KR101244436B1 - 신규한 핵위치화 시그널 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 특정의 아미노산 서열을 필수 아미노산 서열로 하는 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 NLS 펩타이드는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 선택적 스플라이싱에 관여하는 NSrp70 단백질로부터 유래된 것이다. 본 발명의 NLS 펩타이드는 운반 대상의 카고(cargo)를 핵 내로 운반하는 데 효과적이다.

Description

신규한 핵위치화 시그널{Novel Nuclear Localization Signal}
본 발명은 신규한 핵위치화 시그널 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 본 발명은 선택적 스플라이싱에 관여하는 NSrp70(Nuclear Speckle related protein 70) 단백질로부터 유래된 핵위치화 시그널 펩타이드 및 그의 용도에 관한 것이다.
핵 반점(Nuclear speckle)은 불규칙적으로 나타나는 소핵구조(subnuclear)이고, 형광 현미경을 이용하여 분석할 때, 크기나 모양에서 다양하게 나타나는 불규칙적인 구두점 구조를 가진다. 그들은 동물세포의 핵질(nucleoplasm)의 염색질 사이(interchromatin) 부위에 위치한다. 이 입자들은 특정 지역의‘구름(clouds)’에서 존재하고, 세포화학적 분석을 통해 이 입자들이 RNA를 가지고 있음을 보여준다(1). snRNPs(small nuclear ribonucleoprotein)와 같은 스플라이싱 인자에 특이적인 항체를 사용하여, 핵 반점과 pre-mRNA 사이의 관련성이 처음 규명되었다(2). 현재, 핵 반점이 pre-mRNA 스플라이싱 시스템 구성요소, 예컨대 snRNP, 스플라이스오좀 소단위(spliceosome subunit) 및 그 밖에 다른 non-snRNP 스플라이싱 인자의 저장 장소로 기능을 하고 있음은 확실한 바, 따라서 핵 반점은 선택적 스플라이싱에 중요한 역할을 한다.
선택적 pre-mRNA 스플라이싱은 모든 후생동물(metazoans)에서 유전자 발현과 단백질체 다양성에서 매우 중요한 단계이다. 반점 내의 다수의 단백질의 정제와 분석에 의해 이들을 대략 두 종류로 구분한다: 한 종류는 상대적으로 넓게 발현되는 단백질로 이루어져 있으며, mRNA 생체 내 합성에서 폭 넓은 역할을 하는 것으로 예측한다. 이러한 단백질들은 두 그룹으로 분류할 수 있다: SR 단백질(Serine/Arginine rich protein) 및 hnRNP 단백질이 있다. SR 단백질은 엑손 봉입(exon inclusion)을 촉진하는 경향이 있는데 반하여, hnRNP는 주로 반대의 효과를 갖는다(3).
다른 종류는 조직 특이적인 선택적 스플라이싱 현상을 조절하는데 관여하는 제한된 발현 패턴을 가지는 인자들로 구성된다. Nova-1/2와 Hu 단백질을 포함하는 이러한 단백질들은 다양한 접근들에 의해 확인되었고, 그들 각자는 두드러지는 특성을 공유한다: 각각은 K-상동관계(K-homology)의 RNA-결합 도메인이나 RNA 인식 모티프(RRM)을 포함한다 (3).
SR 군의 구성들에는 ASF/SF2, SC35와 SRp20을 포함한다. 이들 단백질 각각은 항시적(constitutive) 스플라이싱에 필요하고 선택적 스플라이싱을 조절할 수 있다. SR 단백질들은 스플라이싱 결핍 S100 추출물을 보충할 수 있기 때문에 이들은 필수 스플라이싱 인자들이다(4). 그들은 하나 또는 그 이상의 RRM 및 인산화 될 수 있는 세린 잔기를 포함하는 C-말단 아르기닌/세린-풍부 도메인을 포함한다(5,6). RNA 인식 모티프(RRM)는 RNA에 서열 특이적인 결합을 중재하는 반면 RS-풍부 도메인은 주로 단백질-단백질 상호작용과 관련이 있고 그것은 스플라이싱 시스템의 참여, 스플라이스 위치 짝지음(7,8) 그리고 반점으로의 핵 위치 신호(NLS)에 필수적인 것으로 판단된다(9). 특히, 마우스 생식선에서 두 SR 단백질, ASF/SF2 또는 SC35의 손실은 7.5일 이전에 배아 치사를 유발한다(10-13).
다른 종류의 스플라이싱 인자는 SR-관련 단백질인데, 이는 다양한 길이의 RS 도메인을 포함한다. SR 단백질과 달리, SR-관련 단백질은 RRM을 포함하지 않을 수도 있고, 대신 DEXD/H 박스 또는 아연 핑거 구조와 같은 도메인을 포함한다. U2AF35, U1-70 및 SRm160은 모두 SR-관련 단백질들의 예이고(14), 많은 다른 단백질들은 이 군에 속해있는 것으로 최근에 알려져 왔다.
최근에 예기치 않게 마이크로어레이 분석을 통해 T-세포 운동성에 영향을 줄 수 있는 유전자를 본 발명자들은 발견하였다. 이 유전자는 세계 최초로 동정된 것이고 미국국립보건원의 포유동물 유전자 집합 프로그램(NIH Mammalian Gene Collection program)에 의해 CCDC55(coiled-coil domain containing 55)으로 명명되었으며 그 이유는 코일드-코일 도메인을 포함하기 때문이다.
상기 유전자는 운동 세포에서 상당히 상향 조절되었으나, 비 운동 세포에서는 하향 조절되었다. 그러나 이소성(ectopic) 발현과 녹다운 실험에서는 T-세포 운동성과 CCDC55 단백질의 특이적 관련성이 나타나지 않았다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
핵 반점 도메인 내의 CCDC55의 동정(15)은 스플라이싱 시스템에 대한 새로운 통찰을 본 발명자들에게 제공하였고, 이에 본 발명자들은 다른 알려진 스플라이싱 관련 단백질과 CCDC55의 서열을 비교하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 CCDC55의 N-말단에서 추정의 RRM의 서열, C-말단에서 RS 유사 지역 및 N-말단과 C-말단 모두에서 두 개의 코일드-코일 도메인을 발견하였으며, 이는 CCDC55이 RNA 가공에 관여함을 보여주는 것이다. 따라서, CCDC55의 세포소기관 위치 및 SDS-PAGE에서의 분자량을 기초로하여, 본 발명자들은 CCDC55을 NSrp70(Nuclear Speckle related protein 70)으로 재 명명하였고, 그 생물학적 기능을 더 살펴보았다. 본 발명자들은 NSrp70가 SC35, ASF/SF2와 상호작용하고 핵 반점에서 같이 존재하고 있으며, 또한 CD44, Tra2β1과 Fas 미니유전자에 의해 결정되듯이 NSrp70가 인 비보에서 선택적 스플라이싱 위치 선정을 조절한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 NLS 서열 부위, 반점의 위치 그리고 SC35와 ASF/SF2에 결합하는 위치 그리고 pre-mRNA 스플라이싱 활성을 위한 위치를 결정하였다. 최종적으로, NSrp70 녹아웃 마우스를 통한 접근을 토대로, 본 발명자들은 NSrp70은 초기 배아 발달 단계시 필수적 유전자임을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 NSrp70의 C-말단에 유용한 NLS 서열이 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 핵 내로 운반하고자 하는 카고(cargo)를 포함하는 핵 내 운반체를 제공하는 데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 카고(cargo)를 핵 내로 운반하는 방법을 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환 세포를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 필수 아미노산 서열로 하는 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드를 제공한다.
핵 반점 도메인 내의 CCDC55의 동정(15)은 스플라이싱 시스템에 대한 새로운 통찰을 본 발명자들에게 제공하였고, 이에 본 발명자들은 다른 알려진 스플라이싱 관련 단백질과 CCDC55의 서열을 비교하였다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 CCDC55의 N-말단에서 추정의 RRM의 서열, C-말단에서 RS 유사 지역 및 N-말단과 C-말단 모두에서 두 개의 코일드-코일 도메인을 발견하였으며, 이는 CCDC55이 RNA 가공에 관여함을 보여주는 것이다. 따라서, CCDC55의 세포소기관 위치 및 SDS-PAGE에서의 분자량을 기초로 하여, 본 발명자들은 CCDC55을 NSrp70(Nuclear Speckle related protein 70)으로 재 명명하였고, 그 생물학적 기능을 더 살펴보았다. 본 발명자들은 NSrp70가 SC35, ASF/SF2와 상호작용하고 핵 반점에서 같이 존재하고 있으며, 또한 CD44, Tra2β1과 Fas 미니유전자에 의해 결정되듯이 NSrp70가 인 비보에서 선택적 스플라이싱 위치 선정을 조절한다는 것을 발견하였다. 본 발명자들은 NLS 서열 부위, 반점의 위치 그리고 SC35와 ASF/SF2에 결합하는 위치 그리고 pre-mRNA 스플라이싱 활성을 위한 위치를 결정하였다. 최종적으로, NSrp70 녹아웃 마우스를 통한 접근을 토대로, 본 발명자들은 NSrp70은 초기 배아 발달 단계시 필수적 유전자임을 발견하였다. 또한, 본 발명자들은 NSrp70의 C-말단에 유용한 NLS 서열이 있음을 규명하였다.
본 발명의 펩타이드는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 필수 아미노산 서열로 포함한다.
본 명세서에서 용어 “필수 아미노산 서열로 포함”은 NLS 기능과 관련하여 언급된 서열을 최소 서열로 포함하며 다른 서열을 추가적으로 포함할 수 있음을 의미한다. 예를 들어, NLS 펩타이드 기능을 위하여 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 구성된(consisting of) 펩타이드 또는 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에 추가적으로 다른 아미노산 서열이 결합된(N-말단, C-말단 또는 두 양말단에) 펩타이드는 본 발명의 NLS 펩타이드에 속하는 것이다.
본 발명의 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 필수 아미노산 서열로 하는 펩타이드는 NLS 기능을 한다.
본 발명의 예시적인 NLS 펩타이드는 서열목록 제5서열의 펩타이드, 서열목록 제6서열의 펩타이드 및 서열목록 제7서열의 펩타이드를 포함한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 NLS 펩타이드는 서열목록 제7서열의 펩타이드를 포함한다.
본 명세서에서 용어 “NLS"는 특정물질(예컨대, 단백질)을 세포 핵 내로 운반하는 역할을 하는 아미노산 서열을 의미하며, 대체적으로 핵공(Nuclear Pore)을 통하여 세포 핵 내로 운반하는 작용을 한다(Kalderon D, et al., Cell 39:499509(1984); Dingwall C, et al., J Cell Biol . 107(3):8419(1988)).
본 발명의 펩타이드는 당업계에서 통상적으로 사용하는 고체상(solid-phase) 합성 방법에 의해 제조된다(Merrifield, R. B., J. Am . Chem . Soc . , 85:2149-2154(1963), Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I., Anal . Biochem ., 34:595-598(1970)). 즉, α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 레진에 결합시킨 후, α-아미노 보호기를 제거하고 남은 α-아미노 및 측쇄 작용기가 보호화된 아미노산을 원하는 순서로 단계적으로 커플링하여 중간체를 얻는다. 상기 펩타이드의 합성은 수동 또는 자동으로 수행할 수 있다. 자동 합성의 경우에는, 예컨대, Applied Biosystems 431A Peptide Synthesizer(Perkin Elmer)를 사용하여 상기 펩타이드를 합성할 수 있다.
