BR112014013205A2

BR112014013205A2 - proteína de fusão, seu uso e seu método de produção, composição farmacêutica, ácido nucleico, e kit

Info

Publication number: BR112014013205A2
Application number: BR112014013205-4A
Authority: BR
Inventors: Jeng-Horng Her; Huang-Tsu Chen
Original assignee: Protevobio, Inc.; Innovent Biologics, Inc.
Priority date: 2011-12-01
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2020-10-27
Also published as: US20150079084A1; JP6138815B2; EP2785744A4; US11518984B2; ES2651521T3; CN104159926B; EP2785744A1; CA2857168A1; WO2013082563A8; US9988611B2; CA2857168C; AU2012318288A1; AU2012318288B2; US20180312819A1; DK2785744T3; CN110078831A; CN104159926A; WO2013082563A1; EP2785744B1; JP2015500811A

Abstract

proteína de fusão, seu uso e seu método de produção, composição farmacêutica, ácido nucleico, e kit. a presente invenção se refere às proteínas de fusão biespecíficas que inibem a ativação da via do complemento e fator de crescimento endotelial vascular (vegf), via e métodos para o uso destas proteínas de fusão.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROTE- ÍNA DE FUSÃO, SEU USO E SEU MÉTODO DE PRODUÇÃO, COM- POSIÇÃO FARMACÊUTICA, ÁCIDO NUCLEICO, E KIT". REFERÊNCIA CRUZADA AOS PEDIDOS DE PATENTE RELACIO-

NADOS

[001] Este pedido de Patente reivindica o benefício de prioridade de Pedido de Patente Provisório U.S. número de série 61 / 629, 932, depositado em 1 de dezembro de 2011, que é incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

CAMPO DA PRESENTE INVENÇÃO

[002] A presente invenção se refere a proteínas de fusão biespe- cíficas que inibem a ativação da via do complemento e a via do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), as composições que com- preendem estas proteínas de fusão, bem como os métodos para pro- duzir e utilizar a mesma.

ANTECEDENTES DA PRESENTE INVENÇÃO

[003] O sistema de complemento é um efetor funcional do siste- ma imune inato que consiste em uma série de proteínas do plasma e proteínas de membrana celular. A ativação do complemento conduz a uma série de libertação do desencadeamento em cascata da ativação da protease de citocinas e de amplificação da cascata de ativação. O resultado final da ativação do complemento é a ativação do complexo de ataque à membrana de morte celular (MAC), inflamação causada por meio da anafilatoxinas C3a e C5a, e opsonização de organismos patogênicos. O MAC é essencial para eliminar os patógenos invasores e danificado, necrose e apoptose.

[004] Um delicado equilíbrio entre a defesa contra o patógeno e evitar o excesso de inflamação tem de ser alcançado por meio do sis- tema de complemento (Ricklin, D., et al., (2007) Nature Biotechnology, (11): 1265 a 1275). Muitas doenças inflamatórias, autoimunes,

neurodegenerativas e infecciosas têm sido mostrados para serem as- sociadas com a atividade do complemento em excesso. Por exemplo, a patogênese devido a lesão de isquemia / reperfusão (| / R) indicou que a ativação do complemento leva ao dano induzido por meio da inflamação em uma série de doenças, incluindo o Infarto Agudo do Mi- ocárdio (AMI), derrame, choque Hemorrágico e séptico, e complicação de cirurgia de revascularização do miocárdio (CABG) (Markiewski, MM, et al., (2007) Am. J. Pathol 171 : 715 a 727). (Manderson, AP, et al., (2004 Y) Annu Rev. Immunol 22 : 431 a 456) Além disso, a ativação do complemento é um contribuinte principal para uma série de doen- ças autoimunes, incluindo lúpus eritematoso, artrite reumatoide (RA), psoríase e asma (.. Guo, RF, et al., (2005) Annu Rev. Immunol 23 : 821 a 852.). A ativação do complemento também tem sido associada com a patologia da doença de Alzheimer (Bonifati, DM, et al., (2007) Mol Immunol 44 : 999 a 1010) e outras doenças neurodegenerativas, tais como doença de Huntington, doença de Parkinson, e degeneração macular relacionada com a idade (AMD) (Gehrs, KM, (2010) Arch Oph- thalmol, 128 (3) . 249 a 258).

[005] O sistema do complemento pode ser ativado através de três caminhos diferentes : a via clássica, a via alternativa e a via da lectina. Todas as três vias passam por meio de complexos de protease críticos de C3 - convertase e C5 - convertase que clivam os compo- nentes do complemento C3 e C5, respectivamente. A via clássica é iniciada por meio da ligação de Ciq de anticorpos IgM ou IgG que conduz à ativação do complexo C1, que cliva os componentes do complemento C2 e C4, produzindo C2a, C2b, C4a e C4b. C4b e C2b forma então a via de C3 - convertase clássica, que promove a cliva- gem do C3 em C3a e C3b. C3b forma então a C5 - convertase por meio da ligação a C4bC2b (a C3 - convertase). A via da lectina é idên- tica à da via clássica jusante da C3 - convertase, e é ativada por meio da ligação de lectina de ligação a manose (MBL) para os resíduos de manose na superfície do patógeno. A serina - proteases associada a MBL MASP - 1 e MASP - 2 pode então clivar C4 e C2 para formar a C3 - convertase da mesma como na via clássica. Ao contrário das vias clássicas e de lectina que são respostas imunitárias específicas que requerem antígenos, a via alternativa é uma resposta imune não espe- cífica que é continuamente ativa a um nível baixo. Espontaneamente a hidrólise de C3 leva a C3a e C3b. C3b pode ligar fator B e, em segui- da, a clivagem do Fator B a Ba e Bb com o auxílio do fator D. O com- plexo C3bBb que pode ser estabilizada através da ligação do fator P (properdina) é a C3 - convertase da via alternativa que cliva C3 em C3a e C3b. C3b pode se juntar ao complexo C3bBb para formar o complexo C3bBbC3b que é a C5- convertase da via alternativa. As C5 convertases de todas as três vias podem clivar C5 a C5a e C5b. C5b então recruta e monta C6, C7, C7, C8 e as várias moléculas C9 para montar o MAC. Isto cria um orifício ou poro na membrana que pode matar ou danificar o patogénio ou célula. O sistema complemento é estreitamente regulado por meio de dois mecanismos : o decaimento de aceleração da atividade (DAA) e atividade de cofator (CA). DAA refere-se à capacidade de promover a dissociação da C3 - convertase ou C5 - convertase. CA refere-se à capacidade de facilitar o fator | pa- ra clivar C3b ou C4b para fragmentos inativos. Para uma revisão do sistema de complemento vide Wagner, E., et al., (2010), Nat. Rev. Fármaco Discov, 9 (1) : 43 a 56.

[006] Os receptores de complemento humano do tipo 1 (CRI) é o único regulador do complemento, que tem DAA para as convertases C3 tanto clássica quanto alternativa e C5 convertase e CA para C3b e C4b, e, por conseguinte, tem gerado interesse em aplicações terapêu- ticas (Krych - Goldberg, M., et al., (2001), Inmunological Reviews, 180 : 112 a 122). Um CR1 humano solúvel que ocorre naturalmente (s-

CR1) faltando a transmembrana e o domínio intracelular tem sido mos- trado para inibir o sistema do complemento in vitro e vários estudos in vivo com animais (Mollnes, TE, et al., (2006), Molecular Immunology, 43 : 107 a 121). SCR1 também foi testado em ensaios clínicos em se- res humanos para reduzir os danos nos tecidos em infarto do miocár- dio (Perry, GJ, et al., (1998), J. Am. Coll Cardiol, 31 : 1h 41), síndrome da angústia respiratória adulta (Zimmerman, JL, et al., (2000), Crit Ca- re Med, 28 (9) : 3149 a 3154), e o transplante de pulmão (Zamora, MR, et al., (1999), Chest, 116 : 46s). Verificou-se segurança, não imunoge- nicidade, e eficácia em termos de inibição da atividade do complemen- to in vivo. No entanto, a estrutura molecular torna difícil produzir SCR1 como um agente terapêutico. A mutagênese de deleção identificou que os primeiros três SCRs (SCR1 - 3) eram suficientes para transmitir a DAA para as convertases C3, mas não a da CA para C3b e C4b (Kry- ch - Goldberg, M., (1999), J. Bio. Chem., 274 (44) : 31160 a 31168). Semelhante a CR1, as proteínas reguladoras do complemento DAF, MCP, o Fator H e C4BP contêm uma série de SCR, onde os locais de ligação de C3b ou C4b e os locais ativos de inibição do complemento foram mapeados (Makrides SC, (1998), Pharmacological Reviews, 50 (1) : 59 a 87). As formas solúveis de MCP, DAF, e Protectina têm sido produzidas e mostraram ser eficazes para inibir o complemento in vitro e vários modelos animais (Wagner, E., et al.., (2010), Nat. Rev. Drug Discov., 9 (1) : 48 a 56). No entanto, eles têm relativamente baixas po- tências e curta meia-vida in vivo.

[007] O fator de crescimento endotelial vascular (VEGF) é uma das proteínas mais importantes que promovem a angiogênese, o que é um processo fortemente regulado de desenvolvimento de novos va- sos sanguíneos a partir de uma rede vascular preexistente (Ferrara, N., (2004), Endocrine Reviews, 25 (4) : 581 a 611). A angiogênese é necessária durante o desenvolvimento e os processos fisiológicos normais, tais como cura de feridas, e também está envolvida na pato- gênese de uma série de doenças, incluindo a AMD, RA, a retinopatia diabética, o crescimento de tumores e a metástase. A inibição da an- giogênese foi demonstrada ser eficaz em aplicações terapêuticas.

[008] A via de VEGF e a via de complemento contribuem para a formação de doenças com etiologias semelhantes. Portanto, existe uma necessidade para o desenvolvimento de agentes terapêuticos que têm como alvo tanto a via de VEGF quanto a via do complemento. São proporcionadas na presente invenção as proteínas de fusão, que inibem a ativação de ambas as vias do complemento e da via VEGF. As proteínas de fusão da presente invenção podem ser utilizadas co- mo agente terapêutico para a utilização no tratamento de complemen- to e doenças relacionadas com VEGF.

BREVE SUMÁRIO DA PRESENTE INVENÇÃO

[009] A presente invenção descreve, inter alia, uma proteína de fusão compreendendo um domínio de inibição do complemento (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio que prolonga a meia - vida, as composições compreendendo as proteínas de fusão, os métodos de fazer a fusão de proteínas, e os métodos de utilização destas proteínas de fusão para inibição da ativação do complemento e da via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF).

[0010] Em conformidade, em um aspecto, a presente invenção proporciona uma proteína de fusão compreendendo um domínio de inibição do complemento (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio que prolonga a meia - vida, em que a proteína de fusão inibe a ativação do complemento e a via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). Em uma modalidade, CID compreende pelo menos uma repetição curta de consenso (SCR) de uma proteína reguladora de complemento humano selecionada a partir do grupo que consiste em CR1, o Fator H, C4 - BP, DAF e MCP.

Em uma outra modalidade, CID compreende uma sequência de ami- noácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 1a6e13a16, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 1a 6 e 13 a 16. Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, VID compre- ende uma porção do domínio extracelular de um receptor de VEGF humano.

Em uma modalidade, VID compreende uma imunoglobulina (lg) do domínio 2 de VEGFR - 1 humano e domínio do tipo lg 3 de VEGFR - 2 humano.

Em uma outra modalidade, VID compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 11 ou 38, ou uma sequên- cia de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO :. 11 ou 38 Em qualquer uma das modalidades na presente invenção, o domínio que prolonga a se- mivida compreende uma região Fe de imunoglobulina.

Em uma moda- lidade, a região Fc é uma Fc humana de IgG1, I9gG2, I9gG3, ou I9G4. Em uma outra modalidade, a região Fc compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 7, 39, 41 e 42, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos selecio- nada de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO : 7., 39, 41 e 42 Em qualquer uma das modalidades descritas na presente invenção, a proteína de fusão compreende ainda um ligante de peptídeo entre do- mínios.

Em uma modalidade, o ligante peptídeo compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO : 8 ou uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 8. Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, as proteínas de fusão compreendem os refe- ridos VID, CID, e Fc a partir de Terminal N para Terminal C, em uma ordem selecionada a partir do grupo que consiste em (1) VID, Fc, CID ; (2) CID, Fc, VID ; (3) CID, VID, Fc ; (4) VID, CID, Fc ; (5) Fc, VID, CID ; e (6) Fc, CID, VID.

[0011] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona uma proteína de fusão que compreende, a partir do Terminal N para o Ter- minal C, um domínio de inibição do VEGF (VID), uma região Fc de i- munoglobulina, e um domínio de inibição do complemento (CID), em que a proteína de fusão inibe a ativação do complemento e a via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). Em uma modalidade, CID compreende uma sequência de aminoáci- dos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQIDNO : 1a 6 e 13 a 16, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 1 a 6 é 13 a 16. Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, VID compreende uma porção do domínio extracelular de um receptor de VEGF humano. Em uma modalidade, VID compreende uma imunoglobulina (lg) do domí- nio 2 de VEGFR - 1 humano e domínio do tipo lg 3 de VEGFR - 2 hu- mano. Em uma outra modalidade, o VID compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 11 ou 38, ou uma sequência de aminoá- cidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO :. 11 ou 38. Em qualquer uma das modalida- des na presente invenção, a região Fc é uma Fc humana de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Em uma modalidade, a região Fc compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 7, 39, 41 e 42, ou uma sequência de ami- noácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 7, 39, 41 e 42. Em qualquer uma das modalidades descritas na presente invenção, a proteína de fusão compreende ainda um ligante de peptídeo entre os domínios. Em uma modalidade, o agente de liga- ção peptídico está entre a região Fe e CID. Em uma outra modalidade, o ligante peptídeo compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 8 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 8. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende a sequência de a- minoácido selecionada de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo me- nos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40.

[0012] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteí- na de fusão produzida por meio da cultura de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica toda a proteína de fu- são descrita na presente invenção sob uma condição que produz a proteína de fusão, e a recuperação da proteína de fusão produzida por meio das células do hospedeiro. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende a sequência de aminoácido selecionado de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO : 12., 33 a 37 e 40 Em uma outra modalidade, a prote- Ína de fusão compreende ainda um peptídeo de sinal no seu Terminal N que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 9, 10 e 43. Em uma outra modalidade, a proteína de fusão produzida por meio da célula hospe- deira recuperado pode compreender um peptídeo de sinal que é cliva- do parcialmente no Terminal N. Em uma modalidade, a célula hospe- deira é uma célula de mamífero. Em uma outra modalidade, a célula de mamífero é uma célula CHO.

[0013] Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma proteí-

na de fusão dimérica (por exemplo, uma proteína de fusão dimérica de Fc) que compreende duas proteínas de fusão, em que cada proteína de fusão compreende qualquer proteína de fusão descrita na presente invenção. Em uma modalidade, a proteína de fusão dimérica compre- ende duas proteínas de fusão idênticas. Em uma outra modalidade, a proteína de fusão dimérica compreende duas proteínas de fusão dife- rentes. Em uma outra modalidade, a proteína de fusão dimérica com- preende pelo menos uma proteína de fusão compreendendo a se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de amino- ácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12,33 a 37 e 40.

[0014] Em um aspecto, a presente invenção também proporciona as composições compreendendo qualquer proteína de fusão descrita na presente invenção e um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende a sequência de a- minoácido selecionado de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo me- nos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO : 12. 33 a 37 e 40 Em uma modalidade, a proteína de fusão é uma forma dimérica. Em outra modalidade, a proteína de fusão dimérica compreende duas proteínas de fusão idênticas. Em uma outra modalidade adicional, a proteína de fusão dimérica compreende duas proteínas de fusão diferentes. Em uma outra modalidade adicional, a proteína de fusão dimérica, com- preende pelo menos uma proteína de fusão compreendendo a se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de amino-

ácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12,33 a 37 e 40.

[0015] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um á- cido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas de fusão descri- tas na presente invenção. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica para uma proteína de fusão compreende um domínio de inibi- ção do complemento (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio que prolonga a meia - vida, em que a proteína de fusão inibe a ativação do complemento e a via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica para um CID que compreende, pelo me- nos, uma repetição curta de consenso (SCR) de uma proteína regula- dora de complemento humano selecionado a partir do grupo que con- siste em CR1, o Fator H, C4 - BP, DAF e MCP. Em uma outra modali- dade, o ácido nucleico que codifica para um CID que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 1a 6 e13a16, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com um aminoácido sequência selecionada a partir do grupo que consiste em SEQIDNO : 1a 6 e 13 a 16. Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, o ácido nucleico que codifica para um VID compreende uma porção do domínio extracelular de um receptor de VEGF humano. Em uma mo- dalidade, o ácido nucleico que codifica para um VID compreende uma imunoglobulina (Ig) do domínio 2 de VEGFR - 1 humano e domínio do tipo lg 3 de VEGFR - 2 humano. Em uma outra modalidade, o ácido nucleico que codifica para um VID compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 11 ou 38, ou uma sequência de aminoá- cidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de ami- noácidos da SEQ ID NO : 11 ou 38. Em qualquer uma das modalida- des desta presente invenção, o ácido nucleico que codifica para um domínio que prolonga a semivida compreende uma região Fe de imu- noglobulina. Em uma modalidade, o ácido nucleico que codifica para uma região Fc compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 7, 39, 41 e 42, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácido selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 7, 39, 41 e 42. Em qualquer uma das mo- dalidades desta presente invenção, o ácido nucleico codifica mais um ligante peptídico compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 8 ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 8. Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, o ácido nu- cleico que codifica para uma proteína de fusão compreende a sequên- cia de aminoácido selecionado de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos sele- cionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12,33 a 37 e

40.

[0016] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um ve- tor que compreende um ácido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas de fusão descritas na presente invenção. Em uma modalida- de, a proteína de fusão compreende um domínio de inibição do com- plemento (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio que prolonga a meia - vida, em que a proteína de fusão inibe a ativa- ção do complemento e a via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, o vetor compreende qualquer um dos ácidos nucleicos descritos na presente invenção que codificam uma proteína de fusão como descrito na presente invenção. Em uma modalidade, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica para uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 12, 33 a 37 e 40 em todos os aspectos, a presente invenção proporciona uma célula hospedeira compreende qualquer um dos ácidos nucleicos descritos na presente invenção, que codificam uma proteína de fusão como descrito na presente invenção. Em uma modalidade, a célula hospedeira compreende um ácido nucle- ico que codifica para uma proteína de fusão compreendendo a se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoáci- dos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de amino- ácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12,33 a 37 e 40.

[0017] Em ainda outro aspecto, a presente invenção proporciona um método de produção de uma proteína de fusão que compreende a cultura de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica qualquer uma das proteínas de fusão descritas na presen- te invenção sob uma condição que produz a proteína de fusão, e a re- cuperação da proteína de fusão produzida por meio da célula hospe- deira. Em uma modalidade, a proteína de fusão é recuperada a partir do meio de cultura celular e purificado. Em uma outra modalidade, a célula hospedeira é uma célula de mamífero ou uma célula de levedu- ra. Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, a pro- teína de fusão é recuperada em um dímero. Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, a proteína de fusão é recupe- rada a partir de uma proteína de fusão parcialmente clivada, tal como descrito na presente invenção.

[0018] Em outro aspecto, a presente invenção proporciona um mé-

todo de tratamento de um indivíduo com uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença ocular ou do câncer, compreen- dendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz de qualquer uma das proteínas de fusão descritas na presente invenção. Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende um domínio de inibição do complemento (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio que prolonga a meia - vida, em que a proteína de fusão inibe a ativação do complemento e a via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende a sequência de aminoácido selecio- nada de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12,33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de iden- tidade com a sequência de aminoácidos selecionada de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO : 12., 33 a 37 e 40 Em uma modalidade, o indivíduo tem a artrite reumatoide, a psoríase, a degeneração macu- lar, a retinopatia diabética, a oclusão da veia retinal central, ou trans- plante de córnea. Em uma outra modalidade, a degenerescência ma- cular é a degeneração macular relacionada com a idade molhada ou a degeneração macular relacionada com a idade seca. Em uma modali- dade, o indivíduo tem câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão, câncer de rim, câncer gástrico, câncer de ovário, ou retino- blastoma. Em uma outra modalidade, o método compreende ainda a administração de um segundo agente terapêutico para o tratamento da doença.

[0019] Em um aspecto adicional, a presente invenção proporciona um kit que compreende qualquer uma das proteínas de fusão descritas na presente invenção. Em uma modalidade, a proteína de fusão com- preende um domínio de inibição do complemento (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio que prolonga a meia - vida, em que a proteína de fusão inibe a ativação do complemento e a via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). Em uma modalidade, a proteína de fusão compreende a se- quência de aminoácido selecionada de entre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de aminoáci- dos selecionada de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO : 12, 33 a 37 e 40 em uma modalidade, o kit compreende ainda um folheto informativo que compreende as instruções para a utilização da proteí- na de fusão para o tratamento de uma doença inflamatória, uma doen- ça autoimune, uma doença ocular ou câncer em um indivíduo.

[0020] É para ser compreendido que uma, algumas, ou todas as propriedades das diferentes modalidades descritas na presente inven- ção podem ser combinadas para formar outras modalidades da pre- sente invenção. Estes e outros aspectos da presente invenção serão evidentes para uma pessoa que seja versada na técnica.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[0021] A Figura 1 apresenta os desenhos esquemáticos das pro- teínas de fusão. A) proteínas anticomplemento (ACPs), ACP - 1 e ACP- 10. CID -WT é CR1 SCR1 -3 humano do tipo selvagem ; CID - KN é variante de CR1 SCR1 - 3 N29K / D109N humana ; CID - YD é variante de CR1 SCR1-3 S37Y / G79D humana ; CID - KYDN é vari- ante humana CR1 SCR1-3 N29K / S37Y / G79D / D109N, CID -NT é CR1 SCR8 -10 humano do tipo selvagem ; e Fc, a região Fc da I9G1 humana. B) As proteínas biespecíficos anticomplementares / VEGF (ACVPs), ACVP - 1 para ACVP - 6. CID é variante de CR1 SCR1- 3 N29K humano / S37Y / G79D / D109N ; VID é a fusão do domínio do tipo Ig 2de VEGFR1 e o domínio do tipo lg 3 de VEGFR2 ;eFc,a região Fc da IgG1 humana.

[0022] A Figura 2 mostra os géis de SDS - PAGE de proteínas de fusão purificadas. A) As proteínas de fusão purificadas ACP - 10 (fai-

xa1), ACP - 9 (faixa 2), ACP - 8 (faixa 3), ACP - 7 (faixa 4) e ACP -6 (faixa 5). B) proteína de fusão purificada ACVP - 1, sob condições não redutoras (faixa 1) e redutoras (faixa 3) ; e proteína de fusão purificada ACP - 9, sob condições não redutoras (faixa 2) e redutoras (faixa 4).

[0023] A Figura 3 é uma série de gráficos que demonstram a inibi- ção da via do complemento por meio da fusão proteínas ACP. A) À inibição da via clássica do complemento em eritrócitos de carneiro sensibilizado com anticorpos de várias concentrações de proteínas de fusão ACP - 6, ACP -7, ACP - 9€ ACP - 10. B) A inibição da via alter- nativa do complemento em eritrócitos de coelho por meio de várias concentrações de proteínas de fusão ACP -6, ACP -7, ACP -9 e ACP -

10. Fc Log [ nM ] é concentração log da proteína de fusão indicada (nM).

[0024] A Figura 4 é uma série de gráficos que demonstram a liga- ção in vitro de um VEGF por meio das proteínas de fusão tal como de- tectado por ELISA. A) a ligação direta in vitro de VEGF mobilizado por ACVP - 1. B) A ligação in vitro do VEGF solúvel por ACVP - 1. CJ) À ligação in vitro de VEGF por ACVP -1, VID, ou Avastin.

[0025] A Figura 5 é uma série de gráficos que demonstram a inibi- ção da via do complemento por meio da fusão proteínas ACVPs. A) À inibição da via clássica do complemento em eritrócitos de carneiro sensibilizados com anticorpos de várias concentrações de proteína de fusão ACVP - 1. B) Inibição da via alternativa do complemento em eri- trócitos de coelho por meio das várias concentrações da proteína de fusão ACVP - 1. Fc Log [ nM ] é concentração log da proteína de fusão indicada (nM).

[0026] A Figura 6 é um gráfico que demonstra a inibição da proli- feração induzida por VEGF de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) por, VID, ou proteínas de fusão CID ACVP - 1. To- dos os ensaios foram realizados em triplicado. ** p < 0,01 quando comparados com o controle de DMEM + VEGF.

[0027] A Figura 7 é um western blot que demonstra a inibição de ativação da via VEGFR2 por meio das proteínas de fusão ACVP - 1, VID, ou CID.

[0028] A Figura 8 é uma série de fotografias de olhos de um mo- delo de macaco CNV induzido por laser. Vinte e um dias após a foto- coagulação a laser com diodo 532 nm foi entregue em torno da mácu- la, os macacos foram injetados intra-vitrealmente com a) um veículo controle (PBS) ; B) ACVP - 1; C) VID ; ou D) CID nas concentrações indicadas e as fotografias do olho tratado foram feitas 14 dias após a dose, para medir a fuga de local.

DESCRIÇÃO DETALHADA

[0029] A presente invenção proporciona, inter alia, as proteínas de fusão, e as composições dos mesmos, que inibem a via do comple- mento e a via do fator de crescimento endotelial vascular (VEGF). Uma proteína de fusão da presente invenção, tal como descrito na presente invenção compreende um domínio de inibição do comple- mento (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio que prolonga a meia - vida, em que a proteína de fusão inibe a ativa- ção do complemento e a via de sinalização de VEGF (por exemplo, inibição da atividade do VEGF). Também são descritos na presente invenção os métodos para a produção das proteínas de fusão e os métodos de utilização das proteínas de fusão no tratamento de doen- ças autoimunes, doenças relacionadas com o complemento, doenças inflamatórias, doenças oculares, e/ou câncer. |. Técnicas gerais

[0030] As técnicas e os procedimentos descritos ou mencionados são geralmente bem entendidos e vulgarmente empregues utilizando a metodologia convencional por meio das pessoas que são versadas na técnica, tais como, por exemplo, as metodologias amplamente utiliza-

das descritas em Sambrook et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual 3d edition (2001) Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. ; Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Au- subel, et al. eds., (2003)) ; the series Methods in Enzymology (Acade- mic Press, Inc.) : PCR 2: A Practical Approach (M.J. MacPherson, B.D. Hames e G.R. Taylor eds. (1995)), Harlow e Lane, eds. (1988) Antibodies, A Laboratory Manual, and Animal Cell Culture (R.|. Fresh- ney, ed. (1987)) ; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984) ; Methods in Molecular Biology, Humana Press ; Cell Biology : A Labora- tory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press ; Animal Cell Culture (R.l. Freshney), ed., 1987) ; Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press ; Cell and Tissue Culture : Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Nevwell, eds., 1993-8) J. Wiley e Sons ; Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir e C.C. Blackwell, eds.) ; Gene Transfer Vec- tors for Mammalian Cells (J.M. Miller e M.P. Calos, eds., 1987) ; PCR : The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994) ; Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991) ; Short Proto- cols in Molecular Biology (Wiley e Sons, 1999) ; Immunobiology (C.A. Janeway e P. Travers, 1997) ; Antibodies (P. Finch, 1997) ; Antibodies : A Practical Approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989) ; Mono- clonal Antibodies : A Practical Approach (P. Shepherd e C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000) ; Using Antibodies : A Laboratory Ma- nual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999) ; The Antibodies (M. Zanetti e J. D. Capra, eds., Hanvood Aca- demic Publishers, 1995) ; e Cancer : Principles and Practice of Onco- logy (V.T. DeVita et al., eds., J.B. Lippincott Company, 1993).

!l. Definições

[0031] Uma molécula " isolada " (por exemplo, ácido nucleico ou proteína) ou células é uma que foi identificada e separada e/ou recu-

perada de um componente do seu ambiente natural.

[0032] Tal como utilizado na presente invenção, " substancialmen- te puro " refere-se a material que é, pelo menos, 50% puro (isto é, i- sentos de contaminantes), mais preferencialmente pelo menos 90% puro, mais preferencialmente pelo menos 95% puro, mais preferenci- almente pelo menos 98% puro, mais preferencialmente pelo menos 99% puro.

[0033] Um "polipeptídeo de fusão" ou "proteína de fusão" (utilizado na presente invenção indistintamente) refere-se a um polipeptídeo que possui duas ou mais porções ligadas covalentemente, em conjunto, em que cada uma das porções é derivados de proteínas diferentes. As duas ou mais porções podem ser ligadas diretamente por meio de uma única ligação peptídica ou através de um ligante peptídico que contém um ou mais resíduos de aminoácidos. Geralmente, as duas porções e o ligante será na estrutura de leitura uma com a outra e são produzi- das utilizando as técnicas recombinantes.

[0034] A "porcentagem (%) de aminoácidos ou de nucleotídeos de identidade de sequência ", com respeito a um polipeptídeo de referên- cia, ou sequência de ácido nucleico que é definida como a porcenta- gem de resíduos de aminoácidos ou nucleotídeos em uma sequência candidata que são idênticos aos resíduos de aminoácidos ou nucleotí- deos na sequência polipeptídica de referência ou de ácido nucleico, após o alinhamento das sequências e introdução de aberturas, se ne- cessário, para atingir a máxima porcentagem de identidade de se- quência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. O alinhamento para fins de determinação da porcentagem de aminoácido ou identidade de se- quência de ácido nucleico pode ser conseguido por meio de várias formas que estão dentro do conhecimento daqueles que são versados na técnica, por exemplo, utilizando os programas de computador dis-

poníveis publicamente tais como os programas de software BLAST, BLAST - 2, ALIGN ou Megalign (DNASTAR) ou aqueles descritos em Ausubel et al.., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nova lorque, (2009). As pessoas que são versadas na técnica podem determinar os parâmetros adequados para o alinhamento de sequências, incluindo quaisquer algoritmos necessários para conse- guir o alinhamento máximo ao longo do comprimento total das se- quências a ser comparada. Por exemplo, o programa Megalign (DNASTAR) pode criar alinhamentos entre duas ou mais sequências de acordo com métodos diferentes, por exemplo, o método Clustal. Vide, por exemplo, Higgins, D. G. e P. M. afiada. (1988). Gene. 73 : 237 a 244. O algoritmo Clustal agrupa as sequências em agrupamen- tos, examinando as distâncias entre todos os pares. Os agrupamentos estão alinhados aos pares e depois em grupos. A porcentagem de semelhança entre duas sequências de aminoácidos, por exemplo, se- quência de uma sequência e B, é calculada dividindo o comprimento da sequência de A, menos o número de resíduos de abertura na se- quência A, menos o número de resíduos de abertura na sequência B, na soma do resíduo corresponde entre a sequência a e sequência B, vezes cem. As aberturas de baixa ou de nenhuma semelhança entre as duas sequências de aminoácidos não são incluídas na determina- ção percentual de similaridade. A porcentagem de identidade entre as sequências de ácidos nucleicos também podem ser contadas ou cal- culada através de outros métodos conhecidos na técnica, por exemplo, o método de Jotun Hein. Vide, por exemplo, Hein, J. (1990) Methods Enzymol. 183 : 626 a 645.

