá, ktoré účinne neutralizujú biologické účinky VEGF, môžu mať terapeutický prínos pri uvedených a podobných stavoch.
Angiogenéza a cievna prestavba sú tiež charakteristikami implantácie blastocystov a vývoja placenty (Findlay, 1986). VEGF je silne exprimovaný tak v matemálnej lamina decidua, ako aj v embryonálnom trofoblaste, kde sa predpokladá, že najskôr stimuluje expanziu a hyperpermeabilitu cievnej vaskulatúry v priebehu periimplantačného obdobia, a potom sprostredkuje tvorbu materských a embryonálnych zložiek placentámej vaskulatúry (Schweiki et al., 1993; Cullinan-Bove and Koos, 1993; Chakraborty et al., 1995; Das et al., 1997). VEGF je tiež nutné pre luteálnu angiogenézu a s ňou spojenú sekréciu progesterónu nutnú na prípravu maternice na implantáciu (Ferrara et al., 1998). Preto môžu byť činidlá inhibujúce biologické účinky VEGF použiteľné ako antikoncepčné činidlá (tým, že bránia implantácii), alebo ako Činidlá spôsobujúce potraty v skorých štádiách gestácie. Druhé uvedené použitie môže byť najmä významné pri nechirurgickom ukončení ektopických tehotenstiev.
Hoci je expresia VEGF receptorov obmedzená najmä na cievny endotel v normálnom reprodukčnom tkanive, je Fltl exprimovaný tiež trofoblastami v placente tak ľudí, ako aj iných zvierat (Clark et al., 1996; He et al., 1999), kde sa predpokladá, že sa podieľa na invázii trofoblastu. Zaujímavé je, že tak Fltl, ako i KDR (Flkl) sú exprimované choriokarcinómovou bunkovou líniou BeWo (Chamock-Jones et al., 1994) a bolo preukázané, že VEGF podporuje syntézu DNA a fosforyláciu tyrozínu MAP kinázy v týchto bunkách. Ďalej, metastázujúce ovariálne karcinómy nielen exprimujú vysoké koncentrácie VEGF, ale - okrem cievneho endotelu - nádorové bunky exprimujú KDR a/alebo Fltl (Boocock et al., 1995). Tieto zistenia naznačujú, že VEGF sa môže nielen zásadne podieľať na tvorbe a udržiavaní cievnej vaskulatúry, ale že aspoň pri niektorých nádoroch môže mať VEGF samotnú autokrinnú úlohu a môže priamo podporovať prežívanie a proliferáciu nádorových buniek. Preto môžu mať činidlá blokujúce účinky VEGF najmä výhodné účinky pri liečbe nádorov reprodukčných orgánov.
Metódy a výsledky (a) Hodnotenie maternicovej hyperpermeability indukovanej VEGF
Sérový gonadotropín žrebných kobýl (PMSG) sa podkožnou injekciou (5 IU) aplikoval na účely indukcie ovulácie u prepubertálnych krysích samíc. Toto viedlo k vzostupu estradiolu po 2 dňoch, čo nakoniec spôsobilo indukciu VEGF v maternici. Je opísané, že táto indukcia vedie k hyperpermeabilite maternice a zvyšuje hmotnosť maternice o 6 hodín neskôr a tento účinok môže byť potenciálne blokovaný modifikovanými Fit receptormi Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). V tomto modeli in vivo je normálna hmotnosť krysej maternice približne 50 mg a PMSG môže indukovať zvýšenie hmotnosti na 350 mg. Sušením tkaniva sa ukáže, že toto zvýšenie hmotnosti je úplne spôsobené vodou. Podkožná injekcia Fltl(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcACl(a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a) v dávke 25 mg/kg za 1 hodinu po injekcii PMSG vedie k približne 50 % inhibícii zvýšenia hmotnosti maternice. Zvýšenie dávky modifikovaných Fit receptorov ďalej neredukuje zvýšenie maternice, čo naznačuje, že v tomto modeli existuje zložka nezávislá od VEGF. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 41.