본 발명의 펩타이드는 그 자체로도 우수한 안정성을 나타내지만, 안정성을 더 크게 향상시키기 위하여 다양한 보호기(protection group)가 결합될 수 있다. 보호기의 예는, 아미노산, 아세틸기, 플루오레닐 메톡시 카르보닐기, 포르밀기, 팔미토일기, 미리스틸기, 스테아릴기 및 폴리에틸렌글리콜(PEG)을 포함한다. 상기 보호기는 본 발명의 펩타이드의 다양한 아미노산 잔기에 결합될 수 있지만, 바람직하게는 N- 또는 C-말단에 결합되어 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 필수 아미노산 서열로 하는 핵 위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드; 및 (b) 상기 펩타이드에 결합된 핵 내로 운반하고자 하는 카고(cargo)를 포함하는 핵 내 운반체를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 필수 아미노산 서열로 하는 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드; 및 (b) 상기 펩타이드에 결합된 핵 내로 운반하고자 하는 카고(cargo)를 포함하는 핵 내 운반체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 카고(cargo)를 핵 내로 운반하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 사용되는 용어, “카고(cargo)”는 상기 NLS 펩타이드에 결합하여 핵 내로 운반될 수 있는 화학물질, 작은 분자, 폴리펩타이드, 핵산 또는 바이러스를 의미한다.
본 발명에서 상기 카고(cargo)가 될 수 있는 작은 분자는 예를 들어, 펩타이드, 핵산, 바이러스, 약물, 검출 가능한 신호를 발생시키는 레이블(형광 마커, 염색 물질), 나노입자 등이 될 수 있으나, 이에 한정되지는 않는다.
카고(cargo)가 될 수 있는 폴리펩타이드는 예를 들어, 세포 불멸에 관여하는 단백질(예컨대, SV40 라지 T 항원 및 텔로머라아제), 항-아폽토틱 단백질(예컨대, 돌연변이 p53 및 BclxL), 항체, 암유전자(예컨대, ras, myc, HPV E6/E7 및 아데노바이러스 Ela), 세포 주기 조절 단백질(예컨대, 사이클린 및 사이클린 의존성 인산화효소) 또는 효소(예컨대, 녹색 형광 단백질, 베타-갈락토시다아제 및 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제)가 될 수 있으나, 이에 한정하지는 않는다.
카고(cargo)가 될 수 있는 핵산은 예컨대, RNA, DNA 또는 cDNA가 될 수 있으며, 핵산의 시퀀스는 암호화 부위 서열 또는 비암호화 부위 서열(예컨대, 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 miRNA)이 될 수 있다. 또한, 바이러스는 바이러스 전체 또는 바이러스의 핵산을 포함하는 바이러스 코어(즉, 바이러스의 엔빌로프 없이 패키지된 바이러스의 핵산)가 될 수 있다. 운반될 수 있는 바이러스 및 바이러스 코어의 예로는 파필로마 바이러스, 아데노 바이러스, 배큘로바이러스, 레트로 바이러스 코어 및 세밀키 바이러스 코어 등이 있으나, 이에 한정하지는 않는다. 핵산 카고로서의 뉴클레오티드는 표준 뉴클레오티드(예컨대, 아데노신, 시토신, 구아닌, 티민, 이노신 및 우라실) 또는 아날로그(예컨대, 포스포로티오에이트 뉴클레오티드)일 수 있다.
카고(cargo)가 될 수 있는 검출가능한 신호를 발생시키는 레이블은 T1 조영물질(예컨대, Gd 킬레이트 화합물), T2 조영물질(예컨대, 초상자성 물질(예: 마그네타이트, Fe3O4,γ-Fe2O3, 망간 페라이트, 코발트 페라이트 및 니켈 페라이트)), 방사성 동위 원소(예컨대, 11C, 15O, 13N, P32, S35, 44Sc, 45Ti, 118I, 136La, 198Tl, 200Tl, 205Bi 및 206Bi), 형광물질(플루오리신 (fluorescein), 피코에리트린 (phycoerythrin), 로다민, 리사민 (lissamine), 그리고 Cy3와 Cy5), 화학발광단, 자기입자, 매스 표지 또는 전자밀집입자를 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
카고(cargo)가 될 수 있는 화학약물은 예를 들어, 항염증제, 진통제, 항관절염제, 진경제, 항우울증제, 항정신병약물, 신경안정제, 항불안제, 마약길항제, 항파킨스질환 약물, 콜린성 아고니스트, 항암제, 항혈관신생억제제, 면역억제제, 항바이러스제, 항생제, 식욕억제제, 진통제, 항콜린제, 항히스타민제, 항편두통제, 호르몬제, 관상혈관, 뇌혈관 또는 말초혈관 확장제, 피임약, 항혈전제, 이뇨제, 항고혈압제, 심혈관질환 치료제, 미용성분(예컨대, 주름개선제, 피부노화 억제제 및 피부미백제) 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 카고는 본 발명의 NLS 펩타이드에 다양한 방식으로 결합될 수 있다. 바람직하게는, 카고는 본 발명의 NLS 펩타이드의 N-말단 또는 C-말단에 공유결합된다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제1서열의 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자를 제공한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공한다.
본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 1616 번째 내지 1645 번째의 뉴클레오타이드 서열로 구성된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 핵산 분자는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 1619 번째 내지 1648 번째의 뉴클레오타이드 서열로 구성된다.
본 명세서에서 사용되는 용어, "벡터(vector)"는 외부의 유전 물질을 다른 세포로 옮기는데 사용되는 전달 수단인 DNA 분자이다. 대표적으로 플라스미드 벡터, 박테리오파아지 벡터, 코스미드 벡터, 인공 염색체를 이용한 벡터(예컨대, YAC, BAC) 등이 존재한다. 벡터를 이용하여 원하는 유전 물질을 대량 발현하는데 있으므로 벡터로서의 기능을 하기 위해 필요한 공통 요소가 존재하는데, 복제 원점(Replication Origin), 여러 제한효소 자리(Multicloning site), 선택표지(selective marker)가 반드시 존재하여야 한다. 벡터 그 자체는 DNA 염기 서열로 이식할 유전자(transgene)과 벡터 백본(backbone)을 포함한다.
본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵 세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 본 발명의 핵산 분자가 원핵 세포 유래이고, 배양의 편의성 등을 고려하여, 원핵 세포를 숙주로 하는 것이 바람직하다. 본 발명의 벡터는 전형적으로 클로닝을 위한 벡터 또는 발현을 위한 벡터로서 구축될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터 (예컨대, tac 프로모터, lac 프로모터, lacUV5 프로모터, lpp 프로모터, pL λ프로모터, pR λ프로모터, rac5 프로모터, amp 프로모터, recA 프로모터, SP6 프로머터, trp 프로모터 및 T7 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 라이보좀 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 E. coli가 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위 (Yanofsky, C., J. Bacteriol ., 158:1018-1024(1984)) 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터 (pL λ프로모터, Herskowitz, I. and Hagen, D., Ann . Rev . Genet ., 14:399-445(1980))가 조절 부위로서 이용될 수 있다.
한편, 본 발명에 이용될 수 있는 벡터는 당업계에서 종종 사용되는 플라스미드 (예: pSC101, ColE1, pBR322, pUC8/9, pHC79, pUC19, pET, pEGFP, pCR 등), 파지 (예: λgt4λB, λ-Charon, λΔz1 및 M13 등) 또는 바이러스 (예: SV40 등)를 조작하여 제작될 수 있다.
한편, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 진핵 세포를 숙주로 하는 경우에는, 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터 (예: 메탈로티오닌 프로모터) 또는 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 (예: 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, 사이토메갈로바이러스 프로모터 및 HSV의 tk 프로모터)가 이용될 수 있으며, 전사 종결 서열로서 폴리아데닐화 서열을 일반적으로 갖는다.
한편, 본 발명의 벡터는 선택표지로서, 당업계에서 통상적으로 이용되는 항생제 내성 유전자를 포함하며, 예를 들어 암피실린, 겐타마이신, 카베니실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 카나마이신, 게네티신, 네오마이신 및 테트라사이클린에 대한 내성 유전자가 있다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상술한 본 발명의 벡터에 의해 형질 전환된 형질 전환 세포를 제공한다.
명세서에서 사용되는 용어, "형질 전환"은 외부로부터 주어진 유전 물질에 의하여 생물의 유전적인 성질이 변하는 것을 말한다. 형질 전환은 폐렴쌍구균, 대장균 등의 박테리아에서 주로 일어나지만, 최근에는 많은 실험들을 통해 식물이나 동물 등에 새로운 유전자를 이식하는 방식도 가능해지고 있다.
본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주 세포는 당업계에 공지되어 어떠한 숙주 세포도 이용할 수 있으며, 예컨대, E. coli JM109, E. coli BL21(DE3), E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 츄린겐시스와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움, 세라티아 마르세슨스 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.
또한, 본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주 세포로서, 이스트 (Saccharomyce cerevisiae), 곤충 세포 및 사람 세포 (예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 등이 이용될 수 있다.
본 발명의 벡터를 숙주 세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl2 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973)), 하나한 방법 (Cohen, S.N. et al., Proc . Natl . Acac . Sci . USA, 9:2110-2114(1973); 및 Hanahan, D., J. Mol . Biol ., 166:557-580(1983)) 및 전기 천공 방법 (Dower, W.J. et al., Nucleic . Acids Res ., 16:6127-6145(1988)) 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주 세포가 진핵 세포인 경우에는, 미세 주입법 (Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973)), 전기 천공법 (Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982)), 리포좀-매개 형질감염법 (Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980)), DEAE-덱스트란 처리법 (Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)), 및 유전자 밤바드먼트 (Yang et al., Proc . Natl . Acad . Sci ., 87:9568-9572(1990)) 등에 의해 벡터를 숙주 세포 내로 주입할 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 신규 서열의 NLS 펩타이드 서열을 제공한다.
(b) 본 발명의 NLS 펩타이드는 본 발명자들에 의해 최초로 규명된 선택적 스플라이싱에 관여하는 NSrp70 단백질로부터 유래된 것이다.
(c) 본 발명의 NLS 펩타이드는 운반 대상의 카고(cargo)를 핵 내로 운반하는 데 효과적이다.
도 1a는 pEGFP 또는 pEGFP/NSrp70 cDNA DAPI(파랑)와 phalloidin-TRITC(빨강)로 염색한 후 NSrp70이 핵 부위에 반점의 형식으로 위치하고 있음을 나타내는 컨포컬 현미경 사진이다.
도 1b은 내인성 NSrp70가 항 래빗 다중 클로닝 항-NSrp70 항체와 FITC-짝지음 항-래빗 항체와 함께 핵이 있는 위치에서 시각화 된 컨포컬 현미경 사진이다.
도 2a는 NSrp70에 의해 Tra2β1에 엑손 v2와 CD44 미니 유전자에서 엑손 v5가 절단된 것을 보여주는 겔 사진이다.
도 2b는 NSrp70에 의해 HEK293T 세포와 Jurkat T 세포에서 엑손 v6이 절단된 것을 보여주는 겔 사진이다.
도 2c는 Jurkat T 세포에서 shRNA에 의해 NSrp70이 억제되어 엑손 v6의 절단 정도가 감소하는 경향을 보여주는 겔 사진이다.
도 2d는 CD44, Fas, Tra2β1의 미니유전자가 myc와의 항체 면역 침강에 의한 상호 작용을 보여주는 겔 사진이다.
도 2e는 CD44, Fas, Tra2β1의 미니유전자가 NSrp70와의 항체 면역 침강에 의한 상호 작용을 보여주는 겔 사진이다.
도 3a은 야생형과 비교하여 NSrp70의 서열을 부분적으로 소거시킬 때 핵 위치화에 미치는 영향을 나타내는 컨포컬 현미경 사진(패널 a),및 야생형과 비교하여 NSrp70의 서열 중 C-말단 부위를 중심으로 부분적으로 소거시킬 때 핵 위치화에 미치는 영향을 나타내는 컨포컬 현미경 사진(패널 b)이다.
도 3b은 NSrp70의 서열 중 531~540 번째 서열에 대한 여러 종을 비교한 사진(왼쪽)과 536~540의 각 아미노산을 돌연변이 시 핵 위치화에 미치는 영향을 보여주는 컨포컬 현미경 사진이다.
