MXPA01012630A - Polipeptidos quimericos modificados con propiedades farmacocineticas mejoradas. - Google Patents

Abstract

Se describen polipeptidos quimericos modificados con farmacocinetica mejorada. En forma especifica, se describen polipeptidos del receptor Flt1 quimericos modificados que han sido modificados de tal forma que se mejore su perfil farmacocinetico. Se describen tambien metodos para hacer y usar los polipeptidos modificados, que incluyen pero no estan limitados a usar los polipeptidos modificados para disminuir o inhibir el derrame de plasma y/o la permeabilidad vascular en un mamifero.

Description

POLIPEPTIDOS QUIMÉRICOS MODIFICADOS CON PROPIEDADES FARMACOCINETICAS MEJORADAS A lo largo de esta solicitud se hace referencia a varias publicaciones. Las descripciones de estas publicaciones en sus totalidades se incorporan en la presente a manera de referencia en esta solicitud.

Campo de la invención El campo de la invención es polipéptidos modificados con farmacocinética mejorada. En forma especifica, el campo de esta invención se refiere a polipéptidos del receptor Fltl que han sido modificados de una manera tal que se mejore su perfil farmacocinético. El campo de esta invención se refiere también a métodos para hacer y usar los polipéptidos modificados, que incluyen pero no están limitados a usar los polipéptidos modificados para disminuir o inhibir el derrame de plasma y/o la permeabilidad vascular en un mamífero.

Antecedentes de la invención La capacidad de los ligandos de polipéptidos para unirse a células e inducir de esta manera una respuesta REF.: 134831 . i < a fenotipica tal como crecimiento celular, supervivencia, secreción de producto celular o diferenciación es mediada comúnmente a través de receptores transmembrana sobre las células. El dominio extracelular de estos receptores (es decir, la porción del receptor que es desplegada sobre la superficie de la célula) es generalmente la porción más distintiva de la molécula, ya que proporciona a la proteina su característica de unión a ligandos. La unión de un ligando al dominio extracelular generalmente resulta en la transducción de señal que transmite una señal biológica a objetivos intracelulares. Comúnmente, esta transducción de señal actúa por medio de un dominio intracelular catalítico. La disposición particular de motivos de secuencia de este dominio intracelular catalíticos determina su acceso a substratos de cinasa potenciales (Mohammadi, et al . , 1990, Mol. Cell. Biol.. 11:5068-5078; Fantl, et al . , 1992, Cell _69: 413-413) . Ejemplos de receptores que transducen señales por medio de dominios intracelulares catalíticos incluyen las tirosina cinasas receptoras (RTKs) tales como la familia Trk de receptores que están limitados generalmente a células del sistema nervioso, la familia de citocinas de receptores que incluyen el complejo de receptor CNTF tripartato (Stahl & Yancopoulos, 1994, J. Neurobio. 25:1454-1466) que también *? -s . * ^ - ? i está limitado generalmente a las células del sistema nervioso, receptores copulados a proteina G tales como el receptor ß2-adrenérgico encontrado en, por ejemplo, células de músculo cardiaco, y el receptor de alta afinidad IgE multimérico FceRI que se localiza, para la mayor parte, en células cebadas y basófilos (Sutton & Gould, 1993, Nature 366:421-428) . Todos los reportes identificados hasta el momento parecen sufrir dimerización, multimerización, o cierto cambio conformacional relacionado después de la unión de ligando (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sci. 13:443-447; Ullrich & Schlessinger, 1990, Cell 61:203-212; Schlessinger & Ullrich, 1992, Neuron 9 : 383-391) e interacciones moleculares entre dominios intracelulares de dimerización llevaron a la activación de la función catalitica. En algunos casos, tales como el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , el ligando es un dimero que une dos moléculas receptoras (Hart, et al . , 1988, Science, 240:1529-1531; Heldin, 1989, J.

Biol.. Chem. 264 : 8905-8912) aunque, por ejemplo, en el caso del factor de crecimiento epidérmico (EGF) , el ligando es un monómero (Weber et al . , 1984, J. Biol.. Chem. 259: 14631-14636) . En el caso del receptor FceRI, el ligando IgE existe J--, ,Á - ?ybr i _.,. Ji . , .. iifeS sfalbl unido a FceRI en una forma monomérica y sólo se activa cuando el antigeno se une al complejo IgE/FceRI y entrelaza moléculas IgE adyacentes (Sutton & Gould, 1993, Nature 366:421-428) . Comúnmente, la distribución en tejido de un receptor particular dentro de organismos superiores proporciona un discernimiento de la función biológica del receptor. Las RTKs para algunos factores de crecimiento y diferenciación, tales como factor de crecimiento de fibroblastos (FGF), son ampliamente expresadas y por lo tanto parecen jugar algún papel general en el crecimiento y mantenimiento de tejidos. Miembros de la familia Trk RTK (Glass & Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3:262-268) de receptores están más generalmente limitados a células del sistema nervioso, y la familia del Factor de Crecimiento de Nervios que consiste en factor de crecimiento de nervios (NGF) , factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) , neurotrofina-3 (NT-3) y neurotrofina-4/5 (NT-4/5) , los cuales se unen a los receptores de la familia Trk- RTK, promueven la diferenciación de diversos grupos de neuronas en el cerebro y periferia (Lindsay, R. M. 1993, en Neurotrophic Factors, S.E. Loughlin & J.H. Fallón, eds., pp. 257-284, San Diego, CA, Academic Press) . FceRI se localiza en un número muy limitado «*-.<<í < .«,-l-¿---,2 liÍ- de tipos de células tales como células cebadas y basófilos. Las células cebadas se derivan de un linaje de células madre hematopoyéticas pluripotentes de médula ósea, pero completan su maduración en el tejido después la migración desde el torrente sanguíneo (Véase Jane ay & Travers, 1996, en Immunology, 2a. Edición, M. Robertson & E. Lawrence, eds., pp. 1:3-1:4, Current Biology Ltd., Londres, RU, Publisher) y están implicadas en la respuesta alérgica. Muchos estudios han demostrado que el dominio extracelular de un receptor proporciona la característica de unión a ligando especifica. Además, el ambiente celular en el cual un receptor es expresado puede influenciar la respuesta biológica exhibida después de la unión de un ligando al receptor. Por ejemplo, cuando una célula neuronal que exprese un receptor Trk sea expuesta a una neurotrofina que se una a ese receptor, el resultado en la supervivencia y diferenciación neuronal. Cuando el mismo receptor se expresa por un fibroblasto, la exposición a la neurotrofina resulta en la proliferación del fibroblasto (Glass, et al . , 1991, Cell 66:405-413) . Una clase de mitógenos diméricos derivados de células con selectividad para células endoteliales vasculares ha sido identificada y designada factor de crecimiento de células endoteliales (VEGF) . El VEGF ha sido purificado de medios de crecimiento acondicionados de células de glioma de rata [Conn et al . , (1990), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87. pp. 2628-2632]; y medios de crecimiento acondicionados de células esteladas de folículo pituitario de bovino [Ferrara y Henzel, (1989), Biochem. Biophys. Res. Comm., 161, pp. 851-858; Gozpadorowicz et al . , (1989), Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 86, pp. 7311-7315] y medio de crecimiento acondicionado de células U937 humanas [Conolly, D. T. et al . , (1989), Science, 246, pp. 1309-1312]. El VEGF es un dimero con una masa molecular aparente de alrededor de 46 kDa con cada subunidad teniendo una masa molecular aparente de alrededor de 23 kDa. El VEGF tiene ciertas similitudes estructurales con el factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) , el cual es un mitógeno para células de tejido conectivo pero no mitogénico para células endoteliales vasculares de grandes vasos. El receptor de tirosina cinasa unido a membrana, conocido como Fit, mostró ser un receptor de VEGF [DeVries, C. et al . , (1992), Science, 255, pp . 989-991]. El receptor Fit se une específicamente a VEGF, el cual induce mitogénesis. Se sabe también que otra forma del receptor de VEGF, designada KDR, se une a VEGF e induce la mitogénesis. rl-t •< La secuencia de ADNc parcial y la secuencia de proteinas de longitud casi completa de KDR se conoce también [Ter an, B. I. et al . , (1991) Oncogene 6, pp. 1677-1683; Terman, B. I. et al . , (1992) Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, pp. 1579-1586]. La angiogénesis persistente puede causar o exacerbar ciertas enfermedades tales como psoriasis, artritis reumatoide, hemangionas, angiofibromas, retinopatia diabética y glaucoma neovascular. Un inhibidor de la actividad de VEGF podria ser útil como un tratamiento para tales enfermedades y otras angiogénesis patológicas inducidas por VEGF y condiciones de permeabilidad vascular, tales como vascularización de tumores. La presente invención se refiere a un inhibidor de VEGF que se basa en el receptor Fltl de VEGF. El derrame de plasma, un componente clave de la inflamación, ocurre en un subconjunto distinto de microvasos. En particular, en muchos órganos el derrame de plasma ocurre específicamente en las vénulas. A diferencia de las arteriolas y los capilares, las vénulas se vuelven permeables en respuesta a numerosos mediadores inflamatorios que incluyen histamina, bradiquinina y serotonina. Una característica de la inflamación es el derrame de plasma que resulta de espacios intercelulares que se forman en el endotelio de las vénulas. Muchos modelos experimentales de inflamación indican que estos espacios intercelulares ocurren entre las células endoteliales de vénulas postcapilares y recolectoras (Baluk, P. et al . , Am. J. Pathol. 1998 152:1463- 5 76) . Se ha demostrado que ciertas lectinas pueden usarse para revelar características de sitios focales de derrame de plasma, espacios endoteliales y procesos tipo dedo en los bordes de células endoteliales en vénulas inflamadas (Thurston, G., et al . , Am. J. Physiol, 1996, 271: H2547-62) . 10 En particular, las lectinas vegetales se han usado para visualizar cambios morfológicos en los bordes de células endoteliales en vénulas inflamadas de, por ejemplo, la tráquea de la rata. Las lectinas, tales como conconavalina A y pcina, las cuales se unen focalmente a vénulas inflamadas, 15 revelan regiones de la pared del vaso subendotelial expuestas por espacios que corresponden a sitios de derrame de plasma (Thurston, G., et al . , Am J Physiol., 1996, 271: H2547-62). Las propiedades de los microvasos son dinámicas. Las enfermedades inflamatorias crónicas, por ejemplo, están 20 asociadas con la remodelación vascular, incluyendo angiogénesis y agrandamiento de microvasos. Los microvasos también pueden remodelarse adquiriendo propiedades fenotípicas anormales. En un modelo murino de inflamación HjK crónica de vías aérea, los capilares de la vía aérea adquieren propiedades de las vénulas, incluyendo diámetro de vaso expandido, inmunorreactividad incrementada para el factor de von Willebrand e inmunorreactividad incrementada para P-selectina. Además, estos vasos remodelados derraman en respuesta a mediadores inflamatorios, mientras que los vasos en la misma posición en las vias aéreas de ratones normales no lo hacen. Ciertas sustancias han mostrado disminuir o inhibir la permeabilidad vascular y/o derrame de plasma. Por ejemplo, las mistixinas son polipéptidos sintéticos que se han reportado como inhibidores del derrame de plasma sin bloquear la formación de espacios endoteliales (Baluk, P., et al . , J. Pharmacol. Exp. Ther., 1998, 284: 693-9). Asimismo, el agonista del receptor beta 2-adrenérgico formoterol reduce el derrame microvascular inhibiendo la formación de espacios endoteliales (Baluk, P. y McDonald, D.M., Am. J. Physiol., 1994, 266:L461-8) . Las angiopoyetinas y miembros de la familia del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) son los únicos factores de crecimiento que se cree son ampliamente específicos para células endoteliales vasculares. Estudios de inactivación de genes identificados en ratones han mostrado que el VEGF es necesario para las etapas iniciales del desarrollo vascular, y que se requiere Ang-1 para las etapas posteriores de la remodelación vascular. La patente de E.U.A. No. 6,011,003, expedida el 4 5 de enero de 2000, a nombre de Metris Therapeutics Limited, describe una forma alterada y soluble de polipéptido FLT que es capaz de unirse a VEGF y ejercer de esta manera un efecto inhibitorio en el mismo, el polipéptido comprende cinco o menos dominios de inmunoglobulina completos. 10 La patente de E.U.A. No. 5,712,380, expedida el 27 de enero de 1998 y asignada a Merck & Co., describe inhibidores del factor de crecimiento endotelial (VEGF) que son formas solubles que ocurren naturalmente o que están manipuladas en forma recombinante con o sin una región de 15 transmembrana C-terminal del receptor para VEGF. También está cedida a Merck & Co. la publicación de PCT No. WO 98/13071, publicada el 2 de abril de 1998, la cual describe metodología de terapia génica para la inhibición del crecimiento de tumores primario y metástasis mediante la 20 transferencia de genes de una secuencia de nucleótidos que codifica para una proteína receptora soluble que se une a VEGF.

^J¡t^^ ^ ^»?»? t .j,?m, i.t:ii.,Ji .t?.-itá&. ?tit??á?iLj.* . nsjTsai-jí..-.

La publicación de PCT No. WO 97/44453, publicada el 27 de noviembre de 1997, a nombre de Genentech, Inc., describe proteinas receptoras de VEGF quiméricas novedosas que comprenden secuencias de aminoácidos derivadas de los receptores Fltl y KDR del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , incluyendo el homólogo de munno para el receptor KDR humano FLK1, en donde las proteinas receptoras de VEGF quiméricas se unen a VEGF y antagonizan la actividad proliferativa y angiogénica en células endoteliales del mismo. La publicación de PCT No. WO 97/13787, publicada el 17 de abril 1997, a nombre de Toa Gosei Co., LTD., describe un inhibidor de VEGF de bajo peso molecular útil en el tratamiento de enfermedades acompañadas por neovascularización tales como tumores sólidos. Un polipéptido que contiene al primer dominio tipo inmunoglobulina y al segundo dominio tipo inmunoglobulina en la región extracelular de un receptor VEGF FLT pero que no contiene al sexto dominio tipo inmunoglobulina y al séptimo dominio tipo inmunoglobulina del mismo muestra una actividad inhibitoria de VEGF. Sharifi, J. et al . , 1998, The Quarterly Jour. Of Nucí. Med. 12 : 247 -249 , escribe sue debido a que los anticuerpos monoclonales son proteinas básicas cargadas positivamente, y que las células de mamífero están cargadas negativamente, las interacciones electrostáticas entre los dos pueden crear niveles más altos de unión antecedente que resulte en bajas relaciones tumor a órgano normal. Para superar este efecto, los investigadores intentaron mejorar la eliminación de MAb usando varios métodos tales como agentes secundarios, así como modificaciones químicas y de carga del propio MAb. Jensen-Pippo, et al . , 1996, Pharmaceutical Research 13:102-107, describen que la pegilación de una proteína terapéutica, factor de estimulación de colonia de granulocitos humano recombinante (PEG-G-CSF) , da como resultado un aumento en la estabilidad y en la retención de la bioactividad in vivo cuando se administra por la ruta mtraduodenal . Tsutsumi, et al . , 1997, Thromb Haemost, 77:168-73, describen experimentos en los que la actividad trombopoyética in vivo de interleucina-6 modificada con polietilenglicol (MPEG-IL-6) , en los cuales 54% de los 14 grupos amino de lisina de IL.6 fueron acoplados con PEG, se comparó con la de IL-6 nativa.

Yang et al . , 1995, Cáncer 76 : 687-94, describe que la conjugación de polietilenglicol a interleucina-2 (IL-2) humana recombinante da como resultado un compuesto, IL-2 modificada con polietilenglicol (PEG-IL-2) que conserva la actividad in vi tro e in vivo de IL-2, pero exhibe una vida promedio circulante marcadamente prolongada. R. Duncan y F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet . 27: 290-306, 296 (1994) revisan esfuerzos por mejorar la vida promedio del plasma de asparaginasa conjugando son polietilenglicol. La publicación internacional de PCT No. WO 99/03996, publicada el 28 de enero de 1999 a nombre de Regeneron Pharmaceuticals, Inc. y The Regents of The University of California, describe polipéptidos cubilete humanos modificados que tienen deleciones de regiones de aminoácidos básicos. Se describe que los polipéptidos cubilete humanos modificados conservan su actividad biológica mientras tienen afinidad reducida para heparina y farmacocinética superior en sueros de animales en comparación con el polipéptido cubilete humano no modificado. ¡- '*<¡..t Á..Í... tí ? Breve descripción de la invención La presente invención está dirigida a antagonistas de VEGF con propiedades farmacocinéticas mejoradas. Una modalidad preferida es una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido de fusión capaz de unirse a un polipéptido VEGF que comprende a) una secuencia de nucleótidos que codifique para un componente receptor de VEGF unido operativamente a b) una secuencia de nucleótidos que codifique para un componente multimerizador, en donde el componente receptor de VEGF es el único componente receptor de VEGF del pollpéptido de fusión, y en donde la secuencia de nucleótidos de a) consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos del dominio 2 Ig del dominio extracelular de un primer receptor de VEGF y una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos del dominio 3 Ig del dominio extracelular de un segundo receptor de VEGF. En una modalidad más, el ácido nucleico aislado del primer receptor de VEGF es Fltl. En una modalidad más, el ácido nucleico aislado del segundo receptor de VEGF es Flkl. En otra modalidad, el ácido nucleico aislado del segundo receptor de VEGF es Flt .

