CN116515827A - 用于治疗年龄相关性黄斑变性的活性成分、药物组合物和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于治疗年龄相关性黄斑变性的活性成分、药物组合物和应用，活性成分为小非编码RNA拮抗剂，或，经过化学修饰的小非编码RNA拮抗剂的衍生物；所述小非编码RNA为tRNA‑Glu‑CTC来源的小非编码RNA；且，所述小非编码RNA为序列如SEQ ID No：1所示的tRF‑Glu‑CTC，或，剪切自序列如SEQ ID No：2所示的tRNA‑Glu‑CTC，并包含5’端、长度为23‑31nt、功能与所述tRF‑Glu‑CTC相同或基本相同的小非编码RNA。本发明提供的活性成分和/或药物组合物能够作用于VEGF之外，对年龄相关性黄斑变性具有高效安全的治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体地，涉及用于治疗年龄相关性黄斑变性的活性成分、药物组合物和应用。
背景技术
年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration，AMD)是发生于老年人群的进行性致盲眼病，已危及全球约2亿患者的视力。本病的主要特征为黄斑区感光细胞及视网膜色素上皮的退行性病变，患者可出现中心视力模糊、视物变形，严重者视力突然下降、视网膜下出血及脱离，严重影响生活质量。临床上本病可分为萎缩性(干性)和新生血管性(湿性)病变，其中新生血管性AMD是患者致盲的首要原因，其发病机制涉及血眼屏障的破坏，异常增生的脉络膜血管对黄斑区神经视网膜造成损害，严重影响患者视力。目前临床上AMD的治疗主要靶向湿性AMD的异常新生血管，治疗措施较为局限，包括抗血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)玻璃体腔内注射，激光，光动力疗法和手术治疗，其中激光和手术主要为对症治疗，疗效并不确切，抗VEGF药物是目前最主流的治疗手段。
抗VEGF药物治疗的原理为直接抑制在脉络膜异常新生血管生成中发挥关键作用的分子VEGF，促使血管闭塞，减少渗漏。然而，在临床应用中发现部分患者存在耐药或反应不完全的现象，约有50％以上的患者在治疗2年后仍有渗出；再则，抗VEGF药物需要多次反复的玻璃体腔注射，频繁的治疗导致患者经济负担增加、依从性下降，进而影响治疗效果。此外，研究也发现对VEGF这单一因子的抑制不利于病理性血管内皮功能的恢复，目前尚缺乏既能够抑制异常新生血管，又可保护正常血管功能的药物。
因此，本领域亟需开发作用于VEGF机制之外的，高效安全的新型治疗新生血管性AMD的药物。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的在于提供一种作用靶点为VEGF之外的，高效且安全的用于治疗年龄相关性黄斑变性的活性成分和药物组合物。
为了实现上述目的，本发明提供了一种用于治疗年龄相关性黄斑变性的活性成分，所述活性成分为小非编码RNA拮抗剂，或，
经过化学修饰的小非编码RNA拮抗剂的衍生物；其中，
所述小非编码RNA为tRNA-Glu-CTC来源的小非编码RNA；且，
所述小非编码RNA为序列如SEQ ID No：1所示的tRF-Glu-CTC，或，
剪切自序列如SEQ ID No：2所示的tRNA-Glu-CTC，并包含5’端、长度为23-31nt、功能与所述tRF-Glu-CTC相同或基本相同的小非编码RNA。
优选地，所述小非编码RNA拮抗剂的序列如SEQ ID No：3所示。
本发明还提供了一种用于治疗年龄相关性黄斑变性的活性成分，所述活性成分为包括如上述所述的小非编码RNA拮抗剂的表达载体。
优选地，所述表达载体能够表达靶向所述tRF-Glu-CTC，以及来源于相同前体tRNA且序列、功能相似的tRF的拮抗剂核酸分子。
上述活性成分，为小非编码RNA拮抗剂，或，经过化学修饰的小非编码RNA拮抗剂的衍生物，或，包括如上述所述的小非编码RNA拮抗剂的表达载体，可在制备用于治疗年龄相关性黄斑变性的药物中应用。
本发明还提供了一种用于治疗年龄相关性黄斑变性的药物组合物，所述药物组合物包括如上述所述的活性成分。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体或其他的用于治疗年龄相关性黄斑变性的药物。
优选地，所述药物组合物可以以盐类、水合物或溶剂化物的形式存在。
本发明还提供了上述药物组合物在制备用于治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用，所述的药物为药物治疗学上可接受的剂量。