도 3c은 NSrp70의 서열 중 M1, M7, M8, M10의 소실시 Tra2β1의 미니유전자의 엑손 v2의 절단 정도에 미치는 영향여부를 판단하는 겔 사진 및 컨포컬 현미경 사진이다.
도 3d는 NSrp70 결실 변이체의 핵 위치화 능력을 분석한 결과이다. D521_GFP는 NSrp70의 1-521번 아미노산 서열이 결실된 변이체, D530_GFP는 NSrp70의 1-530번 아미노산 서열이 결실된 변이체, 472-540_GFP는 NSrp70의 472-540번 아미노산 서열로 이루어진 변이체이다.
도 4a는 선택적 스플라이싱 활성에 미치는 효과를 알아보기 위해, NSrp70의 N-말단 위치의 코일드-코일 서열의 소실 돌연변이체가 핵 위치에 미치는 영향을 알아보는 사진이다.
도 4b는 선택적 스플라이싱 활성에 미치는 효과를 알아보기 위해, NSrp70의 N-말단 위치의 코일드-코일 서열의 소실 돌연변이체가 핵 위치에 미치는 영향을 알아보는 히스토그램과 겔 사진이다.
도 5a는 NSrp70가이 스플라이소좀 인자들인 ASF/SF2과 SC35뿐 아니라 비스플라이소좀 인자들인 PML3, Sp100, 아세틸화 히스톤, Daxx와의 상호 작용이 가능한지 알아보기 위해, 형질 전환시킨 컨포컬 현미경 사진이다.
도 5b는 Myc-tagged NSrp70과 GFP-tagged ASF/SF2 또는 SC35을 만들고, 이후 HEK293T 세포들 안으로 함께 형질 변환시켜 NSrp70이 ASF/SF2 및 SC35와 반응하여 면역 침강하는지 알아보는 겔 사진이다.
도 5c는 HEK293T 세포들을 pCS4-3Myc/SC35 및 지시된 NSrp70의 돌연변이체 컨스트럭트(M11, M12, M13, 또는 M15)와 형질 변환시키고, 면역침강을 수행한 겔 사진이다.
도 5d는 HEK293T 세포들을 pCS4-3Myc/SC3Myc/ASF/SF2 및 지시된 NSrp70의 돌연변이체 컨스트럭트(M11, M12, M13, 또는 M15)와 형질 변환시키고, 면역침강을 수행한 겔 사진이다.
도 5e는 HEK293T 세포들을 pCS4-3Myc/SC35 및 pCS4-3Myc/SC3Myc/ASF/SF2 및 지시된 NSrp70의 돌연변이체 컨스트럭트(M11, M12, M13, 또는 M15)와 형질 변환시키고, 면역침강을 수행한 겔 사진이다.
도 6a은 NSrp70의 제거 돌연변이체들의 도식적 다이어그램 및 HEK293T 세포들을 지시된 컨스트럭트(M14, M15, M16, M17 또는 M18)와 형질 전환시킨 24시간 후 100배 대물렌즈를 이용한 컨포컬 현미경 사진이다.
도 6b은 HEK293T 세포들을 Tra2β1 미니 유전자 및 지시된 컨스트럭트와 공동 형질 전환시킨 24시간 후 제거된 엑손 v2를 RT-PCR로 확인하고(왼쪽 위), 엑손이 제거된 비율을 나타낸 히스토그램(왼쪽 아래) 및 GFP와 GFP_NSrp70 돌연변이체의 단백질 양을 웨스턴 블로팅으로 확인한 겔 사진이다.
도 7a-도 7f는 NSrip70-결핍 동형접합 마우스가 초기 배아 치사를 나타냄을 보여준다. 도 7a는 교환 가능한 Gene-Trap 체계로 엑손1과 엑손2 사이에 ROSAβgeo를 삽입한 도식적 다이어그램(위)과 야생형(NSrp70+/+)과 Gene-Trap(NSrp70+/GT)을 각각 로딩하여 나타난 겔 사진(아래)이다.
도 7b는 Gene-Trap 벡터를 삽입한 이형 마우스의 교배(NSrp70+/GT)로 나타날 수 있는 자손이 가지는 유전자 형태를 보여주고 숫자는 해당 유전자를 가지고 있는 자손 수로 표현된 막대 그래프이다.
도 7c는 야생형(NSrp70+/+) 및 Gene-Trap(NSrp70+/GT) 마우스의 몸무게 변화를 매주 측정한 그래프이다.
도 7d는 항-NSrp70 항체를 이용하여 야생형(NSrp70+/+) 및 Gene-Trap(NSrp70+/ GT)을 각 조직들(뇌, 비장, 림프구)에서 발현된 NSrp70 단백질 양의 차이를 비교한 웨스턴 블로팅 분석을 수행하여 나타난 겔 사진이다.
도 7e는 NSrp70+/+ 및 NSrp70+/ GT로부터 얻은 림프구를 PMA(200 nM)와 A23187(1 μM)으로 24시간 자극시킨 경우 나타난 mIL-2 및 mNSrp70 mRNA의 발현을 RT-PCR로 확인한 겔 사진이다. mGAPDH는 로딩 대조군으로 이용하였다.
도 7f는 막대 그래프는 하부 구획의 3개의 서로 다른 필드로부터 얻은 이동세포를 정량화 한 결과이다. NSrp70+/+ 또는 NSrp70+/ GT 마우스의 림프구(5 x 105)를 2.5 시간 동안 37℃에서 SDF-α(50 ng/ml)-포함 하부 웰로 이동시켰다.
도 8a는 이동성 Jurkat T 세포와 비 이동성 Jurkat T 세포에서 NSrp70의 발현량의 차이를 보여주는 그래프와 겔 사진이다.
도 8b는 BioGPS를 기반으로하는 인 실리코 분석에서 각 기관마다 NSrp70의 발현량의 차이를 보여주면서 특히 발현량이 많은 부위를 따로 표시한 그래프이다.
도 8c는 노던 블로팅 분석을 이용하여 여러 면역 기관들에서 NSrp70의 발현량을 보여주는 그래프이다.
도 9a는 GFP-tagged NSrp70 cDNA가 여러 세포들에서 도우넛 모양으로 분포하고 있음을 보여주는 컨포컬 현미경 사진이다.
도 9b는 NSrp70가 SC35와 상호 작용을 하고 있음을 보여주는 컨포컬 현미경 사진이다.
도 10a는 인간의 NSrp70과 다른 종의 NSrp70 간의 서열의 동일성 및 차이를 보여주는 서열 정보이다.
도 10b는 인간의 NSrp70과 다른 종의 NSrp70 간의 서열의 동일성 정도의 확률을 보여주는 계통 발생 트리이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실험재료 및 실험방법
시약과 항체들
포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(Phorbol 12-myristate 13-acetate, PMA), A23187, 형광 아이소싸이오사이아네이트(fluorescein isothiocyanate FITC)-짝지음, 항 래빗 IgG, 팔로이딘-TRITC(phalloidin-TRITC), 그리고 래빗 다중 클론성 항인성 NSrp70(CCDC55) 항체는 Sigma Chemical Co. (St.Louis, MO)에서 구입하였다. 4´,6-아미디노-2-페닐인돌 다이하이드로클로라이드(4´,6-amidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI)는 Moleculare Probes (Eugene, OR)에서 구입하였다. DirectPCR 분해 시약은 VIAGEN Biotech(Wilshire Boulevard, LA, USA)에서 구입하였다. 재조합 인간 SDF-1α는 R&D System(Minneapolis, MN, USA)에서 구입하였다. WelprepTM 총 RNA 분리 시약은 JBI(Join Bio Innovation, Korea)에서 구입하였다. 역 전사 PCR 예비 배합물(premix)와 종래 PCR 예비 배합물은 iNtRON(iNtRON Biotechnology, Korea)에서 구입하였다. Magna RIPTM 염소 다중 클론성 항인성 베타-액틴(Goat polyclonal anti-human β-actin), 마우스 단일 클론성 항 myc-tag(9B11), 래빗 다중 클론성 항인성 아세틸-히스톤 H2A(Lys5) 과 래빗 다중 클론성 항인성 PARP 항체는 Cell Signaling Technology (Beverly, MA)에서 구입하였다.
래빗 다중 클론성 항인성 I-κB 항체는 Santa Cruz biotechnology(Santa Cruz, CA)에서 구입하였다. 마우스와 래빗 다중 클론성 항인성 SC35 항체는 BD Pharmingen (San Jose, CA)에서 구입하였다. 래빗 다중 클론성 항-GFP 항체는 래빗에 정제한 재조합 총길이 GFP 단백질을 사용하여 개발되었다.
[α-32P]dCTP는 Perkin Elmer(Waltham, MA, USA)에서 구입하였다. OmicLinkTM shRNA 발현 클론과 NSrp70에 대항하는 siRNA는 GeneCopoeiaTM(Germantown, MD, USA)와 Dharmacon Inc.(Chicago, IL, USA)에서 각각 구입하였다.
세포 배양과 형질 전환
10% FBS(Giboco-BRL), 페니실린 그리고 스트렙토마이신 (100 μg/ml; Invitrogen, Carlsbad, CA)가 보충된 DMEM(Gibco-BRL, Gaithersburg, MD)에서 COS-7과 HEK293T 세포를 유지하였다. 제조사의 프로토콜에 따라, 리포펙타민 2000(Lipofectamine 2000) (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 컨스트럭트를 HEK293T 또는 COS-7 세포에 형질전환시켰다. 형질전환 24시간 후, RNA 정제 또는 생화학 분석을 위하여 상기 세포를 수집하였다. 제조사의 지시에 따라, Nucleofector 키트 Ⅴ (Amaxa, Koeln, Germany)를 이용하여 Jurkat T 세포의 형질전환을 실시하였다.
플라스미드
pEGFP-C1/ASF/SF2 그리고 pETv5/CD44, 그리고 pCR3.1/MGTra 미니 유전자의 포유동물 발현 벡터는 Brain J. Morris박사(시드니대, NSW2006, Australia)부터 선물받았다. Michael Sattler (GSF-환경 보건 국립 조사 센터, Neuherberg, Germany)로부터 Fas 미니 유전자를 선물받았다. pEGFP-C3/SP100, Daxx와 PML3는 David J. Picketts(펜실베니아대 의대, Philadelpia, PA)로부터 얻었다. SC35의 cDNA는 Jurkat T 세포를 주형으로 하여 만든 총 RNA를 이용하여 RT-PCR을 통해 얻었다. 이 이후 전사적 융합(in-frame fusion) 방식을 이용하여 cDNA를 pCS4-3Myc,pEGFP-C1 그리고 pmCherry-C1 안으로 삽입하였다. pEGFP/NSrp70 컨스트럭트를 만들기 위해, NSrp70(CCDC55)의 전체 길이 전사 해독틀(open reading frame)을 부호화하는 인간 NSrp70 클론을 imaGenes ORF Expression Clone(imaGenes GmbH, Germany)에서 구입하였다. NSrp70 또는 소실, 치환 돌연변이들을 부호화하는 DNA 파편들을 전체 길이의 NSrp70 전사 해독틀 클론을 이용한 PCR로부터 만들었고, pEGFP-C1 또는 pmCHerry-C1 안으로 삽입하였다.
키메라 NSrp70 단백질을 위한 발현 벡터는 다음과 같다: M16(Δ290C_fNLS), 이것은 1-289 NUCKS(Nuclear Casein kinase and cyclin-dependent kinase substrate)의 NLS와 함께 전사적으로 융합된 아미노산이다; M17(Δ 105N_Δ290C_fNLS), 이것은 106-289 NSrp70의 아미노산으로 NUCKS의 NLS와 전사적으로 융합되어 있다. NSrp70 손실 돌연변이 모두, 키메라 돌연변이 그리고 SR 단백질은 전사적으로 표식이 된 GFP(in-frame tagged GFP)을 포함하고, mCherry 또는 N-말단에 있는 Myc 그리고 그들의 염기 서열들은 자동 시퀀싱을 이용하여 확인한다.
