JP4358159B2 - 血管形成及び心臓血管新生の促進又は阻害 - Google Patents
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Description
A. 心臓疾患と因子
約500万人のアメリカ人が心不全を患っており、心不全の新しい患者は毎年約400000にのぼる。これは、アメリカ合衆国における65歳以上の人々の、最も頻出の入院原因である。急性心筋梗塞を含む急性心臓疾患の治療技術における最近の進歩により、慢性の心不全が発症した患者数が拡大する結果となった。1979年から1995年まで、鬱血性心不全(CHF)により入院した患者は、377,000から872,000まで増加し(130パーセントの増加)、CHFによる死亡は116パーセント増加した。
CHFは、左心室の機能不全、運動耐性(exercise tolerance)の低下、生活水準の悪化、顕著な寿命の低下により特徴付けられる症候群である。心不全の必須条件は、心臓が体組織の代謝必要量を満たすのに十分な速度で血液を押し出すことが不可能であることである(換言すれば、心拍出量の不足である)。
種々の天然に生じるポリペプチドは内皮細胞の増殖を誘発すると報告されている。これらのポリペプチドとしては、塩基性及び酸性の線維芽細胞増殖因子(FGF)(Burgess及びMaciag, Annual Rev. Biochem., 58:575(1989))、血小板誘導内皮細胞成長因子(PD-ECGF)(Ishikawa等, Nature, 338:557(1989))、及び血管内皮成長因子(VEGF)を挙げることができる。Leung等, Science, 246:1306(1989);Ferrara及びHenzel, Biochem. Biophys. Res. Commun., 161:851(1989);Tischer等, Biochem. Biophys. Res. Commun., 165:1198(1989);1996年7月31日に許可されたEP471,754B。
付加的な分裂促進因子として、インシュリン様成長因子結合タンパク質(IGFBPs)が、インシュリン様成長因子(IGF)との複合体において、線維芽細胞及び平滑筋細胞表面レセプターへのIGFの結合性を増加させるように刺激することが示されている。Clemmonsら., J. Clin. Invest., 77: 1548(1986)。様々なインビトロでのIGF作用に対するIGFBPの阻害効果は、脂肪細胞によるグルコース輸送の刺激、軟骨細胞によるサルフェートの取り込み、及び線維芽細胞中へのチミジンの取り込みを含む。Zapf等, J. Clin. Invest., 63:1077(1979)。さらに、正常な細胞での、成長因子媒介性分裂促進因子活性におけるIGFBPの阻害効果が示されている。
多くの病気及び疾患における血管内皮細胞の成長及び血管形成の役割に鑑みると、これらのプロセスに起因する一又は複数の生物学的影響を低減又は抑制する手段を有していることが好ましい。また、正常及び病気の状態、特にガンにおいて病原性ポリペプチドの存在を検査する手段を有していることも望ましい。さらに、特定の側面では、心臓肥大の治療には一般的に適用できる治療法がないので、心臓ミオサイト肥大を防止又は低減可能な因子を同定することは、病態生理学的な心臓成長を阻害するための新規な治療方策の開発において非常に重要である。様々な心臓血管及び発癌遺伝子疾患のためのいくつかの治療様式が存在するが、さらなる治療的アプローチがなお必要とされている。
従って、本発明は、哺乳類における血管形成及び/又は心臓血管新生を促進又は阻害するための組成物及び方法に関する。本発明は、ある種の生物学的活性の促進又は阻害を試験する種々の心臓血管アッセイにおいて陽性を試験するタンパク質の同定に基づく。従って、血管形成の促進又は阻害、血管内皮細胞成長の阻害又は刺激、血管内皮細胞の成長又は増殖の刺激、腫瘍成長の阻害、血管形成依存性組織成長の阻害、血管形成依存性組織成長の刺激、心臓肥大の阻害及び心臓肥大の刺激、例えば鬱血性心不全の治療等の効果が望まれているところでは、当該タンパク質は疾患の診断及び/又は治療(予防を含む)に有用な薬剤であると考えられる。
他の実施態様において、本発明は、製薬的に許容される担体と混合された、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含有する組成物を提供する。一態様では、組成物はアゴニスト又はアンタゴニストの治療的有効量を含有する。他の態様では、組成物はさらなる活性成分、すなわち、心臓血管、内皮又は血管形成薬又は血管形成抑制薬、好ましくは血管形成又は血管形成抑制薬を含有する。好ましくは組成物は無菌である。PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストは、液状の製薬調製物の形態で投与してもよく、貯蔵時の安定性の延長が達成されるように保存されてよい。保存された液状の製薬調製物は複数投与量のPROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを含有していてもよく、よって繰り返し使用に適している。
さらなる実施態様において、本発明は、製薬的に許容される担体と、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストとの混合物を含有する、心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療に有用なこのような組成物の調製方法を提供する。
さらなる実施態様において、本発明は製薬的に許容される担体と、治療的有効量の抗-PRO抗体との混合物を含有する、心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療に有用なこのような組成物の調製方法を提供する。
(a)治療的有効量のPROポリペプチドを含有する物質の組成物;
(b)該組成物を収容する容器;及び
(c)心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療における該PROポリペプチドの使用を記した、該容器に添付されるラベル又は当該容器に収納される包装挿入物を具備する製造品を提供し、前記アゴニスト又はアンタゴニストはPROポリペプチドに結合する抗体であってよい。当該組成物は、治療的有効量のPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストを含んでいてよい。
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ;そして
(b)前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、前記細胞性反応の誘発が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
他の実施態様において、本発明は、PROポリペプチドのアゴニストを同定する方法を提供し、それは:
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下で接触させ;そして
(b)前記細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定することを含んでなり、当該細胞増殖の刺激が前記試験化合物が有効なアゴニストであることを示す。
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドの存在したで、PROポリペプチドによって通常誘発される細胞性反応の誘発に適した条件下で接触させ;そして
(b)前記細胞性反応の誘発を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定する工程を含む。
他の好ましい態様においては、この方法は:
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とを、PROポリペプチドの存在下で、PROポリペプチドによる細胞増殖の刺激に適した条件下で接触させ;そして
(b)前記細胞の増殖を測定して、試験化合物が有効なアゴニストであるか否かを決定する工程を含む。
(a)細胞とスクリーニングすべき試験化合物とをPROポリペプチドを発現させるのに適した条件下で接触させ;そして
(b)前記ポリペプチドの発現の阻害を測定する工程を含む。
またさらなる実施態様では、本発明は、前掲の方法により同定された化合物等の、PROポリペプチドの発現を阻害する化合物を提供する。
PROポリペプチドの一又は複数の機能又は活性を阻害するPROポリペプチドのアンタゴニストの一種は抗体である。よって、他の態様では、本発明はPROポリペプチドに結合する単離された抗体を提供する。好ましい態様において、抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは非ヒト相補性決定領域(CDR)残基及びヒトフレームワーク領域(FR)残基を有する。抗体は標識されていても固体支持体上に固定化されていてもよい。さらなる態様では、抗体は抗体断片、一本鎖抗体、又はヒト化抗体である。好ましくは、抗体はポリペプチドに特異的に結合する。
またさらなる態様において、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を診断する方法を提供し、それは、前記哺乳動物から得た組織細胞の試験試料におけるポリペプチドの有無を検出することを含んでなり、前記試験試料における前記ポリペプチドの有無が前記哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患の存在を示す。
他の実施態様では、本発明は、試料中のPROポリペプチドの存在を測定する方法を提供し、それは、PROポリペプチドを含有すると推測される試料を抗-PRO抗体と接触させ、前記抗体の前記試料の成分への結合を測定することを含んでなる。特別な態様では、当該試料はPROポリペプチドを含むと推定される細胞を含み、抗体は細胞に結合する。抗体は、好ましくは検出可能に標識され及び/又は固体支持体に固定化される。
さらに他の実施態様では、本発明は、哺乳動物における心臓血管、内皮又は血管形成疾患を治療する方法を提供し、それは、PROポリペプチドの有効量を当該哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、疾患は心臓肥大、創傷又は火傷などの外傷、又は癌の一型である。さらなる態様では、心臓血管、内皮又は血管形成疾患が癌の一型であるならば、哺乳動物は、血管形成術、又は心臓血管、内皮又は血管形成疾患を治療するための薬剤、例えばACEインヒビター、又は化学治療薬にさらに暴露される。好ましくは哺乳動物はヒト、好ましくは心臓肥大を起こす危険性のあるヒト、より好ましくは心筋梗塞を罹患しているヒトである。
他の好ましい態様において、心臓肥大は、PGF2α’レベルの上昇が存在することにより特徴付けられる。あるいは、心臓肥大は心筋梗塞により誘発され、ここで、好ましくはPROポリペプチドの投与は、心筋梗塞に続いて48時間、好ましくは24時間以内に開始される。
他の好ましい態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大であり、PROポリペプチドは急性心筋梗塞の治療のための一次血管形成術に続いて投与され、ここで好ましくは、当該哺乳動物は血管形成術又は心臓血管、内皮又は血管形成薬にさらに暴露される。
他の好ましい実施態様において、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は癌であり、PROポリペプチドは化学治療薬、成長阻害薬又は細胞毒性薬と組合せて投与される。
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法に関し、それは、PROポリペプチドのアンタゴニストの有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大、外傷、癌、又は加齢性黄斑変性である。また好ましくは哺乳動物はヒトであり、有効量の血管形成又は血管形成抑制薬はアンタゴニストと共に投与される。
さらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓血管、内皮又は血管形成疾患の治療方法に関し、それは、抗-PRO抗体の有効量を哺乳動物に投与することを含んでなる。好ましくは、心臓血管、内皮又は血管形成疾患は心臓肥大、外傷、癌、又は加齢性黄斑変性である。また好ましくは哺乳動物はヒトであり、有効量の血管形成又は血管形成抑制薬は抗体と共に投与される。
また、他の態様において、本発明は、プロモータ、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターを含有する組換えレトロウイルス粒子を提供し、ここでレトロウイルスベクターはレトロウイルス構造タンパク質を付随している。好ましくは、シグナル配列は哺乳動物、例えば天然PROポリペプチドからのものである。
また、さらなる実施態様において、本発明は、レトロウイルス構造タンパク質を発現する核酸構造体を含有し、プロモータ、(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニストポリペプチド、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストポリペプチドをコードする核酸分子、及びポリペプチドの細胞分泌のためのシグナル配列から本質的になるレトロウイルスベクターをさらに含有するエキソビボ産生細胞(producer cell)を提供し、ここで当該産生細胞は、組換えレトロウイルス粒子を生産させる構造タンパク質を付随するレトロウイルスベクターを包含する。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の内皮細胞の成長を刺激する方法を提供し、それは(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、当該哺乳動物の内皮細胞の成長が刺激され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
また他の実施態様において、本発明は、哺乳動物の心臓肥大を阻害する方法を提供し、それは(a)PROポリペプチド、(b)PROポリペプチドのアゴニスト、又は(c)PROポリペプチドのアンタゴニストを哺乳動物に投与することを含んでなり、前記哺乳動物の心臓肥大が阻害され、前記アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体であってよい。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、心臓肥大は心筋梗塞によって誘発されたものである。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてPROポリペプチドにより誘発される血管形成を阻害する方法を提供し、それは、当該哺乳動物に治療的有効量の抗-PRO抗体を投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物は鬱血性心不全を罹患したヒトである。
また他の実施態様では、本発明は、哺乳動物においてPROポリペプチドにより誘発される血管形成を刺激する方法を提供し、それは、当該哺乳動物に治療的有効量の抗-PRO抗体を投与することを含んでなる。好ましくは、哺乳動物はヒトであり、より好ましくは血管形成は組織再生又は外傷治癒を促進する。
本発明の他の態様において、本発明はPROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を含む単離された核酸分子を提供する。
一態様では、単離された核酸分子は、(a)ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つPROポリペプチドをコードするDNA分子、又は(b)(a)のDNA分子の相補鎖に対して少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約82%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約83%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約84%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約86%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約87%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約88%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約89%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約91%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約92%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約93%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約94%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約96%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約97%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約98%の配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を有するヌクレオチド配列を含む。
或る態様では、本発明は、ここに開示する全長アミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチドを欠くアミノ酸配列、ここに開示するシグナルペプチド有又は無の膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、又はここに開示する全長アミノ酸配列の特に同定された他の断片を持つPROポリペプチドに対して少なくとも約80%の配列同一性、好ましくは少なくとも約81%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約82%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約83%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約84%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約85%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約86%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約87%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約88%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約89%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約90%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約91%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約92%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約93%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約94%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約95%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約96%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約97%の配列同一性、より好ましくは少なくとも約98%の配列同一性、そして、より好ましくは少なくとも約99%の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む単離されたPROポリペプチドに関する。
本発明の他の態様は、膜貫通ドメインの欠失した又は膜貫通ドメインが不活性化された、単離されたPROポリペプチドを提供する。それらを製造する方法もここに記載され、それらの方法は、適当なコード化核酸分子を含むベクターを含む宿主細胞をPROポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、培養培地からPROポリペプチドを回収することを含む。
さらに他の実施態様では、本発明は、ここで同定される天然PROポリペプチドのアゴニスト及びアンタゴニストに関する。特別な実施態様では、アゴニスト又はアンタゴニストは抗-PRO抗体又は小分子である。
さらなる実施態様では、本発明は、PROポリペプチドのアゴニスト又はアンタゴニストを同定する方法に関し、それは、PROポリペプチドを候補分子と接触させ、前記PROポリペプチドによって媒介される生物学的活性を監視することを含む。好ましくは、PROポリペプチドは天然PROポリペプチドである。
本発明の他の実施態様は、PROポリペプチド、又は上記したようなそのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体の、PROポリペプチド、そのアゴニスト又はアンタゴニスト又は抗-PRO抗体に起因する状態の治療において有用な医薬の調製のための使用に向けられる。
本発明のさらなる実施態様では、本発明は、ここに記載するポリペプチドの任意のものをコードするDNAを含むベクターを提供する。そのようなベクターの任意のものを含む宿主細胞も提供される。例として、宿主細胞はCHO細胞、大腸菌、又はバキュウロウイルス感染昆虫細胞であってよい。ここに記載する任意のポリペプチドの製造方法がさらに提供され、それは、宿主細胞を所望のポリペプチドの発現に適した条件下で培養し、細胞培地から所望のポリペプチドを回収することを含む。
他の実施態様では、本発明は、上記又は下記のポリペプチドの任意のものに特異的に結合する抗体を提供する。場合によっては、抗体はモノクローナル抗体、ヒト化抗体、抗体断片又は一本鎖抗体である。
さらに他の実施態様では、本発明は、ゲノム及びcDNAヌクレオチド配列又はアンチセンスプローブの単離に有用なオリゴヌクレオチドプローブを提供し、それらのプローブは上記又は下記のヌクレオチド配列の任意のものから誘導されうる。
(発明の詳細な説明)
「心臓血管、内皮及び血管形成疾患」、「心臓血管、内皮及び血管形成機能不全」、「心臓血管、内皮又は血管形成疾患」及び「心臓血管、内皮又は血管形成機能不全」という用語は相互交換可能に使用され、並びに血管、例えば動脈、毛細管、静脈、及び/又はリンパ管それ自体の病気の一部を称する。これには、血管形成及び/又は心臓血管新生を刺激する徴候、及び血管形成及び/又は心臓血管新生を阻害する徴候が含まれている。このような疾患には、例えば動脈の病気、例えばアテローム性動脈硬化、高血圧、炎症性脈管炎、レーノー病及びレーノー現象、動脈瘤、及び動脈再狭窄;静脈及びリンパ管の疾患、例えば血栓静脈炎、リンパ管炎、及びリンパ浮腫;及び他の血管疾患、例えば末梢血管病、癌、例えば血管腫瘍、例えば血管腫(毛細管及び海綿状)、グロムス腫瘍、毛細管拡張症、細菌性血管腫症、血管内皮腫、血管肉腫、血管外皮細胞腫、カポジ肉腫、リンパ管腫、及びリンパ管肉腫、腫瘍血管形成、外傷、例えば傷、火傷、及び他に損傷を被った組織、移植固定、瘢痕化、虚血再潅流傷害、慢性関節リュウマチ、脳血管の病気、腎臓病、例えば急性腎不全、及び骨粗鬆症が含まれる。また、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、心臓肥大、及び心不全、例えばCHFも含まれる。
「鬱血性心不全」(CHF)は、末梢組織まで酸素化された血液を送達させるために、十分な心拍出量(経時的に心臓により押し出される血液量)を供給することのできない心臓の進行性の病状である。 CHFが進行すると、構造的及び血行力学的ダメージが生じる。これらのダメージは色々と現れ、一つの特徴的徴候は心室肥大である。CHFは多くの心疾患の共通した終末結果である。
「心臓弁逆流」は心臓弁の疾患の結果による心臓病の結果として生じる。リュウマチ熱のような種々の病気は、弁オリフィスの収縮又は引っ張りを引き起こすものであるが、他の病気は、心内膜炎、心内膜又は心房オリフィスの内側の膜の炎症、及び心臓の手術になる。欠損、例えば弁狭窄又は弁の欠損近接により、心臓腔における血液の蓄積、又は弁を通過しての血液の逆流が生じる。弁狭窄又は不全を長期間治癒しないと、心臓肥大や心筋に関連したダメージを被る結果となり、最終的には弁の交換が必要となる。
これら全て、及び心臓肥大が付随してもしなくてもよい他の心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療が本発明に含まれる。
「化学治療薬」は、癌の治療に有用な化学化合物である。化学治療薬の例には、アルキル化剤、葉酸アンタゴニスト、核酸代謝の代謝産物、抗生物質、ピリミジン類似物、5-フルオロウラシル、シスプラチン、プリンヌクレオシド、アミン類、アミノ酸、トリアゾールヌクレオシド、又はコルチコステロイド類が含まれる。特定の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、5-フルオロウラシル、シトシンアラビノシド(「Ara-C」)、シクロホスファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、トキソテア、メトトレキセート、シスプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イフォスファミド、マイトマイシンC、ミトキサントン、ビンクリスチン、ビノレルビン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン、ダクチノマイシン、マイトマイシン、エスペラマイシン(米国特許第4,675,187号参照)、メルファラン及び関連するナイトロジェンマスタードを含む。また、タモキシフェン及びオナプリストン等の腫瘍に対するホルモン作用を調節又は阻害するように機能するホルモン薬もこの定義に含まれる。
「慢性」投与とは、急性様式とは異なり連続的な様式での薬剤を投与し、初期の治療効果、例えば抗肥大効果を長時間に渡って維持することを称する。
治療の目的のための「哺乳動物」は、ヒト、家庭及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなどを含む哺乳類に分類される任意の動物を称する。好ましくは、哺乳動物はヒトである。
一又は複数のさらなる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び任意の順序での連続した投与を含む。
「血管形成抑制薬」は血管形成又は管形成を阻害、又は癌細胞の成長を阻害又は防止する活性剤である。例には、上述した血管形成剤の抗体又は他のアンタゴニスト、例えばVEGFに対する抗体が含まれる。さらに、細胞治療薬、例えば細胞毒性薬、化学治療薬、成長阻害、アポトーシス薬、及び癌を治療する他の薬剤、例えば抗-HER-2、抗-CD20、及び生物活性及び有機化学薬が含まれる。
ここで使用される場合、活性剤、例えばPROポリペプチド、又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト、又は抗-PRO抗体の「有効量」とは記載した目的の実行に有効な量を称するものであり、このような量は、所望する効果に応じて経験的に決定することができる。
「天然配列PROポリペプチド」は、天然由来の対応するPROポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでいる。このような天然配列PROポリペプチドは、自然から単離することもできるし、組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列PROポリペプチド」という用語には、特に、特定のPROポリペプチドの自然に生じる切断又は分泌形態(例えば、細胞外ドメイン配列)、自然に生じる変異形態(例えば、選択的にスプライシングされた形態)及びそのポリペプチドの自然に生じる対立遺伝子変異体が含まれる。本発明の種々の実施態様において、ここに開示される天然配列PROポリペプチドは、添付の図面に示される全長アミノ酸配列を含む成熟又は全長天然配列ポリペプチドである。開始及び停止コドンは、図において太字及び下線で示した。しかし、添付の図面に開示したPROポリペプチドは、図面におけるアミノ酸1としてここに命名されるメチオニン残基で始まるように示されているが、図面におけるアミノ酸位置1の上流又は下流に位置する他のメチオニン残基をPROポリペプチドの開始アミノ酸残基として用いることも考えられるし可能でもある。
さらに、表2A-2Dは、ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いた%アミノ酸配列同一性(表2A-2B)及び%核酸配列同一性(表2C-2D)を決定するために下記の方法を使用する仮説的な例を示し、「PRO」は対象とする仮説的PROポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「比較タンパク質」は対象とする「PRO」ポリペプチドが比較されるポリペプチドのアミノ酸配列を示し、「PRO-DNA」は対象とする仮説的PRO-コード化核酸配列を示し、「比較DNA」は対象とする「PRO-DNA」核酸分子が比較される核酸分子のヌクレオチド配列を示し、「X」、「Y」及び「Z」は各々異なる仮説的アミノ酸残基を示し、「N」、「L」及び「V」は各々異なる仮説的ヌクレオチドを示す。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%アミノ酸配列同一性の計算の例として、表2A-Bは、「比較タンパク質」と称されるアミノ酸配列の「PRO」と称されるアミノ酸配列に対する%アミノ酸配列同一性の計算方法を示す。
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のA及びBのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%アミノ酸配列同一性は、BのAに対する%アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、%アミノ酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。ここでの目的のために、%アミノ酸配列同一性値は、(a)天然PROポリペプチドから誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列と、対象とする比較アミノ酸配列(即ち、対象とするPROポリペプチドが比較されるPROポリペプチド変異体であってもよい配列)との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一アミノ酸残基の数を、(b)対象とするPROポリペプチドの残基の総数で除した商によって決定される。例えば、「アミノ酸配列Bに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っているアミノ酸配列Aを含んでなるポリペプチド」という表現では、アミノ酸配列Aが対象とする比較アミノ酸配列であり、アミノ酸配列Bが対象とするPROポリペプチドのアミノ酸配列である。
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムALIGN-2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。この方法を用いた%核酸配列同一性の計算の例として、表2C-Dは、「比較DNA」と称される核酸配列の「PRO-DNA」と称される核酸配列に対する%核酸配列同一性の計算方法を示す。
特に断らない限りは、ここでの全ての%核酸配列同一性値は上記のようにALIGN-2配列比較コンピュータプログラムを用いて得られる。しかしながら、%核酸配列同一性は、配列比較プログラムNCBI-BLAST2(Altschul等, Nucleic Acids Res. 25: 3389-3402 (1997))を用いて決定してもよい。NCBI-BLAST2配列比較プログラムは、http://ww.ncbi.nlm.nih.govからダウンロードできる。NCBI-BLAST2は幾つかの検索パラメータを使用し、それら検索パラメータの全ては初期値に設定され、例えば、unmask=可、鎖=全て、予測される発生=10、最小低複合長=15/5、マルチパスe-値=0.01、マルチパスの定数=25、最終ギャップアラインメントのドロップオフ=25、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62を含む。
分率W/Zの100倍
ここで、Wは配列アラインメントプログラムNCBI-BLAST2のC及びDのアラインメントによって同一であると一致したスコアのヌクレオチドの数であり、ZはDの全ヌクレオチド数である。核酸配列Cの長さが核酸配列Dの長さと異なる場合、CのDに対する%核酸配列同一性は、DのCに対する%核酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。
さらに、%核酸配列同一性値は、WU-BLAST-2コンピュータプログラム(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて決定してもよい。殆どのWU-BLAST-2検索パラメータは初期値に設定される。初期値に設定されない、即ち調節可能なパラメータは以下の値に設定する:オーバーラップスパン=1、オーバーラップフラクション=0.125、ワード閾値(T)=11、及びスコアリングマトリクス=BLOSUM62。ここでの目的のために、%核酸配列同一性値は、(a)天然配列PROポリペプチドコード化核酸から誘導された配列を有する対象とするPROポリペプチドコード化配列の核酸配列と、対象とする比較核酸分子(即ち、対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の配列が比較される変異体ポリヌクレオチドであってもよい配列)との間の、WU-BLAST-2によって決定した一致する同一ヌクレオチドの数を、(b)対象とするPROポリペプチドコード化核酸のヌクレオチドの総数で除した商によって決定される。例えば、「核酸配列Bに対して少なくとも80%のアミノ酸配列同一性を持つ又は持っている核酸配列Aを含んでなる単離された核酸分子」という表現では、核酸配列Aが対象とする比較核酸配列であり、核酸配列Bが対象とするPROポリペプチドコード化核酸分子の核酸配列である。
ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Aの、与えられたアミノ酸配列Bとの、又はそれに対する%ポジティブ値(あるいは、与えられたアミノ酸配列Bと、又はそれに対して或る程度の%ポジティブを持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Aと言うこともできる)は次のように計算される:
分率X/Yの100倍
ここで、Xは配列アラインメントプログラムALIGN-2のA及びBのアラインメントによってポジティブであるとのスコアのアミノ酸残基の数であり、YはBの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Aの長さがアミノ酸配列Bの長さと異なる場合、AのBに対する%ポジティブは、BのAに対する%ポジティブとは異なることは理解されるであろう。
PROポリペプチドをコードする「単離された」核酸分子、又は抗-PRO抗体をコードする「単離された」核酸分子は、同定され、PRO-コード化核酸の天然源、又は抗-PRO-コード化核酸の天然源に通常付随している少なくとも1つの汚染核酸分子から分離された核酸分子である。好ましくは、単離された核酸分子は、自然に結合する全ての汚染物質と結合していない。単離されたPRO-コード化核酸分子又は単離された抗-PRO-コード化核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。ゆえに、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在するPRO-コード化核酸分子又は抗-PRO-コード化核酸分子とは区別される。しかし、PROポリペプチドをコードする単離された核酸分子、又は抗-PRO抗体をコードする単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然細胞のものとは異なった染色体位置にあるPROポリペプチド又は抗-PRO抗体を通常は発現する細胞に含まれるPRO-核酸分子、又は抗-PRO-核酸分子を含む。
核酸は、他の核酸配列と機能的な関係にあるときに「作用可能に結合し」ている。例えば、プレ配列あるいは分泌リーダーのDNAは、ポリペプチドの分泌に参画するプレタンパク質として発現されているなら、そのPROポリペプチドのDNAに作用可能に結合している;プロモーター又はエンハンサーは、配列の転写に影響を及ぼすならば、コード配列に作用可能に結合している;又はリボソーム結合部位は、もしそれが翻訳を容易にするような位置にあるなら、コード配列と作用可能に結合している。一般的に、「作用可能に結合している」とは、結合したDNA配列が近接しており、分泌リーダーの場合には近接していて読みフェーズにあることを意味する。しかし、エンハンサーは必ずしも近接している必要はない。結合は簡便な制限部位でのライゲーションにより達成される。そのような部位が存在しない場合は、従来の手法に従って、合成オリゴヌクレオチドアダプターあるいはリンカーが使用される。
ここで定義される「ストリンジェントな条件」又は「高度にストリンジェントな条件」は、(1)洗浄のために低イオン強度及び高温度、例えば、50℃において0.015Mの塩化ナトリウム/0.0015Mのクエン酸ナトリウム/0.1%のドデシル硫酸ナトリウムを用いるもの;(2)ハイブリダイゼーション中にホルムアミド等の変性剤、例えば、42℃において50%(v/v)ホルムアミドと0.1%ウシ血清アルブミン/0.1%フィコール/0.1%のポリビニルピロリドン/50mMのpH6.5のリン酸ナトリウムバッファー、及び750mMの塩化ナトリウム、75mMクエン酸ナトリウムを用いるもの;(3)42℃における50%ホルムアミド、5xSSC(0.75MのNaCl、0.075Mのクエン酸ナトリウム)、50mMのリン酸ナトリウム(pH6.8)、0.1%のピロリン酸ナトリウム、5xデンハード液、超音波処理サケ精子DNA(50μg/ml)、0.1%SDS、及び10%のデキストラン硫酸と、42℃における0.2xSSC(塩化ナトリウム/クエン酸ナトリウム)中の洗浄及び55℃での50%ホルムアミド、次いで55℃におけるEDTAを含む0.1xSSCからなる高度にストリンジェントな洗浄を用いるものによって同定される。
「中程度のストリンジェントな条件」は、Sambrook等, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)に記載されているように同定され、上記のストリンジェンシーより低い洗浄溶液及びハイブリダイゼーション条件(例えば、温度、イオン強度及び%SDS)の使用を含む。中程度のストリンジェントな条件は、20%ホルムアミド、5xSSC(150mMのNaCl、15mMのクエン酸三ナトリウム)、50mMリン酸ナトリウム(pH7.6)、5xデンハード液、10%デキストラン硫酸、及び20mg/mlの変性剪断サケ精子DNAを含む溶液中の37℃での終夜インキュベーション、次いで1xSSC中37−50℃でのフィルターの洗浄といった条件である。当業者であれば、プローブ長などの因子に適合させる必要に応じて、どのようにして温度、イオン強度等を調節するかを認識するであろう。
PRO変異体における「活性な」及び「活性」とは、天然又は天然発生PROポリペプチドの生物学的及び/又は免疫学的活性を保持するPROタンパク質の形態を称する。
ここで開示されているスクリーニングアッセイにより同定可能なPROポリペプチドに拮抗する分子(例えば、有機又は無機小分子、ペプチド等)における「生物学的活性」とは、ここで同定されたPROポリペプチドに結合又は複合体化、又は他の細胞タンパク質とPROポリペプチドとの相互作用を干渉、又はPROポリペプチドの転写又は翻訳を阻害する分子の能力を称するときに使用される。特に好ましい生物学的活性には、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病、並びに動脈、毛細管、静脈及び/又はリンパ管の病気、及び癌に作用する心臓肥大活性が含まれる。
「小分子」とは、ここでは約500ダルトン以下の分子量を有するものと定義する。
ここで使用される場合の「PROポリペプチドレセプター」なる用語は、PROポリペプチドの細胞性レセプター、通常は血管内皮細胞に見出される細胞表面レセプター、並びにPROポリペプチドに結合する能力を保持しているそれらの変異体を称する。
「天然抗体」及び「天然免疫グロブリン」は、通常、2つの同一の軽(L)鎖及び2つの同一の重(H)鎖からなる、約150000ダルトンのヘテロ四量体糖タンパク質である。各軽鎖は一つの共有ジスルフィド結合により重鎖に結合しており、ジスルフィド結合の数は、異なった免疫グロブリンアイソタイプの重鎖の中で変化する。また各重鎖と軽鎖は、規則的に離間した鎖間ジスルフィド結合を有している。各重鎖は、多くの定常ドメインが続く可変ドメイン(VH)を一端に有する。各軽鎖は、一端に可変ドメイン(VL)を、他端に定常ドメインを有し;軽鎖の定常ドメインは重鎖の第一定常ドメインと整列し、軽鎖の可変ドメインは重鎖の可変ドメインと整列している。特定のアミノ酸残基が、軽鎖及び重鎖可変ドメイン間の界面を形成すると考えられている。
抗体のパパイン消化により、各々が単一の抗原結合部位を有する「Fab」断片と呼ばれる2つの同一の抗原結合断片と、その名称が容易に結晶化する能力を表す、残りの「Fc」断片が産生される。ペプシン処理により、2つの抗原結合部位を有し、更に抗原を架橋させ得るF(ab')2断片が得られる。
「Fv」は、完全な抗原認識及び抗原結合部位を含む最小抗体断片である。この領域は、堅固な非共有結合をなした一つの重鎖及び一つの軽鎖可変ドメインの二量体からなる。この配置において、各可変ドメインの3つのCDRは相互に作用してVH-VL二量体表面に抗原結合部位を形成する。集合的に、6つのCDRが抗体に抗原結合特異性を付与する。しかし、単一の可変ドメイン(又は抗原に対して特異的な3つのCDRのみを含むFvの半分)でさえ、全結合部位よりも親和性が低くなるが、抗原を認識して結合する能力を有している。
任意の脊椎動物種からの抗体(免疫グロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる2つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に応じて、免疫グロブリンは異なるクラスに割り当てることができる。免疫グロブリンには5つの主たるクラス:IgA、IgD、IgE、IgG及びIgMがあり、それらのいくつかは更にサブクラス(アイソタイプ)、例えばIgG1、IgG2、IgG3及びIgG4、IgA及びIgA2に分割される。異なるクラスの免疫グロブリンに対応する重鎖定常ドメインは、それぞれα、σ、ε、γ及びμと呼ばれる。異なるクラスの免疫グロブリンのサブユニット構造及び3次元構造はよく知られている。
ここで、モノクローナル抗体は、重鎖及び/又は軽鎖の一部が特定の種由来の抗体あるいは特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同であり、鎖の残りの部分が他の種由来の抗体あるいは他の抗体クラスあるいはサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一であるか相同である「キメラ」抗体(免疫グロブリン)、並びにそれが所望の生物的活性を有する限りそれら抗体の断片を特に含む(米国特許第4,816,567号; Morrisonほか, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855[1984])。
「ダイアボディー」という用語は、2つの抗原結合部位を有する小さな抗体断片を意味するもので、断片は軽鎖可変ドメイン(VL)に結合した重鎖可変ドメイン(VH)を同じポリペプチド鎖(VH-VL)に含有する。同じ鎖上での二つのドメイン間の対合が許されないほど短いリンカーを使用することにより、ドメインが、他の鎖の相補的ドメインとの対合を強いられ、二つの抗原結合部位をつくりだす。ダイアボディーは、例えば、欧州特許第404,097号;国際公開93/11161号;及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)に更に詳しく記載されている。
「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定され分離及び/又は回収されたものである。その自然環境の汚染成分とは、その抗体の診断又は治療への使用を妨害する物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。好ましい実施態様において、抗体は、(1)ローリ法(Lowry method)で測定した場合95%を越える抗体、最も好ましくは99重量%を越えるまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも15残基のN末端あるいは内部アミノ酸配列を得るのに充分なほど、あるいは、(3)クーマシーブルーあるいは好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのSDS-PAGEによる均一性まで精製される。単離された抗体には、抗体の自然環境の少なくとも1つの成分が存在しないため、組換え細胞内のインサイツの抗体が含まれる。しかしながら、通常は、単離された抗体は少なくとも1つの精製工程により調製される。
