KR100553300B1 - 혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법 - Google Patents

혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법 Download PDF

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Abstract

인간을 포함한 포유동물의 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 자극하거나 억제하는 조성물 및 방법이 개시되어 있다. 본원의 조성물로 진단, 예방 또는 치료할 수 있는 질환에는 창상과 같은 외상, 다양한 암, 및 죽상경화증과 심비대증을 포함한 혈관 질환이 포함된다. 또한, 본 발명은 신규 폴리펩티드, 및 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다. 또한, 본원은 이 핵산 서열을 포함하는 벡터 및 숙주 세포, 이종 폴리펩티드 서열에 결합된 본 발명의 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드 분자, 본 발명의 폴리펩티드에 결합하는 항체, 및 본 발명의 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.
혈관신생, 심혈관형성, PRO 폴리펩티드

Description

혈관신생 및 심혈관형성의 촉진 또는 억제 방법 {Promotion or Inhibition of Angiogenesis and Cardiovascularization}
본 발명은 혈관신생 및(또는) 심혈관형성의 촉진 또는 억제 효과가 필요한 포유동물에서 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 촉진하거나 억제하는 데 유용한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 이것은 종양 질환 뿐만 아니라 심혈관 질환의 진단 및 치료를 포함한다.
A. 심장 질환 및 인자
약 5백만명의 미국인이 심부전을 앓고 있고, 해마다 약 400,000명의 심부전 환자가 새로 발생한다. 심부전은 미국에서 65세 이상의 사람이 입원하는 가장 높은 빈도의 단일 원인이다. 최근에, 급성 심근경색을 비롯한 급성 심장 질환의 진보된 관리 결과, 결국 만성 심부전으로 발전될 환자 집단이 팽창되고 있음을 알 수 있다. 1979년부터 1995년까지, 울혈성 심부전 (CHF)으로 인한 입원은 377,000명에서 872,000명으로 늘었고 (130% 증가), CHF로 인한 사망은 116% 증가되었다.
CHF는 좌심실 기능저하, 감소된 운동 내성, 손상된 삶의 질 및 매우 단축된 수명에 의해 특징지워지는 증후군이다. 심부전의 필수 조건은 심장이 체조직의 대사 요구를 총족시키기에 충분한 속도로 혈액을 펌프할 수 없다는 점 (달리 말하면 불충분한 심박출량)이다.
심부전 환자의 심박출량을 상승시키는 데 있어서, 말초혈관수축, 증가된 심박수, 증가된 심수축성 및 증가된 혈장량을 비롯하여 적어도 4가지 주요 보충 기작이 활성화된다. 이들 효과는 교감신경계 및 레닌-안지오텐신계에 의해 주로 매개된다 (Eichlorn, American Journal of Medicine, 104: 163-169 (1998) 참조). 교감신경계로부터의 증가된 출량은 혈관긴장도, 심박수 및 수축성을 증가시킨다. 안지오텐신 II는 1) 혈관 평활근 수축을 직접 자극시키고, 2) 알도스테린 및 항이뇨 호르몬 분비를 자극하여 혈장량의 팽창을 촉진시키고, 3) 교감-매개 혈관긴장도를 자극시키고, 4) 혈관확장 활성 및 나트륨이뇨 활성을 나타내는 브래디키닌(Bradykinin)의 분해를 촉매함으로써 혈압을 상승시킨다 (Review by Brown and Vaughan, Circulation. 97: 1411-1420 (1998) 참조). 아래에 기재한 바와 같이, 안지오텐신 II는 근세포 괴사 (수축 기능을 손상시킴) 및 심장내섬유증 (이완 기능을 손상시키고, 몇몇 경우에서는 수축 기능을 손상시킴)을 촉진시킴으로써 심장에 대해 직접적으로 유해한 영향을 줄 수도 있다 (Weber, Circulation, 96: 4065-4082 (1998) 참조).
울혈성 심부전 (CHF)의 일관성 있는 특징은 심장비대, 즉 기계적 자극 및 호르몬 자극에 의해 활성화되어 심장이 증가된 심박출량에 대한 수요에 적응할 수 있게 하는 심장의 이완이다 (Morgan and Baker. Circulation, 83: 13-25 (1991) 참조). 이 비대 반응은 고혈압, 대동맥협착증, 심근경색증, 심근병증, 판역류증 및 심장내단락과 같은 다양한 병리학적 증상 (이들은 모두 만성 혈액동력학적 과부하 를 초래함)와 종종 관련되어 있다.
비대증은 일반적으로 종양 형성을 수반하지 않는 천연 증식과는 다른, 기간 또는 구조의 크기 증가로 정의된다. 심장의 비대증은 개별 세포 (근세포)의 질량의 증가, 또는 조직을 구성하는 세포 수의 증가 (과다형성), 또는 둘다의 증가로 인한 것이다. 배아 (embryo) 심장의 이완은 주로 근세포 수의 증가 (이것은 생후까지만 지속됨)에 달려 있는 반면, 생후 심근세포는 증식 능력을 상실한다. 개별 세포의 비대증을 통해 추가 증식이 일어난다.
성숙 근세포의 비대증은 개별 근섬유에 가해지는 부하를 감소시키므로 손상된 심장 기능에 대한 단기 반응으로서 초기에는 유익하다. 그러나, 장기간 지속되는 심한 과부하로 인해 비대화된 세포가 퇴화되기 시작하고 결국 사멸한다 (Katz, "Heart Failure", in A.M. ed., Physiology of the Heart (New York: Raven Press, 1992) pp. 638-668). 심비대증은 심부전의 임상 경과에 있어서의 사망 및 이환에 영향을 주는 상당한 위험 인자이다 (Katz, Trends Cardiovasc. Med., 5: 37-44 (1995)). 심비대증의 원인 및 병리학에 대해 좀더 자세한 내용은 예를 들어, 문헌 (Heart Disease. A Textbook of Cardiovascular Medicine, Braunwald, E. ed. (W.B. Saunders Co., 1998), Chapter 14, "Pathophysiology of Heart Failure")을 참조한다.
세포 수준에서, 심장은 근세포와 일반적으로 비근세포라고 불리는 주변 지지세포로 구성되어 있다. 비근세포는 주로 섬유아세포/중간엽세포이지만 내피세포 및 평활근 세포도 포함한다. 실제로, 근세포가 대부분의 성숙 심근 덩어리를 구성 하더라도 이들은 심장에 존재하는 총 세포수의 약 30%만을 차지한다. 성숙 심실 근세포는 호르몬 자극, 생리적인 자극, 혈액동력학적인 자극 및 병리적인 자극에 반응하여 비대 과정의 활성화를 통해 증가된 과부하에 적응할 수 있다. 이 반응의 특징은 동시다발적인 세포 분열, 및 심방 나트륨이뇨 펩티드 (ANP)의 유전자를 비롯한 배아 유전자의 활성화 없이 근세포 크기가 증가되고 개별 심근세포의 수축성 단백질 함량이 증가되는 것이다 (Chien et al., FASEB J., 5: 3037-3046 (1991); Chien et al., Annu. Rev. Physiol., 55: 77-95 (1993)). 세포외 매트릭스내, 및 심근내 관상동맥 주변에 있는 간질 콜라겐의 축적과 관련된 근세포 크기의 증가 결과로서 심근 질량이 증가한 것은 압력 과부하로 인한 인간의 좌심실 비대증에서 보고된 바 있다 (Caspari et al., Cardiovasc. Res., 11: 554-558 (1997); Schwarz et al., Am. J. Cardiol., 42: 895-903 (1978); Hess et al., Circulation, 63: 360-371 (1981); Pearlman et al., Lab. Invest., 46: 158-164 (1982)).
또한, 비근세포를 지지하는 세포에 의해 생성되는 측분비 인자도 심비대증의 발달에 관여할 수 있다고 제안된 바 있고, 다양한 비근세포로부터 생성된 비대 인자 (예를 들어, 백혈구 억제 인자 (LIF) 및 엔도텔린)도 확인되었다 (Metcalf, Growth Factors, 7: 169-173 (1992); Kurzrock et al., Endocrine Reviews, 12: 208-217 (1991); Inoue et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2863-2867 (1989); Yanagisawa and Masaki, Trends Pharm. Sci., 10: 374-378 (1989); 미국 특허 제5,573,762호 (1996년 11월 12일 간행)). 심비대증의 잠재적인 매개자로 확인된 예시적인 추가 인자로는 카디오트로핀-1 (CT-1) (Pennica et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 92: 1142-1146 (1995)), 카테콜아민, 아드레노코르티코스테로이드, 안지오텐신, 프로스타글란딘이 있다.
현재, 심비대증의 치료는 원인이 되는 심질환에 따라 다양하다. 카테콜아민, 아드레노코르티코스테로이드, 안지오텐신, 프로스타글란딘, LIF, 엔도텔린 (엔도텔린-1, -2 및 -3와 빅 엔도텔린을 포함함) 및 CT-1은 비대증의 잠재적인 매개자로 확인된 인자들이다. 예를 들어, 베타-아드레날린성 수용체 차단 약물 (베타-차단제, 예를 들어, 프로프라노롤, 티모롤, 테르타롤올, 카르테오롤, 나도롤, 베타소롤, 펜부토롤, 아세토부토롤, 아테노롤, 메토프로롤 및 카르베디롤 등) 및 베라파밀은 비대성 심근병증의 치료에 광범위하게 사용되어 왔다. 증상 (예: 가슴 통증) 및 운동 내성에 대한 베타-차단제의 유익한 효과는 주로 심박수의 감소와 그에 따르는 이완기의 연장 및 증가된 수동 심실 충만에 기인한다 (Thompson et al., Br. Heart J., 44: 488-98 (1980); Harrison et al., Circulation., 29: 84-98 (1964)). 베라파밀은 심실 충만을 향상시키고, 심근 허혈을 감소시킬 가능성이 있는 것으로 기재된 바 있다 (Bonow et al., Circulation, 72: 853-64 (1985)).
니페디핀 및 딜티아젬도 비대성 심근병증의 치료에 종종 사용된 바 있다 (Lorell et al., Circulation, 65: 499-507 (1982); Betocchi et al., Am. J. Cardiol., 78: 451-457 (1996)). 그러나, 니페디핀은 그의 강력한 혈관확장성 때문에 특히 배출 장애를 앓는 환자에게 해로울 수 있다. 디이소피라미드는 그의 수축력 감소성 때문에 증상을 완화시키는 데 사용된 바 있다 (Pollick, N. Engl. J. Med., 307: 997-999 (1982)). 그러나, 많은 환자에서 초기 효과가 시간에 따라 감 소한다 (Wigle et al., Circulation., 92: 1680-1692 (1995)). 항고혈압성 약물 치료법은 상승된 혈압과 관련된 심비대증에 유익한 효과가 있는 것으로 보고된 바 있다. 단독으로, 또는 배합되어 항고혈압 치료법에 사용되는 약물의 예로는 칼슘 길항제, 예를 들어, 니트렌디핀; 아드레날린성 수용체 차단제, 예를 들어, 상기 기재된 것들; 퀴나프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴과 같은 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제; 이뇨제, 예를 들어, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로로펜아미드, 아세타졸아미드 및 인다파미드; 및 칼슘 채널 차단제, 예를 들어, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 및 니카르디핀이 있다.
예를 들어, 딜티아젬 및 캡토프릴으로 고혈압을 치료하면 좌심실근 질량이 감소하고, 이완 기능의 도플러 (Doppler) 지수가 정상화되지 않았다 (Szlachcic et al., Am. J. Cardiol., 63: 198-201 (1989); Shahi et al., Lancet, 336: 458-461 (1990)). 이러한 발견은 과량의 간질 콜라겐이 좌심실 비대증의 퇴행 후에 남아 있을 수 있음을 나타내는 것으로 해석되었다 (Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992)). 상기 로시 (Rossi) 등은 실험 래트의 압력 과부하성 심비대증에서 심근세포비대증 및 간질 섬유증의 예방 및 퇴행에 대한 캡토프릴의 효과를 조사하였다.
심수축성을 직접 증가시키는 물질(근수축제)은 단기간에 심박출량을 향상시키기 때문에 처음에는 심부전을 앓는 환자에 효과적일 것으로 생각되었다. 그러나, 디고시제닌을 제외한 모든 근수축력 증가제는 단기간 동안 심장 기능을 향상시 킨다고 하더라도, 장기간 동안 사망률을 증가시키는 것으로 밝혀진 바 있다 (Massie, Curr. Op. in Cardiology, 12: 209-217 (1997); Reddy et al., Curr. Opin. Cardiol., 12: 233-241 (1997)). 최근에 베타-아드레날린성 수용체 차단제는 심부전에 사용하도록 추천된 바 있다. 보고된 환자 생존률의 향상은 아직 입증되지 않았지만, 임상 시험의 연구 결과로부터 사망률을 증가시키지 않으면서 심장 기능을 향상시킬 수 있음을 알 수 있다. 또한, CHF의 치료에 있어서 카디오트로핀-1 또는 그의 길항제, 또는 증식 호르몬 및(또는) 인슐린-유사 증식 인자-I의 용도에 관해서는 미국 특허 제5,935,924호, 제5,624,806호, 제5,661,122호 및 제5,610,134호와 WO 95/28173를 참조한다. 또다른 치료 방법은 심장이식이지만, 이것은 공여자 심장의 입수가능성에 의해 제한된다.
엔도텔린은 돼지 동맥의 내피세포 배양 상등액으로부터 단리되어 구조적으로 확인된, 21개의 아미노산을 포함하는 혈관수축 펩티드이다 (Yanagisawa et al., Nature, 332: 411-415 (1988)). 엔도텔린은 나중에 다양한 작용을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 엔도텔린 길항제로서의 엔도텔린 항체는 심근경색증, 신부전 및 기타 질환의 치료에 효과적인 것으로 입증되었다. 엔도텔린은 생체내에 존재하고 혈관수축 작용을 나타내기 때문에, 순환계의 조절에 관여하는 내인성 인자인 것으로 기대되고 있고, 고혈압, 심근경색증과 같은 심혈관 질환, 및 급성 신부전과 같은 신장 질환과 관련되어 있을 수 있다. 엔도텔린 길항제는 예를 들어, 미국 특허 제5,773,414호; 일본 특허 공개 제3130299/1991호; 유럽 특허 제457,195호; 유럽 특허 제460,679호; 및 유럽 특허 제552,489호에 기재되어 있다. 엔도텔린 수용체 길항제를 확인하기 위한 신규 엔도텔린 B 수용체는 미국 특허 제5,773,223호에 기재되어 있다.
심부전에 대한 현재 치료법은 주로 캡토프릴과 같은 안지오텐신-전환 효소 (ACE) 억제제 및 이뇨제를 사용하는 것이다. 이들 약물은 혈액동력학적 프로필 및 운동 내성을 향상시키고, CHF를 앓는 환자의 이환률 및 사망률을 감소시킨다 (Kramer et al., Circulation, 67(4): 807-816 (1983); Captopril Multicenter Research Group, J.A.C.C., 2(4): 755-763 (1983): The CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1435 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302 (1991)). 또한, 상기 약물은 고혈압, 좌심실 기능저하, 죽상경화성 혈관질환 및 당뇨병성 신병증을 치료하는 데 유용하다 (상기 Brown 및 Vaughan). 그러나, 입증된 효능에도 불구하고 ACE 억제제에 대한 반응은 제한되어 있다. 예를 들어, ACE 억제제는 심부전의 치료에 있어서 생존 기간을 연장시키면서 말기 심부전을 향한 진행을 늦추는 듯하지만, ACE 억제제로 치료받는 상당수의 환자가 기능성 클래스 III 심부전을 앓는다.
게다가, 기능성 및 운동 시간의 개선은 작을 뿐이고 사망률은 비록 감소되기는 하지만 여전히 높다 (CONSENSUS Trial Study Group, N. Engl. J. Med., 316(23): 1429-1453 (1987); The SOLVD Investigators, N. Engl. J. Med., 325(5): 293-302 (1991); Cohn et al., N. Engl. J. Med., 325(5): 303-310 (1991); The Captopril-Digoxin Multicenter Research Group, JAMA, 259(4): 539-544 (1988)). 그러므로, ACE 억제제는 60% 이상의 심부전 환자에서 일관성 있게 증상을 완화시킬 수 없는 듯하고 심부전의 사망률을 약 15-20%까지만 감소시키는 듯하다. 다른 부작용은 상기 문헌 (Brown 및 Vaughan)을 참조한다.
ACE 억제제에 대한 대안은 특정한 AT1 수용체 길항제에 의해 나타난다. 심혈관 질환 및 신장 질환의 치료에 있어서 이들 두 가지 방법의 효능을 비교하기 위해 임상 연구를 계획한다. 그러나, 동물 모델 데이타는 ACE/Ang II 경로가 심비대증에 분명히 관여하지만 심비대증에서 활성인 유일한 경로 또는 주요 경로가 아니라는 것을 제시하고 있다. 마우스 유전 "넉아웃" 모델은 상기 경로의 개별 성분을 시험하기 위해 만들어졌다. Ang II에 대한 주요 심장 수용체인 AT 서브 1A가 유전적으로 결실된 상기 한 모델에서, 이들 마우스는 AngII가 실험적으로 주어지는 경우 비대증을 발전시키지 않았다 (Ang II로 인한 비대증이 없음을 확신시켜 주는 기초적인 성공 모델임). 그러나, 대동맥이 이들 동물 (고혈압성 심장 스트레스 모델)에서 수축되는 경우, 심장은 여전히 비대하게 된다. 이것은 상기 수용체 (AT s서브 1A)에 의존하지 않는 별도의 신호 경로가 고혈압에서 활성화된다는 것을 암시한다. ACE 억제제는 이들 경로를 억제할 수 없는 것으로 추측된다 (Harada et al., Circulation, 97: 1952-1959 (1998) 참조). 또한, 심비대증의 과정 및 기작과 관련된 수수께끼에 관해서는 문헌 (Homcy, Circulation, 97: 1890-1892 (1998))을 참조한다.
약 750,000명의 환자가 해마다 급성 심근경색증 (AMI)를 앓고, 대략 미국인의 모든 사망 원인의 4분의 1이 AMI이다. 최근에, 혈전용해제, 예를 들어, 스트렙토키나제, 유로키나제 및 특히 플라스미노겐 활성화제 (t-PA)는 심근경색증을 앓는 환자의 생존률을 상당히 증가시켰다. t-PA가 1.5시간 내지 4시간에 걸친 연속적인 정맥내 주입으로 투여된 경우, t-PA는 치료받은 환자의 69% 내지 90%에서 90분에 관상 개방성을 나타낸다 (Topol et al., Am. J. Cardiol., 61, 723-728 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol., 12: 581-587 (1988); Neuhaus et al., J. Am. Coll. Cardiol., 14: 1566-1569 (1989)). 가장 높은 개방률은 고용량 또는 가속화된 투약 처방시 보고된 바 있다 (Topol et al., J. Am. Coll. Cardiol., 15: 922-924 (1990)). 또한, t-PA는 단회 볼루스로tj 투여될 수 있지만, 상대적으로 짧은 반감기 때문에 관주 치료법에 보다 더 적합하다 (Tebbe et al., Am. J. Cardiol., 64: 448-453 (1989)). t-PA 변이체, 구체적으로는 보다 긴 반감기와 보다 높은 피브린 특이성을 나타내도록 디자인된 t-PA 변이체인 TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR(296-299)AAAA t-PA 변이체, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91: 3670-3674 (1994))는 특히 볼루스 투여에 적합하다. 그러나, 이들 모든 진보에도 불구하고 환자 생존의 장기간 예후는 심비대증의 관찰 및 치료를 포함하는, 환자의 경색 후 관찰 및 치료에 주로 달려 있다.
B. 증식 인자
보고된 바에 의하면 다양한 천연 발생 폴리펩티드는 내피세포의 증식을 유도한다. 이들 폴리펩티드 중에는 염기성 및 산성 섬유아세포 증식 인자 (FGF) (Burgess and Maciag, Annual Rev. Biochem., 58: 575 (1989)), 혈소판-유도 내피세포 증식 인자 (PD-ECGF) (Ishikawa et al., Nature, 338: 557 (1989)) 및 혈관 내피세포 증식 인자 (Leung et al., Science, 246: 1306 (1989); Ferrara and Henzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161: 851 (1989); Tischer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun., 165: 1198 (1989); EP 471, 754B (1996년 7월 31일 특허 결정)가 있다.
인간 VEGF (hVEGF) cDNA로 형질감염된 세포를 포함하는 배지는 모세혈관 내피세포의 증식을 촉진한 반면, 대조구 세포는 촉진하지 못하였다 (Leung et al., Science, 246: 1306 (1989)). 여러 가지 추가 cDNA가 hVEGF의 121-, 189- 및 206-아미노산 동종체 (집합적으로 hVEGF-관련 단백질로도 불림)를 코딩하는 cDNA 라이브러리에서 확인되었다. 121-아미노산 단백질은 hVEGF의 잔기 116과 159사이에 44개 아미노산이 결실되었다는 점에서 hVEGF와 상이하다. 189-아미노산 단백질은 hVEGF의 잔기 116에서 24개 아미노산이 삽입됨으로써 hVEGF와 상이하며, 인간 혈관 투과성 인자 (hVPF)와 명백히 동일하다. 206-아미노산 단백질은 hVEGF의 잔기 116에서 41개 아미노산이 삽입됨으로써 hVEGF와 상이하다 (Houck et al., Mol. Endocrin., 5: 1806 (1991); Ferrara et al., J. Cell Biochem., 47: 211(1991); Ferrara et al., Endocrine Reviews, 13: 18(1992); Keck et al., Science, 246: 1309 (1989); Connolly et al., J. Biol. Chem., 264: 20017 (1989); EP 370,989 (1990년 5월 30일 공개됨)).
현재, 기존 내피로부터의 새로운 혈관의 형성을 수반하는 혈관신생이 다양한 질환의 발병기전에 관여한다는 것은 잘 확립되어 있다. 이들은 고형 종양 및 전이; 죽상경화증; 수정체후부 섬유증식증; 혈관종; 만성 염증; 증식성 망막병증 예컨대, 당뇨병성 망막병증과 같은 안내 신생혈관 증후군; 연령 관련 황반 퇴화증 (AMD); 신생혈관 녹내장; 이식된 각막 조직 및 기타 조직의 면역 거부; 류마티스성 관절염; 및 건선을 포함한다 (Folkman et al., J. Biol. Chem., 267: 10931-10934 (1992); Klagsbrun et al., Annu. Rev. Physiol., 53: 217-239 (1991); and Garner A., "Vascular Diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease, A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 제2판 (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710).
종양 증식의 경우, 혈관신생은 이상증식에서 종양으로 전이하는 데, 그리고 영양분을 증식하는 고형 종양에 공급하는 데 결정적인 역할을 하는 듯하다 (Folkman et al., Nature, 339: 58(1998)). 혈관신생은 정상 세포와 비교할 때 종양 세포가 증식 잇점 및 증식 자율성을 획득하게 한다. 따라서, 종양 절편의 미세혈관 밀도와, 유방암 뿐만 아니라 여러 가지 다른 암에 있어서의 환자 생존률 사이에 연관성이 관찰된 바 있다 (Weidner et al., N. Engl. J. Med., 324: 1-6 (1991); Horak et al., Lancet, 340: 1120-1124 (1992); Macchiarini et al., Lancet, 340: 145-146 (1992)).
혈관신생의 양성 조절자를 검색한 결과, aFGF, bFGF, TGF-α, TGF-β, HGF, TNF-α, 안지오제닌, IL-8 등을 포함한 많은 후보가 확인되었다 (상기 Folkman et al., J.B.C., 및 상기 Klagsbrun et al.,). 지금까지 확인된 음성 조절자에는 트롬보스판딘 (Good et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA., 87: 6624-6628 (1990)), 프로락틴의 N-말단 단편 (16-킬로달톤) (Clapp et al., Endocrinology, 133: 1292-1299 (1993)), 안지오스타틴 (O'Reily et al., Cell, 79: 315-328 (1994)) 및 엔도 스타틴 (O'Reily et al., Cell, 88: 277-285 (1996))이 포함된다.
최근 몇 년간의 연구 결과, 혈관 내피세포 증식을 자극시키는 데 뿐만 아니라 혈관 투과성 및 혈관신생을 유도하는 데 있어서 VEGF의 핵심 역할이 확립되었다 (Ferrara et al., Endocr. Rev., 18: 4-25 (1997)). 심지어 단일 VEGF 대립유전자의 손실이 배아에 치명적이라는 발견은 혈관계의 발달 및 분화에 있어서 이 인자가 하는 대체불가능한 역할을 암시한다. 게다가, VEGF는 종양 및 안내 질환과 관련된 혈관신생의 핵심 매개자로 보인다 (상기 Ferrara et al., Endocr. Rev.). VEGF의 mRNA는 조사한 인간 종양의 대다수에 의해 과발현된다 (Berkman et al., J. Clin. Invest., 91: 153-159 (1993); Brown et al., Human Pathol., 26: 86-91 (1995); Brown et al., Cancer Res., 53: 4727-4735 (1993); Mattern et al., Brit. J. Cancer, 73: 931-934 (1996); Dvorak et al., Am. J. Pathol., 146: 1029-1039 (1995)).
또한, 안액내 VEGF의 농도 수준은 당뇨병성 망막병증 및 기타 허혈-관련 망막병증을 앓는 환자 혈관의 활발한 증식과 밀접하게 관련되어 있다 (Aiello et al., N. Engl. J. Med., 331: 1480-1487 (1994)). 게다가, 최근 연구는 AMD에 걸린 환자의 맥락 신생혈관막에서 VEGF의 국소화를 입증하였다 (Lopez et al., Invest. Ophthalmol. Vis. Sci., 37: 855-868 (1996)).
항-VEGF 중성화 황체는 누드 마우스에서 다양한 인간 종양세포주의 증식을 억제하고 (Kim et al., Nature, 362: 841-844 (1993); Warren et al., J. Clin. Invest., 95: 1789-1797 (1995); Borgstrom et al., Cancer Res., 56: 4032-4039 (1996); Melnyk et al., Cancer Res., 56: 921-924 (1996)), 허혈성 망막 질환의 모델에서 안내 혈관신생을 억제하기도 한다 (Adamis et al., Arch. Ophthalmol., 114: 66-71 (1996)). 그러므로, 항-VEGF 모노클로날 항체 또는 VEGF 활성의 다른 억제제는 고형 종양 및 다양한 안내 혈관신생성 질환의 치료용 물질일 가능성이 있다. 이러한 항체는 예를 들어, 1998년 1월 14에 공개된 유럽 특허 제817,648호 및 1998년 4월 3일 출원된 PCT/US98/06724에 기재되어 있다.
일부 세포에 의해 발현되는 유전자 세트를 신속히 유도할 수 있는, 형질전이 종양유전자를 비롯한 여러 가지 다른 증식 인자 및 미토겐 (mitogen)이 존재한다 (Lau and Nathans, Molecular Aspects of Cellular Regulation, 6: 152-202 (1991)). 즉시-조기 유전자 또는 조기-반응 유전자라고 불리는 이들 유전자는 새로운 단백질 합성과는 독립적으로 증식 인자 및 미토겐과 접촉한 후 수분 내에 전사 활성화된다. 이들 즉시-조기 유전자 군은 분화 및 증식, 재생, 및 창상 치유와 같은 다양한 생물학적 과정의 조정에 필요한 세포외 분비 단백질을 코딩한다 (Ryseck et al., Cell Growth Differ., 2: 233-235 (1991)).
이 군에 속하는 매우 관련된 단백질에는 cef10 (Simmons et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 1178-1182 (1989)); 혈청 또는 혈소판-유도 증식 인자 (PDGF)에 의해 신속히 활성화되는 cyr61 (O'Brien et al., Mol. Cell Biol., 10: 3569-3577 (1990)); 형질전이 증식 인자 베타 (TGF-β)에 의해 활성화된 후 인간 혈관 내피세포에 의해 고농도로 분비되어 PDGF-유사 생물학적 및 면역학적 활성을 나타내고, 특정한 세포 표면 수용체(fisp-12 (Ryseck et al., Cell Growth Differ., 2: 235-233 (1991))에 대해 PDGF와 경쟁하는 인간 결합 조직 증식 인자 (CTGF) (Bradham et al., J. Cell. Biol., 114: 1285-1294 (1991)); 인간 혈관 IBP-유사 증식 인자 (VIGF) (WO 96/17931); 및 골수아세포증-관련-바이러스-타입-1-유도 신모세포종에서 과발현되는 것으로 확인된, 정상적으로 성숙 신장 세포에 억류되어 있는 nov가 포함된다 (Joloit et al., Mol. Cell Biol., 12: 10-21 (1992)).
이들 즉시-조기 유전자의 발현은 증식 인자에 의해 일어나는 단계적 연쇄 반응에서 '제3 메신저"로 작용한다. 또한, 상기 유전자는 세포 증식이 공통 사건인 분화 및 창상 치유와 같은 복합적인 생물학적 과정을 통합하고 조정하는 데 필요한 것으로 생각된다.
추가적인 미토겐으로서 인슐린-유사 증식 인자 결합 단백질 (IGFBP)은 인슐린-유사 증식 인자 (IGF)와의 결합체로 섬유아세포 및 평활근 세포 표면 수용체와 IGF의 결합 증가를 자극하는 것으로 확인되었다 (Clemmons et al., J. Clin. Invest., 77: 1548 (1986)). 시험관내에서 다양한 IGF 작용에 대한 IGFBP의 억제 효과로는 지방세포에 의한 글루코스 수송의 자극, 연골세포에 의한 술페이트 혼입, 및 섬유아세포에 있어서의 티미드 혼입이 있다 (Zapf et al., J. Clin. Invest., 63: 1077 (1979)). 또한, 정상 세포에서 증식 인자-매개 미토겐 활성에 대한 IGFBP의 억제 효과가 나타났다.
C. 추가 치료에 대한 필요성
많은 질환 및 장애에 있어서 혈관 내피세포 증식 및 혈관신생의 역할을 볼 때, 이들 과정을 야기하는 한 가지 이상의 생물학적 효과를 감소 또는 억제시키는 방법이 있는 것이 바람직하다. 또한, 정상 및 질환 상태, 및 특히 암에서 병원성 폴리펩티드의 존재를 검출하는 방법이 있는 것이 바람직하다. 추가로, 특정한 측면에서, 심비대증의 치료에 일반적으로 적용가능한 치료법이 없기 때문에, 심근세포 비대증을 예방 또는 감소시킬 수 있는 인자의 확인은 병리생리학적 심장 증식을 억제하는 신규 치료법의 개발에 있어서 1차적으로 중요하다. 다양한 심혈관 질환 및 종양 질환을 위한 여러 가지 치료법이 있지만 추가적인 치료법이 여전히 필요하다.
<발명의 요약>
A. 실시양태
따라서, 본 발명은 포유동물의 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 촉진 또는 억제하는 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명은 일부 생물학적 활성의 촉진 및 억제를 시험하는 다양한 심혈관 검정에서 양성으로 시험된 단백질의 확인을 기초로 한다. 따라서, 본 단백질은 혈관신생의 촉진 또는 억제, 혈관 내피세포 증식의 억제 또는 자극, 혈관 내피세포의 증식 또는 증식의 자극, 종양 증식의 억제, 혈관신생-의존성 조직 증식의 억제, 혈관신생-의존성 조직 증식의 자극, 심비대증의 억제 및 심비대증의 자극과 같은 효과가 필요한 질환의 치료 (예방을 포함함) 및 진단, 예를 들어, 울혈성 심부전의 치료에 유용한 약물인 것으로 생각된다.
한 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 PRO 폴리펩티드를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 폴리펩티드를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가 활성 성분, 즉 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균 상태이다. 상기 PRO 폴리펩티드는 저장 안정성을 높이기 위해 보존가능한 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액상 제약 제제는 PRO 폴리펩티드의 다회 용량을 함유할 수 있으므로 반복 사용하기에 적합할 것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드를 혼합하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 조성물을 제공한다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 아고니스트 또는 길항제를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가 활성 성분, 즉 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제, 또는 혈관신생 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균 상태이다. 상기 PRO 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제는 저장 안정성을 높이기 위해 보존가능한 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액상 제약 제제는 PRO 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제의 다회 용량을 함유할 수 있으므로 반복 사용하기에 적합할 것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드 아고니스트 또는 길항제를 혼합하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 항-PRO 항체를 포함하는 조성물에 관한 것이다. 한 측면에서, 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 항체를 포함한다. 또다른 측면에서, 상기 조성물은 추가 활성 성분, 즉 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제, 또는 혈관신생 억제제, 바람직하게는 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 포함한다. 바람직하게는, 상기 조성물은 멸균 상태이다. 상기 조성물은 저장 안정성을 높이기 위해 보존가능한 액상 제약 제제의 형태로 투여될 수 있다. 보존된 액상 제약 제제는 항-PRO 항체의 다회 용량을 함유할 수 있으므로 반복 사용하기에 적합할 것이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 항체는 모노클로날 항체, 항체 단편, 인간화된 항체 또는 단일쇄 항체이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 제약학적으로 허용가능한 담체와 치료 유효량의 항-PRO 항체를 혼합하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유용한 상기 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
추가 측면에서, 본 발명은
(a) PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 포함하는 물질 조성물;
(b) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및
(c) 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 있어서 상기 PRO 폴리펩티드, 또는 상기 PRO 폴리펩티드에 결합하는 항체일 수 있는 그의 아고니스트 또는 길항제의 용도를 언급하는, 상기 용기에 부착된 표지 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물
을 포함하는 제품을 제공한다. 상기 조성물은 치료 유효량의 상기 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 포함할 수 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도되는 세포 반응을 유도하기에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트인지를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 확인하는 단계 (여기서, 상기 세포 반응의 유도는 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트라는 표시임)
를 포함하는, PRO 폴리펩티드의 아고니스트를 확인하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은
(a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드에 의한 세포 증식의 자극에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제인지를 결정하기 위해 상기 세포의 증식을 측정하는 단계 (여기서, 세포 증식의 자극은 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제라는 표시임)
를 포함하는, PRO 폴리펩티드의 길항제를 확인하는 방법을 제공한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 시험 화합물과 폴리펩티드가 상호작용하는 조건하에서 시험 화합물을 충분한 시간동안 PRO 폴리펩티드와 접촉시키는 단계, 및 상기 PRO 폴리펩티드의 활성이 억제되지를 확인하는 단계를 포함하는, PRO 폴리펩티드의 활성을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공한다. 바람직한 특정 측면에서, 상기 시험 화합물 또는 PRO 폴리펩티드는 고형 지지체 상에 부착되어 있다. 또다른 바람직한 측면에서, 부착되지 않은 성분은 탐지가능한 표지를 수반한다. 바람직한 측면에서, 본 방법은
(a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드에 의해 정상적으로 유도된 세포 반응을 유도하기에 적합한 조건 하에 PRO 폴리펩티드의 존재하에서 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 아고니스트인지를 결정하기 위해 상기 세포 반응의 유도를 확인하는 단계
를 포함한다.
또다른 바람직한 측면에서, 본 방법은
a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 PRO 폴리펩티드에 의한 세포 증식의 자극에 적합한 조건하에 PRO 폴리펩티드의 존재하에서 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 시험 화합물이 효과적인 길항제인지를 결정하기 위해 상기 세포의 증식을 측정하는 단계
를 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 정상적으로 상기 폴리펩티드를 발현하는 세 포에서 PRO 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 확인하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 방법은 시험 화합물과 세포를 접촉시키고, 상기 PRO 폴리펩티드의 발현이 억제되는지를 확인하는 것을 포함한다. 바람직한 측면에서, 이 방법은
(a) 세포와 스크리닝할 시험 화합물을 상기 PRO 폴리펩티드의 발현을 허용하기에 적합한 조건하에서 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 폴리펩티드의 발현 억제를 확인하는 단계
를 포함한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 상기 방법에 의해 확인된 화합물과 같은, PRO 폴리펩티드의 발현을 억제하는 화합물을 제공한다.
본 발명의 또다른 측면은 상기 기재한 방법에 의해 임의로 확인될 수 있는 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제에 관한 것이다.
상기 PRO 폴리펩티드의 한 가지 이상의 기능 또는 활성을 억제하는 PRO 폴리펩티드의 길항제의 한 유형은 항체이다. 따라서, 또다른 측면에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드에 결합하는 단리된 항체를 제공한다. 바람직한 측면에서, 상기 항체는 바람직하게는 비인간 상보성-결정-영역 (CDR) 잔기 및 인간 골격-영역 (FR) 잔기를 포함하는 모노클로날 항체이다. 상기 항체는 표지될 수 있고 고상 지지체 상에 부착될 수 있다. 추가 측면에서, 상기 항체는 항체 단편, 단일쇄 항체 또는 인간화된 항체이다. 바람직하게는, 상기 항체는 상기 폴리펩티드에 특이적으로 결합한다.
추가 측면에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드 핵산 서열에서 돌연변이의 존재 또는 부재를 확인하는 것을 포함하는, PRO 폴리펩티드-코딩 핵산 서열에 있는 돌연변이와 관련된 질환 또는 이 질환에 대한 민감성을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 돌연변이의 존재 또는 부재는 상기 질환 또는 상기 질환에 대한 민감성의 존재 또는 부재의 표시이다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플 및 (b) 동일한 세포형의 공지된 정상 조직 세포의 대조구 샘플에서 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현도를 분석하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 대조구 샘플과 비교할 때 시험 샘플의 보다 높은, 또는 보다 낮은 발현도는 상기 포유동물에서 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다. 임의로, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 발현은 대조구 샘플과 비교할 때 시험 샘플에서 mRNA 또는 상기 폴리펩티드의 농도를 측정함으로써 확인할 수 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플에서 PRO 폴리펩티드의 존재 또는 부재를 검출하는 것을 포함하는, 상기 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 시험 샘플에서 상기 PRO 폴리펩티드의 존재 또는 부재는 상기 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) 항-PRO 항체를 포유동물로부터 얻은 조직 세포의 시험 샘플과 접촉시키는 단계, 및 (b) 시험 샘플에서 상기 항체와 상기 PRO 폴리펩티드 사이의 결합체 형성을 검출하는 단계를 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 진단하는 방법을 제공하는 것으로, 상기 결합체의 형성은 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다. 상기 검출은 정성적 또는 정량적일 수 있고, 동일한 세포형의 공지된 정상 조직 세포의 대조구 샘플의 결합체 형성을 관찰하면서 비교함으로써 수행한다. 상기 시험 샘플에 형성된 보다 많은, 또는 보다 적은 양의 결합체는 시험 조직 세포가 얻어지는 포유동물에서 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 존재를 표시한다. 바람직하게는, 상기 항체는 탐지가능한 표지를 수반한다. 결합체 형성은 예를 들어, 당분야에 공지된 광학 현미경, 유량 세포측정기 (flow cytometry), 플루오리메트리 (fluorimetry) 또는 다른 기술로 관찰할 수 있다. 상기 시험 샘플은 대개 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환에 걸린 것으로 의심되는 개체로부터 수득한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 포함하는 것으로 의심되는 샘플을 항-PRO 항체에 노출시키고 상기 항체가 상기 샘플의 성분에 결합하는 것을 확인하는 단계를 포함하는, 샘플에서 PRO 폴리펩티드의 존재를 확인하는 방법을 제공한다. 특정 측면에서, 상기 샘플은 PRO 폴리펩티드를 함유하는 것으로 의심되는 세포를 포함하고, 상기 항체는 상기 세포에 결합한다. 바람직하게는, 상기 항체는 탐지가능하게 표지되어 있고(있거나) 고형 지지체에 부착되어 있다.
추가 측면에서, 본 발명은 적당한 포장안에 항-PRO 항체 및 담체를 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환용 진단 키트를 제공한다. 바 람직하게는, 이러한 키트는 PRO 폴리펩티드의 존재를 검출하는 상기 항체를 사용하기 위한 지시물을 추가로 포함한다. 바람직하게는, 상기 담체는 예를 들어, 완충액이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 암이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 PRO 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 질환은 심비대증, 창상 또는 화상과 같은 외상, 또는 암 유형이다. 추가 측면에서, 상기 포유동물은 혈관성형술, ACE 억제제 또는 화학요법제 (심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환이 암 유형인 경우)와 같은, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 약물에 노출된다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간, 바람직하게는 심비대증으로 발전할 위험이 있는 인간, 보다 바람직하게는 심근경색증을 앓는 인간이다.
또다른 바람직한 측면에서, 심비대증은 고농도 PGF2α의 존재에 의해 특징지워진다. 별법으로, 심비대증은 심근경색증에 의해 유도될 수 있는데, 여기서 바람직하게는 상기 PRO 폴리펩티드의 투여는 심근경색 후 48시간내, 보다 바람직하게는 24시간내에 개시된다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증이고, 상기 PRO 폴리펩티드는 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또 는 혈관형성제와 함께 투여한다. 이러한 목적에 바람직한 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제는 항고혈압성 약물, ACE 억제제, 엔토텔린 수용체 길항제 및 혈전용해제로 구성된 군에서 선택된다. 혈전용해제를 투여하는 경우, 상기 약제를 투여한 후 PRO 폴리펩티드를 투여하는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는, 혈전용해제는 재조합 인간 조직 플라스미노겐 활성화제이다.
또다른 바람직한 측면에서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증이고, 급성 심근경색증의 치료를 위해 1차 혈관성형술 후 PRO 폴리펩티드를 투여하는데, 여기서 바람직하게는 상기 포유동물은 혈관성형술, 또는 심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관형성제에 추가로 노출시킨다.
또다른 바람직한 실시양태에서, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 암이고, 상기 PRO 폴리펩티드는 화학요법제, 증식 억제제 또는 세포독성제와 함께 투여한다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 PRO 폴리펩티드 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증이다. 또한, 포유동물이 인간이고 유효량의 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 아고니스트와 함께 투여하는 경우가 바람직하다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 PRO 폴리펩티드 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관 신생 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증이다. 또한, 포유동물이 인간이고 유효량의 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 길항제와 함께 투여하는 경우가 바람직하다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 유효량의 항-PRO 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 치료하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환은 심비대증, 외상, 암 또는 연령-관련 황반퇴화증이다. 또한, 포유동물이 인간이고 유효량의 혈관형성제 또는 혈관신생 억제제를 상기 항체와 함께 투여하는 경우가 바람직하다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산 분자를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환을 앓는 포유동물을 치료하는 방법에 관한 것으로, 여기서 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체이다. 바람직한 실시양태에서, 상기 포유동물은 인간이다. 또다른 바람직한 실시양태에서, 상기 유전자는 생체외 유전자 치료법을 통해 투여한다. 바람직한 추가 실시양태에서, 상기 유전자는 벡터, 보다 바람직하게는 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터 또는 레트로바이러스 벡터에 포함되어 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 본질적으로 프로모터, (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산, 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비용 신호 서열로 이루어진 레트로바이러스 벡터를 포함하는 재조합 레트로바이러스 입자를 제공하는 것으로, 여기서 상기 레트로바이러스 벡터는 레트로바이러스 구조 단백질과 결합되어 있다. 바람직하게는, 상기 신호 서열은 천연 PRO 폴리펩티드의 신호 서열과 같은 포유동물로부터 유래한 것이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 레트로바이러스 구조 단백질을 발현하고, 본질적으로 프로모터, (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 폴리펩티드 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 코딩하는 핵산, 및 상기 폴리펩티드의 세포 분비용 신호 서열로 이루어진 레트로바이러스 벡터도 포함하는 핵산 구조물을 포함하는 생체외 생산 세포를 제공하는 것으로, 여기서 상기 생산 세포는 재조합 레트로바이러스 입자를 생산하기 위해 상기 구조 단백질과 결합되어 있는 레트로바이러스 벡터를 패키징한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 억제하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 억제되고, 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고 상기 내피세포 증식은 종양 또는 망막질환과 관련되어 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 자극하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 자극되고 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 억제하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 억제되고, 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고 상기 심비대증은 심근경색증에 의해 유도된 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 (a) PRO 폴리펩티드, (b) PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 (c) PRO 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 자극하는 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 자극되고 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체일 수 있다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 울혈성 심부전을 앓는 인간이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 항-PRO 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 PRO 폴리펩티드에 의해 유도된 혈관신생을 억제하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고, 보다 바람직하게는 상기 포유동물은 종양 또는 망막질환을 앓는다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드를 포유동물 에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 PRO 폴리펩티드에 의해 유도된 혈관신생을 자극하는 방법을 제공한다. 바람직하게는, 상기 포유동물은 인간이고, 보다 바람직하게는 혈관신생은 조직 재생 또는 창상 치유를 촉진할 것이다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO333, PRO364, PRO877, PRO879, PRO882 또는 PRO885 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 억제하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 억제된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846 PRO878 또는 PRO879 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 자극하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 자극된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846 PRO878 또는 PRO879 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 억제하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 억제된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO333, PRO364, PRO877, PRO879, PRO882 또는 PRO885 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 내피세포 증식을 자극하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 내피세포 증식은 자극된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO205, PRO882 또는 PRO887 폴리펩티드 또 는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 유도하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 유도된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO238, PRO878 또는 PRO1760 폴리펩티드 또는 그의 아고니스트를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 감소시키 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 감소된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO238, PRO878 또는 PRO1760 폴리펩티드 의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 유도하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 유도된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO205, PRO882 또는 PRO887 폴리펩티드의 길항제를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물의 심비대증을 감소시키 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 포유동물의 심비대증은 감소된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 항-PRO179, 항-PRO321, 항-PRO840, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO878 또는 항-PRO879 항체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 또는 PRO879 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈관신생을 억제하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 혈관신생은 억제된다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 치료 유효량의 PRO179, PRO321, PRO840, PRO844, PRO846, PRO878 또는 PRO879 폴리펩티드를 포유동물에게 투여하는 것을 포 함하는, 상기 폴리펩티드에 의해 유도되는 혈관신생을 자극하기 위한 방법을 제공하는 것으로, 여기서 상기 혈관신생은 자극된다.
B. 추가 실시양태
본 발명의 다른 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자를 제공한다.
한 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원의 아미노산 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원의 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 다른 단편을 포함하는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
다른 측면에서, 상기 단리된 핵산 분자는 (a) 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 cDNA의 코딩 서열, 신호 펩티드가 없는 본원의 PRO 폴리펩티드의 코딩 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원의 막횡단 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인의 코딩 서열, 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 다른 단편의 코딩 서열을 포함하는 DNA 분자, 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
추가 측면에서, 본 발명은 (a) 본원에 개시된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 것과 동일한 성숙 폴리펩티드를 코딩하는 DNA 분자 또는 (b) 상기 (a) DNA 분자의 상보체와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단리된 핵산 분자에 관한 것이다.
또다른 측면에서, 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되었거나 막횡단 도메인이 불활성화된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하거나, 이러한 코딩 뉴클레오티드 서열에 상보적인 단리된 핵산 분자를 제공하는 것으로, 여기서 이러한 폴리펩티드의 막횡단 도메인(들)은 본원에 개시되어 있다. 그러므로, 본원 에 기재된 PRO 폴리펩티드의 가용성 세포외 도메인도 고려된다.
또다른 실시양태는 임의로 항-PRO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 폴리펩티드를 코딩하는 PRO 폴리펩티드의 단편을 코딩하는 PRO 폴리펩티드 코딩 단편에 대한 혼성화 프로브 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 프로브로서 사용할 수 있는 PRO 폴리펩티드 코딩 서열 또는 그의 상보체에 관한 것이다. 이러한 핵산 단편의 길이는 일반적으로 약 20개 이상의 뉴클레오티드, 바람직하게는 약 30개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 40개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 50개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 60개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 70개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 80개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 90개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 100개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 110개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 120개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 130개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 140개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 150개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 160개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 170개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 180개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 190개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 200개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 250개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 300개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 350개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 400개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 450개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직 하게는 약 500개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 600개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 700개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 800개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 900개 이상의 뉴클레오티드, 보다 바람직하게는 약 1000개 이상의 뉴클레오티드이고, 이 내용에서 용어 "약"은 상기 언급한 길이의 플러스 또는 마이너스 10%의 뉴클레오티드 서열 길이를 의미한다. 다수의 잘 공지된 임의의 서열 정렬 프로그램을 이용하여 다른 공지된 뉴클레오티드 서열과 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열을 정렬하고 어떤 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 단편(들)이 신규한지를 결정하는 통상적인 방식으로 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열의 신규 단편을 확인할 수 있다. 본원에서는 이러한 PRO 폴리펩티드-코딩 뉴클레오티드 서열 모두를 고려한다. 또한, 이들 뉴클레오티드 분자 단편에 의해 코딩되는 PRO 폴리펩티드 단편, 바람직하게는 항-PRO 항체에 대한 결합 부위를 포함하는 PRO 폴리펩티드 단편도 고려한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기에서 확인한 임의의 단리된 핵산 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다.
일부 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같은 전장 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원의 아미노산 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원의 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원의 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 단편을 포함하는 PRO 폴리펩티드와 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이 상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 바와 같이 ATCC에 기탁된 임의의 인간 단백질 cDNA에 의해 코딩되는 아미노산 서열과 약 80% 이상의 서열 동일성, 바람직하게는 약 81% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 서열 동일 성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 서열 동일성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 서열 동일성을 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.
추가 측면에서, 본 발명은 본원에 개시된 전장 아미노산 서열, 신호 펩티드가 없는 본원의 아미노산 서열, 신호 펩티드가 있거나 없는 본원의 막횡단 단백질의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 아미노산 서열의 구체적으로 정의된 임의의 단편을 포함하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교할 때 약 80% 이상의 양성, 바람직하게는 약 81% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 82% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 83% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 84% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 85% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 86% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 87% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 88% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 89% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 90% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 91% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 92% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 93% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 94% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 95% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 96% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 97% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 98% 이상의 양성, 보다 바람직하게는 약 99% 이상의 양성을 기록하는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 PRO 폴리펩티드에 관한 것이다.
특정 측면에서, 본 발명은 N-말단 신호 서열 및(또는) 개시 메티오닌이 없으 며 상기와 같은 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩되는 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다. 동일한 것을 생산하는 방법도 본원에 기재되어 있는데, 여기서 상기 방법은 PRO 폴리펩티드의 발현에 적당한 조건하에서 적당한 코딩 핵산 분자를 포함하는 벡터를 포함하는 숙주 세포를 배양하는 것, 그리고 세포 배양물로부터 상기 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
또다른 측면에서, 본 발명은 막횡단 도메인이 결실되었거나 불활성화된 단리된 PRO 폴리펩티드를 제공한다. 동일한 것을 생산하는 방법도 본원에 기재되어 있는데, 여기서 상기 방법은 PRO 폴리펩티드의 발현에 적당한 조건하에서 적당한 핵산 분자를 포함하는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 배양하는 것, 그리고 세포 배양물로부터 상기 PRO 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 정의된 천연 PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제에 관한 것이다. 구체적인 실시양태에서, 상기 아고니스트 또는 길항제는 항-PRO 항체 또는 소분자이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 PRO 폴리펩티드를 후보 분자와 접촉시키는 것, 그리고 상기 PRO 폴리펩티드에 의해 매개되는 생물학적 활성을 관찰하는 것을 포함하는, PRO 폴리펩티드에 대한 아고니스트 또는 길항제를 확인하는 방법에 관한 것이다. 바람직하게는, PRO 폴리펩티드는 천연 PRO 폴리펩티드이다.
추가 실시양태에서, 본 발명은 담체와 함께 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드, PRO 폴리펩티드의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체를 포함하는 물질 조성물에 관한 것이다. 임의로, 상기 담체는 제약학상 허용가능한 담체이다.
본 발명의 또다른 실시양태는 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체에 반응하는 질환의 치료에 유용한 약제를 제조하기 위한, 상기 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재한 임의의 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 포함하는 벡터를 제공한다. 이러한 임의의 벡터를 포함하는 숙주 세포도 제공한다. 예를 들어, 상기 숙주 세포는 CHO 세포, 대장균, 효모 또는 바큘로바이러스-감염된 곤충 세포일 수 있다. 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드를 제조하는 방법도 추가로 제공하고, 상기 방법은 원하는 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것, 그리고 이 세포 배양물로부터 원하는 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드가 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 결합되어 있는 키메라 분자를 제공한다. 이러한 키메라 분자의 예로는 본원에 기재된 임의의 폴리펩티드가 이뮤노글로불린의 에피토프 태그 서열 또는 Fc 영역에 결합되어 있는 것이 있다.
또다른 실시양태에서, 본 발명은 상기 또는 하기 기재된 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 임의로, 상기 항체는 모노클로날 항체, 인간화된 항체, 항체 단편 또는 단일쇄 항체이다.
다른 실시양태에서, 본 발명은 안티센스 프로브로서 게놈 서열 및 cDNA 뉴클레오티드 서열을 단리하는 데 유용한 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공하는 것으 로, 여기서 상기 프로브는 상기 또는 하기 기재된 임의의 뉴클레오티드 서열로부터 유도할 수 있다.
도 1은 천연 서열 PRO179 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 1)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 1은 본원에서 "DNA16451-1388"로 지칭되는 클론이다.
