CN104548131B - Vgll4基因治疗肿瘤的用途及其相关药物 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域,具体涉及VGLL4基因治疗肿瘤的用途及其相关药物。本发明公开了分离的VGLL4基因及其同源序列,以及VGLL4蛋白及其相关蛋白在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途。本发明研究发现VGLL4通过抑制YAP介导的TEAD4转录激活,从而抑制在胃癌中高表达的TEAD4靶基因CDX2的转录,最终达到抑制癌细胞增殖的目的。本发明可用于制备抑制肿瘤细胞生长的药物、开发抗癌药物,以及制备癌症早期诊断和制备手术预后药物,为癌症的治疗提供了新的技术手段,极具市场价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,具体涉及VGLL4基因治疗肿瘤的用途及其相关药物。
背景技术
胃癌是全世界范围内仅次于肺癌的发生率的癌症,其预后较差,死亡率很高。然而,目前对于胃癌发生的分子机制还不甚清楚,也没有有效的检测手段可以检测早期胃癌,对于胃癌相关的原癌基因和抑癌基因还有待于进一步深入的研究。
近年来的研究发现Hippo信号通路中的关键转录共激活因子YAP在肺癌、肝癌、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌中表达明显上调,是一个原癌基因。
Hippo信号通路参与细胞增殖,细胞分化以及细胞凋亡等生理过程,在器官大小调控中起着至关重要的作用。Hippo信号通路,从果蝇到人,在进化上都十分保守。Hippo信号通路的核心激酶MST1/2和Lats1/2被激活后产生激酶级联效应,使该通路下游的转录共激活因子YAP/TAZ被磷酸化,进而与14-3-3蛋白相互作用而被滞留在胞质中,阻碍其入核与DNA结合转录因子TEAD/TEF的相互作用,从而抑制TEAD/TEF的转录活性。反之,YAP 入核之后则与TEAD/TEF结合形成活性的转录复合物,启动下游靶基因的转录,从而抑制细胞凋亡,促使细胞增殖。因此,Hippo信号通路的紊乱会引起抗凋亡作用,使细胞过度增殖,增加癌症的患病风险。
VGLL4基因是转录共调节因子,其在果蝇中的同源基因Vestigial 4(Vg)在果蝇翅膀的发育中起到关键的调节作用,在功能上它与YAP密切相关。Vg不具有DNA结合结构域,它与Sd通过Tondu(TDU)结构域相互作用,形成“杂合型”共转录调控复合物调控基因转录。哺乳动物中VGLL1-3的N端具有一个保守的TDU结构域,而VGLL4的C端具有两个保守性相对较低的TDU结构域。VGLL蛋白的TDU结构域,介导其与TEAD蛋白的相互作用。
发明内容
本发明的目的在于公开VGLL4基因及其同源基因治疗肿瘤的用途及其相关药物,其中, VGLL4通过抑制YAP介导的TEAD4转录激活,从而抑制在胃癌中高表达的TEAD4靶基因CDX2等的转录,最终达到抑制癌细胞增殖的目的。
本发明首先公开了分离的VGLL4基因及其同源序列在制备或筛选肿瘤治疗药物,或者在制备肿瘤诊断药物中的用途。
优选的,所述肿瘤选自胃癌。
VGLL4基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:59所示(可参考genebank中序列号为 NM_001128219.1的序列)。
优选的,所述VGLL4的同源序列为与genebank中标号为NM_001128219.1所示序列的核苷酸序列在确定的分子长度内,序列显示有至少约50%;优选至少约为75%;更佳至少约为80-85%;尤其佳至少约为90%;最佳至少约为95-98%序列相似性的DNA序列。
更优选的,所述VGLL4的同源序列选自小鼠VGLL4基因或果蝇Vestigial 4基因。
所述VGLL4基因及其同源序列在制备肿瘤诊断药物中的用途,是指将VGLL4基因表达水平作为一项肿瘤诊断指标应用于肿瘤诊断药物的制备。
所述VGLL4基因及其同源序列在制备或筛选肿瘤治疗药物中的用途,是指以VGLL4基因为目的基因,制备或筛选能调控(上调或下调)该基因表达的药物。
所述通过分离的VGLL4基因制备或筛选获得的肿瘤治疗药物或者肿瘤诊断药物包括但不限于:核酸分子、碳水化合物、脂类、小分子化学药、抗体药、多肽、蛋白或干扰慢病毒。
所述肿瘤治疗药物的施用量为足够改变人VGLL4基因的转录或翻译,或者足够改变人 VGLL4蛋白的表达或活性的剂量。
采用前述肿瘤治疗药物治疗肿瘤的方法,主要是通过过表达人VGLL4基因,通过有效阻断YAP与TEAD的相互作用,从而抑制TEAD的转录激活,最终达到抑制肿瘤细胞增殖的目的。具体的,治疗时,将能过表达VGLL4基因的物质给药于患者。
本发明第二方面公开了一种治疗肿瘤的多肽或蛋白药物,所述多肽或蛋白含有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
优选的,所述多肽的序列如SEQ ID NO:1所示,为VGLL4的串联TDU结构域;所述蛋白的序列如SEQ ID NO:58所示,为VGLL4蛋白。
本发明证实VGLL4蛋白的TDU串联结构域与单独的TDU结构域都能在MGC-803细胞系中抑制YAP介导的细胞增殖,抑制YAP介导的TEAD转录激活以及下调TEAD下游靶基因CDX2的表达。因而TDU结构域本身是VGLL4转录抑制关键结构域,第二个TDU 结构域的转录抑制作用最为明显。并且,本发明还通过生化分析发现,VGLL4和YAP竞争结合TEAD,其与TEAD的结合具有剂量依赖效应。
本发明第三方面公开了一种治疗癌症的Super-TDU多肽,所述Super-TDU多肽的氨基酸序列含有SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:67所示的氨基酸序列。
优选的,所述Super-TDU多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
更优选的,所述Super-TDU多肽还包括在SEQ ID NO:1所示序列的氨基酸侧链基团上、氨基端或羧基端进行羟基化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修饰,得到的具有癌症治疗活性的多肽衍生物;基于SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加等突变形成的具有癌症治疗活性的衍生多肽;或者,为基于SEQ ID NO:1所示Super-TDU核心序列(HF,组氨酸-苯丙氨酸)的蛋白质工程改造获得的衍生多肽。
YAP-TEAD复合物通过3个关键的相互作用界面形成异源二聚体。而VGLL4的TDU 结构域与YAP的TEAD-bingding结构域(TBD)类似,通过TDU结构域与TEAD蛋白形成复合物,2个关键的相互作用界面,其复合物构象与YAP-TEAD类似。通过三维结构比较和突变与生化实验发现VGLL4和YAP在TEAD上的结合位点有重合,但各自结合TEAD 的最关键位点并不重合。具体而言,YAP的第三个相互作用界面(氨基酸序列如SEQ ID NO: 67所示)对其结合TEAD最重要,而VGLL4的第二个相互作用界面(氨基酸序列如SEQ ID NO:66所示)对其结合TEAD最重要。
