CN108059681B - 一种抗vegf及egfr的双特异抗体融合蛋白及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白，所述融合蛋白由抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体组成，其具有能够分别识别VEGF和EGFR的两组独特的CDR区序列，对VEGF和EGFR具有高度特异的的识别能力，且具有优异的肿瘤结合效果和肿瘤定位效应。本发明还公开了偶联了指示剂的所述双特异抗体融合蛋白在制备体外肿瘤诊断试剂和体内生物成像剂中的应用。偶联上核磁和荧光显像剂的双特异抗体融合蛋白，可以在体内进行肿瘤成像。而且该抗体融合蛋白的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。

Description

一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白及其应用
技术领域
本发明公开了一种抗体蛋白，更具体地，本发明公开了一种双特异抗体融合蛋白。
背景技术
肿瘤是威胁人类生存最大的疾病。世界卫生组织研究显示，2012年中国癌症发病人数为306.5万，约占全球发病的五分之一；癌症死亡人数为220.5万，约占全球癌症死亡人数的四分之一。
肿瘤的临床诊断技术也在逐渐提高。从最初的肿瘤标记物的检测、超声、透视等手段，发展到现在更多的肿瘤相关因子的蛋白水平和分子水平的检测、CT、核磁、PET、SPET，以及肿瘤微创的活检等等技术都已在临床上广泛应用。
肿瘤的诊断分为体外和体内诊断。在体外，肿瘤组织的免疫组织化学染色是确诊肿瘤的一个重要指标。体内诊断，一般是利用一些显像剂再辅助一些仪器进行肿瘤成像。肿瘤体内成像不仅能够早期诊断肿瘤，而且能够实时监测抗肿瘤治疗的效果以及肿瘤的进展情况。因为它是无创检查，给病人带来的痛苦小，已经成为临床确诊和治疗肿瘤的必不可少的诊断手段。目前医院常用的肿瘤体内显像使用的是放射性核素显像，以及核磁。
近年来，光学成像以其非侵袭性、实时、分辨率高等优势广泛应用于肿瘤研究领域，可对肿瘤进行早期诊断，反映肿瘤解剖学结构及代谢情况。近红外荧光成像是目前光学分子成像领域研究的热点，其光谱范围为700-1000nm，在此波段范围内被监测的生物体与组织的自发荧光干扰较小，穿透组织距离可高达数厘米，提高了成像的准确度和灵敏度。
随着肿瘤靶点不断增多，利用特异性针对肿瘤靶抗原的抗体作为指示剂的研究也在逐渐深入。但是传统的全分子抗体分子量较大，并不能很快分布到全身，也不能很好地结合一些被遮蔽的靶位，所以抗体作为指示剂的可行性大打折扣。但是基因工程技术创造出了仅有抗原结合功能的分子量小的抗体片段，使得这一设想得以实现。
如果将特异性针对肿瘤靶点的抗体偶联上顺磁性阳性造影剂和近红外荧光染料，这样可以同时适用两种临床诊断手段，一种通过核磁，另一种通过激光激发。不仅增加了核磁的确诊率，而且通过激光激发出的红色荧光还可以应用到手术导航中，为临床肿瘤的确诊提供了一个新的方法，而且也为手术切除肿瘤提供了一个助判手段。
用来确诊肿瘤的靶点通常都是细胞表面蛋白。血管内皮生长因子(VEGF)也可以作为一个肿瘤诊断的靶标，VEGF是分泌型可溶性蛋白，能直接作用于血管内皮细胞促进血管内皮细胞增殖，增加血管通透性。研究表明，良性肿瘤血管生成稀少，血管生长缓慢；而大多数恶性肿瘤的血管生成密集且生长迅速。因此，血管生成在肿瘤的发展转移过程中起到重要作用，抑制这一过程将能明显阻止肿瘤组织的发展和扩散转移。表皮生长因子受体(EGFR)是一种具有酪氨酸激酶活性的跨膜受体，普遍表达于人体的表皮细胞和基质细胞，并在多种人类恶性肿瘤中存在高表达，与恶性肿瘤的发生、发展密切相关。EGFR的高表达可以促进肿瘤细胞的增殖、血管生成、粘附、侵袭和转移。EGFR信号传导关乎细胞的凋亡、增殖、分化、迁移和细胞周期循环，与肿瘤的形成和恶化息息相关。通过阻断EGFR与其配体的结合可以抑制EGFR向胞内的信号传导，从而起到抑制肿瘤细胞生长、迁移的效果。
在一篇研究中，科学家利用特异性针对前列腺特异性膜抗原的纳米抗体制备了显像剂用于前列腺癌的SPECT/CT显像。(A Novel 111In-Labeled Anti–Prostate-SpecificMembrane Antigen Nanobody for Targeted SPECT/CT Imaging of Prostate Cancer.JNucl Med 2015；56:1094–1099.)。另一篇研究中，科学家将两个鼠源Fab抗体片段通过点化学的方法连接起来，再连上铜64用来肿瘤显像，效果也很好。(Noninvasive brain cancerimaging with a bispecific antibody fragment,generated via clickchemistry.PNAS,2015(112):12806–12811.)。刚刚发表的一篇研究中(Sarah M.Cheal etal,Curative Multicycle Radioimmunotherapy Monitored by Quantitative SPECT/CT-Based Theranostics,Using Bispecific Antibody Pretargeting Strategy inColorectal Cancer,Journal of Nuclear Medicine(2017).DOI:10.2967/jnumed.117.193250)，纽约纪念斯隆凯特林癌症中心和波士顿麻省理工学院的研究人员开发了一个新的三步系统，使用核医学来瞄准和消除结直肠癌。在这项使用小鼠模型的研究中，研究人员达到了100％的治愈率-没有任何治疗相关的毒性作用。这项研究报告在“核医学杂志”2017年11月份的专题文章中出现。