도 2는 도 1에 나타낸 서열 1의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 2)를 나타낸다.
도 3은 천연 서열 PRO238 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 3)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 3는 본원에서 "DNA35600-1162"로 지칭되는 클론이다.
도 4는 도 3에 나타낸 서열 3의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 4)를 나타낸다.
도 5는 천연 서열 PRO364 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 5)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 5는 본원에서 "DNA47365-1206"으로 지칭되는 클론이다.
도 6은 도 5에 나타낸 서열 5의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 6)를 나타낸다.
도 7은 천연 서열 PRO844 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 7)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 7은 본원에서 "DNA59838-1462"로 지칭되는 클론이다.
도 8은 도 7에 나타낸 서열 7의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 8)를 나타낸다.
도 9는 천연 서열 PRO846 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 9)을 나타내는 것 으로, 여기서 서열 9은 본원에서 "DNA44196-1353"으로 지칭되는 클론이다.
도 10은 도 9에 나타낸 서열 9의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 10)를 나타낸다.
도 11은 천연 서열 PRO1760 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 11)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 11은 본원에서 "DNA76532-1702"로 지칭되는 클론이다.
도 12는 도 11에 나타낸 서열 11의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 12)를 나타낸다.
도 13은 천연 서열 PRO205 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 13)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 13은 본원에서 "DNA30868"로 지칭되는 클론이다.
도 14는 도 13에 나타낸 서열 13의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 14)를 나타낸다.
도 15는 천연 서열 PRO321 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 15)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 15는 본원에서 "DNA34433"으로 지칭되는 클론이다.
도 16은 도 15에 나타낸 서열 15의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 16)를 나타낸다.
도 17은 천연 서열 PRO333 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 17)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 17은 본원에서 "DNA41374"로 지칭되는 클론이다.
도 18은 도 17에 나타낸 서열 17의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 18)를 나타낸다.
도 19는 천연 서열 PRO840 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 19)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 19는 본원에서 "DNA53987"로 지칭되는 클론이다.
도 20은 도 19에 나타낸 서열 19의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 20)를 나타낸다.
도 21은 천연 서열 PRO877 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 21)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 21은 본원에서 "DNA58120"으로 지칭되는 클론이다.
도 22는 도 21에 나타낸 서열 21의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 22)를 나타낸다.
도 23은 천연 서열 PRO878 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 23)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 23는 본원에서 "DNA58121"로 지칭되는 클론이다.
도 24는 도 23에 나타낸 서열 23의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 24)를 나타낸다.
도 25는 천연 서열 PRO879 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 25)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 25는 본원에서 "DNA58122"로 지칭되는 클론이다.
도 26은 도 25에 나타낸 서열 25의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 26)를 나타낸다.
도 27은 천연 서열 PRO882 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 27)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 27은 본원에서 "DNA58125"로 지칭되는 클론이다.
도 28은 도 27에 나타낸 서열 27의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 28)를 나타낸다.
도 29는 천연 서열 PRO885 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 29)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 29은 본원에서 "DNA58128"로 지칭되는 클론이다.
도 30은 도 29에 나타낸 서열 29의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 30)를 나타낸다.
도 31은 천연 서열 PRO887 cDNA의 뉴클레오티드 서열 (서열 31)을 나타내는 것으로, 여기서 서열 31은 본원에서 "DNA58130"으로 지칭되는 클론이다.
도 32는 도 31에 나타낸 서열 31의 코딩 서열로부터 유도된 아미노산 서열 (서열 32)를 나타낸다.
1. 정의
어구 "심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환", "심혈관 장애, 내피세포 장애 및 혈관신생 장애", "심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환" 및 "심혈관 장애, 내피세포 장애 또는 혈관신생 장애"는 교환가능하게 사용되고, 동맥, 모세혈관, 정맥 및(또는) 림프관과 같은 혈관 자체의 질환 뿐만 아니라 부분적으로는 당뇨병과 같은, 혈관에 영향을 미치는 전신 질환을 말한다. 이는 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 자극하는 증상, 및 혈관신생 및(또는) 심혈관형성을 억제하는 증상을 포함한다. 이러한 질환에는 예를 들어, 죽상경화증, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이나우드병 및 레이나우드 증후군, 동맥류 및 동맥성 재발협착증과 같은 동맥 질환; 혈전성정맥염, 림프관염 및 림프부종과 같은 정맥 및 림프관 질환; 및 말초 혈관 질환, 혈관 종양 (예컨대, 혈관종 (모세혈관 및 해면), 사구 종양, 모세혈관확장증, 세균성 혈관종증, 혈관내피종, 혈관육종, 혈관외피세포종, 카 포시 육종, 림프관종 및 림프관육종)과 같은 암, 종양 혈관신생, 창상, 화상 및 기타 손상된 조직과 같은 외상, 이식물 고착, 흉터형성, 허혈성 재관류 손상, 류마티스성 관절염, 뇌혈관 질환, 급성 신부전과 같은 신장 질환 및 골다공증과 같은 기타 혈관 질환이 포함된다. 상기 질환에는 협심증, 급성 심근경색증과 같은 심근경색증, 심비대증, 및 CHF와 같은 심부전도 포함된다.
본원에 사용된 "비대증"은 종양 형성을 수반하지 않는 자연적인 증식과는 독립적으로 기관 또는 구조의 질량이 증가된 것으로 정의된다. 기관 또는 조직의 비대증은 개별 세포의 질량 증가 (진정한 의미의 비대증) 또는 상기 조직을 구성하는 세포 수의 증가 (과다증식증), 또는 둘다에 기인한다. 심장과 같은 일부 기관은 생후 즉시 분열하는 능력을 상실한다. 따라서, "심비대증"은 세포 분열을 수반하지 않으며, 근세포 크기 및 수축 단백질 함량의 증가에 의해 특징지워지는, 성인의 심장 질량의 증가로 정의된다. 비대증을 유도하는 스트레스의 특징 (예컨대, 심근경색증에서와 같이 근세포의 증가된 전(前)하중, 후(後)하중, 근세포의 손실 또는 수축성 일차 우울증)은 반응성을 결정하는 데 결정적인 역할을 하는 듯하다. 심비대증의 초기 단계는 일반적으로 미토콘드리아 및 핵의 팽창 뿐만 아니라 근섬유 및 미토콘드리아의 크기 증가에 의해 형태학적으로 특징지워진다. 이 단계에서, 근세포는 정상세포보다 더 크지만 세포 조직화는 대부분 보존된다. 심비대증의 진행 단계에서, 미토콘드리아와 같은 특정 소기관의 크기 또는 수가 월등히 증가되어 있고, 새로운 수축 요소가 불규칙적인 방식으로 세포의 국소 구역에 첨가된다. 오랜동안 비대화된 세포는 인접한 근섬유를 대체하고 정상적인 Z-밴드 표시의 분해를 야기하는 고도의 소엽막이 있는 현저히 팽창된 핵을 비롯하여 세포 조직화에 있어서 보다 분명한 붕괴를 보인다. 어구 "심비대증"은 근원적인 심질환과는 관계없이 심근의 다양한 구조적 손상도에 의해 특징지워지는, 이 질환의 모든 발전 단계를 포함하는 것으로 사용한다. 그러므로, 상기 용어는 고혈압, 대동맥 협착증, 또는 심근경색증과 같은 심비대증의 발달과 관련된 생리적인 증상도 포함한다.
"심부전"은 심장이 조직 대사의 요구에 필요한 속도로 혈액을 펌프하지 않는 경우의 심장 기능의 비정상성을 말한다. 심부전은 허혈성, 울혈성, 류마티스성 또는 특발성 형태를 포함한 다수의 인자에 의해 야기될 수 있다.
"울혈성 심부전" (CHF)은 심장이 산소를 포함한 혈액을 말초 조직에 전달하기에 적당한 심박 출량 (일정 시간에 걸쳐 심장에 의해 펌프되는 혈액 부피)을 점차적으로 공급할 수 없는 경우의 진행성 병적 상태이다. CHF가 진행됨에 따라, 구조적 및 혈액동력학적 손상이 일어난다. 이들 손상은 다양한 증상을 나타내지만 한 가지 특징적인 증상은 심실 비대증이다. CHF는 많은 다양한 심장 질환의 공통적인 결과이다.
"심근경색증"은 종종 중복성 관상 혈전증이 있는 관상 동맥의 죽상경화증으로부터 일반적으로 발생한다. 심근경색증은 두 가지 주요 유형, 즉 심근괴사가 심실벽의 전층을 수반하는 전층경색증, 및 괴사가 심실벽을 통해 심장외막까지 뻗어 있지 않고 심내막하층, 벽내심근층 또는 둘다를 수반하는 심내막하(비전층)경색증으로 나눌 수 있다. 심근경색증은 손상된 심장 구역 및 건강한 심장 구역에서 혈액동력학적 효과의 변화 및 구조의 변이 둘다를 초래하는 것으로 알려져 있다. 따 라서, 예를 들어, 심근경색증은 심장의 최대 심박 출량 및 졸중 용적을 감소시킨다. 또한, 영향받지 않은 심장 구역에서 콜라겐 형성의 증가 뿐만 아니라 간극에서 일어나는 DNA 합성의 자극은 심근경색증과 관련되어 있다.
예를 들어, 증가된 총 말초저항으로 인한 지속성 고혈압에 있어서 심장에 가해지는 증가된 스트레스 또는 피로의 결과로서 초래된 심비대증은 오랫동안 "고혈압"과 관련되어 있다. 만성 압력 과부하의 결과로서 비대하게 된 심실의 특징은 손상된 이완 수행능력이다 (Fouad et al., J. Am. Coll. Cardiol., 4: 1500-1506 (1984); Smith et al., J. Am. Coll. Cardiol., 5: 869-874 (1985)). 지속성 좌심실 이완은 정상 또는 최정상 수축 기능에도 불구하고 초기의 본질적인 고혈압에서 관찰된 바 있다 (Hartford et al., Hypertension, 6: 329-338 (1984)). 그러나, 혈압 수준과 심비대증 사이의 밀접한 대응관계는 없다. 항고혈압 치료법에 반응하는 좌심실 기능의 개선이 인간에서 보고되어 있다 하더라도, 이뇨제 (히드로클로로티아지드), β-차단제 (프로프라놀롤) 또는 칼슘 채널 차단제 (딜티아젬)로 다양하게 치료받은 환자는 이완 기능의 향상 없이 좌심실 비대증의 반전을 보인 바 있다 (Inouye et al., Am. J. Cardiol., 53: 1583-7 (1984)).
심비대증과 관련된 또다른 복합성 심장 질환은 "비대증성 심근병증"이다. 이 질환은 형태적, 기능적 및 임상적 특징의 높은 다양성 (Maron et al., N. Engl. J. Med., 316: 780-789 (1987); Spirito et al., N. Engl. J. Med., 320: 749-755 (1989); Louie and Edwards, Prog. Cardiovasc. Dis., 36: 275-308 (1994); Wigle et al., Circulation, 92: 1680-1692 (1995)), 및 모든 연령의 환자가 상기 질환을 앓는다는 사실에 의해 강조되는 이질성 (Spirito et al., N. Engl. J. Med., 336: 775-785 (1997))에 의해 특징지워진다. 비대증성 심근병증의 원인 인자도 다양하고 거의 알려져 있지 않다. 일반적으로, 근절 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이는 비대증성 심근병증과 관련되어 있다. 최근 데이타는 β-미요신 중쇄 돌연변이가 가족성 비대증성 심근병증 경우의 약 30 내지 40%의 원인일 수 있다고 제시한다 (Warkins et al., N. Engl. J. Med., 326: 1108-1114 (1992); Schwartz et al., Circulation, 91: 532-540 (1995); Marian and Roberts, Circulation, 92: 1336-1347 (1995); Thierfelder et al., Cell, 77: 701-712 (1994); Watkins et al., Nat. Gen., 11: 434-437 (1995)). β-미요신 중쇄 이외에 다른 위치의 유전자 돌연변이에는 심장 트로포닌 T. 알파 토포미요신, 심장 미요신 결합 단백질 C, 필수 미요신 경쇄 및 조절 미요신 경쇄가 포함된다 (Malik and Watkins. Curr. Opin. Cardiol., 12: 295-302 (1997) 참조).
판상부 "대동맥 협착증"은 오름대동맥의 협착에 의해 특징지워지는 유전성 혈관 질환이지만, 폐동맥을 포함한 다른 동맥도 영향받을 수 있다. 치료받지 않은 대동맥 협착증은 심장내 혈압을 상승시키고, 이 심장내 혈압 상승은 심근비대증을 초래해서 결국 심부전 및 사망에 이르게 한다. 이 질환의 발병기작은 완전히 이해되지 않았지만, 내측평활근의 비대증과 (아마도) 증식증이 이 질환의 두드러진 특징이다. 엘라스틴 유전자의 분자 변이체가 대동맥 협착증의 발달 및 발병기작에 관여하는 것으로 보고된 바 있다 (1997년 7월 22일 간행된 미국 특허 제5,650,282호).
"판역류"는 심장 판막 질환을 초래하는 심장 질환의 결과로서 일어난다. 류마티스열과 같은 다양한 질환은 판막구와는 관계없는 수축 또는 당기기를 초래할 수 있지만, 다른 질환은 심내막염, 심내막 또는 방실구 내막의 염증 및 심장 수술을 초래할 수 있다. 판막 협착증의 협착 또는 판막의 결손 폐쇄와 같은 결함은 심강의 혈액 축적, 또는 판막을 지나는 혈액의 역류를 초래한다. 지속성 판막 협착증 또는 지속성 판막 부전은 치료하지 않으면 심비대증, 및 심근과 관련된 손상을 초래할 수 있는데, 이러한 손상은 결국 판막 교체를 필요로 한다.
본 발명은 심비대증이 수반될 수 있거나 수반될 수 없는 이들 모든 질환, 및 기타 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료를 포함한다.
용어 "암", "암의" 및 "악성의"는 조절되지 않는 세포 증식이 전형적인 특징인 포유동물의 생리학적 상태를 말하거나 기술한다. 암의 예로는 선암종, 림프종, 모세포종, 흑색종, 육종 및 백혈병을 비롯한 암이 있으나, 여기에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 구체적인 예로는 편평 세포암, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 위장암, 호지킨 림프종 및 비호지킨 림프종, 췌장암, 교모세포종, 자궁암, 난소암, 간암 (예컨대, 간암종 및 간세포암), 방광암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막암, 침샘암, 신장암 (예컨대, 신세포암 및 윌름스 종양), 기저세포암, 흑색종, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 고환암, 식도암 및 다양한 유형의 머리와 목 암이 있다. 여기서 치료하기에 바람직한 암은 유방암, 결장암, 폐암, 흑색종, 난소암, 및 상기에 기재한 혈관종양을 수반하는 다른 암이다.
본원에서 사용한 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제하거나 방해하여 세포를 파괴시키는 물질을 말한다. 이 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, 131I, 125I, 90Y 및 186Re), 화학요법제, 및 세균, 진균, 식물 또는 동물 유래의 효소 활성 독소와 같은 독소 또는 그의 단편을 포함하는 것으로 한다.
"화학요법제"는 암의 치료에 유용한 화합물이다. 화학요법제의 예로는 알킬화제, 폴산 길항제, 핵산 대사의 항-대사물질, 항생제, 피리미딘 동족체, 5-플루오로우라실, 시스플라틴, 퓨린 뉴클레오시드, 아민, 아미노산, 트리아졸 뉴클레오시드 또는 코르티코스테로이드가 있다. 구체적인 예로는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실, 시토신 아라비노시드 ("Ara-C"), 시클로포스파미드, 티오테파, 부술판, 시톡신, 탁솔, 톡소테레, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파미드, 미토마이신 C, 미톡산트론, 빈크레이스틴, 빈오렐빈, 카르보플라틴, 테니포시드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 미토마이신, 에스페라미신 (미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 다른 관련 질소 겨자가 있다. 이 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 호르몬제, 예컨대 타모시펜 및 오나프리스톤도 포함된다.
본원에 사용된 "증식 억제제"는 시험관내 또는 생체내에서 세포, 예컨대 Wnt-과다발현 암세포의 증식을 억제하는 화합물 또는 조성물을 말한다. 따라서, 증식 억제제는 S기에 있는 종양세포의 비율을 상당히 감소시키는 것이다. 증식 억제제의 예로는 (S기 이외의 상태에서) 세포 주기 진행을 차단하는 물질, 예컨대 G1-기 정체 및 M-기 정체를 유도하는 물질이 있다. 전형적인 M-기 차단제로는 빈카스 (빈크리스틴 및 빈블라스틴), 탁솔 및 토포 II 억제제 (예컨대, 독소루비신, 다우노루비신, 에토포사이드 및 블레오마이신)가 있다. G1 정체를 유도하는 물질, 예컨대 타모시펜, 프레드니손, 다카르바진, 메클로르에타민, 시스플라틴, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실 및 아라-C와 같은 DNA 알킬화제는 S-기 정체도 유도한다. 자세한 정보는 문헌 (The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn and Israel, eds., Chapter 1, entitled "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs" by Murakami et al. (WB Saunders; Philadelphia, 1995), especially p.13)에서 찾을 수 있다. 추가적인 예로는 종양 괴사 인자 (TNF); 산성 또는 염기성 FGF 또는 간세포암 증식 인자 (FGF)의 혈관신생 활성을 억제 또는 중화할 수 있는 항체; 조직 인자, 단백질 C 또는 단백질 S (WO 91/01753, 1991년 2월 21일 공개)의 응고 활성을 억제하거나 중화할 수 있는 항체; 및 4D5 항체 (및 그의 기능적 등가물) (예를 들어, WO 92/22653)와 같이 HER2 수용체 (WO 89/06692)에 결합할 수 있는 항체가 있다.
"치료"는 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 발달을 예방하거나 상기 질환의 병리학을 바꾸기 위한 의도로 수행되는 것이다. 치료의 개념은 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 임의의 단계의 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 방지 (예방), 완화, 경감 및 치유를 포함한다. 따라서, "치료"는 치료적인 치료, 및 예방 또는 방지 처치 둘다를 말하는 것으로, 이 때 목적은 심혈관 질환, 내피세포 질환, 및 비대증과 같은 혈관신생 질환을 예방하거나 늦추는 것이다. 치료가 필요한 대상은 상기 질환에 걸리기 쉬운 대상 또는 상기 질환을 예방할 대상 뿐만 아니라 이미 상기 질환을 앓는 대상을 포함한다. 상기 질환은 특발성, 심장친화성 또는 근육친화성 원인을 비롯한 임의의 원인, 또는 심근경색증과 같은 허혈이나 허혈성 발작으로부터 발생할 수 있다.
"만성" 투여는 항-비대증성 효과와 같은 초기 효과를 장기간동안 유지하기 위해 급성 방식과는 반대인 연속 방식으로 약제(들)을 투여하는 것을 말한다.
치료 목적을 위한 "포유동물"은 인간, 가축 및 사육 동물, 동물원 동물, 스포츠 동물 및 애완 동물, 예컨대 개, 말, 고양이, 소, 양, 돼지 등을 포함한 포유동물로 분류된 임의의 동물을 말한다. 바람직하게는, 포유동물은 인간이다.
1종 이상의 추가 치료제와 "함께" 투여하는 것은 동시적인 투여 및 임의의 순서의 연속적인 투여를 포함한다.
어구 "심혈관계 약제, 내피세포계 약제 또는 혈관신생 관련 약제"는 일반적으로 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환을 치료하는 데 작용하는 임의의 약물을 말한다. 심혈관계 약제의 예로는 혈관 질환에 작용하는 인자인 혈압, 심박동수, 심수축성, 및 내피근과 평활근의 생물학을 조절하여 혈관 항상성을 촉진하는 약제가 있다. 이들의 구체적인 예로는 안지오텐신-II, 수용체 길항제; 엔도텔린 수용체 길항제, 예컨대, BOSENTAN (상표명) 및 MOXONODIN (상표명); 인터페론-감마 (INF-γ); 데스-아스파르테이트-안지오텐신 I; 혈전용해제, 예컨대 스트렙토키나제, 유로키나제, t-PA, 및 보다 긴 반감기 및 매우 높은 피브린 특이성을 나타내도록 특이적으로 디자인된 t-PA, TNK t-PA (T103N, N117Q, KHRR (296- 299)AAAA t-PA 변이체, Keyt et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 91, 3670-3674 (1994)); 디고시제닌 및 β-아드레날린성 수용체 차단제와 같은 수축촉진제 또는 고혈압제, 예컨대 프로프라노롤, 티모롤, 테르타롤올, 카르테오롤, 나도롤, 베타소롤, 펜부토롤, 아세토부토롤, 아테노롤, 메토프로롤 및 카르베디롤; 안지오텐신 전환 효소 (ACE) 억제제, 예컨대, 퀴나프릴, 캡토프릴, 에날아프릴, 라미프릴, 벤아제프릴, 포시노프릴 및 리시노프릴; 이뇨제, 예컨대, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 및 인다프아미드; 및 칼슘 채널 차단제, 예컨대, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀, 니카르디핀이 있다. 이 유형의 한 가지 바람직한 카테고리는 심비대증; 또는 고혈압, 대동맥 협착증 또는 심근경색증과 같은 심비대증을 발달시키는 생리학적 증상의 치료에 사용되는 치료제이다.
"혈관형성제" 및 "내피세포계 약제"는 혈관신생 및(또는) 내피세포 증식 또는, 적용가능하다면 혈관생성을 촉진하는 활성제이다. 이것은 증식 호르몬, 인슐린-유사 증식 인자-I (IGF-I), VEGF, VIGF, PDGF, 표피 증식 인자 (EGF), CTGF 및 그의 구성원, FGF, TGF-α및 TGF-β와 같은 창상 치유를 가속화하는 인자를 포함한다.
"혈관신생 억제제"는 혈관신생 또는 혈관생성을 억제하거나 암세포의 증식을 억제 또는 방해하는 활성제이다. 예로는 VEGF에 대한 항체와 같은, 상기 정의한 혈관형성제에 대한 항체 또는 다른 길항제가 있다. 추가적으로 이들은 세포치료제, 예컨대, 세포독성제, 화학요법제, 증식 억제제, 아폽토시스제, 및 암을 치료하 는 다른 약제 (예컨대, 항-HER-2, 항-CD20, 다른 생물활성제 및 유기 화학제)를 포함한다.
제약학적 의미에서, 본 발명의 내용에서 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체와 같은 "치료 유효량"의 활성제는 포유동물의 심혈관 질환, 내피세포 질환 또는 혈관신생 질환의 치료에 유효한 양을 말하고 실험적으로 결정할 수 있다.
본원에 사용된 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 또는 항-PRO 항체와 같은 "유효량"의 활성제는 상기 목적을 수행하기에 유효한 양을 말하는데, 여기서 상기 양은 원하는 효과를 얻기 위해 실험적으로 결정할 수 있다.
"PRO 폴리펩티드" 및 "PRO"란 용어는 본 명세서에 사용된 바와 같이 바로 뒤에 숫자가 붙은 경우 다양한 폴리펩티드를 말하는데, 완전한 명칭(즉, PRO/숫자)은 본 명세서에 기재된 특정 폴리펩티드 서열을 말한다. 본 명세서에 사용된 "PRO/숫자 폴리펩티드" 및 "PRO/숫자" (여기서, 숫자는 실질적인 숫자로 표시됨)는 천연 서열 폴리펩티드 및 폴리펩티드 변이체 (본 명세서에 추가로 정의됨)를 포함하는 용어이다. 본 명세서에 기재된 PRO 폴리펩티드는 인간 조직 또는 다른 출처와 같은 다양한 출처로부터 단리될 수 있거나 재조합 또는 합성에 의해 제조될 수 있다.
"천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 자연으로부터 유도된 상응하는 PRO 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 이러한 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 자연으로부터 단리할 수 있거나 재조합 또는 합성 방법으로 제조할 수 있다. 용어 "천연 서열 PRO 폴리펩티드"는 구체적으로는 자연발생적으로 특정 PRO 폴리펩티드의 말단이 절단된 (truncated) 형태 또는 분비되는 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 이러한 폴리펩티드의 자연발생적 변이체 형태 (예컨대, 대체 스프라이싱된 형태) 및 자연발생적 대립 변이체를 포함한다. 본 발명의 여러 실시양태에서, 본 명세서에서 기재된 천연 서열 PRO 폴리펩티드는 수반하는 도면에 나타낸 전장 아미노산 서열을 포함하는 성숙 또는 전장 천연 서열 폴리펩티드이다. 개시 및 중지 코돈은 도면에서 굵은 글씨 및 밑줄로 표시된다. 그러나, 본원에서 수반하는 도면에 개시된 PRO 폴리펩티드는 도면에서 아미노산 위치 1로 지칭되는 메티오닌 잔기로 시작하는 것으로 나타나 있지만, 도면에서 아미노산 위치 1로부터 위쪽 또는 아래쪽 부분에 위치한 다른 메티오닌 잔기가 PRO 폴리펩티드의 출발 아미노산 잔기로 사용될 수 있다.
PRO 폴리펩티드 "세포외 도메인" 또는 "ECD"란 본질적으로 막횡단 또는 세포질 도메인이 없는 PRO 폴리펩티드의 형태를 의미한다. PRO 폴리펩티드 ECD는 통상 막횡단 및(또는) 세포질 도메인을 1% 미만으로 포함하며, 바람직하게는 상기 도메인들을 0.5% 미만으로 포함한다. 본 발명의 PRO 폴리펩티드에서 확인된 모든 막횡단 도메인은 당업계에서 소수성 도메인 유형을 밝히는 데 통상적으로 사용되는 기준에 따라 확인된 것임을 이해해야 할 것이다. 막횡단 도메인의 정확한 경계선은 다를 수 있지만, 대부분은 본원에서 처음 확인된 도메인의 말단에서 약 5개 아미노산내에 존재한다. 따라서, PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인은 임의로 실시예 및 상세한 설명에서 확인된 막횡단 도메인/세포외 도메인의 각 경계면에서 약 5개 이하의 아미노산을 포함할 수 있고, 결합된 신호 펩티드가 있거나 없는 이러한 폴리 펩티드, 및 이들을 코딩하는 핵산은 본 발명에 포함된다.
본원에 개시된 다양한 PRO 폴리펩티드의 "신호 펩티드"의 대략적인 위치는 본 명세서 및(또는) 수반하는 도면에 나타나 있다. 그러나, 신호 펩티드의 C-말단 경계는 다양할 수 있지만, 대부분 본원에서 처음 확인된 신호 펩티드 C-말단의 각 경계면에는 약 5개 이하의 아미노산이 존재할 수 있음을 알아야 하는데, 여기서 신호 펩티드의 C-말단 경계는 당업계에서 아미노산 서열 요소의 타입을 확인하는 데 통상적으로 이용되는 기준에 따라 확인될 수 있다 (예를 들어, Nielsen et al., Prot. Eng. 10: 1-6 (1997) 및 von Heinje et al., Nucl. Acids. Res. 14: 4683-4690 (1986)). 게다가, 일부 경우에는 분비 폴리펩티드의 신호 서열의 절단이 전체적으로 통일성이 없어서 하나 이상의 분비 폴리펩티드를 생성시킨다는 것도 인지해야 한다. 신호 펩티드가 본원에서 확인된 신호 펩티드의 C-말단의 각 경계면에 있는 약 5개 이하의 아미노산내에서 절단된 경우, 이들 성숙 폴리펩티드, 및 이들을 코딩하는 폴리뉴클레오티드도 본 발명에 포함된다.
"PRO 폴리펩티드 변이체"는 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과 약 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는, 앞서 또는 뒤에 정의된 활성 PRO 폴리펩티드를 의미한다. 이러한 PRO 폴리펩티드 변이체로는 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기가 전장 천연 아미노산 서열의 N 말단 또는 C 말단에 부가되거나 결실된 PRO 폴리 펩티드가 있다. 통상, PRO 폴리펩티드 변이체는 본원에서 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 있거나 없는 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 임의의 다른 단편과의 아미노산 서열 동일성이 약 80% 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90% 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95% 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상이다. 통상적으로, PRO 변이체 폴리펩티드는 그 길이가 약 10개 이상의 아미노산, 흔히 약 20개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 30개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 40개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 50개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 60개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 70 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 80 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 90 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 100 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 150 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 200 개 이상의 아미노산, 더 흔히는 약 300 개 이상의 아미노산 또는 그 이상이다.
아래에 나타낸 바와 같이, 표 1은 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램의 완 전한 원시 코드를 제공한다. 이 원시 코드는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 제공하는 UNIX 작동계 상에서 사용하기 위해 통상적으로 편집될 수 있다.
추가로, 표 2A-2D는 ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램을 이용하여 % 아미노산 서열 동일성 (표 2A-2B) 및 % 핵산 서열 동일성 (표 2C-2D)을 측정하기 위한 하기 기재된 방법을 사용하는 가설적인 실시예를 도시하며, 여기서, "PRO"는 관심있는 가정의 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내고, "비교 단백질"은 관심있는 "PRO" 폴리펩티드를 비교할 폴리펩티드의 아미노산 서열을 나타내며, "PRO-DNA"는 관심있는 가정의 PRO-코딩 핵산 서열을 나타내며, "비교 DNA"는 관심있는 "PRO-DNA" 핵산 분자를 비교할 핵산 분자의 뉴클레오티드 서열을 나타내며, "X", "Y" 및 "Z"는 각각 상이한 가정의 아미노산 잔기를 나타내며, "N", "L" 및 "V"는 각각 상이한 가정의 뉴클레오티드를 나타낸다.
<표 1>
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<표 2A>
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<표 2B>
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<표 2C>
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<표 2D>
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본원에서 밝혀진 PRO 폴리펩티드 서열에 대한 "아미노산 서열 동일성 (%)"은 특정 PRO 폴리펩티드 서열과 후보 서열을 정렬하고, 필요한 경우 서열 동일성 퍼센트의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 어떠한 보존적 치환도 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 상태에서 특정 PRO 폴리펩티드 서열의 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열의 아미노산 잔기의 비율로서 정의된다. 아미노산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당업계의 숙련가는 비교되는 서열들의 전 체 길이에 걸쳐 최대로 정렬시키기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기에 적합한 파라미터를 정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 아미노산 서열 동일성 값(%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수도 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 도 248A-Q에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 도 248A-Q에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 다양하지 않다.
본원의 목적상 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않 는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 이 방법을 이용한 아미노산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2A-2B는 "PRO"로 지칭하는 아미노산 서열에 대한 "비교 단백질"로 지칭하는 아미노산 서열의 아미노산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 구체적으로 언급하지 않는 한, 본원에 이용된 모든 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 상기 기재된 바와 같이 ALIGN-2 컴퓨터 프로그램을 이용하여 얻는다. 그러나, 아미노산 서열 동일성 값 (%)은 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402 (1997)을 이용하여 얻을 수도 있다. 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 아미노산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 아미노산 서열 동일성 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 아미노산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 NCBI-BLAST2 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 아미노산 서열 동일성 (%)은 A에 대한 B의 아미노산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
아미노산 서열 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))를 이용하여 결정할 수도 있다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해 아미노산 서열 동일성 값(%)은, 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 원하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열과 비교되는 원하는 아미노산 서열 (즉, 원하는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 아미노산 잔기의 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 원하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 총 잔기수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 아미노산 서열 B와 80% 이상의 아미노산 서열 동일성을 갖는 아미노산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 아미노산 서열 A는 비교하는 원하는 아미노산 서열이고 아미노산 서열 B는 원하는 PRO 폴리펩티드의 아미노산 서열이다.
"PRO 변이체 폴리뉴클레오티드" 또는 "PRO 변이체 핵산 서열"은 아래 정의된 바와 같은 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자로서, 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리핍티드 서열, 본원에 개시된 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 여타의 다른 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상인 핵산 분자이다. 보통 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 본원에 개시된 전장 천연 서열 PRO 폴리펩티드 서열, 본원에 개시된 바와 같이 신호 펩티드가 없는 전장 천연 서열 PRO 폴리핍티드 서열, 본원에 개시된 PRO 폴리펩티드의 세포외 도메인, 또는 본원에 개시된 전장 PRO 폴리펩티드 서열의 여타의 다른 단편 중 어느 하나를 코딩하는 핵산 서열과의 핵산 서열 동일성이 약 80 % 이상, 바람직하게는 약 81 % 이상, 더 바람직하게는 약 82 % 이상, 더 바람직하게는 약 83 % 이상, 더 바람직하게는 약 84 % 이상, 더 바람직하게는 약 85 % 이상, 더 바람직하게는 약 86 % 이상, 더 바람직하게는 약 87 % 이상, 더 바람직하게는 약 88 % 이상, 더 바람직하게는 약 89 % 이상, 더 바람직하게는 약 90 % 이상, 더 바람직하게는 약 91 % 이상, 더 바람직하게는 약 92 % 이상, 더 바람직하게는 약 93 % 이상, 더 바람직하게는 약 94 % 이상, 더 바람직하게는 약 95 % 이상, 더 바람직하게는 약 96 % 이상, 더 바람직하게는 약 97 % 이상, 더 바람직하게는 약 98 % 이상, 가장 바람직하게는 약 99 % 이상일 것이다. 변이체들은 천연 뉴클레오티드 서열 전체를 포괄하지는 않는다.
보통 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 그 길이가 약 30개 이상의 뉴클레오티 드, 더 흔히는 약 60 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 90 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 120 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 150 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 180 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 210 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 240 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 270 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 300 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 450 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 600 개 이상의 뉴클레오티드, 더 흔히는 약 900 개 이상의 뉴클레오티드 또는 그 이상이다.
본원에서 확인된 PRO 코딩 핵산 서열과 관련하여 "핵산 서열 동일성 (%)"은 특정 PRO 핵산 서열과 후보 서열을 정렬시키고, 필요한 경우 서열 동일성의 최대치를 얻기 위해 갭을 도입한 후 특정 PRO 핵산 서열의 뉴클레오티드와 동일한, 후보 서열의 뉴클레오티드의 비율로서 정의된다. 핵산 서열 동일성 (%)을 측정하기 위한 정렬은 당업계에 공지된 다양한 방법, 예를 들어, BLAST, BLAST-2, ALIGN 또는 Megalign (DNASTAR) 소프트웨어와 같은 쉽게 구할 수 있는 컴퓨터 소프트웨어를 사용하여 달성할 수 있다. 당분야에 숙련된 자들은 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하는 데 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여 정렬을 측정하기 위한 적당한 파라미터를 결정할 수 있다. 그러나, 본원의 목적상 핵산 서열 동일성 값 (%)은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수도 있는데, 상기 ALIGN-2 프로그램에 대한 완전한 원시 코드는 하기 표 1에 기재되어 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 제넨텍, 인크사가 개발하였으며, 표 1에 나타낸 원시 코드는 미국 저작권청 (20559 워싱톤 D.C.에 소재)의 사용자 문서로 보관되어 있는데, 상기 코드는 미국 저작권 등록 제TXU510087호 하에 등록되어 있다. ALIGN-2 프로그램은 제넨텍, 인크사 (캘리포니아주 사우스 샌 프란시스코 소재)를 통해 쉽게 구할 수 있거나, 표 1에 기재된 원시 코드로부터 편집될 수 있다. ALIGN-2 프로그램은 UNIX 작동계, 바람직하게는 디지탈 UNIX V4.0D에서 편집되어 이용될 수 있다. 모든 서열 비교 파라미터는 ALIGN-2 프로그램으로 설정하고 다양하지 않다.
본원의 목적상, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
W/Z ×100
여기서, W는 C와 D의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다. 핵산 서열 동일성 계산의 예로서, 표 2C-2D는 "PRO-DNA"로 지칭하는 핵산 서열에 대한 "비교 DNA"로 지칭하는 핵산 서열의 핵산 서열 동일성 (%)을 계산하는 방법을 나타낸다.
달리 구체적으로 명시하지 않는 한, 핵산 서열 동일성 (%)은 하기 기재된 서열 비교 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 얻을 수 있다. 그러나, 핵산 서열 동일성 (%)은 하기 기재된 서열 비교 프로그램 NCBI-BLAST2를 이용하여 계산할 수도 있다 (Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997)). 상기 NCBI-BLAST2 서열 비교 프로그램은 웹 사이트 (http://www.ncbi.nlm.nih.gov.)로부터 다운로드 받을 수 있다. NCBI-BLAST2는 여러 가지 검색 파라미터를 이용하는데, 이러한 모든 검색 파라미터는 예를 들어, 언마스크 = 예, 가닥 = 모두, 기대 발생 = 10, 최소 저복합성 길이 = 15/5, 다중-통과 e-값 = 0.01, 다중-통과에 대한 상수 = 25, 최종 갭 정렬에 대한 드롭오프 = 25 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62를 포함하는 디폴트값으로 설정된다.
NCBI-BLAST2가 핵산 서열 비교에 사용되는 경우, 주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 주어진 핵산 서열 C의 핵산 서열 동일성 (%)(주어진 핵산 서열 D에, D와, 또는 D에 대한 일정한 핵산 서열 동일성 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 핵산 서열 C로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
W/Z ×100
여기서, W는 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 NCBI-BLAST2에 의해 동일하게 매치되는 것으로 기록되는 뉴클레오티드의 수이고, Z는 D에서 뉴클레오티드의 총 수이다. 핵산 서열 C의 길이가 핵산 서열 D의 길이와 같지 않는 경우, D에 대한 C의 핵산 서열 동일성 (%)은 C에 대한 D의 핵산 서열 동일성 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
추가로, 핵산 서열 동일성 값(%)은 WU-BLAST-2 컴퓨터 프로그램 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-80 (1996))를 이용하여 결정할 수도 있 다. WU-BLAST-2 검색 파라미터 대부분은 디폴트값으로 설정된다. 디폴트값으로 설정하지 않은 것들 즉, 조정가능한 파라미터는 다음 값으로 설정된다: 오버랩 스팬 = 1, 오버랩 분획 = 0.125, 워드 한계 (T) = 11, 및 점수 매트릭스 = BLOSUM62. 본원의 목적을 달성하기 위해 핵산 서열 동일성 값(%)은, 천연 PRO 폴리펩티드로부터 유도된 서열을 갖는 원하는 PRO 폴리펩티드의 핵산 서열과 비교되는 원하는 핵산 서열 (즉, 원하는 PRO 폴리펩티드와 비교되는 서열로서 PRO 변이체 폴리펩티드일 수 있음)과의 사이에 매치되는 동일한 뉴클레오티드 수를 WU-BLAST-2로 결정하여 얻고, 이를 원하는 PRO 폴리펩티드 코딩 핵산 분자의 총 뉴클레오티드 수로 나누어 결정한다. 예를 들어, 핵산 서열 B와 80% 이상의 핵산 서열 동일성을 갖는 핵산 서열 A를 포함하는 폴리펩티드"라는 말에서, 핵산 서열 A는 비교하는 원하는 핵산 서열이고 핵산 서열 B는 원하는 PRO 폴리펩티드의 핵산 서열이다.
다른 실시양태에서 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드는 바람직하게는 엄격한 혼성화 및 세척 조건하에서 도 2 (서열 2), 도 4 (서열 4), 도 6 (서열 6), 도 8 (서열 8), 도 10 (서열 10), 도 12 (서열 12), 도 14 (서열 14), 도 16 (서열 16), 도 18 (서열 18), 도 20 (서열 20), 도 22 (서열 22), 도 24 (서열 24), 도 26 (서열 26), 도 28 (서열 28), 도 30 (서열 30) 및 도 32 (서열 32) 각각에 나타낸 전장 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 혼성화할 수 있는 활성 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자이다. PRO 변이체 폴리펩티드는 PRO 변이체 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 것일 수 있다.
상기한 바와 같이 수행되는 서열 비교의 내용에서 "양성"이란 용어는 동일하 지는 않으나 성질이 유사한 비교되는 서열의 아미노산 잔기를 의미한다. 원하는 아미노산 잔기에 대해 양성값을 기록하는 아미노산 잔기는 원하는 아미노산 잔기와 동일한 것이거나 원하는 아미노산 잔기의 바람직한 치환체 (하기 표 3에 정의된 바와 같음)이다.
본원의 목적상, 주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 주어진 아미노산 서열 A의 양성값 (%)(주어진 아미노산 서열 B에, B와, 또는 B에 대한 일정한 양성값 (%)을 갖거나 포함하는 주어진 아미노산 서열 A로 달리 표현할 수 있음)은 하기와 같이 계산한다.
X/Y ×100
여기서, X는 A와 B의 프로그램 정렬에서 서열 정렬 프로그램 ALIGN-2에 의해 상기에서 정의된 양성값을 기록하는 아미노산 잔기의 수이고, Y는 B에서 아미노산 잔기의 총 수이다. 아미노산 서열 A의 길이가 아미노산 서열 B의 길이와 같지 않는 경우, B에 대한 A의 양성값 (%)은 A에 대한 B의 양성값 (%)과 같지 않음을 인지해야 할 것이다.
본원에 개시된 다양한 폴리펩티드를 기술하기 위해 사용된 "단리된"은 폴리펩티드가 확인되고, 그 자연 환경 요소로부터 분리 및(또는) 회수되었음을 의미한다. 폴리펩티드의 자연 환경의 오염 요소는 이 폴리펩티드의 진단 또는 치료적 사용을 일반적으로 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백질성 또는 비단백질성 용질 등이 있을 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드는 (1) 스피닝컵 서열분석기를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 서열의 15개 이상의 잔기를 얻기에 충분한 정도로 정제되거나, 또는 (2) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 비환원 또는 환원 조건 하에 SDS-PAGE에서 하나의 밴드만 나타날 정도로 정제될 수 있다. PRO 폴리펩티드 자연 환경의 요소가 하나 이상 존재하지 않을 것이기 때문에 단리된 폴리펩티드는 재조합 세포 내에 존재하는 폴리펩티드를 포함한다. 그러나, 통상 단리된 폴리펩티드는 하나 이상의 정제 단계에 의해 얻어질 것이다.
PRO 폴리펩티드를 코딩하는 "단리된" 핵산 또는 항-PRO 항체를 코딩하는 "단리된" 핵산 분자란 PRO-코딩 핵산의 천연 출처 또는 항-PRO-코딩 핵산의 천연 출처에서 통상적으로 관련되는 하나 이상의 오염 핵산 분자로부터 확인 및 분리된 핵산 분자라는 의미이다. 바람직하게는, 단리된 핵산은 천연적으로 관련되어 있는 모든 성분과의 결합으로부터 자유로운 상태이다. 단리된 PRO-코딩 핵산 분자 또는 단리된 항-PRO-코딩 핵산 분자는 자연에서 발견되는 형태 또는 상태와는 다른 상태이다. 따라서, 단리된 핵산 분자는 천연 세포에 존재하는 PRO-코딩 핵산 분자 또는 항-PRO-코딩 핵산 분자와 구별된다. 그러나, 예를 들어, 상기 핵산 분자가 천연 세포와 상이한 염색체 위치에 존재하는 경우, PRO 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 핵산 분자 또는 항-PRO 항체를 코딩하는 단리된 핵산 분자에는 통상적으로 PRO 폴리펩티드 또는 항-PRO 항체를 발현하는 세포에 함유된 PRO-핵산 분자 또는 항-PRO핵산 분자가 포함된다.
용어 "조절 서열"이란 특정 숙주 유기체에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필요한 DNA 서열이다. 원핵생물에 적절한 조절 서열로는 예컨데 프로모 터, 경우에 따라 오퍼레이터 서열, 및 리보솜 결합 부위를 들 수 있다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 신호 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.
핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 "작동가능하게 연결"된다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)의 DNA는 해당 폴리펩티드가 분비되기 전의 형태인 전단백질로서 발현되는 경우 그 폴리펩티드의 DNA에 작동가능하게 연결되고, 프로모터 또는 인핸서는 폴리펩티드 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되며, 리보솜 결합 부위는 번역을 촉진하도록 배치될 때 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로 "작동가능하게 연결된"은 연결될 DNA 서열들이 인접하여 위치함을 의미하며, 분비 리더의 경우 인접하여 위치할 뿐만 아니라 동일한 리딩 프레임 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나 인핸서는 인접하여 위치할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션에 의해 달성된다. 이러한 부위가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 통상적인 관행에 따라 사용한다.
혼성화 반응의 "엄격도"는 당업자가 용이하게 결정할 수 있으며, 일반적으로 프로브 길이, 세척 온도, 염 농도에 따라 달라지는 실험적 계산값이다. 일반적으로 보다 긴 프로브일수록 적절한 어닐링에 보다 높은 온도를 필요로하며, 보다 짧은 프로브일수록 보다 낮은 온도를 필요로 한다. 혼성화는 일반적으로 상보적 가닥이 자신들의 용융 온도보다 낮은 환경에 존재할 때 재어닐링되는 변성된 DNA의 능력에 따라 달라진다. 프로브와 혼성화가능한 서열 사이의 원하는 상동성의 정도가 높을수록, 사용할 수 있는 상대적인 온도가 높아진다. 따라서, 상대적 온도보 다 높아질수록 반응 조건은 더욱 엄격해지는 반면, 상대적 온도가 낮을수록 반응조건은 덜 엄격해진다. 혼성화 반응의 엄격도와 관련한 더 자세한 정보 및 설명은 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995))을 참조한다.
본원에서 정의되는 "엄격 조건" 또는 "엄격도가 높은 조건"이란 (1) 세척시 이온 세기가 낮고 온도가 높은 조건, 예를 들면 50 ℃에서 0.015 M 염화나트륨/0.0015 M 시트르산나트륨/0.1 % 소듐 도데실 술페이트를 사용하는 조건, 또는 (2) 혼성화시에 포름아미드, 예를 들어, 42 ℃, 750 mM 염화나트륨, 75 mM 시트르산나트륨이 함유된 50 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.5)/0.1 % 소혈청 알부민/0.1 % 피콜/0.1 % 폴리비닐피롤리돈으로 제조한 50 % (부피/부피) 포름아미드와 같은 변성제를 사용하는 조건, (3) 50 % 포름아미드, 5 x SSC (0.75 M NaCl, 0.075 M 시트르산나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 6.8), 0.1 % 피로인산 나트륨, 5 x Denhardt's 용액, 초음파처리된 연어 정자 DNA (50 ㎍/ml), 0.1 % SDS, 및 10 % 덱스트란 술페이트를 42 ℃에서 사용하고, 42 ℃에서 0.2 x SSC (염화나트륨/시트르산나트륨), 그리고 55 ℃에서 50 % 포름아미드로 세척하며, 55 ℃에서 EDTA가 함유된 0.1 x SSC를 이용한 고엄격 세척을 수행하는 것이다.
"중간정도의 엄격 조건"이란 문헌 (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press 1989)에 기재된 바와 같고, 상기한 것보다 엄격성이 낮은 혼성화 조건 (예를 들어, 온도, 이온 세기 및 %SDS)의 이용을 말한다. 중간정도의 엄격 조건의 예는 20% 포름아미드, 5 x SSC (150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산삼나트륨), 50 mM 인산나트륨 (pH 7.6), 5 x Denhardt 용액, 10% 덱스트란 술페이트 및 20 mg/ml의 잘린 연어 정액 변성 DNA를 포함하는 용액 중에서 37℃로 밤새 인큐베이션한 후 필터를 약 37 내지 50℃에서 1 x SSC로 세척하는 조건이다. 당업계의 숙련가는 프로브 길이 등과 같은 인자에 맞추기 위해 필요한 온도, 이온 세기 등을 조절하는 방법을 잘 알 것이다.
본원에 사용된 "에피토프 태그를 붙인"란 용어는 "태그 폴리펩티드"에 결합된 PRO 폴리펩티드를 포함하는 키메라 폴리펩티드를 지칭한다. "태그 폴리펩티드"가 만들어질 수 있을 정도의 에피토프를 제공하기에 충분한 잔기를 갖지만 결합되는 PRO 폴리펩티드의 활성을 방해하지 않을 정도로 충분히 짧다. 태그 폴리펩티드는 아주 독특해서 자신에 대한 항체가 다른 에피토프와는 실질적으로 가교반응하지 않는 것이 바람직하다. 적절한 태그 폴리펩티드는 일반적으로 6개 이상의 아미노산 잔기를 가지며, 통상 약 8 내지 50개의 아미노산 잔기를 갖는다 (바람직하게는 약 10 내지 20개의 잔기).
PRO 변이체의 내용에서 "활성의" 또는 "활성"은 천연 또는 자연발생 PRO 폴리펩티드의 생물학적 및(또는) 면역학적 활성을 보유하는 PRO 단백질의 형태(들)을 말한다.
본원에 개시된 스크리닝 검정법으로 확인할 수 있는 PRO 폴리펩티드에 대한 길항작용을 할 수 있는 분자 (예컨대, 유기 또는 무기 소분자, 펩티드 등)의 내용에서 "생물학적 활성"이란 본원에서 확인한 PRO 폴리펩티드와 결합하거나 결합체를 형성할 수 있거나, 혹은 달리 말하면 다른 세포 단백질과 PRO 폴리펩티드의 상호작 용을 방해하거나 아니면 PRO 폴리펩티드의 전사 또는 번역을 억제하는 분자의 능력을 말하는 데 사용된다. 특히, 바람직한 생물학적 활성은 동맥, 모세혈관, 정맥 및(또는) 림프관의 질환 및 암 뿐만 아니라 당뇨병과 같은, 혈관에 영향을 미치는 전신 질환에 작용하는 심비대증성 활성을 포함한다.
용어 "길항제"는 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성, 예를 들어, 적용가능하다면 분열촉진 활성 또는 혈관신생 활성 중 하나 이상의 활성을 부분적으로 또는 완전히 차단, 억제 또는 중화시키는 모든 분자를 통칭한다. PRO 폴리펩티드의 길항제는 세포 수용체와 PRO 폴리펩티드의 결합을 방해함으로써, PRO 폴리펩티드에 의해 활성화되는 세포를 무능력화시키거나 살해함으로써, 또는 세포 수용체와 PRO 폴리펩티드의 결합 후 혈관 내피세포 활성화를 방해함으로써 작용할 수 있다. PRO 폴리펩티드 길항제에 의한 이러한 모든 활성은 본 발명의 목적상 동일한 것으로 간주될 것이다. 상기 길항제는 PRO 폴리펩티드의 분열촉진 활성, 혈관신생 활성 또는 기타 생물학적 활성을 억제하므로, 예를 들어, 종양 및 특히 고형 악성 종양, 류마티스성 관절염, 건선, 죽상경화증, 당뇨병성 망막병증 및 기타 망막병증, 수정체후 섬유증식증, 연령-관련 황반 퇴화증, 신생혈관 녹내장, 혈관종, 갑상선 과다증식증 (그레이브스병을 포함함), 각막 및 기타 조직 이식, 및 만성 염증을 포함하여 원하지 않는 과도한 혈관신생이 특징인 질환 또는 질환의 치료에 유용하다. 또한, 길항제는 원하지 않는 과도한 혈관 투과성이 특징인 질환 또는 질환, 예컨대 뇌종양과 관련된 부종, 악성과 관련된 복수, 메이그스 증후군, 폐 염증, 신증후군, 심낭유출 (예를 들어, 심낭염과 관련된 것) 및 흉막유출의 치료에 유용하다. 이와 비슷하게 용어 "아고니스트"도 가장 넓은 의미로 사용되며, 본원에 개시된 천연 PRO 폴리펩티드의 생물학적 활성을 흉내내는 모든 분자를 통칭한다. 적절한 아고니스트 또는 길항제 분자로는 구체적으로 아고니스트 또는 길항제의 항체 또는 항체의 단편, 천연 PRO 폴리펩티드의 단편 또는 아미노산 서열 변이체, 펩티드, 작은 유기분자 등을 들 수 있다.
"소분자"는 본원에서 분자량이 약 500 달톤 미만인 것으로 정의된다.
본원에 사용된 용어 "PRO 폴리펩티드 수용체"란 PRO 폴리펩티드에 대한 세포 수용체, 통상적으로 혈관 내피세포 상에서 발견되는 세포-표면 수용체 뿐만 아니라 PRO 폴리펩티드에 결합하는 능력을 보유하는 그의 변이체를 말한다.
"항체" (Ab) 및 "이뮤노글로불린" (Ig)은 구조적 특징이 동일한 당단백질이다. 항체는 특정 항체에 대한 결합 특이성을 나타내지만, 이뮤노글로불린은 항체, 및 항원 특이성이 없는 기타 항체-유사 분자 둘다를 포함한다. 예를 들어, 항원 특이성이 없는 항체-유사 분자인 폴리펩티드는 림프계에서 낮은 농도로 생산되고 골수종에서 높은 농도로 생산된다. 용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 온전한 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 2종 이상의 온전한 항체로부터 형성된 다중특이적 항체 (예컨대, 이중특이적 항체), 및 항체 단편 (원하는 생물학적 활성을 나타내는 경우)을 포괄하지만, 여기에 제한되지 않는다.