En otra modalidad preferida, la secuencia de ácido nucleico que codifica para el dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor de VEGF está hacia el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor de VEGF. En otra modalidad preferida más, la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor de VEGF está hacia el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor de VEGF. En una modalidad preferida de la invención, el componente multimerizador comprende un dominio de inmunoglobulina. En otra modalidad, el dominio de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en el dominio Fc de IgG, la caden pesada de IgG y la cadena ligera de IgG. Las modalidades preferidas incluyen una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de fusión de receptor Fltl modificado, en donde la región de codificación -«sAA.» i i Í.-Í de la molécula de ácido nucleico consiste en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 13A-13D; b) la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 14A-14C; c) la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 15A-15C; d) la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 16A-16D; e) la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 21A-21C; f) la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 22A-22C; g) la secuencia de nucleótidos mostrada en la figura 24A-24C; y h) la secuencia de nucleótidos que, como resultado de la degeneración del código genético, es diferente de la secuencia de nucleótidos de a) , b) , c) , d) , e) , f) o g) y la cual codifica para una molécula de polipéptido de fusión que tiene la actividad biológica del polipéptido de fusión del receptor Fltl modificado. i J k í'i . j, .»-•. ?.? a k? * En una modalidad adicional de la invención, un polipéptido de fusión es codificado por las moléculas de ácido nucleico aisladas descritas arriba. Una modalidad preferida es una composición capaz de unirse a una molécula de VEGF para formar un complejo no funcional que comprende un multímero del polipéptido de fusión. Se prefiere también una composición en la que el multimero es un dímero. En otra modalidad más, la composición está en un vehículo. Otra modalidad es un vector que comprende las moléculas de ácido nucleico descritas arriba, incluyendo un vector de expresión que comprende las moléculas de ácido nucleico descritas, en donde la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia de control de expresión. Otras modalidades incluidas son un sistema huésped- vector para la producción de un polipéptido de fusión que comprende al vector de expresión, en una célula huésped adecuada; el sistema huésped-vector en el que la célula huésped adecuada es una célula bacteriana, célula de levadura, célula de insecto o células de mamífero; el sistema huésped-vector, en el que la célula huésped adecuada es E. Coli ; el sistema huésped-vector en el que la célula huésped adecuada es una célula COS; el sistema huésped-vector en el que la célula huésped adecuada es una célula CHO. Otra modalidad de la invención es un método para producir un polipéptido de fusión que comprende cultivar células del sistema huésped-vector bajo condiciones que permitan la producción del polipéptido de fusión y recuperar al polipéptido de fusión producido de esta manera. Modalidades adicionales incluyen un polipéptido de fusión codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en la figura 10A-10D o la figura 24A-24C, la cual ha sido modificada mediante acetilación o pegilación, en donde la acetilación se logra con por lo menos aproximadamente un exceso molar de 100 veces de reactivo de acetilación o en donde la acetílación se logra con un exceso molar de reactivo de acetilación que varía de por lo menos aproximadamente un exceso molar de 10 veces a aproximadamente un exceso molar de 100 veces, o en donde la pegilación es 10K o 20K de PEG. Una modalidad preferida incluye un método para disminuir o inhibir el derrame de plasma en un mamífero, que comprende administrar al mamífero el polipéptido de fusión descrito arriba, incluyendo modalidades en las que el mamífero es un humano, el polipéptido de fusión es acetilado o el polipéptido de fusión es pegilado. Una modalidad adicional es un polipéptido de fusión que se une específicamente al ligando VEGF del receptor VEGF. Una modalidad preferida de la invención es un método para bloquear el crecimiento de vasos sanguíneos en un humano, que comprende administrar una cantidad efectiva del polipéptido de fusión descrito arriba. Se prefiere también un método para inhibir la actividad del ligando receptor de VEGF en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva del polipéptido de fusión descrito arriba. Las modalidades preferidas de estos métodos son aquellas en las que el mamífero es un humano. Modalidades adicionales de los métodos de la invención incluyen la atenuación o prevención del crecimiento de tumores en un humano; atenuación o prevención de edema en un humano, especialmente cuando el edema es edema cerebral; la atenuación o prevención de la formación de ascites en un humano, especialmente cuando los ascites son ascites asociados con cáncer ovárico. Modalidades preferidas de la invención incluyen un polipéptido de fusión capaz de unirse a un polipéptido de Í-ii,A ? A..1 ikái it? HU*** É**..-.M-<a- -.-«.í -,-*-. •- «, ..^a?^ .«.»1.Ja«.ft .a.»»-...i~. «ti. i~* « ».«.t«tfa>.

VEGF que comprende a) un componente receptor de VEGF unido operativamente a b) un componente multimerizador, en donde el componente receptor de VEGF es el único componente receptor de VEGF en el polipéptido de fusión y consiste esencialmente en la secuencia de aminoácido del dominio 2 Ig del dominio extracelular de un primer receptor de VEGF y la secuencia de aminoácidos del dominio 3 Ig del dominio extracelular de un segundo receptor de VEGF. En una modalidad adicional del polipéptido de fusión, el primer receptor de VEGF es Fltl. En otra modalidad más del polipéptido de fusión, el segundo receptor de VEGF es Flkl. Otra modalidad del polipéptido de fusión es una en la cual el segundo receptor de VEGF es Flt . Las modalidades preferidas incluyen un polipéptido de fusión en el que la secuencia de aminoácidos del dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor de VEGF está hacia el extremo 5' de la secuencia de aminoácidos del dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor de VEGF y un polipéptido de fusión en el que la secuencia de aminoácidos del dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor de VEGF está hacia el extremo 3' de la secuencia de aminoácidos del dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor de VEGF. En otra modalidad, el componente multimerizador del polipéptido de fusión comprende un dominio de inmunoglobulina que incluye una modalidad en la que el dominio de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en el dominio Fc de IgG, la cadena pesada de IgG y la cadena ligera de IgG. Modalidades preferidas incluyen un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de un receptor Fltl modificado, en donde la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en a) la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 13A-13D; b) la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 14A-14C; c) la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 15A-15C; d) la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 16A-16D; e) la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 21A-21C; f) la secuencia de aminoácidos mostrada en la figura 22A-22C y g) la secuencia de aminoácido mostrada en la figura 24A-24C. Otra modalidad preferida es un método para disminuir o inhibir el derrame de plasma en un mamífero, que comprende administrar al mamífero el polipéptido de fusión descrito arriba. 7..Ü..Í. I. ~afr a .. u&, ** Ü.? Una modalidad alternativa que se prefiere es un método para inhibir la actividad del ligando receptor de VEGF en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad efectiva del polipéptido de fusión descrito arriba.

Breve descripción de las figuras Figura 1. Análisis con gel IEF de proteínas Fltl(l- 3)-Fc no modificadas y acetiladas. La proteína Fltl (1-3) -Fc no es capaz de entrar en el gel debido a su >9.3 pl, mientras que la Fltl (1-3) -Fc acetilada es capaz de entrar en el gel y equilibrarse a pl 5.2.

Figura 2. Unión de proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificada y Fltl (1-3) -Fc acetilada a placas recubiertas con Matrigel®. Las proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificadas se unen en forma extensa a componentes de matriz celular en Matrigel®, mientras que la Fltl (1-3) -Fc acetilada no se une.

Figura 3. Unión de proteinas Fltl (1-3) -Fc no modificada, Fltl (1-3) -Fc acetilada y Fltl (1-3) -Fc pegilada en un ensayo a base de Biacore. Fltl (1-3) -Fc acetilada (columnas 13-16), pegilada (columnas 17-20) y tratada con heparina (columnas 21-24) son cada una capaces de competir completamente con la Fltl(l-3)-Fc unida al fragmento Biacore para la unión a VEGF en comparación con proteínas de control (columnas 1-4) y proteína irrelevante (columnas 5-8) . La Fltl (1-3) -Fc no modificada (columnas 5-6) parece competir sólo parcialmente con Fltl (1-3) -Fc unida a fragmento Biacore para la unión a VEGF. Sin embargo, el lavado de las muestras unidas con NaCl 0.5M (columnas 7-8) da como resultado un perfil de unión similar al de las formas modificadas de Fltl (1-3) -Fc, indicando que la proteína no modificada exhibe unión no específica al fragmento que puede ser eliminada por el lavado con sal.

Figura 4. Unión de proteinas Fltl (1-3) -Fc no modificada, Fltl (1-3) -Fc acetilada y Fltl (1-3) -Fc pegilada a VEGF en un ensayo a base de ELISA. Tanto la proteina Fltl(l- 3)-Fc acetilada como la pegilada se unen a VEGF con afinidades que se acercan a las de la Fltl (1-3) -Fc no modificada.

Figura 5. Perfiles farmacocinéticos de Fltl (1-3) -Fc no modificada, Fltl (1-3) -Fc acetilada y Fltl (1-3) -Fc pegilada. Ratones balb/c (23-28g) fueron inyectados ^subcutáneamente con 4 mg/kg ,de Fltl..(l-3) -Fc no modificada, £S¡¡k?**. l.Á&.Í.t íÁ .lr , .«h ._- acetilada o pegilada. Los ratones fueron desangrados a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 dias y 3 días después de la inyección de proteina y los sueros se analizaron en un ensayo a base de ELISA estándar diseñado para detectar proteina Fltl (1-3) -Fc. La Tma? para todas las proteínas Fltl (1-3) -Fc fue entre los puntos de tiempo de 6 horas y 24 horas. La Cma.? para las proteínas diferentes fue como sigue: No modificada: 0.06 µg/ml - 0.15 µg/ml; acetilada: 1.5 µg/ml - 4.0 µg/ml y pegilada: aproximadamente 5 µg/ml.

Figuras 6A-6B. Análisis con gel IEF de proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificadas y acetiladas gradualmente. La proteína Fltl (1-3) -Fc no modificada no es capaz de entrar en el gel debido a su >9.3 pl, mientras que la mayoría de las muestras de Fltl (1-3) -Fc acetiladas gradualmente (muestras con un exceso de 30-100 veces) fueron capaces de migrar al gel y equilibrar a pls que variaban entre 4.55 - 8.43, dependiendo del grado de acetilación.

Figura 7. Unión de proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificada y Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente a placas recubiertas con Matrigel®. Al igual que con la proteina de control irrelevante, rTie2-Fc, Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente (muestras con excesos molares de 20 y 30 veces) no exhiben unión alguna a la placa recubierta con Matrigel, mientras que la Fltl £1-3) -Fc no acetilada exhibe una unión significativa. La muestra con un exceso molar de 10 veces 5 muestra unión reducida, pero el grado de acetilación no es suficiente como para bloquear completamente la unión a los componentes de la matriz extracelular.

Figura 8. Unión de Fltl (1-3) -Fc no modificada y 10 Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente en un ensayo a base de Biacore. A una relación sub-estequiométrica (0.5 µg/ml de Fltl (1-3) -Fc no modificada o Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente vs . 0.2 µg/ml de VEGF) , no hay Fltl (1-3) -Fc suficiente (ya sea no modificada o acetilada gradualmente) en 15 la solución como para unirse completamente al VEGF. A 1.0 µg/ml, lo cual se aproxima a una relación estequiométrica de 1:1, tanto la Fltl (1-3) -Fc no modificada como acetilada gradualmente son mejores para competir para la unión a VEGF, pero aún hay proteina Fltl (1-3) -Fc insuficiente (ya sea no 20 modificada o acetilada gradualmente) como para saturar completamente al VEGF disponible. Sin embargo, a 5.0 µg/ml, lo cual es varias veces mayor que una relación estequiométrica 1:1, tanto la Fltl (1-3) -Fc como las proteínas «Ü ¿W t .-fc.

Fltl (1-3) -Fc acetiladas gradualmente son capaces de saturar al VEGF, no obstante el grado de acetilación.

Figura 9. Perfiles farmacocinéticos de Fltl (1-3) -Fc no modificada y Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente. Ratones balb/c (23-28g) fueron inyectados subcutáneamente con 4 mg/kg de Fltl (1-3) -Fc no modificada o de muestras con exceso molares de 10, 20, 40, 60 y 100 veces de Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente (3 ratones para no modificada, muestras con excesos molares de 10, 20 y 40 veces y 2 ratones para muestras con excesos molares de 60 y 100 veces) . Los ratones se desangraron por la cola a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días y 3 días después de la inyección. Los sueros se analizaron en un ensayo a base de ELISA diseñado para detectar Fltl (1-3) -Fc. La Tmax para todas las proteínas Fltl (1-3) -Fc probadas fue en el punto de tiempo de 6 horas, pero la Cma> fue como sigue: Fltl (1-3) -Fc no modificada: 0.06 µg/ml; muestra con un exceso molar de 10 veces: 0.7 µg/ml; muestra con un exceso molar de 20 veces: 2 µg/ml; muestra con un exceso molar de 40 veces: 4 µg/ml; muestra con un exceso molar de 60 veces: 2 µg/ml; muestra con un exceso molar de 100 veces: 1 µg/ml.

. Ife --. ^ itjfcrg .il .

Figuras 10A-10D. Secuencia de ácido nucleico y aminoácidos deducida de Fltl (1-3) -Fc.

Figura 11. Diagrama esquemático de la estructura de Fltl.

Figuras 12A-12B. Análisis de hidrofilicidad de las secuencias de aminoácidos del dominio 2 Ig y el dominio 3 Ig de Fltl.

Figuras 13A-13D. Secuencia de ácido nucleico y aminoácidos deducida de Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc.

Figuras 14A-14C. Secuencia de ácido nucleico y aminoácidos deducida de Mut2: Fltl (2-3?B) -FC.

Figuras 15A-15C. Secuencia de ácido nucleico y aminoácidos deducida de Mut3: Fltl (2-3) -Fc.

Figuras 16A-16D. Secuencia de ácido nucleico y aminoácidos deducida de Mut4: Fltl (1-3R_>N) -Fc.

Figura 17. Unión de proteínas Fltl ( 1-3) -Fc no modificada, Fltl (1-3) -Fc mutante de deleción de región básica y Fltl (1-3) R->N mutantes en un ensayo a base de Biacore. En la relación sub-estequiométrica (0.25 µg/ml Fltl (1-3) -Fc de muestras no modificadas, acetiladas o genéticamente modificadas vs. 01. µg/ml de VEGF), hay suficiente proteína Fltl (1-3) -Fc como para bloquear la unión del VEGF a la Fltl (1-3) -Fc inmovilizada en el fragmento Biacore. A 0.5 µg/ml de proteinas Fltl (1-3) -Fc no modificadas, acetiladas o genéticamente modificadas, la relación estequiométrica se aproxima a 1:1 y hay una capacidad incrementada para bloquear la unión de VEGF al fragmento Biacore. A 1.0 µg/ml de proteinas Fltl (1-3) -Fc no modificadas, acetiladas o genéticamente modificadas, la cual es aproximadamente una relación estequiométrica de 10:1, las proteínas Fltl (1-3) -Fc son capaces de bloquear la unión de VEGF al fragmento Biacore, pero no son equivalentes. No modificadas, acetiladas y Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc son esencialmente iguales en su capacidad para bloquear la unión de VEGF, mientras que Mut4: Fltl (1-3R->N) -Fc es un poco menos eficiente en bloquear la unión.

Figura 18. Unión de Fltl (1-3) -Fc no modificada, proteínas mutantes Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc, Mut2 : Fltl (2-3?B) "Fe y Fltl (2-3) a placas recubiertas con Matrigel®. La proteina Fltl (1-3) -Fc no modificada se une ávidamente a estos pocilios, la proteina Mut3: Fltl (2-3) -Fc se une un poco más deficientemente, la proteina Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc se une aún más deficientemente y la proteína Mut2 : Fltl (2-3?B) -Fc muestra el mejor perfil, uniéndose en forma más deficiente que cualquiera de las demás proteínas mutantes. La proteína mutante de glicosilación Mut4: Fltl (1-3R->N) -Fc muestra sólo un beneficio marginal en el ensayo con Matrigel.

Figura 19. Unión de Fltl (1-3) -Fc no modificada, proteínas mutantes Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc, Mut2 : Fltl (2-3?B) -Fc y Fltl (2-3) en un ensayo a base de ELISA. A las concentraciones probadas, Fltl (1-3) -Fc no modificada, proteínas mutantes Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc, Mut2: Fltl (2-3?B) -Fc y Fltl (2-3) se unen a VEGF similarmente.

Figura 20. Perfiles farmacocinéticos de Fltl(l- 3)-Fc no modificada, proteínas mutantes Mutl: Fltl (1-3^) -Fc, Mut2: Fltl (2-3?B)-FC J Fltl (2-3) . La Cmax para estos reactivos Í? Í?.¿ Í. ..i ázL-y.... íi' ^í^. . . „ *??? . n-? »ü?itA?k? fue como sigue: Fltl (1-3) -Fc no modificada - 0.15 µg/ml; Fltl (1-3) -Fc acetilada con exceso molar de 40 veces - 1.5 µg/ml y Mutl: Fltl ( 1-3?B) -Fc - 0.7 µg/ml.

Figuras 21A-21C. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida del receptor Fltl modificado llamado FltlD2.FlklD3.Fc?Cl (a) .

Figuras 22A-22C. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida del receptor Fltl modificado llamado FltlD2.VEGFR3D3.Fc?Cl (a) .

Figura 23. Ensayo de Matriz Extracelular (ECM) .

Los resultados de este ensayo demuestran que las proteínas FltlD2.FlklD3.Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) son considerablemente menos pegajosas a la ECM en comparación con la proteina Fltl (1-3) -Fc.

Figuras 24A-24C. Secuencia de nucleótidos y de aminoácidos deducida del receptor Fltl modificado llamado VEGFRlR2-Fc?Cl (a) . ii¿... ,J: t. ??,j . Ái.Í.. i. i^ i^Á?,rí.. .. - . ; .i,.« .,.... - . - . . -i... .- - »-^. j --. . ._, - ..^.- - a ¿. AtA .l t Figuras 25A-25C. Ensayo de fosforilación. A un exceso molar de 1.5 ya sea de Fltl (1-3) -Fc, Fltl (1-3) -Fc (A40) o FltlD2.FlklD3.Fc?Cl (a) transitoria hay un bloqueo completo de la estimulación del receptor por estos tres receptores Fltl modificados en comparación con el desafio con medios de control. En contraste, la FltlD2VEGFR3D3. Fc?Cl (a) transitoria no muestra bloque significativo alguno a este exceso molar, en comparación con el desafío de control VEGF positivo. Se observan resultados similares en la figura 25B, en donde los receptores Fit modificados están en un exceso molar de 3 veces al ligando VEGF165. en la figura 25C, en donde los receptores Fltl están en un exceso molar de 6 veces al ligando VEGF165, el FltlD2VEGFR3D3. Fc?Cl (a) transitorio puede mostrarse ahora como bloqueando parcialmente la estimulación inducida por VEGF165 de receptores en la superficie de la célula.

Figuras 26A-26B. Ensayo de fosforilación. Detección por Western blot de VEGFR2(Flkl) fosforilado con tirosina mediante estimulación con ligando VEGF165 muestra que los receptores en la superficie de la célula no son fosforilados por muestras de desafio que tienen VEGF165 preincubada con exceso molar de 1 y 2 veces (figura 26A) o exceso molar de 3 y 4 veces (figura 26B) ya sea de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) transitoria, FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) estable o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) . A todas las concentraciones de receptor Fltl modificado probadas, existe una unión completa del ligando VEGF165 durante la preincubación, dando como resultado una estimulación no detectable de receptores de superficie de célula por VEGF165 no unida en comparación con el desafío con medios de control.

Figura 27. Ensayo de proliferación de células MG/R2. Los siguientes receptores Fit modificados Fltl (1-3)-Fc, FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) , más un receptor irrelevante llamado Tie2-Fc como un control negativo, se titularon de 40 nM a 20 pM y se incubaron en las células durante 1 hr a 37°C. El VEGF165 recombinante humano es medios definidos se añadió después a todos los pocilios a una concentración de 1.56nM. El receptor de control negativo Tie2-Fc no bloquea la proliferación de células inducida por VEGF165 a ninguna concentración, mientras que FltlD2.FlklD3.Fc?Cl (a) bloquea VEGF165 1.56nM con una dosis máxima media de O.dnM. Fltl (1-3) -Fc y FltlD2.VEGFR3D3.Fc?C! (a) son menos efectivas para bloquear - l i S-**SU?? VEGF165 en este ensayo con una dosis máxima media de ~ 2nM. El VEGF165 solo da una lectura de 1.2 unidades de absorbancia y el fondo es de 0.38 unidades de absorbancia.