在这项研究中，在95％以上的原发和转移性人结直肠癌中发现抗原糖蛋白A33(GPA33)。用抗A33肿瘤抗原的双特异性抗体和用于小分子放射性半抗原的二抗177(177Lu)和S-2-(4-氨基苄基)1,4,7,10-四氮杂环十二烷四乙酸(177Lu-DOTA-Bn)，应用DOTA预靶向放射免疫疗法(PRIT)策略在小鼠模型上进行测试。所有经DOTA-PRIT处理的动物均耐受良好的治疗，并且所有9只评估的小鼠在显微镜检查时均没有剩余的癌症痕迹。对重要器官，包括骨髓和肾脏也没有可检测的辐射损伤。
在小鼠模型中100％治愈率是一个有希望的初步发现，表明抗GPA33-DOTA-PRIT将是人类GPA33阳性结直肠癌肿瘤的有效放射免疫治疗方案。如果临床上取得成功，使用更多的针对人类肿瘤抗原的精细抗体就可以应用于所有固体和液体肿瘤。在肿瘤学方面，尤其是对于实体瘤，对于晚期疾病的治愈性治疗存在巨大的需求，包括结肠癌，乳腺癌，胰腺癌，黑色素瘤，肺癌和食管癌等等。
随着现有技术的不断发展，基于抗体特异性识别功能的肿瘤成像和治疗需求日益扩大，然而，现有技术中的抗体也因为特异性不高导致肿瘤结合效果欠佳，靶点单一以至于存在漏检风险，偶联剂标记单一造成检测成本增高，以及抗体与指示剂的偶联适应度不高限制成像效果等问题而限制了上述技术的进一步应用。
发明内容
基于现有技术存在的问题，本发明的目的是研发出一种具有双重识别功能的特异性单链抗体融合蛋白，将两种特异性的单链抗体用分子生物学技术串联在一起，利用其抗表皮生长因子受体一端识别肿瘤细胞，另一端利用抗血管内皮生长因子单链抗体识别肿瘤组织局部的血管内皮生长因子，进而提供一种介于上述两种新型抗体药物之间的具有增强了的肿瘤识别作用的双特异抗体。同时也提供了一种具有双重体内显像效果的生物大分子偶联物及其应用。
基于上述发明目的，本发明首先提供了一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白，所述融合蛋白由抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体组成，所述VEGF单链抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗VEGF单链抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示；所述抗EGFR单链抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11和12所示，所述抗EGFR单链抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。
在一个优选的技术方案中，所述抗VEGF单链抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示，所述抗EGFR单链抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。
在一个更为优选的技术方案中，所述抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体的轻链可变区和重链可变区通过可变区连接多肽相连。
更为优选地，所述可变区连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
在一个优选的技术方案中，所述抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体通过单链抗体连接多肽相连。
更为优选地，所述单链抗体连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
其次，本发明提供了一种生物大分子偶联物，所述偶联物中，上述的任一融合蛋白与近红外荧光蛋白和/或顺磁性阳性造影剂偶联。
在一个优选的技术方案中，所述近红外荧光蛋白与所述顺磁性阳性造影剂同时与所述抗体偶联，所述近红外荧光蛋白为irdye800，所述顺磁性阳性造影剂为DOTA@gd。
最后，本发明提供了上述的偶联物在制备肿瘤体内成像诊断制剂中的应用，以及
上述的偶联物在制备免疫荧光诊断试剂中的应用，其中，所述FITC与所述融合蛋白偶联。
本发明选取具有确定性抗肿瘤作用的靶点血管内皮生长因子和表皮生长因子入手，利用噬菌体抗体库方法筛选高亲和力抗VEGF和EGFR的ScFv，利用分子生物学方法将两者在基因水平上组成双特异单链抗体融合蛋白。本发明的抗血管内皮细胞单链抗体及抗表皮生长因子受体单链抗体的双特异抗体融合蛋白具有优异的亲和力，其针对VEGF和EGFR的亲和力常数分别可达到3.26×10-10M和2.36×10-10M。而大多数自身抗体的亲和力常数小于10-5--8M，本发明将双特异抗体融合蛋白偶联顺磁性阳性造影剂和近红外荧光，可以作为体内核磁或荧光显像剂。本发明的双特异抗体融合蛋白用于体内诊断显像时可以不仅竞争自身抗体与EGFR表面抗原结合，也可以竞争自身抗体与VEGF结合，大大提高了抗体诊断肿瘤的灵敏性。