(b) Hodnotenie angiogenézy v corpus luteum s použitím progesterónu ako sledovanej hodnoty
Sérový gonadotropín žrebných kobýl (PMSG) sa podkožnou injekciou (5 IU) aplikoval na účely indukcie ovulácie u prepubertálnych krysích samíc. Toto viedlo po 4 dňoch k vzniku úplne funkčného corpus luteum obsahujúceho hustú sieť ciev, ktorá umožňovala sekréciu progesterónu do krvného riečiska na účely prípravy maternice na implantáciu. Indukcia angiogenézy v corpus luteum vyžaduje VEGF; blokovanie VEGF teda povedie k chýbaniu nových krvných ciev a tak k nedostatku progesterónu secemovaného do krvného riečiska. V tomto modeli in vivo sú pokojové hladiny progesterónu približne 5 ng/ml a pomocou PMSG môžu byť indukované hodnoty 25-40 ng/ml. Podkožná injekcia Fltl(l-3)-Fc (A40) alebo FltlD2-FlklD3.FcACl(a) v dávke 25 mg/kg alebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekcii PMSG vedie ku kompletnej inhibícii indukcie progesterónu v deň 4. Výsledky tohto pokusu sú uvedené na obr. 42A-42B.
Príklad 33: Farmakokinetické analýzy Fltl(l-3)-Fc (A40) a pegylovaného Fltl(l-3)-Fc
Fit 1 (1 -3)-Fc bol PEGylovaný buď pomocou 10 kD PEG, alebo 20 kD PEG a bol testovaný na Balb/c myšiach na zistenie jeho farmakokinetického profilu. Bolo zistené, že obidve pegylované formy Fltl(l-3)-Fc majú oveľa lepšie farmakokinetické profily ako Fit 1 (1 -3)-Fc (A40), s Tniax v 24 hodinách pre pegylované molekuly oproti 6 hodinám pre Fltl (l-3)-Fc (A40).
Príklad 34: VEGF165 ELISA na testovanie afinity modifikovaných variantov Fltl receptorov pM VEGF 165 sa inkubovalo cez noc pri teplote miestnosti s modifikovanými variantmi Fit receptorov v koncentráciách od 160 pM do 0,1 pM. Modifikovanými variantmi Fltl receptorov použitými v tomto pokuse boli Fltl(l-3)-Fc, Fltl(l-3)-Fc (A40), dočasne exprimovaný FltlD2.FlklD3.FcACl(a), dočasne exprimovaný FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a), Fltl(l-3NAS)-Fc, Fltl(l-3R^C)-Fc a Tie2-Fc. Fltl(l-3NAS)-Fc je modifikovanou verziou Fltl(l-3)-Fc, v ktorej je vysoko bázická aminokyselinová sekvencia KNKRASVRRR nahradená sekvenciou NASVNGSR, čo vedie k inkorporácii dvoch nových glykozylačných miest a k redukcii piatich pozitívnych nábojov, oboje s cieľom zníženia nežiaducich vplyvov tejto sekvencie na farmakokinetiku. Fltl(l-3R^c)-Fc je modifikáciou, v ktorej je jeden arginínový (R) zvyšok v rovnakej bázickej aminokyselinovej sekvencii zmenený na cysteín (C) (KNKRASVRRR -> KNKCASVRRR) na umožnenie pegylácie na tomto zvyšku, ktorá môže potom odlíšiť bázický región tak, že nemôže vykazovať nežiaduce účinky na farmakokinetiku. Po inkubácii sa roztok prenesie na platňu obsahujúcu zachytávaciu protilátku na VEGF 165 (RandD). Množstvo voľného VEGF 165 sa potom určí s použitím protilátky na zobrazenie voľného VEGF165. Toto ukazuje, že modifikovaným variantom Fltl receptora s najvyššou afinitou pre VEGF165 (podľa najnižšieho množstva voľného VEGF165) bola FltlD2.FlklD3.FcACl(a), potom Fltl(l-3)-Fc a Fltl(l-3)-Fc (A40) a potom Fltl(l-3R^C)-Fc, Fltl(l-3NAS)-Fc a FltlD2.VEGFR3D3.FcACl(a). Tie2-Fc nemal žiadnu afinitu pre VEGF 165.
PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (21)

1. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, ktorá obsahuje:
a) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu receptorovú zložku cievneho endotelového rastového faktora, čiže VEGF skladajúcu sa v podstate z imunoglobínu čiže Ig podobnej domény 2 prvého VEGF receptora a Ig domény 3 druhého VEGF receptora, a
b) nukleotidovú sekvenciu kódujúcu multimerizačnú zložku, kde prvým receptorom je Fltl a druhým VEGF receptorom je Flkl alebo Flt4 a VEGF receptorová zložka je jediná VEGF receptorová zložka fúzneho plypeptidu.
2. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 1, kde nukleotidová sekvencia kódujúca Ig doménu 2 extracelulámej domény prvého VEGF receptora je pred nukleotidovou sekvenciou kódujúcou Ig doménu 3 extracelulámej domény druhého VEGF receptora.
3. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 1, kde nukleotidová sekvencia kódujúca Ig doménu 2 extracelulámej domény prvého VEGF receptora je za nukleotidovou sekvenciou kódujúcou Ig doménu 3 extracelulámej domény druhého VEGF receptora.
4. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov, kde multimerizačná zložka obsahuje imunoglobulínovú doménu.
5. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 4, kde imunoglobulínová doména je vybraná zo skupiny zahrnujúcej Fc doménu IgG , ťažký reťazec IgG a ľahký reťazec IgG.
6. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 1, obsahujúca nukleotidovú sekvenciu vybranú zo skupiny zahrnujúcej:
a) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 21A až 21 C,
b) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 22A až 22C,
c) nukleotidové sekvencie uvedené na obr. 24A až 24C a
d) nukleotidové sekvencie, ktoré sa v dôsledku degenerácie genetického kódu líšia od nukleotidovej sekvencie (a), (b) alebo (c).
7. Izolovaná molekula nukleovej kyseliny podľa nároku 1, kde sú zložky fuzneho polypeptidu usporiadané ako 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 alebo 3,2,1, kde 1 je prvá VEGF receptorová zložka, 2 je druhá VEGF receptorová zložka a 3 je multimerizačná zložka.
8. Fúzny polypeptid kódovaný izolovanou molekulou nukleovej kyseliny podľa akéhokoľvek z predchádzajúcich nárokov.
9. Vektor, ktorý obsahuje molekulu nukleovej kyseliny podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 7.
10. Expresný vektor obsahujúci molekulu nukleovej kyseliny podľa akéhokoľvek z nárokov 1 až 7, kde molekula nukleovej kyseliny je operatívne naviazaná na sekvenciu riadiacu expresiu.
11. Systém hostiteľ-vektor na produkciu fúzneho polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že obsahuje expresný vektor podľa nároku 10, vo vhodnej hostiteľskej bunke.
12. Systém hostiteľ-vektor podľa nároku 11, vyznačujúci sa tým, že vhodnou hostiteľskou bunkou je bakteriálna bunka, bunka kvasinky, hmyzia bunka alebo cicavčia bunka.
13. Systém hostiteľ-vektor podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že vhodnou hostiteľskou bunkou je E. coli alebo CHO bunka.
14. Spôsob prípravy fúzneho polypeptidu, vyznačujúci sa tým, že zahŕňa rastové bunky systému hostiteľ-vektor podľa akéhokoľvek z nárokov 11 až 13 za podmienok umožňujúcich produkciu fuzneho polypeptidu a odber takto produkovaného fuzneho polypeptidu.
15. Antagonista dimémeho cievneho endotelového rastového faktora VEGF, obsahujúci dva fuzne polypeptidy, pričom fúzny polypeptid obsahuje:
a) VEGF receptorovú zložku obsahujúcu v podstate imunoglobulínu, čiže Ig podobnú doménu 2 VEGF receptora Fltl a Ig doménu 3 VEGF receptora Flkl a Flt4 a
b) multimerizačnú zložku, kde VEGF receptorovou zložkou je jediný VEGF receptor každého fúzneho proteínu.
16. Dimémy antagonista podľa nároku 15, ktorý je modifikovaný acetyláciou alebo pegyláciou.
17. Fúzny polypeptid, ktorý obsahuje:
a) VEGF receptorovú zložku skladajúcu sa v podstate z imunoglobulínu podobnej (Ig) domény 2 Fltl VEGF receptora a Ig domény 3 Flkl a Flk4 VEGF receptora a
b) multimerizačnú zložku, kde VEGF receptorovou zložkou je jediná VEGF receptorová zložka vo fuznom polypeptide.
18. Fúzny polypeptid podľa nároku 17, kde multimerizačná zložka obsahuje imunoglobulínovú doménu.
19. Fúzny polypeptid podľa nároku 18, kde imunoglobulínová doména je vybraná zo skupiny zahrnujúcej Fc doménu IgG a ťažký reťazec IgG a ľahký reťazec IgG.
20. Fúzny polypeptid podľa nároku 19, ktorý obsahuje aminokyselinovú sekvenciu uvedenú na obr. 21A až 21 C, obr. 22A až 22C alebo obr. 24A až 24C.
21. Použitie fúzneho polypeptidu podľa akéhokoľvek z nárokov 17 až 20 alebo dimémeho antagonistu podľa akéhokoľvek z nárokov 15 alebo 16 na výrobu liečiva na použitie pri zmierňovaní alebo prevencii rastu nádorov; zmierňovaní alebo prevencii edému; zmierňovaní alebo prevencii vzniku ascitu, na znižovanie alebo inhibíciu úniku plazmy alebo na blokovanie rastu krvných ciev u človeka.
SK1752-2001A 1999-06-08 2000-05-23 Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, fúzny polypeptid ňou kódovaný, vektor s jej obsahom, systém vektor-hostiteľ na reprodukciu fúzneho polypeptidu a spôsob jeho prípravy, antagonista dimérneho VEGF a použitie SK287332B6 (sk)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13813399P 1999-06-08 1999-06-08
PCT/US2000/014142 WO2000075319A1 (en) 1999-06-08 2000-05-23 Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SK17522001A3 SK17522001A3 (sk) 2003-04-01
SK287332B6 true SK287332B6 (sk) 2010-07-07

