CN104159926A - 补体和vegf途径的蛋白质抑制剂及其使用方法 - Google Patents

补体和vegf途径的蛋白质抑制剂及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供抑制补体途径和血管内皮生长因子(VEGF)途径的激活的双特异性融合蛋白及使用这些融合蛋白的方法。

Description

补体和VEGF途径的蛋白质抑制剂及其使用方法
相关专利申请的交叉参考
本申请要求2011年12月1日提交的美国临时申请系列号61/629,932的优先权益，该临时申请在此以其整体引入作为参考。
技术领域
本发明涉及抑制补体途径和血管内皮生长因子(VEGF)途径的激活的双特异性融合蛋白，包含这些融合蛋白的组合物，以及用于产生和使用这些双特异性融合蛋白和组合物的方法。
背景技术
补体系统是先天免疫系统的功能效应系统，其由许多血浆蛋白质和细胞膜蛋白质组成。补体的激活导致一系列蛋白酶激活级联，引起细胞因子的释放和激活级联的放大。补体激活的最终结果是细胞杀伤膜攻击复合体(MAC)的激活、由过敏毒素C3a和C5a引起的炎症及病原体的调理作用。MAC是清除侵入的病原体及损伤、坏死和凋亡的细胞所必需的。
必须通过补体系统来在防御病原体和避免过度炎症之间达到精巧的平衡(Ricklin，D.等，(2007).Nature Biotechnology，25(11)：1265-1275)。许多炎性疾病、自身免疫病、神经变性疾病和感染性疾病已显示与过量的补体活性相关。例如，由局部缺血/再灌注(I/R)损伤引起的病理发生已显示，补体激活在包括急性心肌梗塞(AMI)、卒中、失血性和败血性休克及冠状动脉旁路移植(CABG)手术并发症的许多疾病中导致炎症诱发的损伤(Markiewski，M.M.等，(2007).Am.J.Pathol.171：715-727)。此外，补体激活是包括系统性红斑狼疮(Manderson，A.P.等，(2004).Annu.Rev.Immunol.22：431-456)、类风湿性关节炎(RA)、银屑病和哮喘(Guo，R.F.等，(2005).Annu.Rev.Immunol.23：821-852)的许多自身免疫病的主要促成者。还已将补体激活与阿尔茨海默病(Bonifati，D.M.等，(2007).Mol.Immunol.44：999-1010)及诸如亨廷顿病、帕金森病和年龄相关黄斑变性(AMD)的其他神经变性疾病(Gehrs，K.M.，(2010).Arch.Ophthalmol.，128(3)：249-258)的病理学相关。
补体系统可以通过三种不同途径激活：经典途径、旁路途径和凝集素途径。全部三种途径都通过分别切割补体成分C3和C5的C3转变酶和C5转变酶的关键蛋白酶复合体。经典途径通过C1q与抗体IgM或IgG的结合起始，导致切割补体成分C2和C4的C1复合体的激活，产生C2a、C2b、C4a和C4b。然后C4b和C2b形成经典途径C3转变酶，C3转变酶促进C3切割为C3a和C3b。然后C3b通过与C4bC2b(C3转变酶)结合形成C5转变酶。凝集素途径在C3转变酶的下游与经典途径相同，通过甘露糖结合凝集素(MBL)与病原体表面的甘露糖残基的结合来激活。然后MBL相关丝氨酸蛋白酶MASP-1和MASP-2可以切割C4和C2形成与经典途径中相同的C3转变酶。与需要抗原的特异性免疫应答的经典途径和凝集素途径不同，旁路途径是持续具有低水平活性的非特异性免疫应答。C3的自发水解产生C3a和C3b。C3b可以结合因子B，然后在因子D的帮助下将因子B切割为Ba和Bb。可以通过因子P(备解素)的结合而稳定化的C3bBb复合体是旁路途径的C3转变酶，其将C3切割为C3a和C3b。C3b可以加入C3bBb复合体来形成旁路途径的C5转变酶C3bBbC3b复合体。来自全部三种途径的C5转化酶都可以将C5切割为C5a和C5b。然后C5b招募和组装C6、C7、C7、C8和多个C9分子来组装MAC。这在膜中产生可以杀死或损伤病原体或细胞的洞或孔。补体系统受两种机制的严密调节：衰变加速活性(DAA)和辅因子活性(CA)。DAA指促进C3转变酶或C5转变酶解离的能力。CA指便于因子I将C3b或C4b切割为非活性片段的能力。补体系统的综述见Wagner，E.等，(2010)，Nat.Rev.Drug Discov.，9(1)：43-56。
人1型补体受体(CR1)是具有对经典和旁路C3转变酶和C5转变酶的DAA及对C3b和C4b的CA的唯一的补体调节物，因此在治疗性应用中产生了兴趣(Krych-Goldberg，M.等，(2001)，Immunological Reviews，180：112-122)。已在体外及多种体内动物研究中显示天然存在的缺乏跨膜结构域和胞内结构域的可溶性人CR1(sCR1)抑制补体系统(Mollnes，T.E.等，(2006)，Molecular Immunology，43：107-121)。还已在人临床试验中测试了sCR1在心肌梗塞(Perry，G.J.等，(1998)，J.Am.Coll.Cardiol.，31：41 1A)、成人型呼吸窘迫综合症(Zimmerman，J.L.等，(2000)，Crit.Care.Med.，28(9)：3149-3154)和肺移植(Zamora，M.R.等，(1999)，Chest，116：46s)中减少组织损伤。已发现就在体内抑制补体活性而言安全、无免疫原性且有效。但是，分子结构使得sCR1难以作为治疗剂产生。缺失诱变已鉴定出，前3个SCR(SCR1-3)足以传递对C3转变酶的DAA，但不足以传递对C3b和C4b的CA(Krych-Goldberg，M.，(1999)，J.Bio.Chem.，274(44)：31160-31168)。类似于CR1，补体调节蛋白DAF、MCP、因子H和C4BP包含许多SCR，其中已作图了C3b或C4b的结合位点和补体抑制的活性位点(Makrides，S.C.，(1998)，Pharmacological Reviews，50(1)：59-87)。已产生了MCP、DAF和保护素的可溶性形式，并显示对在体外和多种动物模型中有效抑制补体(Wagner，E.等，(2010)，Nat.Rev.Drug Discov.，9(1)：43-56)。但是，它们在体内具有相对低的效价和短的半寿期。
血管内皮生长因子(VEGF)是促进血管发生的最重要的蛋白质之一，其是受严密调节的从现有血管网发展新血管的过程(Ferrara，N.，(2004)，Endocrine Reviews，25(4)：581-611)。血管发生为发育及诸如创伤愈合的正常生理过程所需，且还涉及许多疾病病理发生，包括AMD、RA、糖尿病性视网膜病变、肿瘤生长和转移。已显示抑制血管发生在治疗性应用中有效。
VEGF途径和补体途径都促成具有相似病因学的疾病的形成。因此，存在对发展靶向VEGF途径和补体途径二者的治疗剂的需要。本文提供的是抑制补体途径和VEGF途径二者的激活的融合蛋白。本发明的融合蛋白可以用作用于治疗补体和VEGF相关疾病的治疗剂。
发明概述
本文提供的发明尤其公开了包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域的融合蛋白，包含融合蛋白的组合物，制备融合蛋白的方法，及用这些融合蛋白来抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)的方法。
因此，在一个方面，本发明提供包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域的融合蛋白，其中该融合蛋白抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。在一个实施方案中，该CID包含选自CR1、因子H、C4-BP、DAF和MCP的人补体调节蛋白的至少一个短的共有重复序列(SCR)。在另一实施方案中，该CID包含选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列，或与选自SEQ IDNO：1-6和13-16的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在本文的实施方案的任一个中，该VID包含人VEGF受体的胞外结构域的一部分。在一个实施方案中，该VID包含人VEGFR-1的免疫球蛋白样(Ig)结构域2和人VEGFR-2的Ig样结构域3。在另一实施方案中，该VID包含SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在本文的实施方案的任一个中，该半寿期延长结构域包含免疫球蛋白Fc区。在一个实施方案中，该Fc区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人Fc。在另一实施方案中，该Fc区包含选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列，或与选自SEQ IDNO：7、39、41和42的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在本文的实施方案的任一个中，该融合蛋白还在结构域之间包含肽接头。在一个实施方案中，该肽接头包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：8的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在本文的实施方案的任一个中，该融合蛋白从N端至C端按选自(1)VID、Fc、CID；(2)CID、Fc、VID；(3)CID、VID、Fc；(4)VID、CID、Fc；(5)Fc、VID、CID；和(6)Fc、CID、VID的顺序包含所述VID、CID和Fc。
在另一方面，本发明提供从N端至C端包含VEGF抑制结构域(VID)、免疫球蛋白Fc区和补体抑制结构域(CID)的融合蛋白，其中该融合蛋白抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。在一个实施方案中，该CID包含选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在本文的实施方案的任一个中，该VID包含人VEGF受体的胞外结构域的一部分。在一个实施方案中，该VID包含人VEGFR-1的免疫球蛋白样(Ig)结构域2和人VEGFR-2的Ig样结构域3。在另一实施方案中，该VID包含SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在本文的实施方案的任一个中，该Fc区是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的人Fc。在一个实施方案中，该Fc区包含选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在本文的实施方案的任一个中，该融合蛋白还在结构域之间包含肽接头。在一个实施方案中，该肽接头在Fc区和CID之间。在另一实施方案中，该肽接头包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列，或与SEQ IDNO：8的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供通过在产生融合蛋白的条件下培养包含编码本文公开的任意融合蛋白的核酸的宿主细胞并回收该宿主细胞产生的融合蛋白而产生的融合蛋白。在一个实施方案中，该融合蛋白包含选自SEQ IDNO：12、33-37和40的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在另一实施方案中，该融合蛋白还在其N端包含含有选自SEQ ID NO：9、10和43的氨基酸序列的信号肽。在另一实施方案中，该回收的由宿主细胞产生的融合蛋白可以包含在N端部分切割的信号肽。在一个实施方案中，该宿主细胞是哺乳动物细胞。在另一实施方案中，该哺乳动物细胞是CHO细胞。
在另一方面，本发明提供包含两个融合蛋白的二聚体融合蛋白(例如二聚体Fc融合蛋白)，其中每个融合蛋白包含本文公开的任意融合蛋白。在一个实施方案中，该二聚体融合蛋白包含两个相同的融合蛋白。在另一实施方案中，该二聚体融合蛋白包含两个不同的融合蛋白。在另一实施方案中，该二聚体融合蛋白包含至少一个含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的融合蛋白。
在一方面，本发明还提供包含本文公开的任意融合蛋白和可药用载体的组合物。在一个实施方案中，该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该融合蛋白是二聚体形式。在另一实施方案中，该二聚体融合蛋白包含两个相同的融合蛋白。在另一实施方案中，该二聚体融合蛋白包含两个不同的融合蛋白。在另一实施方案中，该二聚体融合蛋白包含至少一个含有选自SEQ IDNO：12、33-37和40的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的融合蛋白。
在另一方面，本发明提供编码本文公开的任意融合蛋白的核酸。在一个实施方案中，该核酸编码包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域的融合蛋白，其中该融合蛋白抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。在一个实施方案中，该核酸编码包含选自CR1、因子H、C4-BP、DAF和MCP的人补体调节蛋白的至少一个短的共有重复序列(SCR)的CID。在另一实施方案中，该核酸编码包含选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列或与选自SEQID NO：1-6和13-16的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的CID。在本文的实施方案的任一个中，该核酸编码包含人VEGF受体的胞外结构域的一部分的VID。在一个实施方案中，该核酸编码包含人VEGFR-1的免疫球蛋白样(Ig)结构域2和人VEGFR-2的Ig样结构域3的VID。在另一实施方案中，该核酸编码包含SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列或与SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的VID。在本文的实施方案的任一个中，该核酸编码包含免疫球蛋白Fc区的半寿期延长结构域。在一个实施方案中，该核酸编码包含选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的Fc区。在本文的实施方案的任一个中，该核酸还编码包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的肽接头。在本文的实施方案的任一个中，该核酸编码包含选自SEQ IDNO：12、33-37和40的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的融合蛋白。
在另一方面，本发明提供包含编码本文公开的任意融合蛋白的核酸的载体。在一个实施方案中，该融合蛋白包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域，其中该融合蛋白抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。在本文的实施方案的任一个中，该载体包含本文公开的编码本文所述的融合蛋白的任意核酸。在一个实施方案中，该载体包含编码含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的融合蛋白的核酸。在任意方面，本发明提供包含本文公开的编码本文所述的融合蛋白的任意核酸的宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞包含编码含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的融合蛋白的核酸。
还在另一方面，本发明提供产生融合蛋白的方法，其包括在产生融合蛋白的条件下培养包含编码本文公开的任意融合蛋白的核酸的宿主细胞，并回收通过该宿主细胞产生的融合蛋白。在一个实施方案中，从细胞培养基回收该融合蛋白并纯化。在另一实施方案中，该宿主细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。在本文的实施方案的任一个中，所回收的融合蛋白是二聚体。在本文的实施方案的任一个中，所回收的融合蛋白是本文所述的部分切割的融合蛋白。
在另一方面，本发明提供治疗患有炎性疾病、自身免疫病、眼病或癌症的对象的方法，其包括对该对象施用有效量的本文公开的任意融合蛋白。在一个实施方案中，该融合蛋白包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域，其中该融合蛋白抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。在一个实施方案中，该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列，或与选自SEQID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该对象患有类风湿性关节炎、银屑病、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞或角膜移植。在另一实施方案中，该黄斑变性是湿性年龄相关黄斑变性或干性年龄相关黄斑变性。在一个实施方案中，该对象患有乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、胃癌、卵巢癌或成视网膜细胞瘤。在另一实施方案中，该方法还包括施用用于治疗该疾病的第二治疗剂。
在另一方面，本发明提供包含本文公开的任意融合蛋白的试剂盒。在一个实施方案中，该融合蛋白包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域，其中该融合蛋白抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。在一个实施方案中，该融合蛋白包含选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列，或与选自SEQ IDNO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该试剂盒还包含含有用该融合蛋白来在对象中治疗炎性疾病、自身免疫病、眼病或癌症的说明的包装说明书。
应理解，本文所述的多种实施方案的一个、一些或全部特性可以组合形成本发明的其他实施方案。对本领域技术人员而言，本发明的这些和其他方面将变得显而易见。
附图简述
图1提供融合蛋白的示意图。A)抗补体蛋白(ACP)ACP-1至ACP-10。CID-WT是人野生型CR1SCR1-3；CID-KN是人变体CR1SCR1-3_N29K/D109N；CID-YD是人变体CR1SCR1-3_S37Y/G79D；CID-KYDN是人变体CR1SCR1-3_N29K/S37Y/G79D/D109N；CID-NT是人野生型CR1SCR8-10；Fc是人IgG1Fc区。B)双特异性抗补体/VEGF蛋白质(ACVP)ACVP-1至ACVP-6。CID是人变体CR1SCR1-3_N29K/S37Y/G79D/D109N；VID是VEGFR1的第二Ig样结构域和VEGFR2的第三Ig样结构域的融合；Fc是人IgG1Fc区。
图2显示纯化的融合蛋白的SDS-PAGE凝胶。A)纯化的融合蛋白ACP-10(泳道1)、ACP-9(泳道2)、ACP-8(泳道3)、ACP-7(泳道4)和ACP-6(泳道5)。B)非还原条件(泳道1)和还原条件(泳道3)下的纯化的融合蛋白ACVP-1；非还原条件(泳道2)和还原条件(泳道4)下的纯化的融合蛋白ACP-9。
图3是证明融合蛋白ACP抑制补体途径的一系列图表。A)多种浓度的融合蛋白ACP-6、ACP-7、ACP-9和ACP-10对抗体致敏的绵羊红细胞中的经典补体途径的抑制。B)多种浓度的融合蛋白ACP-6、ACP-7、ACP-9和ACP-10对兔红细胞中的旁路补体途径的抑制。Fc融合Log[nM]是所示融合蛋白的浓度(nM)的对数。
图4是通过ELISA检测的证明融合蛋白对VEGF的体外结合的一系列图表。A)ACVP-1对固定的VEGF的直接体外结合。B)ACVP-1对可溶性VEGF的体外结合。C)ACVP-1、VID或阿瓦斯丁对VEGF的体外结合。
图5是证明融合蛋白ACVP对补体途径的抑制的一系列图表。A)多种浓度的融合蛋白ACVP-1对抗体致敏的绵羊红细胞中的经典补体途径的抑制。B)多种浓度的融合蛋白ACVP-1对兔红细胞中的旁路补体途径的抑制。Fc融合Log[nM]是所示融合蛋白的浓度(nM)的对数。
图6是证明ACVP-1、VID或CID融合蛋白对VEGF诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)增殖的抑制的图表。所有测定都以一式三份进行。＊＊与DMEM+VEGF对照相比p＜0.01。
图7是证明融合蛋白ACVP-1、VID或CID对VEGFR2途径激活的抑制的Western印迹。
图8是来自激光诱导的CNV猴模型的眼睛照片。在黄斑周围传递532nm二极管激光光凝21天后，按所示浓度用A)载体对照(PBS)、B)ACVP-1、C)VID或D)CID对猴进行玻璃体内注射，并在给药后14天拍摄所处理的眼睛的照片来测量斑点渗漏。
发明详述