本发明的独特构思在于利用两个针对不同靶点的ScFv组成一个双特异抗体融合蛋白，具有同时识别两种靶点。另一独特构思在于在这个双特异抗体融合蛋白上同时偶联两种显像剂，可同时利用核磁或激光成像，不仅拓宽了这种双特异抗体的体内应用方式。而且利用特异性识别肿瘤靶点的双特异抗体进行肿瘤体内成像也降低了假阳性率，提高了确诊率。仅仅通过核磁就能达到确诊，不用患者再进行放射性核素成像，减少了患者的核暴露伤害。最后该双特异抗体融合蛋白也可以应用到肿瘤切除手术中，为医生提供手术导航，达到彻底清除肿瘤组织和转移病灶的效果。由于本发明选用的是抗体小分子片段，该单链抗体的分子量小，可以在原核细胞表达系统中表达，大大降低了抗体药物的生产成本。
附图说明
图1.VH和VLPCR产物鉴定图；
图2.载体图谱和重组载体鉴定图；
图3.筛选出的VEGF ScFv、EGFR ScFv、VEGF ScFv+EGFR ScFv与VEGF-165、EGFR蛋白的结合试验示意图；
图4.纯化后的VEGF ScFv、EGFR ScFv、VEGF ScFv+EGFR ScFv聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图；
图5.FITC和近红外荧光标记的VEGF ScFv、EGFR ScFv对胰腺癌肿瘤细胞panc-1的免疫荧光结果图；
图6.FITC标记的VEGF ScFv、EGFR ScFv、VEGF ScFv+EGFR ScFv对结直肠癌细胞HT29的免疫荧光结果图；
图7.FITC和近红外荧光标记的VEGF ScFv、EGFR ScFv对胰腺癌肿瘤组织的免疫荧光结果图；
图8.irdye800和DOTA@gd标记的VEGF ScFv+EGFR ScFv对小鼠结直肠癌HT29细胞瘤的荧光和核磁显像图；
图9.近红外荧光标记的VEGF ScFv+EGFR ScFv在手术导航中的应用显示图。
具体实施方式
下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的保护范围构成任何限制。
实施例1抗VEGF和抗EGFR双特异抗体的制备
1.1高库容量天然抗体库的建立。
分离人外周血单个核淋巴细胞：随机选取100个健康成年人，抽取每人外周血10ml。用含10％肝素的RPMI-1640培养液1:1稀释，加到装有淋巴细胞分离液的离心管(稀释静脉血与淋巴细胞分离液的体积比为2:1)中，2,000×g，离心17分钟。吸取淋巴细胞分离液界面乳白色单个核细胞层，PBS缓冲液洗两次。
1.2细胞总RNA的提取
按每5×106cells/ml的比例加入Trizol试剂，吹打细胞使之裂解。室温孵育5分钟，移入经DEPC处理的EP管中，加入1/5体积的氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟。4℃，10,000×g离心15分钟，吸取上层水相至一个新的离心管中，加入1/2体积的异丙醇，冰浴10分钟。4℃，12,000×g离心10分钟，弃上清，加入1ml 75％乙醇清洗沉淀。4℃，7,500×g离心5分钟，弃上清，室温干燥沉淀，溶于无RNase的水或沉淀于无水乙醇内，-80℃保存备用。
1.3逆转录合成cDNA第一链
先用无RNase的DNaseⅠ处理总RNA以消除残存的基因组DNA。取处理过的RNA样品2μg和Oligo(dT)15(500μg/ml)1μl，补加DEPC水至12μl，70℃，加热10分钟。取出后马上置于冰浴中，依次加入5×Buffer 5μl；dNTP(10mmol/L)5μl；RNA酶抑制剂1μl,MMLV逆转录酶1μl,补加DEPC水至25μl，42℃，保温60分钟进行逆转录反应，70℃，15分钟灭活酶活性。
1.4PCR扩增VH和VL基因
以逆转录合成cDNA第一链为模板，采用人ScFv抗体库引物扩增所表达的VH和VL基因。反应体系如下：
Figure BDA0001525349810000071
引物1：5’ATCGACTTCGCTGGTCTGTATGG3’
引物2：5’GTAGTCGAACGGAAGCAG3’
PCR参数：94℃变性3分钟后，再以94℃30秒；61℃30秒；72℃1分钟，进行PCR，共30个循环，最后72℃延伸10分钟。反应结束后取5μl反应产物进行1％琼脂糖凝胶电泳分析。
PCR产物回收
(1)PCR产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳，从琼脂糖凝胶上切下目的DNA片段，放入1.5ml离心管中。
(2)加入400μl溶胶液A，70℃溶解5分钟，至凝胶全部溶解。
(3)加入200μl溶胶液B，混均后将全部液体吸入回收柱中。
(4)12,000×g离心1分钟，弃废液。
(5)加入500μl中和液，12,000×g离心1分钟，弃废液。
(6)加入700μl洗涤液，12,000×g离心1分钟，弃废液。重复步骤(6)1次。
(7)12,000×g离心2分钟，弃废液，将回收柱移入新的接收管上，室温干燥5分钟。
(8)加入30μl去离子水，12,000×g离心1分钟，洗脱DNA片段，于-20℃保存备用。
1.5搭桥PCR法进行VH和VL的拼接
将制备的VH和VL片段作为模板，进行VH和VL片段的串联。
PCR反应体系：
Figure BDA0001525349810000081
RSC-F:5’GGTACTGGAAGGTGGTGGCGGTTCT3’
RSC-B:5’GTCAGTGCCAGTTCAGAACC3’