Family

ID=22480568

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SK1752-2001A SK287332B6 (sk) 1999-06-08 2000-05-23 Izolovaná molekula nukleovej kyseliny, fúzny polypeptid ňou kódovaný, vektor s jej obsahom, systém vektor-hostiteľ na reprodukciu fúzneho polypeptidu a spôsob jeho prípravy, antagonista dimérneho VEGF a použitie

Country Status (33)

Country Link
EP (2) EP1544299B1 (sk)
JP (2) JP4723140B2 (sk)
KR (1) KR100659477B1 (sk)
CN (3) CN101433715B (sk)
AT (2) ATE417928T1 (sk)
AU (2) AU779303B2 (sk)
BE (1) BE2013C029I2 (sk)
BR (2) BRPI0011407B8 (sk)
CA (1) CA2376379C (sk)
CY (2) CY1108883T1 (sk)
CZ (2) CZ303656B6 (sk)
DE (2) DE60019415T2 (sk)
DK (2) DK1544299T3 (sk)
ES (2) ES2319305T3 (sk)
FR (1) FR13C0028I2 (sk)
HK (3) HK1043388A1 (sk)
HR (1) HRP20010908B1 (sk)
HU (3) HU230159B1 (sk)
IL (3) IL146890A0 (sk)
LT (1) LTC1183353I2 (sk)
LU (1) LU92195I2 (sk)
ME (2) ME00024B (sk)
MX (1) MXPA01012630A (sk)
NO (3) NO330775B1 (sk)
NZ (1) NZ515913A (sk)
PL (1) PL208247B1 (sk)
PT (2) PT1183353E (sk)
RS (1) RS50073B (sk)
RU (1) RU2265661C2 (sk)
SK (1) SK287332B6 (sk)
UA (1) UA74146C2 (sk)
WO (1) WO2000075319A1 (sk)
ZA (1) ZA200110068B (sk)

