CN103012566B - 结合Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体及其制药用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及结合Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体及其制药用途。具体而言,本发明涉及一种肽段,具有通式I:GIPT/K/NX15G/WD/IP所示的序列,其中X选自氨基酸残基P、S、T、Q、N、H、A、Y、L、E、D、F、R、K,X15整体富含P、S、T、Q、N,且其中P占21%,T占18%,S占13%,且所述肽段是Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体,能够结合Grb7蛋白SH2结构域。本发明还涉及含有通式I所示肽段的肽段、包含所述肽段的组合物、所述肽段的编码序列、含有所述编码序列的核酸构建物、含有所述编码序列和/或所述核酸构建物的宿主细胞,及其用途,及筛选所述肽段的方法。
Description
技术领域
本发明涉及结合Grb7蛋白的SH2结构域的非磷酸化配体及其制药用途。
背景技术
Grb7蛋白家族最初是由筛选编码磷酸化酪氨酸受体配体的cDNA表达文库而发现的(1,2),作为接头蛋白,该家族成员通过SH2结构域募集下游信号分子并参与多种信号通路传导途径。该家族蛋白一共有3个成员:Grb7、Grb10和Grb14,其中,Grb7蛋白主要参与细胞的迁移和血管化过程,Grb10蛋白在细胞代谢调节和发育过程中发挥重要作用,而Grb14则主要参与调节细胞代谢和细胞增殖过程(3)。Grb7蛋白家族的结构上一共有3个主要的功能区域,N末端为富含脯氨酸的序列(2),其PS/AIPNPFPEL结构域可以结合某些蛋白中的SH3结构域(4),中间的功能区域称为GM区,该区包括3个功能性的结构域,分别为PH结构域、RA结构域和BPS结构域(Between PH and SH2),该结构域和线虫Caenorhabditis的Mig-10蛋白有着很高的序列同源性(5,6),C末端为一SH2结构域。
SH2结构域作为接头蛋白、激酶、细胞骨架等结构,在细胞信号传导中发挥重要作用(7)。由于SH2结构域的发现,人们开始由结构域之间的相互作用来研究蛋白-蛋白间的相互作用及细胞的信号通路(8)。SH2结构域由约100个氨基酸残基构成,其二级结构包括一个反平行的β折叠和两个α螺旋(9),SH2结构域中有一个阳性的结合口袋(10),通过这个结构,SH2结构域可以直接识别并结合磷酸化酪氨酸模序(11)。不同的SH2结构域在结合各自的磷酸化配体时,有各自不同的偏好(12)。近年来的研究显示,SH2结构域的结合特性远超过目前用计算机软件所预测的结果,因此,在研究SH2结构域的生物活性时,应采取个性化的措施,且应把发生相互作用的SH2/磷酸化配体对的空间构象考虑在内(13)。
尽管SH2结构域主要识别磷酸化配体,不过SH2结构域并非只是识别磷酸化配体,且SH2结构域与磷酸化配体间的结合也并非很牢固(10)。目前已有许多关于SH2结构域识别非磷酸化酪氨酸模序的报道。非磷酸化配体结合SH2结构域的亲和力,大约是磷酸化配体与SH2结构域间亲和力的1/104~105(35)。
Grb7蛋白家族的SH2结构域与其它典型的SH2结构域略有不同,首先,在氨基酸的排列上,Grb7蛋白家族的SH2结构域更具扩展性(14),其次,其它的SH2结构域通常为单体结构,但Grb10γ蛋白SH2结构域和Grb7蛋白SH2结构域却可以形成二聚体结构(15)。同时,Grb7蛋白家族3个成员之间的SH2结构域也有所不同:首先,从氨基酸序列来看,Grb10蛋白和Grb14蛋白更为相似(1),其序列重合性约为90%,Grb7蛋白的SH2结构域仅有60%~70%的氨基酸是和Grb10蛋白和Grb14蛋白相似的,其次,只有Grb7蛋白SH2结构域倾向于结合具有β折叠结构的肽段,该特性和Grb2蛋白SH2结构域的结合特性相似(16)。
Grb7蛋白通过其SH2结构域广泛参与各种信号传导途径,如胰岛素的信号传导途径(17),表皮生长因子受体ErbB2、ErbB3和ErbB4的信号传导途径(18),黏着斑激酶的信号传导途径(19),c-Kit/SCFR的信号传导途径(20)等。由于Grb7蛋白的SH2结构域与某些肿瘤的恶性扩增和转移密切相关,如乳腺癌(21),食管癌(22),胰腺癌(23),白血病(24)等,目前,已有许多将该结构域作为靶点设计的抗肿瘤药物,Krag等人已发现了一种可结合Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化肽段-G7-18NATE,在体外试验中,该肽段与Grb7蛋白SH2结构域的亲和力约为磷酸配体ErbB3与Grb7蛋白SH2结构域亲和力的1/10(25),且该肽段可有效抑制Grb7蛋白和ErbB3蛋白的结合(26)、抑制胰腺癌的转移(23)和乳腺癌细胞的增殖(27),可作为化学药物的研发基础(28)。