"천연 항체" 및 "천연 이뮤노글로불린"은 대개 2개의 동일한 경쇄 (L) 및 2개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된, 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머 당단백질이다. 각 경쇄는 1개의 공유결합성 이황화 결합에 의해 중쇄에 결합되어 있지만, 이황화 결합의 수는 다양한 이뮤노글로불린 동종형의 중쇄 사이에 다양하다. 각 중쇄 및 경쇄는 규칙적으로 공간을 두고 떨어져 있는 쇄내 이황화 가교도 갖는다. 각 중쇄의 한 말단에는 많은 불변 도메인 다음의 가변 도메인 (VH)이 있다. 각 경쇄의 한 쪽 말단에는 가변 도메인 (VL)이 있고 다른 쪽 말단에는 불변 도메인이 있는데, 경쇄의 불변 도메인은 중쇄의 제1 불변 도메인과 정렬되고, 경쇄 가변 도메인은 중쇄의 가변 도메인과 정렬된다. 특정 아미노산 잔기가 경쇄 가변 도메인과 중쇄 가변 도메인 사이에 접점을 형성하는 것으로 생각된다.
용어 "가변"이란 가변 도메인의 일부가 항체들 사이에 서열상 광범위하게 상이하여 특정 항원과 각 특정 항체의 결합, 및 특정 항원에 대한 각 특정 항체의 특이성에 사용된다는 것을 말한다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 도메인 전체를 통해 골고루 분포되어 있지는 않다. 가변은 경쇄 및 중쇄 가변 도메인 둘다에서 상보성-결정 영역 (CDR) 또는 과다가변 영역이라고 불리는 세 개의 절편에 집중되어 있다. 가변 도메인의 보다 높은 보존부는 골격 영역 (FR)이라고 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄 각각의 가변 도메인은 3개의 CDR에 의해 연결된, β-시트 구조를 주로 취하는 4개의 FR 영역을 포함는데, 여기서 상기 3개의 CDR은 β-시트 구조를 연결하는 루프를 형성하고, 몇몇 경우에는 β-시크 구조의 일부를 형성한다. 각 쇄의 CDR은 FR 영역에 의해 아주 가깝게 모여 있고, 다른 쇄의 CDR과 함께 항체의 항원-결합 부위의 형성에 기여한다 (Kabat et al., NIH Publ. No. 91-3242, Vol. I, pages 647-669 (1991) 참조). 불변 도메인은 항체를 항원에 결합시키는 데 직접 관여하지 않지만, 항체-의존성 세포 독성에 있어서 항체의 참여와 같은 다양한 이펙터 기능을 나타낸다.
"항체 단편"은 온전한 항체의 일부, 바람직하게는 온전한 항체의 항원 결합 영역 또는 가변 영역을 포함한다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F(ab')2 및 Fv 단편; 디아바디; 선형 항체 (Zapata et al., Protein Eng., 8 (10):1057-1062 (1995); 단쇄 항체 분자; 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이성 항체 등이 있다.
항체를 파파인 (Papain) 분해하면 2개의 동일한 항원 결합 단편, 즉 단일 항원 결합 부위가 있는 각 "Fab" 단편, 및 쉽게 결정화되는 능력을 반영하여 이름 붙여진 나머지 "Fc" 단편이 생성된다. 펩신을 처리하면, 2개의 항원 결합 부위가 있으며 여전히 항원에 교차결합할 수 있는 F(ab')2 단편이 생성된다.
"Fv"는 완전한 항원 인식 및 항원 결합 부위를 포함하는 최소 항체 단편이다. 이 영역은 단단하게 비공유결합된 하나의 중쇄 가변 도메인과 하나의 경쇄 가변 도메인으로 이루어진 이량체로 구성된다. 이 구조에서 각 가변 도메인의 CDR 3개는 상호작용하여 VH-VL 이량체의 표면에 항원 결합 부위를 형성한다. 결론적으로 보면, 6개의 CDR이 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 단지 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반) 조차도 전체 결합 부위보다 친화성은 낮지만 항원을 인식하여 항원에 결합하는 능력을 갖는다.
또한, Fab 단편은 경쇄의 불변 도메인 및 중쇄의 제1 불변 도메인(CH1)을 함 유한다. Fab' 단편은 몇 개의 잔기가 항체 힌지 (Hinge) 영역으로부터 유래한 하나 이상의 시스테인을 포함하는 중쇄 CH1 도메인의 카르복시 말단에 첨가되었다는 점에서 Fab 단편과 상이하다. 본원에서 Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 유리 티올기를 보유하는 Fab'를 말한다. F(ab')2 항체 단편은 본래 Fab' 단편들 사이에 힌지 시스테인이 있는 몇쌍의 Fab' 단편으로서 생성되었다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링도 공지되어 있다.
임의의 척추동물종으로부터 유래한 항체(이뮤노글로불린)의 "경쇄"는 항체의 불변 도메인의 아미노산 서열을 기초로 하여 카파(κ) 및 람다(λ)로 불리는 2개의 명백하게 상이한 타입 중의 하나로 분류될 수 있다.
이뮤노글로불린은 그의 중쇄의 불변 도메인의 아미노산 서열에 따라 다양한 클래스로 분류될 수 있다. 이뮤노글로불린에는 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM의 5개 주요 클래스가 있고, 이들 중 몇 개는 서브클래스(이소타입), 예를 들어, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA 및 IgA2로 더 분류될 수 있다. 다양한 이뮤노글로불린류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각 α, δ, ε, γ 및 μ라 불린다. 다양한 이뮤노글로불린류의 서브유닛 구조 및 3차원적 구조는 잘 공지되어 있다.
본원에서 사용되는 용어 "모노클로날 항체"는 실질적인 동종 항체들의 집단으로부터 얻은 항체를 말하는데, 즉 한 집단을 이루는 개별 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연발생적 돌연변이를 제외하고 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원성 부위에 대해 매우 특이적이다. 게다가, 전형적으로 다양한 결정인자 (에피토프)에 대한 다양한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 집단과는 반대로 각 모노클로날 항체는 항원 상의 단일 결정인자에 대한 것이다. 모노클로날 항체의 특이성 이외에도, 이들은 다른 이뮤노글로불린에 의해 오염되지 않은 하이브리도마 배양에 의해 합성된다는 점에서 유리하다. 수식자 "모노클로날"은 실질적인 동종 항체 집단으로부터 수득한 항체의 특성을 나타내지만, 임의의 구체적 방법에 의한 항체의 생산을 요구하는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler et al., Nature, 256: 459 (1975))에 처음 기재된 하이브리도마 방법으로 만들 수 있거나, 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 만들 수 있다. "모노클로날 항체"는 예를 들어, 문헌 (Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) and Marks et al., J. Mol. Biol., 222: 581-597 (1991))에 기재된 기술을 이용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수도 있다.
본원에서 모노클로날 항체는 구체적으로 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린)를 포함하는데, 상기 키메라 항체에서 중쇄 및(또는) 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래한 항체 또는 특정 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일 또는 상동성이 있지만, 상기 쇄의 나머지는 또다른 종으로부터 유래한 항체 또는 또다른 항체 부류 또는 하위 부류에 속하는 항체 뿐만 아니라 이러한 항체의 단편 (이들이 원하는 생물학적 활성을 나타내는 경우)의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이 있다 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 6851-6855 (1984)).
비인간 (예를 들어, 뮤린) 항체의 "인간화된" 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유도된 최소 서열을 포함하는 키메라 이뮤노글로불린, 이뮤노글로불린쇄, 또는 그의 단편 (예컨대, 항체의 Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 다른 항원-결합 하위서열)이다. 대부분의 경우, 인간화된 항체는 수령자의 CDR이 원하는 특이성, 친화도 및 수용력을 갖는 비인간종 (공여자 항체), 예컨대, 마우스, 래트 또는 토끼의 CDR 잔기로 바뀐 인간 이뮤노글로불린 (수령자 항체)이다. 몇몇 경우에서, 인간 이뮤노글로불린의 Fv FR 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 대체된다. 게다가, 인간화된 항체는 수령자 항체 및 이입된 CDR 또는 골격 서열 둘다에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 항체 수행능력을 개량하고 최대화하기 위해 추가로 이러한 수식을 한다. 일반적으로, 인간화된 항체는 실질적으로 1종 이상, 및 전형적으로는 2종의 가변 도메인으로 구성되어 있을 것이고, 여기서 상기 가변 도메인내의 CDR 영역 모두 또는 실질적으로 모두는 비인간 이뮤노글로불린의 CDR 영역에 상응하고, FR 영역의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 이뮤노글로불린 서열의 FR 여역이다. 또한, 인간화된 항체는 바람직하게는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로는 인간 이뮤노글로불린의 일부를 포함할 것이다. 더 상세한 것을 위해서는, 문헌 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature, 322: 323-329 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struc. Biol., 2: 593-596 (1992))을 참조한다. 인간화된 항체는 항체의 항원-결합 영역이 원하는 항원으로 마카크 원숭이를 면역화시켜 제조한 항체로부터 유도된 PRIMATIZED (상표명) 항체를 포함한다.
"단일쇄 Fv" 또는 "sFv" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함하는데, 여기서 이들 도메인은 단일 폴리펩티드쇄에 존재한다. 바람직하게는, Fv 폴리펩티드는 VH와 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 링커를 추가로 포함하는데, 이 링커는 sFv가 항원 결합을 위한 원하는 구조를 형성하게 한다. sFv를 조사하기 위해서는, 문헌 (Pluckthun in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore, eds. (Springer-Verlag: New York, 1994), pp. 269-315)을 참조한다.
용어 "디아바디 (diabody)"는 동일한 폴리펩티드쇄 (VH-VL)에 있는 경쇄 가변 도메인(VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함하는, 2개의 항원 결합 부위가 있는 작은 항체 단편을 말한다. 동일한 쇄 상에서 2개의 도메인을 페어링시키기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 도메인을 다른 쇄의 상보적 도메인과 강제로 페어링시켜 2개의 항원 결합 부위를 생성시킨다. 디아바디는 예를 들어, 문헌 (EP 404,097, WO93/11611 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993))에 보다 상세하게 기재되어 있다.
"단리된" 항체란 자신의 천연 환경의 성분으로부터 확인되어 분리 및(또는) 회수된 항체이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 항체의 진단 또는 치료적 용도를 방해하는 물질로서, 효소, 호르몬 및 다른 단백성 또는 비단백성 용질을 포함할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의해 측정시 95 중량%를 초과하는 정도까지, 가장 바람직하게는 99 중량%를 초과하는 정도까지 정제되거나, 또는 (2) 스피닝 컵(spinning cup) 시퀀서를 사용하여 N 말단 또는 내부 아미노산 잔기 15개 이상을 수득하기에 충분한 정도까지 정제되거나, 또는 (3) 쿠마시 블루, 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 하나의 밴드로 나타날 정도까지 정제될 것이다. 단리된 항체는 재조합 세포내의 제자리 (in situ) 항체를 포함하는데, 이는 그 항체의 천연 환경에 있는 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 단리된 항체는 일반적으로 하나 이상의 정제 단계에 의해 정제될 것이다.
"표지 (label)"는 이 명세서에 사용될 때, 항체에 직간접적으로 접합되어 "표지된" 항체를 생성시키는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 말한다. 표지는 그 자체로 검출될 수 있거나 (방사성동위원소 표지 또는 형광 표지), 효소 표지인 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉매할 수 있다. 탐지가능한 표지로 작용할 수 있는 레디오뉴클리드는 예를 들어, I-131, I-123, I-125, Y-90, Re-188, At-211, Cu-67, Bi-212 및 Pd-109를 포함한다. 표지는 독소와 같은 탐지불가능한 것일 수도 있다.
"고상 (solid phase)"은 본 발명의 항체가 부착될 수 있는 비수성 매트릭스를 의미한다. 여기서, 고려되는 고상의 예는 부분적으로 또는 전체적으로 유리로 형성된 것 (예를 들어, 조절된 세공 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어, 아가로스), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘 등이 있다. 특정 실시양태에서, 내용에 따라 고상은 검정용 플레이트의 웰일 수 있으며, 다른 실시양태에서 고상은 정제 컬럼 (예를 들어, 친화 크로마토그래피 컬럼)일 수 있다. 이 용어는 또한 미국 특허 제4,275,149호에 기재된 것과 같은 개별 입자의 비연속적 고상도 포함한다.
"리포좀"은 약물 (예를 들어, 본원에 개시된 PRO 폴리펩티드 또는 이에 대한 항체)을 포유동물에게 전달하는 데 유용한 여러 형태의 지질, 인지질 및(또는) 계면활성제로 이루어진 작은 베지클 (vesicle)이다. 리포좀의 성분들은 통상적으로 생체막의 지질 정렬과 유사하게 이중층 형태로 정렬된다.
본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "이뮤노어드헤신"은 이뮤노글로불린 불변 도메인의 이펙터 기능과 이종 단백질 (어드헤신)의 결합 특이성을 겸비한 항체 유사 분자를 지칭한다. 구조적으로 보면, 이뮤노어드헤신은 항체의 항원 인식 및 결합 부위 보다는, 원하는 결합 특이성을 나타내는 (즉, "이종성") 아미노산 서열과 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열의 결합체를 포함한다. 이뮤노어드헤신 분자의 어드헤신 부분은 전형적으로 적어도 수용체 또는 리간드의 결합 부위를 포함하는 인접 아미노산 서열이다. 이뮤노어드헤신내 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열은 IgG-1, IgG-2, IgG-3, IgG-4 서브타입, IgA (IgA-1 및 IgA-2 포함), IgE, IgD 또는 IgM과 같은 임의의 이뮤노글로불린으로부터 얻을 수 있다.
II. 본 발명의 조성물 및 방법
A. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 변이체
본원에 기재된 전장 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 폴리펩티드 이외에, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 변이체도 제조될 수 있는 것으로 생각된다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 변이체는 적당한 뉴클레오티드 변화를 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 DNA에 도입하고(하거나), 원하는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 합성하여 제조할 수 있다. 당업자라면 아미노산 변화가 글리코실화 부위의 수 또는 위치의 변화 또는 멤브레인 앵커링 특성의 변화와 같은, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 번역후 프로세싱을 바꿀 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본원에 기재된 전장 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887; 또는 본원에 기재된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 여러 도메인에 있어서의 변이는 예를 들어, 미국 특 허 제5,364,934호에 개시된 보존적 및 비보존적 돌연변이유발 기술 및 지침 중 임의의 것을 이용하여 제조할 수 있다. 변이는 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887과 비교할 때 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 아미노산 서열의 변화를 초래하는, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 코딩하는 하나 이상의 코돈의 치환, 결실 또는 삽입일 수 있다. 임의로, 하나 이상의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 도메인에 존재하는 하나 이상의 아미노산을 임의의 다른 아미노산으로 치환함으로써 변이시킨다. 원하는 활성에 악영향을 주지 않으면서 삽입, 치환 또는 결실될 수 있는 아미노산 잔기는, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 서열을 공지된 상동 단백질 분자의 서열과 비교하고 상동성이 높은 영역에서 아미노산 서열의 변화를 최소화함으로써 결정할 수 있다. 아미노산 치환은 하나의 아미노산을 유사한 구조 및(또는) 화학적 특성을 갖는 다른 아미노산으로 치환, 예를 들어, 류신의 세린으로의 치환, 즉 아미노산의 보존적 치환의 결과일 수 있다. 삽입 또는 결실은 임의로 약 1 내지 5개의 아미노산의 삽입 또는 결실일 수 있다. 허용되는 변이는 서열내 아 미노산을 체계적으로 삽입, 결실 또는 치환시키고, 전장 또는 성숙 천연 서열에 의해 나타나는 활성에 대해 생성된 변이체를 시험함으로써 결정할 수 있다.
구체적인 실시양태에서, 관심있는 보존적 치환은 바람직한 치환이라는 표제로 표 3에 나타내었다. 이러한 치환에 의해 생물학적 활성이 변화하는 경우, 하기 표 3에 예시적 치환으로 지칭되거나 아미노산 종류에 대해서 하기에 보다 상세하게 설명된 보다 실질적인 변화를 도입하고 생성물을 스크리닝하였다.
<표 3>
Figure 112001022912775-pct00029
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 기능 또는 면역학적 동일성에서의 실질적인 수식은 (a) 치환 영역에서의 폴리펩티드 백본의 구조를, 예를 들어, 쉬이트 또는 나선 구조로서 유지하거나, (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성을 유지하거나, 또는 (c) 용적이 큰 측쇄를 유지하는 그의 효과를 상당히 변화시키는 치환을 선택함으로써 수행된다. 자연 발생 잔기는 공통적인 측쇄 특성에 따라 다음과 같은 군으로 구분된다:
(1) 소수성: norleucine, met, ala, val, leu, ile;
(2) 중성 친수성: cys, ser, thr;
(3) 산성: asp, glu;
(4) 염기성: asn, gln, his, lys, arg;
(5) 사슬 배향에 영향을 미치는 잔기: gly, pro; 및
(6) 방향족; trp, tyr, phe.
비보존적 치환은 상기 군 중 하나의 구성원을 다른 종류의 것으로 교환시킬 것이다. 또한, 이렇게 치환된 잔기는 보존적 치환 부위에 도입될 수 있거나 또는 보다 바람직하게는 나머지 (비보존) 부위에 도입될 수 있다.
올리고뉴클레오티드 매개 (부위 특이적) 돌연변이 유발법, 알라닌 스캐닝법 및 PCR 돌연변이 유발법과 같은 당업계에 공지된 방법을 사용하여 변이시킬 수 있다. 부위 특이적 돌연변이 유발법 [Carter et al., Nucl. Acids Res.,13:4331 (1986); Zoller et al., Nucl. Acids Res.,10:6487 (1987)], 카세트 돌연변이 유발법 [Wells et al., Gene,34:315 (1985)], 제한 선택 돌연변이 유발법 [Wells et al., Philos. Trans. R. Soc. London SerA,317:415 (1986)] 또는 다른 공지의 기술을 클로닝된 DNA에 적용하여 본 발명의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 변이체 DNA를 생성시킬 수 있다.
또한, 스캐닝 아미노산 분석법을 실시하여 인접 서열을 따라 하나 이상의 아미노산을 확인할 수 있다. 바람직한 스캐닝 아미노산은 비교적 작은 중성 아미노산이다. 이러한 아미노산은 알라닌, 글리신, 세린 및 시스테인을 포함한다. 알라닌은 베타-탄소 상의 측쇄를 제거하고 변이체의 주쇄 구조를 바꿀 가능성이 적기 때문에 이들 중 대표적인 바람직한 스캐닝 아미노산이다[Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]. 또한, 알라닌은 가장 흔한 아미노산이기 때문에 특히 바람직하다. 또한, 알라닌은 파묻힌 위치 및 노출된 위치 모두에서 빈번하게 발견된다 [Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150:1 (1976)]. 알라닌 치환이 적당한 양의 변이체를 생성시키지 않으면, 동배체(isoteric) 아미노산을 사용할 수 있다.
B. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 수식
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 공유결합 수식은 본 발명의 범위에 포함된다. 공유결합 수식의 한 형태는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 선별된 측쇄, N 말단 또는 C 말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 표적 아미노산 잔기를 반응시키는 것을 포함한다. 이중관능제를 사용한 유도체화는 예를 들어, 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 및 항-PRO887 항체를 정제하는 방법에 사용하기 위한 불용성 지지체 매트릭스 또는 표면에 PRO를 가교결합시키거나, 그 반대로 가교결합시키는 데 유용하다. 통상 사용되는 가교결합제는 예를 들어, 1,1-비스(디아조아세틸)-2-페닐에탄, 글루타르알데히드, N-히드록시숙신이미드 에스테르, 예를 들어, 4-아지도살리실산 에스테르, 3,3'-디티오비스(숙신이미딜프로피오네이트)와 같은 디숙신이미딜 에스테르를 포함하는 동종이중관능성 이미도에스테르, 비스-N-말레이미도-1,8-옥탄과 같은 이중관능성 말레이미드 및 메틸-3-[(p-아지도페닐)디티오]프로피오이미데이트와 같은 물질을 포함한다.
다른 수식으로는 글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기를 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화시키는 것; 프롤린 및 리신의 히드록실화; 세릴 또는 트레오닐 잔기 중 히드록실기의 인산화; 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄 중 알파-아미노기의 메틸화[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86(1983)]; N-말단 아민의 아세틸화; 및 C-말단 카르복실기의 아미드화가 있다.
본 발명의 범위에 포함되는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 공유결합 수식의 다른 유형은 폴리펩티드의 천연 글리코실화 패턴의 변화를 포함한다. 본원에서 "천연 글리코실화 패턴의 변화"는 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에서 발견되는 하나 이상의 탄수화물 잔기의 결실(잠재적인 글리코실화 부위를 제거하거나, 화학적 및(또는) 효소적 방법에 의해 글리코실화를 결실시킴으로써 달성됨) 및(또는) 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 존재하지 않는 하나 이상의 글리코실화 부위의 부가를 의미한다. 또한, 이 용어는 존재하는 다양한 탄수화물 잔기의 성질 및 비율의 변화를 비롯한 천연 단백질의 글리코실화에 있어서의 질적 변화를 포함한다.
글리코실화 부위를 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887폴리펩티드에 부가하는 것은 아미노산 서열의 변화에 의해 달성될 수 있다. 변화는 예를 들어, 하나 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기를 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 부가하거나, 상기 천연 서열 폴리펩티드를 상기 잔기로 치환시켜 달성할 수 있다 (O-연결 글리코실화 부위의 경우). PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 아미노산 서열은 특히, 원하는 아미노산으로 번역될 코돈을 생성시키도록 미리 선택된 염기 에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 DNA를 돌연변이시킴으로써 DNA 수준에서의 변화를 통하여 임의로 변경시킬 수 있다.
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 수를 증가시키는 다른 수단은 글리코시드를 폴리펩티드에 화학적으로 또는 효소에 의해 커플링시키는 것이다. 이러한 방법은 예를 들어, 1987년 9월 11일 공개된 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin and Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem., pp. 259-306 (1981)]에 기재되어 있다.
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 존재하는 탄수화물 잔기의 제거는 화학적으로, 효소에 의해, 또는 글리코실화의 표적으로 작용하는 아미노산 잔기를 코딩하는 코돈의 돌연변이 치환에 의해 달성될 수 있다. 화학적 탈글리코실화 기술은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Hakimuddin, et al., Arch. Biochem. Biophys., 259:52(1987) 및 Edge et al., Anal. Biochem., 118:131(1981)]에 기재되어 있다. 폴리펩티드 상의 탄수화물 잔기의 효소적 절단은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제를 사용하여 달성할 수 있다 [Thotakura et al., Meth. Enzymol., 138:350(1987)].
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 공유결합 수식의 다른 종류는 미국 특허 제4,640,835호, 동 제4,496,689호, 동 제4,301,144호, 동 제4,670,417호, 동 제4,791,192호 또는 동 제4,179,337호에 기재된 방식으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 폴리펩티드를 다양한 비단백질성 중합체 중 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 결합시키는 것을 포함한다.
또한, 본 발명의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887는 다른 이종 폴리펩티드 또는 아미노산 서열에 결합된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 포함하는 키메라 분자를 형성하는 방식으로 수식될 수 있다.
본 발명의 한 실시태양에서, 이러한 키메라 분자는 항-태그 항체가 선택적으로 결합할 수 있는 에피토프를 제공하는 태그 폴리펩티드와 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 결합체를 포함한다. 에피토프 태그는 일반적으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 아미노 또는 카르복실 말단에 위치한다. 이러한 에피토프-태그 형태의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 존재는 태그 폴리펩티드에 대한 항체를 사용하여 검출할 수 있다. 또한, 에피토프 태그를 도입하면 항-태그 항체, 또는 에피토프 태그에 결합하는 다른 종류의 친화성 매트릭스를 사용한 친화성 정제에 의해 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 용이하게 정제할 수 있다. 다양한 태그 폴리펩티드 및 이들 각각의 항체는 당업계에 공지되어 있다. 그 예로는 폴리-히스티딘(poly-his) 또는 폴리-히스티딘-글리신 (poly-his-gly) 태그; flu HA 태그 폴리펩티드 및 그의 항체 12CA5 [Field et al., Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)]; c-myc 태그 및 이에 대한 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 및 9E10 항체 [Evan et al., Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3636 (1985)]; 및 단순포진 바이러스 당단백질 D (gD) 태그 및 그의 항체 [Paborsky et al., Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]를 들 수 있다. 다른 태그 폴리펩티드는 Flag-펩티드 [Hopp et al., BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)], KT3 에피토프 펩티드 [Martin et al., Science, 255:192-194 (1992)], 알파-튜불린 에피토프 펩티드 [Skinner et al., J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)] 및 T7 유전자 10 단백질 펩티드 태그 [Lutz-Freyermuth et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]를 포함한다.
다른 한 실시태양에서, 키메라 분자는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887와 이뮤노글로불린 또는 이뮤노글로불린의 특정 영역의 결합체를 포함할 수 있다. 키메라 분자의 2가 형태("이뮤노어드헤신"으로 언급하기도 함)의 경우, 이러한 결합체는 IgG 분자의 Fc 영역일 수 있다. 이 Ig 결합체는 바람직하게는 Ig 분자내 1개 이상의 가변성 영역 대신에 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887 폴리펩티드의 가용성(결실 또는 불활성화된 막횡단 도메인) 형태의 치환체를 포함한다. 특히 바람직한 한 실시태양에서, 이뮤노글로불린 결합체는 IgG1 분자의 힌지, CH2 및 CH3, 또는 힌지, CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함한다. 이뮤노글로불린 결합체를 생산하는 방법으로는, 1995년 6월 27일 간행된 미국 특허 제5,428,130호를 참조한다.
C. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 제조
본 발명은 본원에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887로 불리는 폴리펩티드를 코딩하는, 새로이 확인되고 단리된 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 특히, 하기 실시예에 보다 상세히 기재된 바와 같이, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 확인하고 단리하였다. 별도의 발현 라운드에서 생산된 단백질의 PRO 숫자는 다를 수 있지만, UNQ 수는 임의의 해당 DNA 및 코딩된 단백질 특유의 것이며, 변하지 않을 것이다. 그러나, 본원에서는 간단하게, DNA16451-1388, DNA35600-1162, DNA47365-1206, DNA59838-1462, DNA44196-1353, DNA76532-1702, DNA30868, DNA34433, DNA41374, DNA53987, DNA58120, DNA58121, DNA58122, DNA58125, DNA58128 또는 DNA58130에 의해 코딩된 단백질 뿐만 아니라 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO887의 상기 정의에 포함된 다른 천연 상동체 및 변이체를 이들의 출처 및 제조 방식과 상관없이 각각 "PRO179", "PRO238", "PRO364", "PRO844", "PRO846", "PRO1760", "PRO205", "PRO321", "PRO333", "PRO840", "PRO877", "PRO878", "PRO879", "PRO882", "PRO885" 또는 "PRO887"로 불를 것이다.
이하에 설명되는 내용은 주로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 함유하는 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 세포를 배양함으로써 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 제조하는 방법에 관한 것이다. 물론, 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 제조하는 것도 고려된다. 예를 들어, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 서열 또는 그의 단편은 고상 기술을 이용하는 직접 펩티드 합성법으로 제조할 수 있다 [문헌 (Stewart et al., Solid -Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co., San Francisco, CA (1969); Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963))을 참조함]. 시험관내 단백질 합성은 수동 방법 또는 자동 방법을 이용하여 수행할 수 있다. 자동 합성법은 예를 들어, 어플라이드 바이오시스템스 펩티드 합성기( Applied Biosystems Peptide Synthesizer)(미국 캘리포니아주 포스터시티 소재)를 제조사의 지시에 따라 사용하여 수행할 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 다양한 일부를 별도로 화학적으로 합성하고 화학적 또는 효소적 방법을 이용하여 조합함으로써 전장 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
i. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA의 단리
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 DNA는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 mRNA를 보유하여 그를 검출가능한 수준으로 발현할 것으로 생각되는 조직으로부터 제조된 cDNA 라이브러리로부터 수득할 수 있다. 따라서, 인간 PRO179, 인간 PRO238, 인간 PRO364, 인간 PRO844, 인간 PRO846, 인간 PRO1760, 인간 PRO205, 인간 PRO321, 인간 PRO333, 인간 PRO840, 인간 PRO877, 인간 PRO878, 인간 PRO879, 인간 PRO882, 인간 PRO885 또는 인간 PRO887을 코딩하는 DNA는 실시예에 기재된 바와 같은, 인체 조직으로부터 유래한 cDNA 라이브러리로부터 편리하게 수득할 수 있다. 또한, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는 게놈 라이브러리로부터 수득하거나 또는 올리고뉴클레오티드 합성으로 수득할 수 있다.
라이브러리는 원하는 유전자 또는 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 확인하기 위해 디자인된 프로브 (예를 들어, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대한 항체 또는 약 20 내지 80개 이상의 염기로 구성된 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 스크리닝할 수 있다. 선택된 프로브를 사용한 cDNA 또는 게놈 라이브러리의 스크리닝은 예를 들어, 문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Haror Laboratory Press, 1989)]에 기재된 바와 같은 표준 방법을 사용하여 수행할 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자 를 단리하는 별법은 PCR 방법을 사용하는 것이다 [Sambrook et al., 상기 문헌; Dieffenbach et al., PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Haror Laboratory Press, 1995)].
하기 실시예는 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 기술을 설명한다. 프로브로서 선택된 올리고뉴클레오티드 서열은 원하지 않는 결과를 최소화하기 위해서 길이가 충분하고 분명한 서열이어야 한다. 올리고뉴클레오티드는 스크리닝되는 라이브러리의 DNA와 혼성화시 검출될 수 있도록 표지하는 것이 바람직하다. 표지 방법은 당업계에 공지되어 있고, 32P-표지된 ATP와 같은 방사성 표지, 비오티닐화 또는 효소 표지의 사용을 포함한다. 중간정도의 엄격도 및 높은 엄격도를 포함하는 혼성화 조건은 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에서 제공된다.
상기 라이브러리 스크리닝 방법에서 확인된 서열은 GenBank와 같은 공용 데이타베이스 또는 다른 독점 서열 데이타베이스에 기탁되어 입수될 수 있는 다른 공지의 서열과 비교하여 정렬시킬 수 있다. 분자의 한정된 영역내 또는 전장 서열에 걸친 서열 동일성 (아미노산 또는 뉴클레오티드 수준에서)은 상동성을 측정하기 위해 다양한 알고리즘을 사용하는 컴퓨터 소프트웨어 프로그램, 예컨대, ALIGN, DNAstar 및 INHERIT를 사용하여 서열 정렬을 통해 결정할 수 있다.
단백질 코딩 서열이 있는 핵산은 먼저 본원에 개시된 추정 아미노산 서열을 사용하고, 필요하다면, 전구체를 검출하기 위해 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 통상의 프라이머 연장 방법을 사용하여, 선택된 cDNA 또는 게놈 라이 브러리를 스크리닝하고, cDNA로 역전사되지 않는 mRNA의 중간체를 프로세싱함으로써 수득할 수 있다.
ii. 숙주 세포의 선별 및 형질전환
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 생산을 위해, 숙주 세포를 본원에 기재된 발현 또는 클로닝 벡터로 형질감염 또는 형질전환시키고, 프로모터 유도, 형질전환체 선별 또는 목적 서열을 코딩하는 유전자 증폭에 적합하게끔 개질된 통상의 영양 배지에서 배양한다. 당업자라면 불필요한 실험을 수행하지 않고서도 배지, 온도, pH 등과 같은 배양 조건을 선택할 수 있다. 일반적으로, 세포 배양물의 생산성을 최대화하기 위한 원칙, 프로토콜 및 실시 기술은 문헌 [Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, ed. (IRL Press, 1991) 및 Sambrook et al., 상기 문헌]에서 찾을 수 있다.
형질감염 방법, 예를 들어, CaPO4 처리 및 일렉트로포레이션은 당업계의 숙련가에게 공지되어 있다. 사용되는 숙주 세포에 따라, 형질전환은 상기 세포에 적합한 표준 기술을 이용하여 수행한다. 원핵세포 또는 실질적인 세포벽을 함유하는 다른 세포의 경우, 일반적으로 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌)에 기재된 염화칼슘법을 이용하는 칼슘 처리, 또는 일렉트로포레이션을 이용한다. 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)를 사용한 감염은 문헌 [Shaw et al., Gene, 23:315(1983) 및 1989년 6월 29일 공개된 WO 89/05859]에 기재된 바와 같이 특정 식물 세포의 형질전환에 사용한다. 이러한 세포벽이 없는 포유동물 세포의 경우, 문헌 [Graham and van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978)]의 인산칼슘 침전법을 사용할 수 있다. 포유동물 세포 숙주계 형질감염의 일반적인 특징은 미국 특허 제4,399,216호에 기재되어 있다. 효모 내로의 형질전환은 일반적으로 문헌 [Van Solingen et al., J. Bact., 130:949(1977) 및 Hsiao et al., Proc. Natl. Acad. Sci.(USA), 76:3829(1979)]의 방법에 따라 수행한다. 그러나, 세포내로 DNA를 도입하는 다른 방법, 예를 들어, 핵내 미세주입, 일렉트로포레이션, 온전한 세포와의 세균 원형질체 융합, 또는 다가양이온(polycation), 예를 들어, 폴리브렌 또는 폴리오르니틴도 사용할 수 있다. 포유동물 세포의 형질전환을 위한 여러 기술에 대해서는 문헌 [Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) 및 Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988)]을 참조한다.
본원에서 벡터내의 DNA를 클로닝 또는 발현하기에 적합한 숙주 세포에는 원핵세포, 효모 또는 고등 진핵세포가 포함된다. 적합한 원핵세포는 진정세균, 예를 들어, 그람 음성 또는 그람 양성 생물, 예를 들어, 이. 콜라이 (E. coli)와 같은 엔테로박테리아세애(Enterobacteriaceae)를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 다양한 이. 콜라이 균주, 예를 들어, 이. 콜라이 K12 균주 MM294 (ATCC 31,446), 이. 콜라이 X1776 (ATCC 31,537), 이. 콜라이 균주 W3110 (ATCC 27,325) 및 K5 772 (ATCC 53,635)는 용이하게 입수할 수 있다. 다른 적당한 원핵생물 숙주 세포는 에셔리키아(Eshcerichia), 예를 들어, 이. 콜라이, 엔테로박터 (Enterobacter), 에르위니아 (Erwinia), 클렙시엘라 (Klebsiella), 프로테우스 (Proteus), 살모넬라 (Salmonella), 예를 들어, 살모넬라 티피무리움 (typhimurium), 세라티아 (Serratia), 예를 들어, 세라티아 마르세스칸스 (marcescans) 및 시겔라 (Shigella)와 같은 장내세균 (Enterobacteriaceae), 비. 서브틸리스 (subtilis) 및 비. 리체니포르미스 (licheniformis) (예를 들어, 1989년 4월 12일자로 공고된 DD 266,710호에 기재된 비. 리체니포르미스 41P)와 같은 바실러스 (Bacillus), 피. 아에루기노사 (aeruginosa)와 같은 슈도모나스 (Pseudomonas), 및 스트렙토마이세스 (Streptomyces)를 포함한다. 이들 예는 단지 예시적인 것으로서 이에 제한되는 것은 아니다. 균주 W3110은 재조합 DNA 산물 발효에 공통적인 숙주 균주이기 때문에 특히 바람직한 숙주 또는 모숙주이다. 바람직하게는, 숙주 세포는 최소량의 단백질 분해 효소를 분비한다. 예를 들어, 균주 W3110은 숙주의 내생 단백질을 코딩하는 유전자의 돌연변이를 초래하도록 수식될 수 있고, 이러한 숙주의 예는 완전한 유전자형 tonA를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 1A2, 완전한 유전자형 tonA ptr3을 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 9E4, 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 27C7 (ATCC 55,244), 완전한 유전자형 tonA ptr3 phoA E15 (argF-lac)169 degP ompT rbs7 ilvG kanr를 갖는 이. 콜라이 W3110 균주 37D6, 비-카나마이신 내성 degP 결실 돌연변이를 갖는 균주 37D6인 이. 콜라이 W3110 균주 40B4, 및 1990년 8월 7일 간행된 미국 특허 제4,946,783호에 개시된 페리플라즘 프로테아제 돌연변이체인 이. 콜라이 균주를 포함한다. 별법으로, 시험관내 클로닝 방법, 예를 들어, PCR 또는 다른 핵산 폴리 머라제 반응이 적합하다.
원핵세포 이외에, 섬유상 진균 또는 효모와 같은 진핵미생물이 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 벡터에 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae)가 일반적으로 사용되는 하등 진핵 숙주 미생물이다. 다른 미생물에는 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe) (Beach and Nurse, Nature, 290: 140 [1981]; 1985년 5월 2일 공개된 EP 139,383); 클루이베로마이세스 (Kluyveromyces) 숙주 (미국 특허 제4,943,529호; Fleer et al., Bio/Technology, 9:968-975 (1991)), 예를 들어, 케이. 락티스 (lactis) (MW98-8C, CBS683, CBS4574; Louvencourt et al., J. Bacteriol., 737 [1983]), 케이. 프라질리스 (fragilis) (ATCC 12,424), 케이. 불가리쿠스(bulgaricus) (ATCC 16,045), 케이. 위케라미 (wickeramii) (ATCC 24,178), 케이. 왈티이 (waltii) (ATCC 56,500), 케이. 드로소필라룸 (drosophilarum) (ATCC 36,906; Van den Berg et al., Bio/Technology, 8:135(1990)), 케이. 테르모톨레란스 (thermotolerans) 및 케이. 막시아누스 (marxianus); 야로위아 (yarrowia) (EP 402,226); 피치아 파스토리스 (Pichia pastoris) (EP 183,070; Sreekrishna et al., J. Basic Microbiol., 28:265-278 [1988]); 칸디다 (Candida); 트리코데르마 레에시아 (Trichoderma reesia)(EP 244,234); 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa; Case et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76:5259-5263 [1979]); 시와니오마이세스 (Schwanniomyces), 예를 들어, 시와니오마이세스 옥시덴탈리스 (occidentalis) (1990년 10월 31일 공개된 EP 394,538); 및 섬유상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라, 페니실리움 (Penicillium), 톨리포클라디움 (Tolypocladium) (1991년 1월 10일 공개된 WO 91/00357) 및 아스퍼질러스 (Aspergillus) 숙주, 예를 들어, 에이. 니둘란스 (nidulans) (Ballance et al,, Biochem. Biophys. Res. Commun., 112:284-289 [1983]; Tilburn et al., Gene, 26:205-221 [1983]; Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81: 1470-1474 [1984]) 및 에이. 니게르 (niger) (Kelly and Hynes, EMBO J., 4: 475-479 [1985])가 있다. 본원에는 메틸 영양 요구성 효모가 적합하고, 이 효모에는 한세눌라 (Hansenula), 칸디다 (Candida), 클로엑케라 (Kloeckera), 피치아, 사카로마이세스, 토룰롭시스(Torulopsis) 및 로도토룰라 (Rhodotorula)로 이루어지는 속으로부터 선택된, 메탄올 상에서 증식할 수 있는 효모가 있으나 이에 한정되지 않는다. 이들 종류의 효모의 예인 구체적인 종의 목록은 문헌 [C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982)]에 기재되어 있다.
글리코실화된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현에 적합한 숙주 세포는 다세포 생물로부터 유래한다. 무척추동물 세포의 예에는 드로소필라 S2 및 스포도프테라 Sf9와 같은 곤충 세포 및 식물 세포가 포함된다. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예에는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 및 COS 세포가 포함된다. 보다 구체적인 예에는 SV40에 의해 형질전환 된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7, ATCC CRL 1651), 인간 배아 신장 세포주 (293 세포 또는 현탁 배양액에서 증식시키기 위해 서브클로닝된 293 세포, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59(1997)), 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)), 마우스 세르톨리 세포 (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)), 인간 폐 세포 (W138, ATCC CCL 75), 인간 간세포 (Hep G2, HB 8065) 및 마우스 유선 종양 (MMT 060562, ATCC CCL51)이 포함된다. 당업계의 숙련가라면 적합한 숙주 세포를 선택할 수 있다.
iii. 복제가능 벡터의 선별 및 사용
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산 (예를 들어, cDNA 또는 게놈 DNA)은 클로닝 (DNA의 증폭) 또는 발현을 위한 복제가능 벡터에 삽입할 수 있다. 다양한 벡터를 용이하게 구할 수 있다. 예를 들어, 벡터는 플라스미드, 코스미드, 바이러스 입자 또는 파지의 형태일 수 있다. 적합한 핵산 서열은 다양한 방법에 의해 벡터 내에 삽입될 수 있다. 일반적으로, 당업계에 공지된 기술을 이용하여 DNA를 적당한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 삽입한다. 서열이 분비되는 경우, 벡터 성분은 일반적으로 하나 이상의 신호 서열, 복제 기점, 하나 이상의 마커 유전자, 인핸서 요소, 프로모터 및 전사 종결 서열을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 상기 성분을 하나 이상 포함하는 적당한 벡터의 제작은 당업계의 숙련가에게 공지된 표준 라이게이션 기술을 이용한다.
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887은 직접 재조합 방법에 의해 생산될 수 있을 뿐만 아니라 성숙 단백질 또는 폴리펩티드의 N-말단에 특이적 절단 부위가 있는 다른 폴리펩티드 또는 신호 서열일 수 있는 이종 폴리펩티드와의 융합 폴리펩티드로서 생산될 수 있다. 일반적으로, 신호 서열은 벡터의 성분일 수 있거나, 벡터내로 삽입된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA의 일부일 수 있다. 신호 서열은 예를 들어, 알칼리성 포스파타제, 페니실리나제, lpp 또는 열안정성 장내독소 II 리더의 군으로부터 선택된 원핵생물 신호 서열일 수 있다. 효모 분비의 경우, 신호 서열은 예를 들어, 효모 인버타제 리더, α 인자 리더 (사카로마이세스 및 클루이베로마이세스 α-인자 리더 (미국 특허 제5,010,182호)를 포함함), 산 포스파타제 리더, 씨. 알비칸스 (C. albicans) 글루코아밀라제 리더 (1990년 4월 4일 공개된 EP 362,179), 또는 1990년 11월 15일 공개된 WO 90/13646에 기재된 신호 서열일 수 있다. 포유동물 세포에서 발현시키는 경우, 포유동물 신호 서열, 예를 들어, 동일하거나 관련된 종의 분비 폴리펩티드로부터 유래된 신호 서열 및 바이러스 분비 리더를 사용하여 단백질을 분비시킬 수 있다.
발현 및 클로닝 벡터 모두는 벡터가 하나 이상의 선별된 숙주 세포에서 복제할 수 있도록 하는 핵산 서열을 함유한다. 이러한 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 공지되어 있다. 플라스미드 pBR322의 복제 기점은 대부분의 그람 음성 세균에 적합하고, 2μ의 플라스미드 기점은 효모에 적합하고, 다양한 바이러스 기점 (SV40, 폴리오마, 아데노바이러스, VSV 또는 BPV)은 포유동물 세포에서 벡터를 클로닝하는 데 유용하다.
발현 및 클로닝 벡터는 통상적으로 선별가능한 마커로도 불리는 선별 유전자를 함유할 것이다. 대표적인 선별 유전자는 (a) 항생제 또는 다른 독소, 예를 들어, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라싸이클린에 대한 내성을 부여하는 단백질, (b) 영양요구성 결핍을 보충하는 단백질 또는 (c) 복합 배지로부터 입수할 수 없는 중요한 영양물질을 공급하는 단백질을 코딩하는데, 예를 들어, 바실러스 (Bacillus)의 경우에는 D-알라닌 라세마제를 코딩하는 유전자가 있다.
포유동물 세포에 적합한 선별가능한 마커의 예는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산을 수용할 수 있는 세포의 동정을 가능하게 하는 것, 예를 들어, DHFR 또는 티미딘 키나제이다. 야생형 DHFR이 사용될 경우, 적합한 숙주 세포는 DHFR 활성이 없는 CHO 세포주이고, 문헌 [Urlaub et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)]에 기재된 바와 같이 제조 및 증식된다. 효모에 사용하기에 적합한 선별 유전자는 효모 플라스미드 YRp7에 존재하는 trp1 유전자이다 [Stinchcomb et al., Nature, 282:39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7:141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10:157 (1980)]. trp1 유전자는 트립토판이 함유된 배지에서 증식할 수 없는 효모의 돌연변이주 (예를 들어, ATCC 44076 또는 PEP4-1)에 대한 선별 마커를 제공한다 [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)].
발현 및 클로닝 벡터는 일반적으로 mRNA로 합성되는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산 서열에 작동가능하게 결합된 프로모터를 함유한다. 다양한 잠재적인 숙주 세포에 의해 인식되는 프로모터는 공지되어 있다. 원핵생물 숙주에 사용하기에 적합한 프로모터에는 β-락타마제 및 락토스 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature, 275:615 (1978); Goeddel et al., Nature, 281:544 (1979)], 알칼리성 포스파타제, 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel, Nucleic Acid Res., 8:4057 (1980); EP 36,776], 및 하이브리드 프로모터, 예를 들어, tac 프로모터 [deBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80:21-25 (1983)]가 있다. 또한, 세균계에서 사용되는 프로모터는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA에 작동가능하게 결합된 샤인-달가노 (S.D.) 서열을 포함할 것이다.
효모 숙주에 사용하기 적합한 프로모터 서열의 예는 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)] 또는 다른 당분해 효소 [Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968); Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)], 예를 들어, 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 디카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리 오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제 및 글루코키나제에 대한 프로모터를 포함한다.
증식 조건에 의해 조절되는 전사의 다른 장점을 갖는 유도가능한 프로모터인 다른 효모 프로모터는 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소, 메탈로티오네인, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나제, 및 말토스와 갈락토스 이용에 작용하는 효소에 대한 프로모터 영역이다. 효모 발현에 사용하기에 적합한 벡터 및 프로모터는 유럽 특허 제73,657호에 더 기재되어 있다.
포유동물 숙주 세포에서 벡터로부터의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 핵산 전사는 예컨대, 폴리오마 바이러스, 계두 바이러스 (1989년 7월 5일 공개된 UK 제2,211,504호), 아데노바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 2), 소 유두종 바이러스, 조류 육종 바이러스, 사이토메갈로바이러스, 레트로바이러스, B형 간염 바이러스 및 원숭이 바이러스 40 (SV40)과 같은 바이러스의 게놈으로부터 얻은 프로모터; 이종 포유동물 프로모터, 예를 들어, 액틴 프로모터 또는 이뮤노글로불린 프로모터; 및 열-충격 프로모터로에 의해 조절되는데, 단, 상기 프로모터는 숙주 세포와 상용가능하다.
고등 진핵세포에 의한 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA의 전사는 인핸서 서열을 벡터에 삽입함으로써 증가될 수 있 다. 인핸서는 일반적으로 전사를 증가시키기 위해 프로모터에 작용하는, 약 10 내지 300 bp DNA의 시스-액팅 요소이다. 많은 인핸서 서열이 포유동물 유전자 (글로빈, 엘라스타제, 알부민, α-페토단백질 및 인슐린)로부터 유래하는 것으로 알려져 있다. 그러나, 통상적으로 진핵세포 바이러스로부터 유래한 인핸서를 사용할 것이다. 그 예로는 복제 기점의 후측에 있는 SV40 인핸서 (bp 100-270), 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 기점의 후측에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서가 있다. 인핸서는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 서열의 5' 또는 3' 위치에서 벡터에 스플라이싱될 수 있지만, 프로모터로부터 5' 부위에 위치하는 것이 바람직하다.
또한, 진핵생물 숙주 세포 (효모, 진균, 곤충, 식물, 동물, 인간 또는 다른 다세포 생물로부터 유래한 다핵 세포)에 사용되는 발현 벡터는 전사 종결 및 mRNA 안정화에 필요한 서열을 포함할 것이다. 이러한 서열은 통상적으로 진핵세포나 바이러스 DNA 또는 cDNA의 5' 및, 종종, 3' 비번역 영역으로부터 얻어진다. 이들 영역은 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 mRNA의 비번역 부분에서 폴리아데닐화 단편으로서 전사되는 뉴클레오티드 단편을 포함한다.
재조합 척추동물 세포 배양에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 합성에 적용하는 데 적합한 다른 방법, 벡터 및 숙주 세포는 문헌 [Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060 및 EP 117,058]에 기재되어 있다.
iv. 유전자 증폭/발현의 검출
유전자 증폭 및(또는) 발현은 예를 들어, 통상의 서던 블로팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블로팅 [Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:5201-5205 (1980)], 돗 블로팅 (DNA 분석), 또는 본원에 제공된 서열을 기초로 하여 적절하게 표지된 프로브를 사용한 제자리 (in situ) 혼성화를 통해 시료에서 직접 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄, 및 DNA-RNA 혼성 이중쇄 또는 DNA-단백질 이중쇄를 비롯한 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다. 상기 항체는 표지할 수 있고, 상기 이중쇄를 표면에 결합시켜 표면 상에 이중쇄가 형성될 때 이중쇄에 결합된 항체의 존재를 검출할 수 있는 경우에는 상기 검정법을 수행할 수 있다.
별법으로, 유전자 발현은 세포 또는 조직 절편의 면역조직화학적 염색과 같은 면역학적 방법 및 유전자 산물의 발현을 직접 정량하기 위한 세포 배양액 또는 체액의 분석을 통해 측정할 수 있다. 면역조직화학적 염색 및(또는) 시료액의 분석에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날 항체일 수 있고, 임의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연 서열 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 본원에 제공된 DNA 서열을 기초로 한 합 성 펩티드, 또는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA에 결합되어 특정 항체 에피토프를 코딩하는 외인성 서열에 대한 항체를 제조할 수 있다.
v. 폴리펩티드의 정제
폴리펩티드 형태의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887은 배양 배지 또는 숙주 세포 용해물로부터 회수할 수 있다. 상기 폴리펩티드가 멤브레인에 결합하는 경우, 적합한 세제 용액 (예를 들어, Triton-X (상표명) 100)을 사용하거나 효소를 사용한 절단을 통해 멤브레인으로부터 유리시킬 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현에 사용된 세포는 동결-해동 싸이클, 초음파 처리, 기계적 분쇄 또는 세포 용해제와 같은 다양한 물리적 또는 화학적 수단으로 분해시킬 수 있다.
재조합 세포 단백질 또는 폴리펩티드로부터 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 정제하는 것이 바람직할 수 있다. 적합한 정제 방법의 예는 이온 교환 컬럼 상 분획화; 에탄올 침전; 역상 HPLC; 실리카 또는 양이온 교환 수지, 예를 들어, DEAE 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱; SDS-PAGE; 황산암모늄 침전; 예를 들어, 세파덱스 (Sephadex) G- 75를 사용한 겔 여과; IgG와 같은 오염물질을 제거하기 위한 단백질 A 세파로스 컬럼; 및 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 에피토프 태그 형태를 결합시키기 위한 금속 킬레이팅 컬럼이다. 다양한 단백질 정제 방법을 사용할 수 있으며, 이러한 방법은 당업계에 공지되어 있고, 예를 들어, 문헌 [Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990); Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)]에 기재되어 있다. 선택되는 정제 단계(들)은 예를 들어, 사용되는 생산 방법 및 생산되는 특정 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 특성에 따라 달라질 것이다.
D. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 용도
i. 심혈관과 관련된 활성, 내피세포와 관련된 활성 및 혈관신생 활성에 대한 검정
다양한 검정법을 이용하여 심혈관과 관련된 활성, 내피세포와 관련된 활성 및 혈관신생 활성에 대해 본원의 폴리펩티드를 시험할 수 있다. 이러한 검정법은 하기 실시예에 기재된 것을 포함한다.
미국 특허 제5,773,414호에 개시된, 엔도텔린 길항제 활성에 대한 시험용 검정법에는 수용체 검정법에서 요오드화된 엔도텔린-1 결합을 억제하는 상기 폴리펩티드의 능력을 시험하는 래트 심장 심실 결합 검정법, 토끼 신장 동맥 혈관 평활근 세포를 사용하여 방사선표지된 엔도텔린-1의 온전한 세포 결합을 시험하는 엔도텔린 수용체 결합 검정법, 제2 메신저의 세포내 농도를 측정하여 Rat-1 세포에서 기능 활성을 측정하는 이노시톨 포스페이트 축적 검정법, 배양된 혈관 평활근에서 엔도텔린으로 자극된 아라키돈산 유리를 감소시키는 첨가 화합물의 능력을 측정하는 아라키돈산 유리 검정법, 및 수컷 뉴질랜드 토끼의 내피세포를 사용한 시험관내 (단리된 혈관) 연구, 및 스프라그-돌리 래트를 사용한 생체내 연구가 있다.
조직 재생 활성 검정법에는 WO 95/16035 (뼈 연골, 힘줄); WO 95/05846 (신경, 신경세포); 및 WO 91/07491 (피부, 내피세포)에 기재된 것이 있으나 여기에 제한되지 않는다.
창상-치유 활성 검정법에는 예를 들어, 문헌 (Eaglstein and Mertz, J. Invest. Dermatol., 71: 382-384 (1978))에 의해 변형된, 문헌 (Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI and Rovee, DT, eds (Year Book Medical Publishers, Inc., Chicago), pp. 71-112)에 기재된 검정법이 있다.
