CZ302689B6

CZ302689B6 - Izolovaná molekula nukleové kyseliny, fúzní polypeptid jí kódovaný, vektor s jejím obsahem, systém vektor-hostitel pro produkci fúzního polypeptidu a zpusob jeho prípravy, antagonista dimerního VEGF a použití

Info

Publication number: CZ302689B6
Application number: CZ20014387A
Authority: CZ
Inventors: J. Papadopoulos@Nicholas; Davis@Samuel; D. Yancopoulos@George
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals, Inc.
Priority date: 1999-06-08
Filing date: 2000-05-23
Publication date: 2011-09-07
Also published as: DE60019415D1; CN1369009A; ATE417928T1; EP1183353A1; NO2013010I1; SK17522001A3; LU92195I2; BRPI0011407B1; NO2022060I1; LTPA2013009I1; BR0011407A; KR20020019070A; HRP20010908B1; PT1183353E; WO2000075319A1; CZ303656B6; HUS1300052I1; FR13C0028I1; FR13C0028I2; HRP20010908A2

Abstract

Je popsána izolovaná molekula nukleové kyseliny, která obsahuje: (a) nukleotidovou sekvenci kódující receptorovou složku cévního endotelového rustového faktoru (VEGF) skládající se z v podstate z imunoglobulinu (Ig) podobné domény 2 prvního VEGF receptoru a Ig domény 3 druhého VEGF receptoru, a (b) nukleotidovou sekvenci kódující multimerizacní složku, kde prvním VEGF receptorem je Flt 1 a druhým VEGF receptorem je Flk 1 nebo Flt 4 a VEGF receptorová složka je jediná VEGF receptorová složka fúzního polypeptidu. Dále je popsán fúzní polypeptid kódovaný takovou molekulou a jeho použití pro výrobu léciva, vektor, který obsahuje takovou molekulu, systém vektor-hostitel pro produkci fúzního polypeptidu, a zpusob prípravy fúzního polypeptidu, jakož i antagonista dimerního cévního endotelového rustového faktoru, obsahující dva fúzní polypeptidy, a jeho použití pro výrobu léciva.

Description

Předkládaný vynález uplatňuje prioritu z US prozatímní přihlášky 60/138133, podané 8. června 1999.

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká modifikovaných polypeptidů se zlepšenou farmakokinetikou. Přesněji se předkládaný vynález týká Fltl receptorových polypeptidů, které byly modifikovány tak, že mají lepší farmakokinetický profil. Předkládaný vynález se také týká způsobů přípravy a použití modifikovaných polypeptidů, včetně například použití modifikovaných polypeptidů pro snížení nebo inhibici úniku plasmy a/nebo cévní permeability u savců.

Dosavadní stav techniky

Schopnost peptidových ligandů vázat se na buňky a tak vyvolá vat fenotypové reakce, jako je rast buněk, jejich přežívání, sekrece produktů buňkami nebo diferenciace, je často zprostředkována transmembránovými receptory na těchto buňkách. Extracelulámí doména takových receptorů (tj. část receptoru vystavená na povrchu buňky) je obvykle nejvíce specifickou částí molekuly a dodává proteinu charakteristické vázání ligandů. Vazba ligandu na extracelulámí doménu obvykle vede k přenosu signálu, kterým se přenáší biologické signály k intracelulámím cílům. Často je přenos signálu veden přes katalytickou intracelulámí doménu. Uspořádání motivů v této katalytické doméně určuje její účinky na potenciální kinázové substráty (Mohammadi et al., 1990, Mol. Cell Biol. 11: 5068 až 5078; Fantl et at, 1992, Cell, 69: 413 až 413). Příklady receptorů, které přenášejí signály cestou katalytických intracelulámích domén, zahrnují receptorové tyrosin kinázy (RTK), jakoje Trk rodina receptorů, které jsou obvykle omezeny na buňky nervového systému, cytokinová rodina receptorů, včetně trojdílného CNTF receptorového komplexu (Stáhl and Yancopoulos, 1994. J. Neurobio. 25: 1454 až 1466), která je také obvykle omezena na buňky nervového systému, receptory spřažené s G-proteinem, jako jsou například ₂-adrenergní receptory, které se vyskytují, například, v buňkách srdečního svalu, a multimemí IgE vysoceafinitní receptor FcepsilonRI, který je lokalizován, například, na žímých buňkách a na bazofilech (Sutton and Gould, 1993, Nátuře 366: 421 až 428).

Zdá se, že všechny doposud identifikované receptory podléhají po vazbě ligandu dimerizaci, multimerizaci, nebo některým konformačním změnám (Schlessinger, J., 1988, Trend Biochem. Sci., 13: 443 až 447; Ullrich and Schlessinger, J., 1990, Cell 61: 203 až 212; Schlessinger and Ullrich, 1992, Neuron 9: 383 až 391) a molekulová interakce mezi dimenzujícími intracelulárními doménami vede k aktivaci katalytické funkce. V některých případech, jak například u destičkového růstového faktoru (PDGF), je ligandem dimer, který se váže na dvě receptorové molekuly (Hart et al., 1988, Science, 240: 1529 až 1531; Heldin, 1989, J. Biol. Chem. 264: 8905 až 8912), zatímco například u epidermálního růstového faktoru (EGF) je ligandem monomer (Weber et al., 1984, J. Biol. Chem. 259: 14631 až 14636). V případě FcRI receptoru existuje ligand, IgE, navázaný na Fc RI ve formě monomeru a je aktivován pouze tehdy, když se na komplex IgE/Fc RI naváže antigen a dojde k zesítění sousedních molekul IgE (Sutton and Gould, 1993, Nátuře 366: 421 až 428).

Často ukazuje tkáňová distribuce určitého receptoru ve vyšších organismech na biologickou funkci receptoru. RTK pro některé růstové a diferenciační faktory, jakoje fibroblastový růstový faktor (FGF), jsou exprimovány v mnoha tkáních a proto se zdá, že mají nějakou úlohu při růstu tkání ajejich udržování. Členové Trk RTK rodiny (Glass and Yancopoulos, 1993, Trends in Cell Biol. 3: 262 až 268) jsou obvykle omezeny na buňky nervového systému a rodina nervového

-1 CZ 302689 B6 růstového faktoru skládající se z nervového růstového faktoru (NGF), mozkového neurotrofního faktoru (BDNF), neurotrofinu 3 (NT-3) a neiirotrofinu-4/5 (NT-4/5), které se váží na Trk rodinu RTK, podporuje diferenciaci různých skupin neuronů v mozku a na periferii (Lindsay, R.M., 1993, v Neurotrofic Factors, S.E. Loughlin and J.H. Fallon, ed., str. 257 až 284, San Diego, CA,

Academie Press). Fc Rl se vyskytuje na velmi omezeném počtu typů buněk, jako jsou žírné buňky a bazofily. Žírné buňky vznikají z pluripotentních hematopoetických kmenových buněk kostní dřeně, ale dozrávají ve tkáních po migraci z krevního řečiště (viz Janeway and Travers, 1966, v lmmunology, 2. vydání, M. Robertson and E. Lawrence, ed., str. 1:3 až 1:4, Current Biology Ltd., London, UK, Publisher), a podílejí se na alergické reakci.

io

Mnoho studií prokázalo, že extracelulámí doména receptorů dodává specifické charakteristiky vazby ligandu. Dále, buněčné prostředí, ve kterém je receptor exprimován, může ovlivňovat biologickou reakci vznikající po vazbě ligandu na receptor. Například, když je neuronální buňka exprimující Trk receptor vystavena působení neurotrofinu, který sc váže na tento receptor, tak i? dojde k přežívání buňky a diferenciaci. Když je stejný receptor exprimován fibroblasty, tak vede vystavení působení neurotrofinu k proliferací tlbroblastů (Glass et al., 1991, Cell. 66: 405 až

413).

Byla identifikována třída buněčných dimerních mitogenů se selektivitou pro cévní endotelové buňky a tato třída byla označena jako cévní endotelový růstový faktor (VEGF). VEGF byl přečištěn z kondicionovaného růstového média krysích gliomových buněk (Conn et al., (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 87, str. 2628 až 2632); a z kondicionovaného růstového média folikulárních hvězdicovitých buněk hovězí hypofýzy (Ferrara and Henzcl, 1989, Biochem. Btophys. Res. Comm. 161, str. 851 až 858; Gozpadorowicz ct al., 1989, Science, 246: 1309 až 1312). VEGF je dimer se zřetelnou molekulovou hmotností přibližně 46 kDa, kde každá podjednotka má zřetelnou molekulovou hmotnost přibližně 23 kDa. VEGF má určitou strukturální podobnost s destičkovým růstovým faktorem (PDGF), který je mítogenem pro buňky pojivové tkáně, ale který není mitogenní pro cévní endotelové buňky z velkých cév.

3o Bylo zjištěno, že membránový lyrosin-kínázový receptor, známý jako Fit, je VEGF rcccptorcm (DeVries, C. et al., 1992, Science 255, str. 989 až 991). Fit receptor specificky váže VEGF, který indukuje mitogenezi. Také je známá částečná cDNA sekvence a téměř kompletní proteinová sekvence KDR (Tcrman, B.l. et al., 1992, Biochem. Biophys. Res. Comm. 187, str. 1579 až 1586).

Persistující angiogeneze může způsobovat nebo excerbovat některá onemocněni, jako je psoriasa, revmatoidní artritida, hemangiomy, angiofibromy, diabetická retinopatie a neovaskulární glaukom. Inhibitor aktivity VEGF by byl účinný v léčbě takových onemocnění a také jiné patologické angiogeneze cévní permeability indukované VEGF, jako je vaskularizace nádorů. Předkládaný vynález se týká VEGF inhibitoru, který je založen na VEGF receptorů Fit 1.

Unik plasmy, klíčová složka zánětu, se vyskytuje v různých podskupinách mikrocév. Konkrétně, ve většině orgánů dochází k úniku plasmy specificky ve venulách. Na rozdíl od arteriol a kapilár se venuly stávají propustnými v reakci na různé zánětlivé mediátory, jako je histamin, bradykínín a serotonin. Jednou charakteristikou zánětu je únik plasmy, ke kterému dochází v důsledku mezi45 buněčných mezer v endolelu venul. Většina experimentálních modelu zánětu naznačuje, že tyto mezibuněčné mezery se vyskytují mezi endotelovými buňkami postkapilárně ve sběrných venulách (Baluk, P. et al., Am. J. Pathol. 1998, 152: 1463 až 76). Bylo prokázáno, že některé lektiny mohou být použily pro odhalení lokálních míst úniku plasmy, mezer v endotelu a finger-like procesů na hranicích endotelových buněk ve venulách v zánětlivém ložisku (Thurston, G. et al..

Am. J. Physiol., 1996, 271: H2547-62). Konkrétně, rostlinné lektiny byly použity pro vizualizaci morfologických změn v endotelových buňkách v zánětlivých venulách krysí průdušnice. Lektiny, jako je konkavalin A a riein, které se váží lokálně na zánětlivé venuly, ukázaly regiony stěny cévy pod mezerami v endotelu, které odpovídají regionům úniku plasmy (Thurston G. et al„ Am. J. Physiol., 1996. 271: H2547-62).

Vlastnosti mikrocév jsou dynamické. Chronická zánětlivá onemocnění jsou asociovaná s přestavbou mikrovaskulatury, včetně angiogeneze a zvětšování mikrocév. Mikrocévy mohou být také přestaveny tak, že mají abnormální vlastnosti. V myším modelu chronického zánětu dýchacích cest získávají kapiláry dýchacích cest vlastnosti venul, včetně zvětšení průměru cév, zvýšení reaktivity pro von Wilebrandův faktor a zvýšení reaktivity pro P-selektin. Dále, tyto remodelované cévy se stávají propustnými v reakci na zánětlivé mediátory, zatímco cévy ve stejné lokalizaci v dýchacích cestách normálních myší nikoliv.

Bylo prokázáno, že některé substance snižují nebo inhibují cévní permeabilitu a/nebo unikání io plasmy. Například mystixiny jsou syntetické polypeptidy, které inhibují unikání plasmy bez blokování tvorby endotelových mezer (Baluk, P. et al.. J. Pharmacol. Exp. Ther. 1998, 284: 693 až

9). Také agonista beta-2-adrenergních receptorů formoterol redukuje propustnost mikrocév tím, že inhibuje tvorbu endotelových mezer (Baluk, P. and McDonald, D.M., Am. J. Physiol., 1994, 266: L461-8).

Angiopoetiny a členy rodiny cévního endotelového růstového faktoru (VEGF) jsou jedinými růstovými faktory, o kterých se soudí, že jsou specifické pro cévní endotelové buňky. Pokusy s cílenou inaktivací genů u myší ukázaly, že VEGF je nutný pro Časná stadia vývoje cév a že pro pozdější stadia remodel ování cév je nutný Ang-1.

Patent US 6 011 003, udělený 4. 1.2000 (Metris Therapeutics Limited), popisuje alterovanou, solubilní formu FLT polypeptidu, který je schopen vazby na VEGF a proto má inhibiční efekt na VEGF, kde uvedený polypeptid se skládá z pěti nebo méně kompletních ímunoglobulinových domén.

Patent US 5 712 380, udělený 27. 1. 1998 (Merck and Co.) popisuje inhibitory cévního endotelového růstového faktoru (VEGF), které jsou buď přirozené, nebo rekombinantně upravené solubilní formy s nebo bez C—koncového transmemhranového regionu receptoru pro VEGF.

PCT přihláška WO 98/13 071, publikovaná 2. 4. 1998 (Merck and Co.) popisuje techniku genové terapie pro inhibicí růstu primárního nádoru a metastas pomocí genového přenosu nukleotidové sekvence kódující solubilní receptorový protein, který se váže na VEGF.

PCT přihláška WO 97/44 453, publikovaná 27. 11. 1997 (Genetech, lne.) popisuje nové chimé35 rické VEGF receptorové proteiny obsahující aminokyselinové sekvence odvozené od receptorů pro cévní endotelový růstový faktor (VEGF) Fltl a KDR, včetně myšího homologú pro lidský KDR receptor FLK1, kde uvedené chimérické VEGF receptorové proteiny se váží na VEGF a antagonizují proliferační a angiogenní aktivity endotelových buněk (viz také Davis-Smyth et al., EMBOJ., 1996, sv, 15, 4919 až 4927).

PCT přihláška WO 97/13 787, publikovaná 17. 4. 1997 (Toa Gosei Co., Ltd.), popisuje inhibitor VEGF s nízkou molekulovou hmotností použitelný v léčbě onemocnění spojených s neovaskularizací, jako jsou solidní nádory. Polypeptid obsahující první imunoglobulinu podobnou doménu a druhou imunoglobulinu podobnou doménu v extracelulámím regionu VEGF receptoru Fit, ale neobsahující šestou imunoglobulinu podobnou doménu a sedmou imunoglobulinu podobnou doménu, vykazuje inhibiční aktivitu vzhledem k VEGF.

Sharifi, J. et al., 1998, The Quarterly Jour. of Nucl. Med. 42: 242 až 249, popisují, že v důsledku toho, že monoklonální protilátky (MAb) jsou bazické proteiny s pozitivním nábojem a savčí buňky mají negativní náboj, mohou elektrostatické interakce mezi nimi vytvářet vysoké hladiny základního vázání, které vedou k nízkému poměru nádor vs, normální orgány. Pro vyřešení tohoto účinku se výzkumníci pokusili zlepšit klírens MAb pomocí různých metod, jako jsou sekundární činidla nebo chemické modifikace nebo modifikace náboje MAb samotných.

-3QZ 302689 B6

Jensen-Pippo et al., 1996, Pharmaceutical Research 13: 102 až 107, popisují, že pegylace terapeutického proteinu, rekombinantního lidského faktoru stimulujícího kolonie granulocytů (PEG-G-CSF), vede k zvýšení jeho stability a k retencí biologické aktivity in vivo, když je tento protein podán intraduodenálně.

Tsutsumi et al., 1997, Thromb. Haemost. 77: 168 až 173, popisují pokusy, při kterých byla in vivo trombopoetická aktivita ínterleukinu 6 modifikovaného polyethylenglykolem (MPEG-IL6), ve kterém bylo 54 % ze 14 lysinových aminoskupin IL-6 vázáno na /EG, srovnávána s aktivitou přirozeného 11,6.

io

Yang et al., 1995, Cancer 76: 687 až 694, popisují, že konjugace polyethylenglykolu na lidský interleukin-2 (IL—2) vede k zisku sloučeniny (polyethylenglykolem modifikovaného 1L-2 (PEG-1L-2)), která si zachovává in vitro a ín vivo aktivitu 1L 2, ale která má významně prodloužený cirkulační poločas.

R. Duncan and F. Spreafico, Clin. Pharmacokinet. 27: 290 až 306, 296 (1994) uvádějí přehled snah o zlepšení plasmatického poločasu asparaginasy pomocí konjugace s polyethylenglykolem.

PCT mezinárodní přihláška WO 99/03 996, publikovaná 28.1.1999 (Regeneration Pharma20 ceuticals, lne. a The Reagents of The University of California) popisuje modifikované lidské podpůrné polypeptidy obsahující delece regionů s bazickými aminokyselinami. Je popsáno, že modifikované lidské podpůrné polypeptidy si zachovávají biologickou aktivitu a zároveň mají redukovanou afinitu pro heparin a lepší farmakokinetiku ve zvířecím séru ve srovnání s nemodifikovaným lidským podpůrným polypeptidem.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález je zaměřen na izolovanou molekulu nukleové kyseliny, která obsahuje:

3(1 (a) nukleotidovou sekvenci kódující cévní endotelový růstový faktor (VEGF) receptorovč složky sestávající v podstatě z imunoglobulinu podobné (lg) domény z prvního VEGF receptoru a Ig domény 3 druhého VEGF receptoru a (b) nukleotidovou sekvenci kódující muitimerizační složku, kde prvním VEGF rcceptorem je

Fltl a druhým VEGF receptorem je Fikl nebo Flt4 a složkou VEGF receptoru je pouze VEGF receptorová složka fúzního polypeptidu.

Při výhodném ztělesnění nukleotidovou sekvencí kódující lg doménu 2 extracelulámí domény

4o prvního VEGF receptoru je před nukleotidovou sekvencí kódující lg doménu 3 extracelulámí domény druhého VEGF receptoru.

Při jiném výhodném ztělesnění nukleotidová sekvence kódující lg doménu 2 extracelulámí domény prvního VEGF receptoru je za nukleotidovou sekvencí kódující lg doménu 3 extra45 celulární domény druhého VEGF receptoru.

Ve výhodném ztělesnění tohoto vynálezu muitimerizační složka obsahuje imunoglobu línovou doménu.

5d V jiném ztělesnění imunoglobulinová doména je vybraná ze skupiny zahrnující Fc doménu IgG a těžký řetězec IgG.

-4CZ 302689 B6

Výhodné ztělesnění zahrnuje izolovanou molekulu nukleové kyseliny obsahující nukleotidovou sekvenci kódující modifikovaný Fit ΐ receptorový fúzní polypeptid, kde kódující region molekuly nukleové kyseliny se skládá z nukleotidové sekvence vybrané ze skupiny zahrnující:

(a) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 21A až 21C, (b) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 22A až 22C, (c) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 24A až 24C a (d) nukleotidová sekvence, která se v důsledku degenerace genetického kódu liší od nukleotidové sekvence (a), (b) nebo (c), a která kóduje molekulu fúzního polypeptidu majícího biologickou aktivitu modifikovaného Fltl receptorového fúzního polypeptidu.