酵母双杂交是一种具有较高灵敏度的检测蛋白相互作用的方法,尤其是能检测到一些不容易被其它方法检测到的蛋白相互作用(8),根据一篇综述的报道,在酵母双杂交系统里面被检测到的相互作用蛋白间的亲和力是μM级别的范围(31)。因此,酵母双杂交技术非常灵敏,能够检测到常规生物化学方法检测不到的、弱的或瞬时的蛋白质相互作用(29,30)。这是由于细胞内阳性信号经过了多次放大(比如:转录、翻译、酶体系的逐级放大)。而且,双杂交反应发生在细胞内,使蛋白能够最大程度的保留其原始信息,这也大大增加了检测的灵敏度和准确性。但是,传统酵母双杂交技术是用于筛选cDNA文库,这会导致由于蛋白表达的丰度差异而使低丰度配体被高丰度配体掩盖;而且一次实验一般只筛选一种组织来源的cDNA文库,不能得到全面的结果。而用酵母双杂交筛选随机多肽文库,则可以同时解决亲和力竞争、丰度抑制和组织差异表达的问题。因此从理论上来说,一次随机多肽文库筛选就可以相对全面地研究目的结构域的结合特性。
识别线形模体的蛋白质相互作用结构域的结合特性可利用随机的或多样性的多肽文库来研究。通过筛选高度复杂的短肽文库,能够全面地研究目的结构域的识别特性。根据得到的识别规律搜索蛋白数据库,可在全蛋白质组水平上预测潜在的天然配体。筛选随机多肽文库还能得到筛选cDNA文库无法得到的非天然配体。这种非天然配体不仅可作为一种模拟工具用于功能研究,而且可能为药物分子的研究提供重要依据。
由于Grb7蛋白SH2结构域参与了众多的信号传导途径,和肿瘤的恶性增殖及转移密切相关(33,34),因此针对Grb7蛋白SH2结构域研发抗Grb7蛋白高表达的肿瘤药物,具有重要的临床意义。比如,最近报道了一类Grb7蛋白SH2结构域的化学拮抗剂,此类拮抗剂是基于计算机辅助的Grb7蛋白SH2结构域配体设计,通过搜索NCI的化学数据库而得到的,且被证实可有效抑制高表达Grb7蛋白的MDA-MB-468乳腺癌细胞系的生长(28)。
同时,由于与磷酸化配体比较,非磷酸化配体因不易被体内广泛存在的磷酸酶降解而稳定存在,同时,酵母细胞内无磷酸化修饰,适合筛选蛋白的非磷酸化配体。
美国专利号No.7229960公开了一类非磷酸化肽段及其在体内体外试验中可以特异结合Grb7蛋白的信号传导的实验结果。
因此,本发明的技术目的在于利用酵母双杂交技术和随机多肽文库筛选Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体并探究所述非磷酸化配体在制药领域中的用途。
发明内容
因此,本发明的第一方面涉及一种肽段,其具有通式I:GIPT/K/NX15G/WD/IP所示的序列,其中X选自氨基酸残基P、S、T、Q、N、H、A、Y、L、E、D、F、R、K,X15整体富含P、S、T、Q、N,且其中P占21%,T占18%,S占13%,且所述肽段是Grb7蛋白SH2结构域的非磷酸化配体,能够结合Grb7蛋白SH2结构域。优选地,X1选自氨基酸残基H、Y、A或Q,X2选自S、T、P、F、Q或D,X3选自S、P、T、Q或N,X4选自P、T、S或N,X5选自Q、T、P、S、D或A,X6选自Y、P、S、T或A,X7选自S、T、E、Y或H,X8选自P、L、N、Q或S,X9选自P、L、A、S、E或T,X10选自S、L、N、P或Q,X11选自T、P、H或S,X12选自Y、R、P、S、A、Q或H,X13选自S、P、H、N、E或K,X14选自P、L、Q、T或N,X15选自P、T或N。优选地,所述的肽段选自:
3和52. GIPTHSSPQYSPPSTYSPPGDP(SEQ ID No.1)
10. GIPNYTPTTPTLLLTRPLPGIP(SEQ ID No.2)
16. GIPTATTSPYENANPPHQTWDP(SEQ ID No.3)
41-A. GIPTQPTTSSEPSPPSNPPWDP(SEQ ID No.4)
41-B GIPTHHQNDTYNSPHAHPNRDP(SEQ ID No.5)
60. RNSYFTFLPARSLYLIKTHWDP(SEQ ID No.6)
67. GIPKAQNTTATPEQHASPTGIP(SEQ ID No.7)
98. GIPNQDPPAATQSPSQETTWDP(SEQ ID No.8)
106. GIPTSTPNTHSTTSHHKNPWDP(SEQ ID No.9)
本发明的第二方面涉及一种含有上述肽段的肽段,其具有通式II:B1-uGIPT/K/NX15G/WD/IPZ1-j,其中u为不大于5的数值,优选地,u为3,优选地,B1为V,B2为A,B3为V,j为不大于5的数值,优选地,j为3,优选地,Z1为G,Z2为R,Z3为V。最优选地,所述肽段的序列为VAVGIPTQPTTSSEPSPPSNPPWDPGRV。
本发明的第三方面涉及一种包含有效量的上述肽段的组合物,其中所述肽段为组合物的活性成分。
本发明的第四方面涉及一种编码上述肽段的核苷酸序列。
本发明的第五方面涉及一种包含上述的编码上述肽段的核苷酸序列的核酸构建物,其中所述核苷酸构建物能在原核或真核宿主细胞内有效表达,优选地,所述原核宿主细胞是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌,所述真核宿主细胞是酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞,优选地,所述核酸构建物是原核表达载体或真核表达载体,优选地,所述原核表达载体是质粒,更优选地,所述原核表达载体是pBridge;优选地,所述真核表达载体是pEFGF-C3或pXflag-CMV-14。