엔도텔린 B1 (ETB1) 수용체 폴리펩티드에 결합하고 신호 전달 활성을 조절하는 PRO 폴리펩티드와 관련된 시험 화합물을 스크리닝하는 검정법은 엔도텔린 B1 수용체 폴리펩티드를 코딩하는 DNA로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 단계, 이 세포를 시험 후보물질에 노출시키는 단계, 및 예컨대, 미국 특허 제5,773,223호에 기재된 바와 같이 엔도텔린 B1 수용체 신호 전달 활성을 측정하는 단계를 포함한다.
여러 가지 심비대증 검정법이 있다. 시험관내 검정법으로는 성숙 래트의 심 근세포의 퍼짐을 유도하는 것이 있다. 이 검정법에서, 본질적으로 문헌 (Piper et al., "Adult ventricular rat heart muscle cells" in Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research, H.M. Piper, ed. (Berlin:Springer-Verlag, 1990), pp. 36-60)에 상세히 기재된 방법의 변법에 따라 단일 (수컷 스프라그-돌리) 래트로부터 심실 근세포를 단리한다. 이 방법은 성숙 심실 근세포의 단리를 허용하고, 이 방법을 이용하면 이들 세포가 막대 모양의 표현형으로 장기간 배양된다. 페닐에프린 및 프로스타글란딘 F2α(PGF2α)는 이들 성숙 세포에서 퍼짐 반응을 유도하는 것으로 나타났다. 그 다음으로, 심비대증의 다양한 잠재적 억제제로 PGF2α 또는 PGF2α 동족체 (예컨대, 플루프로스테놀)에 의해 유도된 근세포 퍼짐의 억제를 시험한다.
생체내 검정법의 한 예는 생체내에서 플루프로스테놀에 의해 유도된 심비대증의 억제에 대한 시험이다. 이 제약학적 모델은 플루프로스테놀 (PGF2α의 아고니스트 동족체)의 피하 주사에 의해 래트에서 유도된 심비대증을 억재하는 PRO 폴리펩티드의 능력을 시험한다. 심근경색증에 의해 유도된 병적 심비대증을 앓는 래트는 그들의 심근에서 임상적으로 추출가능한 고농도의 PGF2α를 갖는 것으로 공지되어 있다 (Lai et al., Am. J. Physiol. (Heart Circ. Physiol.), 271:H2197-H2208 (1996)). 따라서, 생체내에서 심근 성장에 대한 플루프로스테놀의 효과를 억제할 수 있는 인자는 심비대증의 치료에 유용할 수 있다. 심비대증에 대한 PRO 폴리펩 티드의 효과는 PRO 폴리펩티드를 수용하지 않은 플루프로스테놀-처리 래트에 대한 심장, 심실 및 좌심실의 중량 (체중에 의해 표준화됨)을 측정하여 결정한다.
생체내 검정법의 또다른 예는 압력-과부하 심비대증 검정법이다. 생체내 시험을 위해, 통상적으로 시험 동물의 복부 대동맥을 수축시켜 압력-과부하 심비대증을 유도한다. 전형적인 프로토콜에서, 래트 (예컨대, 수컷 위스타 또는 스프라그-돌리)를 마취 처리하고, 각 래트의 복부 대동맥을 횡경막 바로 아래에서 좁힌다 (Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33: 985-94 (1995)). 대동맥을 절개 수술하여 노출시키고, 돗바늘을 혈관 옆에 배치한다. 바늘 주위의 견사로 봉합하여 대동맥을 수축시키는데, 상기 견사는 즉시 제거되고 바늘의 직경까지 대동맥의 루멘 (lumen)을 줄인다. 이 방법은 예를 들어, 문헌 (Rossi et al., Am. Heart J., 124: 700-709 (1992) and O' Rourke and Reibel, P.S.E.M.B., 200: 95-100 (1992))에 기재되어 있다.
또다른 생체내 검정법에서, 실험적으로 유도된 심근경색증 (MI) 후의 심비대증에 대한 효과를 측정한다. 래트에서 좌관상동맥 결찰로 급성 MI를 유도하고 심전도 검사로 확인한다. 겉보기 수술한 동물군도 대조 동물로서 준비한다. 초기 데이타는 체중에 대한 심장 중량의 비율이 18% 증가된 것으로 입증된 MI를 앓는 동물군에 심비대증이 존재함을 나타낸다 (상기 Lai et al.). 심비대증의 후보 차단제, 예컨대, PRO 폴리펩티드를 사용한 이들 동물의 치료는 시험된 후보물질의 치료 잠재력에 대한 가치 있는 정보를 제공한다. 스프라그-돌리 래트를 사용한 심비대증 유도에 대한 이러한 검정 시험은 미국 특허 제5,773,415호에 더 자세히 개시되 어 있다.
암의 경우, 잘 공지된 다양한 동물 모델을 사용하여 암의 발달 및 병리과정에 있어서 본원에서 확인한 유전자의 역할을 더 이해하고, 항체 및 소분자 길항제와 같은 천연 PRO 폴리펩티드의 다른 길항제를 비롯한 후보 치료제의 효능을 시험할 수 있다. 이러한 모델의 생체내 성질은 인간 환자에서 반응을 구체적으로 예측할 수 있게 한다. 종양 및 암 (예를 들어, 유방암, 결장암, 전립선암, 폐암 등)의 동물 모델에는 비재조합 동물 및 재조합 (형질전환) 동물이 포함된다. 비재조합 동물에는 예를 들어, 설치류 (예컨대, 뮤린 동물)가 포함된다. 이러한 모델은 표준 기술, 예를 들어, 피하 주사, 꼬리 정맥 주사, 비장 이식, 복강내 이식, 신장 캡슐 하의 이식, 또는 오르토핀 이식 (예컨대, 결장 조직에 이식된 결장 암세포)을 이용하여 종양 세포를 유전적 동계의 마우스 내로 도입하여 만들 수 있다 (예컨대, 1997년 9월 18일 공개된 PCT 공개 제WO97/33551호 참조). 종양학 연구에 가장 흔히 사용되는 동물종은 아마도 면역결핍 마우스, 구체적으로는 누드 마우스이다. 흉선 저형성증 또는 무형성증을 앓는 누드 마우스가 인간 종양 이종이식을 위한 숙주로서 성공적으로 작용할 수 있었다는 사실 때문에 상기 누드 마우스는 이 목적에 많이 사용된다. 상동염색체 열성 nu 유전자가 예를 들어, ASW, A/He, AKR, BALB/c, B10.LP, C17, C3H, C57BL, C57, CBA, DBA, DDD, I/st, NC, NFR, NFS, NFS/N, NZB, NZC, NZW, P, RIII 및 SJL을 포함한, 매우 많고 다양한 유사유전자형 (congenic) 누드 마우스 종내로 도입되었다. 추가로, 누드 마우스 이외에 유전적 면역 결핍을 앓는 다양한 기타 동물을 육종하여 왔고, 이를 종양 이종이식의 수용 자로 사용하여 왔다. 보다 자세한 것을 위해서는 예를 들어, 문헌 (The Nude Mouse in Ocology Research, E. Boven and B. Winograd, eds. (CRC Press, Inc., 1991))을 참조한다.
이러한 동물내로 도입된 세포는 예컨대, 상기 기재한 종양세포주, 예를 들어, B104-1-1 세포주 (neu 원종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주); ras-형질감염된 NIH-3T3 세포; Caco-2 (ATCC HTB-37); 또는 적당하게 잘 분화된 등급 II 인간 결장 아데노암세포주인 HT-29 (ATCC HTB-38)와 같은 공지된 종양(암) 세포주 또는 종양 및 암으로부터 유래할 수 있다. 종양세포 또는 암세포 샘플은 액체 질소 중의 동결 및 저장을 수반하는 표준 조건을 이용하여 외과수술을 한 환자로부터 수득할 수 있다 (Karmali et al., Br. J. Cancer, 48: 689-696 (1983)).
종양세포는 다양한 방법으로 누드 마우스와 같은 동물내로 도입할 수 있다. 마우스의 피하 (s.c.) 공간은 종양 이식에 매우 적합하다. 종양은 고형 덩어리, 투관침의 사용에 의한 침생검 또는 세포 현탁액으로서 피하 이식할 수 있다. 고형 덩어리 또는 투관침 이식의 경우, 적당한 크기의 종양 조직 단편을 피하 공간내로 도입한다. 세포 현탁액은 원발성 종양세포주 또는 안정한 종양세포주로부터 새로 준비하고 피하 주사한다. 또한, 종양세포는 진피하 이식으로서 주사할 수 있다. 이 위치에서, 접종물 (inoculum)은 피부 결합 조직의 하부와 피하 조직 사이에 놓는다.
유방암의 동물 모델은 본질적으로 문헌 (Drebin et al., Proc. Nat. Acad. Sci., USA, 83: 9129-9133 (1986))에 기재된 바와 같이 예를 들어, 래트 신경모세 포종 세포 (이 세포로부터 neu 종양유전자를 처음 단리함) 또는 neu-형질전환된 NIH-3T3 세포를 누드 마우스에 이식하여 만들 수 있다.
유사하게, 결장암의 동물 모델은 결장암 세포를 동물, 예컨대, 누드 마우스에서 계대배양하여 이들 동물 모델에서 종양이 나타나게함으로써 만들 수 있다. 누드 마우스에서 인간 결장암의 동소이식 모델은 예컨대, 문헌 (Wang et al., Cancer Research. 54: 4726-4728 (1994) and Too et al., Cancer Research, 55: 681-684 (1995))에 기재되어 있다. 이 모델은 안티캔서사 (AntiCancer, Inc., San Diego, California)에 의해 시판되는 소위 "METAMOUSE" (상표명)를 기초로 한 것이다.
동물에서 발생하는 종양은 적출하여 시험관내에서 배양할 수 있다. 이어서, 시험관내 배양물로부터 수득한 세포를 동물에서 계대배양할 수 있다. 이러한 종양은 다른 시험 또는 약물 스크리닝을 위한 표적으로 작용할 수 있다. 별법으로, 계대배양으로부터 생성된 종양은 단리할 수 있고, 예비-계대 세포, 및 1회 이상의 계대배양 후 단리된 세포로부터 수득한 RNA는 원하는 유전자의 분별 발현에 대해 분석할 수 있다. 이러한 계대 기술은 임의의 공지된 종양세포주 또는 암세포주를 사용하여 수행할 수 있다.
예를 들면, Meth A, CMS4, CMS5, CMS21 및 WEHI-164는 다양한 물질의 항-종양 활성을 연구하기 위한 매우 조절가능한 모델계를 제공하는 BALB/c 수컷 마우스 (DeLeo et al., J. Exp. Med., 146: 720 (1997))의 화학적으로 유도된 섬유육종이다 (Palladino et al., J. Immunol., 138: 4023-4032 (1987)). 간단하게, 종양세 포는 시험관내에서 세포 배양으로 증식시킬 수 있다. 동물내로 주사하기 전, 세포주를 세척하고 약 10x106 내지 10x107 세포/ml의 세포 밀도로 완충액에 현탁시킨다. 그 다음으로, 동물을 10 내지 100 ㎕의 세포 현탁액으로 피하 감염시켜 1 내지 3주 후에 종양이 나타나게 한다.
추가로, 가장 철저히 연구된 실험 종양 중 하나인 마우스의 루이스 (Lewis) 폐 (3LL) 암을 연구 종양 모델로서 사용할 수 있다. 이 종양 모델에 있어서의 효능은 소세포성 폐암 (SCC)으로 진단받은 인간 환자의 치료에 있어서 유리한 효과와 연관성이 있다. 이 종양은 병에 걸린 마우스로부터 수득한 종양 단편, 또는 배양 중인 세포를 주사할 때 정상 마우스내로 도입할 수 있다 (Zupi et al., Br. J. Cancer. 41: suppl. 4, 30 (1998)). 종양이 심지어 단일 세포의 주사로부터 시작될 수 있으며 매우 높은 비율의 감염된 종양세포가 생존한다는 것이 입증되었다. 이 종양 모델에 대한 추가 정보를 위해서는 문헌 (Zacharski, Haemostasis, 16: 300-320 (1986))을 참조한다.
이식된 종양이 있는 동물 모델에서 시험 화합물의 효능을 측정하는 한 방법은 치료 전 및 후의 종양 크기를 측정하는 것이다. 통상적으로, 이식된 종양 크기는 2차원 또는 3차원의 슬라이드 칼리퍼 (caliper)로 측정한다. 2차원에 제한된 측정은 종양의 크기를 정확하게 반영하지 못하므로 대개 수학식을 사용하여 상응하는 부피로 전환한다. 그러나, 종양 크기의 측정은 매우 부정확하다. 약물 후보의 치료 효과는 치료-유도 증식 지연 및 특정 증식 지연으로 더 잘 표현할 수 있다. 종양 증식의 표현에 있어서 또다른 중요 변수는 두 배의 종양 부피가 되는데 걸리는 시간이다. 종양 증식의 계산 및 표현을 위한 컴퓨터 프로그램, 예컨대, 문헌 (Rygaard and Spang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals, Wu and Sheng eds. (Basel, 1989), p.301)에 의해 보고된 프로그램도 이용가능하다. 그러나, 치료 후 세포괴사 및 면역 반응은 실재로 적어도 초기에 종양 크기를 증가시킨다. 그러므로, 이들 변화는 형태 계측 방법 및 유량 세포측정 분석을 병행하여 조심스럽게 관찰할 필요가 있다.
또한, 재조합 (형질전환) 동물 모델은 형질전환 동물을 제조하는 표준 기술을 이용하여 본원에서 확인된 PRO 유전자의 코딩 일부를 원하는 동물의 게놈내로 도입시켜 만들 수 있다. 형질전환 조작용 표적으로 작용할 수 있는 동물은 마우스, 래트, 토끼, 기니아 피그, 양, 염소, 돼지 및 기타 비인간 영장류, 예컨대, 개코원숭이, 침팬지 및 원숭이를 포함하나, 여기에 제한되지 않는다. 형질전이유전자를 이러한 동물내로 도입하는, 당업계에 공지된 기술에는 전핵 미세주입 (미국 특허 제4,873,191호); 생식세포주내로의 레트로바이러스-매개 유전자 전달 (예컨대, Van der Putten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82: 6148-615 (1985)); 배아 줄기 세포에 있어서의 유전자 표적화 (gene targeting) (Thompson et al., Cell, 56: 313-321 (1989)); 배아의 일렉트로포레이션 (Lo, Mol. Cell. Biol., 3: 1803-1814 (1983)); 및 정자-매개 유전자 전달 (Lavitrano et al., Cell, 57: 717-73 (1989))이 포함된다. 보다 자세한 것은 예를 들어, 미국 특허 제4,736,866호를 참조한다.
본 발명의 목적상, 형질전환 동물에는 일부 세포에만 형질전이유전자가 있는 동물 ("모자이크 동물")이 포함된다. 형질전이유전자는 단일 형질전이유전자 또는 콘카타머 (concatamer), 예컨대, 헤드-대-헤드 또는 헤드-대-테일 텐덤으로서 삽입될 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Lasko et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 6232-636 (1992))의 기술에 따라 형질전이유전자를 특정 세포형내로 선별적으로 도입하는 것도 가능하다. 형질전환 동물내 형질전이유전자의 발현은 표준 기술로 관찰할 수 있다. 예를 들어, 서던 블롯 분석 또는 PCR 증폭을 이용하여 형질전이유전자의 삽입을 확인할 수 있다. 이어서, 제자리 혼성화 (in situ hybridization), 노던 블롯 분석, PCR 또는 면역세포화학과 같은 기술을 이용하여 mRNA 발현도를 조사할 수 있다. 추가로, 상기 형질전환 동물에서 종양 또는 암 발달의 증상을 더 조사한다.
별법으로, 본원에서 확인된 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 내인성 유전자와 동물의 배아세포내로 도입된 것과 동일한 폴리펩티드를 코딩하는 변이 게놈 DNA 사이의 상동 재조합 결과로서, 상기 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 결손 또는 변이 유전자를 갖는 "넉아웃" 동물을 제작할 수 있다. 예를 들면, 확립된 기술에 따라 특정 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA를 사용하여 상기 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA를 클로닝할 수 있다. 특정 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 게놈 DNA의 일부는 결실할 수 있거나, 삽입을 관찰하는 데 사용할 수 있는 선별가능한 마커를 코딩하는 유전자와 같은 또다른 유전자로 대체될 수 있다. 전형적으로, 벡터는 (5' 및 3' 말단 둘다에서) 변이되지 않은 수백 킬로베이스의 플랭킹 DNA를 포함한다. 상동 재조합 벡터의 설명에 대해서는 예컨대, 문헌 (Thomas and Capecchi, Cell, 51: 503 (1987))을 참조한다. 벡터를 (예를 들어, 일렉트로포레이션으로) 배아 줄기 세포주내로 도입하고, 도입된 DNA가 내인성 DNA와 상동 재조합된 세포를 선별한다 (예를 들어, Li et al., Cell. 69: 915 (1992) 참조). 그 다음으로, 선별된 세포를 동물 (예컨대, 마우스 또는 래트)의 포배내에 주사하여 침전 키메라를 형성한다 (예컨대, Bradley, in Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach. E. J. Robertson, ed. (IRL: Oxford, 1987), pp. 113-152 참조). 그 다음, 키메라 배아를 적당한 가임신 암컷 양육 동물 내에 이식할 수 있고, 이 배아로 인해 "넉아웃" 동물이라는 용어가 생겨났다. 표준 기술를 이용하여 상동 재조합 DNA가 생식세포내에 있는 새끼를 확인할 수 있고, 이 새끼를 사용하여 모든 세포가 상동 재조합 DNA를 함유하는 동물을 육종할 수 있다. 예를 들어, 넉아웃 동물의 특징은 일부 병적 상태에 대한 방어 능력, 및 PRO 폴리펩티드의 부재로 인한 병적 상태의 발달일 수 있다.
자연발생적인 동물 종양의 치료에 있어서 본원에서 확인한 PRO 폴리펩티드에 특이적으로 결합하는 항체 및 기타 약물 후보물질의 효능도 시험할 수 있다. 이러한 연구에 적합한 표적은 고양이 구강 편평 세포암 (SCC)이다. 고양이 구강 SCC는 이 종에서 보고된 구강암의 60% 이상을 차지하는 가장 흔한 고양이 구강 악성종양인 고침습 악성 종양이다. 이러한 저발생 전이가 단지 이 종양이 있는 고양이의 짧은 수명을 반영할 수 있다고 하더라도, 상기 종양은 거의 다른 부위로 전이되지 않는다. 이들 종양은 주로 고양이 구강의 해부구조 때문에 통상적으로 외과수술로 치료되지 않는다. 현재, 이 종양에 대한 효과적인 치료법은 없다. 연구로 들어가기 전, 각 고양이는 완전한 임상 조사 및 생검을 하고, 전산화 단층촬영술 (CT)로 스캐닝한다. 설하 구강 편평 세포 종양으로 진단받은 고양이는 연구에서 제외한다. 혀가 이러한 종양의 결과로 마비될 수 있고, 치료로 종양을 없앨 수 있다 하더라도, 동물은 스스로 먹을 수 없다. 각 고양이를 보다 장시간 동안 반복해서 치료한다. 종양의 사진을 치료 기간동안 매일 촬영한 후, 각각을 재조사한다. 치료 후, 각 고양이를 또다른 CT 스캔한다. 그 후, CT 스캔 및 흉부 방사선상은 8주마다 평가한다. 대조구와 비교할 때 생존, 반응 및 독성의 차이점에 대해 데이타를 평가한다. 양성 반응은 종양 퇴행, 바람직하게는 삶의 질 향상 및(또는) 늘어난 수명의 증거를 요구할 수 있다.
추가로, 섬유육종; 선암종; 림프종; 연골종; 또는 개, 고양이 및 개코원숭이의 평활근육종과 같은 기타 자연발생적 동물 종양도 시험할 수 있다. 이들 중, 개 및 고양이의 유방 선암종은 그의 외관 및 행동이 사람의 유방 선암종과 매우 유사하기 때문에 바람직한 모델이다. 그러나, 이 모델의 용도는 동물에서 이러한 형태의 종양 발생이 드물기 때문에 제한된다.
당업계에 공지된 다른 시험관내 및 생체내 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 시험도 본원에 적합하다.
ii. 조직 분포
본원에서 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 검정법의 결과는 다른 연구, 예컨대, 다양한 인간 조직의 mRNA 발현을 측정하는 것으로 입증할 수 있다.
전술한 바와 같이, 다양한 조직에 있어서의 유전자 증폭 및(또는) 유전자 발현은 본원에 제공된 서열을 기초로 한 적당한 표지 프로브를 사용하여 통상적인 서던 블롯팅, mRNA의 전사를 정량하기 위한 노던 블롯팅 (Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 5201-5205 (1980)), 돗 블롯팅 (DNA 분석) 또는 제자리 혼성화로 측정할 수 있다. 별법으로, DNA 이중쇄, RNA 이중쇄 및 DNA-RNA 하이브리드 이중쇄나 DNA-단백질 이중쇄를 포함한 특정 이중쇄를 인식할 수 있는 항체를 사용할 수 있다.
별법으로, 다양한 조직의 유전자 발현은 면역학적 방법, 예컨대, 조직 절편의 면역조직학적 염색; 및 세포 배양물 또는 체액의 검정을 통해 측정하여 유전자 산물의 발현을 직접 정량할 수 있다. 면역조직학적 염색 및(또는) 샘플액의 검정에 유용한 항체는 모노클로날 또는 폴리클로날일 수 있고, 임의의 포유동물에서 제조할 수 있다. 편리하게는, 천연-서열 PRO 폴리펩티드, 또는 본원에 제공된 DNA 서열이나 특정 항체 에피토프를 코딩하는, PRO DNA에 결합된 외인성 서열을 기초로 한 합성 펩티드에 대한 항체를 제조할 수 있다. 항체를 생성시키기 위한 일반 기술, 및 제자리 혼성화를 위한 특별한 프로토콜은 하기에 제공된다.
iii. 항체 결합 연구
심혈관, 내피세포 및 혈관신생 연구의 결과는 항체 결합 연구로 더 입증할 수 있는데, 상기 항체 결합 연구에서 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 검정법에서 사용된 내피세포 또는 다른 세포에 대한 PRO 폴리펩티드의 효과를 억제하는 항-PRO 항체의 능력을 시험한다. 예시적 항체에는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 인 간화된 항체, 이중특이적 항체 및 헤테로컨쥬게이트 항체가 포함되고, 이 항체들의 제조는 하기에 기재할 것이다.
항체 결합 연구는 임의의 공지된 검정 방법, 예컨대, 경쟁적 결합 검정법, 직간접 샌드위치 검정법 및 면역침전 검정법을 이용하여 수행할 수 있다 (Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc., 1987), pp. 147-158).
경쟁적 결합 검정법은 제한된 양의 항체와 결합하기 위해 시험 샘플 분석물과 경쟁하는 표지된 표준물의 능력에 의존한다. 상기 시험 샘플에 있는 표적 단백질의 양은 항체에 결합하게 되는 표준물의 양과 반비례한다. 결합하게 되는 표준물의 양을 측정하기 쉽게 하기 위해, 바람직하게는 경쟁 전 또는 후에 항체를 불용화시켜서 상기 항체에 결합하는 표준물 및 분석물을 비결합 상태로 남은 표준물 및 분석물로부터 편리하게 분리할 수 있다.
샌드위치 검정법은 검출할 단백질의 상이한 면역원성 부위 또는 에피토프에 각각 결합할 수 있는 두 항체를 사용한다. 샌드위치 검정법에서, 시험 샘플 분석물은 고형 지지체에 부착된 제1항체와 결합한 후, 제2 항체가 상기 분석물에 결합하여 불용성 3부 결합체를 형성한다 (예를 들면, 미국 특허 제4,376,110호 참조). 제2 항체는 그 자체가 검출가능한 잔기로 표지되거나 (직접 샌드위치 검정법), 검출가능한 잔기로 표지된 항-이뮤노글로불린 항체를 사용하여 측정할 수 있다 (간접 샌드위치 검정법). 예를 들면, 샌드위치 검정법의 한 유형은 검출가능한 잔기가 효소인 ELISA 검정법이다.
면역조직화학의 경우, 조직 샘플은 신선한 것이거나 동결된 것일 수 있고, 또는 파라핀에 함몰시키고 예를 들어, 포르말린과 같은 방부제로 고정시킬 수 있다.
iv. 세포를 사용한 종양 검정법
종양과 같은 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 질환의 세포-기재 검정법 및 동물 모델은 본원의 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 검정법의 발견을 입증하는 데, 그리고 추가로 본원에서 확인된 유전자와, 원하지 않는 심혈관 세포, 내피세포 및 혈관신생 세포 증식의 발달 및 병리과정 사이의 관계를 이해하는 데 이용할 수 있다. 원하지 않은 심혈관 세포, 내피세포 및 혈관신생 세포 증식, 예컨대, 종양 세포의 발달 및 병리과정에 있어서 본원에서 확인된 유전자 산물의 역할은 본원의 PRO 폴리펩티드에 의해 자극되거나 억제되는 것으로 확인된 세포 또는 세포주를 사용하여 시험할 수 있다. 이러한 세포에는 예를 들어, 하기 실시예에 기재된 것들이 포함된다.
다른 방법에서, 특정한 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환과 관련된 것으로 공지된 세포 유형의 세포를 본원의 cDNA로 형질감염시키고, 과도한 증식을 유도하거나 증식을 억제하는 이들 cDNA의 능력을 분석한다. 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환이 암인 경우, 적합한 종양세포에는 예를 들어, B104-1-1 세포주 (neu 원종양유전자로 형질감염된 안정한 NIH-3T3 세포주) 및 ras-형질감염된 NIH-3T3 세포와 같은 안정한 종양 세포주가 포함되는데, 이 종양 세포주를 원하는 유전자로 형질감염시켜 종양 증식에 대해 관찰할 수 있다. 그 다음으 로, 이러한 형질감염된 세포주는 형질전환된 세포의 증식에 대한 세포활동 억제 활성 또는 세포독성 활성을 발휘하거나, 항체-의존성 세포의 세포독성 (ADCC)을 매개하여 종양세포 증식을 억제하는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항체 조성물의 능력을 시험하는 데 사용할 수 있다. 본원에서 확인된 유전자의 코딩 서열로 형질감염된 세포는 암과 같은 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료용 약물 후보물질을 확인하는 데 사용할 수도 있다.
또한, 안정한 세포주가 바람직하다 하더라도, 형질전환 동물 (상기 기재됨)의 종양으로부터 유래된 1차 배양물을 본원의 세포 사용 검정법에 사용할 수 있다. 형질전환 동물로부터 연속 세포주를 유도하는 기술은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, Small et al., Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 (1985) 참조).
v. 유전자 치료법
본원의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 폴리펩티딜 아고니스트 및 폴리펩티딜 길항제는 본 발명에 따라 상기 폴리펩티드를 발현시켜 사용할 수 있는데, 이것은 흔히 유전자 치료법이라 불린다.
환자 세포내로 핵산 (임의로는 벡터에 포함되어 있음)을 도입하는 두 가지 방법, 즉 생체내 및 생체외 방법이 있다. 생체내 전달의 경우, 핵산은 대개 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드가 필요한 부위, 즉 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 합성 부위, 및 알려져 있다면, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 생물학적 활성이 필요한 부위 (예, 창상)에서 환자 내로 직접 주사한다. 생체외 치료의 경우, 환자의 세포를 적출하고, 핵산을 이들 단리된 세포내로 도입한 다음, 형질전환된 세포를 환자에게 직접 투여하거나, 예를 들어, 환자내로 이식되는 다공성 막내에 캡슐화시켜 환자에게 투여한다 (예컨대, 미국 특허 제4,892,538호 및 제5,283,187호 참조). 핵산을 생존가능한 세포 내로 도입하는 데 이용가능한 다양한 기술이 있다. 이 기술은 핵산이 시험관내에서 배양된 세포내로 전달되는지 생체내에서 의도한 숙주 세포내로 전달되는지에 따라 다양하다. 시험관내에서 포유동물 세포내로 핵산을 전달하기에 적합한 기술에는 리포좀의 사용, 일렉트로포레이션, 미세주입, 형질도입 (transduction), 세포 융합, DEAE-덱스트란, 칼슘 포스페이트 침전법 등이 포함된다. 형질도입은 세포 수용체와 복제-결함성 재조합 바이러스 (바람직하게는 레트로바이러스) 입자를 결합시킨 후, 상기 입자에 함유된 핵산을 세포 내로 도입하는 것을 포함한다. 유전자의 생체외 전달을 위해 통상적으로 사용되는 백터는 레트로바이러스이다.
현재 바람직한 생체내 핵산 전달 기술에는 바이러스 벡터 또는 바이러스가 아닌 벡터 (예컨대, 아데노바이러스, 렌티바이러스, 헤르페스 심플렉스 I 바이러스 또는 아데노-관련 바이러스 (AAV)) 및 지질-매개 전달계 (유전자의 지질-매개 전달에 유용한 지질은 예를 들어, DOTMA, DOPE 및 DC-Chol임, 예컨대, Tonkinson et al., Cancer Investigation, 14 (1): 54-65 (1996) 참조)가 포함된다. 유전자 치료법에 사용하기에 가장 바람직한 벡터는 바이러스, 가장 바람직하게는 아데노바이러스, AAV, 렌티바이러스 또는 레트로바이러스이다. 레트로바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터에는 1종 이상의 전사 프로모터/인핸서 또는 좌위-정의 요소(들), 또는 얼터네이티브 스플리싱 (alternative splicing), 핵 RNA 유출 또는 메신저의 번역 후 수식과 같은 다른 방식으로 유전자 발현을 조절하는 기타 요소가 포함된다. 또한, 레트로바이러스와 같은 바이러스 벡터가 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 존재하에 전사되는 경우, 상기 벡터에는 상기 유전자에 작동가능하게 결합되어 번역 개시 서열로 작용하는 핵산 분자가 포함된다. 또한, 이러한 벡터 구조물에는 패키징 신호, 긴 말단 반복부 (LTR) 또는 그의 일부, 사용되는 바이러스에 적합한 음성 가닥 프라이머 결합 부위 (이들이 바이러스 벡터에 이미 존재하지 않는 경우)가 포함된다. 또한, 이러한 벡터에는 전형적으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 포함하는 숙주 세포로부터의 상기 폴리펩티드의 분비를 위한 신호 서열이 포함된다. 바람직하게는, 이 목적을 위한 신호 서열은 포유동물의 신호 서열, 가장 바람직하게는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드용 천연 신호 서열이다. 임의로, 상기 벡터 구조물에는 한 개 이상의 제한효소 부위 및 번역 종결 서열 뿐만 아니라 폴리아데닐화를 지시하는 신호도 포함될 수 있다. 예를 들면, 이러한 벡터에는 전형적으로 5'LTR, tRNA 결합 부위, 패키징 신호, 제2 가닥 DNA 합성 기점, 및 3'LTR 또는 그의 일부가 포함될 것이다. 양이온성 지질, 폴리라이신 및 덴드리머와 같은 바이러스가 아닌 기타 벡터를 사용할 수 있다.
몇몇 경우에서, 표적 세포를 목표로 하는 물질, 예컨대, 세포 표면 막단백질 또는 표적 세포에 대해 특이적인 항체, 표적 세포의 수용체에 대한 리간드 등을 핵산 공급원에 제공하는 것이 바람직하다. 리포좀이 사용되는 경우, 세포내이입 (endocytosis)과 관련된 세포 표면 막단백질에 결합하는 단백질은 예컨대, 켑시드 단백질 또는 특정한 세포 유형에 친화적인 그의 단편, 시클링시 내재화를 겪는 단백질에 대한 항체, 및 세포내 위치결정을 목표로 하고 세포내 반감기를 증가시키는 단백질을 표적화하고(거나) 용이하게 받아들이는 데 사용될 수 있다. 수용체-매개 세포내이입의 기술은 예를 들어, 문헌 (Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); and Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990))에 기재되어 있다. 현재 공지된 유전자 표시 (marking) 및 유전자 치료법 프로토콜의 검토를 위해서는 문헌 (Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992))을 참조한다. 또한, WO93/25673 및 본원에서 언급한 문헌들을 참조한다.
레트로바이러스 입자 및 구조 단백질을 만드는 데 적합한 유전자 치료법 및 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,681,746호에서 찾을 수 있다.
vi. 진단수단으로서의 유전자 용도
본 발명은 진단수단으로서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 용도에 관한 것이기도 하다. 돌연변이 형태의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 검출하는 것은 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 돌연변이가 종양을 일으킬 수 있기 때문에 종양과 같은 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환, 또는 이들 질환에 대한 감수성을 진달할 수 있게 할 것이다.
인간 PRO179, 인간 PRO238, 인간 PRO364, 인간 PRO844, 인간 PRO846, 인간 PRO1760, 인간 PRO205, 인간 PRO321, 인간 PRO333, 인간 PRO840, 인간 PRO877, 인간 PRO878, 인간 PRO879, 인간 PRO882, 인간 PRO885 또는 인간 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자의 돌연변이를 수반하는 개체는 다양한 기술로 DNA 수준에서 검출할 수 있다. 진단용 핵산은 혈액, 소변, 침, 조직 생검 및 부검 물질과 같은 환자의 세포로부터 수득할 수 있다. 게놈 DNA는 검출에 직접 사용할 수 있고, 또는 분석 전에 PCR (Saiki et al., Nature, 324: 163-166 (1986))을 이용하여 효소적으로 증폭시킬 수 있다. RNA 또는 cDNA는 상기와 동일한 목적에 사용할 수도 있다. 예로서, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 를 코딩하는 핵산에 상보적인 PCR 프라이머를 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 돌연변이체를 확인 및 분석할 수 있다. 예컨대, 결실 및 삽입은 정상 유전형과 비교할 때 증폭된 생성물의 크기 변화로 검출할 수 있다. 점돌연변이는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 방사선표지된 RNA, 또는 별법으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 방사선표지된 안티센스 DNA 서열과 증폭된 DNA를 혼성화시켜 확인할 수 있다. 완전히 일치하는 서열은 RNase A 절단, 또는 융점의 차이를 통해 일치하지 않는 이중쇄와 구별할 수 있다.
DNA 서열 차이를 기초로 한 유전자 시험은 변성제가 있거나 없이 겔에서 DNA 단편의 전기영동 이동에 있어서의 변화를 검출하여 달성할 수 있다. 소규모 서열 결실 및 삽입은 고해상 전기영동으로 관찰할 수 있다. 다양한 서열의 DNA 단편은 변성 포름아미딘 농도구배 겔에서 구별할 수 있는데, 여기서 여러 가지 DNA 단편의 이동성은 이들의 특정 융점 또는 부분 융점에 따라 겔의 다양한 위치에서 지연된다 (예컨대, Myers et al., Science, 230: 1242 (1985) 참조).
특정 위치에서의 서열 변화는 예를 들어, RNase 및 S1 보호 방법 또는 화학적 절단 방법과 같은 뉴클리아제 보호 검정법에 의해 나타날 수도 있다 (Cotten et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4397-4401 (1985)).
따라서, 혼성화, RNase 보호법, 화학적 절단법, 직접 DNA 시퀀싱, 제한효소의 사용, 예컨대 제한 단편 길이 다형성 (RFLP), 및 게놈 DNA의 서던 블롯팅과 같은 방법으로 특정 DNA 서열을 검출할 수 있다.
vii. PRO 폴리펩티드 농도를 검출하는 용도
통상적인 겔 전기영동 및 DNA 시퀀싱 이외에도 제자리 분석 (in situ analysis)으로 돌연변이체를 검출할 수도 있다.
PRO 폴리펩티드를 코딩하는 핵산의 발현은 종양 형성과 관련된 혈관 질환 또는 혈관형성과 연관성이 있을 수 있다. PRO 폴리펩티드에 신호 서열이 있고, mRNA가 내피세포에서 많이 발현되고 평활근세포에서 보다적은 농도로 발현되는 경우, 이는 PRO 폴리펩티드가 혈청에 존재함을 나타낸다. 따라서, 이 PRO 폴리펩티드의 바뀐 농도가 이러한 질환의 표시일 수 있기 때문에 항-PRO 폴리펩티드 항체는 종양 형성과 관련된 혈관 질환 또는 혈관형성을 진단하는 데 사용할 수 있다.
경쟁적 검정법도 사용할 수 있는데, 여기서 상기 PRO 폴리펩티드에 특이적인 항체는 고형 지지체에 부착시키고, 표지된 PRO 폴리펩티드 및 숙주로부터 유래된 샘플은 상기 고형 지지체를 통과시키고, 상기 고형 지지체에 부착된 표지의 검출량은 샘플 중의 PRO 폴리펩티드의 양과 상관관계가 있을 수 있다.
viii. 염색체 맵핑(Chromosome mapping)
본 발명의 서열은 염색체 확인에도 가치가 있다. 본 서열은 개별 인간 염색체 상의 특정 위치에 특이적으로 표적화되어 상기 특정 위치와 혼성화할 수 있다. 게다가, 현재 염색체 상의 특정 부위를 확인할 필요가 있다. 현재, 실제 서열 데이타 (반복부 다형성)를 기초로 한 소수의 염색체 표시 시약을 사용하여 염색체에서의 위치를 표시할 수 있다. 본 발명에 따라 DNA를 염색체에 맴핑하는 것은 상기 DNA 서열과 질환과 관련된 유전자를 연관시키는 데 있어서 중요한 첫 단계이다.
간단하게 말하면, cDNA로부터 PCR 프라이머 (바람직하게는 15-25 bp)를 제조함으로써 서열을 염색체에 맴핑할 수 있다. 3'-비번역 영역에 대한 컴퓨터 분석은 게놈 DNA에서 한 개 이상의 엑손에 걸쳐 있지 않은 프라이머를 신속히 선별하는 데 을 이용하므로 증폭 과정이 복잡해진다. 그 다음으로, 이들 프라이머는 개별 인간 염색체를 함유하는 체세포 하이브리드의 PCR 스크리닝에 사용한다. 상기 프라이머에 상응하는 인간 유전자를 함유하는 하이브리드만이 증폭된 단편을 제공할 것이다.
체세포 하이브리드의 PCR 맴핑은 특정 DNA를 특정 염색체에 할당하는 신속한 방법이다. 동일한 올리고뉴클레오티드 프라이머를 쓰는 본 발명을 이용하여, 유사한 방식으로 특정 염색체 또는 큰 게놈 클론 집단으로부터 수득한 단편 판넬로 서브로칼리제이션(sublocalization)할 수 있다. 염색체에 맴핑하는 데 유사하게 사용할 수 있는 다른 맴핑 방법에는 제자리 혼성화, 표지된 유량-분류 염색체를 사용한 예비스크리닝, 및 염색체-특정 cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 혼성화에 의한 예비선별이 포함된다.
cDNA 클론과 중기 염색체 스프레드의 형광 제자리 혼성화 (FISH)는 한 단계로 정확한 염색체 위치를 알아내는 데 이용할 수 있다. 이 기술은 500 또는 600 개의 염기만큼 짧은 cDNA를 사용할 수 있지만, 2,000 bp보다 큰 클론은 단순 검출에 충분한 신호 강도로 유일한 염색체 위치에 결합할 가능성이 보다 높다. FISH는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자가 유래한 클론의 사용을 필요로 하고, 이 클론은 길수록 더 좋다. 예를 들어, 2,000 bp는 좋고, 4,000 bp는 더 좋지만, 4,000 bp 이상은 시간과 좋은 결과의 적당한 비율을 얻는 데 필요한 것은 아닌 것 같다. 이 기술의 검토를 위해서는 문헌 (Verma et al., Human Chromosomes: a Manual of Basic Techniques (Pergamin Press, New York, 1988))을 참조한다.
일단 서열이 정확한 염색체 위치에 맴핑되면, 염색체에서의 서열의 물리적 위치는 유전적 맴 데이타와 상관성이 있을 수 있다. 이러한 데이타는 예를 들어, 문헌 (V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man (존 홉킨스 유니버시티 웰치 메디칼 라이브러리로부터 온라인으로 이용가능함))에서 찾을 수 있다. 그 다음으로, 동일한 염색체 영역에 맴핑된 유전자와 질환 사이의 관계를 링키지 분석 (linkage analysis) (물리적으로 인접한 유전자의 동시유전)을 통해 확인한다.
그 다음, 병에 걸린 개체와 병에 걸리지 않은 개체 사이의 cDNA 또는 게놈 서열의 차이점을 결정할 필요가 있다. 만약 돌연변이가 병에 걸린 일부 또는 모든 개체에서 관찰되지만, 임의의 정상 개체에서는 관찰되지 않으면, 이 돌연변이는 질환의 원인일 수 있다.
물리적 맴핑 및 유전적 맴핑 기술의 현재 해상력으로 볼 때, 질환과 관련된 염색체 영역에 정확히 위치한 cDNA는 50 내지 500개 (이것은 맴핑 해상력이 1 메가 염기이고 20 kb 당 한 개의 유전자가 있다고 가정할 경우임)의 잠재적인 원인 유전자들 중 하나일 수 있다.
ix. 약물 후보물질에 대한 스크리닝 검정법
본 발명은 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 흉내내는 화합물 (아고니스트), 또는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 효과를 방해하는 물질 (길항제)을 확인하기 위해 화합물을 스크리닝하는 방법도 포함한다. 길항제 약물 후보물질에 대한 스크리닝 검정법은 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드와 결합하거나, 결합체를 형성하는 화합물, 또는 다른 세포 단백질과 코딩된 폴리펩티드의 상호작용을 방해하는 화합물을 확인할 수 있도록 디자인한다. 이러한 스크리닝 검정법은 소분자 약물 후보물질을 확인하기에 특히 적합하게 하는, 대량으로 화학적 라이브러리를 스크리닝할 수 있는 검정법을 포함할 것이다.
상기 검정법은 단백질-단백질 결합 검정법, 생화학적 스크리닝 검정법, 면역검정법 및 세포를 사용한 검정법을 비롯하여 다양한 형식으로 수행할 수 있고, 이들의 특징은 당업계에 잘 규명되어 있다.
길항제에 대한 모든 검정법은 약물 후보물질이 본원에서 확인된 핵산에 의해 코딩된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드와 상호작용하기에 충분한 조건하에서 충분한 시간동안 이들 두 성분이 접촉하는 것을 요구한다는 점에서 같다.
결합 검정법에서, 상기 상호작용은 결합이고, 형성된 결합체는 반응 혼합물에서 단리 또는 검출할 수 있다. 구체적인 실시양태에서, 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 또는 약물 후보물질은 공유결합 또는 비공유결합 부착에 의해 고상, 예컨대, 마이크로타이터 플레이트 상에 부착되어 있다. 비공유결합 부착은 일반적으로 고체 표면을 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 용액으로 코팅하고 건조하여 달성한다. 별법으로, 부착될 항체, 예를 들어, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대해 특이적인 모노클로날 항체는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 고체 표면에 부착시키는 데 사용할 수 있다. 상기 검정은 검출가능한 표지로 표지될 수 있는 비부착된 성분을 부착된 성분, 예컨대, 부착된 성 분을 함유하는 코팅 표면에 첨가함으로써 수행된다. 반응이 완결될 때, 반응하지 않은 성분은 예를 들어, 세척하여 제거하고, 고체 표면 상에 부착된 결합체를 검출한다. 본래 부착되지 않은 성분이 검출가능한 표지를 수반하는 경우, 표면 상에 부착된 표지의 검출은 결합체 형성이 일어났음을 나타낸다. 본래 부착되지 않은 성분이 표지를 수반하지 않는 경우, 결합체 형성은 예컨대, 부착된 결합체에 특이적으로 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
후보 화합물이 본원에서 확인된 유전자에 의해 코딩되는 특정 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드와 상호작용하지만 결합하지 않는 경우, 상기 폴리펩티드와 후보 화합물의 상호작용은 단백질-단백질 상호작용을 검출하기 위한 공지된 방법으로 검정할 수 있다. 이러한 검정법에는 예를 들어, 교차-결합, 동시-면역침전, 및 농도구배 또는 크로마토그래피 컬럼을 통한 동시-정제와 같은 전통적인 방법이 포함된다. 또한, 단백질-단백질 상호작용은 문헌 (Chevray and Nathans, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5789-5793 (1991))에 개시된 바와 같은 필드 (Fields) 및 공동-연구자들의 문헌 (Fields and Song, Nature (London), 340: 245-246 (1989); Chien et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 9578-9582 (1991))에 기재된 효모 유전계를 사용하여 관찰할 수 있다. 효모 GAL4와 같은 많은 전사 활성자는 물리적으로 구별되는 두 개의 조절 도메인으로 구성되어 있는데, 하나는 DNA-결합 도메인으로 작용하고 다른 하나는 전사-활성화 도메인으로 작용한다. 상기 문헌에 기재된 효모 발현계 (일반적으로 " 투-하이브리드 시스템"으로 불림)는 이 특성을 이용하여 두 가지 하이브리드 단백질을 사용하는데, 한 개의 하이브리드 단백질은 표적 단백질이 GAL-4의 DNA-결합 도메인에 결합된 것이고, 또다른 하이브리드 단백질은 후보 활성화 단백질이 활성화 도메인에 결합된 것이다. GAL4-활성화 프로모터의 조절하의 GAL1-lacZ 레포터 유전자의 발현은 단백질-단백질 상호작용을 통한 GAL4 활성의 재구성에 달려 있다. 상호작용하는 폴리펩티드를 함유하는 클론은 β-갈락토시다제에 대한 정색 기질로 검출한다. 투-하이브리드 기술을 이용하여 두 개의 특정 단백질 사이의 단백질-단백질 상호작용을 확인하기 위한 완전한 키트 (MATCHMAKER(상표명))가 클론텍으로부터 시판된다. 이 계는 이들 상호작용에 중요한 핀포인트 아미노산 잔기 뿐만 아니라 특정한 단백질 상호작용에 관여하는 단백질 도메인을 맴핑하는 데에도 사용할 수 있다.
본원에서 확인된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자와 다른 세포내 또는 세포외 성분의 상호작용을 방해하는 화합물은 하기와 같이 시험할 수 있다. 통상적으로, 상기 유전자의 산물과 세포내 또는 세포외 성분을 함유한 반응 혼합물은 이들 두 생성물을 상호작용시키고 결합시키는 조건하에서 충분한 시간동안 제조한다. 결합을 억제하는 후보 화합물의 능력을 시험하기 위해, 반응은 시험 화합물의 존재 및 부재하에 수행한다. 또한, 위약을 제3 반응 혼합물에 첨가하여 양성 대조구로 사용할 수 있다. 상기 혼합물에 존재하는 시험 화합물과 세포내 또는 세포외 성분 사이의 결합 (결 합체 형성)은 상기에 기재한 바와 같이 관찰한다. 대조 반응물(들)에는 결합체가 형성되지만 시험 화합물을 함유하는 반응 혼합물에는 결합체가 형성되지 않는 것은 시험 화합물이 후보 화합물과 그의 반응 파트너의 상호작용을 방해한다는 것을 나타낸다.
만약 PRO 폴리펩티드가 코-마이토겐 ConA의 존재 하에 내피세포의 증식을 자극하는 능력을 갖는다면, 이 능력을 이용하는 스크리닝 방법의 한 예가 있다. 구체적으로는, 증식 검정법에서 인간 배꼽정맥 내피세포를 수득하여 96-웰 평편-바닥 배양 플레이트에서 배양하고 (Costar, Cambridge, MA), 세포의 증식을 촉진하기에 적합한 반응 혼합물, 즉 Con-A를 함유한 혼합물 (Calbiochem, La Jolla, CA)로 보충한다. Con-A 및 스크리닝할 화합물을 첨가하고 37℃에서 배양한 후, 3H-티미딘을 펄스를 통해 배양물에 넣고 유리 섬유 필터 (phD:; Cambridge Technology, Watertown, MA) 위에서 세포를 모았다. 액체 신틸레이션 카운터 (Beckman Instrument, Irvine, CA)를 사용하여 삼중 배양물의 평균 3H-티미딘 삽입양 (cpm)을 계산한다. 상당한 3H-티미딘 삽입은 내피세포 증식의 자극을 나타낸다.
길항제를 검정하기 위해, 상기 검정법을 수행하나, 이 검정법에서 PRO 폴리펩티드를 스크리닝할 화합물과 함께 첨가하고, PRO 폴리펩티드의 존재하에서 3(H)-티미딘 삽입을 억제하는 화합물의 능력은 상기 화합물이 PRO 폴리펩티드에 대한 길항제임을 나타낸다. 별법으로, 길항제는 경쟁적인 억제 검정법에 적당한 조건하에 서 PRO 폴리펩티드 및 잠재적인 길항제를 막결합 PRO 폴리펩티드 수용체 또는 재조합 수용체와 결합시켜 검출할 수 있다. 상기 PRO 폴리펩티드는 방사능과 같은 것으로 표지할 수 있으므로, 수용체에 결합된 PRO 폴리펩티드의 수를 세어 잠재적인 길항제의 효능을 측정할 수 있다. 수용체를 코딩하는 유전자는 당업계에 공지된 다수의 방법, 예컨대, 리간드 패닝 및 FACS 분류로 확인할 수 있다 (Coligan et al., Current Protocols in Immun., 1(2): Chapter 5 (1991)). 바람직하게는, 발현 클로닝을 이용하는데, 여기서 폴리아데닐화된 RNA는 PRO 폴리펩티드에 반응하는 세포로부터 제조하고, 이 RNA로부터 만들어진 cDNA 라이브러리는 군으로 나누어 PRO 폴리펩티드에 반응하지 않는 COS 세포 또는 기타 세포를 형질감염시키는 데 사용한다. 유리 슬라이드 위에 자란 형질감염된 세포를 표지된 PRO 폴리펩티드에 노출시킨다. PRO 폴리펩티드는 부위-특이적 단백질 키나제에 대한 인식 부위의 요오드화 또는 포섭 (inclusion)을 비룻한 다양한 방법으로 표지할 수 있다. 고정 및 인큐베이션 후, 상기 슬라이드를 방사능 사진으로 분석한다. 양성 집단을 확인하고 하위집단을 준비한 후, 상호작용성 하위-집단화 (pooling) 및 재스크리닝 방법을 사용하여 다시 형질감염시킴으로써 최종적으로 잠정적인 수용체를 코딩하는 단일 클론을 얻는다.
수용체 확인을 위한 대안으로서, 표지된 PRO 폴리펩티드는 수용체 분자를 발현하는 세포막 또는 추출물과 광친화-결합시킬 수 있다. 가교결합된 물질을 PAGE로 해상하고 X-선 막에 노출시킨다. 수용체를 함유하는 표지된 결합체를 잘라내어 펩티드 단편으로 해상하고, 단백질 미세-시퀀싱할 수 있다. 잠정적인 수용체를 코 딩하는 유전자를 확인하기 위해, 미세-시퀀싱으로부터 얻은 아미노산 서열을 이용하여 cDNA 라이브러리의 스크리닝에 쓰이는 축퇴 (degenerate) 올리고뉴클레오티드 프로브의 세트를 디자인할 수 있다.
길항제에 대한 또다른 검정법에서, 수용체를 발현하는 포유동물 세포 또는 막 준비물은 후보 화합물의 존재하에서 표지된 PRO 폴리펩티드와 함께 인큐베이션한다. 그 다음으로, 이 상호작용을 상승시키거나 차단하는 화합물의 능력을 측정할 수 있다.
심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료에 유용한 조성물에는 표적 유전자 산물의 발현 및(또는) 활성을 억제하는 항체, 작은 유기 및 무기 분자, 펩티드, 포스포펩티드, 안티센스 및 리보자임 분자, 삼중-나선 분자 등이 포함되나, 여기에 제한되지 않는다.
잠재적인 길항제의 보다 구체적인 예로는 PRO 폴리펩티드와 이뮤노글로불린 의 융합체에 결합하는 올리고뉴클레오티드, 및 구체적으로는 인간 항체 및 항체 단편 뿐만 아니라, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체, 항체 단편, 단일쇄 항체, 항-이디오타입 항체, 및 이러한 항체 또는 단편의 키메라 또는 인간화된 항체를 비롯한 항체가 있으나, 이에 제한되지 않는다. 별법으로, 잠재적인 길항제는 밀접하게 관련된 단백질, 예를 들어, 수용체를 인식하나 효과를 나타내지 않아 PRO 폴리펩티드의 작용을 경쟁적으로 억제하는 PRO 폴리펩티드의 돌연변이 형태일 수 있다.