Figura 28. Análisis Biacore de Estequiometría de Unión. Se calculó la estequiometria de unión como una relación molar de VEGF165 unido a la FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) , usando el factor de conversión de 1000 RU equivalente a 1 ng/ml. Los resultados indicaron estequiometría de unión de una molécula dimérica de VEGF165 por una molécula de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFR1R2- Fc?Cl (a) .

Figura 29 y Figura 30. Estequiometria por Cromatografia de Exclusión de Tamaño. FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) a una concentración de InM (estimada como de 1000 veces más alta que la KD de la FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o la interacción VEGFRlR2-Fc?Cl (a) /VEGF165) se mezclaron con concentraciones variadas de VEGF165. Después de la incubación, se midieron las concentraciones de la FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) libre en solución. Los datos muestran que la adición de 1 nM de VEGF165 en la solución de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) bloquea completamente la unión de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) a la superficie del VEGF165. Este resultado sugirió la estequiometría de unión de una molécula de VEGF165 por una molécula de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) .

Figura 31. Cromatografia de Exclusión de Tamaño (SEC) bajo condiciones nativas. El pico #1 representa el complejo FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) /VEGF165 y el pico #2 representa VEGF165 no unido. Las fracciones eluidas entre 1.1 y 1.2 ml fueron combinadas y se añadió clorhidrato de guanidinio (GuHCl) a una concentración final de 4.5M para disociar al complejo.

Figura 32. Cromatografia de Exclusión de Tamaño (SEC) bajo condiciones disociativas . Para separar los componentes del complejo receptor-ligando y para determinar su relación molar, 50 µl de complejo disociado se cargaron en Superóse 12 PC 3.2/30 equilibrado en GuHCl 6M y se eluyeron. El pico #1 representa FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y el pico #2 representa VEGF165.

Figura 33, Figura 34 y Figura 35. Cromatografía de Exclusión de Tamaño (SEC) con Dispersión de Luz En Línea. La columna de cromatografía de exclusión de tamaño con un detector de dispersión de luz en línea MiniDawn (Wyatt Technology, Santa Barbara, California) y detectores de índice refractivo (Rl) (Shimadzu, Kyoto, Japón) se usó para determinar el peso molecular (PM) di complejo receptor- ligando. Como se muestra en la figura 33, el perfil de elusión muestra dos picos. El pico #1 representa al complejo ligando-receptor y el pico #2 representa al VEGF165 no unido. Se calculó el PM de señales LS y Rl . Se usó el mismo procedimiento para determinar el PM de los componentes individuales del complejo receptor-ligando. Los resultados de estas determinaciones son como sigue: PM del complejo FltlD2FlklD3.Fc?Cl (a) /VEGF165 en la posición pico es 157 300 (figura 33), el PM de VEGF165 en la posición pico es 44 390 (figura 34) y el PM de R1R2 en el pico es 113 300 (figura 35) .

Figura 36. Mapeo con péptidos y análisi de glicosilación. Las estructuras de disulfuro y los sitios de glicosilación en FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) se determinaron mediante* un método de mapeo con péptidos. Hay un total de diez cisteínas en FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) ; seis de ellos pertenecen a la región Fc. Cys27 es unido por disulfuro a Cys76. Cysl21 es unido por disulfuro a Cys 182. Las primeras dos cisteínas en la región Fc (Cys211 y Cys214) forman un enlace de disulfuro intermolecular con las mismas dos cisteínas en otra cadena Fc. Sin embargo, no puede determinarse si la unión por disulfuro está ocurriendo entre las mismas cisteínas (Cys211 a Cys211, por ejemplo) o entre Cys211 y Cys214. Cys216 es unido por disulfuro a Cys306. Cys 352 es unido por disulfuro a Cys410. Hay cinco sitios de glicosilación N-enlazados posibles en FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) y se encuentran glicosilados en grados variables. La glicosilación completa se observa en Asn33, Asnl93 y Asn282. La glicosilación parcial se observa en Asn65 y Asnl20. Los sitios de glicosilación se resaltan estando subrayados en la figura.

Figura 37. Farmacocinética de Fltl (1-3) -Fc (A40), FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGFRlR2-Fc?Cl (a) . Ratones balb/c fueron inyectados subcutáneamente con 4 mg/kg de Fltl (1-3) -Fc (A40), FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente por CHO, FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente por CHO y VEGFRlR2-Fc?Cl (a) expresada transitoriamente por CHO. Los ratones fueron desangrados por la cola a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días, 3 días y 6 días después de la inyección. Los sueros se analizaron en una ELISA diseñada para detectar Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) . El Tma, para Fltl (1-3) -Fc (A40) fue a 6 horas mientras que el Tma para la FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) transitoria y estable y la VEGFR1R2-Fc?Cl(a) fue de 24 horas. La Cmax para Fltl (1-3) -Fc (A40) fue de 8 µg/ml, para ambas transitorias (FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGFRlR2-Fc?Cl (a) ) la Cmax fue de 18 µg/ml y la Cmax para la VEGFRlR2-Fc?Cl (a) estable fue de 30 µg/ml.

Figura 38. Farmacocinética de Fltl (1-3) -Fc (A40), FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) . Ratones balb/c fueron inyectados subcutáneamente con 4 mg/kg de Fltl (1-3) -Fc (A40), FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente por CHO y FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente por CHO. Los ratones fueron desangrados por la cola a 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 y 20 dias después de la inyección. Los sueros se analizaron en una ELISA diseñada para detectar Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFR3D3-Fc?Cl (a) . Fltl (1-3) -Fc (A40) ya no pudo detectarse en el suero después del día 5, mientras que FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) fueron detectables durante 15 días o más.

Figura 39. La capacidad de FltlD2.FlklD3.Fc?Cl (a) para inhibir Crecimiento de Tumor de Fibrosarcoma HT-1080 In Vivo. Un tratamiento cada otro día o 2 veces por semana de ratones SCID con FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) a 25 mg/Kg disminuye significativamente el crecimiento de tumores de fibrosarcona HT-1080 subcutáneos.

Figura 40, La capacidad de FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) para inhibir Crecimiento de Tumor de Glioma C6 In Vivo. Un tratamiento cada otro día o 2 veces por semana de ratones SCID con FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) disminuye significativamente el crecimiento de tumores de glioma C6 a dosis tan bajas como de 25 mg/Kg.

Figura 41. Hiperpermeabilidad Uterina Inducida por VEGF. PMSG inyectada subcutáneamente (5 Ul) para inducir la ovulación en ratas hembra antes de la pubertad da como *^^^X^^¡ ^k¡¡á- resultado una oleada de estradiol después de 2 días, lo cual a su vez causa una inducción de VEGF en el útero. Esta inducción resulta en la hiperpermeabilidad del útero y un incremento en el peso en húmedo uterino. La inyección subcutánea de Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFR3D3-Fc?Cl (a) a 25 mg/kg una hora después de la inyección de PMSG da como resultado una inhibición de aproximadamente 50% del incremento en el peso en húmedo del útero .

Figura 42A-42B. Determinación de Angiogénesis del Cuerpo Lúteo Usando Progesterona como una Presentación de Lectura. Se inyectó PMSG subcutáneamente (5 Ul) para inducir la ovulación en ratas hembra antes de la pubertad, dando como resultado un cuerpo lúteo completamente funcional que contenia una densa red de vasos sanguíneos que secreta progesterona en el torrente sanguíneo para preparar al útero para la implantación. La inducción de angiogénesis en el cuerpo lúteo requiere de VEGF. Los niveles en descanso de progesterona son de aproximadamente 5ng/ml y pueden inducirse a 25-40 mg/ml después de PMSG. La inyección subcutánea de Fltl (1-3) -Fc (A40) o FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) a 25 mg/kg o 5 mg/kg una hora después de la inyección de PMSG dio como resultado una inhibición completa de la inducción de progesterona el día 4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Ha sido un problema de larga duración en la técnica el producir un antagonista de VEGF a base de receptores que tenga un perfil farmacocinético que sea adecuado para que el antagonista se considere como un candidato terapéutico. Los solicitantes describen en la presente, por primera vez, una molécula de polipéptido quimérica, capaz de antagonizar la actividad de VEGF, que exhibe propiedades farmacocinéticas mejoradas en comparación con otros antagonistas de VEGF a base de receptores. Las moléculas de polipéptido quiméricas descritas en la presente proporcionan de esta forma por primera vez moléculas adecuadas para usarse en terapias en las cuales el antagonismo de VEGF sea un resultado deseado. La presente invención proporciona moléculas de polímero quiméricas novedosas formadas fusionando un dominio de unión de ligando extracelular modificado del receptor Fltl a la región Fc IgG. El dominio de unión del ligando extracelular se define como la porción de un receptor que, en su conformación nativa en la membrana de la célula, está orientado extracelularmente en donde puede hacer contacto con su ligando cognado. El dominio de unión de ligando extracelular no incluye los aminoácidos hidrófobos asociados con el dominio de transmembrana del receptor o cualquier aminoácido asociado con el dominio intracelular del receptor. Generalmente, el dominio intracelular o citoplásmico de un receptor está compuesto normalmente de aminoácidos cargados positivamente o polares (por ejemplo, lisina, arginina, histidina, ácido glutámico, ácido aspártico) . Los 15-30 aminoácidos precedentes, predominantemente hidrófobos o apolares (es decir, leucina, valina, isoleucina y fenilalanina) comprenden el dominio de transmembrana. El dominio extracelular comprende los aminoácidos que preceden al tramo de transmembrana hidrófobo de los aminoácidos. Normalmente el dominio de transmembrana está flanqueado por aminoácidos positivamente cargados o polares tales como lisina o arginina. Von Heijne ha publicado reglas detalladas que son llamadas comúnmente por los expertos en la técnica cuando se determina qué aminoácidos de cierto receptor pertenecen a los dominios extracelular, de transmembrana o intracelular (véase von Heijne, 1995, BioEssays l_7:25-30) . o- z alternativa, los sitios en red de Internet, tales como htt : //ulrec3. unil . ch/software/TMPRED form.html . se han vuelto disponibles para proporcionar a los químicos de proteínas información acerca de hacer predicciones acerca de dominios de proteínas. La presente invención proporciona la construcción de moléculas de ácido nucleico que codifican para moléculas de polipéptido quiméricas que son insertadas en un vector que es capaz de expresar las moléculas de polipéptido quiméricas cuando es introducido en una célula huésped adecuada. Las células huésped adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, células bacterianas, células de levadura, células de insecto y células de mamífero. Cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la técnica para la inserción de fragmentos de ADN en un vector pueden usarse para construir vectores de expresión que codifiquen para las moléculas de polipéptido quiméricas bajo el control de señales de control transcripcional/traduccional. Estos métodos pueden incluir técnicas de ADN recombinante ín vivo y sintéticas, y recombinaciones in vi vo (recombinación genética) (Véase Sambrook, et al . , Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, Eds. Ausubel, et al . , Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY) .

^^^-^^ La expresión de moléculas de ácido nucleico que codifican para las moléculas de polipéptido quiméricas puede regularse por una segunda secuencia de ácido nucleico para que la molécula de polipéptido quimérica sea expresada en un huésped transformado con la molécula de ADN recombinante . Por ejemplo, la expresión de las moléculas de polipéptido quiméricas descritas en la presente puede controlarse por cualquier elemento promotor/mejorador conocido en la técnica. Los promotores que pueden usarse para controlar la expresión de las moléculas de polipéptido quiméricas incluye, pero no están limitadas a, la repetición terminal larga como la descrita en Squinto et al . , (1991, Cell _65:l-20); la región promotora temprana SV40 (Bernoist and Chambón, 1981, Nature 290: 304-310) , el promotor de CMV, la repetición terminal M-MuLV 5' , el promotor contenido en la repetición terminal larga 3' del virus de sarcoma de Rous (Yamamoto, et al . , 1980, Cell 22:787-797), el promotor de timidina cinasa del herpes (Wagner et al . , 1981, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 78^:144-1445), las secuencias reguladoras del gen de metalotionina (Brinster et al . , 1982, Nature 296:39-42) ; vectores de expresión procarióticos tales como el promotor de ß-lactamasa (Villa-Ka aroff, et al . , 1978, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 75:3727-3731) o el promotor tac (DeBoer, et al . , &+ ¿t*}k?±k+íuia?*k.^ >*M?é&*r &-x«.*. ^.x' ,,., y. ^á^j^^^wt^^j^^^^^E^^^^i 1983, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25, véase también "Useful proteins from recombinant bacteria" en Scientific American, 1980, 242:74-94) ; elementos promotores de levadura u otros hongos tales como el promotor Gal 4, el promotor de ADH (alcohol deshidrogenasa), promotor de PGK (fosfoglicerol cinasa) , promotor de fosfatasa alcalina y las siguientes regiones de control transcripcional animales, las cuales exhiben especificidad de tejidos y se han utilizado en animales transgénicos: región de control del gen de elastasa I que es activa en células acinares pancreáticas (Swift et al . , 1984, Cell 38:639-646; Ornitz et al . , 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant . Biol. 50:399-409; MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515); región de control del gen de insulina, la cual es activa en células beta pancreáticas (Hanahan, 1985, Nature 315:115-122), región de control del gen de inmunoglobulina que es activa en células linfoides (Grosschedl et al . , 1984, Cell 38:647-658; Adames et al . , 1985, Nature 318:533-538; Alexander et al . , 1987, Mol. Cell.

Biol. 7:1436-1444), región de control del virus de tumor mamario de ratón, la cual es activa es células testiculares, de mama, linfoides y cebadas (Leder et al . , 1986, Cell 45:485-495), región de control del gen de albúmina que es activa en el hígado (Pinkert et al . , 1987, Genes and Devel. _l:268-276), región de control del gen de alfa-fetoproteína, la cual es activa en el hígado (Krumlauf et al . , 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648; Ha er et al . , 1987, Science 235:53-58); región de control del gen de alfa 1-antitripsina, la cual es activa en el hígado (Kelsey et al . , 1987, Genes and Devel. 1 : 161-171), región de control del gen de beta-globina, la cual es activa en células mieloides (Mogram et al . , 1985, Nature 315:338-340; Kollias et al . , 1986, Cell 46:89-94); región de control del gen de proteína básica de mielina, la cual es activa en células de oligodendrocitos en el cerebro (Readhead et al . , 1987, Cell 48:703-712); región de control del gen de la cadena ligera-2 de miosina, la cual es activa en músculo esquelético (Shani, 1985, Nature 314 : 283-286) y región de control del gen de hormona de liberación gonadotrópica, la cual es activa en el hipotálamo (Masón et al . , 1986, Science 234:1372-1378). De esta manera, de acuerdo con la invención, los vectores de expresión capaces de ser replicados en un huésped bacteriano o eucariótico que comprenden ácido nucleico que codifica para moléculas de polipéptido quiméricas como los descritos en la presente, se usan para transfectar al huésped y de esta manera dirigir la expresión de estos ácidos nucleicos para producir las moléculas de polipéptido Í.«-L--L-*----* - t quiméricas, las cuales pueden recuperarse después en una forma biológicamente activa. Según se usa en la presente, una forma biológicamente activa incluye una forma capaz de unirse a VEGF. Los vectores de expresión que contienen las moléculas de polipéptido quiméricas descritas en la presente pueden identificarse por tres enfoques generales: a) hibridación ADN-ADN, b) presencia o ausencia de funciones de gen "marcador" y c) expresión de secuencias insertadas. En el primer enfoque, la presencia de un gen extraño insertado en un vector de expresión puede detectarse mediante hibridación de ADN-ADN usando sondas que comprenden secuencias que son homologas a las secuencias de la molécula de polipéptido quimérica insertadas. En el segundo enfoque, el sistema de vector/huésped recombinante puede ser identificado y seleccionado con base en la presencia o ausencia de ciertas funciones de gen "marcador" (por ejemplo, actividad de timidina cinasa, resistencia a antibióticos, fenotipo de transformación, formación de cuerpo de oclusión en baculovirus, etc.) causadas por la inserción de genes extraños en el vector. Por ejemplo, si la secuencia de ADN de la molécula de polipéptido quimérica se inserta dentro de la secuencia del gen marcador del vector, recombinantes que contengan el inserto pueden identificarse por la ausencia de la función del gen marcador. En el tercer enfoque, los vectores de expresión recombinantes pueden identificarse analizando al producto de gen extraño expresado por el recombinante. Estos ensayos pueden basarse, por ejemplo, en las propiedades físicas o funcionales de las moléculas de polipéptido quiméricas. Las células de la presente invención pueden expresar transitoriamente o, de preferencia, constitutiva y permanentemente las moléculas de polipéptido quiméricas. Las moléculas de polipéptido quiméricas pueden purificarse mediante cualquier técnica que permita la formación subsecuente de una molécula de polipéptido quimérica biológicamente activa. Por ejemplo, y no a manera de limitación, los factores pueden recuperarse de las células ya sea como proteinas solubles o como cuerpos de inclusión, de los cuales pueden extraerse cuantitativamente mediante clorhidrato de guanidinio 8M y diálisis (véase, por ejemplo, Builder, et al . , patente de E.U.A. No. 5,663,304). Para purificar más los factores, se pueden usar cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de fase inversa o filtración en gel convencionales .

*-*- En una modalidad de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica para el primer componente está hacia el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para el segundo componente. En otra modalidad de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica para el primer componente está hacia el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica para el segundo componente. Pueden prepararse modalidades adicionales de la invención en las cuales el orden de los primero, segundo y tercero componentes de polipéptido de fusión pueda reacomodarse. Por ejemplo, si la secuencia de nucleótidos que codifica para el primer componente es designada 1, la secuencia de nucleótidos que codifica para el segundo componente es designada 2, y la la secuencia de nucleótidos que codifica para el tercer componente es designada 3, entonces el orden de los componentes en el ácido nucleico aislado de la invención se lee de 5' a 3' puede ser cualquiera de las siguientes seis combinaciones: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2 ó 3,2,1. La presente invención tiene también utilidades de diagnóstico y terapéuticas. En modalidades particulares de la invención, los métodos para detectar aberraciones en la función o expresión de las moléculas de polipéptido quiméricas descritas en la presente pueden usarse en el ?ÍAl¿j& .A. * itJÍ& -i..*. Jbiai i. ,, .- ..-A^---... . -t-jfr diagnóstico de trastornos. En otras modalidades, la manipulación de las moléculas de polipéptido quiméricas o agonistas o antagonistas que se unen a las moléculas de polipéptido quiméricas pueden usarse en el tratamiento de 5 enfermedades. En modalidades adicionales, la molécula de polipéptido quimérica se utiliza como un agente para bloquear la unión de un agente de unión a su objetivo. A manera de ejemplo, perno no de limitación, el método de la invención puede ser útil en el tratamiento de 10 condiciones clínicas que se caracterizan por permeabilidad vascular, edema o inflamación tal como edema de cerebro asociado con lesión, ataque o tumor; edema asociado con trastornos inflamatorios tales como psoriasis o artritis, incluyendo artritis reumatoide; asma; edema generalziado 15 asociado con quemaduras; ascites y efusión pleural asociada con tumores, inflamación o trauma; inflamación crónica de vía aérea; síndrome de derrame capilar; sepsis; enfermedad de riñon asociada con derrame excesivo de proteínas y trastornos del ojo tales como degeneración macular relacionada con la 20 edad y retinopatía diabética. Un análisis de secuencia de aminoácidos de Fltl(l- 3)-Fc reveló la presencia de un número inusualmente alto (46) del residuo de aminoácido básico lisina. Un análisis IEF de Fltl (1-3) -Fc mostró que esta proteina tiene pl más alto que 9.3, confirmando la predicción de que la proteina es muy básica. Se estableció la hipótesis de que la naturaleza básica de la proteína Fltl (1-3) -Fc le causaba unirse a los componentes de la matriz celular, y de que esta interacción pudiera ser la causa de la vida media del suero circulante detectable extremadamente corta exhibida por Fltl (1-3) -Fc cuando se inyecta en ratones. Para probar esta hipótesis, la proteína Fltl (1-3) -Fc se acetiló en los residuos de lisina para reducir la carga básica. La Fltl (1-3) -Fc acetilada se probó después en los ensayos descritos abajo. Los siguientes ejemplos se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación.