因此本发明设计了Super-TDU多肽,该多肽包含YAP-TEAD第三个相互作用界面以及 VGLL4-TEAD第二个相互作用界面的氨基酸序列,可以占据TEAD与YAP以及VGLL4相互作用的界面。该多肽具有核定位信号,可以正常入核发挥功能。在体外和体内检测了 Super-TDU多肽对胃癌的治疗作用。结果发现,Super-TDU多肽显著抑制了胃癌细胞 MGD-803的细胞增殖(>50%),同时在MGC-803的细胞克隆形成实验中,相较于TDU结构域,Super-TDU多肽表现出更强的抑制细胞克隆形成的作用。同时在诱导成瘤的小鼠模型中,被给予Super-TDU多肽的小鼠体内的肿瘤在体积和重量上都明显减少,且与 Super-TDU用量有计量依赖效应。Super-TDU多肽能有效地阻断YAP-TEAD的相互作用,抑制YAP介导的转录激活,在肿瘤治疗中有潜在的临床应用价值。
优选的,所述癌症选自胃癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、骨肉瘤、宫颈癌或者结肠癌。本发明的Super-TDU多肽可应用于制备肿瘤治疗药物。
本发明第四方面公开了一种治疗癌症的药物组合物,其含有前述多肽药物、前述蛋白药物,和/或前述Super-TDU多肽。
本发明第五方面公开了一种肿瘤诊断试剂盒,其含有针对VGLL4基因的RT-PCR引物。
优选的,所述针对VGLL4基因的RT-PCR引物序列如SEQ ID NO:3-4所示。
优选的,所述试剂盒还含有针对YAP基因的RT-PCR引物。
更优选的,所述针对YAP基因的RT-PCR引物序列如SEQ ID NO:5-6所示。
本发明最后一方面公开了一种治疗肿瘤的方法,包括对患者施用前述述多肽或蛋白药物,和/或前述Super-TDU多肽。
本发明还公开了一种肿瘤诊断方法,包括对患者的VGLL4基因表达水平进行检测。
优选的,所述肿瘤诊断方法还包括对患者的YAP基因表达水平进行检测。
较优的,所述肿瘤选自胃癌、乳腺癌、白血病、淋巴瘤、肺癌、骨肉瘤、宫颈癌或者结肠癌。
本发明发现,在84例胃癌样本中,60%的样本中YAP表达明显上调。而同样在这些样本中,61%的样本转录因子VGLL4表达明显下调,而且胃癌TMN病理分期和临床分期越晚,VGLL4表达下调的比例越高,临床I期的胃癌样本中35.7%VGLL4表达下调,而在临床IV期的胃癌样本中80%VGLL4表达下调,说明VGLL4很可能是胃癌发生过程中一个重要的抑癌基因。通过TEAD4报告基因实验发现,VGLL4抑制YAP介导的TEAD4转录激活、抑制在胃癌中高表达的TEAD4靶基因CDX2的转录并且抑制胃癌细胞系MGC-803的细胞增殖。
本发明公开了VGLL4基因及其同源基因,或者VGLL4基因或其同源基因编码的氨基酸序列在制备用于抑制胃癌肿瘤细胞生长的药物、开发抗癌药物,制备胃癌早期诊断和治疗手术预后药物中的用途。并且利用VGLL4通过抑制YAP介导的TEAD4转录激活,从而抑制在胃癌中高表达的TEAD4靶基因CDX2等的转录,最终抑制癌细胞增殖的新发现,设计了一种Super-TDU多肽,表现出极强的抑制胃癌细胞生长及成瘤的功能,极具临床和市场价值。
附图说明
图1:VGLL4表达与胃癌发生、发展相关。A.胃癌组织样本中VGLL4的mRNA水平;B.胃癌组织样本中YAP的mRNA水平;C.肿瘤组织和肿瘤旁正常组织中YAP免疫组化结果; D.肿瘤组织和肿瘤旁正常组织中VGLL4免疫组化结果;E.胃癌不同时期YAP和VGLL4 相对表达水平的分析(C:肿瘤组织样本N:正常人组织样本)
图2:VGLL4抑制YAP介导的TEAD4转录激活以及细胞增殖。图2A、2B表明VGLL4 的TDU结构域对于其对细胞存活率的影响是必须的;图2C、2D表明在胃癌细胞系 MGC-803中,VGLL4通过TDU结构域减少克隆形成数目。
图3:VGLL4-TEAD4相互作用影响VGLL4抑制YAP介导的TEAD4转录激活。A.MBP 融合表达的TEAD4偶联在直链淀粉凝胶上并与不同的VGLL4突变体混合,进行pull-down 实验的结果;B.HA标签的TEAD4,Flag标签的VGLL4转染HEK293细胞,细胞裂解后用于免疫共沉淀实验。
图4:VGLL4通过与YAP竞争结合TEAD4发挥功能。A.VGLL4的TDU结构域突变体与YAP竞争结合TEAD4,抑制TEAD4转录活性;B.VGLL4突变体与YAP介导的CDX2的转录活性的关系;C.VGLL4的TDU结构域突变体与细胞增殖的关系;D、E、F Pull-down 实验;G.VGLL4或YAP与TEAD4的动力学实验实验结果。
图5:VGLL4的串联TDU结构域通过与YAP竞争结合TEAD4发挥功能。A.串联TDU结构域抑制YAP介导的TEAD4转录激活效应;B.串联TDU结构域抑制YAP介导的CDX2 转录激活;C.串联TDU结构域抑制YAP介导的细胞增殖;D和E.串联TDU结构域抑制 YAP介导的细胞克隆形成
图6:Super-TDU三维结构
图7:Super-TDU多肽抑制YAP介导的细胞增殖
图8:Super-TDU在不同细胞系中对细胞增殖的影响。A.人肾上皮细胞系HEK293;B.人胃癌细胞系MGC-803;C.人乳腺癌细胞系MCF-7;D.人急性T细胞白血病细胞系Junkat; E.人B细胞淋巴瘤细胞系Raji;F.人肺癌细胞系A549;G.人骨肉瘤细胞系U2OS;H.人宫颈癌细胞系HeLa;I.人结肠癌细胞系HCT116。
图9:VGLL4表达与结肠癌发生相关。A.结肠癌组织样本中VGLL4的mRNA水平;B.结肠癌组织样本中YAP的mRNA水平;C.肿瘤组织中VGLL4与YAP以及CFGF的mRNA的相关性统计结果;D.肿瘤组织和肿瘤旁正常组织中VGLL4和YAP的免疫印迹结果(C:肿瘤组织样本N:正常人组织样本)
图10:Super-TDU多肽对结肠癌的治疗作用。A.Super-TDU多肽给药方式。B.小鼠存活率统计曲线。C.解剖镜下小鼠结肠。D.小鼠结肠腺瘤统计结果。
具体实施方式
在进一步描述本发明具体实施方式之前,应理解,本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案;还应当理解,本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案,而不是为了限制本发明的保护范围。
可从Genebank获得人VGLL4基因的核苷酸序列(NM_001128219.1)及其氨基酸序列(NP_001121691.1)。本文中同源基因指种间同源基因,不同物种中起源于一个共同的祖先基因的一些同源基因,这些基因通常保持相同的或相似的功能。根据NCBI网站BLAST的结果,人VGLL4的同源基因包括小鼠VGLL4基因(NM_177683.2)和果蝇Vestigial 4基因 (NM_078999.3)。
或者,可以“同源性”来定义本申请的同源基因。“同源性”指两条多核苷酸或两条多肽部分之间的相似性百分数。两条DNA或两条多肽序列在确定的分子长度内,当序列显示有至少约50%,优选至少约为75%、更佳至少约为80-85%、尤其佳至少约为90%、最佳至少约为95-98%序列相似性时,彼此“基本上同源”。如本文所述,基本同源也指与特定的DNA或多肽序列完全相同的序列。
本文中,“抑制肿瘤细胞生长的药物”包括诱导肿瘤细胞凋亡。例如,对于胃癌患者。可上调所述VGLL4基因或其同源基因的表达,或者给予本申请的VGLL4基因或其同源基因、或者所述基因的编码序列,促进肿瘤细胞凋亡,起到抗癌效果。所述上调可包括给予所述基因或编码序列的激动剂。
基本实验方法:
1.克隆,纯化及蛋白表达纯化
