CN104341504B - 双特异性抗体 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的双特异性抗体是由一个完整抗体融合单链可变区片段（scFv）组成的，这两部分具有不同的抗原或抗原决定簇的特异性，完整抗体部分含有抗体恒定区或其修饰产物。在特定的实施方式中，完整抗体部分靶向表皮生长因子受体EGFR，单链可变区片段抗体部分靶向血管内皮生长因子VEGF。

Description

双特异性抗体
技术领域
本发明涉及双特异性抗体，还涉及所述双特异性抗体的免疫偶联体、制备方法和含有所述偶联体的药物组合物及其用途。
技术背景
双特异性抗体(BsAb)或双特异性单克隆抗体(BsMAb)是由两种不同的抗体片段构成的一种人工蛋白质。由于包含两种不同的抗原结合域，一个双特异性抗体能够识别和结合两个不同的抗原或两个不同的抗原表位。在肿瘤免疫治疗中，双特异性抗体能够同时结合肿瘤细胞表面受体和细胞毒性细胞表面的受体，如CD3，将细胞毒性细胞靶向到肿瘤细胞，进而杀伤肿瘤细胞。
双特异性抗体在各方面都面临着挑战。首先，他们难以工业化生产。更重要的是，这类人工蛋白质在体外和体内的稳定性通常不高。当一个蛋白质中具有两个空间上非常接近的抗原结合域，这两个抗原结合域能否保留彼此的结合活性是最需要关注的一个问题。
为了克服工业化生产困难，第一代双特异性单克隆抗体，也被叫做三功能性抗体，已经开发出来了。它是由两条重链和两条轻链组成，每条重链和轻链都来自于两个不同的抗体。两个Fab区域靶向两个抗原。Fc区域则是由这两条重链共同组成，形成第三个结合位点，因此得名三功能性抗体。
其他类型的双特异性抗体也已被设计出来用于解决某些特定问题，例如半衰期短、免疫原性和细胞因子释放引起的副作用。这些方法包括只有Fab区域的化学偶联Fabs，以及各种类型的二价和三价的单链式可变区片段(scFvs)，模拟两个抗体可变区结构域的融合蛋白。
在过去的一段时间内，其他类型的重组抗体形式也一直在发展,例如通过融合一个IgG抗体和单链结构域而形成的四价双特异性抗体(参见Coloma,M.J.等,NatureBiotech 15(1997)159-163；WO 2001/077342和Morrison,S.L.,Nature Biotech 25(2007)1233-1234)。
同时其他几种新的形式也被开发出来，其中抗体核心结构(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)不再保留，如二价、三价或四价抗体，小分子抗体，单链形式抗体(scFv，Bis-scFv)，它们都能够绑定两个或更多的抗原(Holliger,P.等,Nature Biotech 23(2005)1126-1136；Fischer,N.,Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14；Shen,J.等,Journal ofImmunological Methods 318(2007)65-74；Wu,C.等,Nature Biotech.25(2007)1290-1297)。
所有这些形式都是使用连接子来融合抗体核心部分(IgA、IgD、IgE、IgG或IgM)和另一个结合蛋白(如scFv)，例如融合两个Fab片段，或者scFvs(Fischer,N.,Leger,O.,Pathobiology 74(2007)3-14)。其中通过维持与天然抗体的高相似性来保留抗体效应功能是非常重要的，比如补体依赖细胞毒性(CDC)或抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)，这些都是通过Fc受体结合介导的。
专利WO2007/024715报道了双可变结构域免疫球蛋白，该蛋白为多价和多特异性结合蛋白。美国专利6897044报道用于制备具有生物活性的抗体二聚体的方法。美国专利7129330报道至少具有四个通过肽连接子连接的可变结构域的多价F.sub.v抗体。在专利US2005/0079170中报告二聚体和多聚体的抗原结合结构。美国专利6511663报道了三或四价单特异性抗原结合蛋白，其包括3个或4个通过共价键连接的Fab片段，该蛋白不是天然的免疫球蛋白。专利WO2006/020258报道了可以在原核和真核细胞中高效表达的四价双特异性抗体，用于治疗和诊断。专利US 2005/0163782报道了从两种类型的多肽二聚体的混合物中分离或选择性地合成至少由一个链间二硫键连接的二聚体和不是至少由一个链间二硫键连接二聚体的方法。美国专利5959083报告了四价双特异性受体。专利WO2001/077342中报道了具有三个或更多抗原结合位点官能团的工程抗体。
专利WO1997/001580报道了具有多特异性和多价抗原结合的多肽。专利WO1992/004053报道了一种同合物，通过合成交联共价连接具有相同的抗原决定簇的IgG类单克隆抗体制备而成。专利WO1991/06305报道了具有高抗原亲和力的IgG类低聚化单克隆抗体，分泌表达两个或两个以上的免疫球蛋白单体，这些单体交联在一起以形成四价或六价的IgG分子。美国专利6350860报道了羊源抗体和工程抗体的构建，可以用于治疗干扰素γ活性相关疾病。专利US 2005/0100543报道了双特异性抗体多价靶向载体的构建，即靶向构建的每个分子可以作为两个或更多的双特异性抗体的载体。专利WO1995/009917报道了基因工程四价双特异性抗体。专利WO109254/2007报道了一种稳定结合分子，该分子具有一个稳定的scFv。
表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor；EGFR)是一种由1186个氨基酸组成的单链跨膜糖蛋白。在多种人实体瘤中EGFR基因都存在着过度扩增和表达。多年来的研究结果显示，EGFR的这种过度表达与肿瘤的形成、发生和发展有着密切的关系。因此，表皮生长因子受体(EGFR)已成为近二十年来最热门的抗肿瘤药物开发靶点之一。
针对EGFR靶点有两类药物被开发。一类是针对EGFR胞外区的单克隆抗体，这一类药物以已经上市的产品：爱必妥、帕尼单抗、尼妥珠单抗为代表；一类是针对胞内酪氨酸激酶活性区的小分子激酶抑制剂，这一类药物以已经上市的产品：易瑞沙(Iressa)、吉非替尼(erlotinib)为代表。这两类药物在临床应用中取得不错的效果，但也存在一个共同的缺点：部分患者易产生耐药性或者说EGFR表达阳性的患者只有一部分受益，并且效果有限。产生这种耐药性的原因是部分患者体内的KRAS基因发生突变，这样，虽然抗体或小分子抑制剂阻止了EGFR胞内酪氨酸激酶的激活，但突变的KRAS蛋白使GTPase一直处于活性状态，持续激活MAPK信号，产生了不依赖EGFR激活的MAPK信号通路。
多种疾病的发病机制都与血管生成有关，包括实体瘤、眼内新生血管综合征，如增殖性视网膜病或年龄相关性黄斑变性(AMD)，类风湿关节炎和牛皮癣等(Folkman,J.等,J.Biol.Chem.267(1992)10931-10934；Klagsbrun,M.等,Annu Rev.Physiol.53(1991)217-239)。血管生成能够使肿瘤细胞比正常细胞获得更大的生长优势，实现自主增殖。人血管内皮生长因子(VEGF/VEGF-A)负责调控正常的和非正常的血管生成以及与肿瘤和眼内疾病相关的新生血管生成(Ferrara,N.等,Endocr.Rev.18(1997)4-25；Berkman,R.A.等,J.Clin.Invest.91(1993)153-159；Brown,L.F.等,Human Pathol.26(1995)86-91；Brown,L.F.等,Cancer Res.53(1993)4727-4735；Mattern,J.等,Brit.J.Cancer.73(1996)931-934；和Dvorak,H.等,Am.J.Pathol.146(1995)1029-1039)。
VEGF是一种同型二聚体的糖蛋白，具有高度特异性的血管内皮细胞的促有丝分裂活性，负责调控胚胎血管生成以及成年体内的血管生成(Carmeliet,P.等,Nature,380(1996)435-439；Ferrara,N.等,Nature,380(1996)439-442；Ferrara和Davis-Smyth,Endocrine Rev.,18(1997)4-25)。VEGF发挥着非常重要的功能，研究显示在灭活一个VEGF等位基因会由于脉管生成失败而导致的胚胎致死(Carmeliet,P.等,Nature,380(1996)435-439；Ferrara,N.等,Nature,380(1996)439-442)。
VEGF对单核细胞具有较强的趋化活性，在血管内皮细胞中可诱导血纤维蛋白溶酶原活化因子以及纤溶酶原激活物抑制因子，并诱导微血管通透性，因此也被称为血管通透因子(VPF)(参见Ferrara,N.等,J.Cellular Biochem.,47(1991)211-218和Connolly,J.Cellular Biochem.,47(1991)219-223)。VEGF基因通过可变剪切可产生5种异构体。
在小鼠模型中，抗VEGF的中和抗体能够抑制多种肿瘤的生长(Kim,I.等,Nature362(1993)841-844；Warren,S.R.等,J.Clin.Invest.95(1995)1789-1797；Borgstrom,P.等,Cancer Res.56(1996)4032-4039；和Melnyk,O.等,Cancer Res.56(1996)921-924)。WO94/10202、WO 98/45332、WO 2005/00900和WO 00/35956专利中提及到抗VEGF抗体。人源化的单克隆抗体贝伐珠单抗(商品名Avastin)是临床上用于治疗肿瘤的抗VEGF单克隆抗体(WO 98/45331)。
贝伐珠单抗联合氟尿嘧啶为基础的化疗方案，用于转移性结直肠癌的一线治疗。西妥昔单抗，抗表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合型IgG1单克隆抗体，作为单药治疗和联合伊立替康治疗伊立替康耐药患者均有效。由此推测在卡培他滨、奥沙利铂、贝伐珠单抗联合治疗中加入西妥昔单抗，同时阻断EGFR和VEGF的功能，一线治疗转移性结直肠癌(CAIRO2试验)患者会取得较好的疗效。
然而，西妥昔单抗和贝伐珠单抗两个封闭抗体联合治疗组的整体生存期和反应率并没有改善。西妥昔单抗治疗带有KRAS基因突变肿瘤的患者与西妥昔单抗治疗野生型KRAS肿瘤的患者(Tol,J.等,N Engl J Med.360(2009)563-572)相比，无进展生存期(PFS)明显下降。