PCR反应条件为94℃预变性5分钟，然后按如下参数进行30个循环：94℃变性30秒，60℃退火45秒，72℃延伸1分钟半，最后72℃延伸10分钟。重复胶回收步骤，PCR产物溶于30μl ddH2O中。图1为ScFv PCR产物鉴定图，其中泳道1为Marker，泳道2为VEGF ScFv，泳道3为EGFR ScFv。
1.6连接到噬菌体载体上，
Sfi1酶切载体和PCR产物
Figure BDA0001525349810000082
Figure BDA0001525349810000091
37℃酶切2小时，用相同的方法回收酶切片段。
连接反应
Figure BDA0001525349810000092
上述反应物充分混匀并离心使其沉于管底后，4℃连接过夜。酶切后的片段与pComb3XSS载体片段连接，构建成重组质粒。图2为重组载体电泳鉴定图。其中，泳道1为DNAMarker，泳道2、3为重组体片段pComb3XSS载体酶切图谱。
1.7转化和表达
将构建好的载体(质粒)转化(电转)到大肠杆菌内(特定的大肠杆菌)，扩增大肠杆菌并加辅助噬菌体，收集重组后的噬菌体就是噬菌体抗体库。经检测百人天然ScFv抗体库的库容量为2*1010，完全满足抗体筛选的需要。
1.8VEGF和EGFR ScFv抗体的筛选
从抗体库中取出10ul在大肠杆菌中扩增，收集扩增后的抗体库，EGFR和VEGF蛋白分别包被ELISA板后加入抗体库，孵育后冲洗非特异噬菌体，消化特异结合噬菌体，富集后将消化的噬菌体感染大肠杆菌涂板，挑取单克隆菌团并小量诱导，小量诱导后的单克隆菌上清做ELISA筛选阳性克隆，经过多次验证，选取亲和力和特异性都高(亲和力达到10-8-10-9KD)的阳性克隆进行抗体表达。同时将VEGF ScFv和EGFR ScFv在基因水平上进行串联，然后再进行表达。图3为筛选出的VEGF ScFv、EGFR ScFv、VEGF ScFv+EGFR ScFv与VEGF-165、EGFR蛋白的结合试验。可见基因水平串联起来的VEGF ScFv+EGFR ScFv对两种蛋白的结合活性不减。
将阳性克隆中的质粒提取并转化到其他表达菌，或将抗体基因连接到其他载体再转化到相应表达菌中，筛选最佳表达条件进行大量诱导表达，最后选择最佳的纯化方法及缓冲液，获得抗体蛋白。
表1.VEGF ScFv、EGFR ScFv、双特异抗体(VEGF ScFv+EGFR ScFv)与VEGF-165、EGFR蛋白亲和力常数对照表
抗体 抗原 亲和力常数
VEGF ScFv VEGF 3.59×10<sup>-10</sup>M
EGFR ScFv EGFR 2.84×10<sup>-10</sup>M
双特异抗体 VEGF 3.26×10<sup>-10</sup>M
双特异抗体 EGFR 2.36×10<sup>-10</sup>M
经过对筛选出的抗VEGF抗体的序列分析，所述抗VEGF抗体轻链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.1、2和3所示，所述抗VEGF单链抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.5、6和7所示；
所述抗VEGF抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示。
经过对筛选出的抗EGFR抗体的序列分析，所述抗EGFR抗体的轻链CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.10、11和12所示，所述抗EGFR单链抗体的重链的CDR1、CDR2和CDR3区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.14、15和16所示。
所述抗EGFR抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。
本发明提供的单链抗体来源于人源的噬菌体抗体库，因此其序列是全人源的，这为该抗体在人体内作为治疗药物或者体内成像诊断试剂的使用奠定了低免疫原性基础。
对上述的两株抗体进行进一步改构，在轻链可变区和重链可变区之间添加如SEQID NO.9所示的可变区连接多肽，形成两株单链抗体，即抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体。
在对两株单链抗体进行串联，即，所述抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体通过如SEQ ID NO.18所示的单链抗体连接多肽相连。串联后自融合蛋白的氨基端至羧基端排列的顺序依次为抗EGFR重链、可变区连接肽(SEQ ID NO.9)、抗EGFR轻链、单链抗体连接肽(SEQID NO.18)、抗VEGF轻链、连接肽(SEQ ID NO.9)、抗VEGF重链。
将编码该单链抗体的核苷酸序列(SEQ ID NO.19)克隆入pGEM-T Easy，并转化入大肠杆菌DH5α保存。制备该单链抗体时，将编码该单链抗体的核苷酸序列克隆入表达载体PET28a+载体，再转化到相应BL21(DE3)大肠杆菌宿主菌中，筛选最佳表达条件进行大量诱导表达，最后选择最佳的纯化方法及缓冲液，获得抗体蛋白。
大肠杆菌DH5α为本室保存，基因型为：supE44ΔlacU169
Figure BDA0001525349810000111
