CN114507677B - Ndufs1基因在治疗心梗后心衰中的应用和相关产品 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种Ndufs1基因在治疗心梗后心衰中的应用和相关产品，Ndufs1的上调可显著减少缺氧引起的细胞凋亡以及线粒体呼吸功能障碍，这对提高心肌细胞功能和减少细胞死亡极其有利，基于AAV的Ndufs1过表达载体可显著改善心梗后心肌纤维化和心功能障。因此，针对Ndufs1这个新靶点，基于AAV的基因治疗有望成为治疗或预防心梗后心衰的有效手段。

Description

Ndufs1基因在治疗心梗后心衰中的应用和相关产品
技术领域
本发明属于生物与新医药技术领域，具体属于一种Ndufs1基因在治疗心梗后心衰中的应用和相关产品。
背景技术
在全球范围内，心血管疾病是最常见的死亡原因。心力衰竭是大多数心血管疾病的终末期表现，其长期预后较差，其5年死亡率超过一些常见癌症。在过去的20年中，心肌梗死一直是心力衰竭的最常见原因。在心梗发生期间，血液供应的突然中断或减少导致心肌细胞死亡或使剩余存活心肌细胞功能障碍。心梗后细胞凋亡和心肌纤维化是不良心肌重构的重要病理特征。虽然目前介入和药物策略的进步已经为心梗患者带来了较好的临床结果，但心梗后心力衰竭的发病率和死亡率仍然很高。因此，寻找并确定新的治疗靶点非常重要。
心脏收缩和舒张需要持续供应ATP，其中大部分来自线粒体中的氧化磷酸化。线粒体复合物I是线粒体呼吸链的起始酶和最大的酶，负责从NADH到辅酶Q10的电子转移，并与质子从基质转运到膜间隙的过程相耦合。哺乳动物复合体I由45个亚基组成；14个核心亚基中有7个由核基因编码。Ndufs1是由核基因编码的最大核心亚基，是八个铁硫链的一部分，负责NADH的氧化。质子跨线粒体内膜易位产生电化学梯度，驱动复合体V中的ATP产生。作为同时产生ATP的副产品，活性氧也会在几个线粒体复合体中产生，主要是复合体I。之前的一项研究表明，神经元中的Ndufs1超低导致耗氧量受损，线粒体活性氧增加；星形胶质细胞中上调的Ndufs1也减少了活性氧的产生。在从患有Ndufs1突变的患者身上获得的皮肤成纤维细胞中，发现了高水平的氧化应激，伴随着复合物I活性的降低、耗氧量的降低和糖酵解的增加。作为线粒体电子传递链(ETC)的起点，Ndufs1是ATP和活性氧产生的双重“引擎”，并在多种疾病的代谢重编程、氧化应激和细胞凋亡中发挥重要作用。心脏是一个高耗能、富含线粒体的器官。Ndufs1在人类心脏中高度表达。然而，Ndufs1在心脏病中的作用及其潜在机制尚不清楚。
腺相关病毒(AAV)是一种线性单链的DNA病毒，是基因治疗的重要工具，具有表达时间持久、安全性高、免疫原性低等优势，已有大量的临床前研究和临床研究正在开展。不同血清型的AAV具有不同的组织特异性，可以实现组织特异性的基因递送，逐渐成为一种理想的基因治疗载体。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明提供一种Ndufs1基因在治疗心梗后心衰中的应用和相关产品，基于AAV构建重组的Ndufs1过表达载体，通过胸腔注射等手段，实现小鼠心脏特异性表达，缓解小鼠心梗后心力衰竭。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种用于治疗心梗后心衰的基因，所述基因为Ndufs1基因，Ndufs1基因的碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明提供了一种过表达质粒，将上述Ndufs1基因作为目的基因插入携带心脏特异性启动子cTNT的质粒中构建得到。
进一步的，所述质粒为GV618，克隆位点为AgeI/HindIII，构建过表达质粒时，正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物的碱基序列碱基序列如SEQ ID NO:3所示。
