CN105349618B - 三阴性乳腺癌标记物及其在诊断和治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种三阴性乳腺癌标记物及其在诊断和治疗中的应用。具体地，本发明提供了蛋白C受体(Procr蛋白)在制备检测三阴性乳腺癌的诊断试剂或试剂盒中的用途。研究表明，Procr是三阴性乳腺癌的特征性标志物。因此，Procr可作为三阴性乳腺癌的诊断的标志物。本发明还提供基于Procr对三阴性乳腺癌进行治疗的方法和药物组合物。

Description

三阴性乳腺癌标记物及其在诊断和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及肿瘤学和诊断领域。更具体地，本发明涉及一种诊断三阴性乳腺癌的标记物及其在诊断和治疗中的应用。

背景技术

人类乳腺癌在临床上大致分为四种亚型。三种亚型(Luminal A，Luminal B，Her2阳性)的乳腺癌已知是由乳腺管腔细胞病变形成，并知道它们特异的细胞表面分子标志物分别为雌激素受体(Estrogen Receptor)，孕酮受体(Progesterone Receptor)和EGF受体(EGF Receptor，Her2)。对于这三种乳腺癌，现在临床上已有针对性的治疗靶点药物(见图14)。

上述三种受体都不表达的乳腺癌，在临床上被诊断为三阴性乳腺癌。对于三阴性乳腺癌，由于没有特异性的细胞表面分子标志，无法进行针对性地药物研发。目前在临床上用于三阴性乳腺癌的一线治疗药物为广普性的细胞毒化疗药物，仍缺乏有效的靶向治疗方法。现状是三阴性乳腺癌预后差，3-5年复发率及转移率为所有乳腺癌亚型中最高。

综上所述，寻找新的具有诊断或联合诊断价值的三阴性乳腺癌标志物，并针对性地进行靶向药物的研发是当务之急。因此，本领域迫切需要开发可用于检测或判断三阴性乳腺癌的特异标志物。

发明内容

本发明的目的就是提供一种可用于三阴性乳腺癌的特异标志物及其在临床诊断和肿瘤治疗中的用途。

在本发明第一方面，提供了一种蛋白C受体(Procr)的基因、mRNA、cDNA、或蛋白(包括其活性片段)的用途，它被用作检测三阴性乳腺癌的标志物；用于制备检测三阴性乳腺癌或对三阴性乳腺癌进行分型的试剂或试剂盒；用作治疗三阴性乳腺癌的靶点；和/或用于制备治疗三阴性乳腺癌的药物。

在另一优选例中，所述的试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片(如DNA芯片)或蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的蛋白包括全长蛋白或蛋白片段。

在另一优选例中，所述的Procr基因、mRNA、cDNA、或蛋白来源于哺乳动物，更佳地来源于啮齿动物(如小鼠、大鼠)、灵长动物和人。

在另一优选例中，所述检测是测定组织样品。

在另一优选例中，所述的检测还包括检测乳腺癌的转移能力。

在另一优选例中，所述用途还包括用于预测乳腺癌患者生存时间(预后)。

在本发明的第二方面，提供了一种蛋白C受体(Procr)蛋白或其特异性抗体的用途，用于制备检测三阴性乳腺癌的诊断试剂或试剂盒。

更佳地，所述的检测针对三阴性乳腺癌组织样本。

在本发明的第三方面，提供了一种用于检测三阴性乳腺癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒包含：

(a)抗蛋白C受体(Procr蛋白)的抗体；和/或

(b)特异性扩增Procr mRNA或Procr cDNA的引物或引物对。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断三阴性乳腺癌。

在另一优选例中，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断三阴性乳腺癌。

在另一优选例中，所述的抗Procr蛋白的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂盒还用于预测三阴性乳腺癌患者的生存时间或预后。

在本发明的第四方面，提供了一种检测三阴性乳腺癌的方法，该方法包括：

a)准备受试者测试样品；

b)检测测试样品中蛋白C受体(Procr)mRNA或蛋白的表达量，并将表达量检测结果与参比值进行比较，其中Procr的表达量显著高于参比值表明受试者患有三阴性乳腺癌，或患三阴性乳腺癌的几率高于正常人群。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指测试样品的表达量E1与参比值E0之比≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3。

在另一优选例中，所述测试样品为乳腺组织样品。

在另一优选例中，所述的样品包括乳腺癌组织样品。

在本发明的第五方面，提供了一种对乳腺癌进行分型的方法，包括步骤：

(a)提供一乳腺癌组织样品，所述样品为雌激素受体阴性(ER^-)，孕酮受体阴性(PR^-)和Her2阴性(Her2^-)的三阴性乳腺癌；

(b)检测测试样品中蛋白C受体(Procr)基因或蛋白的表达量，并将表达量检测结果与参比值进行比较，其中Procr的表达量显著高于参比值，则将所述乳腺癌样品分型为Procr阳性乳腺癌；否则将所述乳腺癌样品分型为Procr阴性乳腺癌。

在另一优选例中，所述的“显著高于”指测试样品的表达量E1与参比值E0之比≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3。

在另一优选例中，所述参比值为正常乳腺组织或非三阴性乳腺癌样品中Procr的表达量。

在另一优选例中，所述检测步骤(b)包括通过RT-qPCR方法或测序进行检测。

在另一优选例中，所述的检测步骤(b)包括使用抗Procr蛋白的抗体进行检测。

在另一优选例中，检测步骤(b)通过免疫组化或酶联免疫反应法(ELISA法)实现。

在另一优选例中，所述抗Procr蛋白的抗体是单克隆抗体或多克隆抗体(如抗血清)。

在另一优选例中，所述方法还包括评估测试样品中其他乳腺癌标记物的表达。

在另一优选例中，所述的其他乳腺癌标记物包括：甲胎蛋白AFP、雌激素受体，孕酮受体和Her受体或其组合。

在本发明的第六方面，提供了一种蛋白C受体(Procr蛋白)或其特异性抗体的用途，用于制备检测三阴性乳腺癌的诊断试剂或试剂盒。

在另一优选例中，所述的检测为组织样品检测或血清检测。

在另一优选例中，所述的Procr蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在另一优选例中，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