[0035] O termo "vetor ", como utilizado na presente invenção, refe- re-se a uma molécula de ácido nucleico capaz de propagar um outro ácido nucleico ao qual está ligado. O termo inclui o vetor, tal como uma estrutura de ácido nucleico de autorreplicação, assim como o ve-

tor incorporado no genoma de uma célula hospedeira no qual foi intro- duzido. Determinados vetores são capazes de dirigir a expressão de ácidos nucleicos aos quais estão ligados operacionalmente. Estes ve- tores são referidos na presente invenção como "vetores de expres- são".

[0036] Os termos " célula hospedeira ", " linha celular hospedeira ", e " cultura de células hospedeiras " são utilizados de forma intercambi- ável e referem-se a células nas quais o ácido nucleico exógeno tiver sido introduzido, incluindo a descendência destas células. As células hospedeiras incluem " transformantes " e as " células transformadas" as quais incluem a célula primária transformada e descendência deri- vada a partir da mesma, sem levar em consideração o número de pas- sagens. A descendência pode não ser totalmente idêntica em teor de ácido nucleico para uma célula-mãe, mas pode conter mutações. À descendência mutante que tem a mesma função ou atividade biológica que a pesquisada ou selecionada na célula originalmente transforma- da está incluída na presente invenção.

[0037] Tal como utilizado na presente invenção, " tratamento " ou " tratar " é uma abordagem para obtenção de resultados benéficos ou desejados, incluindo e de preferência os resultados clínicos. Para os fins desta presente invenção, os resultados clínicos benéficos ou dese- jados incluem, mas não estão limitados a, um ou mais dos seguintes procedimentos : a diminuir os sintomas resultantes da doença, o au- mento da qualidade de vida daqueles que sofrem da doença, a diminu- ição da dose de outros medicamentos necessários para tratar a doen- ça, retardando a progressão da doença, e/ou prolongando a sobrevi- vência dos indivíduos.

[0038] Tal como utilizado na presente invenção, " retardar o de- senvolvimento de uma doença " significa adiar, impedir, tornar mais lenta, retardar, estabilizar e/ou adiar o desenvolvimento da doença (tal como câncer). Este atraso pode ser de diferentes comprimentos de tempo, dependendo da história natural da doença e/ou indivíduo a ser tratado. Como é evidente para uma pessoa que é versada na técnica, um atraso suficiente ou significativo pode, com efeito, incluir a preven- ção, em que o indivíduo não desenvolve a doença.

[0039] Um "indivíduo" ou "sujeito" é um mamífero. Os mamíferos incluem, mas não estão limitados a, animais domésticos (por exemplo, vacas, ovelhas, gatos, cães e cavalos), primatas (por exemplo, seres humanos e primatas não humanos, tais como macacos, coelhos), e roedores (por exemplo, ratos e camundongos). Em algumas modalida- des, o indivíduo ou sujeito é um ser humano.

[0040] O termo "formulação farmacêutica" refere-se a uma prepa- ração que é de tal forma a permitir que a atividade biológica de um in- grediente ativo nele contido venha a ser eficaz, e que não contém quaisquer componentes adicionais que são inaceitavelmente tóxicos ao indivíduo ao qual a formulação deve ser administrada.

[0041] Um "veículo farmaceuticamente aceitável" refere-se a um ingrediente em uma formulação farmacêutica, que não seja um ingre- diente ativo, que não é tóxico para um indivíduo. Um veículo farmaceu- ticamente aceitável inclui, mas não está limitado a, um tampão, um excipiente, estabilizador, ou conservantes.

[0042] Uma "quantidade eficaz ou dose" de um agente, por exem- plo, uma formulação farmacêutica, refere-se a uma quantidade eficaz, em dosagens e por períodos de tempo necessários, para alcançar o resultado terapêutico ou profilático desejado. Uma dosagem eficaz po- de ser administrada em uma ou mais administrações. Para os fins des- ta presente invenção, uma dose eficaz do fármaco, composto, ou a composição farmacêutica é uma quantidade suficiente para realizar o tratamento profilático ou terapêutico, quer direta ou indiretamente. Tal como é entendido no contexto clínico, uma dosagem eficaz de uma composição de fármaco, composto, ou composição farmacêutica pode ou não pode ser conseguida em conjunto com outro fármaco, compos- to, ou composição farmacêutica. Dessa maneira, uma " quantidade ou dose eficaz " pode ser considerada no contexto de administrar um ou mais agentes terapêuticos, e um agente único pode ser considerado para ser administrado em uma quantidade eficaz se, em conjunto com um ou mais outros agentes, um resultado desejável pode ser ou é al- cançado.

[0043] Tal como utilizado na presente invenção, "em conjunto com" refere-se à administração de uma modalidade de tratamento pa- ra além de outra modalidade de tratamento. Como tal, " em conjunto com " refere-se à administração de uma modalidade de tratamento an- tes, durante ou após a administração da outra modalidade de trata- mento para o indivíduo.

[0044] O termo "bula" é usado para se referir às instruções nor- malmente incluídas nos pacotes comerciais de produtos terapêuticos, que contêm informações sobre as indicações, uso, dosagem, adminis- tração, a terapia combinada, contraindicações e/ou avisos sobre o uso de tais produtos terapêuticos.

[0045] Tal como na presente invenção e nas reivindicações em anexo, as formas singulares " um, " uma ", "a" e" o" incluem referên- cia plural a menos que o contexto indique claramente o contrário. Por exemplo, a referência a uma " proteína de fusão " ou " polipeptídeo de fusão " é uma referência a partir de uma de muitas proteínas de fusão ou polipeptídeos de fusão, tais como quantidades molares, e inclui os seus equivalentes conhecidos por meio das pessoas que são versadas na técnica, e assim por diante.

[0046] Referência a "cerca de" um valor ou parâmetro na presente invenção inclui (e descreve) as modalidades que são direcionadas a esse valor ou parâmetro per se. Por exemplo, a descrição referindo-se a " cerca de X" inclui a descrição de "X".

[0047] Entende-se que modalidades, aspectos e variações da pre- sente invenção descritas na presente invenção incluem " composto " e/ou " consistindo essencialmente em " modalidades, aspectos e vari- ações. Ill. As proteínas de fusão

[0048] A presente invenção proporciona as proteínas de fusão que inibem a ativação da via do complemento e a via do VEGF. Em algu- mas modalidades, a via do complemento, que é inibida por meio da proteína de fusão pode ser a via clássica do complemento, a via alter- nativa do complemento, e/ou a via da lectina. Em algumas modalida- des, a via de VEGF que é inibida por meio das proteínas de fusão é mediada pelos receptores de VEGF, por exemplo, o VEGFR - 1, VEG- FR - 2, e VEGFR - 3. Em algumas modalidades, a via de VEGF que é inibida por meio das proteínas de fusão é mediada por VEGF-A VEGF - B, VEGF - C, VEGF - D e PIGF. Em algumas modalidades, as proteí- nas de fusão descritas na presente invenção inibem a ativação do complemento e via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). As proteínas de fusão descritas na presente invenção compreendem um domínio de inibição do complemento (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e uma meia - vida pro- longando o domínio. Domínio de inibição do complemento (CID)

[0049] A presente invenção proporciona os domínios de inibição do complemento (CIDs) que podem ser um componente de qualquer polipeptídeo de fusão descrito na presente invenção. O CID pode compreender um fragmento de polipeptídeo de uma proteína de regu- lação do complemento envolvido na via do complemento, que incluem os membros dos reguladores de ativação do complemento (RCA) e as proteínas de controle de complemento (CCP). Em algumas modalida-

des, um CID compreende um fragmento de uma proteína do comple- mento regulação que inclui, mas não está limitado a, receptor 1 do complemento (CR1), o Fator H, fator de aceleração do decaimento (DAF), a proteína de cofator de membrana (MCP), e proteína de liga- ção a C4b (C4BP). Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, a proteína reguladora de complemento é a partir de um ma- miífero, tal como um ser humano, babuínos, chimpanzés, rato ou ca- mundongo. Em algumas modalidades, a proteína reguladora de com- plemento é uma proteína humana. As proteínas reguladoras do com- plemento se ligam a componentes da via do complemento, incluindo, mas não limitado a, C3b, C4b, iC3b, C3dg, Cia, e MBP. Em algumas modalidades, o fragmento da proteína reguladora de complemento se liga a um componente do complemento (por exemplo, C3b, C4b, iC3b, C3dg, C1q, e MBP) e inibe a ativação da via do complemento (por e- xemplo, a via clássica, a via alternativa, e/ou a via da lectina). Os mé- todos de ensaio de proteínas que inibem qualquer uma das vias de complemento são conhecidos na técnica e incluem os métodos descri- tos nos exemplos (como os Exemplos 2, 3 e 6). Vide, por exemplo, Scesney S. M,, et al., (1996). Eur. J. Immunol, 26 : 1729-1735, que é na presente invenção incorporado na sua totalidade por meio de refe- rência. Em algumas modalidades, o CID compreende, pelo menos, um SCR de uma proteína reguladora de complemento humano seleciona- da a partir do grupo que consiste em CR1, o Fator H, DAF, MCP, e C4BP.

[0050] O CID pode compreender uma porção de uma proteína re- guladora de complemento, que se liga a um componente do comple- mento e inibe a ativação do complemento. Por exemplo, o CR1 huma- no (alotipo A) é uma glicoproteína grande (- 200 kD), que consiste em um domínio extracelular que compreende 30 repetições homólogas de consenso curtas (SCR), cada uma variando de 60 a 70 aminoácidos,

um domínio transmembranar, e um domínio citoplasmático.

Os primei- ros 28 SCR são organizados em 4 repetições longas homólogas (LHR- A, - B, - C, e - D) de 7 SCRs cada.

Os primeiros três SCRs (sSCR1 - 3) do primeiro LHR (LHR-A) se liga a C4b com uma afinidade intermédia e C3b com uma baixa afinidade.

Os primeiros três SCRs (SCR8 - 10) do segundo LHR (LHR - B) e os primeiros três SCRs (SCR15 - 17) da terceira LHR (LHR - C) são aproximadamente idênticos.

Ambos ligam C3b com uma alta afinidade e C4b com uma afinidade intermédia.

À LHR -A tem alta incidência de decaimento da atividade de aceleração (DAA) para ambas as convertases C3 clássica e alternativa, mas baixa atividade de cofator (CA), enquanto que o LHR- B e LHR- C têm alta CA, mas baixa DAA para a C3- convertases.

Ambos LHR -A e LHR- B com espaçamento apropriado são necessários para DAA para as C5- convertases.

São proporcionados na presente invenção os CIDs com- preendendo, pelo menos, um SCR de uma proteína reguladora do complemento.

Em algumas modalidades, um CID compreende, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, mas não mais do que 30 SCRs de uma proteína reguladora do complemento.

Em alguns aspectos, um CID compreende qualquer um de 1 a 30, 1 a 29, 1 a 28, 1 a 27, 1 a 26, 1a25,1a24,1a23,1a22,1a21,1a20,/1a19,/1a218,/1a17,1a 16,1a15,1a14,1a13,1a12,/1a11,1a10,de1a9,1a8, 1-7, 1- 6, 1-5, 1-4, 1-3, ou 1-2 SCRs de uma proteína reguladora do comple- mento.

Em algumas modalidades, um CID compreende um ou mais SCRs de uma proteína reguladora do complemento selecionada a par- tir do grupo que consiste em, mas não está limitado a, CR1, o Fator H, DAF, MCP, e C4BP.

Em algumas modalidades, um CID compreende pelo menos um, pelo menos dois, pelo menos três, pelo menos quatro, pelo menos cinco, pelo menos seis, pelo menos sete, pelo menos oito, pelo menos nove, ou pelo menos dez SCR de CR1, Fator H, DAF,

MCP, ou C4BP. Um CID que compreende, pelo menos, um SCR de duas ou mais proteínas reguladoras do complemento também é con- templado. Em algumas modalidades, um CID compreende, pelo me- nos, um SCR a partir de duas ou mais proteínas reguladoras do com- plemento selecionadas a partir do grupo que consiste em CR1, o Fator H, DAF, MCP, e C4BP.

[0051] São fornecidos na presente invenção CIDs compreenden- do, pelo menos, um SCR de qualquer da proteína reguladora do com- plemento apresentadas na presente invenção. A não ser que seja ex- plicitamente mencionado na presente invenção, SCR são numerados sequencialmente a partir do Terminal N para Terminal C da proteína reguladora do complemento. Por exemplo, o CR1 humano contém 30 SCR que são numerados de 1 a 30 com SCR1 no Terminal N da pro- teína de CR1 humano e SCR30 na extremidade Terminal C da proteí- na de CR1 humano. Em algumas modalidades, o CID compreende SCR1 - 10 de CR1, tal como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 6. Em outras modalidades, o CID compreende SCR1 - 3 do CR1, tal como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 1. Em ainda outras modalidades, o CID compreende SCR8 - 10 de CR1, tal como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 5. Em algumas modalida- des, o CID compreende SCR2 - 4 de DAF, tais como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 13. Em outras modalidades, o CID com- preende SCR2 - 4 de MCP, tal como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 14. Em ainda outras modalidades, o CID compreende SCR1 - 4 do fator H. Em alguns aspectos, SCR1 - 4 do Fator H, tal como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 15. Em ainda ou- tras modalidades, o CID compreende SCR1 - 3 de C4BPA, tal como a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 16. Em qualquer um dos aspectos desta presente invenção, um CID pode compreender uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO : 1a6e13a16. O fator H SCR1 - 4 é um CID que visa especificamente a via alternativa, mas não a via clássica. Uma vez que a via clássica do complemento é necessária para a depuração do anticorpo patógeno dependente, as aplicações terapêuticas de uma proteína de fusão contendo um CID compreendendo Fator de SCR1 H - 4 que inibe apenas a via alternativa podem ser uma proteína de fu- são preferida para limitar o efeito colateral potencial de infecções gra- ves.

[0052] Os CIDs descritos na presente invenção podem ser quais- quer inibidores de peptídeos ou inibidores de oligonucleotídeos contra o fator B, ou fator D, ou Fator P, ou C3 ou C5. Os CIDs também po- dem ser qualquer um dos fragmentos de comprimento completo de anticorpos ou uma das regiões variáveis de anticorpo (VH ou VK), ou os anticorpos scFv derivados a partir de anticorpos contra o fator B, ou Fator D, ou Fator P, ou C3 ou C5.

[0053] Em algumas modalidades, as variantes da sequência de aminoácidos dos CIDs proporcionadas na presente invenção são con- templadas. Por exemplo, pode ser desejável para melhorar a ligação de afinidade e/ou outras propriedades biológicas de um CID. As vari- antes da sequência de aminoácidos de um CID podem ser preparadas por meio da introdução de alterações apropriadas na sequência de nu- cleotídeos que codifica para o CID, ou por meio da síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, as deleções e/ou as inser- ções e/ou as substituições de resíduos no interior das sequências de aminoácidos do CID. Qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição pode ser feita para se chegar ao constructo final, desde que o constructo final possua as características desejadas, por exem- plo, a ligação a um componente do complemento e inibição da ativa- ção da via do complemento. Na presente invenção são proporcionadas as variantes de um CID que é um componente de quaisquer proteínas de fusão descritas na presente invenção. Em algumas modalidades, um CID compreende uma sequência de aminoácidos tendo pelo me- nos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pe- lo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 1a 6 e 13 a 16.

[0054] Em alguns aspectos, o CID variante compreende uma ou mais substituições em resíduos de aminoácidos escolhidos dentre o grupo que consiste em N29, S37, G79, e D109, em que a posição do resíduo de aminoácido é relativo a SEQ ID NO : 1. Em uma modalida- de particular, a variante CID compreende as substituições em resíduos de aminoácidos N29 e D109, em que a posição do resíduo de aminoá- cido é relativo a SEQ ID NO : 1. Em uma outra modalidade particular, a variante CID compreende as substituições em resíduos de aminoá- cidos S37 e G79, em que a posição do resíduo de aminoácido é relati- vo a SEQ ID NO : 1. Em ainda outra modalidade particular, a variante CID compreende as substituições em resíduos de aminoácidos N29, S37, G79, e D109, em que a posição do resíduo de aminoácido é rela- tivo a SEQ ID NO : 1. Em algumas modalidades, a variante CID com- preende as substituições em resíduos de aminoácidos N29K, S37Y, G79D, e D109N, em que a posição do resíduo de aminoácido é relati- vo a SEQ ID NO : 1. Em alguns aspectos, a variante CID compreende as substituições de qualquer uma das posições de aminoácidos em relação a SEQ ID NO : 1, como mostrado na Tabela 1.

Tabela 1. Substituições de aminoácidos CID Substituições de aminoácidos (A) CID A2Z9 AST AT9 A1O9 CID-WT N Ss G D CID-KN K ) G N CID-YD N Y D D CID-KYDN K Y D N Domínio de inibição de VEGF (VID)

[0055] A presente invenção proporciona domínios da inibição de VEGF (VIDs) que podem ser um componente de qualquer proteína de fusão descrita na presente invenção. A família do gene do VEGF hu- mano contém cinco membros : VEGF-A VEGF - B, VEGF - C, VEGF - D e o fator de crescimento placentário (PIGF). Além disso, várias iso- formas do VEGF-A, VEGF - B e PIGF são geradas através do fatia- mento alternativo do RNA (Sullivan LA, et al., (2010), MAb, 2 (2) : 165 a 75). Todos os membros da família VEGF estimulam as respostas celulares por meio da ligação a receptores de superfície celular de VEGF (VEGFR). Por exemplo, VEGF -A tem mostrado estimular a mi- togênese de células endoteliais, promovendo a sobrevivência e prolife- ração celular, induzindo a migração de células, e aumentando a per- meabilidade microvascular. Os receptores VEGFR são receptores tiro- sina-quinase que têm regiões extracelulares que consistem em 7 do- mínios do tipo imunoglobulina (Ig) . VEGFR - 1 (FIt - 1), liga-se o VEGF - A, - B,/ e o PIGF, e pode funcionar como um receptor de engo- do para VEGF ou um regulador de VEGFR - 2. O VEGFR - 2 (KDR / FLK-1) liga-se a todas as isoformas de VEGF e é o mediador predomi- nante de sinalização de angiogênese induzida por VEGF). O VEGFR - 3 (FIt - 4) liga-se o VEGF - C e VEGF - D, mas não de VEGF - A, e funciona como um mediador da linfangiogênese.

[0056] Em qualquer um dos aspectos da presente invenção desc- tios na presente invenção, um VID compreende um fragmento de poli-

peptídeo de VEGFR que inclui, mas não está limitado a, o VEGFR - 1, VEGFR - 2, e VEGFR - 3. Em algumas modalidades, um VID compre- ende uma porção do domínio extracelular de um VEGFR que inclui, mas não está limitado a, o VEGFR - 1, VEGFR - 2, e VEGFR - 3. Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, o VEGFR é de um mamífero, tal como um ser humano, babuínos, chimpanzés, ra- to ou camundongo. Em qualquer um dos aspectos desta presente in- venção, uma porção do domínio extracelular é um (lg) de domínio de tipo imunoglobulina. Por exemplo, VEGFR - 1 humano contém sete domínios de tipo lg que são numerados de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 e com Ig do tipo 1 no domínio do Terminal N do domínio extracelular e domínio do tipo lg 7 na extremidade Terminal C do domínio extracelular. A não ser que seja explicitamente mencionado na presente invenção, os do- mínios do tipo lg são numerados sequencialmente a partir do Terminal N para Terminal C da proteína VEGFR. Em algumas modalidades, um VID compreende pelo menos um domínio de tipo lg de um ou mais VEGFRs selecionados de entre o grupo que consiste em VEGFR - 1, VEGFR - 2, e VEGFR - 3. Em alguns aspectos, um VID compreende, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, mas não mais de 7 domínios do tipo lg de VEGFR. Em um outro aspecto, um VID compreende 1 a 7, de 1 a 6, de 1a5,1a4,1a3,ou1a2 domínios do tipo Ig de um VEGFR.

[0057] VID compreendendo pelo menos um domínio de tipo Ig dos dois ou mais VEGFRs é contemplado na presente invenção. Em algu- mas modalidades, um VID compreende pelo menos um de tipo Ig a partir de dois ou mais VEGFRs selecionados de entre o grupo que consiste em VEGFR - 1, VEGFR - 2, e VEGFR - 3. Em alguns aspec- tos, um VID compreende, pelo menos, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, mas nenhuma mais de 21 domínios do tipo lg de, pelo menos, dois ou mais VEGFR. Em um outro aspecto, um VID compreende 1 a 21, de 1a 20,1a19,1a18,1a17,1a16,1 a 15, 1a 14,1a13,1a12,1a11,1-10, 1-9, 1-8, 1-7, 1-6, 1-5, 1-4, 1- 3, ou 1-2 domínios do tipo lg de, pelo menos, dois ou mais VEGFR.

VIDs que compreendem qualquer combinação dos sete domínios do tipo Ig de cada VEGFR são contemplados na presente invenção.

Por exemplo, um VID pode compreender o domínio Do tipo lg 2 do VEGFR - 1 (por exemplo, VEGFR - 1 humano) e domínio do tipo lg 3 de VEG- FR - 2 (por exemplo, humano VEGFR - 2). Em outro exemplo, um VID pode compreender os domínios do tipo lg 1-3 de VEGFR - 1 (por e- xemplo, VEGFR - 1 humano), os domínios do tipo lg 2-3 de VEGFR - 1 (por exemplo, VEGFR - 1 humano), os domínios de tipo lg 1-3 de VEGFR - 2 (por exemplo, humano VEGFR - 2), o domínio de Do tipo Ig 2 do VEGFR - 1 (por exemplo, VEGFR - 1 humano) e os domínios do tipo Ig de VEGFR - 3-4 2 (por exemplo, humano VEGFR - 2), ou o do- mínio de Do tipo lg 2 do VEGFR - 1 (por exemplo, VEGFR - 1 humano) e domínio do tipo Ig 3 de VEGFR - 3 (por exemplo, humano VEGFR - 3) . Para uma descrição mais detalhada destes domínios de tipo Ig e outros domínios de tipo Ig que podem ser utilizados como parte de um VID, vide a Patente U.S.

Nº 7531173, Yu, D. et al. ., (2012). Mol.

Ther. (3) : 938 a 947, e Holash, J. et al.., (2002). PNAS. 99 (17) : 11393 a 11398, todas as quais são incorporadas na presente invenção na sua totalidade por meio de referência.

Em alguns aspectos, um VID com- preende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 11. Em alguns aspectos, um VID compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 38. Em algumas modalidades, um VID se liga um fator de crescimento endotelial vascular, selecionado de entre o grupo que consiste em VEGF-A, VEGF - B, VEGF - C, VEGF - D, e PAGF.

Como proporcionado na presente invenção, um polipeptídeo ou peptídeo que se liga a um fator de crescimento endotelial vascular (por exemplo, VEGF-A, VEGF - B, VEGF - C, VEGF - D, e PIGF), ou que se liga a um VEGFR (por exemplo, o VEGFR - 1, VEGFR -2, e VEGFR - 3) para inibir a ativação de uma via de VEGF é um VID. Por exemplo, um VID pode compreender um anticorpo ou um fragmento do mesmo (por e- xemplo, Fab, Fab ', Fab - SH, Fv, scFv ou F (ab ') 2), um peptídeo na- tural, ou um peptídeo sintético que se liga a um crescimento endotelial vascular fator (por exemplo, VEGF-A, VEGF - B, VEGF - C, VEGF - D, e P1GF) e bloqueia a sua interacção com o VEGFR. Em alguns aspec- tos, um VID é um anticorpo ou um fragmento do mesmo (por exemplo, Fab, Fab ', Fab - SH, Fv, scFv ou F (ab ') 2), um peptídeo natural, ou um peptídeo sintético que se liga a um VEGFR (por exemplo, VEGFR - 1, VEGFR - 2, e VEGFR - 3) e bloqueia a sua interacção com o VEGF. Em alguns aspectos, o VID é acetilado. Em qualquer uma das modali- dades da presente invenção, o VID é de um mamífero, tal como um ser humano, babuínos, chimpanzés, rato ou camundongo.

[0058] Os VIDs da presente invenção podem ser qualquer domínio extracelular de VEGFR, dominam as formas negativas de membros da família VEGF, anticorpos contra os membros da família VEGF, anti- corpos contra VEGFR, inibidores peptídicos para os membros da famí- lia do VEGF ou VEGFR, inibidores de oligonucleotídeos para membros da família VEGF ou VEGFRs.

[0059] Em algumas modalidades, as variantes de sequências de aminoácidos de quaisquer VIDs proporcionados na presente invenção são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afini- dade e/ou outras propriedades biológicas do VID ligação. As variantes da sequência de aminoácidos de um VID podem ser preparadas por meio da introdução de alterações apropriadas na sequência de nucleo- tídeos que codifica o VID, ou por meio da síntese peptídica. Tais modi- ficações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substitui- ções de resíduos no interior das sequências de aminoácidos da VID. Qualquer combinação de eliminação, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao constructo final, desde que o constructo final pos-

sua as características desejadas, por exemplo, a ligação de um VEGF e a inibição da ativação da via VEGF.

São proporcionadas na presente invenção as variantes de VID que podem ser um componente de qual- quer polipeptídeo de fusão descrita na presente invenção.

Em algumas modalidades, um VID compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das Ig como os domínios 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 do VEGFR - 1 (por exemplo, VEGFR - 1 humano). Em algumas modalidades, um VID compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo me- nos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pe- lo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma das lg como os domínios 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 do VEGFR - 2 (por exemplo, humano VEGFR - 2). Em algumas modalidades, um VID compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo me- nos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pe- lo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de qualquer uma dos Domínios do tipo lg 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 de VEGFR- 3. Em algumas modalidades, um VID compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo me-

nos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos de uma sequência de a- minoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 11 e 38.

Domínio que prolonga a Meia-vida

[0060] A presente invenção proporciona um domínio que prolonga a meia - vida que pode ser um componente de qualquer proteína de fusão descrita na presente invenção. Por exemplo, as regiões Fc de uma imunoglobulina podem ser incorporadas em um polipeptídeo de fusão para aumentar a semivida in vivo. Um domínio que prolonga a meia - vida pode compreender uma região Fc de qualquer imunoglobu- lina do isotipo, subclasse ou alotipo. Em algumas modalidades, o do- mínio de prolongando a semivida é uma região Fc de uma imunoglo- bulina do isotipo selecionado de entre o grupo que consiste em IgG, IgA, 1gD, IgM e IgE. Em algumas modalidades, o domínio que prolonga a semivida compreende uma região Fe de imunoglobulina. Em alguns aspectos, a região Fc é uma Fc humana de IgG1, IgG2, I9G3 ou I19G4. Em alguns aspectos, a região Fc é uma Fc humana de IgA1 ou IgA 2. Em alguns aspectos, a região Fc é uma Fc humana de IgD. Em alguns aspectos, a região Fc é uma Fc humana de IgE. Em alguns aspectos, a região Fc é uma Fc humana de IgM. Em alguns aspectos, a região Fe está glicosilada. Em algumas modalidades, a região Fc compreen- de a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 7, 39, 41, e 42 Em qualquer um dos as- pectos proporcionados na presente invenção, o domínio que prolonga a meia - vida pode ser um polipeptídeo ou seu fragmento selecionado a partir do grupo que consiste em, mas não limitado a, um anticorpo, albumina, ou um inibidor de protease (por exemplo, alfa-1 - antitripsi- na). Em qualquer um dos aspectos proporcionados na presente inven-

ção, o domínio que prolonga a meia - vida pode ser uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em, mas não limitado a, uma sequência rica em glicina do aminoácido, sequência PESTAG, ou sequência de PAS. O domínio que prolonga a meia - vida pode ser qualquer sequência polipeptídica ou de aminoácidos conhe- cidas na técnica para aumentar a meia - vida de um polipeptídeo in vivo. Vide Kontermann, R. (Ed.) (2011). Proteínas Terapêuticas : Es- tratégias para modular o seu tempo de semivida, que é na presente invenção incorporado por meio de referência na sua totalidade. Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, o domínio de prolongando a semivida é de um mamífero, tal como um ser humano, babuínos, chimpanzés, rato ou camundongo.

[0061] Em algumas modalidades, as variantes de sequências de aminoácidos dos domínios que prolongam a meia-vida fornecidas na presente invenção são contempladas. Por exemplo, pode ser desejá- vel para melhorar as propriedades biológicas do domínio que prolonga a semivida. As variantes da sequência de aminoácidos de um domínio que prolonga a meia - vida podem ser preparadas por meio da introdu- ção de alterações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codi- fica o domínio que prolonga a meia - vida, ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, deleções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos no interior das sequências de aminoácidos do domínio que prolonga a meia - vida. Qualquer combinação de eli- minação, inserção e substituição pode ser feita para chegar ao cons- tructo final, desde que o constructo final possua as características de- sejadas, por exemplo, prolongando a semivida da proteína de fusão. São proporcionadas na presente invenção variantes de um domínio prolongamento meia - vida que pode ser um componente de qualquer polipeptídeo de fusão descrita na presente invenção. Em algumas mo- dalidades, a variante de domínio que prolonga a semivida é de uma variante da região Fc . Variantes da região Fc são conhecidas na téc- nica, por exemplo, Publicação do Pedido de Patente U.S. N º 2010 / 02493852, e pedido de Patente U.S. Número de Publicação 2006 / 01341105, que são incorporadas na presente invenção por meio de referência na sua totalidade. Em algumas modalidades, uma ou mais modificações de aminoácidos podem ser introduzidos na região Fc de um polipetídeo de fusão na presente invenção proporcionada, gerando assim uma variante região Fc. A variante da região Fc pode compre- ender uma sequência de região Fc humano (por exemplo, uma IgG1 humana, IgG2, IgG3 ou região Fc de IgG4) que compreende uma alte- ração de aminoácido (por exemplo, uma substituição) em uma ou mais posições de aminoácidos. Em algumas modalidades, a região Fc com- preende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pe- lo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequên- cia com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO :. 7, 39, 41, e 42 Em algumas modalida- des, a variante da região Fc é glicosilada.