Ejemplos Ejemplo 1 Expresión de proteína Fltl (1-3) -Fc en células CHO Kl .

Usando técnicas de biología molecular estándares (véase, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al . , Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al . , Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY) , el gen que codifica para Fltl (1-3) -Fc se insertó en el vector de expresión pEE14.1 (Lonza Biologícs, pie) en un sitio de clonación múltiple hacia el extremo 3' del promotor de CMV. Células CHO Kl se transfectaron con la construcción de ADN pEE14.1/Fltl (1-3) -Fc usando lipofecta ina (Gaithersburg, MD) . Las células CHO Kl transfectadas se cultivaron en DMEM libre de glutamina (JRH, Kansas City, MO) que contenía 25 µM de sulfoximina de metionina (MSX) de Sigma Inc., St. Louis, MO, y expresores de proteínas recombinantes altos se obtuvieron analizando los sobrenadantes de células CHO Kl de más de 100 aislados de colonia recogidos manualmente usando un inmunoensayo estándar que captura y detecta Fc humana. El clon recogido manualmente seleccionado se amplificó en presencia de 100 µM de MSX seguido por una segunda ronda de análisis de los clones amplificados. El clon de más alta producción tuvo una productividad específica de proteína Fltl (1-3) Fc recombinante de 55 pg/célula/día . El clon seleccionado se expandió en matraces en T de 225 cm- (Corning, Acton, MA) y después en botellas giratorias de 8.5L (Corning, Acton, MA) usando los medios de cultivo de células descritos arriba. Las células se removieron de las botellas giratorias mediante tripsinización l.L i¡ *. ? *. ¡ tj. I .jJ J' l estándar y se pusieron en 3.5L de medio de suspensión. El medio de suspensión comprende medio ISCHO libre de glutamina (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) que contiene 5% de suero de bovino fetal (FBS de Hyclone Labs, Logan, UT) , 100 µM de 5 MSX y suplemento GS (JRH Scientific, Kansas City, MO) en un bioreactor Celligen de 5L (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) a una densidad de 0.3 x 106 células/mL. Después de que las células alcanzaron una densidad de 3.6 x 106/mL y se adaptaron a la suspensión, fueron transferidas a 10 un bioreactor de 60L (ABEC, Allentown, PA) a una densidad de 0.5 x 106 células/mL en 20L de medio ISCHO con 5% de suero de bovino fetal. Después de dos dias se añadieron al bioreactor 20L adicionales de ISCHO + 5% de suero de bovino fetal. Las células se dejaron crecer durante dos días adicionales 15 alcanzando una densidad final de 3.1 x 106 células/mL, y una concentración final de Fltl (1-3) -Fc en la cosecha fue de 95 mg/L. En la cosecha las células fueron removidas mediante filtración por flujo tangencial usando filtros Prostak de 0.45 µm (Millipore, Inc., Bedford, MA) 20 Ejemplo 2 Purificación de proteína Fltl (1-3) -Fc obtenida de células CHO Kl La proteina Fltl (1-3) -Fc se purificó inicialmente mediante cromatografía de afinidad. Se usó una columna Protein A para unir, con alta especificidad, la porción Fc de la molécula. Esa proteína purificada por afinidad se concentró y se pasó después sobre una columna SEC. La proteína se eluyó después en el regulador de pH de formulación. A continuación se describen estos procedimientos en detalle.

Materiales y métodos Todos los químicos se obtuvieron de J.T. Baker, Phillipsburg, NJ con excepción del PBS, el cual se obtuvo como un concentrado 10X de Life Technologies, Gaithersburg, MD. Las resinas grado preparación Protein A Fast Flow y Superdex 200 se obtuvieron de Pharmacia, Piscataway, NJ. El equipo y membranas para la concentración de proteínas se obtuvieron de Millipore, Bedford, MA. Aproximadamente 40L de medio acondicionado con CHO filtrado an G.45µm que contenía proteína Fltl (1-3) -Fc se .r.. & , Í ,Í-..Í aplicaron a una columna Protein A Fast Flow de 290 mL (10 cm de diámetro) que había sido equilibrada con PBS. La columna se lavó con PBS que contenía 350mM de NaCl y 0.02% de CHAPS, y la proteína unida se eluyó con 20 mM de ácido cítrico que contenía lOOmM de Na2HP04. Se tomó el pico individual en la elución y su pH se elevó a neutralidad con NaOH 1M. Las fracciones del eluato se concentraron a aproximadamente 9 mg/mL usando membranas de celulosa regeneradas 10K tanto mediante filtración por flujo tangencial como por concentración de células agitadas. Para remover los agregados y otros contaminantes, la proteina concentrada se aplicó a una columna empacada con resina grado preparación Superdex 200 (lOcm x 55cm) y se corrieron en PBS que contenía 5% de glicerol. Las fracciones pico principales se reunieron, se filtraron estérilmente, se formaron en alícuotas y se almacenaron a -80°C.

Ejemplo 3 Acetilación de la proteína Fltl (1-3) -Fc Dos miligramos de proteína Fltl (1-3) -Fc se acetilaron como se describe en el manual de instrucciones ..-»¿? ¿.i, . -£-* ..-.? -.-&-. . Á.-4. á proporcionado con el kit de modificación sulfo-NHS-acetato (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat. #26777).

Ejemplo 4 Caracterización de proteína Fltl (1-3) -Fc acetilada (a) Análisis IEF: Fltl (1-3) -Fc y Fltl(l-3)-Fc acetilada se analizaron mediante análisis IEF estándar. Como se muestra en la figura 1, la proteína Fltl (1-3) -Fc no es capaz de emigrar al gel y por lo tanto tiene que tener un pl de más de 9.3, el más alto pl en el estándar. Sin embargo, la Fltl (1-3) -Fc acetilada es capaz de migrar al gel y equilibrarse a un pl de aproximadamente 5.2. Este resultado demuestra que la acetilación reduce la carga positiva neta de la proteína y por lo tanto su pl considerablemente. (b) Unión a componentes de la matriz extracelular Para probar la unión a los componentes de la matriz extracelular, Fltl (1-3) -Fc y Fltl (1-3) -Fc acetilada se probaron en un ensayo diseñado para simular la interacción con los componentes de la matriz extracelular. En este ensayo, placas de cultivo de tejidos de 96 pocilios se recubren con Matrigel (placa de 96 pocilios de capa delgada ?Jf? it A?r -di- l tn.t- fclt~. *&--! ¿ a. l de matriz Biocoat MATRIGEL®, Catálogo #40607, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) . Las placas incubadas con concentraciones variables de proteínas Fltl (1-3) -Fc, Fltl(l-3)-Fc acetilada o rTie2-Fc (un control irrelevante) se añaden a los pocilios. Las placas se incuban durante 1-2 horas ya sea a temperatura ambiente o a 37 °C y después la detección de las proteínas unidas se logra añadiendo un anticuerpo Fc anti-humano conjugado a fosfatasa alcalina secundario a los pocilios. Finalmente, un sustrato de fosfatasa alcalina se añade a los pocilios y se mide la densidad óptica. La figura 2 muestra los resultados de este ensayo. Al igual que la proteína de control irrelevante rTie2-Fc, la Fltl (1-3) -Fc acetilada no exhibe unión alguna a la placa recubierta con Matrigel, mientras que la proteína Fltl (1-3) -Fc no acetilada exhibe una unión significativa. Este resultado indica que la acetilación de residuos de aminoácidos básicos es una forma efectiva para interferir con las interacciones de carga que existen entre proteínas positivamente cargadas y los componentes de la matriz extracelular negativamente cargados a los que son expuestos in vi vo . .i fr.

Ejemplo 5 Pegilación de la proteína Fltl (1-3) -Fc Aunque la pegilación (polietilenglicol - PEG) de proteínas ha mostrado incrementar su potencia in vi vo mejorando la estabilidad y biodisponibilidad minimizando al mismo tiempo la inmunogenicidad (véanse referencias citadas arriba) , es contraintuitivo que las moléculas pegilantes que son demasiado grandes como para ser filtradas por los glomérulos del riñon pudieran mejorar sus propiedades farmacocinéticas. Sin ser limitados por teoría, los solicitantes postularon que la pegilación de las moléculas Fltl (1-3) -Fc podría mejorar las propiedades farmacocinéticas, posiblemente no alterando la carga positiva o disminuyendo el pl de Fltl (1-3) -Fc, sino más bien protegiendo físicamente las cargas positivas de la interacción con la matriz extracelular. Los solicitantes decidieron intentar mejorar las propiedades farmacocinéticas de las moléculas de Fltl(l-3)-Fc uniendo hebras de PEGs de 20K como se describe abajo.

Materiales y métodos Fltl (1-3) -Fc purificada derivada de células CHO (véase arriba) se usó en los siguientes experimentos de ^&-^ ^ & & ?. pegilación. PEGs funcionalizados se obtuvieron de Shearwater Polymers, Huntsville, AL; Bicine de Sigma, St Louis, MO; columna Superóse 6 de Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS como un concentrado 10X de Life Technologies, Gaithersburg, MD; Glicerol de J.T. Baker, Phillipsburg, NJ y geles precolados Bis-Tris de Novex, CA. Hebras de PEG de 20K funcionalizadas con porciones terminales específicas para amina se usaron en estudios de reacción a pequeña escala que fueron establecidos para evaluar diferentes condiciones de reacción en las cuales la estequiometría PEG:proteína fue variada. Con base en estas reacciones y los análisis de las muestras en SDS-PAGE estándar, Fltl (1-3) -Fc a una concentración de 1.5 mg/mL se hizo reaccionar a pH 8.1 con 20K de SPA-PEG (PEG propionato de succinimidilo) a una relación molar de monómero PEG-a-Fltl(l-3)-Fc de 1:6. La reacción se dejó proceder a 8°C durante la noche. Para la purificación inicial, los productos de reacción se aplicaron a una columna Superóse 6 de 10 mm x 30 cm equilibrada con PBS que contenía 5% de glicerol. La columna pareció separar moléculas de Fltl (1-3)-Fc pegiladas con base en el grado de pegilación. Se reunieron las fracciones que correspondían a lo que parecía ser principalmente Fltl (1-3) -Fc dimérica mono-pegilada y di- pegilada, según se juzga por los patrones de bandas en geles de SDS-PAGE reductores y no reductores. La concentración de proteína se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm. La proteína Fltl (1-3) -Fc pegilada fue filtrada estérilmente, formada en alícuotas y almacenada a -40°C.

Ejemplo 6 Unión de Fltl (1-3) -Fc no modificada, acetilada y pegilada en un ensayo a base de Biacore Proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificada, acetilada y pegilada se probaron en un ensayo a base de Biacore para evaluar su capacidad para unirse al ligando de Fltl, VEGF. En este ensayo, la proteína Fltl (1-3) -Fc no modificada se inmovilizó sobre la superficie de un fragmento Biacore (véase el manual de instrucciones de Biacore, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, para procedimientos estándares) y una muestra que contenía 0.2 µg/mL de VEGF y Fltl (1-3) -Fc no modificada, Fltl (1-3) -Fc acetilada o Fltl (1-3) -Fc pegilada (cada una a 25 µg/ml) se pasó sobre el fragmento recubierto con Fltl (1-3)-Fc. Para minimizar los efectos de la unión no específica, las muestras unidas se lavaron con un lavado de NaCl 0.5M. £v. ur.a muestra, la Fltl(I-3)-Fc no modificada se mezcló con t?,í¿,.? 3Ásü , ¿.. ,X.Í.. ^^^^^-^^^¡^^¡^^3^^^^ heparina. La heparina es una molécula negativamente cargada y la proteína Fltl (1-3) -Fc es una molécula positivamente cargada, por lo que cuando las dos moléculas se mezclan juntas, deben interactuar a través de sus cargas respectivas. Esto neutraliza esencialmente la carga positiva inherente de la Fltl (1-3) -Fc haciendo que la molécula se comporte como si hubiera sido modificada química o genéticamente para reducir su carga y su tendencia a unirse por medio de interacciones de carga. Como se muestra en la figura 3, la Fltl (1-3) -Fc acetilada (columnas 13-16), pegilada (columnas 17-20) y tratada con heparina (columnas 21-24) son cada una capaces de competir completamente con la Fltl (1-3) -Fc unida al fragmento Biacore para la unión a VEGF en comparación con proteínas de control (columnas 1-4) e irrelevantes (columnas 5-8). Fltl (1-3) -Fc no modificada (columnas 5-6) pareció competir sólo parcialmente con la Fltl (1-3) -Fc unida a fragmento Biacore por la unión a VEGF. Sin embargo, el lavado de las muestras unidas con NaCl 0.5M (columna 7-8) dio como resultado un perfil de unión similar al de las formas modificadas de Fltl (1-3) -Fc, indicando que la proteína no modificada exhibía unión no específica al fragmento que podía ser eliminada por el lavado con sal.

Ejemplo 7 Unión de Fltl (1-3) -Fc no modificada, acetilada y pegilada en un ensayo a base de ELISA 5 Proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificadas, acetiladas y pegiladas se probaron en un ensayo a base de ELISA estándar para evaluar su capacidad para unirse al ligando VEGF del receptor Fltl. Como se muestra en la figura 4, las proteínas Fltl (1-3) -Fc tanto pegilada como acetilada son capaces de 10 unirse a VEGF, demostrando que modificando la proteína ya sea mediante pegilación o acetilación no se destruye su capacidad para unirse a su ligando.

Ejemplo 8 15 Análisis farmacocmético de Fltl (1-3) -Fc no modificada, Fltl (1-3) -Fc acetilada y Fltl (1-3) -Fc pegilada Experimentos in vivo se diseñaron para determinar los perfiles farmacocinéticos de proteína Fltl (1-3) -Fc no 20 modificada, Fltl (1-3) -Fc acetilada y Fltl (1-3) -Fc pegilada. Ratones balb/c (23-28g; 3 ratones/grupo) se inyectaron subcutáneamente con 4 mg/Kg de Fltl (1-3) -Fc no modificada, acetilada o pegilada. Los ratones se desangraron por la cola a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días y 3 días después de la inyección de la proteína. Los sueros se probaron en un ensayo a base de ELISA estándar diseñado para detectar la proteína Fltl (1-3) -Fc. Brevemente, el ensayo incluye recubrir una placa de ELISA con VEGF, unir el suero que contiene Fltl (1-3) -Fc no modificada, acetilada o pegilada, y reportar con un anticuerpo anti-Fc unido a fosfatasa alcalina. Como se muestra en la figura 5, el Tmax para todas las proteínas Fltl (1-3) -Fc fue entre los puntos de tiempo de 6 horas y 24 horas. La Cmax para las diferentes proteínas fue como sigue: no modificada 0.06 µ/ml - 0.15 µg/ml; acetilada: 1.5 µg/ml - 4.0 µg/ml; y pegilada: aproximadamente 5 µg/ml.

Ejemplo 9 Acetilación gradual de Fltl (1-3) -Fc Para determinar qué cantidad mínima de acetilación es necesaria para eliminar la unión a los componentes de la matriz extracelular, se diseñó un experimento que acetilaba la proteína Fltl (1-3) -Fc de una manera gradual usando cantidades cada vez más altas de excesos molares de reactivo de acetilación en la mezcla de reacción de acetilación. La *- l -;.&*...,. escala de excesos molares fue como sigue: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 y 100 moles de reactivo de acetilación por 1 mol del monómero de Fltl (1-3) -Fc. Las reacciones se llevaron a cabo como se detalla en el manual de instrucciones proporcionado con el equipo de modificación sulfo-NHS-Acetate (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, Cat. #26777).