在另一优选例中，所述诊断试剂是单克隆抗体。

在另一优选例中，所述的试剂是蛋白质芯片。

在另一优选例中，所述的核酸芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针，所述的癌症相关基因的特异性寡核苷酸探针包括与Procr多核苷酸(mRNA或DNA)特异性结合的探针。

在另一优选例中，所述的蛋白质芯片包括基片和点样在基片上的癌症相关蛋白的特异性抗体，所述的癌症相关蛋白的特异性抗体包括抗Procr的特异性抗体。

在另一优选例中，所述的特异性抗体是单克隆抗体或多克隆抗体。

在本发明的第八方面，提供了一种用于检测三阴性乳腺癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有Procr蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断三阴性乳腺癌。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果检测对象的Procr蛋白浓度C1与正常人群的参比值C0之比≥1.5，较佳地≥2.0，更佳地≥3，则该对象发生乳腺癌的几率大于正常人群。

在另一优选例中，所述的Procr蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

在本发明的第九方面，提供了一种用于检测乳腺癌的诊断试剂盒，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有特异性扩增Procr mRNA或cDNA的特异性引物；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于通过定量检测Procr的表达量来判断患三阴性乳腺癌的几率。

在另一优选例中，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果检测对象的Procr mRNA的量与一般人群中Procr mRNA的量之比≥1.5(较佳地≥2.0，更佳地≥3)，则该对象发生三阴性乳腺癌的几率大于一般乳腺癌人群。

在本发明的第十方面，提供了一种蛋白C受体(Procr蛋白)基因、RNA、或蛋白的用途，它被用作检测三阴性乳腺癌的标志物或对三阴性乳腺癌进行分型的标志物。

在本发明的第十一方面，提供了一种蛋白C受体(Procr蛋白)的拮抗剂的用途，它被用于制备(a)抑制三阴性乳腺癌细胞生长的药物；(b)降低三阴性乳腺癌细胞转移能力的药物，(c)阻遏三阴性乳腺癌细胞的上皮-间充质转化的特性；或(d)治疗三阴性乳腺癌的药物。

在本发明的第十二方面，提供了一种用于治疗乳腺癌的药物组合物，它含有药学上可接受的载体以及蛋白C受体(Procr蛋白)的拮抗剂。

在另一优选例中，所述的拮抗剂包括：

(i)针对Procr的siRNA、shRNA、反义RNA、抗体、或其组合；

(ii)Procr的可溶性片段或胞外片段，或含有所述片段的融合蛋白。

在另一优选例中，所述的融合蛋白保留了Procr与蛋白C的结合活性。

在另一优选例中，所述的胞外片段的序列为SEQ ID NO.:2中第1-210位或第18–210位，或其保留结合与蛋白C的结合活性的活性片段。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有其他额外的治疗剂。

在另一优选例中，所述的治疗剂是针对Luminal A阳性、Luminal B阳性和/或Her2阳性的乳腺癌的靶点药物或化疗药物。

在另一优选例中，所述的药物通过选自下组的用药方式进行给药：口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、舌下含化、直肠灌注、鼻腔喷雾、口腔喷雾、皮肤局部或全身经皮用药。

在另一优选例中，所述的药物的制剂选自下组：片剂、胶囊剂、注射剂、颗粒剂、喷雾剂。

在另一优选例中，所述的抑制剂以0.05-5mg/kg体重的剂量(每次或每天)施用于哺乳动物。

在另一优选例中，所述的哺乳动物包括人、小鼠、大鼠，更佳地，为人。

在本发明的第十三方面，提供了一种体外检测乳腺组织中Procr mRNA的表达是否异常的方法，包括以下步骤:

A、用特异性Procr的引物，作定量PCR检测,测定待测乳腺组织中Procr mRNA的数值；

B、将步骤A测得的Procr的数值与正常乳腺组织中的Procr的数值进行比较，如测得的数值高于正常值，则表示被检测乳腺组织中Procr的表达异常。

在本发明的第十四方面，提供了一种体外检测乳腺组织中Procr蛋白的表达是否异常的方法，包括以下步骤:

A、用特异性抗Procr的抗体检测待测乳腺组织中Procr蛋白的数量；

B、将步骤A测得的Procr的数量与正常乳腺组织中的Procr的数量进行比较，如测得的蛋白数量高于正常值，则表示被检测乳腺组织中Procr的表达异常。

在本发明的第十五方面，提供了一种(a)治疗乳腺癌，(b)阻遏乳腺干细胞发生上皮-间充质转化；或(c)防止乳腺癌转移的方法，包括步骤：给需要的对象施用蛋白C受体的拮抗剂。

在本发明的第十六方面，提供了一种体外非治疗性的(a)抑制乳腺癌细胞生长，(b)阻遏乳腺癌细胞或乳腺干细胞发生上皮-间充质转化；或(c)抑制乳腺癌细胞转移能力的方法，包括步骤：将所述的细胞与蛋白C受体的拮抗剂进行接触。

在另一优选例中，所述乳腺癌细胞为三阴性乳腺癌细胞。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了人4种亚型乳腺癌样品的Procr免疫组织化学染色结果和阳性样品的比例。

图2定量PCR显示在代表人乳腺癌3种亚型的细胞系中仅三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231高表达Procr。