Ligante do peptídeo de fusão

[0062] A presente invenção proporciona um ligante que pode ser um componente de qualquer proteína de fusão descrita na presente invenção. Por exemplo, os peptídeos curtos flexíveis podem ser usa- dos entre os domínios (por exemplo, CID, VID, e domínio que prolonga a meia - vida) do polipeptídeo fundido para assegurar a correta dobra- gem de cada domínio e para minimizar o impedimento estérico. Em algumas modalidades, o ligante é um ligante peptídico. Em algumas modalidades, o ligante é um peptídeo constituído por meio dos amino- ácidos selecionados a partir do grupo que consiste em glicina, alanina e serina.

Em algumas modalidades, o ligante compreende 2 a 100 a- minoácidos.

Em outras modalidades, o ligante compreende 100 ami- noácidos ou menos.

Em algumas modalidades, o ligante compreende ou menos aminoácidos.

Em algumas modalidades, o ligante com- preende 15 ou menos aminoácidos.

Em algumas modalidades, o a- gente de ligação peptídico compreende 10 ou menos aminoácidos.

Em algumas modalidades, o ligante compreende 6 ou menos aminoácidos.

Em alguns aspectos, o ligante tem 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72,73, 74,75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99, mas não superior a 100 ami- noácidos.

Em algumas modalidades, o ligante compreende a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO : 8. Em algumas modalidades, o ligante é usado entre o CID e domínio que prolonga a semivida.

Em algumas modalidades, o ligante é usado entre o VID e o domínio que prolonga a semivida.

Em outras modalidades, o ligante é usado entre o VID e CID.

Em ainda outras modalidades, o ligante é usado entre o domínio tanto o VID e meia - vida e prolongando o CID e domínio que prolonga a meia - vida.

Em outras modalidades, o ligante é usado en- tre o tanto o VID e CID quanto o CID e domínio que prolonga a meia - vida.

Em algumas modalidades, o ligante é usado entre o domínio de ambos os CID e VID quanto VID e domínio que prolonga a meia - vida.

Em algumas modalidades, um polipeptídeo de fusão compreende pelo menos um ligante, mas não mais do que quatro elementos de ligação.

Por exemplo, um polipeptídeo de fusão pode compreender um CID, um VID, uma região Fc (Fc), e pelo menos um ligante a partir de Ter- minal N para Terminal C, em uma ordem selecionada a partir do grupo que consiste em (1) VID, Fc, ligante, CID ; (2) CID, ligante, Fc, ligante,

VID ; (3) CID, ligante, VID, Fc ; (4) VID, ligante, CID, ligante, Fc ; (5) Fc, ligante, VID, ligante, CID ; e (6) Fc, ligante, CID, ligante, VID. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende um CID, um VID, Fc, e ligante a partir de Terminal N para Terminal C, em uma ordem de VID, Fc, ligante, CID.

As proteínas de fusão

[0063] Como descrito na presente invenção, as proteínas de fusão são polipeptídeos que têm especificidades de ligação para dois parcei- ros de ligação alvo diferente. Em algumas modalidades, os polipeptí- deos de fusão são polipeptídeos humanos. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fusão compreendem uma primeira especificidade de ligação a um componente da via do complemento (por exemplo, C3b, C4b, iC3b, C3dg, C1qg ou MBP) e uma segunda especificidade de ligação para um VEGF (por exemplo, VEGF-A VEGF - B, VEGF - C, VEGF - D, ou PIGF). Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fu- são compreende uma primeira especificidade de ligação a um compo- nente de mamíferos (por exemplo, ser humano) da via do complemen- to e uma segunda especificidade de ligação para um (por exemplo, humano) VEGF de mamíferos. Em algumas modalidades, os polipep- tídeos de fusão ligam-se ao mesmo componente da via do comple- mento, como qualquer um dos complemento proteínas reguladoras descrita na presente invenção. Em algumas modalidades, os polipep- tídeos de fusão ligam-se ao mesmo componente da via do comple- mento, como qualquer um de CR1, o Fator H, DAF, MCP, ou C4BP. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fusão compreender pe- lo menos um CID de qualquer um dos CIDs descritas na presente in- venção. Em alguns aspectos, de um polipeptídeo de fusão compreen- de um CID que compreende a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 1a 6 e 13a 16. Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fusão ligam-se ao mesmo componente da via VEGF como qualquer um dos descritas na presen- te invenção VEGFR.

Em algumas modalidades, os polipeptídeos de fusão ligam-se ao mesmo componente da via VEGF como qualquer um de VEGFR - 1, VEGFR - 2, ou VEGFR - 3. Em algumas modalida- des, os polipeptídeos de fusão compreendem pelo menos um VID de qualquer uma das VIDs descritas na presente invenção.

Em alguns aspectos, de um polipeptídeo de fusão compreende um VID compre- endendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 11. Em outros aspectos, um polipeptídeo de fusão compreende um VID compreen- dendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 38. Qualquer um dos polipeptídeos de fusão descritos na presente invenção, compre- endendo um CID e um VID pode ainda compreender um domínio que prolonga a meia - vida.

Em algumas modalidades, o domínio de pro- longar a semivida é de uma região Fc.

Em algumas modalidades, a região Fc compreende a sequência de aminoácido selecionado de en- tre o grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 7, 39, 41, e 42 Em algu- mas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreendendo um CID, um VID, e uma domínio que prolonga a meia - vida inibe a ativação do complemento e via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). Qualquer um dos polipeptídeos de fusão des- critos na presente invenção, compreendendo um CID, um VID, e um domínio que prolonga a meia - vida pode ainda compreender um ligan- te.

Em algumas modalidades, o ligante compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 8. Em algumas modalidades, o CID compreende, pelo menos, um SCR curto de um mamífero (por exem- plo, ser humano) complementando a proteína reguladora.

Em outras modalidades, o VID compreende uma porção do domínio extracelular de um (por exemplo, ser humano) VEGFR mamíferos.

Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende um CID que com- preende, pelo menos, um SCR curto de uma proteína reguladora de complemento humano e um VID compreendendo uma porção do do- mínio extracelular do VEGFR humano. Em um aspecto, a presente in- venção proporciona um polipeptídeo de fusão compreendendo : a) um CID que compreende a sequência de aminoácido de

QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKN SVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGY

RLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENF HYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGE- SIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI (SEQ ID NO : 4); b) um VID que compreende a sequência de aminoácido de

GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDG KRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIID

VVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKL VNRDLKTOSGSEMKKFLSTLTIDGVYV- RSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO : 11); e c) um domínio que prolonga a meia - vida que compreen- de a sequência de aminoácido de

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELT

KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 39).

[0064] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona um polipetídeo de fusão que compreende : a) um CID que compreende a sequência de aminoácido de

QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKN SVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGY RLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENF HYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGE-

SIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI (SEQ ID NO : 4); b) um VID que compreende a sequência de aminoácido de

DTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIP DGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTI

IDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK LVNRDLKTOSGSEMKKFLSTLTIDG- TRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO : 38) ; e c) um domínio que prolonga a meia - vida que compreen- de a sequência de aminoácido de

[0065] São fornecidos na presente invenção os polipeptídeos de fusão compreendendo um CID, um VID e um domínio que prolonga a meia - vida em qualquer ordem. Por exemplo, um polipeptídeo de fu- são pode compreender um CID, um VID, e uma região Fc (Fc) a partir de Terminal N para Terminal C, em uma ordem selecionada a partir do grupo que consiste em (1) VID, Fc, CID ; (2) CID, Fc, VID ; (3) CID, VID, Fc ; (4) VID, CID, Fc ; (5) Fc, VID, CID ; e (6) Fc, CID, VID. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende um CID, um VID, e Fc a partir de Terminal N para Terminal C, em uma ordem de VID, Fc, CID. Em algumas modalidades, o polipeptídeo de fusão compreende a sequência de aminoácidos de :

[0066] GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFP

LDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTH RQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSK HQHKKLVNRDLKTASGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGL MTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQ KSLSLSPGKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYE CRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVI KDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGL

PPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCT SNDDQVGIWSGPAPQCI (SEQ ID NO : 12).

[0067] Em outras modalidades, o polipetídeo de fusão compreen- de a sequência de aminoácido de :

QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKN SVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGY RLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENF HYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQ CIGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLS PGKGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLK KFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNY

LTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYP SSKHQHKKLVNRDLKTASGSEMKKF- STLTIDGVTRSDOQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO : 33).

[0068] Em ainda uma outra modalidade, o polipetídeo de fusão compreende a sequência de aminoácido de :

QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKN SVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGY RLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENF HYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQ CIGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKF PLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLT HRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSS KHQHKKLVNRDLKTASGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSG LMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST YRVVSVLTVLHQODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREP

QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRW- QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 34).

[0069] Em ainda outras modalidades, o polipetídeo de fusão com- preende a sequência de aminoácido de :

GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDG KRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIID VVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKL VNRDLKTAOSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNS TFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYEC RPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIK DIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLP PTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTS NDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTK PREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS

KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES NGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYS- LTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG (SEQ ID NO : 35).

[0070] Em outras modalidades, o polipetídeo de fusão compreen- de a sequência de aminoácido de :

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGG GGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPD GKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROQTNTII DVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK LVNRDLKTOSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKN STFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYE CRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVI KDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGL

PPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCT SNDDQVGIWSGPAPQCI (SEQ ID NO : 36).

[0071] Em outras modalidades, o polipetídeo de fusão compreen- de a sequência de aminoácido de :

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVS HEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQD WLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMT KNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGG GQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLK NSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKG YRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNREN FHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAP QCIGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKK FPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYL THRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPS

SKHQHKKLVNRDLKTOSGSEMKKFL- TLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ |D NO : 37).

[0072] Em ainda outras modalidades, o polipetídeo de fusão com- preende a sequência de aminoácido de :

DTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIP DGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTI IDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKK LVNRDLKTOSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKN STFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV TCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSV LTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLP PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLD SDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP

GKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYG RPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSOQA!|

KYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDF ISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGR- VFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI (SEQ ID NO : 40).

[0073] As proteínas de fusão que compreendem pelo menos dois ou mais CIDs, dois ou mais VIDs, e/ou dois ou mais domínios prolon- gando a meia - vida estão também contemplados. Por exemplo, uma proteína de fusão pode incluir dois CIDs, um VID, e uma região Fc de Terminal N para Terminal C, em uma ordem de VID, Fc, CID, CID, ou qualquer outra combinação destes. Em uma modalidade, a proteína de fusão pode compreender um CID, dois VIDs, e uma região Fc de Ter- minal N para Terminal C, em uma ordem de VID, VID, Fc, CID, ou qualquer outra combinação destes. Em uma outra modalidade, a pro- teína de fusão pode compreender um CID, um VID, e duas regiões Fc de Terminal N para Terminal C, em uma ordem de VID, Fc, CID, Fc ou qualquer outra combinação destes. Em ainda outra modalidade, a pro- teína de fusão podem compreender, pelo menos, dois CIDs, pelo me- nos, dois VIDs, e pelo menos duas regiões Fc de Terminal N para Terminal C, em uma ordem de VID, Fc, VID, Fc, CID, ou CID qualquer outra combinação destes. Qualquer combinação de pelo menos um VID, pelo menos, um CID, e pelo menos um domínio que prolonga a meia - vida é fornecido na presente invenção como se cada combina- ção tinha sido expressamente mencionado neste documento.

[0074] As proteínas de fusão descritas na presente invenção po- dem compreender as formas quimicamente modificadas dos CIDs. Por exemplo, os CIDs pode ser PEGuilado ou conjugados com polímeros para aumentar a meia - vida in vivo ; ou os CIDs podem ser reticulados quimicamente a anticorpos, fragmentos de anticorpos, regiões Fe, HSA, ou de outras proteínas humanas para aumentar a meia - vida in vivo ; ou os CIDs podem ser formulados em qualquer formato de libe- ração sustentada a longo prazo para prolongar a atividade anticom- plemento in vivo.

[0075] As proteínas de fusão descritas na presente invenção po- dem compreender as formas quimicamente modificadas dos VIDs. Por exemplo, os VIDs podem ser PEGuilados ou conjugados com políme- ros para aumentar a meia - vida in vivo ; ou os VIDs podem ser quimi- camente reticulados de anticorpos, fragmentos de anticorpos, regiões Fe, HSA, ou de outras proteínas humanas para aumentar a meia - vida in vivo ; ou os VIDs podem ser formulados em qualquer formato de li- beração sustentada a longo prazo para prolongar a atividade anti - complemento in vivo.

[0076] As proteínas de fusão descritas na presente invenção po- dem compreender as formas quimicamente modificadas das CIDs e VIDs. Por exemplo, os CIDs e VIDs podem ser PEGuilados ou conju- gados com polímeros para aumentar a meia - vida in vivo ; ou os CIDs e VIDs podem ser reticulado quimicamente a anticorpos, fragmentos de anticorpos, regiões Fe, HSA, ou de outras proteínas humanas para aumentar a meia - vida in vivo ; ou os CIDs e VIDs poderiam ser for- mulados em qualquer formato de liberação sustentada a longo prazo para prolongar a atividade anticomplemento in vivo.

[0077] Em algumas modalidades, as variantes de sequências de aminoácidos das proteínas de fusão fornecidas na presente invenção são contempladas. Por exemplo, pode ser desejável melhorar a afini- dade e/ou outras propriedades biológicas do CID, VID de ligação, e/ou o domínio que prolonga a meia - vida. As variantes da sequência de aminoácidos do polipeptídeo de fusão podem ser preparadas por meio da introdução de alterações apropriadas na sequência de nucleotídeos que codifica para o CID, VID e/ou domínio que prolonga a meia - vida, ou por síntese peptídica. Tais modificações incluem, por exemplo, de- leções e/ou inserções e/ou substituições de resíduos no interior das sequências de aminoácidos do CID, VID e/ou domínio que prolonga a meia - vida. Qualquer combinação de eliminação, inserção e substitui- ção podem ser feitas para chegar ao constructo final, desde que o constructo final possua as características desejadas (por exemplo, li- gação a um componente do complemento, ligação de um VEGF, ini- bindo a ativação da via do complemento, inibição da ativação da via VEGF e/ou prolongada meia-vida). Em algumas modalidades, o poli- peptídeo de fusão compreende pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo me- nos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99% de identidade de sequência com a se- quência de aminoácidos de um polipeptídeo de fusão compreendendo todo o CID, VID, e Fc, tal como na presente invenção descrito a partir de Terminal N para Terminal C, em uma ordem selecionada a partir do grupo que consiste em (1) VID, Fc, CID ; (2) CID, Fc, VID ; (3) CID, VID, Fc ; (4) VID, CID, Fc ; (5) Fc, VID, CID ; e (6) Fc, CID, VID. Em algumas modalidades, a variante de polipeptídeo de fusão compreen- de pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo menos 91%, pelo me- nos 92%, em menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecio- nada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12,33 a 37, e

40.

[0078] As substituições de resíduos de aminoácidos descritas na presente invenção também incluem as substituições conservadoras. As substituições conservadoras são apresentadas na Tabela 2 a se- guir, sob o título de " substituições preferidas ". Se tais substituições resultarem em uma alteração na atividade biológica, então as altera- ções mais substanciais, denominadas " Substituições exemplificativas " na Tabela 2, ou como melhor descrito abaixo em referência às clas- ses de aminoácidos, podem ser introduzidas e os produtos são rastre- ados. As substituições de aminoácidos como apresentadas na Tabela 2, ou como descrito abaixo em referência às classes de aminoácidos podem ser introduzidas em qualquer um dos polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que pro- longa a meia - vida, etc.) proporcionados na presente invenção.

Tabela 2. Potenciais substituições de aminoácidos riginal preferidas [ reu) | Noreucina; le; Val MeizAa;çRe | Ne

[0079] As modificações substanciais nas propriedades biológicas das proteínas ou polipeptídeos são realizadas selecionando as substi- tuições que diferem significativamente no seu efeito sobre a manuten- ção (a) da estrutura do esqueleto do polipeptídeo na área da substitui- ção, por exemplo, como uma folha ou conformação helicoidal, (b) a carga ou hidrofobicidade da molécula no local-alvo, ou (c) o volume da cadeia lateral. Os aminoácidos podem ser agrupados de acordo com as propriedades da cadeia lateral comuns : (1) hidrófobos : norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lle ;

(2) hidrófilo neutro : Cys, Ser, Thr, Asn, Gln ; (3) ácidos : Asp, Glu ; (4) básico : His, Lys, Arg ; (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia : Gly, Pro; (6) aromático : Trp, Tyr, Phe ; (7) grande hidrófobos : norleucina, Met, Val, Leu, lie.

[0080] As substituições não - conservadoras implicarão na troca de um membro de uma destas classes por outra classe.

[0081] Um método útil para a identificação de certos resíduos ou regiões da proteína de fusão, que são localizações preferidas para mu- tagênese é denominado " mutagênese de varrimento da alanina " co- mo descrito por Cunningham e Wells na Science, 244 : 1081 a 1085 (1989). Na presente invenção, um resíduo ou grupo de resíduos alvo são identificados (por exemplo, resíduos, tais como arg, asp, his, lys, e glu carregada) e substituídos por meio de um aminoácido neutro ou carregado negativamente (mais preferencialmente alanina ou poliala- nina) para afetar a interação dos aminoácidos com o parceiro de liga- ção alvo. Esses locais de aminoácidos que demonstram sensibilidade funcional para as substituições são então refinados através da introdu- ção de mais ou outras variantes no, ou para os, locais de substituição. Dessa maneira, embora o local para introdução de uma variação na sequência de aminoácidos é predeterminado, a natureza da mutação per se não necessita de ser predeterminada. Por exemplo, para anali- sar o desempenho de uma mutação em um dado local, de varrimento de ala ou a mutagênese aleatória é conduzida no códon ou região-alvo e as variantes de polipeptídeos de fusão expressas são rastreadas quanto à atividade desejada.

[0082] Qualquer resíduo cisteína não envolvido na manutenção da conformação adequada dos polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.) podem também ser substituídos, geralmente com serina, para melhorar a oxidativo estabilidade da molécula e prevenir a reticu- lação aberrante. Por outro lado, ligação (ões) de cisteína pode ser adi- cionado aos polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.), pa- ra melhorar a sua estabilidade.

[0083] Em outras modalidades, os peptídeos ou polipeptídeos da presente invenção podem compreender um ou mais aminoácidos que não ocorrem naturalmente ou são modificados . Um " resíduo de ami- noácidos que não ocorre naturalmente " refere-se a um resíduo, exce- to os resíduos de aminoácidos acima mencionados, que é capaz de se ligar de forma covalente ao (s) resíduo (s) de aminoácidos adjacente (s) em uma cadeia de polipeptídeo que ocorre naturalmente. Os ami- noácidos não naturais incluem, mas não estão limitados a homo - lisi- na, homo - arginina, homo - serina, ácido azetidinocarboxílico, ácido 2 - aminoadípico, ácido 3 - aminoadípico, beta - alanina, aminoácidopro- piônico, ácido 2 - aminobutírico, ácido 4 - aminobutírico, ácido 6 - ami- nocaproico, ácido 2 -amino-heptanoico, ácido 2aminoisobutírico, ácido 3 - aminoisbutírico, ácido 2 - aminopimelic, terc- butilglicina, ácido 2,4- diaminoisobutírico, desmosina, ácido 2,2 ' - diaminopimélico, 2, ácido 3 - diaminopropiônico, N - etilglicina, N - ethylasparagine, homoprolina, hidroxilisina, alo- hidroxilisina, 3 - hidroxiprolina, 4 - hidroxiprolina, iso- desmosina, alo- isoleucina, N - metilalanina, N - metilglicina, N - metili- soleucina, N - metilpentilglicina, N - metilvalina, naftalanina, norvalina, norleucina, ornitina, citrulina, pentilglicina, ácido pipecólico e tioprolina. Os aminoácidos modificados incluem os aminoácidos naturais e não naturais que estão quimicamente bloqueados, reversivelmente ou irre- versivelmente, ou modificados no seu grupo amino Terminal N ou os seus grupos de cadeia lateral, como por exemplo, aminoácidos D e L

N-metilados, grupos de cadeia lateral funcionais que são quimicamen- te modificados para um outro grupo funcional. Por exemplo, os amino- ácidos modificados incluem o sulfóxido de metionina ; metionina sulfo- na ; ácido aspártico - (éster beta - metil), um aminoácido modificado de ácido aspártico ; N - etil-glicina, um aminoácido modificado de glicina ; ou carboxamida alanina e um aminoácido modificado de alanina. Os aminoácidos adicionais não naturais e modificados, e os métodos de incorporá-los em proteínas e peptídeos, são conhecidos na técnica (vide, por exemplo, Sandberg et al., (1998) J. Med. Chem 41 : 2481 a 91 ; Xie e Schultz (2005) Curr Opin Chem Biol 9 : 548 a 554 ; Hodgson e Sanderson (2004) Chem Soc Rev. 33 : 422 a 430.

[0084] As inserções na sequência de aminoácidos incluem os ter- minais de a -amino - (" N ") e/ou carbóxi - (" C ") variando em compri- mento de um resíduo a polipeptídeos contendo uma centena ou mais de resíduos, bem como as inserções intra-sequência de um ou múlti- plos resíduos de aminoácidos. Exemplos de inserções terminais inclu- em um polipeptídeo de fusão com um resíduo metionila do Terminal N ou o polipeptídeo de fusão, fundido com um polipeptídeo citotóxico. Outras variantes de inserção da molécula de polipeptídeo de fusão que incluem a fusão ao Terminal N ou C do polipeptídeo de fusão com uma enzima ou um polipeptídeo que aumenta a semi - vida no soro do polipeptídeo de fusão (por exemplo, domínio que prolonga a meia - vida)

[0085] A presente invenção proporciona um peptídeo de sinal, que pode ser um componente de quaisquer polipeptídeos de fusão propor- cionados na presente invenção. Por exemplo, um polipeptídeo de fu- são compreendendo um CID, um VID, e um domínio que prolonga a meia - vida pode ainda compreender um polipeptídeo heterólogo, pre- ferivelmente uma sequência de sinal ou outro polipeptídeo possuindo um local de clivagem específico no Terminal N da proteína ou polipep-

tídeo maduro.

A sequência de sinal heteróloga selecionada é de prefe- rência uma que seja reconhecida e processada (ou seja, clivada por meio de uma peptidase de sinal) por células hospedeiras eucarióticas.

Para células hospedeiras procariotas que não reconhecem e proces- sam as sequências de sinal de mamífero nativas, a sequência de sinal eucariótica (por exemplo, de mamífero) é substituída por meio de uma sequência de sinal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo que consiste em sequências de comando de fosfatase alcalina, penicilinase, genes |pp, ou genes de enterotoxina estável ao calor |l.

Para a secreção em levedura a sequência sinal nativa pode ser substi- tuída por, por exemplo, o líder de invertase de levedura, o comando do fator (incluindo os líderes de fator Saccharomyces e Kluyveromyces), ou líder de fosfatase ácida, o comando da glucoamilase de C. albi- cans, ou o sinal descrito em WO 90 / 13646. Na expressão em células de mamífero, as sequências sinal de mamífero bem como comandos de secreção virais, por exemplo, o sinal gD de herpes simplex, estão disponíveis.

Em algumas modalidades, um polipeptídeo de fusão com- preendendo um VID, um CID, e um domínio que prolonga a meia - vi- da compreende ainda um peptídeo de sinal que compreende a se- quência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 9, 10 e 43 Um peptídeo sinal pode ser completa- mente clivado do polipeptídeo de fusão, uma vez que é produzido a partir de células hospedeiras ou pode ser parcialmente clivado.

Uma população mista de polipeptídeos de fusão pode ser produzida a partir de uma célula hospedeira, em que os polipeptídeos de fusão compre- endem uma sequência sinal completamente clivada (por exemplo, ne- nhuma sequência de sinal), uma sequência de sinal parcialmente cli- vada (por exemplo, porção da sequência de sinal) e/ou uma sequência de sinal não-clivada (por exemplo, a sequência sinal completa). Por exemplo, qualquer polipetídeo de fusão descrito na presente invenção,

que compreende ainda no seu Terminal N de um peptídeo de sinal que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 9, 10, e 43 podem ser parcial- mente clivada no terminal-N. Em uma modalidade, um polipeptídeo de fusão, que compreende ainda um peptídeo de sinal no Terminal N po- de ser clivada no terminal N por qualquer um de 1, 2, 3,4,5,6,7,8,9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, ou 22 resíduos de amino- ácidos. Em uma outra modalidade, um polipeptídeo de fusão que compreende ainda um peptídeo de sinal no Terminal N pode ser cliva- da no terminal N para produzir um polipeptídeo de fusão que compre- ende qualquer um de 1, 2, 3, 4 ou 5 resíduos de aminoácidos a partir do sinal peptídeo. Em algumas modalidades, um polipeptídeo de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37, e 40, compreende ainda um peptídeo de sinal que compreende a sequência de aminoá- cidos da SEQ ID NO : 9. Em outras modalidades, um polipeptídeo de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a par- tir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, compre- ende ainda um peptídeo de sinal que compreende a sequência de a- minoácidos da SEQ ID NO : 10 ou 43.

[0086] A presente invenção proporciona uma proteína de fusão dimérica compreendendo duas proteínas de fusão, em que cada prote- Ína de fusão compreende qualquer proteína de fusão descrita na pre- sente invenção. Em uma modalidade, a proteína de fusão dimérica compreende duas proteínas de fusão idênticas. Em uma outra modali- dade, a proteína de fusão dimérica compreende duas proteínas de fu- são diferentes. Em uma outra modalidade, a proteína de fusão diméri- ca compreende pelo menos uma proteína de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40, ou uma sequência de aminoáci-

dos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequência de amino- ácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 12, 33 a 37 e 40. Em outra modalidade, uma proteína de fusão com- preendendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37, e 40 pode ter 1, 2, 3,4, ou resíduos de aminoácidos removidos a partir do Terminal N ou Termi- nal C. Em uma modalidade, a proteína de fusão é recuperada a partir de uma célula hospedeira compreendendo um ácido nucleico que co- difica a referida proteína de fusão como um dímero de proteína de fu- são. IV. Os ácidos nucleicos, vetores e células hospedeiras Os ácidos nucleicos

[0087] São fornecidos na presente invenção os ácidos nucleicos isolados que codificam para qualquer um dos CIDs descritos na pre- sente invenção. Em algumas modalidades, o CID, compreende uma sequência de aminoácidos codificada por meio da sequência de ácido nucleico selecionado a partir do grupo consistindo das SEQ ID NOS : 17 - 22 e 29-32. Esta descrição proporciona ainda uma molécula isola- da de ácido nucleico, em que a molécula de ácido nucleico que codifi- ca para um CID que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo me- nos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 1a 6 e 13 a 16. Também na presente invenção são ácidos nucleicos isolados que codificam para qualquer um dos VIDs descritas na presente in- venção. Em algumas modalidades, o VID compreende uma sequência de aminoácidos codificada por meio da sequência de ácido nucleico de

SEQ ID NO : 27. Além disso, é na presente invenção proporcionada uma molécula de ácido nucleico isolada, em que a molécula de ácido nucleico codifica um VID compreendendo uma sequência de aminoá- cidos com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, em menos 90%, pelo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pe- lo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 11 e 38 propor- cionados na presente invenção também são ácidos nucleicos isolados que codificam para qualquer um dos domínios que prolongam a meia- vida descritas na presente invenção. Em algumas modalidades, o do- mínio que prolonga a semivida é de uma região Fc. Em algumas mo- dalidades, a região Fc compreende uma sequência de aminoácidos codificada por meio da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO :

23. Além disso, é na presente invenção proporcionada uma molécula de ácido nucleico isolada, em que a molécula de ácido nucleico codifi- ca um domínio que prolonga a meia - vida que compreende uma se- quência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pe- lo menos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pelo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 7, 39, 41, e 42 são na presente invenção forneci- dos ácidos nucleicos isolados que codificam qualquer um dos polipetí- deos de fusão descritas na presente invenção. Em algumas modalida- des, o polipeptídeo de fusão compreende uma sequência de aminoá- cidos codificada por meio da sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO : 28. Além disso, é na presente invenção proporcionada uma mo-

lécula de ácido nucleico isolada, em que a molécula de ácido nucleico codifica um polipeptídeo de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos com pelo menos 85%, pelo menos 86%, pelo menos 87%, pelo menos 88%, pelo menos 89%, pelo menos 90%, pelo me- nos 91%, pelo menos 92%, pelo menos 93%, pelo menos 94%, pelo menos 95%, pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, pe- lo menos 99%, ou 100% de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37 e 40.

[0088] As sequências polinucleotídicas que codificam para qual- quer um dos polipeptídeos descritos na presente invenção (por exem- plo, os CIDs, VIDs, domínios que prolongam a meia - vida, ligantes, polipeptídeos de fusão, etc) podem ser obtidos usando a síntese pa- drão e/ou as técnicas recombinantes. As sequências polinucleotídicas desejadas podem ser isoladas e sequenciadas a partir de células de origem apropriadas. As células de origem para os anticorpos, peptí- deos e/ou polipeptídeos que incluem anticorpos, peptídeos, e/ou célu- las produtoras de polipeptídeos, tais como células de hibridoma. Alter- nativamente, os polinucleotídeos podem ser sintetizados utilizando os sintetizadores de nucleotídeos ou de técnicas de PCR. Vetores

[0089] Uma vez obtidas, as sequências que codificam o peptídeo, e/ou polipeptídeo são inseridas em um vetor recombinante capaz de replicar e expressam os polinucleotídeos heterólogos em uma célula hospedeira. Muitos vetores estão disponíveis e conhecidos na técnica podem ser utilizados para os fins da presente invenção. A seleção de um vetor apropriado dependerá principalmente do tamanho dos ácidos nucleicos a serem inseridos no vetor e da célula hospedeira particular a ser transformada com o vetor. Cada vetor contém vários componen- tes, dependendo da sua função (amplificação ou expressão do polinu-

cleotídeo heterólogo, ou ambas) e da sua compatibilidade com a célula hospedeira particular na qual reside.