本发明的第六方面涉及一种包含上述核酸构建物的宿主细胞,优选地,所述宿主细胞是原核宿主细胞或真核宿主细胞,更优选地,所述真核宿主细胞是哺乳动物细胞,最优选地,所述真核宿主细胞是人细胞。
本发明的第七方面涉及上述肽段、组合物、核苷酸序列、核酸构建物或宿主细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途,优选地,所述肿瘤为乳腺癌、食管癌、胰腺癌或白血病。
本发明的第八方面涉及一种上述的肽段、组合物、核苷酸序列、核酸构建物或宿主细胞,其分别用作治疗肿瘤的药物,优选地,所述肿瘤为乳腺癌、食管癌、胰腺癌或白血病。
本发明的第九方面涉及一种筛选上述肽段的方法,其包括如下步骤:
a)构建能在酵母细胞中表达Grb7蛋白的SH2结构域的诱饵蛋白质粒;
b)将所述诱饵蛋白质粒转化酵母菌并筛选获得阳性克隆;
c)将随机多肽文库质粒转化上述获得的阳性克隆并确定相互作用情况;
d)酵母双杂交二次验证非磷酸化肽段和Grb7SH2结构域的相互作用;
e)将获得的阳性质粒进行测序。
优选地,所述诱饵蛋白质粒为pBridge,所述酵母菌为CG1945,所述随机多肽文库质粒为Clonetech目录号PT303921的产品,确定相互作用情况时利用β-半乳糖甘酶活性检测实验进行。
换言之,Grb7蛋白是一种接头蛋白,该蛋白是Grb7蛋白家族的成员之一,这个家族的蛋白包括Grb7、Grb10和Grb14。现在研究发现,Grb7蛋白在一些恶性肿瘤组织中,尤其是高转移性肿瘤组织中处于高表达状态,比如乳腺癌,食管癌,胃癌等。编码Grb7蛋白的基因位于人染色体17q12-q21,该区域在临床检验中已被证实在某些肿瘤中有明显的扩增,这一基因基础,决定了Grb7蛋白有可能成为临床治疗肿瘤的一个重要靶点。在Grb7蛋白中,一共有3个主要的功能区域,N末端富含脯氨酸,中间序列和Caenorhabditis elegans的Mig-10有很高的相似性,该结构域在细胞迁移中发挥了重要作用。其中,C末端是一个SH2结构域。SH2结构域在Grb7蛋白参与的细胞信号传导通路中发挥了重要作用。虽然Grb7 SH2结构域主要是以结合磷酸化酪氨酸模序为主,但研究发现Grb7蛋白也可以结合非磷酸化肽段序列,而且由于非磷酸化肽段较磷酸化肽段更加稳定,所以研究Grb7的SH2结构域与非磷酸化肽段的结合特性更有助于研制针对Grb7蛋白高表达的肿瘤治疗的药物。在本文的研究中,发明人通过使用酵母双杂交的方法,在随机多肽文库中筛选到了可结合Grb7蛋白SH2结构域的一系列非磷酸化肽段,这些肽段的共同之处在于,每个肽段序列中均有一个含22个氨基酸的序列,其中,N末端为GIPT/N/K的保守序列,C末端为G/WD/IP的保守序列,中间为15个随机排列的氨基酸,计算获得的非磷酸化配体的序列可见,该片段富含脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、谷氨酰胺和天冬酰胺等中性氨基酸,很少含有空间位阻大的氨基酸残基,突变实验表明在22个氨基酸序列中,两端保守的7个氨基酸对非磷酸化肽段和Grb7SH2结构域的结合起重要作用,这种新的结合方式在体外免疫共沉淀和活细胞内的荧光能量转移实验都已得到证实。据我们所知,未有过结合Grb7的SH2结构域的该序列的类似报道,这是一种全新的结合Grb7的SH2结构域的非磷酸化序列。发明人将该22个氨基酸的序列归纳为公式:GIPT/KX15G/WD/IP模序(X代表任意氨基酸)。
当识别磷酸化酪氨酸配体时,SH2结构域中的EF环通常识别+3位氨基酸(磷酸化酪氨酸为0位,左侧为-,右侧为+),这一特性决定了不同的SH2结构域具有不同的识别特性(32)。发明人猜想在SH2结构域识别非磷酸化配体时,EF环状结构也起到了识别关键位点的作用,因组成EF环氨基酸序列的不同,造成了是Grb7蛋白SH2结构域,而不是Grb2蛋白和Grb14蛋白的SH2结构域,能够结合非磷酸化的模序。
发明人在研究中发现,非磷酸化的22个氨基酸模序结合Grb7蛋白SH2结构域的亲和力略高于磷酸化配体结合Grb7蛋白SH2结构域的亲和力(图4),活细胞内的荧光能量转移实验也证实,非磷酸化肽段41结合Grb7蛋白SH2结构域的530/480nm比值,是ErbB3结合Grb7蛋白SH2结构域的530/480nm比值的80%(图3A和图3B),这进一步揭示了当结合Grb7蛋白SH2结构域时,发明人得到的非磷酸化的22个氨基酸模序与Grb7蛋白SH2结构域的天然配体具有相似的亲和力。有人发现,当结合SAP蛋白SH2结构域时,非磷酸化的n-Y-c肽段具有和磷酸化配体相似的亲和力(36)。这一发现也证实了本发明的结论。功能试验中,我们也发现瞬时转染非磷酸化肽段41质粒的SK-BR-3人乳腺癌细胞的增殖速度明显慢于对照组(图5),在未来的研究中,本发明发现的非磷酸化肽段可以像非磷酸化肽段G7-18NATE一样,可以作为研发治疗Grb7蛋白高表达的肿瘤药物的基础。
附图说明
图1:显示了本发明筛选出的肽段41和Grb7蛋白SH2结构域的免疫共沉淀图谱,其中mRLUC是空白对照,10是肽段10,41是肽段41,10CM是阴性对照肽段10CM。A图显示了编码非磷酸化肽段的质粒在真核细胞内表达时,肽段10的表达量少(原因不详),肽段41,0CM及阴性对照的表达量正常。B图显示了免疫共沉淀实验中检测到非磷酸化肽段41结合Grb7蛋白SH2结构域。
