CN104721820A - 双特异性单克隆抗体在治疗葡萄膜炎中的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种双特异性单克隆抗体在治疗葡萄膜炎中的用途。具体地，本发明公开一种具有如SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽在制备治疗葡萄膜炎的药物组合物中的用途，其具有高效、低毒的优点。

Description

双特异性单克隆抗体在治疗葡萄膜炎中的用途

技术领域

本发明属于生物医药领域，具体地，本发明公开了一种双特异性单克隆抗体在治疗葡萄膜炎中的用途。

背景技术

葡萄膜炎指的是虹膜、睫状体、脉络膜的炎症，是一种多发于青壮年的眼病，种类繁多，病因相当复杂，主要表现为眼痛、畏光、流泪、视力下降，睫状充血或混合充血，视力变形等，治疗不当可导致失明。葡萄膜炎的患病率占眼病的5.7%-8.2%，致盲率占1.1%-9.2%。据报道，美国大约有230万名葡萄膜炎患者，而我国保守估计也有300余万名患者。在致盲眼病中占有重要地位，已引起世界范围内的重视。

由于其发病及复发机制尚不完全清楚，故其预防无从着手，治疗效果也很不理想。葡萄膜炎目前常用糖皮质激素(如强的松、地塞米松等)、阿托品、肾上腺素、环磷酰胺、苯丁酸氮芥、甲氨蝶呤、硫唑嘌呤、环孢霉素等治疗葡萄膜炎。这些药物均具有多种毒副作用，可引起多种全身多系统并发症和眼部并发症的发生：如药物性青光眼、高血压、糖尿病、胃肠道溃疡穿孔出血、骨折、股骨头无菌性坏死、出血性膀胱炎、继发性肿瘤、白血病、不育、肺纤维化、肝功能损坏、肾功能损坏、脱发、皮肤损害、精神病以及其它意外情况，严重时可危及生命。

因此，开发高效、低毒副作用的治疗葡萄膜炎药物迫在眉睫。

发明内容

本发明的目的是提供一种高效、低毒副作用的用于治疗葡萄膜炎的药物。

在本发明的第一方面中，提供了一种眼用制剂，包含具有如SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述多肽为双特异性单克隆抗体。

在另一优选例中，所述眼用制剂为注射制剂。

在另一优选例中，所述眼用制剂为施用于玻璃体的注射制剂。

在本发明第二方面中，提供了一种具有如SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列多肽或如本发明第一方面所述眼用制剂的用途，用于制备治疗葡萄膜炎的药物组合物。

在另一优选例中，所述药物组合物施用于玻璃体。

在另一优选例中，所述药物组合物为施用于玻璃体的注射剂。

在另一优选例中，所述多肽、所述眼用制剂或所述药物组合物的施用浓度为1-100μg/μl。

在另一优选例中，所述多肽、所述眼用制剂或所述药物组合物的施用浓度为5-80μg/μl；较佳地，为10-60μg/μl；更佳地，为10μg/μl、20μg/μl、40μg/μl。

在另一优选例中，所述葡萄膜炎为非感染性葡萄膜炎。

在另一优选例中，所述非感染性葡萄膜炎为内毒素引起的葡萄膜炎。

在另一优选例中，所述多肽、所述眼用制剂或所述药物组合物还用于抑制炎症因子。

在另一优选例中，所述炎症因子选自下组：IL-1β、IL-6、TNF-α或其组合。

在本发明第三方面中，提供了一种葡萄膜炎的治疗方法，包括步骤：给需要治疗的对象施用药学有效量的具有如SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽或如本发明第一方面所述的眼用制剂。

在另一优选例中，将所述药学有效量的具有如SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽或如本发明第一方面所述的眼用制剂施用于需要治疗的对象的玻璃体。

在另一优选例中，所述多肽、所述眼用制剂的施用浓度为5-80μg/μl；较佳地，为10-60μg/μl；更佳地，为10μg/μl、20μg/μl、40μg/μl。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1为临床评分。

图2为IL-1β相对mRNA水平。

图3为TNF-α相对mRNA水平。

图4为IL-6相对mRNA水平。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，意外地发现本发明所述的多肽对葡萄膜炎具有显著的治疗作用，具有低毒、高效的优点，尤其可以作为施用于玻璃体的注射制剂使用。在此基础上，发明人完成了本发明。