Dalším ztělesněním tohoto vynálezu je fúzní polypeptid, kterýje kódován izolovanou molekulou nukleové kyseliny popsané výše.

Jiným ztělesněním je vektor, který obsahuje molekuly nukleové kyseliny popsané výše, zahrnující expresní vektor obsahující molekuly nukleové kyseliny popsané výše, kde molekula nukleové kv^elinv ie onerativně navázaná na sekvenci řídící exnresi.

* * *

Jiným zahrnutým ztělesněním je systém vektor-hostitel pro produkci fúzního polypeptidu, který obsahuje expresní vektor ve vhodné hostitelské buňce, systém hostitel-vektor, ve kterém vhodnou hostitelskou buňkou je bakteriální buňka, kvasinka, hmyzí buňka nebo savčí buňka, systém hostitel-vektor, ve kterém vhodnou hostitelskou buňkou je E. coli, systém hostitel-vektor, ve kterém vhodnou hostitelskou buňkou je COS buňka nebo systém hostitel-vektor, ve kterém vhodnou hostitelskou buňkou je CHO buňka.

Jiným ztělesněním tohoto vynálezu je způsob přípravy fúzního polypeptidu, který zahrnuje kultivaci buněk systému vektor-hostitel za podmínek umožňujících produkci fúzního polypeptidu a odběr takto produkovaného fúzního polypeptidu.

Další ztělesnění zahrnuje antagonistů dimerního cévního endotelového růstového faktoru (VEGF), který obsahuje dva fúzní póly peptidy, přičemž každý fúzní protein zahrnuje:

(a) složku VEGF receptorů sestávající v podstatě z imunoglobulinu podobné (Ig) domény 2 Fltl VEGF receptorů a Ig domény 3 Fltl nebo Flt4 VEGF receptorů a (b) mu 1ti meri začni složku, kde složkou VEGF receptorů je pouze složka VEGF receptorů každého fúzního polypeptidu.

Takový antagonista může být modifikován acetylací nebo pegylací.

Fúzní protein podle tohoto vynálezu může být používán pro snížení nebo inhibici úniku plasmy u savců, podáním fúzního polypeptidu popsaného výše savci, přičemž zahrnuje ztělesnění, ve kterém savcem je člověk, fúzní polypeptid je acetylovaný nebo fúzní polypeptid je pegylovaný. Fúzní polypeptid může být také používán pro blokování růstu krevních cév u člověka.

Další použití podle tohoto vynálezu zahrnuje zmírnění nebo prevenci růstu nádorů u člověka, zmírnění nebo prevenci vzniku otoků u člověka, zvláště když otokem je otok mozku, zmírnění nebo prevenci ascitů vzniklých u člověka, zvláště když ascitem je ascites asociovaný s karcinomem ovaria.

-5CZ 302689 B6

Tento vynález dále poskytuje fúzní polypeptid, který obsahuje:

(a) složku VEGF receptorů sestávající v podstatě z imunoglobulinů podobné (lg) domény 2 Fltl VEGF receptorů a Ig domény 3 Fltl nebo Flt4 VEGF receptorů a (b) multimerizační složku, kde složkou VEGF receptorů je pouze složka VEGF receptorů fúzního polypeptidu.

io Výhodné ztělesnění zahrnuje fúzní polypeptid, kde aminokyselinová sekvence Ig domény 2 extracelulámí domény prvního VEGF receptorů je před aminokyselinovou sekvencí Ig domény 3 extracelulámí domény druhého VEGF receptorů a fúzní polypeptid, kde aminokyselinová sekvence Ig domény 2 extracelulámí domény prvního VEGF receptorů je za aminokyselinovou sekvencí Ig domény 3 extracelulámí domény druhého VEGF receptorů.

V ještě jiném ztělesnění fúzní polypeptid multimerizační složka obsahuje imunoglobulinovou doménu, včetně ztělesnění, kde imunoglobulinová doména je vybrána ze skupiny zahrnující Fc doménu IgG a těžký řetězec IgG.

2o Výhodné ztělesnění zahrnuje polypeptid, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci modifikovaného Fltl receptorů, kde aminokyselinová sekvence je vybrána ze skupiny zahrnující:

(a) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 21A až21C, (b) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 22A až 22C a (c) aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 24A až 24C.

Jiným výhodným ztělesněním je použití fúzního polypeptidu nebo dimerního antagonisty podle tohoto vynálezu pro výrobu léčiva pro použití pro zmírnění nebo prevenci růstu nádoru; zmírnění nebo prevenci vzniku otoků, zmírnění nebo prevenci vzniku ascitu, pokles nebo inhibici pronikání plasmy nebo pro blokování růstu krevních cév u člověka.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. I. 1EF gelová analýza nemodifikovaných a acetylovaných Fitl( 1-3)-Fc proteinů. Nemo35 difikovaný Fltl (1-3 }-Fc protein není schopen pronikat gelem v důsledku svého pl > 9,3, zatímco acelylovaný Fit 1 (1 -3)-Fc protein je schopen prostupovat gelem a dosahuje rovnováhy při pl 5,2.

Obr. 2. Vazba nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc acetylovaného Fltl(1-3)-Fc proteinu na plotny potažené Matrigelem®. Nemodifikované Fltl(1-3)-Fc proteiny se výrazně váží na složky extra40 celuiární matrice v Matrígelu®, zatímco acetylované Fit 1 (l-3)-Fc proteiny se neváží.

Obr. 3. Vazba nemodifikovaných Fit 1(I-3)-Fc proteinů, acetylovaných Fltl(1-3)-Fc proteinů a pegylovaných Fltl(l-3)-Fc proteinů v testu na bázi Biacore. Acetylované (sloupce 13 až 16), pegylované (sloupce 17 až 20) a heparinem zpracované Fltl(I-3)-Fc (sloupec 21 až 24) byly každý schopen úplně kompotovat s Fit 1( 1-3)-Fc navázaným na Biacore čip o vazbu na VEGF ve srovnání s kontrolními (sloupce 1 až 4) a irelevantními proteiny (sloupce 5 až 8). Nemodifikovaný Fit I (1 —3)—I’C (sloupce 5 až 6) jako jediný částečně kompetuje s Fit l( I - 3 >-Tc navázaným na Biacore čip o vazbu VEGF. Nicméně, promytí navázaných vzorků 0,5 M NaCl (sloupec 7 až 8) vedlo k zisku vazebného profilu podobného vazebnému profilu modifikovaných forem

Fit 1( I-3)-Fc, což naznačuje, že nemodifikovaný protein vykazuje nespecifickou vazbu na čip. která může být eliminována promytím roztokem soli.

-6CZ 302689 B6

Obr.4. Vazba nemodifikovaného Fit 1 (1 -3)—Fc, acetylovaného Fltl(l~3)—Fc a pegylovaného Fit 1 (1-3)-Fc na VEGF v testu na bázi ELISA. Jak pegylovaný, tak acetylovaný Fltl(l-3>-Fc se váží na VEGF s afinitními blížícími se nemodifikovanému Fit 1 (1 -3)~Fc.

Obr. 5. Farmakokinetické profily nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, acetylovaného Fit 1 (1-3)—I c a pegylovaného Fit 1 (1-3)-Fc. Balb/c myším (23 až 28 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fit 1 (1 —3)—Fc. Myším se odebírala krev z ocasu za 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci proteinu a sérum se testovalo ve standardním ELISA testu určeném pro detekci Fltl (1—3)—Fc proteinu. T_max pro všechny Fltl (1—3>—Fc proteiny bylo mezi 6 hodinami a 24 hodinami. C_inax pro různé proteiny byla následující: nemodifikovaný 0,06 pg/ml - 0,15 pg/ml; acetylovaný - 1,5 pg/ml - 4,0 pg/ml; a pegylovaný - přibližně 5 pg/ml.

Obr. 6A—6B. IEF gelová analýza nemodifikovaných a postupně acetylovaných Fit 1 (1—3)—Fc proteinů. Nemodifikovaný Fltl(l—3)—Fc protein není schopen prostupovat gelem v důsledku svého pH >9,3, zatímco většina postupně acetylovaných Fltl(l—3)-Fc (30 až 100 násobný nadbytek vzorků) byly schopné migrovat gelem a dosahovaly rovnováhy při pl v rozmezí od 4,55 až 8,43, podle stupně acetylace.

Obr. 7. Vazba nemodifikovaného Fltl(1-3)-Fc a postupně acetylovaných Fltl(1-3)—Fc nrotein ň na nlotnv natažené Matri Pelem®. Steině iakn irelevantní kontrolní nrotein nevvkaziiií

I 1 I W postupně acetylované Fltl(1-3)-Fc (20 a 30-násobné vzorky) jakoukoliv vazbu na plotnu potaženou Matrigelem®, zatímco neacetylovaný Fltl(l—3)-Fc protein vykazuje významnou vazbu. 10-násobné vzorky vykazují redukovanou vazbu, ale stupeň acetylace není dostatečný pro úplné blokování vazby na složky extracelulámí matrice.

Obr. 8. Vazba nemodifikovaného Fit 1 (1—3)—Fc a postupně acetylovaného Fltl(1-3)-Fc v testu na bázi Biacore. V sub-stechiometrickém poměru (0,5 pg/ml buď nemodifikovaného Fltl (1-3). nebo postupně acetylovaného Fltl(l—3)—Fc vs. 0,2 pg/ml VEGF) není v roztoku dostatek Fltl(l-3)-Fc (nemodifikovaného nebo acetylovaného) pro úplnou vazbu VEGF. Pri 1,0 pg/ml, což je přibližně 1:1 stechiometrický poměr, jsou jak nemodifikovaný, tak postupně acetylovaný Fit 1( 1—3)—Fc lépe schopny kompetovat o vazbu VEGF, ale stále ještě není dostatek Fltl(l—3)—Fc proteinu (nemodifikovaného nebo postupně acetylovaného) pro kompletní saturaci dostupného VEGF. Nicméně, při 5,0 pg/ml, což je několikrát více, než je stechiometrický poměr 1:1, jsou jak Fit 1(1-3)-Fc, tak postupně acetylovaný Fit 1(1—3)—Fc proteiny schopny saturovat VEGF, bez ohledu na stupeň acetylace.

Obr. 9. Farmakokinetické profily nemodifikovaného Fltl(l—3)—Fc a postupně acetylovaného Fit 1( 1 —3)—Fc. Balb/c myším (23 až 28 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného nebo 10, 20, 40, 60 a 100-násobné vzorky postupně acetylovaného Fltl(l—3)—Fc (3 myši pro nemodifikovaný, 10, 20 a 40-násobné vzorky a 2 myši pro 60 a 100-násobné vzorky). Myším sc odebírala krev z ocasu za 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci proteinu a sérum se testovalo v ELISA testu určeném pro detekci Fit 1 (1 —3)—Fc proteinu. T_max pro všechny testované Fltl(l—3)—Fc proteiny bylo 6 hodin, ale C_max byla následující: nemodifikovaný Fltl(1 -3)—Fc 0,06 pg/ml; 10-násobný nadbytek-0,7 pg/ml; 20-násobný nadbytek - 2,0 pg/ml; 40-násobný nadbytek - 4,0 pg/ml; 60—násobný nadbytek - 2,0 pg/ml; 100-násobný nadbytek - 1,0 pg/ml.

Obr. 10A-10D. Sekvence nukleových kyselin a odvozené aminokyselinové sekvence Fltl(I-3)-Fc.

Obr. 11. Schématický diagram struktury Fltl.

Obr. 12A a 12B. Analýza hydrofilnosti aminokyselinových sekvencí Ig domény 2 a lg domény 3 Fltl.

-7CZ 302689 B6

Obr. 13A-13D. Sekvence Mutl :Fltl( 1-3_B)-Fc.	nukleovýeh	kyselin	a	odvozené	aminokyselinové	sekvence
Obr. 14A-14C. Sekvence Mut2:Fltl(2-3_B)-Fc.	nukleovýeh	kyselin	a	odvozené	aminokyselinové	sekvence
Obr. 15A-15C. Sekvence Mut3:Fltl(2-3)-Fc.	nukleovýeh	kyselin	a	odvozené	aminokyselinové	sekvence
Obr. 16A-16D, Sekvence	nukleovýeh	kyselin	a	odvozené	aminokyselinové	sekvence

Mut4:Fltl(1-3_R_>_N)-Fc.

Obr. 17. Vazba nemodifikovaného Fit 1 (1 -3)-Fc, mutantního Fltl(l—3)—Fc s delecí bazického regionu a mutantního proteinu Fltl(l— 3)_R ._N v testu na bázi Biacore. Při substechiometrickém poměru (0,25 μg/ml Fltl(l-3)-Fc nemodifikovaných, acetylovaných nebo geneticky modifikovaných vzorků vs. 0,1 gg/ml VEGF) je nedostatek Fltl( 1-3)-Fc proteinu pro blokování vazby VEGF na Fltl(l-3)-Fc imobilizovaný na Biacore čipu. Při 0.5 gg/ml nemodifikovaných, acetylovaných nebo geneticky modifikovaných Fltl(1-3)-Fc proteinů je stechiometrický poměr přibližně 1:1 aje patrná zvýšená schopnost blokování vazby VEGF na Biacore čip. Pri 1,0 gg/ml nemodifikovaných, acetylovaných nebo geneticky modifikovaných Fit 1(1-3f-Fc proteinů je stechiometrický poměr přibližně 10:1 a Fltl(l-3)-Fc proteiny jsou schopny blokovat vazbu VEGF na Biacore čip, ale nejsou rovnocenné. Nemodifikovaný, acetylovaný a Mut 1 :Flt 1 (l —3n)— Fc jsou v podstatě rovnocenné ve schopnosti blokovat vazbu VEGF, zatímco Mut4:Fit 1 (1 —3r _n)-Fc je o něco méně účinný v blokování vazby.

Obr. 18. Vazba nemodifikovaného Fit 1 (1-3)-Fc, Mutl:Fit 1 (1 -3„)-Fc, Mut2:Fltl(2-3_B)-Fc a Fit 1 (2-3) mutantních proteinů na plotny potažené Malrigelem®. nemodifikovaný Fit I(I—3>—Fc protein se váže dobře na tyto jamky, M ut3: Fltl (2-3 )-Fc protein se váže o něco slaběji a Mutl: (2—3r)—Fc protein má nejlepší profil s vazbou slabší než kterýkoliv jiný mutantní protein. Mut4:Flt 1 (I-3« _N)-Fc glykosylovaný mutantní protein je v tomto testu pouze o něco lepši.

Obr. 19. Vazba nemodifikovaného Fit 1 (1 -3)-Fc, Mutl:Fltl( 1-3_K)-Fc, Mut2: Fltl (2-3 _B)-Fc a Fltl(2-3) mutantních proteinů v testu na bázi ELISA. Při testovaných koncentracích se váží nemodifikovaný Flll(l-3)-Fc, Mutl :Fltl( 1-3_B)-Fc, Mut2:Fit 1 (2-3_B)~Fc a Fit 1(2-3) mutantní proteiny na VEGF podobné.

Obr. 20. Farmakokinetické profily pro nemodifikované Fltl(1-3)-Fc. Mutl :I’lt 1 (1 —3n)—

Mut2:Fit 1 (2-3_fi)-Fc a Fltl(2-3) mutantní proteiny. C_II|;|X pro všechna tato činidla byly následující: nemodifikovaný Flll( l-3)-Fe - 0,15 g/ml, 40-násobný molární nadbytek acetylovaného Fit 1(1-3 f-Fc - 1,5 gg/ml; a Mutl :Flt 1(1-3_B)-Fe - 0.7 gg/ml.

Obr. 21A-21C. Sekvence nukleové kyseliny a odvozená aminokyselinová sekvence modifikovaného Fltl receptoru označeného Fltl D2.Fikl D3.Fc C'l (a).

Obr. 22A-22C. Sekvence nukleové kyseliny a odvozená aminokyselinová sekvence modifikovaného Fltl receptoru označeného Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a).

Obr. 23. fest na extracelulámí matrici (ECM). Výsledky tohoto testu ukazují, že Fltl D2.FIL1 D3.Fc Cl (a) a Fit I D2.VEGFR3D3.Fc C 1 (a). Proteiny jsou významně méně lepivé na ECM ve srovnání s Fit I(I-3)-Fc proteinem.

Obr. 24A-24C. Sekvence nukleové kyseliny a odvozená aminokyselinová sekvence modifikovaného 1 lil receptoru označeného VEGFR1 R2.Fc Cl (a).

-8CZ 302689 B6

Obr. 25A-25C. Fosforylační test. Při 1,5 molámím nadbytku buď Fit 1( 1 —3)—Fc. nebo FItl(l-3)-Fc (A40) nebo dočasného fltlD2FIklD3.Fc Cl (a) dochází ke kompletní blokádě receptorové stimulace těchto tří modifikovaných Fltl receptorů ve srovnání s expozicí kontrolnímu médiu. Naopak, dočasný FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl (a) nevykazuje pří tomto molárním nadbytku žádnou blokádu, ve srovnání sVEGF pozitivní kontrolou. Podobné výsledky jsou uvedeny na obr. 25B. kde jsou modifikované Fit receptory ve 3-násobném molámím nadbytku vzhledem k VEGF165 ligandu. Na obr. 25C, kde jsou modifikované Fltl receptory v ó násobném molámím nadbytku vzhledem kVEGF165 ligandu, je uvedeno, že dočasný FltlD2VEGFR3D3.FcCl (a) částečně blokuje VEGF165 indukovanou stimulaci buněčných povrchových receptorů.

Obr. 26A-26B. Fosforylační test. Westernová hybridizace na tyrosinu fosfóry 1 ováných VEGFR2 (Fikl) VEGF165 ligandem ukazuje, že povrchové buněčné receptory nejsou fosforylované expozicí se vzorky, které obsahovaly VEGF165 preinkubovaný v 1 a 2-násobném molárním nadbytku (obr. 26A) nebo 3- nebo 4-násobném molárním nadbytku (obr. 26B) buď s dočasným FltlD2FlklD3.Fc Cl (a), nebo stabilním FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a), nebo s dočasným VEGFR1 R2-Fc Cl (a). Při všech testovaných koncentracích modifikovaného Fltl receptoru je patrná kompletní vazba VEGF165 ligandu během preinkubace, což vede k nedetekovatelné stimulaci povrchových buněčných receptorů nevázaným VEGF ve srovnání s kontrolním médiem.

Obr. 27. MG/R2 buněčný proliferační test. Následující modifikované Fit receptory Fit 1 (1 —3)—Fc, Fltl D2FlklD3.Fc Cl (a) a FltlD2VEGFR3D3.Fc Cl (a) a irelevantní receptor označený Tie2-Fc jako negativní kontrola, byly títrovány od 40 nM do 20 pM a byly inkubovány na buňkách po dobu 1 hodiny pri 37 °C. Lidský rekombinantní VEGF 165 v definovaném médiu se potom přidal do všech jamek v koncentraci 1,56 nM. Negativní kontrolní receptor Tie2-Fc neblokoval proliferaci buněk indukovanou VEGF165 v žádné koncentraci, zatímco FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) blokoval 1,56 nM VEGF165 při poloviční maximální dávce 0,8 nM. Fltl(l—3)—Fc aFltlD2VEGFR3D3.Fc Cl (a) byly méně účinné v blokování VEGF165 v tomto testu s poloviční maximální dávkou přibližně 2nM. VEGF165 v tomto testu s poloviční maximální dávkou přibližně 2 nM. VEGF 165 sám měl při odečtu absorbanci 1,2 jednotky a pozadí je 0,38 absorbačních jednotek.