Families Citing this family (98)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6710174B2 (en) 2001-09-13 2004-03-23 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense inhibition of vascular endothelial growth factor receptor-1 expression
US6100071A (en) 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production
US7070959B1 (en) 1999-06-08 2006-07-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
US7396664B2 (en) 1999-06-08 2008-07-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
US6833349B2 (en) * 1999-06-08 2004-12-21 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of treating inflammatory skin diseases
US7087411B2 (en) * 1999-06-08 2006-08-08 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Fusion protein capable of binding VEGF
JP4669984B2 (ja) 2001-01-19 2011-04-13 ベジェニクス リミテッド 腫瘍画像化のターゲットとしてのＦ１ｔ４（ＶＥＧＦＲ−３）および抗腫瘍療法
US6734017B2 (en) 2001-09-28 2004-05-11 Isis Pharmaceuticals, Inc. Antisense modulation of vascular endothelial growth factor receptor-2 expression
WO2004108069A2 (en) 2002-05-04 2004-12-16 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods for promoting neuronal outgrowth
PL1608685T3 (pl) 2003-03-28 2007-07-31 Regeneron Pharma Antagoniści VEGF do leczenia cukrzycy
ES2616749T3 (es) 2003-05-16 2017-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Mutantes degradantes del proteoglucano para el tratamiento del SNC
US7959914B2 (en) 2003-05-16 2011-06-14 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of reducing extravasation of inflammatory cells
ES2831031T3 (es) * 2003-05-16 2021-06-07 Acorda Therapeutics Inc Proteínas de fusión para el tratamiento del CNS
WO2004106378A2 (en) * 2003-05-28 2004-12-09 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating corneal transplant rejection by using vegf antagonists
US7186699B2 (en) 2003-06-03 2007-03-06 Cell Genesys, Inc. Method for treating cancer by vector-mediated delivery of one or more anti-angiogenic or pro-apoptotic genes
WO2004110490A2 (en) * 2003-06-06 2004-12-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of vegf inhibitors for tumor regression
US7399612B2 (en) 2003-06-30 2008-07-15 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. VEGF-binding fusion proteins and nucleic acids encoding the same
AR046510A1 (es) * 2003-07-25 2005-12-14 Regeneron Pharma Composicion de un antagonista de vegf y un agente anti-proliferativo
WO2005016369A1 (en) * 2003-08-06 2005-02-24 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of a vegf antagonist in combination with radiation therapy
CA2566731C (en) 2004-05-18 2012-07-24 Acorda Therapeutics, Inc. Methods of purifying chondroitinase and stable formulations thereof
CA2569108C (en) 2004-06-08 2012-08-21 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co. Ltd Angiogenesis-inhibiting chimeric protein and the use
AU2005254058A1 (en) 2004-06-10 2005-12-29 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Use of VEGF inhibitors for the treatment of human cancer
AU2005265071A1 (en) * 2004-06-18 2006-01-26 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center VEGF inhibitors for the treatment of malignant pleural effusion
MX2007001241A (es) 2004-07-30 2007-07-11 Regeneron Pharma Metodos para tratar diabetes tipo i mediante el bloqueo de la actividad mediada de vegf.
PL2229956T3 (pl) 2004-09-13 2013-09-30 Genzyme Corp Konstrukty multimeryczne
FR2878749B1 (fr) * 2004-12-03 2007-12-21 Aventis Pharma Sa Combinaisons antitumorales contenant en agent inhibiteur de vegt et du 5fu ou un de ses derives
US7303748B2 (en) 2005-02-02 2007-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Method of treating eye injury with local administration of a VEGF inhibitor
WO2006104852A2 (en) 2005-03-25 2006-10-05 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Vegf antagonist formulations
JP5189985B2 (ja) 2005-09-26 2013-04-24 アコーダ セラピューティクス、インク． コンドロイチナーゼａｂｃｉ変異体を用いた組成物およびその使用方法
PT1962895E (pt) † 2005-12-16 2013-03-28 Regeneron Pharma Utilização terapêutica de um antagonista dll4 e de um inibidor fcev para inibição de crescimento de tumores