本发明提供了一种AAV过表达病毒载体，采用AAV9型病毒，由pHelper、pAAV-RC与上述过表达质粒共转染AAV-293细胞得到。
本发明提供了一种细胞，所述细胞中含有上述的AAV过表达病毒载体。
本发明提供了上述过表达质粒、AAV过表达病毒载体或细胞在制备治疗心梗后心衰的药物或医疗器材中的用途。
本发明提供了一种用于治疗心梗后心衰的产品，其特征在于，所述产品的活性物质为上述基因、过表达质粒、AAV过表达病毒载体或细胞。
本发明提供了一种用于治疗心梗后心衰的药品，所述药品中包括上述基因、过表达质粒、AAV过表达病毒载体或细胞。
进一步的，所述药品通过注射导入机体。
本发明提供了一种AAV过表达病毒载体的构建方法，所述构建方法至少包括：
1)构建腺相关病毒穿梭质粒；
2)腺相关病毒包装。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
本发明提供一种Ndufs1基因在治疗心梗后心衰中的应用和相关产品，Ndufs1的上调可显著减少缺氧引起的细胞凋亡以及线粒体呼吸功能障碍，这对提高心肌细胞功能和减少细胞死亡极其有利，基于AAV的Ndufs1过表达载体可显著改善心梗后心肌纤维化和心功能障。因此，针对Ndufs1这个新靶点，基于AAV的基因治疗有望成为治疗或预防心梗后心衰的有效手段。
其中AAV9对心脏的亲和性较高，cTNT为心肌特异性启动子，通过在载体上加入cTNT，可达到心肌细胞特异性过表达的效果。基于AAV9构建重组的Ndufs1过表达载体，通过胸腔注射等手段，实现小鼠心脏特异性表达，提高了心脏射血功能以及减少了心肌纤维化，缓解小鼠心梗后心力衰竭。
附图说明
图1为含Ndufs1基因序列的AAV图谱，其中载体名称为GV618，元件顺序为cTNTp-MCS-SV40 PolyA，其中cTNT为心肌特异性启动子。
图2为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图3为重组质粒PCR鉴定的琼脂糖凝胶电泳结果图。
图4为小鼠心脏超声结果分析图。
图5为小鼠心脏石蜡切片Masson染色图。
图6为Ndufs1在小鼠心肌中过表达的免疫印迹图。
图7为不同处理后细胞凋亡标志蛋白Cleaved caspase3表达的免疫印迹图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步的说明。
一、如图1所示，本发明提供基于AAV9的Ndufs1过表达载体，该载体用于对心梗后心衰的治疗，其构建方法如下：
1.基因基本信息
基因名称：Ndufs1(NM_145518-3flag)
基因ID:227197
物种:小鼠
CDS长度：2184bp
CDS区碱基序列碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
2.载体酶切
2.1载体信息：
根据Ndufs1基因碱基长度选择合适载体，该载体携带心脏特异性启动子cTNT，本实验选用的载体信息如下：
载体名称：GV618
元件顺序：cTNTp-MCS-SV40 PolyA
克隆位点：AgeI/HindIII
对照编号：CON308
2.2载体酶切：
根据表1，配制50μl酶切体系。按表1顺序依次加入各种试剂，用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，置于37℃1反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带。
表1酶切体系配置
图2为PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果图，如图2所示，右侧条带为DNA分子量标志物，自上而下依次为：5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，250bp，100bp。左侧条带为目的基因PCR产物条带，实际大小为2318bp。结果符合预期。