帕尼单抗是全人源抗体，靶向表皮生长因子受体，批准用于治疗转移性结直肠癌(mCRC)患者，在另一项试验中，通过添加贝伐珠单抗和化疗(奥沙利铂和伊立替康)作为第一线治疗评估转移性结直肠癌，也得到类似的数据。贝伐珠单抗与奥沙利铂或伊立替康为基础的化疗联合治疗中加入帕尼单抗会导致毒性增加，减少PFS。在临床实践中，这些简单的药物组合不推荐用于治疗转移性结直肠癌(Hecht,J.等,J Clin Oncol.27(2009)672-680)。因此，通过靶向化学分子到肿瘤组织，同时阻断VEGF和EGFR的信号转导通路，显然是一个更好的治疗实体肿瘤的方法。
据报道，同时靶向VEGF和EGFR的人源结构域抗体是以双靶标IgG抗体分子(DT-IgG抗体)的形式直接作用于两个抗原(Zhang,H.等,Int J Cancer.131(2012)956-69)。该DT-IgG抗体如西妥昔单抗一样有效地抑制EGFR阳性细胞的生长，阻止EGFR的激活和诱导细胞凋亡，如贝伐珠单抗一样有效地中和VEGF。然而，DT-IgG的形式是以单个结构域为基础的，半衰期很短，因此不适合用于治疗癌症。
发明内容
一方面，本发明提供一种双特异性抗体，其包括一个由两条轻链和两条重链组成的完整抗体，其特征在于，两条重链与单链可变结构域(scFv)融合，其特征在于，所述完整的抗体对第一抗原表位或抗原有特异性结合，而scFv对不同于第一个抗原表位或抗原的第二个抗原表位或抗原有特异性结合。
一方面，完整抗体和/或scFv对肿瘤抗原有特异性结合。肿瘤抗原选自下列组成，包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、Mucins、TAG-72、CIX、PSMA、folate-结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、Integrin、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和Tenascin。
在一个实施例中，提供了一种双特异性抗体，其包含(a)第一和第二条多肽，每一个都包括一个免疫球蛋白轻链；以及(b)第三和第四条多肽，每一个从N末端到C-末端都包括，可变区，恒定区，和一个单链可变结构域(scFv)，其特征在于每个所述第一和第二条多肽，与来自第三和第四条多肽的N末端可变区形成抗原结合位点，能够特异性识别EGFR；其特征在于，每一个scFv能够特异性地识别VEGF。
在一个实施例中，提供了一种双特异性抗体，其包含(a)第一和第二条多肽，每一个都包括一个免疫球蛋白轻链；以及(b)第三和第四条多肽，每一个从N末端到C-末端都包括，可变区，恒定区，和一个单链可变结构域(scFv)，其特征在于每个所述第一和第二条多肽，与来自第三和第四条多肽的N末端的可变区形成抗原结合位点，能够特异性识别VEGF的抗原结合位点；其特征在于，每一个scFv能够特异性地识别EGFR。
在一些方面，第一和第二多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1或者与SEQ ID NO:1具有至少90％相似性。在一些方面，第三和第四多肽具有SEQ ID NO:2氨基酸序列或者与SEQID NO:2具有至少90％相似性。
在一个实施例中，提供了一种由两条轻链和两条长链组成的双特异性抗体，轻链的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，长链氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
一方面，提供了一个双特异性抗体，该抗体包含由两条轻链和两条重链组成的完整抗体，这里的两条重链由IgG1的恒定区构成，并且C末端融合了一个单链可变区结构域scFv，这里完整的抗体具有EGFR特异性，而scFv具有VEGF特异性。
在一些方面中，该抗体与类美登素化合物偶联，具有式Ia、Ib或Ic结构，
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中
X为氢或卤素；
Y选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基和C(＝O)R5；
R1选自H、OH、OC(＝O)R5和OR5基团；
R2为H或C1-C6烷基；
R3为甲基、-CH2OH或-CH2OC(＝O)R6；
R4为-OH或-SH；
R5为C1-C6烷基或苄基；
R6为C1-C6烷基、苯基或苄基；
R7为氢或氨基酸侧链；
R8为氢或者C1-6烷基；
n为0、1、2、3、4、5、6、7或者8。
p为3、4、5、6、7、8、9或者10；
BsAb为双特异性抗体。
一方面，所述的类美登素的化合物通过一个连接子与双特异性抗体连接，该连接子具有酸稳定性、肽酶组织蛋白酶非敏感性，并且不包含二硫键。
在另一个实施例中，所提供的是一种组合物，其含有第一条多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：1相同和与第二条多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：2相同。
还提供了一种多核苷酸，该核酸序列编码的氨基酸序列与SEQ ID NO：2相同或与SEQ ID NO：2具有至少90％的氨基酸序列一致性。
一个实施例中还提供了一种转化任何上述实施例中所述的多核苷酸的细胞。同时本发明还提供了一种方法。该方法用于治疗EGFR阳性的癌症患者，包括对患者施用有效量的本发明所述的抗体。
在此基础上，本发明还提供了本发明所述的的抗体在制备治疗EGFR阳性的癌症患者的药物中的应用。
在另一些实施例中，提供的制备双特异性抗体的方法是来自于一个IgG2的第一抗体和一个与第一抗体结合不同的抗原或不同的抗原位点的第二抗体，其为一个单链可变区结构域scFv。IgG2抗体可以修改为包括IgG1抗体的恒定区。这样修改的多核苷酸可以被转染到细胞中，允许生产双特异性抗体。
因此，在一个实施例中，提供了一种双特异性抗体，来自于一个IgG2的第一抗体和一个与第一抗体具有不同的抗原表位特异性的第二抗体，其包含(a)第一和第二条多肽，每一个都包括一个免疫球蛋白轻链；以及(b)第三和第四条多肽，每一个从N末端到C-末端都包括，第一抗体的可变区，一个IgG1的恒定区，和一个来自第二抗体的单链可变结构域(scFv)。
附图说明
图1A为906双特异性抗体分子结构图。
图1B为206单抗、906双特异性抗体以及对照双特异性抗体2016在CHO中的表达产量。
图2A为206单抗、906双特异性抗体以及对照双特异性抗体2016的SDS-PAGE电泳图。
图2B为906双特异性抗体的分子筛色谱图。
图3A为906双特异性抗体的差式扫描仪测量结果。
图3B为906双特异性抗体的热稳定性测试结果。
图4A为运用ELISA方法检测906抗体的亲和常数实验结果。
图4B为运用FACS技术检测待测抗体与细胞表面EGFR抗原的结合情况。
图5显示906抗体以及其它待测抗体对不同细胞生长的增殖抑制作用，其中A431细胞(图5A)，MDA-MB-468细胞(图5B)，A549细胞(图5C)和A673细胞(图5D)。
图6为906双特异性抗体在BALB/C小鼠中的药代动力学研究。
图7A为906抗体治疗EGFR阳性细胞A431异种移植动物模型肿瘤实验结果。
图7B为906抗体根除EGFR阴性细胞A673异种移植动物模型肿瘤实验结果。
图8为906抗体及其它对照抗体对HUVEC细胞的生长抑制结果。
图9为抗体浓度在4μg/mL时，906-SMCC-MD1对HUVEC细胞的生长抑制结果。
具体实施方式
I.定义
如果没有特别指明，本文所涉及的描述和要求依照以下所述来定义。
需要说明的是，除非特别指明，本文所述单数形式包含复数含义。如，当述及一种复合物”时，同时包含复合物的复数形式。
本文所涉的“大约”应为本领域普通技术人员所理解并且能够简单扩展其应用。如果有术语的应用对于本领域的普通技术人员是不清楚的，则需给出应用的上下文。“大约”指特定值的+10％至-10％、+5％至-5％或+1％至-1％。
本文所述术语，“包括”意在是指组成和方法包括所述物质，而不排除其他物质。当“主要包括”用于定义组成和方法时，应当意为不包括其他任何重要的组分。例如，一个复合物包括所述的重要组分但排除其他的重要组分。例如，一个复合物由所述定义的重要组分组成，则不排除那些对本发明的基本特性及新颖性无重大影响的组分。“由……组成”意为排除超过微量的成分和重要方法步骤。这些术语所定义的实施方式限于本发明的范围中。
如本文所用，“抗体(Ab)”或“抗原结合单元(Abu)”是指，其包含一个或多个抗原结合位点的蛋白或分子。该术语包含了完整的抗体和抗体片段，但不限于此。在某一方面，抗体包含重链可变区(VH)和/或抗体轻链可变区(VL)，或一对VH/VL，以及可以是完整抗体或抗体片段，如单链Fv、VH结构域和/或VL结构域、Fab、或(Fab)2。在某一方面，每一个抗原结合位点包括抗体重链可变区(VH)和/或抗体轻链可变结构域(VL)，也可以是一对由抗体轻链可变区(VL)和抗体的重链可变区(VH)多肽组成。
“双特异性抗体”是指能与两个不同的抗原或两个不同的抗原表位结合的抗体，这些抗原表位可以存在于相同的抗原，或在不同的抗原中。与此相反，“单特异性抗体”可以具有一个或多个结合位点，但它们中的每一个都结合相同的抗原表位。
在当前应用中所用的术语“价”表示抗体分子存在特定数量的结合位点。因此，术语“二价”、“四价”和“六价”分别表示在抗体分子中存在两个结合位点、四个结合位点和六个结合位点。本发明中的双特异性抗体是至少为“二价”，可以是“三价”或“多价”(例如，“四价”或“六价”)。在一些方面，双特异性抗体是二价，三价或四价的。在一些方面，双特异性抗体是二价的。在一些方面，双特异性抗体是三价的。在一些方面，双特异性抗体是四价的。
如本文所用，术语“重组人源抗体”是指包括所有利用重组方法制备、表达、创造或分离的人源抗体，例如，从NSO或CHO宿主细胞中分离出的抗体，或是利用表达人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如小鼠)中获得的抗体，或使用重组表达载体，转染到宿主细胞中表达的抗体。