Ejemplo 10 Caracterización de Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente (a) Análisis IEF: Proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificada y Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente se analizaron mediante análisis IEF estándar. Como se muestra en la figura 6A-6B, la proteína Fltl (1-3) -Fc no modificada no fue capaz de migrar al gel debido a su pl extremadamente alto (mayor que 9.3). Sin embargo, la mayoría de las muestras de Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente (muestras con excesos molares de 30-100 veces) fueron capaces de migrar al gel y de equilibrarse a pls que variaban entre 4.55 - 8.43, dependiendo del grado de acetilación de la proteina. Este resultado demuestra que la acetilación puede cambiar la carga positiva de la proteína de una manera dependiente de dosis y Í Á- i á.jfciifaAA-i&t, aa ,^».! .... .<. r* J&->t ^^Í^^ J^^^£^^£*wK |?gg^to^j^^ que la reducción del pl puede controlarse controlando el grado de acetilación. (b) Unión de Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente a componentes de la matriz extracelular Para probar la unión a los componentes de la matriz extracelular, Fltl (1-3) -Fc y Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente se probaron en el ensayo descrito arriba diseñado para simular la interacción con los componentes de la matriz extracelular. Concentraciones variables de proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificada, Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente (muestras con un exceso molar de 10, 20 y 30 veces) o rTie2-Fc (un control irrelevante) se añadieron a los pocilios. Las placas se incubaron durante 1-2 horas a temperatura ambiente o 37 °C y después la detección de las proteinas unidas se logró añadiendo un anticuerpo Fc antihumano conjugado a fosfatasa alcalina secundario a los pocilios. El substrato de fosfatasa alcalina se añadió posteriormente a los pocilios y se midió la densidad óptica. La figura 7 muestra los resultados de este ensayo. Al igual que la proteína de control irrelevante rT?e2-Fc, la Fltl(l-3)-Fc acetilada gradualmente (muestras con excesos molares de 20 y 30 veces) no exhibió unión significativa alguna a la t&^ ? * .áaÍi?i ?????A**i¡a**~<,* **. *. „^ » . -i u , -'.jw_ - j, . .. «aa,?fc. . . - a»? i *- , placa recubierta con Matrigel, mientras que la proteína Fltl (1-3) -Fc no acetilada exhibió una unión significativa. La unión es saturable, indicando que la proteína Fltl (1-3) -Fc podría unirse a sitios específicos, en lugar de una interacción mediada por carga más general que pudiera no ser saturable. La muestra con un exceso molar de 10 veces mostró una unión reducida, pero el grado de acetilación no fue suficiente como para bloquear completamente la unión a los componentes de la matriz extracelular. Las muestras con un exceso molar de 20 veces y más alto no presentaron una unión detectable, a pesar del hecho de que mediante análisis IEF (figuras 6A y 6B) las muestras con un exceso molar más bajo aún tenían una gran carga positiva neta. Este resultado demuestra que no es necesario acetilar completamente todos los aminoácidos básicos para poder eliminar la unión a los componentes de la matriz extracelular. (c) Unión de Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente en un ensayo a base de Biacore Proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificada y acetilada gradualmente se probaron en un ensayo a base de Biacore para evaluar su capacidad para unirse al ligando de Fltl, VEGF. En este ensayo, proteína Fltl (1-3) -Fc no modificada (0.5, 1.0 .-.. -- «* * * *A. a >* i * ó 5.0 µg/ml) se inmovilizó sobre la superficie de un fragmento Biacore (véase el manual de instrucciones de Biacore, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, para procedimientos estándares) y una solución que contenía 0.2 µg/ml de VEGF y Fltl (1-3) -Fc no modificada (a 0.5, 1.0 ó 5.0 µg/ml) o 10 muestras de Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente (a 0.5, 1.0, ó 5.0 µg/ml cada una) diferentes se pasaron sobre el fragmento recubierto con Fltl (1-3) -Fc. Como se muestra en la figura 8, a una relación sub-estequiométrica (0.5 µg/ml ya sea de Fltl (1-3) no modificada o de Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente vs . 0.2 µg/ml de VEGF), no hay suficiente Fltl (1-3) -Fc (ya sea no modificada o acetilada gradualmente) en la solución como para unirse completamente al VEGF. A 1.0 µg/ml, lo cual se aproxima a una relación estequiométrica 1:1, tanto la Fltl (1-3) -Fc modificada como la acetilada gradualmente son más capaces de competir por la unión a VEGF, pero existe aún proteína Fltl (1-3) -Fc insuficiente (ya sea no modificada o acetilada gradualmente) como para unirse completamente al VEGF disponible. Sin embargo, a 5.0 µg/ml, lo cual es muchas veces mayor que una relación estequiométrica 1:1, tanto la proteína Fltl (1-3) -Fc como la Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente son capaces de unirse al • i ? i» a- -i Airi ^aJt VEGF, sin importar el grado de acetilación. Esto demuestra claramente que la acetilación no altera la capacidad de la Fltl (1-3) -Fc para unirse a VEGF. (d) Análisis farmacocinético de Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente Se diseñaron experimentos in vi vo para determinar los perfiles farmacocinéticos de proteína Fltl (1-3) -Fc no modificada y Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente. Ratones balb/c (23-28g) se inyectaron subcutáneamente con 4 mg/kg de muestras con excesos molares de 10, 20, 40, 60 y 100 veces o no modificadas de Fltl (1-3) -Fc acetilada gradualmente (3 ratones para muestras no modificada, de excesos molares de 10, 20 y 40 veces y dos ratones para muestras con excesos molares de 60 y 100 veces) . Los ratones se desangraron por la cola a 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 dias y 3 dias después de la inyección. Los sueros se probaron en un ensayo a base de ELISA diseñado para detectar Fltl (1-3) -Fc (descrito arriba). La figura 9 detalla los resultados de este estudio. El Tmax para todas las proteínas Fltl (1-3) -Fc probadas fue en el punto de tiempo de 6 horas, pero la Cmax fue como sigue: Fltl (1-3) -Fc no modificada: 0.06 µg/ml; muestra con un exceso molar de 10 veces: -0.7 µg/ml, muestra con un exceso molar de - *> * á *- 20 veces -2 µg/ml, muestra con un exceso molar de 40 veces -4 µg/ml, muestra con un exceso molar de 60 veces -2 µg/ml, muestra con un exceso molar de 100 veces -1 µg/ml. Estos resultados demuestran que la acetilación o pegilación de Fltl (1-3) -Fc mejora significativamente su perfil farmacocinético .

Ejemplo 11 Construcción del mutante de deleción de la región básica de Fltl (1-3) -Fc designado Mutl : Fltl (1-3?B) -FC Con base en la observación de que la Fltl (1-3) -Fc acetilada, la cual tiene un pl de menos de 6, tiene mucho mejor farmacocinética que la Fltl (1-3) -Fc (pl > 9.3) positiva y no modificada, surgió la pregunta de si la diferencia en farmacocinética podría atribuirse a la carga neta de la proteína, la cual la hizo adherirse a los componentes de la matriz extracelular negativamente cargados, o de si tal vez hay lugares específicos sobre la superficie de la proteína Fltl (1-3) -Fc que constituían sitios de unión específicos para los componentes de la matriz extracelular. Por ejemplo, se sabe que muchas proteínas tienen sitios de unión a heparina, que consisten comúnmente en un racimo de residuos básicos. lili- -n-TtíH» Algunas veces estos residuos se encuentran en un racimo sobre la secuencia primaria de la proteína; alguna literatura ha identificado "secuencias consenso" para tales sitios de unión a heparina (véase por ejemplo Hileman, et al . , 1998, Bioessays 20 (2) : 156-67) . En otros casos, la estructura cristalina conocida de una proteína revela un racimo de residuos positivamente cargados sobre la superficie de una proteína, pero los residuos provienen de diferentes regiones de la secuencia primaria y sólo se juntan cuando la proteina se dobla en su estructura terciaria. De esta manera, es difícil deducir si un residuo de aminoácido aislado forma parte de un racimo de residuos básicos sobre la superficie de la proteína. Sin embargo, si hay un racimo de residuos de aminoácidos positivamente cargados en la secuencia primaria, no es poco razonable suponer que los residuos estén espacialmente cercanos entre sí y pudieran por lo tanto formar parte de un sitio de unión a componente de matriz extracelular. El receptor Fltl se ha estudiado extensamente y se han descrito varios dominios (véase por ejemplo Tanaka et al . , 1997, Jpn. J. Cáncer Res 88:867-876). En referencia a la secuencia de ácido nucleico y de aminoácidos mostrada en la figura 10A-10D de esta descripción, se puede identificar la secuencia de señal para secreción que se localiza en el i? i_?ti-t .l -¿., ¡ - fc<f | -? &f. ^.alMt*!.^ . . --.-_ . _ - --...--.-.. .,».- *. — ....a - .- --. --.*- /».-. . -i- .»-.- inicio de la secuencia y se extiende hasta la glicina codificada por los nucleótidos 76-78. La proteína madura comienza con Ser-Lys-Leu-Lys, iniciando en el nucleótido 79 de la secuencia de ácido nucleico. El dominio 1 Ig de Fltl se extiende desde el nucleótico 79 al 393, concluyendo con los aminoácidos Ser-Asp-Thr. El dominio 2 Ig de Fltl se extiende del nucleótido 394 al 687 (codificando Gly-Arg-Pro a Asn-Thr-Ile) , y el dominio 3 Ig de Fltl se extiende de los nucleótidos 688 a 996 (codificando Ile-Asp-Val a Asp-Lys-Ala) . Existe una secuencia de aminoácidos de puenteo, Gly- Pro-Gly, codificada por los nucleótidos 997-1005, seguida por la secuencia de nucleótidos que codifica para Fc humana (nucleótidos 1006-1701 o los aminoácidos Glu-Pro-Lys a Pro- Gly-Lys-paro) . Un análisis más detallado de la secuencia de aminoácidos de Fltl revela que existe un racimo, a saber, los residuos de aminoácidos 272-281 (KNKRASVRR) de la figura 10A-10D, en el cual 6 de cada 10 residuos de aminoácidos son básicos. Esta secuencia se localiza en el dominio 3 Ig de Fltl del receptor (véase la figura 11), el cual no es a su vez esencial para la unión del ligando VEGF, pero el cual confiere una unión de más alta afinidad al ligando. Una alineación de la secuencia del dominio 3 Ig con la del **?- * ' ~"*H?- -»»* - •• ... , . t í , dominio 2 Ig revela que en esta región existe una alineación muy deficiente entre los dos dominios Ig, y que hay aproximadamente 10 aminoácidos adicionales en el dominio 3 Ig. Un análisis de los perfiles de hidrofilicidad (software 5 de computadora MacVector) de estos dos dominios indica claramente la presencia de una región hidrofílica en la proteína (figura 12A-12B) . Estas observaciones crearon la posibilidad de que la conformación tridimensional real del dominio 3 Ig de Fltl permitió cierto tipo de saliente que no 10 está en el domino 2 Ig de Fltl. Para probar esta hipótesis, los 10 aminoácidos adicionales se eliminaron y la proteína resultante se probó para verificar si la deleción afectaría la farmacocinética favorablemente sin comprometer seriamente la afinidad del receptor por VEGF. Esta construcción de ADN, 15 la cual se construyó usando técnicas de biología molecular estándares (véase, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al . , Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al., Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY) 20 en el vector de expresión de mamífero pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA) , es referida como Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc. La construcción Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc se derivó de Fltl (1-3) -Fc mediante la deleción de los nucleótidos 814-843 (mostrados en la figura 10A-10D) , la cual elimina la secuencia de residuos de 10 aminoácidos altamente básica Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-Val-Arg-Arg-Arg del dominio 3 Ig de Fltl. Se verificó la secuencia de la construcción de ADN final usando un secuenciador de ADN ABI 373A y un equipo de Secuenciación de Ciclo Terminador Didesoxi Taq (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . La secuencia de Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc se muestra en las figuras 13A-13D.

Ejemplo 12 Construcción del mutante de deleción de la región básica de Fltl (1-3) -Fc designado Mut2: Fltl (2-3?B) -Fc Una segunda construcción de mutante de deleción, designada Mut2 : Fltl (2-3?B) -Fc, se derivó de la construcción Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc mediante la deleción del dominio 1 Ig de Fltl codificado por los nucleótidos 79-393 (véanse las figuras 10A-10D) ; por motivos de conveniencia, los nucleótidos 73-78 (TCA GGT) se cambiaron a TCC GGA. Esto introdujo un sitio de restricción (BspEl) sin alterar la secuencia de aminoácidos asociada, Ser-Gly. Esta construcción de ADN, la cual se construyó usando técnicas de biología molecular estándares (véase, por ejemplo, Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook, et al . , Cold Spring Harbor Laboratory) , Current Protocols in Molecular Biology (Eds. Ausubel, et al . , Greene Publ. Assoc, Wiley-Interscience, NY) en el vector de expresión de mamífero pMT21 (Genetics Institute, Inc., Cambridge, MA) , también fue verificada en su secuencia usando un secuenciador de ADN ABI 373A y un equipo de Secuenciación de Ciclo Terminador Taq Didesoxi (Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA) . La secuencia de Mut2 : Fltl (2-3?B) -Fc se muestra en las figuras 14A-14C.

Ejemplo 13 Construcción del mutante de deleción de Fltl (1-3) -Fc designado Mut3: Fltl (2-3) -Fc Una tercera construcción de mutante de deleción, designada Mut3: Fltl (2-3) -Fc, se construyó de la misma manera que la construcción de Mut2: Fltl (2-3?B) -Fc; excepto que el dominio 3 Ig de Fltl se dejó intacto (los aminoácidos de la región básica no se eliminaron) . La construcción se construyó usando técnicas de biología molecular estándares y se verificó la secuencia de la construcción final como se describió arriba. La secuencia de Mut3: Fltl (2-3) -Fc se muestra en las figuras 15A-15C.

Ejemplo 14 5 Construcción del mutante de N-glicosilación de la región básica de Fltl (1-3) -Fc designado Mut4 : Fltl (1-3R->N) -Fc Se hizo una construcción final en la cual se introdujo un sitio de N-glicosilación en medio de la región 10 básica del dominio 3 Ig de Fltl. Esta construcción se designó Mut4: Fltl (1-3R_>N) -Fc y se hizo cambiando los nucleótidos 824-825 de GA a AC, consecuentemente cambiando el residuo Arg codificado (AGA) a un residuo Asn (AAC) (véanse figuras 10A-10D) . La secuencia de aminoácidos resultante es 15 por lo tanto cambiada de Arg-Ala-Ser a Asn-Ala-Ser, lo cual coincide con la señal canónica (Asn-Xxx-Ser/Thr) para la adición de un sitio de N-glicosilación en el residuo Asn. La secuencia de Mut4 : Fltl (1-3R_>N) -Fc se muestra en las figuras 16A-16D. 20 jaa¡fa-te*-« - — - — -•*-* *~J Ejemplo 15 Caracterización de Fltl (1-3) -Fc acetilada, mutantes Mutl : Fltl(l-3?B)-Fc y Mut4 : Fltl (1-3R->N) -Fc (a) Unión a los componentes de la matriz extracelular Para determinar si las tres proteínas modificadas eran más o menos probables de tener propiedades farmacocinéticas mejoradas, placas de 96 pocilios recubiertas con Matrigel (como se describió arriba) se incubaron con concentraciones variables de las proteínas mutantes y se detectaron con anticuerpos conjugados Fc anti-humano/fosfatasa alcalina. Como se muestra en la figura 18, este experimento mostró que aunque la proteína Fltl (1-3) -Fc no modificada pudo unirse ávidamente a estos pocilios, la proteína Mut3: Fltl (2-3) -Fc se unió en forma un poco más deficiente, la proteína Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc se unió en forma todavía más deficiente y la proteína Mut2 : Fltl (2-3?B) -Fc mostró el mejor perfil, uniéndose más deficientemente que cualquiera de las demás proteínas mutantes. La proteína mutante de glicosilación Mut4: Fltl (1-3R_>N) -Fc mostró un beneficio sólo marginal en el ensayo con Matrigel. Estos resultados confirman la hipótesis de que una secuencia lineal *.? ¿ i, .. de aminoácidos positivos puede eliminarse de la secuencia primaria dando como resultado una disminución en la interacción de carga con los componentes de la matriz extracelular. (b) Unión de Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc y Mut4: Fltl(l-3R-) -Fc en un ensayo a base de Biacore Proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificada y acetilada y Mutl: Fltl (1-3?B)-Fc y Mut4 : Fltl ( 1-3R_>N) -Fc genéticamente modificadas se probaron en un ensayo a base de Biacore para evaluar su capacidad para unirse al ligando Fltl, VEGF. En este ensayo, la proteína Fltl (1-3) -Fc no modificada (0.25, 0.5 ó 1.0 µg/ml) se inmovilizó sobre la superficie de un fragmento Biacore (véase el manual de instrucciones de Biacore, Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ, para procedimientos estándares) y una solución que contenía 0.1 µg/ml de VEGF y sobrenadante purificado o de células COS que contenía Fltl(l-3)-Fc no modificada (a aproximadamente (0.25, 0.5 ó 1.0 µg/ml), Fltl(l-3)-Fc acetilada purificada (a (0.25, 0.5 ó 1.0 µg/ml), sobrenadante de células COS que contenía Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc (a aproximadamente (0.25, 0.5 ó 1.0 µg/ml) o sobrenadante de células COS que contenia Mut4: Fltl (1-3R_>N) - ü „ i & í «JU Fc (a aproximadamente (0.25, 0.5 ó 1.0 µg/ml) se pasaron sobre el fragmento recubierto con Fltl (1-3) -Fc. Como se muestra en la figura 17, en la relación sub-estequiométrica (0.25 µg/ml Fltl (1-3) -Fc de las muestras no modificadas, 5 acetiladas o genéticamente modificadas vs . 0.1 µg/ml de VEGF), hay proteína Fltl (1-3) -Fc insuficiente como para bloquear la unión de VEGF a la Fltl (1-3) -Fc inmovilizada en el fragmento Biacore. A 0.5 µg/ml de proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificada, acetilada o genéticamente modificada, la 10 relación estequiométrica se aproxima a 1:1 y hay una capacidad incrementada para bloquear la unión de VEGF al fragmento Biacore. A 1.0 µg/ml de proteínas Fltl (1-3) -Fc no modificada, acetilada o genéticamente modificada, la cual es aproximadamente una relación estequiométrica 10:1, las 15 proteínas Fltl (1-3) -Fc son capaces de bloquear la unión de VEGF al fragmento Biacore, pero no son equivalentes. La no modificada, acetilada y Mutl: Fltl ( 1-3?B) -Fc son esencialmente iguales en su capacidad para bloquear la unión de VEGF, mientras que Mut4 : Fltl ( 1-3R_>N) -Fc es un poco menos eficiente 20 en el bloqueo de la unión. Estos resultados confirman la hipótesis de que es posible reducir la unión no específica de una molécula positivamente cargada removiendo genéticamente una secuencia lineal de aminoácidos predominantemente cargados en forma negativa. (c) Unión de Mutl: Fltl ( 1-3?B) -Fc, Mut2 : Fltl (2- 3?B)-Fc, Mut3: Fltl (2-3) -Fc y en un ensayo a base de ELISA Para determinar si las tres proteínas mutantes podían unirse al ligando Fltl de VEGF, se hicieron experimentos de unión los cuales placas de 96 pocilios recubiertas con VEGF se incubaron con concentraciones variables de la proteína mutante respectiva, y después del lavado, se detectó la cantidad unida incubando con un anticuerpo Fc anti-humano conjugado a fosfatasa alcalina y se cuantificó colorimétricamente mediante la adición de un substrato de fosfatasa alcalina adecuado. Como se muestra en la figura 19, este experimento mostró que todas las proteínas mutantes podían unirse a VEGF similarmente, a las concentraciones probadas.

-*- «*- » *A"* Ejemplo 16 Análisis farmacocinético de Fltl (1-3) -Fc acetilada, Mutl: Fltl (1-3^) -Fc y Fltl (1-3) -Fc no modificada Se diseñaron experimentos in vi vo para establecer los perfiles fármacocinéticos de Fltl (1-3) -Fc no modificada, Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc y proteína Fltl (1-3) -Fc acetilada con un exceso molar de 40 veces. Ratones balb/c (25-30 g) se inyectaron subcutáneamente con 4 mg/kg de proteínas Fltl(l-3)-Fc no modificada, Fltl (1-3) -Fc acetilada con un exceso molar de 40 veces y Mutl: Fltl (1-3?B) -Fc (4 ratones cada una). Estos ratones se desangraron por la cola 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días, 3 días y 5 días después de la inyección. Los sueros se probaron en una ELISA diseñada para detectar proteína Fltl (1-3) -Fc que incluye recubrir una placa ELISA con VEGF, unir la Fltl (1-3) -Fc y reportar con un anticuerpo anti-Fc unido a fosfatasa alcalina. Como se muestra en la figura 20, la Cmax para estos reactivos fue la siguiente: Fltl (1-3) -Fc no modificada - 0.15 µg/ml; Fltl (1-3) -Fc acetilada con un exceso molar de 40 veces - 1.5 µg/ml y Mutl: Fltl (1-3?B)-Fc - 0.7 µg/ml.