3.目的基因片段的获取
3.1引物
正向引物Ndufs1(66517-1)-P1的碱基序列如SEQ ID NO:2所示；
反向引物Ndufs1(66517-1)-P2的碱基序列如SEQ ID NO:3所示
引物说明：含交换配对碱基、酶切位点，并含有目的基因5’端部分序列用于PCR获取目的基因。
3.2 PCR扩增目的基因片段
反应条件如表3所示：
表2PCR扩增反应条件
根据表4配制如下PCR扩增反应体系，轻轻吹打混匀，短暂离心，置于PCR仪中进行目的基因的扩增；
表3PCR扩增反应体系
4.重组质粒构建
4.1PCR产物与GV618载体进行交换与转化
表4交换反应体系
于冰水浴中配制上述反应体系。用移液器轻轻吹打混匀，短暂离心，避免产生气泡。于37℃反应30min，随后置于冰水浴中冷却5min后立即转化，得到过表达质粒。
将10μL过表达质粒加入到100μL感受态细胞中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有相应抗生素的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12～16h。
4.2 PCR鉴定引物
引物KL66517-P3的碱基序列碱基序列如SEQ ID NO:4；
引物SV40 PolyA-R的碱基序列碱基序列如SEQ ID NO:5；
配制如下PCR鉴定反应体系，震荡混匀，短暂离心。在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μL鉴定体系中，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。
表5PCR鉴定反应体系配制
表6PCR鉴定反应条件
4.3 PCR鉴定结果
1.空白对照以无菌水为模板，用于检测鉴定体系是否存在污染。
2阴性对照以未插入目的基因的空载体为模板，用于证明扩增过程中无假阳性现象。
3阳性对照以含有GAPDH基因的DNA为模板，用于验证鉴定工作体系是否正常。
如图3所示，从左到右依次编号：1-12#：
1#：阴性对照(水)
2#：阴性对照(空载自连对照组)
3#：阳性对照(GAPDH)
4#：DNA分子量标志物，自上而下依次为5kb，3kb，2kb，1.5kb，1Kb，750bp，500bp，
250bp，100bp
5-12#：1-8号转化子。转化子PCR产物大小：1166bp。结果符合预期。
说明上述过表达质粒重组成功。
5.阳性克隆测序结果及结果分析：
比对结果：
1)加粗部分为目的基因CDS区+Flag标签的DNA碱基序列(共计2268个碱基)。
2)加粗部分的开头双下划线ATG以及结尾TGA分别为起始密码子和终止密码子的DNA碱基序列(均为3个碱基)。
3)开头和结尾单下划线部分为酶切位点DNA碱基序列(均为6个碱基)。
6.质粒抽提
将测序正确的菌液转接于10ml含相应抗生素的LB液体培养基中，37℃培养过夜，用天根无内毒素质粒小提中量试剂盒进行质粒抽提，抽提合格的质粒进入下游流程。详细操作步骤如下：
(1).收集过夜培养的菌液于标记好的5ml离心管，12000rpm，离心2min收菌；
(2).弃上清，加入250μl细胞重悬液，充分振荡，使菌块悬浮均匀；
(3).加入250μl细胞裂解液，再加入10μl蛋白酶K，上下颠倒5-6次，轻轻混匀；静置1-2min，致使菌体裂解澄清；
(4).加入350μl中和液，上下颠倒混匀，使蛋白完全析出，冰浴静置5min；
(5).10000rpm离心10min，弃蛋白，收集上清于另一干净无菌的1.5ml EP管；
(6).12000rpm离心5min，同时准备标记好的回收柱，将上清转移至回收柱中，12000rpm离心1min，弃下层废液；