术语“可变结构域”，当使用在重链或轻链结构域，分别是指直接参与在与抗原结合的抗体的重链或轻链的部分。人轻链和重链的可变结构域具有相同的普遍结构和每个结构域包括4个序列广泛保守的框架区(FR)，由三个“高变区”(或互补决定区，CDRs)连接。框架区采用beta-折叠构象和CDR可能会形成环状结构连接beta-折叠结构。在每个链的CDRs被保持在他们的框架区的三维结构体中，并与其它链的抗原结合位点的CDR形成一体。根据本发明抗体重链和轻链的CDR3区在抗体的结合特异性/亲和力中发挥特别重要的作用，因此进一步提供了本发明的目的。
术语“高变区”或“抗体的抗原结合部分”，在本文中使用时，请参阅负责抗原结合的抗体的氨基酸残基。高变区包括从“互补性决定区”或“CDR”氨基酸残基。“框架”或“FR”区域是本文所定义的高变区残基以外的那些可变结构域的区域。因此，抗体的轻链和重链包括从N-到C-末端的结构域FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。这样的框架氨基酸分隔的每个链的CDR。每个链的CDR由这样的框架氨基酸分隔开。特别是，重链CDR3是主要负责抗原结合的区域。CDR和FR区域的确定是根据Kabat等的标准定义(Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，5th ed.，Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。
“单链可变区片段”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)可变区形成的融合蛋白。在一些方面中，这些区域是由一段10至约25个氨基酸的短的连接肽连接。连接子通常富含甘氨酸来加强灵活性，以及丝氨酸或苏氨酸中来增加可溶性，既可以连接在VH的N-末端也可以在VL的C-末端，或反之亦然。此蛋白保留原来的免疫球蛋白的特异性，尽管去除了恒定区并引入连接子。scFv抗体分子在本领域中是已知的，并进行了描述，例如，在美国专利5892019中。
正如于此使用的那样，“类美登素”指的是美登素类似物，包括其立体异构体。美登素可从美登木属植物分离得到(美国专利3896111)，其结构式为：
类美登素为具有美登素的环结构且其环上具有一个或一个以上取代基修饰的化合物。“烷基”指的是具有1到10个碳原子(优选为1到6个碳原子)的单价饱和脂肪烃基。Cv烷基，其中v为整数表示具有v个碳原子的烷基。这一术语包括，例如，直链和支链的烃基如甲基(CH3)、乙基(CH3CH2)、正丙基(CH3CH2CH2)、异丙基(CH3)2CH)、正丁基(CH3CH2CH2CH2)、异丁基((CH3)2CHCH2)、仲丁基((CH3)(CH3CH2)CH)、叔丁基((CH3)3C)、正戊基(CH3CH2CH2CH2CH2)和新戊基((CH3)3CCH2)。“亚烃基”是具有1到10个碳原子(优选为1到6个碳原子)的二价饱和脂肪烃基。
“烯基”指的是具有2到6个碳原子(优选为2到4个碳原子)并且具有至少1个(优选为1到2个)位置的不饱和烯基(>C＝C<)直链或支链烃基。这些基团实例包括乙烯基、烯丙基和3-丁烯-1-基。顺式和反式异构体或这些异构体的混合物包括在该范围内。
“炔基”指的是具有2到6个碳原子(优选为2到3个碳原子)并且具有至少1个(优选为1到2个)位置的不饱和炔基(C≡C-)的直链或支链烃基。这些炔基的实例包括乙炔基(C≡CH)和炔丙基(CH2C≡CH)。
“氨基”指的是NR’R”基团，其中R’和R”独立选自氢、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、杂芳基、取代杂芳基、杂环、取代杂环，以及如果R’和R”都不是氢，其中R’和R”可选地与结合的氮原子共同连接形成杂环或取代杂环(其中烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、环烷基、取代环烷基、芳基、取代芳基、杂芳基、取代杂芳基、杂环、取代杂环定义如上)。当R’为氢和R”为烷基，取代氨基有时称作烷氨基。当R’和R”为烷基，取代氨基有时称作二烷氨基。-NH2有时称作未取代氨基。当提及单取代氨基，意为R’和R”两者其中任一个为氢，但并非两者都是。当提及二取代氨基，意为R’和R”两者都不是氢。
“氨基酸”指包含氨基和羧基的任何化合物，不论其为天然，非天然还是合成的。氨基酸的实例包括，但不限于甘氨酸(NH2CH2COOH)、半胱氨酸、丙氨酸、N-甲基丙氨酸、其包括D和L光学异构体。“氨基酸侧链”指取代甘氨酸亚甲基上一个氢原子的取代基。氨基酸侧链实例包括，但不限于天然氨基酸侧链、烷基、取代烷基、烯基、取代烯基、炔基、取代炔基、芳基、取代芳基、环烷基、取代环烷基、环烯基、取代环烯基、杂芳基、取代杂芳基、杂环基、取代杂环基。
“芳基”指单价芳香具有6到14碳原子的碳环基团，其可为单一环系(如苯基)或多稠环(如萘或蒽)，只要连接点在芳香碳原子上，这些稠环可以是或者不是芳香的(如2-苯并噁唑酮、2H-1、4-苯并噁嗪-3(4H)-酮-7-基等)。优选的芳基包括苯基和萘基。
“羰基”指二价基团C(O)，其等价于C(＝O)。
“羧基”指的是COOH或CO2H，或其盐。
“羧酸”指含有至少一个羧基的化合物。
“氰基”指–CN基团。
“环烷基”指具有3到10个碳原子的环状烷基，可以是单个或多个环状环，包括稠环、桥环和螺环系统。只要连接点是通过非芳香、非杂环碳环形的环，这些环中一个或多个可以是芳基、杂芳基或杂环基。合适的环烷基的实例包括，如：环丙基、环丁基、环戊基和环辛基。其它环烷基的实例包括双环[2、2、2]辛基、降莰基和螺双环如螺[4.5]癸-8-基：
环烯指的是环状的烯烃。“环烯基”指的是具有单个或多个环状环和至少一个>C＝C<环不饱和(最优选为1到2个位置的>C＝C<环不饱和)的3到10个碳原子的非芳香环状烷基。
“卤原子”或“卤素”指的是氟、氯、溴和碘，优选为氟或氯。
“卤代烷基”指的是1到5、1到3或1到1个卤原子取代的烷基，其中烷基和卤原子定义如上。
“羟基”指的是OH基团。
“杂芳基”指的是环中具有1到10个碳原子和1到4个杂原子(从氧、氮和硫原子选择)。这些杂芳基可以是单一环(如吡啶基或呋喃基)或多个稠环(如吲哚基或苯并噻吩基)其中只要连接点是通过芳香杂芳基上的原子，稠环可以是或不是芳香的和/或含有一个杂原子。在一个实施例中，杂芳基为5或6元杂芳基，其具有5或6个环原子并具有1到4个杂原子。在一个实施例中，杂芳基上的氮和/或硫环原子另外可氧化成氮-氧(N→O)、或磺酰部分。优选的杂芳基包括吡啶基、吡咯基、吲哚基和呋喃基。
“杂环”或“杂环的”或“杂环烷基”或“杂环基”指的是饱和的或部分饱和的，但不是芳香的基团，其具有1到10个环碳原子和1到4个环杂原子(由氮、硫或氧基团选择)。在一个实施例中，杂环为5、6或7元杂芳基，其具有5、6或7个环原子，其中有1到4个杂原子。这些杂环包括单一环或多个稠环(包括稠桥和稠螺环系)。在稠环系中，只要连接点是通过非芳香环，一个或多个环可以是环烷基、芳基或杂芳基。在一个实施例中，杂环基上的氮和/或硫环原子另外可氧化成氮-氧(N→O)，或磺酰部分。
杂环和杂芳基的实例包括但不限于吖丁啶、吡咯、吡唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲嗪、异吲哚、吲哚、二氢吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪、异喹啉、喹啉、酞嗪、萘吡啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、碟啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、菲啰啉、异噻唑、吩嗪、异噁唑、吩噁嗪、吩噻嗪、咪唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚啉、邻苯二甲酰亚胺、1,2,3,4四氢异喹啉、4,5,6,7四氢苯并[b]噻吩、噻唑、噻唑烷、噻吩、苯并[b]噻吩、吗啉基、硫代吗啉基、1,1-二氧代硫代吗啉基、哌啶基、吡咯烷和四氢呋喃基。
“取代烷基”、“取代烯基”、“取代炔基”、“取代环烷基”、“取代环烯基”、“取代芳基”、“取代杂芳基”或“取代杂环基”指的是各个为1到5个、特别是1到3个、优选是1到2个取代基取代的烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、芳基或杂环基，这些取代基选自烷基、卤代烷基、O-R20、-S-R20、烯基、炔基、氧代、-C(＝O)R20、-C(＝S)R20、C(＝O)OR20、-NR20C(＝O)R21、OC(＝O)R21、NR20R20、C(＝O)NR20R20、C(＝S)NR20R20、NR20C(＝O)NR20R20、NR20C(＝S)NR20R20、OC(＝O)NR20R20、SO2NR20R20、OSO2NR20R20、NR20SO2NR20R20、C(＝NR20)NR20R20、芳基、NR20C(＝O)OR21、OC(＝O)OR21、氰基、环烷基、环烯基、NR20C(＝NR20)NR20R20、卤素、羟基、杂芳基、杂环基、硝基、SO3H、-SO2R21和OSO2R21，其中R20独立地为氢、烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基和杂环基，或两个R20与其结合的原子形成一个杂环，R21为烷基、烯基、炔基、芳基、环烷基、环烯基、杂芳基和杂环基。
“硝基”指NO2基团。
“氧代”指的为原子(＝O)或(O)。“螺环系”指的是双环系，其中有一个单一环原子为两个环所共有。
“巯基”指的是SH基团。
“硫羰基”指的是二价C(S)基团，等同于C(＝S)。
“硫酮”指的是原子(＝S)。
如上使用的“化合物”应包括指明的分子式的立体异构体和互变异构体。
“立体异构体”指的是一个或多个立体中心的手性不同的化合物。立体异构体包括对映异构体和非对映异构体。
“互变异构体”指的是一个化合物其质子的位置不同的变化形式，如烯醇-酮和亚胺-烯胺互变异构体，或者杂芳基的互变异构形式包括环原子连接到环NH部分和环＝N部分如吡唑、咪唑、苯并咪唑、三氮唑和四氮唑。
“溶剂合物”指的是溶剂以晶型方式和化合物缔合。溶剂缔合通常由于在化合物的合成、结晶和/或重结晶中使用溶剂。“溶剂合物”包括水以晶型方式和化合物缔合的水合物。
“患者”或“接受实验的对象”指的是哺乳动物，其中包括人和非人类哺乳动物。