图3裸鼠成瘤实验显示在MMTV-Wnt1的小鼠乳腺肿瘤模型中，Procr阳性肿瘤细胞表现出更强的成瘤性。

图4免疫组化显示起源于Procr阳性细胞的小鼠乳腺肿瘤中有Procr阳性细胞的聚集。

图5转录组分析显示正常小鼠的乳腺干细胞表现出明显的上皮-间充质转化特性，该特性在肿瘤发生和转移过程中具有重要作用。

图6裸鼠成瘤实验显示在MMTV-Wnt1小鼠乳腺肿瘤细胞中，移植5倍数量的Procr阴性肿瘤细胞能够使得其形成的原位肿瘤的大小与Procr阳性肿瘤细胞形成的原位肿瘤的大小达到相似水平。

图7裸鼠成瘤实验显示在MMTV-Wnt1小鼠乳腺肿瘤细胞中，Procr阳性肿瘤细胞具有更强的肺转移能力，而Procr阴性的肿瘤细胞不能转移。

图8免疫组化显示Procr阳性的小鼠肿瘤细胞形成的肺部转移灶中有Procr阳性肿瘤细胞聚集。

图9裸鼠成瘤实验显示Procr敲低的人三阴性乳腺肿瘤细胞成瘤能力明显减弱。

图10免疫荧光染色显示在小鼠肿瘤细胞系4T1中敲低Procr显著抑制其上皮-间充质转化。

图11免疫荧光染色显示在人三阴性乳腺癌细胞中敲低Procr能够抑制其上皮-间充质转化。

图12裸鼠成瘤实验显示Procr敲低的人三阴性乳腺肿瘤细胞转移受到明显抑制。

图13人Procr胞外区段可溶性多肽片段的制备及免疫荧光染色显示其阻断人三阴性乳腺癌细胞的上皮-间充质的转化。

图14显示了目前乳腺癌的分型以及靶向药物。

图15显示了Procr的表达与(a)乳腺癌病人的存活率低存在相关性。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次意外地发现，Procr在三阴性乳腺癌组织特异性高表达，因此可用作三阴性乳腺癌标志物，尤其是作为三阴性乳腺癌进一步分型的标志物。实验结果显示，Procr的表达与(a)乳腺癌病人的存活率低、(b)增强肿瘤干细胞的特性以及(c)在肿瘤模型中的高转移能力存在密切的相关性。因此，Procr可以作为检测三阴性乳腺癌或进一步分型的极其有用的标志物。本发明的实验还进一步证明：抑制Procr其活性可以有效地遏制三阴性乳腺癌细胞生长及转移，因此该分型标志物是一种极有价值的三阴性乳腺癌的治疗靶点。在此基础上完成了本发明。

具体地，通过对不同亚型人乳腺癌临床样本的组织切片进行Procr免疫组化染色分析，本发明人发现了三阴性乳腺癌的新的细胞表面标记分子Procr，其能够作为三阴性乳腺癌诊断标记，并证明能够作为靶点，进行针对性的药物研发。

试验表明，Procr阳性标记的肿瘤细胞具有更强的成瘤能力；敲低Procr使得成瘤性降低。

试验表明，Procr阳性标记的肿瘤细胞具有典型的上皮-间充质转化的特性；在三阴性乳腺癌细胞中敲低Procr显著抑制上皮-间充质转化，进而阻断三阴性乳腺癌细胞的转移。

在靶向性治疗方面，本发明人利用shRNA或Procr胞外可溶性多肽片段成功地抑制了人三阴性乳腺癌细胞的肿瘤发生和转移。阻断Procr功能将成为未来三阴性乳腺癌的治疗的重要方向。

术语

如本文所用，术语“三阴性乳腺癌(Triple Negative Breast Cancer，TNBC)”指雌激素受体阴性(ER-)，孕酮受体阴性(PR-)和Her2阴性(Her2—)的乳腺癌。

样品

本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料，从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样品可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。样品也可以是以某种方式与受试者接触过的材料，这种接触方式使得对样品进行的测试可以提供与受试者有关的信息。样品也可以是已经与其它材料接触过的材料，这种其它材料不是受试者的，但是能够使第一材料随后被测试以确定与受试者有关的信息，例如样品可以是探针或解剖刀的清洗液。样品可以为接触受试者之外的生物材料源，只要本技术领域的专业人员仍然能够从样品确定与受试者有关的信息就行。

表达

如本文所用，术语“表达”包括mRNA从基因或基因部分的产生，并且包括由RNA或基因或基因部分所编码的蛋白质的产生，还包括与表达相关的检测物质的出现。例如，cDNA，结合配体(如抗体)与基因或其它寡核苷酸、蛋白质或蛋白质片段的结合以及结合配体的显色部分都包括在术语“表达”的范围内。因此，在免疫印迹如western印迹上半点密度的增加也处于以生物学分子为基础的术语“表达”的范围内。

参比值

如本文所用，术语“参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中，参比值是根据对比较Procr蛋白的表达与已知的临床结果的研究进行的统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是，来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。

非乳腺癌样品

如本文所用，术语“非乳腺癌样品”包括但不限于未患有乳腺癌的人群，乳腺癌患者的非乳腺癌组织。

Procr蛋白和多核苷酸

在本发明中，术语“本发明蛋白”、“Procr蛋白”、“Procr多肽”或“蛋白C受体”可互换使用，都指具有蛋白C受体氨基酸序列的蛋白或多肽。它们包括含有或不含起始甲硫氨酸的Procr蛋白。此外，该术语还包括全长的Procr及其片段。本发明所指的Procr蛋白包括其完整的氨基酸序列、其分泌蛋白、其突变体以及其功能上活性的片段。