형광 항체법(Immunofluorescence staining)과 공초점(confocal) 영상 분석
형광을 이용한 시각화를 위해, 세포는 18mm 비코팅 구형 덮개 유리(Nalge Nunc International, Denmark)에서 배양되었으며, 3.7% 포름 알데하이드에 15분 간 고정시켰다. PBS 완충 용액(인산 완충 용액과 식염수)에서 5%의 BSA(소 혈청 알부민, Bovine Serum Albumin)를 함께 1시간 동안 처리하여 막은 후에 1차 항체를 4℃에서 하룻밤 동안 처리하였고, 이후 2차 항체를 1시간 동안 처리하였다. 경우에 따라서, 세포들은 PBS에서 젤라틴/글리세롤으로 고정하기 전 300 nM 4´,6-아미디노-2-페닐인돌 다이하이드로클로라이드(4´,6- amidino-2-phenylindole dihydrochloride, DAPI) (Molecular Probes, Eugene, OR)을 처리하여 염색하였고, 이는 50:50 vol/vol의 비율로 하였다(Sigma Chemical Co., St Louis, MO). 샘플들은 40,60× 그리고 100×대물렌즈가 장착된 FV1000 공초점 레이저 스캐닝 현미경(Olympus, Japan)로 실험하였다. 살아있는 세포를 영상화하기 위해, 세포들은 직접 PC-R-10 배스 플로우 챔버(bath flow chamber)안에서 고정시켰고(Live Cell Instruments, Seoul, Korea) FV1000 공초점 현미경을 이용하여 관찰하였다.
면역 침강법( Immunoprecipitation )과 웨스턴 블로팅( Western blotting )
분해 완충 용액(1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 20 mM Tris pH 7.5)에 의해 만들어진 지시된 구조들과 함께 형질 감염 된 HEK293T 또는 COS-7 세포(1×107 세포)에서 세포를 추출하였다. 대략 1 mg의 추출물을 50 μl의 항-GFP 전구체 또는 항-NSrp70 항체 짝지음 세파로오즈(antibody-conjugated sepharose) 4B(GE Healthcare, Sweden)를 혼합하였다. 면역 복합체들은 4℃ 밤새도록 자주 믹싱해 주면서 배양시키고, 세척 완충액 Ⅰ(1% Triton X-100, 150 mM NaCl, 20 mM Tris-HCl pH 7.5)과 완충액 II (150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 7.5)으로 각각 두 번 씻어주고 12% SDS-PAGE에 용해시킨다. 단백질들은 PVDF 막(Perkin Elmer)위로 웨스턴 블로팅 세트인 Trans-Blot SD semidry transfer cell (Bio-Rad, Hercules, CA)을 이용하여 웨스턴 블로팅을 시켰다. 막은 5%의 탈지 우유에서 차단되었고, (1 시간), 이를 헹군 후, 0.1% Tween 20(TBS-T)와 3%의 탈지 우유가 포함된 TBS에서 지시된 항체와 밤새도록 배양하였다. 과량의 일차 항체는 TBS-T에서 네 번 막을 세척하여 제거한다. 이 후 막은 0.1 μg/ml 페록시다아제로 표지한 이차 항체(항 래빗 또는 마우스)와 2시간 동안 배양 하였다. TBS-T로 세 번 세척한 후, ECL 웨스턴 블로팅 탐지(iNtRON Biotechnology, Inc)를 이용하여 밴드를 시각화 하였다. RNA 면역 침강법 실험은 키트(Millipore; catalogue 17-701)에서 제공한 프로토콜에 따라 수행하였다.
핵 분류( Nuclear fractionation )
HeK293T 또는 COS-7 세포(1 × 107cells)는 ice-cold PBS에서 세척하고, 1 ml의 저삼투압의 디기토닌(digitonin) 추출 완충용액(5 mM Tris pH 7.5, 10 mM NaCl, 0.5 mM MgCl2, 1 mM EGTA,1 mM DTT, 40 μg/ml digitonin, 5 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 1 mM PMSF 과 1 mM Na3VO4)에서 재 부유하였다. 얼음에서 15분 후, 세포들은 5분 동안 1000 g 펠렛화되었고, 상층액을 모아 세포기질 단백질 양을 분석하였다. 불용성 펠렛은 PBS로 세척하고 이 후 0.5 ml NP-40 분해 완충 용액(10 μM Tris pH 7.5, 40 mM NaCl, 1 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0.2% NP-40, 5 μg/ml aprotinin, 10 μg/ml leupeptin, 1 mM PMSF 과 1 mM Na3VO4)을 처리하여 재 추출하였다. 샘플들을 볼텍싱하고 얼음에서 10분 간 배양하였다. 세포 용해물 들은 18,000g로 돌린 원심 분리하여 불용성 물질이 없어졌고, 가용성 단백질들은 정량화되었다. 디기토닌(digitonin) 분취액(Aliquots)과 각 샘플에서 NP40의 추출가능한 부분은 SDS-PAGE에 의해 분리하고 웨스턴 블로팅으로 분석하였다.
인 비보 스플라이싱 분석들
인 비보 스플라이싱 분석들은 서술한대로 근본적으로 시행되었다(16,17). 간단히 한 스플라이싱 리포터 미니유전자는 HEK293T 세포에서 맣은 양의 NSrp70 발현 컨스트럭트(pEGFP/NSrp70)와 함께 형질 전환되었다. 동량의 DNA가 형질 전환되었는지 확인하기 위해 비어 있는 pEGFP-C1 플라스미드가 첨가되었다. 형질 전환 24시간 후, RNA는 Total RNA Isolation 시약을 사용하여 분리하였다. CD44 미니 유전자에 대한 RT-PCR 프라이머 N3INS(5'-CTCCCGGGCCACCTCCAGTGCC-3')과 N5INS (5'-GAGGGATCCGCTTCCTGCCCC-3')에 대한 PCR을 (30 cycles of 20 s at 94℃, 30 s at 68℃, and 40 s at 72℃) 수행하였다. Tra2β1에 대해, 본 발명자들은 프라이머 pCR3.1-RT-Rev (5'-GCCCTCTAGACTCGAGCTCGA-3')과 MGTra-R-Xho (5'-GGGCTCGAGTACCCGATTCCCAACATGACG-3')에 대한 PCR을 (35 cycles of 20 s at 94℃, 20 s at 65℃, and 40 s at 72℃) 수행하였다. Fas에 대해서는, PT1(5'-GTCGACGACACTTGCTCAAC-3')과 PT2(5'-AAGCTTGCATCGAATCAGTAG-3')에 대한 PCR을 (33 cycles of 20 s at 94℃, 1 s at 65℃, and 20 s at 72℃) 수행하였다. PCR 생성물들은 1% 아가로즈 겔을 이용하여 분석하였고, 스플라이싱 패턴은 ImageJ 1.44d(ImageJ는 미국 국립 보건원에서 지원하는 퍼블릭 도메인 Java 이미지 프로세싱 프로그램이다.)을 이용하여 정량화하였다.
녹아웃 마우스
녹아웃 마우스를 얻기 위해, 본 본 발명자들은 NSrp70(CCDC55) 주입을 위해 Gene-Trap 배아 줄기 세포(ES) 저장소를 조사하였다. A BLAST는 세포주 Ayu21-T93를 판단하는 마우스 cDNA를 이용하여 조사하였다. C57B6 NSrp70+/ GT 이형(heterozygous) 마우스는 다음과 같이 만들었다. 간단히, 변화가능한 gene trap pU-21T 벡터는 임의의 gene trap 돌연변이 유발에 사용되었다. 돌연변이 컨스트럭트는 β-geo 리포터 유전자에 연관된 스플라이스 받개 서열(splice acceptor sequence)을 포함하고, 그 통합된 부위는 trapped 유전자 5` 말단에 집중적으로 모여있다. pU-21T(20-40μg)은 전기 천공법(800V, 3μF with Bio-Rad Gene Pulser)에 의해 feeder-free 줄기 세포 세포주 KTPU8(B6의 F1 및 CBA) 안으로 형질 변환되었다. 그 후에, G418-저항 클론은 선별되고 확장되었다. Genomic DNA는 클론들에서 만들어졌고, PCR에 의한 조사 및 single-copy intergration과 lox71- lox 2272 부위의 존재를 위해 써던 블로팅으로 조사하였고, 이는 위치-특이적 재조합에 없어서는 안된다. Trapped gene을 확인하기 위해, 5`-RACE으로 실험하였다. 본 발명자들은 pU-21T가 엑손 NSrp70유전자의 1번 엑손 다운스트림의 1,141 bp에 삽입하였다. 게다가, 본 발명자들은 trap 벡터의 5` 말단 569bp 부위가 소실된 것을 발견하였다. NSrp70에서 trap gene 삽입이 된 클론은 키메라 마우스를 발생시키곤 한다. 배아 줄기 세포들을 ICR(Imprinting Control Region) 마우스로부터 상실기 단계 배아(morulae)와 함께 모았다. 본 발명자들은 세포주 당 125개의 상실기 단계 배아를 사용하였고, 이를 대리모 역할을 할 마우스 다섯 마리에 주입하였다. 키메라 마우스는 C57BL/6 암컷과 교배시켰다. 자손 F1과 원 줄기 세포의 genomic DNA들은 벡터의 결합 패턴이 마우스 세포주와 원 ES 클론 사이 동일성이 있는지 확인하는데 써던 블로팅을 필요로 하였다.
배아들과 자손들의 PCR 유전자형( genotyping ) 분석
배아들과 자손들의 태일(tail)은 태일 분해 완충 용액(DirectPCR Lysis Reagent, VIAGEN Biotech)이 들어 있는 1.5 mL 튜브에서 용해되고, 2 μg 용해물은 PCR 유전자 분석을 위해 사용되었다. wild-type 대립 유전자에 필요한 PCR 프라이머들은 엑손 1에서 (21T 93-1: 5'ATATACACGTCGGCGTCAGC-3') 엑손 2에서 (21T93-3R: 5'-CAAAATAAGCCCATACCTGCGTAA-3')에 위치하며, trap 대립유전자는 엑손 1과 엑손 2 사이 (21T93-9: 5'-GAAGAGAGGCCCATTGGTTG-3')에 위치한다. 프라이머 21T93-1과 21T93-3R은 nature 인트론 1의 1,737 염기쌍을 PCR(35 cycles of 1 min at 94℃, 1 min at 58℃, and 2 min at 72℃)하는 데에 이용되었고, 프라이머 21T94-9와 SA-5AS는 일부의 trap 벡터와 인트론 1 서열로 구성된 597 염기쌍을 PCR(35 cycles of 1 min at 94℃, 15 s at 56℃, and 30 s at 72℃)하는 데에 이용되었다.
렌티 바이러스( Leti - viral ) 감염
10 μg의 패키징 플라스미드가 적절하게 삽입된 렌티 바이러스 벡터(2 μg 비 타켓(non target) psiLv-H1 또는 NSrp70 타겟 psiLv-H1)는 리포펙타민 2000(Invitrogen)을 이용하여 HEK293T 안으로 형질전환되었다. 형질 전환 48시간 후에 컬처 상층액을 분리하였다. 상층액이 모이고, 초원심분리로 농축시키고 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다. 렌트 바이러스를 감염시키기 위해, 바이러스 입자는 폴리브렌(polybrene) 8 μg/ml이 들어 있는 15 ml 원심분리용 튜브에서 Jurkat T cell(2 × 105/500 ml)과 섞었다. 1시간 동안 1341g로 원심 분리 후, 세포들은 60 mm 컬처 디쉬로 옮기고 감염과 녹아웃 효과는 감염 후 48 시간이 지나서 FACS(Fluorescence-activated cell sorting) 분석과 RT-PCR을 이용하여 검사하였다.