本发明尤其提供抑制补体途径和血管内皮生长因子(VEGF)途径的融合蛋白及其组合物。本文所述的本发明的融合蛋白包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域，其中该融合蛋白抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。本文还提供用于产生该融合蛋白的方法，及在自身免疫病、补体相关疾病、炎性疾病、眼病和/或癌症的治疗中使用该融合蛋白的方法。
I.一般技术
本文描述或参考的技术和方法一般为本领域技术人员所熟知，且通常用常规方法利用，例如，广泛使用的方法描述于以下中：Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual第3版(2001)Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols inMolecular Biology(F.M.Ausubel等编辑，(2003))；Methods in Enzymology(Academic Press，Inc.)：PCR2：A Practical Approach(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))系列；Harlow和Lane编辑(1988)Antibodies，A Laboratory Manual，and Animal Cell Culture(R.I.Freshney编辑(1987))；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编辑，1984)；Methods inMolecular Biology，Humana Press；Cell Biology：A Laboratory Notebook(J.E.Cellis编辑，1998)Academic Press；Animal Cell Culture(R.I.Freshney)编辑，1987)；Introduction to Cell and Tissue Culture(J.P.Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum Press；Cell and Tissue Culture：LaboratoryProcedures(A.Doyle，J.B.Griffiths和D.G.Newell编辑，1993-8)J.Wileyand Sons；Handbook of Experimental Immunology(D.M.Weir和C.C.Blackwell编辑)；Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells(J.M.Miller和M.P.Calos编辑，1987)；PCR：The Polymerase Chain Reaction，(Mullis等编辑，1994)；Current Protocols in Immunology(J.E.Coligan等编辑，1991)；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons，1999)；Immunobiology(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；Antibodies(P.Finch，1997)；Antibodies：A Practical Approach(D.Catty.编辑，IRL Press，1988-1989)；Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean编辑，Oxford University Press，2000)；Using Antibodies：ALaboratory Manual(E.Harlow和D.Lane(Cold Spring HarborLaboratory Press，1999)；The Antibodies(M.Zanetti和J.D.Capra编辑，Harwood Academic Publishers，1995)；及Cancer：Principles and Practice ofOncology(V.T.DeVita等编辑，J.B.Lippincott Company，1993)。
II.定义
“分离的”分子(例如核酸或蛋白质)或细胞是已鉴定并从其天然环境的成分分开和/或回收的分子或细胞。
本文所用的“基本上纯的”指至少50％纯(即不含污染物)、更优选至少90％纯、更优选至少95％纯、更优选至少98％纯、更优选至少99％纯的物质。
“融合多肽”或“融合蛋白”(本文中可互换使用)指具有共价连接在一起的两个或多个部分的多肽，其中该部分中的每一个源自不同的蛋白质。该两个或多个部分可以直接通过单个肽键或通过含有一个或多个氨基酸残基的肽接头连接。通常，该两个部分和该接头将彼此处于可读框中，并用重组技术产生。
就参考多肽或核酸序列而言的“百分比(％)氨基酸或核苷酸序列同一性”定义为在比对序列并根据需要引入缺口来达到最大百分比序列同一性，而不将任意保守取代视为序列同一性的部分时，候选序列中与参考多肽或核酸序列中的氨基酸残基或核苷酸相同的氨基酸残基或核苷酸的百分比。以测定百分比氨基酸或核酸序列同一性为目的的比对可以以本领域技术人员技术之内的多种方式来达到，例如，使用公开可用的计算机软件，如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件，或描述于Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，(2009)中的那些。本领域技术人员可以确定适当的参数来比对序列，包括在所比较的序列的全长内达到最大比对所需的任意算法。例如，Megalign(DNASTAR)程序可以按照不同方法(例如Clustal法)产生两个或多个序列之间的比对。见例如Higgins，D.G.和P.M.Sharp.(1988).Gene.73：237-244。Clustal算法通过检查所有对之间的距离来将序列分为簇。配对比对簇，然后成组。通过以下来计算两个氨基酸序列(例如序列A和序列B)之间的百分比相似性：序列A和序列B之间匹配的残基数÷(序列A的长度-序列A中的缺口残基数-序列B中的缺口残基数)×100。在两个氨基酸序列之间具有低相似性或无相似性的缺口不包括在测定百分比相似性中。核酸序列之间的百分比相似性也可以通过本领域已知的其他方法计数或计算，例如Jotun Hein法。见例如Hein，J.(1990)MethodsEnzymol.183：626-645。
本文所用的术语“载体”指能够繁殖与它连接的另一核酸的核酸分子。该术语包括作为自主复制核酸结构的载体，以及掺入它所引入的宿主细胞的基因组中的载体。某些载体能够指导与它们有效连接的核酸的表达。这类载体在本文中称为“表达载体”。
术语“宿主细胞”、“宿主细胞系”和“宿主细胞培养物”可互换使用，指已将外源核酸引入其中的细胞，包括这类细胞的后代。宿主细胞包括“转化体”和“经转化的细胞”，其包括最初转化的细胞和从其衍生的后代，而不考虑代数。后代可以在核酸含量上不与亲本细胞完全相同，但可以包含突变。本文还包括具有与在最初转化的细胞中筛选或选择的功能或生物学活性相同的功能或生物学活性的突变体后代。
本文所用的“治疗”是获得有益的或希望的结果(包括且优选临床结果)的方法。为了本发明的目的，有益的或希望的临床结果包括但不限于以下的一种或多种：减少疾病引起的症状、提高患有疾病的个体的生活质量、减少治疗疾病所需的其他药物的剂量、延迟疾病的进展和/或延长个体的存活。
本文所用的“延迟疾病的发展”意指推迟、阻碍、减缓、减慢、稳定和/或延缓疾病(如癌症)的发展。取决于所治疗的疾病和/或个体的历史，此延迟可以具有不同的时长。如对本领域技术人员而言显而易见，足够或显著的延迟实际上可以涵盖预防，因为个体不发展疾病。
“个体”或“对象”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于饲养的动物(例如牛、绵羊、猫、狗和马)、灵长类(例如人类和非人灵长类，如猴)、兔和啮齿类(例如小鼠和大鼠)。在一些实施方案中，个体或对象是人。
术语“药物制剂”指这样的制备物，其处于这样的形式，以致允许包含在其中的活性成分的生物学活性有效，且其不包含对将被施用该制剂的对象具有不可接受的毒性的其他成分。
“可药用载体”指药物制剂中除活性成分以外的成分，其对对象无毒性。可药用载体包括但不限于缓冲剂、赋形剂、稳定剂或防腐剂。
活性剂(例如药物制剂)的“有效量或剂量”指在必要的剂量和时期内对达到希望的治疗性或预防性结果有效的量。有效剂量可以在一次或多次施用中施用。为了本发明的目的，药物、化合物或药物组合物的有效剂量是足以直接或间接实现预防性或治疗性处理的量。如在临床背景中所理解，药物、化合物或药物组合物的有效剂量可以与或不与另一药物、化合物或药物组合物结合达到。因此，可以在施用一种或多种治疗剂的背景中考虑“有效量或剂量”，并且如果与一种或多种其他活性剂结合可以达到或已达到希望的结果，则可以考虑以有效量提供单种活性剂。
本文所用的“与...结合”指施用除另一种治疗方式外的一种治疗方式。因此，“与...结合”指在对个体施用其他治疗方式之前、期间或之后施用一种治疗方式。
术语“包装说明书”用来指通常包含在治疗性产品的商业包装中的说明，其包含关于适应症、用法、剂量、施用、联合治疗、禁忌症的信息和/或关于这类治疗性产品的用途的警告。
除非文中清楚地另有说明，本文和所附权利要求中所用的单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代物。例如，提到“融合蛋白”或“融合多肽”是提到从一个至许多个融合蛋白或融合多肽，如摩尔量，且包括本领域技术人员已知的其等同物，等等。
本文提到“约”某个值或参数包括(和描述)指向该值或参数本身的实施方案。例如，提到“约X”的描述包括“X”的描述。
应理解，本文所述的本发明的实施方案、方面和变通形式包括由实施方案、方面和变通形式组成和/或基本上由实施方案、方面和变通形式组成。
III.融合蛋白
本发明提供抑制补体途径和VEGF途径的激活的融合蛋白。在一些实施方案中，该融合蛋白抑制的补体途径可以是经典补体途径、旁路补体途径和/或凝集素途径。在一些实施方案中，该融合蛋白抑制的VEGF途径由VEGF受体(例如VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)介导。在一些实施方案中，该融合蛋白抑制的VEGF途径由VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和PlGF介导。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。本文所述的融合蛋白包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域。
补体抑制结构域(CID)
本发明提供可以是本文公开的任意融合多肽的成分的补体抑制结构域(CID)。CID可以包含涉及补体途径的补体调节蛋白的多肽片段，该补体调节蛋白包括补体激活的调节物(RCA)和补体控制蛋白(CCP)的成员。在一些实施方案中，CID包含包括但不限于补体受体1(CR1)、因子H、衰变加速因子(DAF)、膜辅因子蛋白(MCP)和C4b结合蛋白(C4BP)的补体调节蛋白的片段。在本文的实施方案的任一个中，该补体调节蛋白来自哺乳动物，如人、狒狒、黑猩猩、小鼠或大鼠。在一些实施方案中，该补体调节蛋白是人蛋白质。补体调节蛋白与包括但不限于C3b、C4b、iC3b、C3dg、C1q和MBP的补体途径的成分结合。在一些实施方案中，补体调节蛋白的片段与补体成分(如C3b、C4b、iC3b、C3dg、C1q和MBP)结合，并抑制补体途径(如经典途径、旁路途径和/或凝集素途径)的激活。测试抑制任意补体途径的蛋白质的方法为本领域已知，且包括实施例(如实施例2、3和6)中所述的方法。见例如Scesney S.M.等，(1996).Eur.J.Immunol，26：1729-1735，在此以其整体引入作为参考。在一些实施方案中，CID包含选自CR1、因子H、DAF、MCP和C4BP的人补体调节蛋白的至少一个SCR。
CID可以包含与补体成分结合并抑制补体激活的补体调节蛋白的一部分。例如，人CR1(同种异型A)是由包含30个各60至70个氨基酸的重复的同源短共有重复序列(SCR)的胞外结构域、跨膜结构域和胞质域组成的大的糖蛋白(～200kD)。前28个SCR组织成各7个SCR的4个长同源重复序列(LHR-A、-B、-C和-D)。第一LHR(LHR-A)的前3个SCR以中等亲和力与C4b结合，以低亲和力与C3b结合。第二LHR(LHR-B)的前3个SCR(SCR8-10)和第三LHR(LHR-C)的前3个SCR(SCR15-17)几乎相同。它们都以高亲和力结合C3b，以中等亲和力结合C4b。LHR-A对经典和旁路C3转变酶二者都具有高衰变加速活性(DAA)，但辅因子活性(CA)低，而LHR-B和LHR-C对C转变酶具有高CA，但低DAA。具有适当间隔的LHR-A和LHR-B二者都为对C5转变酶的DAA所需。本文提供包含补体调节蛋白的至少一个SCR的CID。在一些实施方案中，CID包含补体调节蛋白的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29个，但不超过30个SCR。在一些方面，CID包含补体调节蛋白的1至30、1至29、1至28、1至27、1至26、1至25、1至24、1至23、1至22、1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2个SCR中的任一个。在一些实施方案中，CID包含选自但不限于CR1、因子H、DAF、MCP和C4BP的补体调节蛋白的一个或多个SCR。在一些实施方案中，CID包含CR1、因子H、DAF、MCP和C4BP的至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个SCR。还考虑包含两种或多种补体调节蛋白的至少一个SCR的CID。在一些实施方案中，CID包含来自两种或多种选自CR1、因子H、DAF、MCP和C4BP的补体调节蛋白的至少一个SCR。
本文提供包含本文呈现的任意补体调节蛋白的至少一个SCR的CID。除非本文明确提到，SCR从补体调节蛋白的N端至C端顺序编号。例如，人CR1包含编号1至30的30个SCR，SCR1在人CR1蛋白的N端，SCR30在人CR1蛋白的C端。在一些实施方案中，CID包含CR1的SCR1-10，如SEQ ID NO：6的氨基酸序列。在其他实施方案中，CID包含CR1的SCR1-3，如SEQ ID NO：1的氨基酸序列。还在其他实施方案中，CID包含CR1的SCR8-10，如SEQ ID NO：5的氨基酸序列。在一些实施方案中，CID包含DAF的SCR2-4，如SEQ ID NO：13的氨基酸序列。在其他实施方案中，CID包含MCP的SCR2-4，如SEQ ID NO：14的氨基酸序列。还在其他实施方案中，CID包含因子H的SCR1-4。在一些方面，因子H的SCR1-4，如SEQ ID NO：15的氨基酸序列。还在其他实施方案中，CID包含C4BPA的SCR1-3，如SEQ ID NO：16的氨基酸序列。在本文的任意方面中，CID可以包含选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列。因子HSCR1-4是特异性靶向旁路途径而不是经典途径的CID。由于经典补体途径为依赖抗体的病原体清除所需，包含仅抑制旁路途径的含有因子HSCR1-4的CID的融合蛋白的治疗性应用可以是限制严重感染的潜在副作用的优选融合蛋白。
本发明中所述的CID可以是针对因子B、或因子D、或因子P、或C3、或C5的任意肽抑制剂或寡核苷酸抑制剂。CID还可以是源自针对因子B、或因子D、或因子P、或C3、或C5的抗体的任意全长抗体或抗体片段、或抗体可变区(VH或VK)、或scFv抗体。
在一些实施方案中，考虑本文提供的CID的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善CID的结合亲和力和/或其他生物学特性。CID的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码CID的核苷酸序列或通过肽合成来制备。这类修饰包括例如在CID的氨基酸序列内缺失和/或插入和/或取代残基。可以产生缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望的特征，例如，与补体成分结合并抑制补体途径的激活。本文提供作为本文公开的任意融合蛋白的成分的CID的变体。在一些实施方案中，CID包含与选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
在一些方面，CID变体在选自N29、S37、G79和D109的氨基酸残基处包含一个或多个取代，其中氨基酸残基位置是相对于SEQ ID NO：1。在具体实施方案中，CID变体在氨基酸残基N29和D109处包含取代，其中氨基酸残基位置是相对于SEQ ID NO：1。在另一具体实施方案中，CID变体在氨基酸残基S37和G79处包含取代，其中氨基酸残基位置是相对于SEQ ID NO：1。还在另一具体实施方案中，CID变体在氨基酸残基N29、S37、G79和D109处包含取代，其中氨基酸残基位置是相对于SEQ IDNO：1。在一些实施方案中，CID变体在氨基酸残基N29K、S37Y、G79D和D109N处包含取代，其中氨基酸残基位置是相对于SEQ ID NO：1。在一些方面，CID变体包含表1中所示的相对于SEQ ID NO：1的任意氨基酸位置的取代。
表1.CID氨基酸取代
氨基酸取代(A)
VEGF抑制结构域(VID)
本发明提供可以是本文公开的任意融合蛋白的成分的VEGF抑制结构域(VID)。人VEGF基因家族包含五个成员：VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PlGF)。此外，通过可变RNA剪接产生了VEGF-A、VEGF-B和PlGF的多种同种型(Sullivan L.A.等，(2010)，MAbs，2(2)：165-75)。VEGF家族的所有成员通过与细胞表面VEGF受体(VEGFR)结合来刺激细胞反应。例如，已显示VEGF-A刺激内皮细胞有丝分裂发生、促进细胞存活和增殖、诱导细胞迁移和提高微血管通透性。VEGFR受体是具有由7个免疫球蛋白(Ig)样结构域组成的胞外区的酪氨酸激酶受体。VEGFR-1(Flt-1)结合VEGF-A、-B和PIGF，且可以作为VEGF的诱饵受体或VEGFR-2的调节物发挥作用。VEGFR-2(KDR/Flk-1)结合所有VEGF同种型，且是VEGF诱导的血管发生信号传导的主要中介物。VEGFR-3(Flt-4)结合VEGF-C和VEGF-D，但不结合VEGF-A，并作为淋巴管发生(lymphangiogenesis)的中介物发挥作用。
在本文公开的本发明的任意方面中，VID包含包括但不限于VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的VEGFR的多肽片段。在一些实施方案中，VID包含包括但不限于VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的VEGFR的胞外结构域的一部分。在本文的实施方案的任一个中，该VEGFR来自哺乳动物，如人、狒狒、黑猩猩、小鼠或大鼠。在本文的任意方面中，胞外结构域的一部分是免疫球蛋白样(Ig)结构域。例如，人VEGFR-1包含编号1、2、3、4、5、6和7的七个Ig样结构域，Ig样结构域1在胞外结构域的N端，Ig样结构域7在胞外结构域的C端。除非本文明确提到，Ig样结构域从VEGFR蛋白的N端至C端顺序编号。在一些实施方案中，VID包含选自VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的一种或多种VEGFR的至少一个Ig样结构域。在一些方面，VID包含VEGFR的至少1、2、3、4、5、6个但不超过7个Ig样结构域。在另一方面，VID包含VEGFR的1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2个Ig样结构域。
