JP5143552B2 - 細胞周期フェーズマーカー - Google Patents
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Description
i)例えば、潜在性のある抗癌治療薬としての研究のために、直接若しくは間接的に細胞周期の進行を修飾する物質が望まれる場合;
ii)薬物候補が、細胞周期の進行に対する望ましくない効果についてチェックされるべき場合;及び/又は
iii)ある薬剤が、細胞周期の特定の期にある細胞に対して活性か若しくは不活性であると推測される場合。
a)細胞中で上述の核酸構築物を発現させ;
b)レポーター分子によって発生するシグナルをモニターすることにより細胞周期位置を決定する工程を含む。
a)上述の核酸レポーター構築物を、被検薬剤の非存在下及び存在下に細胞中で発現させ;並びに
b)レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定する工程を含み、ここで、被検薬剤の非存在下と存在下に測定された発生シグナル間の差が、細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果の指標となる。
a)当該被検薬剤の存在下に、上述の核酸レポーター構築物を当該細胞中で発現させ;
b)レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し;並びに
c)被検薬剤の存在下に発生するシグナルを、被検薬剤の非存在下に発生するシグナルに対する既知の数値と比較する工程を含み、
ここで、被検薬剤の存在下に測定された発生シグナルと、被検薬剤の非存在下での既知の数値との差が、細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果の指標となる。
a)上述の核酸レポーター構築物を含む細胞を用意し;
b)細胞の第一及び第二集団を、被検薬剤の存在下及び非存在下、核酸レポーター構築物の発現を許容する条件下にそれぞれ培養し;並びに
c)第一及び第二細胞集団において、レポーター分子が発生するシグナルを測定する工程を含み、
ここで、第一及び第二細胞集団で測定された発生シグナル間の差が、細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果の指標となる。
a)被検薬剤の存在下に、上述の第二核酸レポーター構築物を、細胞中で発現させ;
b)第二レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し;並びに
c)第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルをモニターする工程を含み、
ここで、工程b)によって決定された細胞周期位置と第一の検出可能なレポーターが発生するシグナルとの関係が、当該細胞プロセスが細胞周期依存性であるか否かの指標となる。
a)上述の細胞中で核酸構築物を発現させ;及び
b)レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによってCDK2活性を決定する工程を含む。
a)当該被検薬剤の非存在下及び存在下に、上述の核酸構築物を当該細胞中で発現させ;並びに
b)レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによってCDK2活性を決定する工程を含み、ここで、当該被検薬剤の非存在下及び存在下で測定された発生シグナル間の差が、CDK2活性に対する被検薬剤の効果の指標となる。
a)当該被検薬剤の存在下に、上述の核酸構築物を当該細胞中で発現させ;及び
b)レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し;
c)被検薬剤の存在下に発生するシグナルを、被検薬剤の非存在下に発生するシグナルに対する既知の数値と比較する工程を含み、
ここで、被検薬剤の存在下に測定された発生シグナルと、被検薬剤の非存在下での当該既知の数値との差が、細胞のCDK2活性に対する被検薬剤の効果の指標となる。
図1は、核又は細胞質におけるHDHBの局在を示す図である。
(A)U2OS細胞の細胞質及び核抽出物を、変性ゲル電気泳動、並びに組換えHDHB、α−チューブリン、及びPCNAに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。免疫反応性タンパク質は、化学発光によって検出した。