또다른 잠재적인 PRO 폴리펩티드 길항제 또는 아고니스트는 안티센스 기술을 이용하여 제조된 안티센스 RNA 또는 DNA 구조물인데, 여기서 안티센스 RNA 또는 DNA 분자는 표적 mRNA와 혼성화하여 단백질 번역을 방해함으로써 mRNA의 번역을 직접 차단하는 작용을 한다. 안티센스 기술은 삼중-나선 형성 또는 안티센스 DNA나 RNA를 통해 유전자 발현을 조절하는 데 사용할 수 있으며, 이들 방법 둘다는 DNA 또는 RNA와 폴리뉴클레오티드의 결합을 기초로 한다. 예를 들면, 본원의 성숙 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 5' 코딩부는 길이가 약 10 내지 40 bp인 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드를 디자인하는 데 사용한다. DNA 올리고뉴클레오티드는 전사 (triple helix - Lee et al., Nucl. Acids Res., 6: 3073 (1979); Cooney et al., Science, 241: 456 (1988); Dervan et al., Science, 251: 1360 (1991) 참조)에 관여하는 유전자의 영역에 상보적이어서 PRO 폴리펩티드의 전사 및 생성을 방해하도록 디자인한다. 안티센스 RNA 올리고뉴클레오티드는 생체내에서 mRNA와 혼성화하여 mRNA 분자가 PRO 폴리펩티드로 번역되는 것을 차단한다 (안티센스-Okano, Neurochem., 56: 560 (1991); Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988)). 상기 올리고뉴클레오티드를 세포에 전달하여 안티센스 RNA 또는 DNA가 생체내에서 발현되어 PRO 폴리펩티드의 생성을 억제할 수도 있다. 안티센스 DNA를 사용하는 경우, 표적 유전자 뉴클레오티드 서열의 번역-개시 부위, 예컨대, 약 -10과 +10 위치 사이의 서열로부터 유래한 올리고디옥시리보뉴클레오티드가 바람직하다.
안티센스 RNA 또는 DNA 분자의 길이는 일반적으로 약 5개 염기 이상, 약 10개 염기 이상, 약 15개 염기 이상, 약 20개 염기 이상, 약 25개 염기 이상, 약 30개 염기 이상, 약 35개 염기 이상, 약 40개 염기 이상, 약 45개 염기 이상, 약 50 개 염기 이상, 약 55개 염기 이상, 약 60개 염기 이상, 약 65개 염기 이상, 약 70개 염기 이상, 약 75개 염기 이상, 약 80개 염기 이상, 약 85개 염기 이상, 약 90개 염기 이상, 약 95개 염기 이상, 약 100개 염기 이상, 또는 그 이상이다.
잠재적인 길항제에는 활성 부위, 수용체 결합 부위, 또는 PRO 폴리펩티드의증식 인자나 다른 관련 결합 부위에 결합하는 소분자가 있다. 소분자의 예로는 작은 펩티드 또는 펩티드-유사 분자, 바람직하게는 가용성 펩티드, 및 합성 비펩티딜 유기 또는 무기 화합물이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
리보자임은 RNA의 특이적 절단을 촉매할 수 있는 효소계 RNA 분자이다. 리보자임은 상보적인 표적 RNA와의 서열 특이적 혼성화에 이은 핵산내부분해성 절단 (endonucleolytic cleavage)을 통해 작용한다.
잠재적인 RNA 표적내의 특이적인 리보자임 절단 부위는 공지된 기술로 확인할 수 있다. 더 자세한 내용은 문헌 (Rossi, Current Biology, 4: 469-471 (1994), and PCT 공개 번호 제WO 97/33551 (1997년 9월 18일 공개됨))을 참조한다.
전사를 억제하는 데 사용되는 삼중-나선 형성에 있어서의 핵산 분자는 단일 가닥이고 디옥시뉴클레오티드로 구성된다. 이들 올리고뉴클레오티드의 염기 조성은 일반적으로 퓨린 또는 피리미딘의 꽤 큰 스트레취가 이중쇄의 한 가닥에 존재ㅎ해야 하는 호그스틴 (Hoogsteen) 염기-짝짓기 규칙을 통해 삼중-나선 형성을 촉진하도록 디자인한다. 보다 자세한 내용은 문헌 (상기 PCT 공개 번호 제WO 97/33551호)을 참조한다.
이들 소분자는 본원에서 논의된 하나 이상의 임의의 스크리닝 검정법 및(또 는) 당업자에 잘 공지된 임의의 다른 스크리닝 기술로 확인할 수 있다.
x. 치료받아야 하는 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 형태
본원에 기재된 심혈관, 내피세포 및 혈관신생 검정법에서 활성을 나타내는 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제, 및(또는) 심혈관계에 위치하는 것으로 확인된 그의 유전자 산물은 당뇨병과 같이 혈관에 영향을 주는 전신질환을 포함하여 다양한 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 치료에 사용할 수 있다. 이들의 치료 용도에는 동맥, 모세혈관, 정맥, 및(또는) 림프관의 질환이 포함된다. 치료의 예로는 근육 소모병의 치료, 골다공증의 치료, 이식물 주위의 세포 증식을 자극하여 의도한 부위와 이식물의 부착을 용이하게 하는 이식물 고정에 있어서 보조, 조직 또는 혈청내 IGF의 안정성 증가 및, 적용가능하다면, IGF 수용체에 대한 결합 증가 (IGF가 시험관내에서 인간 골수 적혈구 및 과립성 전구세포 증식을 촉진하는 것으로 나타나기 때문임)가 있다.
PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제는 적혈구조혈 또는 과립구조혈을 자극하는 데; 조직, 예컨대 결합조직, 피부, 골, 연골, 근육, 폐 또는 신장의 재증식과 관련된 창상 또는 조직 재생 및 관련 치료를 자극하는 데; 혈관신생을 촉진하는 데; 내피세포의 이동을 자극하거나 억제하는 데; 및 혈관 평활근의 증식 및 내피세포 생성을 상승시키는 데 사용할 수도 있다. PRO 폴리펩티드 또는 길항제에 의해 매개되는 혈관신생의 증가는 허혈 조직, 및 관상 협착증을 수반하는 심장의 측부 관상 발달에 이롭다. 길항제는 이러한 폴리펩티드의 작용을 억제하는 데 사용하는데, 예를 들어, PRO 폴리펩티드가 창상 치유 또는 폐섬유증 과정동안 과도한 결합 조직의 생성을 촉진한다면 이러한 생성을 제한하는 데 사용한다. 이것은 급성 심근경색증 및 심부전의 치료를 포함할 것이다.
게다가, 본 발명은 근원적인 원인과 관계없이 치료 유효량의 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 투여하여 근원적인 원인과 관계없이 심비대증을 치료하는 것에 관한 것이다. 목적이 인간 환자의 치료라면, PRO 폴리펩티드로는 재조합 인간 PRO 폴리펩티드 (rhPRO 폴리펩티드)가 바람직하다. 심비대증의 치료는 임의의 다양한 단계에서 수행할 수 있는데, 상기 심비대증은 심근경색증, 고혈압, 비대증성 심근병증 및 판역류를 비롯한 다양한 병리적 상태로부터 발생할 수 있다. 치료는 근원적인 심장 질환과 관계 없이 심근의 구조적인 손상이 있거나 없는 심비대증의 모든 진행 단계까지 확장된다.
분자 자체를 사용할지, 아니면 이 분자에 대한 길항제와 반대로 작용하는, 임의의 특정 증상에 대한 그의 아고니스트를 사용할지를 결정하는 것은 본원의 분자가 심혈관형성, 내피세포 생성 또는 혈관신생을 촉진하는지, 아니면 이들 상태를 억제하는지에 주로 달려 있다. 예를 들어, 분자가 혈관신생을 촉진하면, 그의 길항제는 혈관신생을 제한하거나 방해하는 것이 필요한 질환의 치료에 유용하다. 이러한 질환의 예로는 혈관종과 같은 혈관 종양; 종양 혈관신생; 당뇨병성 망막병증 또는 미성숙 소아 망막병증, 또는 황반퇴행성 및 증식성 유리체망막병증과 관련된 망막, 맥락막, 각막에서의 혈관신생; 류마티스성 관절염; 크론병, 죽상경화증, 난소 과자극증후군, 건선, 혈관신생과 관련된 자궁내막증, 풍선 혈관성형술 후의 재발협착증, 예컨대 수술 후 형성되는 켈로이드에서 나타나는 반흔 조직의 과다형성, 심근경색증 후의 섬유증, 또는 폐섬유증과 관련된 섬유 손상이 있다.
그러나, 만약 상기 분자가 혈관신생을 억제하면, 이 분자는 상기 질환의 치료에 직접 사용할 수 있다.
한편, 상기 분자가 혈관신생을 자극하면, 말초 혈관 질환, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이나우드병 및 레이나우드 증후군, 동맥류, 대동맥 재발협착증, 혈전성정맥염, 림프관염, 림프부종, 창상 치유 및 조직 회복, 허혈, 재관류 손상, 협심증, 급성 심근경색증과 같은 심근경색증, 만성 심장 질환, 울혈성 심부전과 같은 심부전 및 골다공증과 같이 혈관신생이 바람직한 질환을 위해 그 자체 (또는 그의 아고니스트)를 사용할 수 있다.
그러나, 만약 상기 분자가 혈관신생을 억제하면, 상기 분자의 길항제는 혈관신생이 바람직한 상기 질환의 치료에 사용할 수 있다.
특정한 형태의 질환이 하기에 기재되어 있는데, 여기서 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 혈관-관련 약물 표적화에 유용한 것으로서, 또는 하기 질환의 치료 또는 예방용 치료 표적으로서 작용가능하다. 죽상경화증은 동맥벽내 지질 축적, 평활근 세포의 증식 및 섬유 조직의 형성으로 인한 동맥의 내막 비후화 플라크의 축적에 의해 특징지워지는 질환이다. 상기 질환은 임의의 기관에 있는 대동맥, 중동맥 및 소동맥에 영향을 줄 수 있다. 내피세포 및 혈관 평활근 세포 기능의 변화는 이들 플라크의 축적 및 퇴행을 조절하는 데 중요한 역활을 하는 것으로 알려져 있다.
고혈압은 전신 동맥, 폐동맥 또는 문맥계의 상승된 혈압에 의해 특징지워진 다. 상승된 혈압은 손상된 내피세포 기능 및(또는) 혈관 질환으로부터 초래되거나, 손상된 내피세포 기능 및(또는) 혈관 질환을 초래할 수 있다.
염증성 혈관염에는 거대 세포 동맥염, 타카야수 (Takayasu's) 동맥염, 결절성 다발동맥염 (미세혈관병증 형태를 포함함), 가와사키병 (Kawasaki's disease), 현미경 다발염, 베게너 (Wegener's) 육아종증, 및 다양한 감염-관련 혈관 질환 (헤노호-쉐라인 (Henoch-Schonlein) 자반증을 포함함)이 포함된다. 바뀐 내피세포 기능은 이들 질환에서 중요한 것으로 나타났다.
레이나우드병 및 레이나우드 증후군은 추위에 노출시 사지를 통해 순환의 비정상적인 간헐적 손상에 의해 특징지워진다. 바뀐 내피세포 기능은 이 질환에서 중요한 것으로 보인다.
동맥류는 바뀐 내피세포 및(또는) 혈관 평활근 세포와 관련된 동맥계 또는 정맥계의 낭상형 또는 방추형 팽창이다.
동맥 재발협착증 (동맥벽의 재발협착증)은 내피세포 및 혈관 평활근 세포의 기능 및 증식에 있어서의 변화의 결과로서 혈관성형술 후에 발생할 수 있다.
혈전성정맥염, 림프관염은 바뀐 내피세포 기능으로부터 초래할 수 있고(거나), 바뀐 내피세포 기능을 초래할 수 있는 정맥 및 림프관 각각의 염증성 질환이다. 유사하게, 림프부종은 내피세포 기능으로부터 발생되는 손상된 림프 혈관을 수반하는 질환이다.
양성 및 악성 혈관 종양 족은 혈관계 세포 요소의 비정상적인 증식 및 증식에 의해 특징지워진다. 예컨대, 림프관종은 신생아에서 흔히 발생하는 선천성 림 프관 기형(종종 낭성임)인 림프계의 양성 종양이다. 낭성 종양은 인접한 조직내까지 증식하는 경향이 있다. 낭성 종양은 대개 자궁 및 겨드랑 부위에서 발생한다. 이들은 사지의 연조직에서도 발생할 수 있다. 주요 증상은 부풀어 있고 종종 그물모양 구조인 림프관, 및 결합조직에 의해 둘러쌓인 림프구이다. 림프관종은 부적절하게 결합된 배아 림프관 또는 이들의 결핍에 의해 발생되는 것으로 생각된다. 손상된 국소 림프 배출이 그 결과이다 (Griener et al., Lymphology, 4: 140-144 (1971)).
본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 또다른 용도는 종양이 증식하고(거나) 전이할 수 있게 하는 종양의 혈관형성을 수반하는 종양 혈관신생의 예방에 있다. 이 과정은 새로운 혈관의 증식에 달려 있다. 종양 혈관신생을 수반하는 종양 및 관련 질환의 예로는 유방암, 폐암, 위암, 식도암, 결장직장암, 간암, 난소암, 난포막종, 남성배세포종, 자궁암, 자궁내막암, 자궁내막 증식증, 자궁내막증, 섬유육종, 융모막종, 머리 및 목 암, 비강인두암, 후두암, 간모세포종, 카포시 육종, 흑색종, 피부암, 혈관종, 해면혈관종, 혈관모세포종, 췌장암, 망막모세포종, 성상세포종, 교모세포종, 슈반종, 핍지교종, 수모세포종, 신경모세포종, 횡문근육종, 골육종, 평활근육종, 요도육종, 갑상선암, 윌름스종양, 신장세포암, 전립선암, 모반증과 관련된 비정상적 혈관 증식, 부종 (뇌종양과 관련된 것과 같은 부종) 및 메이그스 증후군 (Meigs's syndrome)이 있다.
연령-관련 황반퇴화증 (AMD)은 나이가 든 집단에서 심각한 시각 손실을 일으키는 주원인이다. AMD 삼출 형태의 특징은 맥락 혈관신생 및 망막 색소 상피세포 탈착이다. 맥락 혈관신생이 예후에 있어서 급격한 악화와 관련되어 있기 때문에, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 AMD의 심각도를 완화시키는 데 유용한 것으로 기대된다.
창상 치유 및 조직 회복과 같은 외상의 치유 역시 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그들의 길항제의 또다른 용도이다. 새로운 혈관의 형성 및 퇴행은 조직 치유 및 회복에 필수적이다. 이 카테고리에는 화상, 절개 및 궤양의 치료에 있어서의 창상 치유와 조직 회복 및 교체 뿐만 아니라 골, 연골, 힘줄, 인대 및(또는) 신경 조직 증식 또는 재생이 포함된다. 골이 정상적으로 형성되지 않는 환경하에서 연골 및(또는) 골 증식을 유도하는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 인간 및 다른 동물에서 골 골절, 및 연골 손상 또는 결함의 치료에 적용된다. PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 포함하는 제제는 개방성 골절 뿐만 아니라 폐쇄성 골절 완화에 사용할 수 있고, 인공 관절의 고정을 개선시키는 데 사용할 수도 있다. 골생성제에 의해 유도된 새로운 골 형성은 선천성 두개안면 결함, 외상에 의해 유도된 두개안면 결함, 종양성 두개안면 결함, 또는 절개에 의해 유도된 두개안면 결함의 회복에 기여하고, 미용 성형 수술에도 유용하다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 압력 궤양, 혈관 부족과 관련된 궤양, 수술 및 외상적 창상 등을 비롯한, 그러나 여기에 제한되지 않는 비-치유 창상의 보다 개선된 또는 보다 빠른 폐쇄를 촉진하는 데 유용할 수도 있다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 기관 (예컨대, 췌장, 간, 장, 신장, 피부 또는 내피), 근육 (평활근, 골격근 또는 심근), 및 혈관 (혈관 내피 포함함) 조 직과 같은 다른 조직의 생성 또는 재생, 또는 이러한 조직을 구성하는 세포의 증식 촉진에 대한 활성을 나타낼 수도 있다. 원하는 효과 중에는 섬유성 반흔형성의 억제 또는 조절에 의해 정상 조직을 재생하는 것이다.
본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 소화관 보호 또는 재생, 및 폐 또는 간 섬유증, 다양한 조직의 재관류 손상 및 전신적인 사이토카인 손상으로부터 발생하는 질환의 치료에 유용할 수도 있다. 또한, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 전구 조직 또는 전구 세포로부터의 상기 조직의 분화를 촉진 또는 억제하는 데 유용할 수 있거나, 상기 조직의 증식을 억제하는 데 유용할 수 있다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 치주질환의 치료 및 다른 치아-회복 과정에 사용할 수도 있다. 이러한 약제는 골-형성 세포를 끌어당기거나, 골-형성 세포의 증식을 자극하거나, 골-형성 세포 전구체의 분화를 유도하는 환경을 제공할 수 있다. 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 골 및(또는) 연골 회복의 자극을 통해 골다공증 또는 골관절염의 치료에 유용할 수 있거나, 염증, 또는 염증 과정에 의해 매개되는 조직 파괴 (콜라게나제 활성, 파골세포 활성 등) 과정의 차단을 통해 골다공증 또는 골관절염의 치료에 유용할 수도 있는데, 이는 혈관이 골 교체 및 증식의 조절에 중요한 역할을 하기 때문이다.
본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제에 기인할 수 있는 조직 재생 활성의 또다른 카테고리는 힘줄/인대 형성이다. 이러한 조직이 정상적으로 형성되지 않는 환경에서 힘줄/인대-유사 조직 또는 다른 조직 형성을 유도하는 단백질은 인간 및 다른 동물에서 힘줄 또는 인대 누액, 기형, 및 다른 힘줄 또는 인대 결함의 치유에 사용할 수 있다. 이러한 제제는 골 또는 다른 조직에 힘줄 또는 인대를 고정시키는 것을 개선시키고 힘줄 또는 인대 조직의 결함을 회복시키는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라, 힘줄 또는 인대 조직의 손상을 예방하는 데 사용할 수 있다. 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 조성물에 의해 유도된 새로운 힘줄/인대-유사 조직 형성은 선천성 힘줄 또는 인대 결함, 외상에 의해 유도된 힘줄 또는 인대 결함, 또는 다른 유래의 기타 힘줄 또는 인대 결함에 기여하고, 힘줄 또는 인대의 부착 또는 회복을 위한 미용 성형 수술에도 유용하다. 본원의 조성물은 힘줄 또는 인대 형성 세포를 끌어당기거나, 힘줄 또는 인대 형성 세포의 증식을 자극하거나, 힘줄 또는 인대 형성 세포의 전구체의 분화를 유도하거나, 생체외에서 힘줄/인대 세포 또는 전구체의 증식을 유도하는 환경을 제공함으로써 조직을 회복시키는 생체내 복구를 가능케 한다. 본원의 조성물은 건염, 수근관증후군 및 기타 힘줄 또는 인대 결함의 치료에 유용할 수도 있다. 상기 조성물은 당업계에 잘 공지된 담체로서 적당한 매트릭스 및(또는) 분포획제를 포함할 수도 있다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 신경세포의 증식, 및 신경조직과 뇌조직의 재생, 즉 기계적 및 외상적 질환 뿐만 아니라 신경세포 또는 신경조직의 퇴화, 사멸, 또는 외상을 수반하는 중추 및 말초 신경계 질환 및 신경병증의 치료에 유용할 수도 있다. 보다 구체적으로, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 말초 신경 손상, 말초 신경병증 및 국소 신경병증과 같은 말초 신경계 질환, 및 알쯔하이머병, 파킨슨병, 헌팅톤병, 근위축성측삭경화증 및 샤이-드래거 (Shy-Drager) 증후군과 같은 중추 신경계 질환의 치료에 유용할 수 있다. 본 발명에 따라 치료가능한 추가 질환에는 기계적 및 외상적 질환, 예컨대 척수 질환, 머리 외상, 및 졸중과 같은 뇌혈관 질환이 포함된다. 화학치료법 또는 다른 의학적 치료법으로부터 발생한 말초 신경병증은 본원의 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 사용하여 치료할 수도 있다.
허혈-재관류 손상은 또다른 질환이다. 내피세포 기능저하는 허혈-재관류 손상 후에 일어나는 후유증의 개시 및 조절 둘다에 중요할 수 있다.
류마티스성 관절염은 또다른 질환이다. 맥관계를 통한 혈관 증식 및 염증세포의 표적화는 류마티스성 관절염 및 혈청반응-음성 형태의 관절염의 병리과정에 중요한 성분이다.
심비대증을 앓는 환자에게 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 투여하면 심비대증의 진행을 예방하고, 무증상 환자의 사망을 비롯해 갑작스러운 사망을 피할 수도 있다. 광범위한 좌심실 심비대증 (성인의 경우에는 35mm 이상의 최대 벽 두께, 또는 어린이의 경우에는 비교가능한 값)으로 진단받은 환자의 경우, 및 심장 상의 혈액동력학적 과부하가 상당히 강한 경우에는 상기 예방 요법이 특히 필요하다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 실질적으로 비대증성 심근병증으로 진단받은 일부 환자에서 발달하는 심방세동의 관리에 유용할 수도 있다.
추가 질환에는 협심증, 급성 심근경색증과 같은 심근경색증, 및 울혈성 심부전과 같은 심부전이 포함된다. 추가적인 비종양성 질환에는 건선, 당뇨병성 망막병증, 및 미숙아 망막병증을 포함한 기타 증식성 망막병증, 수정체후부 섬유증식 증, 신생혈관 녹내장, 갑상선 과다증식증 (그레이브스병을 포함함), 각막 및 기타 조직 이식, 만성 염증, 폐 염증, 신증후군, 전자간증, 복수증, 심낭삼출증 (심낭과 관련된 것과 같은 것) 및 흉막삼출증이 포함된다.
상기의 관점에서, 내피세포 기능, 증식 및(또는) 형태를 바꾸거나 손상을 주는 것으로 보이는, 본원에 기재된 PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제는 상기 기재한 다수의 질환 또는 모든 질환의 병인 및 발병기전에 중요한 역할을 하는 것 같으므로, 이들 과정을 증대시키거나 억제하기 위한 치료 표적으로서, 또는 이들 질환에 있어서 혈관-관련 약물 표적화에 작용할 수 있다.
xi. 투여 프로토콜, 스케줄, 투여량 및 제제
본원의 분자 및 그의 아고니스트와 길항제는 상기에 기재한 다양한 질환 및 장애의 예방제 및 치료제로서 제약학적으로 유용하다.
PRO 폴리펩티드, 아고니스트 또는 길항제의 치료 조성물은 동결건조된 제제 또는 수용액의 형태로 적당한 순도의 원하는 분자를 임의로 제약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제 (Remington's Pharmaceutical Science, 16th edition, Osol, A. ed. (1980))와 혼합하여 저장용으로 제조한다. 허용가능한 담체, 부형제 또는 안정화제는 사용되는 양 및 농도에서 수용자에게 무독성이고, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산과 같은 완충액; 아스코르브산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 방부제, 예컨대, 옥타데실디메틸벤질 암노늄 클로라이드, 헥사메토늄 클로라이드, 벤즈알코늄 클로라이드, 벤즈에토늄 클로라이드, 페놀, 부틸 또는 벤질 알콜, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레소르시놀, 시클로헥사놀, 3-펜타놀 및 m-크레졸; 저분자량 (약 10개 잔기 이하)의 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 이뮤노글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 중합체; 글리신, 글루타민, 아스파라진, 히스티딘, 아르기닌 또는 라이신과 같은 아미노산; 모노사카라이드, 디사카라이드, 및 글루코스, 만노스 및 덱스트린을 포함한 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트화제; 슈크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨과 같은 당; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온; 금속 착화물 (예컨대, Zn-단백질 착화물); 및(또는) TWEEN (상표명), PLURONICS (상표명) 또는 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 비-이온성 계면활성제를 포함한다.
이러한 담체의 다른 예로는 이온 교환제, 알루미나, 알루미늄 스테아레이트, 레시틴, 인간 혈청 알부민과 같은 혈청 단백질, 포스페이트와 같은 완충 물질, 글리신, 소르브산, 포타슘 소르베이트, 포화된 식물성 지방산의 부분 글리세라이드 혼합물, 물, 염 또는 전해질이 있고, 상기 전해질의 예로는 프로타민 술페이트, 디소듐 히드로겐 포스페이트, 포타슘 히드로겐 포스페이트, 소듐 클로라이드, 아연염, 실리카 콜로이드, 마그네슘 트리실리케이트, 폴리비닐 피롤리돈, 셀룰로스-기재 물질 및 폴리에틸렌 글리콜이 있다. 국소 형태 또는 겔-기재 형태의 길항제용 담체로는 소듐 카르복시메틸셀룰로스 또는 메틸셀룰로스와 같은 폴리사카라이드, 폴리비닐피롤리돈, 폴리아크릴레이트, 폴리옥시에틸렌-폴리옥시프로필렌-블록 중합체, 폴리에틸렌 글리콜 및 나무 왁스 알콜이 있다. 모든 투여를 위해, 통상적인 데포 형태를 적당하게 사용한다. 이러한 형태로는 예를 들어, 마이크로캡슐, 나노-캡슐, 리포좀, 반창고, 흡입 형태, 비강 분무, 설하 정제 및 서방 제제가 있 다. PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제는 전형적으로 약 0.1 mg/ml 내지 100 mg/ml의 농도의 상기 비히클로 제제화될 것이다.
다른 제제는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 형성된 제품내로 혼입하는 것을 포함한다. 이러한 제품은 내피세포의 증식 및 혈관신생을 조절하는 데 사용될 수 있다. 또한, 종양 침윤 및 전이도 상기 제품으로 조절할 수 있다.
생체내 투여에 사용되는 PRO 폴리펩티드 또는 길항제는 멸균되어야 한다. 이는 동결 건조 및 재구성 이전 또는 이후에 멸균 여과막을 통해 여과시킴으로써 용이하게 달성될 수 있다. 전신 투여하는 경우, 상기 PRO 폴리펩티드는 통상 동결 건조 형태로 또는 용액 중에 보관할 것이다. 동결 건조된 형태인 경우, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 통상 사용시 적합한 희석제와의 재구성을 위해 다른 성분과의 배합물 형태로 제제화한다. PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 액상 제제의 예에는 피하 주사용 단일 투여 바이알내에 채워진 멸균, 투명, 무색의 무방부 용액제가 있다. 반복 사용에 적합한 방부 처리 제약 조성물은 주로 처방전 및 폴리펩티드 유형에 따라,
a) PRO 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제,
b) 폴리펩티드 또는 기타 분자가 용액 중에서 최대로 안정될 수 있는 pH(바람직하게는 약 4 내지 8)를 유지할 수 있는 완충액,
c) 교반에 의해 유도되는 응집 현상에 대해 폴리펩티드 또는 분자를 일차적으로 안정화시키는 세정제 및 계면활성제,
d) 등장화제(isotonifier),
e) 페놀, 벤질 알콜 및 벤즈에토늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드)의 군으로부터 선택되는 방부제, 및
f) 물
을 함유할 수 있다.
사용되는 세정제가 비이온성인 경우, 세정제는 예를 들면, 폴리소르베이트(예를 들면, 폴리소르베이트(등록상표)(POLYSORBATE), 트윈(등록상표)(TWEEN) 20, 80 등) 또는 폴록사머(예를 들면, 폴록사머(등록상표)(POLOXAMER) 188)일 수 있다. 비이온성 계면활성제를 사용하면 폴리펩티드의 변성을 일으키지 않으면서 제제를 전단 표면 스트레스에 노출시킬 수 있다. 또한, 이러한 계면활성제 함유 제제는 폐 투여에 사용되는 것과 같은 에어로졸 장치, 및 바늘이 없는 제트 주사기 (needleless jet injector gun; EP 제257,956호 참조)로 투여될 수 있다.
등장화제는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 액상 조성물의 등장성을 유지하도록 하기 위해 존재할 수 있으며, 그 예에는 폴리히드릭 당 알콜, 바람직하게는 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨과 같은 트리히드릭 또는 그 이상의 당 알콜이 있다. 이들 당 알콜은 단독으로 또는 배합된 상태로 사용될 수 있다. 별법으로, 염화나트륨 또는 기타 적합한 무기염이 용액을 등장액으로 만드는 데 사용될 수 있다.
완충액은 예를 들어, 원하는 pH에 따라 아세테이트, 시트레이트, 숙시네이트 또는 포스페이트 완충액 등일 수 있다. 본 발명의 액상 제제 중 한 유형의 pH는 약 4 내지 8, 바람직하게는 대략 생리적 pH로 완충된다.
페놀, 벤질 알콜 및 벤즈에토늄 할라이드(예를 들면, 클로라이드) 등의 방부제는 사용가능한 공지된 항미생물제이다.
통상, 치료용 PRO 폴리펩티드 조성물은 멸균 투입구가 있는 용기, 예를 들어, 정맥내 주사용 백, 피하 주사 바늘이 관통할 수 있는 마개를 갖는 바이알내에 넣는다. 바람직하게는, 상기 제제는 정맥내 (i.v.), 피하 (s.c.) 또는 근육내 (i.m.) 주사로 반복 투여하거나, 또는 비강내 또는 폐내 전달에 적합한 에어로졸 제제로서 투여한다 (페내 전달의 경우에는 유럽 특허 제257,956호 참조).
또한, PRO 폴리펩티드는 서방성 제제의 형태로 투여될 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예에는 상기 단백질을 함유하는 고형 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 포함되며, 상기 매트릭스는 성형품 형태, 예컨대, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다. 서방성 매트릭스의 예에는 폴리에스테르, 문헌 (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) 및 Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982))에 기재된 바와 같은 히드로겔 (예를 들면, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트)), 폴리락티드(미국 특허 제3,773,919호 및 EP 제58,481호), L-글루탐산과 감마 에틸-L-글루타메이트의 공중합체(Sidman et al., Biopolymers, 22: 547-556 (1983)), 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트(Langer et al., 상기 문헌), Lupron Depot(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 루프롤리드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어)와 같은 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산(EP 제133,988호)이 포함된다.
에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동 안 분자를 방출시키지만, 어떤 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 단백질이 장기간동안 체내에 남아있는 경우, 상기 단백질은 37 ℃에서 습기에 노출될 때 변성 또는 응집되어 생물학적 활성이 감소되고 면역원성이 변화될 수 있다. 단백질의 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀지면, 술프히드릴 잔기의 수식, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량의 조절, 적절한 첨가제의 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발을 통해 안정화시킬 수 있다.
또한, 서방성 PRO 폴리펩티드 조성물에는 리포좀에 의해 포획된 PRO 폴리펩티드가 포함될 수 있다. PRO 폴리펩티드를 함유하는 리포좀은 문헌 (DE 제3,218,121호; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); EP 제52,322호; EP 제36,676호; EP 제88,046호; EP 제143,949호; EP 제142,641호; 일본 특허 출원 제83-118008호; 미국 특허 제4,485,045호; 미국 특허 제4,544,545호; 및 EP 제102,324호)에 공지된 방법에 의해 제조될 수 있다. 통상, 리포좀은 지질 함량이 약 30 몰%의 콜레스테롤보다 더 높고, 선택된 비율을 조정하여 최적의 치료를 할 수 있는 작은 크기의(약 200 내지 800Å) 단일 적층형이다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 치료 유효량은 물론, 치료할 (예방 포함) 병리적 증상, 투여 방법, 치료에 사용되는 화합물의 유형, 관련된 임의의 보조 치료법, 환자의 연령, 환자의 체중, 일반적인 의학적 상태, 병력 등과 같은 인자에 따라 달라질 것이며, 그 결정은 전문의가 능숙하게 할 것이다. 따라서, 치료자는 최대의 치료 효과를 얻는 데 필요한 투여량을 결정하고 투여 경로를 변화시킬 필요가 있다. PRO 폴리펩티드의 숙주 범위가 좁은 경우, 인간 PRO 폴리펩티드를 포함하는 제제가 인간 환자의 치료에 바람직하며, 천연 서열의 인간 PRO 폴리펩티드를 포함하는 제제가 더욱 바람직하다. 임상의는 투여량이 해당 증상의 치료에 필요한 효과를 얻을 때까지 PRO 폴리펩티드를 투여할 것이다. 예를 들어, 치료 목적이 CHF의 치료인 경우, 상기 투여량은 CHF와 관련된 진행성 심비대증을 억제하는 양이다. 이 치료법의 진행은 초음파 심전도검사를 수행하여 용이하게 관찰할 수 있다. 이와 유사하게, 비대증성 심근병증을 앓고 있는 환자의 경우, PRO 폴리펩티드는 임상 실험을 기초로 하여 투여할 수 있다.
상기 지침에 따라, 효과적인 투여량은 통상 약 0.001 내지 약 1.0mg/kg이며, 더욱 바람직하게는 약 0.01 내지 1.0mg/kg, 가장 바람직하게는 약 0.01 내지 0.1mg/kg이다.
성인 고혈압 치료를 위해 비경구 투여하는 경우, 체중 1kg당 PRO 폴리펩티드를 약 0.01 내지 50mg, 바람직하게는 0.05 내지 20mg, 가장 바람직하게는 1 내지 20mg씩 주사 형태로 일일 1 내지 3회에 걸쳐 정맥내 주사 투여하는 것이 유리하다. 경구 투여의 경우, 체중 1kg당 약 5mg 내지 1g, 바람직하게는 10 내지 100mg의 PRO 폴리펩티드 분자를 일일 1 내지 3회 투여하는 것이 바람직하다. 내독소의 오염은, 예를 들면, 단백질 1mg당 0.5ng 미만의 안전한 수준으로 최소화되어야 함을 알아야 한다. 게다가, 인간에게 투여하는 경우, 제제는 FDA 및 생물학적 표준에서 요구하 는 멸균성, 발열성, 총체적 안전성 및 순도를 총족시키는 것이 바람직하다.
조직의 재생에 사용되는 PRO 폴리펩티드를 함유하는 제약 조성물의 투약법은 주치의가 폴리펩티드의 작용을 변화시키는 다양한 인자, 예컨대, 형성시키길 원하는 조직의 중량, 손상 부위, 손상된 조직의 상태, 상처의 크기, 손상된 조직의 유형(예를 들어, 뼈), 환자의 연령, 성별 및 식이 요법, 임의의 감염의 심각성, 투여 시간 및 기타 임상적 인자를 고려하여 결정할 것이다. 투여량은 재구성에 사용되는 매트릭스의 유형, 및 다른 단백질이 제약 조성물에 포함되었는지에 따라 달라질 수 있다. 예를 들면, IGF-I과 같은 기타 공지된 증식 인자를 최종 조성물에 첨가하는 것도 투여량에 영향을 미칠 수 있다. 치료의 진행은 예컨대, X-선, 조직형태학적 측정 및 테트라싸이클린 표지를 통해 조직과 뼈의 성장 및(또는) 회복을 주기적으로 측정함으로써 관찰할 수 있다.
PRO 폴리펩티드, 아고니스트 또는 길항제는 공지된 방법, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 뇌내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 안내, 동맥내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로에 의한 주사 또는 관주, 또는 하기 기재되는 바와 같은 서방계를 통해 투여된다. 또한, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 국소 및 전신 치료 효과를 나타내기 위해 종양 내부, 종양 주변, 손상부 내부 또는 손상부 주변 경로를 통해 적당하게 투여할 수 있다. 예를 들면, 난소암 치료시 복강내 투여가 특히 유용할 것으로 생각된다.
펩티드 또는 소분자가 길항제 또는 아고니스트로 사용되는 경우, 이는 액체 또는 고체의 형태로 포유동물에게 경구 또는 비경구적 투여하는 것이 바람직하다.
염을 형성하고 본원의 하기에 유용한 분자의 약리학상 허용되는 염의 예는 알칼리 금속염(예를 들면, 나트륨염, 칼륨염), 알칼리 토금속염(예를 들면, 칼슘염, 마그네슘염), 암모늄염, 유기 염기염(예를 들면, 피리딘염, 트리에틸아민염), 무기산염(예를 들면, 염산염, 황산염, 질산염), 및 유기산의 염(예를 들면, 아세테이트, 옥살레이트, p-톨루엔술포네이트)이 포함된다.
뼈, 연골, 힘줄 또는 인대 재생에 유용한 본원의 조성물의 경우, 치료 방법에는 조성물을 이식재 또는 장치로서 국소, 전신 또는 국부 투여하는 것이 포함된다. 투여할 때, 사용되는 치료 조성물은 발열원이 없고 생리적으로 허용가능한 형태이다. 또한, 조성물은 바람직하게는 캡슐화되거나, 뼈, 연골 또는 조직 손상 부위에 전달하기 위한 점액질 형태로 주사될 수 있다. 국소 투여가 상처 치유 및 조직 복구에 적합할 수 있다. 바람직하게는 뼈 및(또는) 연골 형성의 경우, 단백질 함유 조성물을 뼈 및(또는) 연골 손상 부위에 전달할 수 있고, 발생중인 뼈 및 연골을 위한 구조를 제공하며, 바람직하게는 신체에 재흡수될 수 있는 매트릭스가 상기 조성물에 포함될 것이다. 이러한 매트릭스는 기타 이식 의학 분야에 현재 사용되고 있는 물질 형태일 수 있다.
매트릭스 재료의 선택은 생체상용성, 생분해성, 기계적 특성, 외양 및 계면성에 기초를 둔다. 상기 조성물의 구체적인 용도에 따라 적합한 제제화 방법이 정해질 것이다. 상기 조성물의 잠재적 매트릭스는 생분해성일 수 있으며, 화학적으로 정의된 칼슘 술페이트, 트리칼슘 포스페이트, 히드록시아파타이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 폴리안하이드라이드일 수 있다. 기타 잠재적 재료는 생분해성이 며, 뼈 또는 피하 콜라겐과 같이 생물학적으로 잘 정의된 것이다. 다른 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 구성된다. 다른 잠재적 매트릭스는 비분해성이며, 소결된 히드록시아파타이트, 바이오글래스, 알루미네이트 또는 기타 세라믹과 같은 화학적으로 정의된 것이다. 매트릭스는 폴리락트산과 히드록시아파타이트, 또는 콜라겐과 트리칼슘 포스페이트와 같은 임의의 상기 재료의 배합물로 구성될 수 있다. 바이오세라믹은 칼슘-알루미네이트-포스페이트와 같은 조성물 중에서 변화될 수 있으며, 공극 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생분해성의 변화를 위해 가공될 수 있다.
구체적인 한 실시양태는 직경이 150 내지 800㎛인 다공성 입자 형태인 락트산과 글리콜산 (50:50(몰 중량)의 공중합체이다. 어떤 분야에서는 카르복시메틸 셀룰로스 또는 자가이식 응혈과 같은 격리제를 사용하여 폴리펩티드 조성물이 매트릭스로부터 분리되는 것을 방지하는 것이 유용할 것이다.
적합한 격리제 족은 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 히드록시에틸셀룰로스, 히드록시프로필셀룰로스, 히드록시프로필메틸셀룰로스 및 카르복시메틸셀룰로스를 비롯한 알킬셀룰로스(히드록시알킬셀룰로스를 포함함)와 같은 셀룰로스성 물질이며, 카르복시메틸셀룰로스(CMC)의 양이온염이 바람직하다. 다른 바람직한 격리제에는 히알루론산, 알긴산나트륨, 폴리(에틸렌 글리콜), 폴리옥시에틸렌 옥시드, 카르복시비닐 중합체 및 폴리(비닐 알콜)이 포함된다. 본원에 유용한 격리제의 양은 제제의 총 중량을 기준으로 0.5 내지 20 중량%, 바람직하게는 1 내지 10 중량%이며, 이는 폴리펩티드(또는 그의 길항제)가 중합체 매트릭스로부터 탈착되는 것을 방지 하고 조성물을 적절히 취급하는 데 필요한 양이지만, 부모세대의 세포가 매트릭스를 침윤하지 않게 함으로써 폴리펩티드(또는 그의 길항제)가 부모세대 세포의 골형성 활성을 보조하는 기회를 제공하는 양은 아니다.
xii. 병용 치료법
해당 질환을 예방 또는 치료함에 있어서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제의 효과는, 활성제를 연속 투여하거나, 활성제를 동일한 조성물 중에서 또는 별개의 조성물로서 상기 목적에 효과적인 다른 약제와 병용함으로써 개선시킬 수 있다.
예를 들어, 심비대증을 치료할 경우, PRO 폴리펩티드 치료법은 공지된 심근세포 비대증 인자의 억제제, 예를 들면, 페닐에프린과 같은 α-아드레날린계 아고니스트의 억제제; 보센탄(등록상표)(BOSENTAN) 및 목소노딘(등록상표)(MOXONODIN)과 같은 엔도텔린-1 억제제; CT-1에 대한 억제제(미국 특허 제5,679,543호); LIF에 대한 억제제; ACE 억제제; 데스-아스파테이트-안지오텐신 Ⅰ 억제제(미국 특허 제5,773,415호) 및 안지오텐신 Ⅱ 억제제)의 투여와 병행할 수 있다.
고혈압과 관련된 심비대증의 치료를 위해, PRO 폴리펩티드는 β-아드레날린계 수용체 차단제, 예컨대, 프로프라노롤, 티모롤, 테르타롤올, 카르테오롤, 나도롤, 베타소롤, 펜부토롤, 아세토부토롤, 아테노롤, 메토프로롤 및 카르베디롤; ACE 억제제, 예컨대, 퀴나프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 또는 리시노프릴; 이뇨제, 예를 들면, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지 드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 또는 인다파미드; 및(또는) 칼슘 채널 차단제, 예컨대, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 또는 니카르디핀과 함께 투여할 수 있다. 본원에서 일반명으로 확인된 치료제를 포함하는 제약 조성물은 시판되는 것이며, 투여량, 투여, 부작용, 금기사항 등에 대한 제조자의 지시에 따라 투여될 것이다(Physicians' Desk Reference (Medical Economics Data Production Co.: Montvale, N. J., 1997), 51판 참조).
비대증성 심근병증의 치료에 있어서 병용 치료법에 바람직한 후보물질로는 β-아드레날린계 차단 약물(예를 들면, 프로프라노롤, 티모롤, 테르타롤올, 카르테오롤, 나도롤, 베타소롤, 펜부토롤, 아세토부토롤, 아테노롤, 메토프로롤 및 카르베디롤), 베라파밀, 디페디핀 또는 딜티아젬이 있다. 고혈압과 관련된 비대증의 치료는 칼슘 채널 차단제, 예컨대, 딜티아젬, 니페디핀, 베라파밀 또는 니카르디핀; β-아드레날린계 차단제; 이뇨제, 예컨대, 클로로티아지드, 히드로클로로티아지드, 히드로플루메타지드, 메틸클로티아지드, 벤즈티아지드, 디클로르펜아미드, 아세타졸아미드 또는 인다파미드; 및(또는) ACE 억제제, 예컨대, 퀴나프릴, 캡토프릴, 에날라프릴, 라미프릴, 베나제프릴, 포시노프릴 또는 리시노프릴을 사용하는 고혈압 억제성 약물 치료법을 이용할 필요가 있다.
다른 증상의 경우, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 뼈 및(또는) 연골 결함, 상처, 또는 해당 조직의 치료에 유익한 다른 제제와 병용할 수 있다. 이러한 제제에는 EGF, PDGF, TGF-α 또는 TGF-β, IGF, FGF, 및 CTGF와 같은 다양한 증식 인자가 포함된다.
또한, 암의 치료에 사용되는 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제는 상기 기재된 바와 같은 세포 독성제, 화학요법제 또는 증식-억제제와 병용할 수 있다. 또한, 암 치료의 경우, PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제를 연속 투여하거나, 상기 PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제의 투여를 방사선 조사, 또는 방사성 물질의 투여를 포함하는 방사선 치료와 병행하는 것이 적합하다.
PRO 폴리펩티드 또는 그의 길항제와 병용되는 치료제의 유효량은 내과의사 또는 수의사의 재량에 달려있을 것이다. 치료할 증상이 최대로 치료되도록 투여량을 정하고 조절한다. 예를 들면, 고혈압 치료의 경우, 유효량은 이뇨제 또는 강심제의 용도, 및 고혈압 또는 저혈압, 신장 손상 등과 같은 증상을 고려하는 것이 이상적이다. 부가적으로, 투여량은 사용될 치료제의 유형 및 치료받는 환자의 유형과 같은 인자에 따라 달라질 것이다. 통상, 사용되는 양은 해당 치료제가 PRO 폴리펩티드 없이 투여되는 경우와 동일한 양일 것이다.
xiii. 제품
상기 기재된 질환의 진단 또는 치료에 유용한 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제를 함유하는 키트와 같은 제품은 적어도 용기 및 표지를 포함한다. 적합한 용기에는, 예를 들어, 병, 바이알, 주사기 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로 형성될 수 있다. 이 용기에는 증상의 진단 또는 치료에 효과적인 조성물이 들어 있으며, 멸균 입구 (access port) (예를 들어, 이 용기는 정맥 주사용액 백(bag)이거나, 피하 주사기 바늘이 뚫을 수 있는 마개가 달린 바이알일 수 있음)가 있을 수 있다. 상기 조성물 중의 활성제는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드, 그의 아고니스트 또는 길항제이다. 용기 위에 있거나 용기에 부착되어 있는 표지는 상기 조성물이 선택된 증상의 진단 또는 치료에 사용된다는 것을 지시한다. 이 제품은 또한 인산염-완충 식염수, 링거액 및 덱스트로스 용액과 같은 제약학적으로 허용가능한 완충액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이 제품은 다른 완충액, 희석액, 필터, 바늘, 주사기, 및 사용 지침이 쓰여 있는 패키지 삽입물을 비롯한, 상업적 관점 및 사용자의 관점에서 볼 때 바람직한 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다. 또한, 이 제품은 상기 기재된 바와 같은 다른 활성제를 함유하는 제2 또는 제3 용기를 포함할 수 있다.
E. 항체
본 발명에 따른 가장 유망한 약물 후보 중 일부는 본원에서 확인된 유전자 산물의 생성을 억제하고(하거나), 유전자 산물의 활성을 감소시킬 수 있는 항체 및 항체 단편이다.
i. 폴리클로날 항체
폴리클로날 항체의 제조 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 폴리클로날 항체는 예를 들어, 면역화제 및, 필요한 경우, 면역보강제를 1회 이상 주사함으로써 포유동물에서 생성시킬 수 있다. 일반적으로, 면역화제 및(또는) 면역보강제는 수회의 피하 또는 복강내 주사를 통해 포유동물에게 주사한다. 면역화제는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 수 있다. 면역화될 포유동물에서 면역원성인 것으로 공지된 단백질에 면역화제를 접합시키는 것이 유용할 수 있다. 상기 면역원성 단백질의 예로는 키홀 림펫 헤모시아닌, 혈청 알부민, 소 티로글로불린 및 대두 트립신 억제제를 들 수 있으나, 여기에 제한되지 않는다. 사용될 수 있는 면역보강제의 예로는 프로이드 완전 면역보강제 및 MPL-TDM 면역보강제 (모노포스포릴 지질 A 또는 합성 트레할로스 디코리노미콜레이트)가 있다. 면역화 방법은 불필요한 실험 없이도 당업자가 선별할 수 있다.
ii. 모노클로날 항체
별법으로, 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 항체는 모노클로날 항체일 수 있다. 모노클로날 항체는 문헌 (Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975))에 기재된 바와 같은 하이브리도마 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 하이브리도마 방법에서, 마우스, 햄스터 또는 다른 적절한 숙주 동물은 통상적으로 면역화제로 면역화시켜 면역화제에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나 생산할 수 있는 림프구를 유도한다. 별법으로, 상기 림프구는 시험관내에서 면역처리될 수 있다.
면역화제는 일반적으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 또는 그의 융합 단백질을 포함할 것이다. 일반적으로, 인체 기원의 세포를 원하는 경우에는 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되나, 비인간 포유동물 공급원을 원하는 경우에는 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 이어서, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적당한 융합제를 사용하여 림프구와 무한증식 세포주를 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성한다 (Goding, Monoclonal Antibodies: Principle and Practice, Academic Press, (1986) pp. 59-103). 무한증식 세포주는 대체로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 및 인체 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 래트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 융합되지 않은 무한증식 세포의 증식 또는 생존을 억제하는 하나 이상의 물질을 함유하는 적당한 배양 배지에서 배양시킬 수 있다. 예를 들면, 모세포에 하이포잔틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 없는 경우, 하이브리도마용 배양 배지는 전형적으로 하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지")을 포함할 것이며, 이들 물질은 HGPRT-결핍 세포의 증식을 억제시킨다.
바람직한 무한증식 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정한 고발현도를 유지하며, HAT 배지와 같은 배지에 민감한 것이다. 보다 바람직한 무한증식 세포주는 예를 들어, 살크 인스티튜트 셀 디스트리뷰션 센터 (Salk Institute Cell Distribution Center, 미국 캘리포니아주 샌디에고) 및 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션 (American Type Culture Collection, 미국 버지니아주 마나사스)으로부터 입수가능한 뮤린 골수종 세포주이다. 또한, 인간 골수종 세포주 및 마우스-사람 헤테로골수종 세포주도 인간 모노클로날 항체의 생산용으로 기재된 바 있다 (Kozbor, J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc., New York, (1987) pp. 51-63).
그 다음으로, 하이브리도마 세포가 배양되는 배양 배지를 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대한 모노클로날 항체의 존재를 분석할 수 있다. 바람직하게는, 하이브리도마 세포에 의해 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성을 면역침전법에 의해, 또는 방사성면역검정법 (RIA) 또는 효소 결합 면역 흡착 검정법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합 분석을 통해 측정한다. 이러한 기술 및 분석은 당업계에 공지되어 있다. 모노클로날 항체의 결합 친화도는 예를 들어, 스캐쳐드 (Scatchard) 분석 (Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980))으로 측정할 수 있다.
원하는 하이브리도마 세포를 확인한 후, 제한 희석 방법으로 클론을 서브클로닝하고 표준 방법 (Goding, 상기문헌)으로 배양한다. 이러한 목적에 적합한 배양 배지로는 예를 들면, 둘벨코스 수식 이글 배지 (Dulbecco's Modified Eagle's Medium) 또는 RPMI-1640 배지가 있다. 별법으로, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수종양으로서 생체내 배양할 수 있다.
서브클론에 의해 분비된 모노클로날 항체는 예를 들면, 단백질 A-세파로스 (Sepharose), 히드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화 크로마토그래피와 같은 통상의 이뮤노글로불린 정제 방법으로 배양 배지 또는 복수액으로부터 단리 및 정제할 수 있다.
또한, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기재된 것과 같은 재조합 DNA 방법으로도 제조할 수 있다. 본 발명의 모노클로날 항체를 코딩하는 DNA는 통상의 방법 (예를 들면, 뮤린 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 사용함)을 이용하여 쉽게 단리하고 시퀀싱할 수 있다. 본 발명의 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 바람직한 공급원으로서 작용한다. DNA는 일단 단리되면 발현 백터에 넣을 수 있고, 이어서, 이뮤노글로불린 단백질을 별도로 생산하지 않는 원숭이 COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포, 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포내로 형질감염시켜 재조합 숙주 세포에서 모노클로날 항체를 합성시킬 수 있다. 또한, 예를 들어, DNA는 상동 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인을 코딩하는 서열을 삽입시킴으로써 (미국 특허 제4,816,567호; Morrison et al., 상기 문헌), 또는 비-이뮤노글로불린 폴리펩티드에 대한 코딩 서열의 전체 또는 일부를 이뮤노글로불린 코딩 서열에 공유 결합시킴으로써 수식할 수 있다. 상기 비이뮤노글로불린 폴리펩티드는 본 발명의 항체의 불변 도메인에 대신에 치환되거나, 본 발명의 항체의 한 항체-결합 부위의 가변 도메인에 대신에 치환되어 키메라 2가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 1가 항체일 수 있다. 1가 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되 어 있다. 예를 들어, 한 방법은 이뮤노글로불린 경쇄와 수식된 중쇄의 재조합 발현시킨다. 중쇄 가교결합을 방지하기 위해서, 일반적으로 중쇄의 Fc 영역 중 임의의 지점에서 말단을 절단한다. 별법으로, 가교결합을 방지하기 위해서, 관련 시스테인 잔기를 다른 아미노산 잔기로 치환시키거나 결실시킨다.
또한, 시험관내 방법도 1가 항체의 제조에 적합하다. 항체 단편, 특히 Fab 단편을 생성하기 위한 항체의 절단은 당업계에 통상적으로 알려진 기술을 이용하여 달성할 수 있다.
iii. 인간 항체 및 인간화된 항체
항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 항체는 추가로 인간화된 항체 또는 인간 항체를 포함할 수 있다. 비인간(예를 들어, 뮤린) 항체의 인간화된 형태는 비인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 포함하는 키메라 면역 글로불린, 이뮤노글로불린쇄 또는 그의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F(ab')2 또는 항체의 다른 항원 결합 서열)이다. 인간화된 항체는, 수용자의 상보성 결정 영역 (CDR)의 잔기를 특이성, 친화도 및 능력이 원하는 만큼 높은 마우스, 래트 또는 토끼와 같은 비인간 종 (공여자 항체)의 CDR의 잔기로 바꾼 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)을 포함한다. 몇몇 경우, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 골격 잔기는 상응하는 비인간 잔기로 바꾼다. 또한, 인간화된 항체는 수용자 항체에서도 발견되지 않고 도입되는 CDR 또는 골격 서열에서도 발견되지 않는 잔기를 포함할 수 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나 이상, 일반적으로 둘 이상의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이며, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 영역은 비인간 이뮤노글로불린의 영역에 상응하고, 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 컨센서스 서열의 영역에 상응한다. 또한, 인간화된 항체는 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc), 일반적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); 및 Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)).