本文考虑包含两种或多种VEGFR的至少一个Ig样结构域的VID。在一些实施方案中，VID包含来自两种或多种选自VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3的VEGFR的至少一个Ig样结构域。在一些方面，VID包含至少两种或多种VEGFR的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20个但不超过21个Ig样结构域。在另一方面，VID包含至少两种或多种VEGFR的1至21、1至20、1至19、1至18、1至17、1至16、1至15、1至14、1至13、1至12、1至11、1至10、1至9、1至8、1至7、1至6、1至5、1至4、1至3或1至2个Ig样结构域。本文考虑包含每个VEGFR的七个Ig样结构域的任意组合的VID。例如，VID可以包含VEGFR-1(例如人VEGFR-1)的Ig样结构域2和VEGFR-2(例如人VEGFR-2)的Ig样结构域3。在另一实例中，VID可以包含VEGFR-1(例如人VEGFR-1)的Ig样结构域1-3、VEGFR-1(例如人VEGFR-1)的Ig样结构域2-3、VEGFR-2(例如人VEGFR-2)的Ig样结构域1-3、VEGFR-1(例如人VEGFR-1)的Ig样结构域2和VEGFR-2(例如人VEGFR-2)的Ig样结构域3-4，或VEGFR-1(例如人VEGFR-1)的Ig样结构域2和VEGFR-3(例如人VEGFR-3)的Ig样结构域3。这些Ig样结构域和其他可以用作VID的部分的Ig样结构域的更详细描述见美国专利号7,531173、Yu，D.等，(2012).Mol.Ther.20(3)：938-947和Holash，J.等，(2002).PNAS.99(17)：11393-11398，全都在此以其整体引入作为参考。在一些方面，VID包含SEQ ID NO：11的氨基酸序列。在一些方面，VID包含SEQ ID NO：38的氨基酸序列。在一些实施方案中，VID结合选自VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和P1GF的血管内皮生长因子。如本文所提供，结合血管内皮生长因子(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和P1GF)或结合VEGFR(例如VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)来抑制VEGF途径的激活的多肽或肽是VID。例如，VID可以包含结合血管内皮生长因子(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D和P1GF)并阻断其与VEGFR的相互作用的抗体或其片段(例如Fab、Fab’、Fab-SH、Fv、scFv或F(ab’)2)、天然肽或合成肽。在一些方面，VID是结合VEGFR(例如VEGFR-1、VEGFR-2和VEGFR-3)并阻断其与VEGF的相互作用的抗体或其片段(例如Fab、Fab’、Fab-SH、Fv、scFv或F(ab’)2)、天然肽或合成肽。在一些方面，VID是乙酰化的。在本文的实施方案的任一个中，VID来自哺乳动物，如人、狒狒、黑猩猩、小鼠或大鼠。
本发明的VID可以是VEGFR的任意胞外结构域、VEGF家族成员的显性阴性形式、针对VEGF家族成员的抗体、针对VEGFR的抗体、VEGF家族成员或VEGFR的肽抑制剂、VEGF家族成员或VEGFR的寡核苷酸抑制剂。
在一些实施方案中，考虑本文提供的任意VID的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善VID的结合亲和力和/或其他生物学特性。VID的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码VID的核苷酸序列或通过肽合成来制备。这类修饰包括例如VID的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以产生缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望的特征，例如与VEGF结合并抑制VEGF途径的激活。本文提供可以是本文公开的任意融合多肽的成分的VID的变体。在一些实施方案中，VID包含与VEGFR-1(例如人VEGFR-1)的Ig样结构域1、2、3、4、5、6或7中的任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VID包含与VEGFR-2(例如人VEGFR-2)的Ig样结构域1、2、3、4、5、6或7中的任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VID包含与VEGFR-3的Ig样结构域1、2、3、4、5、6或7中的任一个的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，VID包含与选自SEQID NO：11和38的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
半寿期延长结构域
本发明提供可以是本文公开的任意融合蛋白的成分的半寿期延长结构域。例如，可以将来自免疫球蛋白的Fc区掺入融合多肽来增加其体内半寿期。半寿期延长结构域可以包含来自任意免疫球蛋白同种型、亚类或同种异型的Fc区。在一些实施方案中，该半寿期延长结构域是来自选自IgG、IgA、IgD、IgM和IgE的免疫球蛋白同种型的Fc区。在一些实施方案中，该半寿期延长结构域包含免疫球蛋白Fc区。在一些方面，该Fc区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc。在一些方面，该Fc区是人IgA1或IgA2的Fc。在一些方面，该Fc区是人IgD的Fc。在一些方面，该Fc区是人IgE的Fc。在一些方面，该Fc区是人IgM的Fc。在一些方面，该Fc区是糖基化的。在一些实施方案中，该Fc区包含选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列。在本文提供的任意方面中，该半寿期延长结构域可以是选自但不限于抗体、白蛋白或蛋白酶抑制剂(例如α1-抗胰蛋白酶)的多肽或其片段。在本文提供的任意方面中，该半寿期延长结构域可以是选自但不限于富含甘氨酸的氨基酸序列、PESTAG序列或PAS序列的氨基酸序列。该半寿期延长结构域可以是本领域已知的增加多肽的体内半寿期的任意多肽或氨基酸序列。见Kontermann，R.(编辑)(2011).TherapeuticProteins：Strategies to Modulate their Plasma Half-lives，在此以其整体引入作为参考。在本文的实施方案的任一个中，该半寿期延长结构域来自哺乳动物，如人、狒狒、黑猩猩、小鼠或大鼠。
在一些实施方案中，考虑本文提供的半寿期延长结构域的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善半寿期延长结构域的生物学特性。半寿期延长结构域的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码半寿期延长结构域的核苷酸序列或通过肽合成来制备。这类修饰包括例如半寿期延长结构域的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以产生缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望的特征，例如延长融合蛋白的半寿期。本文提供可以是本文公开的任意融合多肽的成分的半寿期延长结构域的变体。在一些实施方案中，该半寿期延长结构域变体Fc区变体。Fc区的变体为本领域已知，例如美国专利申请公开号2010/02493852和美国专利申请公开号2006/01341105，在此以其整体引入作为参考。在一些实施方案中，可以在本文提供的融合多肽的Fc区中引入一个或多个氨基酸修饰，从而产生Fc区变体。Fc区变体可以包含在一个或多个氨基酸位置处含有氨基酸修饰(例如取代)的人Fc区序列(例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4Fc)。在一些实施方案中，该Fc区包含与选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，该Fc区变体是糖基化的。
融合肽接头
本发明提供可以是本文公开的任意融合蛋白的成分的接头。例如，可以在融合的多肽的结构域(例如CID、VID和半寿期延长结构域)之间使用短的柔性肽来确保各结构域的正确折叠和最小化空间位阻。在一些实施方案中，该接头是肽接头。在一些实施方案中，该接头是由选自甘氨酸、丙氨酸和丝氨酸的氨基酸组成的肽。在一些实施方案中，该接头包含2至100个氨基酸。在其他实施方案中，该接头包含100个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，该接头包含20个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，该接头包含15个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，该肽接头包含10个或更少的氨基酸。在一些实施方案中，该接头包含6个或更少的氨基酸。在一些方面，该接头包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99个但不超过100个氨基酸。在一些实施方案中，该接头包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，该接头用在CID和半寿期延长结构域之间。在一些实施方案中，该接头用在VID和半寿期延长结构域之间。在其他实施方案中，该接头用在VID和CID之间。还在其他实施方案中，该接头用在VID和半寿期延长结构域之间及CID和半寿期延长结构域之间。在其他实施方案中，该接头用在VID和CID之间及CID和半寿期延长结构域之间。在一些实施方案中，该接头用在CID和VID之间及VID和半寿期延长结构域之间。在一些实施方案中，融合多肽包含至少一个接头，但不超过四个接头。例如，融合多肽可以从N端至C端按选自以下的顺序包含CID、VID、Fc区(Fc)和至少一个接头：(1)VID、Fc、接头、CID；(2)CID、接头、Fc、接头、VID；(3)CID、接头、VID、Fc；(4)VID、接头、CID、接头、Fc；(5)Fc、接头、VID、接头、CID；和(6)Fc、接头、CID、接头、VID。在一些实施方案中，该融合多肽从N端至C端按VID、Fc、接头、CID的顺序包含CID、VID、Fc和接头。
融合蛋白
本文所公开的融合蛋白是对两种不同的靶结合配偶体具有结合特异性的多肽。在一些实施方案中，融合多肽是人多肽。在一些实施方案中，融合多肽包含对补体途径的成分(例如C3b、C4b、iC3b、C3dg、C1q或MBP)的第一结合特异性和对VEGF(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或P1GF)的第二结合特异性。在一些实施方案中，该融合多肽包含对哺乳动物(例如人)补体途径成分的第一结合特异性和对哺乳动物(例如人)VEGF的第二结合特异性。在一些实施方案中，融合多肽结合与本文所述的任意补体调节蛋白相同的补体途径成分。在一些实施方案中，融合多肽结合与CR1、因子H、DAF、MCP或C4BP中的任一种相同的补体途径成分。在一些实施方案中，融合多肽包含本文所述的任意CID中的至少一个CID。在一些方面，融合多肽包含含有选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列的CID。在一些实施方案中，融合多肽结合与本文所述的VEGFR中的任一种相同的VEGF途径成分。在一些实施方案中，融合多肽结合与VEGFR-1、VEGFR-2或VEGFR-3中的任一种相同的VEGF途径成分。在一些实施方案中，融合多肽包含本文所述的任意VID中的至少一个VID。在一些方面，融合多肽包含含有SEQ ID NO：11的氨基酸序列的VID。在其他方面，融合多肽包含含有SEQ ID NO：38的氨基酸序列的VID。本文公开的含有CID和VID的融合多肽中的任一种可以还包含半寿期延长结构域。在一些实施方案中，该半寿期延长结构域是Fc区。在一些实施方案中，该Fc区包含选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列。在一些实施方案中，包含CID、VID和半寿期延长结构域的融合多肽抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。本文公开的含有CID、VID和半寿期延长结构域的融合多肽中的任一种可以还包含接头。在一些实施方案中，该接头包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列。在一些实施方案中，该CID包含哺乳动物(例如人)补体调节蛋白的至少一个短SCR。在其他实施方案中，该VID包含哺乳动物(例如人)VEGFR的胞外结构域的一部分。在一些实施方案中，该融合多肽包含含有人补体调节蛋白的至少一个短SCR的CID和含有人VEGFR的胞外结构域的一部分的VID。在一方面，本发明提供包含以下的融合多肽：
a)包含以下氨基酸序列的CID
QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI(SEQ ID NO：4)；
b)包含以下氨基酸序列的VID
GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK(SEQ ID NO：11)；and
c)包含以下氨基酸序列的半寿期延长结构域
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：39).
在另一方面，本发明提供包含以下的融合多肽：
a)包含以下氨基酸序列的CID
QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI(SEQ ID NO：4)；
b)包含以下氨基酸序列的VID
DTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK(SEQ ID NO：38)；and
c)包含以下氨基酸序列的半寿期延长结构域
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：39).
本文提供按任意顺序包含CID、VID和半寿期延长结构域的融合多肽。例如，融合多肽可以从N端至C端按选自以下的顺序包含CID、VID和Fc区(Fc)：(1)VID、Fc、CID；(2)CID、Fc、VID；(3)CID、VID、Fc；(4)VID、CID、Fc；(5)Fc、VID、CID；和(6)Fc、CID、VID。在一些实施方案中，融合多肽从N端至C端按VID、Fc、CID的顺序包含CID、VID和Fc。在一些实施方案中，融合蛋白包含以下氨基酸序列：
GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI(SEQ IDNO：12).
在其他实施方案中，融合多肽包含以下氨基酸序列：
QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK(SEQ ID NO：33).
还在其他实施方案中，融合多肽包含以下氨基酸序列：
QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：34).
还在其他实施方案中，融合多肽包含以下氨基酸序列：
GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：35).
在其他实施方案中，融合多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI(SEQ ID NO：36).
在其他实施方案中，融合多肽包含以下氨基酸序列：
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK(SEQ ID NO：37).
还在其他实施方案中，融合多肽包含以下氨基酸序列：
DTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI(SEQID NO：40).
还考虑包含至少两个或多个CID、两个或多个VID和/或两个或多个半寿期延长结构域的融合蛋白。例如，融合蛋白可以从N端至C端按VID、Fc、CID、CID的顺序或其任意其他组合包含两个CID、VID和Fc区。在一个实施方案中，该融合蛋白可以从N端至C端按VID、VID、Fc、CID的顺序或其任意其他组合包含CID、两个VID和Fc区。在另一实施方案中，该融合蛋白可以从N端至C端按VID、Fc、CID、Fc的顺序或其任意其他组合包含CID、VID和两个Fc区。还在另一实施方案中，该融合蛋白可以从N端至C端按VID、Fc、VID、Fc、CID、CID的顺序或其任意其他组合包含至少两个CID、至少两个VID和至少两个Fc区。本文提供至少一个VID、至少一个CID和至少一个半寿期延长结构域的任意组合，就如同本文明确陈述每种组合一样。
本发明中所述的融合蛋白可以包含CID的化学修饰形式。例如，CID可以PEG化或与聚合物缀合来增加体内半寿期；或者CID可以与抗体、抗体片段、Fc区、HSA或其他人蛋白质化学交联来增加体内半寿期；或者CID可以以任意长期持续释放形式配制来延长体内抗补体活性。
本发明中所述的融合蛋白可以包含VID的化学修饰形式。例如，VID可以PEG化或与聚合物缀合来增加体内半寿期；或者VID可以与抗体、抗体片段、Fc区、HSA或其他人蛋白质化学交联来增加体内半寿期；或者VID可以以任意长期持续释放形式配制来延长体内抗补体活性。
本发明中所述的融合蛋白可以包含CID和VID的化学修饰形式。例如，CID和VID可以PEG化或与聚合物缀合来增加体内半寿期；或者CID和VID可以与抗体、抗体片段、Fc区、HSA或其他人蛋白质化学交联来增加体内半寿期；或者CID和VID可以以任意长期持续释放形式配制来延长体内抗补体活性。
在一些实施方案中，考虑本文提供的融合蛋白的氨基酸序列变体。例如，可以希望改善CID、VID和/或半寿期延长结构域的结合亲和力和/或其他生物学特性。融合多肽的氨基酸序列变体可以通过将适当的修饰引入编码CID、VID和/或半寿期延长结构域的核苷酸序列或通过肽合成来制备。这类修饰包括例如CID、VID和/或半寿期延长结构域的氨基酸序列内的残基的缺失和/或插入和/或取代。可以产生缺失、插入和取代的任意组合来达到最终的构建体，只要最终的构建体具有希望的特征(例如，与补体成分结合、与VEGF结合、抑制补体途径的激活、抑制VEGF途径的激活和/或延长半寿期)。在一些实施方案中，融合多肽包含与从N端至C端按选自(1)VID、Fc、CID；(2)CID、Fc、VID；(3)CID、VID、Fc；(4)VID、CID、Fc；(5)Fc、VID、CID；和(6)Fc、CID、VID的顺序包含本文公开的任意CID、VID和Fc的融合多肽的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，融合多肽变体包含与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、或至少99％序列同一性的氨基酸序列。
本文公开的氨基酸残基取代还包括保守取代。保守取代显示在以下表2的“优选的取代”的标题下。如果这类取代导致生物学活性改变，则可以引入更实质性的改变(表2中命名为“示例性取代”，或如下文参考氨基酸种类进一步描述)，并筛选产物。可以将表2中所示或下文参考氨基酸种类描述的氨基酸取代引入本文提供的任意融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)。
表2.可能的氨基酸取代
原残基 示例性取代 优选的取代
Ala(A) Val；Leu；Ile Val
Arg(R) Lys；Gln；Asn Lys
Asn(N) Gln；His；Asp，Lys；Arg Gln
Asp(D) Glu；Asn Glu
Cys(C) Ser；Ala Ser
Gln(Q) Asn；Glu Asn
Glu(E) Asp；Gln Asp
Gly(G) Ala Ala
His(H) Asn；Gln；Lys；Arg Arg
Ile(I) Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸 Leu
Leu(L) 正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe Ile
Lys(K) Arg；Gln；Asn Arg
Met(M) Leu；Phe；Ile Leu
Phe(F) Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr Tyr
Pro(P) Ala Ala
Ser(S) Thr Thr
Thr(T) Val；Ser Ser
Trp(W) Tyr；Phe Tyr
Tyr(Y) Trp；Phe；Thr；Ser Phe
Val(V) Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸 Leu
通过选择在其对维持(a)取代区域中的多肽骨架的结构(例如，作为片层或螺旋构象)、(b)在靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积的作用上显著不同的取代来实现蛋白质或多肽的生物学特性的实质性修饰。氨基酸可以按照共同的侧链特性分组：
(1)疏水性：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；
(2)中性亲水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；
(3)酸性：Asp、Glu；
(4)碱性：His、Lys、Arg；
(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；
(6)芳族：Trp、Tyr、Phe；
(7)大的疏水性：正亮氨酸、Met、Val、Leu、Ile。
非保守取代需将这些种类之一的成员换为另一种类。
如Cunningham和Wells在Science，244：1081-1085(1989)中所述，用于鉴定融合蛋白的用于诱变的优选位置的某些残基或区域的方法称为“丙氨酸扫描诱变”。在此，鉴定残基或靶残基组(例如，诸如arg、asp、his、lys和glu的带电荷残基)，并用中性或带负电荷的氨基酸(最优选丙氨酸或聚丙氨酸)取代，以影响氨基酸与靶结合配偶体的相互作用。然后通过在该取代位点或为该取代位点引入另外的或其他变体来提炼证明对取代的功能敏感性的那些氨基酸位置。因此，虽然引入氨基酸序列变异的位点是预定的，但突变的性质本身无需是预定的。例如，为了分析给定位点的突变的性能，在靶密码子或区域处进行ala扫描或随机诱变，并针对希望的活性筛选所表达的融合多肽变体。