将小鼠TEAD4蛋白的YAP结合结构域(210-427)以及小鼠VGLL4蛋白串联TDU结构域(203-256)片段克隆至HT-pET-28a载体中并在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中使用IPTG 诱导蛋白表达。TEAD4和VGLL4通过镍柱亲和以及凝胶过滤层析柱HiLoad 16/60Superdex 75纯化后,将VGLL4和TEAD4以1:2的摩尔比混合,再次通过凝胶过滤层析柱HiLoad 16/60Superdex 75纯化得到VGLL4-TEAD4复合物。
其他融合表达的标签蛋白同样通过体外表达、亲和纯化以及凝胶过滤层析获得。
2.复合物晶体筛选
VGLL4和TEAD4复合物浓缩至7.2mg/ml,进行晶体筛选。晶体生长条件为0.2M L-proline,0.1M HEPES pH 7.5,24%w/v polyethylene glycol 1500,18℃。在上海同步辐射光源BL17U线站进行晶体衍射,HKL2000软件处理衍射数据。VGLL4-TEAD4复合物结构通过Phenix软件的Phaser-MR程序,采用分子置换的方式解析,以TEAD4(PDB code 3JUA) 为搜索模型。建模在Coot软件中进行并采用phenix.refine进行修正。
3.Pull-down实验
MBP或GST融合表达的标签蛋白交联在直链淀粉(Amylose)凝胶或GST凝胶上,与目标蛋白与4℃混合1小时,混合的缓冲液体系为20mM HEPES,200mM NaCl,1mM DTT, pH 7.5。之后缓冲液洗三次,使用含有20mM麦芽糖或20mM还原性谷胱甘肽的缓冲液进行洗脱。通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色或免疫印迹检测实验结果。
4.细胞培养
HEK293T、MGC-803、MCG-7、U2OS、HeLa、HCT116细胞培养于DMEM(Hyclone) 培养液中,培养液中添加10%血清,100ug/mL盘尼西林,100μg/mL链霉素。细胞于37℃培养,二氧化碳浓度为5%。
Jurkat、Raji、A549细胞培养于RPMI-1640(Invitrogen公司)培养液中,培养液中添加10%血清,100ug/mL青霉素,100μg/mL链霉素。细胞于37℃培养,二氧化碳浓度为5%。5.免疫印迹和免疫沉淀
免疫印迹和免疫沉淀按照文献所述方法进行(Shi,Z.,et al.Structure of theMST4 in complex with MO25 provides insights into its activationmechanism.Structure 21,449-461, 2013)。
将收集的样品加入等量2×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液,100℃变性5分钟,进行SDS-PAGE凝胶电泳,100V恒压电泳90至120分钟。电泳完成后采用Bio-Rad的标准湿式转膜装置和Bio-rad的PVDF膜(货号162-0177)在4℃进行转膜,转膜电流为300-400mA,转膜时间为30-60分钟。转膜完毕后,立即把PVDF膜放入封闭液中,在摇床上缓慢摇动, 室温封闭60分钟。PBST洗脱液洗去封闭液。参考一抗的说明书,按照适当比例用一抗稀释液稀释抗体,一抗孵育一小时。PBST洗脱液洗去一抗。参考二抗的说明书,按照适当比例用二抗稀释液稀释抗体。PBST洗脱液洗去二抗。使用Pierce公司ECL检测试剂(货号 32106)和GE公司LAS4000荧光/化学发光成像系统检测样品。
其中HA标签抗体,VGLL4、Flag标签抗体和β-actin抗体购自Sigma公司(St.Louis,MO)。YAP抗体购自Santa Cruz生物技术公司(Santa Cruz,CA)。
实验用试剂配制方法如下所示:
1)2×SDS上样缓冲液:每10ml含3.55ml去离子水,1.25ml 0.5M Tris-Cl,pH6.8,2.5ml甘油, 2.0ml 10%(w/v)SDS,0.2ml 0.5%(w/v)溴酚蓝,0.05mlβ-巯基乙醇。
2)10×Western电泳缓冲液:30.3g Tris base,144g甘氨酸以及10g SDS溶解,加去离子水至 1升。
3)10×Western转膜缓冲液:30.3g Tris base,144g甘氨酸,使用时取100ml溶解加去离子水至1升,不用调pH值,使用时将100ml的10×转膜缓冲液稀释至800ml,加入200ml甲醇。
4)PBST洗脱液:用800ml水溶解80g NaCl,2g KCl,14.4g Na2HPO4和2.4g KH2PO4,用HCl调 PH值至7.4,加水至1L。使用时取100ml溶解加去离子水至1升,加入500μlTween20。
5)一抗稀释液:称取5g BSA粉末溶于100ml 1×PBS溶液中,再加入0.02%的叠氮钠,4度保存。
6)二抗稀释液:5g脱脂牛奶溶解至100ml PBST中。
7)磷酸缓冲液(10×PBS):用800ml水溶解80g NaCl,2g KCl,14.4g Na2HPO4和2.4gKH2PO4, 用HCl调PH值至7.4,加水至1L,保存于室温使用。
6.免疫组化
肿瘤样本按照BD PharmingenTMIHC Zinc Fixative手册(手册编号:550523),采用锌剂固定(BD Biosciences)并进行石蜡包埋。肿瘤组织切片(厚度5μm)通过加热固定,切片在二甲苯中脱蜡5分钟,再换用新鲜的二甲苯脱蜡,共用二甲苯脱蜡3次。无水乙醇5分钟,两次。90%乙醇5分钟,两次,70%乙醇5分钟,一次。蒸馏水5分钟,两次。根据不同的抗原和抗体,可以选择把切片放置在如下抗原修复液中,10mM柠檬酸钠,pH6.0,或1mM EDTA,pH8.0,或10mM Tris,pH10.0,95℃加热12分钟,大约在30分钟内缓慢冷却至室温。加入5%脱脂牛奶封闭60分钟。
从封闭开始所有的步骤,一定要注意样品的保湿,避免样品的干燥,否则极易产生较高的背景。适当比例稀释一抗,4℃缓慢摇动孵育过夜,回收一抗,加入PBST,洗涤5分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5分钟。共洗涤3次。按照适当比例稀释辣根过氧化物酶(HRP)或生物素(Biotin)或碱性磷酸酯酶(AP)标记的二抗。室温或4℃在侧摆摇床上缓慢摇动孵育一小时。回收二抗。加入PBST洗涤液,在侧摆摇床上缓慢摇动洗涤5分钟。吸尽洗涤液后,再加入洗涤液,洗涤5分钟。共洗涤3次。选用DAB进行后续检测。DAB 染色后进行HE染色。使用YAP,VGLL4,Ki67对应的抗体染色。Ki67抗体购自Abcam 公司(Cambridge,MA)。最后进行.脱水,透明,中性树脂封片。
7.转染及荧光酶素检测实验
使用Invitrogen公司(San Diego,CA)的转染试剂2000对细胞进行瞬时转染。对转染的细胞进行孵育过夜,并通过G418(600mg/ml)筛选,以挑选稳定转染的细胞株。每2-3天更换含有G418的培养液,2周后可以筛选得到稳定转染的单克隆,3周后可以获得具有G418抗性的稳定转染的细胞株。