Ejemplo 17 Construcción del vector del receptor Fltl modificado La forma racional para construir versiones modificadas del receptor Fltl (también conocido como VEGFR1) se basó en la observación de que la secuencia de proteínas de Fltl era altamente básica, y era por lo tanto propensa a adherirse a la matriz extracelular (ECM) . La naturaleza altamente básica del Fltl probablemente explica por qué la Fltl (1-3) -Fc no modificada (descrita arriba) tiene farmacocinética deficiente que hace difícil usarla como un agente terapéutico. Como se describió arriba, la forma químicamente modificada de Fltl (1-3) -Fc acetilada con exceso molar 40 veces, en adelante llamada A40, exhibió un perfil farmacocinético (PK) altamente mejorado sobre la Fltl (1-3) -Fc no acetilada. Por lo tanto, se hicieron intentos para diseñar moléculas de ADN que pudieran usarse para expresar recombinantemente formas modificadas de una molécula de receptor Fltl que pudiera poseer el perfil de PK mejorado exhibido por A40 y conservar aún la capacidad para unirse estrechamente a VEGF. Se conoce en la literatura que el primer dominio Ig de Fltl (el cual tiene una carga neta de +5 a pH neutro) no es esencial para una unión estrecha a VEGF, por lo que este dominio fue eliminado. El tercer dominio Ig (que tiene una carga neta de +11) no es esencial para la unión, pero confiere afinidad más alta por VEGF que el segundo dominio Ig, por lo que en lugar de eliminarlo completamente, se reemplazó con los dominios equivalentes del receptor Fltl relacionados Flkl (también conocido como VEGFR2) y Flt4 (también conocido como VEGFR3) . Estas moléculas quiméricas (indicadas como R1R2 (Fltl .D2. FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGFR1R2- Fc?Cl (a) y R1R3 (FltlD2.VEGFR3D3-Fc?Cl (a) y VEGFRlR3-Fc?Cl (a) respectivamente, en donde Rl y FltlD2 = dominio 2 Ig de Fltl (FEGFR1); R2 y FlklD3 = dominio 3 Ig de Flkl (VEGFR2) y R3 y VEGFR3D3 = dominio 3 Ig de Flt4 (VEGFR3) ) fueron mucho menos pegajosas a ECM, según se juzga por un ensayo de unión a ECM in vi tro como el que se describe abajo, tuvieron una PK ampliamente mejorada como se describe abajo. Además, estas moléculas fueron capaces de unirse a VEGF estrechamente como se describe abajo y de bloquear la fosforilación del receptor Flkl nativo expresado en células endoteliales como se describe abajo. (a) Construcción del plásmido de expresión pFltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) Las plásmidos de expresión pMT21. Fltl (1-3) .Fc (6519pb) y pMT21. Flk-1 (1-3) . Fc (5230pb) son plásmidos que codifican para resistencia a ampicilina y versiones marcas con Fc de los dominios 1-3 Ig de Fltl humano y Flkl humano, respectivamente. Estos plásmidos se usaron para construir un fragmento de ADN que consistía en una fusión del dominio 2 Ig de Fltl con el dominio 3 Ig de Flkl, usando amplificación por PCR de los dominios Ig respectivos seguida por rondas adicionales de PCR para lograr la fusión de los dos dominios en un solo fragmento. Para el domino 2 Ig de Fltl, los cebadores de amplificación 5' y 3' fueron los siguientes: 5': bsp/fltlD2 (5' -GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3' ) 3'-FltlD2-FlklD3.as (5' -CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT-3' ) El cebador de amplificación 5' codifica para el sitio de enzima de restricción BspEl hacia el extremo 5' del dominio 2 Ig de Fltl, definido por la secuencia de aminoácidos GRPFVEM (que corresponde a los aminoácidos 27-33 de la figura 21A-21C) . El cebador 3' codifica para el . „ A. t i^?a^Ai^ n*s complemento inverso del extremo 3' del dominio 2 Ig de Fltl fusionado directamente al inicio 5' del dominio 3 Ig de Flkl, con el punto de fusión definido como TIID de Fltl (que corresponde a los aminoácidos 123-126 de la figura 21A-21C) y continuando en WLS (que corresponde a los aminoácidos 127-130 de la figura 21A-21C) de Flkl. Para el dominio 3 Ig de Flkl, los cebadores de amplificación 5' y 3' fueron los siguientes: 5': FltlD2-FlklD3.s (5' -ACAATCATAGATGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG-3' ) 3': FlklD3/apa/srf .as (5' -GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3' ) El cebador de amplificación 5' codifica para el extremo del dominio 2 Ig de Fltl fusionado directamente al inicio del dominio 3 Ig de Flkl, como se describió arriba. El cebador de amplificación 3' codifica para el extremo del dominio 3 Ig de Flkl, definido por los aminoácidos VRFHEK (que corresponden a los aminoácidos 223-228 de la figura 21A-21C) , seguido por una secuencia de puenteo que incluye una secuencia de reconocimiento para la enzima de restricción Srfl, y codifica para los aminoácidos GPG. La secuencia de puenteo corresponde a los aminoácidos 229-231 de la figura 21A-21C. Después de una ronda de amplificación por PCR para producir los dominios individuales, los productos se combinaron en un tubo y se sometieron a una ronda adicional de PCR con los cebadores Bsp/fltlD2 y FlklD3/apa/srf . as (descritos arriba) para producir el producto de fusión. Este producto de PCR se digirió subsecuentemente con las enzimas de restricción BspEl y Smal, y el fragmento de 614pb resultante se subclonó en los sitios de restricción BspEl a Srfl del vector pMT21/?B2. Fc, para crear al plásmido pMT21/FltlD2.FlklD3.Fc. La secuencia de nucleótidos del inserto de fusión génica FltlD2-FlklD3 se verificó mediante análisis de secuencia estándar. Este plásmido se digirió después con las enzimas de restricción EcoRl y Srfl, y el fragmento de 702pb resultante se transfirió a los sitios de restricción EcoRl y Srfl del plásmido pFltl (1-3) B2-Fc?Cl (a) para producir al plásmido pFltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) . Las secuencias de aminoácidos deducida y de ADN completa de la molécula quimérica FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) se muestran en la figura 21A-21C. (b) Construcción del plásmido de expresión pFltlD2VEGFR3D3Fc?Cl (a) El plásmido de expresión pMT21. Fltl (1-3) . Fc (6519pb) codifica para resistencia a ampicilina y una versión marcada con Fc de los dominios 1-3 Ig del receptor Fltl humano. Este plásmido se usó para producir un fragmento de ADN que contenía el dominio 2 Ig de Fltl mediante PCR. ARN de la línea de células HEL921.7 se usó para producir el domino 3 Ig de Flkl, usando metodología RT-PCR estándar. Una ronda adicional de amplificación por PCR se usó para lograr la fusión de los dos dominios Ig en un solo fragmento fusionado. Para el dominio 2 Ig de Fltl, los cebadores de amplificación 5' y 3' fueron los siguientes: 5': bsp/fltlD2 (5' -GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTACAGATG-3' ) 3' :TltlD2.VEGFR3D3.as (TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT) El cebador de amplificación 5' codifica para un sitio de restricción BspEl hacia el extremo 5' del dominio 2 Ig de Fltl, definido por la secuencia de aminoácidos GRPFVEM (que corresponde a los aminoácidos 27-33 de la figura 22A- 22C) . El cebador de amplificación 3' codifica para el *•< »- -«**«*«í - - aaa¿. - . .t. -. «. .. ^-.....4—.-.., .• . j^t.. .- ....._ .?.~* -~~, . .......m-tiij complemento inverso del extremo del dominio 2 Ig de Fltl fusionado directamente al inicio del dominio 3 Ig de VEGFR3, con el punto de fusión definido como TIID de Fltl (que corresponde a los aminoácidos 123-126 de la figura 22A-22C) y continúa en IQLL de VEGFR3 (que corresponde a los aminoácidos 127-130 de la figura 22A-22C) . Para el dominio 3 Ig de VEGFR3, los cebadores 5' y 3' usados para RT-PCR fueron los siguientes: 5': R3D3.S (ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTGGTA) 3' :R3D3.as (ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG) Tanto los cebadores de amplificación 5' como 3' coinciden con la secuencia de VEGFR3. El producto de amplificación de 296pb de esta reacción de RT-PCR se aisló mediante técnicas estándares y se sometió a una segunda ronda de PCR para añadir secuencias adecuadas para permitir la fusión del FltlD2 con los dominios FlklD3 y la fusión de los dominios FlklD3 y Fc por medio de un puente GPG (véase abajo) . Los cebadores de amplificación fueron los siguientes : 5': FltlD2.VEGFR3D3.s (TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG) 3': VEGFR3D3/srf .as (GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT) El cebador de amplificación 5' codifica para el extremo 3' del dominio 2 Ig de Fltl fusionado directamente al inicio (extremo 5' ) del dominio 3 Ig de VEGFR3, como se describió arriba. El cebador de amplificación 3' codifica para el extremo 3' del dominio 3 Ig de VEGFR3, definido por los aminoácidos VIVHEN (que corresponden a los aminoácidos 221-226 de la figura 22A-22C) , seguido por una secuencia de puenteo que incluye una secuencia de reconocimiento para Srfl, y codifica para los aminoácidos GPG. La secuencia de puenteo corresponde a los aminoácidos 227-229 de la figura 22A-22C. Después de una ronda (para el dominio 2 Ig de Fltl) o de dos rondas (para el dominio 3 Ig de Flt4) de PCR para producir los dominios Ig individuales, los productos de PCR se combinaron en un tubo y se sometieron a una ronda adicional de amplificación por PCR con los cebadores de amplificación bsp/fltlD2 y VEGFR3D3/srf . as descritos arriba, para producir el producto de fusión. Este producto de PCR se digirió subsecuentemente con las enzimas de restricción BspEl y Smal, y el fragmento de 625pb resultante se subclonó en los sitios de restricción BspEl a Srfl del vector pMT21/Fltl?B2. Fc (descrito arriba), para crear al plásmido pMT21/FltlD2.VEGFR3D3.Fc. La secuencia del inserto de fusión génica FltlD2-VEGFR3D3 se verificó mediante análisis de secuencia estándar. Este plásmido se digirió después con las enzimas de restricción EcoRl y Srfl, y el fragmento de 693pb resultante se subclonó en los sitios de restricción EcoRl a Srfl del plásmido pFltl ( 1-3) ?B2-Fc?Cl (a) para producir el plásmido designado pFltlD2.VEGFR3D3. F?C1 (a) . La secuencia de aminoácidos deducida de ADN completa de la molécula quimérica FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) se muestra en las figuras 22A-22C.

Ejemplo 18 Ensayo de unión a la matriz extracelular (ECM) Placas recubiertas con ECM (Becton Dickson catálogo # 35-4607) se rehidrataron con DME caliente suplementado con glutamina (2mM) , 100U de penicilina, 100U de estreptomicina y 10% de BCS durante al menos 1 hora antes de añadir las muestras. Las placas se incubaron después durante 1 hora a ? ?. .L ¿.í' .^.iHí. -j¡ Z_ .i-riSMU i . -- 1-.--H-»-. --.. * J^a, -^ •-,, **•» ,--»->-..--_- .---fc-- J-^»...> t,.¡ temperatura ambiente con concentraciones variables de FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) iniciando a lOnM con diluciones de 2 veces posteriores en PBS más 10% de BCS. Las placas se lavaron después 3 veces con PBS más 0.1% de Triton-X y se incubaron con anticuerpo Fc anti-humano conjugado a fosfatasa alcalina (Promega, 1:4000 en PBS más 10% de BCS) durante 1 hora a temperatura ambiente. Las placas se lavaron después 4 veces con PBS 0.1% Triton-X y se añadió una solución de regulador de pH de fostasa alcalina/pNPP (Sigma) para desarrollo de color. Las placas se leyeron a 1 = 405-570nm. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 23 y demuestran que las proteínas FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) son considerablemente menos pegajosas a la ECM en comparación con la proteína Fltl (1-3) -Fc.

Ejemplo 19 Expresión transitoria de pFltlD2.Fl lD3. Fc?Cl (a) en células CHO-K1 (E1A) Un cultivo a gran escala (2L) de células DH10B de E. coli que portaban al plásmido pFltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) descrito arriba en el ejemplo 17 (a) se cultivó durante la noche en caldo Terrific Broth (TB) más 100 µg/ml de ampicilina. Al día siguiente, el ADN plasmídico se extrajo usando un equipo QIAgen Endofree Megaprep siguiendo el protocolo del fabricante. La concentración del ADN 5 plasmídico purificado se determinó mediante técnicas estándares usando un espectrofotómetro UV y fluorómetro. El ADN plasmídico se verificó mediante digestión con enzimas de restricción estándar de alícuotas usando las enzimas de restricción EcoRl más Notl y Asel. Todos los fragmentos de 0 digestión con enzima de restricción correspondieron a los tamaños predichos cuando se analizaron en un gel de agarosa al 1%. Cuarenta cajas de petri de 15 cm se sembraron con células CHO-K1/E1A a una densidad de 4 x 106 células/placa. 5 El medio para la placa fue F-12 de Gibco Ham complementado con 10% de Suero de Bovino Fetal Hyclone (FBS), 100U de penicilina/lOOU de estreptomicina y glutamina (2mM) . Al día siguiente cada placa de células se transfectó con 6 µg del ADN plasmídico pFltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) usando Gibco Optimen y 0 Gibco Lipofectamina en un volumen de 12 ml, siguiendo el protocolo del fabricante. Cuatro horas después de añadir la mezcla de transfección a las células, se añadieron 12 ml/placa de Optimem complementado con 10% de FBS. Las placas se incubaron a 37 °C en una incubadora de C02 a 5% durante la noche. Al día siguiente el medio se removió de cada placa y se añadieron 25 ml de medios de expresión (Gibco CHO-S-SFM II complementados con glutamina (2mM) y 1 mM de butirato de sodio). Las placas se incubaron a 37°C durante 3 días. Después de 3 días de incubación, los medios se aspiraron de cada placa y se centrifugaron a 400 rpm en un rotor de cubeta oscilatoria para granular las células. El sobrenadante se decantó en botellas de 1L estériles y la purificación de la proteína expresada se llevó a cabo como se describe abajo.

Ejemplo 20 Construcción del vector de expresión pVEGFR!R2-Fc?Cl (a) El plásmido de expresión pVEGFRlR2. Fc?Cl (a) se construyó mediante la inserción de ADN que codificaba para los aminoácidos SDT (que corresponden a los aminoácidos 27-29 de las figuras 24A-24C) entre los aminoácidos 26 y 27 de Fltld2-Flkld3-Fc?Cl (a) de las figuras 21A-21C (GG) y la remoción de ADN que codifica para los aminoácidos GPG que corresponden a los aminoácidos 229-231 de la figura (sic). La secuencia de aminoácidos SDT es nativa al receptor Fltl y se añadió de nuevo para disminuir la probabilidad del procesamiento N-terminal heterogéneo. La GPG (secuencia de puenteo) se removió para que los dominios Ig de Fltl y Flkl se fusionaran directamente unos a otros. Las secuencias de ADN completa y de aminoácidos deducida de la molécula 5 quimérica PVEGFR1R2. Fc?Cl (a) se muestran en las figuras 24A- 24C.

Ejemplo 21 Proceso de cultivo de células usado para producir receptores 10 Fltl modificados (a) Proceso de cultivo de células usado para producir FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) El proceso para la producción de la proteína 15 FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) usando el plásmido de expresión pFltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) descrito arriba en el ejemplo 1, incluye el cultivo en suspensión de células de ovario de hámster chino recombinantes (CHO K1/E1A) que expresan en forma constitutiva al producto de proteína. Las células se 20 cultivan en biorreactores y el producto de proteína se aisla y purifica por cromatografía de afinidad y de exclusión de tamaño. El proceso se describe más detalladamente abajo. i--fl--l 'áA..... >t J -t i?. •*-*--' ' * Expansión de las células Dos matraces T-225 cm2 confluentes que contenían la línea de células de expresión FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) se expandieron pasando células en ocho matraces T-225 cm2 en medio (GMEM + 10% de suero, GIBCO) y se incubaron a 37°C y 5% de CO;. Cuando los matraces se acercaron a la confluencia (aproximadamente 3 a 4 días) las células se desprendieron usando tripsina. Se añadió medio fresco para proteger a las células de una exposición adicional a la tripsina. Las células se centrifugaron y resuspendieron en medio fresco y después se transfirieron a ocho botellas giratorias de 850 cm2 y se incubaron a 37°C y 5% de C02 hasta ser confluentes.

Cultivo de suspensión en biorreactores Las células cultivadas en botellas giratorias se tripsinizaron para desprenderlas de la superficie y se lavaron con medio de cultivo en suspensión. Las células se transfieren asépticamente a un bioreactor de 5L (New Brunswick Celligen Plus) en donde las células se cultivan en 3.5L de cultivo en suspensión. El medio del cultivo en suspensión era una modificación de baja glucosa libre de glutamina de IS-CHO (Irvine Scientific) a la cual se le añadió 5% de suero de bovino fetal (Hyclone) , suplemento GS '-*•-»-* ».*-*- ».->» .- (Life Technologies) y se añadieron 25 µM de sulfoximina de metionina (Sigma). El pH se controló a 7.2 mediante la adición de dióxido de carbono a la entrada de gas o mediante la adición de una solución líquida de carbonato de sodio al biorreactor. El nivel de oxígeno disuelto se mantuvo a 30% de saturación mediante la adición de oxígeno o nitrógeno a la entrada de gas y la temperatura se controló a 37 °C. Cuando se alcanzó una densidad de 4 x 106 células/mL, las células se transfirieron a un biorreactor de 40L que contenía el mismo medio y puntos de partida para controlar al biorreactor. El punto de partida de temperatura se redujo a 3 °C para hacer más lento el crecimiento celular e incrementar la velocidad relativa de expresión de proteínas. (b) Proceso de cultivo de células usado para producir FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) Las mismas metodologías que las descritas arriba para FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) se usaron para producir FltlD2.FEGFR3D3. Fc?Cl (a) .