还可以取代(通常用丝氨酸)不涉及维持融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的正确构象的任意半胱氨酸残基，以改善分子的氧化稳定性和防止异常交联。相反，可以向该融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)加入一个或多个半胱氨酸键来改善其稳定性。
在其他实施方案中，本发明的肽或多肽可以包含一个或多个非天然存在的或修饰的氨基酸。“非天然存在的氨基酸残基”指除上文列出的那些天然存在的氨基酸残基之外的残基，其能够共价结合多肽链中邻近的一个或多个氨基酸残基。非天然氨基酸包括但不限于高赖氨酸、高精氨酸、高丝氨酸、氮杂环丁烷羧酸、2-氨基己二酸、3-氨基己二酸、β-丙氨酸、氨基丙酸、2-氨基丁酸、4-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基庚酸、2-氨基异丁酸、3-氨基异丁酸、2-氨基庚二酸、叔丁基甘氨酸、2，4-二氨基异丁酸、锁链素、2，2’-二氨基庚二酸、2，3-二氨基丙酸、N-乙基甘氨酸、N-乙基天冬酰胺、高脯氨酸、羟基赖氨酸、别羟基赖氨酸、3-羟脯氨酸、4-羟脯氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、N-甲基丙氨酸、N-甲基甘氨酸、N-甲基异亮氨酸、N-甲基戊基甘氨酸、N-甲基缬氨酸、萘丙氨酸、正缬氨酸、正亮氨酸、鸟氨酸、瓜氨酸、戊基甘氨酸、哌啶酸和硫代脯氨酸。修饰的氨基酸包括可逆或不可逆地化学阻断、或在其N端氨基或其侧链基团上修饰(例如N-甲基化的D和L氨基酸)、侧链官能团化学修饰为另一官能团的天然和非天然的氨基酸。例如，修饰的氨基酸包括蛋氨酸亚砜；蛋氨酸砜；天冬氨酸的修饰氨基酸，天冬氨酸-(β-甲酯)；甘氨酸的修饰氨基酸，N-乙基甘氨酸；或丙氨酸甲酰胺和丙氨酸的修饰氨基酸。其他非天然的和修饰的氨基酸及将它们掺入蛋白质和肽的方法为本领域已知(见例如Sandberg等，(1998)J.Med.Chem.41：2481-91；Xie和Schultz(2005)Curr.Opin.Chem.Biol.9：548-554；Hodgson和Sanderson(2004)Chem.Soc.Rev.33：422-430)。
氨基酸序列插入包括长度范围从一个残基至包含一百个或更多个残基的多肽的氨基(“N”)和/或羧基(“C”)端融合，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的实例包括具有N端甲硫氨酰残基的融合多肽或与细胞毒性多肽融合的融合多肽。融合多肽分子的其他插入变体包括与融合多肽的N端或C端与酶或增加融合多肽的血清半寿期的多肽(例如半寿期延长结构域)的融合。
本发明提供可以是本文提供的任意融合多肽的成分的信号肽。例如，包含CID、VID和半寿期延长结构域的融合多肽可以还包含异源多肽，优选信号肽或在成熟蛋白质或多肽的N端具有特异性切割位点的其他多肽。所选择的异源信号序列优选是真核宿主细胞识别和加工(即通过信号肽酶切割)的异源信号序列。对于不识别和加工天然哺乳动物信号序列的原核宿主细胞，用选自例如来自碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II基因的前导序列的原核信号序列取代真核(即哺乳动物)信号序列。对于酵母分泌，可以用例如酵母转化酶前导序列、因子前导序列(包括酵母属(Saccharomyces)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)因子前导序列)或酸性磷酸酶前导序列、白假丝酵母(C.albicans)葡糖淀粉酶前导序列或WO90/13646中所述的信号序列取代天然信号序列。在哺乳动物细胞表达中，哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列(例如单纯疱疹病毒gD信号)可用。在一些实施方案中，含有VID、CID和半寿期延长结构域的融合多肽还包含含有选自SEQ ID NO：9、10和43的氨基酸序列的信号肽。信号肽可以在它从宿主细胞产生时被从融合多肽完全切割，或者它可以被部分切割。可以从宿主细胞产生融合多肽的混合群体，其中融合多肽包含完全切割的信号序列(例如无信号序列)、部分切割的信号序列(例如信号序列的一部分)和/或未切割的信号序列(例如完整信号序列)。例如，本文公开的还在其N端包含含有选自SEQ ID NO：9、10和43的氨基酸序列的信号肽的任意融合多肽可以在N端部分切割。在一个实施方案中，还在N端包含信号肽的融合多肽可以在N端切割1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21或22个氨基酸残基的任一个。在另一实施方案中，还在N端包含信号肽的融合多肽可以在N端切割，以产生包含来自信号肽的1、2、3、4或5个氨基酸的任一个的融合多肽。在一些实施方案中，含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列的融合多肽还包含含有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的信号肽。在其他实施方案中，含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列的融合多肽还包含含有SEQ ID NO：10或43的氨基酸序列的信号肽。
本发明提供含有两个融合蛋白的二聚体融合蛋白，其中每个融合蛋白包含本文公开的任意融合蛋白。在一个实施方案中，该二聚体融合蛋白包含两个相同的融合蛋白。在另一实施方案中，该二聚体融合蛋白包含两个不同的融合蛋白。在另一实施方案中，该二聚体融合蛋白包含至少一个含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列或与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列的融合蛋白。在另一实施方案中，含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列的融合蛋白可以从N端或C端去除1、2、3、4或5个氨基酸残基。在一个实施方案中，从包含编码所述作为蛋白质融合二聚体的融合蛋白的核酸的宿主细胞回收融合蛋白。
IV.核酸、载体和宿主细胞
核酸
本文提供分离的编码本文所述的任意CID的核酸。在一些实施方案中，该CID包含由选自SEQ ID NO：17-22和29-32的核酸序列编码的氨基酸序列。本公开还提供分离的核酸分子，其中该核酸分子编码包含与选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的CID。本文还提供分离的编码本文所述的任意VID的核酸。在一些实施方案中，该VID包含由SEQ ID NO：27的核酸序列编码的氨基酸序列。本文还提供分离的核酸分子，其中该核酸分子编码包含与选自SEQ ID NO：11和38的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的VID。本文还提供分离的编码本文所述的任意半寿期延长结构域的核酸。在一些实施方案中，该半寿期延长结构域是Fc区。在一些实施方案中，该Fc区包含由SEQ IDNO：23的核酸序列编码的氨基酸序列。本文还提供分离的核酸分子，其中该核酸分子编码包含与选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的半寿期延长结构域。本文提供分离的编码本文所述的任意融合多肽的核酸。在一些实施方案中，该融合多肽包含由SEQ ID NO：28的核酸序列编码的氨基酸序列。本文还提供分离的核酸分子，其中该核酸分子编码包含与选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列具有至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％序列同一性的氨基酸序列的融合多肽。
编码本文所述的任意多肽(例如CID、VID、半寿期延长结构域、接头、融合多肽等)的多核苷酸序列可以用标准的合成和/或重组技术获得。可以从适当的来源细胞分离所希望的多核苷酸序列并测序。抗体、肽和/或多肽的来源细胞可以包括产生抗体、肽和/或多肽的细胞，如杂交瘤细胞。备选地，可以用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。
载体
一旦获得，即可以将编码肽和/或多肽的序列插入能够在宿主细胞中复制并表达异源多核苷酸的重组载体中。本领域可得和已知的许多载体可以用于本发明的目的。适当的载体的选择将主要取决于将要插入该载体的核酸的大小和将要用该载体转化的具体宿主细胞。取决于其功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者)及其与它所驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体包含多种成分。载体成分通常包括但不限于：复制起点(尤其是在将载体插入原核细胞时)、选择标记基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段和转录终止序列。在一些实施方案中，该载体是表达载体。在一些实施方案中，该载体包含编码CID氨基酸序列的核酸。在一些方面，该载体包含编码含有选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列的CID的核酸。在一些实施方案中，该载体包含编码VID氨基酸序列的核酸。在一些方面，该载体包含编码含有选自SEQ ID NO：11和38的氨基酸序列的VID的核酸。在一些实施方案中，该载体包含编码半寿期延长结构域氨基酸序列的核酸。在一些方面，该半寿期延长结构域是Fc区。适宜的Fc区序列为本领域公知。例如，许多编码一个或多个Fc区的表达载体可从美国模式培养物保藏所(American Type CultureCollection)(Rockville，Md)获得。在一些方面，该载体包含编码含有选自SEQ ID NO：7、39、41和42的氨基酸序列的Fc区的核酸序列。在一些实施方案中，该载体包含编码融合多肽氨基酸序列的核酸。在一些方面，该载体包含编码含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列的融合多肽的核酸序列。
在一些实施方案中，含有编码融合多肽氨基酸序列的核酸的载体还包含编码信号肽的核酸。编码信号肽的核酸与编码融合多肽的核酸符合读框地连接。在一些方面，含有编码融合多肽的核酸的载体还包含编码含有选自SEQ ID NO：9、10和43的氨基酸序列的信号肽的核酸。在一些方面，该载体包含编码含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列的融合多肽的核酸，及编码含有选自SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ IDNO：43的氨基酸序列的信号序列的核酸。在一些方面，该载体包含编码含有SEQ ID NO：12的氨基酸序列的融合多肽的核酸，及编码含有SEQ IDNO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：43的氨基酸序列的信号序列的核酸。在其他方面，该载体包含编码含有SEQ ID NO：40的氨基酸序列的融合多肽的核酸，及编码含有SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10或SEQ ID NO：43的氨基酸序列的信号序列的核酸。可以用本领域公知的载体以及本文公开的载体(例如pCI-neo)来在宿主细胞中复制和表达编码本文公开的任意融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的多核苷酸。
(1)信号序列成分
在一些实施方案中，重组载体内的每个顺反子包含指导所表达的多肽跨膜易位的分泌信号序列成分。通常，信号序列可以是载体的成分，或者它可以是插入载体中的靶多肽DNA的一部分。选择用于本发明的目的的信号序列应是宿主细胞可识别和加工(即通过信号肽酶切割)的信号序列。对于不识别和加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，用选自例如碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP的原核信号序列取代该信号序列。在一些实施方案中，该信号序列由选自SEQ ID NO：25和26的核酸编码。
(2)复制起点
表达载体和克隆载体都包含使得载体能够在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，此序列是使得载体能够独立于宿主染色体DNA复制的序列，且包括复制起点或自主复制序列。对于多种细菌、酵母和病毒，这类序列众所周知。来自质粒pBR322的复制起点适合用于大多数革兰氏阴性菌，2μ质粒起点适合用于酵母，多种病毒起点(SV40病毒、多瘤病毒、腺病毒、水疱性口炎病毒(“VSV”)或牛乳头瘤病毒(“BPV”))用于哺乳动物细胞中的克隆载体。通常，哺乳动物表达载体无需复制起点成分(通常可以使用SV40起点，但仅是因为它包含早期启动子)。
(3)选择基因成分
表达载体和克隆载体也可以包含能够在转化的细胞中提供表型选择的选择基因，也称为选择标记。典型的选择基因编码这样的蛋白质，该蛋白质(a)赋予对抗生素或其他毒素(例如氨苄青霉素、新霉素、氨甲喋呤或四环素)的抗性、(b)弥补营养缺陷或(c)提供从复合培养基不可得的关键营养物，例如编码芽孢杆菌属(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。选择方案的一个实例利用药物来阻断宿主细胞的生长。异源基因成功转化的那些细胞产生赋予药物抗性的蛋白质，因此从选择方案存活下来。这种显性选择策略的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。适合用于哺乳动物细胞的选择标记的另一实例是使得能够鉴定有能力摄取融合多肽(或融合多肽片段)编码核酸的细胞的那些，如二氢叶酸还原酶(“DHFR”)、谷氨酰胺合成酶(GS)、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II(优选灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，首先通过在包含氨甲喋呤(Mtx)(DHFR的竞争性拮抗剂)的培养基中培养所有转化体来鉴定用DHFR选择基因转化的细胞。用于野生型DHFR的示例性宿主细胞株是缺乏DHFR活性的中国仓鼠卵巢(“CHO”)细胞系(例如ATCC CRL-9096)。备选地，通过在包含GS抑制剂L-蛋氨酸亚砜亚胺(Msx)的培养基中培养转化体来鉴定用GS(谷氨酰胺合成酶)基因转化的细胞。在这些条件下，GS基因与任意其他共转化的核酸一起扩增。GS选择/扩增系统可以与上述DNFR选择/扩增系统组合使用。
对于另一实例，通常用衍生自大肠杆菌(E.coli)物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，因此提供容易的手段来鉴定转化的细胞。pBR322、其衍生物或其他微生物质粒或噬菌体还可以包含或修饰为包含微生物可以用来表达内源蛋白质的启动子。
适合用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒YRp7中的trp1基因(Stinchcomb等，Nature，282：39(1979))。trp1基因为缺乏在包含色氨酸的培养基中生长的能力的酵母突变体菌株(例如ATCC No.44076或PEP4-1)提供了选择标记。Jones，Genetics，85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中trp1损伤的存在则为通过在缺乏色氨酸的情况下生长来检测转化提供了有效的环境。类似地，Leu2缺陷的酵母菌株(例如ATCC20,622或38,626)可以通过具有Leu2基因的已知质粒来互补。此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可以用于转化克鲁维酵母属酵母。备选地，针对乳酸克鲁维酵母(K.lactis)报道了用于大规模产生重组小牛凝乳酶的表达系统。Vanden Berg，Bio/Technology，8：135(1990)。还已公开了用于通过克鲁维酵母属的工业菌株分泌成熟的重组人血清白蛋白的稳定的多拷贝表达载体。Fleer等，Bio/Technology，9：968-975(1991)。
此外，包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体可以用作与这些宿主相关的转化载体。例如，诸如λGEM.TM.-11的噬菌体可以用于制备可用来转化诸如大肠杆菌LE392的易感宿主细胞的重组载体。
(4)启动子成分
表达载体和克隆载体通常包含宿主生物可识别且与编码融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的核酸有效连接的启动子。适合用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶启动子、色氨酸启动子系统及杂合启动子，如tac启动子。但是，在细菌中具有功能的其他启动子(如其他已知的细菌或噬菌体启动子)也是适宜的。
根据具体情况的需要，可以在本发明中使用组成型或诱导型启动子，这可以由本领域技术人员确定。多种潜在的宿主细胞识别的大量启动子是公知的。可以通过经限制酶消化从源DNA去除启动子，并将分离的启动子序列插入所选择的载体来将所选择的启动子与编码本文所述多肽的顺反子DNA有效连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可以用来指导靶基因的扩增和/或表达。但是，优选异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常允许所表达的靶基因的更多的转录和更高的产率。
已知真核生物的启动子序列。基本上所有真核基因都具有位于转录起始位点上游约25至30个碱基的富含AT的区域。见于许多基因的转录起点上游70至80个碱基的另一序列是CNCAAT区，其中N可以是任意核苷酸。大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，其可以是将poly A尾加至编码序列3’端的信号。所有这些序列都可以插入真核表达载体中。
适合用于酵母宿主的启动子序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其他糖酵解酶(如烯醇化酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡萄糖激酶)的启动子。
酵母中的诱导型启动子具有允许通过生长条件来控制转录的额外优势。诱导型启动子的实例包括醇脱氢酶2、异细胞色素(isocytochrome)C、酸性磷酸酶、氮代谢相关降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适合用于酵母表达的载体和启动子还描述于EP73,657中。还有利地与酵母启动子一起使用酵母增强子。
哺乳动物宿主细胞中编码融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的核酸从载体的转录可以例如通过获自病毒(如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、反转录病毒、乙型肝炎病毒和最优选猿猴病毒40(SV40))基因组的启动子、通过异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)和通过热休克基因启动子来控制，只要这类启动子与希望的宿主细胞系统相容。
作为SV40限制片段方便地获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该限制片段还包含SV40病毒复制起点。作为HindIII E限制片段方便地获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利号4,419,446中公开了用牛乳头瘤病毒作为载体来在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利号4,601,978中描述了此系统的修改。关于人干扰素cDNA在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶激动子的控制下在小鼠细胞中的表达，还见Reyes等，Nature297：598-601(1982)。备选地，可以用劳斯肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。
(5)增强子元件成分
通常通过将增强子序列插入载体来增加高等真核生物对编码融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的DNA的转录。现已知来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。但是，本领域普通技术人员通常将使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括复制起点晚期一侧的SV40增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、复制起点晚期一侧的多瘤增强子和腺病毒增强子。关于用于激活真核启动子的增强元件，还见Yaniv，Nature297：17-18(1982)。增强子可以在融合蛋白(或融合蛋白片段)编码序列的5’或3’的位置剪接入载体，但优选位于启动子的5’的位点。