图2:A-E显示的是质粒在真核细胞内的转染效率,其中mRLUC是空白对照,10是肽段10,41是肽段41,10CM是阴性对照肽段10CM,ErbB3是Grb7天然配体,EYFP-mRLUC是阳性对照。
图3A:显示的是非磷酸化肽段41和10结合Grb7SH2结构域的亲和力虽然不及Grb7蛋白的天然配体ErbB3强,但是却超过了阴性对照10CM和空白对照的空载体,其中mRLUC是空白对照,10是肽段10,41是肽段41,10CM是阴性对照肽段10CM,ErbB3是Grb7天然配体,EYFP-mRLUC是阳性对照,此图为荧光强度对比图。
图3B:显示的是非磷酸化肽段41和10结合Grb7SH2结构域的亲和力虽然不及Grb7蛋白的天然配体ErbB3强,但是却超过了阴性对照10CM和空白对照的空载体,其中mRLUC是空白对照,10是肽段10,41是肽段41,10CM是阴性对照肽段10CM,ErbB3是Grb7天然配体,EYFP-mRLUC是阳性对照,此图为相对荧光强度对比图。
图4:显示的是体外实验中,非磷酸化肽段41-A和磷酸化肽段均可以干扰非磷酸化肽段41与Grb7SH2结构域的结合,甚至非磷酸化肽段41-A的干扰效果要优于磷酸化肽段。41-A的序列为:VAVGIPTQPTTSSEPSPPSNPPWDPGRV,磷酸化肽段的序列为:DEEYEpY(1180)MNRRR,该肽段来源于ErbB3蛋白。
图5:18~24小时:细胞内蛋白表达较少,G418的杀伤作用占主导,因此细胞数量逐渐减少;24~48小时:细胞内蛋白表达逐渐达到高峰,细胞增殖占主导,虽然起始细胞数是相同的,但是转染41-mRLUC质粒的细胞数一直少于转染阴性对照mRLUC质粒的细胞数,说明肽段41可结合Grb7蛋白SH2结构域并在一定程度上阻止了Grb7蛋白SH2结构域参与的细胞增殖的信号转导通路;48~60小时:蛋白表达逐渐减少,G418的杀伤作用占主导,细胞数量一直下降。
具体实施方式
下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明,本领域技术人员公知,在不背离本发明精神的情况下,可以对本发明做出许多修改,这样的修改也落入本发明的范围。
下述实验方法如无特别说明,均为常规方法,所使用的实验材料如无特别说明,均可容易地从商业公司获取。
实施例
实施例1实验材料
1、菌株:大肠杆菌菌株E.coli DH5α,酵母菌株CG1945(Clontech Laboratories,Inc,目录号PT3247-1)。
2、质粒载体:pBridge(含Gal4DNA结合结构域编码序列,BD BiosciencesClontech,目录号:6184-1)、pGADGH(Clontech Laboratories,Inc,目录号PT3062-1)、pGADT7(含Gal4转录激活结构域编码序列,Clontech Laboratories,Inc,目录号PT3249-5)、PEGFP-C3(含GFP标签,用于免疫共沉淀和荧光能量转移实验,BDBiosciences Clontech,目录号:6082-1)、p3XFLAG-CMV-14(含flag标签,用于免疫共沉淀和荧光能量转移实验,sigma.目录号:E4901)。
3、cDNA和核苷酸片段:Grb7、Grb14 cDNA克隆购于Proteintech Group,Inc.;Grb2,ABL_1质粒:获自Brandeis University,USA;mRLUC(海参荧光素酶,用于免疫共沉淀和荧光能量转移实验)和EYFP(用于免疫共沉淀和荧光能量转移实验)参考文献(37);ErbB3 cDNA克隆:购于Sino Biological Inc.ErbB3-mRLUC融合蛋白编码质粒由北京神州义翘生物公司合成,构建于p3Xflag-CMV-14载体的NOTI、ClaI之间,mRLUC构建于KpnI、BamHI之间。
4、肽段:磷酸化肽段DEEYEpY(1180)MNRRR和非磷酸化肽段VAVGIPTQPTTSSE PSPPSNPPWDPGRV均由上海强耀生物科技有限公司合成。
5、工具酶、分子量标准、DNA制备试剂盒分别购自北京天根公司、博大泰恒公司和大连宝生物。
6、随机多肽文库购于Clonetech(目录号:PT303921)
7、细菌、酵母培养用品、细菌和酵母转化用品分别购自Sigma公司、MERCK公司、北京欣经科公司、博大泰恒公司、OXOID公司、Difco、Clontech LaboratoriesInc,本发明实施例中使用的其他化学试剂均可从商业公司容易地获得。
8、细胞试验相关试剂均由北京迈晨科技公司购得。
本发明所使用的溶液、试剂的配置方法均可从常规分子生物学操作手册,如冷泉港出版社出版的“分子克隆”第三版等容易地获取。
实施例2诱饵蛋白(bait)构建
1、利用下述引物进行PCR从质粒中扩增SH2结构域,质粒可购于Protein TechGroup,Inc.Grb2(目录号:BC000631),Grb7(目录号:BC006535),Grb14(目录号:BC053559),ABL-1(目录号:BC024254)。
利用下述引物从cDNA质粒中扩增SH2结构域的编码基因,质粒来源见实施例1。