活性成分

本发明的活性成分是指具有如SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽，是双特异性单克隆抗体，对葡萄炎症有显著的治疗作用，尤其是非感染性葡萄炎症(如内毒素引起的葡萄炎)。本发明的多肽还能显著降低葡萄膜炎模型中的IL-1β、IL-6以及TNF-α等炎症因子，能显著改善葡萄膜炎炎症症状。临床计划玻璃体内注射本发明的多肽，毒副作用较小，为治疗葡萄膜炎提供可能的新的选择。

应理解，已知本发明多肽的氨基酸序列，因此可以用本领域常规的DNA重组技术而获得其蛋白。

药物组合物和施用方法

本发明的药物组合物包含安全有效量的本发明的多肽以及药理上可接受的赋形剂或载体。

其中，“安全有效量”指的是：多肽的量足以明显改善病情，而不至于产生严重的副作用。通常，药物组合物含有0.1-10mg本发明的多肽/剂，更佳地，含有0.3-3mg本发明多肽/剂。较佳地，所述的“一剂”为一个安瓿。

“药学上可以接受的载体”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的多肽以及它们之间相互掺和，而不明显降低多肽的药效。

本发明的多肽或药物组合物的施用方式没有特别限制，代表性的施用方式包括(但并不限于)：肠胃外给药(如玻璃体内注射剂等)。

用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明多肽可以单独给药，或者与其他药学上可接受的药物联合给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的活性成分适用于需要治疗的哺乳动物(如人)，其中施用时剂量为药学上认为的有效给药剂量，日给药剂量通常为0.1-10mg/眼，优选0.3-3mg/眼。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明的主要优点包括：

1.提供了一种用于治疗葡萄膜炎的眼用制剂。

2.提供了本发明所述的双特异性单克隆抗体在治疗葡萄膜炎中的用途。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1IBI-B的制备

基于野生型的人可溶性补体受体1(sCR1)第1～3个结构域，人工合成其cDNA序列，与人IgG1受体Fc段的DNA序列3'端(对应于Fc片段的C端)进行融合，得到基因序列1；

基于人血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)细胞外第2个结构域和人血管内皮生长因子受体2细胞外第3个结构域，人工合成其cDNA序列，与基因序列1中人IgG1受体Fc段的5端（对应于Fc片段的N端）进行融合，从而得到基因序列2(序列如SEQ ID NO.:2所示)。

将所述基因序列2按pCI-neo质粒(购自Promega,Inc.)的操作手册插入其多克隆位点中，该质粒包含新霉素耐药基因和氨苄西林耐药基因。得到质粒pCI-neo－IBI-B。

将转化后质粒pCI-neo－IBI-B转染入中国仓鼠卵巢细胞(CHO)中，在新霉素和氨苄西林加压条件下筛选出合适的稳定细胞株。

将细胞按1～100×10⁵细胞/ml开始培养，经8～14天培养后收获，经澄清过滤、纳米膜过滤、Protein A亲和、阴离子交换、阳离子交换、超滤换液和无菌过滤等纯化步骤，得到纯度>95%的蛋白。该蛋白记为IBI-B，氨基酸序列如SEQID NO.:1所示。

对该蛋白氨基酸序列进行分子量测定，约140kDa，与预测值相符。

实施例2IBI-B对葡萄膜炎的治疗作用

1.实验目的

以内毒素诱导的葡萄膜炎模型为对象，研究IBI-B(见SEQ ID NO.:1)抑制葡萄膜炎的效果。

2.实验材料:

动物：6-8周雌性Balb/c小鼠，随机分为EIU模型组与治疗组，每组各5只；

内毒素(LPS)：溶于生理盐水中，60ng/μl或30ng/μl构建EIU模型。

麻醉剂：盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪质量比为4:1的复合麻醉剂KR(盐酸氯胺酮购自北京双鹤药业股份有限公司，盐酸赛拉嗪，购自太极集团西南药业股份有限公司)：10ml/kg腹腔注射；

实验器材：裂隙灯(康华,中国)，手术显微镜(Leica,德国)，微量注射器(WPI,INC美国)，电子天平(岛津,日本)，超声匀浆器(SONOPNCS,美国)，高速低温离心机(Sigma,美国)，移液枪、Bio-Rad real-time PCR仪(Sigma,美国)等。