(6)转录终止成分
用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其他多细胞生物的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。这类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5’和，偶尔3’，非翻译区获得。这些区域包含转录为编码抗体或其片段的mRNA的非翻译部分中的聚腺苷酰化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止成分是牛生长激素聚腺苷酸化区域。见WO94/11026及其中公开的表达载体。
宿主细胞
适合用于克隆或表达本文所述的载体中的编码融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的DNA的宿主细胞包括上述原核细胞、酵母细胞或高等真核细胞。适合用于此目的的原核生物包括真细菌，如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，如埃希氏菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌；肠杆菌属(Enterobacter)；欧文氏菌属(Erwinia)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)；变形杆菌属(Proteus)；沙门氏菌属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)；和志贺氏菌属(Shigella)；以及芽孢杆菌属，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如，公开于1989年4月12日公开的DD266,710中的地衣芽孢杆菌41P)；假单胞菌属(Pseudomonas)，如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)；和链霉菌属(Streptomyces)。一种优选的大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，但其他诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)的菌株也适合。这些实例是说明性的而不是限制性的。
尤其是在不需要糖基化时，如在将融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)与细胞毒剂(例如毒素)缀合时，可以在细菌中产生融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)。大肠杆菌中的产生更快，更有成本效益。对于融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)在细菌中的表达参见例如U.S.5,648,237(Carter等)、U.S.5,789,199(Joly等)和U.S.5,840,523(Simmons等)，其描述了用于优化表达和分泌的翻译起始区(TIR)和信号序列。表达后，从可溶性级分中的大肠杆菌细胞糊分离融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)，并可以通过例如A蛋白或G蛋白柱(取决于融合多肽的结合部分，如Fc区同种型)纯化。可以通过与用来纯化在例如CHO中表达的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的方法相同的方法来进行最后的纯化。
除原核生物外，诸如丝状真菌或酵母的真核微生物也是适合用于融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)编码载体的克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常见的面包酵母是常用的低等真核宿主微生物。但是，许多其他属、物种和菌株通常可获得，并用于本文，如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属物种，如乳酸克鲁维酵母、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC24,178)、瓦尔提克鲁维酵母(K.waltii)(ATCC56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；耶氏酵母属(yarrowia)(EP402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP183,070)；假丝酵母属(Candida)；里氏木霉(Trichoderma reesia)(EP244,234)；粗糙链孢霉(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，如西方许旺酵母(Schwanniomyces occidentalis)；和丝状真菌，如脉孢霉属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)；和曲霉属(Aspergillus)宿主，如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。讨论酵母和丝状真菌在产生治疗性蛋白质中的用途的综述见例如Gerngross，Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)。
可以选择某些真菌和酵母菌株，其中糖基化途径已“人源化”，导致产生具有部分或完全人糖基化模式的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)。见例如Li等，Nat.Biotech.24：210-215(2006)(描述巴斯德毕赤酵母中糖基化途径的人源化)；及Gerngross等，上文。
适合用于表达糖基化的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的宿主细胞衍生自多细胞生物。无脊椎动物细胞的实例包括植物细胞和昆虫细胞。已鉴定了来自诸如草地夜蛾(Spodopterafrugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedesalbopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)(蛾)的宿主的许多杆状病毒株和变体及对应的许可的昆虫宿主细胞。多种用于转染的病毒株是公开可得的，例如苜蓿银纹夜蛾(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5病毒株。可以将这类病毒用作根据本发明的病毒，尤其是用于转染草地夜蛾细胞。
也可以用棉花、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。
但是，对脊椎动物细胞的兴趣是最大的，且繁殖培养(组织培养)的脊椎动物细胞已成为常规方法。有用的哺乳动物宿主细胞系的实例是SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL1651)；人胚肾细胞系(293或为在悬浮培养物中生长亚克隆的293细胞，Graham等，J.Gen.Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；小鼠足细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CVl ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL3A，ATCC CRL1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982))；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。其他有用的哺乳动物宿主细胞系包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，包括DHFR-CHO细胞(Urlaub等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA77：4216(1980))；骨髓瘤细胞系，如NS0和Sp2/0。某些适合用于多肽产生的哺乳动物宿主细胞系的综述见例如Yazaki和Wu，Methods in Molecular Biology，248卷(B.K.C.Lo编辑，Humana Press，Totowa，NJ，2003)，255-268页。
能够表达本文公开的任意蛋白质的哺乳动物细胞的实例可以选自仓鼠细胞、小鼠细胞、大鼠细胞、兔细胞、猫细胞、狗细胞、牛细胞、山羊细胞、猪细胞、马细胞、绵羊细胞、猴细胞、黑猩猩细胞和人细胞。在另一实施方案中，该动物细胞是神经细胞(如但不限于外周神经系统细胞或中枢神经细胞细胞)、肌细胞(如心肌、骨骼肌或平滑肌细胞)、配子(如精细胞或卵母细胞)、癌细胞、免疫细胞(如但不限于巨噬细胞、T细胞或B细胞)、干细胞(如但不限于胚胎干细胞或成体干细胞)或内分泌细胞(如但不限于甲状腺细胞、下丘脑细胞、垂体细胞、肾上腺细胞、睾丸细胞、卵巢细胞、胰细胞(如β细胞)、胃细胞或肠细胞)。在一些实施方案中，该细胞是细胞培养物中的人细胞。在一些实施方案中，该细胞是细胞培养物中的非人细胞。在一些实施方案中，该细胞是癌细胞。
用上述用于融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)产生的表达载体或克隆载体转化或转染宿主细胞，并在适于诱导启动子、选择转化体或扩增编码希望的序列的基因而改进的常规营养培养基中培养。
转染指实际上表达或不表达任何编码序列的宿主细胞摄取表达载体。许多转染方法为普通技术人员已知，例如CaPO4沉淀和电穿孔。当宿主细胞内发生此载体运行的任何指示时，通常认为是成功转染。
转化意指将DNA引入原核宿主，使得DNA可作为染色体外元件或通过染色体整合体复制。取决于所使用的宿主细胞，用适合于这类细胞的标准技术进行转化。利用氯化钙的钙处理通常用于含有实质性细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法利用聚乙二醇/DMSO。可以使用的另一种技术是电穿孔。
V.产生融合多肽及其片段的方法
本文提供用于产生本文公开的本发明的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的方法。在一些实施方案中，用于产生本文公开的任意融合多肽的方法包括：在产生该融合多肽的条件下培养包含编码本文公开的任意融合多肽的核酸的宿主细胞，并回收由该宿主细胞产生的融合多肽。在一些方面，用于产生融合多肽的方法包括：在产生该融合多肽的条件下培养包含编码含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列的融合多肽的核酸的宿主细胞，并回收由该宿主细胞产生的融合多肽。
(1)培养宿主细胞
在本领域已知且适合用于培养所选择的宿主细胞的培养基中培养用于产生本发明的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的原核细胞。适宜的培养基的实例包括添加了必需的营养补充物的Luria肉汤(LB)。在优选实施方案中，该培养基还包含根据表达载体的构建选择的选择剂，以选择性地允许包含表达载体的原核细胞的生长。例如，向培养基中加入氨苄青霉素来培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞。还可以按适当的浓度包含除碳、氮和无机磷酸来源以外的任意必需补充物，其单独引入或作为与另一补充物或培养基的混合物(如复合氮源)引入。可选地，该培养基可以包含选自谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙醇酸盐、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇的一种或多种还原剂。在适宜的温度下培养原核宿主细胞。对于大肠杆菌生长，例如，优选的温度在从约20℃至约39℃的范围内，更优选从约25℃至约37℃，甚至更优选在约30℃。主要取决于宿主生物，培养基的pH可以是从约5至约9的范围内的任意pH。对于大肠杆菌，pH优选从约6.8至约7.4，且更优选约7.0。如果将诱导型启动子用于表达载体中，则在适合于激活该启动子的条件下诱导蛋白质表达。例如，如果用PhoA启动子来控制转录，则可以在用于诱导的磷酸盐限制培养基中培养转化的宿主细胞。如本领域已知，根据所利用的载体构建体，可以使用多种其他诱导物。
可在多种培养基中培养用来产生本文所述的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的宿主细胞。诸如Ham′s F10(Sigma)、Minimal Essential Medium(MEM)(Sigma)、RPMI-1640(Sigma)和Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium(DMEM，Sigma)的市售培养基适合用于培养宿主细胞。此外，可以用Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利号4,767,704、4,657,866、4,927,762、4,560,655或5,122,469；WIPO公开号WO90/03430；WO87/00195；或美国专利Re.30,985中所述的任意培养基作为宿主细胞的培养基。可以根据需要向任意这些培养基中补充激素和/或其他生长因子(如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子)、盐(如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(如HEPES)、核苷酸(如腺苷和胸苷)、抗生素(如GENTAMYCINTM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围内的终浓度存在的无机化合物)和葡萄糖或等同的能量来源。还可以按本领域技术人员已知的适当浓度包含任意其他必需的补充物。培养条件(如温度、pH等)是之前用于选择用于表达的宿主细胞的那些，且对普通技术人员而言将是显而易见的。
(2)融合多肽及其片段的纯化
在使用重组技术时，本文所述的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)可以在胞内、在周质间隙中产生，或者直接分泌入培养基。如果多肽在胞内产生，作为第一步骤，蛋白质回收通常涉及破裂微生物，通常通过诸如渗透压休克、超声处理或裂解的手段。一旦破裂细胞，即可以例如通过离心或超滤来去除来自宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片。Carter等，Bio/Technology10：163-167(1992)描述了用于分离分泌至大肠杆菌的周质间隙的多肽的方法。简言之，在醋酸钠(pH3.5)、EDTA和苯甲基磺酰氟(PMSF)的存在下融化细胞糊约30分钟。可以通过离心去除细胞碎片。在多肽分泌入培养基时，通常先用市售蛋白浓缩滤器(例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)过滤并浓缩来自这类表达系统的上清。可以在任意前述步骤中包含诸如PMSF的蛋白酶抑制剂来抑制蛋白水解，且可以包含抗生素来防止外来污染物的生长。
可以用例如羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从这类细胞制备的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的组合物，亲和层析是优选的纯化技术。在一些实施方案中，用蛋白A或蛋白G作为用于亲和层析的亲和配体。蛋白A作为亲和配体的适合性取决于存在于融合多肽或其片段中的任意免疫球蛋白Fc区的种类和同种型(Lindmark等，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。在优选实施方案中，用蛋白A作为用于分离和纯化本文所述的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的亲和配体。在一些实施方案中，用蛋白G作为用于分离和纯化本文所述的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的亲和配体。亲和配体所附着的基质最常见的是琼脂糖，但其他基质也可用。与用琼脂糖可以达到的流速和处理时间相比，机械稳定的基质(如可控孔度玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)允许更快的流速和更短的处理时间。取决于要回收的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)，用于蛋白质纯化的其他技术(如离子交换柱上的分级分离，乙醇沉淀，反相HPLC，二氧化硅、肝素、SEPHAROSETM或阴离子或阳离子交换树脂(如聚天冬氨酸柱)上的层析，以及层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀)也是可用的。在一些实施方案中，所回收的融合蛋白基本纯。在另一实施方案中，所回收的融合蛋白为至少90％、91％、92.％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％纯中的任一。
任意一个或多个初步纯化步骤后，可以对包含目的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)和污染物的混合物进行低pH疏水作用层析，该层析使用pH在约2.5-4.5之间的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例如约0-0.25M盐)下进行。
一般而言，用于制备用于研究、测试和临床应用的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)的多种方法在本领域中是完善的，与上述方法一致和/或由本领域技术人员认为适合用于具体的目的融合多肽或其片段(例如CID、VID、半寿期延长结构域等)。
(3)融合多肽及其片段的生物学活性
可以用公知的方法纯化和鉴定多肽，如免疫亲和柱或离子交换柱上的分级分离；乙醇沉淀；反相HPLC；二氧化硅上或诸如DEAE的阳离子交换树脂上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；使用例如SephadexG-75的凝胶过滤；疏水亲和树脂；使用固定在基质上的适宜的结合配偶体的配体亲和；ELISA；BIACore；Western印迹测定；氨基酸和核酸测序；及生物学活性。
可以表征或评估本文公开的融合蛋白的包括但不限于以下的生物学活性：与靶结合配偶体(例如VEGF或补体蛋白)的亲和力、竞争性结合(例如阻断靶结合配偶体与补体调节蛋白或VEGFR的结合)、抑制活性(例如抑制补体激活或VEGF激活)、融合蛋白的半寿期、细胞增殖的抑制、肿瘤生长的抑制及血管发生(例如脉络膜新血管形成)的抑制。在一些实施方案中，可以评估本文公开的融合蛋白的体内和体外生物学活性。在本文所述的任意测定中，在4℃、20-28℃(例如25℃)或37℃的温度下进行该测定。
可以评估本文公开的融合蛋白与诸如补体蛋白(例如C3b、C4b、iC3b、C3dg、C1q或MBP)的结合配偶体的亲和力。许多用于评估结合亲和力的方法为本领域已知，且可以用来鉴定融合蛋白与结合配偶体的结合亲和力。结合亲和力可以表示为解离常数(Kd)值或半最大有效浓度(EC50)值。用于测定结合亲和力(例如Kd值)的技术为本领域公知，如酶联免疫吸附测定(ELISA)和BIAcore。见Harlow和Lane，Antibodies：ALaboratory Manual，CSH Publications，NY(1988)；Ausubel等，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，New York，(2009)；Altschuh等，Biochem.，31：6298(1992)；及Pharmacia Biosensor公开的BIAcore方法；其全都在此引入作为参考。例如，可以用ELISA测定融合蛋白与结合配偶体的结合亲和力。在一些实施方案中，用ELISA测定融合蛋白与C3b或C4b的结合。在此示例性测定中，用100ng/孔的C3b或C4b包被96孔ELISA平板的孔。向各孔中加入约0-1μM的纯化融合蛋白，并孵育1小时，然后洗涤，以去除未结合的C3b或C4b。随后向各孔中加入1∶5000稀释的抗-Fc HRP缀合物(例如Sigma目录号A0170-1ML)，并孵育1小时。孵育后，洗涤孔，然后加入TMB底物(例如Sigma目录号S5814-100ML)的终止试剂。在450nm测量样品的吸光度，并用计算机软件(例如Prism4)通过S形曲线拟合分析来获得融合蛋白与C3b或C4b的结合的Kd值和/或EC50值。在另一实例中，用ELISA测定融合蛋白与VEGF(例如VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或PlGF)的结合。在示例性测定中，用100ng VEGF-A(例如R&D Systems)包被96孔ELISA平板，并向各孔中加入约0-10nM的纯化融合多肽，然后孵育1小时。洗涤后，向各孔中加入1∶5000稀释的抗-Fc HRP缀合物孵育1小时，然后洗涤，并向各孔中加入TMB底物的终止试剂。在450nm测量样品的吸光度，并用计算机软件通过S形曲线拟合分析来获得融合蛋白与VEGF-A结合的Kd值和/或EC50值。在另一示例性测定中，用人VEGFQuantikine ELISA试剂盒(R&D Systems目录号DVE00)通过ELISA来测定融合蛋白与可溶性VEGF的结合。