Obr. 28. Biacore analýza vazebné stechiometrie. Vazebná stechiometrie byla vypočtena jako molámí poměr navázaného VEGF165 k zmobilizovanému FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFRlR2Fc Cl (a), za použití konverzního faktoru 1000RU ekvivalentních 1 ng/ml. Výsledky ukazují vazebnou stechiometrii jedné VEGF 165 dimemí molekuly na jednu molekulu FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGF165 dimemí molekuly na jednu molekulu FltlD2F1klD3.FcCl (a) nebo VEGFRlR2Fc Cl (a).

Obr. 29 a Obr. 30. Stechiometrie chromatografie s vylučováním podle velikosti. FltlD2FlklD3.FcCl (a) nebo VEGFR1R2FcCl (a) v koncentraci 1 nM (což by mělo být 1000-kral více než KD interakce FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2FC Cl (a)/VEGF165) sc smísily s různými koncentracemi VEGF165. Po inkubaci se měřily koncentrace volného FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) v roztoku. Data ukazují, že adice VEGF165 do roztoku FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) zcela blokuje vazbu FltlD2FlklD3.Fc Cl (a) na povrch VEGF 165. Tento výsledek ukazuje na stechiometrii jedné molekuly VEGF 165 na jednu molekulu FltlD2FlklD3.Fc Cl (a).

Obr. 31. Chromatografie s vylučováním podle velikosti (SEC) za nativních podmínek. Pík 1 představuje komplex Fit 1 D2Flk 1D3.Fc C1 (a)/VEGF165 a pík 2 představuje nenavázaný VEGF165. Frakce eluované mezi 1,1 a 1,2 ml se kombinovaly a přidal se guanidinium hydrochlorid (GuHCI) v konečné koncentraci 4,5 M pro disociaci komplexu.

Obr. 32. Chromatografie s vylučováním podle velikosti (SEC) za disociačních podmínek. Pro separování složek komplexu receptor-ligand a pro určení jejich molámího poměru se 50 μΙ

-9CZ 302689 B6 disociovaného komplexu vneslo do Superose 12 PC 3.2/30 uvedené do rovnováhy v 6M GuHCl a provedla se eluce. Pík 1 představuje Fltl D2Flk1 D3.Fc Cl (a) a pík 2 představuje VEGF 165.

Obr. 33, 34 a 35. Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) s detektorem ? rozptylu světla. Kolona pro chromatografii s vylučováním podle velikosti částic s MiniDawn on-line detektorem rozptylu světla (Wyatt Technology, Santa Barbara, California) a detektory' refrakterního indexu (Rl) (Sbimadzu, Kyoto, Japan) se použily pro určení molekulové hmotnosti (mol. hmot.) komplexu ligand-receptor. Jak je uvedeno na obr. 33, ukazuje eluční profil dva píky. Pík 1 představuje komplex ligand-receptor a pík 2 představuje nenavázaný VEGF 165. Mol. ío hmotnost byla vypočtena z LS a Rl signálů. Stejný postup byl použit pro určení molekulové hmotnosti jednotlivých složek komplexu ligand-receptor. Výsledky těchto pokusů jsou následující: molekulová hmotnost komplexu Fit!D2FlklD3.Fc Cl (a)/VEGFl65 v píkové pozici je 157 300 (obr. 33), molekulová hmotnost VEGF165 v píkové pozici je 44 390 (obr. 34) a molekulová hmotnost R1R2 v píku je 113 300 (obr. 35). i>

Obr. 36. Mapování peptidu a analýza glykosylace. Disulfidové struktury a glykosylační místa Flt1D2.FlklD3.FcCl (a) byly určeny metodou peptidového mapování. Ve FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) existuje celkem 10 cysteinů; šest žních náleží k Fc regionu. Cys27 je disulfidové vázán na Cys76. Cys 121 je disulfidové vázán na Cysl82. První dva cysteiny v Fc regionu (Cys211 aCys214) tvoří intermolekulovou disulfidovou vazbu se stejnými dvěma cysteiny v jiném Fc řetězci. Nicméně, nemůže být stanoveno, zda se disulfidová vazba vyskytuje mezi stejnými cysteiny (Cys211 a Cys211, například), nebo mezi Cys211 a Cys214. Cys2l6 je disulfidové vázán naCys306. Cys352 je disulfidové vázán na Cys410.

Ve FltlD2.FIR1 D3.Fc Cl (a) existuje 5 možných N-vázaných glykosylačních míst a tato místa jsou glykosy iována v různém stupni. Kompletní glykosylace je pozorována na Asn32, Asn 193 aAsn282. Částečná glykosylace je pozorována na Asn65 a Asn 120. Místa glykosylace na obr. podtržena.

Obr. 37. Farmakokinetiky Fltl(1-3)-Fc (A40), Fltl D2.Flkl D3.Fc Cl (a) a VEGFRIR2 Fc Cl (a). Balb/c myším byly injekčně podkožně podány 4 mg/kg Fit)(l-3)-Fc(A40), CHO dočasně exprimující FltlD2.Flk1 D3.Fc Cl (a), CHO stabilně exprimující Fltl D2.Flk1 D3.Fc CI (a) a CHO dočasně exprimující VEGFR1R2-Fc Cl (a). Myším byla z ocasu odebírána krev za 1,2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny, 3 dny a 6 dnů po injekci. Sérum se testovalo pomocí ELISA testu navrženého pro detekci FcCl (a) (A40), FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a). T_msis pro Fitϊ( 1—3)—Fc (140) byl 6 hodin, zatímco T_max pro přechodný a stabilní Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a přechodný VEGFR1 R2-Fc Cl (a) byl 24 hodin. C_max pro Fltl(l-3)-Fc (A40) byla 8 gg/ml, pro oba dočasné (FltlD2.F1klD3.Fc Cl (a) a VEGFR1 R2-Fc C1 (a)) byla 18 pg/ml a C_max pro stabilní VEGFR1R2-Fc Cl (a) byla 30 gg/ml.

Obr. 38. Farmakokinetiky Fltl(l-3)-Fc (A40), Fltl D2.Flkl D3.Fc Cl (a) a FltD2.VEGFR3R3FcCl (a). Balb/c myším byly injekčně podkožně podány 4 mg/kg Fltl(1-3)-Fc (A40), CHO dočasně exprimující FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a CHO dočasně exprimující FltlD2VEGFR3R3FcCl (a). Myším byla z ocasu odebírána krev za 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 a 20 dnů po injekci.

Sérum se testovalo pomocí ELISA testu navrženého pro detekcí Fltl( l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcCl (a) nebo FltlD2.VEGFR3R3-Fc C1 (a),Fltl(l-3)-Fc (A40) nebyl detekován v séru po 5 dnech, zatímco FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) a FltD2.VEGFR3R3-Fc CI (a) byly detekovatelné i po 15 dnech.

Obr. 39. Schopnost FitI D2.Flkl D3.Fc C1 (a) inhibovat růst fibrosarkomu HT-1080 in vivo. Léčba SOD myší každý druhý den nebo 2-krát týdně 25 mg/kg Fill D2.Fikl D3.Fc C1 (a) signifikantně snižuje růst podkožních fibrosarkomu HT-1080.

- 10 CZ 302689 B6

Obr. 40. Schopnost Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) inhibovat růst gliomu C6 in vivo. Léčba SCID myší každý druhý den nebo 2-krát týdně 2,5 mg/kg Fltl D2.FlklD3.Fc Cl (a) signifikantně snižuje růst podkožních gliomů C6.

Obr. 41. Děložní hypermeabilita indukovaná VEGF. PMSG injíkovaný podkožně (5 IL) pro indukci ovulace prepubertálním myším samicím způsobil surge of estradíolu po 2 dnech, což nakonec způsobilo indukcí VEGF v děloze. Tato indukce způsobila hypermeabilitu dělohy a zvýšila obsah kapaliny v děloze. Podkožní injekce Fltl(l—3)—Fc (A40), FltlD2.FlklD3.FcCl (a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) v dávkách 25 mg/kg 1 hodinu po injekci PMSG vedla k přibližně 50% inhibici zvýšení vlhké hmotnosti dělohy.

Obr. 42A-42B. Hodnocení angiogeneze v corpus luteum za použití progesteronu jako sledované hodnoty. PMSG byl injikován podkožně (5 IU) pro indukci ovulace u prepubertálních myších samic, což vedlo ke vzniku plně funkčního corpus luteum obsahujícího hustou síť krevních ccv, kde toto corpus luteum secemovalo do krve progesteron za účelem přípravy dělohy pro implantaci. Indukce angiogeneze v corpus luteum vyžaduje VEGF. Klidové koncentrace progesteronu jsou přibližně 5 ng/ml a PMGS může indukovat hodnoty až 25 až 40 ng/ml. Podkožní injekce Fltl(l— 3)-Fc (A40) nebo FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) v dávce 25 nebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekci PMSG vede ke kompletní inhibici indukce progesteronu v den 4.

Podrobný popis vynálezu

V oboru dlouho přetrvávaly problémy při produkci receptorového antagonisty VEGF s farmakokinetickým profilem, který by byl vhodný pro použití antagonisty jako možného terapeutika. Předkladatelé vynálezu zde poprvé popisují chimérický polypeptíd schopný antagonizování VEGF, který má lepší farmakokinetické vlastnosti ve srovnání sjinými antagonisty VEGF na bázi receptoru. Chimérické polypeptidy podle předkládaného vynálezu jsou tedy prvními molekulami vhodnými pro léčbu, při které je žádoucí dosažení antagonizování VEGF.

Předkládaný vynález poskytuje nové chimérické polypeptidy vytvořené fúzováním modifikované extracelulámí vazebné domény pro ligand Fltl receptoru a Fc regionu IgG.

Extracelulámí vazebná doména pro ligand je definována jako část receptoru, která-ve své přirozené konformaci v buněčné membráně - je orientovaná extracelulámě, takže může kontaktovat svůj ligand. Extracelulámí vazebná doména pro ligand neobsahuje hydrofobní aminokyseliny asociované s transmembránovou doménou receptoru ani žádné aminokyseliny asociované s intracelulámí doménou receptoru. Obecně je intracelulámí nebo cytoplasmatická doména receptoru složena obvykle z pozitivně nabitých nebo polárních aminokyselin (tj. lysinu, argininu, histidinu. kyseliny glutamové, kyseliny asparagové). Předchozích 15 až 30, především hydrofobních nebo apolárních aminokyselin (jako je leucin, valin, isoleucin a fenylalanin), tvoří transmembránovou doménu. Extracelulámí doména obsahuje aminokyseliny, které předcházejí hydrofobnímu transmembránovému řetězci aminokyselin. Obvykle je transmembránová doména obklopena pozitivně nabitými nebo polárními aminokyselinami, jako je lysin nebo arginin. Von Heijne publikoval podrobná pravidla, která jsou používána odborníky v oboru pro stanovování toho, zda daný receptor náleží k extracelulámí, transmembránové nebo intracelulámí doméně (viz von Heijne, 1995, BioEssays 17: 25 až 30). Alternativně, na internetu jsou dostupné stránky, jako například http://ulrec3.unil.ch/software/TMPRED_form.html, které umožní odborníkům v proteinové chemii predikci týkající se proteinových domén.

Předkládaný vynález umožňuje konstrukci molekul nukleové kyseliny kódující chimérické polypeptidy, které jsou vloženy do vektoru, který exprimuje molekuly chimérických polypeptidů po vložení do vhodné hostitelské buňky. Vhodnými hostitelskými buňkami jsou, například, bakteriální buňky, kvasinky, hmyzí buňky a savčí buňky. Jakákoliv metoda známá odborníkům v oboru pro inserci DNA fragmentů do vektoru může být použita pro konstrukci expresních vektoru

- 11 CZ 302689 Β6 kódujících chimérické poiypeptidové molekuly pod kontrolou transkripčních/translačních kontrolních signálů. Mezi tyto metody patří rekombinantní DNA a syntetické techniky in vitro, a in vivo rekombinace (genetické rekombinace) (viz Sambrook et al., Molecular Cloning. A Laboraotry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-lnterscience, NY).

Exprese molekul nukleové kyseliny kódující chimérické poiypeptidové molekuly může být regulována druhou sekvencí nukleové kyseliny tak, že chimérická poiypeptidové molekula je exprimována v hostiteli transformovaném rekombinantní DNA molekulou. Například, exprese chimérických polypeptidových molekul, jak je zde popsána, může být řízena jakýmkoliv promotorem/zesilovačem transkripce známým v oboru. Promotory, které mohou být použity pro řízení exprese chimérických polypeptidových molekul, jsou například: dlouhá koncová repetice, jak je popsáno v Squinto et al., (1991, Cell 65: 1 až 20); časný promotorový region SV40 (Bemoist and Chambon, 1981, Nátuře 290: 304 až 310), CMV promotor, M-MuLV 5’ koncový repetitívní promotor obsaženy v 3’ dlouhé koncové repetitivní sekvenci viru Rousova sarkomu (Yamamoto et al., 1980, Cell, 22: 787 až 797), promotor herpetické thymidin kinázy (Wagner et al., 1981, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78: 144 až 1445), regulační sekvence metallothioninového genu (Brinster et al., 1982, Nátuře 296: 39 až 42); prokaryotické expresní vektory, jako je beta-l akta masový promotor (Villa-Kamaroff et al., 1987, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 75: 3727 až 3731), nebo tac promotor (DeBoer et al·, 1983, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 80: 21 až 25, viz též „Useful proteins from recombinant bacteria“, v Scientific American, 1980, 242: 74 až 94); promotorové elementy z kvasinek nebo jiných hub, jako je Gal4 promotor, ADH (alkohol dehydrogenasový) promotor, PGK (fosfogiycerolkinázový) promotor, promotor alkalické fosfatázy a následující zvířecí transkripční kontrolní regiony, které vykazují tkáňovou specificitu a které byly použity u transgenních zvířat: kontrolní region genu pro elastasu I, který je aktivní v acinárních buňkách slinivky břišní (Swift et al., 1984, Cell, 38: 639 až 646; Ornitz et al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50: 399 až 409; MacDonald, 1987, Hepatology 7: 425 až 515); kontrolní region inzulínového genu, který je aktivní v beta-buňkách slinivky břišní (Hanahan, 1985, Nátuře 315: 1 15 až 122), kontrolní region imunoglobulinového genu, ktetý je aktivní v lymfoidních buňkách (Grosschedl ct 1., 1984, Cell 38: 647 až 658; Adames et al., 1985, Nátuře 318; 533 až 538; Alexander et al., 1987, Mol. Cell. Biol. 7: 1436 až 1444), kontrolní region viru myších nádorů mléčné žlázy, který je aktivní v testikulámích, prsních, lymfoidních ažírných buňkách (Lederet al., 1986, Cell 45: 485 až 495), kontrolní region albuminového genu, který je aktivní v játrech (Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1: 268 až 276), kontrolní region alfa-fetoproteinového genu, který je aktivní v játrech (Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5: 1639 až 1648; Hammer et al., 1987, Science 235: 53 až 58); kontrolní region genu pro alfa-l-antitrypsin, který je aktivní v játrech (Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. I: 161 až 171), kontrolní region genu pro bctaglobin, který je aktivní v myeloidních buňkách (Mogram et al., 1985, Nátuře 315: 338 až 340, Kollias el aL, 1986, Cell 46: 89 až 94); kontrolní region genu pro myelinový bazický protein, který je aktivní v oligodendrocytech v mozku (Readhead et al., 1987, Cell 48: 703 až 712); kontrolní region genu pro lehký řetězec 2 myosinu, který je aktivní v kosterním svalu (Shani, 1985, Nátuře 314: 283 až 286), a kontrolní region genu pro hormon uvolňující gonadotropín, který je aktivní v hypothalamu (Mason etal., 1986, Science 234: 1372 až 1378).

Podle předkládaného vynálezu jsou tedy expresní vektory repl i kováte lné v bakteriálních nebo eukaryotických hostitelích obsahující nukleové kyseliny kódující chimérické polypeptidy podle předkládaného vynálezu použity pro transfekci hostitele a tak pro řízení exprese takových nukleových kyselin lak, že produkují chimérické polypeptidy, které mohou být potom získány v biologicky aktivní formě. Termín biologicky aktivní formy označuje schopné vazby na VEGF.

Expresní vektory obsahující chimérické molekuly nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu mohou být identifikovány třemi obecnými postupy: (a) DNA-DNA hybridizaci; (b) podle přítomnosti nebo nepřítomnosti funkce „markerového“ genu; a (c) podle exprese insertovaných sekvencí. V prvním způsobu může být přítomnost cizorodého genu insertovaného v expresním vektoru detekována DNA-DNA hybridizaci za použití sond obsahujících sekvence, které jsou

- 12CZ 302689 B6 homologní se sekvencemi insertované chimérické polypeptidové molekuly. Ve druhém způsobu může být systém rekombinantní vektor/h osti tel identifikován a selektován podle přítomnosti nebo nepřítomnosti některých funkcí „markerového“ genu (například podle aktivity thymidin-kinázy, podle resistence na antibiotika, podle transformačního fenotypu, podle tvorby oklusních tělísek v bakuloviru atd.), kteréjsou způsobeny insercí cizorodých genů do vektoru. Například, když je DNA sekvence pro chimérický polypeptid vložena do vektoru do sekvence markerového genu, tak mohou být rekombinanty obsahující insert identifikovány podle absence funkce markerového genu. Ve třetím způsobu mohou být rekombinantní expresní vektory identifikovány testováním produktu cizorodého genu exprimovaného rekombinantem. Takové testy mohou být založeny, například na fyzikálních nebo funkčních vlastnostech chimérických polypeptidů.

Buňky podle předkládaného vynálezu mohou dočasně, nebo lépe konstitutivně a permanentně, exprimovat chimérické polypeptidy.

Chimérické polypeptidy mohou být přečištěny jakoukoliv technikou, která umožňuje následnou tvorbu stabilních, biologicky aktivních chimérických polypeptidů. Například mohou být faktory získány z buněk ve formě solubilních proteinů nebo ve formě inklusních tělísek, ze kterých mohou být extrahovány kvantitativně 8M guanidinium hydrochloridem a dialýzou (viz například Builder et al., patent US 5 663 304). Pro další přečištění faktorů může být použito běžné ionto20 měničové chromatografie, p.hrnmfltngrafie s reverzní fází nebo gelové filtrace.

V jednom provedení vynálezu je nukleotidová sekvence kódující první složku před nukleotidovou sekvencí kódující druhou složku. V jiném provedení vynálezu je nukleotidová sekvence kódující první složku za nukleotidovou sekvencí kódující druhou složku. Mohou být připravena další provedení vynálezu, ve kterých je pořadí první, druhé a třetí složky jiné. Například, pokud je nukleotidová sekvence kódující první složku označena č. 1, nukleotidová sekvence kódující druhou složku označena č. 2 a nukleotidová sekvence kódující třetí složku označena č. 3, tak může být pořadí složek izolované nukleové kyseliny podle předkládaného vynálezu ve směru 5’ -3’jedno z následujících poradí: 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; nebo 3,2,1.

Předkládaný vynález má také diagnostické a terapeutické použití. Způsoby pro detekci aberací ve funkci nebo expresi molekul chimérických polypeptidů zde popsané mohou být použity pro diagnostiku onemocnění. Úprava molekul chimérických polypeptidů nebo agonisté nebo antagonisté, kteří se váží na molekuly chimérických polypeptidů, mohou být použity pro léčbu onemocnění.