荧光酶素检测实验使用双荧光酶素检测试剂盒(Promega),通过萤火虫荧光素酶与海肾荧光素酶活性的比例检测荧光素酶活性。将用于实验的细胞用PBS溶液漂洗后,每1×105细胞加入60μl裂解缓冲液(试剂盒自带),晃动培养皿数次以保证裂解缓冲液完全覆盖细胞。 -80℃保存30分钟后,室温放置10分钟,将细胞及所有的液体转移至一个离心管中,然后以12,000x g离心30秒,将上清液转移至一个新的试管中。将萤光光度计的程序设置为:2秒延迟及10秒萤光素酶活性测量读数。如果有足够的光产生,读数时间可缩短。将100μl萤光素酶检测试剂加入萤光光度计试管中,每管一个样品。然后将20μl细胞裂解液加入装有萤光素酶检测试剂的萤光光度计试管中。吹打或轻微旋涡震荡以混合,将萤光光度计试管置于萤光光度计中并开始读数。
8.实时定量荧光PCR
实时定量荧光PCR采用Applied Biosystems公司两步法实时PCR(Realtime-PCR)系统,检测相对CT值。使用定量荧光PCR预混液(Toyobo公司提供2xGreen RealtimePCR reagent)配置反应体系检测并定量目标基因的表达水平,GAPDH作为内参。
9.细胞增殖实验
细胞转染以下质粒:pcDNA3.1,Flag标签的VGLL4野生型或突变体以及HA标签的YAP 野生型。使用ATP细胞活力检测试剂盒检测细胞增殖(Promega公司Luminescent Cell Viability Assay)。在一块壁不透明的96孔板上准备好带培养基的细胞, 100μl/孔,同时准备只含培养基不含细胞的对照孔,以得到背景发光值。在实验孔中加入待测化合物,按合适的条件进行孵育。
将平板及其内容物平衡到室温,大约需要30分钟。向每孔中加入与细胞培养基体积相等的试剂100μl。在一个定轨振荡器上混合内容物2分钟,诱导细胞裂解,然后将平板室温孵育10分钟,使萤光信号值稳定,记录发光信号。
10.软琼脂糖细胞克隆形成实验
转染有一定质粒的MGC-803细胞在细胞密度达到104后,接种至6孔板中的软琼脂糖上,14天后对直径大于0.05毫米的克隆进行计数。
11.活体肿瘤生长实验
四周雄性裸鼠(BALB/cA-nu/nu)购自上海实验动物中心并培养于无菌环境中。裸鼠分为四组分别通过皮下注射稳转有表达绿色荧光蛋白GFP的pEGFP-C1质粒(购自Clontech公司)的MGC-803细胞。注射的细胞量为2×106,细胞注射于小鼠腋下,通过测量肿瘤大小检测实验结果。肿瘤形成后,两组小鼠分别给予每天50μg/ml/kg(n=5)或者500μ g/ml/kg(n=5)的Super-TDU多肽或对照多肽(n=10)。此外,小鼠腹腔注射5mg/ml的5- 氟尿嘧啶作为阳性对照。通过酶联免疫吸附实验试剂盒(Sigma公司ELISA试剂盒)检测小鼠血清中β2-微球蛋白的含量。
动物培养及动物实验遵照中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所动物管理委员会相关章程和动物福利政策。
12数据分析
采用SAS数据软件分析包(9.1.3)对数据进行分析,统计数据的平均数±标准差。单因子变异数分析(ANOVA)and Student’s t-test用于分析连续变量。置信区间为P<0.05。
实施例1 VGLL4表达与胃癌发生、发展的关系
1.实验方法
为研究VGLL4和YAP在临床上的关系,对84例人胃癌样本,91例正常人胃组织样本中VGLL4和YAP的mRNA水平进行检测。异硫氰酸胍一步法抽提总RNA,AMV逆转录酶合成第一链,并以其为模板,在DNA taq酶的作用下用对应的引物进行PCR扩增;PCR 引物见表1,Realtime-PCR反应体系见表2,Realtime-PCR扩增程序见表3,PCR扩增结果见图1A及图1B。
表1引物序列
表2 Realtime-PCR反应体系
表3 PCR反应体系程序设定
取胃癌的肿瘤样本,采用锌剂固定(BD Biosciences)并进行石蜡包埋。肿瘤组织切片(厚度5μm)通过加热固定,二甲苯脱蜡,通过乙醇梯度处理水合化并使用YAP,VGLL4,Ki67 对应的抗体染色。Ki67抗体购自Abcam公司(Cambridge,MA),VGLL4抗体购自Sigma 公司(St.Louis,MO),YAP抗体购自Santa Cruz生物技术公司(Santa Cruz,CA),免疫组化结果见图1C-D。
针对胃癌发展不同时期YAP和VGLL4表达水平是否有变化,对正常人组织样本和胃癌样本中YAP和VGLL4的蛋白表达进行免疫印迹实验。实验结果见图1E。
2.实验结论
84例人胃癌样本中VGLL4基因和YAP基因的mRNA水平见图1(图1A和1B)。相对于正常人胃组织样本,50例(60%)胃癌样本中YAP的mRNA水平在明显上调。形成鲜明反差的是,51例(61%)胃癌样本中Vgl4的mRNA水平明显下调。免疫组化和免疫印迹实验都证实,胃癌样本中YAP表达上调(图1C),VGLL4表达下降(图1D)。
正常组织样本中YAP与VGLL4的表达比例约为0.84±0.13而在胃癌样本中这一比例升至5.92±1.71。肿瘤分级就越高,VGLL4的mRNA水平越低,胃癌浸润程度和转移程度越严重(图1E)。在14例I期胃癌样本中,5例出现VGLL4表达下调(35.7%),在19例II期胃癌样本中,10例出现VGLL4表达下调(52.6%),在26例III期胃癌样本中,16例出现 VGLL4表达下调(61.5%),而在25例IV期胃癌样本中,20例出现VGLL4表达下调(80%) (P=0.0437)。
可见,胃癌组织样本中VGLL4的mRNA水平的比例有明显下调,并且胃癌样本中VGLL4 的mRNA水平与YAP的表达水平相关,因而VGLL4与YAP相互作用的的紊乱可能导致这些肿瘤细胞的过度增殖。
实施例2 VGLL4抑制YAP介导的TEAD4转录激活以及细胞增殖
1.实验目的
本实施例的目的在于研究VGLL4、YAP和TEAD4这三者间的调控方式及其对细胞增殖的影响。
2.实验方法
2.1质粒构建
1)pCDH-YAP质粒和pCDH-VGLL4质粒的构建:异硫氰酸胍一步法抽提人HEK293 细胞总RNA,AMV逆转录酶合成第一链,并以其为模板,在Takara高保真DNA聚合酶 PrimeSTAR的作用下用对应的引物进行PCR扩增;PCR引物见表4,PCR反应体系见表5,PCR扩增程序见表6。
表4 引物序列
表5 PCR反应体系
表6 PCR扩增程序
扩增获得的片段,通过1%琼脂糖凝胶电泳,确认大小与目的条带相同,切下胶,使用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收(天根生化科技(北京)有限公司,货号DP209)。YAP片段使用限制性内切酶EcoRI和BamHI(thermo scientific)进行双酶切,VGLL4片段使用EcoRI 和NotI,酶切反应体系如表7所示,反应在37度进行2小时。
表7 片段酶切反应体系
酶切后,通过普通产物纯化试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司,货号DP204),纯化获得酶切后的片段。YAP片段(EcoRI/BamHI双酶切)与pCDH载体(购自Addgene 公司)(EcoRI/BamHI双酶切)进行连接,VGLL4片段(EcoRI/NotI双酶切)与pCDH载体(EcoRI/NotI双酶切)进行连接,连接体系表8所示,连接反应在室温(25℃)进行2 小时。载体双酶切反应体系如表9所示,反应在37℃进行4小时。反应完成后使用天根普通产物纯化试剂盒纯化获得酶切后的载体。连接后的产物转化DH5α感受态细胞,通过抗性筛选,获得的阳性克隆,经测序验证正确后用于TEAD4报告基因转录活性实验。
表8 连接反应体系
表9 载体酶切反应体系
