CN111187351A - 一种肝癌检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种肝癌检测试剂盒，该试剂盒包含一种新型的与靶标蛋白亲和力更高的抗GPC3的单克隆抗体，该抗体可以有效区分肝癌细胞和其他肿瘤细胞，并且能够与肝癌患者体内的循环肿瘤细胞结合，提示其可以作为有效的肝癌检测抗体，用于肿瘤的早期诊断之中，从而便于相关患者早发现早治疗，改善治疗预后，降低死亡率。

Description

一种肝癌检测试剂盒
技术领域
本发明属于生物制药领域，具体涉及一种肝癌检测试剂盒。
背景技术
肝癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升趋势，严重威胁着人类的健康，有研究显示，肝癌的发病率在恶性肿瘤中排名世界第5位，而死亡率则位居第3位。在中国，由于存在较为严重的乙型肝炎病毒（HBV）感染等致癌风险因素，肝癌的发病率和死亡率态势尤为严峻，每年有超过10万人死于肝癌及其并发症。肝癌的治疗手段主要包括肝移植、肿瘤切除及非切除性局部疗法如肝动脉化疗栓塞等，然而晚期患者难以进行手术治疗，在临床实践中只有10-20％的肝癌患者能够在患病早期被确诊，大部分患者被诊断时已是晚期，预后较差，且治疗手段有限，易复发，使得肝癌的死亡率居高不下。因此，寻找一种可以适用于肝癌早期准确诊断的试剂和方法具有重要意义。
目前临床应用最为广泛的肝癌肿瘤标志物是甲胎蛋白（AFP），但是随着研究的深入和临床实践的反馈，甲胎蛋白的诊断敏感性不能令人满意，尤其在小细胞性、高分化肝细胞癌敏感性较低，阳性率也较低，对早期诊断的临床使用价值不高，对此甚至美国肝病研究学会指南中已经建议不将甲胎蛋白作为首选筛查指标。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican 3，GPC3）是具有HS的蛋白多糖，通过糖基磷脂酰肌醇锚定在细胞膜表面，作为硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族成员，该基因编码580个氨基酸能够产生大约70 kD 的核心蛋白。核心蛋白由两个亚基构成，弗林蛋白在358-359 氨基酸位置将该核心蛋白裂解为N端和C端两个亚基，N末端存在着一种分泌型信号蛋白，C末端通过与糖基磷脂酰肌醇（GPI）共价结合，从而使GPC3核心蛋白锚定于肝细胞膜上，且C端最末50个氨基酸决定两条硫酸乙酰肝素链（HS）插入点的位置，使该链靠近细胞膜。从表达谱系来看，虽然在大多数成人组织中GPC3的启动子DNA甲基化，但只在肺、间皮、卵巢、乳腺上皮、子宫内膜中微量表达，GPC3 在肿瘤组织中的表达具有差异性：在成肝细胞瘤、非小细胞肺癌、睾丸和卵巢卵黄囊瘤、恶性黑色素瘤、卵巢透明细胞癌、睾丸生殖细胞瘤、结肠癌、肾横纹肌样瘤中为高表达。然而在卵巢癌、胆管癌、GC和间皮瘤中表达下调，这也提示GPC3可以作为肿瘤的特异性生物标志物，目前研究较多的是将GPC3作为肝癌检测的标志物和治疗靶点，但是现有的靶向GPC3的单克隆抗体仍面临特异性不高，与目标抗原亲和力低，检测准确性不理想等问题，制约了其在肿瘤检测中的应用。
发明内容
基于现有靶向GPC3的检测单克隆抗体存在的问题，本发明提供了一种全新的抗GPC3的单克隆抗体，所述抗体包含有SEQ IDNO.1-3的顺序所示的重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域和SEQ ID NO.4-6的顺序所示的轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3区域。
本发明所述抗体包含有如SEQ IDNO.7所示的重链可变区氨基酸序列和/或如SEQID NO.8所示的轻链可变区氨基酸序列。
本发明所述抗体为IgG型抗体。
本发明提供了一种多核苷酸，其特征在于，编码本发明中所述的抗GPC3单克隆抗体。
本发明所述的多核苷酸，编码所述重链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQID NO.9所示，编码所述轻链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。
本发明提供了一种载体，所述载体包含本发明中所述的多核苷酸。
本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞包含本发明中所述的多核苷酸，或本发明中所述的载体。
本发明提供了一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含本发明中所述的单克隆抗体。