可以评估本文公开的融合蛋白的补体途径(例如经典途径、旁路途径和/或凝集素途径)的抑制活性。许多用于评估抑制活性的方法为本领域已知，且可以用来鉴定融合蛋白的抑制活性。结合亲和力可以表示为半最大有效浓度(EC50)值。例如，可以用总溶血(CH50)测定来测定融合蛋白对经典补体途径或凝集素途径的抑制活性。在此示例性测定中，首先测定在37℃孵育1小时后裂解1x107抗体致敏绵羊红细胞/ml的90％的正常人血清的稀释度。该测定在含有0.15mM CaCl2和0.5mM MgCl2的缓冲液中进行。通过将可以裂解90％抗体致敏绵羊红细胞的正常人血清稀释液与0-500nM的融合蛋白在37℃混合1小时来激活经典补体途径的抑制。然后在孵育1小时后通过以下来测定抗体致敏的绵羊红细胞的溶血：在541nm测量吸光度，然后用计算机软件(例如Prism4)通过S形曲线拟合分析来获得融合蛋白对经典补体途径或凝集素途径的抑制活性的EC50值。在另一示例性测定中，通过在用于CH50测定的缓冲液中包含用于螯合钙离子的乙二醇四乙酸(EGTA)来测定融合蛋白对旁路补体的抑制活性。在一些实施方案中，融合蛋白对补体途径的抑制活性是抑制旁路C3转变酶的衰变加速活性(DAA)。在另一实施方案中，融合蛋白对补体途径的抑制活性是抑制旁路C3转变酶的衰变加速活性(DAA)。融合蛋白对DAA的抑制可以通过本领域已知的方法及本文公开的任意方法(例如实施例7)来测定。示例性CH50测定见Costabile，M.，(2010).J.Vis.Exp.29(37)：1923，在此以其整体引入作为参考。
在本文的实施方案的任一个中，对于抑制活性(例如抑制补体活性和/或VEGF活性)，融合蛋白具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、≤0.01nM或≤0.001nM(例如10-8M或更小，例如从10-8M至10-13M，例如从10-9M至10-13M)的EC50。在本文的实施方案的任一个中，融合蛋白具有小于约1.0mM、500μM、100μM、50μM、25μM、10μM、5μM、1μM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、350nM、300nM、250nM、200nM、150nM、100nM，95nM、90nM、85nM、80nM、75nM、70nM、65nM、60nM、55nM、50nM、45nM、40nM、35nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、5nM、1nM、900pM、800pM、700pM、600pM、500pM、400pM、300pM、200pM、100pM、50pM、25pM、12.5pM、6.25pM、5pM、4pM或3pM(包括性的，包括这些值之间的任意值)中任一的对结合配偶体(例如补体蛋白和/或VEGF)的Kd。在一些实施方案中，与本文所述的野生型融合多肽的结合相比，本文所述的融合多肽变体以更高的亲和力与结合配偶体结合。在一些方面，与含有选自SEQ ID NO：12、33-37和40的氨基酸序列的融合多肽对结合配偶体的结合相比，融合多肽变体以高至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000或10,000(包含性的，包括这些数值之间的任意值)倍中任一的亲和力与结合配偶体结合。
在一些实施方案中，可以评估本文公开的融合蛋白的诸如减少细胞增殖或肿瘤生长的抗增殖活性。许多用于评估融合蛋白的抗增殖活性的方法为本领域已知。在一个示例性测定中，可以用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)来证明VEGF依赖性细胞增殖的抑制。在此测定中，将HUVEC维持在含2％FBS的内皮细胞生长培养基(例如Lonza，Inc.)中。向用胶原和多种浓度的融合蛋白包被的96孔平底微量滴定板的孔中加入约50μl的l nM的VEGF-A。向各孔中加入约50μl培养基-199(例如Hyclone，Inc.)中的1x105细胞/ml的HUVEC，并在37℃、5％CO2下孵育72小时。孵育后，通过以下来测定细胞增殖：向各孔中加入10μl CCK-8(例如Dojindo，Inc.)，然后在450/650nm测量OD吸光度来测定融合蛋白对细胞增殖的抑制。在示例性体内测定中，在具有源自某种癌症类型(例如肝细胞癌、结肠直肠癌等)的肿瘤的异种移植小鼠中评价肿瘤生长的抑制。在此测定中，按具体的剂量方案对小鼠施用多种浓度的融合蛋白，并在一定时期内测量肿瘤生长至少两次来测定融合蛋白对肿瘤生长的抑制。在一些实施方案中，用本领域公知的技术测量融合蛋白的抗血管发生特性。在一个示例性测定中，用湿性年龄相关黄斑变性的动物模型来测定融合蛋白对眼中新血管形成的抑制。在此测定中，向动物(例如小鼠、猴等)的视网膜传递激光光凝来获得脉络膜新血管形成(CNV)，并施用融合蛋白。用本领域已知和本文公开(例如实施例11和12)的技术测量动物(例如小鼠、大鼠和猴)眼中的CNV损伤来确定融合蛋白的施用是否使它们减少。见Liu，J.等，(2011).J.Biol.Chem.286(23)：20991-21001；Nork，T.M.，(2011).Arch.Ophthalmol.129(8)：1042-1052；及Lichtlen，P.(2010).Invest.Ophthalmol.Vis.Sci.15(9)：4738-4745；在此以其整体引入作为参考。
VI.使用融合多肽及其片段的治疗方法
本发明提供用于治疗或预防炎性疾病、自身免疫病、补体相关疾病、眼病和癌症的方法。在一些实施方案中，本发明提供治疗患有炎性疾病、自身免疫病、补体相关疾病、眼病和/或癌症的对象的方法，其包括对该个体施用有效量的本文所述的任意融合蛋白。在一些实施方案中，该方法还包括对该个体施用有效量的至少一种例如下文所述的额外治疗剂。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制补体蛋白与补体调节蛋白的结合的融合蛋白。在一些实施方案中，本发明提供用于在对象中抑制补体蛋白与补体调节蛋白的结合的融合蛋白，其包括对该对象施用有效量的融合蛋白来抑制补体蛋白与补体调节蛋白的结合。在一些实施方案中，本发明提供用于抑制VEGF与VEGFR的结合的融合蛋白。在一些实施方案中，本发明提供用于在对象中抑制VEGF与VEGFR的结合的融合蛋白，其包括对该对象施用有效量的融合蛋白来抑制VEGF与VEGFR的结合。在一些实施方案中，本发明提供用于在对象中抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)的融合蛋白，其包括对该对象施用有效量的融合蛋白来抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。以上实施方案中任一个的“对象”优选是人。
可以通过本文所述的融合蛋白治疗或预防的炎性疾病包括但不限于黄斑变性(例如年龄相关黄斑变性)、急性心肌梗塞(AMI)、动脉粥样硬化、glomernephritis、哮喘和多发性硬化。可以通过本文所述的融合蛋白治疗或预防的自身免疫病包括但不限于阿尔茨海默病、自身免疫性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、溃疡性结肠炎、炎性肠病、克罗恩病、成人型呼吸窘迫综合症(ARDS)、多发性硬化、糖尿病、亨廷顿病、帕金森病、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、CNS炎性障碍、重症肌无力、肾小球肾炎和自身免疫性血小板减少。可以通过本文所述的融合蛋白治疗或预防的补体相关疾病包括但不限于动脉瘤、非典型溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、AMD、自发流产、复发性流产、创伤性脑损伤、银屑病、自身免疫性溶血性贫血、遗传性血管性水肿、卒中、失血性休克、败血性休克、来自手术(如冠状动脉旁路移植(CABG)手术)的并发症、肺部并发症(如慢性阻塞性肺病(COPD))、局部缺血-再灌注损伤、器官移植排斥和多器官衰竭。在一些实施方案中，可以通过本文所述的融合蛋白治疗或预防的癌症包括结肠直肠癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、腺癌、成胶质细胞瘤、肾癌、胃癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、卵巢癌、子宫内膜癌和乳腺癌。在另一实施方案中，本文公开的可以通过本文所述的融合蛋白治疗或预防的任意癌症是转移性的。可以通过本文所述的融合蛋白治疗或预防的眼病包括但不限于湿性年龄相关黄斑变性、干性年龄相关黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性视网膜水肿、糖尿病性黄斑水肿、晶状体后纤维增生症、视网膜中央阻塞、视网膜静脉阻塞、缺血性视网膜病变、高血压性视网膜病变、葡萄膜炎(例如前葡萄膜炎、中葡萄膜炎、后葡萄膜炎或全葡萄膜炎)、Behcet病、Biett晶状体营养障碍、睑炎、青光眼(例如开角型青光眼)、新生血管性青光眼、角膜新血管形成、脉络膜新血管形成(CNV)、视网膜下新血管形成、角膜炎和来自角膜移植的并发症。
本文所述的融合多肽和组合物对治疗诸如AMD的黄斑变性尤其有用。在美国和其他发达国家，AMD是老年人(＞50岁)中失明和视力缺损的首要原因(Bird，A.C.，(2010).J.Clin.Invest.，120(9)：3033-3041)。AMD大体上分为两类，湿性形式和干性形式，干性形式构成所有AMD病例的80-90％。干性AMD(非渗出性)是这样的AMD形式，其中称为玻璃疣的细胞碎片累积在视网膜和脉络膜之间。干性AMD具有三个阶段(早期、中期和晚期)，且表征为存在黄斑玻璃疣。在晚期干性AMD中，发生中央区域性萎缩，导致眼睛中央的视力丧失。湿性(渗出性或新生血管性)形式的AMD是更严重的形式，其中在黄斑后通过布鲁赫膜从脉络膜长出异常的血管(脉络膜新血管形成，CNV)，导致快速视力丧失。近年来，越来越多的证据显示，补体激活在AMD的病理发生中发挥主要作用(Issa，P.C.等，(2011)，Graefes.Arch.Clin.Exp.Ophthalmol.，249：163-174)。例如，在玻璃疣中检测到了高水平的补体蛋白。此外，遗传研究已确认了AMD风险和包括因子H(CFH)、CFHR1、CFHR3、C2、C3、因子B、因子I的补体蛋白基因中的多态性的关联。特别地，CFH Y402H等位基因与AMD风险高度相关。最后，还已在AMD患者的血浆中发现了提高水平的补体激活产物。可以用视敏度测试、散瞳检查、阿姆斯勒方格表、荧光素血管造影或通过针对AMD相关生物标志的遗传测试来在对象中检测AMD。普遍认为，干性AMD可以进展至湿性AMD。本发明提供通过施用有效量的含有本文所述的融合蛋白的组合物来治疗AMD(如湿性或干性形式的AMD)的方法。在一些实施方案中，本发明提供治疗或预防AMD的一个或多个方面或症状的方法，该方面或症状包括但不限于眼玻璃疣的形成、眼或眼组织中的炎症、感光细胞丧失、视力(包括例如视敏度和视野)丧失、新血管形成、视网膜下出血、视网膜脱落、血管渗漏及任意其他AMD相关方面。
在另一方面，本发明提供融合蛋白在制造或制备药物中的用途。在一些实施方案中，该药物用于治疗炎性疾病、自身免疫病、补体相关疾病、眼病和癌症。在一些实施方案中，本发明提供用于制备用于抑制补体蛋白与补体调节蛋白的结合的药物的融合蛋白。在一些实施方案中，本发明提供用于制备用于抑制VEGF与VEGFR的结合的药物的融合蛋白。在一些实施方案中，本发明提供用于制备用于在对象中抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)的药物的融合蛋白，其包括对该对象施用有效量的融合蛋白来抑制补体激活和VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)。以上实施方案中任一个的“对象”优选是人。在一些实施方案中，用该药物来治疗炎性疾病，该炎性疾病包括但不限于黄斑变性(例如年龄相关黄斑变性)、急性心肌梗塞(AMI)、动脉粥样硬化、glomernephritis、哮喘和多发性硬化。在一些实施方案中，用该药物来治疗自身免疫病，该自身免疫病包括但不限于阿尔茨海默病、自身免疫性葡萄膜炎、系统性红斑狼疮(SLE)、狼疮肾炎、溃疡性结肠炎、炎性肠病、克罗恩病、成人型呼吸窘迫综合症(ARDS)、多发性硬化、糖尿病、亨廷顿病、帕金森病、类风湿性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、骨关节炎、银屑病关节炎、CNS炎性障碍、重症肌无力、肾小球肾炎和自身免疫性血小板减少。在一些实施方案中，用该药物来治疗补体相关疾病，该补体相关疾病包括但不限于动脉瘤、非典型溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜、特发性血小板减少性紫癜、AMD、自发流产、复发性流产、创伤性脑损伤、银屑病、自身免疫性溶血性贫血、遗传性血管性水肿、卒中、失血性休克、败血性休克、来自手术(如冠状动脉旁路移植(CABG)手术)的并发症、肺部并发症(如慢性阻塞性肺病(COPD))、局部缺血-再灌注损伤、器官移植排斥和多器官衰竭。在一些实施方案中，可以通过本文所述的融合蛋白治疗或预防的癌症包括结肠直肠癌、转移性结肠直肠癌、非小细胞肺癌、淋巴瘤、白血病、腺癌、成胶质细胞瘤、肾癌、转移性肾癌、胃癌、前列腺癌、成视网膜细胞瘤、卵巢癌、子宫内膜癌和乳腺癌。在其他实施方案中，用该药物来治疗眼病，该眼病包括但不限于湿性年龄相关黄斑变性、干性年龄相关黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、糖尿病性视网膜水肿、糖尿病性黄斑水肿、晶状体后纤维增生症、视网膜中央阻塞、视网膜静脉阻塞、缺血性视网膜病变、高血压性视网膜病变、葡萄膜炎(例如前葡萄膜炎、中葡萄膜炎、后葡萄膜炎或全葡萄膜炎)、Behcet病、Biett晶状体营养障碍、睑炎、青光眼(例如开角型青光眼)、新生血管性青光眼、角膜新血管形成、脉络膜新血管形成(CNV)、视网膜下新血管形成、角膜炎和来自角膜移植的并发症。
药物剂量
取决于设想的具体用途，本发明的药物组合物的剂量和希望的药物浓度可以不同。适当的剂量或给药途径的确定良好地处于普通技术人员的技术之内。动物实验为确定用于人类治疗的有效剂量提供了可靠的指引。可以按照Toxicokinetics and New Drug Development，Yacobi等编辑，Pergamon Press，纽约1989，42-46页中的Mordenti，J.和Chappell，W.“The Use of Interspecies Scaling in Toxicokinetics”所确定的原则来进行有效剂量的种间缩放。
对于本文所述融合多肽的体内施用，取决于给药途径，正常剂量可以从约每天10ng/kg至约100mg/kg个体体重或更多变动，优选约1mg/kg/天至10mg/kg/天。对于在几天或更长时间内反复施用，取决于要治疗的疾病或障碍的严重度，该治疗持续进行，直至达到所希望的症状抑制。
示例性给药方案包括施用约2mg/kg的融合蛋白的起始剂量，然后每两周施用约1mg/kg的周维持剂量。取决于医生希望达到的药物代谢动力学衰变模式，可以使用其他剂量方案。例如，本文考虑每周对个体给药从1次至21次。在某些实施方案中，可以使用从约3μg/kg至约2mg/kg的范围内(如约3μg/kg、约10μg/kg、约30μg/kg、约100μg/kg、约300μg/kg、约1mg/kg和约2/mg/kg)的给药。在某些实施方案中，给药频率为每天三次、每天两次、每天一次、每两天一次、每周一次、每两周一次、每四周一次、每五周一次、每六周一次、每七周一次、每八周一次、每九周一次、每十周一次、或每月一次、每两月一次、每三月或更长时间。通过常规技术和测定容易地检测治疗进展。给药方案(包括所施用的融合蛋白)可以独立于所使用的剂量随时间而变。
可以在已给予了一次或多次融合蛋白施用的个体中凭经验确定具体融合蛋白的剂量。对个体给予递增剂量的融合蛋白。为了评估融合蛋白的功效，可以监测炎性疾病(如AMD)的临床症状。
取决于例如受体的生理条件、施用的目的是治疗还是预防、及熟练的从业人员已知的其他因素，本发明的方法的融合蛋白的施用可以是连续的或间歇的。融合蛋白的施用可以是在预先选择的时期内基本连续的，或者可以是在例如发展炎性疾病(如AMD)期间或之后的一系列间隔的剂量。
文献中提供了关于具体剂量和递送方法的指导；见例如美国专利号4,657,760；5,206,344；或5,225,212。在本发明的范围内的是，不同的制剂将对不同的治疗和不同的疾病或障碍有效，并且旨在治疗具体器官或组织的施用可以有必要以不同于另一器官或组织的方式递送。此外，可以通过一次或多次分开的施用或通过连续输注来施用剂量。对于在几天或更长时间内反复施用，取决于病症，治疗可以持续进行，直至发生所希望的疾病症状抑制。但是，可以使用其他剂量方案。通过常规技术和测定容易地监测此治疗的进展。
制剂的施用
本发明的融合蛋白(和任意额外的治疗剂)可以以包括胃肠外、肺内和鼻内的任意适宜的方式施用，并且如果希望进行局部治疗，还可以病灶内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下施用。部分取决于施用是短暂的还是长期的，可以通过任意适宜的途径，例如通过注射(如静脉内或皮下注射)来给药。本文考虑多种给药方案，其包括但不限于在多个时间点单次或多次施用、团注施用和脉冲输注。在一些实施方案中，对眼或眼组织直接施用组合物。在一些实施方案中，对眼局部施用组合物(例如在滴眼液中)。在一些实施方案中，通过对眼(眼内注射)或与眼结合的组织注射来施用组合物。可以例如通过眼内注射、眼周注射、视网膜下注射、玻璃体内注射、跨隔膜注射、巩膜下注射、脉络膜内注射、前房内注射、subconjectval注射、结膜下注射、眼球筋膜下注射、眼球后注射、眼球周注射或后巩膜旁递送来施用组合物。还可以例如对个体的玻璃体、视神经、房水、巩膜、结膜、巩膜和结膜之间的区域、视网膜脉络膜组织、黄斑或眼中或靠近眼的其他区域施用组合物。在一些实施方案中，将组合物作为眼植入物对个体施用。
将以符合良好医疗规范的方式配制、给药和施用本发明的融合蛋白。此背景中考虑的因素包括要治疗的具体疾病或障碍、所治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床病症、疾病或障碍的原因、活性剂的递送部位、施用方法、施用时程安排及医疗从业人员已知的其他因素。融合蛋白无需但可选地与目前用来预防或治疗所讨论的疾病或障碍的一种或多种活性剂配制在一起。这类其他活性剂的有效量取决于存在于制剂中的融合蛋白的量、疾病或障碍或治疗的类型及上文讨论的其他因素。这些药物通常以相同的剂量和本文所述的给药途径使用，或是本文所述剂量的约1-99％，或以经验上/临床上确定为适当的任意剂量和任意途径施用。
组合治疗
本发明的融合蛋白可以单独使用或与一种或多种额外的治疗剂组合使用。这类组合治疗涵盖组合施用(其中两种或多种治疗剂包含在相同的或分开的制剂中)和分开施用，在分开施用的情况下，本发明的融合蛋白的施用可以发生在施用该额外治疗剂和/或佐剂之前、与之同时和/或之后。
在一些实施方案中，融合蛋白与包括但不限于以下的治疗剂组合施用：补体抑制剂(例如ARC1905、TT30、Compstatin和/或POT-4)、补体抗体(例如依库丽单抗(Eculizumab)、FCFD4514S、TNX-558和/或TNX-234)、VEGFR抑制剂(例如舒尼替尼、索拉非尼、瓦他拉尼和/或凡德他尼)、VEGFR抗体(例如Ramucirumab)或VEGF抗体(例如贝伐珠单抗(Bevacizumab)、兰尼单抗(Ranibizumab)、阿柏西普(Aflibercept)和/或哌加他尼(Pegaptanib))。针对补体蛋白的示例性活性剂见Ehrnthaller，C.等，(2011)，Mol.Med.，17：317-329。在其他实施方案中，融合蛋白与包括但不限于以下的活性剂组合施用：抗氧化剂(例如维生素C、维生素E、β-胡萝卜素、叶黄素和/或玉米黄质)、长链Ω-3脂肪酸(例如二十二碳六烯酸和/或十二碳五烯酸)、锌或铜。在另一实施方案中，融合蛋白与包括但不限于睫状神经营养因子的神经保护剂细胞因子组合施用。在其他实施方案中，在AMD的情况下，融合蛋白与激光治疗(光动力学疗法)组合施用。在一些实施方案中，与单独使用有效量的融合蛋白或其他治疗剂相比，有效量的融合蛋白与一种或多种额外治疗剂的组合更有效。
在一些实施方案中，通过不同于一种或多种额外治疗剂的给药途径来施用融合蛋白。在一些实施方案中，胃肠外(例如中央静脉管路、动脉内、静脉内、肌内、腹膜内、真皮内或皮下注射)、口服、胃肠、局部、鼻咽和肺部(例如吸入或鼻内)施用一种或多种额外治疗剂。
VII.组合物