Procr蛋白是一种针对活化的蛋白C的受体，而蛋白C是一种在凝血途径中被激活的丝氨酸蛋白酶。

人的Procr蛋白全长为238个氨基酸(序列号:Q9UNN8或SEQ ID NO.:2)。其中，第1-17位为信号肽。结构分析表明，胞外区为第18–210位(长度193aa)，跨膜区域为第211–231位；胞质区域为第232–238位。

鼠的Procr蛋白全长为242个氨基酸(序列号:Q64695或SEQ ID NO.:4)。其中，第1-17位为信号肽。结构分析表明，胞外区为第18–214位(长度197aa)，跨膜区域为第215–235位；胞质区域为第236–242位。

在本发明中，术语“Procr基因”、“Procr多核苷酸”或“蛋白C受体基因”可互换使用，都指具有Procr核苷酸序列的核酸序列。

人Procr基因的基因组全长44815bp(NCBI GenBank登录号为NC_000020.11)，其转录产物mRNA序列全长717bp(NCBI GenBank登录号为NM_006404.4或如SEQ ID NO.:1所示)。

鼠Procr基因的基因组全长4354bp(NCBI GenBank登录号为NC_000068.7)，其转录产物mRNA序列全长729bp(NCBI GenBank登录号为NM_011171.2或如SEQ ID NO.:3所示)。

人和鼠Procr，在DNA水平的相似性为76％，蛋白序列相似性为74％。

需理解的是，当编码相同的氨基酸时，密码子中核苷酸的取代是可接受的。另外需理解的是，由核苷酸取代而产生保守的氨基酸取代时，核苷酸的变换也是可被接受的。

在得到了Procr的氨基酸片段的情况下，可根据其构建出编码它的核酸序列，并且根据核苷酸序列来设计特异性探针。核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的Procr核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(如载体)和细胞中。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的Procr多肽。一般来说有以下步骤：

(1).用本发明的编码人Procr多肽的多核苷酸(或变异体)，或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转导合适的宿主细胞；

(2).在合适的培养基中培养的宿主细胞；

(3).从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

本发明中，Procr多核苷酸序列可插入到重组表达载体中。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用。表达载体的一个重要特征是通常含有复制起点、启动子、标记基因和翻译控制元件。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含Procr编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属的细菌细胞；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞；动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

抑制剂

利用本发明蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Procr蛋白发生相互作用的物质，尤其是抑制剂等。

本发明Procr蛋白的抑制剂(包括抗体、反义核酸、小分子化合物以及其他抑制剂)，当在治疗上进行施用(给药)时，可抑制Procr蛋白的表达和/或活性，进而抑制肿瘤的转移或肿瘤细胞的迁移。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药。

可用于本发明的抑制剂包括：Procr的抗体、抑制性mRNA、Procr核酸的反义RNA、siRNA、shRNA、小分子化合物以及Procr的活性抑制剂。其中，典型的Procr抑制剂为抑制性miRNA、siRNA。

典型地，将Procr基因作为制备预防或治疗肿瘤转移或肿瘤细胞迁移的药物的靶点的技术方案包括以下方案：

1.化学合成双链核糖核酸分子，其序列特异性针对Procr基因序列。可利用本领域常规的方法来设计和合成特异性针对Procr的核酸序列(如siRNA)。

2.利用各种载体，包括DNA载体、慢病毒载体来干扰Procr基因的表达，达到体内干扰Procr基因的效果，从而实现抑制肿瘤增殖的目的。

3.获得能够特异性抑制Procr基因转运活性的多肽、单克隆抗体，达到抑制Procr活性的目的，从而现实抑制肿瘤细胞转移或迁移的目的。

本发明还提供了一种药物组合物，它含有安全有效量的本发明Procr抑制剂(如抗体、反义序列(如siRNA)、或抑制剂)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克-10毫克/千克体重。

特异性抗体

在本发明中，术语“本发明抗体”和“抗Procr的特异性抗体”可互换使用。

本发明还包括对人Procr多肽具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于人Procr基因产物或片段。较佳地，指那些能与人Procr基因产物或片段结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明中抗体包括那些能够结合并抑制人Procr蛋白的分子，也包括那些并不影响人Procr蛋白功能的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的人Procr基因产物结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab'或(Fab)2片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子(Ladner等人，美国专利No.4,946,778)；或嵌合抗体，如具有鼠抗体结合特异性但仍保留来自人的抗体部分的抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的人Procr基因产物或者其具有抗原性的片段，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达人Procr蛋白或其具有抗原性的片段的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人,Nature 256；495,1975；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：511,1976；Kohler等人,Eur.J.Immunol.6：292,1976；Hammerling等人,In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,N.Y.,1981)。本发明的抗体包括能阻断人Procr蛋白功能的抗体以及不影响人Procr蛋白功能的抗体。本发明的各类抗体可以利用人Procr基因产物的片段或功能区，通过常规免疫技术获得。这些片段或功能区可以利用重组方法制备或利用多肽合成仪合成。与人Procr基因产物的未修饰形式结合的抗体可以用原核细胞(例如E.Coli)中生产的基因产物来免疫动物而产生；与翻译后修饰形式结合的抗体(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核细胞(例如酵母或昆虫细胞)中产生的基因产物来免疫动物而获得。

抗人Procr蛋白的抗体可用于免疫组织化学技术中，检测标本(尤其是组织样本或血清样本)中的人Procr蛋白。由于Procr蛋白存在胞外区，因此在胞外区脱落并进入血液的情况下，这些可溶性的Procr胞外区就可成为血清检测的靶对象。

检测方法

利用Procr存在于三阴性乳腺癌细胞或组织中，且与三阴性乳腺癌密切相关这一特点，本发明还提供了检测三阴性乳腺癌或进一步分型的方法。

在本发明的一个优选例中，本发明提供一种检测Procr的ELISA法以及时间分辨免疫荧光法(TRFIA)。

检测试剂盒

基于Procr与三阴性乳腺癌的相关性，即Procr在乳腺癌组织中高表达并且在三阴性乳腺癌病人中含量非常高，因此Procr可以作为三阴性乳腺癌的一种诊断或分型标志物。