FR2895258B1 (fr) 2005-12-22 2008-03-21 Aventis Pharma Sa Combinaison comprenant de la combretastatine et des agents anticancereux
CN100502945C (zh) * 2006-03-31 2009-06-24 成都康弘生物科技有限公司 Vegf受体融合蛋白在治疗眼睛疾病中的应用
US8216575B2 (en) 2006-03-31 2012-07-10 Chengdu Kanghong Biotechnologies Co., Ltd. Inhibition of neovascularization with a soluble chimeric protein comprising VEGF FLT-1 and KDR domains
MX2008016124A (es) 2006-06-16 2009-01-20 Regeneron Pharma Formulaciones antagonistas de vegf adecuadas para la administracion intravitreal.
MX2009003229A (es) 2006-09-29 2009-06-18 Oncomed Pharm Inc Composiciones y metodos para diagnosticar y tratar cancer.
EP2450442B1 (en) 2006-10-10 2017-07-19 Acorda Therapeutics, Inc. Compositions and methods of using chondroitinase abci mutants
FR2918279B1 (fr) * 2007-07-05 2010-10-22 Aventis Pharma Sa Combinaisons antitumorales contenant un agent inhibiteur de vegf et de l'irinotecan
CN101575379B (zh) * 2008-05-09 2012-05-30 上海抗体药物国家工程研究中心有限公司 可溶性vegfr双功能融合受体、其制备方法及用途
ES2836948T3 (es) 2008-11-03 2021-06-28 Molecular Partners Ag Proteínas de unión que inhiben la interacción del receptor de VEGF-A
CN101838329A (zh) * 2009-03-18 2010-09-22 嘉和生物药业有限公司 抗血管新生融合蛋白
ES2895226T3 (es) 2009-10-16 2022-02-18 Mereo Biopharma 5 Inc Combinación terapéutica y uso de anticuerpos antagonistas de DLL4 y agentes antihipertensivos
AR081361A1 (es) * 2010-04-30 2012-08-29 Molecular Partners Ag Proteinas de union modificadas que inhiben la interaccion de receptor del factor de crecimiento endotelial vascular de glicoproteina a vegf-a
EP3327032A1 (en) 2010-08-06 2018-05-30 Genzyme Corporation Vegf antagonist compositions and uses thereof
JP6043629B2 (ja) * 2011-01-07 2016-12-14 中外製薬株式会社 抗体の物性を改善させる方法
KR20190049934A (ko) 2011-01-13 2019-05-09 리제너론 파아마슈티컬스, 인크. 혈관신생 눈 장애를 치료하기 위한 vegf 길항제의 용도
JO3283B1 (ar) 2011-04-26 2018-09-16 Sanofi Sa تركيب يتضمن أفليبيرسيبت, حمض فولينيك, 5- فلورويوراسيل (5- Fu) وإرينوسيتان (FOLFIRI)
KR101397088B1 (ko) 2011-06-10 2014-05-19 강원대학교산학협력단 암세포 증식 억제와 혈관신생 억제를 위한 융합 단백질 및 이를 포함한 항암 조성물
JO3370B1 (ar) * 2011-11-10 2019-03-13 Regeneron Pharma طريقة لتثبيط نمو الورم عن طريق تثبيط مستقبل انترلوكين 6
ES2651521T3 (es) * 2011-12-01 2018-01-26 Innovent Biologics, Inc. Inhibidores proteicos de las rutas del complemento y de VEGF y métodos de uso de los mismos
CN103304668B (zh) * 2012-03-12 2015-10-28 江苏健德生物药业有限公司 Ultra-VEGF-trap免疫融合蛋白、其制备方法及其应用
DK2846836T3 (da) 2012-05-07 2019-11-11 Allergan Inc Fremgangsmåde til behandling af amd hos patienter, der er refraktære overfor anti-vegf-terapi
WO2014006113A1 (en) 2012-07-03 2014-01-09 Sanofi Method of treating cancer by effective amounts of aflibercept
AR093445A1 (es) 2012-11-14 2015-06-10 Regeneron Pharma Metodos para tratar el cancer de ovario con antagonistas de dll4
CA2901226C (en) 2013-02-18 2020-11-17 Vegenics Pty Limited Vascular endothelial growth factor binding proteins
AR095196A1 (es) * 2013-03-15 2015-09-30 Regeneron Pharma Medio de cultivo celular libre de suero
CN104193828B (zh) * 2013-09-12 2017-04-05 北京韩美药品有限公司 同时阻断her2和vegfr信号通路的重组融合蛋白
EP3065761B1 (en) 2013-11-05 2020-01-08 Allergan, Inc. Method of treating conditions of the eye with an anti-vegf darpin
EP3143044A1 (en) 2014-05-12 2017-03-22 Formycon AG Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist
ES2732925T3 (es) 2014-07-18 2019-11-26 Sanofi Sa Método para predecir el resultado de un tratamiento con aflibercept de un paciente que se sospecha que padece un cáncer
JP2016036322A (ja) * 2014-08-11 2016-03-22 日本化薬株式会社 血管新生因子と結合するキメラタンパク質
SI3230316T1 (sl) 2014-12-11 2022-05-31 Bayer Healthcare Llc Zdravljenje starostne degeneracije makule z majhno aktivno horoidalno neovaskularizacijsko lezijo
GB201503453D0 (en) 2015-03-01 2015-04-15 Jain Arjun Endothelin-1"sponge"
TW202330904A (zh) 2015-08-04 2023-08-01 美商再生元醫藥公司 補充牛磺酸之細胞培養基及用法
WO2017046140A1 (en) 2015-09-18 2017-03-23 Bayer Pharma Aktiengesellschaft Treatment regimens for dr and rvo in dependence of the extent of retinal ischemia
WO2017065559A1 (ko) 2015-10-15 2017-04-20 (주)알테오젠 Igg fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
KR101936049B1 (ko) * 2015-10-15 2019-01-08 (주)알테오젠 IgG Fc 도메인을 가지는 융합 단백질의 생산방법