세포 이동 검사( Cell migration assay )
세포 이동 검사는 트랜스웰 키모택시스 시스템(CHEMOTX system, 3-5 μm pores, Neuro Probe, Inc., Gaithersburg, MD)을 이용하여 시행하였다. Wild-type이나 NSrp70+/ GT에서 얻은 림프구(5 x 105)는 상층 웰들(wells) (50 μl)에 두었고, 50 ng/ml SDA-1α가 들어있는 미디어를 하층 웰(30 μl)에 추가하였다. 접시들은 가습 이산화탄소 배양기에서 37℃에 2.5 시간 동안 배양되었다. 배양 후, 삽입물들은 제거되었고 필터를 통해 하층 웰로 이동한 세포들은 ImageJ 1.44d를 이용하여 개수를 세었다. 각각의 웰의 세 가지 다른 필드는 영상화를 위해 선택되었고, 현미경 필드 안에 있는 세포들은 ImageJ 1.44d를 이용하여 개수를 측정하였다.
실험 결과
NSrp70 은 새로운 핵 반점 단백질이다
이 연구에서, 본 본 발명자들은 처음으로 T 세포에서 이동 관련 유전자로서 NSrp70을 발견하였다. 도. 8a에서 나타나듯이, 이동 T 세포에서 NSrp70의 발현량은 모체 T 세포보다 대략 4배 이상 컸다. BioGPS를 기반으로 하는 인 실리코 ( In silico ) 분석에서 NSrp70은 면역 기능 관련 세포, 예컨대 덴드리틱 세포, T 세포, B 세포 및 자연 살해 세포에서 크게 발현되는 것으로 나타났다(도 8b). 노던 블로팅 분석은 지속적으로 NSrp70이 비장, 장간막, 겨드랑이, 팔림프절(도 8c)과 같은 2차 림프 기관들에서 상당히 발현된다는 사실을 밝혀내었다. 그러나, RNAi 또는 NSrp70의 이소성 과발현 모두 SDF-1α와 PMA+A23187에 각기 반응하는 그들의 운동(화학운동)과 활성(IL-2 발현)과 관련하여 Jurkat T 세포들에 영향을 미치지 않음을 보여주었다(도 8d 및 8e).
NSrp70와 T 세포 이동과 활성 사이의 관련성이 없어 다양한 세포 타입들 안에서 NSrp70가 핵 내부에 반점 구조를 형성한다는 이전의 연구에서 설명하듯이 NSrp70가 존재하는 위치가 어디인지 추적해 보았다(15). 본 발명자들은 지속적으로 GFP-tagged NSrp70 cDNA가 COS-7 안으로 형질 전환될 때의 전형적 핵 반점 패턴을 관찰하였다(도 1a). 고 해상도 컨포컬 현미경 분석을 통해 많은 세포들 내에서 GFP-tagged NSrp70가 산발적으로 분포하거나 도우넛 모양으로 분포하는 것으로 밝혀졌다(도 9a). 그러나, colocalization 연구에서 NSrp70가 스플라이싱 인자 SC35와 정확한 오버랩을 보여준다는 사실을 밝혀내어(도 9b), 핵 반점이 해당 부위임을 확실히 하였다. 내인성 NSrp70도 핵 안에서 발견되었으나, 주로 고정된 HEK293T 세포에서 산발적인 패턴으로 나타났다(도 1b, 좌). 핵 부위 패턴이라는 면에서 GFP-tagged NSrp70이 내인성 NSrp70 인자와 비교하여 조금 다른지 여부를 명확히 하는 것은 tagged 단백질의 인공 산물 때문이며, 본 발명자들은 293T 세포에서 Myc-tagged NSrp70 cDNA를 더 사용하였으며, 그 후에 SC35와 함께 colocalization 연구를 시행하였다. myc-tagged NSrp70은 내인성 NSrp70처럼 산발적인 패턴에서 반점 패턴에 이르기 까지 비슷한 패턴으로 나타나고 있음을 보여주고, 분명하게 SC35와 겹쳐서, tagged 단백질이 NSrp70 부위화에 거의 영향을 미치지 않음을 시사한다. 대신에 이는 항체 염색 후에 직접 시각화 vs. 간접 시각화로 측정한 차이일 것이다. NSrp70의 부위화는 COS-7과 HEK293T 세포들을 통한 핵 분류 분석으로 추가 확인되었다(도 1a 및 1b, 오른쪽). NSrp70 orthologues의 서열 얼라인먼트는 다른 종들과 함께 매우 보존된 상동성을 보여준다(도 10a 및 10b).
NSrp70 은 새로운 SR -관련 단백질이고 선택적 스플라이싱 부위 선택에 영향을 준다.
GFP_NSrp70 단백질의 반점 패턴은 페리크로마틴 원섬유(perichromatin fibrils, PFs)와 인터크로마틴 그래뉼 클러스터(Interchromatin granule clusters, IGCs)에 일치할 것이고, 스플라이싱 시스템의 구성요소들에 대항하는 항체와 함께 세포를 염색할 때, 전자 현미경으로 검출할 수 있다(20). NSrp70의 역할을 보다 특성화하기 위해, 본 발명자들은 EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms의 니들 방법(needle method)에 따라 다른 반점 단백질과 함께 NSrp70 아미노산의 전체 길이의 서열 정렬을 수행하였다. 본 발명자들은 또한 실험 재료 및 실험 방법에서 서술한 것과 같이 BLAST and Protein의 정보 데이터베이스에서 보존된 도메인을 조사하였다. 그러나 서열 분석을 통해 본 발명자들은 NSrp70은 SR 단백질과 SR-관련 단백질과 서열 유사성과 동일성이 낮음을 발견하였다(데이터로 표시되지 않음).
본 발명자들이 생각했던 대로 니들 방법을 통한 낮은 확률의 유사성과 동일성은 많은 삽입된 간격들(inserted gaps)을 가지고 있는 전체 길이 서열 때문이었으며, 본 발명자들은 다른 SR 또는 SR-관련 단백질에서 이미 알려진 RRM과 RS 도메인을 선택하였고 그리고는 두 서열들 사이에서 가장 유사한 지역을 찾기 위해 전체 NSrp70 서열을 RRM과 RS 도메인과 함께 EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms의 물 방법에 따라 정렬하였다. 흥미롭게도, 2개의 N-말단 부위(20-85 aa 및 180-289 aa)는 RRM들과 마찬가지로 유사 부위 안에서 관찰되었다(표. 1). 알려진 SR 단백질의 RRM 서열에서 나타난 시그너처 서열 "RDAEDA"은 NSrp70의 아미노산 20에서 85사이에서 발견되었다(도 10a) 본 발명자들은 또한 C-말단에서 RS-유사 부위를 발견하였으나(290-551 aa) 그 예상했던 RS-유사 부위 서열들은 아스파틱 산(D)또는 아르기닌(R) 이후 글루탐산(E)에 의해 방해받았다. 이 단백질이 진화적으로 얼마나 멀리 거슬러 올라가는지 이해하기 위해서, 본 발명자들은 orthologue 단백질들을 ClustalW 분석을 이용하였다. 구조적인 계통 발생 트리는 인간 NSrp70가 소 NSrp70와 82% 염기 서열의 동일성을, 인간 U2-associated와는 14%의 동일성을 SC35와는 15%의 동일성을 공유한다고 밝혀졌다(도 10b). NSrp70가 핵 반점 단백질이라는 사실을 가지고 한 orthologue 분석은 NSrp70는 SR-관련 단백질이라는 것을 강력하게 시사한다. 다른 SR-단백질들 또는 SR-관련 단백질들과 함께 염기 서열을 정렬하여 얻은 결과를 기초로 하여, 본 발명자들은 NSrp70가 전형적인 SR 단백질과 같이 행동하는지, 예컨대 pre-mRNA 스플라이싱을 활성화 시킬 수 있거나 농도 의존적 방식에서 선택적 스플라이싱을 조절하는지 여부를 테스트하기 위해 미니 유전자를 이용한 인 비보 스플라이싱 분석을 시행하였다 (5,21).
이것을 위해, pEGFP/NSrp70의 양을 늘려, Tra2β1 또는 CD44 미니 유전자를 HEK293T 세포 내로 형질 전환시켰다. RT-PCR은 측면 지속적(flanking constitutive) 엑손에 위치하는 염기 서열을 향하는 프라이머와 함께 수행하였다. 도 2a에서 보여지듯이 본 발명자들은 NSrp70의 추가를 0.5 μg에서 2 μg로 조금 늘린 결과 Tra2β1 미니유전자에서 엑손 v2의 배제를 69%에서 92%까지, CD44 미니 유전자에서 엑슨 v5의 배제를 39%에서 65%까지 증가되었다는 사실을 알게 되었다. 컨트롤과 같이 빈 벡터에 Tra2β1 또는 CD44의 동시 형질 전환 시 스플라이싱 패턴이 변화하지 않았는데, 이는 스플라이싱 반응과 스플라이싱 조절에서 NSrp70의 관여가 인위적이 아니었음을 설명한다. 웨스턴 블로팅 데이터가 HEK293T 세포들에서 GFP와 GFP_NSrp70의 형질 전환 후 단백질 양을 보여준다(도 2a).
NSrp70가 실로 선택적 스플라이싱 조절에 관여하는지 보다 확실히 하기 위해, 본 발명자들은 다른 스플라이싱 리포터 미니 유전자 Fas를 사용하여 인 비보 스플라이싱 분석에서 NSrp70의 효율을 측정하였다. 도 2b에서 보여지듯이, NSrp70 형질전환은 HEK293T 세포들과 Jurkat T 세포들 모두에서 Fas 미니유전자의 엑손 v6의 제외가 대략 3배에서 7배의 증가를 초래했다. 중요하게도 본 발명자들은 뿐만 아니라, NSrp70의 소모가 Jurkat T 세포들의 내인성 Fas의 엑손 v6의 제외에 반대로 영향을 줄 수 있는 것인지도 검사하였다.
NSrp70가 안정적으로 소모되는 Jurkat T 세포를 얻기 위해 본 발명자들은 NSrp70를 과녁으로 하는 shRNA을 포함하는 렌티바이러스 시스템을 이용하였다. 도.2c에서 보여주듯이, NSrp70가 소모된 결과 내인성 Fas의 엑손 v6 제외를 증가시켰다. 함께 생각해보면, 이러한 결과들은 NSrp70가 예컨대 Tra2b1, CD44, 및 Fas와 같은 다양한 pre-mRNA들의 선택적 스플라이싱 부위 선택에 영향을 줄 수 있는 것이라 강력하게 증명하는 것이다.
이 시점에서 일어나는 중요한 이슈는 이 연구에서 NSrp70이 직접 RNA들과 상호 작용을 하는가이다. 이를 위하여 형질 전환된 NSrp70 또는 내인성 NSrp70가 myc(도 2d) 또는 NSrp70(도 2e)에 대항하여 항체와 면역 침강시켰고, 그런 다음 RT-PCR를 돌릴 때 각각의 미니 유전자가 실재하는지를 위해 침전물을 분석하였다. 세 가지 모든 미니 유전자는 myc-tagged NSrp70 또는 내인성 NSrp70에 의해 면역 침강되었고, 이로써 예컨대 NSrp70가 물리적으로 Tra2β1, CD44 및 Fas와 같은 RNA들과 상호 작용하고 있음을 보여준다.