「固相」とは、本発明の抗体がそれに付着することのできる非水性マトリクスを意味する。ここに含まれる固相の例は、部分的又は全体的に、ガラス(例えば、孔制御ガラス)、多糖類(例えばアガロース)、ポリアクリルアミド、ポリスチレン、ポリビニルアルコール及びシリコーンから形成されたものを含む。或る種の実施態様では、内容に応じて、固相はアッセイプレートのウェルを構成することができ;その他では精製カラム(例えばアフィニティクロマトグラフィーカラム)とすることもできる。また、この用語は、米国特許第4,275,149号に記載されたような、別個の粒子の不連続な固相も包含する。
ここで用いられる「イムノアドヘシン」なる用語は、異種タンパク質(「アドヘシン」)の結合特異性と免疫グロブリン定常ドメインのエフェクター機能とを結合した抗体様分子を指す。構造的には、イムノアドヘシンは、所望の結合特異性を持ち、抗体の抗原認識及び結合部位以外である(即ち「異種の」)アミノ酸配列と、免疫グロブリン定常ドメイン配列との融合物を含む。イムノアドヘシン分子のアドへシン部分は、典型的には少なくともレセプター又はリガンドの結合部位を含む隣接アミノ酸配列である。イムノアドヘシンの免疫グロブリン定常ドメイン配列は、IgG-1、IgG-2、IgG-3又はIgG-4サブタイプ、IgA(IgA-1及びIgA-2を含む)、IgE、IgD又はIgMなどの任意の免疫グロブリンから得ることができる。
A. PRO変異体
ここに記載した全長天然配列PROポリペプチドに加えて、PRO変異体も調製できると考えられる。PRO変異体は、PRODNAに適当なヌクレオチド変化を導入することにより、及び/又は所望のPROポリペプチドを合成することにより調製できる。当業者は、グリコシル化部位の数又は位置の変化あるいは膜固着特性の変化などのアミノ酸変化がPROポリペプチドの翻訳後プロセスを変えうることと評価されるであろう。
天然全長配列PROポリペプチド又はここに記載したPROポリペプチドの種々のドメインにおける変異は、例えば、米国特許第5,364,934号に記載されている保存的及び非保存的変異についての任意の技術及び指針を用いてなすことができる。変異は、結果として天然配列PROポリペプチドと比較してPROポリペプチドのアミノ酸配列が変化するPROポリペプチドをコードする一又は複数のコドンの置換、欠失又は挿入であってよい。場合によっては、変異は少なくとも1つのアミノ酸のPROポリペプチドの一又は複数のドメインの任意の他のアミノ酸による置換である。いずれのアミノ酸残基が所望の活性に悪影響を与えることなく挿入、置換又は欠失されるかの指針は、PROポリペプチドの配列を相同性の知られたタンパク質分子の配列と比較し、相同性の高い領域内でなされるアミノ酸配列変化を最小にすることによって見出される。アミノ酸置換は、一のアミノ酸の類似した構造及び/又は化学特性を持つ他のアミノ酸での置換、例えばロイシンのセリンでの置換、即ち保存的アミノ酸置換の結果とすることができる。挿入及び欠失は、場合によっては1から5のアミノ酸の範囲内とすることができる。許容される変異は、配列においてアミノ酸の挿入、欠失又は置換を系統的に作成し、得られた変異体を全長又は成熟天然配列により示される活性について試験することにより決定される。
(1)疎水性:ノルロイシン, met, ala, val, leu, ile;
(2)中性の親水性:cys, ser, thr;
(3)酸性:asp, glu;
(4)塩基性:asn, gln, his, lys, arg;
(5)鎖配向に影響する残基:gly, pro; 及び
(6)芳香族:trp, tyr, phe。
非保存的置換は、これらの分類の一つのメンバーを他の分類に交換することを必要とするであろう。また、そのように置換された残基は、保存的置換部位、好ましくは残された(非保存)部位に導入されうる。
また、隣接配列に沿って一又は複数のアミノ酸を同定するのにスキャンニングアミノ酸分析を用いることができる。好ましいスキャンニングアミノ酸は比較的小さく、中性のアミノ酸である。そのようなアミノ酸は、アラニン、グリシン、セリン、及びシステインを含む。アラニンは、ベータ炭素を越える側鎖を排除し変異体の主鎖構造を変化させにくいので、この群の中で典型的に好ましいスキャンニングアミノ酸である[Cunningham及びWells, Science, 244:1081-1085(1989)]。また、アラニンは最もありふれたアミノ酸であるため典型的には好ましい。さらに、それは埋もれた及び露出した位置の両方に見られることが多い[Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, J. Mol. Biol., 150: 1 (1976)]。アラニン置換が十分な量の変異体を生じない場合は、アイソテリック(isoteric)アミノ酸を用いることができる。
PROポリペプチドの共有結合的修飾は本発明の範囲内に含まれる。共有結合的修飾の一型は、PROポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を、PROポリペプチドの選択された側鎖又はN-又はC-末端残基と反応できる有機誘導体化試薬と反応させることである。二官能性試薬での誘導体化が、例えばPROポリペプチドを水不溶性支持体マトリクスあるいは抗-PRO抗体の精製方法又はその逆で用いるための表面に架橋させるのに有用である。通常用いられる架橋剤は、例えば、1,1-ビス(ジアゾアセチル)-2-フェニルエタン、グルタルアルデヒド、N-ヒドロキシスクシンイミドエステル、例えば4-アジドサリチル酸、3,3’-ジチオビス(スクシンイミジルプロピオネート)等のジスクシンイミジルエステルを含むホモ二官能性イミドエステル、ビス-N-マレイミド-1,8-オクタン等の二官能性マレイミド、及びメチル-3-[(p-アジドフェニル)-ジチオ]プロピオイミダート等の試薬を含む。
他の修飾は、グルタミニル及びアスパラギニル残基の各々対応するグルタミル及びアスパルチルへの脱アミノ化、プロリン及びリシンのヒドロキシル化、セリル又はトレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リシン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化[T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp.79-86 (1983)]、N-末端アミンのアセチル化、及び任意のC-末端カルボキシル基のアミド化を含む。
PROポリペプチドへのグリコシル化部位の付加はアミノ酸配列の変更を伴ってもよい。この変更は、例えば、一又は複数のセリン又はトレオニン残基の天然配列PROポリペプチド(O-結合グリコシル化部位)への付加、又は置換によってなされてもよい。PROアミノ酸配列は、場合によっては、DNAレベルでの変化、特に、PROポリペプチドをコードするDNAを予め選択された塩基において変異させ、所望のアミノ酸に翻訳されるコドンを生成させることを通して変更されてもよい。
PROポリペプチド上に存在する炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的に、あるいはグルコシル化の標的として提示されたアミノ酸残基をコードするコドンの変異的置換によってなすことができる。化学的脱グリコシル化技術は、この分野で知られており、例えば、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。ポリペプチド上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成される。
PROポリペプチドの共有結合的修飾の他の型は、PROポリペプチドの、種々の非タンパク質様ポリマー、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンの一つへの、米国特許第4,640,835号;第4,496,689号;第4,301,144号;第4,670,417号;第4,791,192号又は第4,179,337号に記載された方法での結合を含む。
一実施態様では、このようなキメラ分子は、抗-タグ抗体が選択的に結合できるエピトープを提供するタグポリペプチドとPROポリペプチドとの融合を含む。エピトープタグは、一般的にはPROのアミノ-又はカルボキシル-末端に位置する。このようなPROポリペプチドのエピトープタグ形態の存在は、タグポリペプチドに対する抗体を用いて検出することができる。また、エピトープタグの提供は、抗-タグ抗体又はエピトープタグに結合する他の型の親和性マトリクスを用いたアフィニティ精製によってPROポリペプチドを容易に精製できるようにする。種々のタグポリペプチド及びそれら各々の抗体はこの分野で良く知られている。例としては、ポリ-ヒスチジン(poly-his)又はポリ-ヒスチジン-グリシン(poly-his-gly)タグ;flu HAタグポリペプチド及びその抗体12CA5[Field等, Mol. Cell. Biol., 8:2159-2165 (1988)];c-mycタグ及びそれに対する8F9、3C7、6E10、G4、B7及び9E10抗体[Evan等, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)];及び単純ヘルペスウイルス糖タンパク質D(gD)タグ及びその抗体[Paborsky等, Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)]を含む。他のタグポリペプチドは、フラッグペプチド[Hopp等, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)];KT3エピトープペプチド[Martin等, Science, 255:192-194 (1992)];α-チューブリンエピトープペプチド[Skinner等, J. Biol. Chem., 266:15163-15166 (1991)];及びT7遺伝子10タンパク質ペプチドタグ[Lutz-Freyermuth等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6393-6397 (1990)]を含む。
これに換わる実施態様では、キメラ分子はPROと免疫グロブリン又は免疫グロブリンの特定領域との融合体を含んでもよい。キメラ分子の二価形態(「イムノアドヘシン」とも呼ばれる)については、そのような融合体はIgG分子のFc領域であり得る。Ig融合体は、好ましくはIg分子内の少なくとも1つの可変領域に換えてPROポリペプチドの可溶化(膜貫通ドメイン欠失又は不活性化)形態を含む。特に好ましい実施態様では、免疫グロブリン融合体は、IgG1分子のヒンジ、CH2及びCH3、又はヒンジ、CH1、CH2及びCH3領域を含む。免疫グロブリン融合体の製造については、1995年6月27日発行の米国特許第5,428,130号を参照のこと。
本発明は、本出願においてPROと称される、新規に同定及び単離されたポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を提供するものである。特に、PROポリペプチドをコードするcDNAは、以下の実施例にさらに詳細に開示するようにして、同定され単離された。別々の発現ラウンドで産生されるタンパク質は異なるPRO番号が付与されるが、UNQ番号は任意の与えられたDNA及びコード化タンパク質に独特であり変わることはない。しかしながら、簡単にする目的で、本明細書においては、DNA35916-1161、DNA23339-1130、DNA16451-1388、DNA27865-1091、DNA27864-1155、DNA28497-1130、DNA26847-1395、DNA30942-1134、DNA32286-1191、DNA33094-1131、DNA33221-1133、DNA34434-1139、DNA35558-1167、DNA35638-1141、DNA33473-1176、DNA38260-1180、DNA39969-1185、DNA40628-1216、DNA35595-1228、DNA40981-1234、DNA47470-1130-P1、DNA47365-1206、DNA44184-1319、DNA48613-1268、DNA29101-1122、DNA49646-1327、DNA49829-1346、DNA56405-1357、DNA56352-1358、DNA59205-1421、DNA53974-1401、DNA57689-1385、DNA60615-1483、DNA59814-1486、DNA59846-1503、DNA64883-1526、DNA64885-1529、DNA64889-1541、DNA64903-1553、DNA64905-1558、DNA65409-1566、DNA65406-1567、DNA61873-1573、DNA64966-1575、DNA67300-1605、DNA68872-1620、DNA76538-1670、又はDNA33087にコードされるタンパク質、並びにさらなる天然相同体、及びPROの先の定義に含まれる変異体は、由来又は調製方法とは無関係に、各々「PRO」と称される。
以下の説明は、主として、PROポリペプチドをコードする核酸を含むベクターで形質転換又は形質移入された細胞を培養することによりPROポリペプチドを生産する方法に関する。もちろん、当該分野においてよく知られている他の方法を用いてPROを調製することができると考えられる。例えば、PROポリペプチド配列、又はその一部は、固相技術を用いた直接ペプチド合成によって生産してもよい。例えば、Stewart等, Solid-Phase Peptide Synthesis,(W.H. Freeman Co., San Francisco, CA 1969);Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85:2149-2154 (1963)参照。手動技術又は自動によるインビトロタンパク質合成を行ってもよい。自動合成は、例えば、アプライド・バイオシステムズ・ペプチド合成機(Foster City, CA)を用いて、製造者の指示により実施してもよい。PROポリペプチドの種々の部分は、別々に化学的に合成され、化学的又は酵素的方法を用いて結合させて全長PROポリペプチドを生産してもよい。
PROポリペプチドをコードするDNAは、PROポリペプチドをコードするmRNAを保有していてそれを検出可能なレベルで発現すると考えられる組織から調製されたcDNAライブラリから得ることができる。従って、ヒトPROポリペプチドをコードするDNAは、実施例に記載されるように、ヒトの組織から調製されたcDNAライブラリから簡便に得ることができる。またPROポリペプチドをコードする遺伝子は、ゲノムライブラリから又はオリゴヌクレオチド合成により得ることもできる。
ライブラリは、対象となる遺伝子あるいはそれによりコードされるタンパク質を同定するために設計されたプローブ(PROポリペプチドに対する抗体又は少なくとも約20−80塩基のオリゴヌクレオチド等)によってスクリーニングできる。選択されたプローブによるcDNA又はゲノムライブラリのスクリーニングは、例えばSambrook等, 上掲に記載されている標準的な手順を使用して実施することができる。所望のPROをコードする遺伝子を単離する他の方法はPCR法を使用するものである。Sambrook等, 上掲;Dieffenbach等, PCR Primer:A Laboratory Manual(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)。
このようなライブラリースクリーニング法において同定された配列は、Genbank等の公共データベース又は個人の配列データベースに寄託され公衆に利用可能とされている周知の配列と比較及びアラインメントすることができる。分子の決定された領域内又は全長配列に渡っての(アミノ酸又は核酸レベルのいずれかでの)配列同一性は、相同性を測定する種々のアルゴリズムを使用する、コンピュータソフトウエアプログラム、例えばALIGN、DNAstar及びINHERITにより決定することができる。
タンパク質コード化配列を有する核酸は、初めてここで開示された推定アミノ酸配列を使用し、また必要ならば、cDNAに逆転写されなかったmRNAの生成中間体及び先駆物質を検出する上掲のSambrook等に記述されているような従来のプライマー伸展法を使用し、選択されたcDNA又はゲノムライブラリをスクリーニングすることにより得られる。
宿主細胞を、ここに記載したPROポリペプチド生産のための発現又はクローニングベクターで形質移入又は形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードする遺伝子を増幅するために適当に変性された常套的栄養培地で培養する。培養条件、例えば培地、温度、pH等々は、過度の実験をすることなく当業者が選ぶことができる。一般に、細胞培養の生産性を最大にするための原理、プロトコール、及び実用技術は、Mammalian Cell Biotechnology: A Practical Approach, M.Butler編 (IRL Press, 1991)及びSambrook等, 上掲に見出すことができる。
形質移入の方法、例えば、CaPO4処理及びエレクトロポレーションは当業者に知られている。用いられる宿主細胞に応じて、その細胞に対して適した標準的な方法を用いて形質転換はなされる。前掲のSambrook等に記載された塩化カルシウムを用いるカルシウム処理又はエレクトロポレーションは、原核生物又は実質的な細胞壁障壁を含む他の細胞に対して一般に用いられる。アグロバクテリウム・トゥメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)による感染が、Shaw等, Gene, 23: 315 (1983)及び1989年6月29日公開の国際特許出願第WO89/05859号に記載されたように、ある種の植物細胞の形質転換に用いられる。このような細胞壁のない哺乳動物の細胞に対しては、Graham及びvan der Eb, Virology, 52: 456-457 (1978)のリン酸カルシウム沈降法が用いられる。哺乳動物細胞の宿主系形質転換の一般的な態様は米国特許第4,399,216号に記載されている。酵母中への形質転換は、典型的には、Van solingen等, J. Bact., 130: 946 (1977)及びHsiao等, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76:3829 (1979)の方法に従って実施される。しかしながら、DNAを細胞中に導入する他の方法、例えば、核マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、無傷の細胞、又はポリカチオン、例えばポリブレン、ポリオルニチン等を用いる細菌プロトプラスト融合もまた用いることができる。哺乳動物細胞を形質転換するための種々の技術については、Keown等, Methods in Enzymology, 185: 527-537 (1990)及び Mansour等, Nature, 336: 348-352 (1988)を参照のこと。
グリコシル化PROポリペプチドをコードする核酸の発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例としては、ショウジョウバエS2及びスポドスペラSf9等の昆虫細胞並びに植物細胞が含まれる。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、チャイニーズハムスター卵巣(CHO)及びCOS細胞を含む。より詳細な例は、SV40によって形質転換されたサル腎臓CV1株 (COS-7, ATCC CRL 1651);ヒト胚腎臓株(293又は懸濁培養での増殖のためにサブクローン化された293細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36:59 (1977));チャイニーズハムスター卵巣細胞/-DHFR(CHO, Urlaub及びChasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980));マウスのセルトリ細胞(TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980));ヒト肺細胞 (W138, ATCC CCL 75); ヒト肝細胞 (Hep G2, HB 8065); 及びマウス乳房腫瘍細胞 (MMT 060562, ATTC CCL51)を含む。適切な宿主細胞の選択は、この分野の技術常識内にある。
PROポリペプチドをコードする核酸(例えば、cDNA又はゲノムDNA)は、クローニング(DNAの増幅)又は発現のために複製可能なベクター内に挿入される。様々なベクターが公的に入手可能である。ベクターは、例えば、プラスミド、コスミド、ウイルス粒子、又はファージの形態とすることができる。適切な核酸配列が、種々の手法によってベクターに挿入される。一般に、DNAはこの分野で周知の技術を用いて適当な制限エンドヌクレアーゼ部位に挿入される。ベクター成分としては、一般に、これらに制限されるものではないが、配列が分泌されるならば、一又は複数のシグナル配列、複製開始点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終結配列を含む。これらの成分の一又は複数を含む適当なベクターの作成には、当業者に知られた標準的なライゲーション技術を用いる。
PROポリペプチドは組換え手法によって直接的に産生されるだけではなく、シグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのN-末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ペプチドとしても生産される。一般に、シグナル配列はベクターの成分であるか、ベクターに挿入されるPROポリペプチドをコードするDNAの一部である。シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、lppあるいは熱安定性エンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列であってよい。酵母の分泌に関しては、シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、アルファ因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含み、後者は米国特許第5,010,182号に記載されている)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー(1990年4月4日発行のEP362179)、又は1990年11月15日に公開されたWO 90/13646に記載されているシグナルであり得る。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物シグナル配列は、同一あるいは関連ある種の分泌ポリペプチド由来のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダーのようなタンパク質の直接分泌に使用してもよい。
発現及びクローニングベクターは、典型的には、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含む。典型的な選択遺伝子は、(a)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(b)栄養要求性欠陥を補い、又は(c)例えばバシリに対する遺伝子コードD-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給するタンパク質をコードする。
哺乳動物細胞に適切な選択可能マーカーの例は、DHFRあるいはチミジンキナーゼのように、PROポリペプチドをコードする核酸を取り込むことのできる細胞成分を同定することのできるものである。野生型DHFRを用いた場合の好適な宿主細胞は、Urlaub 等により, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)に記載されているようにして調製され増殖されたDHFR活性に欠陥のあるCHO株化細胞である。酵母菌中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドYRp7に存在するtrp1遺伝子である。Stinchcomb等, Nature, 282:39(1979);Kingman等, Gene, 7:141(1979);Tschemper等, Gene, 10:157(1980)。trp1遺伝子は、例えば、ATCC番号44076あるいはPEP4-1のようなトリプトファン内で成長する能力を欠く酵母菌の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85:12 (1977)。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、3-ホスホグリセラートキナーゼ[Hitzeman 等, J. Biol. Chem., 255:2073 (1980)]又は他の糖分解酵素[Hess 等, J. Adv. Enzyme Reg., 7:149 (1968);Holland, Biochemistry, 17:4900(1987)]、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ、3-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。
他の酵母プロモーターとしては、成長条件によって転写が制御される付加的効果を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ2、イソチトクロムC、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母菌での発現に好適に用いられるベクターとプロモータはEP 73,657に更に記載されている。
より高等の真核生物による所望のPROポリペプチドをコードするDNAの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。エンハンサーは、通常は約10から300塩基対で、プロモーターに作用してその転写を増強するDNAのシス作動要素である。哺乳動物遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。しかしながら、典型的には、真核細胞ウィルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製起点の後期側のSV40エンハンサー(100−270塩基対)、サイトメガロウィルス初期プロモーターエンハンサー、複製起点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウィルスエンハンサーが含まれる。エンハンサーは、PROポリペプチドをコードする配列の5’又は3’位でベクター中にスプライシングされ得るが、好ましくはプロモーターから5’位に位置している。
また真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、転写の終結及びmRNAの安定化に必要な配列も含む。このような配列は、真核生物又はウィルスのDNA又はcDNAの通常は5’、時には3’の非翻訳領域から取得できる。これらの領域は、PROポリペプチドをコードするmRNAの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。
組換え脊椎動物細胞培養でのPROポリペプチドの合成に適応化するのに適切な他の方法、ベクター及び宿主細胞は、Gething等, Nature, 293:620-625 (1981); Mantei等, Nature, 281:40-46 (1979); EP 117,060; 及びEP 117,058に記載されている。
遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法[Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980)]、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって、直接的に試料中で測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA−RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。次いで、抗体を標識し、アッセイを実施することができ、ここで二本鎖は表面に結合しており、その結果二本鎖の表面での形成の時点でその二本鎖に結合した抗体の存在を検出することができる。
あるいは、遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば細胞又は組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPROポリペプチドをコードするDNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。
PROポリペプチドの形態は、培地又は宿主細胞の溶菌液から回収することができる。膜結合性であるならば、適切な洗浄液(例えばトリトン-XTM100)又は酵素的切断を用いて膜から引き離すことができる。PROポリペプチドの発現に用いられる細胞は、凍結融解サイクル、超音波処理、機械的破壊、又は細胞溶解剤などの種々の化学的又は物理的手段によって破壊することができる。
PROポリペプチドを、組換え細胞タンパク又はポリペプチドから精製することが望ましい。適切な精製手順の例である次の手順により精製される:すなわち、イオン交換カラムでの分画;エタノール沈殿;逆相HPLC;シリカ又はカチオン交換樹脂、例えばDEAEによるクロマトグラフィー;クロマトフォーカシング;SDS-PAGE;硫酸アンモニウム沈殿;例えばセファデックスG-75を用いるゲル濾過;IgGのような汚染物を除くプロテインAセファロースカラム;及びPROポリペプチドのエピトープタグ形態を結合させる金属キレート化カラムである。この分野で知られ、例えば、Deutcher, Methodes in Enzymology, 182 (1990);Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, (Springer-Verlag, New York 1982)に記載された多くのタンパク質精製方法を用いることができる。選ばれる精製過程は、例えば、用いられる生産方法及び特に生産される特定のPROの性質に依存する。
i.心臓血管、内皮及び血管形成活性のアッセイ
種々のアッセイがここで記載されたポリペプチドの心臓血管、内皮及び血管形成活性を試験するために使用可能である。このようなアッセイは、下記の実施例に記載されるもの含む。
米国特許第5,773,414号に開示されているエンドセリンアンタゴニスト活性を試験するアッセイには、レセプターアッセイにおけるポリペプチドのヨード化エンドセリン-I結合を阻害する能力を試験するラット心室結合アッセイ、ウサギ腎動脈平滑筋細胞を使用し、放射能標識されたエンドセリン-Iの無傷細胞結合性を試験するエンドセリンレセプタ結合アッセイ、機能活性が第2のメッセッンジャーの細胞内レベルを測定することにより、Rat-I細胞内で測定されるイノシトールホスファート蓄積アッセイ、雄のニュージーランドウサギの内皮を使用するインビボ(単離された管)研究、及びSDラットを使用するインビトロ研究において、添加化合物の、培養血管平滑筋内に放出されるエンドセリン刺激アラキドン酸を低減させる能力を測定するアラキドン酸放出アッセイが含まれる。
創傷治癒活性のアッセイには、例えば、Eaglstein及びMertz, J. Invest. Dermatol., 71:382-384(1978)の論文で改変されている、Winter, Epidermal Wound Healing, Maibach, HI及びRovee, DT,編(Year Book Medical Publishers. Inc., Chicago),pp71-112に記載されているものが含まれる。
エンドセリンB1(ETB1)レセプターポリペプチドに結合し、シグナル変換活性を調節するPROポリペプチドに関連したテスト用分子のスクリーニングアッセイは、米国特許第5,773,223号に記載されたようにして、エンドセリンB1レセプターポリペプチドをコードするDNAで形質転換した宿主細胞を提供し、試験用候補薬に細胞を曝露し、エンドセリンB1レセプターシグナル変換活性を測定する。
幾つかの心臓肥大アッセイが存在する。インビトロアッセイには、成体ラット心臓ミオサイトの拡散の誘導が含まれる。このアッセイにおいて、心室ミオサイトは、Piper等,「Adult ventricular rat heart muscle cells」, Cell Culture Techniques in Heart and Vessel Research. H.M. Piper. ed(Berlin:Springer-Verlag,1990),pp.36-60により詳細に記載されている手順を改変したものに本質的に従って、単一の(雄のSprague-Dawley)ラットから単離される。この手順により、成長心室ミオサイトの単離、及び桿体フェノタイプ細胞の長期間にわたる培養が可能になる。フェニレフリンとプロスタグランジンF2α(PGF2α)は、これら成長細胞の転移反応を誘発することが示されている。種々の心臓肥大の潜在的インヒビターによる、PGF2α又はPGF2α類似体(例えばフルプロステノール)及びフェニレフリンにより誘発されるミオサイト転移阻害を次いで試験する。
インビボアッセイの他の例は、圧力負荷心臓肥大アッセイである。インビボ試験において、試験用動物の腹部大動脈の収縮による圧力負荷心臓肥大を誘発することは共通している。典型的なプロトコルにおいて、ラット(例えば雄のWistar又はSD)は麻酔処理され、各ラットの腹部大動脈を横隔膜の真下まで狭窄する。Beznak M., Can. J. Biochem. Physiol., 33:985-94(1955)。 大動脈を外科的切開により曝露し、短い太針を管の隣におく。大動脈を針周囲に絹糸で結紮して収縮させ、すぐに除去し、針の直径まで大動脈の管腔を低減させる。このアプローチは、例えばRossi等, Am. Heart J., 124:700-709(1992)及びO'Rourke及びReibel, P.S.E.M.B., 200:95-100(1992)に記載されている。
癌において、腫瘍の病原及び進行におけるここで同定された遺伝子の役割をさらに理解し、天然PROポリペプチドの抗体及び他のアンタゴニスト、例えば小分子アンタゴニストを含む治療用候補薬の効力をテストするために、種々のよく知られた動物モデルを使用することができる。このようなモデルのインビボの性質は、ヒト患者に前兆となる反応を特に起こさせるものである。腫瘍及び癌(乳癌、結腸癌、前立腺癌、肺癌等)の動物モデルには、非組換え及び組換え(トランスジェニク)動物が含まれる。非組換え動物モデルには、例えば齧歯動物、例えばネズミモデルが含まれる。このようなモデルは標準的な技術、例えば皮下注射、尾静脈注射、脾臓移植、腹膜移植、腎嚢下移植、又はオルソピン(orthopin)移植、例えば結腸組織に移植された結腸癌細胞を使用し、同系のマウスに腫瘍細胞を移入することにより作成することができる。例えば、1997年9月18日に公開されたPCT公開番号WO97/33551を参照されたい。おそらくは癌遺伝子の研究に最も頻繁に使用される動物種は、免疫欠損マウス、特にヌードマウスである。胸腺刺激/形成不全を有するヌードマウスがヒト腫瘍異種移植片用の宿主として成功裡に作用するという知見はこの目的への広範な使用に導いた。常染色体劣性nu遺伝子は、例えばASW、A/He、BALB/c、B10、LP、C17、CH3、C57BL、C57、CBA、DBA、DDD、I/st、NC、NFR、NFS、NFS/N、NZB、NZC、NZW、P、RIII及びSJLを含む、非常に多数の明確に同族のヌードマウスに導入される。さらに、ヌードマウス以外に免疫学的欠損を受け継いだ広範囲の他の動物を育て、腫瘍異種移植片のレシピエントとして使用する。さらなる詳細は、The Nude Mouse in Oncology Research, E. Boven及びB. Winograd. eds.(CRC Press, Inc., 1991)を参照されたい。
腫瘍細胞は種々の手順によりヌードマウス等の動物に導入することができる。腫瘍の移植には、マウスの皮下(s.c.)空間が非常に適している。腫瘍は、固体ブロックとして、例えばトロカール(trochar)の使用による針バイオプシー、又は細胞懸濁液を移植することもできる。固体ブロック又はトロカール移植用に適した大きさの腫瘍組織断片が皮下空間に導入される。細胞懸濁液は一次腫瘍又は安定腫瘍細胞系から新鮮に調製され、皮下注射される。また、腫瘍細胞は皮下移植として注射することもできる。この位置において、移植片は真皮結合組織の下部と皮下組織との間に付与される。
同様に、結腸癌の動物モデルは、動物、例えばヌードマウスに結腸癌細胞を通過させ、これらの動物に腫瘍を出現せしめることにより作成することができる。ヌードマウスにおけるヒト結腸癌の同所移植モデルは、例えばWang等, Cancer Research, 54:4726-4728(1994)及びToo等, Cancer Research, 55:681-684(1995)により記載されている。このモデルはAntiCancer,Inc.,(San Diego, California)から販売されている、いわゆる「METAMOUSETM」に基づく。
動物内で生じた腫瘍は除去され、インビトロで培養することができる。ついで、インビトロ培養からの細胞を動物に継代させる。このような腫瘍はさらなるテスト又は薬剤スクリーニングを目的となりうる。あるいは、継代により得られた腫瘍は単離可能で、継代前細胞及び一又は複数の継代段階の後に単離された細胞のRNAは、関心のある遺伝子の差次的発現用に分析される。このような継代技術は、任意の周知の腫瘍又は癌細胞系で行うことができる。
例えば、Meth A、CMS-4、CMS5、CMS21及びWEHI-164はBALB/c雌マウス(DeLeo等, J. Exp. Med., 146:720(1977))の繊維肉腫を化学的に誘発し、種々の薬剤の抗腫瘍活性を研究する高度に制御されたモデル系を提供する。Palladino等, J. Immunol., 138:4023-4032(1987)。簡単に言えば、腫瘍細胞は細胞培養におけるインビトロで増殖される。動物に注射をする前に細胞系を洗浄し、10x106から10x107細胞/mlの細胞密度でバッファーに懸濁させる。ついで、動物に10から100μlの細胞懸濁液を皮下注射すると、1から3週間で腫瘍が出現する。
移植腫瘍を有する動物モデルにおける試験化合物の効力を評価する方法の一つは、治療前又は後の腫瘍の大きさを測定することである。伝統的に、移植腫瘍の大きさは2又は3次元のスライドカリパスで測定される。2次元に限定する測定は腫瘍の大きさを正確に反映せず;よって通常は数学的公式を使用し、対応する量に転換する。しかし、腫瘍サイズの測定は非常に不正確である。候補薬の治療効果は治療誘発性の成長が遅れ、特定の成長が遅れた場合に、より良好であると記載することができる。腫瘍成長の記載における他の重要な変数は腫瘍量が2倍になる時間である。また、腫瘍成長の算出及び記載のためのコンピュータプログラム、例えばRygaard及びSpang-Thomsen, Proc. 6th Int. Workshop on Immune-Deficient Animals. Wu及びSheng. eds.(Basel. 1989), p.301により報告されているプログラムを入手することができる。しかし、治療後の壊死及び炎症反応は、実際には少なくとも当初には腫瘍サイズの増加の結果となり得ることに留意されるべきである。よって、これらの変化は形態計測とフローサイトメトリー分析を組み合わせて、注意深く監視する必要がある。
本発明の目的に関して、トランスジェニック動物にはそれらの細胞の一部のみに導入遺伝子を担持するもの(「モザイク動物」)が含まれる。導入遺伝子は、単一の導入遺伝子として、又は鎖状体で組み込むことができ、例えば、ヘッド対ヘッド又はヘッド対テイルのタンデムで組み込むことができる。また特定の細胞系への導入遺伝子の選択的導入は、例えばLasko等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 89:6232-636(1992)の技術に続いて可能である。
トランスジェニック動物における導入遺伝子の発現は通常の技術により監視可能である。例えば、サザンブロット分析又はPCR増幅を導入遺伝子の統合を証明するために使用することができる。ついで、mRNAの発現レベルはインサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット分析、PCR又は免疫細胞化学等の技術を使用して分析することができる。動物は腫瘍又は癌進行の徴候のためにさらに試験される。
さらに、イヌ、ネコ及びヒヒ他の自発的動物腫瘍、例えば繊維肉腫、腺癌、リンパ腫、軟骨腫、又は平滑筋肉腫もテストすることができる。もちろん、イヌ及びネコの乳房腺癌は好ましいモデルであり、その外観及び性質はヒトのものと非常に似ている。しかし、このモデルの使用は動物におけるこの種の腫瘍の発生率により制限される。
また、当該技術で周知の他のインビトロ及びインビボ心臓血管、内皮及び血管形成試験もここで適切である。
さらなる研究、例えば種々のヒト組織におけるmRNA発現を測定することにより、ここで心臓血管、内皮及び血管形成アッセイの結果を証明することができる。
上述したように、種々の組織における遺伝子の増幅及び/又は発現は、ここで提供された配列に基づき、適切に標識されたプローブを用い、例えば、従来よりのサザンブロット法、mRNAの転写を定量化するノーザンブロット法(Thomas, Proc. Natl. Acad. Sci. USA,77:5201-5205 (1980))、ドットブロット法(DNA分析)、又はインサイツハイブリダイゼーション法によって測定することができる。あるいは、DNA二本鎖、RNA二本鎖及びDNA-RNAハイブリッド二本鎖又はDNA-タンパク二本鎖を含む、特異的二本鎖を認識することができる抗体を用いることもできる。
あるいは、種々の組織における遺伝子の発現は、遺伝子産物の発現を直接的に定量する免疫学的な方法、例えば組織切片の免疫組織化学的染色及び細胞培養又は体液のアッセイによって測定することもできる。試料液の免疫組織化学的染色及び/又はアッセイに有用な抗体は、モノクローナルでもポリクローナルでもよく、任意の哺乳動物で調製することができる。簡便には、抗体は、天然配列PROポリペプチドに対して、又はここで提供されるDNA配列をベースとした合成ペプチドに対して、又はPRODNAに融合し特異的抗体エピトープをコードする外因性配列に対して調製され得る。抗体生産のための一般的な技術、及びインサイツハイブリダイゼーションのための特定のプロトコルは以下に提供する。
心臓血管、内皮及び血管形成アッセイに使用される内皮細胞又は他の細胞におけるPROポリペプチドの効果を阻害する抗-抗体の能力を試験する、心臓血管、内皮及び血管形成研究の結果は、抗体結合性を研究することで証明することができる。抗体の例としては、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、二重特異性及びヘテロ複合体抗体が含まれ、その調製は以下に記載する。
抗体結合性の研究は任意の周知のアッセイ方法、例えば競合結合アッセイ、直接及び間接サンドイッチアッセイ、及び免疫沈降アッセイ等で行われうる。Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, (CRC Press, Inc. 1987)pp. 147-158 。
競合結合アッセイは、有限量の抗体との結合における、試験用サンプルに対して競合する標識された標準体の能力による。試験用サンプル中の標的タンパク質の量は、抗体が結合する標準体の量に対して逆比例する。結合する標準体の量の測定を容易にするため、好ましくは抗体は競合の前後に不溶化され、抗体に結合する分析物及び標準体は、便宜上、結合しないで残存する標準体及び分析物から分離する。
サンドイッチアッセイでは、検出される互いに異なる免疫原部分、又はエピトープ、又はタンパク質に結合可能な2つの抗体が使用される。サンドイッチアッセイにおいて、分析されるテスト用サンプルは、固体支持体に固定化された第1の抗体に結合し、その後、第2の抗体が分析物に結合し、よって不溶性の3部位複合体が形成される。例えば、米国特許第4,376,100号を参照されたい。第2の抗体は検出可能な部分で、それ自身がラベルされてもよく(直接サンドイッチアッセイ)、又は検出可能な部分でラベルされた抗免疫グロブリン抗体を使用して測定してもよい(間接サンドイッチアッセイ)。例えば、一方の種類のサンドイッチアッセイはELISAアッセイであり、この場合、検出可能な部分は酵素である。
免疫組織化学において、組織サンプルは新鮮なものであるか凍結されていてもよく、パラフィンに埋設されていてもよく、防腐剤、例えばホルマリンで固定されていてもよい。
心臓血管、内皮及び血管形成疾患、例えば腫瘍のための細胞ベースのアッセイ及び動物モデルは、ここで心臓血管、内皮及び血管形成アッセイの発見を立証し、さらに、ここで同定された遺伝子と所望しない心臓血管、内皮及び血管形成細胞成長の進行及び病因との関係を理解するために使用可能である。所望しない心臓血管、内皮及び血管形成細胞成長、例えば腫瘍の進行及び病因におけるここで同定された遺伝子産物の役割は、PROポリペプチドにより刺激又は阻害されると同定された細胞又は細胞系を使用して試験することができる。このような細胞には、例えば以下の実施例に示すものが含まれる。
異なるアプローチにおいて、特定の心臓血管、内皮及び血管形成疾患に係る周知の細胞種の細胞を、cDNAを用いて形質移入し、これらのcDNAが過度の成長を誘発するか、又は成長を阻害する能力を分析する。心臓血管、内皮及び血管形成疾患が癌である場合、適切な腫瘍細胞には、例えば安定腫瘍細胞系、例えばB104-1細胞系(neu原腫瘍遺伝子で形質移入された安定NIH-3T3細胞系)及びras-形質移入NIH-3T3細胞が含まれ、これらは所望する遺伝子を形質移入することができ、腫瘍形成成長を監視することができる。ついで、このような形質移入細胞系を使用し、ポリ-又はモノクローナル抗体又は抗体組成物が、形質移入細胞の成長における細胞増殖抑制又は細胞毒性活性を働かせることによる、又は抗体-依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を媒介することによる腫瘍形成細胞成長を阻害する能力をテストする。さらに、ここで同定された遺伝子のコード化配列で形質移入された細胞を、心臓血管、内皮及び血管形成疾患、例えば癌の治療用の候補薬を同定するのに使用することができる。