V dalších ztělesněních jsou molekuly chimérických polypeptidů použity jako činidla pro blokování vazby vazebného činidla na cíl.

Jako neomezující příklad se uvádí že tento vynález může být vhodný pro klinickou léčbu onemocnění, kteréjsou charakterizována cévní permeabilitou, edémem nebo zánětem, jako je edém mozku asociovaný s poraněním, mrtvicí nebo nádorem; edémem asociovaným se záněty jako je psoriasa nebo artritida, včetně revmatoidní artritidy; astma; generál izo váný edém spojený s popáleninami; ascites a pleurální výpotky asociované s nádory, záněty nebo úrazy; chronické záněty dýchacích cest, syndrom zvýšené propustnosti kapilár; sepse; onemocnění ledvin asociované s vyššími ztrátami proteinů; a oční onemocnění, jako je makulámí degenerace asociovaná s věkem a diabetická retinopatie.

Analýza aminokyselinové sekvence Fit 1(1 —3)—Fc ukázala přítomnost neobvykle vysokého počtu (46) bazické aminokyseliny lysinu. IEF analýza Fltl(l—3)—Fc ukázala, že tento protein má pl vyšší než 9,3, což potvrzuje předpoklad, že tento protein je velmi bazický. Předpokládá se, že bazický charakter Fltl(l—3)—Fc způsobuje jeho vazbu na složky mezibuněČné hmoty a tato interakce může způsobit extrémně krátký cirkulační sérový poločas Fit 1( 1—3)—Fc, když jc injekčně podán myším. Pro testování této hypotézy byl Fit 1 (1-3)-Fc protein acetylován na lysinu za účelem redukce této bazicity. Acetylovaný Fit 1( 1—3)—Fc byl potom testován v testu popsaném dále.

- 13CZ 302689 B6

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález a nijak jej neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Exprese Fit 1 (1—3>—Fc proteinu v CHO K1

Za použití standardních technik molekulární biologie (víz např. Molecular Cloning, A Laboratory io Manual (Sambrook et al.. Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular

Biology (ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY), se gen kódující Fltl( 1-3)lc insertoval do expresního vektoru pEEH.l (Lonza Biologics, plc) v mnohotném klonovacím místě za CMV promotorem. CHO K1 buňky se transfektovaly pEE 14.1 /Fitl(1-3)-Fc DNA konstruktem za použití lipofektaminu (Gaithersburg, MD). Transfektované CHO K1 buňky se kultivovaly v bezglutaminovém DMEM (JRH, Kansas City, MO) obsahujícím 25 μΜ methionin sulfoximu (msx) od Sigma lne., Sl. Louis, MO, a buňky exprimující vysoké kvantity rekombinantního proteinu se získaly testováním supernatantů CHOK1 buněk zvíce než 100 ručně odebraných kolonií izolátů za použití standardního ímunotestu, který zachycuje a detekuje lidský Fc. Selektované ručně odebrané kolonie se amplifikovaly za přítomnosti 100 μΜ MSX a potom se provedlo druhé kolo skríningu amplifikovaných kolonií. Klon s nejvyšší produkcí měl specifickou produktivitu rekombinantního Fit 1 (1-3)-Fc proteinu 55 pg/bunku/den.

Selektovaný klon byl expandován v T-baňce o objemu 225 cm² (Corning, Acton, MA) a potom sc přenesl do 8,51 válcových zkumavek (Corning. Acton, MA) za použití buněčného kultivačního média popsaného výše. Buňky se odstranily z válcových zkumavek pomocí standardní trypsinizace a vnesly se do 3,5 Utru suspenzního média. Suspenzní médium se skládalo z bezglulamlnového 1SCHO média (I rvi ne Scientific, Santa Anna, CA) obsahujícího 5% fetáiní hovězí sérum (FBS od Hyclone Labs, Logan, UT), 100 μΜ MSX a GS doplněk (JRH Scientific, Kansas City, MO) v 51 Cellingen bioreaktoru (New Brunswick Scientific, New Brunswick, NJ) v hustotě

3o 0,3 x IO⁶ buněk/ml. Poté, co buňky dosáhly densily 3,6 x IO⁶/ml a adaptovaly se na suspenzi, byly přeneseny do 601 bioreaktoru (ABEC, Allentown, PA) v hustotě 0,5 x 10⁶ buněk/ml ve 20 I ISCHO média s 5% fetálním hovězím sérem. Po 2 dnech se do bioreaktoru přidalo dalších 20 1 ISCHO + 5% fetáiní hovězí sérum. Buňky se nechaly růst po dobu dalších dvou dnů do dosažení konečné hustoty 3,1 x 10^fl buněk/ml a konečná koncentrace Fit 1(1-3)-Fc při sběru byla

95 mg/ml. Při odběru byly buňky odstraněny filtrací s tangenciálním tokem za použití 0,45μιη

Prostak filtrů (Millipore, lne., Bedford, MA).

Příklad 2: Přečištění Fit 1 (1—3>—Fc proteinu získaného z CHO K1 buněk 4(1

Flll(l-3)-Fc protein byl nejprve přečištěn afinitní chromatografií. Kolona s proteinem A byla použita pro navázání, s vysokou specificitou, Fe části molekuly. Tento aílnitně přečištěný protein byl potom zahuštěn a nechal sc projít SEC-kolonou. Protein byl potom eluován do formulačního pufru. Dáte je tento postup popsán podrobně.

Materiály a metody

Všechny chemikálie byly získány od J.T. Baker, Phillipsburg, NJ, s výjimkou PBS, který byl získán jako lOx koncentrát od Life Technologies, Gaithersburg, MD. Protein Λ Fast Flow a Supcr5(i dex 200 přípravky pryskyřic byly získány od Pharmacia. Piscataway, NJ. Vybavení a membrány pro zahuštění proteinu byly získány od Millipore, Bedford. MA.

Přibližně 40 1 0.45gm-filtrovaného CHO kondiciovaného média obsahujícího Flll(l-3)-Fc protein se aplikovalo do 290 ml Protein Λ Fast Flow kolony (průměr 10 cm), která se uvedla do rovnováhy v PBS. Kolona se promyla PBS obsahujícím 350 mM Nad a 0,02% CHAPS

- 14 CZ 302689 B6 a navázaný protein se eluoval 20 mM kyseliny citrónové obsahujícími 10 mM Na^HPO^ Jediný pík v eluátu se odebral ajeho pH se zvýšilo na neutrální hodnotu pomocí 1M NaOH. Frakce eíuátu se zahustily na přibližně 9 mg/ml za použití 10K regenerovaných celulosových membrán za použití jak filtrace s tangenciálním tokem, tak zahuštění buněk míšením. Pro odstranění agregátů a jiných kontaminujících složek se zahuštěný protein aplikoval do kolony naplněné Superdex 200 pryskyřicí (10 cm x 55 cm) a provedla se eluce PBS obsahujícím 5% glycerol. Hlavní píky se odebraly, sterilně se přefiltrovaly, rozdělily se do podílů a uskladnily se při teplotě -80 °C.

io

Příklad 3: Acetylace Fltl(1-3)-Fc proteinu mg Fit 1 (1—3>—Fc proteinu se acetylovaly způsobem popsaným v návodu k použití sulfo-NHSacetátového modifikačního kitu (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, kat. č. 26777).

Příklad 4: Charakterizace acetylovaného Fltl (1--3)-Fc proteinu (a) ÍEF analýza: Fltl(l—3)—Fc a acetylovaný Fltl(l-3)-Fc se analyzovaly standardní IEF analýz™’ LA i* uvedeno na obr. 1. Fit 1 (1 -3Ί-Fc nrotein není schoDen migrovat do gelu a proto musí mít pí vyšší než 9,3, což je nejvyšší pí ve standardu. Nicméně, acetylovaný Fit 1 (1—3)—Fc je schopen migrovat do gelu a dosahuje rovnováhy pri pí přibližně 5,2. Tento výsledek demonstruje, že acetylace významně redukuje pozitivní náboj proteinu atak jeho pí.

(b) Vazba na složky mezibuněčné hmoty

Pro testování vazby na složky mezibuněčné hmoty se F1tl(1—3)—Fc a acetylovaný Fit 1 (1—3)—Fc testovaly v testu napodobujícím interakce se složkami mezibuněčné hmoty. V tomto testu jsou 96-jamkové tkáňové kultivační plotny potažené Matrigelem (Biocoat MATRIGEL®

96-jamková plotna s tenkou vrstvou matrice, katalog, č. 40607. Becton Dickinson Labware. Bedford, MA). Plotny se ínkubovaly s různými koncentracemi Fltl (1 -3)-Fc, acetylovaného Fltl(l— 3)-Fc nebo rTie2-Fc (irelevantní kontrola) proteinu, které se přidaly do jamek. Plotny se Ínkubovaly po dobu 1 až 2 hodin buď pri teplotě místnosti, nebo pri 37 °C, a potom se detekce navázaných proteinů provedla pomocí přidání druhé protilátky proti lidskému Fc konjugované s alkalickou fosfatázou do jamek. Nakonec se do jamek přidal substrát pro alkalickou fosfatázu a měřila se optická den šita. Obr. 2 ukazuje výsledky tohoto testu. Podobně jako irelevantní kontrolní protein rTie2-Fc, nevykazoval acetylovaný Fltl (1-3)-Fc jakoukoliv vazbu na plotnu potaženou Matrigelem, zatímco neacetylovaný Fltl (1-3)-Fc protein vykazoval významnou vazbu. Tento výsledek naznačuje, že acetylace bazických aminokyselinových zbytků je účinnou cestou pro interferenci s elektrickými interakcemi, které existují mezi proteiny s pozitivním nábojem a negativně nabitými složkami extracelulámí hmoty, které se odehrávají in vivo.

Příklad 5: Pegylace Fit 1(1-3)-Fc proteinu

Ačkoliv bylo prokázáno, že pegylace (polyethylenglykol = PEG) proteinu zvyšuje jeho účinnost invivo tím, že zvyšuje jeho stabilitu a biologickou dostupnost za minimalizace imunogenicity (viz odkazy citované výše), je intuitivně nevhodné pegylovat molekuly, které jsou příliš velké pro glomerulámí filtraci s cílem zlepšení jejich farmakokinetických vlastností. Bez vazby na konkrét50 ní teorii předkladatelé vynálezu postulovaly teorii, že pegylace Fltl(l-3)-Fc molekul může zlepšit jejich farmakokinetické vlastnosti, pravděpodobně ne změnou pozitivního náboje nebo snížením pí Fit 1 (1 -3)-Fc, ale spíše fyzikálním odstraněním pozitivního náboje z interakce s extracelulámí hmotou. Předkladatelé vynálezu se rozhodli o pokus o zlepšení farmakokinetických vlastností Fit 1 (1 —3)—Fc molekul tak, že naváží řetězec 20K PEG, jak je popsáno dále.

- 15CZ 302689 B6

Materiály a metody

Přečištěný Fit 1 (1-3)-Fc získaný z CHO buněk (viz výše) byl použit v následujících pegylačních pokusech. Funkcionalizované PEG byly získány od Shearwater Polymers, Huntsville, AL; Bicin od Sigma, St. Louis, MO; Superose 6 kolona od Pharmacia, Piscataway, NJ; PBS jako IOx koncentrát od Life Technologies. Gaithersburg, MD; Glycerol od J.T. Baker. Phillipsburg, NJ; a Bis-tris předem odlité gely od Novex, CA.

20K PEG řetězce funkcionalizované amin-specifickými koncovými skupinami byly použity v reakčních pokusech v malém rozsahu, které byty provedeny pro hodnocení různých reakčních podmínek, ve kterých se lišila stechiometrie PEG;protein. Na základě těchto reakcí a analýzy vzorků na standardní SDS-PAGE reagoval Fltl(l— 3)-Fc v koncentraci 1,5 ng/ml při pH 8,1 s 20K SPA-PEG (PEG-sukcinimidylpropionát) molekulami při molámím poměru PEG:Fltl(l3)-Fc monomer 1:6. Reakce se nechala probíhat při 8 °C pres noc. Pro počáteční přečištění se reakční produkty aplikovaly do 10 mm x 30 cm Superose 6 kolony uvedené do rovnováhy PBS obsahujícím 5% glycerol. Zdá se, že kolona separovala pegylované Fit 1 (1-3> Fc molekuly podle rozsahu pegylace. Byly odebírány frakce odpovídající primárně monopegylovaným a dipegylováným dimerickým Fit 1 (1-3)-Fc, jak byly potvrzeny charakterem proužků na redukujících a neredukujících SDS-PAGE gelech. Koncentrace proteinu byla určena měřením absorbance při 280 nm. Pegylovaný Fltl(1-3)-Fc protein byl sterilně přefiltrován, rozdělen do podílů a uskladněn při -40 °C.

Příklad 6: Vazba nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fit 1 (1-3)-Fc v testu na bázi Biacore

Nemodifikovaný, acetylovaný a pegylovaný Fit 1 (1—3)—Fc proteiny byly testovány na Fltl ligand, VEGF. V tomto testu se nemodifikovaný Fltl( 1-3)-Fc protein imobilízuje na povrchu Biacore čipu (viz Biacore lnstruction Manual, Pharmacia, lne., Piscataway, NJ, kde je uveden standardní postup) a vzorek obsahující 0,2 pg/ml VEGF a bud nemodifikovaný Fit 1 (1 -3)-Fc, acetylovaný Fit 1 (1 —3)—Fc, nebo pegylovaný Fit 1(1-3)-Fc (vždy při 25 pg/ml) se přelil přes čip potažený Fltl(1 -3)-Fc. Pro minimalizaci vlivu nespecifické vazby se navázané vzorky promyly 0,5 M NaCl. V jednom vzorku se nemodifikovaný Fltl(l-3)-Fc smísil s heparinem. Heparin je molekula s pozitivním nábojem a Fltl (1 -3)-Fc protein je molekula s negativním nábojem, takže když jsou tyto dvě molekuly smíseny dohromady, měly by interagovat v důsledku svých příslušných nábojů. Toto v podstatě neutralizuje vlastní pozitivní náboj Fit 1 (1 -3)-Fc, což způsobí, že se molekula chová jako chemicky či geneticky modifikovaná tak, že je redukován její náboj a její tendence k vazbě prostřednictvím elektrických interakcí. Jak je uvedeno na obr.3, acetylovanc (sloupce 13 až 16), pegylované sloupce 17 až 20) a heparinem zpracované Fltl(1 -3)-Fc (sloupce 21 až 24) jsou každý schopen zcela inhibovat s Fltl(1-3)-Fc navázaným na Biacore čip o vazbu VEGF ve srovnání s kontrolním (sloupce 1 až 4) a irelevantním (sloupce 5 až 8) proteinem. Nemodifikovaný Fit 1 (1-3)-Fc (sloupce 5 až 6) pouze částečně soutěžil s Fit 1(1-3)-Fe navázaným na Biacore čip o vazbu VEGF. Nicméně, promytí navázaných vzorků 0,5 M NaCl (sloupce 7 až 8) vedlo k dosažení vazebného profilu podobného profilu modifikovaných forem Fltl(1-3fFc, což naznačuje, že modifikovaný protein vykazuje nespecifickou vazbu na Čip, která může býl eliminována promytím solným roztokem.

Příklad 7: Vazba nemodifikovaného, acetylovaného a pegylovaného Fit 1 (1-3)-Fc v testu na bázi ELISA

Nemodifikovaný, acetylovaný a pegylovaný Fit 1 (1-3)-Fc proteiny byly testovány v testu na bá/i ELISA pro hodnoceni jejich schopnosti vazby na ligand Fltl receptoru VEGF, což dokazuje, že modifikace proteinu buď pegylací, nebo acety lácí, neničí jejich schopnost vázat se na ligand.

- 16CZ 302689 B6

Příklad 8: Farmakokinetické analýzy nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc, acetylovaného Fltl(1-3)Fc a pegylovaného Fit 1 (1 -3)-Fc

Pokusy in vivo byly navrženy pro hodnocení farmakokinetíckých profilů nemodifikovaného Fit 1 (1—3)—Fc, acetylovaného Fltl (1 -3)-Fc a pegylovaného Fit 1( 1-3)-Fc proteinu. Balb/c myším (23 až 28 g; 3 myši na skupinu) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného, acetylovaného nebo pegylovaného Fit 1 (1 -3)-Fc. Myším se odebírala krev zocasu 1, 3, 4, 6, 24 hodin, 2 dny a 3 dny po injekci proteinu. Sérum se testovalo standardním ELISA testem navrženým pro io detekci Fltl(1—3)—Fc proteinu. Stručně, test zahrnoval potažení ELISA plotny VEGF, vazbu séra obsahujícího nemodifikovaný, acetylovaný nebo pegylovaný Fltl (1—3>—Fc, a detekci anti-Fc protilátkou navázanou na alkalickou fosfatázu. Jak je uvedeno na obr. 5, T_max pro všechny Fit 1(1-3)-Fc proteiny bylo mezi 6 a 24 hodinami. C_max pro různé proteiny byly následující: nemodifikovaný: 0,06 pg/ml až 0,15 pg/ml; acetylovaný: 1,5 pg/ml až 4,0 pg/ml; a pegylovaný:

i? přibližně 5 pg/ml.

Příklad 9: Postupná acetylace Fit 1 (1—3>—Fc

Pře stanovení toho, jaká minimální množství acetylace je nutné p^rn eliminaci vazhv na složkv extracelulámí matrice, byl navržen pokus, ve kterém byla provedena postupná acetylace Fit 1(1-3)-Fc proteinu za použití postupně se zvyšujících molámích nadbytků acetylačního činidla v acetylační reakční směsi. Rozmezí molámích nadbytků bylo následující: 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 a 100 ml acetylačního činidla na 1 mol Fit 1 (1—3)—Fc monomeru. Reakce se provedly podle návodu dodaného k sulfo-NHS acetát modifikačnímu kitu (Pierce Chemical Co., Rocford, IL, kat. č. 26777).

Příklad 10: Charakterizace postupně acetylovaného Fltl(l~3)_Fc (a) IEF analýza: nemodifikovaný a postupně acetylovaný Fltl( 1 -3)-Fc proteiny se analyzovaly standardní IEF analýzou. Jak je uvedeno na obr. 6A-6B, nemodifikovaný Fit 1 (I-3)-Fc protein není schopen migrovat do gelu v důsledku extrémně vysokého pl (vyššího než 9,3). Nicméně, většina z postupně acetylovaných Fltl(1 —3)—Fc vzorků bylo schopno migrovat do gelu a dosaho35 vály rovnováhy při pl přibližně 4,55 až 8,43, podle stupně acetylace proteinu. Tento výsledek demonstruje, že acetylace může měnit pozitivní náboj proteinu v závislosti na velikosti acetylace a že redukce pl může být řízena ovlivněním stupně acetylace.