hsdR17 recA1 end1 gyr96 thi-1 relA1,用于质粒的扩增与转化。
大肠杆菌BL21(DE3),基因型为hsdS gal(λcIts857ind1 Sam7 nin5 lacUV5-T7),用于重组蛋白质的表达。
pGEM-T Easy：用于PCR产物的克隆，购自Promega公司。
原核表达质粒载体pET28a，pET42，pGEX-4t-1均为本室保存。
VEGF-EGFR单链抗体的纯化
将含有六个组氨酸标记的VEGF-EGFR ScFv-His6以0.45μm滤膜过滤，准备过柱。
HisTrap kit亲和柱用Binding Buffer 10ml平衡后，加入已经准备好的待纯化样品。调节流速约为8-10滴/分钟。
使用Binding Buffer洗柱。
使用6ml Elution Buffer洗脱柱子。分管收集洗脱液。取少量进行SDS-PAGE鉴定，图4为表达的VEGF ScFv、EGFR ScFv、VEGF ScFv+EGFR ScFv的聚丙烯酰氨凝胶电泳鉴定图。泳道1为抗VEGF ScFv，泳道2为抗EGFR ScFv，泳道3为VEGF ScFv+EGFR ScFv，泳道4为蛋白Marker。VEGF ScFv+EGFR ScFv双特异抗体分子量为50KD左右，而EGFR ScFv和VEGF ScFv分子量均为25KD。
实施例2.双特异抗体的纯化
将两种ScFv的序列进行重新基因合成，使其按照VEGF单链抗体的重链可变区和轻链可变区连接EGFR单链抗体的轻链可变区和重链可变区的顺序重新组成新的双特异抗体。由北京诺赛生物科技有限公司合成。
挑单菌落接种于5ml LB培养基中，37℃剧烈振荡培养过夜。
将上述菌液按1:100的比例接种到一个含有400ml LB(抗生素)的锥形瓶中，37℃剧烈振荡培养2小时。
加入终浓度为1mmol/LIPTG，于37℃诱导表达3-4小时。
收集培养液，5,000rpm离心10分钟，弃上清。PBS洗菌体沉淀。
用PBS按照5ml/g重悬，冰浴下以工作10秒/300W/30次，每次间隔15秒的参数，超声破碎细胞。12,000rpm离心20分钟，收集上清。
重组蛋白质的纯化
将含有六个组氨酸标记的融合蛋白VEGF ScFv+EGFR ScFv-His6以0.45μm滤膜过滤，准备过柱。
HisTrap kit亲和柱用Binding Buffer 10ml平衡后，加入已经准备好的待纯化样品。调节流速约为8-10滴/分钟。
使用Binding Buffer洗柱。
使用6ml Elution Buffer洗脱柱子。分管收集洗脱液。取少量进行SDS-PAGE鉴定，富含目的蛋白的各管于-70℃保存。
实施例3.FITC标记的VEGF ScFv、EGFR ScFv以及VEGF ScFv+EGFR ScFv对胰腺癌肿瘤细胞panc-1的免疫荧光结果(confocal)
利用胰腺癌细胞系panc-1验证VEGF ScFv、EGFR ScFv以及VEGF ScFv+EGFR ScFv对肿瘤细胞的结合。
首先FITC(异硫氰酸荧光素)或irdye800标记VEGF ScFv、EGFR ScFv以及VEGFScFv+EGFR ScFv，步骤如下：
(1)将待交联的蛋白(浓度≥1mg/ml)对交联反应液透析三次(4℃)，至pH＝9.0。交联反应液配制方法：7.56g NaHCO3，1.06g Na2CO3，7.36g NaCl，加水定容至1L。
(2)将FITC溶于DMSO中，浓度为1mg/ml。每次交联使用的FITC均应新鲜配制，避光。
(3)按P:F(蛋白质：FITC)＝1mg:150μg的比例将FITC缓慢加入于抗体溶液中，边加边轻轻晃动使其与抗体混合均匀，暗处4℃反应8小时。
(4)加入5mol/L的NH4Cl至终浓度50mmol/L，4℃终止反应2小时。
(5)将交联物在PBS中透析四次以上，至透析液清亮。
(6)交联物的鉴定。
蛋白浓度(mg/ml)＝[A280–0.31×A495]/1.4
F/P比例:3.1×A495/[A280–0.31×A495]，该值应介于2.5～6.5之间。
FITC交联的蛋白应置于pH7.4的磷酸盐缓冲液中，加入0.1％NaN3、1％BSA，4℃暗处保存。
然后进行细胞染色，步骤如下：
1)细胞种于共聚焦专用培养皿里，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
2)细胞半干时，覆盖以4％冷的多聚甲醛固定15分钟，避光。
3)吸去多聚甲醛后，用冰PBS洗三遍，每次5分钟。
4)0.5％Triton X-100覆盖细胞10分钟，冰PBS洗三遍，每次5分钟。
5)进口胎牛血清室温封闭30分钟。
6)配制一抗VEGF ScFv、EGFR ScFv以及VEGF ScFv+EGFR ScFv:FBS＝1:200。
7)加入一抗覆盖细胞，锡纸包裹4度避光过夜。
8)次日，取出细胞复温至室温约1小时。
9)冰1‰Tween洗两次，每次5分钟于摇床。冰PBS洗一次，5分钟于摇床。
10)DAPI染核，每皿1滴，完全覆盖住细胞即可。
11)冰1‰Tween洗两次，每次5分钟于摇床。冰PBS洗一次，5分钟于摇床。
12)加入防荧光淬灭封片剂，避光。
13)上机confocal。
结果如图5所示。FITC标记的VEGF ScFv可以结合panc-1细胞浆里的VEGF蛋白，使得细胞呈均匀绿色，与DAPI染的细胞核重合。irdye800标记的EGFR ScFv可以结合panc-1细胞膜表面中的EGFR，使得整个细胞显红色，DAPI将细胞核染成蓝色，两种颜色叠加相互吻合，说明该绿色荧光显示的是细胞形态。同时在一张细胞爬片上使用这两种ScFv可以使细胞呈现黄色，且与细胞核染色吻合。使用特异性抗体均可以阻断探针染色，说明该探针结合细胞的特异性。