さらに、トランスジェニック動物の腫瘍から得られた一次培地(上述に記載)を細胞ベースのアッセイに使用することができるが、安定細胞系が好ましい。トランスジェニック動物から一定の細胞系を誘導するための技術は当該技術においてよく知られている。例えばSmall等, Mol. Cell. Biol., 5:642-648(1985)を参照されたい。
ここで、PROポリペプチド、及びポリペプチド性アゴニスト及びアンタゴニストは、それらのペプチドをインビトロでの発現により本発明に従って用いてもよく、しばしば遺伝子治療と呼ばれる。
核酸(場合によってはベクター内に含まれたもの)を患者の細胞に入れるために:インビボ及びエキソビボという2つの主要な方法がある。インビボ送達では、核酸は、通常はPROポリペプチドが必要とされている部位、すなわちPROポリペプチドの合成部位、もし知られているならばPROポリペプチドの生物学的活性が必要とされる部位(例えば傷)に、患者に直接注入される。エキソビボ処理では、患者の細胞を取り出し、核酸をこれらの単離された細胞に導入し、修飾された細胞を患者に、直接、又は例えば患者に埋め込まれる多孔性膜にカプセル化して投与する(米国特許第4,892,538号及び第5,283,187号参照)。核酸を生細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。これらの技術は、核酸が培養された細胞にインビトロで移入されるか、又は対象とする宿主にインビボで移入されるかに依る。哺乳動物細胞にインビトロで核酸を移入するのに適した技術は、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、形質導入、細胞融合、DEAE-デキストラン、リン酸カルシウム沈降法などを含む。形質導入は、複製欠陥、組換えウイルス(好ましくはレトロウイルス)粒子の細胞レセプターとの結合、次いで粒子に含まれる核酸の細胞への導入を含む。遺伝子のエキソビボ送達に通常用いられるベクターはレトロウイルスである。
好適な遺伝子治療及びレトロウイルス粒子及び構造タンパク質の作成方法は、米国特許第5,681,746号に見出される。
また本発明は、診断法としてのPROポリペプチドをコードする遺伝子の用途に関する。PROポリペプチド中の変異体は腫瘍の原因であるため、変異した形態のPROポリペプチドの検出は、心臓血管、内皮及び血管形成疾患、又は心臓血管、内皮及び血管形成疾患、例えば腫瘍への感染性の診断を可能にする。
ヒトPROポリペプチドをコードする遺伝子に変異体を担持する個人は、種々の技術でDNAレベルが検出される。診断用の核酸は患者の細胞、例えば血液、尿、唾液、組織バイオプシー、及び検屍物質から得ることができる。ゲノムDNAは、分析の前にPCRを使用して酵素的に増幅させる(Saiki等, Nature, 324:163-166(1986))か、又は直接検出に使用することができる。RNA又はcDNAは同じ目的のために使用することができる。例として、PROポリペプチドをコードする核酸に相補的なPCRプライマーを、PROポリペプチド変異体の同定及び分析に使用することができる。例えば、欠失及び挿入は正常な遺伝子型と比較した増幅産物の大きさの変化により検出することができる。点変異(point mutations)は、PROポリペプチドをコードする放射能標識されたRNA、又はPROポリペプチドをコードする放射能標識されたアンチセンスDNA配列に対し、増幅DNAをハイブリダイゼーションさせることにより同定することができる。好ましい適合配列はRNアーゼA消化又は溶解温度の相違により非適合二重鎖と区別することができる。
また特定の位置における配列変化はヌクレアーゼ保護アッセイ、例えばRNアーゼ及びSI保護、又は化学的切断方法、例えばCotton等, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 85:4397-4401(1985)により明らかになる。
よって、特定のDNA配列の欠失はハイブリダイゼーション、RNアーゼ保護、化学的切断、直接DNA配列化、又は制限酵素、例えば制限断片長のポリモルフィズム(RFLP)の使用、及びゲノムDNAのサザンブロット等の方法により達成することができる。
より便宜的なゲル電気泳動及びDNA配列化に加えて、変異はインサイツ分析で検出することもできる。
PROポリペプチドをコードする核酸の発現は、腫瘍形成に関連した血管の病気、又は新血管新生に連動している。PROポリペプチドがシグナル配列を有している場合は、mRNAは平滑筋細胞では少ないのに対して内皮細胞では高度に発現しており、このことはPROポリペプチドが血清中に存在していることを示している。従って、このPROポリペプチドのレベルの変化が腫瘍形成に関連した血管の病気、又は新血管新生であることを示しているために、抗-PROポリペプチド抗体は、このような疾患の診断に使用することができる。
PROポリペプチドに特異的な抗体を固体支持体上に取り付け、標識されたPROポリペプチド及び宿主から誘導されたサンプルを固体支持体に通過させる競合アッセイを使用することもでき、固体支持体に取り付けた検出されるレベルの量はサンプル中のPROポリペプチドの量と相関関係がある。
また、本発明の配列は染色体同定において重要である。配列は特異的に標的とされ、個人のヒト染色体の特定の位置にハイブリダイゼーションさせることができる。さらに、染色体の特定の部位を同定するために、現在必要である。実際の配列データ(反復多形性)に基づいたいくつかの染色体マーキング試薬は、現在、染色体位置のマーキングのために入手可能である。本発明の染色体のDNAマッピングは、病気に関連した遺伝子を有する配列を相関させるために、重要な第1段階である。
簡単に言えば、配列はcDNAからPCRプライマー(好ましくは15−25塩基対)を調製することにより、染色体にマッピングすることができる。3'-非翻訳領域のコンピュータ分析を使用すると、ゲノムDNAの一エクソン以上のスパンではないプライマーが素早く選択され、よって増幅プロセスがより複雑になる。これらのプライマーを、次に、個々のヒト染色体を遺伝子を含有する体細胞ハイブリッドのPCRスクリーニングに使用する。プライマーに対応するヒト遺伝子を含有するハイブリッドのみが、増幅断片を作成するであろう。
体細胞ハイブリッドのPCRマッピングは、特定の染色体に特定のDNAを割り当てるための急速な手順である。同様のオリゴヌクレオチドプライマーを本発明で使用すると、サブ局部限定を、類似した方法で、大きなゲノムクローンのプール又は特定の染色体からの断片のパネルで達成することができる。同様に、その染色体へのマッピングに使用可能な他のマッピング方法には、インサイツハイブリダイゼーション、標識されたフローソート染色体を用いたプレスクリーニング、及び染色体特異性cDNAライブラリを組み立てるためのハイブリダイゼーションによるプレ選択が含まれる。
一度、配列を厳密な染色体位置にマッピングすると、染色体上の配列の物理的位置は遺伝子地図データと相関可能である。このようなデータは、例えば、V. McKusick, Mendelian Inheritance in Man(Johns Hopkins University Welch Medical Library)に見出される。次に、同じ染色体領域にマッピングされる遺伝子と病気の関係を連鎖アッセイにより同定する(物理的に隣接する遺伝子の共同相続)。
次に、病気に罹患した又は病気に罹患しなかった個体間のcDNA又はゲノム配列における差異を測定する必要がある。変異が病気に罹患し個体の数人又は全員に見出され、正常な個体では見出されない場合、変異は病気の原因であると思われる。
物理的マッピング及び遺伝子マッピング技術の現在の解像度によれば、病気に関連した染色体領域に厳密に位置するcDNAは、50と500潜在的原因遺伝子の間の一つである(このことは、1メガベースのマッピング解像度で、20kb当たり1遺伝子であると仮定している)。
本発明は、PROポリペプチドを模倣する(アゴニスト)又はPROポリペプチドの効果を阻害する(アンタゴニスト)ものを同定するための化合物のスクリーニング方法も包含する。アンタゴニスト候補薬のスクリーニングアッセイは、ここに同定した遺伝子にコードされるPROポリペプチドと結合又は複合体形成する化合物、又は他にコード化ポリペプチドと他の細胞性タンパク質との相互作用を阻害する化合物を同定するために設計される。このようなスクリーニングアッセイは、それを特に小分子候補薬の同定に適したものにする、化学的ライブラリの高スループットスクリーニングに適用可能なアッセイを含む。
このアッセイは、タンパク質−タンパク質結合アッセイ、生化学的スクリーニングアッセイ、イムノアッセイ、及び細胞ベースのアッセイを含む方式で実施され、それらはこの分野で良好に特徴付けされている。
アンタゴニストについての全てのアッセイは、それらが候補薬をここで同定された核酸にコードされるPROポリペプチドと、これら2つの成分が相互作用するのに十分な条件下及び時間で接触させることを必要とすることにおいて共通する。
PROポリペプチドが同時有糸分裂促進物質ConAの存在下で内皮細胞の増殖を刺激する能力を有している場合、スクリーニング方法の一例では、この能力の利点が利用される。特に、増殖アッセイにおいて、ヒト臍帯静脈内皮細胞を得、96-ウェル平底培養皿(Costar, Cambridge, MA)で培養し、細胞の増殖を容易にするのに適切な反応混合物を補い、該混合物はCon-A(Calbiochem, La Jolla, CA)を含有している。Con-A及びスクリーニングされる化合物を添加し、37℃でインキュベートした後、培養物を3−Hチミジンで標識し、ガラス繊維フィルター上に収集する(phD;Cambridge Technology, Watertown, MA)。3媒体の平均3−Hチミジン取り込み(cpm)を、液体シンチレーション計測器を使用して測定する(Beckman Instruments. Irvine. CA)。有意な3−(H)チミジン混入率が内皮細胞の刺激において示された。
アンタゴニストの他の検定では、レセプターを発現する哺乳動物細胞又は膜調製物を、候補化合物の存在下で標識PROポリペプチドとともにインキュベートする。次いで、この相互作用を促進又は阻止する化合物の能力を測定する。
心臓血管、内皮及び血管形成疾患の治療に有用な組成物には、限定するものではないが、標的遺伝子産物の活性及び/又は発現を阻害する抗体、小有機及び無機分子、ペプチド、リンペプチド、アンチセンス及びリボザイム分子、トリプルへリックス分子が含まれる。
潜在的なアンタゴニストのより特別な例は、免疫グロブリンとPROポリペプチドとの融合体に結合するオリゴヌクレオチド、特に、限られないが、ポリ-及びモノクローナル抗体及び抗体断片、単鎖抗体、抗-イディオタイプ抗体、及びこれらの抗体又は断片のキメラ又はヒト化形態、並びにヒト抗体及び抗体断片を含む抗体を含んでいる。あるいは、潜在的アンタゴニストは、密接に関連したタンパク質、例えば、レセプターを認識するが影響せず、それによりPROポリペプチドの作用を競合的に阻害するPROポリペプチドの変異形態であってもよい。
潜在的アンタゴニストは、PROポリペプチドの活性部位、レセプター結合部位、又は成長因子又は他の関連結合部位に結合し、それによりPROリペプチドの正常な生物学的活性を阻止する小分子を含む。小分子の例は、これらに限られないが、小型ペプチド又はペプチド様分子、好ましくは可溶性ペプチド、及び合成非ペプチド有機又は無機化合物を含む。
リボザイムは、RNAの特異的切断を触媒できる酵素的RNA分子である。リボザイムは、相補的標的RNAへの配列特異的ハイブリダイゼーション、次いでヌクレオチド鎖切断的切断により作用する。潜在的RNA標的内の特異的リボザイム切断部位は、既知の技術で同定できる。更なる詳細は、例えば、Rossi, Current Biology 4: 469-471 (1994)及びPCT公報、番号WO 97/33551(1997年9月18日発行)を参照されたい。
転写阻害に用いられるトリプルヘリックス形成における核酸分子は一本鎖でデオキシヌクレオチドからなる。これらのオリゴヌクレオチドの基本組成は、フーグスチン塩基対則を介するトリプルヘリックス形成を促進するように設計され、それは一般に二重鎖の一方の鎖上のプリン又はピリミジンのサイズ変更可能な伸展を必要とする。さらなる詳細は、例えば、上掲のPCT公報、番号WO 97/33551を参照されたい。
これらの小分子は、上記で議論したスクリーニングアッセイの一又は複数の任意のものにより及び/又は当業者に良く知られた他の任意のスクリーニング技術により同定できる。
ここで記載された心臓血管、内皮及び血管形成アッセイにおいて活性を有し、及び/又はそれらの遺伝子産物が心臓血管系に位置することが見出されているPROポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニストは、血管に影響を及ぼす全身疾患、例えば真性糖尿病を含む種々の心臓血管、内皮及び血管形成疾患において治療用途を有していると思われる。それらの治療有効性は、動脈、毛細管、静脈、及び/又はリンパ管の病気を含みうる。以下治療例には、筋肉消耗病治療、骨粗鬆症治療、移植周囲の細胞成長を刺激するための移植固定補助、よってその意図する部位への結合を容易にするもの、組織又は血清中のIGF安定性の増加、適切であるならば、IGFレセプターへの結合性の増加(IGFがヒト骨髄赤血球及び顆粒球原種細胞の成長を高めることが、インビトロで示されているため)が含まれる。
また、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、赤血球生成又は顆粒球生成を刺激し、傷の治癒及び組織の再生を刺激し、組織、例えば結合組織、皮膚、骨、軟骨、筋肉、肺又は腎臓の再成長に関連した治療に関連し、内皮細胞の移動を刺激又は阻害するために使用することができる。PROポリペプチド又はアンタゴニストにより媒介される血管形成の増加は、虚血組織、心臓の側枝冠動脈、続いて冠動脈狭窄に有益である。アンタゴニストはこのようなポリペプチドの作用を阻害し、例えば傷の治癒又は胚線維症の間に、過度の結合組織の生成を制限するために使用される。これには急性心筋梗塞及び心不全が含まれる。
分子のアンタゴニストに対抗する場合、特定の指示に対し、分子それ自身又はそのアゴニストを使用するか否かの決定は、主として、分子が新血管新生、内皮細胞の発生、又は血管形成を促進する、又はこれらの病状を阻害するか否かに依存する。例えば、分子が血管形成を促進する場合は、そのアンタゴニストは血管形成の制限又は防止が所望されている疾患の治療に有用である。このような疾病の例には、血管腫瘍、例えば血管腫、腫瘍血管形成、網膜の新血管新生、糖尿病性網膜症又は時期尚早の幼児性網膜症又は黄斑変性及び増殖性硝子体網膜症に関連した脈絡膜、慢性関節リュウマチ、クローン病、アテローム性動脈硬化、卵巣過剰刺激、乾癬、新血管新生に関連した子宮内膜症、気球血管形成が続く再狭窄、瘢痕組織過剰生成、例えば外科手術の後の形成されるケロイドのようなもの、心筋梗塞の後の線維症、又は胚線維症に関連した線維症障害が含まれる。
しかし、分子が血管形成を阻害するならば、上述した病状の治療に直接使用されることが予期される。
しかし、分子が血管形成を阻害するならば、そのアンタゴニストは血管形成が所望される病状の治療に使用される。
特定の型の病気は以下に記載され、ここでのPROポリペプチド又はそのアンタゴニストは疾患の予防、又は治療のための治療標的として、又は標的とする血管放出剤に有用なものとして提供される。アテローム性動脈硬化は、体液の蓄積、平滑筋細胞の増殖、及び動脈壁内の繊維組織の形成により、動脈内の厚みが増した脈管内膜にプラークが蓄積することにより特徴付けられる病気である。病気は、任意の器官において大、中及び小動脈を襲う。内皮及び血管平滑筋細胞機能の変化は、これらのプラークの蓄積及び緩和を調節する、重要な役割を担っていることが知られている。
高血圧は全身性動脈、肺動脈、又は門脈系において血圧が上昇することにより特徴付けられる。上昇した血圧は、欠陥のある内皮機能及び/又は血管病に帰着するか、又はこれらに起因する。
レーノー病は及びレーノー現象は、冷気にさらされた手足を通って、循環の間欠性異常欠陥により特徴付けられるものである。変更内皮細胞機能がこれらの病気において重要であることが示されている。
動脈瘤は、変更内皮細胞及び/又は血管平滑筋細胞に関連した動脈又は静脈樹状分の嚢状又は紡錘状拡張症である。
動脈再狭窄(動脈壁再狭窄)は、内皮及び血管平滑筋細胞の増殖及び機能の変更の結果によるもので、続いて血管形成を生じる。
血栓静脈炎は及びリンパ管炎は静脈及びリンパ管の炎症性疾患であり、それぞれ内皮細胞機能の変更に帰着するか、及び/又は起因する。同様に、リンパ浮腫は内皮細胞機能からのリンパ管の欠陥に関連した病状である。
良性及び悪性血管腫瘍のファミリーは、血管系の細胞エレメントの異常な増殖及び成長により特徴付けられる。例えば、リンパ管腫は、先天的で、しばしば膀胱のリンパ系の良性腫瘍、通常新生児に生じるリンパの奇形である。膀胱腫瘍は隣接した組織内で成長する傾向にある。膀胱腫瘍は、通常、子宮頸部及び腋か領域に生じる。また、それらは四肢の軟組織でも生じる。主たる徴候は膨張であり、時折、網状に構造化されたリンパ及びリンパ球(lymphocyst)は結合組織に囲まれている。リンパ管腫は、胎性リンパ管又はそれらの欠失に不適当に結合することに起因すると仮定されている。結果は局所的にリンパドレナージを害している。Griener等, Lymphology, 4: 140-144 (1971)。
加齢性黄斑変性(AMD)は年輩者の集団における、ひどい視覚損失に至る原因である。AMDの滲出形態は脈絡膜新血管新生及び網膜色素内皮細胞剥離により特徴付けられる。脈絡膜新血管新生が予後の動的低下に関連しているため、PROポリペプチド又はそれらのアンタゴニストは、重度のAMDを低減させるのに有用であることが予期される。
さらに、PROポリペプチド又はそのアンタゴニストは、限定するものではないが、圧迫潰瘍、血管不全に関連した潰瘍、外科的又は外傷的な傷等を含む治癒していない傷を、より良好により早く閉塞させることを促進させるのに有用である。
またさらに、PROポリペプチド又はそのアンタゴニストは、他の組織、例えば器官(例えば、膵臓、肝臓、腸、腎臓、配列又は内皮を含む)、筋肉(平滑筋、骨格筋又は心筋)、及び血管(血管内皮を含む)組織の生成又は再生、又はこのような組織を含む細胞成長の促進活性を示し得る。所望の効果の一部は、線維性瘢痕化を阻害又は調節して、正常な組織を再生することである。
さらに、PROポリペプチド又はそのアンタゴニストは歯周病の治療及び他の歯修復プロセスに使用することができる。このような薬剤は骨形成細胞を誘引し、骨形成細胞の成長を刺激し、又は骨形成細胞の原種の分化を誘発する環境で提供される。ここでのPROポリペプチド又はそのアンタゴニストは、血管が、骨の回転及び成長の調節において重要な役割を担っているため、骨粗鬆症又は骨関節症の、例えば骨及び/又は軟骨修復を刺激、又は炎症プロセスにより媒介される組織破壊(コラゲナーセ活性、破骨細胞等)のプロセス又は炎症をブロックすることによる治療に有用である。
ここでPROポリペプチド又はそのアンタゴニストにあるとされる組織再生活性の他の範疇は、腱/靱帯形成である。組織が通常形成されない環境での腱/靱帯様組織又は他の組織形成を誘発するタンパク質は、ヒト及び他の動物の腱又は靱帯の裂け目、奇形、及びの腱又は靱帯の欠損の治癒に適用される。このような調製物は、腱又は靱帯組織へのダメージの予防、並びに腱又は靱帯の骨又は他の組織への固定の改善、及び腱又は靱帯組織の欠損の修復において予防的に使用される。ここでのPROポリペプチド又はそのアンタゴニストの組成物により誘発される新しい腱/靱帯様組織形成は、先天的、外傷誘発性、又は他の由来による腱又は靱帯のたの欠損の修復に寄与し、また腱又は靱帯の取り付け又は修復のための美容形成外科においても有用である。ここでの組成物は、腱-又は靱帯-形成細胞を誘引、腱-又は靱帯-形成細胞の成長を刺激、腱-又は靱帯-形成細胞原種の分化を誘発、又はイクスビボでの回復インビボでの組織修復効果における腱/靱帯細胞又は原種の成長を誘発する環境で提供される。また、ここでの組成物は、腱炎、手根管症候群、及び他の腱又は靱帯欠損にも有用である。さらに組成物は、当該技術でよく知られている担体と同じ適切なマトリクス及び/又は金属イオン封鎖剤の含む。
虚血-再潅流傷害は他の徴候である。内皮細胞機能不全は虚血-再潅流傷害が続いて生じる事象の後遺症の開始及び調節の両方において重要である。
慢性関節リュウマチはさらなる徴候である。血管成長及び脈管構造を通過する炎症細胞の標的は、関節炎のリュウマチ様及び血清ネガティブの形態の病因の重要な要因である。
さらにPROポリペプチド又はそのアンタゴニストは、肥大性心筋症と診断された患者のかなりの部分に発現する、心房細動の治療に有用である。
さらなる徴候には、アンギナ、心筋梗塞、例えば急性心筋梗塞、及び心不全、例えば鬱血性心不全が含まれる。さらなる、非新生物病状には乾癬、糖尿病、及び時期尚早の網膜症、水晶体後方繊維増殖症、新血管緑内障を含む他の増殖性網膜症、甲状腺過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織の移植、慢性的炎症、肺炎、ネフローゼ症候群、子癇前症、心膜滲出(例えば心膜炎に関連するもの)、及び胸膜滲出が含まれる。
上述した観点から、内皮細胞機能、増殖及び/又は形態を変更又はこれに衝撃を与えると示されている、ここで記載されたPROポリペプチド、又はそのアゴニスト又はアンタゴニストは、上述した多くの又は全ての疾患の原因及び病因において重要な役割を担っており、これらの疾患を標的とする血管関連剤、又はこれらのプロセスを増大又は阻害するための治療標的として提供可能であると思われる。
ここに記載された分子及びそれらのアゴニスト及びアンタゴニストは、上述した種々の疾患及び病気の予防及び治療薬として製薬的に有用である。
PROポリペプチド又はアゴニスト又はアンタゴニストの治療用組成物は、適当な純度を持つ所望の分子を任意の製薬的に許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤(Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Osol, A.編, (1980))と、凍結乾燥した製剤又は水溶液の形態で混合することにより調製することができる。許容可能な担体、賦形剤、又は安定化剤は、好ましくは用いられる投与量及び濃度で受容者に非毒性であり、リン酸塩、クエン酸炎、及び他の有機酸などのバッファー;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロライド;ヘキサメトニウムクロライド;ベンザルコニウムクロライド;ベンゼトニウムクロライド;フェノール、ブチル又はベンジルアルコール;メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン;カテコール;レゾルシノール;シクロヘキサノール;3-ペンタノール;及びm-クレゾール);低分子量(約10残基未満)ポリペプチド;血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質;ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー;グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、又はリシン等のアミノ酸;グルコース、マンノース、又はデキストランを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物;EDTA等のキレート剤;スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖;ナトリウム等の塩形成対イオン;金属錯体(例えば、Zn-タンパク質錯体);及び/又はTWEENTM、PLURONICSTM又はポリエチレングリコール(PEG)等の非イオン性界面活性剤を含む。
インビボ投与に用いられるPROポリペプチド又はアンタゴニストは無菌でなければならない。これは、凍結乾燥及び再形成の前又は後の滅菌濾過膜を通した濾過によって容易に達成される。PROポリペプチドは通常は凍結乾燥形態又は全身投与される場合には溶液中に貯蔵される。凍結乾燥形態にある場合、PROポリペプチド又はアゴニストは典型的には使用時の適当な希釈剤を含む他の成分と組み合わせて処方される。PROポリペプチド又はアンタゴニストの液体製剤の例は、無菌の、透明な、無色の生鮮溶液で、皮下注射用の1回投与バイアルに充填されている。繰り返し使用に適切な防腐製薬組成物は、例えばポリペプチドの種類及び指示に主として依存し、
a)PROポリペプチド又はそれらのアゴニスト又はアンタゴニスト;
b)溶液中のポリペプチド又は他の分子の安定性を最大にする範囲内のpH、好ましくは約4-8のpHを維持可能なバッファー;
c)主として、撹拌誘発性集合体に対しポリペプチド又は分子を安定化させる洗浄剤/界面活性剤;
d)等張剤;
e)フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物の群から選択される防腐剤;及び
f)水;
を含有し得る。
等張剤は、PROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストの液体組成物を確実に等浸透圧とするために存在し、多価糖アルコール、好ましくは3価又は高級糖アルコール、例えばグリセリン、エリトリトール、アラビトール、キシリトール、ソルビトール及びマンニトールが含まれる。これらの糖アルコールは、単独で、又は組合せて使用することもできる。また、塩化ナトリウム又は他の適切な塩を、溶液を等にするために使用してもよい。
バッファーは、所望するpHに応じて、アセタート、シタラート、スクシナート又はホスファートバッファーであってよい。本発明の液状調製物の一種類のpHは、約4から8、好ましくはほぼ生理学的pHの範囲に緩衝される。
防腐剤、フェノール、ベンジルアルコール及びベンゼトニウムハロゲン化物、例えば塩化物は、使用可能な周知の抗菌薬である。
また、PROポリペプチドは持続放出製剤の形態で投与することもできる。持続放出製剤の好適な例は、タンパク質を含む固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、当該マトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。持続放出マトリクスの例は、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及びLanger, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982)に記載されたようなポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリアクチド(米国特許第3,773,919号、EP 58,481)、L-グルタミン酸及びガンマエチル-L-グルタメートのコポリマー(Sidman等, Biopolymers, 22: 547-556 (1983))、非分解性エチレン−酢酸ビニル(Langer等, 上掲)、分解性乳酸−グリコール酸コポリマー、例えばLupron DepotTM(乳酸−グリコール酸コポリマ及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能な微小球)、及びポリ-D-(−)-3-ヒドロキシブチル酸(EP 133,988)を含む。
PROポリペプチドの持続放出組成物は、リポソーム的に包括されたPROポリペプチドを含む。PROポリペプチドを含有するリポソームは、それ自体周知である方法、例えば、DE 3,218,121、Epstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:3688-3692 (1985)、Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4030-4034 (1980)、EP 52,322、EP 36,676、EP 88,046、EP 143,949、EP 142,641、特願昭58-118008、米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号、及びEP 102,324等による方法によって調製する。通常、リポソームは、脂質含有量が約30モル%以上コレステロールであり、選択される割合が最適な治療法に対して調整された微小(約200-800オングストローム)な単ラメラ状のものである。
上記の指針では、有効投与量は、一般的に約0.001から約1.0mg/kg、好ましくは約0.01−1.0mg/kg、最も好ましくは約0.01−0.1mg/kgの範囲内である。
組織再生に使用されるPROポリペプチドを含有する製薬組成物の用量計画は、ポリペプチドの作用を変える種々の要因、例えばを、形成が望まれる組織(例えば骨)の重量、患者の年齢、性別、食餌、感染症の重傷度、投与時間、及び他の臨床的要因を考慮して、担当する医師により決定されるであろう。用量は、再構成に使用されるマトリクスの種類、製薬組成物の他のタンパク質含有物により変わり得る。例えば、他の周知の成長因子、例えばIGF−Iを最終組成物に添加すると、さらに用量に影響を与える。進行状況は組織/骨の成長及び/又は修復を、例えばX線、組織形態測定(histomorphometric determinations)及びテトラサイクリン標識化により、定期的に評価することにより監視可能である。
ペプチド又は小分子がアンタゴニスト又はアゴニストとして使用される場合、好ましくは、液体又は固体の形態で経口的又は非経口的に哺乳動物に投与される。
塩を形成し下記において有用な分子の薬理学的に許容可能な塩類の例には、アルカリ金属塩(例えばナトリウム塩、カリウム塩)、アルカリ土類金属塩(例えばカルシウム塩、マグネシウム塩)、アンモニウム塩、有機塩基塩(例えばピリジン塩、トリエチルアミン塩)、無機酸塩(例えば塩酸、硫酸塩、硝酸塩)及び有機酸塩(例えば酢酸塩、シュウ酸塩、p-トルエンスルホン酸塩)が含まれる。
ここで記載され、骨、軟骨、腱、又は靱帯再生に有用な組成物における治療方法には、移植又は装置としての、局所的(topically)、全身的又は局部的(locally)な組成物の投与が含まれる。投与した場合、有用な治療用組成物は、発熱物質を含有しない生理学的に許容可能形態である。さらに組成物は、骨、軟骨又は組織のダメージ部位に送達される粘性のある形態で注射されるかカプセル化されることが望ましい。局所的投与は傷の治癒及び組織の修復に適している。好ましくは、骨及び/又は軟骨の形成のためには、組成物は、骨及び/又は軟骨のダメージ部位にタンパク質含有組成物を送達せしめ、好ましくは体内に再吸収可能な骨及び軟骨を発育する構造体を提供することのできるマトリクスを含む。このようなマトリクスは他の移植医療用途に使用される材料で作成される。
特定の一実施態様では、乳酸とグリコール酸が50:50(モル重量)のコポリマーであり、150から180ミクロンの範囲の直径を有する多孔質粒子の形態である。いくつかの用途において、金属イオン封鎖剤、例えばカルボキシメチルセルロース、又は自己移植血塊を利用し、マトリクスからの分離から組成物を保護するのに有用である。
一好適なファミリーの金属イオン封鎖剤は、セルロース材料、例えばメチルセルロース、エチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース及びカルボキシメチルセルロースを含むアルキルセルロース(ヒドロキシアルキルセルロースを含む)であり、好ましくはカルボキシメチルセルロース(CMC)のカチオン塩である。他の好ましい金属イオン封鎖剤には、ヒアルロン酸、アルギニン酸ナトリウム、ポリ(エチレングリコール)、ポリオキシエチレンオキシド、カルボキシビニルポリマー、及びポリ(ビニルアルコール)が含まれる。ここで有用な金属イオン封鎖剤の量は、調製物の全量に基づき、0.5−20重量%、好ましくは1−10重量%であり、ポリマトリクスからのポリペプチド(又はそのアンタゴニスト)の脱着を防止し、組成物に適切な操作性を付与し、さらに原細胞のマトリクスへの浸透を防止し、よって、ポリペプチドに原細胞の骨形成活性を助長する機会を付与するのに必要な量である。
当問題となる疾患の防止又は治療におけるPROポリペプチド、アミンそのアゴニスト又はアンタゴニストの効力は、同じ組成物又は別個の組成物において、これらの目的のために有効な他の薬剤と組合せるか、又は活性剤を連続して投与することにより改善される。
例えば、心臓肥大の治療のためには、PROポリペプチド治療は、周知の心筋ミオサイト肥大因子のインヒビター、例えばフェニレフリン等のα-アドレナリンアゴニストのインヒビター;エンドセリン-Iインヒビター、例えばBOSENTANTM及びMOXONODINTM;CT-1に対するインヒビター(米国特許第5,679,545号);LIFに対するインヒビター;ACEインヒビター;デス-アスパラタート-アンギオテンシンIインヒビター(米国特許第5,773,415号)及びアンギオテンシンIIインヒビターの投与を組合せることができる。
高血圧に関連した心臓肥大の治療のためには、PROポリペプチドを、β-アドレナリン様レセプターブロック剤、例えばプロプラノロール、チモロール、タータロロール、カルテオロール、ナドロール、ベタキソロール、ペンブトロール、アセトブトロール、アテノロール、メトプロロール、又はカーベジルロール;ACEインヒビター、例えばクイナピリル、カプトプリル、エナラプリル、ラミプリル、ベナゼプリル、フォシノプリル又はリシノプリル;ジウレティクス、例えばクロロチアザイド、ヒドロクロロチアザイド、ヒドロフルメタザイド、メチルクロチアザイド、ベンズチアザイド、ジクロロフェナミド、アセタゾラミド、又はインダパミド;及び/又はカルシウムチャンネルブロッカー、例えばジルチアゼム、ニフェジピン、ベラパミル又はニカルジピンと組合せて投与することができる。一般名によりここで同定された治療薬を遺伝子製薬用組成物は市販されており、用量、投与方法、副作用、禁忌等の製造者の使用説明書に従い投与される。例えば、Physicians'Desk Reference(Medical Economics Data Production Co.:Montvale, N.J., 1997), 51th版を参照されたい。
他の徴候のために、PROポリペプチド又はそれらのアンタゴニストは、当該問題における骨及び/又は軟骨欠損、傷又は組織の治療に有用な他の薬剤と組合せてもよい。このような薬剤には、種々の成長因子、例えばEGF、PDGF、TGF-α又はTGF-β、IGF、FGF、及びCTGFが含まれる。
加えて、癌の治療に使用されるPROポリペプチド又はそれらのアンタゴニストは、上述にて同定したような細胞毒性薬、化学治療薬又は成長阻害薬と組合せられる。また癌の治療のために、PROポリペプチド又はそのアンタゴニストは適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含んでも含まなくても、放射線学的治療と組合せられる。
PROポリペプチド又はそのアンタゴニストと組合せて投与される治療薬の有効量は、医師又は獣医の裁量による。投与量とその調節は処理される病状に最大の治療効果が達成されるようになされる。例えば、高血圧の治療においては、これらの量は、理想的にはジウレティクス又はデジタルの使用、及び高血圧又は低血圧、腎損傷等を考慮に入れる。用量は、治療される特定の患者及び使用される治療薬の種類等の因子に依存する。典型的には、使用される量は、治療薬をPROポリペプチドと共に投与しない場合と同じ用量である。
上述した疾患の診断又は治療に有用なPROポリペプチド又はそのアンタゴニストを含むキットのような製造品は、少なくとも1つの容器及びラベルを具備する。適切な容器には、例えばボトル、バイアル、シリンジ及び試験管が含まれる。容器はガラス又はプラスチックのような種々の物質から形成できる。容器は、状態の診断又は治療に有効な組成物を収容し、無菌のアクセスポートを有し得る(例えば、容器は皮下注射針で穿孔可能なストッパーを具備する静脈内バッグ又はバイアルであってよい)。組成物中の活性剤はPROポリペプチド又はそのアゴニスト又はアンタゴニストである。容器上又は添付されるラベルには、組成物が選択した状態の診断又は治療に使用されることが示されている。この製造品は、製薬的に許容可能なバッファー、例えばリン酸緩衝塩水、リンガー液、及びデキストロース溶液を収容した第2の容器をさらに具備してもよい。さらに、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、シリンジ、及び使用説明書を備えた包装挿入物を含む、商業的及び使用者の立場から望ましい他の材料を具備してもよい。また、この製造品は、上述の他の活性剤を収容した第2又は第3の容器を具備してもよい。
本発明で最も有望な候補薬の幾つかは、ここで同定された遺伝子の産生又は遺伝子産物を阻害及び/又は遺伝子産物の活性を低減する抗体及び抗体断片である。
i.ポリクローナル抗体
ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に知られている。哺乳動物においてポリクローナル抗体は、例えば免疫化剤、及び所望するのであればアジュバントを、一又は複数回注射することで発生させることができる。典型的には、免疫化剤及び/又はアジュバントを複数回皮下又は腹腔内注射により、哺乳動物に注射する。免疫化剤は、PROポリペプチド又はその融合タンパク質を含みうる。免疫化剤を免疫化された哺乳動物において免疫原性が知られているタンパク質に複合させるのが有用である。このような免疫原タンパク質の例は限られないが、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン及び大豆トリプシンインヒビターが含まれる。使用され得るアジュバントの例には、フロイント完全アジュバント及びMPL-TDMアジュバント(モノホスホリル脂質A、合成トレハロースジコリノミコラート)が含まれる。免疫化プロトコールは、過度の実験なく当業者により選択されるであろう。
あるいは、抗-PRO抗体はモノクローナル抗体であってもよい。モノクローナル抗体は、Kohler及びMilstein, Nature, 256:495 (1975)に記載されているようなハイブリドーマ法を使用することで調製することができる。ハイブリドーマ法では、マウス、ハムスター又は他の適切な宿主動物を典型的には免疫化剤により免疫化することで、免疫化剤に特異的に結合する抗体を生成するかあるいは生成可能なリンパ球を誘発する。また、リンパ球をインビトロで免疫化することもできる。
免疫化剤は、典型的には対象とするPROポリペプチド又はその融合タンパク質を含む。一般にヒト由来の細胞が望まれる場合には末梢血リンパ球(「PBL」)が使用され、あるいは非ヒト哺乳動物源が望まれている場合は、脾臓細胞又はリンパ節細胞が使用される。次いで、ポリエチレングリコール等の適当な融合剤を用いてリンパ球を不死化株化細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成する。Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,(New York;Academic Press, 1986) pp. 59-103。不死化株化細胞は、通常は、形質転換した哺乳動物細胞、特に齧歯動物、ウシ、及びヒト由来の骨髄腫細胞である。通常、ラット又はマウスの骨髄腫株化細胞が使用される。ハイブリドーマ細胞は、好ましくは、未融合の不死化細胞の生存又は成長を阻害する一又は複数の物質を含有する適切な培地で培養される。例えば、親細胞が、酵素のヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(HGPRT又はHPRT)を欠いていると、ハイブリドーマの培地は、典型的には、ヒポキサチン、アミノプチリン及びチミジンを含み(「HAT培地」)、この物質がHGPRT欠乏性細胞の増殖を阻止する。
次いでハイブリドーマ細胞が培養される培養培地を、PROポリペプチドに対するモノクローナル抗体の存在について検定する。好ましくは、ハイブリドーマ細胞によって生成されたモノクローナル抗体の結合特異性は免疫沈降又はラジオイムノアッセイ(RIA)や酵素結合免疫測定法(ELISA)等のインビトロ結合検定法によって測定する。このような技術及びアッセイは、当該分野において公知である。モノクローナル抗体の結合親和性は、例えばMunson及びPollard, Anal. Biochem., 107:220 (1980)によるスキャッチャード分析法によって測定することができる。
サブクローンによって分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインA−セファロース法、ヒドロキシルアパタイトクロマトグラフィー法、ゲル電気泳動法、透析法又はアフィニティークロマトグラフィー等の従来の免疫グロブリン精製方法によって培養培地又は腹水液から単離又は精製される。
抗体は一価抗体であってもよい。一価抗体の調製方法は当該分野においてよく知られてる。例えば、一つの方法は免疫グロブリン軽鎖と修飾重鎖の組換え発現を含む。重鎖は一般的に、重鎖の架橋を防止するようにFc領域の任意の点で切断される。あるいは、関連するシステイン残基を他のアミノ酸残基で置換するか欠失させて架橋を防止する。
一価抗体の調製にはインビトロ法がまた適している。抗体の消化による、その断片、特にFab断片の生成は、当該分野において知られている慣用的技術を使用して達成できる。
抗-PRO抗体は、さらにヒト化抗体又はヒト抗体を含む。非ヒト(例えばマウス)抗体のヒト化形とは、キメラ免疫グロブリン、免疫グロブリン鎖あるいはその断片(例えばFv、Fab、Fab'、F(ab')2あるいは抗体の他の抗原結合サブ配列)であって、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むものである。ヒト化抗体はCDRの残基が、マウス、ラット又はウサギのような所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト種(ドナー抗体)のCDRの残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)を含む。幾つかの例では、ヒト免疫グロブリンのFvフレームワーク残基は、対応する非ヒト残基によって置換されている。また、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、移入されたCDRもしくはフレームワーク配列にも見出されない残基を含んでいてもよい。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいはほとんど全てのCDR領域が非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいはほとんど全てのFR領域がヒト免疫グロブリンコンセンサス配列のものである、少なくとも1つ、典型的には2つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、最適には免疫グロブリン定常領域(Fc)、典型的にはヒトの免疫グロブリンの定常領域の少なくとも一部を含んでなる。Jones等, Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature, 332:323-329 (1988); 及びPresta, Curr. Op Struct. Biol., 2:593-596 (1992)。
非ヒト抗体をヒト化する方法はこの分野でよく知られている。一般的に、ヒト化抗体には非ヒトを源にする一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的に齧歯動物のCDR又はCDR配列でヒト抗体の該当する配列を置換することによりウィンター(winter)及び共同研究者[Jones等, Nature, 321:522-525 (1986);Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988);Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)]の方法に従って、齧歯類CDR又はCDR配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第4,816,567号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのCDR残基及び場合によっては幾つかのFR残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
二重特異性抗体は、少なくとも2つの異なる抗原に対して結合特異性を有するモノクローナル抗体、好ましくはヒトもしくはヒト化抗体である。本ケースの場合において、結合特異性の一方はPROポリペプチドに対してであり、他方は任意の他の抗原、好ましくは細胞表面タンパク質又はレセプター又はレセプターサブユニットに対してである。
二重特異性抗体を作成する方法は当該技術分野において周知である。伝統的には、二重特異性抗体の組換え生産は、二つの重鎖が異なる特異性を持つ二つの免疫グロブリン重鎖/軽鎖対の同時発現に基づく。Milstein及びCuello, Nature, 305:537-539 (1983)。免疫グロブリンの重鎖と軽鎖を無作為に取り揃えるため、これらハイブリドーマ(クアドローマ)は10種の異なる抗体分子の潜在的混合物を生成し、その内一種のみが正しい二重特異性構造を有する。正しい分子の精製は、アフィニティークロマトグラフィー工程によって通常達成される。同様の手順が1993年5月13日公開のWO 93/08829、及びTraunecker等, EMBO J.,10:3655-3656 (1991)に開示されている。
所望の結合特異性(抗体-抗原結合部位)を有する抗体可変ドメインを免疫グロブリン定常ドメイン配列に融合できる。融合は、好ましくは少なくともヒンジ部、CH2及びCH3領域の一部を含む免疫グロブリン重鎖定常ドメインとのものである。少なくとも一つの融合には軽鎖結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(CH1)が存在することが望ましい。免疫グロブリン重鎖融合をコードするDNA、及び望むのであれば免疫グロブリン軽鎖を、別々の発現ベクターに挿入し、適当な宿主生物に同時形質移入する。二重特異性抗体を作成するための更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210(1986)を参照されたい。
