CN108892727A - 一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的重组抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体及其应用。其由以下四条肽链组成：(1)两条完全相同的抗体轻链，和，(2)两条完全相同的重组抗体重链；其中，所述的抗体轻链是识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链，所述的重组抗体轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；所述的重组抗体重链从N端至C端依次为：①识别p185抗原表位或抗原的抗体的重链可变区，②抗体重链恒定区，③柔性连接短肽，和，④具有结合VEGF能力的受体结构域，所述的重组抗体重链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.2所示。其具有同时结合p185和VEGF的能力，并能够抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞的增殖，在T淋巴细胞中会显著促进IFN‑γ表达，是优良的抗肿瘤的抗体药物。

Description

一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的重组抗体及其制 备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的重组抗体及其制备方法和应用。
背景技术
恶性肿瘤是在各种致瘤因子作用下，局部组织细胞增生所形成的新生物。2015年中国新发肿瘤病例数达4,292,000例，严重危险人类健康。
肿瘤分子生物学研究证实人表皮生长因子受体2(human epidermal growthfactor receptor,HER2)基因和Myc基因等癌基因异常活化引起细胞信号传导通路失调，进而导致细胞无限增殖是肿瘤发生的分子机制。HER2是表皮生长因子受体(epidermalgrowth factor receptor,EGFR)家族成员，位于人染色体17q21。HER2编码由1255个氨基酸组成的，具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白p185。P185由胞外的配体结合区、单链跨膜区及胞内的蛋白酪氨酸激酶区(720-987位氨基酸)三部分组成，过度活化的p185蛋白通过激活膜受体酪氨酸蛋白激酶信号传导通路(Ras/Raf/MAPK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K/AKT)信号传导通路及转录激活(STAT)信号传导通路发挥促进细胞增殖的作用。
肿瘤细胞的无限增殖消耗大量的营养成分。在肿瘤生长的初始阶段，周围组织的渗透作用负责提供维持其生长的营养成分。当肿瘤生长到2.0mm3时，即有新生血管长入，否则其中心部分将因缺乏营养供应出现缺血坏死，肿瘤组织也很难继续生长。肿瘤细胞分泌的血管内皮生长因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)是重要的促血管生长因素，它是诱导肿瘤血管生成作用最强、特异性最高的生长因子。VEGF基因位于染色体6p21.3，由8个外显子和7个内含子组成，其编码产物是二聚体糖蛋白。VEGF不仅能提高内皮细胞胞浆内钙离子的浓度，还能增加微血管对大分子物质的通透性。
上述肿瘤分子生物学的研究进展为抗肿瘤药物研发理念的更新提供了坚实的科学依据。目前，抗肿瘤药物研发的焦点已从传统的研发细胞毒药物转移到研发针对肿瘤细胞内细胞信号传导通路失调关键靶点的特异性新一代抗肿瘤药物。靶点特异性抗肿瘤药物，特别是抗体药物，以正常细胞和肿瘤细胞之间基因表达差异为依据，发挥高特异性和低毒性的治疗效果。
发明内容
本发明想要解决的技术问题是，针对缺乏肿瘤药物的缺陷，提供一种同时靶向p185和VEGF双特异性的重组抗体及其制备方法和应用，其具有同时结合p185和VEGF的能力，并能够抑制血管内皮细胞和肿瘤细胞的增殖。
本发明人利用分子生物学技术分别合成多条靶向p185和VEGF的抗体序列，利用DNA重组技术制备成不同形式的重组DNA，然后转染哺乳动物细胞表达并纯化双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)。经纯化并鉴定后筛选获得同时靶向人源化p185和VEGF的抗体且具有同时靶向人源化p185和VEGF的生物学效应。本发明人首先利用分子生物学技术分别合成靶向p185的曲妥珠单抗的抗体序列和靶向VEGF的贝伐单抗的抗体序列，利用聚合酶链式反应(PCR)技术将它们均分别制备成免疫球蛋白样(IgG)形式和单链抗体形式(scFv)的中间体，并利用DNA重组技术制备成包括附图6和7形式在内的由两种抗体序列组成的同时靶向p185和VEGF的不同形式的重组DNA(图6中靶向p185的曲妥珠单抗的抗体序列位于N端，靶向VEGF的ScFv形式的贝伐单抗序列位于C端；图7中，靶向VEGF的贝伐单抗的抗体序列位于N端，靶向p185的ScFv形式的曲妥珠单抗的抗体序列位于C端)，然后将其瞬时转染哺乳动物细胞进行瞬时表达及抗体结合能力检测，但均未成功，具体表现为，双特异性抗体中含scFv形式的曲妥珠单抗结合p185的能力出现2-5倍的降低，且在纯化透析过程中出现蛋白沉淀现象，同时含scFv形式的贝伐单抗的双特异性抗体的不表达或低表达，即使改变scFv中重链和轻链的顺序也未能改善抗体表达问题，由此可见，靶向p185的曲妥珠单抗和靶向VEGF的贝伐单抗均不适合以scFv形式存在，因此无法制备成由两种scFv形式或者一种为IgG形式另一种为scFv形式组成的双特异性抗体。