Ejemplo 22 Cosecha y purificación de receptores Fltl modificados (a) Cosecha y purificación de FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) La proteína producto se cosechó asépticamente del biorreactor mientras se retienen las células usando módulos de filtración por flujo tangencial Millipore Prostak y una bomba mecánica de bajo esfuerzo cortante (Fristam) . Se añadió medio fresco al biorreactor para reemplazar al removido durante la filtración de la cosecha. Aproximadamente 40L del filtrado de la cosecha se cargaron después sobre una columna de 400 L que contenía resina Protein A Sepharosa (Amersham Pharmacia) . Después de cargar la resina se lavó con regulador de pH que contenía 10 mM de fosfato de sodio, 500 mM de cloruro de sodio, pH 7.2, para remover cualquier proteína contaminante no unida. La proteína FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) se eluyó con un regulador de pH de citrato, pH 3.0. La proteína eluida se neutralizó mediante la adición de base Tris y se congeló a -20°C. Varios lotes congelados de proteína FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) de la etapa con Protein A arriba se descongelaron, reunieron y concentraron usando una membrana de filtración por flujo tangencial de corte con peso molecular nominal de 30 kD (NMWCO) Millipore. La proteína se transfirió a un concentrador de células agitado (Milipore) y se concentró más a 30 mg/mL usando una membrana NMWCO de 30 kD. La proteína concentrada se cargó en una columna de exclusión de tamaño empacada con resina Superdex 200 (Amersham Pharmacia) que se equilibró con solución salina regulada en su pH con fosfato más 5% de glicerol. Se usó el mismo regulador de pH para activar la columna. Las fracciones que correspondían al dímero FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) se reunieron, se filtraron estérilmente a través de un filtro de 0.22 mieras, se formaron en alícuotas y se congelaron. (b) Cosecha y purificación de FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) Las mismas metodologías que las descritas arriba para FltlD2. FlklD3. Fc?Cl (a) se usaron para cosechar y purificar FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) .

Ejemplo 23 Ensayo de fosforilación para VEGFR2 expresado transitoriamente Células endoteliales de vena umbilical humana primaria (HUVECs) , pasaje 4-6, se dejaron consumir durante 2 horas en medio de alta glucosa-DME libre de suero. Las muestras que contenían 40 ng/ml (InM) de VEGF165 humano, el cual es un ligando para los receptores VEGF Fltl, Flkl y Flt4 (VEGFR3) se prepararon y se preincubaron durante 1 hora a temperatura ambiente con cantidades variables de los receptores Fltl modificados Fltl (1-3) -Fc, Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2VEGFR3D3. Fc?Cl (a) en medio de DME libre de suero-alta glucosa que contenía 0.1% de BSA. Las células se desafiaron durante 5 minutos con las muestras preparadas arriba +/- VEGF165, seguidas por la lisis de células enteras usando regulador de pH de lisis completo. Los lisados de células se inmunoprecipitaron con un anticuerpo dirigido contra el término C del receptor VEGFR2. Los lisados inmunoprecipitados se cargaron sobre gel 4-12% SDS-PAGE Novex y después se transfirieron a la membrana PVDF usando metodologías de transferencia estándares. La detección de VEGFR2 fosfoplado se hizo mediante '¿->""' jJ-'- -- -- - - -- - --» -- •- -~ -- -* — , " ^ f • * W?«-fW inmunoabsorción con la anti-fosfo Tirosina mAb llamada 4G10 (UBI) y desarrollada usando ECL-reactivo (Amersham) . Las figuras 25A-25C y 26A-26B muestran los resultados de este experimento. La figura 25A-25C revela que la detección mediante Western blot de VEGFR2(Flkl) fosforilado con tirosina por la estimulación con ligando VEGF165 muestra que los receptores en la superficie de las células se fosforilan a niveles variables dependiendo de qué receptor Fltl modificado se use durante las preincubaciones con VEGF. Como se observa en la figura 25A, a un exceso molar de 1.5 de Fltl (1-3) -Fc, Fltl (1-3) -Fc (A40) o FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) transitoria existe un bloqueo completo de la estimulación del receptor por estos tres receptores Fltl modificados en comparación con el desafío con medios de control. En contraste, la FltlD2VEGFR3D3. Fc?Cl (a) transitoria no muestra un bloqueo significativo alguno en este exceso molar, en comparación con el desafío del control positivo de VEGF. Se observan resultados similares en la figura 25B, en donde los receptores Fltl modificados están en un exceso molar de 3 veces al ligando VEGF165. En la figura 25C, en donde los receptores Fltl modificados se encuentran en un exceso molar de 6 veces al ligando VEGF165, la FltlD2VEGFR3D3. Fc?Cl (a) transitoria puede mostrarse ahora - ?.? .1^1 ^ «.«-.A..-.......J-^. - - . *~« - - - -..-*.. ?. ..*-. =.^ -^-< .*-.?..*~J»-*-¿. --» *~* **?~* ?k *- .** como bloqueando parcialmente la estimulación inducida por VEGF-165 de los receptores en la superficie de la célula. En las figuras 26A-26B, la detección por Western blot de la estimulación con ligando VEGF165 de VEGFR2(Flkl) fosforilado con tirosina muestra que los receptores en la superficie de la célula no son fosforilados por muestras de desafío que tienen VEGF165 preincubado con exceso molar de 1 y 2 veces (figura 26A) o exceso molar de 3 y 4 veces (figura 26B) de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) transitoria, FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) estable o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) transitoria. A todas las concentraciones del receptor Fltl modificado probadas hay una unión completa del ligando VEGF165 durante la preincubación, dando como resultado una estimulación no detectable de los receptores de superficie de célula por VEGF165 no unido en comparación con el desafio con medios de control.

Ejemplo 24 Bioensayo de proliferación de células La población de células de prueba es de células MG87 que han sido transfectadas establemente con un plásmido de expresión que contiene un inserto de ADN que codifica para el dominio extracelular de VEGFR2(Flkl) fusionado al dominio de cinasa intracelular TrkB, produciendo de esta manera una molécula quimérica. La razón por la que se usó el dominio intracelular de cinasa TrkB en lugar del dominio de cinasa intracelular de VEGFR2(Flkl) nativo es que el dominio de cinasa intracelular de VEGFR2(Flkl) no ocasiona una fuerte respuesta proliferativa cuando es estimulado por VEGF165 en estas células. Se sabe que las células MG87 que contienen al receptor TrkB de longitud completa dan una fuerte respuesta proliferativa cuando son estimuladas con BDNF, por lo que el dominio de cinasa intracelular TrkB fue manipulado para reemplazar al dominio de cinasa intracelular de VEGFR2(Flkl) para sacar ventaja de su capacidad de respuesta proliferativa. 5 x 10J Células/pocilio se colocaron en una placa de 96 pocilios y se dejaron sedimentar durante 2 horas a 37°C. Los siguientes receptores Fit modificados Fltl (1-3)-Fc, FltlD2.FlklD2. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) , más un receptor irrelevante llamado Tie2-Fc como un control negativo, fueron titulados de 40nM a 20pM y se incubaron en las células durante 1 hora a 37°C. VEGF165 recombinante humano en medios definidos se añadió después a todos los pocilios a una concentración de 1.56nM. Las placas se -t a---.. JLtt i i incubaron durante 72 horas a 37 °C y después se añadió MTS (reactivo de Owen, Promega) , y las placas se incubaron durante 4 horas adicionales. Finalmente, las placas se leyeron en un espectrofotómetro a 450/570nm. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 27. El receptor de control Tie2-Fc no bloquea la proliferación de células inducida por VEGF165 a ninguna concentración, mientras que FltlD2.FlklD3. Fc?Cl (a) bloquea VEGF165 1.56nM con una dosis máxima media de 0.8nM. Fltl (1-3) -Fc y FltlD2.VEGFR3D3. Fc?Cl (a) son menos efectivos para bloquear VEGF165 en este ensayo con una dosis máxima media de ~ 2nM.

El VEGF165 solo da una lectura de 1.2 unidades de absorbancia y el fondo es de 0.38 unidades de absorbancia.

Ejemplo 25 Estequiometría de unión de receptores Fit modificados a VEGF165 (a) Análisis con BIAcore La estequiometría de la interacción de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGFRlR2-Fc?Cl (a) con VEGF165 humano se determinó midiendo ya sea el nivel de saturación de VEGF uniéndose a las superficies de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) , o midiendo la concentración de VEGF165 necesaria para evitar completamente la unión de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFR1R2-Fc?Cl (a) a la superficie del fragmento BIAcore de VEGF. 5 Los receptores Fit modificados FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGFRlR2-Fc?Cl (a) , se capturaron con un anticuerpo anti-Fc específico que se inmovilizó primero en un fragmento Biacore (BIACORE) usando química de copulación de amina. Se usó una superficie anticuerpo en blanco como un 10 control negativo. Se inyectó VEGF165 a una concentración de 1 nM, 10 nM y 50 nM sobre las superficies de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGFRlR2-Fc?Cl (a) a 10 µl/min durante una hora. Se registró una señal de unión en tiempo real y la unión de saturación se logró al final de cada inyección. La 15 estequiometría de unión se calculó como una relación molar de VEGF165 unido a la FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) inmovilizada, usando el factor de conversión de 1000 RU equivalente a 1 ng/ml. Los resultados indicaron estequiometría de unión de una molécula dimérica de VEGF165 20 por una molécula de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) (figura 28) . En solución, FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFR1R2- Fc?Cl (a) a una concentración ae InM (que se estimó era 1000 a>fe ,^ veces más alta que el KD de la FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o la interacción VEGFRlR2-Fc?Cl (a) /VEGF165) se mezclaron con concentraciones variadas de VEGF165. Después de una hora de incubación, las concentraciones de la FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) libre en solución se midieron como una señal de unión a una superficie VEGF165 copulada a amina. Se usó una curva de calibración para convertir la señal de unión BIAcore FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) a su concentración molar. Los datos mostraron que la adición de InM de VEGF165 a la solución de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) bloqueó completamente la unión de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) a la superficie de VEGF165. Este resultado sugirió que la estequiometría de unión de una molécula de VEGF165 por una molécula de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) (figura 29 y figura 30) . Cuando la concentración de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) se gráfico como una función de la concentración añadida de VEGF165, la pendiente de la porción lineal fue de -1.06 para FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y -1.07 para VEGFRlR2-Fc?Cl (a) . La magnitud de la pendiente, muy cercana a una negativa, indicó que una molécula de VEGF165 se unió a una molécula de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) . ^- 8 (b) Cromatografía de exclusión de tamaño FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) se mezcló con un exceso de 3 veces de VEGF165 y el complejo receptor-ligando se purificó usando una columna de cromatografía de exclusión de tamaño Pharmacia Superóse 6. El complejo receptor-ligando se incubó después en un regulador de pH que contenía clorhidrato de guanidina 6M para poder disociarlo en sus proteínas componentes . Se separó FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) de VEGF165 usando una columna de cromatografía de exclusión de tamaño Superóse 6 activada en cloruro de guanidinio 6M. Para determinar la estequiometría del complejo, se hicieron varias inyecciones de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGF165, y la altura pico o la intensidad integrada pico se gráfico como una función de la concentración de proteína inyectada. La calibración se hizo bajo una condición idéntica a la usada en separar los componentes del complejo FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) /VEGF. La cuantificación de la composición del complejo FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) /VEGF se basó en las curvas de calibración. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 28, la cual muestra que la relación de VEGF165 a FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) en un complejo es de 1:1. --•?------i-t----l--_ ^¡| Ejemplo 26 Determinación de la estequiometría de unión del complejo FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a)/VEGF165 por cromatografía de exclusión de tamaño Preparación del complejo FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a)/VEGF165 Se mezcló VEGF165 (concentración = 3.61 mg/ml) con FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente con células CHO (concentración = 0.9 mg/ml) en una relación molar de 3:1 (VEGF165:FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) ) y se incubó durante la noche a 4°C. (a) Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) bajo condiciones nativas Para separar el complejo del exceso de VEGF165 no unido, se cargaron 50 µl del complejo en una Pharmacia Superóse 12 PC 3.2/30 que se equilibró en regulador de pH de PBS. La muestra se eluyó con el mismo regulador de pH a una velocidad de flujo de 40µl/min a temperatura ambiente. Los resultados de esta SEC se muestran en la figura 31. El pico #1 representa el complejo y el pico #2 representa el VEGF165 o ligado. Las fracciones eluidas entre 1.1 y 1.2 ml se ,- J combinaron, y se añadió cloruro de guanidio (GuHCl) a una concentración final de 4.5M para disociar al complejo. (b) Cromatografia de exclusión de tamaño (SEC) bajo 5 condiciones disociativas Para separar los componentes del complejo receptor- ligando y para determinar su relación molecular, 50 µl del complejo disociado como el descrito arriba se cargaron en una Superóse 12 PC 3.20/30 equilibrada en GuHCl 6M y se eluyó con 10 la misma solución a una velocidad de flujo de 40 µl/min a temperatura ambiente. Los resultados de esta SEC se muestran en la figura 32. El pico #1 representa FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y el pico #2 representa VEGF165. 15 (c) Cálculo de la estequiometría del complejo FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) :VEGF165 La estequiometría del complejo receptor-ligando se determinó a partir del área pico o la altura pico de los componentes. Concentraciones de VEGF165 y 20 FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) que correspondían a la altura pico o área pico, respectivamente, se obtuvieron de las curvas estándar para VEGF165 y FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) . Para obtener una curva estándar, cuatro concentraciones diferentes (0.04 mg/ml - 0.3 mg/ml) de cada componente se inyectaron en una columna Pharmacia Superóse 12 PC 3.2/30 equilibrada en cloruro de guanidinio 6M y se eluyó con la misma solución a una velocidad de flujo de 40 µl/min a temperatura ambiente. La curva estándar se obtuvo graficando el área pico o la altura pico contra la concentración de proteínas. La relación molar de VEGF165: FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) determinada a partir del área pico de los componentes fue 1.16. La relación molar de VEGF165: FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) determinada de la altura pico de los componentes, fue 1.10.

Ejemplo 27 Determinación de la estequiometría del complejo FltlD2FlklD3.Fc?Cl (a)/VEGF165 mediante cromatografía de exclusión de tamaño con dispersión de luz en línea Preparación del complejo Se mezcló VEGF165 con proteína FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente con CHO en una relación molar de 3:1 (VEGF165: FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) ) y se incubó durante la noche a 4°C. —: (a) Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) con dispersión de luz en línea Una columna de cromatografía de exclusión de tamaño con un detector de dispersión de luz en línea MiniDawn (Waytt Technology, Santa Barbara, California) y detectores de índice refractivo (Rl) (Shimadzu, Kyoto, Japón) se usó para determinó el peso molecular (PM) del complejo receptor-ligando. Se inyectaron muestras en una columna Superóse 12 HR 10/30 (Pharmacia) equilibrada en regulador de pH de PBS y se eluyó con el mismo regulador de pH a una velocidad de flujo de 0.5 ml/min a temperatura ambiente. Como se muestra en la figura 33, el perfil de elusión muestra dos picos. El pico #1 representa el complejo receptor-ligando y el pico #2 representa el VEGF165 no unido. El PM se calculó a partir de las señales LS y Rl . Se usó el mismo procedimiento para determinar el peso molecular de los componentes individuales del complejo receptor-ligando. Los resultados de estas determinaciones son los siguientes: El PM del complejo FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a)/VEGF165 en la posición pico es de 157 300 (figura 33), el PM del VEGF165 en la posición pico es de 44 390 (figura 34) y el PM de R1R2 en la posición pico es de 113 300 (figura 35) .

Estos datos indicaron que la estequiometría del complejo FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) /VEGF es 1:1, toda vez que corresponde a la suma de los pesos moleculares para FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGF165. En forma importante, este método probó de manera conclusiva que el complejo FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) /VEGF165 estaba de hecho compuesto de sólo una molécula de ligando VEGF165 y sólo una molécula de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) .

Ejemplo 28 Mapeo con péptidos de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) Las estructuras de disulfuro y sitios de glicosilación en FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) se determinaron mediante un método de mapeo con péptidos. En este método, la proteína se cortó primero con tripsina. Los fragmentos trípticos se analizaron y se identificaron mediante CLAR acoplada con espectrometría de masa, además de una técnica de secuenciación N-terminal. La reducción de la digestión tríptica se empleó para ayudar a identificar fragmentos que contenían enlaces de disulfuro. El tratamiento de la digestón tríptica con PNGasa F (Glyko, Novato, CA) se empleó para ayudar a identificar fragmentos con sitios de ? ? t- -i i. * sAc ,..mí»----- - . .. —*. , ......... -..- ...— - *..^, -...-.„ -,.-..J.-..----1-J-1. glicosilación N-enlazados. Los resultados se resumen en la figura 36 anexa. Hay un total de diez cisteínas en FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) ; seis de ellas pertenecen a la región Fc. Cys27 ha confirmado estar unido por disulfuro a Cys76. Cysl21 se confirma que está unido por disulfuro a Cysl82. Las primeras dos cisteínas en la región Fc (Cys211 y Cys214) forman un enlace de disulfuro intermolecular con las mismas dos cisteínas en otra cadena Fc. Sin embargo, ya que estas dos cisteínas no pueden separarse enzimáticamente unas de otras, no puede determinarse si la unión por disulfuro está ocurriendo entre las mismas cisteínas (Cys211 a Cys211, por ejemplo) o entre Cys211 y Cys214. Se confirma que Cys216 está unida por disulfuro a Cys306. Se confirma que Cys352 está unida por disulfuro a Cys410. Existen cinco sitios de N-glicosilación posibles en FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) . Todos los cinco se encuentran como glicosilados en grados variables. La glicosilación completa se observó en Asn33 (secuencia de aminoácidos NIT) , Asnl93 (secuencia de aminoácidos NST) y Asn282 (secuencia de aminoácidos NST) . Además, la glicosilación parcial se observa en Asn65 y Asnl20. Los sitios de glicosilación son resaltados estando subrayados en la figura 36. aá Ejemplo 29 Análisis farmacocinético de receptores Fit modificados (a) Análisis farmacocinético de Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGFRlR2-Fc?Cl (a) Ratones balb/c (25-30 g) se inyectaron subcutáneamente con 4 mg/kg de Fltl (1-3) -Fn (A40) , FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente por CHO, FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) expresada establemente por CHO y VEGFRlR2-Fc?Cl (a) expresada transitoriamente por CHO. Los ratones fueron desangrados por la cola 1, 2, 4, 6, 24 horas, 2 días, 3 días y 6 días después de la inyección. Los sueros se analizaron en una ELISA diseñada para detectar Fltl (1-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFRlR2-Fc?Cl (a) . La ELISA incluye recubrir una placa para ELISA con VEGF165, unir las Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o VEGFR1R2-Fc?Cl (a) detectadas y reportando con un anticuerpo anti-Fc unido a peroxidasa de rábano. Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 37. El Tmax para Fltl (1-3) -Fc (A40) fue a 6 horas mientras que el Tmax para la FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) transitoria y estable y la VEGFR1R2-Fc?Cl (a) transitoria fue de 24 horas. La Cma> para Fltl (1-3)-Fc (A40) fue de 8 µg/ml. Para ambas (FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y VEGFRlR2-Fc?Cl (a) ) transitorias, la Cmax fue de 18 µg/ml y la Cmax para la VEGFRlR2-Fc?Cl (a) estable fue de 30 µg/ml. (b) Análisis farmacocinético de Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEFGR3D3. Fc?Cl (a) Ratones balb/c (25-30 g) se inyectaron subcutáneamente con 4 mg/kg de Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente con CHO y FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente con CHO. Los ratones se desangraron por la cola 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 y 20 días después de la inyección. Los sueros se probaron en una ELISA diseñada para detectar FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFRlR2-Fc?Cl (a) . La ELISA incluye recubrir una placa para ELISA con 165, unir las FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o FltlD2.VEGFRlR2-Fc?Cl (a) y reportar con un anticuerpo anti-Fc unido a peroxidasa de rábano. La Fltl (1-3) -Fc (A40) no pudo detectarse más en el suero después de 5 días, mientras que FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFRlR2-Fc?Cl (a) fueron detectables durante 15 días o más. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 38.