ヘテロ複合抗体は、2つの共有結合した抗体からなる。このような抗体は、例えば、免疫系細胞を不要な細胞に対してターゲティングさせるため(米国特許第4,676,980号)及びHIV感染の治療のために(WO 91/00360; WO 92/200373; EP 03089)提案されている。この抗体は、架橋剤に関連したものを含む合成タンパク化学における既知の方法を使用して、インビトロで調製することができると考えられる。例えば、ジスルフィド交換反応を使用するか又はチオエーテル結合を形成することにより、免疫毒素を作成することができる。この目的に対して好適な試薬の例には、イミノチオレート及びメチル-4-メルカプトブチリミデート、及び例えば米国特許第4,6767,980号に開示されているものが含まれる。
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌治療における抗体の有効性を向上させるのが望ましい。例えば、システイン残基をFc領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成させるようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上した内部移行能力及び/又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体-依存性細胞性細胞毒性(ADCC)を有しうる。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体はまた、Wolff等, Cancer research 53: 2560-2565 (1993)に記載されたような異種二官能性架橋を用いても調製しうる。あるいは、抗体は、2つのFc領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びADCC能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。
本発明はまた、化学治療薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞毒性薬、あるいは放射性同位体(即ち、放射性複合)に複合された抗体を含む免疫複合体にも関する。
このような免疫複合体の生成に有用な化学治療薬は上記した。用いることのできる酵素活性毒素及びその断片は、ジフテリアA鎖、ジフテリア毒素の非結合活性断片、(緑膿菌からの)外毒素A鎖、リシンA鎖、アブリンA鎖、モデクシン(modeccin)A鎖、アルファ-サルシン、アレウリテス・フォーディ(Aleurites fordii)タンパク質、ジアンチン(dianthin)タンパク質、フィトラカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)タンパク質(PAPI、PAPII、及びPAP-S)、モモルディカ・チャランチア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン(crotin)、サパオナリア・オフィシナリス(sapaonaria oficinalis)インヒビター、ゲロニン(gelonin)、ミトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン(phenomycin)、エノマイシン(enomycin)及びトリコテセン(tricothecene)を含む。様々な放射性ヌクレオチドが放射性複合抗体の生成に利用可能である。例として、212Bi、131I、131In、90Y及び186Reを含む。
抗体及び細胞毒性薬の複合体は、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えば、N-スクシンイミジル-3-(2-ピリジルジチオール)プロピオネート(SPDP)、イミノチオラン(IT)、イミドエステルの二官能性誘導体(ジメチルアジピミデートHCL等)、活性エステル(ジスクシンイミジルスベレート等)、アルデヒド(グルタルアルデヒド等)、ビス-アジド化合物(ビス(p-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン等)、ビス-ジアゾニウム誘導体(ビス-(p-ジアゾニウムベンゾイル)-エチレンジアミン等)、ジイソシアネート(トリエン2,6-ジイソシアネート等)、及びビス-活性フッ素化合物(1,5-ジフルオロ-2,4-ジニトロベンゼン等)を用いて作成できる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238: 1098 (1987)に記載されたように調製することができる。カーボン-14-標識1-イソチオシアナトベンジル-3-メチルジエチレントリアミン五酢酸(MX-DTPA)は、放射性ヌクレオチドの抗体への複合のためのキレート剤の例である。WO 94/11026参照。
他の実施態様では、腫瘍の予備標的化で使用するために、抗体は「レセプター」(ストレプトアビジン等)に複合されてもよく、抗体-レセプター複合体は患者に投与され、次いで清澄化剤を用いて未結合複合体を循環から除去し、次に細胞毒性薬(例えば、放射性ヌクレオチド等)に複合された「リガンド」(アビジン等)を投与する。
また、ここに開示する抗体は、免疫リポソームとして調製してもよい。抗体を含むリポソームは、Epstein等, Proc. Natl. acad. Sci. USA, 82: 3688 (1985); Hwang等, Proc. natl. Acad. Sci. USA, 77: 4030 (1980); 及び米国特許第4,485,045号及び第4,544,545号に記載されたような、この分野で知られた方法で調製される。向上した循環時間を持つリポソームは、米国特許第5,013,556号に開示されている。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びPEG-誘導ホスファチジルエタノールアミン(PEG-PE)を含む脂質組成物での逆相蒸発法によって生成される。リポソームは、所定サイズの孔のフィルターを通して押し出され、所望の径を有するリポソームが生成される。本発明の抗体のFab'断片は、Martin等, J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982)に記載されているように、ジスルフィド交換反応を介してリポソームに複合され得る。化学治療薬(ドキソルビシン等)は、場合によってはリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)参照。
ここで同定されるPROポリペプチドに特異的に結合する抗体、並びに上記に開示したスクリーニングアッセイで同定された他の分子は、上記及び下記に記した種々の疾患の治療のために、製薬組成物の形態で投与することができる。
PROポリペプチドが細胞内であり、全抗体が阻害剤として用いられる場合、内在化抗体が好ましい。しかし、リポフェクション又はリポソームも抗体、又は抗体断片を細胞に導入するのに使用できる。抗体断片が用いられる場合、標的タンパク質の結合ドメインに特異的に結合する最小阻害断片が好ましい。例えば、抗体の可変領域配列に基づいて、標的タンパク質配列に結合する能力を保持したペプチド分子が設計できる。このようなペプチドは、化学的に合成でき、及び/又は組換えDNA技術によって生成できる。例えば、Marasco等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 7889-7893 (1993)を参照。
ここでの製剤は、治療すべき特定の徴候に必要な場合に1以上の活性化合物、好ましくは互いに悪影響を及ぼさない相補的活性を持つものも含んでよい。あるいは、又はそれに加えて、組成物は、細胞毒性薬、サイトカイン又は成長阻害剤を含んでもよい。これらの分子は、適切には、意図する目的に有効な量の組み合わせで存在する。
また、活性成分は、例えばコアセルベーション技術により又は界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えば、各々ヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ(メタクリル酸メチル)マイクロカプセル中、コロイド状薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミン小球、マイクロエマルション、ナノ粒子及びナノカプセル)中、又はマイクロエマルション中に包括されていてもよい。これらの技術は、Remington's Pharmaceutical Science, 上掲に開示されている。
持続放出製剤を調製してもよい。持続放出製剤の好適な例は、抗体を含有する固体疎水性ポリマーの半透性マトリクスを含み、このマトリクスは成形された物品、例えばフィルム、又はマイクロカプセルの形状である。持続放出性マトリクスの例は、ポリエステルヒドロゲル(例えば、ポリ(2-ヒドロキシエチル-メタクリレート)又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3,773,919号)、L-グルタミン酸及びγ-エチル-L-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、LUPRON DEPOT(商品名)(乳酸-グリコール酸コポリマーと酢酸リュープロリドの注射可能な小球)などの分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、ポリ-(D)-3-ヒドロキシブチル酸を含む。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸などのポリマーは分子を100日に渡って放出することができるが、ある種のヒドロゲルはより短時間でタンパク質を放出してしまう。カプセル化された抗体が身体内に長時間残ると、それらは37℃の水分に露出されることにより変性又は凝集し、その結果、生物学的活性の低下及び起こりうる免疫原性の変化をもたらす。合理的な方法は、含まれる機構に依存する安定化について工夫することができる。例えば、凝集機構がチオ−ジスルフィド交換を通した分子間S−S結合形成であると発見された場合、安定化はスルフヒドリル残基の修飾、酸性溶液からの凍結乾燥、水分含有量の制御、適切な添加剤の付加、及び特異的ポリマーマトリクス組成物の開発によって達成されうる。
PROポリペプチドに対する抗体を上述した種々の心臓血管、内皮及び血管形成病の治療に使用できることが予期されている。
抗体は、哺乳動物、好ましくはヒトに、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。抗体の静脈内投与が好ましい。
他の治療的養生法を例えば本発明の抗体の投与と組み合わせてもよい。例えば、抗体で癌の治療をする場合は、このような抗体で治療される患者は放射線治療を受けてもよい。あるいは、又はそれに加えて、患者に化学治療薬を投与してもよい。このような化学治療薬の調製法及び用量スケジュールは、製造者の指示に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定される。そのような化学治療に対する調製法及び用量スケジュールはまたChemotherapy Service M.C. Perry編, (Williams & Wilkins, Baltimore, MD, 1992)にも記載されている。化学治療薬は、抗体の投与に先立って、又は続いて投与してもよく、あるいはそれらと同時に投与してもよい。抗体は、タモキシフェン又はEVISTTM等の抗エストロゲン化合物又はオナプリストンなどの抗プロゲステロン(EP 616812参照)の、それらの分子について知られた用量と組み合わせてもよい。
また、抗体を癌の治療に使用する場合、他の腫瘍関連抗原に対する抗体、例えば一又は複数のErbB2、EGFR、ErbB3、ErbB4、又はVEGFレセプターに結合する抗体を投与することも好ましい。また、上述した薬剤も含む。抗体は適切に連続投与されるか、又は、放射活性物質の照射又は投与を含んでも含まなくても、放射線学的治療と組合せられる。あるいは、又はそれに加えて、ここで開示されており、同じか、又は二又はそれ以上の異なる抗原に対して結合する二又はそれ以上の抗体を、患者に同時投与してもよい。ときどきは、患者に一又は複数のサイトカインを投与することも有利である。好ましい実施態様では、ここの抗体は、成長阻害剤と同時投与される。例えば、まず成長阻害剤を投与し、続いて本発明の抗体を投与する。しかしながら、同時投与、又は本発明の抗癌剤を最初に投与することも考えられる。成長阻害剤についての適切な用量は現在用いられている量であるが、成長阻害剤とこの抗体との組み合わせ(相乗)効果により減少させ得る。
補助剤はその有効性に応じて変わり、便宜的な方式でスクリーニングされるマトリクスにより、腫瘍における影響力と比較することが望ましい。抗-PROポリペプチド抗体及びTNFの投与は、所望する臨床効果が達成されるまで繰り返される。また、抗-PROポリペプチド抗体は、TNF、場合によっては補助剤と共に投与される。固形腫瘍が、四肢又は一般的な循環器からの単離が可能な他の位置で見出される例では、ここに記載される治療薬は単離された腫瘍又は器官に投与される。他の実施態様において、FGF又はPDGFアンタゴニスト、例えば抗-FGF又は抗-PDGF中和剤は、抗-PROポリペプチド抗体と共に患者に投与される。抗-PROポリペプチド抗体を用いた治療は、好ましくは傷の治癒又は所望する新血管新生の期間中は中止する。
例えば、疾患の型及び重篤さに応じて、約1μg/kgから50mg/kg(例えば、0.1−20mg/kg)の抗体が、例えば、1又はそれ以上の別々の投与あるいは連続注入のいずれにしても、患者に投与するための最初の候補用量である。典型的な1日の用量は、上記の要因に応じて、約1μg/kgから100mg/kg又はそれ以上であろう。数日以上に渡る繰り返し投与のためには、状態に応じて、疾患の徴候に所望の抑制が現れるまで治療が続けられる。しかしながら、他の用量計画が有用であることもある。この治療の進行は、従来の技術及びアッセイ、例えばX線腫瘍イメージングによって容易に監視される。
また、抗体を収容する容器とラベルをも具備する製造品も提供される。このような製造品は上述しており、ここで活性剤は抗-PRO抗体である。
xii.抗体を使用する腫瘍の診断及び予知
抗体が使用される徴候が癌である場合、或る種の腫瘍で過剰発現される成長レセプター等の細胞表面タンパク質は候補薬剤又は腫瘍(例えば、癌)治療の優れた標的であるが、PROポリペプチドと同じタンパク質は腫瘍の診断及び予知におけるさらなる用途が見出されている。例えば、PROポリペプチドに対して向けられる抗体は腫瘍の診断及び予知に使用することができる。
例えば、抗体断片を含む抗体は、PROポリペプチドをコードする遺伝子を含む遺伝子の発現の定性的又は定量的検出に用いることができる。抗体は、好ましくは検出可能な、例えば蛍光標識を備え、結合は光学顕微鏡、フローサイトメトリー、フルオロメトリー、又はこの分野で知られた他の技術によって監視できる。このような結合アッセイは、実質的に上述のように実施される。
マーカー遺伝子産物に結合する抗体のインサイツ検出は、例えば、免疫蛍光又は免疫電子顕微鏡によって実施できる。この目的のために、組織学的試料を患者から取り出し、好ましくは生物学的試料に抗体を被せることにより、標識抗体をそれに適用する。この手法はまた、試験される組織におけるマーカー遺伝子産物の分布も決定できるようにする。当業者には、インサイツ検出のために広範な組織学的方法が容易に利用できることは明らかであろう。
本明細書で引用した全ての特許及び文献の開示の全体を、出典明示によりここに取り込む。
(実施例)
実施例で言及されている市販試薬は、特に示さない限りは製造者の使用説明に従い使用した。ATCC登録番号により以下の実施例及び明細書全体を通して特定されている細胞の供給源はアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、マナッサス、VAである。特に記さない限り、本発明は上記及び以下の教科書に記載されたもののような組換えDNA技術の標準的な手法を用いた:上掲のSambrook等; Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology(Green Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y., 1989); Innis等, PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications(Academic Press, Inc.; N.Y.., 1990); Harlow等, Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press: Cold Spring Harbor 1988); Gait, Oligonucleotide synthesis(IRL Press, Oxford, 1984); Freshney, Animal Cell Culture, 1987; Coligan等, Current Protocols in Immunology, 1991。
Swiss-Prot公的データベースからの約950の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ECD)配列(もしあれば、分泌シグナル配列を含む)を、ESTデータベースの検索に使用した。ESTデータベースは、公的データベース(例えば、Dayhoff、GenBank)及び企業のデータベース(例えば、LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST-2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて、ECDタンパク質配列のEST配列の6フレーム翻訳との比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, WA)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。
この細胞外ドメイン相同性スクリーニングを用いて、phrapを用いて他の同定されたEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。さらに、得られたコンセンサスDNA配列を、しばしば(常にではない)BLAST又はBLAST-2及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長し、コンセンサス配列を上で議論したEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた。
cDNAクローンの単離に用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CAからのもの等の市販試薬を用いて標準的な方法によって作成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、平滑末端でSalIヘミキナーゼアダプターに結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動でおよそのサイズ分類し、そして適切なクローニングベクター(pRK5B又はpRK5D等;pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)に、独特のXhoI及びNotI部位において、所定の方向でクローニングした。
1.オリゴdTプライムcDNAライブラリの調製
mRNAを対象とするヒト組織から、Invitrogen, San Diego, CAからの試薬及びプロトコールを用いて単離した(Fast Track 2)。このRNAを、Life Technologies, Gaithersburg, MD (Super Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いるベクターpRK5DにおけるオリゴdTプライムしたcDNAの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAは1000bpを越えるサイズ分類し、SalI/NotI結合cDNAをXhoI/NotI切断ベクターにクローニングした。pRK5Dを、sp6転写開始部位、それに続くSfiI制限酵素部位、さらにXhoI/NotIcDNAクローニング部位を持つベクターにクローニングした。
2.ランダムプライムcDNAライブラリの調製
一次cDNAクローンの5’末端を好ましく表現するために二次cDNAライブラリを作成した。Sp6RNAを(上記の)一次ライブラリから生成し、このRNAを、ベクターpSST-AMY.0におけるLife Technologies (上で参照したSuper Script Plasmid System)からの試薬及びプロトコールを用いたランダムプライムしたcDNAライブラリの生成に使用した。この方法において、二本鎖cDNAを500−1000bpにサイズ分類し、平滑末端でNotIアダプターに結合させ、SfiI部位で切断し、そしてSfiI/NotI切断ベクターにクローニングした。pSST-AMY.0は、cDNAクローニング部位の前に酵母アルコールデヒドロゲナーゼプロモータ、及びクローニング部位の後にマウスアミラーゼ配列(分泌シグナルを持たない成熟配列)に次いで酵母アルコールデヒドロゲナーゼ転写終結区を有するクローニングベクターである。即ち、アミラーゼ配列でフレームに融合するこのベクターにクローニングされたcDNAは、適当に形質移入された酵母コロニーからのアミラーゼの分泌を導くであろう。
上記2パラグラフに記載したライブラリからのDNAを氷上で冷却し、それにエレクトロコンピテントDH10B細菌(Life Technoligies、20ml)を添加した。細菌及びベクターの混合物は、次いで製造者に推奨されているように電気穿孔した。次いで、SOC培地(Life Technplogies、1ml)を添加し、この混合物を37℃で30分間インキュベートした。形質転換体は、次いでアンピシリンを含む20標準150mmLBプレートに蒔き、16時間インキュベートした(37℃)。ポジティブコロニーをプレートから廃棄し、細菌ペレットから標準的な方法、例えばCsCl-勾配を用いてDNAを単離した。精製DNAは、次いで以下の酵母プロトコールにのせた。
酵母方法は3つの範疇に分けられる:(1)酵母のプラスミド/cDNA結合ベクターでの形質転換;(2)アミラーゼを分泌する酵母クローンの検出及び単離;及び(3)酵母コロニーから直接的な挿入物のPCR増幅及び配列決定及びさらなる分析のためのDNAの精製。
用いた酵母菌株はHD56-5A(ATCC-90785)であった。この株は以下の遺伝子型:MATアルファ、ura3-52、leu2-3、leu2-112、his3-11、his3-15、MAL+、SUC+、GAL+を有する。好ましくは、不完全な翻訳後経路を持つ酵母変異体を用いることができる。このような変異体は、sec71、sec72、sec62に転位不全対立遺伝子を持つが、切断されたsec71が最も好ましい。あるいは、これらの遺伝子の正常な操作を阻害するアンタゴニスト(アンチセンスヌクレオチド及び/又はリガンドを含む)、この翻訳後経路に含まれる他のタンパク質(例えば、SEC61p、SEC72p、SEC62p、SEC63p、TDJ1p又はSSA1p-4p)又はこれらのタンパク質の複合体形成も、アミラーゼ発現酵母と組み合わせて好ましく用いられる。
次いで細胞を収穫し、5,000rpmで5分間のSorval GS3 ローターのGS3ローターボトルに移し、上清を捨て、次いで無菌水に再懸濁することにより形質転換のために調製し、そして50mlのファルコン管内で、Beckman GS-6KR遠心機において3,500rpmで再度遠心分離した。上清を捨て、細胞をLiAc/TE(10ml, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH7.5, 100mMのLi2OOCCH3)で続けて洗浄し、LiAc/TE(2.5ml)中に再懸濁させた。
形質転換は、マイクロチューブ内で、調製した細胞(100μl)を新鮮な変性一本鎖サケ精子DNA(Lofstrand Labs, Gaitherburg, MD)及び形質転換DNA(1μg. vol.<10μl)と混合することにより起こした。混合物はボルテックスにより簡単に混合し、次いで40%PEG/TE(600μl, 40%のポリエチレングリコール-4000, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA, 100mMのLi2OOCCH3, pH 7.5)を添加した。この混合物を緩く撹拌し、30℃で撹拌しながら30分間インキュベートした。次いで細胞に42℃で15分間熱衝撃を与え、反応容器をミクロチューブ内で12,000rpmで5-10秒間遠心分離し、デカント及びTE(500μl, 10mMのトリス-HCl, 1mMのEDTA pH 7.5)への再懸濁に次いで遠心分離した。次いで、細胞をTE(1ml)中に希釈し、アリコート(200μl)を150mm成長プレート(VWR)に予め調製した選択培地に拡げた。
用いた選択培地は、Kaiser等, Methods in Yeast Genetics, Cold Spring Harbor press, Cold Spring Harbor, NY, p. 208-210 (1994)に記載されているように調製したウラシルを欠く合成完全デキストロース寒天(SCD-Ura)であった。形質転換体は30℃で2−3日成長させた。
アミラーゼを分泌するコロニーの検出は、選択成長培地における赤色デンプンの包含により実施した。Biely等, Anal. Biochem., 172: 176-179 (1988)に記載された方法に従って、デンプンを赤色染料(反応性 Red-120, Sigma)に結合させた。結合したデンプンをSCD-Ura寒天プレートに最終濃度0.15%(w/v)で導入し、リン酸カリウムでpH7.0に緩衝した(最終濃度50-100mM)。
ポジティブコロニーを拾って新鮮な選択培地(150mmプレート)に画線し、良好に単離され同定可能な単一コロニーを得た。アミラーゼ分泌についてポジティブな良好に単離されたコロニーは、緩衝SCD-Ura寒天への赤色団分の直接導入により検出した。ポジティブコロニーは、デンプンを分解して、ポジティブコロニーの周囲に直接目視できる暈を形成する能力により決定した。
ポジティブコロニーが単離された場合、その一部を楊枝で拾い、96ウェルプレートにおいて無菌水(30μl)に希釈した。この時点で、ポジティブコロニーは凍結して次の分析のために保存するか、即座に増幅するかのいずれかである。細胞のアリコート(5μl)を、0.5μlのKlentaq(Clontech, Palo Alto, CA); 4.0μlの10mM dNTP(Perkin Elmer-Cetus); 2.5μlのKentaqバッファー(Clontech); 0.25μlの正方向オリゴ1;0.25μlの逆方向オリゴ2;12.5μlの蒸留水を含有する25μl容量におけるPCR反応のテンプレートとして使用した。正方向オリゴヌクレオチド1の配列は:
5'- TGTAAAACGACGGCCAGTTAAATAGACCTGCAATTATTAATCT-3'
(配列番号:1)であった。
逆方向オリゴヌクレオチド2の配列は:
5'-CAGGAAACAGCTATGACCACCTGCACACCTGCAAATCCATT-3'
(配列番号:2)であった。
次いで、PCRは以下の通り実施した:
a. 変性 92℃、 5分間
b.次の3サイクル: 変性 92℃、30秒間
アニール 59℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
c.次の3サイクル: 変性 92℃、30秒間
アニール 57℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
d.次の25サイクル:変性 92℃、30秒間
アニール 55℃、30秒間
伸長 72℃、60秒間
e. 保持 4℃
PCRに続いて、反応のアリコート(5μl)を、上掲のSambrook等に記載されたように1%アガロースゲル中でトリス-ボレート-EDTA(TBE)緩衝系を用いたアガロースゲル電気泳動により試験した。400bpより大きな単一で強いPCR産物をもたらすクローンを、96 Qiaquick PCR 清浄化カラム(Qiagen Inc., Chatsworth, CA)での精製の後にDNA配列によりさらに分析した。
種々のポリペプチド-コード化核酸配列は、ジェネンテク,インク(South San Francisco, CA)によって開発された独自の配列発見アルゴリズムを、公的(例えば、GenBank)及び/又は私的(LIFESEQ(登録商標), Incyte Pharmaceuticals, Inc., Palo Alto, CA)データベースからのESTs並びに集団化及び構築されたEST断片に適用することにより同定した。シグナル配列アルゴリズムは、考慮している配列又は配列断片の5'-末端の第1の、場合によっては第2のメチオニンコドン(ATG)を取り囲むDNAヌクレオチドの文字に基づく分泌シグナルスコアを計算する。第1のATGに続くヌクレオチドは、停止コドンを持たない少なくとも35の不明瞭でないアミノ酸をコードしなければならない。第1のATGが必要なアミノ酸を有する場合、第2のものは試験しない。何れも要件を満たさない場合、候補配列にスコアをつけなかった。EST配列が真正のシグナル配列を含むか否かを決定するために、ATGコドンを取り囲むDNA及び対応するアミノ酸配列を、分泌シグナルに関連することが知られた7つのセンサー(評価パラメータ)の組を用いてスコアをつけた。このアルゴリズムの使用により、多くのポリペプチド-コード化核酸配列の同定がなされた。
上記実施例1に記載したように、phrapを用いて他のESTに対してコンセンサスDNA配列を組み立てた。このコンセンサス配列を、ここでDNA28765と命名する。DNA28765コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO172の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正及び逆)の対を合成した:
28765.f(OLI644):
5'-GGATCTCGAGAACAGCTACTCC-3'(配列番号:5)
28765.r(OLI645):
5'-TCGTCCACGTTGTCGTCACATG-3'(配列番号:6)
さらに、合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブはDNA28765配列から作成し、それは以下のヌクレオチド配列を持っていた:
28765.p(OLI643)ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-AAATCTGTGAATTGAGTGCCATGGACCTGTTGCGGACGGCCCTTGCTT-3'(配列番号:7)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO172遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリー作成のためのRNAはヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA35916−1161[図1、配列番号:3]の全長DNA配列;及びPRO172の誘導タンパク質配列が得られた。
図2(配列番号:4)に示した全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析法に基づいて、PRO172はデルタ-1マウスタンパク質と89%のアミノ酸配列同一性を示す。
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、TIEリガンドファミリーと相同性を示すESTを同定した。
cDNAライブライの作成のためのRNAはヒト胎児肺組織から単離した。PRO178をコードするcDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、SalIヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5Bは、SfiI部位を持たないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい)に独特のXhol及びNotI部位においてクローン化した。
上述のEST配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO178の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には40−55bp長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通り:
NL8.5-1:
5'-ACGTAGTTCCAGTATGGTGTGAGCAGCAACTGGA-3'(配列番号:10)
NL8.3-1:
5'-AGTCCAGCCTCCACCCTCCAGTTGCT-3'(配列番号:11)
NL8.3-12
5'-CCCCAGTCCTCCAGGAGAACCAGCA-3'(配列番号:12)
図4(配列番号:9)に示した全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析法に基づいて、PRO178(ここでNL8と命名する)はTIE2レセプターのリガンド1及びリガンド2の両方と23%のアミノ酸配列同一性を示す。TIE2レセプターのリガンド1及びリガンド2は、PRO178に対して各々64%同一及び40−43%同一である。「TIE」という略語は、「チロシンキナーゼ含有Ig及びEGF相同ドメイン(tyrosine kinase containing Ig and EGF homology domains)」の頭文字を表し、レセプターチロシンキナーゼ類の新たなファミリーを指すのに作られた。
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列は、BLAST及びFastA配列アラインメントにより、アンギオポエチン(angiopoietin)タンパク質をコードするヌクレオチド配列と配列相同性を有することがわかった。このcDNA配列を、ここでDNA10028及び/又はDNA25250と命名する。配列相同性に基づいて、DNA10028分子の配列からプローブを調製し、実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎児肝臓ライブラリ(LIB6)のスクリーニングに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)、cDNAサイズカットは2800bp未満であった。
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO179遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
図6(配列番号:14)に示した全長PRO179配列のアミノ酸配列の分析は、それがアンギオポエチンファミリーのタンパク質と有意な類似性を有し、よってPRO179が新規なアンギオポエチンファミリーのメンバーであることを示唆している。より詳細には、Dayhoffデータベース(ハ゛ーシ゛ョン35.45 Swiss Prot 35)の分析により、PRO179と以下のDayhoff配列との有意な相同性が明らかになった:AF004326_1, P_R94605, HSU83508_1, P_R94603, P_R94317, AF025818_1, HSY16132_1, P_R65760, I37391及びHUMRSC192_1。
Incyte, Inc.からの発現配列タグ(EST)のヒト結腸cDNAライブラリ(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)における相同配列の検索に、インシュリンファミリーのタンパク質のメンバーであるリラキシンの核酸配列を用いた。2つのEST、Incyte 番号INC2328985及びINC778319が得られ、各々リラキシン核酸配列の領域に約40%の相同性を持ち、インシュリン-様ポリペプチド(ILP)の遺伝子内の配列を表現している。
cDNAライブラリは、Clontech Laboratories, Inc. Palo Alto, CA, カタログ番号6537-1から得たヒト子宮mRNAから構築した。PRO182の全長核酸配列は、上記のプラスミドcDNAライブラリのスクリーニングにより、Incyte, Inc.からのEST配列(Incyte EST INC2328985及びEST INC778319)に基づいて設計したオリゴヌクレオチドを用いたコロニーハイブリダイゼーションにより得た。PRO178をコードするcDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、SalIヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5Bは、SfiI部位を持たないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい)に独特のXhol及びNotI部位においてクローン化した。
上述のEST配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO178全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドプローブを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には40−55bp長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
5'-CACATTCAGTCCTCAGCAAAATGAA-3'(配列番号:17)
5'-GAGAATAAAAACAGAGTGAAAATGGAGCCCTTCATTTTGC-3'(配列番号:18)
5'-CTCAGCTTGCTGAGCTTGAGGGA-3'(配列番号:19)
全長クローン[DNA27865−1091]が同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置39−41に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置444−446に停止シグナルを持つ(図7、配列番号:15)。予測されるポリペプチド前駆体は135アミノ酸長であり、約15,319ダルトンの算定分子量及び約7.39の見積もりpIを持つ。図8(配列番号:16)に示した全長PRO182配列の分析により、図8に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図8に示した全長PRO182ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸18のシグナルペプチド;約アミノ酸107〜約アミノ酸111のcAMP-及びcGMP-依存性プロテインキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸3〜約アミノ酸9、約アミノ酸52〜約アミノ酸58、約アミノ酸96〜約アミノ酸102、約アミノ酸125〜約アミノ酸131のN-ミリストイル化部位;及び約アミノ酸121〜約アミノ酸136のインシュリンファミリーシグネーチャー。クローンDNA27865−1091は1997年9月23日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209296が付与された。
図8(配列番号:16)に示した全長配列の(ALIGNコンピュータプログラムを用いた)BLAST及びFastA配列アラインメント分析法に基づいて、PRO182は公知のポリペプチド分子と相同性だが明らかに相違しており、よってPRO182ポリペプチドはインシュリンファミリーのタンパク質の新たなメンバーを構成する。
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、アンドロゲン誘導成長因子としても知られる線維芽細胞成長因子(FGF-8)と相同性を示すEST(番号IN843193)を同定した。
cDNAライブライの作成のためのRNAはヒト胎児肺組織から単離した。PRO187をコードするcDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、SalIヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5Bは、SfiI部位を持たないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい)に独特のXhol及びNotI部位においてクローン化した。
上述のEST配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO187の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドプローブを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には40−55bp長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
種々の組織供給源からの幾つかのライブラリを以下のオリゴヌクレオチドプローブでのPCR増幅によりスクリーニングした:
IN843193.f(OLI315):
5'-CAGTACGTGAGGGACCAGGGCGCCATGA-3'(配列番号:22)
IN843193.r(OLI317):
5'-CCGGTGACCTGCACGTGCTTGCCA-3'(配列番号:23)
次いで、上記のオリゴヌクレオチドの一方と以下のオリゴヌクレオチドプローブを用いてFGF-8相同遺伝子をコードするクローンを単離するためにポジティブライブラリを用いた:
IN843193.p(OLI316):
5'-GCGGATCTGCCGCCTGCTCANCTGGTCGGTCATGGCGCCCT-3'(配列番号:24)
図10(配列番号:21)に示した全長配列の(ALIGNコンピュータプログラムを用いた)BLAST及びFastA配列アラインメント分析法に基づいて、PRO187は、ヒト線維芽細胞成長因子(アンドロゲン誘導成長因子)と74%のアミノ酸配列同一性を示す。
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、TIEリガンドファミリーと相同性を示すESTを同定した。 cDNAライブライの作成のためのRNAはヒト胎児肺組織から単離した。PRO188をコードするcDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリーは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、SalIヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5Bは、SfiI部位を持たないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい)に独特のXhol及びNotI部位においてクローン化した。
上述のEST配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO188の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には40−55bp長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
用いたオリゴヌクレオチドプローブは以下の通り:
NL5.5-1:
5'-CAGGTTATCCCAGAGATTTAATGCCACCA-3'(配列番号:27)
NL5.3-1:
5'-TTGGTGGGAGAAGTTGCCAGATCAGGTGGTGGCA-3'(配列番号:28)
NL5.3-12
5'-TTCACACCATAACTGCATTGGTCCA-3'(配列番号:29)
図12(配列番号:26)に示した全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析法に基づいて、PRO188(ここでNL5と命名する)はTIE2レセプターのリガンド1及びリガンド2の両方と24%のアミノ酸配列同一性を示す。TIE2レセプターのリガンド1及びリガンド2は、PRO188に対して各々64%同一及び40−43%同一である。「TIE」という略語は、「チロシンキナーゼ含有Ig及びEGF相同ドメイン(tyrosine kinase containing Ig and EGF homology domains)」の頭文字を表し、レセプターチロシンキナーゼ類の新たなファミリーを指すのに作られた。
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列は、ここでDNA13199_ABI2と命名する。DNA13199_ABI2は、次いで、公的データベース(例えば、GenBank)を含む種々の発現タグ配列(EST)データベースと比較し、存在する相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。同定したコンセンサス配列を、ここでDNA22778と命名する。
DNA13199_ABI2配列及びDNA22778配列に基づいて、オリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト胎盤ライブラリ(LIB89)をスクリーニングするのに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)、cDNAサイズカットは2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(22778.f):
5'-ACAAGCTGAGCTGCTGTGACAG-3'(配列番号:32)
逆方向PCRプライマー(22778.r):
5'-TGATTCTGGCAACCAAGATGGC-3'(配列番号:33)
さらに、DNA22778コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ(22778.p)