비인간 항체의 인간화 방법은 당업계에 잘 알려져 있다. 일반적으로, 인간화된 항체는 인간이 아닌 공급원으로부터 유래된 항체에 도입된 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함한다. 이들 비인간 아미노산 잔기는 종종 "임포트(import)" 잔기로 부르며, 통상적으로 "임포트" 가변 도메인으로부터 얻어진다. 인간화는 인간 항체의 상응하는 서열 대신에 설치류 CDR 또는 CDR 서열을 사용함으로써 본질적으로 윈터 (Winter) 등의 방법 (Jones et al., Nature, 321: 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature, 332: 323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239: 1534-1536 (1988))에 따라 수행할 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 실질적으로 보다 적은 무손상 인간 가변 도메인이 비인간 종 유래의 상응하는 서열에 의해 치환된 키메라 항체 (미국 특허 제4,816,567호)이다. 실제로, 인간화된 항체는 통상적으로 일부 CDR 잔기 및 가능하게는 일부 FR 잔기를 설치류 항체의 동족 부위로부터 유래된 잔기로 치환시킨 인간 항체이다.
인간 항체는 파지 디스플레이 라이브러리를 포함하는 당업계에 공지된 여러 기술을 사용하여 제조할 수도 있다 (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol., 227: 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Bio., 222: 581-597 (1991)). 또한, 코울 등 및 보에르너 등의 기술도 인간 모노클로날 항체의 제조에 사용할 수 있다 (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner et al., J. Immunol., 147(1):86-95 (1991)]. 마찬가지로, 형질전환 동물, 예를 들어, 마우스에 인간 이뮤노글로불린 좌위를 도입함으로써 인간 항체를 제조할 수 있는데, 여기서 내인성 이뮤노글로불린 유전자는 부분 또는 완전 불활성화된다. 항원 투여 후, 인간 항체 생산이 관찰되었는데, 이는 유전자 재배열, 어셈블리 및 항체 레파토리를 비롯한 모든 점에 있어서 인간에서 관찰되는 항체와 매우 유사하였다. 이 방법은 예를 들어, 문헌 (미국 특허 제5,545,807호, 동 제5,545,806호, 동 제5,569,825호, 동 제5,625,126호, 동 제5,633,425호, 동 5,661,016호) 및 과학 간행물 (Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368, 856-859 (1994), Morrison, Nature 368, 812-13 (1994); Fishwild et al., Nature Biotechnology 14, 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14, 826 (1996); Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 65-93 (1995))에 기재되어 있다.
iv. 이중특이적 항체
이중특이적 항체는 2개 이상의 상이한 항원에 대해 결합 특이성을 나타내는 모노클로날, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체이다. 이 경우, 결합 특이성 중 하나는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대한 결합 특이성이고, 다른 하나는 임의 다른 항원, 바람직하게는 세포 표면 단백질, 수용체 또는 수용체 서브유닛에 결합 특이성이다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다. 통상적으로, 이중특이적 항체의 재조합 생산은 2 쌍의 이뮤노글로불린 중쇄/경쇄의 동시발현을 기초로 하며, 여기서 2개의 중쇄는 상이한 특이성을 나타낸다 (Millstein and Cuello, Nature, 305: 537-539 (1983)). 이뮤노글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 분류로 인해, 이들 하이브리도마 (쿠아드로마)는 10개의 상이한 항체 분자의 가능한 혼합물을 생산하며, 이중 하나만이 정확한 이중특이적 구조를 갖는다. 정확한 분자의 정제는 일반적으로 친화 크로마토그래피 단계로 달성된다. 유사한 방법이 WO 제93/08829호(1993년 5월 13일에 공개됨) 및 문헌(Traunecker et al., EMBO J., 10: 3655-3659 (1991))에 기재되어 있다.
원하는 결합 특이성을 나타내는 항체 가변 도메인(항체-항원 결합 부위)은 이뮤노글로불린 불변 도메인 서열과 결합시킬 수 있다. 이 결합은 바람직하게는 힌지, CH2 및 CH3 영역의 적어도 일부를 포함하는 이뮤노글로불린 중쇄 불변 도메인과의 결합이다. 경쇄 결합에 필요한 부위를 포함하는 제1 중쇄 불변 영역 (CH1)이 상기 결합체 중 적어도 하나에 존재하는 것이 바람직하다. 이뮤노글로불린 중쇄 결합체 및, 원한다면, 이뮤노글로불린 경쇄를 코딩하는 DNA를 별개의 발현 벡터에 삽입하고, 적당한 숙주 유기체내로 공동 형질감염시킨다. 이중특이적 항체를 생산하기 위한 보다 상세한 내용은 예를 들면, 문헌(Suresh et al., Methods in Enzymmology, 121: 210(1986))을 참조한다.
v. 이종 접합 항체
이종접합 항체는 2개의 공유결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어, 면역계 세포를 원하지 않는 세포에 표적화시키기 위해 (미국 특허 제4,676,980호), 및 HIV 감염의 치료를 위해 (WO 제91/00360호, 동 제92/200373호, 및 EP 제03089호) 제안되었다. 이종접합 항체는 가교결합제를 사용하는 방법을 포함하여 합성 단백질 화학에 공지된 방법을 이용하여 시험관내에서 제조할 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소는 디술피드 교환 반응을 이용함으로써, 또는 티오에테르 결합을 형성함으로써 제조할 수 있다. 상기 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-메르캅토부티르이미데이트 및 미국 특허 제4,676,980호에 개시된 시약이 있다.
vi. 이펙터 기능 조작
예를 들어, 암치료에 있어서 항체의 효과를 증대하기 위해, 본 발명의 항체의 이펙터 기능을 수식하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기를 Fc 영역에 도입하여 이 영역내 쇄간 디술피드 결합을 형성시킬 수 있다. 이와 같이 생성된 동종이량체 항체는 내부화 능력이 향상되고(되거나) 보체-매개 세포 사멸 및 항체-의존성 세포내 세포독성(ADCC)이 증대될 수 있다(문헌 (Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) 및 Shopes, J. Immunol., 148:2918-2922 (1992))을 참조한다). 또한, 문헌 (Wolff et al. Cancer Research, 53: 2560-2565 (1993))에 기재된 헤테로이중관능성 가교제를 사용하여 상승된 항-종양 활성을 나타내는 동종이량체 항체를 제조할 수도 있다. 별법으로, 이중 Fc 영역을 포함하는 항체를 조작하여 항체의 보체 용해성 및 ADCC 능력을 증대시킬 수 있다 (Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989) 참조).
vii. 면역결합체
또한, 본 발명은 세포독성제, 예를 들어, 화학요법제, 독소(예를 들어, 효소적으로 활성인 박테리아, 진균, 식물 또는 동물성 독소, 또는 그의 단편) 또는 방사활성 동위원소(즉, 방사성결합체)와 결합된 항체를 포함하는 면역결합체에 관한 것이다.
상기 면역결합체의 생성에 유용한 화학요법제는 상기에 기재되어 있다. 사용될 수 있는 효소 활성 독소 및 그의 단편에는 디프테리아 A 쇄, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 쇄(슈도모나스 애루기노사(Pseudomonas aeruginosa)로부터 유래됨), 리신 A 쇄, 아브린 A 쇄, 모데신 A 쇄, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디(Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피톨라카 아메리카나(Phytolaca americana) 단백질(PAPI, PAPII 및 PAP-S), 쓴 멜론(momordica charantia) 억제제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스(sapaonaria officinalis) 억제제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신, 및 트리코테세네스가 포함된다. 여러 방사성핵종을 방사결합체 항체의 제조에 사용할 수 있다. 예에는 212Bi, 131I, 131In, 90Y 및 186 Re가 포함된다.
다양한 이중관능성 단백질-커플링제, 예를 들어, N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티올)프로피오네이트(SPDP), 이미노티올란(IT), 이미도에스테르의 이중관능성 유도체(예를 들어, 디메틸 아디프이미데이트 HCl), 활성 에스테르(예를 들어, 디숙신이미딜 수베레이트), 알데히드(예를 들어, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물(예를 들어, 비스(p-아지도벤조일)헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체(예를 들어, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트(예를 들어, 톨리엔 2,6-디이소시아네이트), 및 비스-활성 불소 화합물(예를 들어, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 사용하여 항체와 세포독성제의 결합체를 만들 수 있다. 예를 들어, 문헌 (Vitetta et al., Science, 238:1098 (1987))에 기재된 바와 같이 리신 면역독소를 제조할 수 있다. 탄소-14-표지된 1-이소티오시아네이토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산(MX-DTPA)은 방사성뉴클레오디드와 항체를 결합시키는 예시적 킬레이트제이다 (WO 94/11026 참조).
또다른 실시태양에서, 항체는 종양 예비표적화에 사용되는 "수용체"(예를 들어, 스트렙타비딘)에 결합시킬 수 있는데, 여기서 항체-수용체 결합체를 환자에게 투여한 다음, 킬레이트제를 사용하여 순환으로부터 결합하지 않은 결합체를 제거한 후, 세포독성제 (예를 들어, 방사성뉴클레오티드)에 결합된 "리간드" (예를 들어, 아비딘)를 투여한다.
viii. 이뮤노리포좀
본원에서 개시된 항체는 이뮤노리포좀으로서 제제화할 수도 있다. 이 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 문헌 (Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); 및 미국 특허 제4,485,045호 및 동 제4,544,545호)에 기재된 방법으로 제조할 수 있다. 순환 시간이 증대된 리포좀은 문헌 (미국 특허 제5,013,556호)에 개시되어 있다.
특히 유용한 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤, 및 PEG로부터 유도된 포스파티딜에탄올아민(PEG-PE)을 함유하는 지질 조성물을 사용한 역상 증발법으로 생성시킬 수 있다. 일정한 공극 크기의 필터를 통해 리포좀을 압출시켜 직경이 원하는 크기인 리포좀을 수득한다. 문헌 (Martin et al., J. Biol. Chem., 257:286-288 (1982))에 기재된 바와 같이 디술피드-상호교환 반응을 통해 본 발명의 항체의 Fab' 단편을 리포좀에 결합시킬 수 있다. 화학요법제 (예를 들어, 독소루비신(Doxorubicin))은 임의로 리포좀내에 포함된다 (Gabizon et al., J. National Cancer Inst., 81(19):1484 (1989) 참조).
ix. 항체의 제약 조성물
상기 및 하기의 다양한 질환을 치료하기 위해, 본원에서 확인된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드와 특이적으로 결합하는 항체, 및 상기 기재된 스크리닝 검정법에 의해 확인된 기타 분자를 제약 조성물 형태로 투여할 수 있다.
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드 가 세포내 폴리펩티드이고 항체 전체가 억제제로 사용되는 경우, 내부화 항체가 바람직하다. 그러나, 리포펙션 또는 리포좀을 사용하여 항체 또는 항체 단편을 세포내에 전달할 수도 있다. 항체 단편이 사용되는 경우, 표적 단백질의 결합 도메인에 특이적으로 결합하는 최소 억제성 단편이 바람직하다. 예를 들어, 항체의 가변-영역 서열을 기초로 하여, 표적 단백질 서열과 결합하는 능력을 지닌 펩티드 분자를 디자인할 수 있다. 이러한 펩티드는 화학적으로 합성하고(하거나) 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다(예를 들어, 문헌 (Marasco et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7889-7893 (1993)) 참조).
또한, 본원의 제제는 치료할 특정 증상에 따라 필요한 경우 1종 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 악영향을 주지 않는 상보적인 활성을 지닌 화합물을 포함할 수 있다. 별법으로, 또는 추가로, 이 조성물은 그의 기능을 증대시키는 물질, 예를 들어, 세포독성제, 시토킨, 화학요법제, 또는 증식-억제제를 포함할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는 의도된 목적에 효과적인 양으로 배합된다.
활성 성분은 예를 들어, 코아세르베이션(coacervation) 기술 또는 계면 중합 기술을 통해 제조된 것, 예를 들어, 콜로이드성 약물 전달계 (예를 들어, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐) 또는 마크로에멀젼 형태의 히드록시메틸셀룰로스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐에 봉입될 수 있다. 상기 기술은 문헌 (Remington's Pharmaceutical Sciences, 상기 문헌)에 개시되어 있다.
생체내 투여에 사용되는 제제는 멸균처리되어야 한다. 이것은 멸균 여과막 을 통한 여과에 의해 용이하게 달성된다.
서방성 제제도 제조될 수 있다. 서방성 제제의 적당한 예로는 항체를 함유하는 고체 소수성 중합체의 반투과성 매트릭스가 있는데, 상기 매트릭스는 성형품, 예를 들어, 필름 또는 마이크로캡슐 형태이다. 서방성 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 히드로겔(예를 들어, 폴리(2-히드록시에틸-메타크릴레이트) 또는 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 (미국 특허 제3,773,919호), L-글루탐산과 γ 에틸-L-글루타메이트의 공중합체, 비분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 공중합체, 예를 들어, LUPRON DEPOT(등록상표)(락트산-글리콜산 공중합체 및 류프롤라이드 아세테이트로 이루어진 주사가능한 마이크로스피어), 및 폴리-D-(-)-3-히드록시부티르산이 있다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 중합체는 100일 이상 동안 분자를 방출시킬 수 있지만, 일부 히드로겔은 보다 짧은 기간 동안 단백질을 방출시킨다. 캡슐화된 항체가 오랫 동안 체내에 남아있는 경우, 상기 항체는 37 ℃에서 습기에 노출시, 변성 또는 응집되어 생물 활성을 상실하고 그의 면역원성이 변화될 수 있다. 안정화를 위해 관련된 메카니즘에 따라 합리적인 전략을 설계할 수 있다. 예를 들어, 응집 메카니즘이 티오-디술피드 상호교환을 통한 분자간 S-S 결합 형성인 것으로 밝혀진다면, 술프히드릴 잔기의 수식, 산성 용액으로부터의 동결건조, 수분 함량 조절, 적절한 첨가제 사용 및 특이적인 중합체 매트릭스 조성물의 개발을 통해 안정화를 달성할 수 있다.
x. 항체를 사용한 치료 방법
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드에 대한 항체는 상기 언급한 바와 같은 다양한 심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다고 생각된다.
상기 항체는 볼루스로서의 정맥내 투여, 또는 장기간의 연속 관주, 예컨대, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 관절내, 활액내, 수막강내, 경구, 국소 또는 흡입 경로와 같은 공지된 방법으로 포유동물, 바람직하게는 인간에게 투여된다. 항체의 정맥내 투여가 바람직하다.
다른 치료법이 본 발명의 상기 항체 투여와 병행될 수 있다. 예를 들어, 항체가 암을 치료하는 경우, 상기 항체로 치료받는 환자는 방사선 치료를 병행하여 받을 수도 있다. 별법으로, 또는 추가로, 화학요법제를 환자에게 투여할 수 있다. 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 제조자의 지시에 따라, 또는 당업계 전문 숙련인에 의해 경험적으로 결정될 수 있다. 또한, 이러한 화학요법제의 제조 및 투여 일정은 문헌 (Chemotherapy Service Ed., M.C.Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992)에 기재되어 있다. 화학요법제는 항체의 투여 전 또는 후에 투여되거나, 동시에 투여될 수 있다. 타목시펜 또는 에비스타(등록상표)(EVISTA)와 같은 항-에스트로겐 화합물, 또는 오나프리스톤과 같은 항-프로게스테론 화합물(EP 제616812호 참조)을 공지된 투여량으로 항체와 함께 투여할 수 있다.
또한, 항체가 암의 치료에 사용되는 경우, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 또는 VEGF 수용체 중 하나 이상과 결합하는 항체와 같은 기타 종양 관련 항원에 대한 항체를 투여하는 것도 바람직할 수 있다. 또한, 이들은 상기 기재된 약제를 포함한 다. 또한, 항체는 연속 투여되거나, 방사선 조사 또는 방사활성 물질의 투여와 같은 방사의학 치료와 병행하여 투여되는 것이 적합하다. 별법으로, 또는 추가로, 본원에 개시된 항원과 동일한 항원, 또는 2종 이상의 상이한 항원에 결합하는 2종 이상의 항체를 환자에 동시 투여할 수 있다. 종종, 환자에 1종 이상의 사이토카인을 환자에게 투여하는 것도 유익할 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 본원의 항체를 증식 억제제와 동시에 투여할 수 있다. 예를 들어, 우선 증식 억제제를 투여한 후 본 발명의 항체를 투여할 수 있다. 그러나, 동시 투여 또는 본 발명의 항체의 우선 투여도 고려할 수 있다. 증식 억제제의 적당한 투여량은 현재 사용되는 투여량이며, 증식 억제제와 본원 항체의 복합 작용(상승작용)으로 인하여 투여량이 저하될 수 있다.
한 실시양태에서, 종양의 혈관 신생은 병용 치료시 공격받는다. 항-PRO 폴리펩티드 항체 및 기타 항체(예를 들면, 항-VEGF)는 종양의 괴사 또는 그의 전이 병소를 관찰하여 결정된 치료 유효량으로 종양을 앓고 있는 환자에게 투여한다. 이 치료법은 유익한 효과가 더 이상 관찰되지 않거나 임상 검사가 종양 또는 임의의 전이 병소의 흔적을 나타내지 않을 때까지 지속한다. 이어서, TNF를 단독으로, 또는 알파-, 베타- 또는 감마-인터페론, 항-HER2 항체, 헤레굴린(heregulin), 항-헤레굴린 항체, D-인자, 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-2(IL-2), 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF), 또는 종양에서 미세혈관 응고를 촉진하는 물질(예를 들면, 항-단백질 C 항체, 항-단백질 S 항체 또는 C4b 결합 단백질; 1991년 2월 21일에 공개된 WO 제91/01753호 참조)과 같은 보조제와 함께 투여하거나, 열 또는 방사 선 치료와 병행하여 투여한다.
상기 보조제는 그 효과가 다양하기 때문에, 종래의 방법으로 매트릭스 스크리닝을 통해 종양에 대한 보조제의 효과를 비교하는 것이 바람직하다. 항-PRO 폴리펩티드 항체 및 TNF의 투여는 원하는 임상 효과가 성취될 때까지 반복한다. 별법으로, 항-PRO 폴리펩티드 항체는 TNF 및 임의로 보조제와 함께 투여된다. 고형 종양이 사지, 또는 대순환으로부터 분리되기 쉬운 다른 위치에서 발견되는 경우, 본원의 치료제를 분리된 종양 또는 기관에 투여한다. 다른 실시양태에서, 항-FGF 또는 항-PDGF 중화 항체와 같은 FGF 또는 PDGF 길항제를 항-PRO 폴리펩티드 항체와 함께 환자에게 투여한다. 바람직하게는, 항-PRO 폴리펩티드 항체를 사용한 치료는 상처 치유 또는 원하는 혈관형성 기간 동안 중지할 수 있다.
심혈관 질환, 내피세포 질환 및 혈관신생 질환의 예방 또는 치료에 있어서, 본원 항체의 적당한 투여량은 상기 정의한 바와 같이 치료할 질환의 유형, 질환의 심각성 및 진행 과정, 항체가 예방 목적으로 투여되는지 아니면 치료 목적으로 투여되는지, 선행 치료법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 및 주치의의 판단에 따라 달라질 것이다. 이 항체는 한번 또는 일련의 치료를 통해 환자에게 투여하는 것이 바람직하다.
예를 들어, 질환의 유형 및 심각성에 따라, 약 1㎍/kg 내지 15mg/kg(예를 들어, 0.1 내지 20mg/kg)의 항체가 1회 이상의 개별 투여 또는 연속 관주를 통해 환자에게 투여될 초기 후보 투여량이다. 통상적인 일일 투여량 또는 주간 투여량은 상기 언급한 인자에 따라 약 1㎍/kg 내지 100mg/kg 또는 그 이상이다. 증상에 따 라 수일 이상에 걸친 반복 투여의 경우, 치료는 질환의 증상을 원하는만큼 억제할 때까지 반복 또는 지속한다. 그러나, 다른 투여량이 효과적일 수도 있다. 이 치료법의 진행은 종래의 기술 및 검정법(예를 들면, 방사성 종양 영상화)으로 쉽게 관찰할 수 있다.
xi. 항체를 포함하는 제품
항체 및 표지을 포함하는 용기가 있는 제품도 제공된다. 이러한 제품은 상기 기재된 바와 같으며, 그 활성 성분은 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 항체이다.
xii. 항체를 사용한 종양의 진단 및 예후
특정 종양에서 과다 발현되는 증식 수용체와 같은 세포-표면 단백질은 약물 후보 또는 종양(예를 들어, 암) 치료에 대한 훌륭한 표적이지만, 항체가 사용되는 증상이 암인 경우, 상기 항체는 PRO 폴리펩티드와 함께 종양의 진단 및 예후에도 사용할 수 있다. 예를 들면, PRO 폴리펩티드에 대해 유도된 항체는 종양의 진단제 또는 예후제로 사용할 수 있다.
예를 들어, 항체 단편을 비롯한 항체는 PRO 폴리펩티드를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자의 발현을 정성적으로, 또는 정량적으로 검출하는 데 사용할 수 있다. 항체는 예를 들어, 형광 표지와 같은 검출가능한 표지가 부착되어 있는 것이 바람직하며, 항체의 결합은 광학현미경법, 세포유량측정법 (flow cytometry), 플루 오리메트리 또는 당업계에 공지된 다른 기술로 관찰할 수 있다. 이러한 결합 검정법은 본질적으로 상기 기재된 바와 같이 수행한다.
마커 유전자 산물에 대한 항체 결합의 제자리 (in situ) 검출은, 예를 들어, 면역형광현미경 또는 면역전자현미경을 이용하여 수행할 수 있다. 이러한 목적을 위해, 조직학적 시료를 환자로부터 분리하고, 바람직하게는 상기 생물학적 샘플에 항체를 올려놓음으로써 표지된 항체를 상기 시료와 반응시킨다. 또한, 이 방법은 조사된 조직내 마커 유전자 산물의 분포를 알 수 있게 해준다. 다양한 조직학적 방법을 제자리 검출에 쉽게 이용할 수 있음이 당업계 숙련자들에게 자명할 것이다.
하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되며, 어떤 방식으로든 본 발명의 범위를 제한하려는 것은 아니다.
본 명세서에 인용된 모든 특허 및 문헌의 개시 내용은 본원에 포함되는 것으로 한다.
실시예에서 언급한 시판 시약들은 달리 지시하지 않는 한 제조업자의 지시에 따라 사용하였다. 하기 실시예와 명세서 전반에서 ATCC 기탁 번호로 확인되는 세포들의 입수원은 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection, Manassas, VA)이다. 달리 언급되지 않는 한, 본 발명은 상기 기재된 문헌 및 문헌 (Sambrook et al., 상기 문헌; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis et al., PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, Inc.: N.Y., 1990); Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor, 1988); Gait, Oligonucleotide Synthesis(IRL Press: Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan et al., Current Protocols in Immunology, 1991)에 기재된 바와 같은 재조합 DNA 기술의 표준 방법을 이용하였다.
실시예 1: 신규 폴리펩티드 및 이를 코딩하는 cDNA를 확인하기 위한 세포외 도메인 상동성 스크리닝
스위스-프롯(Swiss-Prot) 공개 데이타베이스로부터 약 950개의 공지된 분비형 단백질로부터의 세포외 도메인 (ECD) 서열 (존재하는 경우 분비 신호 서열 포함)을 사용하여 EST 데이타베이스를 검색하였다. EST 데이타베이스는 공개 데이타베이스 (예를 들면, 진뱅크(GenBank))와 비공개 데이타베이스 (예를 들면, LIFESEQ™ (인사이트 파마슈티칼스(Incyte Pharmaceuticals, 캘리포니아주 팔로 알토))를 포함한다. 검색은 EST 서열의 6개 프레임 번역에 대한 ECD 단백질 서열의 비교로서 컴퓨터 프로그램 WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))를 이용하여 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는 70 (또는 몇몇 경우 90) 이상의 블라스트(Blast) 스코어를 갖는 비교물을 클러스터시키고, 프로그램 "프랩(phrap)" (Phil Green, University of Washington, 워싱턴주 시애틀)을 사용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다.
이러한 세포외 도메인 상동성 스크린을 이용하여, 컨센서스 DNA 서열을 프랩을 사용하여 확인된 다른 EST 서열에 대해 어셈블리하였다. 또한, 수득한 컨센서 스 DNA 서열을 종종 (항상은 아니지만) 가능한 한 상기 논의한 EST 서열원을 사용하여 컨센서스 서열을 가능한 길게 신장시키기 위해 BLAST 또는 BLAST-2와 프랩의 반복 사이클을 이용하였다.
이어서, 상기한 바와 같이 수득한 컨센서스 서열을 기초로 하여 올리고뉴클레오티드를 합성하여, PCR로 관심있는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 확인하기 위해 사용하고 PRO 폴리펩티드에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리시키기 위한 프로브로서 사용하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머는 일반적으로 20 내지 30개 뉴클레오티드 범위이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 제공하기 위해 고안된다. 프로브 서열은 대개 40 내지 55 bp 길이이다. 몇몇 경우, 컨센서스 서열이 약 1 내지 1.5 kbp보다 큰 경우, 추가의 올리고뉴클레오티드가 합성된다. 전장 클론을 위한 몇몇 라이브러리를 스크리닝하기 위해, 이들 라이브러리로부터의 DNA를 PCR 프라이머 쌍을 사용하여 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 따라 PCR 증폭에 의해 스크리닝하였다. 이어서, 양성 라이브러리를 사용함으로써 프로브 올리고뉴클레오티드 및 프라이머 쌍들 중 하나를 사용하여 관심있는 유전자를 코딩하는 클론을 단리시켰다.
cDNA 클론을 단리시키기 위해 사용되는 cDNA 라이브러리는 인비트로젠(Invitrogen, 캘리포니아주 샌디에고)으로부터의 시약들과 같은 시판 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. cDNA를 NotI 부위를 갖는 올리고 dT로 프라이밍시키고, SalI 헤미키나제화된 어댑터에 평활 말단으로 연결시키고, NotI로 절단하고, 겔 전기영동에 의해 적절한 크기로 분류하고, 적당한 클로닝 벡터 (예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRK5B는 SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5D의 전구체임; 문헌 (Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991))을 참조한다)내의 유일한 XhoI 및 NotI 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
실시예 2: 아밀라제 스크리닝을 이용한 cDNA 클론의 단리
1. 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제작
인비트로젠 (캘리포니아주, 샌디에고)사의 시약 및 프로토콜 (Fast Track 2)을 사용하여 인간 조직으로부터 mRNA를 단리하였다. 미국 메릴랜드주 게터스버그 소재의 라이프테크놀로지사 (Life Technologies)의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System)을 이용하여, 상기 RNA를 사용하여 벡터 pRK5D에 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중 가닥 cDNA의 크기를 1000 bp보다 크도록 선택하고, SalI/NotI 링커 부착 cDNA를 XhoI/NotI 절단 벡터에 클로닝하였다. pRK5D는 sp6 전사 개시 부위, SfiI 제한 효소 부위, XhoI/NotI cDNA 클로닝 부위를 순서대로 포함하는 클로닝 벡터이다.
2. 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리의 제작
1차 cDNA 클론의 5' 말단을 우선적으로 제공하기 위해 2차 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 1차 라이브러리 (상기한 바와 같음)로부터 Sp6 RNA를 생성시키고, 라이프 테크놀로지(Life Technologies)사의 시약 및 프로토콜 (Super Script Plasmid System, 상기한 바와 같음)을 사용하여 상기 RNA로 랜덤 프라이밍된 cDNA 라이브러리를 생성시켰다. 이 과정에서, 이중가닥 cDNA를 500 내지 1000 bp의 크기로 만들고, NotI 어댑터에 평활한 상태로 연결시키고, SfiI로 절단하여 SfiI/NotI 절단 벡터에 클로닝하였다. pSST-AMY.0은 cDNA 클로닝 부위 및 마우스 아밀라제 서열 (성숙 서열, 분비 신호 없음) 앞에 효모 알콜 데히드로게나제 프로모터를 갖고 클로닝 부위 뒤에 효모 알콜 데히드로게나제 터미네이터를 갖는 클로닝 벡터이다. 따라서, 프레임내에 아밀라제 서열과 결합된, 상기 벡터내에 클로닝된 cDNA는 적절하게 형질감염된 효모 콜로니로부터 아밀라제를 분비시킬 수 있다.
3. 형질전환 및 검출
상기 단락 2에 기재된 라이브러리로부터의 DNA를 얼음 위에서 냉각시켜 전기수용성 (electorcompetent) DH10B 세균 (Life Technologies) 20 ml을 첨가하였다. 이어서, 세균 및 벡터 혼합물을 이어서 제조자의 지시에 따라 일렉트로포레이션시켰다. 이어서, SOC 배지 (Life Technologies) 1 ml을 첨가하고 혼합물을 30분 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후에, 형질전환체를 암피실린 함유 표준 150 mm LB 플레이트 20개에 플레이팅하고 16시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 양성 콜로니를 플레이트로부터 분리하여 표준 프로토콜, 예를 들어, CsCl-농도구배법을 이용하여 DNA를 세균 펠렛으로부터 단리하였다. 정제된 DNA를 사용하여 다음과 같은 효모 프로토콜을 수행하였다.
효모 방법은 다음 세개의 카테고리로 분류된다: 1) 플라스미드/cDNA 조합 벡터를 사용한 효모의 형질전환, 2) 아밀라제를 분비하는 효모 클론의 검출 및 단리 및 3) 효모 콜로니로부터 삽입체의 직접 PCR 증폭, 서열분석 및 추가의 분석을 위한 DNA의 정제.
사용된 효모는 HD56-5A (ATCC-90785)이었다. 이 균주는 MAT 알파, ura3-52, leu2-3, leu2-112, his3-11, his3-15, MAL+, SUC+, GAL+의 유전자형을 나타낸다. 바람직하게는, 번역 후 경로가 없는 효모 변이체를 사용할 수 있다. 이러한 변이체는 sec71, sec72, sec62, 바람직하게는 말단이 잘린 sec71에서 전좌(translocation)로 인한 결핍 대립유전자를 가질 수 있다. 별법으로, 상기 유전자의 정상적인 작동을 방해하거나, 상기 번역 후 경로에 관련된 다른 단백질 (예를 들어, SEC61p, SEC72p, SEC62p, SEC63p, TDJ1p 또는 SSA1p-4p) 또는 이들 단백질의 결합체 형성을 방해하는 길항제 (안티센스 뉴클레오티드 및(또는) 리간드 포함)를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
형질전환은 문헌 (Gietz et al., Nucl. Acid. Res., 20:1425 (1992))에 개시된 프로토콜을 기초로 하여 수행하였다. 이어서, 형질전환된 세포를 아가로부터 YEPD 복합 배지 브로쓰 100 ml에 접종하고 30℃에서 밤새 배양하였다. YEPD 브로쓰를 문헌 [Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 207 (1994)]에 기재된 바와 같이 제조하였다. 밤새 배양한 배양액을 신선한 YEPD 브로쓰 500 ml로 약 2 x 106 세포/ml (약 OD600 = 0.1)까지 희석하여 약 1 x 107 세포/ml (약 OD600 = 0.4 - 0.5)로 재배양하였다.
세포를 회수한 다음, 형질전환을 준비하였는데, 소르발 (Sorval) GS3 로터의 GS3 로터 바틀로 옮겨서 5,000 rpm에서 5분 동안 원심분리하고, 상등액을 버리고, 50 ml 팔콘 튜브에서 멸균수로 재현탁시켜 벡크만 (Beckman) GS-6KR 원심분리기에 서 3,500 rpm으로다시 원심분리하여였다. 상등액을 버리고, 세포를 LiAc/TE (10 ml, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH7.5, 100 mM Li2OOCCH3)로 세척하여 LiAc/TE (2.5 ml)에 재현탁시켰다.
마이크로 원심분리 튜브에서, 준비한 세포 100 ㎕를 신선한 변성 단일 가닥 연어 고환 DNA (미국 메릴랜드주 게이터스버그 소재 Lofstrand Lab)와 형질전환 DNA 1 ㎍ (부피 < 10 ㎕)를 혼합하여 형질전환을 수행하였다. 혼합물을 볼텍싱으로 잠깐 혼합한 후, 40% PEG/TE 600 ㎕ (40% 폴리에틸렌 글리콜-4000, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM Li2OOCCH3, pH 7.5)를 첨가하였다. 상기 혼합물을 부드럽게 혼합하고 30분 동안 교반하면서 30℃에서 인큐베이션하였다. 이어서, 42℃에서 15분 동안 열 쇼크를 세포에 가하고, 반응 용기를 12,000 rpm, 마이크로원심분리기에서 5 내지 10초 동안 원심분리하여 상등액을 버리고 TE 500 ㎕ (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA pH7.5)에 재현탁시킨 후 재원심분리하였다. 세포를 TE 1 ml로 희석하고 분취액 200 ㎕를 150 mm 증식 플레이트 (VWR)에 미리 제조된 선별 배지 상에 도말하였다.
별법으로, 수회에 걸친 소규모 반응 대신에 시약량을 증가시키면서 1회의 대규모 반응을 이용하여 형질전환을 수행하였다.
사용된 선별 배지는 문헌 (Kaiser et al., Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994))에 기재된 바와 같이 제조된, 우라실이 없는 합성 완전 덱스트로스 아가 (SCD-Ura)이었다. 형질전 환체를 30℃에서 2 내지 3일 동안 배양하였다.
아밀라제를 분비하는 콜로니의 검출은 적색 전분을 선별 증식 배지에 포함시켜 수행하였다. 문헌 (Biely et al., Anal. Biochem., 172:176-179 (1988))에 기재된 바와 같은 방법에 따라 전분을 적색 염료 (반응성 Red-120, Sigma)와 결합시켰다. 결합된 전분을 최종 농도 0.15% (w/v)로 SCD-Ura 아가 플레이트에 첨가하고, 인산칼륨을 사용하여 pH 7.0으로 완충시켰다 (최종 농도 50 내지 100 mM).
양성 콜로니를 선별하여 새로운 선별 배지 (150 mm 플레이트 상의)에 스트리킹함으로써 잘 단리하여 동정가능한 단일 콜로리를 수득하였다. 적색 전분을 완충된 SCD-Ura 아가에 직접 첨가하여 아밀라제 분비에 대해 양성인 잘 단리된 단일 콜로니를 검출하였다. 전분을 분해하여 눈으로 직접 확인할 수 있는 양성 콜로니 주위에 투명 원광(halo)을 생성시키는 능력을 지닌 양성 콜로니를 선별하였다.
4. PCR 증폭에 의한 DNA의 단리
양성 콜로니를 단리할 때, 그 일부를 이쑤시개로 떼어 내어 96웰 플레이트에 있는 멸균수 30 ㎕에 희석하였다. 이때, 양성 콜로니를 동결시켜 후속 분석을 위해 보관하거나 즉시 증폭하였다. 0.5 ㎕ 클렌택 (Klentaq, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 Clontech), 10 mM dNTP 4.0 ㎕ (Perkin Elmer-Cetus), 클렌텍 완충액 (Clontech) 2.5 ㎕, 전방향 올리고뉴클레오티드 1 0.25 ㎕, 역방향 올리고뉴클레오티드 2 0.25 ㎕, 증류수 12.5 ㎕를 포함하는 25 ㎕ 부피의 PCR 반응에 세포의 분취액 5 ㎕를 주형으로 사용하였다. 전방향 올리고뉴클레오티드 1의 서열은 다음과 같다:
5'-TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3' (서열 33)
역방향 올리고뉴클레오티드 2의 서열은 다음과 같다:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3' (서열 34)
이어서, PCR을 다음과 같이 수행하였다.
a. 92℃에서 5분 동안 변성시킴,
b. 92℃에서 30초 동안 변성, 59℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 3회 실시,
c. 92℃에서 30초 동안 변성, 57℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 3회 실시,
d. 92℃에서 30초 동안 변성, 55℃에서 30초 동안 어닐링, 72℃에서 60초간 신장시키는 과정을 25회 실시,
e. 4℃에서 유지시킴.
올리고뉴클레오티드의 밑줄친 영역은 ADH 프로모터 영역 및 아밀라제 영역에 각각 어닐링되고, 삽입체가 존재하지 않을 경우 벡터 pSST-AMY.O으로부터 307 bp 영역을 증폭하였다. 통상적으로, 상기 올리고뉴클레오티드의 5' 말단의 처음 18개의 뉴클레오티드는 서열 분석 프라이머의 어닐링 부위를 포함한다. 따라서, 공(empty) 벡터로부터 얻은 PCR 반응의 총 생성물은 343 bp이었다. 그러나, 신호 서열이 결합된 cDNA는 상당히 긴 뉴클레오티드 서열을 생성시켰다.
PCR 후, 문헌 [Sambrook et al., 상기 문헌]에 기재된 Tris-Borate-EDTA (TBE) 완충 시스템을 사용한 1% 아가로스 겔 상 아가로스 겔 전기영동으로 반응액 의 분취액 5 ㎕를 조사하였다. 400 bp보다 큰 강력한 하나의 PCR 산물을 생성하는 클론을 96 키아퀵 (Qiaquick) PCR 클린-업 (clean-up) 컬럼 (미국 캘리포니아주 채스워쓰 소재의 Qiagen Inc.)으로 정제한 후 DNA 시퀀싱으로 더 분석하였다.
실시예 3: 신호 연산법 분석을 이용한 cDNA 클론의 단리
제넨테크, 인크사 (Genentech, Inc., South San Franscisco, CA)에서 개발한 비공개 신호 서열 검색 연산법을 이용하여, 다양한 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 공개(예를 들어, Genbank) 및(또는) 비공개(LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA) 데이타베이스로부터의 EST 및 밀집되고 조립된 EST 단편에서 확인하였다. 신호 서열 연산법은 목적 서열 또는 서열 단편의 5'-말단에 있는 첫번째 및 임의로 두번째 메티오닌 코돈(ATG) 주변의 DNA 뉴클레오티드의 특성을 기초로 하여 분비 신호 점수를 계산한다. 첫번째 ATG 다음의 뉴클레오티드는 임의의 정지 코돈 없이 35개 이상의 분명한 아미노산을 코딩해야 한다. 첫번째 ATG는 소정의 아미노산을 갖는 경우, 두번째 ATG는 조사하지 않았다. 이 요건을 충족시키지 못하는 경우, 후보 서열의 점수는 계산하지 않았다. EST 서열이 분명한 신호 서열을 포함하는지를 결정하기 위해, 분비 신호와 관련된 것으로 알려진 7개의 센서(평가 파라미타) 한 세트를 사용하여 상기 DNA 및 ATG 코돈 주변의 아미노산 서열의 점수를 매겼다. 이 연산법을 사용하여 많은 폴리펩티드-코딩 핵산 서열을 확인하였다.
실시예 4: 인간 PRO179를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
cDNA 서열은 상기 실시예 2에 기재된 바와 같은 스크리닝으로 단리하였다. 상기 스크리닝에서 단리된 cDNA 서열은 BLAST 및 FastA 서열 정렬을 통해 다양한 앤지오포이틴 단백질을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 상동한 서열을 포함하고 있는 것으로 밝혀졌다. 이 cDNA 서열은 본원에서 DNA10028 및(또는) DNA25250으로 지칭된다.
그 다음으로, 서열 상동성을 기초로 하여 DNA10028 분자의 서열로부터 올리고뉴클레오티드 프로브를 만들고, 이 프로브를 사용하여 상기 실시예 2의 단락 1에 기재된 바와 같이 제작된 인간 태아의 간 라이브러리 (LIB6)를 스크리닝하였다. 클로닝 벡터는 XhoI 및 NotI 부위가 각각 하나인 pRK5B (SfiI 부위를 포함하지 않는 pRK5B의 전구체임; Holmes et al., Science, 253: 1278-1280 (1991))이고, 절단된 cDNA 크기는 2800 bp 미만이었다.
상기한 바와 같이 단리한 클론의 DNA 시퀀싱을 통하여 PRO179의 전장 DNA 서열 및 PRO179에 대한 유도된 단백질 서열을 얻었다. DNA16451-1388의 전장 뉴클레오티드 서열은 도 1 (서열 1)에 나타내었다. 클론 DNA16451-1388은 뉴클레오티드 위치 37 내지 39에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 1417 내지 1419에서 분명한 정지 코돈을 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 1). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 460개 아미노산이다 (도 2, 서열 2). 도 2에 나타낸 전장 PRO179 단백질의 예측된 분자량은 약 53,637 달톤이고, pI는 약 6.61이다.
도 2 (서열 2)에 나타낸 전장 PRO179 서열의 분석은 도 2에 나타낸 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 여기서 이들 중요 폴리펩 티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타낸 것이다. 전장 PRO179 서열 (도 2; 서열 2)의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 16이고; 류신 지퍼 패턴의 아미노산 위치가 약 120 내지 약 142, 및 약 127 내지 약 149이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 23 내지 약 27, 약 115 내지 약 119, 약 296 내지 약 300, 및 약 357 내지 약 361이고; 피브리노겐 베타쇄 및 감마쇄 C-말단 도메인의 아미노산 위치가 약 271 내지 약 310, 약 312 내지 약 322, 약 331 내지 약 369, 및 약 393 내지 약 424임을 입증한다.
클론 DNA16451-1388은 1998년 4월 14일자로 ATCC에 기탁하였고, ATCC 제209776호의 기탁번호를 부여받았다. 서열을 고려할 때, 기탁된 클론은 정확한 서열을 포함하고 있고, 본원에서 제공하는 서열은 공지된 시퀀싱 기술을 기초로 한 것이다.
전장 PRO179 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 PRO179 폴리펩티드가 앤지오포이에틴족의 단백질과 상당히 유사하므로, PRO179가 앤지오포이에틴족의 신규 구성원일 수 있음을 암시한다. 보다 구체적으로, 데이호프 데이타베이스 (버젼 35.45 스위스프롯 35)의 분석은 PRO179 아미노산 서열과 하기 데이호프 서열 사이에 상당한 상동성이 있음을 입증한다: AF004326_1, P_R94605, HSU83508_1, P_R94603, P_R94317, AF025818_1, HSY16132_1, P_R65760, I37391 및 HUMRSC192_1.
실시예 5: 인간 PRO238을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 phrap을 이용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 본원에서 이 컨센서스 서열을 DNA30908이라 지칭하였 다. DNA30908 컨센서스 서열을 기초로 하여, 1) 원하는 서열을 함유하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고, 2) PRO238에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해, 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. 또한, 상기 컨센서스 DNA30908 서열로부터 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 제작하였다.
여러 라이브러리를 스크리닝하여 전장 클론원을 얻기 위해, 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)의 방법에 따라 하기 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 그 다음으로, 양성 라이브러리는 하기 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하기 PCR 프라이머 중 하나를 사용하여 PRO238 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는 데 사용하였다.
상기 방법에서 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 다음과 같다:
전방향 PCR 프라이머 1:
5'-GGTGCTAAACTGGTGCTCTGTGGC-3' (서열 35)
전방향 PCR 프라이머 2:
5'-CAGGGCAAGATGAGCATTCC-3' (서열 36)
역방향 PCR 프라이머
5'-TCATACTGTTCCATCTCGGCACGC-3' (서열 37)
혼성화 프로브:
5'-AATGGTGGGGCCCTAGAAGAGCTCATCAGAGAACTCACCGCTTCTCATGC-3' (서열 38)
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 RNA는 인간 태아 간 조직으로부터 단리하 였다. cDNA 클론을 단리하는 데 사용된 cDNA 라이브러리는 인비트로젠사 (San Diego, CA)의 시약과 같은 시판되는 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. cDNA는 NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalⅠ 헤미키나아제화 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotⅠ으로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 대략 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기와 같이 단리된 클론 DNA를 시퀀싱하여 PRO238의 전장 DNA 서열 [본원에서 DNA35600-1162로 지칭됨] (도 3, 서열 3) 및 PRO238의 유도된 단백질 서열을 얻었다.
DNA35600-1162의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 3 (서열 3)에 나타내었다. 클론 DNA35600-1162는 뉴클레오티드 위치 134-136에 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 1064-1066의 정지 코돈에서 종결하는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함하고 있다 (도 3). 예측된 폴리펩티드 전구체의 길이는 310 개의 아미노산이고 (도 4; 서열 4), 대략적인 분자량은 약 33,524 달톤이고 pI는 약 9.55이다.
도 4 (서열 4)에 나타낸 전장 PRO238 서열의 분석 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인 각각의 위치는 상기에 기재된 바와 같이 대략적인 것이다. 전장 PRO238 서열 (도 4; 서열 4)의 분석 결과는 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 21 이고; 막횡단 도메인의 아미노산 위치가 약 102 내지 119 및 약 278 내지 약 292이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 228 내지 약 232이고; 글리코스아미노글리칸 부착 부위의 아미노산 위치가 약 47 내지 약 51이고; 티로신 키나제 인산화 부위의 아미노산 위치가 약 145 내지 약 153이고; N-미리스토일화 부위의 아미노산 위치가 약 44 내지 약 50, 약 105 내지 약 111, 약 238 내지 약 244, 약 242 내지 248, 및 약 291 내지 약 297이고; 아미드화 부위의 아미노산 위치가 약 265 내지 269이고; 원핵세포막 지단백질 지질 부착 부위의 아미노산 위치가 약 6 내지 17임을 입증한다. 클론 DNA35600-1162는 1997년 10월 16일자로 기탁되었고, ATCC 209370의 기탁 번호를 부여받았다.
전장 PRO238 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 PRO238의 일부가 리덕타제, 특히 옥시도리덕타제와 상당한 상동성을 나타내므로, 상기 PRO238이 신규 리덕타제일 수 있음을 암시한다.
실시예 6: 인간 PRO364를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, 종양 괴사 인자 (TNFR) 족 폴리펩티드의 구성원과 상동성을 보이는 인사이트 EST 서열 (Incyte EST No. 3003460)을 찾아내었다.
BLAST (Altshul et al., Methods in Enzymology 266:460-480 (1996)) 및 "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)의 반복 주기를 이용하여, Incyte EST 3003460 및 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 "<consen01>"이라 지칭되었으며, 또한 DNA44825라 지칭되었다. 1) 원하는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고 2) PRO364에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해, DNA44825 및 "<consen01>" 컨센서스 서열을 기초로 하여 올리고뉴클레오티드 프로브를 합성하였다. 전방향 및 역방향 PCR 프라이머의 길이는 통상적으로 20 내지 30개의 뉴클레오티드이고, 종종 약 100 내지 1000 bp 길이의 PCR 산물을 얻을 수 있도록 디자인한다. 프로브 서열의 길이는 통상적으로 40 내지 55 bp이다. 여러 라이브러리를 스크리닝하여 전장 클론을 얻기 위해, 상기 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 그 후, 양성 라이브러리는 하기 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하기 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 원하는 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는 데 사용하였다.
하기 PCR 프라이머쌍 (전방향 및 후방향)을 합성하였다:
전방향 PCR 프라이머 (44825.fl):
5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3' (서열 39)
전방향 PCR 프라이머 (44825.f2):
5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3'(서열 40)
전방향 PCR 프라이머 (44825.GITR.f):
5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3' (서열 41)
역방향 PCR 프라이머 (44825.rl):
5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3' (서열 42)
역방향 PCR 프라이머 (44825.r2):
5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3' (서열 43)
역방향 PCR 프라이머 (44825.GITR.r):
5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3' (서열 44)
추가로, 뉴클레오티드 서열이 하기와 같은 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 DNA44825 컨센서스 서열로부터 제조하였다:
혼성화 프로브 (44825.p1):
5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3' (서열 45)
혼성화 프로브 (44825.GITR.p):
5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3' (서열 46)
여러 라이브러리를 스크리닝하여 전장 클론원을 얻기 위해, 상기와 같은 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 양성 라이브러리는 하기 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하기 PCR 프라이머 중의 하나를 사용하여 PRO364 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는 데 사용하였다.
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 RNA는 인간 골수 조직으로부터 단리하였다. cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 시판하는 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalI 헤미키나아제화된 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotI으로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 대략적으로 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터(예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
cDNA 클론을 확인하고 전체 서열을 시퀀싱하였다. DNA47365-1206의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 5 (서열 5)에 나타내었다. 클론 DNA47365-1206은 뉴클레오티드 위치 121 내지 123에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 844 내지 846에서 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 5; 서열 5). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 241개의 아미노산이고, 예상 분자량은 약 26,000 달톤이며, 추정된 pI는 약 6.34이다. 전장 PRO364 단백질은 도 6 (서열 6)에 나타내었다.
도 6 (서열 6)에 나타낸 전장 PRO364 서열의 분석은 도 6에 나타낸 바와 같이 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타나있다. 전장 PRO364 서열 (도 6; 서열 6)의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 25이고; 막횡단 도메인일 가능성이 높은 도메인의 아미노산 위치가 약 162 내지 약 180이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 146 내지 약 150이고; N-미리스토일화 부위의 아미노산 위치가 약 5 내지 약 11, 약 8 내지 약 14, 약 25 내지 약 31, 약 30 내지 약 36, 약 33 내지 약 39, 약 118 내지 약 124, 약 122 내지 약 128, 및 약 156 내지 약 162이고; 원핵세포막 지단백질 지질 부착 부위의 아미노산 위치가 약 166 내지 약 177이고; 류신 지퍼 패턴의 아미노산 위치가 약 171 내지 약 193임을 입증한다. 클론 DNA47365-1206은 1997년 11월 7일에 ATCC에 기탁하였고, ATCC 209436의 기탁 번호를 부여받았다. 기탁된 클론은 본원에 제공된 서열보다 사실상 더 정확한 서열을 갖는 것임을 알아야 한다.
전장 PRO364 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석은 상기 폴리펩티드의 일부분이 종양 괴사 인자 수용체 족의 구성원과 상당한 상동성이 있으므로, PRO364가 종양 괴사 인자 수용체 족의 신규 구성원일 수 있음을 암시한다. PRO364의 세포내 도메인은, TRAF2 결합에 필요한 것으로 보이면서 TNFR2내에 존재하기도 하는 CD30 수용체내의 최소 도메인과 유사한 모티프 (아미노산 207-214 영역내에 있음)를 포함한다. TNFR 족의 특징인 3개의 분명한 세포외 시스테인-풍부 도메인 (CDR)이 존재하는데 (Naismith and Sprang, Trends Biochem. Sci., 23: 74-79 (1998)), 이들 중 3번째 CDR의 시스테인 갯수는 TNFR 족 CDR의 전형적인 시스테인 갯수인 4 또는 6개가 아니라 3개이다. PRO364과 마우스의 GITR (아래에 기재되어 있음)을 비교할 때, 마우스의 GITR은 CRD1에 5개의 시스테인을 포함하는데 반해, PRO364 아미노산 서열은 CRD1에 8개의 시스테인을 포함하고, 마우스의 GITR에는 N-결합 글리코실화 부위일 가능성이 높은 4개의 도메인이 존재하는 반면, ECD에는 N-결합 글리코실화 부위일 가능성이 높은 1개의 도메인이 존재한다.
전장 PRO364 폴리펩티드의 잠정적인 아미노산 서열과, 이 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 상세히 조사해보면, 문헌(Nocenti et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 94: 6216-6221 (1997))에 보고된 마우스 GITR 단백질과 상 동성이 있음이 입증된다. 따라서, PRO364는 상기 문헌에 보고된 마우스 GITR 단백질의 상응하는 단백질일 수 있다.
실시예 7: 인간 PRO844를 코딩하는 cDNA 클론의 단리
발현 서열 태그 (EST) DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 검색하여, LP와의 서열 동일성을 보이는 EST를 찾아내었다. 본원에서 제공한 정보 및 발견을 기초로 하여 폐암세포 라이브러리 (309-LUNGTUT09) 중에서 이 EST에 대한 클론인 인사이트 클론 2657496을 더 조사하였다.
cDNA 클론을 확인하고 전체 서열을 시퀀싱하였다. DNA59838-1462의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 7 (서열 7)에 나타내었다. 클론 DNA59838-1462는 뉴클레오티드 위치 5-7에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 338-340에서 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 7; 서열 7). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 111개의 아미노산이고, 예상 분자량은 약 12,050 달톤이며, 추정된 pI는 약 5.45이다. 전장 PRO844 단백질은 도 8 (서열 8)에 나타내었다.
도 8 (서열 8)에 나타낸 전장 PRO844 서열의 분석은 도 8에 나타낸 바와 같이 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타나있다. 전장 PRO844 서열 (도 8; 서열 8)의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 19이고; N-미리스토일화 부위의 아미노산 위치가 약 23 내지 약 29, 약 27 내지 약 33, 약 32 내지 약 38, 및 약 102 내지 약 108이고; WAP-타입 '4-이황화 코어' 도메인 신호 부위의 아미노산 위치가 약 49 내지 약 63임을 입증한다.
클론 DNA59838-1462는 1998년 6월 16일에 ATCC에 기탁하였고, ATCC 209976의 기탁 번호를 부여받았다. 기탁된 클론은 본원에 제공된 것보다 실제로 더 정확한 서열을 포함하고 있다는 것을 인지해야 한다.