(b) Vazba postupně acetylovaného Fltl (1—3)—Fc na složky mezibuněčné hmoty

Pro testování vazby na složky mezibuněčné hmoty se Fltl(l-3)-Fc a postupně acetylovaný Fit 1( 1-3ý-Fc testovaly v testu popsaném výše napodobujícím interakce se složkami mezibuněčné hmoty. Různé koncentrace nemodifikovaného Fit 1 (l —3)—Fc, postupně acetylovaného Fltl( 1—3)—Fc (vzorky s molámím nadbytkem 10, 20 a 30-násobným) nebo rTie2-Fc (irelevantní kontrola) proteinu se přidaly od jamek. Plotny se inkubovaly po dobu 1 až 2 hodin buď při teplotě místnosti, nebo při 37 °C, a potom se detekce navázaných proteinů provedla pomocí přidání druhé protilátky proti lidskému Fc konjugované s alkalickou fosfatázou do jamek. Nakonec se do jamek přidal substrát pro alkalickou fosfatázu a měřila se optická densita. Obr. 7 ukazuje výsledky tohoto testu. Podobně jako irelevantní kontrolní protein rTie2-Fc, nevykazoval postup50 ně acetylovaný Fit 1 (1 -3)-Fc (20- a 30-násobný molární nadbytek) jakoukoliv významnou vazbu na plotnu potaženou Matrigelem, zatímco neacetylovaný Fltl(1-3)-Fc protein vykazoval významnou vazbu. Tato vazba je saturovatelná, což naznačuje, že Flt1(1—3)—Fc protein se může vázat na specifická místa a ne prostřednictvím obecnějších interakcí zprostředkovaných nábojem, které by nebyly saturovatelné. Vzorek s 10-násobným molárním nadbytkem vykazoval reduko55 vanou vazbu, ale stupeň acetylace nebyl dostatečný pro úplný blok vazby na složky mezibuněčné

- 17CZ 302689 B6 hmoty. Vzorky s 20-násobným a vyšším molárním nadbytkem nevykazovaly žádnou detekovatelnou vazbu, i před skutečnost, že IEF analýza (obr. 6A a 6B) vzorků s nižším molárním nadbytkem stále měla velký pozitivní náboj. Tento výsledek demonstruje, že není nutné kompletně acetylovat všechny dostupné bazické aminokyseliny pro eliminaci vazby na složky extracelulámí matrice.

(c) Vazba postupně acetylovaného Fltl (l-3)-Fc v testu na bázi Biacore

Nemodifikovaný a postupně acetylovaný Fltl(l-3)-Fc proteiny byly testovány v testu na bázi Biacore pro hodnocení jejich schopnosti vazby na Fltl ligand, VEGF. V tomto testu se nemodifikovaný Fltl(1-3T-Fc protein (0,5, 1,0 nebo 5,0 pg/ml) imobilizuje na povrchu Biacore čipu (viz Biacore Instruction Manual, Pharmacia, lne., Piscataway, NJ, kde je uveden standardní postup) a roztok obsahující 0,2 pg/ml VEGF a bud¹ nemodifikovaný Fitl( 1—3)—Fc (v koncentraci 0,5, 1,0 nebo 5.0 pg/ml), nebo 10 různě acetylovaných Flt1(1—3)-Fc (v koncentraci 0,5, 1,0 nebo 5,0 pg/ml) se přelil přes čip potažený Fltl(1-3)-Fc, Jak je uvedeno na obr. 8, v sub-stechiometrickém poměru (0,5 pg/ml nemodifikovaného Flt(l-3)-Fc nebo postupně acetylovaného Fltl (1-3 )-Fc vs. 0,2 pg/ml VEGF) není přítomno dostatečné množství Fit 1 (1-3)-Fc (nemodifikovaného nebo postupně acetylovaného) v roztoku pro úplnou inhibici vazby VEGF. Při 1,0 pg/ml, cožje přibližně stech iometrický poměr 1:1, jsou jak nemodifikovaný, tak postupně acetylovaný Fit 1( 1-3)-Fc lépe schopni soutěžit o vazbu VEGF. ale není stále ještě přítomen dostatek proteinu (nemodifikovaného nebo postupně acetylovaného) v roztoku pro úplnou inhibici vazby VEGF. při 1,0 pg/ml, což je přibližně stechiometrický poměr 1:1, jsou jak nemodifikovaný, tak postupně acetylovaný Fit 1 (1 -3)-Fc lépe schopni soutěžit o vazbu VEGF, ale není stále ještě přítomen dostatek Fltl (1-3 )-Fc proteinu (nemodifikovaného nebo postupně acetylovaného) pro úplnou vazbu dostupného VEGF. Nicméně, při 5,0 pg/ml, cožje několikrát více než je stechiometrický poměr 1:1, jsou jak Fit 1 (1 -3)-Fc, tak postupně acetylovaný Fltl(l-3)-Fc proteiny schopny vázat VEGF, bez ohledu na stupeň acetylace. Toto jasně demonstruje, že acetylace neovlivňuje schopnost Fltl(1 —3>—Fc vázat VEGF.

(d) Farmakokinetické analýzy postupně acetylovaného Fit 1 (1 -3)-Fc

Pokusy Ín vivo byly navrženy pro hodnocení farmakokinetických profilů nemodifikovaného Fltl(l-3)-Fc a postupně acetylovaného Fltl(l-3)-Fe proteinu. Balb/c myším (23 až 28 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného nebo vzorků s 10. 20. 40, 60 a 100 násobným molárním nadbytkem postupně acetylovaného Fltl( 1-3)-Fc (3 myši pro nemodifikovaný, 10, 20 a 40 násobný molární nadbytek a 2 myši pro 60 a 100-násobný molární nadbytek). Myším se odebírala krev z ocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin. 2 dny a 3 dny po injekci proteinu. Sérum se testovalo standardním ELISA testem navrženým pro detekci Fit 1 (1 -3)-Lc proteinu, jak byl popsán výše. Obr. 9 shrnuje výsledky tohoto pokusu. T_max pro všechny Flll(l-3)-Fc proteiny byl 6 hodin, ale C_max pro různé proteiny byly následující: nemodifikovaný: 0,6 pg/ml; 10-násobný molární nadbytek - 0,7 pg/ml, 20-násobný molární nadbytek - 2 pg/ml, 40-násobný molární nadbytek-4 pg/ml, 60-násobný molární nadbytek - 2 pg/ml, 100-násobný molární nadbytek1 pg/ml. Tyto výsledky ukazují, že acetylace nebo pegylace FitI(1-3)-Fc významně zlepšuje jeho farmakokinetický profil.

Příklad II: Konstrukce mutantního Flt1(l—3>—Fc s deleci bazického regionu označeného jako Mutl: Fit 1( I-3_b)-Lc

Na základě zjištění, že acetylovaný Fltl( I—3)—Fc, který má pl nižší než 6, má mnohem lepší farmakokineliku než vysoce pozitivní nemodifikovaný Fll 1 (l-3)-Fc (pl > 9.3), se zjišťovalo, zda rozdíly ve farmakokinetice mohou být přisouzeny náboji proteinu, který se váže na negativně nabité složky extracelulámí matrice, nebo zda existují specifické regiony na povrchu Fltl( I—3)—Fe proteinu, které tvoří specifická vazebná místa pro složky extracelulámí matrice.

- IS CZ 302689 B6

Například, o mnoha proteinech je známo, že mají vazebná místa pro heparin, která se často skládají ze seskupení bazických zbytků. Někdy se tyto zbytky vyskytují v seskupení na primární sekvenci proteinu; v literatuře byly identifikovány „konsensuální sekvence“ pro taková vazebná místa pro heparin (viz např. Hileman et al, 1998, Bioessays 20(2): 156 až 67). V jiných přípa5 dech ukazuje známá krystalická struktura proteinu seskupení pozitivně nabitých zbytků na povrchu proteinu, ale zbytky pocházejí z různých regionů primární sekvence a dostávají se do kontaktu pouze po složení proteinu do terciární struktury. Tak je obtížné zjistit, zda je izolovaný aminokyselinový zbytek součástí seskupení bazických zbytků na povrchu proteinu. Nicméně, pokud existuje seskupení pozitivně nabitých aminokyselinových zbytků v primární sekvenci, io není neopodstatněné předpokládat, že tyto zbytky jsou si prostorově blízké a mohou být proto součástí vazebného místa pro mezibuněčnou hmotu. Fltl receptor byl důkladně zkoumán a byly popsány různé jeho domény (viz například Tanaka et al., 1997, Jpn. J. Cancer Res. 88: 867 až 876). Podle sekvencí nukleových kyselin a aminokyselinových sekvencí uvedených na obr. 10A až 10D tohoto vynálezu lze identifikovat signální sekvence pro sekreci, které jsou lokalizované na začátku sekvence a končí glycinem kódovaným nukleotidy 76 až 78. Zralý protein začíná sekvencí Ser-Lys-Leu-Lys, začínající nukleotidem 79 sekvence nukleové kyseliny. Fltl lg doména 1 je kódovaná nukleotidy 79 až 393 a končí aminokyselinami Ser~Asp-Thr. Fltl Ig doména 2 je kódovaná nukleotidy 394 až 687 (kódujícími Gly-Arg-Pro až Asn-Thr-Ile) a Fltl Ig doména 3 je kódovaná nukleotidy 688 až 996 (kódujícími Ile-Asp-Val až Asp-Lys-Ala). Je zde přítomna přemosťující aminokyselinová sekvence Gly-Pro-Glv. kódovaná nukleotidy 997 až 1005, po které následuje nukleotidová sekvence kódující lidský Fc (nukleotidy 1006 až 1701 nebo aminokyseliny Glu-Pro-Lys až Pro-Gly-Lys-stop).

Podrobnější analýza Fltl aminokyselinové sekvence ukázala, že zde existuje seskupení, konkrét25 ně aminokyselinové zbytky 272 až 281 (KNKRASVRR) obr. 10A až 10D, ve kterém je 6 z 10 aminokyselin bazických. Tato sekvence je lokalizována ve Fltl Ig doméně 3 receptoru (viz obr. 11), ale není sama o sobě esenciální pro vazbu VEGF Iigandu, ale způsobuje vysokou afinitu vazby pro ligand. Srovnání sekvence Ig domény 3 se sekvencí Ig domény 2 ukazuje, že v tomto regionu je velmi slabá shoda mezi dvěma Ig doménami, a že v doméně 3 existuje přibližně 10 dalších aminokyselin. Analýza profilů hydrofílnosti (MacVector počítačový software) těchto dvou domén jasně ukazuje přítomnost hydrofilního regionu v proteinu (obr. 12A až 12B). Tato zjištění ukazují na možnost, že skutečná trojrozměrná konformace Fltl Ig domény 3 umožňuje určitou protrusi, která není přítomná ve Fltl lg doméně 2. Pro testování této hypotézy sc deletovalo 10 dalších aminokyselin a vzniklý protein se testoval za účelem zjištění toho, zda delece bude příznivě ovlivňovat farmakokinetiku bez narušení afinity receptoru pro VEGF. Tento DNA konstrukt, který byl připraven za použití standardních technik molekulární biologie (viz například Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et al., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols in Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) v savčím expresním vektoru pMT21 (Genetics Institute, lne.

Cambridge, MA), je označován jako Mutl:Fltl(1-3_B}-Fc. Mutl :Fltl(l-3_B)-Fc konstrukt byl získán z Fltl(1-3)-Fc deleci nukleotidů 814 až 843 (podle obr. 10A až 10D), což znamená deleci vysoce bazických 10 aminokyselinových zbytků sekvence Lys-Asn-Lys-Arg-Ala-Ser-ValArg-Arg-Arg z Fltl Ig domény 3.

Sekvence konečného DNA konstruktu byla verifikována za použití ABI 373 A DNA sekvenátoru a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Ritu (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA). Sekvence Mutl :Fítl (1 —3_B)—Fc je uvedena na obr. 13A až 13D.

Příklad 12: Konstrukce mutantního Fltl(l—3>—Fc s deleci bazického regionu označeného jako Mut2:Fltl(l—3₀)-Fc

Druhý deleční mutantní konstrukt, označený Mut2:Fltl(2-3_B)-Fc, byl získán z Mutl: Fltl(1 -3_b>-Fc konstruktu deleci Fltl Ig domény 1 kódované nukleotidy 79 až 393 (víz obr. 1 0A až 10D); přesněji, nukleotidy 73 až 78 (TCA GGT) byly změněny na TCC GGA. Tímto sc

-19CZ 302689 B6 vložilo restrikční místo (BspEl) bez alterace asociované aminokyselinové sekvence, Ser-Gly. Tento DNA konstrukt, který byl připraven za použití standardních technik molekulární biologie (viz například Molecular Cloning, A Laboratory Manual (Sambrook et ai., Cold Spring Harbor Laboratory), Current Protocols ín Molecular Biology, ed. Ausubel et al., Greene Publ. Assoc., Wiley-Interscience, NY) v savčím expresním vektoru pMT21 (Genetics Institute, lne. Cambridge, MA), byl také verifikován z hlediska sekvence za použití ABI 373A DNA sekvenátoru a Taq Dideoxy Terminátor Cycle Sequencing Kitu (Applied Biosystems, lne., Foster City, CA). Sekvence Mut2:Fltl(2-3_B)-Fc je uvedena na Obr. 14A až 14C.

Příklad 13: Konstrukce mutantního Fit 1 (1-3)- Fc s delecí označeného jako Mut3:Fltl(2-3_u}_Fc

Třetí deleční mutantní konstrukt, označený Mut3:Fltl(2-3_B)-Fc konstrukt, stou výjimkou, že Fltl lg doména 3 byla ponechána intaktní (bazický aminokyselinový region nebyl detekován). Konstrukt byl připraven technikou molekulární biologie a sekvence konečného konstruktu byla verifikována způsobem popsaným výše. Sekvence Mut3:Fltl(2-3_H)-Fc je uvedena na obr. 15A až I5C.

Příklad 14: Konstrukce mutantního Fit 1 (1-3)-Fc s N-glykosylací bazického regionu označeného Mut4:Fltl(l-3_K ,_N)-Fc

Byl připraven konstrukt, ve kterém bylo N-gly kosy lační místo vloženo do středu bazického regionu Fltl lg domény 3. Tento konstrukt byl označen jako Mut4:Fltl(I-3_k ._N)-Fc a byl připraven změnou nukleotidů 824 až 825 z GA na AC, což změnilo kódovaný Arg zbytek (AGA) na Asn zbytek (AAC) (viz obr. 10A až 10D). Vzniklá aminokyselinová sekvence je tedy změněna zArg-Ala-Ser na Asn-Ala-Ser, což odpovídá kanonickému signálu (Asn-Xxx-Ser/Thr) pro adici N-glykosylačního místa v Asn zbytku. Sekvence Mut4:FIt I(1 -3_{R N})-Fc je uvedena na obr. 16A až 16D.

Příklad 15: Charakterizace acetylovancho Fit 1( l-3)-Fe, Mutl:Fltl(l-3»)-Fc a Mut4:Flt 1 (1 3_r. -_n)-Fc mutantů (a) Vazba na složky mezibuněČné hmoty

Pro stanovení toho, zda tři modifikované proteiny mají více či méně zlepšené farmakokinetické vlastnosti sc 96-jamkové plotny potažené Matrigelem (jak jsou popsané výše) inkubovaly s různými koncentracemi mutantních proteinů a detekovaly se protilátkami proti lidskému Fc konjugovanými s alkalickou fosfatázou. Jak je uvedeno na obr. 18, tento pokus ukázal, že zatímco nemodifikovaný Fltl( 1-3)-Fc protein se dobře váže na tyto jamky, Mut3:Fltl(2-3)-Fc protein se váže o něco slaběji, Mutl ;Fltl(l-3_B)-Fc se váže ještě slaběji a Mut2:Fltl(2-3_B)-Fc protein má nej lepší profil a váže se slaběji než jakýkoliv jiný mutantní protein. Mut4:FltI(I—3r nFFc glykosylační mutantní protein vykazoval pouze marginální benefit v Matrigel testu. Tyto výsledky potvrzují hypotézu, že lineární sekvence pozitivních aminokyselin může být deletována z primární sekvence, což vede ke snížení elektrických interakcí se složkami extracelulámí hmoty.

(b) Vazba Mut 1 : Fit I (1 —3„)—Fc a Mut4:Fltl (1-3_{K N})-Fc v testu na bázi Biacore

Nemodifikovaný a acetylovaný Fit 1 (1 —3 )-Fc proteiny a geneticky modifikovaný Mut l:Fit 1 (l —3|i>—Fc a Mut4:Fit 1 (I —3_K n>-Fc proteiny byly testovány v testu na bázi Biacorc pro hodnocení jejich schopnosti vazby na Fltl ligand, VEGF. V tomto testu sc nemodifikovaný Fit 1( 1-3)-Fc protein (0,25, 0,5 nebo 1,0 gg/ml) imobilizujc na povrchu Biacorc čipu (viz Biacorc Instruction Manual, Pharmacia, lne., Piscataway, NJ, kde je uveden standardní postup) a roztok

-20CZ 302689 B6 obsahující 0,1 gg/ml VEGF a buď přečištěný, nebo supematant COS buněk obsahující nemodifikovaný Fltl (1-3) -Fc (v koncentraci 0,25, 0,5 nebo 1,0 gg/ml), přečištěný acetylovaný Fltl(l—3)—Fc (v koncentraci 0,25, 0,5 nebo 1,0 gg/ml), supematant COS buněk obsahující Mutl :Fltl(1—3_B)—Fc (v koncentraci 0,25, 0,5 nebo 1,0 gg/ml), nebo supematant COS buněk s obsahující Mut4:Fltl(l-3^>_N)-Fc (v koncentraci 0,25, 0,5 nebo 1,0 gg/ml), se přelil přes čip potažený Fit 1 (1-3)-Fc. Jak je uvedeno na obr. 17, v sub-stechiometrickém poměru (0,25 gg/ml nemodifikovaného, acetylovaného nebo geneticky modifikovaného vzorku vs. 0,1 gg/ml VEGF) není přítomno dostatečné množství Fit 1 (1-3)-Fc proteinu v roztoku pro blokování vazby VEGF na Fit 1 (l- 3) Fc imobilizovaný na Biacore čipu. Při 0,5 gg/ml nemodifikovaného, acetylovaného io nebo geneticky modifikovaného Fltl(l-3)-Fc proteinu, což je přibližně stechiometrický poměr

1:1, je patrna zlepšená schopnost blokovat vazbu VEGF na Biacore čip. Při koncentraci

1,0 gg/ml nemodifikovaného, acetylovaného nebo geneticky modifikovaného Fltl(1—3)—Fc proteinu, což je přibližně stech iometrický poměr 10:1, jsou Fltl (1—3)—Fc proteiny schopny blokovat vazbu VEGF na Biacore čip, ale nejsou ekvivalentní. Nemodifikovaný, acetylovaný a Mutl :Fltl(l-3_B)-Fc jsou v podstatě rovnocenné ve své schopnosti blokovat vazbu VEGF, zatímco Mut4:Fltl(l-3_R„>_N)-Fc je o něco méně účinný v blokování vazby. Tyto výsledky potvrzují hypotézu, že je možné redukovat nespecifickou vazbu molekuly genetickým odstraněním lineární sekvence predominantně negativně nabitých aminokyselin.

(c) Vazba Mutl :Fltl(l-3_B)-Fc, Mut2:Fltl(2-3_B)-Fc, Mut3:Htl(l-3_B)-hc v testu na bázi

ELISA

Pro stanovení toho, zda se mohou tří mutantní proteiny vázat na Fltl ligand VEGF se provedly vazebné experimenty, ve kterých se 96-jamkové plotny potažené VEGF inkubovaly s různými koncentracemi příslušného mutantního proteinu a po promytí se úroveň vazby detekovala inkubací s protilátkou proti lidskému Fc konjugovanou s alkalickou fosfatázou a kvantifikovala se kolorimetricky přidáním vhodného substrátu pro alkalickou fosfatázu. Jak je uvedeno na obr. 19, pokus ukázal, že v testovaných koncentracích se mohou všechny mutantní proteiny podobně vázat na VEGF.