使用FITC标记的VEGF ScFv+EGFR ScFv进行细胞染色，结果如图6所示。Bs-ScFv2代表VEG FScFv+EGFR ScFv融合蛋白，它染色的细胞荧光强度明显强于单个ScFv染色的荧光强度(第一排)使用特异性抗体也同样能阻断这些探针的染色(第二排)。
实施例4.FITC和近红外荧光标记的VEGF ScFv、EGFR ScFv对胰腺癌肿瘤组织的免疫荧光结果
使用胰腺癌肝转移肿瘤模型，进行冰冻切片，然后使用荧光标记探针进行组织荧光染色，结果如图7所示。蓝色为细胞核染色，绿色为VEGF ScFv染色，红色为EGFR ScFv染色，可见三张不同部位的染色均有相同的分布特点。VEGF ScFv主要是染组织间隙，而EGFRScFv主要是在细胞膜表面着色。两种不同着色区域的显色可以使两者连用后肿瘤组织显色更强。
实施例5.irdye800和DOTA@gd标记的VEGF ScFv+EGFR ScFv对小鼠结直肠癌动物模型的荧光和核磁显像
用近红外荧光irdye800和DOTA@gd标记VEGF ScFv+EGFR ScFv，然后尾静脉注射肿瘤模型小鼠，观察该双模态双特异抗体在肿瘤模型鼠体内的分布。
结果如图8所示。A：小鼠肿瘤自发光显像。HT29细胞自带luciferase报告基因，可以显示肿瘤模型小鼠肿瘤组织位置。该肿瘤生长在小鼠右侧大腿。B：双特异探针在小鼠体内的荧光显像。可见，红色荧光分布集中在小鼠右侧大腿，与肿瘤细胞自发荧光的位置吻合。C：双特异探针在小鼠体内的核磁显像。采用T2平扫，可见核磁平扫图中肝区有明显肿块，边际清楚且着色重。
实施例6.近红外荧光标记的VEGF ScFv+EGFR ScFv在手术导航中的应用
具有近红外荧光的VEGF ScFv+EGFR ScFv在激发光下，可以呈现肿瘤轮廓，结果见图9所示。在可见光下，可见小鼠模型的肿瘤块，第一排由左向右依次为，皮下，解剖皮肤肿块清晰暴露以及摘除的肿块。第二排则在体视荧光显微镜下观察的相应部位的荧光，位置和大小均和可见光视野下的一致。该探针可以应用到手术导航中。
序 列 表
<110> 北京格根生物科技有限公司
亦康（北京）医药科技有限公司
<120> 一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白及其应用
<160> 19
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Tyr Ser Ser Ile Ser Gln
1 5
<210> 2
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ser Ala Ala
1
<210> 3
<211> 9
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Thr Leu Pro Thr Ser Tyr Ser Gln Gln
1 5
<210> 4
<211> 107
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Lys Ile Glu Leu Lys Thr Gly Gly Gly Phe Thr Leu Pro Thr Ser Tyr
1 5 10 15
Ser Gln Gln Cys Tyr Tyr Thr Ala Phe Asp Glu Pro Gln Leu Ser Ser
20 25 30
Ile Ser Leu Thr Phe Asp Thr Gly Ser Gly Ser Gly Ser Phe Arg Ser
35 40 45
Pro Val Gly Ser Gln Leu Ser Ser Ala Ala His Ile Leu Leu Lys Pro
50 55 60
Ala Lys Gly Pro Lys Gln Gln Tyr Trp Asn Leu Tyr Ser Ser Ile Ser
65 70 75 80
Gln Ser Ala Arg Cys Thr Ile Thr Val Arg Asp Gly Val Ser Ala Ser
85 90 95
Leu Ser Ser Pro Ser Gln Thr Met Val Leu Glu
100 105
<210> 5
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Tyr Tyr Asp Ser Phe Thr Ser Gly
1 5
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 6
Ile Ser Ser Gly Arg Gly Ser Ile
1 5
<210> 7
<211> 14
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7
Ile Asp Phe Ala Gly Leu Tyr Gly Ser Ser Leu Gly Arg Ala
1 5 10
<210> 8
<211> 110
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Ile Asp Phe Ala Gly Leu Tyr Gly Ser Ser Leu Gly Arg Ala Cys Tyr