本发明还提供了一种检测乳腺癌的试剂盒，它含有本发明的抗Procr的免疫球蛋白或免疫偶联物，或其活性片段；或者含有特异性扩增Procr的mRNA或cDNA的引物。

在另一优选例中，本发明还提供了Procr的诊断试剂盒，包括：Procr mRNA诊断试剂盒或Procr酶联免疫(ELISA)检测试剂盒。

药物组合物

本发明还提供了一种药物组合物，它含有上述的Procr的拮抗剂(含量为0.001-99wt％，较佳地0.01-90wt％)，以及药学上可接受的载体(含量为余量)。所述的药物组合物可用于抑制乳腺癌细胞的生长。

在本发明中，所述的拮抗剂包括针对Procr的siRNA、反义RNA、抗体、或其组合。此外，所述的拮抗剂还包括可以降低Procr表达或活性的小分子化合物。一类特别优选的拮抗剂包括(但并不限于)：Procr的可溶性片段或胞外片段，或含有所述片段的融合蛋白。典型地，所述的胞外片段的序列为SEQ ID NO.:2中第1-210位或第18–210位，或其保留结合与蛋白C的结合活性的活性片段。

通常，可将Procr拮抗剂配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、口服、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于抑制乳腺癌细胞(尤其是三阴性乳腺癌细胞)的生长。此外，还可与其他肿瘤治疗剂联用。代表性的例子包括(但并不限于)：图14中所示的针对乳腺癌的靶点药物。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明上述的Procr拮抗剂以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明的Procr拮抗剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约8毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

激动剂

利用本发明的Procr蛋白，通过各种常规筛选方法，可筛选出与Procr蛋白发生相互作用的物质，尤其是激动剂等。

本发明的Procr基因、蛋白或其激动剂特别适用于体外肿瘤细胞的培养以及肿瘤动物模型的制备，尤其是肿瘤细胞肺转移、远处转移或腹腔转移动物模型建模。

筛选方法

本发明还提供了基于Procr进行药物筛选的方法。一种方法是先筛选影响(抑制)Procr表达或活性的化合物，然后对筛选出的化合物进一步测试其对癌细胞的抑制作用。

其中，代表性的癌细胞包括乳腺癌细胞，尤其是三阴性乳腺癌细胞。

本发明提供的筛选预防或治疗肿瘤转移、肿瘤细胞迁移或提高化疗药物敏感性的候选化合物的方法，基于该化合物对Procr的表达量和/或活性的影响，一种典型的筛选方法包括步骤：

(a)测试组中，在细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察所述测试组的细胞中Procr的表达量和/或活性；在对照组中，在相同细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察对照组的所述细胞中Procr的表达量和/或活性；

其中，如果测试组中细胞的Procr的表达量和/或活性小于对照组，就表明该测试化合物是对Procr的表达和/或活性有抑制作用的治疗乳腺癌的候选化合物。和/或

(b)对于步骤(a)中获得的候选化合物，进一步测试其对癌细胞转移或迁移的抑制作用。如，在测试组中，癌细胞的培养体系中添加测试化合物，并观察癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；在对照组中，在癌细胞的培养体系中不添加测试化合物，并观察癌细胞移动的距离的数量和/或侵袭情况；其中，如果测试组中癌细胞的迁移距离或侵袭数量显著小于对照组，就表明该测试化合物是对癌细胞迁移能力有抑制作用的候选化合物。

检测方法和试剂盒

本发明涉及定量和定位检测人Procr蛋白水平或mRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人Procr蛋白水平，可以用于诊断(包括辅助诊断)乳腺癌的发生与否或是否转移。

一种检测样品中是否存在Procr蛋白的方法是利用Procr蛋白的特异性抗体进行检测，它包括：将样品与Procr蛋白特异性抗体接触；观察是否形成抗体复合物，形成了抗体复合物就表示样品中存在Procr蛋白。

Procr蛋白或其多核苷酸可用于Procr蛋白相关疾病的诊断和治疗。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上，用于分析组织中基因的差异表达分析和基因诊断。抗Procr的抗体可以固定在蛋白质芯片上，用于检测样品中的Procr蛋白。

本发明还提供了一种检测乳腺癌的试剂盒，它含有特异性扩增Procr的引物对和/或Procr特异性抗体以及标签或说明书。

其中，所述的标签或说明书注明以下内容：当检测对象的Procr的mRNA表达量与癌旁组织的Procr的mRNA表达量之比≥1.5，则提示该检测对象肿瘤转移的几率高于Procr低表达的乳腺癌患者。

本发明的主要优点包括：

(1)乳腺癌作为危害妇女的最常见的恶性肿瘤，早发现早治疗是提高病人存活率的最有效手段。Procr是本发明人首次发现的一个三阴性乳腺癌的细胞表面标志物，可应用于乳腺癌分型的诊断。

(2)与一般仅具有检测作用的标志物不同，Procr不仅可作为目前临床上无法进一步分型的三阴性乳腺癌的分型标志物，还是有效治疗乳腺癌(尤其是三阴性乳腺癌)的靶点。抑制Procr的功能可以有效地遏制三阴性乳腺癌的发生及转移，这对于提高三阴性乳腺癌的治疗效果具有极其重要的意义。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