“药学上可接受的盐”指的是一化合物药学上可接受的盐，何种盐产生于该技术领域众所周知的各种各样的有机和无机抗衡离子，仅仅示例性盐包括，当分子含有酸性官能团时，有机或无机盐如钠盐、钾盐、钙盐、镁盐、铵盐、异丙胺、三甲胺、二乙胺基、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二甲胺基乙醇、2-二乙胺基乙醇、二环己基胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、hydrabamine、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡糖胺、甲葡糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪、哌啶、N-乙基哌啶、多胺树脂及四烷基铵盐等；以及当分子含有碱性官能团时，有机或无机酸盐如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、醋酸盐、马来酸盐和草酸盐。酸的其它非限制例子包括硫酸、硝酸、磷酸、丙酸、乙醇酸、丙酮酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸等。
患者疾病“治疗”指的是(1)阻止疾病在有倾向性或还没表现疾病症状的患者中出现；(2)抑制疾病或阻止其发展；或(3)减轻疾病或致其退化。
“有效量”意指活性化合物或药剂的量，其导致研究人员、兽医、医生或其他临床医生正寻求的组织、系统、动物、个体以及人的生物或药用响应，这包含治疗一种疾病。
II.双特异性抗体
在一个实施例中，本发明提供了一种双特异性抗体，该抗体具有显著提高的工业化生产效率和稳定性，以及具有高结合亲和力和具有体内肿瘤治疗效果。考虑到双特异性抗体的产量低，稳定性差以及疗效差等缺点，这样的属性是意想不到的。
在一个实施例中，本发明的双特异性抗体包括一个对第一抗原具有特异性的完整的抗体部分，一个与该部分融合的对第二抗原具有特异性的单链可变区片段(scFv)部分。在一些方面，第一抗原是EGFR，并且第二抗原是VEGF。也可接受为第一抗原为VEGF，同时第二抗原为EGFR。
“完整抗体”或“全长抗体”是指包括至少两条轻链和两条重链的抗体或抗体部分，并且每条重链包括至少一个可变区(VH)和三恒定区(例如，CH1、CH2和CH3)。
如图1A所示，本发明的双特异性抗体可以包括四条多肽，两条相对长的多肽和两条轻链。这个双特异性抗体可以视为完整抗体融合了单链可变区片段(scFv)。双特异性抗体上端所示的完整抗体部分包括两条轻链和两条重链，能够靶向EGFR。下端所示的scFv部分能够靶向VEGF。
正如下面的实验数据显示，与本领域中已知的其它双特异性抗体相比，这种抗-EGFR/VEGF的双特异性抗体具有显著提高的工业化生产效率和稳定性，以及具有高结合亲和力和具有体内肿瘤治疗效果。
应当指出，图1A中所示的抗体的，每条长肽的完整抗体部分是来自于一个的IgG2抗体，但是被修改为具有IgG1恒定区。因此，每条长的多肽从N-末端(顶端)的C-末端(底部)包括一个可变区，一个IgG1恒定区，和包含一个VH和VL片段的scFv。
IgG1恒定区增强了双特异性抗体诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。IgG1恒定区介导增强的ADCC的实例在本领域中是已知的(见Stewart等Protein EngDes Sel.24(9):671-8、2011)。
在一些方面中，每一个第一抗原和/或第二抗原是肿瘤抗原。
“肿瘤抗原”是指在肿瘤细胞中产生的抗原物质，即它能在宿主中触发免疫反应。肿瘤抗原在鉴定肿瘤细胞中起重要作用，并在肿瘤治疗中作为重要的候选治疗靶标。正常的蛋白质在体内不具有抗原性。然而，某些蛋白质，或在肿瘤发生过程中过度表达，从而被身体视为“外来物”。这可能包括被免疫系统捕获的正常蛋白质，那些含量极低的蛋白质，仅在某些在发育的某个阶段表达的蛋白质，或者是因突变结构被修改的蛋白质。
大量的肿瘤抗原都是在本领域中已知的，并且通过筛选可以很容易确定新的肿瘤抗原。肿瘤抗原的非限制性实施例包括EGFR、Her2、EpCAM、CD20、CD30、CD33、CD47、CD52、CD133、CEA、gpA33、Mucins、TAG-72、CIX、PSMA、folate-结合蛋白、GD2、GD3、GM2、VEGF、VEGFR、Integrin、αVβ3、α5β1、ERBB2、ERBB3、MET、IGF1R、EPHA3、TRAILR1、TRAILR2、RANKL、FAP和Tenascin。
在一些方面中，第一抗原和第二抗原是EGFR和VEGF，反之亦然。
在一些方面中，IgG1恒定区和scFv是通过一个连接子相连，如短肽。连接子通常是5至约30个氨基酸残基的长度。在一些方面中，连接子是从约10至约25个氨基酸残基的长度。连接子通常富含甘氨酸来加强灵活性，以及丝氨酸或苏氨酸中来增加可溶性。在一些方面中，每一个连接子中包括至少有50％的甘氨酸，或者至少60％、70％、80％或90％的甘氨酸。
在一些方面，每条轻链、可变区、IgG1的恒定区、scFv的VH和VL区都是人源序列，可以任意的修改。
在一些方面中，双特异性抗体中的每一条轻链都包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或具有至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％与SEQ ID NO：1相同的氨基酸序列。
在一些方面中，双特异性抗体中的每一条长的多肽都包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列或具有至少约80％、85％、90％、95％、98％或99％与SEQ ID NO：2相同的氨基酸序列。
表1.抗-EGFR和抗-VEGF双特异性抗体的轻链氨基酸序列
表2.抗-EGFR和抗-VEGF双特异性抗体的长的多肽的氨基酸序列
双特异性的抗-EGFR和抗-VEGF抗体的部分，也可以来自其他抗体。例如，表3提供的西妥昔单抗、尼妥珠单抗这两个抗-EGFR抗体的序列。表3.适合制备双特异性抗体的抗-EGFR抗体。
双特异性抗体的完整抗体及scFv抗体部分也可以来自其他抗体。例如，表4中提供的大量抗体的轻链/重链序列，这可以通过以制备完整抗体部分，或进一步的修改，以制备单链抗体的部分。
在一些方面中，双特异性抗体包括一个完整抗体部分，由两条轻链和两条重链组成，分别具有SEQ ID NO：7，9，11，或13中的氨基酸序列和SEQ ID NO：8，10，12，或14中的氨基酸序列。在一些方面，这些双特异性抗体的scFv部分具有EGFR特异性。
在一些方面中，双特异性抗体包括一个scFv部分，由两条轻链可变区和两条重链可变区组成，分别具有SEQ ID NO：7，9，11，或13中的氨基酸序列和SEQ ID NO：8，10，12，或14中的氨基酸序列。在一些方面，这些双特异性抗体的完整抗体部分具有EGFR特异性。
表4.适合制备双特异性抗体的完整部分或scFv部分的抗体轻链和重链
该抗体链可以修改，最多约1％、2％、5％、10％、15％、20％或25％，同时保持其活性。核苷酸序列和氨基酸序列的修改，并不影响或改变本发明抗体的上述特征。修改可以由在本领域中已知的标准技术，如定点突变和PCR介导的突变引入。保守性氨基酸取代包括氨基酸残基被具有类似侧链的氨基酸残基替换。具有类似侧链的氨基酸残基家族已在本领域中定义。这些家族包括碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)，酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)，不带电荷的极性侧链(例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、、色氨酸)，非极性侧链(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)，β-支链的侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，双特异性抗体中的预设的非必需氨基酸残基可以优选替换为具有相同的侧链家族的其他氨基酸残基。
在一些实施例中还提供了编码的多肽的多核苷酸，含有一个或多个或所有编码这些多肽的多核苷酸的DNA构建体，含有这样的多核苷酸或DNA构建的细胞。
双特异性抗体的抗原结合单元，尤其是重链可变区(VH)和/或抗体的轻链可变区(VL)可以来源于a)已知的抗表皮生长因子受体的抗体，如西妥昔单抗、帕尼单抗或尼妥珠单抗，b)来自于获得新抗体，例如使用初次免疫方法等在该领域已知方法。
双特异性抗体ScFv部分同样可以来自已知抗体的。例如，Kim等,Nature 362(1993)841-844；Warren,R.S.等,J.Clin.Invest.95(1995)1789-1797；Borgstrom,P.等,Cancer Res.56(1996)4032-4039；Melnyk,O.等,Cancer Res.56(1996)921-924).WO 94/10202、WO 98/45332、WO 2005/00900、WO 00/35956和US 2007/0141065中描述的抗-VEGF抗体。
所述双特异性抗体至少是一价，二价更好，并且可以是三价、四价或多价的。优选地，根据本发明的双特异性抗体是二价、三价或四价的。
本发明提供了一段核苷酸序列，该序列编码上述双特异性抗体。
本发明提供了一个表达载体，该表达载体包含有本发明中所述的核苷酸序列，并且能够在原核或者真核细胞中表达上述核苷酸序列。
本发明提供了一种宿主细胞系，该细胞系包含有上述表达载体，该载体能够表达本发明中的重组抗体。
本发明提供了一种原核或者真核细胞的宿主细胞系，该细胞系包含有上述表达载体。
本发明还包括根据本发明的双特异性抗体的生产方法，它包括根据本发明在原核或真核宿主细胞中表达一段核苷酸的方法和从所述细胞或细胞培养上清中回收所述双特异性抗体方法。本发明包括通过这样的重组方法获得的抗体。本发明还包括通过该双特异性抗体的纯化和制备方法，例如大小排阻层析、离子交换层析的方法或进程。
双特异性抗体的可变结构域/区或链的氨基酸序列可以是已知的抗-EGFR的抗体，包括西妥昔单抗、帕尼单抗、尼妥珠单抗或等同物。