Příklad 16: Farmakokinetická analýza acetylovaného Fltl (1-3 )-Fc, Mutl :Flt 1 (1- 3_B)- Fe a nemodifikovaného Fltl( 1-3)-Fc

Pokusy in vivo byly navrženy pro hodnocení farmakokinetických profilů nemodifikovaného Fit 1 (1-3)-Fc, Mutl :Flt 1 (1—3_Ď)—Fc a při 40-násobného molárního nadbytku acetylovaného Fltl( 1 —3)—Fc. Balb/c myším (25 až 30 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg nemodifikovaného Fit 1 (1-3)-Fc, při 40-násobném molámím nadbytku acetylovaného Fltl(l—3)-Fc a Mutl :F1tl (1 — 3_B)-Fc proteinu (vždy 4 myši). Myším se odebírala krev z ocasu 1,2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny, 3 dny a 5 dnů po injekci proteinu. Sérum se testovalo standardním ELISA testem navrženým pro detekci Fit 1 <1—3)—Fc proteinu, kteiý zahrnuje potažení ELISA plotny VEGF, vazbu Fit 1( 1-3)_Fc a detekci anti-Fc protilátkou navázanou na alkalickou fosfatázu. Jak je uvedeno na obr. 20, byly Cmax pro tato činidla následující: nemodifikovaný Fltl(1-3)-Fc - 0,15 gg/ml; při 40-násobném molámím nadbytku acetylovaný Fltl(1—3)—Fc — 1,5 gg/ml; a Mutl:Fltl(l-3_B)-Fc - 0,7 gg/ml.

Příklad 17; Konstrukce vektoru pro modifikovaný Fltl receptor

Konstrukce modifikované verze Fltl receptorů (též známého jako VEGFR1) byla provedena na základě pozorování, že proteinová sekvence Fltl je značně bazická a proto je pravděpodobné, že se bude vázat na extracelulámí hmotu (ECM). Vysoce bazický charakter Fltl pravděpodobně vysvětluje to, proč má nemodifikovaný Fit 1(1-3)-Fc (popsaný výše) špatné farmakokinetické vlastnosti, které činí obtížným jeho použití jako terapeutického činidla. Jak bylo popsáno výše, chemicky modifikovaná forma při 40-násobném molámím nadbytku acetylovaného Fltl( 1 -3)

-21 CZ 302689 B6

Fc, kteráje zde označována jako A40, vykazuje značně vylepšenou farmakokin etiku vzhledem k neacetylovanému Fit 1 (1-3)-Fc. Proto byly provedeny pokusy o přípravu upravených DNA molekul, které mohou být použity pro rekombinantní expresi modifikovaných forem Fit 1 receptoru, které by měly lepší farmakokinetický profil A40 a zároveň by si zachovávaly schopnost vazby VEGF.

Z literatury' je známo, že první Ig doména Fltl (která má náboj +5 při neutrálním pH) není zásadní pro těsnou vazbu na VEGF, proto je tato doména deletována. Třetí Ig doména (mající náboj +11) není zásadní pro vazbu, ale dodává vyšší afinitu pro VEGF než druhá Ig doména, takže místo úplného deletován í byla nahrazena ekvivalentními doménami receptoru příbuzného Fltl, kterým byl Fikl (též známý jako VEGFR2) a Flt4 (též známý jako VEGFR3). Tyto chimérické molekuly (označené R1R2 (Fltl .D2.Flkl D3.Fc C1 (a) a VEGFR1 R2 -Fc- Cl (a) a VEGFR1R3-Fc-Cl (a), v příslušném pořadí, kde Rl a FH1D2 = Ig doména 2 Fltl (VEGFR1); R2 a FlklD3- Ig doména 3 Fikl (VEGFR2); a R3 a VEGFR3D3 - Ig doména3 Flt4 (VEGFR3)) mají mnohem menší vazbu na ECM, jak bylo potvrzeno in vitro testem vazby na ECM, jak je popsáno dále. Dále, tyto molekuly byly schopny pevně se vázat na VEGF, jak je popsáno dále, a blokovat fosforylaci přirozeného Fikl receptoru exprimovaného v endotelových buňkách, jak je popsáno dále.

(a) Konstrukce expresního plasmidu pFItl .D2.FlkI D3.Fc Cl (a)

Expresní plasmidy pMT21.Fltl(l-3)-Fc (6519bp) a pMT21.Fit 1(1-3 )-Fc (5230 bp) jsou plasmidy, které kódují resistenci na ampicilin a Ig domény 1-3 lidského Fltl a lidského Fltl s navázaným Fc, v příslušném pořadí. Tyto plasmidy byly použity pro konstrukci DNA fragmentu skládajícího se z fúze Ig domény 2 Fltl s Ig doménou 3 Fikl, za použití PCR amplifikace příslušných lg doménu, po které následovalo další kolo PCR pro provedení fúze dvou domén do jediného fragmentu. Pro Ig doménu 2 Fltl byly 5’ a 3’ amplifikační primery následující:

' : bsp/f ltlD2 (5 ’ -GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3 ' )

3’ :Fltld2-Flkld3 .as (5 ' - CGGACTCAGAACCACATCTATGATTGTATTGGT - 3 ' )

5' amplifikační primery kódují restrikční místo pro BspEl enzym před lg doménou 2 Fltl. které je definované aminokyselinovou sekvencí GRPFVEM (odpovídající aminokyselinám 27 až 33, obr. 21A až 21C). 3’ primer kóduje reverzní komplement 3’ konce Fltl lg domény 2 fúzovaný přímo na 5'začátek Fikl Ig domény 3, s fúzí vmiste definovaném jako Fltl (odpovídajícím aminokyselinám 123 až 126, obr. 21A až 21C) a pokračujícím do VVLS (odpovídajícím aminokyselinám 127 až 130, obr. 21A až 2IC) Fikl.

Pro lg doménu 3 Fikl byly 5' a 3' amplifikační primery následující

5’:Flt1D2-FlklD3.S (5’-ACAATCATAGA.TGTGGTTCTGAGTCCGTCTCATGG-3¹}

3¹:FlklD3/apa/srf.as (5 ’ -GATAATGCCCGGGCCCTTTTCATGGACCCTGACAAATG-3 * )

5'amplifikační primer kóduje konec Fltl lg domény 2 fúzovaný přímo na začátek Fikl lg domény 3, jak bylo popsáno výše. 3’amplifikační primer kóduje konec Fikl lg domény 3, definovaný aminokyselinami VRVHEK (odpovídajícími aminokyselinám 223 až 228, obr. 21A až 21C), po kterých následuje přemosťující sekvence, která zahrnuje rozpoznávací sekvenci pro restrikční enzym Srfl, a která kóduje aminokyseliny GPG. Přemosťující sekvence odpovídá aminokyselinám 229 až 23 I, obr. 21A až 21C.

Po kole PCR amplifikace pro produkci jednotlivých domén sc produkty smísily ve zkumavce a podrobily se dalšímu kolu PCR s primery bsp/fitlD2 a Fikl D3/apa/srf.as (popsanými výše) za _ 22 CZ 302689 B6 zisku fúzního produktu. Tento PCR produkt byl potom tráven restrikčními enzymy BspEI a Smál a získaný 614 bp fragment byl subklonován do BspEI až Srfl restrikčních míst vektoru pMT21/B2Fc, za zisku plasmidu pMT21/FltlD2.FlklD3.Fc. Nukleotidové sekvence FltlD2— FlklD3 genového fúzního insertu byla verifikována standardní analýzou sekvence. Tento plas5 mid byl potom tráven restrikčními enzymy EcoRI a Srfl a získaný 702 bp fragment byl přenesen do EcoRI až Srfl restrikčních míst plasmidu pFltl(l-3)B2-Fc Cl (a) za zisku plasmidu pFltlD2.FlklD3.Fc Cl (a). Kompletní DNA a odvozená aminokyselinová sekvence chimérické molekuly Fit 1D2—Flk 1 D3.Fc Cl (a) jsou uvedeny na obr. 21A až 21C.

io (b) Konstrukce expresního plasmidu pFltlD2VEGFR3D3Fc Cl (a)

Expresní plasmid pMT2l.FltI(l-3)-Fc (6519 bp) je plasmid, který kóduje resistenci na ampicilin a Ig domény 1 až 3 lidského Fit 1 receptorů s navázaným Fc. Tento plasmid byl použit pro konstrukci DNA fragmentu obsahujícího Ig doménu 2 Fltl za použití PCR. RNA z buněčné linie

HEL921.7 byla použita pro produkci Ig domény 3 Fikl, za použití standardní PCR. Další kolo

PCR amplifikace bylo použito pro provedení fúze dvou Ig domén do jediného fragmentu. Pro Ig doménu 2 Fltl byly 5’ a 3’ amplifikační primery následující ¹ :bsp/f ltlD2 (5 ¹ -GACTAGCAGTCCGGAGGTAGACCTTTCGTAGAGATG-3 ' )

3':FltlD2.VEGFR3D3.as (S'-TTCCTGGGCAACAGCTGGATATCTATGATTGTATTGGT)

5’ amplifikační primer kóduje restrikční místo pro BspEI enzym před Ig doménou 2 Fltl, které je definované aminokyselinovou sekvencí GRPFVEM (odpovídající aminokyselinám 27 až 33. obr. 21A až 21C), 3’primer kóduje reverzní komplement konce Fltl Ig domény 2 fúzovaný přímo na 5’ začátek VEGFR3 Ig domény 3, s fúzí v místě definovaném jako TIID Fltl (odpovídající aminokyselinám 123 až 126, obr. 22A až 22C) a pokračujícím do IQLL VEGFR3 (odpovídajícím aminokyselinám 127 až 130, obr. 22A až 22C).

Pro Ig doménu 3 VEGFR3 byly 5’ a 3' amplifikační primery následující:

’ : R3D3 . s {5 ' -ATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAGCTGCTGGTA) ' :R3D3 .as (5 ’ - ATTTTCATGCACAATGACCTCGGTGCTCTCCCGAAATCG)

5’ a 3’ amplifikační primery odpovídají sekvenci VEGFR3. 296 bp produkt amplifikace této RT-PCR reakce byl izolován standardními technikami a byl zpracován druhým kolem PCR pro přidání vhodných sekvencí pro umožnění fúze Fit 1D2 s FlklD3 doménami a fúze FlklD3 a Fc domén prostřednictvím GPC můstku (viz dále). Amplifikační primery byly následující:

5’: FltlD2.VEGFR3D3.as (TCATAGATATCCAGCTGTTGCCCAGGAAGTCGCTGGAG)

3’: VSGFR3D3/srf.as (GATAATGCCCGGGCCATTTTCATGCACAATGACCTCGGT)

5’ amplifikační primer kóduje 3’ konec Fltl Ig domény 2 fúzovaný přímo na začátek (5’ konec) VEGFR3 Ig domény 3, jak bylo popsáno výše. 3’ amplifikační primer kóduje 3’ konec VEGFR3

Ig domény 3, definovaný aminokyselinami VIVHEN (odpovídajícími aminokyselinám 221 až 226, obr. 22A až 22C), po kterých následuje přemosťující sekvence, která zahrnuje rozpoznávací sekvenci pro restrikční enzym Srfl, a která kóduje aminokyseliny GPG. Přemosťující sekvence odpovídá aminokyselinám 227 až 229, obr, 22A až 22C.

-23 CZ 302689 B6

Po jednom kole (pro Fit 1 Ig doménu 2) nebo dvou kolech (pro Flt4 Ig doménu 3) PCR amplifikace pro produkci jednotlivých Ig domén se produkty PCR smísily ve zkumavce a podrobily se dalšímu kolu PCR amplífikace s amplifikačními primery bsp/fltI D2 a VEGFR3D3/srf.as (popsanými výše) za zisku fúzního produktu. Tento PCR produkt byl potom tráven restrikčním i enzymy BspEl a Smál a získaný 625 bp fragment byl subklonován do BspEI až Srfl restrikčních míst vektoru pMT21/Fltl B2.Fc (popsaného výše), za zisku plasmidu pMT21/FftlD2.VEGFR3D3 genového fúzního insertu byla verifikována standardní analýzou sekvence. Tento plasmid byl potom tráven restrikčními enzymy EcoRI a Srfl a získaný 693 bp fragment byl subklonován do EcoRI až Srfl restrikčních míst plasmidu pFltl(l-3) B2-FcCl(a) za zisku plasmidu pFlt1D2.VEGFR3D3.FcCl (a). Kompletní DNA a odvozená aminokyselinová sekvence chimérické molekuly FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) jsou uvedeny na obr. 22A až22C.

Příklad 18: Test vazby na mezibuněčnou hmotu (ECM)

Plotny potažené ECM (Becton Dickinson katalogové č. 35^4607) byly rehydrátovány teplým DME doplněným glutaminem (2 mM), 100 U penicilinu, 100 U streptomycinu a 10% BCS po dobu alespoň 1 hodiny před přidáním vzorků. Plotny se potom inkubovaly po dobu 1 hodiny při teplotě místnosti s různými koncentracemi Fltl D2.Flkl D3.Fc Cl (a) a Fltl D2.VEGFR3D3.FcCl (a) s první hodnotou 10 nM a potom s 2-násobným ředěním v PBS plus 10% BCS. Plotny se potom promyly 3-krát PBS plus 0,1% Triton-X a inkubovaly se s protilátkou proti lidskému Fc konjugovanou s alkalickou fosfatázou (Promega, 1:4000 v PBS plus 10% BCS) po dobu í hodiny pri teplotě místnosti. Plotny se potom promyly 4-krát PBS s0,l% triton-X a přidal se pufr pro alkalickou fosfatázu/pNPP roztok (Sigma) pro vývoj zbarvení. Plotny se odečítaly pří I = 405 až 507 nm. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 23 a demonstrují, že FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) proteiny se významně méně váží na ECM ve srovnání s Fit 1 (1—3)—Fc proteinem.

Příklad 19: Dočasná exprese FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a)vCNO-Kl (El A) buňkách

Velkoobjemová (2 I) kultura E. coli DH10B nesoucích pFltl D2.Flk I D3.Fc Cl (a) plasmid popsaný výše v příkladu 17(a) se kultivovala přes noc v Terrific Broth (TB) plus 100 pg/ml ampicilinu. Další den se plasmidová DNA extrahovala za použití QIAgen Endofree Megaprep kitu podle návodu výrobce. Koncentrace přečištěné plasmidové DNA se určila standardními technikami za použití UV spektrofotometru a fluorometru. Plasmidová DNA se verifikovala standardním trávením podílů restrikčními enzymy za použití restrikčních enzymů EcoRI plus Notl a Asel. Všechny fragmenty získané trávením restrikčními enzymy měly předpokládanou velikost při analýze na 1% agarosovém gelu.

Ve 14 15cm Petriho miskách se kultivovaly CHO-K1/EIA buňky v hustotě 4x IO⁶ buněk/plotnu. Kultivačním médiem bylo Gibco Harrfs F-12 doplněné 10% Hyclone fetálním sérem (FBS), 100 U penicilinu/100 U streptomycinu a glutaminem (2 mM). Následující den byla každá plotna buněk transfektována 6 pg pFltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) plasmidové DNA za použití Gibco Optimem a Gibco Lipoíectamine v objemu 12 ml, podle návodu výrobce. 4 hodiny po přidání transfekční směsi k buňkám se přidalo I2ml/plotnu Optimem doplněného 10% FBS. Plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C v inkubátoru s 5% CO₂ přes noc. Následující den se z každé plotny odstranilo médium a přidalo se 25 μΙ expresního média (Gibco CHO-S-SFM-II doplněné glutaminem (2 mM) a 1 mM natrium-butyrátem). Plotny se inkubovaly při teplotě 37 °C po dobu 3 dnů. Po 3 dnech inkubace se z každé plotny aspirovalo médium, které se odstředilo při 400 rpm v odstředivce s houpající se komorou za účelem peletování buněk. Supernatant se dekantoval do sterilních 1—litrových baněk a přečištění cxprimovaného proteinu se provedlo způsobem popsaným dále.

-24 CZ 302689 B6

Příklad 20: Konstrukce pVEGFRl R2~Fc Cl (a) expresního vektoru

Expresní plasmid pVEGFRl R2-Fc Cl (a) byl konstruován insercí DNA kódující aminokyseliny SDT (odpovídající aminokyselinám 27 až 29 na obr. 24A až 24C) mezi Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) aminokyseliny 26 a 27 podle obr. 21A až 21C (GG) a odstraněním DNA kódující aminokyseliny GPG odpovídající aminokyselinám 229 až 231 obr. SDT aminokyselinová sekvence je přirozená pro Fltl receptor a byla vrácena pro snížení pravděpodobnosti heterogenního N-koncového zpracování, GPG (přemosťující sekvence) byla odstraněna, takže Fltl a Fikl lg domény byly fúzovány přímo jedna na druhou. Kompletní DNA a odvozená aminokyselinová sekvence to pVEGFRl R2-Fc Cl (a) chimérické molekuly jsou uvedeny na obr. 24 A až 24C.

Příklad 21: Kultivace buněk použitá pro produkci modifikovaných Fltl receptorů (a) Kultivace buněk použitá pro produkci FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a)

Proces pro produkci FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) proteinu za použití expresního plasmidu pFltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) popsaného výše v příkladu 1 zahrnoval suspenzní kultivaci rekombinantních ovariálních buněk čínského křečka (CHO-K1/E1 A). které se kultivovaly v bioreakto20 rech a proteinový produkt se izoloval s vylučováním podle velikosti. Proces je podrobně popsán dále.

Expanze buněk

Dvě konfluentní T-225cm² zkumavky obsahující buněčnou linii exprimující FItlD2.Flkl D3.FcCl (a) se expandovaly pasážováním buněk do 8 T-225cm² zkumavek v médiu (GMEM + 10% sérum, GIBCO) a inkubováním při 37 °C a 5% CO2. Když bylo dosaženo požadované konfluence (přibližně za 3 až 4 dny), tak se buňky rozvolnily za použití trypsinu. Čerstvé médium se přidalo pro chránění buněk před dalším působením tiypsinu. Buňky se odstředily a resuspendova30 iy se v čerstvém médiu a potom se přenesly do 8 850cm² válcových zkumavek a inkubovaly se pří 37 °C a 5% CO2 do dosažení konfluence.

Suspenzní kultura v bioreaktorech

Buňky kultivované ve válcovitých zkumavkách se trypsinizovaly pro uvolnění od povrchu a promyly se suspenzí kultivačního média. Buňky se asepticky přenesly do 51 bioreaktoru (New Brunswick Celligen Plus), kde se kultivovaly ve 3,5 litrové suspenzní kultuře. Suspenzním kultivačním médiem bylo bezglutaminové IS-CHO s nízkým obsahem glukosy (I rvi ne Scientific), do kterého se přidalo 5% fetální hovězí sérum (Hyclone), GS doplněk (Life Technologies) a 25 μΜ methionin sulfoximinu (Sigma). pH se udržovalo na 7,2 pomocí přidávání oxidu uhličitého do dodávaného plynu nebo přidáním kapalného roztoku uhličitanu sodného do bioreaktoru. Koncentrace rozpuštěného kyslíku se udržovala na 30 % saturace pomocí přidávání kyslíku nebo dusíku do dodávaného plynu a teplota se udržovala na 37 °C. Když bylo dosaženo hustoty buněk 4 x 10⁶buněk/ml, tak se buňky přenesly do 401 bioreaktoru obsahujícího stejné médium a stejné nastave45 ní hodnot. Teplota byla snížena na 34 °C pro zpomalení růstu a zvýšení relativní rychlosti exprese proteinu.