从琼脂糖凝胶中回收DNA片段(按博大泰克试剂盒操作说明进行);
酶切目的片段及载体DNA(如EcoRI和BamHI);
从琼脂糖凝胶中回收DNA片段(按博大泰克试剂盒操作说明进行);
纯化酶切产物(按天根试剂盒操作说明进行);
纯化的酶切产物和酶切载体用T4DNA连接酶进行连接。
四个SH2结构域基因片段以及全长基因分别由引物扩增后,经过酶切、连接到GAL 4BD下游的酶切位点之间,构建成pBridge-Grb2-SH2、pBridge-Grb7-SH2、pBridge-Grb14-SH2和pBridge-ABL_1-SH2四个诱饵蛋白质粒。
连接产物转化DH5α化学感受态细胞。挑取阳性克隆,扩增培养后小量制备质粒DNA,进行酶切鉴定和测序鉴定,获得含有插入片段的重组质粒DNA。
用YPD固体培养基培养CG1945酵母菌并验证表型后,采用醋酸锂法转化上述四个诱饵质粒,采用标准方法进行诱饵蛋白的β-半乳糖苷酶活性检测(诱饵蛋白自激活)、His渗漏情况检测及诱饵蛋白的毒性检测,获得含有重组诱饵质粒的酵母单克隆。
实施例3诱饵蛋白筛选随机多肽文库(顺序转化法)
随机多肽文库的扩增,按照Clonetech的说明书进行操作。
文库质粒的大量提取:常规的质粒大量提取,按照北京博大泰恒质粒大提试剂盒说明书进行。
采用标准的PEG/LiAc法将文库质粒DNA转化新鲜制备的含目的基因(SH2结构域)的酵母(CG1945)克隆的酵母感受态细胞,于SD/-Trp-Leu-His+3-AT的固体培养基上(15cm)、30℃倒置培养4-7天。挑取文库转化后在SD/-Trp-Leu-His固体培养基上长出的酵母菌落于3ml SD/-Trp-Leu的培养液中、30℃摇床培养过夜。利用β-半乳糖苷酶活性检测(LacZ)实验确定相互作用情况,一般在8小时内变蓝的菌落被认为是阳性克隆。
为了验证结合非磷酸化肽段是否为SH2结构域蛋白的共同特性,我们挑选了3个含SH2结构域的蛋白,即ABL_1,Grb2和Grb7蛋白。将3种蛋白的SH2结构域构建于pBridge载体(表1)。经过第一次筛选,Grb2和Grb7的SH2结构域均筛选到阳性结果,Grb2的SH2结构域得到1个阳性结果,Grb7的SH2结构域得到13个阳性结果(表2、表3),经过第二次验证,只有Grb7的SH2结构域得到9个阳性结果(表4),且这九个结果经过3次以上独立实验(LacZ二次筛选)的验证,这9个阳性克隆的最大特性就是每个克隆里面都含有一个22个氨基酸的固有序列,即GIPT/K/NX15G/WD/IP序列(X代表任意氨基酸),其中,肽段41含有两个22氨基酸固有序列,肽段60中含有的22氨基酸固有序列不具有左端的4个保守序列。根据我们的知识,这种新的Grb7SH2结构域的结合方式是一种全新的结合方式,以前从未有过类似的报道。经过蛋白序列库的搜索,未发现有类似序列的蛋白存在。
表1不同SH2结构域的插入氨基酸序列
表2Grb2蛋白SH2结构域筛选随机多肽文库的第一次LacZ筛选结果
表3Grb7蛋白SH2结构域筛选随机多肽文库的第一次LacZ筛选结果
表4Grb7蛋白SH2结构域筛选随机多肽文库的第二次LacZ筛选结果
实施例4阳性克隆DNA序列的获得
1、重新划线接种酵母细胞,以获得含单个文库质粒的阳性酵母细胞。由于在一个阳性酵母细胞中可能含有多个AD文库质粒,因此将在上述步骤中获得的阳性酵母重新接种于SD/-Trp-Leu的固体培养皿中,大多数情况下此操作可使多个AD质粒得到分离。重复划线2-3次。将完全分离的酵母克隆重做LacZ检测。
2、阳性酵母中文库质粒DNA的提取
1)挑取阳性酵母菌于3ml SD/-Leu的培养液中,30℃振摇24h,去除BD诱饵质粒。
2)将上述培养液离心,12,000rpm离心30s。
3)将沉淀溶于200μl裂解液,震荡使其充分重悬。
4)加入酸洗玻璃珠使总体积达到400μl,剧烈振荡1min。
5)加入200μl的PCI溶液并剧烈振荡1min。12,000rpm,离心5min。
6)吸上清至另一个离心管中,再加入200μl的PCI溶液并剧烈振荡,离心5min。
7)吸上清至另一个离心管中,加入200μl CHCl3,取上清至另一个离心管中。
8)加入2倍体积的无水乙醇,室温放置15min,12,000rpm×10min以沉淀DNA。
9)用70%的乙醇1ml洗涤2遍,离心回收沉淀。
10)沉淀干燥后溶解于10-20μl TE中。
3、酵母双杂交试验再次验证相互作用(二次转化)
提取转化到细菌中的酵母质粒DNA,PCR验证提取的DNA是文库质粒,然后重新将文库质粒转化到含目的基因(SH2结构域)的CG1945酵母细胞中,LacZ实验再次确定它们之间的相互作用。
4、阳性质粒的测序
将上步中获得的LacZ检测呈阳性的克隆的质粒送北京奥科生物公司测序,获得阳性克隆DNA序列。
实施例5酵母双杂交筛选cDNA文库
本实验中采用的cDNA文库为人骨髓cDNA文库(Protocol number No.PT303921,Clonetech,美国),实验方法同筛选随机多肽文库方法。所得到的结果在www.expasy.org网站进行蛋白质搜索