2)TEAD全长基因的表达质粒pCI-HA-TEAD4,由中国科学院生物物理研究所袁增强研究员提供;TEAD报告基因质粒pGal4-TEAD4/5xUAS-Luc由复旦大学医学院管坤良研究员提供。
3)VGLL4 TDU结构域缺失表达突变载体的构建:构建的VGLL4 delTandem TDU,VGLL4 del TDU1,VGLL4 del TDU2分别表达缺失TDU串联结构域的VGLL4蛋白,缺失第一个TDU结构域的VGLL4蛋白,以及缺失第二个TDU结构域的VGLL4蛋白。
VGLL4 delTandem TDU,VGLL4 del TDU1,以及VGLL4 del TDU2缺失突变体以野生型VGLL4克隆为模板,通过Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR扩增获得带有缺失特定结构域的带有VGLL4基因的载体片段,使用DpnI去甲基化酶去除未突变的野生型VGLL4模板,将PCR扩增片段转化DH5α感受态细胞,利用大肠杆菌本身具有的修复载体缺失的特点,将整个片段环化形成载体,通过抗性筛选,获得的与原始的VGLL4载体骨架相同,但VGLL4片段缺失相应TDU结构域的阳性克隆,经测序验证正确后用于TEAD4 报告基因转录活性实验。(PCR引物见表10,PCR反应体系见表5)PCR扩增程序为: 98℃2min;PCR循环:98℃10s,58℃10s,68℃1kb/min,18个循环;68℃10min。
表10 引物序列
2.2实验步骤
将质粒pCDH-YAP,质粒pCDH-YAP和质粒pCDH-VGLL4(FL),质粒pCDH-YAP 与VGLL4del TDU1缺失突变体,质粒pCDH-YAP与VGLL4 del TDU2缺失突变体,质粒 pCDH-YAP与VGLL4 delTandem TDU缺失突变体,分别转染MGC-803细胞,并采用转染了pCDH载体(空质粒)的细胞作为对照。其中,所采用的pCDH-YAP质粒的转染量为 0.1ug/ml,FL、del TDU1等缺失突变质粒的三个梯度分别为0.025ug/ml,0.05ug/ml,0.1ug/ml。检测转染后细胞的TEAD4转录活性,细胞存活力,以及TEAD4的下游靶基因CDX2的mRNA 水平。
前述细胞转染,TEAD4转录激活的检测及细胞存活力检测实验根据基本实验方法中转染、荧光酶素检测实验及细胞增殖实验的方法进行。对TEAD4的下游靶基因CDX2的mRNA水平的检测方法参考实施例1中对VGLL4和YAP的mRNA水平进行检测的方法,CDX2 cDNA扩增的对应引物见表10。
2.实验结果及分析
TEAD4报告基因实验显示VGLL4抑制YAP介导的TEAD4转录因子的转录激活。相对于对照组,转染了YAP的细胞,其TEAD4的转录活性更高。转染VGLL4对于YAP介导的 TEAD转录激活效应抑制作用明显,这表明VGLL4是一个转录抑制因子。此外,缺失TDU 串联结构域的VGLL4对于TEAD的转录激活完全没有抑制作用,这说明TDU串联结构域对其抑制转录的功能十分重要。缺失第一个TDU结构域对其抑制转录功能有一定的影响,而缺失第二个TDU结构域会大大影响其抑制转录的功能。因而,在VGLL4的转录抑制功能上,第二个TDU结构域比第一个TDU结构域更重要(图2A)。细胞存活力检测实验同样证明这一结果(图2B)。
TEAD4的下游靶基因包括CTGF,Cyr61,JUNB,EOMES及CDX2,其中CDX2在胃癌样本中表达水平很高。我们通过分析CDX2的mRNA水平评估VGLL4对于YAP-TEAD4下游靶基因转录的影响。结果证实,过表达YAP将上调CDX2的mRNA水平,而VGLL4显著下调了CDX2的mRNA水平(图4B)。
实施例3 Vgl4-TEAD4相互作用影响Vgl4抑制YAP介导的TEAD4及其下游基因的转录激活
1.实验材料
1.1质粒的构建
1)HT-pET-28a载体:以商品化的pET-28a(Novagen)为模板,采用如下引物进行构建。 PCR扩增程序为:98℃2min;PCR循环:98℃10s,58℃10s,68℃1kb/min,18个循环;68℃10min。使用DpnI去甲基化酶去除未突变的野生型pET28a模板,将PCR扩增片段转化DH5α感受态细胞,利用大肠杆菌本身具有的修复载体缺失的特点,将整个片段环化形成载体,通过抗性筛选,获得的与原始的pET28a载体骨架相同,但带有TEV酶切位点和常用多克隆位点的HT-pET-28a载体。
HT-s:
5’-Gaaaacctgtattttcagggcgccatggatccggaattcaaaggcctacgtcgacgagctcaactagtgcggccgctttcgaatctagagcctgcagtctcgag-3’(SEQ ID NO:13)
HT-a
5’-ctcgagactgcaggctctagattcgaaagcggccgcactagttgagctcgtcgacgtaggcctttgaattccggatccatggcgccctgaaaatacaggttttC-3’(SEQ ID NO:14)
2)MBP-pET-28a载体:以商品化的,pMAL(NEB England Biolab)为模板,通过PCR的方法扩增获得MBP基因片段,并通过酶切(BglII)连接至HT-pET-28a载体中将其改造为带有TEV酶切位点和常用多克隆位点,并且N端带有助溶标签蛋白MBP的MBP-pET-28a 载体。
MBP-s:5’-tttagatctatgaaaactgaagaagg-3’ (SEQ ID NO:15)
MBP-a:5’-aaaagatcttccgccaaaacagccaa-3’ (SEQ ID NO:16)
3)GST-pET-28a载体:以商品化的pGEX-4T-1为模板,通过PCR的方法扩增获得GST基因片段,并通过酶切(BglII)连接至HT-pET-28a载体中,将其改造为带有TEV酶切位点和常用多克隆位点,并且N端带有助溶标签蛋白GST的GST-pET-28a载体。
GST-s:5’-tttagatctatgtcccctatactaggt-3’ (SEQ ID NO:17)
GST-a:5’-aaaagatctgtcacgatgcggccgctcg-3’ (SEQ ID NO:18)
4)VGLL4全长突变体载体:包括H212A/F213A突变载体,H240A/F241A突变载体及HF4A 突变载体。其中,H212A/F213A突变载体表达VGLL4第一个TDU结构域点突变的突变体H212A/F213A;H240A/F241A突变载体表达VGLL4第二个TDU2结构域点突变的突变体 H240A/F241A;HF4A突变载体表达VGLL4两个TDU结构域同时点突变的HF4A突变体。
A.H212A/F213A突变载体及H240A/F241A突变载体的制备方法为:以pCDH-VGLL4为模板,通过Takara高保真DNA聚合酶PrimeSTAR扩增获得带有点突变的VGLL4 全长片段。使用DpnI去甲基化酶去除未突变的野生型VGLL4模板,扩增获得带有特定位点突变的带有VGLL4基因的载体片段,将PCR产物转化DH5α感受态细胞,通过抗性筛选,获得的阳性克隆,经测序验证正确后用于TEAD4报告基因转录活性实验。(PCR引物见表11,PCR反应体系见表5)PCR扩增程序为:98℃2min;98℃10s,58℃10s,68 ℃1kb/min,共18个循环;68℃10min。
表11 引物序列