本发明提供了一种所述的单克隆抗体在制备肿瘤检测试剂中的应用。
本发明中所述的肿瘤包括肝癌，肺癌，乳腺癌，卵巢癌等等。
本发明所提供的新型抗GPC3的单克隆抗体，具有全新的抗原结合域，本发明中基于RT-PCR、5’RACE技术，结合生物信息学知识，鉴定出了该抗体的轻链可变区和重链可变区的具体氨基酸序列和核苷酸序列，并且通过进一步实验验证其有效性，分子实验显示其具有目标抗原人GPC3具有较强的亲和力，免疫组织化学研究显示其还能够有效识别肝癌组织样本中的GPC3表达情况，并且通过流式细胞检测技术能够有效识别患者外周血中的循环肿瘤细胞，上述结果都提示该抗体可以用于肝癌的早期诊断，具有较好的临床应用前景。
附图说明
图1抗GPC3的单克隆抗体与不同肿瘤细胞系的亲和力图；
图2抗GPC3的单克隆抗体免疫组织化学测试图，A为肝癌组织，B为正常肝组织；
图3循环肿瘤细胞样本检测图。
具体实施方式
实施例1 抗GPC3的单克隆抗体的制备及鉴定
1.1免疫小鼠
本单克隆抗体的制备是以重组人GPC3 (本发明人保存)为免疫原，用PBS溶解重组抗原，与弗氏剂等体积混合，免疫6周龄BALB/c小鼠，皮下多点注射，免疫 3 次，每次间隔2周。第三次免疫 2 周后每只小鼠尾静脉取血，置 37℃温箱放置 1h，于4℃、4000rpm离心15min，收集上层血清，并用间接ELISA测定小鼠效价。检测结果显示免疫小鼠血清效价为1:300000。
1.2细胞准备
复苏小鼠骨髓瘤细胞，用含10%胎牛血清的1640完全培养基，37℃，5％CO2培养箱中培养，当细胞成对数生长时每隔 2-3 天传代一次，选取生长旺盛，形态良好的细胞供融合使用。将免疫后小鼠脱颈处死，取出脾脏，制备单个脾细胞悬液。将脾细胞溶悬液转入50mL 离心管中，3500r/m 离心5min，弃上清。在用不完全培养基重悬洗涤 3 次，然后将细胞沉淀悬于不完全培养液中备用。
1.3细胞融合
将收集好的骨髓瘤细胞及脾脏细胞充分混合，离心共沉淀，在37℃水浴条件下，融合剂为PEG(MW1450，sigma)进行细胞融合。融合时间5分钟后加入新鲜无血清培养基终止融合，并用HAT培养液重悬细胞。将细胞加入已铺有滋养细胞的96孔板中。置37℃，5％CO2培养箱中培养。
1.4克隆筛选
首先使用含有HAT的常规RPM1640培养液进行培养筛选，培养7d后，改用 HT的常规RPM1640培养液培，进行再次培养筛选。培养14d后，用ELISA方法以各个克隆细胞的上清液筛选GPC3抗体的阳性克隆。采用有限稀释法，将细胞悬液稀释至20个/ml，于96孔板中每孔加100μL(约6个细胞/孔)。接种2排，剩余细胞悬液用培养液作倍比稀释，再接种2排，重复一次，置37℃、5％CO2细胞培养箱中孵育。每隔2～3天，更换培养液。培养约14d后，选择单个克隆生长的阳性孔进行第二次筛选和亚克隆。连续三次亚克隆后，经ELISA法检测抗体阳性率为100％时确定为稳定表达目的抗体的5株杂交瘤细胞，分别命名为AW-1、AW-2、AW-3、AW-4、AW-5，并进行保藏。
1.5鼠源单抗的制备与纯化
取健康BALB/c小鼠，腹腔注射高压灭菌的石蜡油，0.5mL/只；一周后分别注入AW-1、AW-2、AW-3、AW-4、AW-5细胞，剂量为106个/mL杂交瘤细胞的细胞悬液于小鼠腹腔，7～10 天后，当小鼠腹部明显膨胀时抽取腹水，将收集好的腹水置37℃保持24 h ，随后置4℃过夜， 第二天将腹水离心除去油脂沉淀，上清液为腹水单抗。抗体纯化过程参照GE protein G蛋白柱进行：
(1)将腹水12000rpm离心15min去杂质与上层降脂烷，平衡缓冲液(pH7.0 PBS) 5倍稀释，用0.45μm膜过滤。
(2)protein G柱用ddH2O平衡柱子5～10柱体积后用平衡缓冲液平衡柱子 10个柱体积；
(3)按照1ml protein G胶结合5mg蛋白的载量上样(腹水抗体含量通常为：1～5mg/ml)
(4)用平衡缓冲液液平衡柱子10柱体积；
(5)用洗脱液洗脱(0.1MpH2.7甘氨酸-HCl)10个柱体积，分管收集，洗脱蛋白迅速按每1ml加入150μL 1MTris-ClpH9.0的比例进行中和。
(6)SDS-PAGE分析洗脱抗体的量和纯度，各个抗体分别命名为AW mab-1、AW mab-2、AW mab-3、AW mab-4、AW mab-5。
经检测，所制备抗体纯度均达98%以上，详细数据见表1。
表1各个抗体的纯度
Figure DEST_PATH_IMAGE002
实施例2、抗GPC3的单克隆抗体亲和力测定