通用方法

免疫组化染色

检测材料及其制备：选取乳腺癌患者的乳腺癌及相应的癌旁组织样本，4％多聚甲醛4℃条件下固定1小时。PBS缓冲液浸洗三次，每次10min。结束后，将固定好的样品经50％，70％，85％，95％，100％，100％梯度乙醇脱水、二甲苯透明，然后在55～60℃条件下进行石蜡包埋，切片机切片，切片厚4-10μm，贴于多聚赖氨酸处理过的干净载玻片上，37℃烤片过夜，之后收集于载片盒中，4℃密封保存。

操作方法：取制备好的组织切片，首先进行二甲苯脱蜡、梯度乙醇复水，然后加入0.3％过氧化氢37℃孵育15分钟，去内源性过氧化物酶；PBS浸洗，5分钟×3次；羊血清室温封闭1小时，加入大鼠抗人Procr单抗(购自Abcam公司，1：200稀释)，4℃孵育过夜；PBS+0.2％TritonX-100(购自sigma)-浸洗，20分钟×3次；加入HRP标记的羊抗大鼠即用型二抗(购自Millipore公司)，室温反应2小时；PBS+0.2％TritonX-100浸洗，20分钟×3次；DAB底物溶液(购自中杉金桥公司)显色，苏木素复染，乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

裸鼠成瘤试验

将Procr阴性和阳性的细胞分别注射到3周雌性裸鼠右侧第四对乳腺。3个月后观察肿瘤的形成情况。

细胞系

人三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231)购自ATCC。产品号

HTB-26^TM

实施例1

Procr在三阴性乳腺癌样本及细胞系中高表达

1.1免疫组织化学染色

利用免疫组织化学染色的方法，在人4种乳腺癌亚型中，检测Procr的表达。

具体步骤：共收集311例人乳腺癌临床样本的组织切片。

免疫组织化学染色结果如图1所示，在三阴性乳腺癌样本中，约86％为Procr阳性(n＝113)；而在Lumimal A、Luminal B、Her2阳性乳腺癌中Procr阳性率显著较低，分别为(约14％,n＝79)、(约12％,n＝58)和(26％,n＝61)。

该结果表明，Procr在三阴性乳腺癌中广泛高表达，可作为三阴性乳腺癌诊断的分子标记。

1.2定量PCR

采用Real-time QPCR的方法，分别检测了不同亚型人乳腺癌代表细胞系(其中三阴性代表细胞系MDA-MB-231、2M4、Hs578T、Luminal A/B型代表细胞系MCF7、Her2阳性代表细胞系SK-BR-3)中Procr表达情况。

结果发现，Procr在三阴性乳腺癌细胞系(MDA-MB-231,2M4、Hs578T)中高表达，而在luminal A/B及Her2类型的细胞系中低表达(图2)。

实施例2

Procr阳性的乳腺癌肿瘤细胞具有更强的成瘤性

具体步骤：将已形成乳腺肿瘤的MMTV-Wnt1小鼠处死后，取出其肿瘤组织并剪碎，利用胶原酶将组织块消化。消化后的乳腺经红细胞裂解液处理后用胰酶消化至单细胞。借助流式细胞分选仪，利用anti-Ter119-FITC,anti-CD31-FITC,anti-CD45-FITC抗体去除乳腺中的血液系统相关组分，利用anti-CD29-APC和anti-CD24-PE-Cy7区分出乳腺肿瘤的上皮细胞，再利用anti-Procr-PE获取Procr阳性和Procr阴性的乳腺肿瘤上皮细胞。

将分选得到的Procr阴性和阳性的细胞分别注射到3周雌性裸鼠右侧第四对乳腺。3个月后观察肿瘤的形成情况。

结果如图3所示。Procr阳性细胞能够形成明显的原位肿瘤，而Procr阴性细胞不能形成原位肿瘤或仅形成极小的肿瘤。表明Procr阳性细胞具有明显的肿瘤干细胞的特性。

此外，免疫荧光染色的结果显示，Procr阳性肿瘤细胞形成的原位肿瘤中的确有Procr阳性细胞的聚集。Procr阴性的细胞也能形成少量且体积更小的原位肿瘤，免疫荧光染色的结果显示肿瘤中没有Procr阳性细胞(如图4)。(注：图中，K14阳性细胞代表从乳腺来源的上皮细胞，区分于肺上皮细胞。)

上述结果提示，Procr阳性肿瘤细胞表现出更强的成瘤性，并且起源于Procr阳性细胞的小鼠乳腺肿瘤中有Procr阳性细胞的聚集。

实施例3

Procr阳性正常小鼠乳腺干细胞表现出典型的上皮-间充质相互转化性质

具体步骤：将成年雌鼠安乐死后，取出其乳腺组织并剪碎，利用胶原酶将组织块消化。消化后的乳腺经红细胞裂解液处理后用胰酶消化至单细胞。借助流式细胞分选仪，利用anti-Ter119-FITC,anti-CD31-FITC,anti-CD45-FITC抗体去除乳腺中的血液系统相关组分，利用anti-CD29-APC和anti-CD24-PE-Cy7区分出乳腺上皮的基底层细胞，再利用anti-Procr-PE获取Procr阳性和Procr阴性的乳腺上皮细胞。

将获取的Procr阳性和Procr阴性细胞进行RNA的测序，通过聚类分析，发现Procr阳性的乳腺干细胞具有明显的上皮-间充质转化的特性。

如图5a所示。上皮-间充质转化中发挥重要功能的转录因子Zeb1，Zeb2，FoxC2及Twist在Procr阳性细胞中高表达。同时，Procr阳性细胞中，上皮-间充质转化过程中的效应基因Vimentin(Vim)，N-Cadherin(N-Cad)高表达，E-Cadherin(E-Cad)，EpCam低表达。相关RNA测序结果也利用Real-time QPCR得到验证(如图5b所示)。