Os componentes do vetor geral- mente incluem, mas não estão limitados a : uma origem de replicação (em especial quando o vetor é inserido em uma célula procariótica), um gene marcador de seleção, um promotor, um local de ligação ao ribossoma (RBS), uma sequência de sinal, a inserção de ácido nuclei- co heteróloga e uma sequência de terminação da transcrição.

Em al- gumas modalidades, o vetor é um vetor de expressão.

Em algumas modalidades, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido CID.

Em alguns aspectos, o vetor compre- ende uma sequência de ácido nucleico que codifica para um CID que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 1a 6 e 13 a 16. Em algumas modalidades, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de aminoácido VID.

Em alguns aspectos, o vetor compre- ende uma sequência de ácido nucleico que codifica um VID compre- endendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 11 e 38 Em algumas modalidades, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um domínio que pro- longa semivida sequência de aminoácidos.

Em alguns aspectos, o domínio que prolonga a semivida é de uma região Fc.

Sequências a- dequadas região Fc são bem conhecidos na técnica.

Por exemplo, um número de vetores de expressão que codifica uma ou mais regiões Fe está disponíveis a partir da American Type Culture Collection (Rockvil- le, Md). Em alguns aspectos, o vetor compreende uma sequência de ácido nucleico que codifica para uma região Fc compreendendo uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 7, 39, 41, e 42. Em algumas modalidades, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica uma sequência de amino- ácidos do polipeptídeo de fusão.

Em alguns aspectos, o vetor compre-

ende uma sequência de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de fusão que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37, e 40.

[0090] Em algumas modalidades, o vetor que compreende um áci- do nucleico que codifica uma sequência de aminoácidos do polipeptí- deo de fusão compreende ainda um ácido nucleico que codifica para um peptídeo de sinal. O ácido nucleico que codifica o peptídeo de sinal é ligado ao ler a partir do ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de fusão. Em alguns aspectos, o vetor que compreende um ácido nuclei- co que codifica um polipetídeo de fusão compreende ainda um ácido nucleico que codifica para um peptídeo de sinal que compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs :. 9, 10 e 43. Em alguns aspectos, o vetor compreen- de um ácido nucleico que codifica um polipeptídeo de fusão compre- endendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37, e 40 e um ácido nucleico que codifica uma sequência de sinal que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 43. Em alguns aspectos, o vetor compreende um ácido nucleico que codi- fica um polipeptídeo de fusão compreendendo a sequência de amino- ácidos da SEQ ID NO : 12 e um ácido nucleico que codifica uma se- quência de sinal que compreende a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 9, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 43. Em outros as- pectos, o vetor compreende um ácido nucleico que codifica um poli- peptídeo de fusão compreendendo a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO : 40 e um ácido nucleico que codifica uma sequência de sinal que compreende a sequência de aminoácidos da SEQID NO : 9, SEQ ID NO : 10, ou SEQ ID NO : 43. Vetores bem conhecidas na téc- nica, bem como os vetores descritos na presente invenção (por exem- plo, pCl - neo), podem ser usados para replicar e expressar os polinu-

cleotídeos codificando qualquer um dos polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, meia - vida prolon- gando - domínio, etc.) descritos na presente invenção, em uma célula hospedeira. (1) Componente de sequência de sinal

[0091] Em algumas modalidades, cada um cistron dentro de um vetor recombinante compreende um componente de sequência de si- nal de secreção que dirige a translocação dos polipeptídeos expressos através de uma membrana. Em geral, a sequência sinal pode ser um componente do vetor, ou pode ser uma parte do DNA do polipeptídeo- alvo que é inserido no vetor. A sequência de sinal selecionada para o fim da presente invenção deve ser uma que seja reconhecida e pro- cessada (ou seja clivada por uma peptidase de sinal) por meio da célu- la hospedeira. Para células hospedeiras procariotas que não reconhe- cem e processam as sequências de sinal nativas para os polipeptídeos heterólogos, a sequência sinal é substituída por uma sequência de si- nal procariótica selecionada, por exemplo, a partir do grupo que con- siste na fosfatase alcalina, penicilinase, Ipp, ou líderes de enterotoxina estável ao calor Il (STH), LamB, PHOE, PelB, OmpA e MBP. Em al- gumas modalidades, a sequência de sinal é codificado por meio de um ácido nucleico selecionado a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 25 e 26. (2) Origem da replicação

[0092] Ambos os vetores de expressão e de clonagem contêm uma sequência de ácido nucleico que permite que o vetor se replique em uma ou mais células - hospedeiras selecionadas. Geralmente, em vetores de clonagem esta sequência é uma que permite ao vetor repli- car independentemente do DNA cromossômico do hospedeiro, e inclui as origens de replicação ou sequências de replicação autônoma. Tais sequências são bem conhecidas para uma variedade de bactérias, le-

veduras e vírus. A origem de replicação do plasmídeo pBR322 é ade- quada para a maioria das bactérias Gram - negativas, a origem do plasmídeo 24 é adequada para levedura, e várias origens virais (SV40, polioma, adenovírus, vírus da estomatite vesicular (" VSV ") ou o vírus do papiloma bovino (" BPV ") são úteis para vetores de clonagem em células de mamíferos. Geralmente, o componente origem de replica- ção não é necessário para vetores de expressão de mamíferos (a ori- gem de SV40 pode tipicamente ser utilizada apenas porque contém o promotor precoce). (3) Componente do gene de seleção

[0093] Os vetores de expressão e clonagem podem conter tam- bém um gene de seleção, conhecido como um marcador selecionável capaz de proporcionar a seleção fenotípica em células transformadas. Os genes de seleção típicos codificam proteínas que (a) conferem re- sistência a antibióticos ou outras toxinas, por exemplo, ampicilina, ne- omicina, metotrexato, ou tetraciclina, (b) complementam deficiências auxotróficas, ou (c) fornecem nutrientes críticos não disponíveis a par- tir de meios complexos, por exemplo, a codificação de D-alanina ra- cemase para gene Bacillii Un exemplo de um esquema de seleção utiliza um fármaco para parar o crescimento de uma célula hospedeira. As células que são transformadas com sucesso com um gene heteró- logo produzem uma proteína que confere resistência ao fármaco e as- sim sobrevivem ao regime de seleção. Exemplos de tais estratégias de seleção dominante utilizam os fármacos de neomicina, ácido micofe- nólico e higromicina. Outro exemplo de marcadores selecionáveis adequados para células de mamífero são aqueles que permitem a i- dentificação de células competentes para tomar os ácidos nucleicos que codificam para fragmentos de polipeptídeo de fusão ou de fusão de polipeptídeos, tais como di-hidrofolato redutase (" DHFR "), gluta- mina -sintetase (GS), timidina quinase, metalotioneina | e Il, de prefe-

rência genes de metalotioneina de primata, adenosina-desaminase, ornitina-descarboxilase, etc. Por exemplo, as células transformadas com o gene de seleção de DHFR são primeiro identificadas por meio da cultura de todos os transformantes em um meio de cultura que con- tém metotrexato (Mtx), um antagonista competitivo de DHFR. Uma ce- pa de célula hospedeira exemplar para uso com o tipo selvagem de DHFR é a de linhagem celular do ovário de hamster chinês (" CHO ") a que falta a atividade de DHFR (por exemplo, ATCC CRL - 9096). Al- ternativamente, as células transformadas com o gene de GS (glutami- na sintetase) são identificadas por meio da cultura dos transformantes em um meio de cultura contendo L - metionina sulfoximina (Msx), um inibidor de GS. Sob essas condições, o gene GS amplificado é, junta- mente com qualquer outro ácido nucleico cotransformado. O sistema de amplificação / de seleção GS pode ser usado em combinação com o sistema de seleção / amplificação DHFR descrito acima.

[0094] Para um outro exemplo, a E. coli é tipicamente transforma- da utilizando pBR322, um plasmídeo derivado de uma espécie de E. coli. O pBR322 contém genes que codificam para a ampicilina (Amp) e tetraciclina (Tet) e a resistência proporciona assim meios fáceis para identificação de células transformadas. O pBR322, seus derivados, ou outros plasmídeos microbianos ou de bacteriófago podem também conter, ou ser modificados para conter, promotores que possam ser usados por meio do organismo microbiano para a expressão das pro- teínas endógenas.

[0095] Um gene de seleção adequado para utilização em levedura é o gene trp 1 presente no plasmídeo de levedura YRp7 (Stincheomb et al.., Nature, 282 : 39 (1979)). O gene trp1 proporciona um marcador de seleção para uma cepa mutante de levedura sem a capacidade de crescer meio contendo triptofano (por exemplo, ATCC N º 44076 ou PEP4 - 1). Jones, Genetics, 85 : 12 (1977). A presença da lesão trp1 no genoma da levedura da célula hospedeira proporciona então um ambiente eficaz para detecção de transformação através do cresci- mento na ausência de triptofano. De modo semelhante, as cepas de levedura deficientes em Leu2 (por exemplo, ATCC 20622 ou 38626) podem ser complementadas por meio dos plasmídeos conhecidos por- tadores do gene Leu2. Além disso, os vetores derivados do plasmídeo circular de 1,ê mM pKD1 podem ser utilizados para transformação de leveduras Kluyveromyces. Alternativamente, um sistema de expressão para produção em grande escala de quimosina de vitelo recombinante foi relatado para K. lactis. Van den Berg, Bio / Technology, 8 : 135 (1990). Os vetores de expressão estáveis de múltiplas cópias para se- creção de soro humano recombinante madura de albumina por cepas industriais de Kluyveromyces foram também descritos. Fleer et al.., Bio / Technology, 9 : 968 a 975 (1991).

[0096] Além disso, os vetores fágicos contendo as sequências de replicão e de controle que são compatíveis com o microrganismo hos- pedeiro podem ser utilizados como vetores de transformação em liga- ção a estes hospedeiros. Por exemplo, de bacteriófagos, tais como AGEM.TM. -11 pode ser utilizado para fazer um vetor recombinante que pode ser utilizado para transformar as células hospedeiras susce- tíveis, tais como E. coli LE392. (4) Componente Promotor

[0097] Os vetores de expressão e clonagem contêm normalmente um promotor que é reconhecido por meio do organismo hospedeiro e está operativamente ligado ao ácido nucleico que codifica os polipeptí- deos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc). Os promotores adequados para utilização com hospedeiros procariotas incluem o promotor phoA, sistemas promotores de lactamase e lactose, fosfatase alcalina promo- tor, um sistema promotor do triptofano, e promotores híbridos tais co-

mo o promotor tac. No entanto, outros promotores que são funcionais em bactérias (tais como outros promotores bacterianos conhecidos ou fagos) são adequados também.

[0098] Tanto os promotores constitutivos quanto os induzíveis po- dem ser usados na presente invenção, de acordo com as necessida- des de uma dada situação, o que pode ser determinado por meio de uma pessoa que é versada na técnica. Um grande número de promo- tores reconhecidos por meio de uma variedade de células hospedeiras potenciais são bem conhecidos. O promotor selecionado pode ser o- perativamente ligado ao cistron de DNA que codifica um polipetídeo descrito na presente invenção, por meio da remoção do promotor do DNA fonte através da digestão com enzimas de restrição e inserção da sequência de promotor isolada no vetor de escolha. Tanto a sequência promotora nativa como muitos promotores heterólogos podem ser utili- zados para dirigir a amplificação e/ou expressão de genes alvo. No entanto, os promotores heterólogos são preferidos, uma vez que ge- ralmente permitem uma maior transcrição e maiores rendimentos de gene alvo expresso quando comparados com o promotor nativo do po- lipeptídeo alvo.

[0099] São conhecidas as sequências promotoras para eucariotas. Virtualmente todos os genes eucarióticos têm uma região rica em AT localizada aproximadamente 25 a 30 bases a montante do local onde a transcrição é iniciada. Outra sequência encontrada 70 a 80 bases a montante do inicio da transcrição de muitos genes é uma região CN- CAAT onde N pode ser qualquer nucleotídeo. Na extremidade 3 ' da maioria dos genes eucarióticos está uma sequência AATAAA que po- de ser o sinal para a adição da cauda poliA à extremidade 3' da se- quência de codificação. Todas estas sequências podem ser inseridas em vetores de expressão eucarióticos.

[00100] Os exemplos de sequências promotoras adequadas para utilização com hospedeiros de levedura incluem os promotores para 3- fosfoglicerato quinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enola- se, gliceraldeído - 3 -fosfato- desidrogenase, hexoquinase, piruvato descarboxilase, fosfo-fructoquinase, glicose - 6 - fosfato isomerase, 3- fosfoglicerato -mutase, piruvato -quinase, triosefosfatoisomerase, fos- foglucose-isomerase e glucoquinase.

[00101] Os promotores indutíveis em levedura tem a vantagem adi- cional de permitir a transcrição controlada por meio das condições de crescimento. Promotores indutiveis exemplares incluem as regiões promotoras para álcool -desidrogenase 2, isocitocromo C, fosfatase ácida, enzimas de degradação associadas ao metabolismo do nitrogê- nio, metalotioneína, gliceraldeído - 3 - fosfato -desidrogenase, e enzi- mas responsáveis pela utilização de maltose e galactose. Os vetores e promotores adequados para utilização em expressão em leveduras são ainda descritos em EP 73657. Os potenciadores de levedura tam- bém são utilizados de forma vantajosa com promotores de levedura.

[00102] A transcrição de ácidos nucleicos que codificam os polipep- tídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc) a partir de vetores em células hospedeiras de mamífero pode ser controlada, por exemplo, por meio dos promotores obtidos a partir dos genomas de vírus, tais como vírus de polioma, poxvírus de aves, adenovírus (tais como Ade- novírus 2), vírus do papiloma bovino, vírus do sarcoma aviário, cito- megalovírus, um retrovírus, vírus da hepatite - B e de preferência mais de Vírus Símio 40 (SV40), por promotores de mamífero heterólogos, por exemplo, o promotor da actina ou um promotor de imunoglobulina, e por promotores de genes de choque térmico, desde que tais promo- tores sejam compatíveis com os sistemas de células hospedeiras pre- tendidos.

[00103] Os promotores precoces e tardios do vírus SV40 são con-

venientemente obtidos como um fragmento de restrição de SV40 que também contém a origem virai de replicação de SV40. O promotor precoce imediato do citomegalovírus humano é convenientemente ob- tido como um fragmento de restrição Hindlll E. Um sistema para ex- pressar DNA em hospedeiros mamíferos utilizando o vírus do papilo- ma bovino como um vetor é descrito na Patente U.S. N *º 4419446. Uma modificação deste sistema é descrita na Patente U.S. Nº

4601978. Vide também Reyes et al.., Nature 297 : 598 a 601 (1982), em relação a métodos para a expressão de cDNA de interferona hu- mano em células de camundongo sob o controle de um promotor de timidina quinase do vírus de herpes simplex. Em alternativa, o terminal longa do Vírus do Sarcoma de Rous repetição pode ser utilizado como promotor.

(5) Componente de elemento potenciador

[00104] A transcrição de um DNA que codifica os polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.) por meio dos eucariotas superiores é frequentemente aumentada por meio da inserção de uma sequência potenciadora no vetor. Muitas sequências potenciadoras são agora conhecidas de genes de mamífero (globina, elastase, albumina, a - fetoproteína e insulina). Tipicamente, no entanto, uma pessoa que é versada na técnica vai usar um potenciador de um vírus eucariótico. Exemplos incluem o potenciador de SV40 no lado tardio da origem de replicação (pb 100-270), o intensificador de promotor precoce de cito- megalovírus, o potenciador de polioma no lado tardio da origem de re- plicação, e potenciadores de adenovírus. Vide também Yaniv, Nature 297 : 17 a 18 (1982) sobre o reforço elementos para ativação de pro- motores eucarióticos. O potenciador pode ser unido no vetor em uma posição 5 ' ou 3 ' para as sequências de codificação da proteína - fragmento de proteína de fusão ou de fusão, mas está preferivelmente localizado em um local 5 ' do promotor. (6) Componente de terminação da transcrição

[00105] Os vetores de expressão utilizados em células hospedeiras eucarióticas (de levedura, fungos, insetos, plantas, animais, seres hu- manos, ou células nucleadas de outros organismos multicelulares) conterão também as sequências necessárias para a terminação da transcrição e para a estabilização do MRNA. Tais sequências estão vulgarmente disponíveis a partir da extremidade 5 ' e, ocasionalmente 3 ', regiões não traduzidas de DNA ou CDNA eucarióticos ou virais. Estas regiões contêm segmentos de nucleotídeos transcritos como fragmentos poliadenilados na porção não traduzida do MRNA que co- difica os anticorpos ou os fragmentos dos mesmos. Um componente de terminação da transcrição útil é a região de poliadenilação da hor- mona de crescimento bovino. Vide WO94 / 11026 e o vetor de expres- são descrito a partir daí. Células hospedeiras

[00106] As células hospedeiras adequadas para clonagem ou ex pressão do DNA que codificam os polipeptídeos de fusão ou os frag- mentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.), nos vetores descritos na presente invenção incluem os procariotas, de levedura ou de eucariotas superiores das células descritas acima. Os procariotas adequados para este fim incluem eu- bactérias, tais como organismos Gram - negativos ou Gram - positivos, por exemplo, Enterobacteriaceae tais como Escherichia, por exemplo, E. coli, Enterobacter, Enwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por e- xemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por exemplo, Serratia mar- cescans, e Shigella, bem como Bacilli tais como B. subtilis e B. licheni- formis (por exemplo, B. licheniformis 41P descrito em DD 266,710 pu- blicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas tais como P. aerugino- Sa, e Streptomyces. Uma E. coli preferida é o hospedeiro de clonagem de E. coli 294 (ATCC 31446), embora outras cepas tais como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537), e E. coli W3110 (ATCC 27325) também são adequadas. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitantes.

[00107] Os polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.) po- dem ser produzidos em bactérias, em particular, quando a glicosilação não é necessária, tal como quando os polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo,, CID, VID, domínio que prolon- ga a meia - vida, etc) é conjugado a um agente citotóxico (por exem- plo, uma toxina). A produção em E. coli é mais rápido e mais eficiente. Para a expressão de polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc) nas bactérias, vide, por exemplo, U.S. 5.648.237 (Carter et al.), U.S. 5.789.199 (Joly et al..) e U.S. 5.840.523 (Simmons et al..) que descreve a região de iniciação da tradução (TIR), e as sequências de sinal para optimizar a expressão e secreção. Após a expressão, os polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia vida, etc.) são isoladas a partir da pasta de células de E. coli em uma fração solúvel e pode ser purifi- cado através de, por exemplo, uma proteína da coluna A ou G, depen- dendo da porção de ligação do polipeptídeo de fusão, tal como a regi- ão de isotipo Fc. A purificação final pode ser realizada pelo mesmo processo utilizado para purificar os polipeptídeos de fusão ou os frag- mentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.), expressos, por exemplo, em células CHO.

[00108] Em adição aos procariotas, micróbios eucarióticos tais co- mo fungos filamentosos ou leveduras também são hospedeiros de clo- nagem ou expressão adequados para polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolon- ga a meia - vida, etc.) vetores de codificação. Saccharomyces cerevi-

Siae, ou levedura de padeiro comum, é o mais vulgarmente utilizado entre os microorganismos hospedeiros eucariotas inferiores. No entan- to, um número de outros gêneros, espécies e cepas estão vulgarmente disponíveis e são úteis na presente invenção, tais como Schizosaccha- romyces pombe ; Kluyveromyces spp., Tais como K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424), K. bulgaricus (ATCC 16.045), K. wickeramii (ATCC

24.178), K. waltiil (ATCC 56,500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans, e K. marxianus ; yarrowia (EP 402226) ; Pichia pasto- ris (EP 183.070) ; Candida ; Trichoderma reesia (EP 244234) ; Neu- rospora crassa ; Schwanniomyces tal como Schwanniomyces occiden- talis ; e fungos filamentosos tais como, por exemplo, hospedeiros Neu- rospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger. Para uma revisão discutindo a utilização de leveduras e fungos filamentosos para a produção de proteínas terapêuticas, vide, por exemplo, Gerngross, Nat. Biotech. 22 : 1409 a 1414 (2004).

[00109] Certos fungos e cepas de levedura podem ser selecionados em que as vias de glicosilação tenham sido " humanizadas ", resultan- do na produção de polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mes- mos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia vida, etc.) com um padrão de glicosilação parcial ou totalmente humano. Vide, por exemplo, Li et al.., Nat. Biotech. 24 : 210 a 215 (2006) (que des- creve a humanização da via de glicosilação em Pichia pastoris) ; e Gerngross et al.. supra.

[00110] As células hospedeiras adequadas para a expressão de polipeptídeos de fusão glicosilada ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc) são deri- vadas de organismos multicelulares. Exemplos de células de inverte- brados incluem células de insetos e plantas. Foram identificadas nu- merosas cepas e variantes de baculovírus e correspondentes células hospedeiras de inseto permissivo - a partir de hospedeiros tais como

Spodoptera frugiperda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes al- bopictus (mosquito), Drosophila melanogaster (mosca da fruta) e Bombyx mori (traça) foram identificadas. Uma variedade de cepas vi- rais para transfecção está publicamente disponível, por exemplo, a va- riante L - 1 de Autographa californica NPV e a cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV. Tais vírus podem ser utilizados como o vírus na presente invenção de acordo com a presente invenção, particularmente para transfecção de células de Spodoptera frugiperda.

[00111] As culturas de células vegetais de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, e tabaco também podem ser utilizadas como hospedeiros.

[00112] Noentanto, o interesse tem sido maior em células de verte- brados e a propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) tornou-se um procedimento de rotina. Exemplos de linha- gens de células hospedeiras de mamíferos úteis são a linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS - 7, ATCC CRL 1651) ; a linhagem de rim embrionário humano (células 293 ou 293 subclo- nadas para crescimento em cultura em suspensão, Graham et al., J. Gen. Virol 36 : 59 (1977)) ; células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10) ; Células de ovário de hamster chinês / - DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc Nati Acad Sci U.S. 77 : 4216 (1980)) ; (23 : 243 a 251 (1980) TM4, Mather, Biol Reprod.). células de Sertoli de camun- dongo ; células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70) ; Células de rim de macaco verde africano (VERO - 76, ATCC CRL -1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34) ; células de fígado de rato búfalo (3A BRL, ATCC CRL 1442) ; células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75) ; células de fígado humano (Hep G2, HB 8065) ; tumor ma- mário de rato (MMT 060562, ATCC CCL51) ; Células TRI (Mather et al., Annals NY Acad Sci 383 : 44-68 (1982)) ; Células MRC 5 ; Células

FS4 ; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Outras linha- gens de células hospedeiras de mamífero úteis incluem células de o- vário de hamster chinês (CHO), incluindo as células DHFR - CHO (Ur- laub et al., Proc Natl Acad Sci U.S. 77 : 4216 (1980 =) ; e linhagens de células de mieloma, tais como NSO e Sp2 / O. Para uma revisão de al- gumas linhagens de células hospedeiras de mamífero adequadas para a produção de polipeptídeos, vide, por exemplo, Yazaki, e Wu, Me- thods in Molecular Biology, vol. 248 (BKC Lo, ed., Humana Press, To- towa, NJ, 2003), pp. 255 a 268.

[00113] Os exemplos de células de mamíferos capazes de expres- sar qualquer uma das proteínas descritas na presente invenção podem ser selecionados a partir do grupo que consiste em uma célula de hamster, uma célula de rato, uma célula de camundongo, uma célula de coelho, uma célula de gato, uma célula de cão, uma célula de bovi- no, uma célula de cabra, uma célula porcina, equina uma célula, uma célula de ovelha, uma célula de macaco, uma célula de chimpanzé, e uma célula humana. Em uma outra modalidade, a célula é uma célula dos animais neurais (tais como, mas não limitado a, uma célula do sis- tema nervoso periférico ou uma célula do sistema nervoso central), uma célula do músculo (tal como uma célula do músculo cardíaco, es- quelético ou liso), um gameta (tal como uma célula de esperma ou de oócito), uma célula cancerosa, uma célula imunitária (tal como, mas não limitado a, um macrófago, uma célula T ou uma célula - B), uma célula-tronco (tais como, mas não se limitando a, uma célula embrio- nária ou uma célula estaminal estaminais adultas), ou uma célula do sistema endócrino (tais como, mas não limitadas a, uma célula da ti- roide, uma célula hipotalâmica, célula pituitária, uma célula adrenal, célula testicular, uma célula de ovário, de uma célula pancreática (tal como uma célula B), uma célula do estômago, ou de uma célula intes- tinal). Em algumas modalidades, a célula é uma célula humana em cultura de células. Em algumas modalidades, a célula é uma célula não humana em cultura de células. Em algumas modalidades, a célula é uma célula cancerosa.

[00114] As células hospedeiras são transformadas ou transfectadas com a expressão dos vetores de clonagem acima descritos ou de poli- peptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.) de produção e cultiva- das em meios nutrientes convencionais modificados conforme apropri- ado para induzir promotores, selecionar os transformantes, ou amplifi- car os genes que codificam as sequências desejadas.

[00115] A transfecção refere- se à incorporação de um vetor de ex- pressão por meio de uma célula hospedeira ou não por quaisquer se- quências de codificação de fato expressas. Numerosos métodos de transfecção são conhecidos por meio da pessoa que é versada na técnica, por exemplo, eletroporação e precipitação de CaPO4. A trans- fecção bem-sucedida é geralmente reconhecida quando qualquer indi- cação da operação deste vetor ocorre dentro da célula hospedeira.

[00116] A transformação significa a introdução de DNA no hospe- deiro procariótico de modo a que o DNA seja replicável, quer como um elemento extracromossômico ou por integrante cromossómico. De- pendendo da célula hospedeira utilizada, a transformação é feita utili- zando técnicas padrão apropriadas para tais células. O tratamento com cálcio empregando cloreto de cálcio, é geralmente utilizado para células bacterianas que contêm barreiras de parede celular substanci- ais. Outro método para transformação emprega polietilenoglico! / DM- SO. Outra técnica que pode ser utilizada é a eletroporação. V. Métodos de produção de polipeptídeos de fusão e os fragmentos dos mesmos

[00117] São fornecidos na presente invenção os métodos para a produção de polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos

(por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc), tal como descrito na presente invenção. Em algumas modalidades, um método para produzir qualquer polipeptídeo de fusão, tal como descri- to na presente invenção, compreendendo a cultura de uma célula hos- pedeira compreendendo um ácido nucleico que codifica qualquer um dos polipeptídeos de fusão descritos na presente invenção sob uma condição que produz o polipeptídeo de fusão, e a recuperação do poli- peptídeo de fusão produzida por meio da célula hospedeira. Em al- guns aspectos, um método para a produção de um polipeptídeo de fusão que compreende a cultura da célula hospedeira que compreen- de o ácido nucleico que codifica o polipeptídeo de fusão compreen- dendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37, e 40 sob uma condição, que produz o polipeptídeo de fusão, e a recuperação do polipeptídeo de fusão produzida pelas células do hospedeiro.

(1) Cultura das células hospedeiras

[00118] As células procariotas utilizadas para produzir os polipeptí- deos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc) da presente invenção são cul- tivadas em meios conhecidos na técnica e adequados para cultura de hospedeiro selecionada células. Exemplos de meios adequados inclu- em o caldo Luria (LB) mais os suplementos de nutrientes necessários. Em modalidades preferidas, os meios de comunicação também con- tém um agente de seleção, escolhido com base no constructo do vetor de expressão, para permitir seletivamente o crescimento de células procarióticas contendo o vetor de expressão. Por exemplo, a ampicili- na é adicionada aos meios para crescimento de células que expres- sam o gene resistente à ampicilina. Quaisquer suplementos necessá- rios para além de carbono, nitrogênio e fontes de fosfato inorgânico podem também ser incluídos em concentrações apropriadas introduzi-

7T4/134 dos sozinhos ou como uma mistura com outro suplemento ou meio tal como uma fonte complexa de nitrogênio. Opcionalmente, o meio de cultura pode conter um ou mais agentes redutores selecionados a par- tir do grupo que consiste em glutationa, cisteína, cistamina, tioglicolato, ditioeritritol e ditiotreitol. As células hospedeiras procariotas são culti- vadas a temperaturas adequadas. Para o crescimento de E. coli, por exemplo, a temperatura preferida varia entre cerca de 20 ºC a cerca de 39 ºC, mais preferivelmente de cerca de 25 ºC a cercade37”"C, ainda mais preferencialmente a cerca de 30 ºC. O pH do meio pode ser qualquer pH entre cerca de 5 a cerca de 9, dependendo principal- mente do organismo hospedeiro. Para E. coli, o pH é de preferência de cerca de 6,8 a cerca de 7,4, e mais preferivelmente cerca de 7,0. Se um promotor indutível é utilizado no vetor de expressão, a expressão da proteína é induzida sob condições adequadas para a ativação do promotor. Por exemplo, se um promotor PhoA é usado para controlar a transcrição, as células hospedeiras transformadas podem ser cultiva- das em um meio limitante de fosfato para a indução. Pode ser usada uma variedade de outros indutores, de acordo com o constructo de vetor empregue, tal como é conhecido na técnica.

[00119] As células hospedeiras utilizadas para produzir os polipep- tídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc) descritas na presente invenção podem ser cultivadas em uma variedade de meios. Os meios comercialmente disponíveis tais como F10 de Ham (Sigma), Meio Es- sencial Mínimo ((MEM), Sigma), RPMI -1640 (Sigma), e Meio de Dul- becco Modificado de Eagle ((DMEM), Sigma) são adequados para cul- tura das células hospedeiras. Além disso, qualquer um dos meios des- critos em Ham et al.. Meth. Enz. 58 : 44 (1979), Barnes et al.. Anal. Biochem.102 : 255 (1980), Patente U.S. N º s 4,767,704 ; 4657866 ; 4927762 ; 4560655 ; ou 5.122.469 ; Publicação da WIPO N ºs WO 90

1 03430 ; WO 87 / 00195 ; ou Patente U.S. Re. 30985 pode ser utiliza- do como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer um destes meios pode ser suplementado conforme necessário com hor- mônios e/ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, trans- ferrina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tais como HEPES), nu- cleotídeos (tais como adenosina e timidina), antibióticos (tais como a fármaco GENTAMYCIN 7“), elementos vestigiais (definidos como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações fi- nais na gama micromolar) e glucose ou uma fonte de energia equiva- lente. Quaisquer outros suplementos necessários podem também ser incluídos nas concentrações apropriadas que seriam conhecidas dos peritos na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e semelhantes, são as previamente utilizadas com a célula hospe- deira selecionada para expressão, e serão evidentes para a pessoa que é versada da técnica.