5'-ATGGCCTTGGCCGGAGGTTCGGGGACCGCTTCGGCTGAAG-3'(配列番号:34)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO195遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
全長PRO195ポリペプチド(図14;配列番号:31)のアミノ酸配列の分析は、それが公知のタンパク質と有意な類似性を持たないことを示唆している。しかし、Dayhoffデータベース(ハ゛ーシ゛ョン35.45 Swiss Prot 35)の分析により、PRO195と以下のDayhoff配列との或る程度の相同性が明らかになった:P_P91380, AF035118_1, HUMTROPCS_1, NUOD_SALTY及びE70002。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列(ジェネンテクが独自に開発したESTを含む)に対してコンセンサスDNA配列を構築した。構築したコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO212の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-CACGCTGGTTTCTGCTTGGAG-3'(配列番号:37)
逆方向PCRプライマー:
5'-AGCTGGTGCACAGGGTGTCATG-3'(配列番号:38)
さらに、コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-CCCAGGCACCTTCTCAGCCAGCCAGCAGCTCCAGCTCAGAGCAGTGCCAGCCC-3'(配列番号:39)
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA30942−1134[図15、配列番号:35])の全長DNA配列;及びPRO212の誘導タンパク質配列が得られた。
DNA30942−1134の全コード化配列が図15(配列番号:35)に含まれる。クローンDNA30942−1134は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置101−103に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1001−1003に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は300アミノ酸長である。図16(配列番号:36)に示した全長PRO212配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図16に示した全長PRO212ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸23のシグナルペプチド;約アミノ酸173〜約アミノ酸177のN-グリコシル化部位;約アミノ酸63〜約アミノ酸67、及び約アミノ酸259〜約アミノ酸263のcAMP及びcGMP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸28〜約アミノ酸37のチロシンキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸156〜約アミノ酸162、約アミノ酸178〜約アミノ酸184、約アミノ酸207〜約アミノ酸213、約アミノ酸266〜約アミノ酸272、及び約アミノ酸287〜約アミノ酸293のN-ミリストイル化部位。クローンDNA30942−1134は1997年9月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209254が付与された。
図16(配列番号:36)に示した全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、PRO212はTNFR2に幾分のアミノ酸配列同一性を示した(28.7%)。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してEGF様相同体をコードするコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA28744と命名する。構築したDNA28744コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO214の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー(OLI556):
5'-ATTCTGCGTGAACACTGAGGGC-3'(配列番号:42)
逆方向PCRプライマー(OLI557):
5'-ATCTGCTTGTAGCCCTCGGCAC-3'(配列番号:43)
さらに、DNA28744コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ(OLI555):
5'-CCTGGCTATCAGCAGGTGGGCTCCAAGTGTCTCGATGTGGATGAGTGTGA-3'(配列番号:44)
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA32286−1191[図17、配列番号:40])の全長DNA配列;及びPRO214の誘導タンパク質配列が得られた。
DNA32286−1191の全コード化配列が図17(配列番号:40)に含まれる。クローンDNA32286−1191は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置103−105に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1363−1365に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は420アミノ酸長である。図18(配列番号:41)に示した全長PRO214配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図18に示した全長PRO214ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸29のシグナルペプチド;約アミノ酸342〜約アミノ酸392の膜貫通ドメイン;約アミノ酸79〜約アミノ酸83、及び約アミノ酸205〜約アミノ酸209のN-グリコシル化部位;約アミノ酸290〜約アミノ酸294のcAMP及びcGMP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸321〜約アミノ酸333のアスパラギン酸及びアスパラギンヒドロキシル化部位;及び約アミノ酸181〜約アミノ酸193のEGF様ドメインシステインパターンシグネーチャー。クローンDNA32286−1191は1997年10月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209385が付与された。 図18(配列番号:41)に示した全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、PRO214はHTタンパク質及び/又はフィブリンにアミノ酸配列同一性を示した(各々49%及び38%)。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA28760と命名する。構築したDNA28760コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO217の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-AAAGACGCATCTGCGAGTGTCC-3'(配列番号:47)
逆方向PCRプライマー:
5'-TGCTGATTTCACACTGCTCTCCC-3'(配列番号:48)
さらに、DNA28760コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-CCCACGATGTATGAATGGTGGACTTTGTGTGACTCCTGGTTTCTGCATC-3'(配列番号:49)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO217遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児肺組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA33094−1131[図19、配列番号:45])の全長DNA配列;及びPRO217の誘導タンパク質配列が得られた。
図20(配列番号:46)に示した全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、PRO217は新規なEGF様相同体であることが明らかになった。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA30845と命名する。構築したDNA30845コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO224の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-AAGTTCCAGTGCCGCACCAGTGGC-3'(配列番号:52)
逆方向PCRプライマー:
5'-TTGGTTCCACAGCCGAGCTCGTCG-3'(配列番号:53)
さらに、DNA30845コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-GAGGAGGAGTGCAGGATTGAGCCATGTACCCAGAAAGGGCAATGCCCACC-3'(配列番号:54)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO224遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児肝臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA33221−1133[図21、配列番号:50])の全長DNA配列;及びPRO224の誘導タンパク質配列が得られた。
全長PRO224配列のアミノ酸配列の分析は、それが極低密度リポタンパク質レセプター、アポリポプロテインEレセプター及びニワトリ卵母細胞レセプターP95に対して相同性を持つことを示唆している。図22(配列番号:51)に示した全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、PRO224はこれらのタンパク質の一部に対して28%〜45%の範囲のアミノ酸同一性を持ち、これらのタンパク質との全体的な同一性は約33%であることが示された。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA30933と命名し、コードされるポリペプチドは推定酸ホスファターゼタンパク質と幾分の相同性を有する。構築したDNA30933コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO231の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー1:
5'-CCAACTACCAAAGCTGCTGGAGCC-3'(配列番号:57)
正方向PCRプライマー2:
5'-GCAGCTCTATTACCACGGGAAGGA-3'(配列番号:58)
逆方向PCRプライマー:
5'-TCCTTCCCGTGGTAATAGAGCTGC-3'(配列番号:59)
さらに、DNA30933コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-GGCAGAGAACCAGAGGCCGGAGGAGACTGCCTCTTTACAGCCAGG-3'(配列番号:60)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO231遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児肝臓組織から単離した。
DNA34434−1139の全コード化配列が図23(配列番号:55)に含まれる。クローンDNA34434−1139は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置173−175に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1457−1459に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は428アミノ酸長であり、約48,886ダルトンの算定分子量及び約6.39の見積もりpIを持つ。図24(配列番号:56)に示した全長PRO231配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図24に示した全長PRO231ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸23のシグナルペプチド;約アミノ酸218〜約アミノ酸222のcAMP及びcGMP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸280〜約アミノ酸288のチロシンキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸15〜約アミノ酸21、約アミノ酸117〜約アミノ酸123、約アミノ酸118〜約アミノ酸124、約アミノ酸179〜約アミノ酸185、約アミノ酸240〜約アミノ酸246、及び約アミノ酸387〜約アミノ酸393のN-ミリストイル化部位;約アミノ酸216〜約アミノ酸220のアミド化部位;約アミノ酸10〜約アミノ酸32のロイシンジッパーパターン;及び約アミノ酸50〜約アミノ酸65のヒスチジン酸ホスファターゼシグネーチャー。クローンDNA34434−1139は1997年9月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209252が付与された。
全長PRO231配列のアミノ酸配列の分析は、それがヒト及びラット前立腺の酸ホスファターゼ前駆体タンパク質と、各々30%及び31%のアミノ酸同一性を有することを示唆している。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA30927と命名する。構築したDNA30927コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO235の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-TGGAATACCGCCTCCTGCAG-3'(配列番号:63)
逆方向PCRプライマー:
5'-CTTCTGCCCTTTGGAGAAGATGGC-3'(配列番号:64)
さらに、DNA30927コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-GGACTCACTGGCCCAGGCCTTCAATATCACCAGCCAGGACGAT-3'(配列番号:65) 全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO235遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児肝臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA35558−1167[図25、配列番号:61])の全長DNA配列;及びPRO235の誘導タンパク質配列が得られた。
図26に示す全長PRO235配列のアミノ酸配列の分析は、その一部がヒト、マウス及びアフリカツメガエルプレキシン(plexin)タンパク質と有意な相同性を有し、よってPRO235が新規なプレキシンタンパク質であることを示している。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA30954と命名し、当該ポリペプチドは、膜貫通タンパク質レセプターチロシンキナーゼタンパク質と幾分の構造的相同性を示した。構築したDNA30954コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO245の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-ATCGTTGTGAAGTTAGTGCCCC-3'(配列番号:68)
逆方向PCRプライマー:
5'-ACCTGCGATATCCAACAGAATTG-3'(配列番号:69)
さらに、DNA30954コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-GGAAGAGGATACAGTCACTCTGGAAGTATTAGTGGCTCCAGCAGTTCC-3'(配列番号:70)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO245遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児肝臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA35638−1141[図27、配列番号:66])の全長DNA配列;及びPRO245の誘導タンパク質配列が得られた。
図28(配列番号:67)に示す全長PRO245配列のアミノ酸配列の分析は、その一部がヒトc-mybタンパク質と60%のアミノ酸同一性を有し、よって膜貫通タンパク質レセプターチロシンキナーゼファミリーの新規なメンバーであることを示唆している。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA30843と命名する。構築したDNA30843コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO261の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-AAAGGTGCGTACCCAGCTGTGCC-3'(配列番号:73)
逆方向PCRプライマー:
5'-TCCAGTCGGCAGAAGCGGTTCTGG-3'(配列番号:74)
さらに、DNA30843コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-CCTGGTGCTGGATGGCTGTGGCTGCTGCCGGGTATGTGCACGGCGGCTGGG-3'(配列番号:75)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO261遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児肝臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA33473−1176[図29、配列番号:71])の全長DNA配列;及びPRO261の誘導タンパク質配列が得られた。
図30(配列番号:72)に示す全長PRO261配列のアミノ酸配列の分析は、その一部がCTGFと有意な相同性を有し、よってPRO261が新規な成長因子であることを示唆している。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA35705と命名する。構築したDNA35705コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO269の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー1:
5'-TGGAAGGAGATGCGATGCCACCTG-3'(配列番号:78)
正方向PCRプライマー2:
5'-TGACCAGTGGGGAAGGACAG-3'(配列番号:79)
正方向PCRプライマー3:
5'-ACAGAGCAGAGGGTGCCTTG-3'(配列番号:80)
逆方向PCRプライマー1:
5'-TCAGGGACAAGTGGTGTCTCTCCC-3'(配列番号:81)
逆方向PCRプライマー2:
5'-TCAGGGAAGGAGTGTGCAGTTCTG-3'(配列番号:82)
さらに、DNA35705コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-ACAGCTCCCGATCTCAGTTACTTGCATCGCGGACGAAATCGGCGCTCGCT-3'(配列番号:83)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO269遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA38260−1180[図31、配列番号:76]の全長DNA配列;及びPRO269の誘導タンパク質配列が得られた。
図32(配列番号:77)に示す全長PRO269配列のアミノ酸配列の分析は、その一部がヒトのトロンボモジュリンタンパク質と有意な相同性を有し、よってPRO269が一又は複数のトロンボモジュリン様ドメインを有することを示している。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA28728と命名する、又はPRO287をコードする延長したコンセンサス配列を構築し、それはI型プロコラーゲンC-プロテイナーゼエンハンサータンパク質及びI型プロコラーゲンC-プロテイナーゼエンハンサータンパク質前駆体に対して類似性を示した。構築したDNA28728コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO287の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-CCGATTCATAGACCTCGAGAGT-3'(配列番号:86)
逆方向PCRプライマー:
5'-GTCAAGGAGTCCTCCACAATAC-3'(配列番号:87)
さらに、DNA28728コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-GTGTACAATGGCCATGCCAATGGCCAGCGCATTGGCCGCTTCTGT-3'(配列番号:88)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO287遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA39969−1185[図33、配列番号:84]の全長DNA配列;及びPRO287の誘導タンパク質配列が得られた。
図34(配列番号:85)に示す全長PRO287配列のアミノ酸配列の分析は、それが一又は複数のプロコラーゲンC-プロテイナーゼエンハンサータンパク質前駆体又はプロコラーゲンC-プロテイナーゼエンハンサータンパク質様ドメインを有することを示唆している。全長配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析に基づいて、PRO287は、プロコラーゲンC-プロテイナーゼエンハンサータンパク質前駆体及びプロコラーゲンC-プロテイナーゼエンハンサータンパク質とアミノ酸配列同一性を示す(各々、47%及び54%)。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA35936と命名する。構築したDNA35936コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO301の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー1:
5'-TCGCGGAGCTGTGTTCTGTTTCCC-3'(配列番号:91)
正方向PCRプライマー2:
5'-ACACCTGGTTCAAAGATGGG-3'(配列番号:92)
正方向PCRプライマー2:
5'-TTGCCTTACTCAGGTGCTAC-3'(配列番号:93)
逆方向PCRプライマー1:
5'-TAGGAAGAGTTGCTGAAGGCACGG-3'(配列番号:94)
逆方向PCRプライマー2:
5'-ACTCAGCAGTGGTAGGAAAG-3'(配列番号:95)
さらに、DNA35936コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-TGATCGCGATGGGGACAAAGGCGCAAGCTCGAGAGGAAACTGTTGTGCCT-3'(配列番号:96)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO301遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児腎臓組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA40628−1216[図35、配列番号:89]の全長DNA配列;及びPRO301の誘導タンパク質配列が得られた。
図36(配列番号:90)に示す全長PRO301配列のBLAST及びFastA配列アラインメント分析は、PRO301がA33抗原前駆体(30%)及びコクサッキー及びアデノウイルスレセプタータンパク質(29%)とアミノ酸配列同一性を示した。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA30875と命名する。構築したDNA30875コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO323の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー1:
5'-AGTTCTGGTCAGCCTATGTGCC-3'(配列番号:99)
正方向PCRプライマー2:
5'-CGTGATGGTGTCTTTGTCCATGGG-3'(配列番号:100)
逆方向PCRプライマー1:
5'-CTCCACCAATCCCGATGAACTTGG-3'(配列番号:101)
さらに、DNA30875コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-GAGCAGATTGACCTCATACGCCGCATGTGTGCCTCCTATTCTGAGCTGGA-3'(配列番号:102)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO323遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児肝臓組織(LIB6)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA35595−1228[図37、配列番号:97]の全長DNA配列;及びPRO323の誘導タンパク質配列が得られた。DNA35595配列の特徴付けで使用するため及び他のcDNAライブラリをスクリーニングするためにDNA35595配列から以下のような付加的プローブを作成した:
正方向PCRプライマー:
5'-TGCTGCTGCTCCAGCCTGTAACC-3'(配列番号:103)
逆方向PCRプライマー:
5'-CTGGCCGTAGCTGAAATTGCGC-3'(配列番号:104)
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-ACTCAGTAGTCCCAGCACCCAGGGCCTGCAAGAGCAGGCACGG-3'(配列番号:105)
図38(配列番号:98)に示す全長PRO323配列のアミノ酸配列分析は、その一部が種々のジペプチダーゼタンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、よってPRO323が新規なジペプチダーゼタンパク質であることを示している。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。構築したコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO331の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。 PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-GCCTTTGACAACCTTCAGTCACTAGTGG-3'(配列番号:108)
逆方向PCRプライマー:
5'-CCCCATGTGTCCATGACTGTTCCC-3'(配列番号:109)
さらに、DNAコンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-TACTGCCTCATGACCTCTTCACTCCCTTGCATCATCTTAGAGCGG-3'(配列番号:110)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO331遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児脳組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA40981−1234[図39、配列番号:106]の全長DNA配列;及びPRO331の誘導タンパク質配列が得られた。
図40(配列番号:107)に示す全長PRO331配列のアミノ酸配列分析は、その一部がLIG-Iタンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、よってPRO331が新規なLIG-I関連タンパク質であることを示している。
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、TIEリガンドファミリーと相同性を示すEST(#2939340)を同定した。PRO356をクローン化するために、Clontech, Inc., (Palo Alto, CA)から購入したmRNA、カタログ番号#6528-1から調製したヒト胎児肺ライブラリを、製造者の指示に従って使用した。
PRO356をコードするcDNAクローンを単離するために用いたcDNAライブラリは、Invitrogen, San Diego, CA からのもの等の市販試薬を用いて標準的方法によって形成した。cDNAは、NotI部位を含むオリゴdTでプライムし、SalIヘミキナーゼアダプターの平滑末端で結合させ、NotIで切断し、ゲル電気泳動で適当にサイズ分割をし、定まった方向で適当なクローニングベクター(pRKB又はpRKD等;pRK5Bは、SfiI部位を持たないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253:1278-1280 (1991)を参照されたい)に独特のXhol及びNotI部位においてクローン化した。
上述のEST配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO356の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には40−55bp長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
用いたオリゴヌクレオチド配列は以下の通り:
5'-TTCAGCACCAAGGACAAGGACAATGACAACT-3'(配列番号:113)
5'-TGTGCACACTTGTCCAAGCAGTTGTCATTGTC-3'(配列番号:114)
5'-GTAGTACACTCCATTGAGGTTGG-3'(配列番号:115)
cDNAクローンが同定され、全体が配列決定された。DNA47470−1130−P1の全ヌクレオチド配列を図41(配列番号:111)に示す。クローンDNA47470−1130−P1は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置215−217に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1253−1255に停止コドンを持つ(図41、配列番号:111)。予測されるポリペプチド前駆体は346アミノ酸長である。全長PRO356反を図42(配列番号:112)に示す。
クローンDNA47470−1130−P1は1997年10月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209422が付与された。寄託されたクローンは、ここに提供する表示ではなく実際の正しい配列を有すると理解される。
図42(配列番号:112)に示した全長配列のALIGN-2配列アラインメント分析法を用いたDayhoffデータベース(ハ゛ーシ゛ョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO356アミノ酸配列とTIE-2L1(32%)及びTIE-2L2(34%)の両方との間のアミノ酸配列同一性が示された。「TIE」という略語は、「チロシンキナーゼ含有Ig及びEGF相同ドメイン(tyrosine kinase containing Ig and EGF homology domains)」の頭文字を表し、レセプターチロシンキナーゼ類の新たなファミリーを指すのに作られた。
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、腫瘍壊死因子レセプター(TNFR)ファミリーのポリペプチドのメンバーと相同性を示すポリペプチドをコードしたEST(Incyte EST no. 3003460)を同定した。
BLAST(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))及び「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)の繰り返しサイクルを用いてIncyte EST no. 3003460及び他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。コンセンサス配列を、ここで「<concen01>」と命名し、またここでDNA44825とも呼ぶ。DNA44825及び「<concen01>」コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO364の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドプローブを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーは一般的に20から30ヌクレオチドの範囲であり、しばしば約100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には40−55bp長である。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。 用いたオリゴヌクレオチド配列は以下の通り:
正方向PCRプライマー(44825.f1):
5'-CACAGCACGGGGCGATGGG-3'(配列番号:118)
正方向PCRプライマー(44825.f2):
5'-GCTCTGCGTTCTGCTCTG-3'(配列番号:119)
正方向PCRプライマー(44825.GITR.f):
5'-GGCACAGCACGGGGCGATGGGCGCGTTT-3'(配列番号:120)
逆方向PCRプライマー(44825.r1):
5'-CTGGTCACTGCCACCTTCCTGCAC-3'(配列番号:121)
逆方向PCRプライマー(44825.r2):
5'-CGCTGACCCAGGCTGAG-3'(配列番号:122)
正方向PCRプライマー(44825.GITR.r):
5'-GAAGGTCCCCGAGGCACAGTCGATACA-3'(配列番号:123)
さらに、DNA44825コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ(44825.p1):
5'-GAGGAGTGCTGTTCCGAGTGGGACTGCATGTGTGTCCAGC-3'(配列番号:124)
ハイブリダイゼーションプローブ(44825.GITR.p):
5'-AGCCTGGGTCAGCGCCCCACCGGGGGTCCCGGGTGCGGCC-3'(配列番号:125)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO364遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、PRO364の全長DNA配列が与えられた[ここで、DNA47365−1206と命名する]。DNA47365−1206の全ヌクレオチド配列を図43(配列番号:116)に示す。クローンDNA47365−1206は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置121−123に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置844−846に停止コドンを持つ(図43;配列番号:116)。予測されるポリペプチド前駆体は241アミノ酸長であり、約26,000ダルトンの算定分子量及び約6.34の見積もりpIを持つ。全長PRO364タンパク質を図44(配列番号:117)に示す。
図44(配列番号:117)に示した全長PRO364配列の分析により、図44に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。全長PRO364配列(図44;配列番号:117)の分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸25のシグナルペプチド;約アミノ酸163〜アミノ酸183の膜貫通ドメイン;約アミノ酸146〜約アミノ酸150のN-グリコシル化部位;約アミノ酸5〜約アミノ酸11、約アミノ酸8〜約アミノ酸14、約アミノ酸25〜約アミノ酸31、約アミノ酸30〜約アミノ酸36、約アミノ酸33〜約アミノ酸39、約アミノ酸118〜約アミノ酸124、約アミノ酸122〜約アミノ酸128、約アミノ酸156〜約アミノ酸162のN-ミリストイル化部位;約アミノ酸166〜約アミノ酸177の原核生物膜タンパク脂質結合部位;及び約アミノ酸171〜約アミノ酸193のロイシンジッパーパターン。クローンDNA47365−1206は1997年11月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209436が付与された。
図44(配列番号:117)に示す全長PRO364配列の分析は、その一部が腫瘍壊死因子レセプターファミリーのメンバーと有意な相同性を有することを示唆し、よってPRO364が腫瘍壊死因子レセプターファミリーの新規なメンバーであることを示している。
全長PRO364ポリペプチドのアミノ酸配列及び当該アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列の詳細な検査により、Nocenti等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94: 6216-6221 (1997)に報告されたマウスGITRタンパク質との配列相同性が明らかになった。従って、PRO364はNocentini等に報告されたマウスGITRタンパク質のヒト対応物を代表する。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。最初のコンセンサスDNA配列を同定し、ここでDNA39626.initと命名した。最初のコンセンサス配列をBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて延長させ、最初のコンセンサス配列を上述のEST配列の供給源を用いて可能な限り延長させた。延長した構築配列をここで<comsen01>と命名する。構築した<concen01>DNAコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO364の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-TGGCTGCCCTGCAGTACCTCTACC-3'(配列番号:128)
逆方向PCRプライマー:
5'-CCCTGCAGGTCATTGGCAGCTAGG-3'(配列番号:129)
さらに、DNAコンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-AGGCACTGCCTGATGACACCTTCCGCGACCTGGGCAACCTCACAC-3'(配列番号:130)
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA44184−1319[図45、配列番号:126]の全長DNA配列;及びPRO526の誘導タンパク質配列が得られた。
DNA44184−1319の全コード化配列が図45(配列番号:126)に含まれる。クローンDNA44184−1319は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置514−516に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1933−1935に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は473アミノ酸長であり、約50,708ダルトンの算定分子量及び約9.28の見積もりpIを持つ。図46(配列番号:127)に示した全長PRO526配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図46に示した全長PRO526ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸26のシグナルペプチド;約アミノ酸135〜アミノ酸157のロイシンジッパーパターン;約アミノ酸436〜約アミノ酸440のグリコサミノグリカン接着部位;約アミノ酸82〜約アミノ酸86、約アミノ酸179〜約アミノ酸183、約アミノ酸237〜約アミノ酸241、約アミノ酸372〜約アミノ酸376、約アミノ酸423〜約アミノ酸427のN-グリコシル化部位;約アミノ酸411〜約アミノ酸427のフォン・ウィルブランド因子C型ドメイン。クローンDNA44184−1319は1998年4月26日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209704が付与された。
図46(配列番号:127)に示す全長PRO526配列のアミノ酸配列分析は、その一部が、ALS、SLIT、カルボキシペプチダーゼ及び血小板糖タンパク質Vを含むロイシンリピートリッチタンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、よってPRO526がタンパク質-タンパク質相互作用に含まれる新規なタンパク質であることを示している。
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、マウスGFRα3(「グリア細胞系誘導神経栄養性因子ファミリーレセプターアルファア」)と61%の同一性を有するIncyte EST(INC3574209)を同定した。PRO538の対応する全長cDNAをクローニングするためにcDNAのパネルを以下のプライマーでスクリーニングした:
newa3.F:
5'-GCCTCTCGCAGCCGGAGACC-3'(配列番号:133)
newa3.R:
5'-CAGGTGGGATCAGCCTGGCAC-3'(配列番号:134)
ライブラリからのDNAを、Ausubel等, Current Protocols in Molecular Biology (1995)に従って、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。強いPCR産物が分析した全てのライブラリで同定された(胎児肺、胎児腎臓、及び胎盤)。
このタンパク質をコードするcDNAクローンを単離するために、ヒト胎児肺-pRK5ベクターを選択し、newa3.Rプライマーを用いたダグ/バング(dug-/bung-)宿主で増殖させたプラスミドライブラリからの一本鎖DNAの延長によりポジティブcDNAクローンについて濃縮した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児肺組織から単離した。
newa3.プローブ:
5'-TCTCGCAGCCGGAGACCCCCTTCCCACAGAAAGCCGACTCA-3'(配列番号:135) 5つのポジティブクローンが同定された。コロニー精製及び2回目のスクリーニングの後に純粋なポジティブクローンが得られた。単離したクローンのうち2つを配列決定し、ここでDNA48613及びDNA48614(又はDNA48613のスプライシング形態)と命名する。
図48(配列番号:132)に示した全長PRO538配列の分析により、図48に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。全長PRO538配列(図48;配列番号:132)の分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸26のシグナルペプチド;約アミノ酸95〜アミノ酸99、約アミノ酸148〜約アミノ酸152、約アミノ酸309〜アミノ酸313のN-グリコシル化部位;約アミノ酸231〜約アミノ酸235のcAMP及びcGMP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸279〜約アミノ酸285、約アミノ酸294〜約アミノ酸300のN-ミリストイル化部位;及び約アミノ酸306〜約アミノ酸317及び約アミノ酸379〜約アミノ酸390の原核生物膜タンパク脂質結合部位。クローンDNA48613−1268は1998年4月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209752が付与された。
全長PRO538ポリペプチド(図48;配列番号:132に示す)のBLAST-2及びFastA配列アラインメント分析に基づくGFRαファミリー間のアミノ酸配列比較を以下に提供する。