事实上，在肿瘤的发生和转移过程中常伴有上皮-间充质转化的现象，Procr阳性细胞表现出的上皮-间充质转化特性，提示这群细胞具有更强的向肿瘤细胞特别是肿瘤干细细胞转变的倾向。重要的是，Procr阳性细胞的Claudins低表达(如图5a所示)，而在人的乳腺癌研究中，Claudin低表达的乳腺癌被认为是从乳腺干细胞起源的。这些实验数据揭示，Procr阳性细胞在正常乳腺组织中已经具有了肿瘤细胞的上皮-间充质转化的特性，提示了Procr阳性细胞可能更具有肿瘤发生的易感性。

实施例4

Procr阳性肿瘤细胞具有更强的转移能力

在本实施例中，利用MMTV-Wnt1小鼠的新鲜肿瘤分选Procr阴性和阳性的肿瘤上皮细胞进行裸鼠成瘤实验，结果表明，Procr阳性肿瘤细胞具有更强的转移能力

具体步骤:实验步骤同实施例2相同。不同点在于：由于Procr阴性肿瘤细胞的原位肿瘤较Procr阳性细胞明显偏小，为保证在原位肿瘤大小一致的条件下衡量肿瘤细胞的转移能力，将注射的Procr阴性小鼠的细胞数量提高5倍(Procr阳性2000细胞；Procr阴性10000细胞)。

三个月后的结果如下：

裸鼠成瘤实验显示，在MMTV-Wnt1小鼠乳腺肿瘤细胞中，移植5倍数量的Procr阴性肿瘤细胞能够使得其形成的原位肿瘤的大小与Procr阳性肿瘤细胞形成的原位肿瘤的大小达到相似水平(图6)。

安乐死小鼠后取出小鼠的肺进行分析。在原位肿瘤大小相似的条件下，Procr阳性肿瘤细胞表现出更强的肺转移能力，而Procr阴性肿瘤细胞无肺转移(图7)。

免疫荧光染色证明肺部转移灶中存在Procr阳性肿瘤细胞(图8)。

这些结果表明，Procr阳性的乳腺癌肿瘤细胞具有更强的成瘤性和转移能力。

实施例5

通过敲低Procr可以抑制乳腺癌肿瘤细胞的成瘤性和侵袭转移能力

在本实施例中，通过敲低Procr来观察其对乳腺癌肿瘤细胞的成瘤性和侵袭转移能力的影响。

5.1通过ShRNA敲低Procr，降低成瘤能力

具体步骤:构建可用于慢病毒包装的的人Procr shRNA。序列如下：

人Procr-shRNA3：TGGCCTCCAAAGACTTCATAT(SEQ ID NO.:6)

将慢病毒包装载体质粒pCMVΔR8.2，pCMV-VSV-G质粒(购自Addgene公司)和ProcrshRNA的慢病毒载体质粒共同转入293T细胞(质粒比例为6：4：10；每4×10⁶细胞中转入20μg质粒)，转染后16至24小时更换新鲜培养液；更换新鲜培养液后24小时和48小时分别收取含有慢病毒颗粒的上清，并以20000RPM，超速离心2小时进行制备浓缩Procr shRNA的慢病毒颗粒。同时制备用于对照的不靶向任何基因的Scramble shRNA慢病毒颗粒。

取5周左右雌性裸鼠，将感染scramble shRNA和Procr shRNA的人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231注射到小鼠右侧第四对乳腺。40天后，将裸鼠处死，取出其形成的乳腺原位肿瘤进行分析。

结果如图9所示。与对照组相比，Procr敲低的MDA-MB-231细胞形成的原位肿瘤显著变小。这表明，Procr敲低的人源三阴性乳腺肿瘤细胞成瘤能力明显减弱。

5.2通过ShRNA敲低Procr，降低上皮间充质转化

本试验利用shRNA敲低Procr，观察鼠源肿瘤细胞系(4T1)和人源三阴性肿瘤细胞系(MDA-MB-231)的上皮间充质转化情况。

具体步骤：构建小鼠Procr shRNAs，序列如下：

小鼠Procr-shRNA6：TTGTGTGGAGTTCCTGGAGAA(SEQ ID NO.:7)

Procr-shRNA7：TCGGTATGAACTGCAGGAATT(SEQ ID NO.:8)

在表达Procr的小鼠肿瘤细胞系4T1中感染Procr shRNA以敲低Procr表达，3天后将细胞转移至盖玻片培养，12小时后经Vim抗体免疫荧光染色。

结果表明，与对照组感染Scramble shRNA的细胞相比，感染Procr shRNA的4T1细胞Vim表达显著降低，且细胞形态从长梭状变成球状。提示其上皮-间充质转化过程受到明显抑制(图10)。

类似地，在人三阴性乳腺癌细胞系中通过感染Procr shRNA慢病毒敲低Procr。通过Vim免疫荧光染色进行观察。

结果表明，在人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中敲低Procr，与鼠源肿瘤细胞系4T1相类似，细胞形态从长梭状变为球状且Vim表达明显降低，提示敲低Procr能够显著抑制人三阴性乳腺癌细胞的上皮间充质转化(图11)。

5.3 Procr敲低的人三阴性乳腺肿瘤细胞,转移受到明显抑制

具体步骤：取5周左右雌性裸鼠，将感染scramble shRNA和Procr shRNA的人三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231注射到小鼠右侧第四对乳腺。40天后，将裸鼠处死，取出其肝脏进行分析。

裸鼠成瘤实验显示，Procr被敲低后，人三阴性乳腺肿瘤细胞转移受到明显抑制(图12)。

实施例6

Procr胞外区段可溶性多肽阻断人三阴性乳腺癌细胞的上皮-间充质的转化

利用Procr胞外可溶性片段抑制Procr的信号转导功能，从而抑制的上皮间充质转化

具体步骤：构建人Procr胞外段(不含信号肽区)克隆所用的PCR引物如下：

Procr-F:TAGCGGCCGCCTGCACCT(SEQ ID NO.:9)