US20180326126A1 (en) 2015-11-18 2018-11-15 Formycon Ag Pre-filled plastic syringe containing a vegf antagonist
KR102354198B1 (ko) 2015-11-18 2022-01-20 에스아이오2 메디컬 프로덕츠, 인크. Vegf-길항제의 액체 제제를 포함하는 사전-충전된 제약 패키지
US11654046B2 (en) 2015-11-18 2023-05-23 Sio2 Medical Products, Inc. Pharmaceutical package for ophthalmic formulations
CA3005391A1 (en) * 2015-11-19 2017-05-26 Zhuhai Tairuishang Biopharm Ltd. Methods and compositions for binding vegf
LT3384049T (lt) 2015-12-03 2023-09-11 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Genetinių variacijų susiejimo su klinikiniais rezultatais būdai pacientams, sergantiems amžine geltonosios dėmės degeneracija, gydytiems anti-vegf
JP6953433B2 (ja) 2016-01-26 2021-10-27 フォーマイコン アーゲーＦｏｒｍｙｃｏｎ Ａｇ Ｖｅｇｆアンタゴニストを含む液体医薬組成物および同医薬組成物を含有する充填済みシリンジ
JPWO2018070390A1 (ja) 2016-10-12 2019-08-22 第一三共株式会社 抗ｒｏｂｏ４抗体と他剤を含む組成物
WO2018094316A1 (en) 2016-11-21 2018-05-24 Just Biotherapeutics, Inc. Aflibercept formulations and uses thereof
EP3630062A2 (en) 2017-05-24 2020-04-08 SiO2 Medical Products, Inc. Sterilizable pharmaceutical package for ophthalmic formulations
EP3630043A1 (en) 2017-05-24 2020-04-08 Formycon AG Sterilizable pre-filled pharmaceutical packages comprising a liquid formulation of a vegf-antagonist
WO2018215580A1 (en) 2017-05-24 2018-11-29 Formycon Ag Method for sterilizing prefilled plastic syringes containing a vegf antagonist
TW201904610A (zh) 2017-06-14 2019-02-01 德商拜耳製藥公司 用於治療新生血管型青光眼之非抗體vegf拮抗劑
WO2019020777A1 (en) 2017-07-26 2019-01-31 Formycon Ag LIQUID FORMULATION OF A VEGF ANTAGONIST
CA3067735A1 (en) 2017-08-17 2019-02-21 Just Biotherapeutics, Inc. Method of purifying glycosylated protein from host cell galectins and other contaminants
JP7183268B2 (ja) 2017-11-20 2022-12-05 ジャスト－エヴォテック バイオロジックス、インコーポレイテッド 等張化剤としてリジン塩を含有するアフリベルセプト製剤及びその使用
DK3717636T3 (da) 2017-11-27 2023-05-30 4D Molecular Therapeutics Inc Adeno-associeret-virus-variantcapsider og anvendelse til inhibering af angiogenese
JP7339248B2 (ja) 2017-11-30 2023-09-05 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド 血管形成眼障害を処置するためのｖｅｇｆアンタゴニストの使用
CN117405806A (zh) * 2017-12-13 2024-01-16 里珍纳龙药品有限公司 管理层析柱床支架的装置和系统及相关方法
CN116059318A (zh) 2018-01-26 2023-05-05 加利福尼亚大学董事会 用于使用抗vegf剂治疗血管生成病症的方法和组合物
AU2019265005A1 (en) 2018-05-10 2020-12-17 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. High concentration vegf receptor fusion protein containing formulations
US11519020B2 (en) 2018-05-25 2022-12-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of associating genetic variants with a clinical outcome in patients suffering from age-related macular degeneration treated with anti-VEGF
CN111378044B (zh) 2018-12-28 2022-07-15 长春金赛药业有限责任公司 抗体融合蛋白、制备方法及其应用
US20220204920A1 (en) 2019-05-16 2022-06-30 Formycon Ag Method for reducing methionine oxidation in recombinant proteins
CA3150481A1 (en) 2019-09-03 2021-03-11 Amgen Inc. Injection device for drug delivery and packaging for the injection device
US20210077645A1 (en) 2019-09-16 2021-03-18 Amgen Inc. Method for external sterilization of drug delivery device
CA3157509A1 (en) 2019-10-10 2021-04-15 Kodiak Sciences Inc. Methods of treating an eye disorder
WO2021108255A1 (en) 2019-11-25 2021-06-03 The Regents Of The University Of California Long-acting vegf inhibitors for intraocular neovascularization
NZ781143A (en) * 2019-12-06 2023-05-26 Regeneron Pharma Anti-vegf protein compositions and methods for producing the same
JP2023505216A (ja) 2019-12-06 2023-02-08 リジェネロン・ファーマシューティカルズ・インコーポレイテッド Ｖｅｇｆミニトラップおよびそれらの使用方法
JP2023514325A (ja) 2020-02-24 2023-04-05 アムジエン・インコーポレーテツド 薬物送達デバイスの外部滅菌中に使用するための容器及びシステム
EP4145456A1 (en) 2021-09-06 2023-03-08 Bayer AG Prediction of a change related to a macular fluid
WO2024029876A1 (ko) * 2022-08-02 2024-02-08 주식회사 파노로스바이오사이언스 변형된 융합 단백질 및 이의 용도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9506466D0 (en) * 1994-08-26 1995-05-17 Prolifix Ltd Cell cycle regulated repressor and dna element
US6100071A (en) * 1996-05-07 2000-08-08 Genentech, Inc. Receptors as novel inhibitors of vascular endothelial growth factor activity and processes for their production