(2) Purificação dos polipeptídeos de fusão e os fragmentos dos mes- mos

[00120] Quando se utilizam as técnicas recombinantes, os polipep- tídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc) descritas na presente invenção podem ser produzidos intracelularmente, no espaço peri- plasmático, ou segregados diretamente para o meio. Se os polipeptí- deos são produzidos intracelularmente, como um primeiro passo, a recuperação da proteína, tipicamente envolve a perturbarção do mi- crorganismo, geralmente por meios tais como choque osmótico, ul- trassons ou lise. Uma vez que as células são rompidas, os resíduos de partículas a partir de células hospedeiras ou fragmentos lisados são removidos, por exemplo, por meio da centrifugação ou por meio da ultrafiltração. Carter et al.., Bio / Technology 10 : 163 a 167 (1992)

descrevem um procedimento para isolamento de polipeptídeos que são segregados para o espaço periplasmático de E. coli. Resumida- mente, a pasta celular é descongelada na presença de acetato de só- dio (pH 3,5), EDTA e fenilmetilsulfonilfluoreto (PMSF) durante cerca de minutos. Os detritos celulares podem ser removidos por centrifuga- ção. Quando os polipeptídeos são secretados para o meio, os sobre- nadantes de tais sistemas de expressão são geralmente primeiro fil- trada e concentrada utilizando um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de proteases tal como PMSF pode ser incluído em qualquer um dos passos anteriores para inibir a proteólise e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o cresci- mento de contaminantes adventícios.

[00121] Os polipetídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.) das composições preparadas a partir de tais células podem ser purificados utilizando, por exemplo, cromatografia de hidroxilapatite, eletroforese em gel, diálise e cromatografia de afinidade, com a cromatografia de afinidade sendo a técnica de purificação preferida. Em algumas moda- lidades, a proteína A ou proteína G é usada como um ligante de afini- dade para utilização em cromatografia de afinidade. A adequabilidade da proteína A como ligante de afinidade depende da espécie e do iso- tipo de qualquer região Fc de imunoglobulina que está presente nos polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (Lindmark et al.., J. Inmunol. Meth. 62 : 1 a 13 (1983). Em uma modalidade preferi- da, a proteína A é usado como um ligante de afinidade para o isola- mento e purificação de polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.), tal como descrito na presente invenção. Em algumas modalida- des, a proteína G é usada como um ligante de afinidade para o isola-

mento e purificação de polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc), tal como descrito na presente invenção. a matriz à qual o ligante de afinidade é ligado é muito frequentemente agarose, mas estão dis- poníveis outras matrizes. matrizes mecanicamente estáveis tais como vidro de poro controlado ou poli (estireno - divinil) benzeno permitem caudais mais rápidos e menores tempos de processamento do que pode ser conseguido com agarose. outras técnicas para purificação de proteína, tais como fraccionamento em uma íon de troca de coluna, precipitação com etanol, HPLC de Fase Inversa, cromatografia em sí- licca, heparina SEPHAROSE 7Y, ou ânion ou resinas de permuta cati- ônica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), bem como croma- tofocagem, SDS -PAGE, e precipitação com sulfato de amônio estão também disponíveis, dependendo dos polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolon- ga a meia - vida, etc.) a ser recuperado. Em algumas modalidades, a proteína de fusão é recuperado substancialmente puro. Em uma outra modalidade, a proteína de fusão é recuperada, pelo menos, qualquer um dos 90%, 91%, 92. %, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% puros.

[00122] “Seguindo qualquer etapa ou etapas de purificação prelimi- nar, a mistura compreendendo o polipeptídeo de fusão ou os fragmen- tos dos mesmos (por exemplo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.) de interesse e contaminantes pode ser submetida a croma- tografia de interação hidrófoba a pH baixo utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca de 2,5-4,5, preferencialmente realizada a baixas concentrações de sal (por exemplo, desde cerca de O a 0,25 M de sal).

[00123] Em geral, as diversas metodologias para a preparação de polipeptídeos de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exemplo,

CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc), para utilização na pesquisa, teste e aplicações clínicas estão bem estabelecidas na téc- nica, consistente com as metodologias acima descritas e/ou conside- radas apropriadas pela pessoa que é versada da técnica para polipep- tídeos específicas de fusão ou os fragmentos dos mesmos (por exem- plo, CID, VID, domínio que prolonga a meia - vida, etc.) de interesse. (3) As atividades biológicas dos polipeptídeos de fusão e os fragmen- tos dos mesmos

[00124] Os polipeptídeos podem ser purificados e identificados utili- zando os métodos geralmente conhecidos, tais como fracionamento em colunas de imunoafinidade ou de permuta iônica ; precipitação com etanol ; HPLC de fase reversa ; cromatografia em sílica ou em uma resina de permuta catiônica tal como DEAE ; cromatofocagem ; SDS - PAGE ; precipitação com sulfato de amônio ; filtração em gel utilizan- do, por exemplo, Sephadex G - 75 ; resinas de afinidade hidrofóbicas, ligante de afinidade utilizando um parceiro de ligação adequado imobi- lizado em uma matriz, ELISA, BIACore, ensaio de transferência de Western, de aminoácidos e sequenciação de ácido nucleico, e a ativi- dade biológica.

[00125] As proteínas de fusão descritas na presente invenção po- dem ser caracterizadas ou avaliadas por meio de atividades biológi- cas, incluindo, mas não limitado a, a afinidade a um parceiro de liga- ção ao alvo (por exemplo, o VEGF ou a proteína complementar), liga- ção competitiva (por exemplo, o bloqueio de parceiro de ligação ao alvo para complementar proteína reguladora ou VEGFR), atividade inibidora (por exemplo, inibição da ativação do complemento ou a ati- vação de VEGF), semivida ou a proteína de fusão, a inibição da proli- feração de células, a inibição do crescimento do tumor, e a inibição de angiogênese (por exemplo, a neovascularização coroidal). Em algu- mas modalidades, as proteínas de fusão descritas na presente inven-

ção podem ser avaliadas quanto à atividade biológica in vivo e in vitro. Em qualquer um dos ensaios na presente invenção descritos, o ensaio é realizado a uma temperatura de 4 ºC, 20-28 * C ( por exemplo, 25 º C), ou 37 ºC.

[00126] As proteínas de fusão descritas na presente invenção po- dem ser avaliadas por meio da afinidade a um parceiro de ligação, tal como uma proteína do complemento (por exemplo, C3b, C4b, iC3b, C3dg, C1q ou MBP). Muitos métodos para a avaliação da afinidade de ligação são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para identifi- car as afinidades de ligação das proteínas de fusão com um parceiro de ligação. As afinidades de ligação podem ser expressas como cons- tante de dissociação (Kd) ou valores de semimáxima concentração eficaz (EC50). Os valores de técnicas para determinar as afinidades de ligação (por exemplo, valores de Kd) são bem conhecidas na técni- ca, tais como Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), e BIAco- re. vide Harlow e Lane, Antibodies : A Laboratory Manual, CSH Publi- cations, Nova lorque (1988) ;. Ausubel et al., Current Protocols in Mo- lecular Biology, John Wiley & Sons, Nova lorque, (2009) ;. Altschuh et al., Biochem, 31 : 6298 (1992). ; e o método BlAcore descrito pela Pharmacia Biosensor, todos os quais são na presente invenção incor- porados por meio de referência. Por exemplo, as afinidades de ligação das proteínas de fusão com um parceiro de ligação pode ser determi- nada utilizando o método ELISA. Em algumas modalidades, a ligação de proteínas de fusão para C3b ou C4b é ensaiada usando ELISA. Neste ensaio exemplar, as cavidades de uma placa de 96 cavidades de ELISA são revestidas com 100 ng / cavidade de C3b ou C4b. Cerca de 0-1 uM de proteína de fusão purificada é adicionado a cada cavida- de e incubados durante 1 hora antes da lavagem para remover desa- coplado C3b ou C4b. A diluição de um conjugado de HRP anti - Fc (por exemplo, Sigma Catalog No. A0170 - 1 ml) 1 : 5000 é subsequen-

temente adicionado a cada cavidade e incubado durante 1 hora. Após a incubação, as cavidades são lavadas antes da adição de um reagen- te de paragem para o substrato TMB (por exemplo, Sigma N º Catálo- go S5814 - 100 ml). Absorção da amostra é medida a 450 nm e anali- sadas por curva sigmoidal ajustando utilizando software computacional (por exemplo, PRISM4), a fim de se obter um valor de Kd e/ou o valor de CE50 para a ligação da proteína de fusão a C3b ou C4b. em um outro exemplo, a ligação das proteínas de fusão a um VEGF (por e- xemplo, VEGF-A VEGF - B, VEGF - C, VEGF - D ou PIGF) é ensaiado usando ELISA. em um ensaio exemplar, uma placa de 96 cavidades de ELISA revestidas com 100 ng de VEGF -A (por exemplo, R & D Systems) e de cerca de O - 10 nM de proteína de fusão purificada é adicionada a cada cavidade antes da incubação durante 1 hora. Após lavagem, uma diluição de anti - Fc conjugado HRP 1 : 5000 é adicio- nada a cada cavidade para uma incubação de 1 hora antes da lava- gem e da adição de um reagente de paragem para o substrato TMB a cada cavidade. A absorção da amostra é medida a 450 nm e analisada por curva sigmoidal de ajuste utilizando software computacional, a fim de se obter um valor de Kd e/ou o valor de CE50 para a ligação da proteína de fusão de um VEGF-A. em um outro ensaio exemplar, a ligação das proteínas de fusão a um VEGF solúvel é ensaiada por E- LISA utilizando um VEGF humano Quantikine Kit ELISA (R & D Sys- tems No. de catálogo DVEO00).

[00127] As proteínas de fusão descritas na presente invenção po- dem ser avaliados para a atividade inibidora de uma via do comple- mento (por exemplo, via clássica, a via alternativa, e/ou a via da lecti- na). Muitos métodos para a avaliação da atividade inibidora são co- nhecidos na técnica e podem ser utilizados para identificar a atividade inibidora de uma proteína de fusão. As afinidades de ligação podem ser expressas como metade dos valores da concentração eficaz má-

xima (EC50). Por exemplo, a atividade inibitória da via clássica do complemento ou a via da lectina de uma proteína de fusão pode ser determinada usando um total de hemolítica (CH50) de ensaio.

Neste ensaio exemplar, uma diluição de soro humano normal, que lisa 90% de 1 x 107 eritrócitos de ovelha sensibilizados anticorpo / ml depois de 1 hora de incubação a 37 * C é determinado em primeiro lugar.

O en- saio foi realizado em tampão contendo CaCl2 a 0,415 mM e MgCl2 a 0,5 mM.

A inibição da via clássica do complemento é ativada através da mistura da diluição do soro humano normal, que pode lisar 90% de eritrócitos de ovelha sensibilizado aos anticorpos com O a 500 nM de um proteína de fusão durante 1 hora a 370C.

Hemólise de eritrócitos de ovelha sensibilizados anticorpo é, em seguida, ensaiado após 1 ho- ra de incubação por meio da medição de absorção a 541 nm antes de análise por curva sigmoidal ajustando utilizando software computacio- nal (por exemplo, PRISM4) para obter um valor de EC50 para a ativi- dade inibitória da via clássica do complemento ou a via da lectina pela proteína de fusão.

Em um outro ensaio exemplar, a atividade inibidora do complemento alternativo por uma proteína de fusão é determinada por meio da inclusão de etileno -glicol do ácido tetra-acético (EGTA) para a quelação de íons de cálcio no tampão usado no ensaio CH50. Em algumas modalidades, a atividade inibidora de uma via do com- plemento por uma proteína de fusão é a inibição da atividade de acele- ração de decaimento (DAA) para a alternativa de C3 - convertase.

Em uma outra modalidade, a atividade inibidora de uma via do comple- mento por uma proteína de fusão é a inibição da atividade de acelera- ção de decaimento (DAA) para a alternativa de C3 - convertase.

A ini- bição de DAA por meio de uma proteína de fusão pode ser determina- da por meio dos métodos conhecidos na técnica, bem como qualquer um dos métodos descrits na presente invenção (por exemplo, Exemplo 7). Para um ensaio CH50 exemplar vide Costabile, M., (2010). J.

Vis.

Exp. 29 (37) : 1923, que é incorporado na presente invenção por meio de referência na sua totalidade.

[00128] Em qualquer uma das modalidades desta presente inven- ção, uma proteína de fusão, tem um EC50 de < 1 uM, 100 nM £, < 10 NM, 1 nM £, < 0,1 nM, < 0,01 nM, ou < 0,001 nM (por exemplo, 10-8 M ou menos, por exemplo, 10-8 M a 10-13 M, por exemplo, 10-9 M a 10- 13 M) para a inibição de uma atividade (por exemplo, a inibição da ati- vidade do complemento e/ou a atividade do VEGF). Em qualquer uma das modalidades desta presente invenção, uma proteína de fusão tem um Kd para um parceiro de ligação (por exemplo, complementar a pro- teína e/ou VEGF) inferior a cerca de qualquer de cerca de 1,0 mM, 500 UM, 100 uM, 50 UM, 25 uM, 10 uM, 5 MM, 1 uM, 900 nM, 800 nM, 700 nM, 600 nM, 500 nM, 400 nM, 350 nM, 300 nM, 250 nM, 200 nM, 150 nM, 100 nM, 95 nM, 90 nM, 85 nM, 80 nM, 75 nM, 70 nM, 65 nM, 60 NM, 55 nM, 50 nM, 45 nM, 40 nM, 35 nM, 30 nM, 25 nM, 20 nM, 15 NM, 10 nM, 5 nM, 1 nM, 900 pM, 800 pM, 700 pM, 600 pM, 500 pM, 400 pM, 300 pM, 200 pM, 100 pM, 50 pM, 25 pM, 12 : 05, 18 : 25, 17: 00, 16 : OO, ou 15 : OO, inclusive, incluindo quaisquer valores entre es- ses números. Em algumas modalidades, as variantes de polipeptídeos de fusão descritas na presente invenção ligam-se a um parceiro de ligação com uma afinidade mais elevada em comparação com a liga- ção de um polipeptídeo de fusão de tipo selvagem descrito na presen- te invenção. Em alguns aspectos, a variante de polipeptídeo de fusão que se liga a um parceiro de ligação com, pelo menos, qualquer um de 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1500, 2000, 2500, 3000, 3500, 4000, 4500, 5000, 6000, 7000, 8000, 9000, ou 10.000, afinidade vezes, inclusive, incluin- do qualquer valor entre estes números, maior em comparação com a ligação do parceiro de ligação de um polipeptídeo de fusão compreen- dendo a sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste nas SEQ ID NOs : 12, 33 a 37, e 40.

[00129] Em algumas modalidades, as proteínas de fusão descritas na presente invenção podem ser avaliadas quanto à atividade antipro- liferativa, tais como a redução da proliferação celular ou o crescimento do tumor. Muitos métodos para avaliar as propriedades antiproliferati- vas para uma proteína de fusão são conhecidos na técnica. em um ensaio exemplar, as células endoteliais da veia umbilical humana (HUVEC) podem ser utilizadas para demonstrar a inibição da prolifera- ção celular dependente de VEGF. Neste ensaio, as células HUVEC são mantidas em Meio de Crescimento de Células Endoteliais (por e- xemplo, da Lonza, Inc.), com 2% de FBS. Cerca de 50 mL de | nM de VEGF - A é adicionado às cavidades de uma placa de microtitulação de 96 cavidades de fundo plano revestidas com colágeno e várias concentrações da proteína de fusão. Cerca de 50 ul de HUVECs em 1 x 105 células / ml em meio - 199 (por exemplo, Hyclone, Inc.) são adi- cionados a cada cavidade e incubados durante 72 horas a 37 º C com 5% de CO2. Após a incubação, a proliferação de células é testada a- través da adição de 10 ul de CCK - 8 (por exemplo, Dojindo, Inc.) a cada cavidade e depois medindo a absorção de OD a 450 / 650 nm, para determinar a inibição da proliferação celular pela proteína de fu- são. Em um exemplar no ensaio in vivo, a inibição do crescimento do tumor é avaliada em camundongos com tumores de xenoenxerto deri- vadas de um determinado tipo de câncer (por exemplo, o carcinoma hepatocelular, o câncer colorretal, etc.) Neste ensaio, a várias concen- trações da proteína de fusão é administrada aos ratos a um regime de dosagem particular e o crescimento do tumor é medido, pelo menos, duas vezes ao longo de um período de tempo para determinar a inibi- ção do crescimento do tumor através da proteína de fusão. Em algu- mas modalidades, as propriedades anti - angiogênicas de uma proteí- na de fusão são medidos usando técnicas bem conhecidas na técnica.

Em um ensaio exemplar, um modelo animal da degeneração macular relacionado com a idade úmida é usado para ensaiar a inibição da ne- ovascularização no olho por a proteína de fusão. Neste ensaio, a foto- coagulação com laser é emitida para a retina do animal (por exemplo, rato, macaco, etc), para se obter a neovascularização coroide (CNV) e a proteína de fusão é administrada. Lesões de CNV nos olhos dos a- nimais (por exemplo, camundongos, ratos, e macacos), utilizando as técnicas conhecidas na técnica e descritas na presente invenção (por exemplo, Exemplo 11 e 12), são medidas para determinar se eles são reduzidos por meio da administração de fusão proteína. vide Liu, J., et al.., (2011). J. Biol. Chem. 286 (23) : 20991 a 21001 ; Nork, T.M., (2011). Arch. Ophthalmol. 129 (8) : 1042 a 1052 ; e Lichtlen, P. (2010). Invista. Ophthalmol. Vis. Sci. 15 (9) : 4738 a 4745, que são n incorpo- radas a presente invenção por meio de referência na sua totalidade. Vl. Métodos de tratamento utilizando polipeptídeos de fusão e os fragmentos dos mesmos

[00130] A presente invenção proporciona métodos para o tratamen- to ou prevenção de uma doença inflamatória, doença autoimune, do- ença relacionada com complementar, doença ocular, e câncer. Em al- gumas modalidades, a presente invenção proporciona um método de tratamento de um indivíduo com uma doença inflamatória, doença au- toimune, doença relacionada com complemento, doença ocular, e/ou de câncer, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz de qualquer proteína de fusão descrita na presente invenção. Em algumas modalidades, o método compreende ainda a administra- ção ao indivíduo de uma quantidade eficaz de pelo menos um agente terapêutico adicional, por exemplo, como descrito abaixo. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de fusão para utilização na inibição de ligação de uma proteína de complemento de uma proteína reguladora do complemento. Em algumas modalidades,

a presente invenção fornece uma proteína de fusão para utilização na inibição de ligação de uma proteína de complemento, com uma proteí- na de regulação do complemento em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da proteína de fusão para inibir a ligação de uma proteína de complemento para uma regu- lação do complemento proteína. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de fusão para utilização na inibição da ligação de um VEGF a um VEGFR. Em algumas modalidades, a pre- sente invenção fornece uma proteína de fusão para utilização na inibi- ção da ligação de um VEGF para o VEGFR um em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da proteí- na de fusão para inibir a ligação de um VEGF a um VEGFR. Em algu- mas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de fusão para utilização na inibição da ativação do complemento e via de sinali- zação de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF) em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantida- de eficaz da proteína de fusão para inibir a ativação do complemento e da sinalização de VEGF via (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). Um " indivíduo ", de acordo com qualquer uma das modalida- des acima é preferencialmente humano.

[00131] Uma doença inflamatória que pode ser tratada ou prevenida por as proteínas de fusão descritas na presente invenção incluem, mas não se limitam, a degeneração macular (por exemplo, a degene- ração macular relacionada com a idade), infarto agudo do miocárdio (AMI), a aterosclerose, glomernephritis, asma, e esclerose múltipla. Uma doença autoimune que pode ser tratada ou prevenida por as pro- teínas de fusão descritas na presente invenção incluem, mas não se limita a, doença de Alzheimer, a uveite autoimune, o lúpus eritematoso sistêmico (LES), nefrite de lúpus, colite ulcerativa, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, adulto síndrome da dificuldade respira-

tória do adulto (SARA), esclerose múltipla, diabetes mellitus, doença de Huntington, doença de Parkinson, a artrite reumatoide, artrite reu- matoide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, distúrbios inflamatórios do sistema nervoso central, miastenia grave, glomerulonefrite, e a trombocitopenia autoimune. Uma doença relacionada com o comple- mento, que pode ser tratada ou prevenida por as proteínas de fusão descritas na presente invenção incluem, mas não se limita a, o aneu- risma, a síndrome urêmica hemolítica atípica, púrpura trombocitopéni- ca trombótica, púrpura trombocitopénica idiopática, AMD, perda fetal espontânea, a perda fetal recorrente, traumatismo crânio-encefálico, psoríase, anemia hemolítica autoimune, angioedema hereditário, aci- dente vascular cerebral, choque hemorrágico, choque séptico, compli- cações de uma cirurgia como a cirurgia de revascularização do mio- cárdio (CRM), complicações pulmonares, como a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), a isquemia -reperfusão lesão, a rejeição de transplantes de órgãos, e falência de múltiplos órgãos.

[00132] Em um outro aspecto, a presente invenção proporciona a utilização de uma proteína de fusão na produção ou preparação de um medicamento. Em algumas modalidades, o medicamento é para o tra- tamento de uma doença inflamatória, doença autoimune, doença rela- cionada com complementar, doença ocular, e câncer. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de fusão para a fabricação de um medicamento para utilização na inibição da ligação de uma proteína de complemento, com uma proteína de regulação do complemento. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de fusão para a fabricação de um medicamento para uti- lização na inibição da ligação de um VEGF a um VEGFR. Em algumas modalidades, a presente invenção fornece uma proteína de fusão para a fabricação de um medicamento para utilização na inibição da ativa- ção do complemento e via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF) em um indivíduo, que compreende administrar ao indivíduo uma quantidade eficaz da proteína de fusão para inibir a ativação do complemento e via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de VEGF). Um " indivíduo ", de acordo com qualquer uma das modalidades acima é preferencialmente humano.

Em algumas modalidades, o medicamento é utilizado para o tratamento de uma doença inflamatória, incluindo, mas não limitado à, degeneração macular (por exemplo, a degeneração macular relacio- nada com a idade), infarto agudo do miocárdio (AMI), a aterosclerose, glomernephritis, asma e esclerose múltipla.

Em algumas modalidades, o medicamento é utilizado para o tratamento de uma doença autoimu- ne, incluindo, mas não se limitando a, doença de Alzheimer, a uveíte autoimune, o lúpus eritematoso sistêmico (LES), nefrite de lúpus, colite ulcerativa, doença inflamatória do intestino, doença de Crohn, dificul- dade respiratória do adulto síndrome (SDRA), a esclerose múltipla, diabetes mellitus, doença de Huntington, doença de Parkinson, a artri- te reumatoide, artrite reumatoide juvenil, osteoartrite, artrite psoriática, doenças inflamatórias do SNC, miastenia grave, glomerulonefrite, e a trombocitopenia autoimune.

Em algumas modalidades, o medicamento é utilizado para o tratamento de uma doença relacionada com o com- plemento, incluindo, mas não limitado a, aneurisma, a síndrome urê- mica hemolítica atípica, púrpura trombocitopénica trombótica, púrpura trombocitopénica idiopática, AMD, perda fetal espontânea, a perda fe- tal recorrente, lesão traumática cerebral, psoríase, anemia hemolítica autoimune, angioedema hereditário, acidente vascular cerebral, cho- que hemorrágico, choque séptico, complicações de uma cirurgia como a revascularização do miocárdio (CRM), complicações pulmonares, como a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC), a lesão de is- quemia-reperfusão, rejeição de transplantes de órgãos, e falência de múltiplos órgãos.

Em algumas modalidades, o câncer que pode ser tratado ou prevenido por meio das proteínas de fusão descritas na presente invenção, inclui o câncer colo-rectal, câncer colorretal metas- tático, câncer do pulmão de células não pequenas, linfoma, leucemia, adenocarcinoma, o glioblastoma, o câncer renal, o câncer renal metas- tático, câncer gástrico, câncer de próstata, retinoblastoma, câncer de ovário, câncer de endométrio e câncer de mama. Em outras modalida- des, o medicamento é utilizado para o tratamento de uma doença ocu- lar incluindo, mas não limitado a, degeneração húmido macular rela- cionada com a idade, a degeneração macular relacionada com a idade seco, retinopatia diabética, edema retinal diabética, edema macular, fibroplasia retrolental, retina oclusão central, a oclusão da veia da reti- na, retinopatia isquêmica, retinopatia hipertensiva, uveite (por exem- plo, anterior, intermediária, posterior, ou panuveíte), doença de Beh- çet, distrofia cristalina do Biett, blefarite, o glaucoma (por exemplo, glaucoma primário de ângulo aberto), o glaucoma neovascular, a neo- vascularização da córnea, neovascularização de coroide (CNV), neo- vascularização sub-retiniana, inflamação da córnea, e complicações do transplante de córnea.

Dosagens Farmacêuticas

[00133] As dosagens e concentração de fármaco desejadas de composições farmacêuticas da presente invenção podem variar de- pendendo da utilização particular pretendida. A determinação da do- sagem ou via de administração adequada está bem dentro da perícia de uma pessoa que é versada na técnica. As experiências com ani- mais proporcionam orientações fiáveis para a determinação de doses eficazes para terapia humana. Interespécies de escalonamento de do- ses eficazes podem ser realizadas seguindo os princípios estabeleci- dos pelo Mordenti, J. e Chappell, W. " The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics" em Toxicocinéticos e Desenvolvimento de Novos Medicamentos, Yacobi et al., Eds, Pergamon Press, Nova lorque

1989, pp.42 a 46.

[00134] Para a administração in vivo dos polipeptídeos de fusão descritos na presente invenção, as quantidades de dosagem normais podem variar de cerca de 10 ng / kg até cerca de 100 mg / kg de peso do corpo de um indivíduo ou mais por dia, de preferência cerca de 1 mg / kg / dia a 10 mg / kg / dia, dependendo da via de administração. Para administrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, de- pendendo da gravidade da doença ou distúrbio a ser tratado, o trata- mento é mantido até ocorrer uma supressão desejada dos sintomas que seja alcançada.

[00135] Um regime de dosagem exemplar compreende a adminis- tração de uma dose inicial de uma proteína de fusão de cerca de 2 mg 1 Kg, seguida por uma dose de manutenção semanal de cerca de 1 mg / kg a cada duas semanas. Outros regimes de dosagem podem ser úteis, de acordo com o padrão de decaimento farmacocinético que o médico deseja atingir. Por exemplo, a dosagem de um indivíduo 1-21 vezes por semana está na presente invenção contemplada. Em certas modalidades, a dosagem varia entre cerca de 3 mg / kg a cerca de 2 mg / kg (tal como cerca de 3 ug / kg, cerca de 10 ug / kg, cerca de 30 ug / kg, cerca de 100 ug / kg, cerca de 300 ug / kg, cerca de 1 mg / kg, e cerca de 2 / mg / kg) pode ser utilizado. Em certas modalidades, da frequência de administração é de três vezes por dia, duas vezes por dia, uma vez por dia, uma vez a cada dois dias, uma vez por semana, uma vez a cada duas semanas, uma vez a cada quatro semanas, uma vez a cada cinco semanas, uma vez de seis em seis semanas, uma vez a cada sete semanas, uma vez a cada oito semanas, uma vez a cada nove semanas, uma vez a cada dez semanas, ou uma vez por mês, uma vez a cada dois meses, uma vez a cada três meses, ou mais. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio das técnicas e ensaios convencionais. O regime de dosagem, incluindo a proteína de fusão administradas, pode variar ao longo do tempo inde- pendentemente da dose utilizada.

[00136] As dosagens para uma proteína de fusão particular, podem ser determinadas empiricamente, em indivíduos a quem foi adminis- trado uma ou mais administrações de proteína de fusão. Os indivíduos recebem doses incrementais de uma proteína de fusão. Para avaliar a eficácia de uma proteína de fusão, um sintoma clínico de uma doença inflamatória (por exemplo, AMD) pode ser monitorizado.

[00137] A administração de uma proteína de fusão de acordo com os métodos da presente invenção pode ser contínua ou intermitente, dependendo, por exemplo, com a condição fisiológica do receptor, se o efeito da administração de forma terapêutica ou profiláctica, e outros fatores conhecidos para os profissionais qualificados. A administração de uma proteína de fusão pode ser essencialmente contínua ao longo de um período pré-selecionado de tempo ou pode ser de uma série de doses espaçadas, por exemplo, durante ou após o desenvolvimento de uma doença inflamatória (por exemplo, AMD).

[00138] Orientação sobre determinadas dosagens e métodos de entrega é fornecido na literatura ; vide, por exemplo, Patente U.S. Nºs 4,657,760 ; 5206344 ; ou 5.225.212. Está dentro do escopo da presen- te invenção que as formulações diferentes serão eficazes para diferen- tes tratamentos e diferentes doenças ou distúrbios, e que a adminis- tração destinada a tratar um órgão ou tecido específico pode necessi- tar de uma entrega de uma maneira diferente do que para outro órgão ou tecido. Além disso, as dosagens podem ser administradas por uma ou mais administrações separadas, ou por infusão contínua. Para ad- ministrações repetidas ao longo de vários dias ou mais, dependendo da condição, o tratamento é mantido até ocorrer uma supressão dese- jada dos sintomas da doença. Contudo, outros regimes de dosagem podem ser úteis. O progresso desta terapia é facilmente monitorado por meio das técnicas e ensaios convencionais. A administração das formulações

[00139] A proteína de fusão da presente invenção (e qualquer a- gente terapêutico adicional) pode ser administrada por meio de qual- quer meio adequado, incluindo parentérica, intrapulmonar e intranasal, e, se desejado para tratamento local, intralesional. Infusões parente- rais incluem a administração intramuscular, intravenosa, intra-arterial, intraperitoneal ou subcutânea. A dosagem pode ser realizada por meio de qualquer via adequada, por exemplo, através de injeções, tais co- mo injeções intravenosas ou subcutâneas, dependendo em parte se a administração é breve ou crônica. Vários esquemas de dosagem, in- cluindo, mas não limitado a administrações únicas ou múltiplas sobre vários pontos de tempo, administração de bolo e infusão de pulso são na presente invenção contemplados. Em algumas modalidades, as composições são administradas diretamente no olho ou no tecido do olho. Em algumas modalidades, as composições são administradas topicamente ao olho, por exemplo, em gotas para os olhos. Em algu- mas modalidades, as composições são administradas por injeção para o olho (injeção intraocular) ou aos tecidos associados com o olho. As composições podem ser administradas, por exemplo, através de inje- ção intraocular, injeção periocular, a injeção sub-retiniana, injeção in- travítrea, injeção trans -septal, injeção subescleral, injeção intracoroi- dal, injeção intracameral, injeção subconjetival, injeção subconjuntival, injeção de sub-Tenon, injeção retrobulbar, injeção peribulbar, ou a en- trega posterior juxtaescleral. As composições também podem ser ad- ministradas, por exemplo, para o nervo vítreo, óptica, humor aquoso, esclera, conjuntiva, a área entre a esclera e da conjuntiva, os tecidos da retina coroide, mácula, ou outra área em ou na proximidade do olho de um indivíduo. Em algumas modalidades, as composições são ad- ministradas ao indivíduo como um implante ocular.