Procr-R:CGGGATCCGGACCCAGGACCAG(SEQ ID NO.:10)

将扩增产物(带有BamHI和NotI酶切位点)，克隆入pCMV-Fc质粒(购自Addgene公司)的相同酶切位点，获得构建的质粒。

将构建的质粒转染常规293T细胞，24小时后将培养液更换为CD293+1％GlutaMax+1％PS。每隔24h收取上清，2000rpm离心去除细胞碎片，5天后将所有上清收集并加入干净的ProteinA beads过夜。第二天将beads用PBS清洗3次，用130ul pH 3.0的glycine-HCl洗脱，用500ul pH 9.5的tris-base中和。将得到的可溶性片段透析过夜。经SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色确定其蛋白大小。同法纯化用作对照的IgG-Fc区段。

纯化蛋白结果如图13a所示。其中，Procr胞外区段蛋白(蛋白修饰后大小)：35KD；IgG蛋白为35KD；Procr胞外区段(修饰后)与IgG的融合蛋白为70KD。

所制备的纯化的融合蛋白中Procr胞外区的氨基酸序列如SEQ ID NO.:5所示，对应于SEQ ID NO.:2中的第1-210位，其中去除信号肽的成熟肽对应于SEQ ID NO.:2中的第18-210位。

MLTTLLPILL LSGWAFCSQD ASDGLQRLHM LQISYFRDPY HVWYQGNASL GGHLTHVLEG

PDTNTTIIQL QPLQEPESWA RTQSGLQSYL LQFHGLVRLV HQERTLAFPL TIRCFLGCEL

PPEGSRAHVF FEVAVNGSSF VSFRPERALW QADTQVTSGV VTFTLQQLNA YNRTRYELRE

FLEDTCVQYV QKHISAENTK GSQTSRSYTS(SEQ ID NO.:5)

按照1:50稀释比例(0.5ug/ml)将可溶性Procr片段与IgG片段(对照)分别加入正在玻片上培养的MEA-MB-231细胞中，24小时后进行免疫荧光染色，结果如图13b所示。

构建的可溶性片段能够像Procr shRNA一样，使得MB-231细胞的形态发生从梭状到球状的转变，即影响其上皮-间充质转化(图13)。

这表明，Procr的可溶性片段也能够有效地阻断Procr的功能，可用作三阴性乳腺癌的治疗剂以及完整Procr的竞争性抑制剂。

实施例7

Procr的表达与乳腺癌病人的存活率低存在相关性

乳腺癌病人基因表达及生存信息来自于包含1809例乳腺癌组织microarray的数据库(Gyorffy et al.,2010)(Affymetrix HGU133A and HGU133+2microarrays)。根据激素受体的表达情况，病人被分为激素受体阳性和激素受体阴性两组。进一步地，根据Procr表达的高低，病人被分为Procr高表达和Procr低表达两组。Kaplan-Meier曲线显示Procr高表达(红线)和Procr低表达(黑线)的乳腺癌病人的存活率。

结果如图15显示。该数据表明，在激素受体阴性组病人(即三阴性乳腺癌症病人中)，Procr的表达与乳腺癌病人的存活率低存在明显的相关性。

实施例8

检测三阴性乳腺癌的试剂盒

制备一用于检测乳腺癌的试剂盒，所述试剂盒包括:

(a)第一容器，以及位于容器内的特异性针对Procr的以下抗体：大鼠抗人Procr单抗(可购自Abcam公司，捕获抗体)；

(b)以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断三阴性乳腺癌；以及

(c)任选的第二容器，以及位于容器内的检测抗体：兔抗人Procr多抗(可购自Proteintech公司，检测抗体)。

用上述检测试剂盒，通过ELISA法定量检测了样本中Procr的含量。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种蛋白C受体(Procr)的mRNA、cDNA、或蛋白的用途，其特征在于，它被用于制备检测三阴性乳腺癌或对三阴性乳腺癌进行分型的试剂或试剂盒。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的试剂包括抗体、引物、探针、测序文库、核酸芯片或蛋白质芯片。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的检测还包括检测乳腺癌的转移能力。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，其特征在于，所述的试剂盒包含：

(a)抗蛋白C受体(Procr蛋白)的抗体；和/或

(b)特异性扩增Procr mRNA或Procr cDNA的引物或引物对。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒还包括标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断三阴性乳腺癌。

6.一种蛋白C受体(Procr蛋白)或其特异性抗体的用途，其特征在于，用于制备检测三阴性乳腺癌的诊断试剂或试剂盒。

7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的检测为组织样品检测或血清检测。

8.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的Procr蛋白或其特异性抗体偶联有或带有可检测标记。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述可检测标记选自下组：生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。

10.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述诊断试剂是单克隆抗体。

11.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有Procr蛋白或其特异性抗体；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测或诊断三阴性乳腺癌。

12.如权利要求11所述的用途，其特征在于，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果检测对象的Procr蛋白浓度C1与正常人群的参比值C0之比≥1.5，则该对象发生乳腺癌的几率大于正常人群。

13.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述的试剂盒含有一容器，所述容器中含有特异性扩增Procr mRNA或cDNA的特异性引物；以及标签或说明书，所述标签或说明书注明所述试剂盒用于通过定量检测Procr的表达量来判断患三阴性乳腺癌的几率。

14.如权利要求13所述的用途，其特征在于，所述的标签或说明书中注明以下内容：

如果检测对象的Procr mRNA的量与一般人群中Procr mRNA的量之比≥1.5，则该对象发生三阴性乳腺癌的几率大于一般乳腺癌人群。

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