为寻找是否存在Grb7蛋白SH2结构域可真实结合的非磷酸化蛋白存在,我们用Grb7蛋白SH2结构域作为诱饵蛋白,在酵母双杂交系统里面搜索人骨髓cDNA文库,得到一条cDNA序列(表5),经过搜索蛋白库(www.expasy.org),我们找到了五个像对应的蛋白(表6),由于这些蛋白的定位都位于细胞外,而Grb7蛋白SH2结构域位于细胞内,生理状态下这些蛋白与Grb7蛋白SH2结构域接触的几率不大。
为进一步研究是否结合非磷酸化肽段为Grb7蛋白家族的特性,我们用该家族的另一个成员,Grb14蛋白的SH2结构域作为诱饵蛋白,分别筛选了随机多肽文库,及用上述结合Grb7蛋白SH2结构域的9条非磷酸化肽段作为AD,进行二次验证筛选,均未得到阳性结果。
证明这些非磷酸化肽段可以特异性的结合Grb7蛋白SH2结构域,从而可以用来设计针对Grb7蛋白作为靶点的抗肿瘤生物药物。
表5Grb7蛋白SH2结构域筛选人骨髓cDNA文库的二次LacZ筛选结果
表6与Grb7蛋白SH2结构域相互作用的cDNA序列搜蛋白库得到的完全匹配的蛋白
实施例6关键位点突变实验
以筛选到的一条非磷酸化肽段NO.10,作为模板,进行突变实验的设计。突变序列如下:
表7三对突变肽段的编码碱基序列
表8三对突变氨基酸序列:
在酵母双杂交系统里面筛选出来的非磷酸肽段里面均含有22个氨基酸的固有序列,其两端均有7个氨基酸的保守序列。为验证这7个氨基酸在结合Grb7蛋白SH2结构域中发挥重要作用,根据肽段10的22个氨基酸的固有序列,设计了3对突变序列(表7、表8)。我们发现虽然非磷酸化肽段10并非每个克隆都能变色,但是三个突变均不能在SD/-Trp-His-Leu的板子上形成明显的克隆。由于cDNA文库中筛选出来的序列中也含有类似22个氨基酸的序列,我们扩增了如下的片段:RQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVG,以该片段作为AD插入pGADT7载体,以Grb7SH2结构域作为BD,进行酵母双杂交的二次验证,在SD/-Trp-His-Leu的板子上未见有明显的克隆形成,经过10天以后,试图挑了几个克隆,这些克隆在SD/-Trp-His-Leu的液体培养基中也未能生长。这表明,由人骨髓cDNA文库中筛选到的序列中结合Grb7SH2结构域的更关键位点还是未知的。
在人骨髓cDNA文库中筛选到了一个可以结合Grb7SH2结构域的非磷酸化序列,由这个序列搜到了5个真实的蛋白。发明人对此有两种设想,一是如果这些蛋白可以和Grb7蛋白共定位的话,将要在细胞内验证这种蛋白间的相互作用,但是经过搜库发现这些蛋白不可能和Grb7蛋白共定位;第二种设想就是如果这些蛋白和Grb7不能共定位的话,这段序列或许像随机多肽文库中筛选到的非磷酸化肽段一样,22个氨基酸序列就是其最小的一个作用片段。所以本发明用片段RQEPSQGTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDTFSCMVG来证明是否可以结合Grb7SH2结构域,但是酵母双杂交实验没有验证出来,说明含GTTTFAVTSILRVAAEDWKKGDT的22个氨基酸序列不能结合Grb7SH2结构域,也就是说,人骨髓cDNA文库中筛选到的非磷酸化蛋白序列虽然可以结合Grb7SH2结构域,但是结合的关键位点不同于22个氨基酸模序。进一步的推测就是,用不同的方法得到的Grb7SH2结构域的结合特性之间可能没有太多的交集,因此目前Grb7SH2结构域的结合序列,都是各不相同的,没有一个共有序列(4)。
实施例7细胞学实验
1)质粒构建
Grb7SH2结构域构建于pEGFP-C3载体EcoRI、BamHI位点之间,p3Xflag-CMV-14载体NotI、BglII之间,非磷酸化肽段10、41、10CM均构建于p3Xflag-CMV-14载体NotI、BglII之间,EYFP构建于p3Xflag-CMV-14载体NotI、BglII之间及p3Xflag-CMV-14载体KpnI、BamHI位点之间,mRLUC构建于p3Xflag-CMV-14载体KpnI、BamHI位点之间,ErbB3构建于p3Xflag-CMV-14载体NotI、ClaI之间。
引物设计如下:
2)质粒扩增
质粒的PCR扩增及酶切连接步骤同前。
3)转染质粒DNA的大量制备
无内毒素、转染级的质粒大量提取,按照博大泰恒质粒A型超纯质粒大量快速提取试剂盒说明书进行。测定质粒DNA的浓度。
真核细胞HEK293T的转染:按常规真核细胞转染方法(磷酸钙转染方法)进行。将转染后的HEK293T细胞用RIPA细胞裂解液进行裂解(按厂商说明书进行),然后进行免疫共沉淀(anti-flag抗体(Abmart)),将获得的样品跑SDS-PAGE电泳,将蛋白质从SDS聚丙烯酰胺凝胶转移至硝酸纤维素(NC)膜(湿式转膜),按常规方法进行杂交和ECL显色(一抗为BCR:1/2000;myc:1/2000,二抗为中杉金桥产品),分析条带密度后,用SPSS11.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用Student’s t-test检验,显著性差异为P<0.05。