例如，对于抗-EGFR和抗-VEGF的双特异性抗体来说，抗-EGFR和/或抗-VEGF区域和链包括抗体片断(多克隆抗体和单克隆抗体)，例如Fab，Fab'，F(ab')2，以及Fv(参见Parham,J.Immunol.131:2895-2902(1983)；Spring等,J.Immunol.113:470-478(1974)；Nisonoff等,Arch.Biochem.Biophys.89:230-244(1960))；结构域抗体(dAbs)和其抗原结合片段，包括camelid抗体(参见Desmyter等,Nature Struct.Biol.3:752(1996))；称为新抗原受体(IgNAR)的shark抗体(参见Greenberg等,Nature,374:168(1995)；Stanfield等,Science 305:1770-1773(2004))。
单克隆抗体技术可用于生产抗-EGFR和/或抗-VEGF的特异性单克隆抗体的技术。特别是在本领域公知的技术，用感兴趣的抗原，例如从靶细胞中分离到的肿瘤特异性抗原，免疫小鼠、兔或者任何其他哺乳动物来生产单克隆抗体。制备抗EGFR和/或抗-VEGF抗体的另一种方法是利用噬菌体文库的scFv(单链可变区)中，特别是人源scFv(参见Griffiths等,U.S.Pat.Nos.5,885,793和5,969,108；McCafferty等,WO 92/01047；Liming等,WO 99/06587或利用酵母选择系统筛选到的抗体结构域(参见U.S.Pat.No.7,195,595)。此外，表面重现的抗体，如在美国专利第5639641号中公开的那些，也可以使用作为可嵌合或人源化抗体。
一个特定的抗-EGFR和/或抗-VEGF抗体的选择取决于疾病的类型，靶向的细胞和组织类型。在一些实施例中，抗EGFR和/或抗-VEGF抗体是人单克隆抗体。
III.类美登素偶联
在一些实施例中，双特异性抗体可以与类美登素分子或类美登素衍生物(有时也简称为“药物”)偶联，从而靶向疾病细胞或组织的同时抑制肿瘤血管生成。这样的偶联抗体能够对抗原表达的细胞发挥细胞毒性、细胞生长抑制或免疫抑制效应。抗体药物偶联物的高亲和力确保了类美登素的细胞毒性只靶向肿瘤细胞。
一个方面，类美登素通过一个连接子与双特异性抗体连接，该连接子具有酸稳定性，肽酶组织蛋白酶非敏感性，并且不包含二硫键。这种连接子能够保持偶联分子在内吞之前的稳定性，例如防止在循环过程中，连接子和释放的有毒药物过早降解，从而最大限度地减少药物的毒性作用。在一些实施例中，偶联的类美登素连接子是N2'-去乙酰基-N2'-(6-马来酰亚氨基-1-氧代-己基)-美登素(3AA-MDC或batansine)，或它们的衍生物。
类美登素是抑制微管蛋白聚合高度细胞毒化合物(Remillard等，Science 189，1002-1005(1975))。美登素最早由Kupchan等从东非灌木Maytenus serrata分离得到(J.Am.Chem.Sci 94：1354-1356(1972))。类美登素，包括美登醇及美登醇C-3酯也可由某些微生物产生(U.S.Pat.No.4、151、042)。具有不同细胞毒性的美登醇的各种类似物也可由合成化学制备(Chem.Pharm.Bull.52(1)1-26(2004))。类美登素的实例包括美登素、MD1、MD3及MD4。美登素为一种强有力的有丝分裂抑制剂并且在实体鼠源肿瘤模型中对多种肿瘤，包括路易斯(Lewis)肺癌和B-16黑素瘤展现显著的抑制活性。据报道，美登素在浓度低至10-7μg/mL可以抑制人类急性淋巴细胞白血病C.E.M.系(Wolpert-DeFillippes等，Biochem.Pharmacol.1735-1738(1975))。业已证明，其细胞毒性比传统化疗试剂如甲氨蝶呤(methotrexate)、柔红霉素(daunorubicin)和长春新碱(vincristine)高100到1000倍(U.S.Pat.No.3、896、111)。
Ansamitocins是美登木素，具有和美登素类似的广谱有效的治疗作用。每天最低剂量在0.8克/公斤就能抑制P388白血病。Ansamitocin P3(AP3)也能够有效的杀伤多种肿瘤(参见Alkaloids,vol.2,149-204(1984)；Chem.Pharm.Bull.52(1)1-26(2004))。美登醇C-3酯与N-甲基-L-丙氨酸衍生物被发现比相应的简单的羧酸酯具有更强的细胞毒性，比他们的相对应的N-甲基-D-丙氨酸差向异构体高100倍以上的细胞毒性(U.S.Pat.Nos.4,137,230；4,260,608；Kawai等,Chem.Pharm.Bull.32:3441-3451(1984)；Widdison等,J.Med.Chem.49:4392-4408(2006))。
由于其高毒性性质及体外抗多种癌细胞系活性，类美登素有望能治疗多种不同的癌症。然而，其毒性也使得这类化合物在人类临床试验中不是令人满意的，因为其副作用对很多患者是无法忍受的(Issel等，CancerTreat.Rev.199-207(1978))。因此，将高毒性化合物偶联到抗体以抗体靶向到肿瘤组织可降低毒性副作用。现已有多种抗体药物偶联体进入临床或临床前研究。
抗体药物偶联体(ADC)由三个关键元件组成：抗体、连接子和药物。抗体和药物的选择取决于具体疾病，其对药物的有效性和安全性有重大影响。连接子的稳定性及药物偶联到抗体的方法对ADC药物开发成功或失败起决定性作用。
抗体药物偶联体的疗效部分取决于多种参数的组合，不仅包括抗体的特异性和药物的药效强度，而且包括连接子的稳定性或其对断裂的敏感性、细胞表面激发内化、转运和随后有效细胞毒性“弹头”的释放。因此，即便针对同一靶点，不同的药物或不同的连接子或针对同一靶标的不同抗体，ADC的应用性和有效性显著不一样。
在一些实施例中，提供了一种类美登素与单特异性抗体，双特异性抗体，多特异性抗体偶联的方法，其中抗体首先被还原，轻链和重链被分离，类美登素化合物被通过接子偶联到轻链，在氧化条件下偶联的轻链与重链混合。这种偶联方法拟提供链特异的偶联抗体分子，对Fc结构域的修饰是最小的，从而达到对Fc结构域的功能影响最小化，包括ADCC活性和FcRn结合的。
本发明提供了式Ia、Ib或Ic的抗体连接子美登素药物衍生物的偶联体：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中
X为氢或卤素；
Y选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基和C(＝O)R5；
R1选自H、OH、OC(＝O)R5和OR5基团；
R2为H或C1-C6烷基；
R3为甲基、-CH2OH或-CH2OC(＝O)R6；
R4为-OH或-SH；
R5为C1-C6烷基或苄基；
R6为C1-C6烷基、苯基或苄基；
R7为氢或氨基酸侧链；
R8为氢或者C1-6烷基；
n为0、1、2、3、4、5、6、7或者8。
p为3、4、5、6、7、8、9或者10；
BsAb为双特异性抗体。
一个方面，所述的类美登素的化合物通过一个连接子与双特异性抗体连接，该连接子具有酸稳定性，肽酶组织蛋白酶非敏感性，并且不包含二硫键。
适于偶联连接基团的类美登素包括美登醇和美登醇类似物以及可以按照已知方法从天然源分离、使用生物技术制造(见如：Yu等，99PNAS 7968-7973(2002)),或按照已知方法合成制备(见如：Cassady等，Chem.Pharm.Bull.52(1)1-26(2004))。
适合的美登醇类似物的实例包括：
(1)C-19-去氯(美国专利号4256746)(由安丝菌素P2经氢化锂铝还原制备)；
(2)C-20-羟基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美国专利号4361650和4307016)(使用链霉菌(Streptomyces)或放线菌(Actinomyces)去甲基或使用氢化锂铝(LAH)去氯制备)；
(3)C-20-去甲氧基、C-20-酰氧基(-OCOR)、+/-去氯(美国专利号4294757)(使用酰氯通过酰化制备)；
(4)C-9-巯基(美国专利号4424219)(通过美登醇与H2S或P2S5反应制备)；
(5)C-14-羟甲基(CH2OH)或酰氧甲基(CH2OC(＝O)苯基或CH2OC(＝O)(C1-C5烷基))(美国专利号4331598)(从诺卡氏菌(Nocardia)制备)；
(6)C-15-羟基/酰氧基(美国专利号4364866)(美登醇经由链霉菌(Streptomyces)转化而成)；
(7)C-15-甲氧基(美国专利号4313946和4315929)(从Trewia nudlflora分离得到)；
(8)C-18-N-去甲基(美国专利号4362663和4322348)(美登醇经由链霉菌(Streptomyces)去甲基制备)；以及
(9)4、5-去氧(美国专利号4371533)(美登醇经由三氯化钛/氢化锂铝还原制备)。
取决于连接子类型，美登醇上很多位置可用作连接位置。例如，对于形成酯键，C-3位置具有羟基、C-14位置为羟甲基修饰、C-15位置为羟基修饰以及C-20位置具有羟基都是合适的。在一些实施例中，连接处为C-3位置。
在一些实施例中，本发明提供了式Ia、Ib或Ic所示的美登素通过连接子偶联双特异性抗体：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中
X为氢或卤素；
Y选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基和C(＝O)R5；
R1选自H、OH、OC(＝O)R5和OR5基团；
R2为H或C1-C6烷基；
R3为甲基、-CH2OH或-CH2OC(＝O)R6；
R4为-OH或-SH；
R5为C1-C6烷基或苄基；
R6为C1-C6烷基、苯基或苄基；
R7为氢或氨基酸侧链；
R8为氢或者C1-6烷基；
n为0、1、2、3、4、5、6、7或者8。
p为3、4、5、6、7、8、9或者10；
BsAb为双特异性抗体。
在一些实施例中，式Ia的化合物为
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中BsAb为双特异性抗体。
在一些实施例中，式Ib或Ic的化合物为
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中BsAb为双特异性抗体。
在一些实施例中，连接子通常是二硫键。这种连接子能够保持偶联分子在内吞之前的稳定性，例如防止在循环过程中，连接子和释放的有毒药物过早降解，降低了药物分子对非靶点细胞的毒性。
式Id作为二硫键作为基础的连接体在某些细胞中可能更容易被释放的例子之一：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中
X为氢或卤素；