通过BIACORE3000生物大分子相互作用仪（购自GE公司）测定各个抗GPC3的单克隆抗体与重组人GPC3的亲和力，结果如表2所示。选择亲和力最高的AW mab-5作为检测用抗GPC3的单克隆抗体，用于后续检测和进一步研发。
表2抗GPC3的单克隆抗体与目标抗原的解离常数
编号 解离常数KD（M）
AW mab-1 8.15E-09
AW mab-2 6.85E-09
AW mab-3 9.54E-08
AW mab-4 5.78E-10
AW mab-5 3.21E-10
实施例3、抗GPC3的单克隆抗体可变区编码序列的克隆
3.1从杂交瘤细胞株中提取抗GPC3的单克隆抗体的总RNA
利用FAST1000试剂盒进行提取，具体步骤为：
(1)取5×106个杂交瘤细胞，1500rpm离心3min，弃上清。用PBS洗涤一次。将细胞重悬于100μL PBS中，放入离心管内。
(2)加入RB1液1ml，充分颠倒混匀直至完全溶解，室温放置5min。
(3)加入RB2液500μL，充分颠倒混匀1min。将混匀后的液体吸入或直接倒入内套管中离心1min。
(4)弃去外套管液体，加入500μL洗液，离心1min，再重复一次。
(5)弃去外套管中液体，内套管空载离心1 min。
(6)将内套管移入新的离心管中，在膜中央加入洗脱液40μL，室温静置1 min，获得总RNA。
3.2 RT-PCR制备HER3鼠源单抗cDNA
以上述总RNA为模板，采用TaKaRa PrimeScript 逆转录试剂盒，以Oligo(dT)为引物，RT-PCR扩增HER3单抗cDNA，反应体系如下：
RNA为模板 1μL
Oligo(dT) 1μL
5×PrimeScript Buffer 4μL
PrimeScript Buffer RT Enzyme Mix 1μL
RNase Free H2O 13μL
总体积为20μL，反应条件为37℃ 1 h。
3.3抗GPC3的单克隆抗体可变区基因的克隆
采用5’RACE技术利用简并引物克隆出抗GPC3的单克隆抗体的VL和VH基因，相关核苷酸片段经琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收目标片段，纯化后连接于pUC18克隆载体上，转化入DH5α大肠杆菌感受态细胞中，抗生素筛选阳性克隆，并将阳性克隆送交测序验证，并根据NCBIIgBLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)免疫球蛋白基因比对分析结果，筛选出功能性抗体可变区序列结果，其中重链可变区的CDRH1、CDRH2、CDRH3氨基酸序列分别如SEQIDNO.1、SEQ IDNO.2、SEQ IDNO.3所示，轻链可变区的CDRL1、CDRL2、CDRL3氨基酸序列分别如SEQ IDNO.4、SEQ IDNO.5、SEQ IDNO.6所示，该抗GPC3的单克隆抗体的重链氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.9所示；轻链氨基酸序列如SEQ IDNO.8所示，核苷酸序列如SEQ IDNO.10所示。
实施例4、抗GPC3的单克隆抗体与肿瘤细胞系的亲和力测定
为了考察筛选获得的抗GPC3的单克隆抗体与各种肿瘤细胞的亲和力高低，本发明中选用肺癌细胞A549、肝癌细胞HepG-2、乳腺癌细胞MCF-7作用实验对象，考察该抗体与不同种类的肿瘤细胞系的亲和力情况，具体操作步骤如下：
4.1 细胞培养
（1）从液氮中取出冻存的A549、HepG-2、MCF-7细胞（本发明人保存），迅速放入37℃温水中，期间不断轻轻摇动，使得细胞液迅速溶解。
（2）1500rpm离心5min，收集细胞，弃去上清，加入1mL含10%FBS的基础培养基（A549细胞和MCF-7细胞选用DMEM培养基，HepG-2细胞选用RPMI1640培养基），重悬细胞，将细胞转移至25mL培养瓶中，再加入4mL含10%FBS的基础培养基于37℃、5% CO2细胞培养箱中培养。
（3）取对数生长期的细胞，经0.25%的胰蛋白酶-EDTA 消化液消化后，加入相应的培养基终止消化并重悬细胞，传代培养2-3次，收集细胞备用。
4.2流式细胞仪检测亲和力
（1）将收集到的各肿瘤细胞采用PBS重悬，调整细胞密度为1×105个/mL，加至96 孔板中，每孔100μL，然后每孔再加入1μL抗GPC3的单克隆抗体，于37℃、5% CO2 培养箱中孵育30min。
（2）弃去培养皿中上清，采用PBS洗涤3次。
（3）加入带绿色荧光染料FITC抗his标签的抗体，4℃孵育30min，PBS清洗细胞3次后重悬在500μL PBS缓冲液。
（4）流式细胞仪上机检测荧光强度。
如图1显示，本发明中筛选获得的抗GPC3的单克隆抗体与肝癌细胞HepG-2具有最强亲和力，明显高于肺癌细胞A549、乳腺癌细胞MCF-7，说明其更适于作为肝癌的检测抗体。