Also Published As

Publication number Publication date
HUP0201515A3 (en) 2004-12-28
EP1183353B1 (en) 2005-04-13
EP1544299A1 (en) 2005-06-22
HUP0201515A2 (en) 2002-08-28
CN103349781B (zh) 2015-04-01
HK1185798A1 (en) 2014-02-28
CA2376379C (en) 2007-08-07
NO2013010I1 (no) 2013-06-17
IL190234A0 (en) 2008-11-03
DK1544299T3 (da) 2009-03-23
CN101433715A (zh) 2009-05-20
NO330775B1 (no) 2011-07-11
DE60019415D1 (de) 2005-05-19
BRPI0011407B1 (pt) 2018-09-25
BR0011407A (pt) 2002-04-02
RS50073B (sr) 2009-01-22
JP2003501089A (ja) 2003-01-14
HU230159B1 (hu) 2015-09-28
FR13C0028I1 (fr) 2013-06-14
HRP20010908B1 (en) 2006-05-31
RU2265661C2 (ru) 2005-12-10
HRP20010908A2 (en) 2005-04-30
HK1132653A1 (en) 2010-03-05
AU2005201365B2 (en) 2007-08-09
AU779303B2 (en) 2005-01-13
KR20020019070A (ko) 2002-03-09
CZ20014387A3 (cs) 2002-10-16
CY1108883T1 (el) 2014-07-02
NO20100656L (no) 2002-02-08
NO332559B1 (no) 2012-10-29
IL146890A (en) 2008-07-08
NO20016036L (no) 2002-02-08
EP1183353A1 (en) 2002-03-06
JP4723140B2 (ja) 2011-07-13
DE60041159D1 (de) 2009-01-29
NO2013010I2 (no) 2013-05-15
ATE417928T1 (de) 2009-01-15
AU5040400A (en) 2000-12-28
DK1183353T3 (da) 2005-08-08
JP2011024595A (ja) 2011-02-10
CY2013019I1 (el) 2015-11-04
CN101433715B (zh) 2013-04-17
ZA200110068B (en) 2002-12-06
LTPA2013009I1 (lt) 2013-06-25
LTC1183353I2 (lt) 2023-02-27
PL352246A1 (en) 2003-08-11
PT1183353E (pt) 2005-06-30
WO2000075319A1 (en) 2000-12-14
ES2319305T3 (es) 2009-05-06
MEP3208A (xx) 2010-02-10
DE60019415T2 (de) 2006-03-09
CZ302689B6 (cs) 2011-09-07
CY2013019I2 (el) 2015-11-04
UA74146C2 (uk) 2005-11-15
IL146890A0 (en) 2002-08-14
AU2005201365A1 (en) 2005-04-28
CN1369009A (zh) 2002-09-11
HK1043388A1 (en) 2002-09-13
SK17522001A3 (sk) 2003-04-01
PT1544299E (pt) 2009-03-18
MXPA01012630A (es) 2002-07-22
ATE293164T1 (de) 2005-04-15
PL208247B1 (pl) 2011-04-29
EP1544299B1 (en) 2008-12-17
CN100523187C (zh) 2009-08-05
NO20016036D0 (no) 2001-12-10
NZ515913A (en) 2004-01-30
CN103349781A (zh) 2013-10-16
ME00024B (me) 2010-02-10
JP5273746B2 (ja) 2013-08-28
FR13C0028I2 (fr) 2014-05-16
CZ303656B6 (cs) 2013-01-30
HUS1300052I1 (hu) 2016-08-29
BE2013C029I2 (sk) 2019-03-06
LU92195I2 (fr) 2013-07-15
HU229156B1 (en) 2013-09-30
YU86901A (sh) 2004-05-12
BRPI0011407B8 (pt) 2021-05-25
KR100659477B1 (ko) 2006-12-20
ES2237429T3 (es) 2005-08-01
CA2376379A1 (en) 2000-12-14

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10392430B2 (en) Methods of making nucleic acid molecules encoding modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties
JP5273746B2 (ja) 改善された薬物動態特性を有する改変キメラポリペプチド
CA2588221C (en) Modified chimeric polypeptides with improved pharmacokinetic properties

Legal Events

Date Code Title Description
SPCF Filing of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: AFLIBERCEPT; REGISTRATION NO/DATE: EU/1/12/797/001 - EU/1/12/797/002 20121122

Spc suppl protection certif: 5011-2013

Filing date: 20130513

SPCG Grant of an spc

Free format text: PRODUCT NAME: AFLIBERCEPT; NAT. REGISTRATION NO/DATE: EU/1/12/797/001 - EU/1/12/797/002 20121122; FIRST REGISTRATION: EU EU/1/12/797/001 - EU /1/12/797/002 20121122

Spc suppl protection certif: 142 5011-2013

Filing date: 20130513

Extension date: 20250524

MK4A Patent expired

Expiry date: 20200523