(B)U2OS細胞に微量注入して一過性に発現されたGFPタグ付きHDHBを、蛍光顕微鏡によって可視化した。核は、ヘキスト染料で染色した。棒:10μm。
(C)U2OS細胞に微量注入して一過性に発現されたFLAGタグ付きHDHBを、蛍光顕微鏡によって可視化した。
(A)非同調性、G1、及びS期のU2OS細胞における、一過性に発現されたGFPタグ付きHDHBの細胞内局在化を数量化した。所定の分布パターンを備えたGFP陽性細胞の数を、GFP陽性細胞の総数(>100個細胞)の百分率として表した。
(B)同調性U2OS細胞(G1及びS期)の細胞質及び核抽出物を、変性ゲル電気泳動、並びに組換えHDHB、α−チューブリン、及びPCNAに対する抗体を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。免疫反応性タンパク質は、化学発光によって検出した。
(A)CDK(SP又はTP)に対する7つの潜在的リン酸化部位、推定細胞内局在化ドメイン(SLD)及びリン酸化SLD(PSLD)、ウォーカーA及びウォーカーBヘリカーゼモチーフを示す、HDHBタンパク質の模式図。アミノ酸残基数を、タンパク質の下に示す。
(B)研究にて作製した、GFP−及びFLAG−タグ付きHDHB、並びにC末端切欠変異体。HDHB SLD(残基1040〜1087)及びPSLD(残基957〜1087)のC末端を、GFP−βGalレポーターに融合させて、それぞれGFP−βGal−SLD及びGFP−βGal−PSLDを作出した。
(C)非同調性、G1、及びS期U2OS細胞における、一過性に発現されたGFP−HDHB−ΔSLDの細胞内局在化を数量化して、GFP陽性細胞の総数の百分率として表した。
(A)非同調性、G1、及びS期U2OS細胞で一過性に発現されたGFP−βGal、GFP−βGal−SLD、及びGFP−βGal−PSLDの細胞内局在化を数量化して、GFP陽性細胞の総数の百分率として表した。
(A)HDHB内推定NESの、他の細胞周期関連タンパク質で同定されたもの(Henderson及びEleftheriou、2000;Fabbro及びHenderson、2003)とのアラインメント。アミノ酸配列の上方の上付き添字は、残基数を示す。太矢印は、NESの保存された脂肪族残基を指し示す。HDHB内推定NESの二対の残基を、細矢印によって示すようにアラニンに変異させてMut1及びMut2を作出した。
(B)GFP−及びFLAG−タグ付きHDHBを、CRM1によって媒介される核外移出を阻害するLMBを、添加して(+)又は添加せずに(−)、非同調的に成長しているU2OS細胞で一過性に発現させた。非同調性、G1、及びS期細胞における、GFP−HDHB及びFLAG−HDHBの細胞内局在化を数量化して、その試料中のGFP陽性細胞の総数の百分率として表した。
(A)FLAG−HDHB(レーン1)、並びにその切欠変異体1−1039(レーン2)及び1−874(レーン3)を一過性に発現しているU2OS細胞を、[32P]オルソ−ホスフェートで標識化した。細胞抽出物を抗FLAGレジンで免疫沈降させた。沈降したタンパク質は、7.5%SDS−PAGEで分離し、PVDF膜に転写して、オートラジオグラフィー(上方)又はウェスタンブロッティング(下方)によって検出した。既知分子量のマーカータンパク質の位置を、左側に示す。
(B)U2OS細胞で発現させたFLAG−HDHBを抗FLAGレジンで免疫沈降させ、示した通りにホスファターゼインヒビターの存在下(+)又は非存在下(−)に、λ−ホスファターゼ(λ−PPase)を添加して(+)又は添加せずに(−)インキュベートして、SDS−PAGE及び抗HDHB抗体を用いたイムノブロッティングによって分析した。
(C)FLAG−HDHBを発現しているU2OS細胞を、G1/S(上方)又はG2/M(下方)で停止させて、その後遮断から復帰させた。表示の時点でFLAG−HDHBを回収し、抗FLAGレジンで免疫沈降させ、λ−PPaseを添加して(+)又は添加せずに(−)処理して、(B)におけると同様に分析した。
(A)ホスホアミノ酸マーカー(左側)、及びインビボで32Pにて標識化したFLAG−HDHBからのホスホアミノ酸(右側)を、二次元で分離し、オートラジオグラフィーによって可視化した。加水分解が不完全であったホスホペプチドのあるものは、起点の近傍に残っていた(+)。
(B)野生型及び変異型FLAG−HDHBタンパク質を、インビボでオルトホスフェートにて放射標識化し、免疫沈降させ、SDS−PAGEによって分離して、オートラジオグラフィー(上方)及び抗HDHBを用いたイムノブロッティング(下方)により分析した。