[00140] As proteínas de fusão da presente invenção pretendem ser formuladas, doseadas, e administradas de um modo consistente com a boa prática médica. Os fatores a serem considerados neste contexto incluem a doença ou distúrbio a ser tratada, o mamífero particular a ser tratado, a condição clínica do paciente individual, a causa da do- ença ou distúrbio, o local de entrega do agente, o método de adminis- tração, o programa de administração, e outros fatores conhecidos dos praticantes de medicina. A proteína de fusão não necessita de ser, mas é opcionalmente formulada com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar a doença ou distúrbio em questão. À quantidade eficaz destes outros agentes depende da quantidade de proteína de fusão presente na formulação, do tipo de doença ou dis- túrbio ou tratamento, e outros fatores discutidos acima. Estes são ge- ralmente utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administra- ção como descrito na presente invenção, ou de cerca de 1 a 99% das doses descrita na presente invenção ou em qualquer uma dose e por meio de qualquer via que é empiricamente / clinicamente determinada como adequada. O tratamento de combinação

[00141] As proteínas de fusão da presente invenção podem ser uti- lizadas isoladamente ou em combinação com um ou mais agentes te- rapêuticos adicionais. Tais terapias combinadas compreendem a ad- ministração combinada (em que dois ou mais agentes terapêuticos es- tão incluídos na mesma ou em diferentes formulações), e a adminis- tração separada, em cujo caso, a administração da proteína de fusão da presente invenção pode ocorrer antes, em simultâneo, e/ou na se- quência, a administração do agente e/ou adjuvante terapêutico adicio- nal.

[00142] Em algumas modalidades, uma proteína de fusão é admi- nistrada em combinação com um agente terapêutico, incluindo, mas não limitado a, um inibidor do complemento (por exemplo, ARC1905, TT30, Compstatina, e/ou POT - 4), um anticorpo do complemento (por exemplo, eculizumab, FCFD4514S, TNX - 558, e/ou TNX - 234), um inibidor de VEGFR (por exemplo, sunitinib, sorafenib, vatalanib, e/ou Vandetanib), anticorpo VEGFR (por exemplo, Ramucirumab) ou VEGF (por exemplo, bevacizumab, O ranibizumab, Aflibercept, e/ou pegapta- nib). Para agentes exemplares contra proteínas do complemento vide Ehrnthaller, C., et al., (2011), Mol. Med., 17 : 317 a 329. De acordo com outras modalidades, uma proteína de fusão é administrada em combinação com agentes que incluem, mas não se limitando a, antio- xidantes (por exemplo, vitamina C, vitamina E, beta - caroteno, luteína e/ou zeaxantina), ácidos graxos de ômega 3 de cadeia longa -(por e- xemplo, ácido docosahexaemoico e/ou ácido eicosapentaenoico), o Zinco ou o cobre. Em uma outra modalidade, uma proteína de fusão é administrada em combinação com neuroprotetores citocinas, incluindo, mas não limitado a, fator neurotrófico ciliar. Em outras modalidades, uma proteína de fusão é administrada em combinação com um trata- mento a laser (por exemplo, a terapia fotodinâmica) no caso de a AMD. Em algumas modalidades, a combinação de uma quantidade eficaz da proteína de fusão com um ou mais agentes terapêuticos adi- cionais, é mais eficaz em comparação com uma quantidade eficaz da proteína de fusão ou de outro agente terapêutico sozinho.

[00143] Em algumas modalidades, a proteína de fusão é adminis- trada por uma via diferente da administração de um ou mais agentes terapêuticos adicionais. Em algumas modalidades, um ou mais agen- tes terapêuticos adicionais são administrados parentericamente (por exemplo, linha venosa central, intra-arterial, intravenosa, intramuscu- lar, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea), por via oral, gastroin- testinalmente, topicamente, naso - faríngea e pulmonar (por exemplo inalação ou por via intranasal).

VII. Composições

[00144] As formulações farmacêuticas de uma proteína de fusão, tal como descritas na presente invenção são preparadas por mistura, tal proteína de fusão possuindo o grau de pureza desejado, com um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, opcionais, na forma de formulações liofilizadas ou soluções aquosas. Os veículos , excipien- tes ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis são descritos na presente invenção e bem conhecidos na técnica (Remington : The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, Mack Publishing (2000)). Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são geralmente não tóxicos para os receptores nas dosagens e concentrações utiliza- das, e incluem, mas não estão limitados a : tampões tais como fosfato, citrato, e outros ácidos orgânicos ; antioxidantes, incluindo ácido as- córbico e metionina ; conservantes (tais como cloreto de octadecildi- metilbenzilamônio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio ; fenol, butila ou álcool benzílico ; alquilparabe- nos tais como metil ou propil parabeno ; catecol ; resorcinol ; ciclohe- xanol, 3 - pentanol, e m - cresol) ; baixo peso molecular (menos do que cerca de 10 resíduos) polipeptídeos ; proteínas, tais como albumina do soro, gelatina, ou imunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos tais como polivinilpirrolidona ; aminoácidos tais como glicina, glutamina, aspara- gina, histidina, arginina, ou lisina ; monossacáridos, dissacáridos, e outros hidratos de carbono incluindo glucose, manose ou dextrinas ; agentes quelantes tais como EDTA ; açúcares tais como sacarose, manitol, trealose ou sorbitol ; contraíons formadores de sais tais como sódio ; complexos metálicos (por exemplo, complexos de Zn - proteí- na) ; e/ou tensoativos não - iônicos, tais como polietileno glicol (PEG). Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis na presente in- venção incluem ainda agentes de dispersão de fármacos intersticiais tais como glicoproteínas solúveis neutras ativo hialuronidase (sHA-

SEGP), por exemplo, glicoproteínas hialuronidase PH - 20 solúveis humanas, tais como rHuPH20 (HYLENEX &, Baxter International, Inc.). Em um aspecto, uma sSHASEGP é combinada com um ou mais glicosaminoglicanases adicionais tais como condroitinases.

[00145] A formulação descrita na presente invenção pode também conter mais do que um ingrediente ativo, como necessário para a indi- cação particular a ser tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não se afetam adversamente uns aos outros. Por exemplo, pode ser desejável proporcionar adicionalmente um inibidor de VEGF ou de complemento. Tais ingredientes ativos são adequa- damente presente em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade pretendida.

[00146] Os ingredientes ativos podem ser encapsulados em micro- cápsulas preparadas, por exemplo, por meio das técnicas de coacer- vação ou por polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulo- se ou microcápsulas de gelatina e de poli-(metilmetacrilato), respecti- vamente, em sistemas de entrega de fármacos coloidais (por exemplo, lipossomas, microcontas de albumina, microemulsões, nanopartículas e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Estas técnicas estão descri- tas em Pharmaceutical Sciences 16 º edição de Remington, Osol, A. Ed.. (1980).

[00147] Em algumas modalidades, as formulações farmacêuticas que compreendem a proteína de fusão é adequada para administração parentérica. Entre os veículos aceitáveis e os solventes são a água, solução de Ringer, solução salina tamponada com fosfato, e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, os óleos fixos estéreis são convencionalmente utilizados como um meio solvente ou de suspen- são. Para este fim, qualquer óleo mineral fixo ou não minerais brando pode ser empregue incluindo mono - ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, os ácidos graxos, como o uso achado ácido oleico na prepara-

ção de injectáveis. Em algumas modalidades, as formulações farma- cêuticas que compreendem a proteína de fusão são adequados para administração subcutânea, intramuscular, intraperitoneal, ou a admi- nistração intravenosa.

[00148] As preparações de libertação prolongada podem ser prepa- radas. Os exemplos adequados de preparações de libertação prolon- gada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrófobos sóli- dos que contêm a proteína de fusão, em que as matrizes estão sob a forma de artigos moldados, por exemplo, filmes, ou microcápsulas. As composições farmacêuticas são adequadas para uso em uma varie- dade de sistemas de entrega de fármacos. Para uma breve revisão dos presentes métodos para administração de fármaco, vide Langer, R. (1990) Science 249 : 1527-33 (1990), que é incorporada na presen- te invenção por meio de referência.

[00149] As formulações a serem utilizadas para administração in vivo geralmente são estéreis. A esterilidade pode ser facilmente con- seguida, por exemplo, por meio da filtração através de membranas de filtração estéreis. VIII. Artigos de Fabricação ou Kits

[00150] Em outro aspecto, um artigo de fabricação, ou kit, que é fornecido contém uma formulação de proteína de fusão. O artigo ou kit pode ainda compreender instruções para a sua utilização nos métodos da presente invenção. Dessa maneira, em certas modalidades, o arti- go de fabricação, ou kit compreende as instruções para a utilização da proteína de fusão em métodos para o tratamento ou prevenção de uma doença inflamatória (por exemplo, a degeneração macular rela- cionada com a idade), doença relacionada com o complemento, e/ou câncer em um compreendendo a administração ao indivíduo a indiví- duo de uma quantidade eficaz de uma proteína de fusão. Em certas modalidades, o indivíduo é um ser humano.

[00151] O artigo de fabricação, ou kit pode ainda compreender um recipiente. Os recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de dupla câmara), seringas (tais como seringas de câmara simples ou dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais tais como vidro ou plástico. O recipiente contém a formulação. O artigo de fabri- cação, ou kit pode ainda compreender uma etiqueta ou um folheto de embalagem, que está sobre ou associada ao recipiente pode indicar instruções para reconstituição e/ou o uso da formulação. A etiqueta ou folheto pode ainda indicar que a formulação é útil ou destina-se a mo- dos subcutâneos ou outros de administração para o tratamento ou prevenção de uma doença inflamatória (por exemplo, a degeneração macular relacionada com a idade), doença relacionada com o com- plemento, e/ou de câncer em um indivíduo. O recipiente que contém a formulação pode ser um frasco de uso único ou um frasco multiuso, que permite a administração de repetição (por exemplo, 2-6) de admi- nistrações a formulação reconstituída. O artigo de fabricação, ou kit pode ainda compreender um segundo recipiente compreendendo um diluente adequado (por exemplo, BWFI). Após a mistura do diluente e da formulação liofilizada, a proteína final, polipeptídeo, ou molécula pequena concentração na formulação reconstituída será geralmente de pelo menos 50 mg / ml. O artigo de fabricação, ou kit pode ainda incluir outros materiais desejáveis do ponto de vista comercial, tera- pêutico e de utilizador, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agu- lhas, seringas e inserções de embalagem com instruções de utilização.

[00152] O artigo de fabricação, ou kit descrito na presente invenção opcionalmente compreende ainda um recipiente que compreende um segundo medicamento, em que o polipeptídeo de fusão é um primeiro medicamento, e que o artigo compreende ainda instruções na bula pa- ra tratar o indivíduo com o segundo medicamento, em uma quantidade eficaz. O segundo medicamento pode ser qualquer um dos definidos acima, com um segundo medicamento exemplar sendo um inibidor do complemento (por exemplo, ARC1905, TT30, Compstatina, e/ou POT - 4), um anticorpo do complemento (por exemplo, eculizumab, FCFDA4514S, TNX - 558, e/ou TNX - 234), um inibidor de VEGFR (por exemplo, sunitinib, sorafenib, vatalanib, e/ou Vandetanib), VEGFR an- ticorpo (por exemplo, Ramucirumab) ou VEGF (por exemplo, bevaci- zumab, ranibizumab, Aflibercept, e/ou pegaptanibe) se a proteína de fusão é utilizada para o tratamento de degeneração macular relacio- nada à idade.

[00153] Em uma outra modalidade, é na proporcionado presente invenção um artigo de fabricação, ou kit, compreendendo as formula- ções descrita na presente invenção para a administração em um dis- positivo de autoinjector. Um autoinjetor pode ser descrito como um dispositivo de injeção que após a ativação, vai entregar o seu conteú- do sem a ação necessária adicional do paciente ou administrador. Eles são particularmente adequados para a automedicação de formulações terapêuticas quando a taxa de libertação deve ser constante e o tempo de entrega é maior do que alguns minutos.

[00154] Também são proporcionadas as formas de dosagem unitá- ria para o tratamento e/ou prevenção de doenças inflamatórias (tais como degeneração macular relacionada com a idade), doença relacio- nada com o complemento, e/ou do câncer, as formas de dosagem que compreendem qualquer uma das proteínas de fusão ou as formula- ções descritas na presente invenção.

[00155] A presente invenção será mais completamente entendida por meio de referência aos exemplos seguintes. Eles não devem, con- tudo, ser interpretados como limitando o âmbito da presente invenção. Todas as citações ao longo da descrição são expressamente incorpo- radas na presente invenção por meio de referência.

VIII. As modalidades exemplificativas

1. Uma proteína de fusão que inibe a ativação do com- plemento e da via de sinalização de VEGF, em que as proteínas de fusão contém um complemento inibindo domínio (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio que prolonga semivida

2. O prolongamento da semivida no domínio de um modo de realização é uma região Fc de imunoglobulina, em que a região Fc é de um tipo selvagem ou uma variante de qualquer isotipos de imu- noglobulina humana, subclasses, alotipos ;

3. AregiãoFc de modalidade 2 é a região Fc com a se- quência de na SEQIDNO?7;

4. O prolongamento da semivida no domínio de um modo de realização é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, albumina sérica humana, ou quaisquer outras proteínas humanas com meia - vida longa in vivo ;

5. OCIDeoNVID na modalidade 2 pode ser feita em qualquer um dos terminais da região Fe, ou nos mesmos terminais da região Fc, ou seja, VID - Fc - CID, CID - Fc - VID, VID - CID - Fc, CID - VID -Fc, Fc- VID- CID, ou Fc- CID - VID ;

6. OCID na modalidade 1, é uma porção de Receptor de complemento humano do tipo 1 (CR1) da região extracelular ; em que as sequências de CIDs são a partir da SEQIDNO : 1a6;

7. OCID na modalidade 1, é uma porção de DAF huma- no, MCP, o Fator H, C4BP, em que as sequências de CIDs são a partir da SEQ ID NO 13 a 16;

8. OCID na modalidade 1 é um fragmento de anticorpo, ou um scFv, ou regiões variáveis (VH ou VK) de anticorpos contra o fator B, ou fator D, ou Fator P, C3 ou C5 ;

9. OCID na modalidade 1, é um peptídeo inibidor ou um inibidor de oligonucleotídeo ao Fator B, ou fator D, ou Fator P, C3 ou

C5;

10. O CID na modalidade 1 é uma variante ou uma combi- nação dos CIDs em modalidades 5 a8;

11. O VID na modalidade 1 contém as porções dos domí- nios extracelulares de VEGFR ;

12. O VID na modalidade 1 é o domínio extracelular de VEGFR - 2 e um domínio extracelular de VEGFR - 3 2 com a sequên- cia de na SEQ ID NO 11;

13. A proteína de fusão na modalidade 1 tem a sequência da SEQ ID NO 12.

14. A proteína de fusão que inibe a ativação do comple- mento, em que a proteína de fusão contém um CID e um domínio que prolonga a meia - vida. ;

15. O domínio de prolongar a semivida na modalidade 14 é uma região Fc de imunoglobulina, em que a região Fc é de um tipo selvagem ou uma variante de qualquer isotipos de imunoglobulina hu- mana, subclasses e alotipos ;

16. A região Fc de modalidade 15 é a região Fc com a se- quência de na SEQIDNO?7;

17. O domínio que prolonga a meia - vida na modalidade 14 é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, albumina sérica huma- na, ou quaisquer outras proteínas humanas com meia - vida longa in vivo ;

18. O CID na modalidade 14 pode ser em qualquer um dos terminais da região Fe, ou seja, CID - Fc ou de Fc - CID ;

19. O CID na modalidade 14 é uma porção de Receptor de complemento humano do tipo 1 (CR1) da região extracelular ; em que as sequências de CIDs são a partir da SEQIDNO : 1a6;

20. O CID na modalidade 14 é uma porção de DAF huma- no, ou MCP, ou fator H, ou C4BP, em que as sequências de CIDs são a partir da SEQ ID NO 13 a 16;

21. O CID na modalidade 14 é um fragmento de anticorpo, ou um scFv, ou regiões variáveis (VH ou VK) de anticorpos contra o fator B, ou Fator D, ou Fator P, ou C3 ou C5 ;

22. O CID na modalidade 14 é um peptídeo inibidor ou um inibidor de oligonucleotídeo ao Fator B, ou fator D, ou Fator P, C3 ou Cc5;

23. O CID na modalidade 14 é uma variante ou uma com- binação de modalidades os CIDs em 19 a 22;

24. A proteína modificada contendo pelo menos uma das, ou uma variante, ou uma combinação dos CIDs nas modalidades 5 a 8, em que o peptídeo é conjugado com um domínio que prolonga a meia - vida. ;

25. A proteína modificada em modalidade 24 inclui um VID em modalidades 11 a 12;

26. O prolongamento da semivida de domínio na modali- dade 24 é um PEG ou outro polímero, com uma meia - vida longa in vivo ;

27. O domínio que prolonga a meia - vida em modalidade 24 é uma região Fc de imunoglobulina, em que a região Fc é de um tipo selvagem ou uma variante de qualquer isotipos de imunoglobulina humana, subclasses, alotipos ;

28. O domínio que prolonga a meia - vida em modalidade 24 é um anticorpo, um fragmento de anticorpo, albumina sérica huma- na, ou quaisquer outras proteínas humanas com meia - vida longa in vivo.

EXEMPLOS Exemplo 1: Expressão e Purificação de Proteínas de anti- complemento (ACPs)

[00156] Para produzir uma série de proteínas de fusão compreen-

dendo um domínio de inibição do complemento (CID) e um domínio de Fe, os CDNA que codificam vários CIDs foram sintetizados e fundido com a extremidade Terminal N (vide ACP - 1 - ACP - 5 na Figura 1A) ou a extremidade Terminal C (vide ACP - 6 - ACP - 10 da Figura 1A) do domínio Fc de IgG1. CIDs são porções da região extracelular de CR1 humano. Especificamente, CID -WT da ACP -1 e ACP- 6 foi CR1 do tipo selvagem de SCR1 -3 humano ; CID - KN da ACP -2 e ACP-7 foi CR1 de SCR1 -3 humano com as mutações de substituição de a- minoácidos N29K e D109N ; CID - YD da ACP- 3 e ACP-8 foi humano CR1 SCR1 -3 com as mutações de substituição de aminoácidos e S37Y G79D ; CID - KYDN da ACP -4 e ACP- 9 foi CR1 humano SCR1 -3 com as mutações de substituição de aminoácidos N29K, S37Y, G79D e D109N ; e CID -NT da ACP -5 e ACP10 foi CR1humano SCR 8-10 (Figura 1A). O domínio CID cDNAs e Fc de IgG1 sintetizado foi ligado a um pCl - neo vetor de expressão mamífero EcoRI / Not | dige- rido (Promega Catalog No. E1841). Um peptídeo curto flexível de seis resíduos de glicina foi usado entre o CID e o domínio Fc. Todas as proteínas de fusão Fc continham o peptídeo sinal SP2 no terminal N para permitir a secreção extracelular de AcP.

[00157] Os plasmídeos construídos para ACP- 1 e ACP- 10 eram cada um transitoriamente transfectados em células HEK293. O meio de cultura celular em que os ACP foram segregados foi colhido 72 ho- ras após a transfecção, e cada ACP foi purificado através de cromato- grafia em Proteína A. Resumidamente, os sobrenadantes da cultura contendo os ACPs segregados foram misturados com proteína A - agarose durante a noite antes de se aplicar a uma coluna de polipropi- leno. As contas foram lavadas com Tris a 0,1 M, pH 8,0 antes da elui- ção das ACPs com tampão de eluição (tampão de glicina a 0,1 M, pH 2,5) e de neutralização com tampão Tris pH 8,0. As ACP's eluídas fo- ram concentradas e dialisadas contra tampão fosfato de solução salina

(PBS) antes da determinação da concentração de proteína final por meio do ensaio BCA. A pureza de cada ACP isolado foi determinada como sendo > 90%. Uma amostra de 2 ug de cada purificado ACP - 6 (faixa 5), ACP - 7 (faixa 4), ACP - 8 (faixa 3), ACP - 9 (faixa 2), e ACP - (faixa 1), a proteína foi carregada em um gel de SDS - PAGE sob condições não redutoras (Figura 2A). Os pesos moleculares das prote- ínas de fusão diméricas Fc foram — 94 kD.

[00158] ACPs em que DAF SCR2 - 4, MCP - 4 SCR2, Fator H SCR 1-4, ou CABPA SCR1 - 3 são cada um fundidos como um CID para o domínio Fc de IgG1 construído, expresso e purificado de uma maneira semelhante. Exemplo 2 : Inibição da via clássica do complemento por meio de ACP

[00159] O ensaio CH50 foi usado para quantificar o grau de ativida- de da via clássica do complemento. Este ensaio determina a capaci- dade funcional de componentes do complemento de soro da via clás- Sica (isto é, presente em uma amostra) para lisar os glóbulos verme- lhos de ovelha pré - revestida com anticorpo de coelho anti - ovelha de anticorpos de glóbulos vermelhos (EA, anticorpos eritrócitos de ovelha sensibilizados, Catálogo da Tecnologia de Complemento No. B200). Quando EA são incubados com, por exemplo, soro de teste, os íons de magnésio e íons de cálcio, a via clássica do complemento é ativada e se obtêm os resultados de hemólise. Um volume fixo de forma ópti- ma de EA sensibilizado é adicionado a cada diluição do soro. Após a incubação, a mistura é centrifugada e o grau de hemólise é quantifica- da através da medição da absorvância da hemoglobina libertada para o sobrenadante a — 540 nm. A quantidade de atividade de complemen- to é determinada através da análise da capacidade de várias diluições do soro de teste para lisar EA. O resultado do ensaio é expresso como o recíproco da diluição de soro necessário para produzir a lise de 50% dos números de eritrócitos definidos sob condições normais.

[00160] O ensaio CH50 é sensível à redução, ausência e/ou inativi- dade de qualquer componente da via clássica do complemento e, as- sim, foi utilizado para avaliar as capacidades de ACP - 6, -7, -9, e -10a inibirem a ativação clássica do complemento. Para este ensaio, a dilui- ção do soro humano normal (Catálogo da Tecnologia de Complemento No. SNS) que lisaram 90% de 1 x 107 EA / ml após incubação de 1 hora a 37 ºC foi determinada pela primeira vez. O ensaio foi realizado em tampão de GVB + + (0,1% de gelatina, veronal a 5 mM, NaCl a 145 MM, 0,025% de NaN3, pH 7,3) contendo CaCl2 a 0,15 mM e MgCl2 a 0,5 mM. A inibição da via clássica do complemento foi ativada através da mistura da diluição do soro humano normal, que pode lisar 90% de EA, com O a 500 nM de proteínas de fusão ACP - 6, ACP -7, ACP -9, ou ACP - 10 durante 1 hora a 370C. Hemólise de EA foi depois ensai- adas depois de 1 hora de incubação do soro e através da medição de absorção de EA em OD541 nm. Os dados foram analisados pela curva sigmoidal de montagem usando Prism 4 (GraphPad, Inc.).

[00161] A análise da porcentagem de hemólise de EA na presença das proteínas de fusão demonstrou que o ACP - 6, em que o domínio CR1 SCR1 - 3 humano foi fundido com a extremidade Terminal C de Fc de IgG1, exibiram inibição robusta de a atividade do complemento com CE50 de 16,2 nM (Figura 3A, círculo fechado). ACP - 7, em que a variante de CR1 SCR1 - 3 N29K / D109N humano foi fundida com a extremidade Terminal C de Fc de IgG1, aumentou significativamente o efeito inibitório de 10 vezes a EC50 de 1,6 nM (Figura 3A, quadrado fechado). ACP - 9, em que a variante de CR1 SCR1 - 3 N29K / DIO9N S37Y / G79D humano foi fundida com a extremidade Terminal C de IgG1, impulsionou a atividade inibidora mais de 2,7 vezes a EC50 de 0,6 nM (Figura 3A, o triângulo fechado). Em contraste, o ACP - 10, em que o CR1 humano SCR 8-10 foi fundido com a extremidade Terminal C de IgG1, não mostrou qualquer inibição da atividade do complemen-

to até 500 nM (Figura 3A, triângulo invertido).

[00162] A inibição da via clássica do complemento pelo ACP con- tendo DAF SCR2 - 4, MCP - 4 SCR2, o Fator H SCR 1-4, ou C4BPA SCR1 - 3 CIDs é analisada de forma semelhante. Exemplo 3 : Inibição da via alternativa do complemento por meio de ACPs

[00163] Em contraste com a via clássica e lectina, que exigem que tanto o magnésio quanto os íons de cálcio para ativação, a ativação da via alternativa do complemento requer apenas os íons de magnésio. Dessa maneira, para quantificar a atividade alternativa do complemen- to na presença de ACP'ss, o ensaio descrito acima foi modificado de tal modo que eritrócitos de coelho (ER) foram incubados com soro, ACP a O a 500 nM, Mg2 + a 5 MM, e EGTA a 5 mM, os quais preferencial- mente quelatos íons de cálcio.

[00164] Para este ensaio, a diluição de soro humano normal (Com- plemento Tecnologia Catalog No. SNS) que lisaram 90% de 1,25 x 107 eritrócitos de coelho / ml (Er, Catálogo da Tecnologia de Complemento No. B300) foi determinada pela primeira vez após 30 minutos de incu- bação a 37ºC. O ensaio foi realizado em tampão GVBO (0,1% de gela- tina, Veronal a 5 mM, NaCl a 145 mM, 0,025% de NaN3, pH 7,3) con- tendo MgCI2 a 5 mM e EGTA a 5 MM . A inibição da via alternativa do complemento foi iniciada através da mistura de uma diluição de soro humano normal, que deve lisar 90% de Er com O a 500 nM das proteí- nas de fusão Fc ACP - 6, ACP - 7, ACP - 9, ou ACP - 10 para 1 hora a 37ºC. Hemólise de Er foi então ensaiada após 30 minutos de incuba- ção do soro e Er medindo a absorção a OD412nm. Os dados foram analisados pela curva sigmoidal de montagem usando Prism 4.

[00165] A análise da porcentagem de hemólise de EA na presença das proteínas de fusão demonstrou que o ACP - 6 exibiu uma muito baixa atividade inibidora com EC50 de 319,9 nM (Figura 3B, círculo fechado). ACP - 7 exibiu um melhor efeito inibidor (2,5 vezes) a CE5O de 127,0 nM (Figura 3B, quadrados fechados). ACP - 9 apresentou um efeito inibidor ainda mais a CESO de 31,9 nM, ou seja, 10 vezes me- lhor do que a sequência de tipo selvagem (APC - 6) (Figura 3B, o tri- ângulo fechado). Em contraste, o ACP - 10 não apresentou qualquer efeito sobre a atividade do complemento até 500 nM (Figura 3B, triân- gulo invertido).

[00166] Ainibição da via alternativa do complemento por ACPs con- tendo DAF SCR2 - 4, MCP - 4 SCR2, o Fator H SCR 1-4, ou CA4BPA SCR1 - 3 CIDs foi ensaiada de forma semelhante. Exemplo 4 : Expressão e purificação da proteína ACVPs biespecífica que inibiu tanto o complemento quanto as vias VEGF

[00167] Uma série de proteínas de fusão biespecífica compreen- dendo um domínio de inibição do complemento (CID), um domínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio de Fe (ou seja, a região Fc de IgG1 humana) foi produzida (Figura 1B). O VID utilizado para as prote- íÍnas de fusão biespecífica era uma fusão VEGFR1 D2 - VEGFR2 D3 do segundo domínio de tipo Ig do VEGFR1 e o terceiro domínio de tipo lg VEGFR?2, ou seja, semelhante à armadilha a olho nu de VEGF, que também é conhecido como Aflibercept (vide, por exemplo, Frampton (2012) Drugs Aging 29 : 839-46 e Ohr et al. (2012) Expert Opin Phar- macother 13 : 585 a 91). Um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão ACVP - 1 foi construído através da inserção de um ácido nuclei- co que codifica o VID a jusante do peptídeo sinal SP2 no Terminal N da ACP - 9 no plasmídeo pV131. O plasmídeo de ACVP - 1 construído foi utilizado para transfectar transitoriamente as células HEK293. O meio de cultura celular contendo o ACVP - 1 secretado foi recolhido 72 horas após a transfecção, e a proteína foi purificada através de croma- tografia de proteína A. Resumidamente, o sobrenadante de cultura contendo secretada ACVP - 1 foi misturada com proteína A -agarose durante a noite antes de se aplicar a uma coluna de polipropileno. As contas foram lavadas com Tris a 0,1 M, pH 8,0 antes da eluição da ACVP - 1 com tampão de eluição (tampão de glicina a 0,1 M, pH 2,5) e de neutralização com tampão Tris de pH 8,0. A proteína eluída foi con- centrada e dialisada contra tampão fosfato de solução salina (PBS) antes da determinação da concentração de proteína final pelo ensaio BCA. A pureza de cada isolado ACVP - 1 foi determinada como sendo > 90%. Uma amostra de 2 ug de ACVP - 1 purificada (faixas 1 e 3) foi comparada com ACP - 9 purificada (faixas 2 e 4) rodando sobre um gel de SDS - PAGE sob condições redutoras (faixas 3 e 4) ou sem condições de redução (as faixas 1 e 2) (Figura 2B). O peso molecular do ACVP - 1 dimérico foi de — 139 kD.