通过将具有希望的纯度的此类融合蛋白与一种或多种可选的可药用载体混合，以冻干制剂或水溶液的形式制备本文所述的融合蛋白的药物制剂。可药用载体、赋形剂或稳定剂在本文中描述且为本领域公知(Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第20版，Mack Publishing(2000))。可药用载体在所利用的剂量和浓度下一般对受体无毒性，且包括但不限于：缓冲剂，如磷酸、柠檬酸和其他有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六甲季铵；苯扎氯铵；苄索氯铵；苯酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其他糖类，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，如EDTA；糖，如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐抗衡离子，如钠；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或非离子型表面活性剂，如聚乙二醇(PEG)。本文的示例性可药用载体还包括间质药物分散剂，如可溶性中性活性透明质酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人可溶性PH-20透明质酸酶糖蛋白，如rHuPH20(BaxterInternational，Inc.)。在一方面，sHASEGP与一种或多种额外的糖胺聚糖酶(如软骨素酶)组合。
本文的制剂还可以包含所治疗的具体适应症所必需的一种以上活性成分，优选相互无不利影响的具有互补活性的那些。例如，可以希望还提供VEGF抗体或补体抑制剂。这类活性成分以对预期目的有效的量适宜地组合存在。
活性成分可以包埋在例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微囊(例如，分别为羟甲基纤维素或明胶微囊和聚-(甲基丙烯酸甲酯)微囊)中、胶体药物递送系统(例如脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒和纳米囊(nanocapsule))中或粗乳剂中。这类技术公开于Remington′sPharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980)中。
在一些实施方案中，包含融合蛋白的药物制剂适合用于胃肠外施用。可用的载体和溶剂是水、林格液、磷酸缓冲盐溶液和等渗氯化钠溶液等。此外，通常用无菌、不挥发的油作为溶剂或悬浮介质。为了此目的，可以利用任意混合的非挥发性矿物油或非矿物油，包括合成的甘油单酯或甘油二酯。此外，诸如油酸的脂肪酸也可用于制备注射物。在一些实施方案中，包含融合蛋白的药物制剂适合用于皮下、肌内、腹膜内或静脉内递送。
可以制备持续释放制剂。持续释放制剂的适宜的实例包括含有融合蛋白的固体疏水聚合物的半透性基质，该基质是成形物品(例如膜或微囊)的形式。药物组合物适合用于多种药物递送系统。目前用于药物递送的方法的简要综述见Langer，R.(1990)Science249：1527-33(1990)，其在此引入作为参考。
将要用于体内施用的制剂通常是无菌的。可以例如通过滤过无菌滤膜来容易地达到无菌。
VIII.制品或试剂盒
在另一方面，提供包含融合蛋白制剂的制品或试剂盒。该制品或试剂盒可以还包含其在本发明的方法中的用途的说明。因此，在某些实施方案中，该制品或试剂盒包含融合蛋白在用于在个体中治疗或预防炎性疾病(如年龄相关黄斑变性)、补体相关疾病和/或癌症的方法中的用途的说明，该方法包括对该个体施用有效量的融合蛋白。在某些实施方案中，该个体是人。
该制品或试剂盒可以还包含容器。适宜的容器包括例如瓶、小管(例如双腔小管)、注射器(如单腔或双腔注射器)和试管。容器可以形成自多种材料，如玻璃或塑料。容器容纳制剂。制品或试剂盒可以还包含标签或包装说明书，该标签或包装说明书在容器上或与容器结合，可以标示重建和/或使用该制剂的说明。该标签或包装说明书可以还标示该制剂可用于或预期用于皮下施用或其他施用方式来在个体中治疗或预防炎性疾病(如年龄相关黄斑变性)、补体相关疾病和/或癌症。容纳制剂的容器可以是单次使用的小管或多次使用的小管，多次使用的小管允许反复施用(例如2-6次施用)重建的制剂。该制品或试剂盒可以还包含含有适宜的稀释剂(例如BWFI)的第二容器。混合稀释剂和冻干制剂后，重建的制剂中蛋白质、多肽或小分子的终浓度通常将是至少50mg/ml。该制品或试剂盒可以还包含商业、治疗和使用者的角度希望的其他材料，包括其他缓冲剂、稀释剂、滤器、针头、注射器和含有使用说明的包装说明书。
本文的制品或试剂盒可选地还包含含有第二药物的容器，其中融合多肽是第一药物，且该制品还包含关于以有效量用该第二药物治疗对象的包装说明书的说明。第二药物可以是上文所示的那些的任一种，如果用融合蛋白来治疗年龄相关黄斑变性，则示例性的第二药物是补体抑制剂(例如ARC1905、TT30、Compstatin和/或POT-4)、补体抗体(例如依库丽单抗、FCFD4514S、TNX-558和/或TNX-234)、VEGFR抑制剂(例如舒尼替尼、索拉非尼、瓦他拉尼和/或凡德他尼)、VEGFR抗体(例如Ramucirumab)或VEGF抗体(例如贝伐珠单抗、兰尼单抗、阿柏西普和/或哌加他尼)。
在另一实施方案中，本文提供包含用于在自动注射装置中施用的本文所述制剂的制品或试剂盒。自动注射器可以描述为将在激活时递送其内含物而无需来自患者或施用者的额外动作的注射装置。在递送速度必须恒定和递送时间大于几分钟时，它们尤其适合用于治疗性制剂的自我用药。
还提供用于治疗和/或预防炎性疾病(如年龄相关黄斑变性)、补体相关疾病和/或癌症的单位剂型，该剂型包含本文所述的融合蛋白或制剂中的任一种。
本发明将通过参考以下实施例而得到更充分的理解。但是，不应将它们解释为限制本发明的范围。本公开通篇中的所有引用在此明确引入作为参考。
VIIII.示例性实施方案
1.抑制补体激活和VEGF信号传导途径的融合蛋白，其中该融合蛋白包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域；
2.实施方案1中的半寿期延长结构域是免疫球蛋白Fc区，其中该Fc区是任意人免疫球蛋白同种型、亚类、同种异型的野生型或变体；
3.实施方案2中的Fc区是具有SEQ ID NO7中的序列的Fc区；
4.实施方案1中的半寿期延长结构域是在体内具有长半寿期的抗体、抗体片段、人血清白蛋白或任意其他人蛋白质；
5.实施方案2中的CID和VID可以在Fc区的任一末端，或在Fc区的同一端，即VID-Fc-CID、CID-Fc-VID、VID-CID-Fc、CID-VID-Fc、Fc-VID-CID或Fc-CID-VID；
6.实施方案1中的CID是人1型补体受体(CR1)胞外结构域的一部分；其中CID的序列来自SEQ ID NO1-6；
7.实施方案1中的CID是人DAF、MCP、因子H、C4BP的一部分，其中CID的序列来自SEQ ID NO13-16；
8.实施方案1中的CID是针对因子B、或因子D、或因子P、C3、或C5的抗体的抗体片段、或scFv、或可变区(VH或VK)；
9.实施方案1中的CID是因子B、或因子D、或因子P、C3、或C5的肽抑制剂或寡核苷酸抑制剂；
10.实施方案1中的CID是实施方案5-8中的CID的变体或组合；
11.实施方案1中的VID包含VEGFR的胞外结构域的一部分；
12.实施方案1中的VID是具有SEQ ID NO11中的序列的VEGFR-1的第二胞外结构域和VEGFR-2的第三胞外结构域；
13.实施方案1中的融合蛋白具有SEQ ID NO12中的序列；
14.抑制补体激活的融合蛋白，其中该融合蛋白包含CID和半寿期延长结构域；
15.实施方案14中的半寿期延长结构域是免疫球蛋白Fc区，其中该Fc区是任意人免疫球蛋白同种型、亚类和同种异型的野生型或变体；
16.实施方案15中的Fc区是具有SEQ ID NO7中的序列的Fc区；
17.实施方案14中的半寿期延长结构域是在体内具有长半寿期的抗体、抗体片段、人血清白蛋白或任意其他人蛋白质；
18.实施方案14中的CID可以在Fc区的任一端，即CID-Fc或Fc-CID；
19.实施方案14中的CID是人1型补体受体(CR1)胞外结构域的一部分；其中CID的序列来自SEQ ID NO1-6；
20.实施方案14中的CID是人DAF、或MCP、或因子H、或C4BP的一部分，其中CID的序列来自SEQ ID NO13-16；
21.实施方案14中的CID是针对因子B、或因子D、或因子P、或C3、或C5的抗体的抗体片段、或scFv、或可变区(VH或VK)；
22.实施方案14中的CID是因子B、或因子D、或因子P、C3、或C5的肽抑制剂或寡核苷酸抑制剂；
23.实施方案14中的CID是实施方案19-22中的CID的变体或组合；
24.修饰的蛋白质，其包含实施方案5-8中的CID的变体或组合中的至少一个，其中该肽与半寿期延长结构域缀合；
25.实施方案24中的修饰的蛋白质包含实施方案11-12中的VID；
26.实施方案24中的半寿期延长结构域是PEG或具有长体内半寿期的另一聚合物；
27.实施方案24中的半寿期延长结构域是免疫球蛋白Fc区，其中该Fc区是任意人免疫球蛋白同种型、亚类、同种异型的野生型或变体；
28.实施方案24中的半寿期延长结构域是在体内具有长半寿期的抗体、抗体片段、人血清白蛋白或任意其他人蛋白质。
实施例
实施例1：抗补体蛋白(ACP)的表达和纯化
为了产生一系列含有补体抑制结构域(CID)和Fc结构域的融合蛋白，合成了编码多种CID的cDNA，并与IgG1Fc结构域的N端(见图1A中的ACP-1-ACP-5)或C端(见图1A中的ACP-6-ACP-10)融合。CID是人CR1的胞外区的部分。具体而言，ACP-1和ACP-6的CID-WT是野生型人CR1SCR1-3；ACP-2和ACP-7的CID-KN是具有氨基酸取代突变N29K和D109N的人CR1SCR1-3；ACP-3和ACP-8的CID-YD是具有氨基酸取代突变S37Y和G79D的人CR1SCR1-3；ACP-4和ACP-9的CID-KYDN是具有氨基酸取代突变N29K、S37Y、G79D和D109N的人CR1SCR1-3；ACP-5和ACP10的CID-NT是人CR1SCR8-10(图1A)。将合成的CID cDNA和IgG1Fc结构域连接入EcoRI/NotI消化的pCI-neo哺乳动物表达载体(Promega目录号E1841)。在CID和Fc结构域之间使用六个甘氨酸的短的柔性肽。所有Fc融合蛋白都在N端包含信号肽SP2，以允许ACP的胞外分泌。
将构建的ACP-1至ACP-10的质粒各自瞬时转染入HEK293细胞。转染后72小时收集ACP已分泌入其中的细胞培养基，并通过蛋白A层析纯化各ACP。简言之，将含有分泌的ACP的培养物上清与蛋白A琼脂糖珠过夜混合，然后加至聚丙烯柱。用0.1M Tris pH8.0洗涤珠，然后用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸缓冲液、pH2.5)洗脱ACP，并用Tris缓冲液pH8.0中和。浓缩洗脱的ACP，并针对磷酸缓冲盐溶液(PBS)透析，然后通过BCA测定来测定最终的蛋白质浓度。测定各分离的ACP的纯度为＞90％。将各纯化的ACP-6(泳道5)、ACP-7(泳道4)、ACP-8(泳道3)、ACP-9(泳道2)和ACP-10(泳道1)蛋白质的2μg样品装载至非还原条件下的SDS-PAGE凝胶上(图2A)。二聚体Fc融合蛋白的分子量为～94kD。
以类似的方式构建、表达并纯化了其中DAF SCR2-4、MCP SCR2-4、因子H SCR1-4或C4BPA SCR1-3各自作为CID与IgG1Fc结构域融合的ACP。
实施例2：ACP对经典补体途径的抑制
用CH50测定来定量经典补体途径的活性程度。此测定测定经典途径的血清补体成分(即存在于样品中)裂解用兔抗绵羊红细胞抗体预包被的绵羊红细胞(EA，抗体致敏的绵羊红细胞，Complement Technology目录号B200)的功能能力。在将EA与例如测试血清、镁离子和钙离子孵育时，激活补体的经典途径，并产生溶血。将固定体积的最佳致敏的EA加至各血清稀释液。孵育后，离心混合物，通过在～540nm测量释放入上清的血红蛋白的吸光度来定量溶血的程度。通过检查测试血清的多种稀释液裂解EA的能力来测定补体活性的量。该测定的结果表示为在标准条件下产生50％确定数目的红细胞的裂解所需的血清稀释液的倒数。
CH50测定对经典补体途径的任意成分的减少、缺乏和/或失活敏感，因此用来评估ACP-6、-7、-9和-10抑制经典补体激活的能力。对于此测定，首先测定了在37℃孵育1小时后裂解了1x107EA/ml的90％的正常人血清(Complement Technology目录号NHS)的稀释液。该测定在包含0.15mM CaCl2和0.5mM MgCl2的GVB++缓冲液(0.1％明胶、5mM佛罗拉、145mM NaCl、0.025％NaN3、pH7.3)中进行。通过将可裂解90％的EA的正常人血清稀释液与0-500nM的融合蛋白ACP-6、ACP-7、ACP-9或ACP-10在37℃混合1小时来激活经典补体途径的抑制。然后在孵育血清和EA1小时后通过在OD541nm测量吸光度来测定EA的溶血。用Prism4(GraphPad，Inc.)通过S形曲线拟合来分析数据。
融合蛋白存在下的EA溶血百分比的分析证明，ACP-6(其中将人CR1SCR1-3结构域与IgG1Fc的C端融合)以16.2nM的EC50显示补体活性的强力抑制(图3A，封闭圆形)。ACP-7(其中将人CR1SCR1-3N29K/D109N变体与IgG1Fc的C端融合)使抑制活性显著增强10倍至1.6nM的EC50(图3A，封闭方形)。ACP-9(其中将人CR1SCR1-3N29K/D109NS37Y/G79D变体与IgG1的C端融合)使抑制活性进一步增强2.7倍至0.6nM的EC50(图3A，封闭三角形)。相反，ACP-10(其中将人CR1SCR8-10与IgG1的C端融合)在多至500nM也未显示对补体活性的任何抑制(图3A，倒三角形)。
类似地测定了包含DAF SCR2-4、MCP SCR2-4、因子H SCR1-4或C4BPA SCR1-3CID的ACP对经典补体途径的抑制。
实施例3：ACP对旁路补体途径的抑制
与需要镁离子和钙离子二者来激活的经典补体途径和凝集素补体途径不同，旁路补体途径的激活仅需镁离子。因此，为了定量ACP存在下的旁路补体活性，这样修改上述测定，使得兔红细胞(Er)与血清、0-500nMACP、5mM Mg2+和5mM EGTA(其优先螯合钙离子)孵育。
对于此测定，首先测定了在37℃孵育30分钟后裂解了1.25x107兔红细胞/ml的90％的正常人血清(Complement Technology目录号NHS)的稀释液。该测定在包含5mM MgCl2和5mM EGTA的GVB0缓冲液(0.1％明胶、5mM佛罗拉、145mM NaCl、0.025％NaN3、pH7.3)中进行。通过将可裂解90％Er的正常人血清稀释液与0-500nM的Fc融合蛋白ACP-6、ACP-7、ACP-9或ACP-10在37℃混合1小时来起始旁路补体途径的抑制。然后在孵育血清和Er30分钟后通过在OD412nm测量吸光度来测定Er的溶血。用Prism4通过S形曲线拟合来分析数据。
融合蛋白存在下的EA溶血百分比的分析证明，ACP-6以319.9nM的EC50显示非常低的抑制活性(图3B，封闭圆形)。ACP-7以127.0nM的EC50显示改善的抑制作用(2.5倍)(图3B，封闭方形)。ACP-9以31.9nM的EC50显示甚至更高的抑制作用，即比野生型序列(APC-6)好10倍(图3B，封闭三角形)。相反，ACP-10在多至500nM也未显示对补体活性的任何作用(图3B，倒三角形)。
类似地测定了包含DAF SCR2-4、MCP SCR2-4、因子H SCR1-4或C4BPA SCR1-3CID的ACP对旁路补体途径的抑制。
实施例4：抑制补体途径和VEGF途径二者的双特异性蛋白ACVP的表达和纯化
产生了一系列包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和Fc结构域(即人IgG1Fc区)的双特异性融合蛋白(图1B)。用于该双特异性融合蛋白的VID是VEGFR1的第二Ig样结构域和VEGFR2的第三Ig样结构域的VEGFR1_D2-VEGFR2_D3融合物，即类似于也称为阿柏西普的VEGF-trap-eye(见例如Frampton(2012).Drugs Aging29：839-46和Ohr等(2012).Expert Opin.Pharmacother.13：585-91)。通过将在ACP-9的N端的SP2信号肽下游编码VID的核酸插入质粒pV131来构建编码融合蛋白ACVP-1的核酸。用构建的ACVP-1质粒瞬时转染入HEK293细胞。转染后72小时收集含有分泌的ACVP-1的细胞培养基，并通过蛋白A层析纯化蛋白质。简言之，将含有分泌的ACVP-1的培养物上清与蛋白A琼脂糖珠过夜混合，然后加至聚丙烯柱。用0.1M Tris pH8.0洗涤珠，然后用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸缓冲液、pH2.5)洗脱ACP，并用Tris缓冲液pH8.0中和。浓缩洗脱的蛋白质，并针对磷酸缓冲盐溶液(PBS)透析，然后通过BCA测定来测定最终的蛋白质浓度。测定各分离的ACVP-1的纯度为＞90％。通过在还原(泳道3和4)或非还原(泳道1和2)条件下在SDS-PAGE凝胶上运行来将2μg样品的纯化的ACVP-1(泳道1和3)与纯化的ACP-9(泳道2和4)相比较(图2B)。二聚体ACVP-1的分子量为～139kD。
ACVP-1的Fc结构域、CID和VID的位置相对于彼此排列。此外，使用交替的CID(如存在于ACP中的那些)和交替的VID。按上文所述制备并在哺乳动物细胞中表达编码图1B中所示的任意ACVP的核酸构建体。
构建了包含DAF SCR2-4、MCP SCR2-4、因子H SCR1-4或C4BPASCR1-3CID的ACVP。
实施例5：ACVP与VEGF的体外结合
进行了ELISA来测定ACVP是否与VEGF直接结合。简言之，用100ng VEGF-A(可获自R&D Systems)包被96孔ELISA平板的孔。然后向各孔加入0-10nM纯化的ACVP并孵育1小时。用400μL含0.1％(v/v)Tween20的PBS洗涤三次后，向各孔加入100μL1∶5000稀释的抗Fc HRP缀合物(Sigma目录号A0170-1ML)进行1小时的孵育。用400μL含0.1％(v/v)Tween20的PBS洗涤三次后，向各孔加入TMB底物(Sigma目录号S5814-100ML)的终止试剂，并测量450nm OD吸光度。用Prism4通过S形曲线拟合来分析数据。如图4A中所示，ACVP-1以0.22nM的EC50显示与VEGF的强烈结合。
为了更好地评估ACVP与溶液中的VEGF的结合亲和力，将5pMVEGF-A与0-100pM的纯化ACVP在稀释缓冲液RD5K(R&D Systems目录号DVE00)中4℃过夜孵育。孵育后，用人VEGF Quantikine ELISA试剂盒(R&D Systems目录号DVE00)通过夹心法ELISA测定缓冲液中游离VEGF的浓度。用Prism4通过S形曲线拟合来分析来自使用ACVP-1的两个独立实验的数据。如图4B中所示，ACVP-1以3.4pM的亲和力显示相同的与VEGF的强烈结合。
也进行了ELISA来比较ACVP-1、VID和阿瓦斯丁与VEGF-A的结合亲和力。所测试的VID是ACVP-1的片段，其中VID具有与其C端融合的Fc结构域。将40pM VEGF165(293-VE)与1nM纯化的ACVP-1、VID或阿瓦斯丁在37℃下孵育45分钟。孵育后，按照厂家的说明用人VEGF DuoSet ELISA Development试剂盒(R&D Systems目录号DY293B)检测游离VEGF。用Prism4通过S形曲线拟合来分析数据。如图4C中所示，ACVP-1显示与VEGF的亲和力(以～0.01nM的EC50)比阿瓦斯丁或VID与VEGF的结合(各以～0.7nM的EC50)高70倍。
测定了其他ACVP(例如包含DAF SCR2-4、MCP SCR2-4、因子HSCR1-4或C4BPA SCR1-3作为CID)结合VEGF的能力，并按上文所述测定了它们对VEGF的结合亲和力。
实施例6：ACP或ACVP与C3b或C4b的体外结合
在直接ELISA实验中测定了ACP或ACVP与C3b或C4b的结合。用100ng/孔的C3b或C4b(可获自Complement Technology，Inc.)包被96孔ELISA平板的孔。然后向各孔加入0-1μM纯化的图1中所示的ACP或ACVP并孵育1小时。洗去未结合的C3b或C4b后，向各孔加入100μl1∶5000稀释的抗Fc HRP缀合物(Sigma目录号A0170-1ML)并孵育1小时。洗涤后，加入TMB底物(Sigma目录号S5814-100ML)的终止试剂，并测量OD450nm吸光度。
实施例7：ACP或ACVP对旁路转变酶的DAA的抑制
通过ELISA测定了旁路C3转变酶的衰变加速活性(DAA)。首先用1μg/ml的C3b(可获自Complement Technology，Inc.)包被96孔ELISA平板的孔，然后封闭。然后用400ng/ml的因子B(可获自ComplementTechnology，Inc.)、25ng/ml的因子D(可获自Technology，Inc.)和2mM的NiCl2孵育各孔。洗涤后，用不同浓度的ACP或ACVP孵育结合于平板的C3bBb(Ni2+)复合物。第二次洗涤后，用山羊抗因子B多克隆抗体(可获自Technology，Inc.)，然后用HRP缀合的兔抗山羊多克隆抗体(Sigma，Inc.)检测剩余的结合于平板的C3bBb(Ni2+)复合物。洗涤后，加入TMB底物(Sigma目录号S5814-100ML)的终止试剂，并测量OD450nm吸光度。