(b) Kultivace buněk použitá pro produkci FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a)

Stejný postup jako je postup popsaný výše pro FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) se použil pro produkci FltlD2.VEGFR3D3.FcCl (a).

-25CZ 302689 B6

Příklad 22: Odběr a přečištění modifikovaných Fltl receptorů (a) Odběr a přečištění Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a)

Proteinový produkt byl asepticky odebírán z bioreaktoru za zachycování buněk za použití Millipore Prostec filtračních modulů s tangenciálním tokem a mechanické pumpy s nízkým střihem (Fristam). Čerstvé médium se přidalo do bioreaktoru pro nahrazení média odstraněného při filtraci. Přibližně 40 I získaného filtrátu se potom vneslo do 400ml kolony obsahující Protein A Sepharose pryskyřici (Amersham Pharmacia). Po vložení se pryskyřice promyla pufrem obsahujícím 10 mM fosforečnan sodný, 500 mM chlorid sodný, pH 7,2, pro odstranění jakýchkoliv nenavázaných kontaminujících proteinů. FltlD2.Fikl D3.Fc Cl (a) protein se eluoval citrátovým pufrem s pH 3,0. Eluovaný profil se neutralizoval přidáním Tris báze a zmrazil se pri -20 °C.

Několik zmrazených šarží Fltl D2.Flk1 D3.Fc Cl (a) proteinu z kroku s proteinem A se rozmrazilo, smísilo a zahustilo za použití Millipore filtrační membrány s tangenciálním tokem s limitem molekulové hmotnosti (NMWCO) 30 kD. Protein se přenesl do zařízení pro zahuštění buněk (Millipore) a dáte se zahustil na 30 mg/ml za použití 30 kD NMWCO membrány. Zahuštěný protein se vnesl do kolony s vylučováním podle velikosti částic naplněné Superdex 200 pryskyřicí (Amersahm Pharmacia), která byla uvedena do rovnováhy fosfátem pufrovaným salinickým roztokem plus 5% glycerolem. Stejný pufr byl použit pro eluci kolony. Frakce odpovídající Fltl D2.FlklD3.Fc Cl (a) dimeru se smísily, sterilně se přefiltrovaly přes 0,22 mikronový filtr, rozdělily se do podílů a zmrazily se.

(b) Odběra přečištění FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a)

Stejný postup jako je postup popsaný výše pro Fltl D2.FiklD3.Fc Cl (a) se použil pro odběr a přečištění Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a).

Příklad 23: Fosfory lační test pro dočasně exprimovaný VEGFR2

Primární lidské endotelové buňky pupečníkové žíly (HUVEC), pasáž 4 až 6, se nechaly po dobu 2 hodin v bezsérovém DME médiu s vysokou koncentrací glukosy. Připravily se vzorky obsahující 40 ng/ml (1 nM) lidského VEGF165, což je ligand pro VEGF receptory Fltl, Fikl a Flt4 (VEGFR3), a tyto vzorky se preinkubovaly po dobu 1 hodiny pri teplotě místnosti s různými množstvími Fltl receptorů Fltl(l-3)-Fc, Fltl (1-3 }-Fc (A40), Fltl D2.Flkl D3.Fc CI (a) FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) v bezsérovém DME s vysokou koncentrací glukosy obsahujícím 0,1% BSA. Buňky se na dobu 5 minut vystavily působení vzorků připravených výše ± VEGF165 a potom se provedla kompletní lýza buněk za použití pufru pro kompletní lýzu buněk. Buněčné lyzáty se imunoprecipitovaly protilátkou namířenou proti C-konci VEGFR2 receptoru. Imunoprccipitované lyzáty se vnesly na 4 až 12% SDS-PAGE Novex gel a potom se přenesly na PVDF membránu za použití standardní techniky. Detekce fosfory lovaného VEGFR2 byla provedena imunopřenosem s anti-fosfo-tyrosin mAb označenou 4G10 (UBI) a vývoj se provedl za použití ECL-činidla (Amersham). Obr. 25A až 25C až 26A až 26B ukazují výsledky tohoto pokusu. Obr. 25A až 25C ukazují, že detekce westernovým přenosem VEGFR2 (Fikl) s fosforylovaným tyrosinem pomocí stimulace VEGF 16 ligandem ukazuje, že povrchové buněčné receptory jsou fosforylovanc v různé míře podle toho, který modifikovaný Fltl receptor je použit během preinkubace s VEGF, Jak je vidět na obr. 25 A, při 1,5 násobném molárním nadbytku buď Fit 1 (13)-Fc, nebo Fit 1 (1-3)-Fc (A40) nebo dočasného Fit 1D2.Fikl D3.Fc Cl (a) je přítomna kompletní blokáda stimulace receptoru těmito třemi modifikovanými Fltl receptory ve srovnání s působením kontrolního média. Naopak, dočasný Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) nevykazuje při tomto molárním nadbytku žádnou významnou blokádu, ve srovnání s pozitivní kontrolou, kterou jc VEGF. Podobné výsledky jsou vidět na obr. 25B, kde jsou modifikované Fit receptory ve 3násobném molárním nadbytku vzhledem k VEGF 165 ligandů. Na obr. 25C, kde jsou modifikované Fltl receptory v 6-násobném molárním nadbytku vzhledem kVEGF165 ligandů, blokuje

-26CZ 302689 B6

FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) částečně stimulaci buněčných povrchových receptoru indukovanou VEGF165.

Na obr. 26A až 26B ukazuje detekce westernovým přenosem VEGFR2 (Fikl) fosfory!ováného na tyrosinu v důsledku stimulace VEGF165 ligandem, že buněčné povrchové receptory nejsou stimulované vzorky, které mají VEGF165 preinkubovaný s 1 a 2-násobným molárním nadbytkem (obr. 26A) nebo 3 a 4-násobným molárním nadbytkem (obr. 26B) dočasného FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a), stabilního FltlD2,FIklD3.Fc Cl (a) nebo dočasného VEGFR1R2FcCl (a). Při všech testovaných koncentracích modifikovaného Fltl receptoru byla pozorována io kompletní vazba VEGF165 ligandů během preinkubace, což vedlo k nedetekovatelné stimulaci buněčných povrchových receptoru pomocí nenavázaného VEGF165 ve srovnání s působením kontrolního média.

Příklad 24: Test buněčné proliferace

Pro testování buněčné populace byly MG87 buňky stabilně transfektovány expresním plasmidem obsahujícím DNA insert kódující extracelulámí doménu VEGFR2 (Fikl) fúzovanou na TrkB intracelulámí kinázovou doménu, za zisku chimérické molekuly. Důvodem použití TrkB intra?n rplnlámí kinázové domény místo přirozené VEGFR2 (Fikl) intracelulámí kinázové domény bylo to, že intracelulámí kinázová doména VEGFR2 (Fikl) nezpůsobuje silnou proliferační odpověď po stimulaci BDNF, a proto byla TrkB intracelulámí kinázová doména použita pro nahrazení intracelulámí kinázové domény VEGFR2 (Fikl) za účelem získání výhody této proliferační reakce.

x 10³ buněk se umístilo do 96-jamkové plotny a buňky se nechaly usadit během 2 hodin při 37 °C. Následující modifikované Fit receptory, Fltl(1-3)-Fc, Fltl D2.Flkl D3.Fc Cl (a) a Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a), a irelevantní receptor Tie2-Fc jako negativní kontrola, se titrovaly od 40 nM do 20 pM a inkubovaly se s buňkami po dobu 1 hodiny při teplotě 37 °C. Lidský rekombinantní VEGF165 v definovaném médiu se potom přidal do všech jamek v koncentraci 1,56 nM. Plotny se inkubovaly po dobu 72 hodin při teplotě 37 °C a potom se přidalo MTS (Owenovo činidlo, Promega) a plotny se inkubovaly po dobu dalších 4 hodin. Nakonec se plotny odečítaly na spektrofotometru při 450/570 nm. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 27. Kontrolní receptor Tie2-Fc neblokuje proliferaci buněk indukovanou VEGF165 v žádné

3? koncentraci, zatímco F1tlD2.FlklD3.Fc Cl (a) blokuje proliferaci při 1,56 nM VEGFI65 s polovinou maximální dávky rovnou 0,8 nM. Fltl(l—3)—Fc a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) jsou méně účinné v blokování VEGF165 v tomto testu, s polovinou maximální dávky rovnou přibližně 2 nM. VEGF165 sám o sobě vede k dosažení absorbance 1,2 jednotek a pozadí je 0,38 absorbaněních jednotek.

Příklad 25: Vazebná stechiometrie modifikovaných Fit receptorů pro VEGF165 (a) Biacore analýza

Stechiometrie FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a VEGFR1R2-Fc Cl (a) interakcí s lidským VEGF165 se určila měřením buď úrovně saturaění vazby VEGF na FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a), nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a) povrchy nebo měření koncentrace VEGF165 nutné pro kompletní blokování vazby FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a) na povrch VEGF Biacore čipu.

Modifikované Fit receptory FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a VEGFRlR2-FcCl (a) byly zachyceny pomocí protilátky specifické pro Fc, která byla nejprve imobilizována na Biacore čipu (BIACORE) za použití aminových kopulačních činidel. Povrch bez protilátky byl použit jako negativní kontrola. VEGF165 byl injikován v koncentraci 1 nM a 50 nM na FltlD2.FlkID3.-27CZ 302689 B6

Fc Cl (a) a VEGFRI R2-Fc Cl (a) povrchy v dávce 10 μΙ/min po dobu jedné hodiny. Vazebný signál v reálném čase byl měřen a na konci každé injekce byla dosažena saturační vazba, vazebná stechiometrie byla vypočtena jako molámí poměr navázaného VEGF165 k imobilizovanému Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a), za použití konverzního faktoru 1000 RU ekvivalentních 1 ng/ml. Výsledky ukazují na vazebnou stechiometrii jedné VEGF 165 dimerní molekuly na jednu molekulu Fltl D2.Fikl D3.Fc C1 (a) nebo VEGFR1 R2-Fc C1 (a) (obr. 28).

V roztoku se FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFRlR2-FcCl (a) v koncentraci 1 nM (což je koncentrace předpokládané 1000-krát vyšší než KD FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFR1R2-Fc Cl (a)/VEGF165 interakce) smísily s různými koncentracemi VEGF165. Po jedné hodině inkubace se volný FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) v roztoku stanovil jako vazebný signál na VEGF165-aminovém povrchu. Kalibrační křivka se použila pro konverzi Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) Biacore vazebného signálu na jeho molámí koncentraci. Data ukazují, že přidání 1 nM VEGF165 do roztoku FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) zcela blokují vazbu FltlD2.FlklD3.FcCl (a) na VEGFI65 povrch. Tento výsledek ukazuje na vazebnou stechiometrii jedné VEGF165 molekuly na jednu molekulu FltlD2,FlklD3.Fc Cl (a) (obr. 29 aobr. 30). Když se koncentrace FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) vnesla do grafu jako funkce přidané koncentrace VEGF165, tak byl sklon lineární části -1,06 pro FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) a -1,07 pro VEGFRIR2-Fc C1 (a). Velikost sklonu, velmi blízká minus jedné, ukazovala na vazbu jedné molekuly VEGFI65 na jednu molekulu buďFltlD2.FlklD3.FcCl (a), nebo VEGFRIR2-Fc Cl (a).

(b) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic

FltlD2.FlklD3.FcCl (a) se smísil s3-násobným nadbytkem VEGFI65 a komplex ligandreceptor se přečistil za použití Pharmacia Superose 6 chromatografické kolony s vylučováním podle velikosti částic. Komplex ligand-receptor se potom inkuboval v pufru obsahujícím 6M guanidinium hydrochlorid pro disociaci do jednotlivých proteinových složek. Flt1D2.FlklD3.FcCI (a) se separoval od VEGF 165 za použití Superose 6 chromatografické kolony s vylučováním podle velikosti částic eluované 6M guanidinium chloridem. Pro určení stechiometrie komplexu se provedlo několik injekcí Fltl D2.FiklD3.Fc Cl (a) a VEGF 165 a výška píku nebo integrovaná intenzita píku se vnesla do grafu jako funkce koncentrace injikovaného proteinu. Kalibrace se provedla za podmínek identických podmínkám použitým pro separování složek komplexu FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a)/VEGF. Kvantifikace složení komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a)/VEGF se provedla podle kalibračních křivek. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 28, který ukazuje, že poměr VEGF! 65 k Fltl D2.FlklD3.Fc Cl (a) v komplexu je 1:1.

Příklad 26: Určení vazebné stechiometrie komplexu FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a)/VEGF165 pomocí chromatografie s vylučováním podle velikostí částic Příprava komplexu Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a)/VEGF165

VEGF165 (koncentrace = 3,61 mg/ml) se smísil s CHO buňkami dočasné exprimujícími Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) (koncentrace = 0,9 mg/ml) v molárním poměru 3:1 (VEGF165:FltlD2.Flkl D3.Fc Cl (a)) a provedla se inkubace pres noc při teplotě 4 °C.

(a) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) za nativních podmínek

Pro separování komplexu od nadbytku nenavázaného VEGF165 se 50 μΐ komplexu vneslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy v PBS pufru. Vzorek se eluoval stejným pufrem při průtoku 40 μΙ/min pri teplotě místnosti. Výsledky teto SEC jsou uvedeny na obr. 31. Pík 1 představuje komplex a pík 2 představuje nenavázaný VEGF 165. Frakce eluované mezi 1,1 a 1,2 ml se smísily a guanidinium chlorid (GuHCI) se přidal v konečné koncentraci 4,5 M pro disociování komplexu.

-28 CZ 302689 B6 (b) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) za disociačních podmínek

Pro separování složek komplexu receptor-ligand a pro určení jejich molámího poměru se 50 ml disociovaného komplexu popsaného výše vneslo do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy pomocí 6M GuHCl a eluovala se stejným roztokem při průtoku 40 ml/min při teplotě místnosti. Výsledky této SEC jsou uvedeny na obr. 32. Pík 1 představuje FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) a pík 2 představuje VEGF165.

(c) Výpočet stechiometrie komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a)/VEGF165 io

Stechiometrie komplexu receptor-ligand se určila z plochy píku nebo výšky píku složek. Koncentrace VEGF165 nebo Fltl D2.FlklD3.Fc Cl (a) odpovídající výšce piku nebo ploše píku, v příslušném pořadí, se získaly ze standardních křivek pro VEGF 165 a Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a). Pro získání standardní křivky se 4 různé koncentrace (0,04 mg/ml az 0,3 mg/ml) jedné ze složek injikovaly do Pharmacia Superose 12 PC 3.2/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy pomocí 6M GuHCl a eluovala se stejným roztokem při průtoku 40 ml/min při teplotě místnosti. Standardní křivka se získala sestrojením grafu plocha píku nebo výška píku vs. koncentrace proteinu. Molámí poměr VEGF165:FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) určený z výšky píku složek byl 1:10.

Příklad 27: Určení vazebné stechiometrie komplexu FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a)/VEGF165 pomocí chromatografie s vylučováním podle velikosti částic s on-line detektorem rozptylu světla

Příprava komplexu

VEGF165 se smísil s CHO buňkami dočasně exprimujícími FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) v molárním poměru 3:1 (VEGF165:FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a)) a provedla se inkubace přes noc při teplotě 4 °C.

(a) Chromatografie s vylučováním podle velikosti částic (SEC) s on-line detektorem rozptylu světla

Chromatografická kolona s vylučováním podle velikosti částic s Mini-Dawn on-line detektorem rozptylu světla (Wyatt Technology, Santa Barbara, Califomia) a detektoiy indexu lomu (Rl) (Shimadzu, Kyoto, Japan) se použila pro stanovení molekulové hmotnosti (MW) komplexu receptor-ligand. Vzorky se injikovaly do Superose 12 HR 10/30 kolony, která se uvedla do rovnováhy v PBS pufru, a eluovaly se stejným pufrem při průtoku 0,5 ml/min při teplotě místnosti. Jak je uvedeno na obr. 33, vykazoval eluční profil dva píky. Pík 1 představuje komplex ligand-receptor a pík 2 představuje nenavázaný VEGF165. Mol. hmot. byla vypočtena z LS a Rl signálů. Stejný postup se použil pro stanovení mol. hmot. jednotlivých složek komplexu ligandreceptor. Výsledky těchto měření jsou následující: mol. hmot. komplexu Fltl D2.Fikl D3,Fc Cl (a)/VEGF165 v píkové pozici je 157 300 (obr. 33), mol. hmot. VEGF165 v píkové pozici je 44 390 (obr. 34 a mol. hmot. R1R2 v píku je 113 300 (obr. 35),

Tato data ukazují, že stechiometrie komplexu FltlD2,F1kl D3.Fc Cl (a)/VEGF je 1:1, protože to odpovídá součtu molekulových hmotností pro Fltl D2.FlklD3.Fc Cl (a) a VEGF165. Důležité je to, že tato metoda ověřila, že komplex FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a)/VEGF165 se skládá z pouze jedné molekuly VEGF165 ligandu a pouze jedné molekuly FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a).

Příklad 28: Peptidové mapování FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a)

Dtsulfidové struktury a glykosylační místa v FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) se určily metodou peptidového mapování. V této metodě se protein nejprve štěpil trypsinem. Získané fragmenty se ana55 lyžovaly a identifikovaly HPLC společně s hmotnostní spektrometrií, a dále také technikou N-29CZ 302689 Β6 terminál η ího sekvenování. Redukce trávení trypsinem se použila pro identifikaci fragmentů obsahujících disulfídové vazby. Zpracování produktů trávení trypsinem PNG aso u (Glyko, N ováto, CA) se použilo pro identifikaci fragmentů sN-vázanými glykosylačními místy. Výsledky jsou shrnuty na obr. 36.

V Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) existuje celkem 10 cysteinů; 6 z nich je přítomno v Fc regionu. Bylo potvrzeno, že Cys27 je disulfídové vázán na Cys76. Bylo potvrzeno, že Cysl21 je disulfídové vázán na Cys 182. První dva cysteiny v Fc regionu (Cys211 a Cys214) tvoří intermolekulovou d i sulfidovou vazbu se stejnými dvěma cysteiny v jiném Fc řetězci. Nicméně, protože tyto dva cysteiny nemohou být od sebe enzymově separovány, nemůže být určeno, zda existuje disulfidová vazba mezi stejnými cysteiny (například Cys2t 1—Cys211), nebo mezi Cys211 aCys214. Bylo potvrzeno, že Cys216 je disulfídové vázán na Cys306, Bylo potvrzeno, že Cys352 je disulfídové vázán na Cys410.

V FltlD2.Flkl D3.Fc Cl (a) existuje 5 potenciálních N-glykosylačních míst. Všech 5 míst je v různém rozsahu glykosylováno. Kompletní glykosylace byla zjištěna na Asn33 (aminokyselinová sekvence NIT), Asnl93 (aminokyselinová sekvence NST), a Asn282 (aminokyselinová sekvence NST). Dále byla zjištěna částečná glykosylace na Asn65 a Asn 120. Místa glykosylace jsou podtržená na obr. 36.