实施例5、抗GPC3的单克隆抗体与人肝癌样本的免疫组织化学研究
（1）选取肝癌患者肿瘤区域的肝癌组织蜡块和正常肝组织蜡块，获取4μm的组织石蜡切片。
（2）室温下用二甲苯脱蜡2次，每次10分钟。
（3）在乙醇梯度洗涤，去除二甲苯，双蒸水中洗5分钟。
（4）用0.3％H2O2封闭内源性过氧化物酶活性，室温10分钟。
（5）双蒸水中洗4次，每次5分钟。
（6）将抗GPC3的单克隆抗体滴加在组织切片上，4℃孵育12小时；
（7）PBS缓冲液冼4次，每次5分钟；
（8）滴加辣根过氧化物酶标记的第二抗体，37℃孵育30分钟；
（9）PBS洗4次，每次5分钟；
（10）滴加DAB显色剂，室温孵育显色。
（11）双蒸水洗4次，每次3分钟；
（12）晾干，封片，显微镜观测。
如图2所示，在肝癌患者的肝脏组织中，本发明所提供的抗GPC3的单克隆抗体能够有效识别目标抗原，而正常人肝组织中却没有明显阳性反应，说明该抗体能够有效识别肝脏组织中的GPC3抗原。
实施例6、抗GPC3的单克隆抗体与人肝癌循环肿瘤细胞的结合
为进一步验证抗GPC3的单克隆抗体的检测效果，本发明中考查了其与人肝癌循环肿瘤细胞的结合能力和检测情况，具体步骤如下：
6.1样本选择
选择并获得肝癌患者临床血液标本共23例，其中男性 9 例，女性14 例；正常人血液样本21例，其中男性10 例，女性11 例，静脉采集外周血。
6.2循环肿瘤细胞分离
（1）用PBS液按1：3比例稀释外周血样本。
（2）小心将5mL稀释后的外周血样本注入密度梯度离心管（含密度梯度离心液）中。
（3）将密度梯度离心管置于离心机中，平衡后，1000g室温离心10min。
（4）移除上层血浆，将中间层细胞小心转移至一个新的灭菌离心管中。
（5）用10mL PBS洗涤中间层细胞。
（6）4℃条件下1000g离心10min，小心吸弃上清液，重复清洗两次。
（7）用100μL PBS重悬细胞沉淀，制备成细胞悬液。
6.3流式细胞仪检测亲和力
（1）调整细胞密度为1×105个/mL，加至96孔板中，每孔100μL，然后每孔再加入1μL抗GPC3的单克隆抗体，于37℃、5% CO2 培养箱中孵育30min。
（2）弃去培养皿中上清，采用PBS洗涤3次。
（3）加入带绿色荧光染料FITC抗his标签的抗体，4℃孵育30min，PBS清洗细胞3次后重悬在500μL PBS缓冲液。
（4）流式细胞仪上机检测荧光强度。
如图3显示，本发明中筛选获得的抗GPC3的单克隆抗体能够与肝癌循环肿瘤细胞有效结合，结果显示肝癌患者样本中的荧光强度明显高于正常人样本，说明该抗体特异性较好，准确度较高。而肝癌循环肿瘤细胞是肝癌早期发生发展的重要影响因素和效应细胞，上述结果提示该抗体适用于肝癌的早期诊断。
序列表
<110> 北京瀚梅生物科技有限公司
<120> 一种肝癌检测试剂盒
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
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1 5 10
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<211> 18
<212> PRT
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<400> 2
Asp Trp Gln Thr Gly Pro Lys Arg Phe Ser Asn Lys Lys Ala Cys Tyr
1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 3
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1 5
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
Asp Gln Trp Ser Ser Leu Val Lys Leu Ile
1 5 10
<210> 5
<211> 9
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<211> 225
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
Asp Val Val Met Gln Cys Tyr Tyr Met Ile Lys Leu Ala Trp Met Gly
1 5 10 15