(C)32Pにて標識化した野生型及びS967A変異型FLAG−HDHBのトリプシンで生じたホスホペプチドを二次元に分離して、オートラジオグラフィーによって可視化した。
(A)図7Cにおけると同様にインビボでリン酸化したFLAG−HDHB、又は精製したサイクリンE/CDK2若しくはサイクリンA/CDK2によってインビトロでリン酸化した組換えHDHB由来の、トリプシンで生じたホスホペプチドを、別個に、又は混合物としてのいずれかで二次元に分離して、オートラジオグラフィーによって可視化した。
(B)FLAGベクターを用いて共免疫沈降させたタンパク質(レーン1、4)、又はU2OS細胞において発現させたFLAG−HDHB(レーン2、5)を、HDHB(レーン1〜6)、サイクリンE(レーン1〜3)、又はサイクリンA(レーン4〜6)に対する抗体を用いてイムノブロッティングによって分析した。免疫沈降のために使用した細胞溶解液の10分の1を、陽性コントロールとして平行して分析した(レーン3、6)。
(A)非同調性、G1、及びS期U2OS細胞において発現したGFP−HDHB S967A及びS967Dの細胞内局在化を数量化した。
プラスミド
BglII/NotI断片とした全長のHDHB cDNAを(Tanejaら、J.Biol.Chem.、(2002)277、40853−40861)を、pEGFP−C1ベクター(クロンテック、Palo Alto、CA)のNotI部位に挿入することにより、pGFP−HDHB、及び変異誘導体(図4及び6参照)を作出した。pFLAG−HDHBは、全長のHDHB cDNAを含むHindIII/NotI断片をpFlag−CMV2ベクター(イーストマンコダック社、Rochester、NY)のNotI部位に挿入することによって構築した。タグ付きHDHBプラスミドを、残基1034のコーディング配列の後をNruIで、及びポリリンカー内をNotIで切断し、そして残基1035〜1039、終止コドン、及び突出しているNotI−適合性5’端をコードする、平滑末端を持つ二重鎖アダプタオリゴヌクレオチドにより、小断片を置換することによって、タグ付きHDHB−SLD(1〜1039)を構築した。pFLAG−HDHB(1〜874)を作出するために、StuIで消化したpFLAG−HDHB DNAをクレノウポリメラーゼで処理して平滑末端を作り、pFLAG−CMV2ベクターに連結させた。pEGFP−βGalを作るために、大腸菌β−ガラクトシダーゼ(βGal)をコードするDNA断片をpβGal−コントロール(クロンテック)からのPCRによって増幅させて、pEGFP−C1内のGFPをコードする配列の3’端にHindIII部位を用いて挿入した。アミノ酸残基1040〜1087(SLD)及び957〜1087(PSLD)に対するHDHB配列をPCRで増幅して、pEGFP−βGal内のβGal cDNAの3’端で挿入して、pGFP−βGal−SLD及びpGFP−βGal−PSLDをそれぞれ作出した。NES変異体、及びリン酸化部位変異体は、HDHB cDNAで、部位特異的突然変異誘発(QuikChange、ストラタジーン、La Jolla、CA)によって作出した。
抗HDHB抗体は、精製した組換えHDHB(ベチルラボラトリーズ、Montgomery、TX)に対して作製して、固定化HDHBにてアフィニティ精製した(Harlow及びLane、抗体:実験室マニュアル、コールド・スプリング・ハーバー研究所)。
U2OS細胞を、10%胎児ウシ血清(FBS)(アトランタバイオロジーズ、Norcross、GA)を追加したダルベッコ変法イーグル培地(DMEM)(ギブコBRLライフテクノロジーズ、Carlsbad、CA)中で、指数関数的に生育する単層として37°Cにて培養した。指数関数的に成長しているU2OS細胞は、5mMチミジン(シグマ−アルドリッチ、St.Louis、MO)を含有するDMEM中でのインキュベーションによって24時間、G1/Sで停止させた。細胞をS期へと復帰させるために、培地を吸引し、10%FBSを含む暖かいDMEMで細胞を3回洗浄して、10%FBSを含む新鮮なDMEM中でインキュベートした。指数関数的に成長しているU2OS細胞を、30ng/mlのノコダゾール(シグマ−アルドリッチ)を含有するDMEM中で16時間、G2/Mで停止させた。G1へと細胞を復帰させるために、穏やかにシェイクオフすることによって有糸分裂細胞を集め、10%FBSを含むDMEMで3回洗浄し、次いで微量注入用のカバーガラス上、又はさらに操作するために培養ディッシュ内で平板培養した。