本发明利用DNA重组技术在以IgG形式存在的靶向p185的曲妥珠单抗的抗体的重链恒定区序列后通过柔性连接短肽在C端连接具有结合VEGF能力的受体结构域序列，制备成如附图1所示IgG-Decoy receptor(IgG-DR)形式的重组抗体DNA，与靶向p185的抗体的轻链DNA共转染哺乳动物细胞表达并纯化双特异性抗体(bispecific antibody,BsAb)。该以双特异性抗体使用具有结合VEGF能力的受体结构域序列替代scFv形式贝伐单抗，瞬时表达的表达量可以提高至约200mg/l,显著优于scFv形式贝伐单抗组成双特异性抗体的表达量(0-20mg/l)，且通过Protein A亲和层析纯化即可达到90％以上的纯化，由此可见，双特异性抗体的C端为具有结合VEGF能力的受体结构域序列时有利于蛋白的表达和纯化，同时保留了N端的另一个抗体识别和结合抗原表位或抗原的能力，经纯化并鉴定后筛选获得同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，其结合p185和VEGF的能力和亲本抗体或受体结构域相当，且具有同时靶向人源化p185和VEGF的生物学效应，从而完成了本发明。
本发明提供一种同时靶向p185和VEGF双特异性抗体，其由以下四条肽链组成：
(1)两条完全相同的抗体轻链，和，
(2)两条完全相同的重组抗体重链；
其中，所述的抗体轻链是识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链，所述的重组抗体轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
所述的重组抗体重链的氨基酸序列从N端至C端依次为：
①识别p185抗原表位或抗原的抗体的重链可变区序列，
②抗体重链恒定区序列，
③柔性短肽序列，和，
④具有结合VEGF能力的受体结构域序列，
所述的重组抗体重链的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示。
本发明中，所述的抗体重链恒定区的氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的第121位-第449位。
本发明中，所述的柔性短肽的氨基酸序列是GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS。
本发明中，所述的具有结合VEGF能力的受体结构域的其氨基酸序列是序列表中SEQ ID NO.2的第468位-第672位。
所述的重组抗体重链的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2的第1-第672位。其中，第449位的氨基酸G和GGGGS连接短肽的首个氨基酸G为共用氨基酸，第468位的S和GGGGS连接短肽的末端氨基酸S为共用氨基酸。设计共用氨基酸的目的是为了实现氨基酸的柔性对接，利于维持蛋白天然的空间构象。
本发明提供的同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，具有特异性识别p185和特异性识别VEGF的生物学功能。
本发明提供同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，其中，序列的融合不影响蛋白的分泌表达，在空间结构和功能上保留了各自特异性地识别VEGF和p185的能力。
本发明还提供一种核酸，其编码所述的同时靶向p185和VEGF双特异性抗体。
本发明还提供一种双特异性抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养所述的重组表达转化体，从培养物中获得双特异性抗体。
本发明所述的双特异性抗体的N端可变区序列可以是已知抗p185的抗体，包括曲妥珠单抗，帕妥珠单抗或等同物。本发明所述的双特异性抗体的C端为具有结合VEGF能力的受体结构域时，其N端可以为其它已知p185同家族抗原的抗体，如西妥昔单抗，帕尼单抗或等同物。
本发明提供的同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，能够特异性结合人p185和VEGF蛋白，具有高度亲和力，并能够在蛋白水平有效封闭p185和VEGF蛋白，既能够有效分别结合p185和VEGF蛋白，又能够在结合一种蛋白之后并不影响另一种蛋白的结合，即具有同时结合p185和VEGF的能力，填补目前没有同时靶向p185和VEGF双特异性抗体的空白。该双特异性抗体抑制血管内皮细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞的增殖。T细胞刺激实验证明，具有良好的生物活性，在T淋巴细胞中会显著促进IFN-γ表达。
附图说明
图1是本发明同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体的结构示意图。
图2显示本发明同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体(轻链序列是No.1，重组重链序列是No.2)与人p185和VEGF蛋白具有高度亲和力。图中，YY0411是实施例1制备而得的，其轻链序列是SEQ ID No.1，重组重链序列是SEQ ID No.2。
图3显示本发明同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体(轻链序列是No.1，重组重链序列是No.2)可以有效识别人p185和VEGF蛋白。