전장 PRO844 폴리펩티드의 아미노산 서열 분석 결과는 상기 폴리펩티드가 세린 프로테아제 억제제와 상당한 동일성을 나타내므로, PRO844가 신규 프로테아제 억제제일 수 있음을 암시한다. 보다 구체적으로, 데이호프 데이타베이스 (버젼 35.45 스위스프롯 35)의 분석 결과는 PRO844 아미노산 서열과 적어도 하기 데이호프 서열 사이에 상당한 상동성이 있음을 입증한다: ALK1_HUMAN, P_P82403, P_P82402, ELAF_HUMAN 및 P_P60950.
실시예 8: 인간 PRO846을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 1에 기재된 바와 같이 phrap를 사용하여 다른 EST 서열에 대해 컨센서스 DNA 서열을 어셈블리하였다. 이 컨센서스 서열은 본원에서 DNA39949 및 "<consen1322>"라 지칭되었다. 1) 원하는 서열을 포함하는 cDNA 라이브러리를 PCR로 확인하고 2) PRO846에 대한 전장 코딩 서열의 클론을 단리하기 위한 프로브로 사용하기 위해, DNA39949 컨센서스 서열 및 "<consen1322>" 서열을 기초로 하여 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. PCR 프라이머 (전방향 및 역방향)는 DNA39949 및 "<consen1322>" 컨센서스 서열을 기초로 하여 합성하였다. 추가로, 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브는 컨센서스 DNA30908 서열로부터 제작하였다.
여러 라이브러리를 스크리닝하여 전장 클론을 얻기 위해, 상기 문헌 (Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology)에 기재된 바와 같이 PCR 프라이머쌍을 사용한 PCR 증폭으로 라이브러리의 DNA를 스크리닝하였다. 그 후, 양성 라이브러리는 하기 프로브 올리고뉴클레오티드 및 하기 프라이머 쌍 중 하나를 사용하여 PRO846 유전자를 코딩하는 클론을 단리하는 데 사용하였다.
상기 방법에서 사용된 올리고뉴클레오티드 서열은 하기와 같다:
전방향 PCR 프라이머 (39949.fl):
5'-CCCTGCAGTGCACCTACAGGGAAG-3' (서열 47)
역방향 PCR 프라이머 (39949.r1):
5'-CTGTCTTCCCCTGCTTGGCTGTGG-3'(서열 48).
추가로, 뉴클레오티드 서열이 하기와 같은 합성 올리고뉴클레오티드 혼성화 프로브를 컨센서스 DNA39949 서열로부터 제작하였다:
혼성화 프로브 (39949.p1):
5'-GGTGCAGGAAGGGTGGGATCCTCTTCTCTCGCTGCTCTGGCCACATC-3' (서열 49).
cDNA 라이브러리를 제작하기 위한 RNA는 인간 태아 신장 조직으로부터 단리하였다 (LIB227). cDNA 클론을 단리하기 위해 사용된 cDNA 라이브러리는, 인비트로젠 (Invitrogen, San Diego, CA)과 같은 회사에서 시판하는 시약을 사용하여 표준 방법으로 제작하였다. NotⅠ 부위를 함유하는 올리고 dT로 cDNA를 프라이밍시키고, SalI 헤미키나아제화된 어댑터에 평활 말단으로 결합시킨 후, NotI으로 절단하고, 겔 전기영동으로 크기에 따라 대략적으로 분류한 다음, 적합한 클로닝 벡터( 예를 들면, pRKB 또는 pRKD; pRKB5는 SfiⅠ부위가 없는 pRK5D의 전구체임; Homles et al., Science, 253:1278-1280 (1991) 참조)의 단일 XhoⅠ 및 NotⅠ 부위에 정해진 방향으로 클로닝하였다.
상기와 같이 단리된 클론의 DNA 시퀀싱을 통해 PRO846에 대한 전장 DNA 서열 [본원에서 DNA44196-1353으로 지칭됨] (도 9, 서열 9) 및 PRO846에 대한 유도된 단백질 서열을 얻었다.
DNA44196-1353의 전체 뉴클레오티드 서열은 도 9 (서열 9)에 나타내었다. 클론 DNA44196-1353은 뉴클레오티드 위치 25-27에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 1021-1023에서 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 9). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 332개의 아미노산이고, 예상 분자량은 약 36,143 달톤이며, 추정된 pI는 약 5.89이다 (도 10, 서열 10).
도 10 (서열 10)에 나타낸 전장 PRO846 서열의 분석은 도 10에 나타낸 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타나있다. 전장 PRO846 서열 (도 10; 서열 10)의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 17이고; 막횡단 도메인의 아미노산 위치가 약 248 내지 약 269이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 96 내지 약 100이고; 피브리노겐 베타쇄 및 감마쇄 C-말단 도메인의 아미노산 위치가 약 104 내지 약 114이고; Ig 유사 V-타입 도메인의 아미노산 위치가 약 13 내지 약 128임을 입증한다. 클론 DNA44196-1353은 1998년 5월 6일자로 ATCC에 기탁하였고, ATCC 209847의 기탁 번호를 부여받았다.
실시예 9: 인간 PRO1760을 코딩하는 cDNA 클론의 단리
상기 실시예 3에 기재된 신호 서열 알고리즘을 이용하여 인사이트 데이타베이스로부터 EST 클러스터 서열을 찾아내었다. 그 다음으로, 상동성이 있는지를 확인하기 위해, 상기 EST 클러스터 서열을 공개된 EST 데이타베이스 (예를 들어, 진뱅크) 및 비공개된 EST DNA 데이타베이스 (LIFESEQ(등록상표), Incyte Pharmaceuticals, Palo Alto, CA)를 비롯한 다양한 발효 서열 태그 (EST) 데이타베이스와 비교하였다. 하나 이상의 EST를 전립선 종양 라이브러리로부터 얻었다. 컴퓨터 프로그램 BLAST 또는 BLAST2 (Altshul et al., Methods in Enzymology, 266: 460-480 (1996))를 사용하여 상동성 검색을 수행하였다. 공지된 단백질을 코딩하지 않는, BLAST 스코어가 70 (또는 일부 경우에는 90) 이상인 EST를 모으고, "phrap" (Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington) 프로그램을 이용하여 컨센서스 DNA 서열로 어셈블리하였다. 이로부터 얻은 컨센서스 서열은 본원에서 DNA58798로 지칭된다.
DNA58798 컨센서스 서열과 인사이트 EST 3358745 사이에 상동성이 있는 서열이 있음을 확인하였기 때문에, 이 EST를 포함하는 클론을 구입하였고, cDNA 인서트를 얻어 시퀀싱하였다. 상기 인서트는 전장 단백질을 코딩하는 것으로 본원에서 밝혀졌다. 이 cDNA 인서트의 서열은 도 11 (서열 11)에 나타내었고 본원에서 DNA76532-1702로 지칭된다.
클론 DNA76532-1702는 뉴클레오티드 위치 60-62에서 분명한 번역 개시 부위를 갖고 뉴클레오티드 위치 624-626에서 정지 코돈 갖는 단일 오픈 리딩 프레임을 포함한다 (도 11). 예상된 폴리펩티드 전구체의 길이는 188개의 아미노산이다 (도 12; 서열 12). 도 12에 나타낸 전장 PRO1760 단백질의 예상 분자량은 약 21,042 달톤이며, 추정된 pI는 약 5.36이다.
도 12 (서열 12)에 나타낸 전장 PRO1760 서열의 분석은 도 12에 나타낸 바와 같이 다양한 중요 폴리펩티드 도메인의 존재를 입증하는데, 상기 중요 폴리펩티드 도메인의 위치는 상기와 같이 대략적으로 나타나있다. 전장 PRO1760 서열의 분석은 신호 펩티드의 아미노산 위치가 약 1 내지 약 20이고; N-글리코실화 부위의 아미노산 위치가 약 121 내지 약 125, 및 약 171 내지 175이고; 티로신 키나제 인산화 부위의 아미노산 위치가 약 25 내지 약 32이고; N-미리스토일화 부위의 아미노산 위치가 약 54 내지 약 60, 및 약 160 내지 166임을 입증한다. 클론 DNA76532-1702는 1998년 11월 17일자로 ATCC에 기탁하였고, ATCC 203473의 기탁 번호를 부여받았다.
도 12 (서열 12)에 나타낸 전장 서열의 WU-BLAST2 서열 정렬 분석을 이용하여 데이호프 데이타베이스 (버젼 35.45 스위스프롯 35)를 분석한 결과는 PRO1760 아미노산 서열과 하기 데이호프 서열 사이에 서열 동일성이 있음을 입증한다: CELT07F12-2, T22J18-16, ATF1C12_3, APE3_YEAST, P_W22471, SAU56908_1, SCPA_STRPY, ATACOO423817, SAPURCLUS_2 및 AF041468_9.
실시예 10: 신생아 심비대증의 자극 (검정 1)
이 검정법은 신생아의 심비대증을 자극하는 PRO 폴리펩티드의 능력을 측정하기 위해 고안된 것이다. 1일된 할란 스프라그 돌리 래트 (Harlan Sprague Dawley rat)로부터 심근세포를 수득하였다. 1일째에 세포(7.5×104/ml의 밀도, 180㎕, 혈청<0.1%, 새로이 단리됨)를 DMEM/F12+4% FCS로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 1일째, 시험 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플 또는 증식 배지만을 함유하는 시험 샘플 (음성 대조구) (20 ㎕/웰)을 상기 웰에 직접 첨가하였다. 그 다음으로, 2일째 날에 PGF (20 ㎕/웰)를 10-6 M의 최종 농도까지 첨가하였다. 그 다음으로, 4일째 날에 상기 세포를 염색하고 5일째 날에 가시적으로 관찰하여 기록하였는데, 여기서 (음성 대조구와 비교할 때) 크기가 증가되지 않은 세포는 0.0으로 기록하고, (음성 대조구와 비교할 때) 크기의 증가가 작거나 중간정도인 세포는 1.0으로 기록하였고, (음성 대조구와 비교할 때) 크기의 증가가 큰 세포는 2.0으로 기록하였다. 이 검정법에 있어서의 양성 결과는 1.0 이상이다.
PRO882는 하기 표 4에 나타낸 바와 같이 이 검정법에서 양성이었다.
<표 4>
PRO번호 농도/희석 크기에 있어서의 상대적인 증가 (음성 대조구와 비교한 경우)
PRO882 0.01% 3
PRO882 0.01% 3
PRO882 0.10% 4
PRO882 0.10% 4
PRO882 1.00% 6
PRO882 1.00% 6
PRO882 0.01% 3
PRO882 0.10% 4.5
PRO882 1.00% 6
PRO882 1.00% 5.5
PRO882 2.6 nM 5.75
실시예 11: 혈관 내피세포 증식 인자( VEGF)에 의해 자극된 내피세포 증식의 억제 (검정 9)
VEGF에 의해 자극된 내피세포의 증식을 억제하는 다양한 PRO 폴리펩티드의 능력을 시험하였다. 내피세포 증식의 억제 효과가 유익한 경우, 즉 종양 증식을 억제할 경우, 이 검정법에서 양성으로 확인된 폴리펩티드는 포유동물의 내피세포 증식을 억제하는 데 유용하다.
구체적으로, 소의 부신 피질 모세혈관 내피세포 (ACE) (1차 배양으로부터 최대 12-14회 패시지를 거친 세포)를 100 ㎕ 당 500 세포/웰로 96-웰 플레이트에 플레이팅하였다. 검정용 배지에는 포도당 농도가 낮은 DMEM, 10% 소혈청, 2mM 글루타민 및 1X 페니실린/스트렙토마이신/펀지존이 포함되어 있다. 대조구 웰로는 (1) ACE 세포를 첨가하지 않은 것, (2) ACE 세포만 있는 것, (3) ACE 세포 + 5 ng/ml FGF, (4) ACE 세포 + 3 ng/ml VEGF, (5) ACE 세포 + 3 ng/ml VEGF + 1 ng/ml TGF-베타, 및 (6) ACE 세포 + 3 ng/ml VEGF + 5 ng/ml LIF가 있다. 폴리-His로 표지된 PRO 폴리펩티드 시험 샘플 (100㎕ 부피)을 상기 웰에 첨가하였다 (각각 1%, 0.1% 및 0.01%로 희석된 것). 세포 배양액을 37℃ 및 5% CO2에서 6 내지 7일 동안 배양하였다. 배양 후, 웰로부터 배지를 제거하고, 세포를 1X PBS로 세척하였다. 이어서, 산 포스파타제 반응 혼합물 (100㎕: 0.1M 아세트산나트륨, pH 5.5, 0.1% 트리톤 X-100, 10mM p-니트로페닐 포스페이트)을 각 웰에 첨가하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 1N NaOH 10㎕를 첨가하여 반응을 멈추게 하였다. 405nm의 마이크로플레이트 판독기에서 광학 밀도(OD)를 측정하였다.
PRO 폴리펩티드의 활성은 자극되지 않은 세포에 대한, VEGF (3 ng/ml)에 의 해 자극된 증식 (OD 405nm에서 산 포스파타제 활성을 측정하여 산출함)의 억제율로서 계산하였다. TGF-베타는 VEGF에 의해 자극된 ACE 세포 증식을 70 내지 90% 억제하기 때문에, 1 ng/ml에서 측정된 활성 기준으로서 TGF-베타를 사용하였다. 하기 표 5에 나타낸 바와 같은 결과는 암 치료시 및, 구체적으로는, 종양의 혈관신생 억제시 PRO 폴리펩티드가 유용하다는 것을 암시한다. 표 5에 기재된 숫자 값 (상대적 억제율)은 자극받지 않은 세포에 대한, VEGF에 의해 자극된 증식의 억제율을 계산하고, 상기 억제율을 VEGF에 의해 자극된 ACE 세포 증식을 70 내지 90% 억제하는 것으로 알려진 TGF-β (1 ng/ml)로 얻은 억제율로 나누어 산출한 값이다. PRO 폴리펩티드가 VEGF에 의해 자극된 내피세포 증식을 30% 이상 억제시키면 (상대적인 억제율 30% 이상), 양성 결과로 간주한다.
<표 5>
VEGF에 의해 자극된 내피세포 증식의 억제
PRO 명칭 PRO 농도 상대적인 억제율(%)
PRO333 PRO333 PRO333 0.01% 0.10% 1.00% 97.0 90.0 63.0
PRO877 PRO877 PRO877 PRO877 PRO877 PRO877 0.01% 0.01% 0.10% 0.10% 1.00% 1.00% 101.0 108.0 86.0 99.0 46.0 46.0
PRO879 PRO879 PRO879 0.01% 0.01% 0.10% 100.0 105.0 97.0
PRO879 PRO879 PRO879 0.10% 1.00% 1.00% 101.0 55.0 66.0
PRO882 PRO882 PRO882 0.01% 0.10% 1.00% 96.0 86.0 70.0
PRO885 PRO885 PRO885 0.01% 0.10% 1.00% 100.0 93.0 64.0
실시예 12: 내피세포에 있어서의 c-fos 유도 (검정 34)
이 검정법은 PRO 폴리펩티드가 내피세포의 c-fos를 유도하는 능력이 있는지를 측정하기 위해 고안된 것이다. 이 검정에서 양성으로 확인된 PRO 폴리펩티드는 예를 들어, 창상 치유 등을 비롯한 혈관신생이 유리한 증상 또는 질환의 치료에 유용할 것으로 기대된다 (이들 PRO 폴리펩티드의 아고니스트도 마찬가지임). 이 검정에서 양성으로 확인된 PRO 폴리펩티드의 길항제는 악성 종양의 치료에 유용할 것으로 기대된다.
증식 배지 (GHT가 없는 50% Ham's F12: 낮은 농도의 포도당, 및 글리신이 없는 50% DMEM: NaHCO3, 1% 글루타민, 10mM HEPES, 10% PBS, 10 ng/ml bFGF를 포함함) 중의 인간의 탯줄 정맥 내피세포 (HUVEC, Cell Systems)를 1×104의 세포 밀도로 96-웰 마이크로타이터 플레이트에 플레이팅하였다. 플레이팅한 다음날, 증식 배지를 제거함으로써 세포에게 영양분을 공급하지 않고, 세포를 웰 당 100㎕의 시험 샘플 및 대조구 (양성 대조구: 증식 배지; 음성 대조구: 10mM HEPES, 140mM NaCl, 4%(w/v) 만니톨, pH 6.8)로 처리하였다. 이 세포를 37℃, 5% CO2 하에서 30분 동안 배양하였다. 샘플을 제거하고, 하기 기재된 시약/완충액을 입수할 수 있는 bDNA 키트의 프로토콜 (Chiron Diagnostics, 카탈로그 번호 6005-037)의 1부에 기재된 방법을 수행하였다.
간략히 설명하면, 시험에 필요한 TM 용해 완충액 및 프로브의 양을 제조자에 의해 제공되는 정보를 기초로 계산하였다. 적당한 양의 해동된 프로브를 TM 용해 완충액에 첨가하였다. 캡쳐 혼성화 완충액 (Capture Hybridization Buffer)을 실온까지 가온하였다. bDNA 스트립을 금속 스트립 홀더에 설치하고, 100㎕의 캡쳐 혼성화 완충액을 필요한 각 b-DNA 웰에 첨가한 후 30분 이상 동안 인큐베이션하였다. 세포를 함유하는 시험 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸 후, 진공 매니폴드를 사용하여 배지를 서서히 제거하였다. 프로브가 함유된 100㎕의 용해 혼성화 완충액을 피펫으로 마이크로타이터 플레이트의 각 웰에 빠르게 첨가하였다. 이어서, 플레이트를 55℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 마이크로타이터 어댑터 헤드가 장착된 볼텍스 혼합기 위에 놓고, #2로 설정한 상태에서 1분 동안 볼텍싱하였다. 80㎕의 용해물을 분취하여 캡쳐 혼성화 완충액을 함유하는 bDNA 웰에 첨가한 후, 피펫을 사용하여 위와 아래를 잘 혼합하였다. 이 플레이트를 53℃에서 16시간 이상 동안 인큐베이션하였다.
그 다음날, bDNA 키트 프로토콜의 2부에 기재된 방법을 수행하였다. 구체적으로, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼내 벤치 위에 놓고 10분 동안 냉각시켰다. 필요한 첨가물의 부피는 제조자에 의해 제공되는 정보를 기초로 계산하였다. 증폭 농축물을 AL 혼성화 완충액으로 1:100 희석하여 증폭 워킹 용액 (Amplifier Working Solution)을 제조하였다. 혼성화 혼합물을 상기 플레이트로부터 제거하고 워시 (Wash) A로 2회 세척하였다. 50㎕의 증폭 워킹 용액을 각 웰에 첨가하고, 각 웰을 53℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 플레이트를 인큐베이터에서 꺼낸 후, 10분 동안 냉각시켰다. 표지 농축물 (40 pmole/마리)을 AL 혼성화 완충액으로 1:100 희석하여 표지 프로브 워킹 용액 (Label Probe Working Solution)을 제조하였다. 10분간 냉각시킨 후, 증폭 혼성화 혼합물을 제거하고, 이 플레이트를 워시 A로 2회 세척하였다. 50㎕의 표지 프로브 워킹 용액을 각 웰에 첨가하고, 각 웰을 53℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 10분 동안 냉각시킨 후, 기질 (Substrate)을 실온까지 가온하였다. 3 ㎕의 기질 증진제 (Substrate Enhancer)를 검정에 필요한 각 기질 1 ml에 첨가하고, 플레이트를 10분 동안 냉각시킨 후, 표지 혼성화 혼합물을 제거하고, 이 플레이트를 워시 A로 2회, 그리고 워시 D로 3회 세척하였다. 증진제가 포함된 50㎕의 기질 용액을 각 웰에 첨가하였다. 이 플레이트를 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하고, 적당한 조도계 (Luminometer)에서 RLU를 판독하였다.
2회 측정하여 평균을 내고, 편차 상수를 결정하였다. 음성 대조구 (상기 기재된 바와 같은 HEPES 완충액)의 값보다 증가된 것으로 측정된 활성은 화학발광 단위 (RLU)로 나타내었다. 그 결과는 하기 표 6에 기재하였고, PRO 폴리펩티드가 음성 대조구보다 2배 이상의 값을 나타낸다면 양성으로 간주하였다. 음성 대조구 = 1.00% 희석시 1.00 RLU, 양성 대조구 = 1.00% 희석시 8.39 RLU.
<표 6>
내피세포의 c-fos 유도
PRO 명칭 PRO 농도 RLU 값
PRO321 PRO321 PRO321 PRO321 PRO321 PRO321 0.011 nM 0.11 nM 1.1 nM 0.011 nM 0.11 nM 1.10 nM 1.51 1.07 2.11 2.13 2.27 2.65
PRO840 PRO840 PRO840 PRO840 PRO840 PRO840 2.44 nM 24.4 nM 244 nM 2.44 nM 24.4 nM 244 nM 1.85 2.21 3.04 2.82 2.90 1.01
PRO878 PRO878 PRO878 PRO878 PRO878 PRO878 0.0.1% 0.10% 1.00% 0.01% 0.10% 1.00% 2.43 2.71 1.39 2.48 2.45 1.89
PRO879 PRO879 PRO879 PRO879 PRO879 PRO879 0.01% 0.10% 1.00% 0.01% 0.10% 1.00% 1.23 1.33 2.54 2.06 1.65 2.25
실시예 13: F2a에 의해 유도된 신생아의 심비대증의 악화
이 검정법은 신생아의 심비대증을 자극하는 PRO 폴리펩티드의 능력을 측정하기 위해 고안된 것이다. 이 검정에서 양성으로 확인된 PRO 폴리펩티드는 다양한 심부전 질환의 치료에 유용할 것으로 기대된다.
1일된 할란 스프라그 돌리 래트 (Harlan Sprague Dawley rat)로부터 심근세포를 수득하였다. 1일째에 세포(7.5×104/ml의 밀도, 180㎕, 혈청<0.1%, 새로이 단리됨)를 DMEM/F12+4% FCS로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 1일째, 시험 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플 (20 ㎕/웰)을 상기 웰에 직접 첨가하였다. 그 다음으로, 2일째 날에 PGF (20 ㎕/웰)를 10-6 M의 최종 농도까지 첨가하였 다. 그 다음으로, 4일째 날에 상기 세포를 염색하고 5일째 날에 가시적으로 관찰하여 기록하였다. 가시적인 스코어는 세포 크기를 기초로 한 것인데, 여기서 음성 대조구와 비교할 때 크기가 증가되지 않은 세포는 0.0으로 기록하고, 음성 대조구와 비교할 때 크기의 증가가 작거나 중간정도인 세포는 1.0으로 기록하였고, 음성 대조구와 비교할 때 크기의 증가가 큰 세포는 2.0으로 기록하였다. 1.0 이상의 스코어는 양성으로 간주하였다.
칼슘 농도가 검정 반응에 결정적이기 때문에 PBS를 포함시키지 않았다. 플레이트를 DMEM/F12 + 4% FCS (200 ㎕/웰)로 코팅하였다. 검정 배지에는 DMEM/F12 (2.44 mg의 중탄산염이 포함되어 있음), 10 ㎍/ml의 트랜스페린, 1 ㎍/ml의 인슐린, 1 ㎍/ml의 아프로티닌, 2 mmol/L의 글루타민, 100 U/ml의 페니실린 G, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신이 포함되어 있다. 만니톨 (4%)을 함유하는 단백질 완충액은 1/10 (0.4%) 및 1/100 (0.04%)에서 양성 신호 (스코어 3.5)를 나타내었으나, 1/1000 (0.004%)에서는 나타내지 않았다. 그러므로, 만니톨을 함유하는 시험 샘플 완충액은 시험하지 않았다. PRO205, PRO882 및 PRO887 폴리펩티드가 이 검정에서 양성이었다.
실시예 14: 성인 심비대증의 억제 (검정 42)
이 검정은 성인 심비대증의 억제를 측정하기 위해 고안되었다. 이 검정에서 양성으로 확인된 PRO 폴리펩티드는 심비대증과 관련된 심장 질환의 치료에 유용할 수 있다.
심실 근세포를 성숙 할란 스프라그 돌리 래트 (250 g)로부터 새롭게 단리하 고, 이 세포 180 ㎕를 플레이팅하였다 (2000/웰). 2일째 날에, 시험 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플 (20 ㎕)을 첨가하였다. 5일째, 상기 세포를 고정한 후 염색하였다. 세포의 ANP 메세지 증가를 수시간 후 PCR로 측정할 수도 있다. 결과는 세포 크기의 가시적 스코어를 기초로 한 것이다: 0 = 억제 없음, -1 = 약간 억제함, -2 = 강하게 억제함. 0 이하의 스코어를 양상으로 간주한다. 활성 기준은 양성 대조구인 0.1 mM의 페닐레프린 (PE)의 활성에 상응한다. 검정 배지에는 M199 (변형된 것-글루타민 없음), NaHCO3, 페놀 레드, 100 nM 인슐린으로 보충됨, 0.2%의 BSA, 5 mM 크레아틴, 2 mM L-카르니틴, 5 mM 타우린, 100 U/ml의 페니실린 G, 100 ㎍/ml의 스트렙토마이신 (CCT 배지)이 포함되어 있다. 96 웰 플레이트에서 60개의 내부 웰만을 사용하였다. 이들 중 6개의 웰을 음성 및 양성 (PE) 대조구로 사용하였다.
PRO878 폴리펩티드는 상기 검정에서 0 미만의 스코어를 나타내었다.
실시예 15: 내피세포 아폽토시스의 유도 (검정 73)
내피세포의 아폽토시스를 유도하는 PRO 폴리펩티드의 능역을 인간 탯줄 정맥 내피세포 (HUVEC, Cell Systems)에서 시험하였다. 이 검정에서 양성은 내피세포의 아폽토시스의 유도가 유리한 혈관 질환 뿐만 아니라 종양을 치료하는 데 있어서 폴리펩티드의 유용함을 나타낸다.
100 ng/ml의 VEGF로 보충된 0% 혈청 배지가 든 96-웰 포맷을 사용하여 내피세포의 아폽토시스를 유도하는 PRO 폴리펩티드의 능력을 인간 탯줄 정맥 내피세포 (HUVEC, Cell Systems)에서 시험하였다 (HUVEC 세포는 플레이팅 표면으로부터 쉽게 떨어지기 때문에 웰에서 하는 모든 피펫팅은 가능한 약하게 해애 함).
배지를 흡입하여 제거하고 세포를 PBS로 1회 세척하였다. 1 x 트립신 5 ml를 T-175 플라스크내의 상기 세포에 첨가하고, 이들 세포가 플레이트로부터 떨어질 때까지 (약 5-10분) 세포를 방치한다. 5 ml의 증식 배지를 첨가하여 트립신 작용을 중지시켰다. 이 세포를 4℃, 1000 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 배지를 제거하고, 세포를 10% 혈청이 든 배지 10 ml (Cell System, 1 x 페니실린/스트렙토마이신을 함유함)에 재현탁시켰다.
세포를 총 부피가 100 ㎕ (밀도 2 x 104 세포/웰)가 되도록 10% 혈청 (CSG-배지, Cell System)이 함유된 96-웰 마이크로타이터 플레이트 (Amersham Life Science, cytostar-T Scintillating microplate, RPNG160, 멸균되고, 조직 배양 처리되고, 개별적으로 포장됨) 상에 플레이팅하였다. 시험 폴리펩티드 샘플 각각을 한 샘플당 1%, 0.33% 및 0.11%로 3번 희석하여 첨가하였다. 세포가 없는 웰을 블랭크로 사용하고, 세포만을 함유하는 웰을 음성 대조구로 사용하였다. 50 ㎕의 3 x 스타우로스포린 원액을 1:3으로 연속 희석하여 양성 대조구로 사용하였다. 아폽토시스를 유도하는 시험 PRO 폴리펩티드의 능력은 아폽토시스를 검출하는 칼슘 및 인지질 결합 단백질의 구성원인 아넥신-V를 사용하여 측정하였다.
0.2 ml의 아넥신 V - 바이오틴 원액 용액 (100 ㎍/ml)을 4.6 ml의 2 x Ca2+ 결합 완충액 및 2.5% BSA (1 : 25로 희석된 것)로 희석하였다. 희석된 아넥신 V - 바이오틴 용액 50 ㎕를 최종 농도가 1.0 ㎍/ml가 되도록 각 웰에 첨가하였다 (대조구는 제외시킴). 이 샘플을 아넥신-바이오틴과 함께 10 내지 15분 동안 인큐베이션한 후, 35S-스트렙타비딘을 직접 첨가하였다. 35S-스트렙타비딘을 2 x Ca2+ 결합 완충액 및 2.5% BSA로 희석하고, 최종 농도가 3 x 104 cpm/웰이 되도록 모든 웰에 첨가하였다. 그 다음으로, 상기 플레이트를 봉합하고, 1000 rpm에서 15분 동안 원심분리하고, 2시간 동안 궤도 진탕기 상에 놓았다. 1450 마이크로베타 트릴룩스 (Microbeta Trilux, Wallac) 상에서 분석하였다. 결과를 표 7에 나타내었는데, 여기서 배경률은 음성 대조구의 분당 카운트 양 (%)을 나타낸다. 배경률보다 30% 이상 높은 것은 양성으로 간주하였다.
PRO333, PRO364 및 PRO879는 상기 기재된 검정에서 양성 결과를 나타내엇다.
<표 7>
내피세포 아폽토시스의 유도
PRO 명칭 PRO 농도 배경률
PRO333 0.11% 61.7%
PRO333 0.33% 37.6%
PRO364 2.99 nM 19.3%
PRO364 8.99 nM 6.9%
PRO364 27.23 nM 31.5%
PRO879 1.00% 64.2%
PRO879 0.11% 65.5%
PRO879 0.33% 14.7%
실시예 16: LIF + 엔도텔린-1 (ET-1)에 의해 유도된 신생아 심비대증의 억제 (검정 74)
이 검정은 본 발명의 PRO 폴리펩티드가 LIF 및 엔도텔린-1 (ET-1)에 의해 유도된 신생아 심비대증을 억제하는 능력을 나타내는지를 알아보기 위한 것이다. 본 검정에서 양성 반응을 보이는 시험 화합물은 원하지 않는 심근비대증을 특징으로 하거나 상기 심근비대증과 관련된 심부전 질환 및 장애의 치료에 유용할 것이다.
1일 된 할란 스프라그 돌리 래트의 심근세포 (7.5 x 104/ml 농도의 180 ㎕, 혈청 < 0.1, 새로 단리함)를 1일째에 DMEM/F12 + 4% FCS으로 미리 코팅된 96-웰 플레이트에 첨가하였다. 그 다음으로, 2일째 된 날에 20 ㎕ 부피의 시험 PRO 폴리펩티드 샘플 또는 증식 배지만 (음성 대조구)을 상기 웰에 직접 첨가하였다. 이어서, 3일째 날에 LIF + ET-1을 상기 웰에 첨가하였다. 세포를 2일 동안 배양한 후 염색하고, 이어서 그 다음날에 가시적으로 스코어를 기록하였다. 이 검정에서 PRO 폴리펩티드로 처리된 근세포가 비처리된 근세포보다 눈으로 관찰시 평균적으로 더 작거나 그 수가 더 적으면 양성으로 기록하였다. PRO238 및 PRO1760 폴리펩티드가 이 검정에서 양성 반응을 나타내었다.
실시예 17: 내피관 형성 - 스프라우트 (Sprout) 형성의 자극 (검정 86)
이 검정은 PRO 폴리펩티드가 외인성 증식 인자의 부재하에 내피세포의 액포 및 루멘 형성을 촉진하는 능력을 보이는지를 알아보기 위한 것이다. 이 검정에서 양성 반응을 보이는 PRO 폴리펩티드는 예컨대, 세포흡수작용 (pinocytosis), 이온 펌핑, 관 투과성 및(또는) 연접 (Junction) 형성의 자극이 유리한 경우를 비롯하여 내피세포의 액포 및(또는) 루멘 형성이 유리한 질환의 치료에 유용할 것으로 기대된다.
HUVEC 세포 (패시지 < 일차 배양으로부터 8차 배양)를 ml당 6 x 105 세포 밀 도로 타입 I 래트 꼬리 콜라겐과 혼합하고 (최종 농도 2.6 mg/ml), PRO 폴리펩티드의 존재하에 세포가 형성되는 동안에 액포를 염색하기 위해, 1 μM의 6-FAM-FITC 염료 및 1% FBS가 함유된 M199 배양 배지를 웰당 50 ㎕씩 플레이팅하였다. 그 다음으로, 이 세포를 37℃, 5% CO2에서 48시간 동안 인큐베이션하고, 실온에서 3.7%의 포르말린으로 10분 동안 고정시키고, M199 배지로 5회 세척한 후, 4℃에서 밤새동안 Rh-팔로이딘으로 염색하고, 이어서 4 μM의 DAPI로 핵을 염색하였다. 이 검정에서 양성 결과는 2 이하이다 [1 = 세포가 모두 원형, 2 = 세포가 길어짐, 3= 세포가 일부 연결된 튜브를 형성함, 4 = 세포가 복합 관상 네트워크를 형성함].
이 검정에서 PRO179 폴리펩티드가 양성 반응을 보였다.
실시예 18: 내피세포 아폽토시스의 유도 (ELISA) (검정 109)
96-웰 포맷을 사용하여, 100 ng/ml의 VEGF, 0.1% BSA, 1X 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 0% 혈청 배지 중의 인간 탯줄 정맥 내피세포 (HUVEC, Cell Systems)에서 PRO 폴리펩티드가 내피세포의 아폽토시스를 유도하는 능력을 시험하였다. 이 검정에 있어서의 양성 결과는 폴리펩티드가 예를 들어, 종양 증식의 억제를 비롯하여 원하지 않는 내피세포 증식과 관련된 다양한 임의의 증상을 치료하는 데 유용하다는 것을 나타낸다. 사용된 96-웰 플레이트는 팔콘사 (Falcon, No.3072)에서 제조하였다. 96-웰 플레이트의 코팅은 PBS 용액 중의 0.2% 젤라틴 100 ㎕로 30분이 넘게 젤라틴화가 일어나도록 함으로써 제조하였다. 젤라틴 혼합물을 흡입 제거한 후, 최종 농도가 2×104세포/ml가 되도록 HUVE 세포(웰당 100㎕ 부피)를 10% 혈청 함유 배지에 플레이팅하였다. 세포를 24시간 동안 배양한 후, 원하는 PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플을 첨가하였다.
100 ng/ml의 VEGF, 0.1% BSA, 1X 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 0% 혈청 배지 (Cell Systems) 100㎕를 모든 웰에 첨가하였다. PRO 폴리펩티드를 함유하는 시험 샘플을 3개의 희석액 (1%, 0.33% 및 0.11%)에 첨가하였다. 세포가 없는 웰을 블랭크로 사용하고, 세포만 있는 웰을 음성 대조구로 사용하였다. 양성 대조구로서 스타우로스포린 3 X 원액 50 ㎕의 1:3 연속 희석액을 사용하였다. 세포를 24 내지 35시간 동안 배양한 후 ELISA를 수행하였다.
베링거 매뉴얼 [Boehringer, 세포 사멸 검출 ELISA 플러스, 카탈로그 번호 1 920 685]에 따라 용액을 제조하여 아폽토시스의 정도를 측정하기 위해 ELISA를 이용하였다. 샘플 제조 : 96 웰 플레이트를 1000 rpm (200g)으로 10분 동안 원심분리하고, 신속히 거꾸로 뒤집어 상등액을 제거한 후, 종이 타올 위에 플레이트를 거꾸로 뒤집은 상태로 방치하여 나머지 상등액을 제가하였다. 200 ㎕의 1X 용해 완충액을 각각의 웰에 첨가하고, 진탕시키지 않으면서 실온에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 플레이트를 1000 rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 20 ㎕의 용해액 (세포질 분획)을 스트렙타비딘으로 코팅된 MTP로 옮겼다. 80 ㎕의 면역시약 혼합물을 각 웰내의 20 ㎕ 용해액에 첨가하였다. 상기 MTP를 접착성 호일로 덮은 후, 궤도 진탕기 (200 rpm) 위에 놓고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 2시간 후, 흡입하여 상층액을 제거하고, 각 웰당 250 ㎕의 1X 인큐베이션 완충액을 사용하여 웰을 3회 세척하였다 (상기 완충액은 흡입에 의해 제거됨). 기질 용액 (100 ㎕)을 각 웰에 첨가하고, 발색이 분광 분석에 충분할 때까지 (대략 10 내지 20분 후) 250 rpm, 실온의 궤도 진탕기에서 인큐베이션하였다. 96 웰 판독기를 사용하여 492 nm를 기준 파장으로 405 nm에서 판독하였다. PIN32 (대조구 완충액)에 대해 얻어진 값을 100%로 설정하였다. 130%를 초과하는 샘플을 아폽토시스 유도에 대한 양성 반응으로 간주하였다. 이 검정에서 PRO846 및 PRO844 폴리펩티드가 양성으로 나타났다.
실시예 19: 제자리 혼성화 ( In situ Hybridization)
제자리 혼성화는 세포 및 조직 표본 내의 핵산 서열을 검출하고 위치를 파악하게 하는 강력한 다용도 기술이다. 예를 들어, 유전자 발현 부위의 확인, 전사체의 조직 분포 분석, 바이러스 감염의 확인 및 감염 위치의 파악, 특정 mRNA 합성에 있어서의 변화, 및 염색체 맴핑의 보조에 유용할 수 있다.
PCR로 얻은 33P-표지된 리보프로브를 사용하여 문헌 (Lu and Gillett, Cell Vision 1:169-176 (1994))의 프로토콜의 최적화된 버전에 따라 제자리 혼성화를 수행하였다. 요컨대, 포르말린에 의해 고정되어 파라핀에 파묻힌 인간 조직을 절단하고, 파라핀을 제거한 후, 37℃에서 15분 동안 단백질 분해효소 K (20 g/ml)로 단백질을 제거하고, 제자리 혼성화를 위해 상기 문헌 (Lu and Gillett)에 기재된 바와 같이 더 처리하였다. PCR 산물로부터 [33P]-UTP로 표지된 안티센스 리보프로브를 얻고 55℃에서 밤새 혼성화하였다. 상기 슬라이드를 코닥 (Kodak) NTB2 (상표명) 핵 트랙 에멀젼 (nuclear track emulsion)에 담그고 4주 동안 노출시켰다.
<33P-리보프로브 합성>
33P-UTP (Amersham BF 1002, SA < 2000 Ci/mmol) 6.0 ㎕ (125 mCi)를 고속 진공기 (speed vacuum)하에서 건조시켰다. 하기 성분을 건조된 33P-UTP가 포함된 각 튜브에 첨가하였다:
2.0㎕ 5x 전사 완충액
1.0㎕ DTT (100mM)
2.0㎕ NTP 혼합물 (2.5mM: 각각 10mM인 GTP, CTP 및 ATP 10㎕ + 10㎕ H2O)
1.0㎕ UTP (50μM)
1.0㎕ RNAsin
1.0㎕ DNA 주형 (l㎍)
1.0㎕ H20
1.0㎕ RNA 중합효소 (PCR 산물의 경우에는 통상 T3 = AS, T7 = S)
상기 튜브를 37℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 총 1.0㎕의 RQ1 DNase를 첨가한 후, 37℃에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 총 90㎕의 TE (10mM Tris(pH 7.6) 및 lmM EDTA(pH 8.0))를 첨가하고, 상기 혼합물을 피펫으로 DE81 페이퍼 위에 떨어뜨렸다. 나머지 용액을 마이크로콘 (Microcon)-50 (상표명) 한외여과 유닛에 로딩하고, 프로그램 10을 사용하여 6분 동안 회전시켰다. 이 여과 유닛을 제2 튜브 위에 거꾸로 올려놓고, 프로그램 2를 사용하여 3분 동안 회전시켰다. 최종적으로 회수 회전시키기 전, 총 100㎕의 TE를 첨가하고, 이어서 최종 생성물 1㎕를 피펫으로 DE81 페이퍼 상에 떨어뜨리고, 6ml의 바이오플라워(Bioflour) Ⅱ로 계수하였다.
프로브를 TBE/우레아 겔 상에서 전기영동하였다. 1 내지 3㎕의 프로브 또는 5㎕의 RNA Mrk Ⅲ를 3㎕의 로딩 완충액에 첨가하였다. 95℃ 가열 블록 (heat block)에서 3분 동안 가열한 후, 즉시 겔을 얼음 위에 놓았다. 겔의 웰을 세척한 후, 샘플을 로딩하고 180 내지 250 볼트에서 45분 동안 전기영동하였다. 겔을 사란 (SARAN (상표명) 브랜드) 랩으로 싸고, 이를 -70℃ 냉동고에서 1시간 내지 밤새 동안 신호 증강 스크린 (intensifying screen) 상에서 XAR 필름에 노출시켰다.
<33 P-혼성화>
A. 동결된 절편의 예비처리
냉동고로부터 슬라이드를 꺼내 알루미늄 트레이 위에 놓고 실온에서 5분 동안 해동시켰다. 축합을 감소시키기 위해, 상기 트레이를 55℃, 인큐베이터에 5분 동안 놓아 두었다. 슬라이드를 발연 후드 (fume hood)에서 얼음 상 4% 파라포름알데히드로 10분 동안 고정시키고, 실온에서 0.5 x SSC (25ml 20 x SSC + 975ml SQ H2O)로 5분 동안 세척하였다. 단백질을 37℃에서 10분 동안 단백질 분해효소 K 0.5 ㎍/ml로 제거한 후 (예열된, RNase가 없는 RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml 원액 12.5㎕), 상기 절편을 실온에서 10분 동안 0.5x SSC로 세척하였다. 이 단편을 70%, 95%, 100% 에탄올에서 각각 2분 동안 탈수하였다.
B. 파라핀에 묻힌 절편의 예비처리
상기 슬라이드로부터 파라핀을 제거하고, SQ H2O에 놓아 두고 실온에서 2 x SSC로 각각 5분씩 2회 세척하였다. 인간 배아 (embryo) 조직의 경우에는 단백질 분해효소 K (RNase가 없는 RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml 용액 500㎕, 37℃, 15분) 20㎕/ml를 사용하여 절편으로부터 단백질을 제거하고, 포르말린 조직의 경우에는 8x 단백질 분해효소 K (RNase 완충액 250ml 중의 100㎕, 37℃, 30분)를 사용하여 절편으로부터 단백질을 제거하였다. 그 후, 상기 기재된 바와 같이 0.5 x SSC로 세척하고 단백질을 제거하였다.
C. 예비혼성화
상기 슬라이드를 박스 (Box) 완충액 (4 x SSC, 50% 포름아미드)으로 포화된 여과지에 의해 구획이 나누어진 플라스틱 상자에 놓았다. 50㎕의 혼성화 완충액 (덱스트란 술페이트 3.75g + SQ H2O 6ml)을 조직 위에 떨어뜨리고 볼텍싱 후, 뚜껑을 느슨하게 한 상태로 2분 동안 마이크로웨이브 오븐에서 가열하였다. 얼음 위에서 냉각시킨 후, 포름아미드 18.75ml, 20x SSC 3.75ml 및 SQ H2O 9ml를 첨가하고 조직을 잘 볼텍싱한 후, 42℃에서 1 내지 4시간 동안 인큐베이션하였다.
D. 혼성화
슬라이드당 1.0 x 106cpm의 프로브 및 tRNA (50mg/ml 원액) 1.0㎕를 95℃에서 3분 동안 가열하였다. 상기 슬라이드를 얼음 위에서 냉각시키고, 슬라이드당 혼성화 완충액 48㎕를 첨가하였다. 볼텍싱한 후, 33P 혼합물 50㎕를 슬라이드 상 예비혼성화 시료 50㎕에 첨가하였다. 이 슬라이드를 55℃에서 밤새 인큐베이션하였다.
E. 세척
실온에서 2 x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척한 후 (20x SSC 400ml + 0.25M EDTA 16ml, 최종 부피=4L), 37℃에서 30분 동안 RNase A로 처리하였다 (RNase 완충액 250ml 중의 10mg/ml RNase 500㎕ = 20㎍/ml). 슬라이드를 실온에서 2x SSC, EDTA로 10분씩 2회 세척하였다. 엄격한 세척 조건은 하기와 같다: 55℃, 0.1x SSC 및 EDTA에서 2시간 (20x SSC 20ml + EDTA 16ml, 최종 부피 = 4L).
F. 올리고뉴클레오티드
본원에 개시된 DNA 서열 중 3개에 대해 제자리 분석을 수행하였다. 이러한 분석에 사용된 올리고뉴클레오티드는 하기와 같다:
(1) DNA47365-1206 (PRO364) (TNF 수용체 동족체)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAC CCG AGC ATG GCA CAG CAC-3' (서열 50)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCT CCC AGC CGC CCC TTC TC-3' (서열 51)
(2) DNA30868 (PRO205) (폴리스타틴 동족체)
p1: 5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AGA GAC AGG GCA AGC AGA ATG- 3' (서열 52)
p2: 5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GAA GGG GAT GAC TGG AGG AAC-3' (서열 53)
(3) DNA41374 (PRO333) (CD33 동족체)
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CTC CAC AGA ACC TCG CCA TCA-3' (서열 54)
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGG GGC AAG ACT CAC AAG CAG-3' (서열 55)
G. 결과
본원에 개시된 상기 3개의 DNA 서열에 대해 제자리 분석을 수행하였다. 이 분석으로부터 하기 결과를 얻었다.
(1) DNA47365-1206 (PRO364) (TNF 수용체 동족체)
태아의 척추체 근내막 앞면에서 발현되었다. 태아 망막에서도 발현되었다. 그러나, 태아의 신경세포에서 낮은 수준으로 발현되었다. 기타 모든 조직에서는 발현되지 않았다.
(2) DNA30868 (PRO205) (폴리스타틴 동족체)
태아 조직의 척수, 자율신경절, 장신경, 천추총, 말초 및 두개 신경에서 발현되었다. 기타 모든 태아 및 성인 조직에서는 발현되지 않았다.
검사한 태아 조직 (12-16주)은 태반, 탯줄, 간, 신장, 부신, 갑상선, 폐, 심장, 대혈관, 식도, 위, 소장, 비장, 흉선, 췌장, 뇌, 눈, 척수, 소체벽, 자궁 및 하지이다.
성인 조직은 간, 신장, 부신, 심근, 대동맥, 비장, 림프절, 췌장, 폐 및 피부이다.
(3) DNA41374(PRO333)(CD33 동족체)
이 분자는 면역자극성인 것으로 보인다 (T 림프구 공자극 검정 중 동일 방식으로 혼합된 림프구 반응에서 T 림프구 증식을 촉진함). 이 분자의 분포 패턴은 이 연구 초기에 이용가능한 조직을 비롯한 제한된 조직 스크리닝으로 조사하였다. 조사한 다수의 조직 중 흉선 T 림프구에서 약간 분산된 발현을 검출하였다 (비장 및 림프절은 조사하지 않음). 이 결과는 후속 제자리 혼성화 연구에서 확인되었다. 상기 제자리 혼성화 연구의 결과는 비인간 영장류 흉선, 및 T 림프구 특이적인 영역 중 인간 편도에서 유사하게 낮은 발현도를 나타내었다. 상기 제한된 분포 패턴은 항원 발현 세포 (수상세포 집단 등)와 같은 T 림프구와 밀접하게 관련되어 있는 T 림프구 또는 T 세포에 의한 발현을 암시한다. 림프구 염증이 상당한 염증 인간 조직 및 반응성 여포 형성의 존재하에, 상당수의 T 림프구가 함유된 영역에서 검출가능한 발현은 없었다.
이러한 분포 차이 (즉, 흉선 및 편도의 T 림프구 영역에서는 발현되지만, T 림프구의 염증이 있는 영역에서는 발현되지 않음)는 하기 가능성을 암시한다:
1. 흉선 및 편도의 림프절에는 존재하지만 염증 조직에는 존재하지 않는 T 림프구 하위 집단에서 선택된(제한된) 발현이 있다. 성숙되지 않은 비수임 T 림프구는 편도 및 흉선 둘다에 존재하나, 만성 염증 조직에서는 주요 집단이 아닐 가능 성이 있다.
2. T 림프구에 있어서의 발현이 T 림프구가 있는 조직에서 약하거나 상이하게 검출되는 것은 여러 가지 T 림프구 세포 집단 유형을 반영한다기 보다는 상기 조직 절편 중의 RNA 질을 반영하는 것이다.
3. 흉선 및 편도에 있어서의 발현은 림프구로부터의 발현이 아니라, 조사된 염증 폐 또는 장에 존재하지 않는, T 림프구와 밀접하게 관련되어 있는 특정 세포 집단으로부터의 발현이다. 상기 세포 집단일 가능성이 있는 한 가지 세포 집단으로는 수상세포 하위집단이 있다.
비인간 영장류에 있어서, 흉선 림프구에서 약한 분산 발현이 있었다.
후속 연구에서, 하기 결과가 보고되었다:
염증 폐 (만성 림프구성 폐렴 및 육아종성 폐렴): 대조구 센스 프로브에 비해 간질에서 약한 신호 내지 음성 신호가 관찰되었고, 정상 침팬지 흉선 (인간 흉선은 이용불가능함) 및 인간 편도에서 약한 발현이 있었다. 정상 침팬지 흉선 및 인간 편도 중, 소포주위 연변층을 비롯한 이러한 구조의 T 림프구 영역 및 가슴샘의존층 (paracortex)에서 주로 발현되었다.
염증성 장 질환 (8명의 환자 표본), 만성 염증 및 정상 폐 (6명의 환자 표본), 만성 경화증 신염 (1명의 환자 표본), 만성 및 급성 염증 및 경변 간 (10개의 표본 다중블록), 정상 및 건성 피부, 및 말초 림프절 (비반응성) 등의 인간 조직에서 검출가능한 발현이 있었다.
실시예 20: 혼성화 프로브로서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 용도
하기 방법에는 혼성화 프로브로서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 용도가 기재되어 있다.
전장 또는 성숙 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 코딩 서열을 포함하는 DNA (각각 도 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31과, 각각 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31로 각각 나타내어짐) 또는 그의 단편은 인간 조직 cDNA 라이브러리 또는 인간 조직 게놈 라이브러리에서 상동한 DNA (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 자연 발생 변이체를 코딩하는 DNA와 같은 것)를 스크리닝하기 위한 프로브로 사용한다.
상기 두 라이브러리 DNA 중 하나를 함유하는 필터는 엄격도가 높은 하기 조건하에서 혼성화시키고 세척한다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 유전자로부터 유도된 방사선표지된 프로브를 50% 포름아미드, 5x SSC, 0.1% SDS, 0.1% 소듐 피로술페이트, 50 mM 인산나트륨, pH 6.8, 2x 덴하츠 용액 (Denhard's solution) 및 10% 덱스트란 술페이트가 함유된 42℃, 용액에서 20시간동안 상기 필터에 혼성화시켰다.
그 다음으로, 당업계에 공지된 표준 기술을 사용하여 전장 천연 서열을 코딩하는 DNA와 원하는 서열 동일성을 보이는 DNA를 확인할 수 있다.
실시예 21: 대장균에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현
이 실시예는 대장균에서 재조합 발현시켜 글리코실화되지 않은 형태의 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 제조하는 것을 기술하고 있다.
먼저, 선별된 PCR 프라이머를 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 (각각 서열 1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29 및 31)을 코딩하는 DNA 서열을 증폭시켰다. 상기 프라이머는 선별된 발현 벡터에 있는 제한 효소 부위에 상응하는 제한 효소 부위를 포함해야 한다. 다양한 발현 벡터를 사용할 수 있다. 적당한 벡터의 예로는 앰피실린 및 테트라시클린 내성 유전자를 포함하는 pBR322 (대장균으로부터 유래됨; 문헌 (Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1997) 참조)가 있다. 상기 벡터는 제한 효소로 절단하고 탈인산화시켰다. 그 다음으로, PCR로 증폭시킨 서열을 상기 벡터와 결찰시켰다. 바람직하게는, 상기 벡터는 항생제 내성 유전자, trp 프로모터, 폴리-His 리더 (첫 6개 의 STII 코돈, 폴리-His 서열 및 엔테로키나제 절단 부위), PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 영역, 람다 전사 종결 신호 및 argU 유전자를 코딩하는 서열을 포함할 것이다.
그 후, 결찰 혼합물은 상기 샘브룩 등의 문헌 (Sambrook et al.,)에 기재된 방법을 사용하여 선별된 대장균 균주를 형질전환시키는 데 사용하였다. LB 플레이트 위에서 증식하는 대장균의 능력으로 형질전환체를 확인한 후, 항생제 내성 콜로니를 선별하였다. 플라스미드 DNA를 단리하고, 제한효소 분석 및 DNA 시퀀싱으로 확인하였다.
선별된 클론은 항생제가 함유된 LB 브로쓰와 같은 배양액에서 밤새 배양할 수 있다. 이어서, 밤새 배양한 배양물을 사용하여 대량 배양을 접종하였다. 그 다음으로, 발현 프로모터가 작동되고 있는 동안 세포를 원하는 광학 밀도까지 배양하였다.