为进一步验证非磷酸化肽段和Grb7SH2结构域之间的相互作用,使用了免疫共沉淀的方法。首先,选择了在酵母双杂交体系内与Grb7SH2结构域有较强相互作用的两个非磷酸化肽段10和41进行实验。非磷酸化肽段的分子量都很小,平均10KD左右,为了使其容易被检测,我们将mRLUC标签与非磷酸化肽段融合,插入3Xflag表达载体中,并将融合mRLUC的3Xflag载体作为阴性对照。EGFP-Grb7SH2分别与10mRLUC-3xFlag,41mRLUC-3xFlag,10CMmRLUC-3x Flag以及mRLUC-3xFlag分别共转染入HEK293T细胞中(磷酸钙转染法)。如图1的A图所示:转染的质粒,只有非磷酸化肽段10不能很好地表达,其余均能正常表达。只有非磷酸化肽段41能明显的和Grb7SH2结构域发生相互作用,10CM和阴性对照均不能结合Grb7SH2结构域(图1的B图)。非磷酸化肽段10结合Grb7SH2结构域不明显,可能与其在HEK293T细胞中的低表达有关。
由此可见,我们筛选出来的非磷酸化肽段在真核细胞内也可以和Grb7SH2结构域发生相互作用。
实施例8肽段体外干扰实验
细胞转染及裂解步骤同前,当细胞裂解液与antiflag抗体孵育时,在不同的样品中加入不同浓度的磷酸化及非磷酸化肽段,其余步骤同免疫共沉淀及蛋白电泳。
为进一步比较非磷酸化肽段与Grb7SH2结构域间以及磷酸化配体与Grb7SH2结构域间的亲和力的区别,我们选择了非磷酸化肽段41与Grb7SH2结构域之间的相互作用作为研究对象,如图4所示,未施加干扰因素时,非磷酸化肽段41可以稳定地结合Grb7SH2结构域,随着加入非磷酸化肽段41-A和磷酸化肽段的浓度不断增加,非磷酸化肽段41和Grb7SH2结构域之间的结合被逐步减弱至消失,而且非磷酸化肽段41-A在浓度较高时的干扰效果优于磷酸化肽段。
由此可见,在非磷酸化肽段41结合Grb7SH2结构域时,22个氨基酸的固有序列发挥重要作用,活细胞内非磷酸化肽段41与Grb7SH2结构域结合明显弱于Grb7SH2结构域与天然配体ErbB3的结合。
实施例9荧光能量转移实验
实验步骤如下:
1)细胞长至80%左右进行转染,转染后36小时收样,弃去培养基,加入胰酶和EDTA,37°孵育5分钟后,加入新鲜培养基终止消化,将99μl细胞悬液加入至96孔板内,再加入1μl 5.9M的肠腔素,在多功能酶标仪上测量读数。
2)多功能酶标仪按照说明进行程序设定,取460/40nm、518/20nm两个光栅通路进行读数。
3)结果统计学处理:SPSS17.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差(x±s)表示,组间比较采用单因素方差分析,显著性差异为P<0.05。
为进一步验证这种新型的相互作用,我们使用了荧光能量转移方法(BRET)。EYFP-mRLUC融合蛋白作为阳性对照,EYFP-Grb7SH2分别与10mRLUC、41mRLUC、10CMmRLUC以及mRLUC分别共转染入HEK293T细胞中(磷酸钙转染法)。首先,我们测定了钙转的转染效率(图2:A-E)。由图3A和图3B中可看出,EYFP标签融合蛋白和mRLUC标签融合蛋白均在细胞内有效表达,Grb7SH2结构域与非磷酸化肽段10、41之间存在明显的相互作用,其530/480nm比值明显强于Grb7SH2结构域与10CM以及与阴性对照之间的比值(表9,表10,表11,表12,表13)。尽管非磷酸化肽段10不能在HEK293T细胞内很好表达,但是非磷酸化肽段10和Grb7SH2结构域之间的相互作用仍然可以被BRET检测到。
证明非磷酸化肽段10可能由于某些原因在真核细胞内表达的时候容易被降解,所以在免疫共沉淀实验中只是检测到肽段41结合Grb7SH2,没有检测到肽段10结合Grb7SH2,但是BRET实验由于其高灵敏度,检测到了肽段10和Grb7SH2的结合,其结合强度甚至略高于肽段41和Grb7SH2的结合(图3A和图3B)。
表9非磷酸化肽段结合Grb7SH2结构域的530/480nm值
表10非磷酸化肽段结合Grb7SH2结构域的530/480nm值的单因素方差分析结果
表11非磷酸化肽段结合Grb7SH2结构域的530/480nm值的均值与方差
表12非磷酸化肽段结合Grb7SH2结构域的530/480nm的相对值
表13肽段41与ErbB3结合Grb7SH2结构域时的530/480nm值
实施例10非磷酸化肽段41结合Grb7蛋白SH2结构域的功能验证
人乳腺癌细胞SK-BR-3(购自北京协和医学院细胞中心,资源编号:3131C0001000700049),人乳腺癌细胞高表达Grb7蛋白(20)。
质粒转染试剂:Mega Tran 1.0(OriGene,美国)
G418:(11811-023,Invitrogen)。配制:1g G418粉末溶于100mM HEPES(pH 7.3)10mL,质量终浓度为100mg/mL。
细胞增殖检测试剂MTS(G3582,promega)。
所用质粒:41-mRLUC,阴性对照为mRLUC。
实验步骤如下:
1)人乳腺癌细胞种植于60mm平皿中培养,培养基为DMEM(高糖,含10%胎牛血清);
2)人乳腺癌细胞SK-BR-3长至70%~80%左右准备进行转染,转染前2~4小时更换5mL新鲜培养基;
3)转染方法:按照Mega Tran1.0的protocol进行细胞转染:
a)将10μg质粒DNA缓慢加入到PBS缓冲液中,缓慢震荡10秒;
b)将30μL转染试剂Mega Tran1.0缓慢加入到含质粒DNA的PBS缓冲液中,保持总体积为500μL,缓慢震荡10秒;