핵 위치화는 NSrp70 -매개로 하는 선택적 스플라이싱을 하는데 필요하다
SR 단백질들과 SR-관련 단백질들의 RS 도메인은 세포하 부위에 대한 것(23, 24)과 마찬가지로 양자 간 또는 스플라이싱 시스템(5, 7, 22)의 다른 구성요소와 단백질-단백질 상호작용에 필요한 것으로 여겨진다. 다른 SR 단백질에서 RS 도메인을 발견한 것과 유사하게 NSrp70에서 RS-유사 지역을 발견한 것처럼, 본 발명자들은 이 지역이 NLS 염기 서열을 포함하고 있을 것으로 가설을 세웠다. 이를 위하여, 본 발명자들은 NSrp70의 patative RS-유사 지역 안에서 NLS 염기 서열을 찾기 위해 일련의 GFP-tagged 소실 돌연변이체를 만들었다. 일시적 형질 전환 후에 GFP-tagged NSrp70 돌연변이체의 위치를 컨포컬 현미경을 이용하여 분석하였다. 위치를 보다 더 잘 모니터하기 위해서, 고정된 세포들도 내인성 SC35와 함께 카운터염색 하였다. 야생형(GFP_NSrp70)와 대조적으로 439-558(M1) 지역을 걸치고 있는 아미노산들의 소실은 이 지역이 NLS 염기서열을 포함하는 것을 시사하면서 세포질 안에서 일어나는 것처럼 보인다(도 3a). 정확한 NLS 염기서열을 찾기 위해, 본 발명자들은 NSrp70 돌연변이체 컨스트럭트들을 보다 많이 디자인하였다(도 3a). 흥미롭게도, 세포질에 위치하는 돌연변이체 M10(Δ531-540)을 발견하였는데, 이 지역이 NSrp70의 NLS 염기서열에 속하게 됨을 시사하는 것이다. 더 나아가 536R/A 또는 537D/A에서의 포인트 돌연변이들은 이러한 2개의 아미노산들이 핵 위치화에 결정적인 나머지들이고, 반점 부위를 겨냥하는 역할을 함을 보여준다(도 3b). 기능적 역할에 대하여 이 발견들을 확장하기 위해, Tra2β1g 미니 유전자 스플라이싱 분석을 인 비보 환경에서 수행하였다. 세포질에 위치하는 M1(Δ439-558), M8(Δ531-558) 및 M10(Δ531-540)은 선택적 스플라이싱을 유도하지 않았다(도 3c). 그런데 흥미롭게도 핵에 위치하는 M7(Δ541-558)는 선택적 스플라이싱 위치 선택에 영향을 주었고, 이는 wild-type의 위치 선택과 비교된다(도 3c). 이러한 결과들은 NLS 염기서열(531-540)에 의한 핵 위치, 예컨대 536RD537가 NSrp70의 기능적 역할에 중요하다는 사실을 설명한다. 게다가 이 염기서열은 알려진 NLS 염기서열과 일치하지 않음을 밝혀냈는데, 이는 이 염기서열이 새로운 NLS 염기서열임을 시사하는 것이다.
한편, 추가적으로 NSrp70 결실 변이체에 대한 실험을 실시하였다(도 3d). 도 3d에서 확인할 수 있듯이, NSrp70의 1-521번 아미노산 서열이 결실된 변이체(D521_GFP), 즉 NSrp70의 아미노산 522-558으로 이루어진 변이체의 경우 핵으로 GFP를 운반하기는 하였으나, 그 능력이 NSrp70 야생형과 비교하여 다소 감소 되었다. NSrp70의 1-530번 아미노산 서열이 결실된 변이체(D530_GFP), 즉 NSrp70의 아미노산 531-558로 이루어진 변이체의 경우 핵으로 GFP를 운반하기는 하였으나, 그 능력이 NSrp70 야생형과 비교하여 다소 감소 되었다. 한편, NSrp70의 472-540번 아미노산 서열로 이루어진 변이체의 경우 핵으로 GFP를 운반하는 능력이 거의 NSrp70 야생형과 비슷하였다.
N-말단의 코일드 -코일 도메인은 선택적 스플라이싱 활성에 중요하다
SR 단백질들은 시그너처 염기서열 RDAEDA, RDADDA 및 SWQDLKD(25, 26)을 내포하는 하나 또는 두 개의 RRM들을 포함한다. 스플라이싱 위치 선택은 RRM의 본질에 의해 결정된다(27). NSrp70이 N-말단에 위치한 아미노산 47과 70 사이에서 대단히 잘 보존된 RDAEDA 서열을 포함하고 있어서(도 10a 및 10b), 선택적 스플라이싱 활성에 관한 이 서열의 역할을 조사하였다. N 말단은 또한 아미노산 106-161에서 코일드-코일 도메인을 포함하고 있으므로, 이 지역이 NSrp70의 스플라이싱 활성에 대응하는지 여부도 검사하였다. 이를 위하여, 일련의 N-말단 소실 컨스트럭트들을 디자인하였고, HEK293T 세포들안에 Tra2β1 미니유전자에 대한 컨스트럭트들의 스플라이싱 활성을 조사하였다(도 4a). 흥미롭게도 비록 모든 소실 돌연변이체들(M11-M13)은 핵 반점 부위화를 보여주었지만 M11(Δ1-105)이 아니라 코일드-코일 도메인의 소실 돌연변이체인 M12(Δ1-170)은 Tra2β1의 pre-mRNA의 선택적 스플라이싱 위치 선택을 완전히 없어지게 하여(도 4b) 코일드-코일 도메인이 NSrp70의 선택적 스플라이싱 활성에 매우 중요하다는 사실을 시사한다. 전체 세포 용해의 웨스턴 블로팅 분석에 의해 증명된 것처럼, 모든 발현된 단백질들은 형질 전환된 HEK293T 세포들에서 비슷한 수준으로 축적되었다(도 4b).
NSrp70 는 C-말단 RS -유사 지역을 통해 SC35 및 ASF / SF2 와 상호작용한다
본 발명자들은 NSrp70가 SC35와 스플라이소좀 구성요소(도 9b)에서 같이 위치하고 있다는 것을 발견하였기에, NSrp70가 아세틸화 히스톤 3, PML, Sp100 및 Daxx이와 같은 ASF/SF2 또는 비스플라이소좀 단백질과 같은 위치에 존재하는지 검사하기 위해 실험을 확장하였다. NSrp70는 SC35 및 ASF/SF2과 상당히 겹치지만, 아세틸화-히스톤 3, PML3, Sp100 및 Daxx와는 겹치지 않는 것으로 보아, NSrp70는 새로운 스플라이소좀 단백질라는 것을 시사한다(도 5a). NSrp70과 ASF/SF2 또는 SC35사이에 물리적 상호 작용을 증명하기 위해, Myc-tagged NSrp70과 GFP-tagged ASF/SF2 또는 SC35을 만들었고, 이후 HEK293T 세포들 안으로 함께 형질 변환시켰다. 도 5b(좌측)에서 보여지듯이, 면역 침강법의 결과들은 NSrp70가 ASF/SF2 및 SC35 모두와 상호작용 할 수 있지만 PML3과는 상호작용하지 않는다고 밝혀졌다. 본래의 단백질들도 물리적으로 상호작용하는지 알아보기 위해, 내인성 NSrp70은 항-NSrp70 항체와 면역 침강시켰으며, 그 이후 항-ASF/SF2 또는 항-SC35 항체들과 면역 탁본(Immunoblot)시켰다. 도 5b(우측)에서 보여지듯이, 내인성 NSrp70도 또한 ASF/SF2 및 SC35의 본래 형태와 물리적으로 상호 작용하였다. 그리고 나서 NSrp70과 ASF/SF2 및 SC35 사이에 물리적 상호 작용 여부가 NSrp70의 스플라이싱 활성과 관련이 있는지 의문을 가졌다. 도 5c 및 5d에서 보여지듯이, 비록 돌연변이체 M12 및 M13이 선택적 스플라이싱 활성을 가지지 않았지만(도 4a 및 4b), 그들은 여전히 ASF/SF2 및 SC35과 상호 작용할 수 있었고 NSrp70가 이 두 가지 스플라이소좀 단백질간과 물리적 상호 작용을 하는 것은 그것의 활성과 직접적으로 관련있는 것이 아님을 설명하는 것이고 더 나아가 C-말단 RS-유사 지역은 상호 작용을 하는 부위를 포함할 것이라는 것을 시사한다. 사실 RS 도메인은 단백질-단백질 상호 작용을 매개하는 것으로 알려져 있다. 예컨대, 그것의 RS 도메인의 소실시, SC35은 Tra, Tra2 및 다른 SR 단백질들과의 결합을 실패한다(7). 예전의 연구에 따라, NSrp70에서 RS-유사 지역의 부분적 소실시(Δ290-471), 단백질은 ASF/SF2 및 SC35과의 상호 작용에 실패한다는 사실을 발견하였다(도 5e).
RS -유사 지역을 통한 반점 위치화 또한 NSrp70 매개의 스플라이싱 활성에 중요하다
지금까지의 결과들이 N-말단의 코일드-코일 도메인과 C-말단의 NLS은 NSrp70의 적절한 활성에 필요함을 설명하였지만, SC35 및 ASF/SF2이 관련되는 RS-유사 지역의 기능을 확립하지 못하였다. 그래서 RS-유사 지역도 마찬가지로 NSrp70-매개의 스플라이싱 기능에 관련 있는지 여부를 검사하였다. 흥미롭게도, 이 지역의 부분적 소실(M15; Δ290-471)이 단백질이 핵 반점에서 위치화 하는데 완전 실패하도록 하며, 핵에서 그것의 산발적 패턴을 밝혀냄으로서, 이 지역이 반점의 위치화(도 6a)와 SC35 및 ASF/SF2의 연관에 필요한 서열을 포함하고 있음을 증명함을 발견하였다(도 5e). N-말단 지역 혼자 스플라이싱 활성을 유도하는지 여부를 더욱 확실히 하기 위하여, RS-유사 지역은 NUCKS로부터 18-aa NLS 서열을 없애 버린 외부 서열로 대체하였다(28). 도 6a는 돌연변이체들 및 그들의 핵 위치화의 개략적 지도를 보여준다. 흥미롭게도, 모든 돌연변이체들은 M15와 같이 비슷한 패턴을 보여주어, RS-유사 지역이 반점의 위치화에 중요함을 시사한다. 결과적으로 이 돌연변이체들은 HEK293T 세포들에서 Tra2β1 엑손 v2 제거에 어떠한 활성도 보이지 않는다(도 6b). 함께 생각해보면, 비록 반점 위치화에 대한 정확한 서열을 더 이상 정하지 못하였지만, SC35 및 ASF/SF2 연관에 해당하는 지역은 아마 반점 위치화를 위한 지역과 겹칠 것이다. 그래서 본 발명자들의 최근 결과는 반점 위치화는 NSrp70의 기능적 역할에 중요하다는 사실을 시사한다.
NSrp70 은 열성 표현형을 가지며, NSrp70 의 녹아웃은 초기 배아 치사를 초래한다
인간 NSrp70은 그것의 마우스 orthologue와 매우 큰 유사성(75.6%)을 가지고 있기 때문에, 참고 그림 Fig. 3에서 묘사하듯이, 대규모의 Gene-Trap 프로젝트에서 만든 마우스 시스템에서의 NSrp70의 역할을 조사하였다(29). NSrp70+/ GT ( Gene - Trap )로부터 분리한 DNA의 염기 서열의 분석을 통해, 레트로바이러스 Gene-Trap 벡터는 초기 메티오닌을 암호화한 엑손의 다운스트림인 11번 염색체 상에 있는 마우스 NSrp70 유전자 1번 인트론에 삽입되어 있음을 확인하였다(도 7a). NSrp70GT / GT 마우스를 만들기 위해 이형 돌연변이체 마우스들을 이종 교배시키고, 그 자손의 유전자형을 PCR로 분석하였다. 조사된 95 마리 이상의 자손 중에서, 오직 NSrp70+/ GT (~80%) 및 NSrp70+/+ (~20%) 마우스만 발견되었고, NSrp70GT / GT마우스는 나타나지 않았으므로(도 7b), 인 비보에서 놋아웃 NSrp70은 그 결과 배아의 치사가 나타난다는 가정을 이끈다. 발달 단계에서 녹아웃 NSrp70가 치사를 유발한다는 것을 결정하기 위해, 6.5일부터 19.5일까지 배아기의 배아 유전자형을 조사하였다. 그러나, 동형접합 배아는 관찰되지 않았기에(데이터가 제시되지 않음), 동형접합 돌연변이는 자궁에 착상하는 즉시 배아 치사가 일어나게 됨을 시사한다. 반면에, 이형 마우스(NSrp70+/ GT)는 wild-type(NSrp70+/+)과 몸무게와 NSrp70 단백질의 발현 수준과 관련해서는 차이가 나타나지 않았다(도 7c 및 d). 게다가 유사 분열 촉진체인 미토겐(mitogen) 자극 및 SDF-1α에 의한 분리된 T 세포들의 이동에 의한 평가처럼, 비장세포에서 IL-2 반응 측면에서 어떠한 차이도 관찰되지 않았고(도 7e 및 f), 이는 마우스에서 NSrp70은 열성 표현형을 가지고 있음을 시사한다.