图4显示本发明同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体(轻链序列是No.1，重组重链序列是No.2)抑制血管内皮细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞的增殖(检测时间：用药后96小时)。
图5显示本发明同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体(轻链序列是No.1，重组重链序列是No.2)促进人T淋巴细胞分泌IFN-γ。
图6是由已知抗体序列构建成的同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体的结构示意图，其中靶向p185的曲妥珠单抗的抗体序列位于N端，靶向VEGF的ScFv形式的贝伐单抗序列位于C端。
图7是由已知抗体序列构建成的同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体的结构示意图，其中靶向VEGF的贝伐单抗的抗体序列位于N端，靶向p185的ScFv形式的曲妥珠单抗的抗体序列位于C端。
具体实施方式
本发明提供一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体。本双特异性抗体由两条完全相同的轻链和两条完全相同的重组重链组成。其中，轻链的结构是：识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链，其氨基酸序列见表1)。重组重链的结构从N端到C端依次为：识别p185抗原表位抗体的重链可变区，重链恒定区，柔性连接短肽，具有结合VEGF能力的受体结构域。重组重链结构示意图参见图1，氨基酸序列见表1。
表1同时靶向人p185和血管内皮生长因子的双特异性抗体的氨基酸序列
本发明分别合成编码抗p185抗体，结合VEGF的结构域序列的DNA片段，然后利用重组DNA，如重叠PCR技术将抗体轻链序列以及重组重链序列分别克隆到真核表达载体pcDNA中，然后共转染293F或CHO细胞，转染后5-7天收集细胞上清液，然后通过亲和层析凝胶柱纯化获得双特异性抗体。
下面结合实施例对本发明做进一步说明，并不是对本发明的限定。
实施例1
分别合成编码抗p185抗体，结合VEGF的结构域序列的DNA片段，然后利用重组DNA，如重叠PCR技术将抗体轻链序列(氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.1)以及重组重链序列(氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.2)分别克隆到真核表达载体pcDNA(购自LifeTechnologies)中，然后将轻链和重组重链DNA按质量比2:1的比例混匀，总量为4-10μg稀释至灭菌水中，加入40μL 2M CaCl2至总体积250μL，然后加入等体积的2×HBS(NaCl 16.3g,KCl 0.74g,Na2HPO4 0.214g，Glucose 2.4g和HEPES 10g，调pH至7.05，定容至1L，0.22μm滤膜过滤)，混匀形成磷酸钙-DNA悬液，或将轻链和重组重链DNA按质量比2:1的比例混匀，与转染试剂PEI或lipofectamine 2000混匀制备成DNA-转染试剂复合体，逐滴加入处于对数生长期的293F或CHO细胞，转染后5-7天收集细胞上清液，经0.45μm滤膜过滤后，将上清液加入经结合缓冲液(12.15g Tris加适量灭菌水溶解，调pH7.5，加8.78g NaCl,定容至1L)冲洗过的亲和层析凝胶柱(Protein A)后用洗脱液(7.5g甘氨酸加入适量双蒸水溶解，调pH3.5，加8.78g NaCl，定容至1L)洗脱，洗脱组分用1M Tris-HCl pH9.0进行中和，得到如图1所示双特异性抗体YY0411。
实施例2酶联免疫吸附检测
分别将人源p185或VEGF蛋白4℃条件下包被于96孔板16小时；37℃条件下在含有1％bovine serum albumin(BSA)的PBS缓冲液中封闭2小时；PBST缓冲液洗涤；分别缓慢加入市售p185抗体、市售VEGF抗体或本发明的双特异性抗体YY0411于37℃条件下孵育2小时；PBST缓冲液洗涤；以抗人IgG Fab抗体37℃条件下孵育1小时；PBST缓冲液洗涤；加入四甲基联苯胺孵育5分钟后加入硫酸终止反应，检测450nm吸光度值。
酶联免疫吸附检测结果见图2，结果表明，所述的同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体YY0411，与人p185(图2A)、VEGF(图2B)、p185-VEGF(图2C)和VEGF-p185(图2D)蛋白具有高度亲和力。
实施例3蛋白印迹检测
(1)检测本发明抗体识别VEGF的能力：
收集细胞形态健康、融合率达80％的血管内皮细胞(HUVEC细胞)，离心后，弃上清，加入细胞裂解液，95℃变性10分钟，以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白，利用半干转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，以5％脱脂牛奶室温下封闭1小时，加入本发明的抗体YY0411或市售VEGF抗体或市售β-actin抗体，室温下孵育1小时，PBST洗涤后，加入带辣根过氧化物酶标签的二抗，室温下孵育1小时，PBST洗涤后，利用化学发光试剂显色，暗室显影。