本发明提供的小非编码RNA拮抗剂为合成核酸制剂，其结构简单、制备方法易操作、给药形式多样；同时，本发明提供的小非编码RNA拮抗剂弥补了目前抗VEGF药物的局限性，具有显著地抑制脉络膜异常新生血管的作用，同时可恢复血管内皮正常功能，改善新生血管区域低氧水平，防止眼底病变的进一步进展，为新生血管性AMD的新药开发提供了一种极具临床转化潜力的候选靶点，并奠定了相应的理论基础。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1是本发明提供的tRF-Glu-CTC和其前体tRNA-Glu-CTC的结构图；
图2A是本发明实施例1中于荧光显微镜下拍摄的脉络膜新生血管图像；
图2B是本发明实施例1中的统计结果图；
图3A是本发明实施例2中于荧光显微镜下拍摄的脉络膜新生血管图像；
图3B是本发明实施例2中的统计结果图；
图4A-图4D是本发明实施例3中血管内皮细胞的迁移和成管特性结果图；
图5A和图5B是本发明实施例4中小鼠眼底新生血管区的结果图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提出了一种用于治疗年龄相关性黄斑变性的作用靶点，并提出了其用于治疗年龄相关性黄斑变性的活性成分，该活性成分选自a)或b)，具体地：a)是一种小非编码RNA拮抗剂或其经过化学修饰、具有相同或相似功能的衍生物，其靶向分子为tRNA-Glu-CTC来源的小非编码RNA。其中，小非编码RNA为tRF-Glu-CTC(核心序列如SEQ ID No：1所示，具体为：5’-TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGCG-3’，见图1)；或剪切自tRNA-Glu-CTC(核心序列如SEQ ID No：2所示，具体为：5’-TCCCTGGTGGTCTAGTGGTTAGGATTCGGCGCTCTCACCGCCGCGGCC CGGGTTCGATTCCCGGTCAGGGAA-3’)并包含5’端序列、长度为23-31nt、功能与tRF-Glu-CTC相同或基本相同的小非编码RNA。小非编码RNA拮抗剂为与tRF-Glu-CTC碱基互补配对的小分子核酸，核心序列如SEQ ID No：3所示，具体为5’-CGCCGAATCCTAACCACTAGACCACCAGGGA-3’。b)是一种表达载体，其中含有a)中所述tRF-Glu-CTC拮抗剂序列，可表达靶向该tRF-Glu-CTC和来源于相同前体tRNA且序列、功能相似的tRF的拮抗剂核酸分子。
本发明还提供了一种药物组合物，该药物组合物包括第一活性成分、第二活性成分和药学上可接受的载体。具体地，这里的第一活性成分为如前所述的活性成分，第二活性成分为治疗学中可接受的其他抗VEGF药物，载体包括药学上可接受的盐、水合物或溶剂化物，以及其他药学上可接受的载体。
本发明还提出了根据上述所述的小非编码RNA拮抗剂或其经过化学修饰、具有相同或相似功能的衍生物，和/或药物组合物在抑制脉络膜新生血管形成或预防和/或治疗年龄相关性黄斑变性中的应用。该应用方法具体为向需要的对象使用前述所述的药物组合物，或施用前述所述的活性成分。该应用中采用的药物制剂可以为药物治疗学上任何可接受的剂型。优选为注射制剂。本发明的药物的各种剂型可以按照药学领域中熟知的方法制备。使用的剂量可以为药物治疗学上任何可接受的剂量。
以下通过具体的实施例进行详细的说明。
实施例1、tRF-Glu-CTC及其拮抗剂对脉络膜新生血管的影响
将野生型C57BL/6雄性6周龄小鼠进行激光诱导视网膜新生血管模型造模。具体方法为将小鼠麻醉后滴加散瞳药，置于小鼠用裂隙灯前，使用110mW强度、100ms持续时间的激光照射小鼠眼底，破坏血眼屏障诱导新生血管产生。tRF-Glu-CTC拮抗剂经玻璃体腔内注射的方法注射到小鼠玻璃体腔内，将相应阴性对照(不做处理)或拮抗剂对照(注射药物为验证无义的随机核酸序列)的小鼠设置为对照。其中，tRF-Glu-CTC拮抗剂和拮抗剂对照使用的浓度为250μM。给药方式为玻璃体腔内注射1μL药液。
在小鼠造模7天后取眼球制作小鼠RPE-脉络膜-巩膜平铺片，使用异凝集素B4(IB4)染色标记血管，评估脉络膜新生血管的面积大小。具体操作流程为：将小鼠使用颈椎脱臼法处死后，剜出小鼠眼球，置于4％多聚甲醛溶液中固定40分钟。之后将眼球依次去除前节结构和视网膜，后部视杯制作成RPE-脉络膜-巩膜平铺片。使用0.5％ Trion-X100和5％ BSA的PBS溶液在37摄氏度下孵育1小时后，使用IB4染色过夜。于荧光显微镜下拍摄脉络膜新生血管图像并统计血管面积，如图2A所示。
统计结果如图2B所示，tRF-Glu-CTC拮抗剂可有效抑制脉络膜新生血管形成，与对照组相比下降幅度为50％左右。
实施例2、tRF-Glu-CTC拮抗剂与抗VEGF药物联用对脉络膜新生血管的影响