Ejemplo 30 Evaluación de la capacidad de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) para inhibir el crecimiento de tumores in vivo Para evaluar la capacidad de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) para inhibir el crecimiento de tumores in vi vo, se empleó un modelo en el cual suspensiones de células tumorales son implantadas subcutáneamente en el flanco derecho de ratones macho con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) . Dos líneas de células, la línea de células de fibrosarcoma HT-1080 humano (número de acceso de ATCC CCL-121) y la línea de células de glioma C6 de rata (número de acceso de ATCC CCL-107) , cada una de las cuales exhiben morfologías y características de crecimiento distintamente diferentes, se usaron en el ensayo. La primera dosis de FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) (a 25 mg/kg o como se indica en las figuras 39 y 40) se dio en el día de la implantación del tumor. Los animales recibieron posteriormente inyecciones subcutáneas de Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) o vehículo ya sea cada otro día (EOD) o dos veces a la semana (2X/wk) durante un periodo de 2 semanas. Después de 2 semanas, los animales fueron inyectados con fijador, se removieron los tumores y las muestras se prepararon. El volumen del tumor se determinó midiendo la longitud y el ancho de los tumores subcutáneos visibles. Tanto Fltl (1-3)- Fc (A40) como FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) redujeron significativamente el crecimiento de tumores formados por 5 células HT-1080 y C6. Los resultados de estos experimentos se muestran en la figura 39 y la figura 40.

Ejemplo 31 El efecto de VEGF165 y receptores Fit modificados en el 10 sistema reproductor femenino El patrón estereotípico de la remodelación vascular que ocurre en el útero y ovario durante el transcurso del ciclo reproductivo ha sido bien caracterizado, haciendo a 15 estos estudios particularmente bien adaptados para el estudio de mecanismos que regulan la angiogénesis, remodelación vascular y la regresión vascular. De hecho, estudios de hibridación in si tu en los tejidos reproductivos proveyeron la primera evidencia clara de que VEGF actúa como un mediador 20 de la angiogénesis fisiológica en roedores maduros, así como en humanos y primates no humanos (Phillips et al , 1990; Ravindranath et al , 1992; Shweiki et al , 1993; Kamat et al , íy.^o) . X que a angiogenesis cíclica y la remodelación vascular son características prominentes del ovario y útero normales, no es sorprendente que se haya descubierto que un crecimiento anormal de los vasos sanguíneos y/o una disfunción vascular caractericen muchas condiciones patológicas que afectan estos órganos. Además, se cree que estas anormalidades vasculares patógenas son causadas o perpetuadas por la expresión no regulada de uno o más factores angiogénicos o antiangiogénicos, muy prominentemente VEGF. Por ejemplo, la angiogénesis anormal es característica de la enfermedad de ovario policística, endometriosis y carcinoma endometrial, y en cada caso VEGF es sobreexpresado en el tejido afectado (Kamat et al , 1995; Shifren et al , 1996; Guidi et al , 1996; Donnez et al , 1998). Se cree también que la sobreexpresión de VEGF juega un papel patógeno en el establecimiento de la hiperpermeabilidad vascular sistémica en el síndrome de hiperestimulación ovárica (McClure et al, 1994; Levin et al, 1998) y preclampsia (Baker et al , 1995; Sharkey et al , 1996) . Además, VEGF ha estado implicado como el factor de permeabilidad responsable de la producción de ascites asociadas con car?inoma ovárico y otros tumores (Senger et al , 1983; Boocock et al , 1995) . Los agentes que neutralizan ^-* « * »• de manera efectiva las acciones biológicas de VEGF pueden anticiparse razonablemente como siendo de beneficio terapéutico en las condiciones anteriores y relacionadas. La angiogénesis y remodelación vascular también son marcas distintivas de la implantación de blastocistos y el desarrollo placental (Findlay, 1986) . El VEGF es fuertemente expresado tanto el deciduos maternos como en trofoblastos embriónicos, en donde se cree que estimula primero la expansión e hiperpermeabilidad de la vasculatura uterina durante el periodo de preimplantación y subsecuentemente media la formación tanto de los componentes maternos como embriónicos de la vasculatura placental (Shweiki et al , 1993; Cullinan-Bove y Koos, 1993; Chakraborty et al , 1995; Das et al , 1997) . El VEGF se requiere también para la angiogénesis luteal y la secreción de progesterona asociada necesarias para prepara al útero para el implante (Ferrara et al , 1998) . De esta manera, los agentes que inhiben las acciones biológicas del VEGF pueden probar ser útiles como agentes contraceptivos (previniendo la implantación) , o como abortivos en las etapas iniciales de la gestación. La última explicación podría encontrar uso particular como una intervención no quirúrgica para la terminación de embarazos ectópicos .

Aunque la expresión de los receptores de VEGF es ampliamente confinada al endotelio vascular en tejidos reproductivos normales, el Fltl también es expresado por trofoblastos en la placenta tanto en humanos como en animales 5 (Clark et ai, 1996; He et al , 1999) en donde se ha propuesto que juega un papel en la invasión de trofoblastos. En forma interesante, tanto Fltl como KDR (Fltl) se expresan por línea de células de coriocarcinoma BeWo (Charnock-Jones et al , 1994), y el VEGF ha mostrado promover la síntesis de ADN y la 10 fosforilación con tirosina de MAP cinasa en estas células. Además, carcinomas ováricos primaros y metastásicos no sólo para expresar niveles altos de VEGF, sino -además del endotelio vascular- las propias células tumorales, expresan KDR y/o Fltl (Boocock et al , 1995) . Estos descubrimientos 15 sugieren que el VEGF podría no sólo estar críticamente implicado en la generación y mantenimiento de la vasculatura del tumor, sino que por lo menos en algunos tumores de origen reproductivo el VEGF podría jugar un papel autócrino, soportando directamente la supervivencia y proliferación de 20 las células tumorales. De esta manera, los agentes que bloquean las acciones de VEGF podrían tener aplicaciones particularmente benéficas para el tratamiento de tumores de origen reproductivo. lt,f*1l--Ír---tf---ír « ¿g&..* i. í .. ? * *-<IHaÍ-l¡,-i- t>-->»?ilt.t.... . u - ,-„-... - ,-. .»--,.-,* ....^.. -j .-.._. -. i-., t-t Métodos y resultados (a) Determinación de la hiperpermeabilidad uterina inducida por VEGF Gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) se inyectó subcutáneamente (5 Ul) para inducir la ovulación en ratas hembra antes de la pubertad. Esto da como resultado una oleada de estradiol después de dos días, lo cual a su vez ocasiona una inducción de VEGF en el útero. Se reporta que esta inducción da como resultado hiperpermeabilidad del útero y un incremento en el peso húmedo uterino 6 horas más tarde y, por lo tanto, podría bloquearse potencialmente por los receptores Fit modificados Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y FltlD2.VEGFRlR2-Fc?Cl (a) . En este modelo in vivo, el peso normal del útero de la rata es de aproximadamente 50 mg y éste puede ser inducido a 300-350 mg mediante PMSG. La desecación del tejido revela que todo este es un peso en húmedo. La inyección subcutánea de Fltl (1-3)-Fc (A40), FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) y FltD2.VEGFRlR2-Fc?Cl (a) a 25 mg/kg una hora después de la inyección de PMSG da como resultado una inhibición de aproximadamente 50% del incremento en el peso uterino en húmedo. El incremento de la dosis del receptor Fit modificado no reduce más el incremento en el peso en húmedo sugiriendo que hay un componente independiente de VEGF para este modelo. Los resultados de este experimento se muestran en la figura 41. (a) Determinación de la angiogénesis del cuerpo lúteo usando progesterona como una presentación de lectura Gonadotropina de suero de yegua preñada (PMSG) se inyecta subcutáneamente (5 Ul) para inducir la ovulación en ratas hembra antes de la pubertad. Esto da como resultado un cuerpo lúteo completamente funcional que contiene una densa red de vasos sanguíneos después de 4 días, y que permite la secreción de progesterona en el torrente sanguíneo para preparar al útero para la implantación. La inducción de la angiogénesis en el cuerpo lúteo requiere de VEGF; por lo tanto, el bloqueo de VEGF podría dar como resultado una falta de nuevos vasos sanguíneos y de esta manera una falta de progesterona secretada en el torrente sanguíneo. En este modelo in vivo, los niveles en descanso de progesterona son de aproximadamente 5 ng/ml y esto puede inducirse a un nivel de 25-40 ng/ml después de PMSG. La inyección subcutánea de Fltl (1-3) -Fc (A40) o FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) a 25 mg/kg o 5 mg/kg una hora después de la inyección de PMSG da como resultado una inhibición completa en la inducción de progesterona en el día cuatro. Los resultados de este experimento se muestran en las figuras 42A-42B.

Ejemplo 33 Análisis farmacocinético de Fltl (1-3) -Fc (A40) y Fltl (1-3) -Fc pegilada La Fltl (1-3) -Fc se PEGiló ya sea con PEG de lOkD o PEG de 20kD y se probó en ratones balb/c para verificar su perfil farmacocinético. Se encontró que ambas formas PEGiladas de Fltl (1-3) -Fc tenían mucho mejores perfiles de PK que la Fltl (1-3) -Fc (A40) , con el Tmax ocurriendo a 24 horas para las moléculas PEGiladas a diferencia de 6 horas para Fltl (1-3) -Fc (A40) .

Ejemplo 34 ELISA de VEGF165 para probar la afinidad de las variantes del receptor Fltl modificadas Diez pM de VEGF165 se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con variantes del receptor Fltl modificadas que variaban de 160pM a O.lpM. Las variantes del receotor Fltl modificadas usadas en este experimento fueron Fltl (1-3) -Fc Fltl (1-3) -Fc (A40) , FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) expresada transitoriamente, FltlD2VEGFR3D3-Fc?Cl (a) expresada transitoriamente, Fltl- (1-3NAS) -FC, Fll (1-3R_>C) -Fc y Tie2-Fc. La Fltl (l-3NAs) -Fc es una versión modificada de Fltl (1-3) -Fc en la cual la secuencia de aminoácidos altamente básica KNKRASVRRR es reemplazada por NASVNGSR, dando como resultado la incorporación de dos nuevos sitios de glicosilación y una reducción neta de cinco cargas positivas, ambos con el propósito de reducir los efectos desfavorables de esta secuencia en la PK. La Fltl (1-3R_>C) -Fc es una modificación en la cual un solo residuo de arginina (R) dentro de la misma secuencia de aminoácidos básica se cambia a una cisteína (C) (KNKRASVRRR->KNKCASVRRR) para permitir la pegilación en ese residuo, la cual podría proteger después a la región básica de ejercer sus efectos desfavorables en la PK. Después de la incubación la solución se transfirió a una placa que contenía un anticuerpo de captura para VEGF165 (R&D) . La cantidad de VEGF165 libre se determinó después usando un anticuerpo para reportar VEGF165 libre. Esto mostró que la variante del receptor Fltl modificada con la más alta afinidad para VEGF165 (determinada como la cantidad más baja de VEGF165 libre) fue FltlD2FlklD3. Fc?Cl (a) , seguida por Fltl (1-3) -Fc y Fltl (1-3) -Fc (A40) y después por Fltl (1-3R_>C) -Fc, Fltl(l-3NAS)-Fc y FltlD2VEFGFR3D3-Fc?Cl (a) . Tie2Fc no tiene afinidad para VEGF165. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (37)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para un polipéptido de fusión capaz de unirse a un polipéptido VEGF, caracterizada porque comprende: a) una secuencia de nucleótidos que codifica para un componente de receptor de VEGF unido operativamente a b) una secuencia de nucleótidos que codifica para un componente ultimerizador, en donde el componente receptor de VEGF es el único componente receptor de VEGF del polipéptido de fusión y en donde la secuencia de nucleótidos de a) consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos del dominio 2 Ig del dominio extracelular de un primer receptor de VEGF y una secuencia de nucleótidos que codifica para la secuencia de aminoácidos del dominio 3 Ig del dominio extracelular de un segundo receptor de VEGF.

2. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el primer receptor de VEGF es Fltl.

3. El ácido nucleico aislado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el segundo receptor de VEGF es Flkl o Flt4.

4. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor de VEGF está hacia el extremo 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor de VEGF.

5. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio 2 Ig del dominio extracelular del primer receptor de VEGF está hacia el extremo 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica para el dominio 3 Ig del dominio extracelular del segundo receptor de VEGF. - - - - - .<aa=B-a--ft-

6. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el componente multimerizador comprende un dominio de inmunoglobulina.

7. La molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con la reivindicación 6, caracterizada porque el dominio de inmunoglobulina se selecciona del grupo que consiste en el dominio Fc de IgG, la cadena pesada de IgG y la cadena ligera de IgG.

8. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de fusión de receptor Fltl modificado, caracterizada porque la región de codificación de la molécula de ácido nucleico consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 21A-21C; b) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 22A-22C; c) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 24A-24C; y « . »» »» S d) una secuencia de nucleótidos que, como resultado de la degeneración del código genético, es diferente de la secuencia de nucleótidos de a) , b) o c) y la cual codifica para una molécula de polipéptido de fusión que tiene la actividad biológica del polipéptido de fusión del receptor Fltl.

9. Una molécula de ácido nucleico aislada que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para un polipéptido de fusión de receptor Fltl modificado, caracterizada porque la región de codificación de la molécula de ácido nucleico consiste esencialmente en una secuencia de nucleótidos seleccionada del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 13A-13D; b) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 14A-14C; c) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 15A-15C; d) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 16A-16D; y e) una secuencia de nucleótidos que, como resultado de la degeneración del código genético, es diferente de la secuencia de nucleótidos de a) , b) , c) o d) y la cual codifica para una molécula de polipéptido de fusión que tiene la actividad biológica del polipéptido de fusión del receptor Fltl.

10. Un polipéptido de fusión codificado por una molécula de ácido nucleico aislada de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.

11. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque se une específicamente al ligando VEGF del receptor de VEGF.

12. Una composición capaz de unirse a una molécula de VEGF para formar un complejo no funcional, caracterizada porque comprende un multímero del polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 10 u 11.

13. La composición de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada porque el multímero es un dímero.

L --, i,-. í I.-* 14. La composición de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada porque es una composición farmacéutica que comprende además un vehículo.

15. Un vector caracterizado porque comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9.

16. Un vector de expresión que comprende una molécula de ácido nucleico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque la molécula de ácido nucleico está unida operativamente a una secuencia de control de expresión.

17. Un sistema de huésped-vector caracterizado porque es para la producción de un polipéptido de fusión que comprende el vector de expresión de conformidad con la reivindicación 16, en una célula huésped adecuada.

18. El sistema de huésped-vector de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la célula huésped adecuada es una célula bacteriana, célula de levadura, célula de insecto o célula de mamífero.

19. El sistema de huésped-vector de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la célula huésped adecuada es una célula de E. coli . 5

20. El sistema de huésped-vector de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque la célula huésped adecuada es una célula COS o una célula CHO.

21. Un método para producir un polipéptido de 10 fusión que comprende cultivar células del sistema de huésped- vector de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 17 a 20, caracterizado porque es bajo condiciones que permiten la producción del polipéptido de fusión y la recuperación del polipéptido de fusión producido de esa 15 manera.

22. Un polipéptido de fusión, caracterizado porque se produce mediante un método de conformidad con la reivindicación 21. 20

23. Un polipéptido de fusión codificado por la secuencia de ácido nucleico mostrada en las figuras 10A-10D, figuras 21A-21C, figuras 22A-22C o figuras 24A-24C, *js ¡*a¡u * ? caracterizado porque ha sido modificado mediante acetilación o pegilación.

24. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la modificación es acetilación que se logra con al menos aproximadamente un exceso molar de 100 veces de acetilación.

25. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la modificación es acetilación que se logra con un exceso molar de reactivo de acetilación que varía de al menos aproximadamente un exceso molar de 10 a aproximadamente un exceso molar de 100 veces.

26. El polipéptido de fusión de conformidad con la reivindicación 23, caracterizado porque la modificación es pegilación usando PEG de 10K o 20K.

27. Un polipéptido de fusión capaz de unirse a un polipéptido VEGF que comprende: a) un componente receptor de VEGF unido operativamente a b) un componente muítimerizador, BÉ .¿ ir - 4-..a* i * H - . £ -. ¿i*< •« - a £ -fr -^*' - . '"A ^~ #< $ ti caracterizado porque el componente receptor de VEGF es el único componente receptor de VEGF en el polipéptido de fusión y consiste esencialmente en la secuencia de aminoácidos del dominio 2 Ig del dominio extracelular de un primer receptor de VEGF y la secuencia de aminoácidos del dominio 3 Ig del dominio extracelular de un segundo receptor de VEGF.

28. Un polipéptido de fusión que consiste esencialmente de la secuencia de aminoácidos de un receptor Fltl modificado, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en: a) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 21A-21C; b) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 22A-22C; y c) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 24A-24C.

29. Un polipéptido de fusión que comprende una secuencia de aminoácidos de un receptor Fltl modificado, caracterizado porque la secuencia de aminoácidos se selecciona del grupo que consiste en: kí,t*&.~&.áL áJ - e&&& ?& í. *.«&# '&, *. a) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 13A-13D; b) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 14A-14C; c) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 15A-15C; y d) la secuencia de nucleótidos mostrada en las figuras 16A-15D.

30. El uso de un polipéptido de fusión de mamífero de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 ó 22 a 29, o de una composición de conformidad con la reivindicación 12, 13 ó 14, en la fabricación de un medicamento para usarse en un método para disminuir o inhibir el derrame de plasma en un mamífero.

31. El uso de conformidad con la reivindicación 30, en el que el mamífero es un humano.

32. El uso del polipéptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 ó 22 a 29, o de una composición de. conformidad con la reivindicación 12, 13 ó 14, en la fabricación de un medicamento para usarse en un método para bloquear el crecimiento de vasos sanguíneos en un humano .

33. El uso del polipéptido de fusión de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10, 11 ó 22 a 29, o de una composición de conformidad con la reivindicación 12, 13 ó 14, en la fabricación de un medicamento para usarse en un método para inhibir la actividad del ligando del receptor de VEGF en un mamífero.

34. El uso de conformidad con la reivindicación 33, en el que el mamífero es un humano.

35. El uso de conformidad con la reivindicación 34, para atenuar o prevenir el crecimiento de tumores, para atenuar o prevenir edema, o para atenuar o prevenir la formación de ascites en un humano.

36. El uso de conformidad con la reivindicación 35, en el que el edema es edema cerebral.

37. El uso de conformidad con la reivindicación 35, en el que los ascites son ascites asociados con cáncer ovárico . ^ .