間接免疫蛍光染色のために、細胞をリン酸緩衝食塩水(PBS)で3回洗浄し、3.7%ホルムアルデヒドを含むPBSで20分間固定して、0.2%TritonX−100で5分間透過化処理をし、そして10%FBSを含むPBS中で45分間インキュベートした。FLAG−HDHBは、マウスモノクローナル抗FLAG抗体(シグマ−アルドリッチ、10%FBSを含むPBS中、1:100)を用いて2時間、室温で検出した。洗浄後、細胞をTexas Redが接合したヤギ抗マウス二次抗体(ジャクソンイムノリサーチラボラトリーズ、West Grove、PA、10%FBSを含むPBS中、1:100)と、室温で1時間インキュベートした。3回洗浄した後、細胞をヘキスト33258(PBS中2μM)と10分間インキュベートした。カバーガラスをProLong Antifade(モレキュラープローブズ、Eugene、OR)に取り付けた。浜松デジタルカメラで、Openlab3.0ソフトウェア(インプロビジョン、Lexington、MA)を用い、Zeiss Axioplan2画像化システム(カールツァイス社)にて画像を得た。細胞内局在化の各パターンを示す細胞の数を計数して、評点した細胞の総数(各実験で100〜150細胞)の百分率として表した。各タンパク質の細胞内分布を、少なくとも二度の独立した実験で定量的に評価した。
U2OS細胞(2.5x106)を、野生型又は変異型FLAGHDHBで一過性にトランスフェクトした。24時間後に、ホスフェートが枯渇したDMEM(ギブコBRLライフテクノロジーズ)中で細胞を15分間インキュベートして、32P−H3PO4(0.35mCi/mlの培地;ICNファーマシューティカルズ社.、Costa Mesa、CA)で4時間放射標識化した。ホスフェートで標識化したFLAG−HDHBを抽出物から免疫沈降させ、7.5%SDS/PAGEによって分離して、下記の通りにポリビニリデンジフルオリド(PVDF)膜に転写した。
トランスフェクションから24時間後に、免疫沈降及びイムノブロッティングによる分析を行う対象となる、FLAG−HDHBでトランスフェクトした培養物を、溶解用緩衝液(50mMトリス−HCl、pH7.5、10%グリセロール、0.1%NP−40、1mM DTT、25mM NaF、100μg/ml PMSF、1μg/mlアプロチニン、1μg/mlロイペプチン)(35mmディッシュ当たり0.5ml、又は60mmディッシュ若しくは75cmフラスコ当たり1ml)で溶解させた。抽出物をディッシュから掻き取り、氷上で5分間インキュベートして、14000gで10分間遠心分離した。上清の試料(0.5〜1mgのタンパク質)を、回転体の上で10μlの抗FLAGアガロース(シグマ)と4°Cにて2時間インキュベートした。アガロースビーズを、溶解緩衝液で3回洗浄した。免疫沈降したタンパク質をPVDF膜に転写して、抗HDHB−ペプチド血清(1:5000)、抗サイクリンE抗体(1:1000)、及び抗サイクリンA抗体(1:1000)(サンタクルーズバイオテクノロジー社、サンタクルーズ、CA)、並びに化学発光(スーパーシグナル、ピアスバイオテクノロジー社、Rockford、IL)を用いたウェスタンブロッティングによって分析した。
抗FLAGビーズに結合したFLAG−HDHBを、100Uのλ−ホスファターゼ(ニューイングランドバイオラボズ、Beverly、MA)を含むホスファターゼ緩衝液(50mMトリス−HCl(pH7.5)、0.1mM EDTA、0.01%NP−40)と30℃で1時間インキュベートした。反応は、ホスファターゼインヒビター(5mM Na3VO4、50mM NaF)の存在下又は非存在下で行った。タンパク質を7.5%SDSPAGE(アクリルアミド−ビスアクリルアミド比、30:0.36)によって分離して、抗HDHB−ペプチド血清及び化学発光を用いたウェスタンブロッティングによってHDHBを検出した。
トランスフェクション後24時間に、免疫沈降及びホスホアミノ酸又はホスホペプチドのマッピングに使用すべき放射標識化FLAG−HDHBをトランスフェクトした培養物を、溶解緩衝液をRIPA緩衝液(50mMトリス−HCl(pH7.5)、150mM NaCl、1%NP−40、0.5%デオキシコール酸、1%SDS、50mM NaF、1mM EDTA、5mM Na3VO4、100μg/mlPMSF、1μg/mlアプロチニン、及び1μg/mlロイペプチン)に置き換えたことを除いては前記と同様に処理した。免疫沈降したタンパク質を、7.5%SDS−PAGEによって分離して、PVDF膜に転写した。放射標識化HDHBを含む膜を、脱イオン水で2回、よく濯いで、その後オートラジオグラフィーによってホスホタンパク質を可視化した。