1 5 10 15
Tyr Val Ala Thr Asp Asp Ala Arg Leu Ser Asn Met Gln Leu Tyr Leu
20 25 30
Ser Asn Lys Ser Asn Asp Arg Ser Ile Ile Phe Arg Gly Lys Val Ser
35 40 45
Asp Ala Tyr His Ile Ser Ser Gly Arg Gly Ser Ile Phe Ser Val Trp
50 55 60
Glu Leu Gly Lys Gly Pro Ala Gln Arg Ile Trp Ser Met Tyr Tyr Asp
65 70 75 80
Ser Phe Thr Ser Gly Ser Ala Ala Cys Ser Leu Arg Leu Ser Gly Gly
85 90 95
Pro Lys Val Leu Gly Gly Gly Ser Glu Val Leu Gln Val Glu
100 105 110
<210> 9
<211> 10
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10
<210> 10
<211> 6
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Asn Ile Gly Ser Lys Ser
1 5
<210> 11
<211> 3
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 11
Tyr Asp Ser
1
<210> 12
<211> 11
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 12
Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gln Gly Val
1 5 10
<210> 13
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13
Glu Leu Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Val Ala Pro Gly Lys
1 5 10 15
Thr Ala Arg Ile Thr Cys Gly Gly Asn Asn Ile Gly Ser Lys Ser Val
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr
35 40 45
Tyr Asp Ser Asp Arg Pro Ser Gly Ile Pro Glu Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Asn Ser Gly Asn Thr Ala Thr Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Gly
65 70 75 80
Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Val Trp Asp Ser Ser Ser Asp Gln
85 90 95
Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Gln Leu Thr Val Leu
100 105
<210> 14
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala
1 5
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15
Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys
1 5
<210> 16
<211> 15
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Pro Phe Asp Tyr
1 5 10 15
<210> 17
<211> 111
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Gln Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1 5 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Gly Arg Tyr Phe Asp Trp Leu Leu Pro Phe Asp Tyr
100 105 110
<210> 18
<211> 5
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 19
<211> 1386
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 19
atcgacttcg ctggtctgta tggtagctct cttggtcgtg catgctacta cgtagctact 60
gacgatgcac gtctgagcaa catgcagctg tatctgtcca acaagtccaa cgatcgttcc 120