Ser Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Cys Tyr Ile Met Val Gly Val
20 25 30
Pro Gln Ile Leu Ile Lys Phe Cys Val Lys Cys Gln Pro Tyr Leu Gln
35 40 45
Lys Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Val His
50 55 60
Met Asn Gln Val Lys Ala Cys Glu Ser Cys Val Leu Gly Tyr Met His
65 70 75 80
Thr His Pro Trp Ala Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu His Val Gln
85 90 95
Trp Gln Ser Ser Lys Phe Tyr Phe Thr Val Ser Cys Phe Ser Cys Gly
100 105 110
Gln Gly Thr Lys Leu Glu Gly Gly Gly Gly Ser Cys Tyr Val Cys Ile
115 120 125
Leu Lys Gly Ser Ala Asp Trp Gln Thr Gly Pro Lys Arg Phe Ser Asn
130 135 140
Lys Lys Ala Cys Tyr Cys Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val
145 150 155 160
Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Val Cys His Ser Gln Trp Met
165 170 175
Ser Leu Leu Ser Gln Trp Cys Val Thr Arg Phe Tyr Ser Gln Ala Asn
180 185 190
His Thr Tyr Thr Arg Asn Thr His Val Glu Ser Ser Gln Trp Tyr Ile
195 200 205
Lys Trp Leu Pro Val Trp Ala Asn Pro Gly Gly Ser Lys Thr Val Ser
210 215 220
Ser
225
<210> 8
<211> 146
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ser Leu Thr Ile Thr Trp
1 5 10 15
Lys Val Leu Ile Ser Val Cys Asp Gln Trp Ser Ser Leu Val Lys Leu
20 25 30
Ile Gln Gln Arg Thr Gln Leu Thr Phe Gly Asn Ile His Trp Lys Glu
35 40 45
Asp Trp Trp Tyr Val Asn Gln Asp Asp Cys Ser Lys Glu Leu Ile Asp
50 55 60
Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Trp Asn Phe Tyr Ser His Val Gly Ser
65 70 75 80
Ile Gly Thr Tyr Gly Ser Val Ser Ser Ser Phe Cys Asn Gly Cys Lys
85 90 95
Glu Thr Tyr Thr Lys Ser Glu Tyr Thr Trp Glu Lys Gly Gly His Glu
100 105 110
Lys Pro Lys Pro Trp Ile Thr Asn Gln Thr Leu Ser His Met His Trp
115 120 125
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Ser Phe Ser Cys Arg Glu Trp Lys Glu
130 135 140
Thr Thr
145
<210> 9
<211> 678
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 9
gatgtggtga tgcagtgcta ttatatgatt aaactggcgt ggatgggcag cagctgccgc 60
agcagccaga gcctgtgcta tattatggtg ggcgtgccgc agattctgat taaattttgc 120