蛋白印迹检测结果见图3B，结果表明，所述的同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体YY0411，能够在蛋白水平有效识别VEGF(图3B)蛋白。
(2)检测本发明抗体识别p185的能力：
收集细胞形态健康、融合率达80％的乳腺癌细胞(MDA-MB-453细胞)，离心后，弃上清，加入细胞裂解液，95℃变性10分钟，以聚丙烯酰胺凝胶电泳分离细胞蛋白，利用半干转法将蛋白转移至硝酸纤维素膜(NC膜)，以5％脱脂牛奶室温下封闭1小时，加入本发明的抗体YY0411或市售p185抗体或市售β-actin抗体，室温下孵育1小时，PBST洗涤后，加入带辣根过氧化物酶标签的二抗，室温下孵育1小时，PBST洗涤后，利用化学发光试剂显色，暗室显影。
蛋白印迹检测结果见图3A，结果表明，所述的同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体YY0411，能够在蛋白水平有效识别p185(图3A)蛋白。
实施例4细胞增殖检测
接种形态健康的血管内皮细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞(分别是图4中的HUVEC，Calu-3，MDA-MB-453，NCI-N87)于96孔板，含0.5％胎牛血清培养基饥饿过夜后，每种细胞分为五组(每组包含三个孔)，分别加入培养基(图4中为Control)、市售p185抗体(图4中为α-HER2)、市售VEGF抗体(图4中为α-VEGF)、市售p185和VEGF抗体(图4中为α-HER2+α-VEGF)以及本发明的抗体YY0411(图4中为YY0411)，继续在细胞培养箱中培养72小时，以市售细胞增殖检测试剂盒(CCK8试剂盒)检测细胞增殖情况。
细胞增殖检测结果见图4，结果表明，所述的同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体YY0411，可以有效抑制血管内皮细胞、人肺癌细胞、人乳腺癌细胞和人胃癌细胞的增殖。
实施例5 T细胞刺激检测
将T淋巴细胞悬液加入96孔板，实验分为两组(每组包含三个孔)，分别加入培养基(图5中的Contrl)和本发明的抗体YY0411(图5中的YY0411)，继续在细胞培养箱中培养72小时，以市售酶联免疫吸附检测试剂盒(ELISA试剂盒)检测IFN-γ浓度。
T细胞刺激检测结果见图5，结果表明，所述的同时靶向人p185和VEGF的双特异性抗体具有良好的生物活性，在T淋巴细胞中会显著促进IFN-γ表达。
对比例1
将已知的靶向p185的曲妥珠单抗的抗体序列和靶向VEGF的贝伐单抗的抗体序列，利用聚合酶链式反应(PCR)技术分别制备成免疫球蛋白样(IgG)形式和单链抗体形式(scFv)的中间体，并利用DNA重组技术制备成包括附图6和7形式在内的由两种抗体序列组成的同时靶向p185和VEGF的不同形式的重组DNA(图6中靶向p185的曲妥珠单抗的抗体序列位于N端，靶向VEGF的ScFv形式的贝伐单抗序列位于C端；图7中，靶向VEGF的贝伐单抗的抗体序列位于N端，靶向p185的ScFv形式的曲妥珠单抗的抗体序列位于C端)，然后将两种抗体序列组成的双特异性抗体瞬时转染哺乳动物细胞进行瞬时表达及抗体结合能力检测，但均未成功，具体表现为，双特异性抗体中含scFv形式的抗p185抗体结合p185的能力出现2-5倍的降低，且在纯化透析过程中出现蛋白沉淀现象，同时含scFv形式的抗-VEGF抗体的双特异性抗体由于空间结构等问题不表达或低表达，即使改变scFv中重链和轻链的顺序也未能改善抗体表达问题，由此可见，靶向p185的曲妥珠单抗和靶向VEGF的贝伐单抗均不适合以scFv形式存在，因此无法制备成由两种scFv形式或者一种为IgG形式另一种为scFv形式的双特异性抗体。
序列表
<110> 生标（上海）医疗器械科技有限公司
<120> 一种同时靶向人p185和血管内皮生长因子的重组抗体及其制备方法和应用
<150> 201710867265.5
<151> 2017-09-22
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 2
<211> 672
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val
115 120 125
Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala
130 135 140
Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser
145 150 155 160
Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val
165 170 175
Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro
180 185 190
Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys
195 200 205
Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp
210 215 220
Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly
225 230 235 240
Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile
245 250 255
Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu
260 265 270
Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His
275 280 285
Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg
290 295 300
Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys
305 310 315 320
Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu
325 330 335
Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr
340 345 350
Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu
355 360 365
Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp
370 375 380
Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val
385 390 395 400
Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp
405 410 415
Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His
420 425 430
Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro
435 440 445
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
450 455 460
Gly Gly Gly Ser Asp Thr Gly Arg Pro Phe Val Glu Met Tyr Ser Glu
465 470 475 480
Ile Pro Glu Ile Ile His Met Thr Glu Gly Arg Glu Leu Val Ile Pro
485 490 495
Cys Arg Val Thr Ser Pro Asn Ile Thr Val Thr Leu Lys Lys Phe Pro
500 505 510
Leu Asp Thr Leu Ile Pro Asp Gly Lys Arg Ile Ile Trp Asp Ser Arg
515 520 525
Lys Gly Phe Ile Ile Ser Asn Ala Thr Tyr Lys Glu Ile Gly Leu Leu
530 535 540
Thr Cys Glu Ala Thr Val Asn Gly His Leu Tyr Lys Thr Asn Tyr Leu
545 550 555 560
Thr His Arg Gln Thr Asn Thr Ile Ile Asp Val Val Leu Ser Pro Ser
565 570 575
His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr
580 585 590
Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro
595 600 605
Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr
610 615 620
Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp
625 630 635 640
Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser
645 650 655
Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr Phe Val Arg Val His Glu Lys
660 665 670

Claims (6)

1.一种同时靶向人源化p185和VEGF的双特异性抗体，其特征在于，其由以下四条肽链组成：
(1)两条完全相同的抗体轻链，和，
(2)两条完全相同的重组抗体重链；
其中，所述的抗体轻链是识别p185抗原表位或抗原的抗体的轻链，所述的重组抗体轻链的氨基酸序列如序列表SEQ ID No.1所示；
所述的重组抗体重链从N端至C端依次为：
①识别p185抗原表位或抗原的抗体的重链可变区，
②抗体重链恒定区，
③柔性连接短肽，和，
④具有结合VEGF能力的受体结构域，
所述的重组抗体重链的氨基酸序列如序列表SEQ IDNo.2所示。
2.一种核酸，其特征在于，其编码如权利要求1所述的同时靶向p185和VEGF双特异性抗体。
3.一种包含如权利要求2所述的核酸的重组表达载体。
4.一种包含如权利要求3所述的重组表达载体的重组表达转化体。
5.一种双特异性抗体的制备方法，其包括如下步骤：培养如权利要求4所述的重组表达转化体，从培养物中获得双特异性抗体。
6.如权利要求1所述的双特异性抗体在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
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