配列比較から、ヒトGFRα3は、GFRα1又はGFRα2のいずれよりも、その齧歯類相同体との関係が少ないことがわかる。GFRα3は、GFRα1とGFRα2相互間よりもGFRα1及びGFRα2に対して関係が薄いことがわかる。
発現配列タグ(EST)DNAデータベース(LIFESEQ(登録商標)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を検索し、VEGFと相同性を示すポリペプチドをコードするEST(Incyte EST no. 1302516)を同定した。Incyte EST no. 1302516の基づくプローブを、ヒト神経膠腫細胞系G61から誘導されたcDNAライブラリのスクリーニングに使用した。特にINC1302516は以下の4つのプローブを作成するのに使用した:
5'-ACTTCTCAGTGTCCATAAGGG-3'(配列番号:138)
5'-GAACTAAAGAGAACCGATACCATTTTCTGGCCAGGTTGTC-3'(配列番号:139)
5'-CACCACAGCGTTTAACCAGG-3'(配列番号:140)
5'-ACAACAGGCACAGTTCCCAC-3'(配列番号:141)
9つのポジティブが同定され特徴づけられた。3つのクローンは全コード化領域を含み配列中に同定された。また、部分的クローンも胎児肺ライブラリから同定され、コード化アミノ酸は変化させない1つのヌクレオチド変化を除いて神経膠腫誘導配列と一致した。
図50(配列番号:137)に示した全長PRO713配列の分析により、図50に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。全長PRO713配列(図50;配列番号:137)の分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸14のシグナルペプチド;約アミノ酸25〜アミノ酸29、約アミノ酸55〜約アミノ酸59、約アミノ酸254〜約アミノ酸258のN-グリコシル化部位;約アミノ酸15〜約アミノ酸21、約アミノ酸117〜約アミノ酸123、約アミノ酸127〜約アミノ酸133、約アミノ酸281〜約アミノ酸287、約アミノ酸282〜約アミノ酸288、約アミノ酸319〜約アミノ酸325のN-ミリストイル化部位;及び約アミノ酸229〜約アミノ酸233のアミド化部位。クローンDNA29101−1122は1998年3月5日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209653が付与された。
図50(配列番号:137)に示す全長PRO713配列の分析は、それが新規なVEGF関連タンパク質(VEGF-E)であることを示唆している。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してEGF様相同体をコードするコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA44851と命名し、それはまた、IncyteESTクローン番号179903と完全に対応する。DNA44851コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO719の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー(44851.f1):
5'-GTGAGCATGAGCGAGCCGTCCAC-3'(配列番号:144)
逆方向PCRプライマー(44851.r1):
5'-GCTATTACAACGGTTCTTGCGGCAGC-3'(配列番号:145)
さらに、DNA44851コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ(44851.p1):
5'-TTGACTCTCTGGTGAATCAGGACAAGCCGAGTTTTGCCTTCCAG-3'(配列番号:146)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO719遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎盤組織(LIB90)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA49646−1327[図51、配列番号:142])の全長DNA配列;及びPRO719の誘導タンパク質配列が得られた。
全長PRO719ポリペプチドのアミノ酸配列の分析により、それがリポタンパク質リパーゼHプロテインと有意な配列相同性を有することが示唆され、よってPRO719が新規なリポタンパク質リパーゼ相同体であることが示された。より詳細には、Dayhoffデータベース(ハ゛ーシ゛ョン35.45 Swiss Prot 35)の分析により、PRO719アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:LIPL_HUMAN, LIPH_HUMAN, D83548_1, A24059_1, P_R30740, D88666_1, A43357, A46696, B43357及びA49488。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここで<consen01>と命名する。<concen01>DNAコンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO713の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-CAGCAATATTCAGAAGCGGCAAGGG-3'(配列番号:149)
逆方向PCRプライマー:
5'-CATCATGGTCATCACCACCATCATCATC-3'(配列番号:150)
さらに、<consen01>DNAコンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-GGTTACTACAAGCCAACACAATGTCATGGCAGTGTTGGACAGTGCTGG-3'(配列番号:151)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO771遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト胎児腎臓組織(LIB28)から単離した。
DNA49829−1346の全コード化配列が図53(配列番号:147)に含まれる。クローンDNA49829−1346は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置134−136に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1442−1444に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は436アミノ酸長であり、約49,429ダルトンの算定分子量及び約4.80の見積もりpIを持つ。図54(配列番号:148)に示した全長PRO771配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図54に示した全長PRO771ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸16のシグナルペプチド;約アミノ酸115〜アミノ酸119のcAMP及びcGMP依存性プロテインキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸62〜約アミノ酸70のチロシンキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸357〜約アミノ酸363、約アミノ酸371〜約アミノ酸377、及び約アミノ酸376〜約アミノ酸382のN-ミリストイル化部位;約アミノ酸246〜約アミノ酸268のロイシンジッパーパターン。クローンDNA49829−1346は1998年4月7日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209749が付与された。
全長PRO771ポリペプチドのアミノ酸配列分析は、それがテスチカン(testican)タンパク質と有意な相同性を有することを示唆し、よってPRO771が新規なテスチカン相同体であることを示している。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここで「<consen01>」と命名する。ここに提供するデータに基づいて、ARS及びE48抗原と相同性を示すIncyte EST 2777282を同定した。構築した「<consen01>」配列及びここに提供する他のデータに基づいて、Incyte EST 2777282を得て全体を配列決定し、ここでDNA56405−1357(図55、配列番号:152)と称されるPRO788の全長DNA配列;及びPRO788の誘導タンパク質配列を得た。
DNA56405−1357の全コード化配列が図55(配列番号:152)に含まれる。クローンDNA56405−1357は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置84−86に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置459−461に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は125アミノ酸長であり、約13,115ダルトンの見積もり分子量及び約5.90のpIを持つ。図56(配列番号:153)に示した全長PRO788配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図56に示した全長PRO788ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸17及び約アミノ酸46〜約アミノ酸50のシグナルペプチド;約アミノ酸3〜アミノ酸9、約アミノ酸33〜約アミノ酸39、及び約アミノ酸84〜約アミノ酸90のN-ミリストイル化部位;及び約アミノ酸6〜約アミノ酸17の原核生物膜リポタンパク脂質結合部位。クローンDNA56405−1357は1998年5月6日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209849が付与された。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA38106と命名し、それはまた、Incyte ESTクローン番号1988930に完全に対応している。DNA38106コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO792の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-GCGAGAACTGTGTCATGATGCTGC-3'(配列番号:156)
逆方向PCRプライマー:
5'-GTTTCTGAGACTCAGCAGCGGTGG-3'(配列番号:157)
さらに、38106DNAコンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-CACCGTGTGACAGCGAGAAGGACGGCTGGATCTGTGAGAAAAGGCACAAC-3'(配列番号:158)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO792遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA56352−1358[図57、配列番号:154]の全長DNA配列;及びPRO792の誘導タンパク質配列が得られた。
全長PRO792ポリペプチドのアミノ酸配列分析は、それがCD23タンパク質タンパク質と有意な配列類似性を有することを示唆し、よってPRO792が新規なCD23相同体であることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(ハ゛ーシ゛ョン35.45 Swiss Prot 35)の分析により、PRO792アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:S34198, A07100-1, A05303_1, P_R41689, P_P82839, A10871_1, P_R12796, P_R47199, A46274及びP_R32188。
上記の実施例3に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してDNA59205−1421を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteESTクラスター番号170079と命名されるLIFESEQ(商品名)からのESTクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのESTクラスター配列を、公的データベース(例えば、GenBank)及び企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA55721と命名する。
DNA55721配列とIncyteEST番号388964との間の配列相同性に鑑みて、IncyteEST番号388964を購入し、cDNA挿入物を得て配列決定した。このcDNA挿入物の配列を図59(配列番号:159)に示し、ここでDNA59205−1421と命名する。
図60(配列番号:160)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO812アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:P_W35802, P_W35803, PSCI_RAT, S68231, GEN13917, PSC2_RAT, CC10_HUMAN, UTER_RABIT, AF008595_1,及びA56413。
上記実施例2に記載したようなアミラーゼスクリーニングにおいて単離されたcDNA配列を、ここでDNA37642又はDNA37642.initと命名する。DNA37642配列は、次いで、公的データベース(例えば、GenBank)及び企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較し、それらの間の相同性を同定した。相同性検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul及びGish, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。公知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。得られた構築物及びコンセンサス配列を、ここでDNA48615と命名する。
DNA48615コンセンサス配列に基づいて、DNA48615分子の配列からオリゴヌクレオチドプローブを生成させ、上記実施例2のパラグラフ1に記載したように調製したヒト腎臓ライブラリ(LIB227)をスクリーニングするのに使用した。クローニングベクターはpRK5Bであり(pRK5BはSfiI部位を含まないpRK5Dの前駆体である;Holmes等, Science, 253: 1278-1280 (1991)参照)、cDNAサイズカットは2800bp未満であった。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー(48615.f1):
5'-AAGCTGCCGGAGCTGCAATG-3'(配列番号:163)
正方向PCRプライマー(48615.f2):
5'-TTGCTTCTTAATCCTGAGCGC-3'(配列番号:164)
正方向PCRプライマー(48615.f3):
5'-AAAGGAGGACTTTCGACTGC-3'(配列番号:165)
逆方向PCRプライマー(48615.r1):
5'-AGAGATTCATCCACTGCTCCAAGTCG-3'(配列番号:166)
逆方向PCRプライマー(48615.r1):
5'-TGTCCAGAAACAGGCACATATCAGC-3'(配列番号:167)
さらに、コンセンサスDNA48615配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ(48615.p1):
5'-AGACAGCGGCACAGAGGTGCTTCTGCCAGGTTAGTGGTTACTTGGATGAT-3'(配列番号:168)
全長クローン[DNA53974−1401]が同定され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置173−175に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1577−1579に停止シグナルを持つ(図61、配列番号:161)。予測されるポリペプチド前駆体は468アミノ酸長であり、約54,393ダルトンの算定分子量及び約5.63の見積もりpIを持つ。図62(配列番号:162)に示した全長PRO865配列の分析により、図62に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図62に示した全長PRO865ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸23のシグナルペプチド;約アミノ酸280〜約アミノ酸284、約アミノ酸384〜約アミノ酸388のN-グリコシル化部位;約アミノ酸94〜約アミノ酸98のアミド化部位;約アミノ酸20〜約アミノ酸24及び約アミノ酸223〜約アミノ酸227のグリコサミノグリカン接着部位;約アミノ酸216〜約アミノ酸223のアミノトランスフェラーゼクラス-Vピリドキサルリン酸部位;及び約アミノ酸338〜約アミノ酸344のインターロイキン-7反部位。クローンDNA53974−1401は1998年4月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209774が付与された。
全長PRO865ポリペプチド(図62;配列番号:162)のアミノ酸配列の分析は、それが公知のタンパク質と有意な類似性を持たないことを示唆している。しかし、Dayhoffデータベース(ハ゛ーシ゛ョン35.45 Swiss Prot 35)の分析により、PRO865と以下のDayhoff配列との或る程度の相同性が明らかになった:YMN0_YEAST, ATFCA4_43, S44168, P_W14549及びRABTCRG4_1。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA34363と命名した。コンセンサス構築には、ジェネンテクが独自に開発したESTを用いた。ジェネンテクESTは、ここでDNA13059及びDNA19463と命名する。DNA34363コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1075の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー(34363.f1):
5'-TGAGAGGCCTCTCTGGAAGTTG-3'(配列番号:171)
正方向PCRプライマー(34363.f2):
5'-GTCAGCGATCAGTGAAAGC-3'(配列番号:172)
正方向PCRプライマー(34363.f3):
5'-CCAGAATGAAGTAGCTCGGC-3'(配列番号:173)
正方向PCRプライマー(34363.f4):
5'-CCGACTCAAAATGCATTGTC-3'(配列番号:174)
正方向PCRプライマー(34363.f5):
5'-CATTTGGCAGGAATTGTCC-3'(配列番号:175)
正方向PCRプライマー(34363.f6):
5'-GGTGCTATAGGCCAAGGG-3'(配列番号:176)
逆方向PCRプライマー(34363.r1):
5'-CTGTATCTCTGGGCTATGTCAGAG-3'(配列番号:177)
逆方向PCRプライマー(34363.r2):
5'-CTACATATAATGGCACATGTCAGCC-3'(配列番号:178)
さらに、34363DNAコンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ(34363.p1):
5'-CGTCTTCCTATCCTTACCCGACCTCAGATGCTCCCTTCTGCTCCTG-3'(配列番号:179)
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA57689−1385[図63、配列番号:169]の全長DNA配列;及びPRO1075の誘導タンパク質配列が得られた。
DNA57689−1385の全コード化配列が図63(配列番号:169)に含まれる。クローンDNA57689−1385は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置137−139に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1355−1357に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は406アミノ酸長であり、約46,927ダルトンの見積もり分子量及び約5.21のpIを持つ。図64(配列番号:170)に示した全長PRO1075配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図64に示した全長PRO1075ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸29のシグナルペプチド;約アミノ酸203〜アミノ酸212のチロシンキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸225〜約アミノ酸231のN-グリコシル化部位;約アミノ酸403〜約アミノ酸408の小胞体標的化配列。クローンDNA57689−1385は1998年5月14日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209869が付与された。
全長PRO1075ポリペプチドのアミノ酸配列分析は、それがプロテインジスルフィドイソメラーゼと有意な配列類似性を有することを示唆し、よってPRO1075が新規なプロテインジスルフィドイソメラーゼであることを示している。より詳細には、Dayhoffデータベース(ハ゛ーシ゛ョン35.45 Swiss Prot 35)の分析により、PRO1075アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:CELC30H7_2, CELC06A6_3, CELF42G8_3, S57942, ER72_CAEEL, CELC07A12_3, CEH06O01_4及びP_R51696。
上記の実施例3に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してDNA60615−1483を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteESTクラスター番号121249と命名されるLIFESEQ(商品名)からのESTクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのESTクラスター配列を、公的データベース(例えば、GenBank)及び企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA56250と命名する。
DNA56250配列IncyteESTクローン番号1437250との間の配列相同性に鑑みて、IncyteEST番号1437250を購入し、cDNA挿入物を得て配列決定した。このcDNA挿入物の配列を図65(配列番号:180)に示し、ここでDNA60615−1483と命名する。
図66(配列番号:181)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1126アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:NOMR_HUMAN, MMUSMYOC3_1, HS454G6_1, P_R98225, RNU78105_1, RNU72487_1, AF035301_1, CEELC48E7_4及びCEF11C3_3。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA34360と命名する。DNA34360コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1130の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー(34360.f1):
5'-GCCATAGTCACGACATGGATG-3'(配列番号:184)
正方向PCRプライマー(34360.f2):
5'-GGATGGCCAGAGCTGCTG-3'(配列番号:185)
正方向PCRプライマー(34360.f3):
5'-AAAGTACAAGTGTGGCCTCATCAAGC-3'(配列番号:186)
逆方向PCRプライマー(34360.r1):
5'-TCTGACTCCTAAGTCAGGCAGGAG-3'(配列番号:187)
逆方向PCRプライマー(34363.r2):
5'-ATTCTCTCCACAGACAGCTGGTTC-3'(配列番号:188)
さらに、34360DNAコンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ(34360.p1):
5'-GTACAAGTGTGGCCTCATCAAGCCCTGCCCAGCCAACTACTTTGCG-3'(配列番号:189)
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA59814−1486[図67、配列番号:182]の全長DNA配列;及びPRO1130の誘導タンパク質配列が得られた。
DNA59814−1486の全コード化配列が図67(配列番号:182)に含まれる。クローンDNA59814−1486は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置312−314に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置984−986に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は224アミノ酸長であり、約24,963ダルトンの見積もり分子量及び約9.64のpIを持つ。図68(配列番号:183)に示した全長PRO1130配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図68に示した全長PRO1130ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸15のシグナルペプチド;約アミノ酸184〜アミノ酸192のATP/GTP-結合部位モチーフA(P-loop);及び約アミノ酸107〜約アミノ酸111のN-グリコシル化部位。クローンDNA59814−1486は1998年10月28日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203359が付与された。
図68(配列番号:183)に示した全長配列のWU-BLAST2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(ハ゛ーシ゛ョン35.45 Swiss Prot 35)の分析により、PRO1130アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:P_W06547, 216_HUMAN, D87120_1, MMU72677_1, LAU04889_1, 及びD69319。
上記の実施例3に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してDNA59846−1503を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、LIFESEQ(商品名)からのESTクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのESTクラスター配列を、公的データベース(例えば、GenBank)及び企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA56250と命名する。
ここに提供する開示に鑑みて、EST2169375(微小血管内皮細胞ライブラリからのライブラリ309-ENDCNOT03-)を含むIncyteクローンを購入し、さらに試験して配列決定した。このcDNA挿入物の配列を図69(配列番号:190)に示し、ここでDNA59846−1503と命名する。
図70(配列番号:191)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1154アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:AB011097_1, AMPN_HUMAN, RNU76997_1, I59331, GEN14047, HSU62768_1, P_R51281, CET07F10_1, SSU66371_1, 及びAMPRE_HUMAN。
上記の実施例3に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してDNA64883−1526を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteESTクラスター番号7874と称されるESTクラスター配列のLIFESEQ(商品名)からの同定が可能となった。次いでこのESTクラスター配列を、公的データベース(例えば、GenBank)及び企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。海綿体の組織から構築したライブラリから一又は複数のESTを誘導した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。構築物は、「DNA18313」、「DNA22812」及びIncyte EST番号3202349と称するEST配列を含んでいた。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA56011と命名する。
DNA56011とIncyte EST番号3202349との間の相同性に鑑みて、Incyte EST番号3202349を購入し、cDNA挿入物を得て配列決定した。このcDNA挿入物の配列を図71(配列番号:192)に示し、ここでDNA64883−1526と命名する。
図72(配列番号:193)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1244アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:AF008554_1, P_485334, G02297, HUMN33S11_1, HUMN33S10_1, YO13_CAEEL, GEN13255, S49758, E70107, 及びERP5_MEDSA。
上記の実施例3に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してDNA64885−1529を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteESTクラスター番号56853と命名されるLIFESEQ(商品名)からのESTクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのESTクラスター配列を、公的データベース(例えば、GenBank)及び企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA56021と命名する。
DNA56021配列IncyteEST番号2481345との間の配列相同性に鑑みて、IncyteEST番号2481345を購入し、cDNA挿入物を得て配列決定した。このcDNA挿入物の配列を図73(配列番号:194)に示し、ここでDNA64885−1529と命名する。
図74(配列番号:195)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1246アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:P_R51355, CELK09C4_1, BCU44852_1.1DS_HUMAN, G65169, E64903, ARSA_HUMAN, GL6S_HUMAN, HSARSF_1, 及びGEN12648。
新規な分泌分子であるDNA57700を、Incyteの企業データベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)及びGenBankの公的データベースに対するBLAST法に使用した。ポジティブクローンを同定してseqextプログラムにより構築物ファイルの作成に使用した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA59573と命名する。
DNA59573配列及びその構築物で同定された配列に対する関係に基づいて
構築物中の配列の一つを含むクローンの一つ(IncyteESTクローン番号2623992)を購入し、cDNA挿入物を得て配列決定した。Incyteクローン2623992は乳房表皮ケラチノサイトからのRNAで構成されたライブラリからのものである。このcDNA挿入物の配列を図75(配列番号:196)に示し、ここでDNA64889−1541と命名する。 DNA64889−1541の全コード化配列が図75(配列番号:196)に含まれる。クローンDNA64889−1541は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置24−26に見かけの翻訳開始部位を持ち、そしてヌクレオチド位置354−356の停止コドンで終端する(図75)。予測されるポリペプチド前駆体は110アミノ酸長である(図76;配列番号:197)。図60に示す全長PRO1274タンパク質は、約12,363の見積もり分子量及び約8.31のpIを有する。図76(配列番号:197)に示した全長PRO1274配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図76に示した全長PRO1274ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸24のシグナルペプチド;約アミノ酸71〜アミノ酸75のN-グリコシル化部位;約アミノ酸76〜約アミノ酸96、及び約アミノ酸42〜約アミノ酸61のインシュリンファミリータンパク質相同ブロック。クローンDNA64889−1541は1998年9月9日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203250が付与された。
図76(配列番号:197)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1274アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:CEW05B2_9, AF016922_1(インシュリン様成長因子1), B48151, A53640, BTIGF2REC_1(インシュリン様成長因子2), HSNFIGEN12_1, TXA3_RADMA(ニューロトキシン3), CXM1_CONGE, P_P61301, TXA4_RADMA(ニューロトキシン4)。
上記の実施例3に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してDNA64903−1553を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteESTクラスター番号86809と命名されるLIFESEQ(商品名)からのESTクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのESTクラスター配列を、公的データベース(例えば、GenBank)及び企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。構築物中のESTは、腫瘍、細胞系、又は疾患細胞から同定されたものを含んでいた。一又は複数のESTは、疾患結腸組織から単離下RNAから構築したcDNAライブラリから得た。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA58822と命名する。
DNA58822配列IncyteEST番号1695434との間の配列相同性に鑑みて、IncyteEST番号1695434を購入し、cDNA挿入物を得て配列決定した。このcDNA挿入物の配列を図77(配列番号:198)に示し、ここでDNA64903−1553と命名する。
図78(配列番号:199)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1286アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:SR5C_ARATH, CELC17H12_11, MCPD_ENTAE, JQ2283, INVO_LEMCA, P_R07309, ADEVBCAGN_4, AF20947_1, CELT23H2_1, 及びMDH_STRAR。
上記の実施例3に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してDNA64905−1558を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteESTクラスター番号10559と命名されるLIFESEQ(商品名)からのESTクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのESTクラスター配列を、公的データベース(例えば、GenBank)及び企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA57203と命名する。
DNA57203配列とIncyteESTクローン番号3037763との間の配列相同性に鑑みて、IncyteEST番号3037763を購入し、cDNA挿入物を得て配列決定した。このcDNA挿入物の配列を図79(配列番号:200)に示し、ここでDNA64905−1558と命名する。
図80(配列番号:201)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1294アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:173636, AF028740_1, AB006686S3_1, P_R98225, RNU78105_1, CELC48E7_4, CEF11C3_3, SCP1_MESAU, TPM3_HUMAN, 及びCELK05B2_3。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA47347と命名する。DNA47347コンセンサス配列及びDNA47347が誘導された構築物のIncyteESTに対するその相同性に基づいて、Incyteクローン1430305を購入して全体を配列決定した。それによりPRO1303をコードする配列を同定した。
図82(配列番号:203)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1303アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:AB009849_1, P_W08475, AF024605_1, A42048_1, TRY3_RAT, MMAE00066414, TRY1_RAT, MMAE000663_4, MMAE000665_2, 及びMMAE00066412。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA35745と命名する。DNA35745コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1304の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー(35745.f1):
5'-GTGTTCTGCTGGAGCCGATGCC-3'(配列番号:206)
正方向PCRプライマー(35745.f2):
5'-GACATGGACAATGACAGG-3'(配列番号:207)
正方向PCRプライマー(35745.f3):
5'-CCTTTCAGGATGTAGGAG-3'(配列番号:208)
正方向PCRプライマー(35745.f4):
5'-GATGTCTGCCACCCCAAG-3'(配列番号:209)
逆方向PCRプライマー(35745.r1):
5'-GCATCCTGATATGACTTGTCACGTGGC-3'(配列番号:210)
逆方向PCRプライマー(35745.r2):
5'-TACAAGAGGGAAGAGGAGTTGCAC-3'(配列番号:211)
さらに、DNA35745コンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ(35745.p1):
5'-GCCCATTATGACGGCTACCTGGCTAAAGACGGCTCGAAATTCTACTGCAGCC-3'(配列番号:212)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1304遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト骨髄組織(LIB255)から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA65406−1567[図83、配列番号:204]の全長DNA配列;及びPRO1304の誘導タンパク質配列が得られた。
図84(配列番号:205)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1304アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:AF040252_1, P_R28980, S71238, CELC05C8_1, VFU52045_1, S75144, FKB3_BOVIN, CELC50F2_6, CELB0511_12, 及びP_R41781。
DNA65406−1567配列は、IncyteESTクローン番号2813577の挿入物の単離及び配列決定によっても得られた。
DNA55773を、ヒト胎児腎臓cDNAライブラリにおいて、酵母スクリーニングによって単離し、それは好ましくは一次cDNAクローンの5'末端を表現する。
全長クローン[DNA61873−1574]が単離され、それは単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置7−9に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置643−645に見かけの停止コドンを持つ(図85;配列番号:213)。予測されるポリペプチド前駆体は212アミノ酸長であり、約24,024ダルトンの算定分子量及び約6.26の見積もりpIを持つ。図86(配列番号:214)に示した全長PRO1312配列の分析により、図86に示すような種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図86に示した全長PRO1312ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸14のシグナルペプチド;約アミノ酸141〜アミノ酸160の膜貫通ドメイン;及び約アミノ酸76〜約アミノ酸80、及び約アミノ酸93〜約アミノ酸97のN-グリコシル化部位。クローンDNA61873−1574は1998年8月18日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203132が付与された。
図86(配列番号:214)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1312アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:GCINTALPH_1, GIBMUC1A_1, P_R96298, AF001406_1, PVU88874_1, P_R85151, AF041409_1, CELC50F2_7, C45875, 及びAB009510_21。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA64876と命名する。DNA64876コンセンサス配列、及びDNA57711と称されるジェネンテクが独自に開発したEST配列との配列相同性の検索にに基づいて、Merck/ワシントン大学EST配列(R80613と称する)が、DNA64876及びDNA57711と有意な相同性を持つことがわかった。従って、Merck/ワシントン大学ESTクローン番号R80613を購入し、その挿入物を得て配列決定することによりPRO1313のタンパク質配列を誘導した。