gtgaaatgcc agccgtatct gcagaaaccg ggccagagcc cgcagctgct gatttataaa 180
gtgagcgtgc atatgaacca ggtgaaagcg tgcgaaagct gcgtgctggg ctatatgcat 240
acccatccgt gggcgggcag cggcaccgat tttaccctgc atgtgcagtg gcagagcagc 300
aaattttatt ttaccgtgag ctgctttagc tgcggccagg gcaccaaact ggaaggcggc 360
ggcggcagct gctatgtgtg cattctgaaa ggcagcgcgg attggcagac cggcccgaaa 420
cgctttagca acaaaaaagc gtgctattgc agccgcgtgg aagcggaaga tgtgggcgtg 480
agcaccagca ccgcgtatat ggaactggtg tgccatagcc agtggatgag cctgctgagc 540
cagtggtgcg tgacccgctt ttatagccag gcgaaccata cctatacccg caacacccat 600
gtggaaagca gccagtggta tattaaatgg ctgccggtgt gggcgaaccc gggcggcagc 660
aaaaccgtga gcagctaa 678
<210> 10
<211> 441
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 10
gatattctgc tgacccagag cccggcgctg agcctgacca ttacctggaa agtgctgatt 60
agcgtgtgcg atcagtggag cagcctggtg aaactgattc agcagcgcac ccagctgacc 120
tttggcaaca ttcattggaa agaagattgg tggtatgtga accaggatga ttgcagcaaa 180
gaactgattg atgcggcgac ctattattgc aaatggaact tttatagcca tgtgggcagc 240
attggcacct atggcagcgt gagcagcagc ttttgcaacg gctgcaaaga aacctatacc 300
aaaagcgaat atacctggga aaaaggcggc catgaaaaac cgaaaccgtg gattaccaac 360
cagaccctga gccatatgca ttgggcgggc accaaactgg aactgagctt tagctgccgc 420
gaatggaaag aaaccaccta a 441

Claims (9)

1.一种抗GPC3的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的序列分别如SEQ ID NO：1-3所示，和所述抗体轻链可变区的CDR1、CDR2和CDR3的序列分别如SEQ ID NO：4-6所示。
2.如权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体重链可变区序列如SEQIDNO.7所示，抗体轻链可变区序列如SEQ ID NO.8所示。
3.如权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，其为IgG型。
4.一种多核苷酸，其特征在于，编码权利要求1中所述的单克隆抗体。
5.如权利要求4所述的多核苷酸，其特征在于包括，编码所述重链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，编码所述轻链可变区氨基酸序列的多核苷酸序列如SEQID NO.10所示。
6.一种载体，其特征在于，所述载体包含如权利要求4或5所述的多核苷酸。
7.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包含如权利要求4或5所述的多核苷酸，或如权利要求6所述的载体。
8.一种肝癌检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含如权利要求1-3中任意一项所述的单克隆抗体。
9.如权利要求1-3中所述的单克隆抗体在制备用于肝癌检测的试剂盒中的应用。
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