将野生型C57BL/6雄性6周龄小鼠进行激光诱导视网膜新生血管模型造模。具体方法为将小鼠麻醉后滴加散瞳药，置于小鼠用裂隙灯前，使用110mW强度、100ms持续时间的激光照射小鼠眼底，破坏血眼屏障诱导新生血管产生。tRF-Glu-CTC拮抗剂(或拮抗剂对照)与抗VEGF药物贝伐珠单抗(bevacizumab)联用经玻璃体腔内注射的方法注射到小鼠玻璃体腔内，将不做处理的小鼠设置为阴性对照。其中，贝伐珠单抗使用浓度为30μg/μL。tRF-Glu-CTC拮抗剂和拮抗剂对照使用的浓度为250μM。联用配置制剂为含有贝伐珠单抗30μg/μL，tRF-Glu-CTC拮抗剂(或拮抗剂对照)250μM的PBS溶液。给药方式为玻璃体腔内注射1μL。
在小鼠造模7天后取眼球制作小鼠RPE-脉络膜-巩膜平铺片，使用异凝集素B4(IB4)染色标记血管，评估脉络膜新生血管的面积大小。统计结果如图3A和3B所示，tRF-Glu-CTC拮抗剂具有和实验浓度的贝伐珠单抗相似的抗血管新生作用。
实施例3、tRF-Glu-CTC拮抗剂有效抑制血管内皮细胞迁移和成管特性
使用人脐静脉血管内皮细胞模拟脉络膜血管内皮细胞的特性，将tRF-Glu-CTCinhibitor(tRF-Glu-CTC拮抗剂)与细胞转染试剂相结合，转染细胞以抑制tRF-Glu-CTC水平。使用Transwell实验和血管形成实验评估血管内皮细胞迁移和成管特性，反应血管内皮的血管形成能力。将不做处理的细胞设为阴性对照，转染拮抗剂对照(验证无义的随机核酸序列)的细胞设为拮抗剂对照。结果如图4A-图4D所示，相较于对照组，tRF-Glu-CTC拮抗剂显著抑制了血管内皮细胞的迁移能力(p<0.05)和成管能力(p<0.01)。
实施例4、tRF-Glu-CTC拮抗剂降低眼底低氧水平
将野生型C57BL/6雄性6周龄小鼠进行激光诱导视网膜新生血管模型造模。使用低氧探针(Hypoxyprobe)评估玻璃体腔内注射tRF-Glu-CTC拮抗剂或贝伐珠单抗对眼底新生血管区低氧水平。在造模后第四天，对小鼠腹腔注射哌莫硝唑盐酸盐溶液(Pimonidazolehydrochloride，60mg/kg)，1小时后使用颈椎脱臼法处死小鼠，并取眼球制作RPE-脉络膜-巩膜平铺片。使用靶向哌莫硝唑、连接荧光基团的单克隆抗体和IB4孵育过夜，第二天拍照并统计眼底荧光面积。由于哌莫硝唑可以通过与大分子共价结合或通过被还原成代谢物后在缺氧细胞中累积，因此可以作为缺氧标记物评估新生血管区缺氧水平。其中，将不做处理的小鼠设置为阴性对照。贝伐珠单抗使用浓度为30μg/μL。tRF-Glu-CTC拮抗剂使用的浓度为250μM。联用配置制剂为含有贝伐珠单抗30μg/μL，tRF-Glu-CTC拮抗剂250μM的PBS溶液。给药方式为玻璃体腔内注射1μL。如图5A和如5B所示，结果显示，相较于贝伐珠单抗，tRF-Glu-CTC拮抗剂可在抑制病理性血管形成的同时显著减少眼底缺氧水平，改善血管周微环境。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
Claims (8)
1.一种用于治疗年龄相关性黄斑变性的活性成分，其特征在于，所述活性成分为小非编码RNA拮抗剂，或，
经过化学修饰的小非编码RNA拮抗剂的衍生物；其中，
所述小非编码RNA为tRNA-Glu-CTC来源的小非编码RNA；且，
所述小非编码RNA为序列如SEQ ID No：1所示的tRF-Glu-CTC，或，
剪切自序列如SEQ ID No：2所示的tRNA-Glu-CTC，并包含5’端、长度为23-31nt、功能与所述tRF-Glu-CTC相同或基本相同的小非编码RNA。
2.根据权利要求1所述的活性成分，其特征在于，所述小非编码RNA拮抗剂的序列如SEQID No：3所示。
3.一种用于治疗年龄相关性黄斑变性的活性成分，其特征在于，所述活性成分为包括如权利要求1或2所述的小非编码RNA拮抗剂的表达载体。
4.根据权利要求3所述的活性成分，其特征在于，所述表达载体能够表达靶向所述tRF-Glu-CTC，以及来源于相同前体tRNA且序列、功能相似的tRF的拮抗剂核酸分子。
5.权利要求1-4任意一项所述的活性成分在制备用于治疗年龄相关性黄斑变性的药物中的应用。
6.一种用于治疗年龄相关性黄斑变性的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括如权利要求1-4中任意一项所述的活性成分。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体。
8.根据权利要求6或7所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物以盐类、水合物或溶剂化物的形式存在。
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