次いでホスホタンパク質を切り出して、膜片をメタノール、その後水で再度湿潤化した。膜を、0.1%Tween20(シグマ−アルドリッチ)を含有する50mM NH4HCO3で室温にて30分間ブロッキングして、50mM NH4HCO3で3回洗浄し、その後PVDFからのホスホタンパク質の酵素的切断を、L−(トシルアミド−2−フェニル)エチルクロロメチルケトンで処理したウシ膵臓トリプシン(ウォージントン、Lakewood、NJ)を用いて行った。ペプチドは次いで、他の文献(Boyleら、Meth.Enzymology、(1991)、201、110−149)で詳説されている二次元ホスホペプチドマッピング又はホスホアミノ酸分析に供した。
精製したサイクリン/CDK(200pmol/時)(R.Ott及びC.Voitenleitnerにより提供)、及び精製した組換えHDHB(Tanejaら、J.Biol.Chem.、(2002)277、40853−40861)を基質として使用し、以前に報告されたように(Voitenleitnerら、Mol.Cell.Biol.、(1999)、19、646−56)キナーゼ反応を実施した。
pCORON1002−EGFP−C1−PSLD構築物を発現している安定な細胞を、抗生物質不含の培地(100μl/ウェル)を使用し、96ウェルのグライナープレートに0.3x105/mlで播種して、16時間インキュベートした。
HDHBは、核点状構造内又は細胞質内に存在する
内在性のHDHBの細胞内局在化を決定するために、核及び細胞質性のタンパク質をヒトU2OS細胞から選択的に抽出し、変性ゲル電気泳動によって分離して、ウェスタンブロッティングにより分析した(図1)。各抽出物中のPCNA及びα−チューブリンの存在を先ずモニターして、抽出手順を評価した。PCNAは細胞質画分でなく核抽出物に濃縮されており、一方α−チューブリンは主として細胞質画分に認められ、分画が確認された。HDHBは、核及び細胞質画分の双方に検出された(図1)。細胞質のHDHBは、核画分よりもゆっくりと移動し(図1)、翻訳後修飾の可能性が示唆された。
U2OS細胞をノコダゾールでG2/Mにて停止させ、3時間G1に復帰させて、その後それらの核内にpGFP−HDHB DNAを微量注入した。GFP−HDHBの発現は、6時間後に容易に検出でき、この際およそ70%のG1期細胞が、主に核内に融合タンパク質を蓄積していた(図2)。一方、細胞をG1/Sでチミジンで同調させ、S期に復帰させて、その後pGFP−HDHB DNAを微量注入した場合、70%より多くのS期細胞が、主に細胞質に融合タンパク質を蓄積していた(図2)。G1及びS期のU2OS細胞の選択的な抽出で、内在性のHDHBは、G1ではほとんど核に、S期では細胞質にあることが明らかになった(図2b)。しかし、内在性のHDHBは、双方の細胞内画分で明らかに検出できた。S期のHDHBの移動性は、G1期タンパク質に比べてわずかに遅延していた。これらの結果から、HDHBの細胞内局在化は細胞周期において調節されており、またGFPタグ付きHDHBは内在性のタグなしヘリカーゼの局在を反映することが示唆される。
核と細胞質との間を行き来する数多くのタンパク質は、HIVrevタンパク質のプロトタイプのNESに類似したNESを含むことが実証されている(図5)。rev型NESを含むタンパク質は、移出因子CRM1(エクスポーチン1とも称される)が結合して核から細胞質までタンパク質を輸送することを必要とする(Weisによる総説、Cell、(2003)、112、441−451)。レプトマイシンB(LMB)は、核タンパク質移出におけるCRM1活性を特異的に阻害する(Wolffら、Chem.Biol.、(1997)、4、139−147;Kudoら、Exp.Cell.Res.、(1998)、242、540−547)。HDHBのPSLD配列の検査によって、推定rev型NES(LxxxLxxLxL;図5)が明らかになった。HDHBの細胞質への局在化が機能性NESを必要とするか否かを決定するために、GFP−HDHB又はFLAG−HDHB DNAに対する発現プラスミドをLMBの存在下及び非存在下に、非同調性のG1、及びS期細胞へ微量注入した。融合タンパク質の局在化は、蛍光顕微鏡によって調べて数量化した。LMBの存在下では、双方の融合タンパク質が細胞周期と無関係に核内に蓄積し(図5)、これはCRM1を通じて機能するrev型NESをHDHBが含む可能性と符合している。しかし、HDHBはCRM1の直接的な積荷にならないかもしれず、またその移出はいくつかの他のタンパク質(単数又は複数)を通じて間接的に媒介されるかもしれないという可能性もある。