atcatcttcc gtggcaaagt gtctgacgca tatcacatca gctctggtcg tggtagcatc 180
ttctctgtct gggaactggg taaaggtcca gctcaacgca tctggtctat gtactacgac 240
agcttcactt ccggttctgc tgcatgttct ctgcgtctgt ctggtggtcc taaagtactg 300
ggtggcggtt ctgaagtact gcaggtcgaa ggcggtggag gctctggtgg tggcggttct 360
aagatcgaac tgaagactgg tggtggcttc actctgccga ctagctactc tcagcaatgc 420
tactatactg cattcgacga accgcaactg tctagcatca gcctgacttt cgacactggt 480
tctggttctg gtagcttccg ttctccggta ggttctcaac tgagctctgc agctcacatt 540
ctgctgaaac cggctaaagg tccgaaacag cagtactgga atctgtatag ctccattagc 600
cagtctgcac gttgtaccat cactgtacgt gacggtgtgt ctgcatctct gtcctctcca 660
tctcagacta tggtactgga aggtggtggc ggttctgaac tggcactgac tcaacctcca 720
tctgcttccg ttgcaccggg taagactgct cgtattacct gtggtggcaa caacatcggt 780
agcaaatctg tacactggta tcagcagaaa ccgggtcaag caccggtact ggtcatctac 840
tatgactctg atcgtccgtc tggtattccg gaacgcttct ctggctccaa ctctggtaac 900
actgccactc tgactatcag ccgtgtcgaa gcaggtgatg aagccgacta ctattgccag 960
gtatgggatt ccagctctga ccaaggtgtc ttcggtggtg gcactcagct gactgtactt 1020
ggtggcggtg gcggttctgg tggtggtgga tctcaagtgc agctgcagca atggggtgga 1080
ggcgtagttc agccaggtcg ttctctgcgt ctgtcttgtg cagcttctgg ctttaccttc 1140
agcagctatg ctatgcattg ggtacgtcaa gctccaggca aaggtctgga atgggtagca 1200
gttatcagct acgatggctc taacaagtac tacgcagact ctgtgaaagg tcgtttcacc 1260
atctctcgtg acaattccaa gaacactctg tatctgcaga tggacagcct gcgtgctgaa 1320
gacactgcag tgtactactg tgctcgttct ggtcgctact ttgactggct gcttccgttc 1380
gactac 1386

Claims (9)

1.一种抗VEGF及EGFR的双特异抗体融合蛋白，所述融合蛋白由抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体组成，所述抗VEGF单链抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.4和8所示，所述抗EGFR单链抗体的轻链可变区和重链可变区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.13和17所示。
2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体的轻链可变区和重链可变区通过可变区连接多肽相连。
3.根据权利要求2所述的融合蛋白，其特征在于，所述可变区连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
4.根据权利要求3所述的融合蛋白，其特征在于，所述抗VEGF单链抗体和抗EGFR单链抗体通过单链抗体连接多肽相连。
5.根据权利要求4所述的融合蛋白，其特征在于，所述单链抗体连接多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.18所示。
6.一种生物大分子偶联物，其特征在于，所述偶联物中，权利要求1-5任一所述融合蛋白与近红外荧光蛋白和/或顺磁性阳性造影剂偶联。
7.根据权利要求6所述的偶联物，其特征在于，所述近红外荧光蛋白与所述顺磁性阳性造影剂同时与所述融合蛋白偶联，所述近红外荧光蛋白为irdye800，所述顺磁性阳性造影剂为DOTA@gd。
8.权利要求7所述的偶联物在制备肿瘤体内成像诊断制剂中的应用。
9.权利要求6所述的偶联物在制备免疫荧光诊断试剂中的应用，其特征在于，所述FITC与所述融合蛋白偶联。
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