c)室温孵育10分钟;
d)将Mega Tran1.0/质粒DNA的混合物逐滴加入到培养基中,轻轻混匀;
e)转染后3~4小时更换新鲜培养基;
4)转染后12小时开始加入抗生素G418,其质量浓度为400μg/ml;
5)转染后18小时,将60mm培养皿中的细胞消化离心,按照转染18小时、24小时、36小时、48小时、60小时等时间段加入到不同的96孔板中(U型底),每个时间段转染41-mRLUC质粒的细胞和转染mRLUC质粒的细胞各10孔,每孔100μL细胞悬浮液,约7500个细胞,作为起始细胞数;
6)检测前约1~2个小时,将检测试剂MTS加入到细胞悬浮液中,每孔加入20μLMTS(避光),37℃孵育一个小时;
7)每个96孔板内取10孔加入培养基,作为背景;
8)96孔板震荡10秒,于酶标仪492nm处读出吸光度,10个加培养基的吸光度的平均值作为背景吸光度,每个孔的读数减去背景吸光度之差为即为校正的吸光度值;
9)结果统计学处理:SPSS17.0软件进行统计学分析,数据以均数±标准差(x±s)表示,采用双因素方差分析,显著性差异为P<0.05。
结果见图5。根据图5的内容,发明人认为,在24~48小时内的蛋白表达高峰阶段,肽段41可结合Grb7蛋白SH2结构域,与对照相比,在一定程度上阻止了Grb7蛋白SH2结构域参与的细胞增殖的信号转导通路,导致转染41-mRLUC质粒的细胞数在转染后24~48小时内一直低于对照组并且有统计学显著性差异,进而说明肽段41可用作药物在一定程度上抑制高表达Grb7蛋白的肿瘤细胞的恶性增殖。
表14不同时间转染非磷酸化肽段编码质粒及阴性对照质粒的人乳腺癌细胞SK-BR-3的492nm OD值
表15非磷酸化肽段41抑制人乳腺癌细胞SK-BR-3细胞增殖的双因素方差分析结果(n=10)
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Claims (15)
1.一种肽段,其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
2.一种含有根据权利要求1所述肽段的肽段,其氨基酸序列为VAVGIPTQPTTSSEPSPPSNPPWDPGRV。
3.一种包含有效量的根据权利要求1或2所述的肽段的组合物,其中所述肽段为组合物的活性成分。
4.一种编码根据权利要求1或2所述的肽段的核苷酸。
5.一种包含根据权利要求4所述的核苷酸的核酸构建物,其中所述核苷酸构建物能在原核或真核宿主细胞内有效表达。
6.根据权利要求5所述的核酸构建物,其中所述原核宿主细胞是大肠杆菌或枯草芽孢杆菌,所述真核宿主细胞是酵母菌、昆虫细胞或哺乳动物细胞。
7.根据权利要求5所述的核酸构建物,其中所述所述核酸构建物是原核表达载体或真核表达载体。
8.根据权利要求7所述的核酸构建物,其中所述原核表达载体是质粒。
9.根据权利要求8所述的核酸构建物,其中所述原核表达载体是pBridge。
10.根据权利要求7所述的核酸构建物,其中所述真核表达载体是pEFGF-C3或pXflag-CMV-14。
11.一种包含根据权利要求5所述核酸构建物的宿主细胞。
12.根据权利要求11所述的宿主细胞,其是原核宿主细胞或真核宿主细胞。
13.根据权利要求12所述的宿主细胞,其中所述真核宿主细胞是哺乳动物细胞。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞,其中所述真核宿主细胞是人细胞。
15.一种根据权利要求1或2所述的肽段、根据权利要求3所述的组合物、根据权利要求4所述的核苷酸、根据权利要求5-10中任一项所述的核酸构建物或根据权利要求11-14中任一项所述的宿主细胞在制备治疗肿瘤的药物中的用途,其中所述肿瘤为乳腺癌。
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CN1769460A (zh) * | 2005-07-25 | 2006-05-10 | 中国人民解放军第四军医大学 | 重组嵌合分子Cb1-Grb7(SH2)-RING真核表达质粒及抗肿瘤基因药物用途 |
Non-Patent Citations (1)
Title |
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Identification of Novel Non-phosphorylated Ligands, Which Bind Selectively to the SH2 Domain of Grb7;Stephanie C.Pero et al.;《The Journal of Biological Chemistry》;20020124;第277卷(第14期);11918-11926 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
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CN103012566A (zh) | 2013-04-03 |
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