HDHB内の推定NESが機能性であるかを評価するために、我々はNESモチーフのVal/Leu及びLeu/Leuをアラニンに変異誘発して、NES変異体1及び2(図5)を作出した。これらのNES変異を内包するGFP−HDHB及びGFP−βGal−PSLDを、非同調性又は同調性のいずれかのU2OS細胞で一過性に発現させた。双方のNES変異型融合タンパク質は、非同調性又は同調性細胞でいつ発現されても、80%を超える細胞で核に蓄積していた(図5)。この結果から、NESの変異がGFP−HDHB及びGFP−βGal−PSLDの双方の移出を特異的に損なったことが示され、HDHBのPSLD領域が機能性NESを含むと論じられる。
HDHBのPSLDドメイン内の潜在的CDKリン酸化部位のクラスタ(図3)により、HDHBのリン酸化が細胞周期におけるその細胞内局在化を調節するかもしれないことが示唆された。そうであれば、HDHBのPSLD領域は細胞周期依存的にリン酸化されることが予想されよう。HDHBがPSLD内のリン酸化を行うかをどうか試験するために、FLAG−HDHBの野生型及びC末端切欠型に対する発現プラスミドでU2OS細胞を一過性にトランスフェクトし、ホスフェートで放射標識化して、その後細胞抽出物からFLAG−HDHBを免疫沈降させた。免疫沈降させたタンパク質を変性ゲル電気泳動、イムノブロッティング、及びオートラジオグラフィーによって分析した(図6)。FLAG−HDHBの放射標識化バンドは、免疫反応性のHDHBバンドと同じ位置に検出された(図6A、レーン1)。SLDを欠損した切欠FLAG−HDHBは、インビボでも確実にリン酸化されたが(レーン2)、一方PSLDを欠損した切欠FLAG−HDHB(1〜874)は、有意にリン酸化されなかった(レーン3)。これらの結果から、SLDはHDHBのリン酸化に必要でなく、PSLDが必要であることが実証され、リン酸化部位はおそらくPSLD内に存在することが示唆される。
FLAG−HDHBにおけるリン酸化部位をマッピングするために、先ず、修飾されたアミノ酸残基が何であるかを決定したいと考えた。インビボで放射標識化したFLAG−HDHBのホスホアミノ酸分析により、インビボではFLAG−HDHBの主要なホスホアミノ酸がホスホセリン(単数又は複数)であることが明らかになった(図7A)。HDHBの細胞周期依存的性リン酸化部位がPSLD中、残基874と1039の間に位置しており(図3A)、これらの部位はCDKによって修飾され、ホスホセリンが主要な修飾アミノ酸である(図7A)と想定すると、7つの潜在的CDK部位のうち4つだけが、候補部位として残ることになるであろう。これらの部位の各々を個々に試験するために、対応するセリンのアラニンへの変異を施したFLAG−HDHB発現プラスミドを構築した。これらのプラスミドを一過性にトランスフェクトした細胞を、オルトホスフェートでインビボに放射標識化して、FLAG−HDHBを免疫沈降させ、オートラジオグラフィー及びウェスタンブロッティングによって分析した(図7B)。この結果、FLAG−HDHB及び変異型タンパク質の3つがほぼ同等にリン酸化されており、一方S967A変異タンパク質は弱くリン酸化されているだけであることが示された(図7B)。この結果は、S967がインビボでのHDHBリン酸化の主要な部位であるかもしれないことを示唆していた。この解釈と符合して、免疫沈降させたFLAG−HDHBのホスファターゼ処理後の電気泳動度の変化が、変異型タンパク質の3つで検出されたが、S967Aタンパク質では検出されなかった。
細胞周期におけるHDHBのリン酸化のタイミングと、修飾の主要部位としてのS967の同定により示唆されるように、CDKが実際にHDHBを修飾することができるのかを試験するために、精製サイクリンE/CDK2又はサイクリンA/CDK2を、精製組換えHDHB及び放射標識化したATPとインビトロでインキュベートした。キナーゼ反応の後、タンパク質を変性ゲル電気泳動によって分離し、PVDF膜に転写して、オートラジオグラフィーにより検出した。この結果、組換えHDHBはサイクリンE/CDK2及びサイクリンA/CDK2の双方によって強くリン酸化されうることが明らかになった。放射標識化HDHBのバンドは、その後さらに、トリプシンで生じるホスホペプチドのマッピングのために処理した。各消化物由来のペプチドを、個々に、又はインビボでリン酸化したFLAG−HDHB由来の、トリプシンで生じたペプチドと混合した後に、のいずれかで二次元にて分離して、オートラジオグラフィーにより可視化した(図8A)。