B.HF4A突变载体的制备,为以H212A/F213突变载体为模板,以表11中HF4A所示引物(SEQ ID NO:23-24)进行PCR扩增后,使用DpnI去甲基化酶去除未突变的野生型 VGLL4模板,扩增获得带有特定位点突变的带有VGLL4基因的载体片段,将PCR产物转化DH5α感受态细胞,通过抗性筛选,获得的阳性克隆,经测序验证正确后用于TEAD4报告基因转录活性实验。
5)VGLL4结构域表达载体
TDU串联结构域载体(Tandem TDU)与单独的TDU结构域载体(TDU1以及TDU2) 的构建方法为:以质粒pCDH-VGLL4为模板,采用表12所示引物进行扩增,并插入pCDH 载体获得。
表12 引物序列
6)VGLL4 TDU结构域突变体载体:
TDU1M:以TDU1为模板,采用表11中SEQ ID NO:19-20所示引物扩增后,插入 pCDH载体获得VGLL4第一个TDU结构域突变体载体。
TDU2M:以TDU2为模板,采用表11中SEQ ID NO:21-22所示引物扩增后,插入 pCDH载体骨架获得第二个TDU结构域突变体载体。
Tandem TDUM:以Tandem TDU为模板,采用表11中SEQ ID NO:23-24所示引物扩增后,插入pCDH载体骨架获得串联的两个TDU结构域突变体载体。
7)质粒His-VGLL4,质粒MBP-TEAD4,质粒HT-TEAD4及质粒GST-TEAD4:质粒 MBP-TEAD4,HT-TEAD4,GST-TEAD4表达TEAD4的YAP结合结构域,但N端的融合表达标签不同;质粒His-VGLL4表达组氨酸标记的VGLL4串联TDU结构域。
通过Takara公司Ex Taq DNA聚合酶以质粒pCDH-VGLL4与质粒pCI-HA-TEAD4为模板,扩增获得TEAD4的YAP结合结构域以及VGLL4串联TDU结构域片段(PCR引物同表13,PCR反应体系同表5)。PCR扩增程序为:95℃5min;PCR循环:95℃30s,58 ℃30s,72℃1kb/min,共30个循环;72℃5min。PCR获得的片段通过琼脂糖凝胶回收后,进行NcoI酶和XholI酶的双酶切,酶切后的TEAD4片段连接至MBP-pET-28a载体(NcoI 酶和XholI酶双酶切),即制得质粒MBP-TEAD4。酶切后的VGLL4片段连接至HT-pET-28a 载体(NcoI酶和XholI酶双酶切),即制得His-VGLL4。片段酶切体系见表7,载体酶切反应体系见上表9。酶切后的载体和片段进行连接反应,连接反应在25℃进行2小时,连接体系见表8。
表13 引物序列
7)His-VGLL4突变体的构建方法:以质粒His-VGLL4为模板(HT-pET-28a载体上表达VGLL4串联TDU结构域片段),克隆构建方法同实施例2突变体的构建方法,引物如表14所示。
表14 引物序列
1.2VGLL4-TEAD4复合物:
通过Takara公司Ex Taq DNA聚合酶以小鼠cDNA(购买)为模板,扩增获得小鼠TEAD4 的YAP结合结构域(210-427)以及VGLL4串联TDU结构域片段(203-256)(PCR引物同表13,PCR反应体系同表5)。PCR扩增程序为:95℃5min;PCR循环:95℃30s,58℃30s, 72℃1kb/min,共30个循环;72℃5min。PCR获得的片段通过琼脂糖凝胶回收后,进行NcoI 酶和XholI酶的双酶切,酶切后的TEAD4片段连接至MBP-pET-28a载体(NcoI酶和XholI 酶双酶切),即制得质粒MBP-mTEAD4。酶切后的VGLL4片段连接至HT-pET-28a载体(NcoI 酶和XholI酶双酶切),即制得His-mVGLL4。片段酶切体系见表7,载体酶切反应体系见上表9。在大肠杆菌BL21(DE3)菌株中使用IPTG诱导MBP-TEAD4蛋白及His-VGLL4蛋白表达。TEAD4和VGLL4通过镍柱亲和以及凝胶过滤层析柱凝HiLoad 16/60Superdex 75 纯化后,将VGLL4和TEAD4以1:2的摩尔比混合,再次通过凝胶过滤层析柱HiLoad 16/60 Superdex 75纯化得到VGLL4-TEAD4复合物,用于蛋白复合物结晶。
2.实验方法
2.1 VGLL4-TEAD4相互作用影响VGLL4抑制YAP介导的TEAD4转录激活
2.1.1 pull-down实验
为研究Vgl4与TEAD4的相互作用方式,通过质粒Vgl4、质粒TEAD4、体外表达纯化获得Vgl4与TEAD4的蛋白,并通过结构生物学的方法进行蛋白结晶及晶体结构解析。蛋白表达纯化及复合物晶体筛选参见基本实验方法1-2,Pull-down实验参考基本实验方法3。具体实验方法如下:
通过体外表达纯化分别获得MBP-TEAD4,His-VGLL4以及His-VGLL4的突变体蛋白(V209A、H212A、F213A、R215A、L217A、V237A、H240A、F241A、L245A、W249A)。 His-VGLL4亲和纯化后需要用TEV蛋白酶切去N端的His标签,具体方法参考基本实验方法。MBP-TEAD4蛋白(10ug)交联在直链淀粉凝胶上(Amylose Resin,New England Biolab catalog#E8021S),与VGLL4蛋白(野生型VGLL4的串联TDU结构域蛋白,突变体V209A 突变载体表达的V209A,H212A突变载体表达的H212A,F213A突变载体表达的F213A, R215A突变载体表达的R215A,L217A突变载体表达的L217A,H212A/F213A突变载体表达的H212A/F213A突变体,V237A突变载体表达的V237A,H240A突变载体表达的H240A, F241A突变载体表达的F241A,L245A突变载体表达的L245A,W249A突变载体表达的 W249A,H240A/F241A突变载体表达的H240A/F241A突变体,及HF4A突变载体表达的 HF4A突变体,所有蛋白均为90ug)于4℃混合1小时,然后按照基本实验方法3进行实验,实验结果见图3。
将GST-TEAD4质粒表达纯化的GST-TEAD4蛋白(10ug)交联在Glutathione-Sepharose 填料上(GE life science),与目标蛋白(MBP-pET-28a YAP质粒表达的MBP-YAP,10ug,以及不同浓度的HT-pET-28a VGLL4质粒表达的VGLL4,0ug,30ug,60ug,90ug)于4℃混合1小时,然后按照基本实验方法3进行实验,实验结果见图4D。
将质粒GST-pET-28a TEAD4表达纯化的GST-TEAD4蛋白10ug交联在 Glutathione-Sepharose填料上(GE life science),与目标蛋白(MBP-pET-28a VGLL4质粒表达的MBP-VGLL4,10ug,与10ug,MBP-pET-28a YAP质粒表达的MBP-YAP,0ug、5ug、 10ug、20ug)于4℃混合1小时,然后按照基本实验方法3进行实验,实验结果见图4E。
将质粒MBP-pET28a YAP表达纯化的MBP-YAP蛋白10ug交联在Amylose Resin(NewEngland Biolab),与目标蛋白(HT-TEAD4质粒表达的TEAD4蛋白10ug以及不同浓度的 HT-pET-28a VGLL4野生型及突变体H212A/F213F、H240A/H241F、HF4A质粒表达的蛋白 0ug、30ug、60ug、90ug,)于4℃混合1小时,然后按照基本实验方法3进行实验,实验结果见图4F。
2.1.2 免疫共沉淀实验。