DNA64966−1575の全コード化配列が図87(配列番号:215)に含まれる。クローンDNA64966−1575は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置115−117に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置1036−1038に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は307アミノ酸長であり、約35,098ダルトンの見積もり分子量及び約8.11のpIを持つ。図88(配列番号:216)に示した全長PRO1313配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図88に示した全長PRO1313ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸106〜約アミノ酸121、約アミノ酸136〜アミノ酸152、約アミノ酸172〜約アミノ酸188、約アミノ酸230〜約アミノ酸245及び約アミノ酸272〜約アミノ酸285の膜貫通ドメイン;約アミノ酸34〜約アミノ酸38、約アミノ酸135〜約アミノ酸139及び約アミノ酸203〜約アミノ酸207のN-グリコシル化部位;約アミノ酸165〜約アミノ酸171、約アミノ酸196〜約アミノ酸202、約アミノ酸240〜約アミノ酸246、約アミノ酸247〜約アミノ酸253のN-ミリストイル化部位;約アミノ酸53〜約アミノ酸61のATP/GTP結合部位モチーフA(P-loop)。クローンDNA64966−1575は1999年1月12日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203575が付与された。
図88(配列番号:216)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1313アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:CELT27A1_3, CEF09C06_7, U93688_9, H64896, YDCX_ECOLI, 及びRNU06101_1。
Merck/ワシントン大学を検索し、配列を登録番号W39620として同定した(ソアレス副甲状腺腫瘍タンパク質として同定)。この配列をデータベースに入れ、他の配列と比較して他の配列と整列されることができた。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA67221と命名した。
MerckのW39620をコードするクローンを購入して全体を配列決定した。上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA67300−1605[図89、配列番号:217]の全長DNA配列;及びPRO1376の誘導タンパク質配列が得られた。
DNA67300−1605の全コード化配列が図89(配列番号:217)に含まれる。クローンDNA67300−1605は単一のオープンリーディングフレームを含み、ヌクレオチド位置107−109に見かけの翻訳開始部位、そしてヌクレオチド位置623−625に見かけの停止コドンを持つ。予測されるポリペプチド前駆体は172アミノ酸長であり、約19,206ダルトンの見積もり分子量及び約5.36のpIを持つ。図90(配列番号:218)に示した全長PRO1376配列の分析により、種々の重要なポリペプチドドメインの存在が明らかになり、それらの重要なポリペプチドドメインに与えられた位置は、およそ上記の通りである。図90に示した全長PRO1376ポリペプチドの分析により、以下の存在が明らかになった:約アミノ酸1〜約アミノ酸23のシグナルペプチド;及び約アミノ酸58〜アミノ酸75のチオレドキシンファミリータンパク質相同ブロック。クローンDNA67300−1605は1998年8月25日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号203163が付与された。
図90(配列番号:218)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1376アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:XAG_XENLA, AF025474_1, NP77_XENLA, D69100, S75124, ER60_SCHMA, H69466, A57254, AB002234_1, 及びTATHIORDH_1。
上記の実施例3に記載した企業のシグナル配列発見アルゴリズムを適用してDNA68872−1620を同定した。上述のシグナル配列アルゴリズムの使用により、IncyteESTクラスター番号10298と命名されるLIFESEQ(商品名)からのESTクラスター配列の同定が可能となった。次いでこのESTクラスター配列を、公的データベース(例えば、GenBank)及び企業のEST DNAデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含む種々の発現配列タグ(EST)データベースと比較して、存在する相同性を同定した。相同体検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2(Altschul等, Methods in Enzymology 266: 460-480 (1996))を用いて実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコア70(90の場合もある)又はそれ以上を持つ比較物は、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)で集団化してコンセンサスDNA配列を構築した。そこから得られたコンセンサス配列を、ここでDNA56259と命名する。ジェネンテクが独自に開発したEST配列を構築に使用し、ここでDNA39516と命名する。
DNA56259配列とIncyteESTクローン番号3507924との間の配列相同性に鑑みて、IncyteEST番号3507924を購入し、cDNA挿入物を得て配列決定した。このcDNA挿入物の配列を図91(配列番号:219)に示し、ここでDNA68872−1620と命名する。
図92(配列番号:220)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1387アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:P_W36955, MYP0_HETFR, HS46KDA_1, AF049498_1, MYO0_HUMAN, AF030454_1, A53268, SHPTCRA_1, P_W14146, 及びGEN12838。
実施例1に記載したように、phrapを用いて他のEST配列に対してコンセンサスDNA配列を構築した。このコンセンサス配列を、ここでDNA40630と命名する。独自に開発したジェネンテクEST配列をコンセンサス構築に用い、ここでDNA40753と命名する。DNA40630コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO1561の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。
PCRプライマー(正方向及び逆方向)の対を合成した:
正方向PCRプライマー(49630.f1):
5'-CTGCCTCCACTGCTCTGTGCTGGG-3'(配列番号:223)
逆方向PCRプライマー(49630.r1):
5'-CAGAGCAGTGGATGTTCCCCTGGG-3'(配列番号:224)
さらに、40630DNAコンセンサス配列から合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブを作成し、それは以下のヌクレオチド配列を有していた:
ハイブリダイゼーションプローブ(49630.p1):
5'-CTGAACAAGATGGTCAAGCAAGTGACTGGGAAAATGCCCATCCTC-3'(配列番号:225)
全長クローンの供給源について幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上で同定したPCRプライマー対でPCR増幅した。次いで、ポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びPCRプライマー対の一方を用いてPRO1561遺伝子をコードするクローンを単離するのに使用した。cDNAライブラリの構築のためのRNAはヒト乳房腫瘍組織から単離した。
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、DNA76538−1670[図93、配列番号:221]の全長DNA配列;及びPRO1561の誘導タンパク質配列が得られた。
図94(配列番号:222)に示した全長配列のWU-BLAST-2配列アラインメント分析を用いたDayhoffデータベース(バージョン35.45 SwissProt 35)の分析により、PRO1561アミノ酸配列と以下のDayhoff配列との間の有意な相同性が明らかになった:P_R63053, P_R25416, P_R63055, P_P93363, P_R63046, PA2A_VIPAA, P_W58476, GEN13747, PA2X_HUMAN, 及びPA2A_CRODU。
上記に加えて、配列相同性検索により、DNA40630コンセンサス配列とIncyteESTクローン番号1921092との間の有意な相同性が明らかになった。従って、IncyteEStクローン番号1921092を購入し、挿入物を得て配列決定することにより、図93(配列番号:221)に示すDNA76538−1670を得た。
Swiss-Prot公的データベースからの約950の既知の分泌タンパク質からの細胞外ドメイン(ECD)配列(あるとすれば分泌シグナル配列を含む)をESTデータベースの検索に使用した。ESTデータベースは公的なESTデータベース(例えばGenBank)及び企業のESTデータベース(LIFESEQ(商品名)、Incyte Pharmaceuticals、Palo Alto, CA)を含んでいた。検索は、コンピュータプログラムBLAST又はBLAST2[Altschul等, Methods in Enzymology, 266: 460-480(1996)]を用い、EST配列の6フレーム翻訳に対するECDタンパク質配列の比較として実施した。既知のタンパク質をコードせず、BLASTスコアが70(90の場合もある)又はそれ以上となる比較物を、プログラム「phrap」(Phil Green, University of Washington, Seattle, Washington)でコンセンサスDNA配列に集団化して構築した。
DNA33087の完全なcDNA配列が登録番号AB000114_1及びAB009589_1(ヒトオステオモジュリン(osteomodulin))としてGenBankに開示されている。関連しているが異なるタンパク質、角膜ケラチンリン酸は、Funderburgh等, J. Biol. Chem., 271: 31431-31436 (1996)に開示されている。
コンセンサスDNA配列は、上記ようにphrapを使用して他のEST配列に対して構築した。このコンセンサス配列をここでDNA28754と命名する。幾つかの場合には、コンセンサス配列はBLAST及びphrapの繰り返しサイクルを用いて伸長させ、上で検討したEST配列の供給源を用いて可能な限り伸長させた中間コンセンサスDNA配列から取り出された
DNA28754コンセンサス配列に基づいて、1)PCRにより対象とする配列を含むcDNAライブラリを同定するため、及び2)PRO216の全長コード化配列のクローンを単離するプローブとして使用するために、オリゴヌクレオチドを合成した。正方向及び逆方向PCRプライマーの対は、一般に20〜30ヌクレオチドの範囲であり、しばしばおよそ100−1000bp長のPCR産物を与えるように設計される。プローブ配列は典型的には40−55bp長である。幾つかの場合には、コンセンサス配列が約1−1.5kbpより大きな場合に更なるオリゴヌクレオチドを合成する。全長クローンについて幾つかのライブラリをスクリーニングするために、ライブラリからのDNAを上掲のAusubel等, Current Protocols in Molecular Biologyに従って、PCRプライマー対でのPCR増幅によりスクリーニングした。次いでポジティブライブラリを、プローブオリゴヌクレオチド及びプライマー対の一方を用いた興味ある遺伝子をコードするクローンの単離に使用した。
PCRプライマーの対(正方向及び逆方向)を合成した:
正方向PCRプライマー:
5'-TCACGATGATCCTGACAATGC-3'(配列番号:228)
逆方向PCRプライマー:
5'-AATAATGAAGGTCAAAGTGCCCTT-3'(配列番号:229)
さらに、次のヌクレオチド配列を持つ合成オリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブをコンセンサスDNA28754配列から構築した:
ハイブリダイゼーションプローブ:
5'-TGCTCCTTCTTGTTCTGGGCTCTCATG-3'(配列番号:230)
上記のように単離したクローンのDNA配列決定により、PRO216ポリペプチドの全長DNA配列(ここで、DNA33087と命名される[図95、配列番号:226])及びPRO216ポリペプチドの誘導タンパク質配列が得られた。
上記で同定した全長クローンは、ヌクレオチド位置268−270に見掛けの翻訳開始部位、及びヌクレオチド位置1531−1533に停止シグナルを持つ単一のオープンリーディングフレームを有していた(図95;配列番号:226)。予想されるポリペプチド前駆体は、421アミノ酸長であり[図96;(配列番号:227)]、約49,492ダルトンの算定分子量及び約5.51の見積もりpIを有する。図96(配列番号:227)に示された全長PRO216配列の分析により、図96に示す様々な重要なポリペプチドドメインの存在が証明されたが、それらの重要なポリペプチドドメインに対して与えられる位置はおよそ上記の通りである。全長PRO216配列(図96;配列番号:227)の分析により以下の存在が証明された:約アミノ酸113〜約アミノ酸117、約アミノ酸121〜アミノ酸125、約アミノ酸187〜約アミノ酸191、約アミノ酸242〜約アミノ酸246、及び約アミノ酸316〜約アミノ酸320のN-グリコシル化部位;約アミノ酸268〜約アミノ酸275及び約アミノ酸300〜約アミノ酸307のチロシンキナーゼリン酸化部位;約アミノ酸230〜約アミノ酸236のN-ミリストイル化部位;及び約アミノ酸146〜約アミノ酸168及び約アミノ酸217〜約アミノ酸239のロイシンジッパーパターン。クローンDNA33087は1997年10月16日にATCCに寄託され、ATCC寄託番号209381が付与された。
このクローンは、I. Ohnoにより1996年12月26日にGenBankに提出された(AB000114_1)及びI. Ohnoにより1997年12月5日にGenBankに提出された(AB009589-1)ヒトオステオモジュリンと同じである。
このアッセイは新生児心臓の肥大を刺激するPROポリペプチドの能力を測定するように設計されている。1日齢のHarlan Sprague Dawleyラットから筋細胞を得た。細胞(7.5x104/mlで180μl、血清<0.1%、新たに単離)をDMEM/F12+4%FCSで予めコートした96ウェルプレートに1日目に添加した。試験PROポリペプチドを含有する試験試料を2日目に20μLの容量でウェルに直接添加した。さらに2日後に細胞をクリスタルバイオレットで染色し、次の日に視覚によりスコアをつけた。インキュベータ条件は重要であり5%のCO2を含む。
活性基準:1-100μMのフェニルエフリン(phenylephrine)、0.1-1.0μMのPGF-2アルファ、1-10nMのエンドセリン、1-10nMのCT1(LIF)。アッセイ反応にCa濃度が重要であるためPBSは含有しない。アッセイ媒体は以下を含む:DMEM/F12(2.44gmの重炭酸塩を含む)、10μg/mlのトランスフェリン、1μg/mlのインシュリン、1μg/mlのアプロチニン、2mmol/Lのグルタミン、100U/mlのペニシリンG、100μg/mlのストレプトマイシン。マンニトール(4%)を含むタンパク質バッファーは1/10(0.4%)及び1/100(0.04%)ではポジティブシグナル(スコア3.5)を与えたが、1/1000(0.004%)では与えなかった。従って、マンニトールを含む試験試料バッファーは実行しなかった。二次アッセイは細胞からの条件培地中でのELISAによるANPレベル(ng/ml)の測定からなる。ANPメッセージの増加は数時間後の細胞からのPCRにより測定できる。
このアッセイは新生児心臓の肥大を刺激するPROポリペプチドの能力を測定するように設計されている。1日齢のHarlan Sprague Dawleyラットから筋細胞を得た。細胞(7.5x10<SUP>4</SUP>/mlで180μl、血清<0.1%、新たに単離)をDMEM/F12+4%FCSで予めコートした96ウェルプレートに1日目に添加した。試験PROポリペプチド(20μl/ウェル)を含有する試験試料を1日目にウェルに直接添加した。次いで2日後にPGF(20μl/ウェル)を最終濃度10<SUP>-6</SUP>Mで添加した。次いで細胞を4日目に染色し、5日目にスコアをつけた。視覚的スコアは細胞サイズに基づき、ネガティブ対照に比較してサイズの増加を示さない細胞を0.0とスコア付けし、ネガティブ対照に比較してサイズの小から中程度の増加を示す細胞を1.0とスコア付けし、ネガティブ対照に比較してサイズの大きな増加を示す細胞を2.0とスコア付けした。1.0又はそれ以上のスコアをポジティブと考えた。
アッセイ反応にCa濃度が重要であるためPBSは含有しない。プレートはDMEM/F12+4%FCS(200μl/ウェル)でコートした。アッセイ媒体は以下を含む:DMEM/F12(2.44gmの重炭酸塩を含む)、10μg/mlのトランスフェリン、1μg/mlのインシュリン、1μg/mlのアプロチニン、2mmol/Lのグルタミン、100U/mlのペニシリンG、100μg/mlのストレプトマイシン。マンニトール(4%)を含むタンパク質バッファーは1/10(0.4%)及び1/100(0.04%)ではポジティブシグナル(スコア3.5)を与えたが、1/1000(0.004%)では与えなかった。従って、マンニトールを含む試験試料バッファーは実行しなかった。
PRO179、PRO182、PRO195、及びPRO224精製ポリペプチドは、下記の表5に示すように、上記の方法によりアッセイしたときポジティブな結果を示した。
このアッセイは心臓成人肥大の阻害を測定するように設計されている。心室筋細胞を成体(250g)Harlan Sprague Dawlwyラットから新たに単離し、細胞を2000細胞/180μlウェル容積でプレーティングした。2日目にPROポリペプチドを含む試験試料(20μl)を添加した。5日目に細胞を固定した後に染色した。数時間後に細胞からのPCRによりANPメッセージの増加も測定できる。結果は細胞サイズの視覚的スコアに基づく:0=阻害無し、-1=小さな阻害、-2=大きな阻害。0未満の祖コアをポジティブと考えた。活性参照は、ポジティブ対照としての0.1mMのフェニルエフィン(PE)に相当する。2のスコアは極めてポジティブと考える。アッセイ媒体は以下を含む:100mMのインシュリン、0.2%のBSA、5mMのクレチン、2mMのL-カルニチン、5mMのタウリン、100U/mlのペニシリンG、100μg/mlのストレプトマイシン(CCT媒体)中に懸濁したM199(修飾)-グルタミンフリー、NaHCO3、フェノールレッド。96ウェルプレートの内側60ウェルのみを使用した。これらの中で、6ウェルをネガティブ及びポジティブ(PE)対照用にとっておいた。最初に、視覚的スコア系と平行して感受性の相対的レベルを決定するための定量的PCRを実行した。
PRO269及びPRO356は、上記のアッセイで心臓成人肥大の阻害においてポジティブな結果を示した。
このアッセイは、PROポリペプチドが副腎皮質毛細管内皮細胞(ACE)成長を刺激する能力を示すか否かを測定する用に設計されている。
ウシ副腎皮質毛細管内皮(ACE)細胞(初代培養からのもの、最大12-14継代)を96ウェルのプレートにおいて100マイクロリットル当たり500細胞/ウェルでプレーティングした。アッセイ媒体は、低グルコースDMEM、10%子ウシ血清、2mMグルタミン、及び1xペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾンを含む。対照ウェルは以下を含む:(1)ACE細胞無添加;(2)ACE細胞のみ;(3)ACE細胞+VEGF(5ng/ml);及び(4)ACE細胞+FGF(5ng/ml)。次いで、対照及び試験試料(100マイクロリットル容量)をウェルに添加した(各々、1%、0.1%及び0.01%希釈)。細胞培地を37℃/5%CO2で6-7日間インキュベートした。インキュべーションの後、ウェル中の培地を吸引して細胞をPBSで1x洗浄した。次いで、酸ホスファターゼ反応混合物(100マイクロリットル、0.1M酢酸ナトリウム, pH5.5, 0.1% トリトンX-100, 10mMのリン酸p-ニトロフェニル)を殻ウェルに添加した。37℃で2時間のインキュベーション後に、10マイクロリットルの1NのNaOHの添加により反応を停止させた。光学密度(OD)を405nmでマイクロタイタープレートで測定した。
PROポリペプチドの活性は、(1)細胞のみのバックグラウンドに対する、及び(2)VEGFによる最大阻害に対する(酸ホスファターゼ活性、OD405nmで測定した)増殖増加の倍数として計算した。最大阻害についての活性参照としてVEGF(3-10ng/ml)及びFGF(1-5ng/ml)を使用した。アッセイの結果は、観察された刺激がバックグラウンドを越えて>=50%である場合に「ポジティブ」と考えた。VEGF(5ng/ml)対照は1%希釈において1.24倍の刺激を与え;FGB(5ng/ml)対照は1%希釈において1.46倍の刺激を与えた。
PRO179、PRO212、PRO1075、PRO1154、PRO1244、PRO1286、及びPRO1303は、下記の表6に示すように、「ポジティブ」と検定された。
内皮細胞のVEGF刺激増殖を阻害する様々なPROポリペプチドの能力を試験した。特に、ウシ副腎皮質毛細管内皮(ACE)細胞(初代培養からのもの、最大12-14継代)を96ウェルのプレートにおいて100マイクロリットル当たり500細胞/ウェルでプレーティングした。アッセイ媒体は、低グルコースDMEM、10%子ウシ血清(牛胎児ではない)、2mMグルタミン、及び1xペニシリン/ストレプトマイシン/ファンギゾンを含む。対照ウェルは以下を含む:(1)ACE細胞無添加;(2)ACE細胞のみ;(3)ACE細胞+5ng/mlFGF;(4)ACE細胞+5ng/mlVEGF;(5)ACE細胞+3ng/mlVEGF+1ng/mlTGT-ベータ;及び(6)ACE細胞+3ng/mlVEGF+5ng/mlLIF。次いで、試験試料、ポリ-HisタグPROポリペプチド(100マイクロリットル容量)をウェルに添加した(各々、1%、0.1%及び0.01%希釈)。細胞培地を37℃/5%CO<SUB>2</SUB>で6-7日間インキュベートした。インキュべーションの後、ウェル中の培地を吸引して細胞をPBSで1x洗浄した。次いで、酸ホスファターゼ反応混合物(100マイクロリットル、0.1M酢酸ナトリウム, pH5.5, 0.1% トリトンX-100, 10mMのリン酸p-ニトロフェニル)を各ウェルに添加した。37℃で2時間のインキュベーション後に、10マイクロリットルの1NのNaOHの添加により反応を停止させた。光学密度(OD)を405nmでマイクロタイタープレートで測定した。
PROポリペプチドの活性は、刺激なしの細胞に対する、(OD405nmでの酸性ホスファターゼ活性を測定したときの)VEGF(3ng/ml)刺激増殖の阻害パーセントとして計算した。TGF-ベータは、VEGF-刺激ACE細胞増殖の70-90%をブロックするため、TGF-ベータを1ng/mlにおいて活性対照として用いた。以下の表7に示す結果は、癌治療、特に腫瘍血管形成の阻害におけるPROポリペプチドの有用性を示す。表7に示される数値(相対的阻害)は、刺激なしの細胞に対するPROポリペプチドによるVEGF刺激増殖の阻害パーセントを算定し、次いでVEGF刺激細胞増殖の70-90%を阻害することが知られている1ng/mlのTGF-βにより得られた阻害パーセントでそのパーセントを割ることにより決定される。結果は、PROポリペプチドが内皮細胞成長のVEGF刺激の30%又はそれ以上の阻害を示した場合(30%以上の相対的阻害)をポジティブと考えた。
このアッセイはPROポリペプチドが内皮細胞においてc-fosを誘導する能力を示すか否を決定するために設計されている。
成長培地(50%のハムのF12w/oGHT:低グルコース、及びグリシンなしの50%DMEM:NaHCO3、1%グルタミン、10mMのHEPES、10%のFBS、10ng/mlのbFGF)中のヒト静脈臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を1x104細胞/ウェルの細胞密度で96ウェルマクロタイタープレートにプレーティングした。プレーティングの次の日、成長培地を除き、細胞を100μl/ウェルの試験試料と対照(ポジティブ対照:成長培地;ネガティブ対照:10mMのHEPES、140mMのNaCl、4%(w/v)マンニトール、pH6.8)で処理することにより、細胞を飢餓させた。細胞を5%CO2中で37℃において30分間インキュベートした。試料を取り除いて、DNAキットプロトコール(Chiron Diagnostics, cat.#6005-037)の最初の部分に従った。ここで、下記の各大文字の試薬/バッファーはキットから利用可能であった。
簡単には、試験に必要なTM溶菌バッファー(TM Lysis Buffer)及びプローブの量を製造者により提供された情報に基づいて計算した。適当な量の解凍プローブをTM溶菌バッファーに添加した。捕獲ハイブリダイゼーションバッファー(Capture Hybridization Buffer)を室温まで温めた。bDNA条片を金属条片ホルダーにセットアップし、100μlの捕獲ハイブリダイゼーションバッファーを必要な各b-DNAウェルに添加し、少なくとも30分インキュベートした。細胞内の試験プレートをインキュベータから取り除き、真空マニフォールドを使用して培地を穏やかに除いた。マイクロタイタープレートの各ウェルに100μlのプローブを伴う溶菌ハイブリダイゼーションバッファーを各b-DNAウェルにピペットで素早く添加した。ついで、プレートを15分間55℃でインキュベートした。インキュベーターからの取り出し、マイクロタイターアダプターヘッドを備えたボルテックスミキサーにプレートを配し、1分の間、#2の設定でボルテックスした。80μlの溶菌液を取り除き、捕獲ハイブリダイゼーションバッファーを含むbDNAウェルに添加し、ピペットで上下して混合した。プレートを少なくとも16時間の間53℃でインキュベートした。
複製を平均化し変動係数を決定した。ネガティブ対照(上述のプロテイン32/HEPESバッファー)値に対する増加倍数の活性の測定は化学発光単位(RLU)によって示された。結果を下記の表8に示し、ネガティブ対照値に対して少なくとも2倍の値を示す試料はポジティブと考えた。
ネガティブ対照=1.00%希釈で1.00RLU。ポジティブ対照=1.00%希釈で8.39RLU。
このアッセイは、PROポリペプチドがヒトの臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)におけるカルシウムフラックスを刺激する能力を示すか否かを決定するために設計されている。Ca流入(influx)は、ある種のリガンドがそのレセプターに結合する際の良好に実証された反応である。このCa流入アッセイにおいてポジティブ反応をもたらす試験化合物は、特定のレセプターに結合してヒト内皮細胞における生物学的シグナル伝達経路を活性化すると言える。これは究極的に、例えば細胞分裂、細胞増殖の阻害、内皮管形成、細胞泳動、アポトーシスを誘導しうる。
成長培地(50:50グリシン無し、1%グルタミン、10mMのHepes、10%FBS、10ng/mlのbFGF)中のヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)を、96ウェルのmicrotiter View Plate-96(Packard Instrument Company Part#6005182)マイクロタイタープレートに2x10<SUP>4</SUP>細胞/ウェルの細胞密度でプレーティングした。プレーティングの次の日、細胞をバッファー(HBSS+10mMのHepes)で3回洗浄し、100μl/ウェルを残した。次いで100μl/ウェルの8μMのFluo-3(2x)を添加した。細胞を37℃/5%CO2において1.5時間インキュベートした。インキュべーションの後、細胞をバッファー(上記)で3x洗浄し、100μl/ウェルを残した。PROポリペプチドの試験試料は、異なる96ウェルプレート上で、バッファー中5x濃度で調製した。ポジティブ対照は50μMイオノマイシン(5x)に相当し;ネガティブ対照はプロテイン32に相当する。細胞プレート及び試料プレートをFLIPR(Molecular Devices)マシンで走らせた。FLIPRマシンは25μlの試験試料を細胞に添加し、2秒ごとに1分間、次いで3秒ごとに3分間読み取りを行った。
曲線のベースラインから最大値まで上昇する蛍光変化(Δ変化)を計算し、複製を平均化した。蛍光増加の速度を監視し、1000より大きなΔ変化及び60秒以内の上昇を有する試料のみをポジティブと考えた。下記の表9において、結果はポジティブ対照に対して表現した。
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するPROポリペプチドの能力をヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)中で試験した。
細胞を96ウェルマイクロたーたープレート(Amersham Life Science, cytostar-Tシンチレーティングマイクロプレート、無菌、組織培地処理、個々にラッピング)で10%の血清(CSG-媒体、Cell Systems)中、ウェル当たり2x104細胞の密度で全容量100μlでプレーティングした。2日目に、PROポリペプチドを含有する試験試料を1%、0.33%及び0.11%希釈の3段階で添加した。細胞無しのウェルをブランクとして用い、細胞のみのウェルをネガティブ対照として用いた。ポジティブ対照としてスタウロスポリンの3xストックの1:3連続希釈50μlを用いた。PROポリペプチドのアポトーシスを誘導する能力は、カルシウム及びリン脂質結合タンパク質のメンバーであるアネキシンVの検出のために96ウェルをプロセッシングしてアポトーシスを検出することにより決定した。
0.2mlのアネキシンV-ビオチンのストック溶液(100μg/ml)を、4.6mlの2 x Ca2+結合バッファー及び2.5%BSA中に希釈した(1:25希釈)。50μlの希釈アネキシンV-ビオチン液を、1.0μg/mlの最終濃度になるまで各ウェル(対照を除く)に添加した。試料を35S-ストレプトアビジンの直接添加の前にアネキシン-ビオチンと共に10-15分間インキュベートした。35S-ストレプトアビジンは2 x Ca2+結合バッファー、2.5%BSA中に希釈し、最終濃度が3 x 104cpm/ウェルになるまで全てのウェルに添加した。次いでプレートを密封し、1000rpmで15分間遠心分離し、2時間の間、軌道シェイカー上に配した。分析は1450 Microbeta Trilux (Wallac)で実施した。バックグラウンドを越えるパーセントがネガティブ対照を越える毎分当たりのカウントのパーセント量を表す。バックグラウンドを越えるパーセントが30%以上のものがポジティブであると考えられる。
PRO178、PRO179、PRO188、PRO217、PRO261、PRO301、PRO538、及びPRO719は、上記のアッセイにおいてポジティブな結果を与えた(内皮細胞アポトーシスを誘導した)。
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するPROポリペプチドの能力を、100ng/mlのVEGF、0.1%のBSA、1Xpenn/strepを補充した0%血清培地中で96ウェルフォーマットを使用して、ヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)中で試験した。使用した96ウェルプレートはFalconにより製造された(番号3072)。96ウェルのコーティングは、PBS溶液中の0.2%ゼラチン100μlで>30分間ゼラチン化を起こすことにより調製した。ゼラチン混合物を全部吸引した後、10%血清含有培地中で最終濃度2x104細胞/mlの最終濃度−ウェル当たり100μl容量でプレーティングした。対象とするPROポリペプチドを含有する試験試料を添加する前に細胞を24時間成長させた。
全てのウェルに、100ng/mlのVEGF、0.1%のBSA、1Xpenn/strepを補充した0%血清培地中100μlを添加した。PROポリペプチドを含有する試験試料を1%、0.33%及び0.11%の希釈で三つ組で添加した。細胞の無いウェルをブランクとして使用し、細胞だけのウェルをネガティブ対照として使用した。ポジティブ対照として、3x原液のスタウロスポリンの50μlの1:3の連続希釈物を使用した。ELISAに先立って、細胞を24から35時間インキュベートした。
ELISAを、Boehringer マニュアル[Boehringer, 細胞死検出ELISA plus, カタログ番号1920685]に従ってアポトーシス調製溶液のレベルを決定するのに使用した。試料調製:96ウェルプレートを1krpmで10分間スピン沈降させ(200g)、高速反転により上清を除去し、プレートをペーパータオル上に上下逆に置いて残りの液体を除去した。各ウェルに、100μlの1X溶菌バッファーを添加して振盪させずに30分間室温でインキュベートした。プレートを1krpmで10分間スピン沈降させ、20μlの溶菌液(細胞質画分)をストレプトアビジン被覆MTPに移した。80μlの免疫試薬混合物を各ウェルで20μl溶菌液に加えた。MTPを粘着性ホイルでカバーし、それを軌道振盪機(200rpm)に配することにより2時間室温でインキュベートした。2時間後、上清を吸引により除去し、ウェル当たり250μlの1Xインキュべーションバッファーで3回ウェルをリンスした(吸引で除去した)。各ウェルに基質溶液を添加し(100μl)、軌道振盪機で室温において250rpmで、光度測定分析に十分な発色がされるまでインキュベートした(約10-20分後)。参照波長492nmとして405nmでプレートを読むのに96ウェルリーダーを用いた。PIN32(対照バッファー)について得られたレベルを100%に設定した。レベル>130%の試料をアポトーシス誘導についてのポジティブと考えた。
PRO172及びPRO235は、上記のELISAアッセイによって測定したときにポジティブな結果を与えた。
内皮細胞においてアポトーシスを誘導するPROポリペプチドの能力を、10継代未満のHUVE細胞を用いてゼラチン化T-175フラスコ内でのヒト静脈の臍静脈内皮細胞(HUVEC, Cell Systems)中で試験した。1日目に細胞を分裂させ[6cmのゼラチン化ディッシュ当たり420,000細胞-(11x103細胞/cm2Falcon, Pharmacia)]、血清(CS-C, Cell System)含有培地中で終夜又は16〜24時間成長させた。
2日目に、細胞を5mlのPBSで洗浄し;3mlの0%血清培地をVEGF(100ng/ml)とともに添加し;そして30μlのPRO試験化合物(最終希釈1%)を添加した。細胞を含む混合物、培地お試験PRO化合物を回収の前に48時間インキュベートした。
次いで細胞をFACS分析のために回収した。培地を吸引し、細胞をPBSで1回洗浄した。T-175フラスコ内で細胞に5mlの1xトリプシンを添加し、細胞をそれらがプレートから放出されるまで(約5-10分間)放置した。5mlの成長培地を添加することによりトリプシン化を停止させた。細胞を4℃において1000rpmで5分間スピンさせた。培地を吸引し、10mlの10%血清補充培地(Cell Systems)中に細胞を再懸濁させ、5μlのアネキシン-FITC(Bio Vison)を添加して冷却管をFACSに提示した。
PRO331及びPRO364は、上記のアッセイによってポジティブな結果を与えた。
インサイツハイブリダイゼーションは、細胞又は組織調製物内での核酸配列の検出及び位置測定のための強力で多用途の技術である。それは、例えば、遺伝子発現部位の同定、転写物の組織分布の分析、ウイルス感染の同定と位置測定、特定のmRNA合成における変化の追跡及び染色体マッピングにおける補助に有用である。
インサイツハイブリダイゼーションは、Lu及びGillett, Cell Vision 1: 169-176 (1994)のプロトコールの最適化バージョンに従って、PCR生成33P-標識リボプローブを用いて実施される。簡単には、ホルマリン固定、パラフィン包埋ヒト組織を切片化し、脱パラフィンし、プロテイナーゼK(20g/ml)で15分間37℃で脱タンパクし、さらに上掲のLu及びGillettに記載されたようにインサイツハイブリダイゼーションする。(33-P)UTP-標識アンチセンスリボプローブをPCR産物から生成し、55℃で終夜ハイブリダイゼーションする。スライドをKodak NTB2TM核トラックエマルションに浸漬して4週間露出する。
6.0μl(125mCi)の33P-UTP(Amersham BF 1002, SA<2000 Ci/mmol)をスピード真空乾燥させた。乾燥33P-UTPを含む各管に以下の成分を添加した:
2.0μlの5x転写バッファー
1.0μlのDTT(100mM)
2.0μlのNTP混合物(2.5mM: 各10μlの10mM GTP, CTP及びATP+10μlのH2O) 1.0μlのUTP(50μM)
1.0μlのRNAsin
1.0μlのDNAテンプレート(1μg)
1.0μlのH2O
1.0μlのRNAポメラーゼ(PCR産物についてT3=AS, T7=S,通常)
管を37℃で1時間インキュベートし、1.0μlのRQ1 DNaseを添加し、次いで37℃で15分間インキュベートした。90μlのTE(10mMトリスpH7.6/1mMのEDTApH8.0)を添加し、混合物をDE81紙にピペットした。残りの溶液をMicrocon-50限外濾過ユニットに負荷し、プログラム10を用いてスピンさせた(6分間)。濾過ユニットを第2の管に変換し、プログラム2を用いてスピンさせた(3分間)。最終回収スピンの後、100μlのTEを添加した。1μlの最終生成物をDE81紙にピペットし6mlのBIOFLUOR IITMで数えた。
プローブをTBE/尿素ゲル上で走らせた。1-3μlのプローブ又は5μlのRNA MrkIIIを3μlの負荷バッファーに添加した。加熱ブロック上で95℃に3分間加熱した後、ゲルを即座に氷上に置いた。ゲルのウェルをフラッシングし、試料を負荷し、180-250ボルトで45分間走らせた。ゲルをサランラップでラップし、−70℃冷凍機内で補強スクリーンを持つXARフィルムに1時間から終夜露出した。
A.凍結切片の前処理
スライドを冷凍機から取り出し、アルミニウムトレイに配置して室温で5分間解凍した。トレイを55℃のインキュベータに5分間配置して凝結を減らした。スライドを蒸気フード内において4%パラホルムアルデヒド中で5分間固定し、0.5xSSCで5分間室温で洗浄した(25ml 20xSSC + 975ml SQ H2O)。0.5μg/mlのプロテイナーゼ中、37℃で10分間の脱タンパクの後(250mlの予備加熱RNase無しRNaseバッファー中の10mg/mlストック12.5μl)、切片を0.5xSSCで10分間室温で洗浄した。切片を、70%、95%、100%エタノール中、各2分間脱水した。
B.パラフィン包埋切片の前処理:
スライドを脱パラフィンし、SQ H2O中に配置し、2xSSCで室温において各々5分間2回リンスした。切片を20μg/mlのプロテイナーゼK(250mlのRNase無しRNaseバッファー中10mg/mlを500μl;37℃、15分間)−ヒト胚又は8xプロテイナーゼK(250mlのRNaseバッファー中100μl、37℃、30分間)−ホルマリン組織で脱タンパクした。続く0.5xSSCでのリンス及び脱水は上記のように実施した。
スライドをBoxバッファー(4xSSC、50%ホルムアミド)−飽和濾紙で列を作ったプラスチックボックスに並べた。組織を50μlのハイブリダイゼーションバッファー(3.75gデキストラン硫酸+6mlSQ H2O)で被覆し、ボルテックスし、キャップを外して2分間マイクロ波で加熱した。氷上で冷却した後、18.75mlのホルムアミド、3.75mlの20xSSC及び9mlのSQ H2Oを添加し、組織を良くボルテックスし、42℃で1-4時間インキュベートした。
D.ハイブリダイゼーション:
スライド当たり1.0x106cpmのプローブ及び1.0μlのtRNA(50mg/mlストック)を95℃で3分間加熱した。スライドを氷上で冷却し、スライド当たり48μlのハイブリダイゼーションバッファーを添加した。ボルテックスの後、50μlの33P混合物をスライド上のプレハイブリッド50μlに添加した。スライドを55℃で終夜インキュベートした。
E.洗浄:
洗浄は、2xSSC、EDTAで2x10分間、室温で実施し(400mlの20xSSC+16mlの0.25M EDTA、Vf=4L)、次いでRNaseA処理を37℃で30分間行った(250mlRNaseバッファー中10mg/mlを500μl=20μg/ml)。スライドを2x10分間、EDTAで室温において洗浄した。ストリンジェントな洗浄条件は次の通り:55℃で2時間、0.1xSSC、EDTA(20mlの20xSSC+16mlのEDTA、Vf=4L)。
ここに開示したDNA配列の二つについてインサイツ分析を実施した。これらの分析に対して用いたオリゴヌクレオチドは次の通りである:
(1)DNA23339−1130(PRO178)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAC GGG CGC TGT GTG CTG GAG-3'(配列番号:231)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGG TGG GGA CCG CAG GGT GAC-3'(配列番号:232)
p3:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCG CCA CGA GGA GCT GTT ACG-3'(配列番号:233)
p4:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGA CCT GCA GGC ATG GGA GAA-3'(配列番号:234)
p5:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGC CGC CAC GAG GAG CTG TTA-3'(配列番号:235)
p6:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GGG GCT CTG GGG CTG GGT C-3'(配列番号:236)
(2)DNA28497−1130(PRO188)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CAA CAC CAA GGG GCA AGA TG-3'(配列番号:237)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GGG CTT TTG GTG GGA GAA GTT-3'(配列番号:238)
(3)DNA30942−1134(PRO212)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TCG CTG CTG TGC CTG GTG TTG-3'(配列番号:239)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCG CTG CAG CCT CTT GAT GGA-3'(配列番号:240)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCC TCC TGC CTT CCC TGT CC-3'(配列番号:241)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GTG GTG GCC GCG ATT ATC TGC-3'(配列番号:242)
(5)DNA33094−1131(PRO217)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TCA GAA AAG CGC AAC AGA GAA-3'(配列番号:243)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TGT CTT CCA TGC CAA CCT TC-3'(配列番号:244)
(6)DNA33221−1133(PRO224)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GCA GCG ATG GCA GCG ATG AGG-3'(配列番号:245)
p2:
5'-CTA GAA ATT AAC CCT CAC TAA AGG GAC AGA CGG GGC AGC AGG GAG TG-3'(配列番号:246)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGG AAG ATG GCG AGG AGG AG-3'(配列番号:247)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCA AGG CCA CAA ACG GAA ATC-3'(配列番号:248)
(8)DNA333473−1176(PRO261)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GCG AGG ACG GCG GCT TCA-3'(配列番号:249)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA AGA GTC GCG GCC GCC CTT TTT-3'(配列番号:250)
(9)DNA40628−1216(PRO301)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GAG TCC TTC GGC GGC TGT T-3'(配列番号:251)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CGG GTG CTT TTG GGA TTC GTA-3'(配列番号:252)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC AAC CCG AGC ATG GCA CAG CAC-3'(配列番号:253)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA TCT CCC AGC CGC CCC TTC TC-3'(配列番号:254)