Y选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基和C(＝O)R5；
R1选自H、OH、OC(＝O)R5和OR5基团；
R2为H或C1-C6烷基；
R3为甲基、-CH2OH或-CH2OC(＝O)R6；
R4为-OH或-SH；
R5为C1-C6烷基或苄基；
R6为C1-C6烷基、苯基或苄基；
R7为氢或氨基酸侧链；
R8为氢或者C1-6烷基；
n为0、1、2、3、4、5、6、7或者8。
p为3、4、5、6、7、8、9或者10；
BsAb为双特异性抗体。
在某些实例中，式Id的一个特定的化合物实例为IId：
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中BsAb为双特异性抗体。
具有连接基团可偶联到抗-E/V双特异性抗体的美登素药物衍生物或类美登素组分也可由其它合适的细胞毒试剂例如：auristatin、DNA小沟结合试剂、DNA小沟烷基化试剂、烯二炔(enediyne)、lexitropsin、duocarmycin、紫杉烷(taxane)、嘌呤霉素(puromycin)、多拉司他汀(dolastatin)及长春花碱(vinca alkaloid)所取代。其它合适的细胞毒试剂包括抗微管蛋白试剂如：auristatin、长春花碱(vinca alkaloid)、竹叶草霉素(podophyllotoxin)、紫杉烷(taxane)、浆果赤霉素衍生物(baccatinderivative)、cryptophysin、类美登素(maytansinoid)、combretastatin、或尾海兔素(dolastatin)。在一些实施例中，细胞毒试剂为AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、auristatin E、长春新碱(vincristine)、长春花碱(vinblastine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)、VP-16、喜树碱(camptothecin)、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、埃博霉素A(epothilone A)、埃博霉素B(epothilone B)、诺考达唑(nocodazole)、秋水仙碱(colchicines)、colcimid、雌氮芥(estramustine)、西马多丁(cemadotin)、圆皮海绵内酯(discodermolide)、美登素(maytansine)、DM-1、DM-3、DM-4或eleutherobin。合适的免疫抑制剂包括如丙氧鸟苷(gancyclovir)、依那西普(etanercept)、环孢霉素(cyclosporine)、他克莫司(tacrolimus)、雷柏霉素(rapamycin)、环磷酰胺(cyclophosphamide)、咪唑硫嘌呤(azathioprine)、霉酚酸酯(mycophenolatemofetil)、甲氨蝶呤(methotrexate)、氢化可的松(cortisol)、醛甾酮(aldosterone)、地塞米松(dexamethasone)、环氧酶抑制剂(cyclooxygenase inhibitor)、5-脂氧合酶抑制剂(5-lipoxygenase inhibitor)或白三烯受体拮抗剂(leukotriene receptorantagonist)。在一些实施例中，细胞毒试剂为AFP、MMAF、MMAE、AEB、AEVB、auristatin E、紫杉醇(paclitaxel)、多西紫杉醇(docetaxel)、CC-1065、SN38、拓扑替康(topotecan)、吗啉代阿霉素(morpholino-doxorubicin)、根霉素(rhizoxin)、氰基吗啉代阿霉素(cyanomorpholino-doxorubicin)、尾海兔素-10(dolastatin-10)、棘霉素(echinomycin)、combretatstatin、卡里奇霉素(calicheamicin)、美登素(maytansine)、DM-1、DM-3、DM-4或纺锤霉素(netropsin)。
具有连接基团能偶联双特异性抗体的类美登素衍生物或类美登素连接子抗原结合单元偶联物的类美登素组分也可由其它合适的免疫抑制剂替代例如：丙氧鸟苷(gancyclovir)﹑依那西普(etanercept)﹑环孢霉素(cyclosporine)﹑他克莫司(tacrolimus)﹑雷柏霉素(rapamycin)﹑环磷酰胺(cyclophosphamide)﹑咪唑硫嘌呤(azathioprine)﹑麦考酚酸酯(mycophenolate mofetil)﹑氨甲喋呤(methotrexate)﹑氢化可的松(cortisol)﹑醛固酮(aldosterone)﹑地塞米松(dexamethasone)﹑环氧酶抑制剂(cyclooxygenase inhibitor)﹑5-脂氧合酶抑制剂(5-lipoxygenase inhibitor)或白三烯受体拮抗剂(leukotriene receptor antagonist)所取代。
偶联体的制备方法
双特异性抗体可以用适当的双官能团修饰试剂修饰。在一些实施例中，含有巯基(SH)的基团可以引入到氨基酸残基侧链，如赖氨酸侧链。例如，赖氨酸残基的氨基可以与2-亚氨基硫烷(Traut’s Reagent)或与3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(DPDB)等反应接着用还原剂如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原转化成含巯基基团。
可取代赖氨酸残基上侧链氨基的含巯基基团的非限制性实例包括-NHC(＝NH)(CH2)nSH和-NHC(O)(CH3)nSH，其中n为1、2、3、4、5或6。当含巯基基团引入氨基酸残基，氨基酸残基被指为巯基化氨基酸。例如，当赖氨酸侧链氨基转化成含巯基基团，赖氨酸残基被指为巯基化赖氨酸。双特异性抗体上引入的游离巯基个数可以变化，比如在1和大约20之间，或者5到15，以及或者5到12。连接子或药物-连接子可以与双特异性抗体上巯基化赖氨酸残基的游离巯基(SH)成键。在一些实施例中，与双特异性抗体上巯基化赖氨酸残基成键的连接子或连接子-药物个数在1和大约10之间。在一些实施例中，如此成键个数至少是1，或至少为2、3、4、或5。在一些实施例中，如此连接的个数为不超过10，或者不超过9、8、7、6、5或4。在一些实施例中，每个双特异性抗体平均与3到5个药物分子偶联。
在另一实施例中，药物-连接子可以通过结合到半胱氨酸残基上的巯基偶联到双特异性抗体上。每个双特异性抗体通常包含许多半胱氨酸，但是它们中很多，如果并非所有，彼此形成二硫键，因此无法用于如此偶联。在一些实施例中，因此，双特异性抗体上的一个或一个以上的二硫键通过与还原剂如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)反应而断裂形成游离巯基(SH)。该反应可以跟踪和/或控制以便足够数量的二硫键断裂而能偶联，同时维持足够数量的二硫键而保持双特异性抗体的结构稳定性。
如上所述，类美登素或类美登素药物衍生物可以通过连接子偶联至轻链上，形成链特异性的药物偶联。在一些实施例中，轻链(短链)可以用适当的双官能团修饰试剂修饰。在一些实施例中，含有巯基(SH)的基团可以引入到氨基酸残基侧链，如赖氨酸侧链。例如，短链上赖氨酸残基的氨基可以与2-亚氨基硫烷(Traut’s Reagent)或与3-(2-吡啶二硫代)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(SPDP)、4-(2-吡啶二硫代)丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(DPDB)等反应接着用还原剂如2-巯基乙醇、二硫苏糖醇(DTT)或三(2-羧乙基)膦(TCEP)还原转化成含巯基基团。
在一些实施例中，与双特异性抗体上巯基化赖氨酸残基成键的连接子或连接子-药物个数在1和大约10之间。在一些实施例中，如此成键个数至少是1，或至少为2、3、4或5。在一些实施例中，如此连接的个数为不超过10，或者不超过9、8、7、6、5或4。在一些实施例中，每个双特异性抗体平均与3到5个药物分子偶联。
在一些实施例中，药物分子通过赖氨酸和半胱氨酸混合残基偶联到双特异性抗体。
双特异性抗体可以通过修饰，引入偶联位点。比如，位点特异突变以便引入额外的巯基化赖氨酸或半胱氨酸残基而允许适当的偶联。氨基酸修饰方法为该技术领域众所周知。修饰过的双特异性抗体然后可以用实验方法考察其稳定性和其抗原结合性能。在一些实施例中，至少一个巯基化赖氨酸或半胱氨酸通过如此修饰而引入。在另一实施例中，至少两个巯基化赖氨酸或半胱氨酸通过如此修饰而引入。
双特异性抗体上药物负载可以改变，这取决于很多因素如药物的效力、大小、双特异性抗体的稳定性、双特异性抗体上可用的能偶联的基团等。在一些实施例中，1到10个类美登素药物分子和1个双特异性抗体分子偶联。在一些实施例中，平均3到5个类美登素药物分子和1个双特异性抗体分子偶联。在一些实施例中，平均3.5个类美登素药物分子和1个双特异性抗体分子偶联。
IV.治疗方案
本发明提供了一种治疗增殖、炎症或免疫疾病或相关病症的方法，该方法需要施用有效量的如本文所述的双特异性抗体。在某些方面、这种疾病是癌症、如膀胱肿瘤、肺癌、乳腺癌、黑色素瘤、结肠癌和直肠癌、非霍奇金淋巴瘤、子宫内膜癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、白血病、甲状腺癌、肺癌、食道癌、头部和颈部癌症。
双特异性抗体可以配制成药物组合物和适于病人所选择的给药途径的各种给药形式，即，口服或静脉内、肌内、局部或皮下等肠胃外给药。化合物的量会有所不同，取决于药物连接体的性质、药物负载、细胞表面引起内化作用的程度、药物的转导和释放、疾病的种类、病人的情况，如年龄、性别、体重等，并可以通过本领域公知的方法来确定，例如，见美国专利4938949，将最终由主治医生或临床医生来决定。
一般，合适的剂量范围是约0.1-200毫克/千克，例如，连续52周中每1-4周每天静脉输注30-90分钟，每千克体重用药量为0.5毫克/千克-50毫克/千克、1.0毫克/千克-25毫克/千克、1.5毫克/千克-15毫克/千克或者1毫克/千克-10毫克/千克在一些实例中，剂量从约1.0毫克/天-100毫克/天，例如，从约2毫克/天至约5克/天，约10毫克/天至约1克/天，约20-500毫克/天，或在约50-100毫克/天。本发明化合物可以每日、每月用药，例如一天一次，持续用药1-3周或一个月。另一方面，本发明化合物可以周期给药，如先每天给药约5-21天，接下来1-7天不用药，如此，循环给药。