VGLL4全长真核表达质粒(pCDH-VGLL4)带有Flag标签,TEAD4全长基因表达质粒(pCI-HA-TEAD4)及该质粒的全长突变体真核表达质粒带有HA标签。这两种质粒转染细胞后,按实验方法中免疫共沉淀的步骤进行。VGLL4-TEAD4相互作用对于TEAD4报告基因转录活性的影响按基本实验方法中荧光酶素检测实验的方法进行。
2.2 VGLL4-TEAD4相互作用影响VGLL4抑制YAP介导的TEAD4下游基因的转录
为研究VGLL4-TEAD4相互作用对于TEAD4下游基因转录额影响,对TEAD4下游基因CDX2的表达水平进行检测,CDX2mRNA水平的检测方法同实施例2。
将质粒pCDH-YAP(2ug)转染到MGC-803细胞中,并分别向转染了质粒pCDH-YAP 的细胞中加入质粒pCDH-VGLL4(FL,0.025ug/ml、0.05ug/ml、0.1ug/ml),TDU1(0.025ug/ml、0.05ug/ml、0.1ug/ml),TDU2(0.025ug/ml、0.05ug/ml、0.1ug/ml),Teandem TDU,TDU1M,TDU2M,Teandem TDUM,以pCDH空载体做空白对照;检测转染后细胞的CDX2mRNA 水平,细胞存活力,以及转染后细胞的TEAD4转录活性,实验结果见图5A到5B。
3.实验结果及分析
3.1 VGLL4-TEAD4相互作用影响VGLL4抑制YAP介导的TEAD4转录激活
体外纯化获得的VGLL4的TDU串联结构域以及TEAD4C端的YAP结合结构域可以以1:2的分子比形成稳定的复合物。通过结构生物学方法,解析复合物结构并确定了 VGLL4-TEAD4复合物相互作用界面上的关键位点,通过定点突变打破VGLL4-TEAD4之间的相互作用(图3A,3B,4D,4E,4F),进一步研究VGLL4-TEAD4相互作用对于TEAD4 报告基因转录活性的影响。
如前所述,野生型的VGLL4可以抑制YAP介导的TEAD4的转录激活作用,并有明显的计量依赖性。但打破VGLL4-TEAD4相互作用的VGLL4第一个TDU结构域突变体 H212A/F213A会减弱VGLL4对于TEAD4转录活性的抑制作用。同样打破VGLL4-TEAD4 相互作用的第二个TDU2结构域突变体H240A/F241A对于YAP介导的TEAD4的转录激活几乎完全没有抑制作用,这说明第二个TDU2结构域对于VGLL4的功能更为重要。同样,转染了打破VGLL4-TEAD4相互作用的VGLL4突变体HF4A的细胞,即两个TDU结构域同时突变,TEAD4的转录活性与转染空载体的对照组相同,VGLL4对TEAD4完全没有抑制作用(图4A)。
单独克隆表达的第一个TDU结构域,第二个TDU结构域以及TDU串联结构域,在不同程度上都能抑制YAP介导的TEAD4的转录激活。而第一个TDU结构域,第二个TDU 结构域的突变体对于TEAD4的抑制作用都受到明显的影响(图5A)。
3.2 VGLL4TDU结构域对于TEAD4下游基因转录的影响。
与荧光素酶检测试验的结果一致,VGLL4第一个TDU结构域突变体H212A/F213A对于YAP介导的TEAD4下游基因CDX2的表达水平的抑制作用在一定程度上减弱,而第二个TDU结构域突变体H240A/F241A以及HF4A对CDX2mRNA水平的抑制作用完全消失 (图5B)。此外,TDU串联结构域以及两个单独的TDU结构域都能减弱YAP对于CDX2的 mRNA水平的促进作用。两个单独的TDU结构域突变体以及TDU串联结构域突变体均不能与TEAD4相互作用,表达这些突变体的细胞中CDX2的mRNA水平较对照组高(图5B)。因而,VGLL4的TDU结构域,尤其是第二个TDU结构域对于YAP-TEAD4复合物下游基因的转录具有重要的调节作用。
实施例4 VGLL4对胃癌细胞增殖的影响
1.实验方法
1.1为研究VGLL4-TEAD4相互作用对YAP介导的细胞增殖的影响,采用基本实验方法中 9.细胞增殖实验检测其影响。
向MGC803细胞分别转染以下质粒:单独的pCDH质粒作为空白对照,单独的质粒pCDH-VGLL4,单独的Teandem TDU质粒,单独的TDU1质粒,单独的TDU2质粒,单独的TeandemTDUM质粒,单独的TDU1M质粒,单独的TDU2M质粒,单独的质粒 pCDH-YAP,质粒YAP与质粒VGLL4,质粒YAP与TDU1,质粒YAP与TDU2,质粒YAP 与Teandem TDU,质粒YAP与TDU1M,质粒YAP与TDU2M,质粒YAP与Teandem TDUM。检测转染后细胞的存活力,以及YAP介导的细胞增殖。
1.2为研究VGLL4的TDU结构域在体外对于胃癌细胞增殖的影响,通过软琼脂糖细胞克隆形成实验研究了TDU结构域对胃癌细胞系MGC-803的增殖的影响。软琼脂糖细胞克隆实验方法如基本实验方法10部分所述。
转染有一定质粒的MGC-803细胞在细胞密度达到104后,接种至6孔板中的软琼脂糖上,14天后对直径大于0.05毫米的克隆进行计数。
2.实验结果分析
2.1 VGLL4-TEAD4相互作用对YAP介导的细胞增殖的影响
与野生型的VGLL4相比,减弱VGLL4与TEAD4相互作用的VGLL4突变体 H212A/F213A对YAP介导的细胞增殖有一定的减弱作用。而打破VGLL4与TEAD4相互作用的VGLL4突变体H240A/F241A和HF4A几乎完全抑制了YAP介导的细胞增殖(图 4C),这进一步证明VGLL4与TEAD4的相互作用对于VGLL4的转录抑制活性是不可或缺的。
TDU串联结构域与单独的TDU结构域都能在MGC-803细胞系中抑制YAP介导的细胞增殖,这与之前的TDU结构域对于TEAD转录活性以及TEAD对于下游基因的调控的结果是一致的(图5C,5D,5E)。TDU串联结构域与单独的TDU结构域突变体会打破其与 TEAD4的相互作用,影响其对YAP介导的细胞增殖的抑制作用。因而,VGLL4的TDU结构域介导其与TEAD蛋白的相互作用,对自身的转录抑制功能至关重要,同时单独TDU串联结构域也就有转录抑制功能并抑制YAP介导的细胞过度增殖。
作为Hippo信号通路关键的调节因子,YAP作用于TEAD转录因子家族蛋白促进细胞生长,是一个原癌基因。通过软琼脂糖细胞克隆形成实验,在胃癌细胞系MGC-803中,YAP 促进细胞增殖,而转染转录抑制因子VGLL4可以促进细胞凋亡,抑制YAP引起的细胞增殖,这种抑制作用具有明显的计量效应。敲除VGLL4的TDU结构域会影响这种抑制作用 (图2C,2D)。在正常的HEK293T细胞系中转染VGLL4对其细胞增殖没有影响。
2.2 VGLL4胃癌细胞增殖的抑制作用
转染单独的TDU结构域或串联TDU结构域同样可以抑制YAP引起的细胞增殖,而不能与TEAD4相互作用的TDU结构域突变体,不具有促进细胞凋亡的作用(图5D,5E)。这证明VGLL4的TDU结构域本身在对胃癌细胞增殖就具有抑制作用;并且,单独的TDU结构域或串联TDU结构域也可以作为肿瘤治疗药物。
实施例5 Super-TDU多肽抑制YAP转录激活及胃癌肿瘤细胞增殖
1.试验方法
由于单独的VGLL4的TDU结构可以在细胞中抑制YAP介导的转录激活,而VGLL4 与YAP结合TEAD4的关键位点又不完全重合,本实施例设计了一段多肽,同时具备VGLL4 与YAP结合TEAD4的关键结合位点,与YAP竞争TEAD4的结合位点,以抑制YAP介导的转录激活,命名为Super-TDU。