검토
본 발명자들은 여기에 새로운 SR-관련의 확인 및 특성과 핵 반점 단백질 NSrp70의 발현량이 정소, 신장 및 비장 과 림프구와 같은 면역 조직에서 높게 나타남을 발표하였다. 내인성 NSrp70 단백질은 NLS 및 반점 위치화에 대한 새로운 서열을 포함하였고 이는 핵 반점에서 SC35 및 ASF/SF2와 함께 위치한다는 사실을 발견하였다. 게다가, NSrp70은 N-말단에서 putative RRM을 가지고 있고, 다음에 C-말단에 RS-유사 지역을 포함하는 것에서, NSrp70은 RNA 프로세싱과 관련된 경로들과 관련있을 수 있는 새로운 SR-관련 단백질임을 시사한다. 따라서, 리포터 미니 유전자가 있는 NSrp70에 대한 기능적 스플라이싱 분석은 NSrp70가 인 비보에서 선택적 스플라이싱 부위를 조절할 수 있을 것임을 증명하였다. 특히, NSrp70 녹아웃 마우스는 자식을 생산하지 못한다는 사실로 NSrp70은 초기 배아 발달 단계에서 필수적 유전자임을 제안한다. 선택적 스플라이싱은 척추 동물에서 단백질 다양성의 가장 중요한 근원인 것으로 간주된다(30, 31). 현재까지, 수백 개의 스플라이싱 인자들이 확인되었다(32); 그러나 지놈-와이드 선택적 스플라이싱 패턴을 설명하려는 시도는 선택적 스플라이싱 조절자의 완전한 리스트 없이는 불가능할 것이다. 비록 뜻밖에 운동 T 세포들에서 신속하게 NSrp70을 발견하였지만, 이 결과들로는 NSrp70가 핵 반점에 위치하는 새로운 단백질이고, 그 기능이 스플라이싱 조절자라는 설명에 대해서는 명확하지 않다. 상기 실험적 결과들은, 대규모 cDNA의 시퀀싱에 의해 동정되는 신규 단백질의 세포소기관 위치화를 결정하는 것을 목적으로 하는 총체적 접근법에 의해 NSrp70이 핵에서 특정되지 않은 단백질로 검출되었다는 사실(15)에 의해 입증될 수 있다.
많은 핵 인자들은 간접적 방식은 면역 형광 현미경으로 관찰할 때 구두점 모양으로 염색됨을 보여주고, 핵 인자들이 반점, para반점, 핵소체사(nucleoli), 캐잘 바디(cajal bodies), GEMS 및 PML체들과 같은 뚜렷한 구조들에서 위치한다(33). NSrp70과 ASF/SF2 또는 SC35와 같은 반점 단백질들과의 분명한 상호 작용으로 NSrp70는 엄밀히 반점들에서 위치하고 있음을 설명한다. 그러나 NSrp70은 PML3, Daxx 또는 SP100와 같은 PML 체들과는 상호작용을 보이지 않는다. 많은 pre-mRNA 스플라이싱 인자들은 핵 반점에서 풍부하게 존재하고 있기 때문에, NSrp70가 SR 단백질 또는 SR-관련 단백질 군의 요소인지 여부에 의문을 여기는 것은 당연하다(4). 다음의 두 가지 인자들이 고려되었다. 우선, SR 단백질들은 RRM의 존재에 의해 특징화되며, SR 도메인은 주로 세린/아르기닌 반복 서열들로 구성된다(4). RRM은 여덟 개 또는 여섯 개의 주로 방향성이며 양전하를 띠고 있는 보존된 잔기의 중심 서열을 포함하는 대략 90개의 아미노산들과 일치하는 서열을 가진다(34-36).
SR 단백질들은 또한 RDAEDA, RDADDA 및 SWQDLKD와 같은 시그너처 서열을 포함한다(25-26). 둘 째, SR 단백질들은 N 말단에 하나 또는 두 개의 RRM 복사본들이 있고 그 뒤에 C 말단에 RS 도메인을 포함한다. 그러나, 단백질들의 보존된 도메인을 기초로 한 첫 번째 상동관계 탐색의 결과 불분명한 RRM이 나타난 반면, 알려진 SR 단백질들 및 SR-관련 단백질들로부터 선택된 RRM 서열들이 있는 두 번째 원형 배열은 N 말단의 두 지역에서(20-85 aa 및 161-290 aa) putative RRM 부위를 발견하였다. 이는 NSrp70은 SR 단백질들의 전형적인 군이 아님을 시사한다. 다른 SR 단백질들에서 보존된 불분명한 RS 도메인은 NSrp70에서 발견되었다. 그러나, 290-550 aa 지역을 다루는 서열들은 연속적인 RS, SR, RD 및 RE 반복서열을 나타내, 그것에 의해서 NSrp70에서 RS-유사 지역을 설명하고 있다. RS 도메인이 단백질-단백질 상호 작용을 중개한다는 사실이 보다 확실해지고 있고, 어떤 경우들에서는 NLS와 같은 역할을 한다(9, 23, 24). 이러한 관찰과 일치하는, NSrp70에 RS-유사 지역은 ASF/SF2 또는 SC35과 결합함은 물론이고, NLS 서열도 포함하고 있다는 사실을 발견하였다. 게다가, ASF/SF2 안의 RS 잔기를 RG가 아닌 RD/RE로 교체하는 것은 인 비트로에서 pre-mRNA의 스플라이싱을 유도할 수 있다고 연구 결과가 보고된바 있는 것과 같이 RS-유사 지역은 NSrp70의 활성 영역을 포함하는 것으로 보여진다(37, 38). RS-유사 지역은 또한 핵 반점 정보에 영향을 주는데, 그 이유는 이 지역(290-471 aa)의 부분적 소실로 핵 반점의 형성이 일어나지 않기 때문이다. Collectively, RRM 및 NLS와 핵 반점 서열을 포함하는 RS-유사 지역의 존재는 NSrp70이 SR-관련 단백질이라는 사실을 강하게 시사한다.
UniProtKB/Swiss-Prot에 의한 예상을 기초로 하여, 106-170 aa 및 379-438 aa를 걸치는 지역에서 두 개의 코일드-코일 도메인을 확인하였다. 첫 번째 지역은 이 지역(106-170 aa)의 소실이 단백질의 선택적 스플라이싱 활성을 완전히 잃어버리도록 하는 것으로 보아 스플라이싱 활성에 중요할 것이다. 코일드-코일 지역이 동형접합 이합체 또는 이형 이합체 상호 작용을 매개할 수 있기 때문에, 이 지역이 ASF/SF2 및 SC35과 결합하는 영역인지 그렇지 않으면, 자체적으로 상호 작용(예: 동형접합 이합체)을 매개하는지 결정하였다. 그러나 NSrp70가 1-129 aa(M13:△1-129)의 소실시 여전히 ASF/SF2 또는 SC35과 결합하고 있는 결과를 보건데, 이 영역은 다른 스플라이싱 조절자들과 함께 상호작용하는 역할을 하지 않음을 보여준다. 비록 추가적인 연구가 그 역할들의 증명을 필요로 하지만, 최근 동형접합 이합체적 상호작용에 필요한 영역이라는 증거를 확보하였다(데이터가 표시되지 않음). 또한 이 코일드-코일 도메인이 RRM으로서의 기능으로 작용할 수 있다는 다른 가능성도 있다. 예를 들어, 뉴런 RNA 과립 안에 있는 새로운 RNA-결합 단백질 RNG105는 코일드-코일 도메인을 통해 mRNA에 직접 연결된다는 연구가 보고된바 있다(39). 그러나, 이 영역이 N 말단에서 두 개의 RRM들 사이에 위치할 것이라고 예상되어지므로 이 영역은 마찬가지로 아마 동형접합 이합체의 상호작용을 이루고 있는 두 RRM들 사이에 위치하여 RNA 결합을 안정화 시킬 수 있다고 볼 수 있다. 그래서, 코일드-코일 도메인과 NSrp70안에 두 개의 RRM들 사이의 상관관계를 확인하기 위해 추가적인 연구들이 진행되고 있다.
RS-유사 부위를 통하여 NSrp70과 SC35 및/또는 ASF/SF2의 상호작용 한다는 사실에 기초하여, 본 발명자들은 NSrp70이 SC35 또는 ASF/SF2의 기능에 영향을 줄 수 있는지 여부를 조사하였다. 그러나, NSrp70이 siRNA에 의해 발현량이 하향조절(down-regulate)될 때 선택적 스플라이싱 활성과 반점 위치화에 관한 어떠한 차이점도 볼 수 없었다(데이터가 표시되지 않음). 기능적 중복은 가능한 이유들 중하나이다. 예컨대, ASF/SF2 및 SC35는 인 비트로 스플라이싱 분석에서 기능적으로 상호교환성이 있는 것으로 조사되었고; SR 단백질-제거 추출물(S100 추출물이라고도 불리운다)들에서 항시적 스플라이싱을 활성화시키는 것 뿐 아니라, 선택적으로 스플라이싱이 가능한 모델 pre-mRNA에서 동일한 스플라이싱 위치 선택도 유도한다(40). 물론 NSrp70이 mRNA 스플라이싱에 관여하는 주요 단백질이 아닐 가능성도 있다. 그러나 비록 NSrp70 녹아웃이 원인인 배아 치사의 배후에 아직 정확한 메커니즘이 정립되지 않았지만, NSrp70 녹아웃 마우스의 자손의 결핍은 이 단백질이 발달에 필수적이라는 것을 시사한다. 본 발명자들은 동형접합체 유전자형을 보여주는 어떤 배아도 보지 못했기에, 이 유전자는 배아 발달의 매우 이른 초기 단계에 관여할 것으로 본다. 따라서 초기 단계에서 예컨대, 배반포(blastocyst)나 상실배아(morula)와 같은 단계에서 NSrp70의 효과를 조사할 필요가 있다. 비슷하게 SR 단백질들의 매우 보존된 군에 속한 스플라이싱 인자인 SRp20은 초기 발달 단계에서 필수적이며 해당 착상 전 돌연변이체 배아는 배반포를 형성하지 못하고 상실기에서 죽는다(41). 마우스에서 어떤 특유한 SR 유전자들의 녹아웃시 초기 배아 치사의 결과를 낳는 것으로 알려져 있다(10, 12, 41). 합쳐서 생각해보면, 이러한 인 비트로 결과들은 SR 단백질들이 인 비보에서 단순한 기능적인 중복하기 보다는 자신만의 독특한 역할을 가지고 있는 것을 보여준다. 특이적 SR 단백질들에 대응하는 선택적으로 스플라이싱된 엑손들에서 독특한 DNA 염기 서열을 확인하는 것은 또한 인 비보에서 여분의 SR 단백질들 중에서 개개의 SR 단백질의 중요성을 보여주는 것이기도 하다(42). 마이크로 어레이 분석을 통해 NSrp70은 처음엔 T-세포 이동에 영향을 주는 것으로 보이는 candidate 유전자로 확인하였다. NSrp70은 비운동 Jurkat T 세포들과 비교하여 운동 Jurkat T 세포들에서 매우 발현이 잘 된다는 것을 확인하였다(도 8a). 게다가, BioGPS를 기반으로 하는 인 실리코 분석에서 NSrp70가 특정 면역-관련 세포들에서 매우 높은 수준으로 발현되어지며, 이러한 결과는 노던 블로팅 분석을 통해 뒷받침되었다(도 8b 및 8c). 그럼에도 불구하고, NSrp70의 과량 발현 또는 녹아웃인 경우 hSDFα에 의한 화학운동 및 PMA와 A23187에 의한 T-세포 활성에 관하여 어떠한 효과도 관찰할 수 없었다(도 8d 및 8e). 흥미롭게도, 그러나, 최근의 연구에서 이 유전자가 두 가지 다른 유방 종양 타입들(PyMT 및 MTLn3)로부터 분리된 침습성(invasive) 및 전이 종양세포들의 부분 모집단에서 2.4배가 더 발현되었다는 연구 결과가 있었다(데이터는 Cell Migration Gateway 협회 웹사이트에서 확인가능하다: http://cmckb.cellmigration.org). 더욱 흥미롭게도, WormBase 데이터베이스(http://www.wormbase.org/)에 따르면, NSrp70의 발현이 RNAi에 의해 중단될 때 동물들을 조절하는 것과 비교하여 distal tip cell의 이동 패턴의 변화들이 있다. 이러한 발견들은 NSrp70가 여전히 세포 이동에 관여할 수 있을 것이라는 의견을 뒷받침한다. 면역 세포 이동에서 NSrp70의 역할을 증명하기 위해 보다 더 많은 연구가 필요하다.