在另一些实施例中，初始给药量为1-4mg/kg静脉输注30-90分钟、接下来的52周里每1-4周经脉输注30分钟以上，药量为1-2mg/kg。在另一些实施例中，初始给药量为2-10mg/kg静脉输注30-90分钟，接下来的52周里每1-4周经脉输注30-90分钟，药量为1-5mg/kg。
在一些实施例中，所述化合物与其他疗法联合应用。例如，所述化合物可与另外一种治疗方法一起应用于肿瘤的治疗，例如，放射治疗或本领域中已知的另一种抗癌剂。
V.药物组合物
另一方面，本发明提供了一些药物组合物，包括如本文所述的一种或多种组合物，及其一种或多种药学上可接受的载体。所述组合物应包含至少0.1％的双特异性抗体。组合物的百分比可以改变，可能是一个给定的单位剂量组成的重量的2-90％。所述治疗效用的组合物中的活性化合物的量需要达到有效剂量水平。
适合于注射或输液的组合物可以包括药学上可接受的液体载体或赋形剂，如无菌水溶液或分散液，或适于临时配制成无菌注射或难溶溶剂，任选地包封在脂质体中的溶液或分散液含有活性成分的无菌粉末。药物组合物的其他形式包括外用制剂，如凝胶、软膏、霜剂、洗剂或贴剂等。所述药物组合物，除本文中提到的以外，还包括本领域公知。合适的药学上可接受的载体；例如，雷明顿，药剂科学和实践，第20版，2000年，利平科特·威廉斯&威尔金斯，(Editors:Gennaro,A.R.等)。
在另一个实施例中，本发明提供了一种制备药物组合物的方法，其特征在于：包括所述双特异性抗体的混合物及其药学上可接受的载体。混合的活性成分与药学上可接受的载体的方法在本领域中是公知技术，例如，将活性化合物与液体或细碎的固体载体或两者按规定比例均匀混合，然后，如果有必要，将所得混合物做成所需的形状。
下面实施例进一步阐述本发明的某些方面和帮助熟悉该技术领域的科技人员施行本发明。这些实施例绝不是限制本发明的范围。
具体实施方式
实施例1
重组抗-EGFR和抗-VEGF双特异性抗体(抗体906)的构建及表达
用于抗体表达的宿主细胞株为CHO-K1细胞的一种衍生细胞系，悬浮生长于CD-CHO培养基中。重组双特异性抗体(被称为“抗体906”)的稳定细胞株构建过程如下：首先用常规的分子生物学方法构建含抗体基因的表达载体，抗VEGF的单链抗体scFv被设计在抗EGFR抗体(被称为“抗体206”)的重链C末端。双特异性抗体的结构如图1A中所示。这些链的氨基酸序列如表1和表2所示。然后将构建好的质粒进行酶切线性化。
将处于对数生长期的宿主细胞离心，并重悬于新鲜的CD-CHO培养基(细胞密度为1.43×107个/毫升)。取600μL上述细胞悬液和40μg已线性化的质粒混合均匀，加入电击杯中电击转化，Bio-rad电转化仪的参数设定为：电容：960μFD，电压：300V，电击时间15-20ms。把电击后的细胞立即重悬于500mL 37℃预热的CD-CHO培养基，每孔100μl分装于96孔板，2-3天后补加100μl的筛选培养基。2-3周后测定96孔板细胞培养上清中的抗体浓度，并将表达水平较高的克隆从96孔板转移到24孔板，待细胞生长到一定数量，再次把抗体表达量高的细胞转入到6孔板，最后保留20-30个高表达细胞株转入摇瓶做进一步评价。最终确定5-8个表达量最高的克隆进行亚克隆和下一步的抗体生产表达检测。
经过几轮的筛选以后，我们得到的双特异性抗体表达细胞株的产量能够达到1g/L，比其相同结构的对照双特异性抗体2016(少于0.2g/L)高很多倍，产量与原始抗体206相当(图1B)。并且906抗体的产量也是之前报道过的类似结构的双特异性抗体(16-87mg/L)的11-60倍(Michaelson,J.S.等,mAbs1(2):128-141(2009))。
实施例2
重组双特异性抗体的表达及纯化抗体纯化过程简单描述如下：细胞大规模培养2周后，通过低速离心使细胞和培养基分离，将收获的上清进一步高速离心得到澄清的料液。重组抗体通过亲和层析法(Protein A)和离子交换两步法进行纯化，纯化中使用的介质分别是GE公司生产的Mab Select SuRe和Capto S。分离纯化的抗体通过SDS-PAGE法(图2A)和分子筛层析鉴定(图2B)。SDS-PAGE结果显示双特异性抗体分子906条带单一特异，而对照双特异性抗体分子2016条带弥散，多聚化严重。分子筛结果也进一步证实了906抗体几乎没有多聚体。所有的这些结果都说明906抗体分子能够在哺乳动物细胞中能够稳定高表达。
实施例3
差式热量扫描仪(Differential scanning calorimetry、DSC)检测
为了研究双特异性抗体的热转化温度，我们运用毛细管差式热量扫描仪来检测906分子各个结构域的热解折叠温度。仪器型号Nano DSC，毛细管样品池和参比池的体积均为0.300mL，加热速率为1℃/min，10min预平衡时间，过滤周期：10秒。从图3A的实验结果中可以看出906分子有三个熔解峰，第一个峰为scFv结构域的熔解峰，Tm值为62.7℃；第二个峰为CH2熔解峰，Tm值为71.5℃；第二个峰为Fab/CH3熔解峰，Tm值为82.5℃。以上数据表明906分子整体结构比较稳定，各个结构域中的最低Tm值也有62.7℃。
实施例4
热稳定性试验
将纯化后的抗体配置成浓度为8mg/mL的制剂溶液，加入100μL到PCR小管中，PCR仪加热90min，温度区间为50-70℃，然后冷却到室温。将加热后的样品4℃离心2000rpm，20min。离心后的上清取出，4℃保存，用于下一步ELISA检测。配置VEGF包被液(1μg/mL)，向每个反应孔中加入100μL VEGF包被液，4℃包被过夜，BSA封闭。将待检测的样品1：16000稀释后加入包被好的ELISA板中孵育过夜，加入二抗，洗板8次后显色。将检测到的样品浓度与4℃保存的样品进行对比，计算出相对VEGF亲和力，最后利用EXCEL绘制成曲线(图3B)。热稳定性结果显示：当温度增加55℃时，抗体开始发生变性，抗体对抗原的亲和力降低。906抗体亲和力降低50％时的温度(T50)为59.3℃，当温度上升到61℃时，906大部分发生了沉淀，完全变性。
实施例5
抗原抗体结合测试(ELISA法)：
配置VEGF包被液(1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL)，向每个反应孔中加入100μL VEGF包被液，4℃包被过夜。配置3％BSA封闭液，将包被液甩干，向每个反应孔中加入200μL封闭液，37℃孵育2h，甩干ELISA板。将906、贝伐珠单抗样品配置成1.25μg/mL的起始浓度，然后作2倍梯度稀释，一共6个梯度。向每个反应孔中加入100μL的稀释液、37℃孵育1h，甩干ELISA板。向每个反应孔中加入100μL酶标二抗(1:10000稀释)、37℃孵育1h，甩干ELISA板。向每个反应孔中加入250μL PBST后甩干ELISA板，重复洗板8次。向每个反应孔中加入100μL底物显色液，37℃孵育15-30min，酶标仪读数(405nm)。以抗体稀释度为横坐标，以A405值为纵坐标绘制曲线，找到A405最大反应值一半对应的抗体浓度，即为[Ab]t，按照下列公式计算单抗的亲和常数，即Kaff值。Kaff＝(n-1)/2(n[Ab’]t-[Ab]t)。式中t代表测定时的温度，n＝[Ag]t/[Ag’]t，[Ag]t表示高浓度抗原浓度，[Ag’]t表示低浓度抗原浓度，[Ab]t表示高浓度抗原包被时对应的抗体浓度，[Ab’]t表示低浓度抗原包被时对应的抗体浓度。EGFR亲和力检测试验步骤参考VEGF如上步骤，简要描述如下：配置EGFR包被液(1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL)，向每个反应孔中加入100μLEGFR包被液，4℃包被过夜，BSA封闭，一抗孵育(906、206起始浓度为2.5μg/mL，2倍梯度稀释)，加入二抗，洗板显色。906是同时靶向细胞表面抗原EGFR和细胞因子VEGF的双特异性抗体，试验结果显示，与靶向EGFR的亲本抗体206相比，906对EGFR的亲和力有2.07×109下降到5.7×108；与靶向VEGF的贝伐珠单抗相比，亲和力相当，仅由6.59×108下降到2.53×108，仍然维持在108左右(图4A)。
实施例6
流式细胞仪检测不同抗体与细胞表面EGFR抗原亲和力
MDA-MB-468人乳腺癌细胞、A431人皮肤鳞癌细胞、A549人肺腺癌细胞、A673人横纹肌瘤细胞在含10％FBS的DMEM-F12培养基中培养。取适量胰酶消化细胞，用含血清培养基终止胰酶消化，800rpm，5min离心细胞，PBS洗涤两次，计数，每管1×106个细胞。双特异抗体906，单抗206，无关对照抗体利妥昔单抗单抗，分别稀释到浓度为10μg/mL，每管细胞中加入300μL抗体，4℃孵育1h。一抗孵育后的细胞液，用PBS洗涤两次，800rpm离心5min，加入荧光二抗，4℃孵育0.5h。二抗孵育后的细胞液，用PBS洗涤两次，800rpm离心5min，将沉淀轻轻吹打悬浮，取100μL上样，流式细胞仪检测。在上述的四种细胞系里，MDA-MB-468及A431是EGFR高表达细胞株，对EGFR信号通路调控敏感；A549是EGFR中表达细胞株并且EGFR信号通路中的K-RAS基因突变，对EGFR调控不敏感；A673是EGFR低表达细胞株，对EGFR调控同样不敏感。实验结果显示(图4B)，906与206对EGFR高表达细胞株MDA-MB-468及A431具有相同的亲和力，而阴性对照利妥昔单抗均不具有亲和力；906与206对EGFR中表达或低表达的细胞株A549、A673亲和力较低，这说明我们设计的906抗体与肿瘤细胞表面的EGFR具有特异的高亲和力。
实施例7
细胞增殖抑制试验