サイクリンE/CDK2及びサイクリンA/CDK2によってリン酸化されたHDHBペプチドでは、インビボで標識化したペプチドのマップで観察されるもの(1つの主要スポットと1つの微弱スポット)と本質的に同じパターンが得られた(図8A)。インビトロ及びインビボで標識化されたペプチドを混合して、1つのクロマトグラムで分離した場合、それらは共遊走した(図8A、右側)。これらのデータから、精製組換えHDHBにおいてインビトロでサイクリンE/CDK2及びサイクリンA/CDK2により修飾された主要なホスホペプチドは、FLAG−HDHBにおいてインビボで修飾された場合と同じものであったと論じることができる。
131残基のドメイン、PSLDは、HDHB、EGFP又はβGalレポーターを、核又は細胞質のいずれかに細胞周期依存的に標的化するのに足るものである(図4及び10)。rev型NESがこのドメイン内に存在している(図5)が、G1/S移行において、核外移出の機構に対するその活性又は接触性はPSLD(主にセリン967)のリン酸化に依存している(図6〜9)。S967は、コンセンサスCDK基質認識モチーフ(S/T)PX(K/R)と完全に一致する。サイクリンE/CDK2及びサイクリンA/CDK2の双方は、インビトロでHDHBを修飾することができるが、細胞抽出物中のHDHBとのサイクリンE/CDK2の複合能から、それがG1/S移行にてHDHBを修飾する初期のキナーゼであるかもしれないことが示唆される(図8)。既知のCdk2インヒビターであるオロモウシン及びロスコビチン(表1)、又はサイクリンEに対するsiRNA(表2)の添加の結果、EGFP−PSLDの主に核への分布と、安定なEGFP−PSLD細胞系に対してG1の停止が引き起こされ、観察された細胞周期に基づくリン酸化依存性の細胞内局在化の制御に、Cdk2/サイクリンEが関与する可能性がさらに支持された。PSLDのリン酸化は、細胞周期の終盤に及ぶまで持続するようであり、これはS及びG2での主に細胞質へのHDHBの局在化に良く呼応していた。24時間にわたってオロモウシンで処理した安定細胞系の動的な画像化によって、G2で停止した細胞については、EGFP−PSLDシグナルが4時間を超え8時間にわたって細胞質から核に再分布する(細胞が有糸分裂を経ることなく)ことが示され、cdk2活性がなければEGFP−PSLDは脱リン酸化されて核に再び入るか、又は破壊されて新しく合成されたタンパク質がcdk2阻害のためにリン酸化されず、従って核に局在するか、のどちらかであることを示唆していた。
上述の通り、一過性にトランスフェクトした細胞での作業は、トランスフェクション効率の低さ、発現の不均一性、及びこのようなデータのハイスループット分析により生じる問題のために、マルチウェルプレート形式では困難であることがわかった。従って、細胞周期に対する数多くのsiRNA又は薬剤の効果をスクリーニングするには、均一な安定細胞系の生産が必要であった。適応性のある7つのアミノ酸リンカーを介して(pCORON1002−EGFP−C1−PSLDを使用)レポーター(EGFP)に連結したPSLD領域で、安定細胞系を作った。図13からわかるように、pCORON1002−EGFP−C1−βGal−PSLDを用いて発生させた安定細胞系が発生する蛍光シグナルは、適応性のある7つのアミノ酸リンカーを有する細胞系により生成されるものよりもかなり小さかった(およそ10倍)。これはおそらく、細胞の転写及び翻訳機構に対して多大な要求を課している、βGalタンパク質のサイズに起因しているようである。
Claims (24)
- 1000ダルトン未満の分子量を有するポリペプチド基を介して、検出可能な生細胞レポーター分子を1以上の細胞周期依存性の位置制御エレメントに連結してなるポリペプチド構築物であって、前記エレメントが、配列番号2の957〜1087のアミノ酸配列からなるヘリカーゼBのC末端の特殊な制御領域のリン酸化依存性細胞内局在化ドメイン(PSLD)であり、前記エレメントの位置はG1及びS期に変化し、哺乳類細胞内での前記構築物の移動が細胞周期位置の指標となる、ポリペプチド構築物。
- 前記ポリペプチド基が700ダルトン未満の分子量を有する、請求項1記載のポリペプチド構築物。
- 前記ポリペプチド基がヘプタペプチドである、請求項1又は請求項2記載のポリペプチド構築物。
- 前記ヘプタペプチドがグリシン−アスパラギン−グリシン−グリシン−アスパラギン−アラニン−セリン(GNGGNAS)である、請求項3記載のポリペプチド構築物。