[00168] As posições do domínio de Fe, CID, e de ACVP VID - 1 são reorganizadas em relação a outra. Além disso, os CIDs alternativos, tais como os presentes nas ACPs, e VIDs alternados são usados. Os constructos de ácidos nucleicos que codificam para qualquer um dos ACVPs representados na Figura 18 são preparados e expressos em células de mamíferos, como descrito acima. Do mesmo modo, tais ACVPs são purificados através de cromatografia de proteína A, tal como descrito na presente invenção.

[00169] —ACVPs contendo DAF SCR2 -4, MCP SCR2 +, o Fator H SCR 1-4, ou C4BPA SCR1 - 3 CIDs são construídos. Exemplo 5 : A ligação in vitro de ACVPs ao VEGF

[00170] ELISA foram realizados para determinar se ACVPs se ligam diretamente a VEGF. Resumidamente, as cavidades de uma placa de 96 cavidades de ELISA foram revestidas com 100 ng de VEGF -A (disponível a partir de R & D Systems). O a 10 nM de ACVP purificada foi então adicionada a cada cavidade e incubado durante 1 hora. De- pois de lavar três vezes com 400 mL de PBS contendo 0,1% (v / v) de Tween 20, a 100 ul de uma diluição de anti - Fc HRP (Sigma Catalog

No. AO0170 - 1 ml) 1 : 5000 é adicionado a cada cavidade para a incu- bação de 1 hora. Depois de lavar três vezes com 400 mL de PBS con- tendo 0,1% (v / v) de Tween 20, para parar o reagente substrato TMB (Sigma Catalog No. S5814 - 100 ml) foi adicionada a cada cavidade, e a absorção de OD a 450 nm foi medida. Os dados foram analisados por meio do ajuste de curva sigmoidal ajustando utilizando Prism 4. Como mostrado na Figura 4A, ACVP - 1 apresentou forte ligação ao VEGF, com uma EC50 de 0,22 nM.

[00171] Para se avaliar a afinidade de ligação de ACVPs ao VEGF em solução, 5 : 00 do VEGF - A, foi incubado com O - 100 pM de um ACVP purificado durante a noite a 4 ºC em diluição RD5K tampão (R & D Systems Catalog No. DVEO0O). Após a incubação, a concentração de VEGF livre no tampão foi determinada através de ELISA de sandu- íche utilizando o Kit ELISA quantitativo de VEGF humano (R & D Sys- tems No. de catálogo DVEO0O). Os dados de duas experiências inde- pendentes, utilizando ACVP - 1 foram analisados por meio da curva sigmoidal de ajuste utilizando Prism 4. Como mostrado na Figura 4B, ACVP - 1 exibiu uma forte ligação idêntica a VEGF com uma afinidade de 15:04.

[00172] Testes ELISA também foram realizados para comparar as afinidades de ligação dos ACVP -1, VID e Avastin para VEGF-A. O VID testado foi um fragmento de ACVP - 1, em que o VID tem o domí- nio Fc fundido com o seu terminal C. Sobre 40pM de VEGF165 (293 - VE) foi incubado com 1 nM de ACVP - 1 purificado, VID, ou Avastin durante 45 minutos a 37 º C. Após a incubação, o VEGF livre foi detec- tado usando o Kit Vde Desenvolvimento ELISA de DuoSet de EGF humano (R & D Systems No. de catálogo DY293B) de acordo com as instruções do fabricante. Os dados foram analisados por meio da cur- va sigmoidal de ajuste utilizando Prism 4. Tal como mostrado na Figu- ra 4C, ACVP - 1 exibe uma afinidade para FCEV (com uma EC50 de

0,01 nM —) que é 70 vezes maior do que a ligação de Avastin ou VID ao VEGF (cada um com uma EC50 de — 0,7 nM).

[00173] Outros ACVPs (por exemplo, contendo DAF SCR2 -4, MCP SCR2 44, o Fator H SCR 1-4, ou C4BPA SCR1 -3 como CIDs) são a- nalisados por meio das suas habilidades para se ligam VEGF e para determinar suas afinidades de ligação para VEGF como descrito aci- ma. Exemplo 6 : A ligação in vitro de ACPs ou ACVPs a C3b ou C4b

[00174] Aligaçãodos ACPs ou ACVPs a C3b ou C4b é testada em experimentos diretos de Elisa. As cavidades de placas de 96 cavida- des de ELISA foram revestidas com 100 ng / cavidade de C3b ou C4b (disponível a partir de Tecnologia de Complemento, Inc.). 0-1 uM de um ACP purificado ou ACVP representado na Figura 1 é então adicio- nado a cada cavidade e incubado durante 1 hora. Após lavagem de C3b ou C4b não ligado, 100 ul de uma diluição de anti - Fc HRP (Sig- ma Catalog No. A0170 - 1 ml) 1 : 5000 é adicionada a cada cavidade e incubada durante 1 hora. Após a lavagem, o reagente é parado para Substrato TMB (Sigma Catálogo No. S5814 - 100 ml) que é adiciona- do, e as absorções OD450 nm são medidos. Exemplo 7 : Inibição da DAA para as convertases alternativas por meio de ACPs ou ACVPs

[00175] O decaimento do aceleramento da atividade (DAA) para a C3- convertase alternativa é determinado por ELISA. As cavidades de placas de 96 cavidades de ELISA são primeiro revestidas com 1 ug / ml de C3b (disponíveis a partir de Tecnologia de Complemento, Inc.) e, em seguida, bloqueado. Cada cavidade é então incubada com 400 ng / mL de Fator de B (disponíveis a partir de Tecnologia de Comple- mento, Inc.), 25 ng / ml de fator D (disponível Tecnologia de Comple- mento, Inc.), e NICI2 a 2 mM . Após a lavagem, os complexos de C3bBb (Ni2 +) ligados a placas são incubados com diferentes concen-

trações de ACPs ou ACVPs. Após uma segunda lavagem, os comple- xos C3bBb restantes ligados à placa (Ni2 +) são detectados com anti- corpos de cabra anti -Fator B anticorpo policlonal (disponível Tecnolo- gia de Complemento, Inc.) seguido por coelho HRP - conjugado de antianticorpo de cabra policlonal (Sigma, Inc.). Após a lavagem, o rea- gente é parado para Substrato TMB (Sigma Catálogo No. S5814 - 100 ml) que é adicionado, e as absorções OD450 nm são medidos..

[00176] DAA para C5 - convertase alternativa é determinado por ELISA, tal como descrito acima, exceto que as cavidades das placas de ELISA são revestidas com 1 ug / ml de dímeros C3b. O dimero C3b é gerado por meio do tratamento de 2 mg de C3 (disponível Tecnolo- gia de Complemento, Inc.) com 20 ug de tripsina (disponível a partir de Sigma, Inc.) em 200 ul de PBS durante 3 min a 37 º C. A reação é en- tão interrompida com 200 ng de inibidor de tripsina de soja (disponível a partir de Sigma, Inc.). Dímeros C3b são então formados após a que- bra da ligação tioéster, durante 3 dias a 4 ºC, us ando 15 ug de 0,34 MM de bismaleimido-hexano (disponível de Pierce, Inc.), dissolvido em metanol. O dímero de C3b é purificado por meio da cromatografia em SEC. Exemplo 8 : Inibição da via clássica do complemento por meio de ACVPs

[00177] A capacidade de ACVPs para inibir a via clássica do com- plemento foi ensaiada tal como descrito no Exemplo 2. O ensaio foi realizado em GVB + + de tampão (0,1% de gelatina, veronal a MM 5, NaCl a 145 mM, 0,025% de NaN3, pH 7,3) contendo CaCl2 a 0,15 mM e MgCl2 a 0,5 mM. A inibição da via clássica do complemento foi ati- vada através da mistura da diluição do soro humano normal, que pode lisar 90% de EA, com O - 500 nM de ACVP - 1 durante 1 hora a 370C. Os dados de inibição foram analisados por meio da curva sigmoidal de ajuste utilizando Prism 4. Como mostrado na Figura 5A, a proteína de fusão biespecífica ACVP - 1 exibiu uma potência muito alta de efeito inibitório sobre a ativação do complemento clássica, com uma EC50 de 0,19 nM.

[00178] Outros ACVPs (por exemplo, contendo DAF SCR2 - 4, MCP - 4 SCR2, o Fator H SCR 1-4, ou CABPA SCR1 - 3 como CIDs) são ensaiados como descrito na presente invenção, para determinar a sua capacidade para inibir a via clássica do complemento. Exemplo 9 : Inibição da via alternativa do complemento por meio de ACVPs

[00179] A capacidade de ACVPs para inibir a via alternativa do complemento foi ensaiada tal como descrito no Exemplo 3. O ensaio foi realizado em tampão GVBO (0,1% de gelatina, Veronal a 5 mM, NaCl a 145 mM, 0,025% de NaN3, pH 7,3) contendo MgCI2 a 5 mM e EGTA a 5 mM. A inibição da via alternativa do complemento foi inicia- da através da mistura de uma diluição de soro humano normal, que pode lisar 90% de Er com O - 500 nM de ACVP - 1 durante 1 hora a 370C. Hemólise de Er foi então ensaiada após 30 minutos de incuba- ção do soro e Er. Os dados de inibição foram analisados por meio da curva sigmoidal de ajuste utilizando Prism 4. Como mostrado na Figu- ra 5B o biespecífico ACVP - 1 da proteína de fusão exibiu um efeito inibitório extremamente potente da ativação alternativa do complemen- to, com uma CE50 de 21,1 nM.

[00180] Outros ACVPs (por exemplo, contendo DAF SCR2 - 4, MCP - 4 SCR2, o Fator H SCR 1-4, ou CABPA SCR1 - 3 como CIDs) são ensaiados como descrito acima, para determinar a sua capacida- de para inibir a via alternativa do complemento. Exemplo 10 : Inibição da proliferação de HUVEC ensaio dependente de VEGF por meio de ACVPs

[00181] ACVPs são testados quanto à sua capacidade para inibir a via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade de

VEGF) em um ensaio de base celular. A veia Umbilical Humana das Células endoteliais (HUVECs, Lonza, Inc.), são muitas vezes utilizadas para demonstrar a proliferação de células dependente de VEGF, que pode ser inibida por meio daligação de ACVPs ao VEGF. Neste ensai- o, células HUVEC são mantidas em Meio de Crescimento de Células Endoteliais (Lonza, Inc.), com 2% de FBS. Uma placa de microtitula- ção de 96 cavidades de fundo plano é revestida com colágeno, e é, em seguida, incubada com 50 ul de VEGF-A a 1 nM (R & D Systems, Inc.) e várias concentrações de ACVPs em cada cavidade durante 1 hora a 37 º C. Após incubação durante 1 hora, 50 mL de HUVECs em 1 x 105 células / ml! no Meio - 199 (10% de FBS, Hyclone, Inc.) é adi- cionada a cada cavidade. Após incubação durante 72 horas a 37 ºC com 5% de CO?, a proliferação de células é testada através da adição de 10 ul de CCK - 8 (Dojindo, Inc.) a cada cavidade. A proliferação ce- lular é medida a absorção OD de 450 / 650 nm.

[00182] Por exemplo, ACVP - 1 foi testado quanto à sua capacidade para inibir a via de sinalização de VEGF (por exemplo, a inibição da atividade do VEGF) neste ensaio à base de células e em comparação com a atividade inibitória de VEGF de um CID e um VID. O VID testa- do foi um fragmento de ACVP - 1, em que o VID tem o domínio Fc fundido com o seu terminal C. O CID foi testado em um fragmento de ACVP - 1, em que o CID tem o domínio Fc fundido com o seu Terminal N. Para medir a proliferação de células endoteliais, as células endote- liais da veia umbilical humana (HUVECSs, disponível a partir de Lonza, Inc.), foram semeadas em placas de 96 cavidades (4 x 104 células / cavidade) com Kit de Meio Completo EndoGRO - VEGF. Após 24 ho- ras, as células foram lavadas com PBS e incubadas com 35nm por ml ACVP - 1, VID, ou CID, na presença de 0,3 nM de FCEVI65 em DMEM suplementado com FBS a 20%. Para os controles, as células foram incubadas com PBS, DMEM suplementado com 20% de FBS,

0,3 nM FCEV165 em DMEM com FBS a 20% ou com 35nm de IgG por ml em DMEM com 20% de FBS. Após 48 horas, 10 ul de CCK- 8 (Do- jindo, Inc.) foi adicionado a cada cavidade e a proliferação de células foi medida a absorção de uma OD de 450 / 570 nm em um leitor de microplacas. A análise estatística utilizando o teste t de Student mos- trou que ACVP - 1 inibiu significativamente a proliferação de HUVEC induzida por VEGF, em comparação com o controle de DMEM + VEGF (**p<0,01) e o efeito inibidor de ACVP - 1 foi maior do que a de VID ou CID (Figura 6). Exemplo 11 : ACVPs inibem a ativação de ERK e AKT em HUVECs através da via VEGFR2

[00183] ACVPs são testados quanto à sua capacidade para inibir a ativação da sinalização intracelular a jusante por uma via de VEGFR. Neste ensaio, células HUVEC são pré-tratadas com 3 nmol / ml de IgG, VID, CID, ou um ACVP por 30 minutos e depois estimuladas com 3 nmol / ml VEGF165 por mais 10 minutos. As células são colhidas e analisadas por Western blot, em que o VEGFR (por exemplo, VEG- FR1, VEGFR2 ou FCEVR3), fosforilação de AKT e ERK são avaliadas. GAPDH é usado como um controle de carga. As membranas bloquea- das são sondadas com anticorpos primários contra VEGFR fosforilado (por exemplo, VEGFR1, VEGFR2 ou FCEVR3), GAPDH (1 : 3000 dilu- ição ; Tecnologia de Sinalização Celular, Beverly, MA), Erk fosforilada (p - Erk), proteína de Erk, AKT fosforilado (p - AKkt), e durante a noite a proteína AKkt a 4 ºC. Após lavagem fora os anticorp os primários, anti- corpos secundários conjugados com peroxidase de rábano silvestre (HRP) são adicionados para as membranas e incubados à temperatu- ra ambiente durante 1 hora antes da lavagem adicional e a proteína foi visualizada com um substrato quimioluminescente para HRP.

[00184] Por exemplo, ACVP - 1 foi testado quanto à sua capacidade para inibir a ativação de ERK e AKT através da via de VEGFR2. Neste ensaio, células HUVEC foram pré-tratadas com 3 nmol / ml de IgG, VID, CID, ou ACVP - 1 durante 30 minutos e depois estimuladas com 3 nmol / ml VEGF165 por mais 10 minutos. O VID testado foi um frag- mento de ACVP - 1, em que o VID tem o domínio Fc fundido com o seu terminal C. A CID foi testado um fragmento de ACVP - 1, em que o CID tem o domínio Fc fundido com o seu Terminal N. As células foram colhidas e analisadas por Western blot, em que VEGFR2, AKT e ERK fosforilação foram avaliadas. GAPDH foi usada como um controle de carga. As membranas bloqueadas foram sondadas com anticorpos primários contra VEGFR?2 fosforilada, (diluição 1 : 1000 ; Tecnologia de Sinalização Celular, Beverly, MA), GAPDH (1 : 3000 diluição ; Tec- nologia de Sinalização Celular, Beverly, MA), Erk fosforilada (p - Erk), proteína Erk, AKT fosforilado (p - AKkt), e proteína AKkt durante a noite a 4 ºC. Após lavagem dos anticorpos primários, os anticorpos secundá- rios conjugados com peroxidase de rábano Silvestre (HRP) foram adi- cionados às membranas e incubados à temperatura ambiente durante 1 hora, antes de nova lavagem e visualização da proteína por um substrato quimioluminescente para HRP. Como mostrado na Figura 7, ACVP - 1 e VID inibiu VEGF165 que induziu VEGFR2, ERK, e fosfori- lação AKT, e CID inibiu a fosforilação de ERK.

Exemplo 12 : Inibição de CNV induzido por laser em ratos por meio de ACVPs

[00185] A neovascularização coroide (CNV) é um sintoma comum de degeneração macular relacionada à idade molhada (AMD). CNV ocorre quando novos vasos sanguíneos que se originam na camada coroide do olho crescem através de uma quebra ou defeito na mem- brana de Bruch e invadem o epitélio pigmentar da retina ou subespaço sub-retiniano. Este processo constitui o tecido da cicatriz que finalmen- te provoca cegueira. A neovascularização coroidal induzida por laser (CNV) como um modelo animal é utilizada para testar os tratamentos para DMRI exsudativa. Por exemplo, este modelo pode ser usado para avaliar a capacidade de ACVPs inibir CNV.

[00186] —CNV induzido por laser em camundongos é usado para tes- tar a capacidade de ACVPs e ACPs para inibir a CNV. Neste ensaio, os camundongos são anestesiados com cloridrato de cetamina (100 mg / kg de peso corporal) e as pupilas são dilatadas com tropicamida a 1%, três queimaduras de diodo 532 nm foto-coagulação com laser são entregues a cada retina. As queimaduras são realizadas no dia 9, 12, e 3 posições do polo posterior da retina. A produção de uma bolha no momento do laser, que indica a ruptura da membrana de Bruch, é um fator importante na obtenção de CNV. Para testar a capacidade de um ACVP ou ACP para impedir a formação de CNV induzido por laser, de uma 41ug ACVP ou ACP é injetado intravitrealmente, no mesmo dia da queima a laser. Aos 14 dias após a lesão do laser, os camundongos são injetados intravenosamente com 50 mg de dextrano marcado com fluoresceína e eutanasiados. Os olhos dos ratos são então dissecados para montagens planas coroidais para avaliar a mudança do tamanho das lesões de NVC. Exemplo 13 : Inibição de CNV induzido por laser em macacos por meio de ACVPs

[00187] —CNV induzido por laser em macaco é usado para testar a capacidade de ACVPs e ACPs para inibir a CNV. Resumidamente, 6 a 9 queimaduras de diodo 532 nm fotocoagulação a laser são entregues em torno da mácula em cada olho. Uma dosagem de 0,1 a 0,5 mg de um ACVP é injetado intra-vitrealmente no mesmo dia de queima a la- ser. Cerca de 20 dias depois, os animais são sedados com pentobarbi- tona solúvel de 2,5% por via intravenosa (1 mL / kg). As pálpebras são fixas para manter o olho aberto e acessível. As fotografias a cores são primeiramente tiradas com uma câmera de fundo de olho. Após a foto- grafia inicial, de fluoresceína (20% de fluoresceína de sódio a 0,05 ml /

kg) é injetado através de uma veia da extremidade inferior. As fotogra- fias são tiradas em vários momentos após a injeção de contraste, in- cluindo a fase arterial, fase arteriovenosa precoce, e várias fases arte- riovenosas finais. O vazamento de fluoresceína associado a lesões de NVC é monitorizado.

[00188] Por exemplo, um modelo CNV induzido por laser foi criado em macacos Rhesus, com idades variando de 3 a 6 anos de idade. Um total de oito macacos foram divididos nos seguintes quatro grupos que foram administrados : 1) controle de veículo (PBS) ; 2) ACVP1 (0,5 mg / olho) ; 3) VID (0,5 mg / olho) ; ou 4) CID (0,5 mg / olho). No total, foram dois macacos (quatro olhos) por grupo. O VID testado foi um fragmento de ACVP - 1, em que o VID tem o domínio Fc fundido com o seu terminal C. O CID foi testado um fragmento de ACVP - 1, em que o CID tem o domínio Fc fundido com o seu Terminal N. Cerca de 6 a 9 queimaduras de diodo 532 nm foto-coagulação a laser foram entregues em torno da mácula em cada olho. De controle do veículo (PBS) ou uma dose de 0,5 mg ACVP -1, VID, ou CID, foi injeção intra- vítrea em 21 dias após a queima de laser. Quatorze dias após a admi- nistração da dose, os animais foram sedados com pentobarbitona so- lúvel 2,5% por via intravenosa (1 mL / kg). As pálpebras foram fixadas para manter o olho aberto e acessível. As fotografias coloridas foram levadas primeiro usando uma câmera de fundo de olho. Após a foto- grafia inicial, de fluoresceína (20% de fluoresceína de sódio a 0,05 ml / kg) foi injetado via uma veia da extremidade inferior. As fotografias fo- ram tiradas 5 minutos após a injeção de corante, incluindo a fase arte- rial, arteriovenosa fase precoce, e várias fases arteriovenosas finais para monitorizar o vazamento de fluoresceína associada a lesões de NVC. A área local em foto foi medida como uma área de vazamento. Análise das fotografias de fuga ponto mostrou que a área de vazamen- to que a média do grupo tratado com veículo foi maior aos 14 dias pós

- injeção, em comparação com a área de vazamento, antes de injeção PBS (Figura 8A). Por outro lado, o vazamento em macacos injetados com qualquer ACVP - 1 (Figura 8B), VID (Figura 8C), ou CID (Figura 8D) foi reduzida de 14 dias após a injeção, em comparação com a á- rea de vazamento, antes de injeção. A análise estatística utilizando o teste t de Student mostrou que o número de área local e de fuga foi significativamente inferior a pré - dose nos animais tratados com ACVP - 1 ou VID (Tabela 3). Nos animais tratados com CID, a área de vaza- mento também foi significativamente menor do que antes da dose (Quadro 3). No geral, ACVP -1 teve melhor eficácia do que VID e CID na inibição de CNV induzida por laser. Tabela 3. Número de Locais e área de vazamento no modelo CNV de macaco nimal | olho ro do vaza- ro do vaza- local mento local mento (mm?) (mm?)

2.65 6.3 2.65 5.2

2.63 6.3 1.29** 0.3**

2.16 41 1.82* 0.7* 171 3.5 1.50 2.8* Em comparação com a de pré-dose, * p < 0,05, ** p < 0,01 Exemplo 14 : Inibição do crescimento do tumor de xenoenxerto huma- no em camundongos por meio de ACP e ACVPs

[00189] Várias células de câncer humanas, tais como carcinoma hepatocelular humano de células Hep3B (ATCC * HB - 8064) e células de câncer colorrectal humano LoVo (ATCC * CCL - 229), podem ser utilizadas para estabelecer os modelos de xenotransplante em camun- dongos nus. A fim de avaliar os efeitos inibidores do ACP e ACVPs sobre o crescimento do tumor, várias concentrações de cada ACP e cada ACVP (por exemplo, 0,1-10 mg / kg) é administrada por via intra- venosa duas vezes por semana em camundongos após a implantação de células de tumor. O crescimento do tumor é medido semanalmente até 7 semanas. Exemplo 15 : A avaliação farmacocinética dos ACP e ACVPs em ca- mundongos e macacos

[00190] Uma dose de 10 a 40 mg / kg de cada ACP e ACVP é ad- ministrada em camundongos ou macacos, por meio da injeção subcu- tânea ou injeção intravenosa. As amostras de soro são tiradas em dife- rentes pontos de tempo após a injeção, por até 15 dias. As concentra- ções de cada ACP ou proteína de fusão ACVP nas amostras de soro são determinadas usando um ensaio de ELISA ensanduichado.

SEQUÊNCIAS Sequências de aminoácido e ácido nucleico SCR1-3 de CRI humano 1 caatgcaatg ccecagaatg gettecattt gccaggecta ccaacetaac tgatgaattt

Q ECN APE WL PF ARP TNL T DEF 61 gagtttccca ttgggacata tetgaactat gaatgcegec ctggttatte cggaagaceg

E F P GT Y L NY E C R P GY S GG RP 121 ttttctatca tetgcetaaa aaactcagte tggactggtyg ctaaggacag gtgcagacgt

FS TI LI CL KNSV WTG AKD RCRR 181 aaatcatgte gtaatectec agatectgtg aatggcatgg tgcatgtgat caaaggcate

K SC RNP P DPV NGM VHV IKGI 241 cagtteggat cccaaattaa atattcttgt actaaaggat accgactcat tggttccteg Q FG Ss o I K Y 8 C T K G Y R L I G SS 301 tectgccacat gcateatete aggtgatact gtcatttggy ataatgaaac acctatttgt S A Cc I I Ss 6 DT VvV I W D N E T P Cc 361 gacagaatte cttgtgggct accceccace atcaccaatg gagatttcat tagcaccaac

DRI PCG LPPT ITN GDF ISTN 421 agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg acctaccgct gcaatectgg aagcggagyg R EN FHY GSVV TYR CNP GS6GG 481 agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgagece tecatatact gcaccageaa tgacgatcaa R K vV F E V GEP Ss I Y Cc TS N DODOQO 541 gtgggcatet ggageggece cgececteay tgcatt (SEQ ID NO : 17) V GI WS G PAPO CI (SEQIDNO:1) Sequências de aminoácido e ácido nucleico SCR1-3 N29K / DIO9N de CRI Humano 1 caatgcaatg ccccagaatg gcttecattt gccaggecta ccaacctaac tgatgaattt

Q CN A FP E W L P F A R P T N L T D E F 61 gagtttccca ttgggacata tetgaaatat gaatgcegec ctggttatte cggaagaceg

E FP IGT YLKY ECR PGTY SGRFPF 121 ttttctatca tctgcetaaa aaactcagte tggactggtg ctaaggacag gtgcagacgt

FS TI LI CL KNSV WTG AKD RCRR 181 aaatcatgtc gtaatectec agatectgtg aatggcatgg tgcatgtgat caaaggcate

K SC RNP PDPV NGM VHV IKGI 241 cagtteggat cccaaattaa atattcttgt actaaaggat accgactcat tggttccteg

Q FG SQI KYSC TKG YRL IGSS 301 tetgccacat gcateatete aggtaatact gtcatttogy ataatgaaac acctatttgt SAT CII SGNT VI1IW DNE TP1C 361 gacagaatte cttgtgggct accceccace atcaccaatg gagatttcat tagcaccaac

DRI PCG LPPT ITN GDF ISTN 421 agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg acctaccgct gcaatectgg aageggaggg R EN FHY GSVV TYR CNP GS6GCG 481 agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgagcce tecatatact gcaccagcaa tgacgatcaa R K vV F E V G E P Ss I Y Cc TS N D DO 541 gtgggcatet ggageggece cgceeeteag tgcatt (SEQ IDNO : 18) ve W SG PA PQ C II (SEQIDNO: 2) Sequências de aminoácido e ácido nucleico SCR1-3 S37Y / G79D de CRI Humano 1 caatgcaatg ccecagaaty gettecattt gccaggecta ccaacetaac tgatgaattt

Q CN APFPE WL PF AR P TNL T DEF 61 gagtttccca ttgggacata tetgaactat gaatgcegec ctggttatta cggaagaceg

E FP IGT YLNY ECR PGTY YGRP 121 ttttctatca tetgcctaaa aaactcagte tggactggty ctaaggacag gtgcagacgt

FS TI ICL KNSV WTG AKD RCRR 181 aaatcatgte gtaatectec agatectgtg aatggcatgg tgcatgtgat caaagacatc

K SC RNP PDPV NGM VHV IKDI 241 cagtteggat cccraaattaa atattcttgt actaaaggat accgactcat tggttccteg Q FG Ss o I K Y SS C T K G Y R L I GE SS 301 totgccacat geateatete aggtgatact gtcatttagyg ataatgaaac acctatttgt S A Cc I I Ss GG DT VvV I W D NE T P Cc 361 gacagaatte cttgtgggct accceccace atcaccaatg gagatttcat tagcaccaac

DRI PCG LPPT ITN GDF ISTN 421 agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg acctaccgct gcaatectgg aageggaggg

R EN FHY GSVV TYR CNP GS6GEG 481 agaaaggtgt ttgagettgt gggtgagece tecatatact gcaccageaa tgacgatcaa

R KV FEL VGEP SIY CTS NDDO 541 gtgggcatet ggageggece cgceeeteag tgcatt (SEQ IDNO : 19) ve WS P A PQ C II (SEQIDNO: 3) Sequências de aminoácido e ácido nucleico SCR1-3 N29K / S37Y / G79D / DIO9N de CR1 Humano 1 caatgcaatg ccccagaatg gettecattt goecaggecta ccaacetaac tgatgaattt

Q ECN APE WL PF AR P TNL T DEF 61 gagtttccca ttgyggacata tetgaaatat gaatgcegee ctggttatta cggaagaceg

E FP IGT YLKY ECR PGY YGRP 121 ttttotatea tetgectaaa aaacteagte tggactggtg ctaaggacag gtgcagacgt

F SI ICL KNSV WTG AKD RCRR 181 aaatcatgte gtaatectec agatectgtg aatggcatygg tgcatgtgat caaagacate

K SC RNP PDPV NGM VRHV IKDI 241 cagtteggat cccaaattaa atattcttgt actaaaggat accgacteat tggttecteg

Q FG SQI KYSC TKG YRL IGSS 301 totgccacat gcateatete aggtaatact gtcatttggg ataatgaaac acctatttgt

SAT CII SGNT VIW DNE T PIC 361 gacagaatte cttgtggget accceecace ateacceaatg gagatttcat tagcaccaac

DRI PCG LPPT ITN GDF ISTN 421 agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg acctaceget gcaatectgg aageggaggg

R EN FHY GSVV TYR CNP GSGEEG 481 agaaaggtgt ttgagcttgt gagtgageco tecatatact gcaccageaa tgacgatcaa

R KV FE V GEP SI Y C TS NDDÇO 541 gtgggcatet ggageggece cgceeeteag tgcatt (SEQ ID NO : 20) V GI WS G PA PQ C I (SEQIDNO:4) Sequências de aminoácido e ácido nucleico SCR8-10 de CR1 Humano 1 cactgtcaag ccecagatea ttttotgttt gccaagttga aaacccaaac caatgcatect

H C Q AP D HF LF AKL K TO TNAS

61 gactttccca ttgggacate tttaaagtac gaatgcegte ctgagtacta cgggaggeca

DF P IGT SLKY ECR PE Y YGRP 121 ttctetatea catgtetaga taacctggte tggtcaagte ccaaagatgt ctgtaaacgt

FS T CL DN V WS SS PK D VC KR 181 aaatcatgta aaactecctec agatccagtg aatggcatgg tgcatgtgat cacagacatec

K SC KT P PDPV NGM VRHV ITDI 241 caggttggat ccagaatcaa ctattettgt actacagggec acegacteat tggtcactea