몇 시간동안 세포를 배양한 후, 원심분리로 세포를 모았다. 원심분리에 의해 얻어진 세포 펠렛은 당업계에 공지된 다양한 물질을 사용하여 용해시킬 수 있고, 이어서 용해된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드는 이 폴리펩티드의 강한 결합을 허용하는 조건하에 금속-킬레이팅 컬럼을 사용하여 정제할 수 있다.
PRO238, PRO364 및 PRO1760은 상기 방법에 의해 폴리-His로 표지된 (tagged) 형태로 대장균에서 성공적으로 발현되었다.
실시예 22: 포유동물 세포에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현
이 실시예에는 포유동물 세포에서 재조합 발현시켜 글리코실화된 형태일 가능성이 있는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 제조하는 것이 기재되어 있다.
벡터, pRK5 (1989년 3월 15일 공개된 유럽 특허 제307, 247호 참조)를 발현 벡터로 사용하였다. 임의로, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 DNA는 상기 샘브룩 등의 문헌에 기재된 바와 같은 결찰 방법을 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 코딩하는 DNA의 삽입을 허용하는 선별된 제한효소로 pRK5와 결찰시켰다. 생성된 벡터를 pRK5-(PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 코딩하는 DNA)라고 불렀다.
한 실시양태에서, 선별된 숙주 세포는 293 세포이다. 인간 293 세포 (ATCC CCL 1573)는 소태아 혈청 및, 임의로 영양 성분 및(또는) 항생제가 함유된 DMEM과 같은 배지가 든 조직 배양 플레이트에서 전면배양시켰다. 약 10 ㎍의 pRK-5 DNA (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA)는 VA RNA 유전자 (Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982))를 코딩하는 DNA 1 ㎍과 혼합하고, 완충액 500 ㎕ (1 mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0.227 M CaCl2)에 용해시켰다. 500 ㎕의 용액 (50 mM HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4)을 상기 혼합물에 적가하고, 25℃에서 10분동안 침전물을 형성시켰다. 상기 침전물을 현탁시키고 상기 293 세포에 첨가한 후, 37℃에서 약 4시간동안 방치하였다. 배양 배지를 흡입 제거하고, PBS 중의 20% 글리세롤을 30초동안 첨가하였다. 그 다음으로, 이 293 세포를 혈청이 없는 배지로 세척하고, 새 배지를 첨가한 후, 상기 세포를 약 5일동안 인큐베이션하였다.
대략적으로 형질감염 24시간 후, 상기 배양 배지를 제거하고 배양 배지만으로 바꾸거나, 200 μCi/ml의 35S-시스테인 및 200 μCi/ml의 35S-메티오닌을 함유하는 배양 배지로 바꾸었다. 12시간동안 인큐베이션한 후, 적응용 배지를 모으고, 회전 필터 상에서 농축시키고, 15% SDS 겔에 로딩하였다. 처리된 겔을 건조하고 일정 기간동안 필름에 노출시켜 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 존재를 확인할 수 있었다. 형질감염된 세포를 함유하는 배양물을 더 인큐베이션시키고 (혈청이 없는 배지에서 인큐베이션시킴), 이 배지를 선별된 생물검정에서 시험하였다.
별법으로, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자는 문헌 (Somparyrac et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 12: 7575 (1981))에 기재된 덱스트란 술페이트 방법을 사용하여 293 세포에 일시적으로 도입시킬 수 있다. 293 세포를 회전 플라스크에서 최대 밀도까지 배양하고, 700 ㎍의 pRK5 (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA)를 첨가하였다. 원심분리하여 상기 회전 플라스크로부터 세포를 먼저 농축시키고 PBS로 세척하였다. DNA-덱스트란 침전물을 몇 시간동안 세포 펠렛 상에서 인큐베이션하였다. 세포를 20% 글리세롤로 90초동안 처리하고, 조직 배양 배지로 세척하고, 조직 배양 배지, 5 ㎍/ml의 소 인슐린 및 0.1 ㎍/ml의 소 트랜스페린이 함유된 회전 플라스크내로 다시 도입하였다. 약 수일 후, 상태가 변한 배지를 원심분리하고 여과하여 세포 및 세포 데브리스 (debris)를 제거하였다. 그 다음으로, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는 발현 유전자를 함유하는 샘플을 농축시키고, 투석 및(또는) 컬럼 크로마토그래피와 같은 임의의 선별된 방법으로 정제할 수 있다.
또다른 실시양태에서, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자를 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. pRK5 (PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA) 핵산은 CaPO4 또는 DEAE-덱스트란과 같은 공지된 시약을 사용하여 CHO 세포내로 형질감염시킬 수 있다. 상기 기재된 바와 같이, 세포 배양물을 인큐베이션하고, 배지를 배양 배지 (단독), 또는 35S-메티오닌과 같은 방사선표지가 함유된 배지로 바꿀 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드의 존재를 확인한 후, 배양 배지를 혈청이 없는 배지로 바꿀 수 있다. 바람직하게는, 배양물을 약 6일동안 인큐베이션한 후, 상태가 변한 배지를 모았다. 그 다음으로, 발현된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 함유하는 배지를 농축하고 임의의 선별된 방법으로 정제할 수 있다.
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 코딩하는, 에피토프 태그가 결합되어 있는 유전자도 숙주 CHO 세포에서 발현시킬 수 있다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자는 pRK5 벡터로부터 얻을 수 있다. 서브클론 인서트를 PCR 증폭시켜 바큘로 바이러스 발현 벡터내의 폴리-His 태그와 같은 선별된 에피토프 태그와 인프레임으로 결합시킬 수 있다. 이어서, 폴리-His 태그가 결합되어 있는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자 인서트는 안정한 클론의 선별을 위한 DHFR과 같은 선별 마커를 함유하는 SV40 유래 벡터내로 서브클로닝시킬 수 있다. 최종적으로, CHO 세포를 상기 SV40 유래 벡터로 (상기와 같이) 형질감염시킬 수 있다. 발현을 확인하기 위해, 상기와 같이 표지할 수 있다. 그 후, 폴리-His 태그가 결합되어 있는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 발현 유전자를 함유하는 배양 배지를 농축하고 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피와 같은 임의의 선별된 방법으로 정제할 수 있다.
상기에 기재된 방법으로 PRO179, PRO364, PRO840, PRO844, PRO846 및 PRO205을 CHO 세포에서 안정하게 발현시켰다. 또한, PRO364 및 PRO846을 일시적인 형질감염 방법으로 CHO 세포에서 발현시켰다.
실시예 23: PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현
효모에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자의 재조합 발현이 하기 방법에 기재되어 있다.
먼저, ADH2/GAPDH 프로모터의 조절하에 세포내에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 폴리펩티드를 생성시키거나, 상기 폴리펩티드를 세포외로 분비시키기 위한 발현 벡터를 제작하였다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA 및 프로모터를 선별된 플라스미드내의 적당한 제한효소 부위내에 삽입시켜 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자를 세포내에서 직접 발현시켰다. 분비시키기 위해서는, ADH2/GAPDH 프로모터, 천연 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 신호 펩티드 또는 포유동물의 신호 펩티드, 예를 들어, 효모 알파-인자 또는 인버타제 분비 신호(리더) 서열, 및 (필요하다면) PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 유전자의 발현을 위한 링커 서열을 코딩하는 DNA와 함께, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 DNA를 선별된 플라스미드내로 클 로닝할 수 있다.
이어서, 효모 균주 AB110과 같은 효모 세포를 상기 발현 플라스미드로 형질전환시키고, 선별된 발효 배지에서 배양할 수 있다. 형질전환된 효모 상등액을 10% 트리클로로아세트산으로 침전시키고 SDS-PAGE로 분리함으로써 분석한 후, 코마시에 블루 염색으로 겔을 염색할 수 있다.
그 후, 재조합 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887는 단리하고, 원심분리하여 발효 배지로부터 효모 세포를 제거한 후 선별된 카트리지 필터를 사용하여 배지를 농축시킴으로써 정제할 수 있다. 선별된 컬럼 크로마토그래피 수지를 사용하여 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 함유하는 농축물을 더 정제할 수 있다.
실시예 24: 바큘로바이러스에 감염된 곤충 세포에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 핵산의 발현
바큘로바이러스에 감염된 곤중 세포에서 재조합 발현시키는 하기 방법이 기재되어 있다.
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터내에 함유된 에피토프 태그의 상류 서열과 결합시 켰다. 이러한 에피토프 태그로는 폴리-His 태그 및 이뮤노글로불린 태그 (IgG의 Fc 영역 등)가 있다. pVL1393 (Novagen)과 같은 시판되는 플라스미드로부터 유래한 플라스미드를 비롯한 다양한 플라스미드를 사용할 수 있다. 간단히 말하면, PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 코딩하는 서열, 또는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887의 코딩 서열 중 원하는 일부 영역 [예컨대, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열, 또는 세포외 단백질인 경우, 성숙 단백질을 코딩하는 서열]은 5' 및 3' 영역과 상보적인 프라이머를 사용한 PCR로 증폭시켰다. 5' 프라이머는 플랭킹 (선별된) 제한효소 부위를 도입시킬 수 있다. 이어서, 생성물을 상기 선별된 제한효소로 절단하고, 발현 벡터내로 서브클로닝시켰다.
리포펙틴 (GIBO-BRL로부터 시판됨)을 사용하여 상기 플라스미드 및 바큘로골드 (상표명) 바이러스 DNA (Pharmingen)를 스포돕테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda, "Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711) 내로 동시에 형질감염시켜 재조합 바큘로바이러스를 얻었다. 28℃에서 4 내지 5일동안 인큐베이션한 후, 배출된 바이러스를 모아 추가 증폭에 사용하였다. 바이러스 감염 및 단백질 발현은 문헌 [O'Reilley et al., Baculovirus Expression Vectors: A Laboratory Manual (Oxford: Oxford University Press, 1994)]에 기재된 바와 같이 수행하였다.
그 다음으로, 발현된 폴리-His 태그-[PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887]을 예컨대, 하기와 같이 Ni2+-킬레이트 친화 크로마토그래피로 정제할 수 있다. 문헌 (Rupert et al., Nature, 362: 175-179 (1993))에 기재된 바와 같이 재조합 바이러스-감염된 Sf9 세포로부터 추출물을 얻었다. 간단히 말해, Sf9 세포를 세척하고, 초음파처리 완충액 (25 mM Hepes, pH 7.9; 12.5 mM MgCl2; 0.1 mM EDTA; 10% 글리세롤; 0.1% NP-40; 0.4 M KCl)에 재현탁시키고, 상등액을 로딩 완충액 (50 mM 포스페이트, 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 7.8)으로 50배 희석하고 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과하였다. 비드 부피가 5 ml인 Ni2+-NTA 아가로스 컬럼 (Qiagen으로부터 시판됨)을 준비하고, 25 ml의 물로 세척한 후, 25 ml의 로딩 완충액으로 평형시켰다. 여과된 세포 추출물을 분당 0.5 ml로 상기 컬럼에 로딩하였다. 컬럼을 로딩 완충액으로 기준치 A280까지 세척하였는데, 상기 기준치는 분획이 모아지기 시작하는 점이다. 다음으로, 상기 컬럼은 비특이적으로 결합되어 있는 단백질을 용출하는 2차 세척 완충액 (50 mM 포스페이트; 300 mM NaCl, 10% 글리세롤, pH 6.0)으로 세척하였다. 다시 기준치 A280에 도달한 후, 상기 컬럼을 2차 세척 완충액 중의 0 내지 500 mM 이미다졸 농도구배로 전개시켰다. 1 ml 분획을 모으고, SDS-PAGE, 및 은 염색 또는 Ni2+-NTA가 접합되어 있는 알칼리성 포스파타제 (Qiagen)을 사용한 웨스턴 블롯으로 분석하였다. 용출된 His10-태그-[PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887] 각각을 함유하는 분획을 모으고 로딩 완충액에 대해 투석하였다.
별법으로, IgG-태그-[PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887]은 예컨대, 단백질 A 또는 단백질 G 컬럼 크로마토그래피를 비롯한 공지된 크로마토그래피 기술을 사용하여 정제할 수 있다.
실제적으로 0.5 내지 2 L 규모로 발현시켰지만, 보다 큰 규모의 발현 (예컨대, 8 L)을 위해서는 용이하게 규모를 증가시킬 수 있다. 단백질의 세포외 영역이 힌지, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 IgG1 불변 영역 서열과 결합되어 있는 IgG 구조물 (이뮤노어드헤신) 또는 폴리-His 태그가 결합되어 있는 형태로서 단백질을 발현시켰다.
PCR 증폭 후, 각 코딩 서열을 바큘로바이러스 발현 벡터 (IgG 결합체의 경우에는 pb.PH.IgG이고, 폴리-His 태그가 결합되어 있는 단백질의 경우에는 pb.PH.His.c)내로 서브클로닝시키고, 리포펙틴 (Gibco BRL)을 사용하여 상기 벡터 및 바큘로골드 (등록상표) 바큘로바이러스 DNA (Pharmingen)를 105 스포돕테라 프루기페르다 ("Sf9") 세포 (ATCC CRL 1711)내로 동시에 형질감염시켰다. pb.PH.IgG 및 pb.PH.His는 His 또는 Fc 태그 서열을 포함하도록 폴리링커 영역이 변형된, 시판되는 바큘로바이러스 발현 벡터 pVL1393 (Pharmingen)이다. 세포는 10% FBS (Hyclone)가 함유된 Hink's TNM-FH 배지에서 배양하였다. 세포를 28℃에서 5일동안 인큐베이션하였다. 상등액을 모은 후, Sf9 세포를 10% FBS가 함유된 Hink's TNM-FH 배지에서 약 10의 감염다중도 (MOI)로 감염시킴으로써 제1 바이러스 증폭에 사용하였다. 세포를 28℃에서 3일동안 인큐베이션하였다. 상등액을 모으고, 1 ml의 상등액을 히스티딘 태그가 있는 단백질의 경우에는 25 ml의 Ni2+-NTA 비드 (Qiagen)에 배치 결합시키고, IgG 태그가 있는 단백질의 경우에는 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia)에 배치 결합시킨 후, 코마시에 블루 염색을 통해 단백질 표준물의 공지된 농도와 비교하는 SDS-PAGE 분석을 수행함으로써 바큘로바이러스 발현 벡터내 구조물의 발현도를 측정하였다.
제1 바이러스 증폭 상등액을 사용하여 ESF-921 배지 (발현계 LLC)에서 배양된 Sf9 세포의 회전 배양물 (500 ml)을 약 0.1의 감염다중도로 감염시켰다. 세포를 28℃에서 3일동안 인큐베이션하였다. 상등액을 모아 여과하였다. 필요하다면, 회전 배양물의 발현이 확인될 때까지 배치 결합 및 SDS-PAGE 분석을 반복하였다.
형질감염된 세포로부터 얻은, 성질이 변한 배지 (0.5 내지 3 L)를 원심분리로 세포를 제거하여 모으고, 0.22 마이크론 필터를 통해 여과하였다. 폴리-His 태그가 있는 구조물의 경우, 단백질 구조물은 Ni2+-NTA 컬럼 (Qiagen)을 사용하여 정제하였다. 정제하기 전, 이미다졸을 5 mM의 농도까지 상기 배지에 첨가하였다. 상기 배지는 4℃에서 4-5 ml/분의 유속으로 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸이 함유된 20 mM 헤페스 (Hepes, pH 7.4) 완충액으로 평형시킨 Ni2+-NTA 컬럼에 로딩하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고, 0.25 M의 이미다졸을 함유하는 평형 완충액으로 단백질을 용출하였다. 그 후, 고도로 정제된 단백질은 25 ml의 G25 수퍼파인 (Superfine; Pharmacia) 컬럼을 사용하여 저장 완충액 (10 mM Hepes, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨, pH 6.8)내로 탈염시키고 -80℃에서 저장하였다.
단백질의 이뮤노어드헤신 (Fc 함유) 구조물은 상태가 변한 배지로부터 하기와 같이 정제하였다. 상태가 변한 배지를 20 mM의 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형시킨 5 ml의 단백질 A 컬럼 (Pharmacia)에 로딩하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 평형 완충액으로 철저히 세척한 다음, 100 mM의 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질은 1 ml의 분획을 1 M 트리스 완충액 (pH 9)이 함유된 튜브내에서 모음으로써 즉시 중화시켰다. 그 후, 고도로 정제된 단백질을 상기 폴리-His 태그-단백질의 경우와 같이 저장 완충액내로 탈염시켰다. 단백질의 균질성은 SDS 폴리아크릴아미드 겔 (PEG) 전기영동, 및 에드만 (Edman) 분해에 의한 N-말단 아미노산 시퀀싱으로 확인하였다.
PRO205, PRO321, PRO840, PRO846, PRO885 및 PRO887은 상기 방법으로, 바큘로바이러스-감염된 곤충 Sf9 세포에서 성공적으로 발현시켰다.
별법으로, 하이-5 세포를 사용하는 경우에는 변형된 바큘로바이러스 방법을 사용할 수 있다. 이 방법에서, 원하는 서열을 코딩하는 DNA를 Pfu (Stratagene)과 같은 적당한 계로 증폭시키고, 바큘로바이러스 발현 벡터에 포함되어 있는 에피토프 태그의 5'-상류와 결합시킨다. 이러한 에피토프 태그로는 폴리-His 태그 및 이뮤노글로불린 태그 (IgG의 Fc 영역과 유사함)가 있다. pIE1-1 (Novagen)과 같은 시판되는 플라스미드로부터 유래된 플라스미드를 비롯한 다양한 플라스미드가 사용가능하다. 안정하게 형질전환된 곤충 세포에서 바큘로바이러스 ie1 프로모터로부 터 재조합 단백질을 기본 농도로 발현시키기 위해 pIE1-1 및 pIE1-2 벡터를 디자인하였다. 상기 플라스미드는 다중 클로닝 부위의 배향에 있어서만 다르고, hr5 인핸서 요소 뿐만 아니라 감염되지 않은 곤중 세포내의 ie1-매개 유전자 발현에 중요한 것으로 공지되어 있는 모든 프로모터 서열을 포함하고 있다. pIE1-1 및 pIE1-2는 번역 개시 부위를 포함하고 있고 융합 단백질을 생성하는 데 사용할 수 있다. 간단히 말해서, 원하는 서열 또는 원하는 일부 서열 (예컨대, 막횡단 단백질의 세포외 도메인을 코딩하는 서열)은 5' 및 3' 영역에 상응하는 프라이머를 사용한 PCR로 증폭하였다. 5' 프라이머는 플랭킹 (선택된) 제한효소 부위를 도입시킬 수 있다. 그 다음으로, 상기 선택된 제한효소로 생성물을 절단하고 발현 벡터내로 서브클로닝하였다. 예를 들어, pIE1-1의 유도체는 원하는 서열의 3'-하류에 인간 IgG의 Fc 영역 (pb.PH.IgG) 또는 8개의 히스티딘 (pb.PH.His) 태그를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 상기 벡터 제작물은 시퀀싱하여 확인하였다.
하이-5 세포를 CO2 및 페니실린/스트렙토마이신이 없는 27℃ 조건하에서 50%의 전면생장률까지 배양하였다. 각 150 mm 플레이트의 경우, 서열을 포함하는 pIE 기재의 벡터 30 ㎍을 1 ml의 Ex-셀 배지 (배지: Ex-셀 401 + 1/100 L-Glu JRH Biosciences #14401-78P (주의: 이 배지는 광에 민감함))와 혼합하고, 다른 튜브에서 100 ㎕의 셀펙틴 (셀펙틴 (GibcoBRL #10362-010) (볼텍싱하여 혼합함))을 1 ml의 Ex-셀 배지와 혼합하였다. 상기 두 용액을 합하고 실온에서 15분동안 인큐베이션하였다. 8 ml의 Ex-셀 배지를 2 ml의 DNA/셀펙틴 혼합물에 첨가하고, 이것을 Ex-셀 배지로 한번 세척한 하이-5 세포 위에 가하였다. 그 다음으로, 이 플레이트를 실온의 암실에서 1시간동안 인큐베이션하였다. 이어서, DNA/셀펙틴 혼합물을 흡입 제거하고, 세포를 Ex-셀 배지로 한번 세척하여 잔존하는 셀펙틴을 제거하고, 30 ml의 새로운 Ex-셀 배지를 첨가한 다음, 세포를 28℃에서 3일동안 인큐베이션하였다. 상등액을 모으고, 히스티딘 태그된 단백질의 경우에는 1 ml의 상등액을 25 ml의 Ni2+-NTA 비드 (Qiagen)에 배치 결합시키고, IgG 태그된 단백질의 경우에는 1 ml의 상등액을 단백질-A 세파로스 CL-4B 비드 (Pharmacia)에 배치 결합시킨 후, 코마시에 블루 염색에 의한 단백질 표준물의 공지된 농도와 비교하는 SDS-PAGE 분석을 수행함으로써 바큘로바이러스 발현 벡터내 서열의 발현을 측정하였다.
형질감염된 세포 (0.5 내지 3 L)로부터 상태가 변한 배지를 원심분리하여 모아 세포를 제거하고, 0.22 마이크론 필터를 통해 여과하였다. 폴리-His 태그된 제작물의 경우에는, Ni2+-NTA 컬럼 (Qiagen)을 사용하여 서열을 포함하는 단백질을 정제한다. 정제하기 전, 이미다졸을 5 mM 농도까지 상기 배지에 첨가하였다. 상기 배지를 48℃에서 4-5 ml/분의 유속으로 Ni2+-NTA 컬럼 [20 mM 헤페스 완충액 (pH 7.4, 0.3 M NaCl 및 5 mM 이미다졸을 함유함)으로 평형된 것] 위에 펌핑하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 평형 완충액으로 세척하고, 단백질을 0.25 M 이미다졸이 함유된 평형 완충액으로 용출하였다. 그 다음으로, 고도로 정제된 단백질은 25 ml G25 수퍼파인 (Superfine, Pharmacia) 컬럼을 사용하여 저장 완충액 (10 mM 헤페스, 0.14 M NaCl 및 4% 만니톨을 함유함, pH 6.8)내로 탈염시키고, -80℃에 저장하 였다.
단백질의 이뮤노어드헤신 (Fc 포함함) 제작물을 하기와 같이 상태가 변한 배지로부터 정제하였다. 상기 배지를 20 mM 인산나트륨 완충액 (pH 6.8)으로 평형시킨 단백질 A 컬럼 (Pharmacia) 상에 펌핑하였다. 로딩 후, 상기 컬럼을 평형 완충액으로 철저히 세척한 후, 100 mM 시트르산 (pH 3.5)으로 용출하였다. 용출된 단백질은 1 ml의 분획을 275 ml의 1 M 트리스 완충액 (pH 9)이 함유된 튜브내로 모음으로써 즉시 중화시켰다. 그 다음으로, 상기 폴리-His 태그된 단백질의 경우와 같이 고도로 정제된 단백질을 저장 완충액내로 탈염시켰다. 서열의 균질성은 SDS 폴리아크릴아미드 겔, 에드만 분해에 의한 N-말단 서열 시퀀싱 및 필요하거나 원한다면 다른 분석 방법으로 조사하였다.
PRO179, PRO205, PRO321, PRO333, PRO364, PRO844, PRO846, PRO877, PRO879, PRO882, PRO885 및 PRO1760을 상기 기재된 방법으로 하이-5 세포에서 발현시켰다.
실시예 25: PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 결합하는 항체의 제조
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887과 특이적으로 결합할 수 있는 모노클로날 항체의 제조를 하기 실시예에서 기술한다.
모노클로날 항체의 제조 기술은 당업계에 공지되어 있는데, 예를 들어, 상기 골딩 (Golding)의 문헌에 기재되었다. 사용할 수 있는 면역원으로는 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 포함하는 정제된 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 융합 단백질, 및 세포 표면 상에서 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887를 코딩하는 유전자를 발현하는 세포가 있다. 당업자는 과도한 실험 없이 면역원을 선별할 수 있다.
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887 면역원을 완전 프로인트 (Freund's) 면역보강제에 유화시키고 1 내지 100 마이크로그램의 양을 피하 또는 복강내 투여함으로써 Balb/c와 같은 마우스를 면역화시켰다.
별법으로, 상기 면역원을 MPL-TDM 면역보강제 (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT)에 유화시키고, 동물의 뒷발 패드내에 주사하였다. 그 다음으로 10 내지 12일 후, 면역화된 마우스를 선별된 면역보강제에 유화된 추가 면역원으로 부스팅하였다. 그 후, 수주동안 마우스를 추가적으로 면역 주사하여 부스팅시킬 수도 있다. 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 항체를 검출하는 ELISA 검정에서 시험하기 위해, 안와후 출혈을 통해 혈청 샘플을 마우스로부터 주기적으로 수득할 수 있다.
적당한 항체 역가를 검출한 후, 항체에 대해 "양성" 반응을 보이는 동물에게 최종적으로 PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887을 정맥내 주사할 수 있다. 3 내지 4일 후, 마우스를 희생시키고, 비장 세포를 채취한다. 그 다음으로, 상기 비장 세포를 P3X63AgU.1 (ATCC No. CRL1597)와 같은 선별된 뮤린 골수종 세포주와 융합시킨다 (35% 폴리에틸렌 글리콜을 사용함). 이 융합의 결과, 융합되지 않은 세포, 육종 하이브리드 및 비장 세포 하이브리드의 증식을 억제하는 HAT 배지를 함유하는 96-웰 조직 배양 플레이트에 플레이팅할 수 있는 하이브리도마 세포를 얻었다.
PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 대한 상기 하이브리도마 세포의 반응성을 ELISA에서 스크리닝할 것이다. PRO179, PRO238, PRO364, PRO844, PRO846, PRO1760, PRO205, PRO321, PRO333, PRO840, PRO877, PRO878, PRO879, PRO882, PRO885 또는 PRO887에 대한 원하는 모노클로날 항체를 분비하는 "양성" 하이브리도마 세포는 당업자라면 판별할 수 있다.
양성 하이브리도마 세포를 유전적 동계의 Balb/c 마우스내에 복강내 주사하여 항-PRO179, 항-PRO238, 항-PRO364, 항-PRO844, 항-PRO846, 항-PRO1760, 항-PRO205, 항-PRO321, 항-PRO333, 항-PRO840, 항-PRO877, 항-PRO878, 항-PRO879, 항-PRO882, 항-PRO885 또는 항-PRO887 모노클로날 항체를 함유하는 복수를 얻을 수 있 다. 별법으로, 상기 하이브리도마 세포를 조직 배양 플라스크 또는 롤러 병에서 배양할 수 있다. 상기 복수에 함유되어 있는 모노클로날 항체는 황산암모늄 침전에 이어 겔-배제 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 별법으로, 단백질 A 또는 단백질 G와 항체의 결합을 기초로 하는 친화 크로마토그래피를 사용할 수 있다.
<물질의 기탁>
하기 물질(들)을 아메리칸 컬쳐 콜렉션 (10801 University Blvd., Manassas, VA 20110-2209, USA (ATCC))에 기탁하였다.
물질 ATCC 기탁 번호 기탁일
DNA16451-1388 209776 1998년 4월 14일
DNA35600-1162 209370 1997년 10월 16일
DNA47365-1206 209436 1997년 11월 7일
DNA59838-1462 209976 1998년 6월 16일
DNA44196-1353 209847 1998년 5월 6일
DNA76532-1702 203473 1998년 11월 17일
DNA34433 209719 1998년 3월 31일
DNA53987 209858 1998년 5월 12일
기탁은 특허 절차상 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약 및 그의 규칙(부다페스트 조약 (Budapest Treaty))의 규정하에 이루어졌다. 이는 기탁일로부터 30년 동안 기탁물의 생존 배양물의 유지를 보장한다. 기탁물은 부다페스트 조약의 협약 하에 ATCC로부터 제넨테크 인크와 ATCC 사이 협정에 따라 분양될 것이며, 이는 관련 미국 특허의 허락시 또는 미국 또는 외국 특허 출원의 공개시(이 중 먼저인 때) 공공에 대한 기탁물의 배양 프로제니의 영구적이고 비제한적인 분양을 보장하고, 미국 특허 및 상표청장에 의해 35 USC §122 및 그에 따른 미국 특허 및 상표청장의 규칙(37 CFR §1.14 포함, 특히 886 OG 638 참조)에 따라 권리 가 있는 것으로 결정한 이에게 프로제니의 분양을 보장한다.
본 출원의 양수인은 적합한 조건하에서 배양시 기탁 물질의 배양물이 사멸하거나 손실되거나 파손된 경우, 이를 통지하면 물질을 다른 동일한 물질로 즉시 교체할 것임을 동의하였다. 기탁 물질의 분양은 각국 정부의 권한으로 그 특허법에 따라 승인된 권리에 위배하여 본 발명을 실시하도록 허가하는 것으로서 해석되어서는 안된다.
앞서 기술한 명세서는 당업계의 숙련인이 본 발명을 실시할 수 있도록 하기에 충분한 것으로 생각된다. 기탁된 실시양태가 본 발명의 특정 측면의 한 예시로서 의도되는 것이므로 본 발명은 기탁된 구조물의 범위에 제한되지 않고, 기능적으로 동등한 임의의 구조물은 본 발명의 범위 내에 있다. 본원에서 물질의 기탁은 본원에 포함된 기재 내용이 본 발명의 최선의 양식을 포함한 임의의 측면을 실시하기에 부적절하다는 것을 의미하지는 않으며, 특허 청구 범위의 범위를 명세서에서 나타내는 구체적인 설명에 제한하려는 것으로 해석되어서는 안된다. 실제로, 앞서의 상세한 설명으로부터 본원에 나타내고 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 수식이 당업계 숙련자에게는 명백하고, 이는 첨부된 특허 청구의 범위 내에 있을 것이다.
Sequence Listing <110> Genentech, Inc. Ashkenazi,Avi J. Baker,Kevin P. Ferrara,Napoleone Gerber,Hanspeter Gerritsen,Mary E. Goddard,Audrey Gurney,Austin L. Hillan,Kenneth J. Marsters,Scot A. Paoni,Nicholas F. Pitti,Robert M. Watanabe,Colin K. Williams,Mickey P. Wood, William I. <120> PROMOTION OR INHIBITION OF ANGIOGENESIS AND CARDIOVASCULARIZATION <130> P2935R1PCT <140> PCT/US00/05004 <141> 2000-02-24 <150> PCT/US99/05028 <151> 1999-03-08 <150> US 60/123,957 <151> 1999-03-12 <150> PCT/US99/12252 <151> 1999-06-02 <150> US 60/144,758 <151> 1999-07-20 <150> US 60/145,698 <151> 1999-07-26 <150> PCT/US99/20111 <151> 1999-09-01 <150> PCT/US99/21090 <151> 1999-09-15 <150> PCT/US99/28313 <151> 1999-11-30 <150> PCT/US99/28409 <151> 1999-11-30 <150> PCT/US99/28565 <151> 1999-12-02 <150> PCT/US00/00219 <151> 2000-01-05 <150> PCT/US00/04341 <151> 2000-02-18 <150> PCT/US00/04342 <151> 2000-02-18 <150> PCT/US00/04414 <151> 2000-02-22 <160> 55 <210> 1 <211> 2042 <212> DNA <213> Homo Sapien <400> 1 gcggacgcgt gggtgaaatt gaaaatcaag ataaaaatgt tcacaattaa 50 gctccttctt tttattgttc ctctagttat ttcctccaga attgatcaag 100 acaattcatc atttgattct ctatctccag agccaaaatc aagatttgct 150 atgttagacg atgtaaaaat tttagccaat ggcctccttc agttgggaca 200 tggtcttaaa gactttgtcc 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gccgctgtcg gtgtctgtct gtctgctctt agctgtctcc 750 attgcctcgg ccttctttgc tttttgtggg ggagagggga ggggacgggc 800 agggtctctg tcgcccaggc tggggtgcag tggcgcgatc ccagcactgc 850 agcctcaacc tcctgggctc aagccatcct tccgcctcag cttccccagc 900 agctgggact acaggcacgc gccaccacag ccggctaatt ttttatttaa 950 ttttttgtag agacgaggtt tcgccatgtt gcccaggctg gtcttgaact 1000 ccggggctca agcgatcctc ccgcttcagc ctccctaagt gctgggattg 1050 caggcgtgag ccactttccc agcctctctt tgctttgcct gccccgttct 1100 cttaactctt ggaccctcct cgtctgcatg gtaactccgt ctgagtctac 1150 cattttcttg ctctccctcc ttccttgggc ctgcctcagt tccctttggc 1200 ctcccccttt acccagctct tggggtgtct ctgttttttc catccccact 1250 tcctgccttc tcgtggccct gtgtgagcac atgtgtacat ctcagcctta 1300 tctcaaggag gtgacacctt ctctccttgt ccccatctgg ccgtctctct 1350 gtgcttccct ggccaggggc gtgcctgctg gtcctatggg gggaaggcta 1400 ctccgcatct cagccacctt cctcaggctc actccaccta catccccagt 1450 ctgccacacc ccatcccttt gggcctcagc cctgtccctt tgatgtcctc 1500 ctttccttca gcccctctgc cctgtccctg cacacctcc 1539 <210> 28 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29 <211> 3611 <212> DNA <213> Homo Sapien <400> 29 ccgccgatgg cgctgaggcg gagcatgggg cggccggggc tcccgccgct 50 gccgctgccg ccgccaccgc ggctcgggct gctgctggcg gctctggctt 100 ctctgctgct cccggagtcc gccgccgcag gtctgaagct catgggagcc 150 ccggtgaagc tgacagtgtc tcaggggcag ccggtgaagc tcaactgcag 200 tgtggagggg atggaggagc ctgacatcca gtgggtgaag gatggggctg 250 tggtccagaa cttggaccag ttgtacatcc cagtcagcga gcagcactgg 300 atcggcttcc tcagcctgaa gtcagtggag cgctctgacg ccggccggta 350 ctggtgccag gtggaggatg ggggtgaaac cgagatctcc cagccagtgt 400 ggctcacggt agaaggtgtg ccatttttca cagtggagcc aaaagatctg 450 gcagtgccac ccaatgcccc tttccaactg tcttgtgagg ctgtgggtcc 500 ccctgaacct gttaccattg tctggtggag aggaactacg aagatcgggg 550 gacccgctcc ctctccatct gttttaaatg taacaggggt gacccagagc 600 accatgtttt cctgtgaagc tcacaaccta aaaggcctgg cctcttctcg 650 cacagccact gttcaccttc aagcactgcc tgcagccccc ttcaacatca 700 ccgtgacaaa gctttccagc agcaacgcta gtgtggcctg gatgccaggt 750 gctgatggcc gagctctgct acagtcctgt acagttcagg tgacacaggc 800 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gaaagtggct 1650 gtgaagatgc tgaaagctga catcattgcc tcaagcgaca ttgaagagtt 1700 cctcagggaa gcagcttgca tgaaggagtt tgaccatcca cacgtggcca 1750 aacttgttgg ggtaagcctc cggagcaggg ctaaaggccg tctccccatc 1800 cccatggtca tcttgccctt catgaagcat ggggacctgc atgccttcct 1850 gctcgcctcc cggattgggg agaacccctt taacctaccc ctccagaccc 1900 tgatccggtt catggtggac attgcctgcg gcatggagta cctgagctct 1950 cggaacttca tccaccgaga cctggctgct cggaattgca tgctggcaga 2000 ggacatgaca gtgtgtgtgg ctgacttcgg actctcccgg aagatctaca 2050 gtggggacta ctatcgtcaa ggctgtgcct ccaaactgcc tgtcaagtgg 2100 ctggccctgg agagcctggc cgacaacctg tatactgtgc agagtgacgt 2150 gtgggcgttc ggggtgacca tgtgggagat catgacacgt gggcagacgc 2200 catatgctgg catcgaaaac gctgagattt acaactacct cattggcggg 2250 aaccgcctga aacagcctcc ggagtgtatg gaggacgtgt atgatctcat 2300 gtaccagtgc tggagtgctg accccaagca gcgcccgagc tttacttgtc 2350 tgcgaatgga actggagaac atcttgggcc agctgtctgt gctatctgcc 2400 agccaggacc ccttatacat caacatcgag agagctgagg agcccactgc 2450 gggaggcagc ctggagctac 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caagggaaga agccaagcct tacccgctat tcccgggacc 250 ttttccaggg agcctgcaaa ctgaccacac accgctgtta tcccttcctc 300 acgccagtgg gtaccagcct gccttgatgt tttcaccaac ccagcctgga 350 agaccacata caggaaacgt agccattccc caggtgacct ctgtcgaatc 400 aaagccccta ccgcctcttg ccttcaaaca cacagttgga cacataatac 450 tttctgaaca taaaggtgtc aaatttaatt gctcaatcaa tgtacctaat 500 atataccagg acaccacaat ttcttggtgg aaagatggga aggaattgct 550 tgggggacat catcgaatta cacagtttta tccagatgat gaagttacag 600 caataatcgc ttccttcagc ataaccagtg tgcagcgttc agacaatggg 650 tcgtatatct gtaagatgaa aataaacaat gaagagatcg tgtctgatcc 700 catctacatc gaagtacaag gacttcctca ctttactaag cagcctgaga 750 gcatgaatgt caccagaaac acagccttca acctcacctg tcaggctgtg 800 ggcccgcctg agcccgtcaa cattttctgg gttcaaaaca gtagccgtgt 850 taacgaacag cctgaaaaat cccccggcgt gctaactgtt ccaggcctga 900 cggagatggc ggtcttcagt tgtgaggccc acaatgacaa agggctgacc 950 gtgtcccagg gagtgcagat caacatcaaa gcaattccct ccccaccaac 1000 tgaagtcagc atccgtaaca gcactgcaca cagcattctg atctcctggg 1050 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ggtcttgatg 3550 tatttgataa gaatgattaa ttttctgata tggcttccat aataaaattg 3600 aaatagga 3608 <210> 32 <211> 999 <212> PRT <213> Homo Sapien <400> 32 Met Gly Pro Ala Pro Leu Pro Leu Leu Leu Gly Leu Phe Leu Pro 1 5 10 15 Ala Leu Trp Arg Arg Ala Ile Thr Glu Ala Arg Glu Glu Ala Lys 20 25 30 Pro Tyr Pro Leu Phe Pro Gly Pro Phe Pro Gly Ser Leu Gln Thr 35 40 45 Asp His Thr Pro Leu Leu Ser Leu Pro His Ala Ser Gly Tyr Gln 50 55 60 Pro Ala Leu Met Phe Ser Pro Thr Gln Pro Gly Arg Pro His Thr 65 70 75 Gly Asn Val Ala Ile Pro Gln Val Thr Ser Val Glu Ser Lys Pro 80 85 90 Leu Pro Pro Leu Ala Phe Lys His Thr Val Gly His Ile Ile Leu 95 100 105 Ser Glu His Lys Gly Val Lys Phe Asn Cys Ser Ile Asn Val Pro 110 115 120 Asn Ile Tyr Gln Asp Thr Thr Ile Ser Trp Trp Lys Asp Gly Lys 125 130 135 Glu Leu Leu Gly Gly His His Arg Ile Thr Gln Phe Tyr Pro Asp 140 145 150 Asp Glu Val Thr Ala Ile Ile Ala Ser Phe Ser Ile Thr Ser Val 155 160 165 Gln Arg Ser Asp Asn Gly Ser Tyr Ile Cys Lys Met Lys Ile Asn 170 175 180 Asn Glu Glu Ile Val Ser Asp Pro Ile Tyr Ile Glu Val Gln Gly 185 190 195 Leu Pro His Phe Thr Lys Gln Pro Glu Ser Met Asn Val Thr Arg 200 205 210 Asn Thr Ala Phe Asn Leu Thr Cys Gln Ala Val Gly Pro Pro Glu 215 220 225 Pro Val Asn Ile Phe Trp Val Gln Asn Ser Ser Arg Val Asn Glu 230 235 240 Gln Pro Glu Lys Ser Pro Gly Val Leu Thr Val Pro Gly Leu Thr 245 250 255 Glu Met Ala Val Phe Ser Cys Glu Ala His Asn Asp Lys Gly Leu 260 265 270 Thr Val Ser Gln Gly Val Gln Ile Asn Ile Lys Ala Ile Pro Ser 275 280 285 Pro Pro Thr Glu Val Ser Ile Arg Asn Ser Thr Ala His Ser Ile 290 295 300 Leu Ile Ser Trp Val Pro Gly Phe Asp Gly Tyr Ser Pro Phe Arg 305 310 315 Asn Cys Ser Ile Gln Val Lys Glu Ala Asp Pro Leu Gly Asn Gly 320 325 330 Ser Val Met Ile Phe Asn Thr Ser Ala Leu Pro His Leu Tyr Gln 335 340 345 Ile Lys Gln Leu Gln Ala Leu Ala Asn Tyr Ser Ile Gly Val Ser 350 355 360 Cys Met Asn Glu Ile Gly Trp Ser Ala Val Ser Pro Trp Ile Leu 365 370 375 Ala Ser Thr Thr Glu Gly Ala Pro Ser Val Ala Pro Leu Asn Val 380 385 390 Thr Val Phe Leu Asn Glu Ser Ser Asp Asn Val Asp Ile Arg Trp 395 400 405 Met Lys Pro Pro Thr Lys Gln Gln Asp Gly Glu Leu Val Gly Tyr 410 415 420 Arg Ile Ser His Val Trp Gln Ser Ala Gly Ile Ser Lys Glu Leu 425 430 435 Leu Glu Glu Val Gly Gln Asn Gly Ser Arg Ala Arg Ile Ser Val 440 445 450 Gln Val His Asn Ala Thr Cys Thr Val Arg Ile Ala Ala Val Thr 455 460 465 Arg Gly Gly Val Gly Pro Phe Ser Asp Pro Val Lys Ile Phe Ile 470 475 480 Pro Ala His Gly Trp Val Asp Tyr Ala Pro Ser Ser Thr Pro Ala 485 490 495 Pro Gly Asn Ala Asp Pro Val Leu Ile Ile Phe Gly Cys Phe Cys 500 505 510 Gly Phe Ile Leu Ile Gly Leu Ile Leu Tyr Ile Ser Leu Ala Ile 515 520 525 Arg Lys Arg Val Gln Glu Thr Lys Phe Gly Asn Ala Phe Thr Glu 530 535 540 Glu Asp Ser Glu Leu Val Val Asn Tyr Ile Ala Lys Lys Ser Phe 545 550 555 Cys Arg Arg Ala Ile Glu Leu Thr Leu His Ser Leu Gly Val Ser 560 565 570 Glu Glu Leu Gln Asn Lys Leu Glu Asp Val Val Ile Asp Arg Asn 575 580 585 Leu Leu Ile Leu Gly Lys Ile Leu Gly Glu Gly Glu Phe Gly Ser 590 595 600 Val Met Glu Gly Asn Leu Lys Gln Glu Asp Gly Thr Ser Leu Lys 605 610 615 Val Ala Val Lys Thr Met Lys Leu Asp Asn Ser Ser His Arg Glu 620 625 630 Ile Glu Glu Phe Leu Ser Glu Ala Ala Cys Met Lys Asp Phe Ser 635 640 645 His Pro Asn Val Ile Arg Leu Leu Gly Val Cys Ile Glu Met Ser 650 655 660 Ser Gln Gly Ile Pro Lys Pro Met Val Ile Leu Pro Phe Met Lys 665 670 675 Tyr Gly Asp Leu His Thr Tyr Leu Leu Tyr Ser Arg Leu Glu Thr 680 685 690 Gly Pro Lys His Ile Pro Leu Gln Thr Leu Leu Lys Phe Met Val 695 700 705 Asp Ile Ala Leu Gly Met Glu Tyr Leu Ser Asn Arg Asn Phe Leu 710 715 720 His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Cys Met Leu Arg Asp Asp Met 725 730 735 Thr Val Cys Val Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Lys Ile Tyr Ser 740 745 750 Gly Asp Tyr Tyr Arg Gln Gly Arg Ile Ala Lys Met Pro Val Lys 755 760 765 Trp Ile Ala Ile Glu Ser Leu Ala Asp Arg Val Tyr Thr Ser Lys 770 775 780 Ser Asp Val Trp Ala Phe Gly Val Thr Met Trp Glu Ile Arg Thr 785 790 795 Arg Gly Met Thr Pro Tyr Pro Gly Val Gln Asn His Glu Met Tyr 800 805 810 Asp Tyr Leu Leu His Gly His Arg Leu Lys Gln Pro Glu Asp Cys 815 820 825 Leu Asp Glu Leu Tyr Glu Ile Met Tyr Ser Cys Trp Arg Thr Asp 830 835 840 Pro Leu Asp Arg Pro Thr Phe Ser Val Leu Arg Leu Gln Leu Glu 845 850 855 Lys Leu Leu Glu Ser Leu Pro Asp Val Arg Asn Gln Ala Asp Val 860 865 870 Ile Tyr Val Asn Thr Gln Leu Leu Glu Ser Ser Glu Gly Leu Ala 875 880 885 Gln Gly Pro Thr Leu Ala Pro Leu Asp Leu Asn Ile Asp Pro Asp 890 895 900 Ser Ile Ile Ala Ser Cys Thr Pro Arg Ala Ala Ile Ser Val Val 905 910 915 Thr Ala Glu Val His Asp Ser Lys Pro His Glu Gly Arg Tyr Ile 920 925 930 Leu Asn Gly Gly Ser Glu Glu Trp Glu Asp Leu Thr Ser Ala Pro 935 940 945 Ser Ala Ala Val Thr Ala Glu Lys Asn Ser Val Leu Pro Gly Glu 950 955 960 Arg Leu Val Arg Asn Gly Val Ser Trp Ser His Ser Ser Met Leu 965 970 975 Pro Leu Gly Ser Ser Leu Pro Asp Glu Leu Leu Phe Ala Asp Asp 980 985 990 Ser Ser Glu Gly Ser Glu Val Leu Met 995 <210> 33 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 33 tgtaaaacga cggccagtta aatagacctg caattattaa tct 43 <210> 34 <211> 41 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 34 caggaaacag ctatgaccac ctgcacacct gcaaatccat t 41 <210> 35 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 35 ggtgctaaac tggtgctctg tggc 24 <210> 36 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 36 cagggcaaga tgagcattcc 20 <210> 37 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 37 tcatactgtt ccatctcggc acgc 24 <210> 38 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 38 aatggtgggg ccctagaaga gctcatcaga gaactcaccg cttctcatgc 50 <210> 39 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 39 cacagcacgg ggcgatggg 19 <210> 40 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 40 gctctgcgtt ctgctctg 18 <210> 41 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 41 ggcacagcac ggggcgatgg gcgcgttt 28 <210> 42 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 42 ctggtcactg ccaccttcct gcac 24 <210> 43 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 43 cgctgaccca ggctgag 17 <210> 44 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 44 gaaggtcccc gaggcacagt cgataca 27 <210> 45 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 45 gaggagtgct gttccgagtg ggactgcatg tgtgtccagc 40 <210> 46 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 46 agcctgggtc agcgccccac cgggggtccc gggtgcggcc 40 <210> 47 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 47 ccctgcagtg cacctacagg gaag 24 <210> 48 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 48 ctgtcttccc ctgcttggct gtgg 24 <210> 49 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 49 ggtgcaggaa gggtgggatc ctcttctctc gctgctctgg ccacatc 47 <210> 50 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 50 ggattctaat acgactcact atagggcaac ccgagcatgg cacagcac 48 <210> 51 <211> 47 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 51 ctatgaaatt aaccctcact aaagggatct cccagccgcc ccttctc 47 <210> 52 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 52 ggattctaat acgactcact atagggcaga gacagggcaa gcagaatg 48 <210> 53 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 53 ctatgaaatt aaccctcact aaagggagaa ggggatgact ggaggaac 48 <210> 54 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 54 ggattctaat acgactcact atagggcctc cacagaacct cgccatca 48 <210> 55 <211> 48 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic oligonucleotide probe <400> 55 ctatgaaatt aaccctcact aaagggatgg ggcaagactc acaagcag 48

Claims (91)

  1. 서열번호 20 (SEQ ID NO: 20)의 아미노산 서열을 갖는 PRO840 폴리펩티드를 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함하는, 말초혈관질환, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이나우드병 및 레이나우드 증후군, 동맥류, 대동맥 재발협착증, 혈전성 정맥염, 림프관염, 림프부종, 창상 치유 및 조직 회복, 허혈, 재관류 손상, 협심증, 심근경색증, 만성 심장 질환, 심부전 및 골다공증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈관신생 질환의 치료를 위한 제약조성물.
  2. 제1항에 있어서, 치료 유효량의 상기 폴리펩티드를 포함하는 조성물.
  3. 서열번호 20 (SEQ ID NO: 20)의 아미노산 서열을 갖는 PRO840 폴리펩티드에 대한 항-PRO840 항체를 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함하는, 혈관종과 같은 혈관 종양; 종양 혈관신생; 당뇨병성 망막병증, 미성숙 소아 망막병증, 황반퇴행성 및 증식성 유리체망막병증과 관련된 망막, 맥락막, 각막에서의 혈관신생; 류마티스성 관절염; 크론병; 죽상경화증; 난소 과자극증후군; 건선; 혈관신생과 관련된 자궁내막증; 풍선 혈관성형술 후의 재발협착증; 수술 후 형성되는 켈로이드에서 나타나는 반흔 조직의 과다형성; 심근경색증 후의 섬유증; 폐섬유증과 관련된 섬유손상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈관신생 질환의 치료를 위한 제약조성물.
  4. 삭제
  5. 제1항에 있어서, 추가로 혈관형성제를 포함하는 제약조성물.
  6. 삭제
  7. (1) 서열번호 20 (SEQ ID NO: 20)의 아미노산 서열을 갖는 PRO840 폴리펩티드를 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함하는 조성물;
    (2) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및
    (3) 혈관신생 질환의 치료에 있어서 상기 조성물의 용도를 기재하고 있는, 상기 용기에 부착된 표지 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물을 포함하는 제품으로서,
    상기 혈관신생질환이 말초혈관질환, 고혈압, 염증성 혈관염, 레이나우드병 및 레이나우드 증후군, 동맥류, 대동맥 재발협착증, 혈전성 정맥염, 림프관염, 림프부종, 창상 치유 및 조직 회복, 허혈, 재관류 손상, 협심증, 심근경색증, 만성 심장 질환, 심부전 및 골다공증으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 제품.
  8. (1) 서열번호 20 (SEQ ID NO: 20)의 아미노산 서열을 갖는 PRO840 폴리펩티드에 대한 항체를 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함하는 조성물;
    (2) 상기 조성물을 함유하는 용기; 및
    (3) 혈관신생 질환의 치료에 있어서 상기 조성물의 용도를 기재하고 있는, 상기 용기에 부착된 표지 또는 상기 용기에 포함된 포장 삽입물을 포함하는 제품으로서,
    상기 혈관신생질환이 혈관종과 같은 혈관 종양; 종양 혈관신생; 당뇨병성 망막병증, 미성숙 소아 망막병증, 황반퇴행성 및 증식성 유리체망막병증과 관련된 망막, 맥락막, 각막에서의 혈관신생; 류마티스성 관절염; 크론병; 죽상경화증; 난소 과자극증후군; 건선; 혈관신생과 관련된 자궁내막증; 풍선 혈관성형술 후의 재발협착증; 수술 후 형성되는 켈로이드에서 나타나는 반흔 조직의 과다형성; 심근경색증 후의 섬유증 및 폐섬유증과 관련된 섬유손상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 제품.
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  10. 제7항에 있어서, 상기 조성물이 치료 유효량의 상기 PR0840 폴리펩티드를 제약학적으로 허용가능한 담체와의 혼합물로 포함하는 것인 제품.
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  30. 적당한 포장내에 서열번호 20 (SEQ ID NO: 20)의 아미노산 서열을 갖는 PR0840 폴리펩티드에 대한 항-PRO840 항체 및 담체를 포함하는, 말초혈관질환; 고혈압; 염증성 혈관염; 레이나우드병 및 레이나우드 증후군; 동맥류; 대동맥 재발협착증; 혈전성 정맥염; 림프관염; 림프부종; 창상 치유 및 조직 회복; 허혈; 재관류 손상; 협심증; 심근경색증; 만성 심장 질환; 심부전; 골다공증; 혈관종과 같은 혈관 종양; 종양 혈관신생; 당뇨병성 망막병증, 미성숙 소아 망막병증, 황반퇴행성 및 증식성 유리체망막병증과 관련된 망막, 맥락막, 각막에서의 혈관신생; 류마티스성 관절염; 크론병; 죽상경화증; 난소 과자극증후군; 건선; 혈관신생과 관련된 자궁내막증; 풍선 혈관성형술 후의 재발협착증; 수술 후 형성되는 켈로이드에서 나타나는 반흔 조직의 과다형성; 심근경색증 후의 섬유증 및 폐섬유증과 관련된 섬유손상으로 구성되는 군으로부터 선택되는 혈관신생 질환용 진단 키트.
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