Příklad 29: Farmako kinetická analýza modifikovaných Fit receptorů (a) Farmakokinetická analýza Flt1(l-3)~Fc (A40), FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) a VEGFR1R2FcCl (a)

Balb/c myším (25 až 30 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg Fltl(l-3)-Fc (A40), CHO dočasně exprimujících FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a), CHO stabilně exprimujících FitID2.F1 k 1D3.FcCl (a) a CHO dočasně exprimujících VEGFRlR2-Fc Cl (a). Myším se odebírala krev zocasu 1, 2, 4, 6, 24 hodin, 2 dny, 3 dny a 6 dnů po injekci. Sérum se testovalo v ELISA testu navrženém pro detekci Flt1(l-3)-Fc (A40), FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) nebo VEGFRl R2-Fc CI (a). ELISA test zahrnuje potažení ELISA plotny VEGF165, vazbu Fit 1 (1-3)-Fc (A40), FltlD2.FIkID3.FcCl (a) nebo VEGFRlR2-Fc C1 (a) a zobrazení anti-Fc protilátkou navázanou na křenovou peroxídázu. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 37. T_mas pro Fit 1(1-3)Fc (A40) byl 6 hodin, zatímco T_I1K1X pro dočasně a stabilně exprimovaný Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a dočasně exprimovaný Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) byly 24 hodin. C_tnax pro Fltl(l-3)-Fc (A40) byla 8 pg/ml. Pro dočasně exprimované peptidy (Fltl D2. Fikl D3.Fc Cl (a) a VEGFRlR2-Fc Cl (a) ) byly C_m:ix 18 pg/ml a pro stabilně exprimovaný VEGFRl R2-Fc Cl (a) byla C_tli;iX 30 pg/ml.

(b) Farmakokinetická analýza Flll( l-3)-Fc (A40), Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a FltlD2.VEGFR3D3.FcCÍ (a)

Balb/c myším (25 až 30 g) se podkožní injekcí podaly 4 mg/kg Fit 1 (1 —3)—í'c (A40), CHO dočasně exprimujících Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a) a CHO dočasně exprimujících Fit 1D2.VEGFR3D3.Fc Ct (a). Myším se odebírala krev zocasu 1, 2, 5, 6, 7, 8, 12, 15 a 20 dnů po injekci. Sérum se testovalo v ELISA testu navrženém pro detekci Fit 1 (1 —3)—Fc. FitlD2.FÍklD3.FcCI (a) nebo FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a). ELISA test zahrnuje potažení ELISA plotny VEGFI65, vazbu FitI(1 -3)-Fc, FltlD2.FlkID3.Fc Cl (a) nebo FltlD2.VEGFR3D3.FeC'1 (a) a zobrazení anti-Fc protilátkou navázanou na křenovou peroxídázu. Fltl( I-3)-Fc (A40) nemohl být detekován v séru po dnu 5. zatímco FltlD2.Flkl D3.Fc Cl (a) a FHID2VEGFR3D3.Fc Cl (a) byly deteko vatě lne po 15 dnech a déle. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 38.

- 30 CZ 302689 B6

Příklad 30: Hodnocení schopnosti FltlD2,FlklD3.Fc Cl (a) inhibovat růst nádorů in vivo

Pro hodnocení schopnosti FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) inhibovat růst nádorů invivo se použil model, ve kterém je suspenze nádorových buněk implantována podkožně do pravé tlapky samců myší $ těžkou kombinovanou imunodeficiencí (SCÍD). V tomto testu se použily dvě buněčné linie, lidská HT-1080 fibrosarkomová buněčná linie (ATCC přírůstkové č. CCL-121) a krysí C6 gliomová buněčná linie (ATCC přírůstkové č. CCL-107), které mají značně odlišné morfologické a růstové charakteristiky. První dávka FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) (25 mg/kg nebo v dávce uvedené na obr. 39 a 40) se podala v den implantace nádoru. Zvířatům se potom podávaly podio kožní injekce Fltl(1-3)_Fc (A40), FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) nebo vehikula bud’ každý druhý den (EOD), nebo dvakrát týdně (2x/týdně) po dobu 2 týdnů. Po 2 týdnech se zvířata fixovala, odebraly se nádory a vzorky se zaslepily. Objem nádorů se měřil pomocí měření délky a šířky viditelných podkožních nádorů. Jak Fit 1 (1—3)—Fc (A40), tak FltlD2.FlklD3.Fc Cl (a) významně redukovaly růst nádorů tvořených HT-1080 a C6 buňkami. Výsledky těchto pokusů jsou uvedeny na obr. 39 a 40.

Příklad 31: Efekt VEGF] 65 a modifikovaných Fit receptorů na samičí reprodukční systém

Stereotypní rbarfikter cévní přestavby, ke které dochází v děloze a ovariu během reprodukčního cyklu, byl dobře charakterizován, což činí tuto tkáň velmi vhodnou pro testování mechanismů, které regulují angiogenezi, cévní přestavbu a regresi cév. Dále, pokusy s hybridizaci reprodukčních tkání in šitu poskytly jasné důkazy, že VEGF působí jako mediátor fyziologické angiogeneze u zdravých hlodavců, stejně jako u člověka a ostatních primátů (Phillips et al„ 1990:

Ravindranath et al., 1992; Shweiki et al., 1993; Kamat et al., 1995). Protože jsou cyklická angiogeneze a cévní přestavba význačnými rysy normálních vaječníků a dělohy, není překvapivé, že abnormální růst cév a/nebo dysfunkce cév charakterizují mnohé patologické stavy, které postihují tyto orgány. Dále, předpokládá se, že tyto patogenní cévní abnormality jsou způsobeny nebo podporovány dysreguíovanou expresí jednoho nebo více angiogenních nebo anti-angiogenních faktorů, hlavně VEGF.

Například je abnormální angiogeneze charakteristická pro polycystická ovaria, endometriosu a karcinom endometria, a u každého z těchto onemocnění je VEGF nadměrně exprimován v postižené tkáni (Kamat et al., 1995; Shifren et al,, 1996; Guidi et al., 1996; Donnez et al.,

1998). Předpokládá se, že nadměrná exprese VEGF hraje patogenní úlohu při vzniku cévní hypermeability při ovariálním hyperstimulačním syndromu (McCIure et al., 1994; Levin et al., 1998) a preeklampsii (Baker et al., 1995; Sharkey et al., 1996). Dále, VEGF se považuje za faktor permeability odpovědný za produkci ascitu asociovaného s karcinomem ovaria a jinými nádory (Senger et al., 1983; Boocock et al., 1995). Činidla, která účinně neutralizují biologické účinky

VEGF, mohou mít terapeutický přínos u výše uvedených a podobných stavů.

Angiogeneze a cévní přestavba jsou také charakteristikami implantace blastocyty a vývoje placenty (Findlay, 1986). VEGF je silně exprimován jak vmatemální lamina decidua, tak v embryonálním trofoblastu, kde se předpokládá, že nejprve stimuluje expanzi a hypermeabilitu cévní vaskulatury během periimplantačního období, a potom zprostředkuje tvorbu mateřských a embryonálních složek placentámí vaskulatury (Schweiki et al., 1993; Cullinan-Bove and Koos, 1993; Chakraborty et al., 1995; Das et al., 1997). VEGF je také nutný pro luteální angiogenezi as ní spojenou sekrecí progesteronu nutnou pro přípravu dělohy pro implantaci (Ferrara et al., 1998). Proto mohou být činidla inhibující biologické účinky VEGF použitelná jako antikoncepční činidla (tím, že brání implantaci), nebo jako činidla způsobující potraty včasných stadiích gestace. Druhé uvedené použití může být zejména významné při nechirurgickém ukončení ektopických těhotenství.

Ačkoliv je exprese VEGF receptorů omezena zejména na cévní endotel v normální reprodukční tkáni, je Fltl exprimován také trofoblasty v placentě jak lidí, tak jiných zvířat (Clark et al., 1996;

-31 CZ 302689 B6

He et al., 1999), kde se předpokládá, že se podílí na invazi trofoblastu. Zajímavé je, že jak Fltl, tak KDR (Fikl) jsou exprimovány cfioriokarcinomovou buněčnou linií BeWo (Charnock-Jones et al., 1994), a bylo prokázáno, že VEGF podporuje syntézu DNA a fosforylaci tyrosinu MAP kinázy v těchto buňkách. Dále, metastazující ovariální karcinomy nejen exprimují vysoké koncentrace VEGF, ale-kromě cévního endotelu - nádorové buňky samy exprimují KDR a/nebo Fltl (Boocock et al., 1995). Tato zjištění naznačují, že VEGF se může nejen zásadně podílet na tvorbě a udržování cévní vaskulatury, ale že alespoň u některých nádorů může mít VEGF samotný autokrinní úlohu a může přímo podporovat přežívání a proliferaci nádorových buněk. Proto mohou mít činidla blokující účinky VEGF zejména výhodné účinky při léčbě nádorů reprodukčních orgánů.

Metody a výsledky (a) Hodnocení děložní hypermeability indukované VEGF

Sérový gonadotropin březích klisen (PMSG) se podkožní injekcí (5 IU) aplikoval za účelem indukce ovulace u prepubertálních krysích samic. Toto vedlo k vzestupu estradiolu po 2 dnech, což nakonec způsobilo indukci VEGF v děloze. Je popsáno, že tato indukce vede k hypermeabilitě dělohy a zvyšuje hmotnost dělohy o 6 hodin později a tento účinek může být potenciálně blokován modifikovanými Fit receptory Fltl(l-3>-Fc (A40), FltlD2.FiklD3.Fc Cl (a) a Fltl D2.VEGFR3D3.Fc Cl (a). V tomto modelu in vivo je normální hmotnost krysí dělohy přibližně 50 mg a PMSG může indukovat zvýšení hmotnosti na 350 mg. Sušením tkáně se ukáže, že toto navýšení hmotnosti je způsobeno zcela vodou. Podkožní injekce Fltl(l-3)-Fc FltID2.FlklD3.FcCl (a) a FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a) v dávce 25 mg/kg za 1 hodinu po injekci PMSG vede k přibližně 50% inhibici zvýšení hmotnosti dělohy. Zvýšení dávky modifikovaných Fit receptorů dále neredukuje zvýšení dělohy, což naznačuje, že v tomto modelu existuje složka nezávislá na VEGF. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 41.

(b) Hodnocení angiogeneze v corpus luteum za použití progesteronu jako sledované hodnoty

Sérový gonadotropin březích klisen (PMSG) se podkožní injekcí (5 IU) aplikoval za účelem indukce ovulace u prepubertálních krysích samic. Ί oto vedlo po 4 dnech k vzniku plně funkčního corpus luteum obsahujícího hustou síť cév. která umožňovala sekreci progesteronu do krevního řečiště za účelem přípravy dělohy pro implantaci. Indukce angiogeneze v corpus luteum vyžaduje VEGF; blokování VEGF tedy povede k chybění nových krevních cév a tak k nedostatku progesteronu secemovaného do krevního řečiště. V tomto modelu in vivo jsou klidové hladiny progesteronu přibližně 5 ng/ml a pomocí PMSG mohou být indukovány hodnoty 25 až 40 ng/ml. Podkožní injekce Fit 1 (l—3)—Ec (A40) nebo Fltl D2.FlklD3.Fc Cl (a) v dávce 25 mg/kg nebo 5 mg/kg 1 hodinu po injekci PMSG vede ke kompletní inhibici indukce progesteronu v den 4. Výsledky tohoto pokusu jsou uvedeny na obr. 42 A až 42B.

Příklad 33: Farmakokinetícké analýzy Fit 1 (1 -3)-Fc a pegylovaného Elt 1 (I —3)—Fc

Fit I(1 -3)-Fc byl pegylován buď pomocí 10 kD PEG. nebo 20 kD PEG, a byl testován na Balb/c myších pro zjištění jeho farmakokinetickcho profilu. Bylo zjištěno, že obě pegylované formy Fltl( l—3)-Fc mají mnohem lepší farmakokinetícké profily než Fltl(1-3)-Fc (A40), sT_max ve 24 hodinách pro pegylované molekuly oproti 6 hodinám pro Fit 1 (1—3)—Fc (A40).

Příklad 34: VF.GF165 ELISA pro testování afinity modifikovaných variant Fltl receptorů pM VEGF 165 sc inkubovalo přes noc při teplotě místnosti s modifikovanými variantami Fltl receptoru v koncentracích od 160 do OJ pM. Modifikovanými variantami l iti receptorů použitými v tomto pokusu byly Fltl(l-3)-Fc. Fit 1 (1 —3)—Fc (A40), dočasně exprimovaný Flt1D2.- 32 CZ 302689 B6

FlklD3.Fc Cl (a), dočasně exprimovaný FltlD2.VEGFR3D3.Fc Cl (a), Fltl(l-3_NAs)*Fc. Fit i (1-3r_>c)-Fc a Tie2-Fc. Fit 1(1 —3_Nas)—Fc je modifikovanou verzí Fit 1 (1-3)-Fc, ve které je vysoce bazická aminokyselinová sekvence KNKRASVRRR nahrazena sekvencí NASVNGSR, což vede k inkorporaci dvou nových glykosylačních míst a k redukci pěti pozitivních nábojů, oboje s cílem snížení nežádoucích vlivů této sekvence na farmakokinetiku. Fltl(l-3_R__>cf-Fc je modifikací, ve které je jeden argininový (R) zbytek ve stejné bazické aminokyselinové sekvenci změněn na cystein (C) (KNKRASVRRR-> KNKCASVRRR) pro umožnění pegylace na tomto zbytku, která může potom odstínit bazický region tak, že nemůže vykazovat nežádoucí účinky na farmakokinetiku. Po inkubaci se roztok přenese na plotnu obsahující zachycovací protilátku pro io VEGF 165 (RandD). Množství volného VEGF165 se potom určí za použití protilátky pro zobrazení volného VEGF 165, Toto ukazuje, že modifikovanou variantou Fltl receptoru s nejvyšší afinitou pro VEGF165 (podle nejnižšího množství volného VEGF165) byla Fltl D2.Fikl D3.Fc Cl (a), potom Fltl(l-3)-Fc a Fltl(l-3)-Fc (A40) a potom Fltl(l-3_R_>_c)~Fc, Fltl(1-3_NAS>· Fc a

FltlD2.VEGFR3D3,Fc Cl (a). Tie2-Fc neměl žádnou afinitu pro VEGF165.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Izolovaná molekula nukleové kyseliny, která obsahuje:

(a) nukleotidovou sekvenci kódující receptorovou složku cévního endotelového růstového fak25 toru (VEGF) skládající se v podstatě z imunoglobulinu podobné (Ig) domény 2 prvního VEGF receptoru a Ig domény 3 druhého VEGF receptoru, a (b) nukleotidovou sekvenci kódující multimer izační složku,

30 kde prvním VEGF receptorem je Fit 1 a druhým VEGF receptorem je Flk 1 nebo Fit 4 a VEGF receptorová složka je jediná VEGF receptorová složka fúzního polypeptidu.

2. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde nukleotidová sekvence kódující Ig doménu 2 extracelulámí domény prvního VEGF receptoru je před nukleotidovou sekvencí

35 kódující lg doménu 3 extracelulámí domény druhého VEGF receptoru.

3. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde nukleotidová sekvence kódující Ig doménu 2 extracelulámí domény prvního VEGF receptoru je za nukleotidovou sekvencí kódující Ig doménu 3 extracelulámí domény druhého VEGF receptoru.

4. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle jakéhokoli z předcházejících nároků, kde multimerizační složka obsahuje imunoglobulinovou doménu.

5. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 4, kde imunoglobulinová doména je 45 vybraná ze skupiny zahrnující Fc doménu IgG a těžký řetězec IgG.

6. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku I, obsahující nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující:

50 (a) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 21A až 21C, (b) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 22A až 22C, (c) nukleotidové sekvence uvedené na obr. 24A až 24C, a 55

-33 CZ 302689 B6 (d) nukleotidové sekvence, která se v důsledku degenerace genetického kódu liší od nukleotidové sekvence (a), (b) nebo (c).

7. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 1, kde složky fúzního polypeptidu jsou uspořádány jako 1,2,3; 1,3,2; 2,1,3; 2,3,1; 3,1,2; nebo 3,2,1, kde 1 je první VEGF receptorové složka, 2 je druhá VEGF receptorové složka a 3 je multimerizační složka.

8. Fúzní polypeptid kódovaný izolovanou molekulou nukleové kyseliny podle jakéhokoli z předcházejících nároků.

9. Vektor, který obsahuje molekulu nukleové kyseliny podle jakéhokoli z nároků 1 až 7.

10. Expresní vektor obsahující molekulu nukleové kyseliny podle jakéhokoli z nároků 1 až 7, kde molekula nukleové kyseliny je operativně navázaná na sekvenci řídící expresi.

11. Systém vektor-hostitel pro produkci fúzního polypeptidu, vyznačující se tím, že obsahuje expresní vektor podle nároku 10, ve vhodné hostitelské buňce.

12. Systém hostitel-vektor podle nároku 11, vyznačující se tím, že vhodnou hostitelskou buňkou je bakteriální buňka, buňka kvasinky, hmyzí buňka nebo savčí buňka.

13. Systém hostitel-vektor podle nároku 12, vyznačující se tím, že vhodnou hostitelskou buňkou je E. coli nebo CHO buňka.

14. Způsob přípravy fúzního polypeptidu, vyznačující se tím, že zahrnuje růstové buňky systému vektor-hostitel podle jekéhokoli z nároků 11 až 13 za podmínek umožňujících produkci fúzního polypeptidu a odběr takto produkovaného fúzního polypeptidu.

15. Antagonista dimerního cévního endotelového růstového faktoru (VEGF), obsahující dva fúzní polypeptidy, přičemž každý fúzní polypeptid obsahuje;

(a) VEGF receptorovou složku obsahující v podstatě imunoglobulinu podobnou (Ig) doménu 2 VEGF receptoru Fit 1 a lg doménu 3 VEGF receptoru Flk 1 a Fit 4 a (b) multimerizační složku, kde VEGF receptorovou složkou je jediný VEGF receptor každého fúzního proteinu.

16. Díměrní antagonista podle nároku 15, který je modifikován acetylací nebo pegylací.

17. Fúzní polypeptid, který obsahuje;

(a) VEGF receptorovou složku skládající se v podstatě z imunoglobulinu podobné (Ig) domény 2 Fit 1 VEGF receptoru a lg domény 3FlklaFlk4VEGF receptoru a (b) multimerizační složku, kde VEGF receptorovou složkou je jediná VEGF receptorová složka ve fúzním polypeptidu.

18. Fúzní polypeptid podle nároku 17. kde multimerizační složka obsahuje imunoglobulinovou doménu.

19. Fúzní polypeptid podle nároku 18, kde imunoglobulinová doména je vybrána zc skupiny zahrnující Fe doménu IgG a těžký řetězec IgG.

-34CZ 302689 B6

20. Fúzní polypeptid podle nároku 19, který obsahuje aminokyselinovou sekvenci uvedenou na obr. 21A až 21C, obr. 22A až 22C nebo obr. 24A až 24C.

5 21. Použití fúzního polypeptidu podle jakéhokoli z nároků 17 až 20 nebo dimerního antagonisty podle jakéhokoli z nároků 15 nebo 16 pro výrobu léčiva pro použití pro zmírňování nebo prevenci růstu nádorů, zmírňování nebo prevencí edému, zmírňování nebo prevenci vzniku ascitu. pro snižování nebo inhibici úniku plasmy nebo pro blokování růstu krevních cév u člověka.