Super-TDU的制备方法为:通过体外合成该Super TDU多肽的DNA编码序列 5’-GAAGCCTCGGTGGACGACCACTTTAACGCCGTCATGAACCCCAAGACGGCCAACGTGCCCCAGACCGTGCCCATGAGGCTCCGGAAGCTGCCCGACTCCTTCTTCAAGCCGCCGGAG-3’(SEQ ID NO:55),通过表15所示引物扩增获得Super TDU片段,通过NcoI 酶和XholI酶,酶切连接至HT-pET-28a中,经过测序验证后,体外表达纯化获得Super-TDU 蛋白,制备方法同实施例3。Super TDU片段扩增引物如下:
表15 引物序列
1.1 Super-TDU多肽对胃癌治疗作用的体外实验
将纯化获得的Super-TDU多肽用细胞培养液稀释后,加入培养的细胞中,检测0ng/ml、 10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml的Super-TDU多肽对于MGC-803、HEK293T和COS7三种细胞增殖的影响。细胞增殖的检测方法如基本实验方法中细胞增殖实验所述。
将纯化获得的Super-TDU多肽用细胞培养液稀释后,以不同浓度加入培养的细胞中, 0ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml、80ng/ml、160ng/ml,进行软琼脂糖细胞克隆形成实验,同时以50ng/ml的5氟胞嘧啶作为阳性对照,实验方法如基本实验方法所述。
1.2 Super-TDU多肽对胃癌治疗作用的体内实验
将MGC-803注射至BALB/cA nu/nu小鼠的腋下诱导成瘤。一旦形成可以检测的肿瘤,随机选择一对小鼠每天注射50μg/ml/kg(n=5)或500μg/ml/kg(n=5)的Super-TDU多肽或者对照多肽(n=10)。同时,小鼠被给予5mg/ml的-5氟胞嘧啶作为阳性对照。
2.实验结果及分析
Super-TDU多肽同时具有VGLL4与YAP结合TEAD4的关键结合位点和核定位信号,即YAP-TEAD第三个相互作用界面以及VGLL4-TEAD第二个相互作用界面的氨基酸序列 (图6),理论上具备很强的抗胃癌作用。
分别在体外和体内检测了Super-TDU多肽对胃癌的治疗作用。结果发现,在体外实验中,40ng/ml的Super-TDU多肽显著抑制了胃癌细胞MGD-803的细胞增殖(>50%),但对于HEK293T和COS7细胞的增殖无明显影响。同时在MGC-803的细胞克隆形成实验中,相较于TDU结构域,Super-TDU多肽表现出更强的抑制细胞克隆形成的作用(图7A,7B)。进一步研究Super-TDU多肽在活体中抑制肿瘤的作用。被给予Super-TDU多肽的小鼠体内的肿瘤在体积和重量上都明显减少,且与Super-TDU用量有计量依赖效应,500μg的 Super-TDU多肽比50ug对肿瘤生长的抑制作用更明显(图7C,7D)。
上述实验结果说明,Super-TDU多肽很可能是有效的一种YAP-TEAD相互作用的阻断剂,在治疗胃癌中有潜在的临床应用价值。
实施例6 Super-TDU多肽抑制肿瘤细胞增殖
1.试验方法
发现了Super-TDU多肽在胃癌细胞及小鼠胃癌模型中都表现出了明显的肿瘤抑制作用之后,使用Super-TDU多肽处理其他人癌细胞系。HEK293细胞,MGC-803细胞,MCF-7 细胞,Jurkat细胞,Raji细胞,A549细胞,U2OS细胞,HeLa细胞以及HCT116细胞的培养方法如基本实验方法4所述。使用不同浓度的Super-TDU多肽处理细胞(0、10、20、40、 80、160、320ng/ml),采用基本实验方法9中所述检测细胞增殖的方法检测细胞存活率。
2.实验结果及分析
实验结果如图8所示,Super-TDU多肽不仅对人胃癌细胞系MGC-803表现出明显的抑制增殖的作用,对其他的人癌细胞系也同样有抑制细胞增殖的作用,包括:人乳腺癌细胞系MCF-7;人急性T细胞白血病细胞系Junkat;人B细胞淋巴瘤细胞系Raji;人肺癌细胞系A549;人骨肉瘤细胞系U2OS;人宫颈癌细胞系HeLa;人结肠癌细胞系HCT116,且与 Super-TDU用量有计量依赖效应。而同时Super-TDU对于正常的人肾上皮细胞系HEK293 没有表现出具有统计意义的抑制细胞增殖的作用。
上述实验结果说明,Super-TDU多肽不仅在治疗胃癌中有潜在的临床应用价值,在其他的诸如乳腺癌、肺癌、结肠癌等多种癌症中具有潜在的临床应用价值。
实施例7 Super-TDU多肽抑制YAP转录激活抑制结肠癌肿瘤细胞增殖
1.试验方法
发现了Super-TDU多肽在胃癌细胞、小鼠胃癌模型以及多种人癌细胞系中都表现出了明显的肿瘤抑制作用之后,我们研究了VGLL4和YAP在结肠癌临床上的关系。
1.1 VGLL4表达与结肠癌发生的关系
对30例结肠癌病人的肿瘤组织和肿瘤旁正常组织中VGLL4和YAP的mRNA水平进行检测。检测方法如实施例1所示。实验结果见图9A-B。
同时检测了YAP下游靶基因CTGF的mRNA。检测方法如实施例1所示。引物序列如表16所示。
表16 引物序列
样本中YAP和VGLL4的蛋白表达的免疫印迹实验,实验结果见图9D。
针对结肠癌中YAP和VGLL4的蛋白表达水平是否有变化,对癌症组织和癌旁组织样本中YAP和VGLL4的蛋白表达进行免疫印迹实验。实验结果见图9D。
1.2 Super-TDU多肽对结肠癌治疗作用的体外实验
正常小鼠以及肠癌模型小鼠APCmin小鼠由4周起每天尾静脉注射对照多肽和Super-TDU多肽,直至8周。小鼠每天注射50μg/ml/kg(n=5)或500μg/ml/kg(n=5)的Super-TDU多肽或者对照多肽(n=10)。Super-TDU多肽的制备方法如实施例5所示。同时,小鼠被给予5mg/ml的5-氟胞嘧啶作为阳性对照。
2.实验结果及分析
30例人结肠癌样本中肿瘤组织和肿瘤旁正常组织中VGLL4基因和YAP基因的mRNA水平见图9A和9B。相对于肿瘤旁正常组织样本,46.7%结肠癌样本中YAP的mRNA水平在明显上调。形成鲜明反差的是,56.7%结肠癌样本中VGLL4的mRNA水平明显下调。对 5组结肠癌样本进行免疫印迹检测,结果表明,结肠癌组织样本中YAP的蛋白表达水平高于正常组织,而VGLL4的蛋白表达水平低于正常组织。(图9D)。
对YAP基因及其下游靶基因CTGF基因的与VGLL4基因的的mRNA水平进行统计,VGLL4与YAP和CTGF的mRNA水平均呈负相关(图9C)。
可见,结肠癌组织样本中VGLL4与YAP相互作用的的紊乱可能导致这些肿瘤细胞的过度增殖。
在解剖显微镜下对小鼠结肠腺瘤进行计数。与对照组的野生型小鼠相比,APCmin的缺陷型小鼠有明显的成瘤。Super-TDU多肽处理后,腺瘤的数量和大小都明显减少(图10C)。与对照多肽相比,Super-TDU处理后肿瘤数目下降了约65%(图10D)。更为重要的是,500ug/kg的剂量有明显的抗肿瘤效果,但对小鼠存活率的统计表明,该剂量的小鼠存活率与野生型相同,Super-TDU对小鼠无致死性,而相当抗肿瘤剂量的5-FU会降低小鼠存活率(图10B)。
上述实验结果说明,Super-TDU多肽作为一种有效的YAP-TEAD相互作用的阻断剂,在治疗结肠癌中也具有潜在的临床应用价值。
Claims (2)
1.一种治疗癌症的Super-TDU多肽,所述Super-TDU多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.一种治疗癌症的药物组合物,含有权利要求1所述Super-TDU多肽。
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