Q VG SRI NYSC TTG HRL IGHS 301 toctgetgaat gtatectete gageaatgct geccattgga gcacgaagec gecaatttgt S AE C IL SGNA AH W STK PPI1IC 361 caacgaattec cttgtgggct acceccecace ategecaatg gagatttcat tagcaccaac 2 R P CG LP PT IAN G DF IS TN 4121 agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg acctacegct gcaatectgyg aageggaggo R E N FHY GSVV TYR CNP GS6GEG 4181 agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgageco tecatatact gcaccageaa tgacgatcaa R KV FEL V GEP S1IY CTS NDDÇO 541 gtgggcatet ggageggece ggceceteag tgcatt (SEQ IDNO : 21) ve WS P A PQ C II (SEQIDNO: 5) Sequências de aminoácido e ácido nucleico SCR1I-10 de CR1 Humano 1 caatgcaatg ccccagaatyg gettecattt gocaggecta ccaacetaac tgatgaattt

Q ECN APE W LPF AR P TNL T DEF 61 gagtttccca ttgggacata tetgaactat gaatgcegee ctagttatte cggaagaceg

E FP IGT YLNY ECR PGY SGRP 121 ttttctatea tetgectaaa aaactcagte tggactggtg ctaaggacag gtgcagacgt FS 1 CL K NS V W TG AKD RCRR 181 aaatcatgte gtaatectec agatectgtg aatggcatgg tgcatgtgat caaaggcate

K SC RNP P DPV NGM VHV IKGI 241 cagtteggat cccaaattaa atattcttgt actaaaggat acegacteat tggttecteg

EQ FG SQI KYSC TKG YRL IGSS

301 tetgccacat gcateatete aggtgatact gtcatttggg ataatgaaac acctatttgt SAT CI SGDT VIW DNE TP1C 361 gacagaattc cttgtgggct acccecccace atcaccaatg gagatttcat tagcaccaac

DRI PCG LPPT ITN GDF ISTN 421 agagagaatt ttcactatgg atcagtggty acctaceget gcaatectgg aageggaggg R EN FHY GSVV TYR CNP GS6GEG 481 agaaaggtgt ttgagcttgt gggtgageco tecatatact gcaccagcaa tgacgatcaa R KV FEL VGEP S1IY CTS NDDO 541 gtgggcatct ggageggece cgcceeteag tygcattatac ctaacaaatg cacgccteca

V GI WSG PAPQ CII PNK CTPP 601 aatgtggaaa atggaatatt ggtatctgac aacagaaget tattttectt aaatgaagtt

N VE NGI LVSD NRS LFS LNEV 661 gtggagttta ggtgtcagec tggetttgte atgaaaggac ccegeegtygt gaagtgccag

V EF RCQO PGFV MKG PRR VKCO 721 gcectgaaca aatgggagec ggagetacca agctgcteca gggtatgtea gecaceteca

A LN K WE P ELF SCS RVC QPPP 781 gatgtcctgc atgctgageg tacccaaagg gacaaggaca acttttcacc tgggcaggaa DV L HAE RTOR DK D NFS P6GQOQE 841 gtgttctaca getgtgagec cggetacgac ctcagagyggg ctgegtetat gegetgcaca

V FY SCE PGYD LRG AAS MRCT 901 ccccagyggag actggagece tgcagcceee acatgtyaag tgaaatcctg tgatgactte

PQG DWS PAAP TCE VKS C D DF 961 atgggccaac ttcttaatgg cegtgtgcta tttccagtaa atctecaget tggagcaaaa

M GQ LLN GRVL FP V NLOQO LGARK 1021 gtggattttg tttgtgatga aggatttcaa ttaaaaggea gctetgetag ttactgtgte

V DF VCD EGFQO LKG SSA SS Y CV 1081 ttggctggaa tggaaagect ttggaatage agtgttocag tgtgtgaaca aatettttgt L AG MES LWNS SVP VCE Q1IFC 1141 ccaagtcete cagttattcc taatgyggaga cacacaggaa aacctetgga agtetttece

PSP PVI PNGR HTG KPL EVFP

1201 tttgggaaaa cagtaaatta cacatgcgac ccecacecag acagagyggac gagettegac

FGK T VN YTCD PHP DRG TSFD 1261 ctcattggag agagcaccat cegetgcaca agtgaccete aagggaatgg ggtttggage L I G E Ss R CT Ss ) P Q GN G V WS 1321 agcectgece ctegetgtgyg aattctgggt cactgtcaag ccccagatea ttttetgttt s P A P ROC G G H CC Q A P o H F L F 1381 gccaagttga aaacccaaac caatgcatet gactttecca ttgyggacate tttaaagtac

A KL K TO TNAS DF P IGT SLKY 1441 gaatgcegte ctgagtacta cgggaggecca ttetetatea catgtetaga taacetggte E CR PEY YGRP FSI1I TCL DNLV 1501 tggtcaagte ccaaagatgt ctgtaaacgt aaatcatgta aaactecetec agatecagto W SS. PK D VOC K R K S C K T P P D PV 1561 aatggcatgg tgcatgtgat cacagacatc caggttggat ccagaatcaa ctattettgt

N GM VHV IT DI QVG SRI NYSC 1621 actacaggge acegacteat tggteactea tetgctgaat gratectete gggcaatget

T TG HRL IGHS SAE C IL SGNA 1681 gcccattgga gcacgaagec gecaatttgt caacgaatte cttgtggget accccecace

A HW STK PPIC QRI PCG LPPT 1741 atcgccaatg gagatttcat tagcaccaac agagagaatt ttcactatgg atcagtggtg

I A N G DF S TN R E N F HH Y GS VV 1801 acctaceget geaatectgg aageggagygy agaaaggtgt ttgagettgt gggtgagece

T YR CNP GSGG RKV FEL V GEP 1861 tocatatact gcaccageaa tgacgatcaa gtgggcatet ggageggece ggccectrag

S IY C TS NDDQO VGI WS G PAPO 1921 tgcatt (SEQ IDNO : 22) C TI (SEQIDNO: 6) Sequências de aminoácido e ácido nucleico Fc n De IgGl humano 1 gacaaaacte acacatgcee acegtgceca geacetgaae tectaggggg acegteagte

D KT HTC PPCP APE L LG GPSV 61 ttcctettee cecraaaace caaggacace cteatgatet cceggacece tgaggteaca

F LF PPK PKDT LMI SRT PEVT 121 tgcgtygtggy tggacgtgag ccacgaagac cctgaggtca agttcaactg gtacgtogac Cc vv V DV SHED PEV KFN WYVD 181 ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag ccgegyggagy agcagtacaa cagcacgtac

G VE VHN AKTK PRE E QY NS TY 241 cgtgtggtca gegtecteac cegtectgcac caggactgge tgaatggcaa ggagtacaag

R VV SVL TVLH QDMW LNG KEYK 301 tgcaaggtct ccaacaaage ceteccages cecategaga aaaccatete caaagccaaa C KV SNK AL PA PIE KTI1I SKAK 361 gggcagcece gagaaccaca ggtgtacace ctgcccccat ccegggagga gatgaccaag

GQ P REP QVYT LPP SRE E MTK 421 aaccaggtca gcetgacetg cetggteaaa ggcttoetate ccagegacat cgcegtagag

NQV SLT CLVK GF Y PSD IAVE 481 tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcetecegt getggactee W ES N6GOQO PENN YKT TP P VLDS 541 gacggctect tettecteta tagcaagete acegtggaca agagcaggty gcagcagggy DGS FFL YSKL TVD K SR W0Q006G6 601 aacgtcttet catgeteegt gatgcatgag getetygcaca accactatac gcagaagage

NV F SCS VMHE ALH NHY TOKS 661 ctetecetgt cteegggtaa a (SEQ IDNO : 23) L SL S PG K (SEQIDNO:7) Sequências de aminoácido e ácido nucleico G6 1 ggaggtggag goeggtggt (SEQ ID NO : 24) G GG G GG (SEQIDNO: 88 Sequências de aminoácido e ácido nucleico SPl 1 atggcctgga tgatycttet ccteggacte cttgcttatg gatcaggagt cgactet (SEQ ID NO : 25) M AW MML LLGL LAY GSG V DS (SEQID NO : 9)

Sequências de aminoácido e ácido nucleico SP2 1 atggagacag acacactect getatgggta ctgctgetet gggttecagg gtegactage

MET DTL LLWV LLL W VP GSTEG 61 gacact (SEQ IDNO : 26) D T (SEQ IDNO : 10) Sequências de aminoácido e ácido nucleico VEGFR-l D2-VEGFR-2 D3 1 ggtagacctt tegtagagat gracagtgaa atcccegaaa ttatacacat gactgaagga G RP F VE MY SE I PE I 1H MTEG 61 agggagecteg teattecetg cegggttacg tcacetaaca teactgttac tttaaaaaag

REL VIP CRVT SPN ITV TLKK 121 tttccacttg acactttgat ccctgatgga aaacgcataa tctgggacag tagaaaggge F PL DT P DG KRI1I IWD SRKG 181 ttcatcatat caaatgcaac gtacaaagaa atagggctte tgacctgtga agcaacagte

F II SNA TYKE IGL LTC E ATV 241 aatgggcatt tgtataagac aaactatctec acacategac aaaccaatac aatcatagat NGH LYK TNYL THR QTN TI11D 301 gtggttctga gteegtetea tagaattgaa ctatetgttg gagaaaaget tgtettaaat

V V L S PS HGTIE LS V GEK LV LN 361 tgtacagcaa gaactgaact aaatgtgggg attgacttca actgggaata ccettetteg

CTA RTE LNVG I DF NWE Y P SS 421 aagcatcage ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtetgg gagtgagato

K HE Q HKK LV NR DLK TOS GSEM 4181 aagaaatttt tgagcacctt aactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac

K K F LST LTID GVT RS D QGLY 541 acctgtgcag catccagtgg gctgatgacc aagaagaaca gcacatttgt cagggtccat

T CA ASS GLMT KKN STF VRVH 601 gaaaag (SEQ IDNO : 27) E K (SEQIDNO: 11) Sequências de aminoácido e ácido nucleico ACVP-1

1 ggaagacctt ttgttgaaat gtattctgaa attcctgaaa ttattcatat gactgaagga G RP F VE MYSE I PE II 1H MTEG 61 agagaacttg ttattcettg tagagttact tetectaata ttactgttac tettaagaag

R EL VIP CRVT SPN ITV TLKK 121 tttectettg atactettat tectgatgga aagagaatta tttgggatte tagaaagyga F PL DTL IP DG KRI1I IWD SRK6G 181 tttattattt ctaatgctac ttataaggaa attggacttc ttacttgtga agctactgtt

F II SNA TYKE IGL LTC E ATV 241 aatggacatc tttataagac taattatctt actcatagac aaactaatac catcatcgac NGH LYK TNYL THR QTN TI1I1LD 301 gtggttetga gteegtetoa tggaattgaa ctatctgttg gagaaaaget tgtcttaaat

VV L SPSS HGIFE LSV GEK LVLN 361 tgtacagcaa gaactgaact aaatgtggyg attgacttca actgggaata cccttetteg

CTA RTE LNVG I DF NWE Y P SS 421 aagcatcagc ataagaaact tgtaaaccga gacctaaaaa cccagtetgg gagtgagato

K H Q H KK LV NR DLK TOS GSEM 481 aagaaattct tgagcaccct gactatagat ggtgtaaccc ggagtgacca aggattgtac

K KF LST LTID GVT RSD QGLY 541 acctgtgcag catccagtgy gctgatgace aagaagaaca gcacatttgt cagggtecat

T CA ASS GLMT KKN STF VRVHE 601 gaaaaagaca aaactcacac atgtccaceg tgtccagecac ctgaactect gggtggaceg

E K D K THB TCPP CPA PEL LGGP 661 tcagtettee tettecaeea aaaacccaag gacaccetea tgateteceg gacccctgag

SVF LF P PKPRK DTL MIS RTPE 721 gtcacatgeg tagtggtaga cgtgagecac gaagacectg aggtcaagtt caactagtac

VTC VVV DVSH E DP E VRK FNWVWY 781 gtggacggcg tggaggtgca taatgccaag acaaageege gggaggagea gtacaacage

V DG VEV HNARK TKP REE QYNS 841 acgtacegtg tggtcagegt ceteacegte ctgcaceagg actggctgaa tggcaaggag

T YR V VS VLTV LHQ DWL NGKE

901 tacaagtgca aggtctccaa caaagecete ccagecececa tegagaaaao catctecaaa Y K Cc K VS NKAL PAP IEK T1ISK 961 gccaaaggge agcccegaga accacaggty tacaccetge ceceateceg ggatgagetg

A KG Q PR E POQV YTL PPS R DEL 1021 accaagaacc aggtcagect gacctgccty gtraaagget tetateccag cgacategec

TKN QVS LTCL VKG FYP S DIA 1081 gtggagtygy agagcaatgy gcagceggag aacaactaca agaccacgce tecegtgeta

V E W E SN GQPE NNY K TT PPVL 1141 gactcegacgy getecttett cctetacage aageteaceg tggacaagag caggtggcag

DS D GSF FLYS KLT V DK SRYMYWO 1201 caggggaacy tetteteatyg cteegtgatyg catgaggete tgcacaacea ctacacgcag Q GN VFS CSsSvVM HEA LHN HY TO 1261 aagagcctet cectgtetee gggtaaaggt ggaggaggeg gtggtcaatg caatgcccca

K SL S LS PGKG GGG GGCOQ CNAP 1321 gaatggctte catttgccag gcctaccaac ctaactgatg aatttgagtt tcccattggg E WL PFA RPTN LTD EFE FPI1G 1381 acatatctga aatatgaatg ccgccctagt tattacggaa gacegtttte tatcatetge T YL KYE CRPG YYG RPF S11C 1441 ctaaaaaact cagtctggac tggtgctaag gacaggtgca gacgtaaate atgtegtaat

L KN SVW TGARK DRC RRK S CRN 1501 cctecagate ctgtgaatgy catggtgcat gtgatcaaag acatccagtt cggatcccaa P PD PVN GMVH VI1IK DI1IQ FGSO 1561 attaaatatt cttgtactaa aggataccga ctcattggtt cctegtetge cacatgcate I1TKY SCT KGYR LIG SSS ATCI 1621 atctcaggta atactgtcat ttgggataat gaaacaccta tttgtgacag aattccttgt 1 SG NTV IWDN ETP I CD RIPC 1681 gggctaccce ceaccateac caatggagat ttcattagca ccaacagaga gaattttcac

GLP PTI TNGD FIS TNR ENFH 1741 tatggatcag tggtgaccta ccgctgcaat cctggaageg gagggagaaa ggtgtttgag Y GS vV VT YRCN PGS GGR KVFE

1801 cttgtgggtg agccctecat atactgcace agcaatgacg atcaagtggg catctggage

L VG E PS IYCT SND DOV GIMWS 1861 ggcecegeac ctreagtgcat t (SEQ IDNO : 28) G PA PQC (SEQ ID NO : 12) Sequências de amincácido e ácido nucleico DAF SCR2-4 1 egtagetgeg aggtygccaac aaggctaaat tetgcatece teaaacages ttatatcact R SC E VP TRLN SAS L KQ PYI1IT 61 cagaattatt ttccagtegyg tactgttgtg gaatatgagt gcegtecagg ttacagaaga

Q NY F PV GTVV EYE CRP GYRR 121 gaaccttete tatcaccaaa actaacttgc cttcagaatt taaaatggtec cacagcagte E PS LS P K L TC L Q N K W s AV 181 gaattttgta aaaagaaatec atgccetaat ccgggagaaa tacgaaatgg tcagattgat E FC KKK SC PN PGE I RN GoQID 241 gtaccaggtg gcatattatt tggtgcaace atetecttet catgtaacac agggtacaaa

V PG GIL FGAT IS F SCN TGYK 301 ttatttggct cgacttetag tttttgtett atttcaggca getetgteca gtggagtgac L F G Ss TS S F Cc L I Ss 6 Ss Ss vV EQ W SD 361 cegttgccag agtgcagaga aatttattgt ccagcaccac cacaaattga caatggaata

PL P ECR EIYC PAP PQOQI DNGI 421 attcaagggyg aacgtgacca ttatggatat agacagtctg taacgtatgc atgtaataaa 1Q0QG ER D HY GY ROS VT Y ACNK 4181 ggattcacca tgattggaga gcactetatt tattgtactg tgaataatga tgaaggagag GF T MIG EHSI1I YCT VNN DE GE 541 tggagtggce caccacetga atgcaga (SEQ IDNO : 29) W Ss E P P P E C R (SEQ ID NO : 13) Sequências de aminoácido e ácido nucleico MCP SCR2-4 1 agagaaacat gtccatatat acgggatcet ttaaatggece aageagtece tgcaaatogg

R ET C PY IR DP LNG QAV PANG

61 acttacgagt ttggttatca gatgcacttt atttgtaatg agggttatta cttaattogt T YE FGY QMHF ICN EGY YLI1IG 121 gaagaaatte tatattgtga acttaaagga tcagtagcaa tttggagegg taageceeca

E E L Y C E L K G S VA I WS G K P P 181 atatgtgaaa aggttttgtg tacaccacct ccaaaaataa aaaatggaaa acacaccttt I1TCE KVL CTPP PKI KNG KRHETF 241 agtgaagtag aagtatttga gtatcttgat gcagtaactt atagttgtga tcctgcacect

S EV E VF EYLD A VT YSC DPA FP 301 ggaccagatec cattttcact tattggagag agcacgattt attgtggtga caattcagtg GP D PFS LIGE ST1I YCG DNSV 361 tggagtegtg ctgctecaga grgtaaagty gtcaaatgte gatttecagt agtegaaaat

WS R A A P E C K V V K C R F P V V E N 421 ggaaaacaga tatcaggatt tggaaaaaaa ttttactaca aagcaacagt tatgtttgaa

GKQ ISG FGKK F YY KAT VMFE 481 tgcgataagg gtttttacct cgatggcage gacacaattg tctgtgacag taacagtact Cc DK GFY LDGS DTI VCD SNST 541 tgggatecce cagttecaaa gtgtett (SEQ IDNO : 30) W DP P VP K Cc (SEQ ID NO : 14) Sequências de aminoácido e ácido nucleico SCR1-4 do Fator H 1 gaagattgca atgaacttcc tccaagaaga aatacagaaa ttctgacagg ttcetggtet

E DC NEL PPRR NTE ILT GSWS 61 dgaccaaacat atccagaagyg cacccaggct atctataaat gcegecetgg atatagatct

DOT Y PE GTÇQOQA IYK CRP GYRS 121 cttggaaatg taataatggt atgcaggaag ggagaatggy ttgctettaa tecattaagg L GG N VvV I M VC R K G E W V A L N P L R 181 aaatgtcaga aaaggccetg tggacatcct ggagatacte cttttggtac ttttaccctt K co KR P CGHP GDT PFG TFTL 241 acaggaggaa atgtgtttga atatggtgta aaagctgtgt atacatgtaa tgaggggtat

T GG NVF EYGV KAV YTC NEGY

301 caattgctag gtgagattaa ttaccgtgaa tgtgacacag atggatggac caatgatatt

Q LL GEI NYRE C DT DGW TNDI 361 cctatatgtg aagttgtgaa gtgtttacca gtgacageac cagagaatgg aaaaattgte P Cc E V V K C P V T A P E N G K I vV 421 agtagtgcaa tggaaccaga tcgggaatac cattttggac aagcagtacy gtttgtatgt

S SA MEP DREY HF G QAV RFVC 481 aactcaggct acaagattga aggagatgaa gaaatycatt gttcagacga tggtttttgg

N SG YKI E GDE E MH CS D DGFYW 541 agtaaagaga aaccaaagtyg tgtggaaatt tcatgcaaat ccccagatgt tataaatgga SK E K PK CVEI SCK SPD VI1ING 601 tetectatat ctragaagat tatttataag gagaatgaac gatttcaata taaatgtaac Ss .P Ss o RkK 1 Y K E NE RF OQ Y K CN 661 atgggttatg aatacagtga aagaggagat gctgtatgca ctgaatctgg atggegteeg

M GY EYS E RGD AVC TES G WRP 721 ttgccttcat gtgaa (SEQ ID NO : 31) L PS CE (SEQIDNO: 15) Sequências de amincácido e ácido nucleico C4BPA SCR1-3 1 aattgtggte ctecacecae tttateattt getgcccega tgagatattac gttgactgag

N CG PPP TLSF AAP MDI TLTE 61 acacgcttca aaactggaac tactctgaaa tacacctgcc tecetyggeta cgtceagatee

TRF KTG TTLK Y TC LPG YVRS 121 cattcaacte agacgcttac ctgtaattct gatagegaat gggtgtataa caccttectgt

HST QTL TCNS DGE WVY NTFC 181 atctacaaac gatgcagaca cccaggagag ttacgtaatg ggcaagtaga gattaagaca I Y K R C R H P GE L R N GQ YvVv E K T 241 gatttatctt ttggatcaca aatagaattc agctgttcag aaggattttt cttaattage

D LS FGS QIEF SCS EGF FLIG 301 tcaaccacta gtegttgtga agtccaagat agaggagttg gctggagtca tectetecea

S TT SRC EVOQOD RGV GWS HPLP

361 caatgtgaaa ttgtcaagtg taagcctect ccagacatca ggaatggaag gcacageggt

QCE IVK CKPP PDI RNG RHSG 421 gaagaaaatt tctacgcata cggecttttet gtreacetaca getgtgacee cegettetea

E EN F YA YGFS VTY SC D PRFS 481 ctcttgggco atgcctecat ttettgcact grggagaatyg aaacaatagg tgtttggaga

L LG HAS IS CT VEN E TI GVMWR 541 ccaageccete ctacctgtga a (SEQ IDNO : 32) PS P PTC E (SEQIDNO: 16) Sequência de aminoácido ACVP-2

QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHV IKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTY RCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGINSGPAPQCIGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDT LMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNK ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG SFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGKGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVI PCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIINDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDV

VLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQOSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDO GLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO : 33) sequência de aminoácido ACVP-3

QCNAPEWL PFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHV IKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTY RCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGINSGPAPQCIGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVT SPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPS HGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHOHKKLVNRDLKTOSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDOGLYTC AASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKEN WYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQOPREPQVYTLP

PSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOQGNVFSCSVM HEALHNHYTOKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 34) sequência de aminoácido ACVP-4

GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRI INDSRKGFIISNATYKEIGLLTC EATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDL KTQOSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEF EFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWIGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRL IGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSI YCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHED PEVKFNWYVDGVEVENAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGOPREP

QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNV FSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPG (SEQ ID NO : 35)

sequência de aminoácido ACVP-5

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPGGG GGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRI INDSRKGFIISNATYKEIG LLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLV NRDLKTOSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDOGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNL TDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWIGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTK

GYRLIGSSSATCIISGNTVINDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVG EPSIYCTSNDDOVGINSGPAPQCI (SEQ ID NO : 36) sequência de aminoácido ACVP-6

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPGGG GGGGQOCNAPENWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWIGAKDRCRRKSCRNPPDPVNG MVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVINDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGS VVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIP CRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFI ISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVV

LSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTOSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDOG LYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK (SEQ ID NO : 37) sequência de aminoácido VEGFR-1 D2-VEGFR-2 D3

DTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIINDSRKGFIISNATYKEIGLL

TCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNR DLKTOSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQOGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK “ (SEQ ID NO : 38) sequência de aminoácido Fc de IgGl Humano

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 39) sequência de aminoácido ACVP-1'

DTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLL TCEATVNGHLYKTNYLTHROTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNR DLKTOSGSEMKKFLSTLT IDGVTRSDQOGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHODWLNGKEYK CKVSNKALPAPIEKTISKAKGQOPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFY PSDIAVENESNGQPENNYKTTPP VLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPGKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDE FEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYR

LIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPS IYCTSNDDQVGINSGPAPQCI (SEQ ID NO : 40) sequência de aminoácido Fc de IgGl Humano

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQF NSTFRVVSVLTVVHODWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGF

YPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWOQGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 41)

sequência de aminoácido Fc de IgGl Humano

DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHODWLNGKDYKCKVSNKALPAPMOKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF

YPRHIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQOQGNVFSCSVMHEALHNHYTQOKSLSLSPGK (SEQ ID NO : 42) sequência de aminoácido SP2 METDTLLLWVLLLWVPGSTG (SEQ ID NO : 43)

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que com- preende (a) um domínio de inibição do complemento (CID), um do- mínio de inibição do VEGF (VID), e um domínio prolongando a meia - vida, ou (b) a partir do N-terminal ao C-terminal, um domínio de ini- bição de VEGF (VID), uma região Fc de imunoglobulina, e um com- plemento inibindo o domínio (CID), em que a proteína de fusão inibe a ativação do complemen- to e a atividade de VEGF.

2. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 (a), caracterizada pelo fato de que o domínio de prolongamento da meia - vida compreende uma região Fc de imunoglobulina.

3. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 2, ca- racterizada pelo fato de que a proteína de fusão compreende o referi- do VID, CID, e Fc a partir do N-terminal ao C-terminal em uma ordem selecionada do grupo que consiste em (1) VID, Fc, CID; (2) CID, Fc, VID; (3) CID, VID, Fc; (4) VID, CID, Fc; (5) Fc, VID, CID; e (6) Fc, CID, VID.

4. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 (b), 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a região Fc é uma Fc humana de IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4.

5. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 (b), 2 ou 3, caracterizada pelo fato de que a região Fc compreende a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou 39, ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 ou 39.

6. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que CID compreende,

pelo menos, uma repetição curta de consenso (SCR) de uma proteína reguladora de complemento humano selecionada a partir do grupo que consiste em CR1, o Fator H, C4 - BP, DAF e MCP.

7. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 6, caracterizada pelo fato de que CID compreende uma sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO: 1 - 6 e 13-16, ou uma sequência de aminoá- cidos tendo pelo menos 90% de identidade com um sequência de aminoácidos selecionada a partir do grupo que consiste em SEQ ID NO:1-6 e 13-16.

8. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que (i) o VID compreende uma porção do domínio extracelular de um receptor de VEGF humano, ou em que (ii) o VID compreende um domínio 2 semelhante de imuno- globulina (Ig ) humano VEGFR-1 e domínio 3 semelhante de lg huma- na VEGFR-2, ou em que (Ill) o VID compreende a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 11 ou 38, ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 11 ou 38.

9. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que (i) a proteína de fu- são compreende ainda um ligante de peptídeo entre domínios, ou em que (ii) a proteína de fusão compreende ainda um ligante entre os do- mínios de peptídeo e o peptídeo ligante compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 ou uma sequência de aminoácidos possuindo pelo menos 90% de identidade com a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 8.

10. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 9, ca- racterizada pelo fato de que o agente de ligação peptídico está entre a região Fe e CID.

11. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 1 (b), caracterizada pelo fato de que proteína de fusão compreende a se- quência de aminoácidos da SEQ ID NO:. 12 ou 40, ou uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade com a sequên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO: 12 ou 40.

12. Proteína de fusão, caracterizada pelo fato de que é pro- duzida por cultura de uma célula hospedeira que compreende um áci- do nucleico que codifica a proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 sob uma condição que produz a proteí- na de fusão, e a recuperação da proteína de fusão produzida por meio das células do hospedeiro.

13. Proteína de fusão dimérica, caracterizada pelo fato de que compreende duas proteínas de fusão, em que cada proteína de fusão compreende a proteína de fusão de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12.

14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende a proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 12, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

15. Composição farmacêutica de acordo com a reivindica- ção 14, caracterizada pelo fato de que a proteína de fusão é uma for- ma dimérica.

16. Ácido nucleico, caracterizado pelo fato de que codifica a proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, ou um vetor compreendendo o referido vetor ou uma célula hospedeira compreendendo o referido ácido nucleico.

17. Método de produção de uma proteína de fusão, caracte- rizado pelo fato de que compreende a cultura de uma célula hospedei- ra que compreende um ácido nucleico que codifica a proteína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 11, sob uma condição que produz a proteína de fusão, e a recuperação da proteína de fusão produzida por meio das células do hospedeiro.

18. Método de acordo com a reivindição 17, caracterizado pelo fato de que (i) a proteína de fusão é recuperada a partir do meio de cultura celular e purificado, ou em que (ii) a célula hospedeira é uma célula de mamífero ou uma célula de levedura, ou em que (Ill) a proteína de fusão é recuperada é um dímero.

19. Proteína de fusão de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que é para uso em um método de tratamento de um indivíduo com uma doença inflamatória, uma doença autoimune, uma doença ocular ou câncer, o referido mé- todo compreendendo a administração ao indivíduo de uma quantidade eficaz da proteína de fusão.

20. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que (i) o indivíduo tem artrite reumatóide, psoríase, degeneração macular, retinopatia diabética, oclusão da veia retinal central, ou transplante de córnea, ou em que (ii) o indivíduo tem uma doença ocular que é a degeneração macular e a degeneração macular é a degeneração macular relacionada com a idade ou a de- generação macular seca relacionada com a idade, ou em que (Ill) o indivíduo tem câncer, que é câncer de mama, câncer colorectal, cân- cer do pulmão, câncer do rim, câncer gástrico, câncer do ovário, ou retinoblastoma.

21. Proteína de fusão de acordo com a reivindicação 19, caracterizada pelo fato de que compreende ainda a administração de um segundo agente terapêutico para o tratamento da doença.

22. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende a prote- ína de fusão como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ainda compreendendo uma inserção na embalagem, que compre- ende instruções para a utilização da proteína de fusão para o trata- mento uma doença inflamatória, uma doença auto-imune, uma doença ocular ou câncer em um indivíduo.

23. Uso de uma proteína de fusão como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 13, ou uma composição como defini- da na reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que é na fa- bricação ou na preparação de um medicamento para o tratamento de um indivíduo com uma doença inflamatória, uma doença auto-imune, uma doença ocular ou câncer.

24. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que (i) o indivíduo tem artrite reumatóide, psoríase, dege- neração macular, retinopatia diabética, oclusão da veia retinal central, ou transplante de córnea, ou (ii) o indivíduo tem uma doença ocular que é a degeneração macular e a degeneração macular é a degenera- ção macular molhada relacionada com a idade ou degeneração macu- lar seca relacionada com a idade, ou (iii) o indivíduo tem câncer, que é câncer de mama, câncer colorectal, câncer do pulmão, câncer do rim, câncer gástrico, câncer do ovário, ou retinoblastoma.

25. Uso de acordo com a reivindicação 23, caracterizado pelo fato de que o referido medicamento se destina ao uso em combi- nação com um segundo agente terapêutico para o tratamento da do- ença.