3.实验方法:

玻璃体内注射药物：取IBI-B(10μg/μl、20μg/μl、40μg/μl)和无菌生理盐水分别进行玻璃体内注射。

首先，小鼠腹腔注射4:1KR(10ml/kg)麻醉，扩瞳后将小鼠双眼均匀涂抹透明质酸钠。然后在角膜区瞳孔缘用30G针头刺一小孔，再换用33G针头用10μl微量注射器通过小孔将1μl药物在30秒内缓慢注射入小鼠玻璃体内，注射完成后停留15秒钟后拔出针头。注射眼滴抗生素眼药水预防感染；

EIU模型的建立：小鼠腹腔注射4:1KR(10ml/kg)麻醉，扩瞳后玻璃体腔注射LPS60ng/μl/眼或30ng/μl/眼。注射后滴抗生素眼药水预防感染；

裂隙灯观察：小鼠腹腔注射4:1KR(10ml/kg)麻醉，用裂隙灯观察并进行临床评分。临床评分(参照Investigative Ophthalmology&VisualScience,Vol.32,No.1,1991)：评分标准见表1。

表1：葡萄膜炎临床评分表

临床症状	临床评分
		虹膜充血
无	0
		轻度	1
中度	2
		重度	3
瞳孔
		正常	0
缩小	1
		前房分泌物
无	0
		少量	1
大量	2
		眼前房积脓
无	0
		有	1
可能的最大临床评分	7

RT-PCR检测炎症介质IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA在全眼球中的表达。

4.实验结果：

6-8周，雌性Balb/c小鼠，随机分为对照组、10μg/μl治疗组、20μg/μl治疗组、40μg/μl治疗组，每组各5只。

对照组：每只小鼠眼玻璃体腔注射1μl生理盐水；

治疗组：每只小鼠分别眼玻璃体腔注射10μg/μl、20μg/μl、40μg/μl的IBI-B1μl；

注射后1天小鼠均玻璃体腔注射30ng/μl LPS1μl建立EIU模型。注射后24小时用裂隙灯观察并进行临床评分。

随后提取全眼球mRNA，用RT-PCR检测炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-αmRNA表达。

4.1临床评分

结果见图1和表2：在造模后，裂隙灯下四组小鼠在炎症高峰期均可见虹膜充血水肿、瞳孔缩小、前房炎性渗出、积脓等炎症表现，给予IBI-B后显著减轻(p<0.05)。

表2：临床评分

注：与EIU+NS组相比，*p<0.05，**p<0.01

4.2.炎症介质检测

结果见表3、表4和表5，以及图2、图3和图4所示：所有EIU动物，不同剂量的治疗组同未用药对照组相比，炎症高峰期炎症因子IL-1β、TNF-α、IL-6mRNA表达水平显著降低(p<0.05)。

表3：IL-1β相对mRNA水平

表4：TNF-α相对mRNA水平

表5：IL-6相对mRNA水平

备注：与EIU+NS组相比，*p<0.05，**p<0.01

5.实验结论：

实验结果提示在本实验条件下IBI-B对内毒素诱导的葡萄膜炎有抑制作用。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种眼用制剂，其特征在于，包含具有如SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列的多肽，以及药学上可接受的载体或赋形剂。

2.如权利要求1所述的眼用制剂，其特征在于，所述多肽为双特异性单克隆抗体。

3.如权利要求1所述的眼用制剂，其特征在于，所述眼用制剂为注射制剂。

4.一种具有如SEQ ID NO.:1所示氨基酸序列多肽或如权利要求1所述眼用制剂的用途，其特征在于，用于制备治疗葡萄膜炎的药物组合物。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述药物组合物施用于玻璃体。

6.如权利要求5所述的用途，其特征在于，所述药物组合物为施用于玻璃体的注射剂。

7.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述多肽、所述眼用制剂或所述药物组合物的施用浓度为1-100μg/μl。

8.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述葡萄膜炎为非感染性葡萄膜炎。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述非感染性葡萄膜炎为内毒素引起的葡萄膜炎。

10.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述多肽、所述眼用制剂或所述药物组合物还用于抑制炎症因子。