MDA-MB-468人乳腺癌细胞、A431人皮肤鳞癌细胞、A549人肺腺癌细胞、A673横纹肌瘤细胞在含10％FBS的DMEM-F12培养基中培养。取适量胰酶消化细胞，用含血清培养基终止胰酶消化，细胞离心，计数，以每孔4000个细胞，铺96孔板。铺板24h后，向每个反应孔中分别加入100μl不同浓度抗体，抗体起始浓度为15μg/mL，2倍梯度稀释，共10个梯度。供检测的抗体为双特异抗体906、单抗206、贝伐珠单抗、利妥昔单抗(为无关抗体对照)、混合单抗贝伐珠单抗+206。药物处理72h后，向每个反应孔中加入10μL cck8检测试剂，培养2h后，在酶标仪450nm处读数，根据酶标仪读数绘制出细胞增殖抑制曲线图。在上述的四种细胞系里，MDA-MB-468及A431是EGFR高表达细胞株，对EGFR信号通路调控敏感；A549是EGFR中表达细胞株并且EGFR信号通路中的K-RAS基因突变，对EGFR调控不敏感；A673是EGFR低表达细胞株，对EGFR调控同样不敏感。实验结果显示(图5)，906与206抗体具有相同的依赖EGFR信号通路的细胞杀伤作用，而贝伐珠单抗和阴性对照利妥昔单抗均不具有细胞杀伤作用，与预期实验结果相同，这说明我们设计的906对EGFR高表达的细胞株具有良好的肿瘤杀伤作用。
实施例8
Balb/C小鼠体内药代动力学研究
雌性BALB/C小鼠(4-8周龄)6只，尾静脉注射2mg/kg 906双特异性抗体后，连续取血(眼静脉采血/眼眶采血)，每次40μL全血，离心收集20μL血清，保存在－80℃。取血时间点为：0h、10min、30min、1h、3h、7h、24h、48h、96h、168h、240h。取血结束后，4℃融化血清，1：200倍稀释血清，ELISA检测测试药在血清中的浓度。ELISA检测方法采用特异抗原包板检测法，简要描述如下：配置VEGF或者EGFR包被液(1ug/ml)，向每个反应孔加入100μL包被液，4℃包被过夜，BSA封闭，加入待检测血清样本孵育(VEGF检测1：200稀释；EGFR检测1：500稀释)，加入二抗，洗板显色，对照标准曲线，计算出血清中的906抗体浓度。实验结果显示(图6)：运用VEGF包被检测得到906在小鼠血清中的半衰期为207.94小时，而当EGFR包板检测时的半衰期为220.9小时。所以906在小鼠血清中的半衰期大约在200个小时左右，是一个非常稳定的抗体。
实施例9
A431体外移植瘤实验
人皮肤鳞癌A431细胞是EGFR高表达细胞株，为了观察双特异性抗体906对该细胞株体外移植瘤的杀伤作用，我们进行了A431体外移植瘤实验。首先培养A431细胞至对数生长期，制备细胞悬液。然后取4-6周龄的雌性裸鼠，于其右腋注射100μL含有4×106细胞悬液。当肿瘤体积达到80-200mm3时开始分组给药，每组12只。各种抗体均按每公斤体重5mg抗体量的剂量每三天一次总共给药8次，给药方式是腹腔注射，注射体积为每次100μL。肿瘤体积每三天用游标卡尺测量一次，计算肿瘤体积(V＝π/6×a×b2，a为小鼠皮下肿瘤最长径，b为最短径)，计算各组平均值，绘制肿瘤生长曲线。最后一次给药并测定肿瘤体积大小后(第一次给药24天后)，动物被立即以无痛至死，肿瘤被剥离并称重。实验结果显示(图7A)与对照组相比，206和贝伐珠单抗均能明显的抑制肿瘤生长，当两者联合用药时，抑制效果明显增强，并且我们设计的双特异性抗体906抑制肿瘤的效果与联合用药相当，这说明双特异性抗体906能有效的抑制EGFR阳性肿瘤的生长。
实施例10
A673体外移植瘤实验
人横纹肌瘤细胞A673是EGFR阴性细胞株，为了观察双特异性抗体906对该细胞株体外移植瘤的杀伤作用，我们进行了A673体外移植瘤实验。首先培养A673细胞至对数生长期，制备细胞悬液。然后取4-8周龄的雌性裸鼠，于其右腋注射100μL含有2×106细胞悬液，接种后24小时将动物随机分为3组，每组13-15只动物。分组后马上开始给药，各种抗体均按每公斤体重0.5mg抗体量的剂量每周三次总共给药9次，每次给药前称量动物体重以调整给药量。给药方式是腹腔注射，注射体积为每次100μL。肿瘤体积每三天用游标卡尺测量一次，计算肿瘤体积(V＝π/6×a×b2，a为小鼠皮下肿瘤最长径，b为最短径)，计算各组平均值，绘制肿瘤生长曲线。最后一次给药并测定肿瘤体积大小后(第一次给药24天后)，动物被立即以无痛至死，肿瘤被剥离并称重。因为A673是EGFR阴性细胞株，所以我们只比较906和贝伐珠单抗抑制肿瘤的效果，实验结果显示(图7B)双特异性抗体906和贝伐珠单抗均能明显的抑制EGFR阴性肿瘤的生长，并且治疗效果相当。
实施例11
906双特异性抗体及其药物偶联物的血管内皮细胞活性检测人脐静脉内皮细胞(HUVEC)需要VEGF的刺激才能生长，因此我们测定906抗体以及其药物偶联物对HUVEC细胞的生长抑制活性。以每孔4000个HUVEC细胞，铺于96孔板中。50μL相关浓度的待测抗体和50μL的VEGF(30ng/mL)混合，孵育1小时，然后加入到96孔板中。测定培养基为10％FBS的DMEM-F12培养基。药物处理72小时后，向每个反应孔中加入10μL cck8检测试剂，培养8小时后，在酶标仪450nm处读数，根据酶标仪读数绘制出细胞增殖抑制曲线图。每个样品浓度都做3个重复，每次试验重复两次。实验结果显示906抗体和贝伐珠单抗对HUVEC细胞的生长都展现了剂量依赖的关系(图8)。906抗体的半数效应值(EC50＝0.025μg/mL)是贝伐珠单抗(EC50＝0.157μg/mL)的6倍左右。
实施例12
SMCC-MDC与906双特异性抗体的偶联
药物连接子SMCC-MDC按照以下反应制备：在N、N-二异丙基(DIEA)存在下，3-巯基丙酸(MPr)与N-琥珀酰亚胺4-(马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-甲酸叔丁酯(SMCC)反应产生MPr-SMCC，产率为95％；Fmoc-N-Me-Ala-MDC通过CH3CN上的碱基哌啶的作用，生成N-Me-L-Ala-MDC；在OFA偶联剂EDC的存在下，浓缩的N-Me-L-Ala-MDC再与MPr-SMCC反应生成预期的偶联产物SMCC-MDC，两步反应产率为60-70％。完整的906抗体用溶液A(50mM磷酸钾，50mMNaCl和2mMEDTA，pH为6.5)稀释至2.5mg/mL。加入SMCC-MDC，使SMCC-MDC与抗体的比率为7:1(摩尔当量)。然后，加入DMA至总体积的15％，室温搅拌4小时使反应物混匀。多余的未反应的或水解的试剂和过量的SMCC-MDC使用Sephadex G-25(GE货号：17-0033-10)在pH值7.4的磷酸盐缓冲液(水溶液)平衡的凝胶过滤柱，纯化得到D-Lmcc-抗EGFR抗体。然后将偶联物用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(水溶液)中透析过夜，然后0.22微米的过滤器过滤，4℃保存。轻链特异性的药物偶联方法简单描述如下：完整的906抗体被稀释成1mg/mL(150mM PB pH7.0),向该溶液中缓慢加入DTT溶液，使DTT的终浓度为20nM，室温下反应30分钟，将上述反应产物过Zenix TM-300柱，分别收集轻链峰和重链峰。超滤浓缩轻链，调整轻链浓度为2.5mg/mL(50mM磷酸钾，50mM NaCl和2mM EDTA，pH为6.5)。轻链与SMCC-MDC偶联方法与上述完整906抗体与SMCC-MDC偶联方法相同。将收集的重链溶液过protein A柱，然后把偶联好的过量轻链药物偶联物上样过柱，在柱上复性完毕，用0.1mM Gly-HCL(pH 3.0)缓冲液洗脱。将该洗脱液用pH为7.4的磷酸盐缓冲液(水溶液)中透析过夜，然后0.22微米的过滤器过滤，4℃保存。每个抗体最终共轭SMCC-MDC的分子的数目通过测定共轭物在252和280nm处的吸光度，这两个波长处SMCC-MDC和抗体使用公知的消光系数。美登素药物与抗体的比率为3.8:1.0。考虑到HUVEC细胞表达极微量的EGFR蛋白，906-MDC偶联物的作用效果在该模型中并不会强于906抗体，实验结果显示当待测抗体浓度均为0.4μg/mL时，906-MDC偶联物对HUVEC细胞生长的抑制效果和906抗体几乎相同，与预期吻合(图9)
尽管已经联系具体实施例及其实施例描述了本发明，但明显的是，本领域技术人员能够看出许多替代方案、修改和变动。相应地，旨在涵盖落在所附权利要求的精神和宽范围内的所有这样的替代方案、修改和变动。
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请均全文经此引用并入本说明书，就像各个出版物、专利或专利申请专门且逐一被指出经此引用并入本文。

Claims (9)

1.一种双特异性抗体，其组成如下：
(a)第一和第二条多肽，每一条多肽都包括一个免疫球蛋白轻链；以及(b)第三和第四条多肽，每一条多肽从N末端到C-末端都包括，可变区，恒定区，和一个单链可变结构域(scFv)，
其特征在于所述第一和第二条多肽，与第三和第四条多肽的一个重链可变区形成特异性地识别EGFR的抗原结合位点；每一个scFv能够特异性地识别VEGF。
第一和第二条多肽为SEQ ID NO:1氨基酸序列；
第三和第四条多肽为SEQ ID NO:2氨基酸序列。
2.一种双特异性抗体，由两条轻链和两条长链组成，其中轻链的氨基酸序列为SEQ IDNO:1，长链氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
3.一种如权利要求2所述的双特异性抗体，该抗体包含由两条轻链和两条重链组成的完整抗体，其中重链的恒定区与一个单链可变结构域(scFv)融合形成一条长链，这里完整的抗体具有EGFR特异性，而一个单链可变结构域scFv具有VEGF特异性。
4.权利要求1-3中任一项的抗体，该抗体与类美登素化合物偶联，具有式Ia、Ib或Ic结构，
或其药学上可接受的盐或溶剂合物，
其中
X为氢或卤素；
Y选自氢、C1-C6烷基、C3-C6环烷基和C(＝O)R5；
R1选自H、OH、OC(＝O)R5和OR5基团；
R2为H或C1-C6烷基；
R3为甲基、-CH2OH或-CH2OC(＝O)R6；
R4为-OH或-SH；
R5为C1-C6烷基或苄基；
R6为C1-C6烷基、苯基或苄基；
R7为氢或氨基酸侧链；
R8为氢或者C1-6烷基；
n为0、1、2、3、4、5、6、7或者8。
p为3、4、5、6、7、8、9或者10；
BsAb为双特异性抗体。
5.根据权利要求4所述的抗体，其特征在于，所述类美登素的化合物通过一个连接子与双特异性抗体连接，该连接子具有酸稳定性，肽酶组织蛋白酶非敏感性，并且不包含二硫键。
6.一种组合物，其含有权利要求1-5任一所述的抗体，以及一种或多种药学上可接受的载体。
7.一种多聚核苷酸，编码SEQ ID NO：2中氨基酸的核苷酸序列。
8.一种转基因细胞，其含有如权利要求7所述的多聚核苷酸。
9.权利要求1-5中任一项所述的抗体在制备治疗VEGF相关疾病以及EGFR阳性的癌症患者的药物中的应用。
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