除用1μg/ml的C3b二聚体包被ELISA平板的孔外，按上文所述通过ELISA来测定旁路C5转变酶的DAA。通过用含20μg胰蛋白酶(可获自Sigma，Inc.)的200μl PBS在37℃下处理2mg C3(可获自ComplementTechnology，Inc.)3分钟来产生C3b二聚体。然后在用溶解在甲醇中的15μg的0.34mM双马来酰亚胺基己烷(可获自Pierce，Inc.)在4℃断裂硫酯键3天后形成C3b二聚体。通过SEC层析纯化C3b二聚体。
实施例8：ACVP对经典补体途径的抑制
按实施例2中所述测定了ACVP抑制经典补体途径的能力。此测定在包含0.15mM CaCl2和0.5mM MgCl2的GVB++缓冲液(0.1％明胶、5mM佛罗拉、145mM NaCl、0.025％NaN3、pH7.3)中进行。通过将可裂解90％EA的正常人血清稀释液与0-500nM的ACVP-1在37℃混合1小时来激活经典补体途径的抑制。用Prism4通过S形曲线拟合来分析抑制数据。如图5A中所示，双特异性融合蛋白ACVP-1以0.19nM的EC50显示对经典补体激活的非常高效能的抑制作用。
按本文所述测定了其他ACVP(例如包含DAF SCR2-4、MCP SCR2-4、因子H SCR1-4或C4BPA SCR1-3作为CID)来测定它们抑制经典补体途径的能力。
实施例9：ACVP对旁路补体途径的抑制
按实施例3中所述测定了ACVP抑制旁路补体途径的能力。该测定在包含5mM MgCl2和5mM EGTA的GVB0缓冲液(0.1％明胶、5mM佛罗拉、145mM NaCl、0.025％NaN3、pH7.3)中进行。通过将可裂解90％Er的正常人血清稀释液与0-500nM的ACVP-1在37℃混合1小时来起始旁路补体途径的抑制。然后在孵育血清和Er30分钟后测定Er的溶血。用Prism4通过S形曲线拟合来分析抑制数据。如图5B中所示，双特异性ACVP-1融合蛋白以21.1nM的EC50显示对旁路补体激活的高度有效能的抑制作用。
按上文所述测定了其他ACVP(例如包含DAF SCR2-4、MCP SCR2-4、因子H SCR1-4或C4BPA SCR1-3作为CID)来测定它们抑制旁路补体途径的能力。
实施例10：ACVP对VEGF依赖性HUVEC增值测定的抑制
在基于细胞的测定中测试了ACVP抑制VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)的能力。人脐静脉内皮细胞(HUVEC，Lonza，Inc.)常用来证明VEGF依赖性细胞增殖，其可以通过ACVP与VEGF的结合抑制。在此测定中，将HUVEC细胞维持在含2％FBS的内皮细胞生长培养基(Lonza，Inc.)中。用胶原包被96孔平底微量滴定板，然后用50μl的l nM VEGF-A(R&D systems，Inc.)和多种浓度的ACVP在各孔中37℃孵育1小时。孵育1小时后，向各孔加入在培养基-199(10％FBS，Hyclone，Inc.)中的50μl的1x105细胞/ml的HUVEC。37℃、5％CO2孵育72小时后，通过向各孔加入10μl的CCK-8(Dojindo，Inc.)来测定细胞增殖。在450/650nm的OD吸光度测量细胞增殖。
例如，在此基于细胞的测定中测试了ACVP-1抑制VEGF信号传导途径(例如抑制VEGF活性)的能力，并与CID和VID的VEGF抑制活性相比较。所测试的VID是ACVP-1的片段，其中VID具有与其C端融合的Fc结构域。所测试的CID是ACVP-1的片段，其中CID具有与其N端融合的Fc结构域。为了测量内皮细胞增殖，用EndoGRO-VEGF完全培养基试剂盒将人脐静脉内皮细胞(HUVEC，可获自Lonza，Inc.)接种在96孔板中(4×104细胞/孔)。24小时后，用PBS洗涤细胞，并在补充了20％FBS的DMEM中在0.3nM VEGF165的存在下与35nM/ml ACVP-1孵育。对于对照，用PBS、补充了20％FBS的DMEM、含20％FBS的DMEM中的0.3nM VEGF165、或含20％FBS的DMEM中的35nM/mlIgG孵育细胞。48小时后，向各孔加入10μl CCK-8(Dojindo，Inc.)，并在酶标仪上在450/570nm的OD吸光度测量细胞增殖。使用学生t检验的统计学分析显示，与DMEM+VEGF对照相比，ACVP-1显著抑制VEGF诱导的HUVEC增殖，且ACVP-1的抑制作用高于VID或CID的抑制作用(图6)。
实施例11：ACVP抑制HUVEC中ERK和AKT通过VEGFR2途径的激活
测试了ACVP抑制下游胞内信号传导通过VEGFR途径激活的能力。在此测定中，用3nmol/ml的IgG、VID、CID或ACVP预处理HUVEC30分钟，然后再用3nmol/ml VEGF165刺激10分钟。收集细胞，并通过Western印迹分析，其中评价了VEGFR(例如VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3)、AKT和ERK磷酸化。用GAPDH作为上样对照。用针对磷酸化的VEGFR(例如VEGFR1、VEGFR2或VEGFR3)、GAPDH(1∶3000稀释；CellSignaling Technology，Beverly，MA)、磷酸化的Erk(p-Erk)、Erk蛋白、磷酸化的AKT(p-AKT)和Akt蛋白的一抗在4℃过夜探测封闭的膜。洗去一抗后，将与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗加至膜，在室温下孵育1小时，然后进一步洗涤，并用HRP的化学发光底物显示蛋白质。
例如，测试了ACVP-1抑制ERK和AKT通过VEGFR2途径激活的能力。在此测定中，用3nmol/ml的IgG、VID、CID或ACVP-1预处理HUVEC30分钟，然后再用3nmol/ml VEGF165刺激10分钟。所测试的VID是ACVP-1的片段，其中VID具有与其C端融合的Fc结构域。所测试的CID是ACVP-1的片段，其中CID具有与其N端融合的Fc结构域。收集细胞，并通过Western印迹分析，其中评价了VEGFR2、AKT和ERK磷酸化。用GAPDH作为上样对照。用针对磷酸化的VEGFR2(1∶1000稀释；Cell Signaling Technology，Beverly，MA)、GAPDH(1∶3000稀释；Cell Signaling Technology，Beverly，MA)、磷酸化的Erk(p-Erk)、Erk蛋白、磷酸化的AKT(p-Akt)和Akt蛋白的一抗在4℃过夜探测封闭的膜。洗去一抗后，将与辣根过氧化物酶(HRP)缀合的二抗加至膜，在室温下孵育1小时，然后进一步洗涤，并通过HRP的化学发光底物来显示蛋白质。如图7中所示，ACVP-1和VID抑制VEGF165诱导的VEGFR2、ERK和AKT磷酸化，CID抑制ERK磷酸化。
实施例12：ACVP对小鼠中激光诱导的CNV的抑制
脉络膜新血管形成(CNV)是湿性年龄相关黄斑变性(AMD)的常见症状。在起源于眼脉络膜层中的新血管生长通过布鲁赫膜中的裂缝或缺陷并侵入视网膜下色素上皮或视网膜下间隙时，发生CNV。此过程形成最终导致失明的瘢痕组织。激光诱导脉络膜新血管形成(CNV)作为动物模型常用来测试湿性AMD的治疗。例如，可以用此模型来评估ACVP抑制CNV的能力。
用小鼠中激光诱导的CNV来测试ACVP和ACP抑制CNV的能力。在此测定中，用盐酸氯酮胺(100mg/kg体重)麻醉小鼠并用1％托吡卡胺扩张瞳孔，向每个视网膜传递532nm二极管激光光凝的三次灼烧。在视网膜后极的9、12和3点钟位置进行灼烧。激光灼烧时产生气泡(其指示布鲁赫膜的破裂)是获得CNV中的重要因素。为了测试ACVP或ACP防止激光诱导的CNV形成的能力，在激光灼烧的同一天玻璃体内注射4μg ACVP或ACP。激光损伤后第14天，用50mg荧光素标记的葡聚糖的玻璃体内注射小鼠并实施安乐死。然后剖出小鼠的眼睛进行脉络膜铺片来评估CNV损伤的大小的改变。
实施例13：ACVP对猴中激光诱导的CNV的抑制
用猴中激光诱导的CNV来测试ACVP和ACP抑制CNV的能力。简言之，在每只眼中的黄斑周围传递532nm二极管激光光凝的6至9次灼烧。在激光灼烧的同一天玻璃体内注射0.1至0.5mg剂量的ACVP。约20天后，用静脉内2.5％可溶性戊巴比妥(1mL/kg)镇静动物。固定眼睑来保持眼睛睁开和可接近。首先用眼底照相机拍摄彩色照片。最初的照片之后，经下肢的静脉注射荧光素染料(20％荧光素钠；0.05mL/kg)。在染料注射后的几个时间点拍摄照片，包括动脉期、早动静脉期和几个晚动静脉期。监测与CNV损伤相关的荧光素渗漏。
例如，在年龄在3至6岁范围内的猕猴中建立激光诱导的CNV模型。将总计8只猴分入施用以下的四个组：1)载体对照(PBS)、2)ACVP1(0.5mg/眼)、3)VID(0.5mg/眼)或4)CID(0.5mg/眼)。每组总计有两只猴(四只眼)。所测试的VID是ACVP-1的片段，其中VID具有与其C端融合的Fc结构域。所测试的CID是ACVP-1的片段，其中CID具有与其N端融合的Fc结构域。在每只眼中的黄斑周围传递532nm二极管激光光凝的约6至9次灼烧。在激光灼烧后21天玻璃体内注射载体对照(PBS)或0.5mg剂量的ACVP-1、VID或CID。施用剂量后14天，用静脉内2.5％可溶性戊巴比妥(1mL/kg)镇静动物。固定眼睑来保持眼睛睁开和可接近。首先用眼底照相机拍摄彩色照片。最初的照片之后，经下肢的静脉注射荧光素染料(20％荧光素钠；0.05mL/kg)。在染料注射后5分钟(包括动脉期、早动静脉期和几个晚动静脉期)拍摄照片来监测与CNV损伤相关的荧光素渗漏。将照片中的斑点面积测量为渗漏面积。斑点渗漏照片的分析显示，在注射后14天，与PBS注射前的渗漏面积相比，载体处理组中的平均渗漏面积更大(图8A)。相反，在注射后14天，与注射前的渗漏面积相比，用ACVP-1(图8B)、VID(图8C)或CID(图8D)注射的猴中渗漏减少。使用学生t检验的统计学分析显示，在用ACVP-1或VID处理的动物中，斑点数和渗漏面积显著小于给药前(表3)。在CID处理的动物中，渗漏面积也显著小于给药前(表3)。总体上，ACVP-1在抑制激光诱导的CNV上比具有比VID和CID更好的功效。
表3.猴CNV模型中的斑点数和渗漏面积
与给药前相比，＊p＜0.05，＊＊p＜0.01。
实施例14：ACP和ACVP对异种移植物小鼠中人肿瘤生长的抑制
可以用诸如人肝细胞癌Hep3B细胞(ATCC#HB-8064)和人结肠直肠癌LoVo细胞(ATCC#CCL-229)的多种人癌细胞来在裸鼠中建立异种移植物模型。为了评估ACP和ACVP对肿瘤生长的抑制作用，肿瘤细胞植入后在小鼠中每周两次静脉内施用多种浓度的各ACP和各ACVP(例如0.1-10mg/kg)。每周测量肿瘤生长，多至7周。
实施例15：ACP和ACVP在小鼠和猴中的药物代谢动力学评估
经皮下注射或静脉内注射将各ACP和ACVP的10至40mg/kg的剂量施入小鼠或猴。在注射后多至15天的不同时间点采集血清样品。用夹心法ELISA测定来测定血清样品中各ACP或ACVP融合蛋白的浓度。
序列
人CR1SCR1-3核酸和氨基酸序列
人CR1SCR1-3N29K/D109N核酸和氨基酸序列
人CR1SCR1-3S37Y/G79D核酸和氨基酸序列
人CR1SCR1-3N29K/S37Y/G79D/D109N核酸和氨基酸序列
人CR1SCR8-10核酸和氨基酸序列
人CR1SCR1-10核酸和氨基酸序列
人IgG1Fc核酸和氨基酸序列
G6核酸和氨基酸序列
1 ggaggtggag gcggtggt(SEQ ID NO：24)
    G  G  G   G  G  G(SEQ ID NO：8)
SP1核酸和氨基酸序列
SP2核酸和氨基酸序列
VEGFR-1D2-VEGFR-2D3核酸和氨基酸序列
ACVP-1核酸和氨基酸序列
DAF SCR2-4核酸和氨基酸序列
MCP SCR2-4核酸和氨基酸序列
因子H SCR1-4核酸和氨基酸序列
C4BPA SCR1-3核酸和氨基酸序列
ACVP-2氨基酸序列
QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK(SEQ ID NO：33)
ACVP-3氨基酸序列
QCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO：34)
ACVP-4氨基酸序列
GRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPG(SEQ ID NO：35)
ACVP-5氨基酸序列
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI(SEQ ID NO：36)
ACVP-6氨基酸序列
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCIGGGGGGGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK(SEQ ID NO：37)
VEGFR-1D2-VEGFR-2D3氨基酸序列
DTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEK(SEQ ID NO：38)
人IgG1Fc氨基酸序列
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：39)
ACVP-1’氨基酸序列
DTGRPFVEMYSEIPEIIHMTEGRELVIPCRVTSPNITVTLKKFPLDTLIPDGKRIIWDSRKGFIISNATYKEIGLLTCEATVNGHLYKTNYLTHRQTNTIIDVVLSPSHGIELSVGEKLVLNCTARTELNVGIDFNWEYPSSKHQHKKLVNRDLKTQSGSEMKKFLSTLTIDGVTRSDQGLYTCAASSGLMTKKNSTFVRVHEKDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGKGGGGGGQCNAPEWLPFARPTNLTDEFEFPIGTYLKYECRPGYYGRPFSIICLKNSVWTGAKDRCRRKSCRNPPDPVNGMVHVIKDIQFGSQIKYSCTKGYRLIGSSSATCIISGNTVIWDNETPICDRIPCGLPPTITNGDFISTNRENFHYGSVVTYRCNPGSGGRKVFELVGEPSIYCTSNDDQVGIWSGPAPQCI(SEQ IDNO：40)
人IgG1Fc氨基酸序列
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：41)
人IgG1Fc氨基酸序列
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKDYKCKVSNKALPAPMQKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPRHIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK(SEQ ID NO：42)
SP2氨基酸序列
METDTLLLWVLLLWVPGSTG(SEQ ID NO：43)

Claims (41)

1.包含补体抑制结构域(CID)、VEGF抑制结构域(VID)和半寿期延长结构域的融合蛋白，其中融合蛋白抑制补体激活和VEGF活性。
2.权利要求1的融合蛋白，其中CID包含选自CR1、因子H、C4-BP、DAF和MCP的人补体调节蛋白的至少一个短共有重复序列(SCR)。
3.权利要求1或2的融合蛋白，其中CID包含选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
4.权利要求1-3中任一项的融合蛋白，其中VID包含人VEGF受体的胞外结构域的一部分。
5.权利要求4的融合蛋白，其中VID包含人VEGFR-1的免疫球蛋白样(Ig)结构域2和人VEGFR-2的Ig样结构域3。
6.权利要求5的融合蛋白，其中VID包含SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
7.权利要求1-6中任一项的融合蛋白，其中半寿期延长结构域包含免疫球蛋白Fc区。
8.权利要求7的融合蛋白，其中Fc区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc。
9.权利要求7的融合蛋白，其中Fc区包含SEQ ID NO：7或39的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：7或39的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
10.权利要求1-9中任一项的融合蛋白，其中融合蛋白还包含结构域之间的肽接头。
11.权利要求10的融合蛋白，其中肽接头包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
12.权利要求1-11中任一项的融合蛋白，其中融合蛋白从N端至C端按选自(1)VID、Fc、CID；(2)CID、Fc、VID；(3)CID、VID、Fc；(4)VID、CID、Fc；(5)Fc、VID、CID；和(6)Fc、CID、VID的顺序包含所述VID、CID和Fc。
13.融合蛋白，其从N端至C端包含VEGF抑制结构域(VID)、免疫球蛋白Fc区，和补体抑制结构域(CID)，其中融合蛋白抑制补体激活和VEGF活性。
14.权利要求13的融合蛋白，其中CID包含选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列，或与选自SEQ ID NO：1-6和13-16的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
15.权利要求13或14的融合蛋白，其中VID包含人VEGF受体的胞外结构域的一部分。
16.权利要求15的融合蛋白，其中VID包含人VEGFR-1的免疫球蛋白样(Ig)结构域2和人VEGFR-2的Ig样结构域3。
17.权利要求15的融合蛋白，其中VID包含SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：11或38的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
18.权利要求13-17中任一项的融合蛋白，其中Fc区是人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的Fc。
19.权利要求18的融合蛋白，其中Fc区包含SEQ ID NO：7或39的序列，或与SEQ ID NO：7或39的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
20.权利要求13-19中任一项的融合蛋白，其中融合蛋白还包含结构域之间的肽接头。
21.权利要求20的融合蛋白，其中肽接头在Fc区和CID之间。
22.权利要求20或21的融合蛋白，其中肽接头包含SEQ ID NO：8的氨基酸序列或与SEQ ID NO：8的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
23.权利要求13的融合蛋白，其中融合蛋白包含SEQ ID NO：12或40的氨基酸序列，或与SEQ ID NO：12或40的氨基酸序列具有至少90％同一性的氨基酸序列。
24.融合蛋白，其通过在产生融合蛋白的条件下培养包含编码权利要求1-23中任一项的融合蛋白的核酸的宿主细胞，并回收由宿主细胞产生的融合蛋白来产生。
25.包含两个融合蛋白的二聚体融合蛋白，其中每个融合蛋白包含权利要求13-24中任一项的融合蛋白。
26.组合物，其包含权利要求1-24中任一项的融合蛋白和可药用载体。
27.权利要求26的药物组合物，其中融合蛋白是二聚体形式。
28.核酸，其编码权利要求1-23中任一项的融合蛋白。
29.载体，其包含编码权利要求1-23中任一项的融合蛋白的核酸。
30.宿主细胞，其包含权利要求28的核酸。
31.产生融合蛋白的方法，所述方法包括在产生融合蛋白的条件下培养包含编码权利要求1-23中任一项的融合蛋白的核酸的宿主细胞，并回收由宿主细胞产生的融合蛋白。
32.权利要求31的方法，其中从细胞培养基回收融合蛋白并纯化。
33.权利要求31或32的方法，其中宿主细胞是哺乳动物细胞或酵母细胞。
34.权利要求31-33中任一项的方法，其中所回收的融合蛋白是二聚体。
35.治疗患有炎性疾病、自身免疫病、眼病或癌症的对象的方法，所述方法包括对所述对象施用有效量的权利要求1-25中任一项的融合蛋白。
36.权利要求35的方法，其中对象具有类风湿性关节炎、银屑病、黄斑变性、糖尿病性视网膜病变、视网膜中央静脉阻塞，或角膜移植。
37.权利要求36的方法，其中黄斑变性是湿性年龄相关黄斑变性或干性年龄相关黄斑变性。
38.权利要求35的方法，其中对象患有乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、胃癌、卵巢癌或成视网膜细胞瘤。
39.权利要求35的方法，还包括施用用于治疗疾病的第二治疗剂。
40.试剂盒，其包含权利要求1-25中任一项的融合蛋白。
41.权利要求31的试剂盒，其还包含包装说明书，所述包装说明书包含用融合蛋白在对象中治疗炎性疾病、自身免疫病、眼病或癌症的说明。
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