마지막으로, 본 발명자들은 새로운 단백질인 NSrp70을 발견하였고, 이는 특정 SR-관련 단백질들과 구조적인 특질이 유사하고, 그 핵 반점들에서 세포내 위치(subcellular localization)을 특징지운다. 더욱이 핵 내의 반점의 분포 패턴 및 SC35과 ASF/SF2의 물리적 상호작용을 기초로 하여 인 비보에서 pre-mRNA 선택적 스플라이싱의 조절에 관한 기능의 윤곽을 그려보았다. 게다가, 이 단백질은 초기 배아 발달에서 필수적이라는 사실도 증명하였다. 최근 결과들뿐 아니라, 이 새로운 스플라이싱 조절자에 대한 앞으로의 연구는 RNA 생체 내 합성(RNA biogenesis)에 대한 새로운 정보를 제공해 줄 것이다.
　

단백질 이름 		RRM 1 　 RS 도메인 　 NSrp70 에서 보존된 영역들

영역 		유사성/
동일성 (%) 		　
영역 		유사성/
동일성 (%) 		　
RRM
RS -유사


전형적
SR
단백질		 SRp75 2-72 43.2/ 29.5 179-494 39.9/23.6 233-292 282-552
104-163 40.9/20.5 335-370
SRp55 1-72 45.5/25 184-343 37.1/20.5 233-274 282-491
110-183 43/19 199-274
SC35 14-92 35.9/21.8 117-221 43.5/23.5 192-269 335-419
SRp40 4-74 37.3/24.1 182-267 51.1/22.7 188-264 445-531
108-181 30.9/18.6 178-274
9G8 11-84 30.9/18.6 　 121-238 38.3/24.1 　 178-274 281-410





추가적
SR 단백질 		SRrp86 66-142 66.7/55.6 194-261 26.6/536 　 256-264 320-398
346-430 29.4/50.6 259-342
U1-70K 103-181 43.1/27.6 230-305 33.3/54.8 285-339 363-455
348-390 34.8/58.7 363-408
p54 33-113 35.8/17 247-353 26.8/44.7 39-88 281-376
XE7 147-256 33.8/25 642-691 52.8/34 502-554 303-352
SRp46 14-92 55/40 83-205 32.5/38.8 303-319 281-359
hTra2 118-196 57.1/10.7 31-113 45.7/34.6 58-85 277-355
231-287 41.5/20.8 294-346
hTra2 119-197 45.8/41.7 30-112 45.7/33 448-471 262-355
226-282 40.4/28.8 312-358
U2AF65 149-231 61.1/27.8 27-62 57.1/37.1 61-78 364-398
259-337 75/62 149-159
385-466 45.5/21.8 　 　 34-80




RNA 결합
SR -관련
인자
U2-결합 단백질 SR140 274-355 40/28.3 　 922-1001 38.9/27.4 　 127-182 281-374
RBM23 166-243 58.8/47.1 366-382
263-341 43.9/26.8 470-502
RBM39 153-230 58.8/47.1 41-90 46.3/29.9 366-382 371-437
250-328 46.4/35.7 36-57
445- 508 43.3/25 173-228
RBM5 98-178 48.6/28.3 206-235
231-315 62.5/37.5 473-488
SFRS15 508-582 46.2/40.8 　 　 501-550
NRrp70에서 RRM들과 RS-유사 영역의 확인 및 다른 SR 또는 SR-관련 단백질들과의 유사성/동일성 백분율
각각의 SR 단백질과 SR-관련 단백질의 RRM 및 RS 도메인 서열은 Nuclear Protein Database와 Knowledgebase UniPortKB에서 수집하였으며, 이후 각 서열은 NSrp70 전체 길이 서열과 함께 정렬하였고, 이는 두 서열들 사이에 유사성이 가장 높은 지역을 판단하기 위해 EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms의 워터 방식을 이용하였다. 이 연구에서 UR들은 참고 방식들로 기술되었다.
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Phe Ala Lys Arg Asn Asn 515 520 525 Glu Glu Thr Val Met Ser Ala Arg Asp Arg Tyr Leu Ala Arg Gln Met 530 535 540 Ala Arg Val Asn Ala Lys Thr Tyr Ile Glu Lys Glu Asp Asp 545 550 555 <210> 5 <211> 521 <212> PRT <213> human <400> 5 Met Ala Ile Pro Gly Arg Gln Tyr Gly Leu Ile Leu Pro Lys Lys Thr 1 5 10 15 Gln Gln Leu His Pro Val Leu Gln Lys Pro Ser Val Phe Gly Asn Asp 20 25 30 Ser Asp Asp Asp Asp Glu Thr Ser Val Ser Glu Ser Leu Gln Arg Glu 35 40 45 Ala Ala Lys Lys Gln Ala Met Lys Gln Thr Lys Leu Glu Ile Gln Lys 50 55 60 Ala Leu Ala Glu Asp Ala Thr Val Tyr Glu Tyr Asp Ser Ile Tyr Asp 65 70 75 80 Glu Met Gln Lys Lys Lys Glu Glu Asn Asn Pro Lys Leu Leu Leu Gly 85 90 95 Lys Asp Arg Lys Pro Lys Tyr Ile His Asn Leu Leu Lys Ala Val Glu 100 105 110 Ile Arg Lys Lys Glu Gln Glu Lys Arg Met Glu Lys Lys Ile Gln Arg 115 120 125 Glu Arg Glu Met Glu Lys Gly Glu Phe Asp Asp Lys Glu Ala Phe Val 130 135 140 Thr Ser Ala Tyr Lys Lys Lys Leu Gln Glu Arg Ala Glu Glu Glu Glu 145 150 155 160 Arg Glu Lys Arg Ala Ala Ala Leu Glu Ala Cys Leu Asp Val Thr Lys 165 170 175 Gln Lys Asp Leu Ser Gly Phe Tyr Arg His Leu Leu Asn Gln Ala Val 180 185 190 Gly Glu Glu Glu Val Pro Lys Cys Ser Phe Arg Glu Ala Arg Ser Gly 195 200 205 Ile Lys Glu Glu Lys Ser Arg Gly Phe Ser Asn Glu Val Ser Ser Lys 210 215 220 Asn Arg Ile Pro Gln Glu Lys Cys Ile Leu Gln Thr Asp Val Lys Val 225 230 235 240 Glu Glu Asn Pro Asp Ala Asp Ser Asp Phe Asp Ala Lys Ser Ser Ala 245 250 255 Asp Asp Glu Ile Glu Glu Thr Arg Val Asn Cys Arg Arg Glu Lys Val 260 265 270 Ile Glu Thr Pro Glu Asn Asp Phe Lys His His Arg Ser Gln Asn His 275 280 285 Ser Arg Ser Pro Ser Glu Glu Arg Gly His Ser Thr Arg His His Thr 290 295 300 Lys Gly Ser Arg Thr Ser Arg Gly His Glu Lys Arg Glu Asp Gln His 305 310 315 320 Gln Gln Lys Gln Ser Arg Asp Gln Glu Asn His Tyr Thr Asp Arg Asp 325 330 335 Tyr Arg Lys Glu Arg Asp Ser His Arg His Arg Glu Ala Ser His Arg 340 345 350 Asp Ser His Trp Lys Arg His Glu Gln Glu Asp Lys Pro Arg Ala Arg 355 360 365 Asp Gln Arg Glu Arg Ser 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Ala Met Lys Gln Thr Lys Leu Glu Ile Gln Lys 50 55 60 Ala Leu Ala Glu Asp Ala Thr Val Tyr Glu Tyr Asp Ser Ile Tyr Asp 65 70 75 80 Glu Met Gln Lys Lys Lys Glu Glu Asn Asn Pro Lys Leu Leu Leu Gly 85 90 95 Lys Asp Arg Lys Pro Lys Tyr Ile His Asn Leu Leu Lys Ala Val Glu 100 105 110 Ile Arg Lys Lys Glu Gln Glu Lys Arg Met Glu Lys Lys Ile Gln Arg 115 120 125 Glu Arg Glu Met Glu Lys Gly Glu Phe Asp Asp Lys Glu Ala Phe Val 130 135 140 Thr Ser Ala Tyr Lys Lys Lys Leu Gln Glu Arg Ala Glu Glu Glu Glu 145 150 155 160 Arg Glu Lys Arg Ala Ala Ala Leu Glu Ala Cys Leu Asp Val Thr Lys 165 170 175 Gln Lys Asp Leu Ser Gly Phe Tyr Arg His Leu Leu Asn Gln Ala Val 180 185 190 Gly Glu Glu Glu Val Pro Lys Cys Ser Phe Arg Glu Ala Arg Ser Gly 195 200 205 Ile Lys Glu Glu Lys Ser Arg Gly Phe Ser Asn Glu Val Ser Ser Lys 210 215 220 Asn Arg Ile Pro Gln Glu Lys Cys Ile Leu Gln Thr Asp Val Lys Val 225 230 235 240 Glu Glu Asn Pro Asp Ala Asp Ser Asp Phe Asp Ala Lys Ser Ser Ala 245 250 255 Asp Asp Glu Ile Glu Glu Thr 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Claims (11)

  1. 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 구성된 필수 아미노산 서열을 포함하는 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드.
  2. (a) 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 구성된 필수 아미노산 서열을 포함하는 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드; 및 (b) 상기 펩타이드에 결합된 핵 내로 운반하고자 하는 카고(cargo)를 포함하는 핵 내 운반체.
  3. (a) 서열목록 제1서열 또는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 구성된 필수 아미노산 서열을 포함하는 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드; 및 (b) 상기 펩타이드에 결합된 핵 내로 운반하고자 하는 카고(cargo)를 포함하는 핵 내 운반체를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 카고(cargo)를 핵 내로 운반하는 방법.
  4. 서열목록 제1서열의 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 1616 번째 내지 1645 번째의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  6. 서열목록 제2서열의 핵위치화 시그널(Nuclear Localization Signal: NLS) 펩타이드를 코딩하는 핵산 분자.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 핵산 분자는 서열목록 제3서열의 뉴클레오타이드 서열 중 1619 번째 내지 1648 번째의 뉴클레오타이드 서열로 구성된 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
  8. 상기 제 4 항 또는 제 5 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  9. 상기 제 6 항 또는 제 7 항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
  10. 상기 제 8 항의 벡터로 형질전환된 형질전환 세포.
  11. 상기 제 9 항의 벡터로 형질전환된 형질전환 세포.
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KR20160083623A (ko) * 2014-12-31 2016-07-12 원광대학교산학협력단 신규 급성백혈병의 진단용 마커
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