(11)DNA29101−1122(PRO713)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC GGC GGA ATC CAA CCT GAG TAG-3'(配列番号:255)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA GCG GCT ATC CTC CTG TGC TC-3'(配列番号:256)
(12)DNA33087(PRO216)
p1:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC CCC GAG TGT TTT CCA AGA-3'(配列番号:257)
p2:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CAA GTT TAC TAG CCC ATC CAT-3'(配列番号:258)
p3:
5'-GGA TTC TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGC TGG ATG GGC TAG TAA ACT TGA-3'(配列番号:259)
p4:
5'-CTA TGA AAT TAA CCC TCA CTA AAG GGA CCC TTC TGC TCC TTC TTG TT-3'(配列番号:260)
ここに開示した上記の12のDNA配列についてインサイツ分析を実施した。これらの分析からの結果は次の通りである:
(1)DNA2339−1130(PRO178)
胎児の下肢において、骨格筋と骨(初期骨膜)との間の結合組織界面で顕著な発現パターンが観察された。また発現は脈管組織に隣接しても観察され、よって血管形成に関連している可能性が示された。体壁では、下肢発現に類似した発現パターンが観察された。発現は気管の平滑筋で見られた。また、発現は固有層の平滑筋/結合組織における小腸及び胃で見られた。臍静脈平滑筋もポジティブであった。発育中の下肢、腸及び体壁における高度に組織化された発現パターンは、これらの部位における顕著な役割を示唆している。可能性は、血管形成及びパターニングを含んでいる。
胎児の胸腺の髄並びに胎児脳の大脳皮質(皮質性ニューロン)において発現が増加する可能性が見られた。以下の胎児組織はポジティブな結果を示さなかった:脊髄、甲状腺、副甲状腺、肝臓及び胎盤。
全ての成人組織はネガティブであると試験された。
胎児の下肢では、軟骨内骨形成の部位において、発育中の骨の骨細胞及び骨膜/軟骨膜において高い発現が観察された。この分布は、骨形成/分化における役割を示唆している。甲状腺上皮細胞に全体に発現の僅かな増加が見られた。体壁では、骨細胞並びに発育中の骨の骨膜/軟骨膜おいて高い発現が観察された。このことは、骨形成及び分化における役割を示唆している。以下の胎児組織では発現は見られなかった:胸腺、気管、脳(大脳皮質)、脊髄、小腸、副腎、肝臓、胃、胎盤及び臍。
成人組織では、良性乳房上皮、アポクリン化生の領域及び硬化性腺疾患に発現が見られた。さらに、浸潤乳房腺管癌細胞全体に発現が見られた。成人肝臓、心臓又は肝細胞癌では発現は見られなかった。
成人皮膚の鱗屑状上皮及び成人副腎皮質で発現の可能性が見られた。他の全ての組織はネガティブであった。胎児の多ブロック組織は以下を含む:肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。成人の多ブロック組織は以下を含む:肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚。
肺癌、腫瘍ブロック、及び乳癌における発現
正常チンパンジー胸腺の多核貪食細胞並びに試験した一つ胃癌のうちの一つ、一つの結腸直腸癌のうちの一つ、五つの乳ガンのうちに二つ及び四つの肺癌のうちの一つで発現が観察された。発現は、骨肉腫の悪性細胞及び僅かに分化した脂肪肉腫により観察された。精巣奇形腫及び試験した五つの乳ガンのうちの一つの悪性細胞において可能なシグナルが見られた。肺癌の一つでは、肺性リンパ組織内の高度な上皮細動脈全体に散乱したシグナルが見られた。
試験した胎児の組織(E12-E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大動脈、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、胎盤及び下肢。試験したヒト成人組織は以下を含む:肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、肺、皮膚、骨肉腫、眼、胃、胃癌、結腸、結腸癌、腎細胞癌、胎盤、膀胱粘膜及び胆嚢、及びアセトアミノフェン誘発性肝臓障害及び肝硬変。試験したアカゲザル組織は大脳皮質(rm)及び海馬(rm)を含む。試験したチンパンジー組織は以下を含む:甲状腺、副甲状腺、卵巣、神経、舌、胸腺、副腎胃粘膜及び唾液腺。
肺の腺癌及び扁平上皮癌における発現
八つの腺癌及び七つの扁平上皮癌を試験した。全ての腫瘍においてアクチンが強いポジティブであり、全てがインサイツハイブリダイゼーション分析に適していることを示した。発現は、以下の六つの腫瘍で観察された:
6727−95扁平上皮癌 −新生上皮全体で強く発現
9558−95扁平上皮癌 −新生上皮全体で発現
12235−95腺癌 −インサイツ及び浸潤腫瘍細胞全体で発現
6545−95及び4187−97扁平上皮癌
−腫瘍間質全体で発現、腫瘍細胞全体で発現は見られず
12954−94扁平上皮癌 −間質細胞全体で弱い発現の可能性。
胎児組織において、間葉全体に渡って低レベルの発現が見られた。膜状組織及び甲状腺の胎盤性間質細胞で中程度の発現が観察された。また、皮質性ニューロンにおいても低レベルの発現が見られた。成人組織は全てネガティブであった。
試験した胎児の組織(E12-E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大動脈、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織は以下を含む:肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚。
高度に特有の発現パターンが以下のように観察された:ヒト胚において、発現は、GI管の外平滑筋層、呼吸器軟骨、分岐状呼吸器上皮、骨芽細胞、腱、生殖腺、視神経頭及び発育表皮において観察された。成体では、発現は、チンパンジー舌の上皮先端、胎盤及び膀胱の基底上皮/筋上皮細胞において観察された。また、発現は、成人肺の肺胞裏打ち細胞、陰茎の勃起組織に並列する間葉細胞、及び大脳皮質(おそらくグリア細胞)においても見られた。腎臓では、発現は疾患においてのみ、甲状腺化尿細管を取り囲む細胞で見られた。
試験したヒト胎児組織(E12-E16)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験したヒト成体組織は以下を含む:腎臓(正常及び末期)、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、胆嚢、膵臓、肺、皮膚、眼(網膜を含む)、胎盤、膀胱、及び肝臓(正常、慢性、急性障害)。
試験した非ヒト霊長類は以下を含む:チンパンジー組織(唾液腺、胃、甲状腺、副甲状腺、皮膚、胸腺、卵巣、リンパ節):アカゲザル組織(大脳皮質、海馬、小脳、陰茎)。
発現は、胎児の脾臓、成体の脾臓、胎児の肝臓、成体の甲状腺及び成体のリンパ節(チンパンジー)の血管内皮に限られていた。発現の付加的部位は発育中の脊髄神経節に見られた。他の全ての組織はネガティブであった。
試験したヒト胎児組織(E12-E16)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験したヒト成体組織は以下を含む:腎臓(正常及び末期)、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、胆嚢、膵臓、肺、皮膚、眼(網膜を含む)、膀胱、肝臓(正常、慢性、急性障害)。試験した非ヒト霊長類は以下を含む:チンパンジー組織(唾液腺、胃、甲状腺、副甲状腺、皮膚、胸腺、卵巣、リンパ節):アカゲザル組織(大脳皮質、海馬、小脳、陰茎)。
ヒト成体及び胎児組織における発現パターン
胎児の胎盤の血管のサブセットを内張する上皮において発現が観察された。内皮発現はこれらの組織ブロックに限定されていた。また発現は胎盤の中間栄養芽細胞全体にも観察された。
試験した胎児組織(E12-E16)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成体組織は以下を含む:肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃癌、結腸、結腸癌、甲状腺(チンパンジー)、副甲状腺(チンパンジー)、卵巣(チンパンジー)及び軟骨肉腫、アセトアミノフェン誘発性肝臓障害及び肝硬変。
炎症組織(乾癬、IBD、炎症性腎臓、炎症性肺、肝炎(肝臓ブロック)、正常扁桃腺、成人及びチンパンジー多ブロック)における発現
この分子は免疫刺激性であり(MLR及び同時刺激においてTリンパ球の増殖を促進し)、プロ炎症特性を有する(インビボで好中球浸潤を誘導する)ことが示された。上に示したように、この分子は胎児組織のサブセットで、上皮/内膜及び胎盤において発現されることが示されたが、これらの組織の種々の正常成体組織又は血管で発現されることは見られなかった。非炎症性組織に比較した場合の炎症性ヒト組織の血管におけるこの分子の発現について評価を実施した。要するに、発現は慢性的炎症に罹患した肺における大血管の上皮/内膜、乾癬性皮膚の表層表皮血管、慢性硬化性腎炎の検体の細動脈及び扁桃の毛包周囲洞を含む毛細管で見られた。
発現は、正常皮膚(ヒト包皮検体)、正常肺、炎症性(8のIBD検体)又は正常大腸、慢性炎症性又は硬変性肝臓、正常成人組織、又は副腎では観察されなかった。
ヒト成体及び胎児組織における発現パターン
正常成体皮膚の表皮線維芽細胞において強い発現が見られた。また、強い発現は、2つの硬変性肝臓においても活性肝性線症の部位で見られた。さらに、副腎皮質の策状(fasiculata)細胞全体に中程度の発現が見られた。発現の局在化は、細胞外マトリクス形成/ターンオーバーにおけるこの分子の役割を支持している。
ヒト乳癌及び正常乳房組織、及び肺癌における発現
試験した二つの乳房腫瘍において弱い拡散性シグナルが見られた。良性及び悪性上皮細胞で発現は見られなかったが、間葉細胞、特に異栄養性骨化を含む組織修復の領域において特異的なハイブリダイゼーションが観察された。シグナルは同じ細胞集団に局在するが、同じ領域(乳房腫瘍02)においてシグナルが有意に強いことがわかった。最もポジティブな細胞は線維芽細胞の形態を有するが、平滑筋細胞はネガティブであることがわかった。シグナルは肺組織の方が弱いが、この断片は乳房腫瘍スライドに比較して見られる組織修復が少なかった。正常肺及び腎臓組織は実質的にネガティブであった。
要するに、この実験は、組織修復及び/又はコラーゲン沈積に含まれる間葉細胞での発現を示した。シグナルは、浸潤性乳癌又は良性炎症性状態による組織破壊(管破裂)のいずれかに隣接する良性線維芽様細胞において特に強かった。注目すべきことは、良性の類骨の沈積がRNAの強い発現と関連していると思われる事実である。
正常ヒト結腸及び結腸癌における発現
腫瘍細胞においてポジティブなハイブリダイゼーションシグナルを示す組織断片は無かった。可変強度のポジティブシグナルが、線維芽又は平滑筋分化のいずれかの間葉細胞で観察された。ポジティブシグナルを持つ線維芽細胞は、浸潤性腫瘍がいわゆる線維形成反応(コラーゲン性線維の沈積を伴う線維芽細胞増殖)を誘発するならば、この腫瘍に隣接して観察された。ポジティブな線維芽細胞は、組織修復の領域(肉芽形成又は肉芽腫性反応)でも見られた。ポジティブな平滑筋細胞は中程度のサイズの殆どの動脈血管で見られた。
炎症性ヒト組織(乾癬、IBD、炎症性腎臓、炎症性肺、肝炎、正常扁桃腺、成人及びチンパンジー多ブロック)での発現
発現は、主に炎症性ヒト組織で、少数の正常ヒト及び非ヒト霊長類組織で評価した。発現は、結腸の粘膜上皮、気管大気道上皮、口腔粘膜(舌)、扁桃陰窩粘膜、胎盤粘膜、前立腺粘膜、腺性胃粘膜、上皮細胞、胸腺ハッサル小体、肝細胞、胆管上皮、及び胎盤上皮を含む評価した各上皮構造で見られた。上皮構造の外側での発現の唯一の証拠は、反応性肥厚を持つ扁桃での濾胞の胚中心における弱くて低い、不整合発現であった。
非ヒト霊長類組織(チンパンジー)において:扁桃上皮の表皮に弱い拡散性発現が見られた;ハッサル小体の胸腺上皮に弱い発現が見られた;胃においては、腺性粘膜の上皮において温和な拡散性発現が観察された。
(1)肝臓(慢性胆管炎、小葉過形成、アセトアミノフェン毒性を含む多ブロック)において、拡散性で低から中程度の発現が肝細胞及び胆管上皮に存在した。発現は小葉周辺/門脈周辺肝細胞において最も優勢であった。慢性硬化性胆管炎を持つ肝臓断片における胆管上皮で最も優勢であった。
(2)表皮の乾癬試料において弱い発現が観察された。
(3)慢性間質性肺炎又は慢性気管支炎を持つ肺において、大気道の粘膜上皮に低い拡散性発現が見られた;肺胞上皮にも弱い拡散性発現が見られた。気管支/細気管支の粘膜下腺の上皮には発現は無かった。
(4)胎盤上皮及び胆嚢の粘膜上皮ともに中程度の拡散性発現が観察された。
(5)前立腺上皮では、低い拡散性発現が見られた。
(6)扁桃粘膜及び陰窩の上皮に高い拡散性発現が観察された;シグナルは扁桃陰窩に並ぶ粘膜細胞で最も高かった。皮質濾胞の胚中心(Bリンパ球領域)において弱い不整合な拡散性発現があった;しかしながら、リンパ構造又はリンパ球性炎症を持つ評価した多の組織では、Bリンパ球での発現のあるものは無かった。
(7)炎症性腸疾患及びポリープ/腺腫性変化を持つ結腸では、粘膜上皮における低い発現が見られ、発現は絨毛先端で最も高かった。ポリープを持つ一検体では、隣接する粘膜に比較した場合、ポリープの形成異常上皮における発現の増加の証拠は無かった。多くの断片に存在する反応性粘膜リンパ組織における明らかな発現は無かった。
発現の無い組織は以下を含む:心臓、末梢神経、及び筋肉(心臓、平滑)。
発現は、胎児において、椎骨体の前側表面を内張りする筋膜で観察された。発現は、胎児網膜全体でも見られた。胎児ニューロン全体で低レベルの発現が起こった。多の組織は全てネガティブであった。
胎児組織において:発現は、軟骨原基の縁における発育中の下肢骨(即ち、外縁周辺)において:発育中の腱、血管平滑筋及び細胞包含発育骨格筋の筋細胞及び筋小管において観察された。また発現は骨端成長板でも観察された。胎児リンパ節では、発現は発育中のリンパ節の辺縁洞で見られた。発現は胸腺皮質の被膜下領域で観察され、おそらく、この領域で見られる被膜下上皮細胞又は増殖中の胸腺細胞のいずれかを表している。さらに発現は以下の組織で見られた:気管の平滑筋における発現;脳の大脳皮質における皮質ニューロンでの局所的発現;小腸の平滑筋での発現;胸腺上皮全体の全般的な発現;肝臓の管板細胞における発現;胃の壁在性平滑筋での発現;胎児皮膚の扁平上皮の基底層での発現;胎盤の栄養芽層絨毛における間質細胞での発現;及び動脈の壁及び臍帯の静脈での発現。発現パターンは、この分子が細胞分化/増殖に含まれることを示唆している。
胎児の脾臓、脊髄、又は副腎では発現が観察されなかった。
高い発現は以下の部位で観察された:
(1)チンパンジーの卵巣−成熟中の濾胞の顆粒膜、低い強度のシグナルが包膜細胞全体で観察された;,
(2)チンパンジーの副甲状腺−高い発現が主細胞全体で見られた;
(3)ヒト胎児の精巣−発育中の管を取り囲む間質細胞全体に中程度の発現が見られた。(4)ヒト胎児の肺−発育中の気管支樹における軟骨細胞で高い発現が見られ、分岐している気管支上皮で低レベルの発現が見られた。
試験した胎児の組織(E12-E16週)は以下を含む:胎盤、臍帯、肝臓、腎臓、副腎、甲状腺、肺、心臓、大血管、食道、胃、小腸、脾臓、胸腺、膵臓、脳、眼、脊髄、体壁、骨盤及び下肢。試験した成人組織は以下を含む:肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺、皮膚、大脳皮質(rm)、海馬(rm)、小脳(rm)、陰茎、眼、膀胱、胃、胃癌、結腸、結腸癌及び軟骨肉腫、アセトアミノフェン誘発性肝臓障害及び肝硬変。
強く特異的な発現が、内軟骨及び骨膜性骨形成の全ての部位で骨芽細胞において見られた。さらなる発現部位は、発育中の肺性動脈及び大動脈幹を含んでいた。それ以外は、全ての胎児組織はネガティブであった。試験した組織は以下を含む:胎盤、臍帯、脳、脊髄、眼、視神経、気管、肺、心臓、胸腺、肝臓、脾臓、食道、小腸、膵臓、副腎、甲状腺、体壁及び下肢。
試験した成人組織は全てネガティブであり、以下を含む:肝臓、腎臓、副腎、心筋、大動脈、脾臓、リンパ節、膵臓、肺及び皮膚。多ブロックにおける全ての成人組織はベータ-アクチンに対してポジティブであった。
この分子の可能な役割は、骨マトリクス沈積及び/又は骨芽細胞成長の制御である。
以下の方法は、PROポリペプチドをコードするヌクレオチド配列のハイブリダイゼーションプローブとしての使用を記述する。
(各々、図1、3、5、7、9、11、13、15、17、19、21、23、25、27、29、31、33、35、37、39、41、43、45、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81、83、85、87、89、91、93及び95、各々、配列番号:3、8、13、15、20、25、30、35、40、45、50、55、61、66、71、76、84、89、97、106、111、116、126、131、136、142、147、152、154、159、161、169、180、182、190、192、194、196、198、200、202、204、213、215、217、219、221及び226に示されたような)全長又は成熟PROポリペプチド又はその断片のコード化配列を含むDNAは、ヒト組織cDNAライブラリ又はヒト組織ゲノムライブラリの同種DNA(PROの天然発生変異体をコードするもの等)のスクリーニングのためのプローブとして用いられ得る。
ハイブリダイゼーション及びいずれかのライブラリDNAを含むフィルターの洗浄は、以下の高度にストリンジェントな条件下で実施される。PROポリペプチドをコードしている遺伝子から誘導された放射標識プローブのフィルターへのハイブリダイゼーションは、50%ホルムアミド、5x SSC、0.1%SDS、0.1%ピロリン酸ナトリウム、50mMリン酸ナトリウム、pH6.8、2xデンハード液、及び10%デキストラン硫酸の溶液中で42℃で20時間実施した。フィルターの洗浄は、0.1xSSC及び0.1%SDS水溶液中で、42℃で実施した。
全長天然配列をコードするDNAと所望の同一性を持つDNAは、次いでこの分野で知られた標準的技術を用いて同定できる。
この実施例は、大腸菌での組換え発現による非グリコシル化形態のPROポリペプチドの調製を例示する。
PRO187、PRO195、PRO224、PRO301、PRO364、PRO713、PRO788、PRO1274、PRO1286、PRO1303、PRO1312、PRO1313及びPRO1376(各々配列番号:20、30、50、89、116、136、152、196、198、202、213、215及び217)をコードするDNA配列を、選択したPCRプライマーを用いて最初に増幅した。プライマーは、選択された発現ベクターの制限酵素部位に対応する制限酵素部位を持たなければならない。種々の発現ベクターが用いられる。好適なベクターの例は、pBR322(大腸菌から誘導されたもの;Bolivar等, Gene, 2:95 (1977)参照)であり、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性についての遺伝子を含む。ベクターは、制限酵素で消化され脱リン酸される。PCR増幅した配列は、次いでベクターに結合させる。ベクターは、好ましくは抗生物質耐性遺伝子、trpプロモーター、ポリ-hisリーダー(最初の6つのSTIIコドン、ポリ-His配列、及びエンテロキナーゼ切断部位を含む)、PRO187、PRO195、PRO224、PRO301、PRO364、PRO713、PRO788、PRO1274、PRO1286、PRO1303、PRO1312、PRO1313及びPRO1376のコード化領域、ラムダ転写終結区、及びargU遺伝子を含む。
ライゲーション混合物は、次いで、上掲のSambrook等に記載された方法を用いた選択した大腸菌の形質転換に使用される。形質転換体は、それらのLBプレートで成長する能力により同定され、次いで抗生物質耐性クローンが選択される。プラスミドDNAが単離され、制限分析及びDNA配列決定で確認される。
選択されたクローンは、抗生物質を添加したLBブロスなどの液体培地で終夜成長させることができる。終夜培地は、続いて大規模培地の播種に用いられる。次に細胞を最適密度で成長させ、その間に発現プロモーターが作動する。
更に数時間の培養の後、細胞を遠心分離により採集できる。遠心分離で得られた細胞ペレットは、この分野で知られた種々の試薬を用いて可溶化され、次いで可溶化PRO187、PRO195、PRO224、PRO301、PRO364、PRO713、PRO788、PRO1274、PRO1286、PRO1303、PRO1312、PRO1313及びPRO1376ポリペプチドを金属キレート化カラムを用いてポリペプチドを緊密に結合させる条件下で精製できる。
この実施例は、哺乳動物細胞での組換え発現による潜在的にグリコシル化形態のPROポリペプチドの調製を例示する。
発現ベクターとしてベクターpRK5(1989年3月15日発行のEP 307,247参照)を用いた。場合によっては、PRO DNAを選択した制限酵素でpRK5に結合させ、上掲のSambrook等に記載されたような結合方法を用いてPROポリペプチドコード化DNAへの挿入を行う。得られたベクターは、pRK5-(PROコード化DNA)と呼ばれる。
一実施態様では、選択された宿主細胞は293細胞とすることができる。ヒト293細胞(ATCC CCL 1573)は、子ウシ胎児血清及び場合によっては滋養成分又は抗生物質を添加したDMEMなどの媒質中で組織培養プレートにおいて成長させて集密化した。約10μgのpRK5-(PROコード化DNA)を約1μgのVA RNA遺伝子をコードするDNA(Thimmappaya等, Cell, 31:543 (1982))と混合し、500μlの1mMトリス-HCl、0.1mMのEDTA、0.227MのCaCl2に溶解させた。この混合物に、滴状の、500μlの50mMのHEPES(pH7.35)、280mmのNaCl、1.5mMのNaPO4を添加し、25℃で10分間析出物を形成させた。析出物を懸濁し、293細胞に加えて37℃で約4時間定着させた。培養培地を吸引し、2mlのPBS中20%グリセロールを30秒間添加した。293細胞は、次いで無血清培地で洗浄し、新鮮な培地を添加し、細胞を約5日間インキュベートした。
形質移入の約24時間後、培養培地を除去し、培養培地(のみ)又は200μCi/mlの35S-システイン及び200μCi/mlの35S-メチオニンを含む培養培地で置換した。12時間のインキュベーションの後、条件培地を回収し、スピンフィルターで濃縮し、15%SDSゲルに添加した。処理したゲルを乾燥させ、PROポリペプチドの存在を現す選択された時間にわたってフィルムに暴露した。形質転換した細胞を含む培地は、更なるインキュベーションを施し(無血清培地で)、培地を選択されたバイオアッセイで試験した。
他の実施態様では、PROポリペプチドをコードする遺伝子をCHO細胞で発現させることができる。pRK5-(PROコード化DNA)核酸は、CaPO4又はDEAE-デキストランなどの公知の試薬を用いてCHO細胞に形質移入することができる。上記したように、細胞培地をインキュベートし、培地を培養培地(単独)又は35S-メチオニン等の放射性標識を含む培地に置換することができる。PROポリペプチドの存在を同定した後、培養培地を無血清培地に置換してもよい。好ましくは、培地を約6日間インキュベートし、次いで条件培地を収集する。次いで、発現されたPROポリペプチドを含む培地を濃縮して、選択した方法によって精製することができる。
また、PROポリペプチドをコードしているエピトープタグ遺伝子を宿主CHO細胞において発現させてもよい。PROポリペプチドをコードしている遺伝子はpRK5ベクターからサブクローニングしてもよい。サブクローン挿入物はPCR増幅を受けてバキュロウイルス発現ベクター中にポリ-hisタグ等の選択されたエピトープタグとフレーム内で融合できる。ポリ-hisタグPROポリペプチドをコードする遺伝子挿入物は、次いで、安定なクローンの選択のためのDHFR等の選択マーカーを含むSV40誘導ベクターにサブクローニングできる。最後に、CHO細胞をSV40誘導ベクターで(上記のように)形質移入した。発現を確認するために、上記のように標識化を行ってもよい。次いで、発現されたポリ-hisタグPROポリペプチドをコードする発現遺伝子を含む培地を濃縮し、Ni2+-キレートアフィニティクロマトグラフィー等の選択された方法により精製できる。 PRO172、PRO178、PRO179、PRO182、PRO188、PRO212、PRO214、PRO216、PRO217、PRO224、PRO245、PRO261、PRO301、PRO356、PRO364、PRO713、PRO788、PRO792、PRO865、PRO1126、PRO1130、PRO1244、PRO1246、PRO1274、PRO1286、PRO1294、PRO1303、PRO1304、PRO1376及びPRO1387は、上述の方法によりCHO細胞に置いて安定に発現された。さらに、PRO172、PRO178、PRO182、PRO231、PRO245、PRO301、PRO356及びPRO364は、CHO細胞において一過性の手法により発現された。
以下の方法は、酵母菌中でのPROポリペプチドをコードする遺伝子の組換え発現を記載する。
第1に、ADH2/GAPDHプロモーターからのPROポリペプチドの細胞内生産又は分泌のための酵母菌発現ベクターを作成する。PROポリペプチドをコードするDNA及びプロモーターを選択したプラスミドの適当な制限酵素部位に挿入してPROポリペプチドをコードする遺伝子の細胞内発現を指示する。分泌のために、PROポリペプチドをコードするDNAを選択したプラスミドに、ADH2/GAPDHプロモーター、天然PROポリペプチドシグナルペプチド又は他の哺乳類シグナルペプチドをコードするDNA、又は、例えば酵母菌アルファ因子分泌シグナル/リーダー配列、及び(必要ならば)PROポリペプチドの発現のためのリンカー配列とともにクローニングすることができる。
酵母菌株AB110等の酵母菌は、次いで上記の発現プラスミドで形質転換し、選択された発酵培地中で培養できる。形質転換した酵母菌上清は、10%トリクロロ酢酸での沈降及びSDS−PAGEによる分離で分析し、次いでクマシーブルー染色でゲルの染色をすることができる。
続いて組換えPROポリペプチドは、発酵培地から遠心分離により酵母菌細胞を除去し、次いで選択されたカートリッジフィルターを用いて培地を濃縮することによって単離及び精製できる。PROポリペプチドを含む濃縮物は、選択されたカラムクロマトグラフィー樹脂を用いてさらに精製してもよい。
以下の方法は、バキュロウイルス感染昆虫細胞中における組換え発現を記載する。
PROポリペプチドをコードする配列は、バキュロウイルス発現ベクターに含まれるエピトープタグの上流に融合させた。このようなエピトープタグは、ポリ-Hisタグ及び免疫グロブリンタグ(IgGのFc領域など)を含む。pVL1393(Navogen)などの市販されているプラスミドから誘導されるプラスミドを含む種々のプラスミドを用いることができる。簡単には、PROポリペプチドをコードする配列又はPROポリペプチドコード化配列の所定部分[膜貫通タンパク質の細胞外ドメインをコードする配列又はタンパク質が細胞外である場合の成熟タンパク質をコードする配列など]が、5'及び3'領域に相補的なプライマーでPCRにより増幅される。5'プライマーは、隣接する(選択された)制限酵素部位を包含していてもよい。生成物は、次いで、選択された制限酵素で消化され、発現ベクターにサブクローニングされる。
組換えバキュロウイルスは、上記のプラスミド及びBaculoGoldTMウイルスDNA(Pharmingen)を、Spodoptera frugiperda(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)中にリポフェクチン(GIBCO-BRLから市販)を用いて同時形質移入することにより作成される。28℃で4-5日インキュベートした後、放出されたウイルスを回収し、更なる増幅に用いた。ウイルス感染及びタンパク質発現は、O'Reilley等, Baculovirus expression vectors: A laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994)に記載されているように実施した。
PRO172、PRO178、PRO214、PRO216、PRO231、PRO235、PRO269、PRO301、PRO356、PRO538、PRO719、及びPRO1376は、バキュロウイルス感染したSf9昆虫細胞で発現された。発現は実際には0.5-2Lのスケールで実施したが、容易により大きな(例えば8L)調製にスケールアップできる。タンパク質はIgG作成物(イムノアドヘシン)として発現され、そこではタンパク質細胞外領域がヒンジ、CH2及びCH3ドメイン及び/又はポリ-Hisタグ形態を含むIgG1定常領域配列に融合している。
PCR増幅に続いて、対応するコード化配列をバキュロウイルス発現ベクター(IgG融合物に対するpb.PH.IgG及びポリ-Hisタグに対するpb.PH.His.c)にサブクローニングし、そのベクター及びBaculogold(登録商標)バキュロウイルスDNA(Pharmingen)を105スポドプテラグルヒペルダ(Spodoptera frugiperda)(「Sf9」)細胞(ATCC CRL 1711)にリポフェクチン(Gibco BRL)を用いて同時形質移入した。pb.PH.IgG及びPH.His.cは、市販のバキュロウイルス発現ベクターpVL1393(Pharmingen)の修飾物であり、His又はFcタグ配列を含むように修飾されたポリリンカー領域を持つ。細胞を、10%のFBS(Hyclone)を添加したHinkのTNM-FM培地で成長させた。細胞は、28℃で5日間インキュベートした。上清を回収し、続いて10%FBSを添加したHinkのTNM-FH培地におけるSf9細胞感染による約10の感染効率(MOI)での最初のウイルス増幅に用いた。細胞を28℃で3日間インキュベートした。上清を回収し、バキュロウイルス発現ベクターにおける作成物の発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のNi2+-NTAビーズ(QIAGEN)又はIgGタグタンパク質用のプロテインAセファロースCL-4Bビーズ(Pharmacia)へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するSDS−PAGE分析により測定した。
形質移入細胞からの条件培地(0.5〜3L)を、遠心分離により細胞を除去し0.22ミクロンフィルターを通して濾過することにより回収した。ポリ-Hisタグ作成物については、配列を含むタンパク質をNi2+-NTAカラム(Qiagen)を用いて精製した。精製前に、イミダゾールを条件培地に5mMの濃度まで添加した。条件培地を、0.3MのNaCl及び5mMイミダゾールを含む20mMのHepes, pH7.4バッファーで平衡化した6mlのNi2+-NTAカラムに4-5ml/分の流速で4℃においてポンプ供給した。負荷後、カラムをさらに平衡バッファーで洗浄し、タンパク質を0.25Mイミダゾールを含む平衡バッファーで溶離した。高度に精製されたタンパク質は、続いて10mMのHepes、0.14MのNaCl及び4%のマンニトールを含む貯蔵バッファー, pH6.8中で25mlのG25 Superfine(Pharmacia)を用いて脱塩し、−80℃で貯蔵した。
タンパク質のイムノアドヘシン(Fc含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Hisタグタンパク質について上記した貯蔵バッファー中で脱塩した。タンパク質の均一性はSDSポリアクリルアミドゲル(PEG)電気泳動及びエドマン(Edman)分解によるN-末端アミノ酸配列決定により評価できる。
High-5細胞は、27℃、CO2無し、pen/strep無しの条件下で50%の集密度まで成長させた。150mmプレート各々について、30μgのPROポリペプチドを含むpIEベースベクターを1mlのEx-細胞培地(媒質:Ex-細胞401+1/100のL-Glu JRH Biosciences #14401-78P(注:この媒質は光感受性))と混合し、別の管において、100μlのセルフェクチン(CellFECTIN(Gibco BRL #10362-010)(ボルテックスで混合))を1mlのEx-細胞培地と混合した。2つの溶液を混合し、室温で15分間インキュベーションした。8mlのEx-細胞培地を2mlのDNA/セルフェクチン混合物に添加し、Ex-細胞培地で1回洗浄したHi5細胞上に層形成させた。次いでプレートを暗中室温でインキュベートした。次いでDNA/セルフェクチン混合物を吸引し、細胞をEx-細胞で1回戦乗して過剰のセルフェクチンを除去した。30mlの新鮮なEx-細胞培地を添加し、細胞を28℃で3日間インキュベートした。上清を回収して、バキュロウイルス感染ベクターでのPROポリペプチドの発現を、1mlの上清の25mLのヒスチジンタグタンパク質用のNi2+-NTAビーズ(QIAGEN)又はIgGタグタンパク質用のプロテインAセファロースCL-4Bビーズ(Pharmacia)へのバッチ結合、次いでクマシーブルー染色により周知の濃度のタンパク質標準と比較するSDS−PAGE分析により測定した。
タンパク質のイムノアドヘシン(Fc含有)作成物を以下のようにして条件培地から精製した。条件培地を、20mMのリン酸ナトリウムバッファー, pH6.8で平衡化した5mlのプロテインAカラム(Pharmacia)に負荷した。負荷後、カラムを平衡バッファーで強く洗浄した後、100mMのクエン酸, pH3.5で溶離した。溶離したタンパク質は、1mlの画分を275mLの1Mトリスバッファー, pH9を含む管に回収することにより即座に中性化した。高度に精製されたタンパク質は、続いてポリ-Hisタグタンパク質について上述した貯蔵バッファー中で脱塩した。配列の均一性はSDSポリアクリルアミドゲル及びエドマン(Edman)分解によるN-末端アミノ酸配列決定及び所望又は必要に応じて他の分析手法により評価できる。
PRO172、PRO178、PRO179、PRO182、PRO187、PRO188、PRO212、PRO216、PRO217、PRO224、PRO231、PRO235、PRO269、PRO287、PRO301、PRO323、PRO331、PRO356、PRO364、PRO526、PRO538、PRO713、PRO771、PRO788、PRO792、PRO812、PRO865、PRO1075、PRO1154、PRO1244、PRO1286、PRO1304、PRO1312、PRO1376、PRO1387、及びPRO1561は、high-5細胞を導入する上記の改変バキュロウイルス法により成功裏に発現された。
この実施例は、PROポリペプチドに特異的に結合できるモノクローナル抗体の調製を例示する。
モノクローナル抗体の生産のための技術は、この分野で知られており、例えば、上掲のGodingに記載されている。用いられ得る免疫原は、PROポリペプチドを含む精製PRO融合タンパク質、細胞表面に組換えPROポリペプチドをコードする遺伝子を発現する細胞を含む。免疫原の選択は、当業者が過度の実験をすることなくなすことができる。
Balb/c等のマウスを、完全フロイントアジュバントに乳化して皮下又は腹腔内に1-100マイクログラムで注入したPROポリペプチド免疫原で免疫化する。あるいは、免疫原をMPL−TDMアジュバント(Ribi Immunochemical Researh, Hamilton, MT)に乳化し、動物の後足蹠に注入してもよい。免疫化したマウスは、次いで10から12日後に、選択したアジュバント中に乳化した付加的免疫源で追加免疫する。その後、数週間、マウスをさらなる免疫化注射で追加免疫する。抗-PRO抗体の検出のためのELISAアッセイで試験するために、レトロオービタル出血により血清試料をマウスから周期的に採取してもよい。
適当な抗体力価が検出された後、抗体に「ポジティブ」な動物に、PROポリペプチドの静脈内注射の最後の注入をすることができる。3から4日後、マウスを屠殺して脾臓を取り出した。次いで脾臓細胞を(35%ポリエチレングリコールを用いて)、ACTTから番号CRL1597で入手可能なP3X63AgU.1等の選択されたマウス骨髄腫細胞系に融合させた。融合によりハイブリドーマ細胞が生成され、次いで、HAT培地を含む96ウェル組織培養プレートに蒔き、非融合細胞、骨髄腫ハイブリッド、及び脾臓細胞ハイブリッドの増殖を阻害した。
ハイブリドーマ細胞は、PROポリペプチドに対する反応性についてのELISAでスクリーニングされる。PROポリペプチドに対する所望のモノクローナル抗体を分泌する「ポジティブ」ハイブリドーマ細胞の決定は技術常識の範囲内である。
ポジティブハイブリドーマ細胞を同系のBalb/cマウスに腹腔内注入し、抗-PROモノクローナル抗体を含む腹水を生成させる。あるいは、ハイブリドーマ細胞を、組織培養フラスコ又はローラーボトルで成長させることもできる。腹水中に生成されたモノクローナル抗体の精製は、硫酸アンモニウム沈降、それに続くゲル排除クロマトグラフィ−を用いて行うことができる。あるいは、抗体のプロテインA又はプロテインGへの親和性に基づくアフィニティクロマトグラフィーを用いることもできる。
次の材料をアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション, 10801 ユニバーシティ・ブルバード、マナッサス、バージニア20110−2209米国(ATCC)に寄託した:
材料 ATCC寄託番号 寄託日
DNA35916-1161 209419 1997年10月28日
DNA23339-1130 209282 1997年 9月18日
DNA16451-1388 209776 1998年 4月14日
DNA27865-1091 209296 1997年 9月23日
DNA27864-1155 209375 1997年10月16日
DNA28497-1130 209279 1997年 9月18日
DNA26847-1395 209772 1998年 4月14日
DNA30942-1134 209254 1997年 9月16日
DNA32286-1191 209385 1997年10月16日
DNA33094-1131 209256 1997年 9月16日
DNA33221-1133 209263 1997年 9月16日
DNA34434-1139 209252 1998年 9月16日
DNA35558-1167 209374 1997年10月16日
DNA35638-1141 209265 1997年 9月16日
DNA33473-1176 209391 1997年10月17日
DNA38260-1180 209397 1997年10月17日
DNA39969-1185 209400 1997年10月17日
DNA40628-1216 209432 1997年11月 7日
DNA35595-1228 209528 1997年12月10日
DNA40981-1234 209439 1997年11月 7日
DNA47470-1130-P1 209422 1997年10月28日
DNA44184-1319 209704 1998年 3月26日
DNA48613-1268 209752 1998年 4月 7日
DNA29101-1122 209653 1998年 3月 5日
DNA49646-1327 209705 1998年 3月26日
DNA49829-1346 209749 1998年 4月 7日
DNA56405-1357 209849 1998年 5月 6日
DNA56352-1358 209846 1998年 5月 6日
DNA59205-1421 203009 1998年 6月23日
DNA53974-1401 209774 1998年 4月14日
DNA57689-1385 209869 1998年 5月14日
DNA60615-1483 209980 1998年 6月16日
DNA59814-1486 203359 1998年10月28日
DNA59846-1503 209978 1998年 6月16日
DNA64883-1526 203253 1998年 9月 9日
DNA64885-1529 203457 1998年11月 3日
DNA64889-1541 203250 1998年 9月 9日
DNA64903-1553 203223 1998年 9月15日
DNA64905-1558 203233 1998年 9月15日
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DNA61873-1574 203132 1998年 8月18日
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DNA67300-1605 203163 1998年 8月25日
DNA68872-1620 203160 1998年 8月25日
DNA76538-1670 203313 1998年10月 6日
DNA33087 203381 1997年10月16日
本出願の譲受人は、寄託した材料の培養物が、適切な条件下で培養されていた場合に死亡もしくは損失又は破壊されたならば、材料は通知時に同一の他のものと速やかに取り替えることに同意する。寄託物質の入手可能性は、特許法に従いあらゆる政府の権限下で認められた権利に違反して、本発明を実施するライセンスであるとみなされるものではない。 上記の文書による明細書は、当業者に本発明を実施できるようにするために十分であると考えられる。寄託した態様は、本発明のある側面の一つの説明として意図されており、機能的に等価なあらゆる作成物がこの発明の範囲内にあるため、寄託された作成物により、本発明の範囲が限定されるものではない。ここでの材料の寄託は、ここに含まれる文書による説明が、そのベストモードを含む、本発明の任意の側面の実施を可能にするために不十分であることを認めるものではないし、それが表す特定の例証に対して請求の範囲を制限するものと解釈されるものでもない。実際、ここに示し記載したものに加えて、本発明を様々に変形することは、前記の記載から当業者にとっては明らかなものであり、添付の請求の範囲内に入るものである。
Claims (15)
- 哺乳動物における心臓血管、内皮、又は血管形成疾患の治療のための医薬組成物であって、
配列番号:155に示されるポリペプチド、あるいは、
一又は複数のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加により、配列番号:155に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有し、心臓新生児肥大を刺激することのできるポリペプチド、
を含んでなる医薬組成物。 - 哺乳動物における心臓血管、内皮、又は血管形成疾患の治療のための医薬組成物であって、
配列番号:155に示されるポリペプチド、あるいは、
一又は複数のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加により、配列番号:155に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有し、心臓新生児肥大を刺激することのできるポリペプチド、
をコードする核酸分子、を含んでなる医薬組成物。 - 前記哺乳動物がヒトである、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 前記ヒトが心筋梗塞に罹患している、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記ヒトが心臓肥大、外傷、癌、又は加齢性黄斑変性に罹患している、請求項3に記載の医薬組成物。
- 前記心臓肥大がPGF2αのレベル上昇の存在によって特徴づけられる、請求項5に記載の医薬組成物。
- 心臓血管、内皮、血管形成又は血管形成抑制薬をさらに含む、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 一次血管形成術に続いて投与される、請求項5に記載の医薬組成物。
- 前記心臓血管、内皮、又は血管形成疾患が癌である、請求項1又は2に記載の医薬組成物。
- 化学治療薬、成長薬、成長阻害薬又は細胞毒性薬を更に含む、請求項9に記載の医薬組成物。
- 前記核酸分子がエキソビボ遺伝子治療を介して投与される、請求項2に記載の医薬組成物。
- 請求項1に記載の医薬組成物の製造方法であって、前記ポリペプチドを製薬的に許容される担体と混合することを含んでなる製造方法。
- 請求項2に記載の医薬組成物の製造方法であって、前記ポリペプチドをコードする核酸分子を製薬的に許容される担体と混合することを含んでなる製造方法。
- 哺乳動物における心臓血管、内皮、又は血管形成疾患の治療のための医薬であって、
(1)プロモータ、
(2)配列番号:155に示されるポリペプチド、あるいは、一又は複数のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加により、配列番号:155に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有し、心臓新生児肥大を刺激することのできるポリペプチド、をコードする核酸、及び
(3)前記ポリペプチドの細胞性分泌のためのシグナル配列、
からなるレトロウイルスベクター、及び、
レトロウイルス構造タンパク質
を含む組換えレトロウイルス粒子、を含んでなる医薬。 - 哺乳動物における心臓肥大の誘発剤であって、配列番号:155に示されるポリペプチド、あるいは、一又は複数のアミノ酸の置換、欠失もしくは付加により、配列番号:155に示されるアミノ酸配列と少なくとも90%の相同性を有し、心臓新生児肥大を刺激することのできるポリペプチドを含んでなる誘発剤。
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