- 前記生細胞レポーター分子が、蛍光タンパク質、酵素及び抗原性タグからなる群から選択される、請求項1乃至請求項4のいずれか1項記載のポリペプチド構築物。
- 前記蛍光タンパク質が、緑色蛍光タンパク質(GFP)、増強型緑色蛍光タンパク質(EGFP)、Emerald及びJ−Redからなる群から選択される、請求項5記載のポリペプチド構築物。
- 前記レポーター分子がEGFPである、請求項1乃至請求項6のいずれか1項記載のポリペプチド構築物。
- 配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチド構築物。
- 請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載のポリペプチド構築物をコードする核酸構築物。
- 前記核酸構築物が、更に、1以上の細胞周期非依存性の発現制御エレメントを含み、この発現制御エレメントに作動可能に連結され、その制御下にある、請求項9記載の核酸構築物。
- 前記発現制御エレメントがユビキチンC又はCMVプロモーターである、請求項10記載の核酸構築物。
- CMVプロモーターと、PSLD及びEGFP又はJ−Redをコードする配列とを含む、請求項9乃至請求項11のいずれか1項記載の核酸構築物。
- ユビキチンCプロモーターと、PSLD及びEGFP又はJ−Redをコードする配列とを含む、請求項9乃至請求項11のいずれか1項記載の核酸構築物。
- 請求項9乃至請求項13のいずれか1項記載の核酸構築物を含むベクター。
- 前記ベクターがウイルスベクター又はプラスミドである、請求項14記載のベクター。
- 前記ウイルスベクターが、アデノウイルスベクター又はレンチウイルスベクターである、請求項15記載のベクター。
- 請求項9乃至請求項13のいずれか1項記載の核酸構築物がトランスフェクトされた宿主細胞。
- 前記細胞がヒト細胞である、請求項17記載の宿主細胞。
- 請求項17又は請求項18記載の宿主細胞の1又は複数を含む安定細胞系。
- 請求項1乃至請求項8のいずれか1項記載のポリペプチド構築物の、哺乳類細胞の細胞周期位置を決定するための使用。
- 哺乳類細胞の細胞周期位置を決定する方法であって、
a)細胞中で請求項9乃至請求項13のいずれか1項記載の核酸構築物を発現させ、
b)前記レポーター分子によって発生するシグナルをモニターすることによって、細胞周期位置を決定する工程を含む方法。 - 哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
a)請求項9乃至請求項13のいずれか1項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の非存在下及び存在下、前記細胞中で発現させ、
b)前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定する工程を含み、前記被検薬剤の非存在下及び存在下で測定された発生シグナル間の差が、前記細胞の細胞周期位置に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。 - 哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
a)請求項9乃至請求項13のいずれか1項記載の核酸構築物を、前記被検薬剤の存在下、前記細胞中で発現させ、
b)前記レポーター分子が発生するシグナルをモニターすることによって細胞周期位置を決定し、
c)前記被検薬剤の存在下で発生するシグナルを、前記被検薬剤の非存在下で発生するシグナルとして既知の数値と比較する工程を含み、
前記被検薬剤の存在下で測定された発生シグナルと、前記被検薬剤の非存在下での既知の数値との差が、前記細胞の細胞周期位置に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。 - 哺乳類細胞の細胞周期位置に対する被検薬剤の効果を決定する方法であって、
a)請求項9乃至請求項13のいずれか1項記載の核酸構築物を含む細胞を用意し、
b)核酸レポーター構築物の発現を許容する条件下で、前記被検薬剤の存在下で前記細胞の第一の集団を培養するとともに、前記被検薬剤の非存在下で前記細胞の第二の集団を培養し、
c)前記細胞の第一及び第二の集団において、前記レポーター分子が発生するシグナルを測定する工程を含み、
前記細胞の第一及び第二の集団で測定された発生シグナル間の差が、前記細胞の細胞周期位置に対する前記被検薬剤の効果の指標となる方法。
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