(7).加入600μl预先配置好的漂洗液，12000rpm离心1min，弃下层废液，重复一次，12000rpm空离2min，进一步除去残留的漂洗液；
(8).在超净台中将回收柱转移至新的1.5ml EP管中，静置10-20min，自然晾干；
(9).往回收柱中加入95μl Nuclease-Free Water，静置2min，12000rpm离心2min，收集样品做好编号，电泳、测定浓度，筛选出符合要求的纯度较高的质粒。
7.AAV病毒包装(因为本研究主要针对的是心肌细胞，建议使用AAV9型病毒)
(1)上述重组表达质粒同pHelper(携带腺病毒来源的基因)和pAAV-RC(携带AAV复制和衣壳基因)共转染AAV-293细胞(购自上海吉凯基因公司)(提供AAV复制和包装所需的反式作用因子)。转染2到3天后重组AAV在AAV-293细胞中组装完成，该细胞中会产生基于AAV的Ndufs1过表达载体。
(2)从被感染AAV-293细胞中收集AAV病毒颗粒，一般AAV颗粒会富集在AAV-293细胞中，所以收集上述细胞而后裂解，使其释放AAV颗粒到上清液中可以回收大部分的AAV颗粒。这一步得到的病毒上清液的随后用于感染各种哺乳动物类细胞系的感染实验。同时上清中的病毒也可以浓缩保留。
8.病毒滴度检测
采用定量PCR法检测病毒滴度，病毒滴度为：1.16×1013v.g./ml。
二.将含有Ndufs1过表达载体的病毒通过胸腔注射的方法导入小鼠心脏
选取4周龄雄性C57小鼠，实验前将小鼠胸前毛发脱去，在2％异氟烷麻醉作用下，将小鼠固定在操作台上。按照每只小鼠注射病毒总量为1x1011vg。病毒用生理盐水稀释，每只小鼠注射体积为50ul。剪开胸前皮肤约1cm，用微量注射器插入小鼠胸腔缓慢注射，注意不要扎入心脏。
本发明也可通过尾静脉注射或者心肌多点原位注射将含有Ndufs1过表达载体的病毒小鼠导入体内。
三.功能学及组织学实验验证：基于AAV9的Ndufs1过表达载体在改善心梗后心脏功能方面的作用
1.小鼠心梗(MI)模型
将小鼠分为4组，包括假手术组、心梗组、心梗+对照病毒组和心梗+Ndufs1过表达组，AAV9病毒注射一个月后进行心梗手术。小鼠用异氟醚(1％-2％)麻醉。通过左胸切口将小鼠心脏快速挤出胸腔。为了诱发心梗，用丝线缝合左前降支(LAD)冠状动脉(6-0)。缺血区的变白和心电图的变化是手术成功的重要参考。假手术对照小鼠接受相同的外科手术，无需结扎冠状动脉。
2.超声心动图
使用Vevo 2100超声系统在M模式下进行经胸超声心动图检查。
实验前用脱毛膏去除小鼠胸毛。然后用2％异氟醚麻醉小鼠并放置在温暖的加热垫上。在M模式下测量心脏功能，并在长轴和短轴视图中对每只小鼠的心脏进行成像。左心室收缩内部尺寸(LVID)和左心室舒张内部尺寸(LVIDd)是使用Vevo 2100软件通过间接测量获得的。通过进一步分析获得射血分数(EF)、左轴缩短率(FS)和其他超声心动图参数。
如图4所示，纵坐标射血分数和左轴缩短率都代表心脏收缩功能，分为4组，假手术组和心梗组比较表示心梗后心功能下降，心梗+对照病毒组和心梗+Ndufs1过表达病毒组比较后说明Ndufs1过表达后提高了心脏功能，证实心脏特异性过表达Ndufs1可显著缓解心梗后(4周)心脏功能障碍。
3.组织学染色
小鼠心脏样本用4％多聚甲醛固定过夜，石蜡包埋，切成5μm厚的切片。进行Masson三色染色以评估心脏胶原蛋白含量并确定梗死面积。梗塞面积被评估为总梗塞周长除以总左心室周长。使用ImageJ软件进行分析。
如图5所示，心梗后会出现纤维组织增多，与对照病毒组相比，Ndufs1过表达组明显纤维组织减少，心梗面积减少，证实心脏特异性过表达Ndufs1可显著减少心梗后(4周)的梗死面积和心肌纤维化。
4.蛋白质印迹
将结扎线下方的心脏组织用RIPA缓冲液裂解。蛋白质(25μg)在SDS-PAGE凝胶上分离，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，用5％牛奶封闭，并在4℃下与一抗孵育过夜。在室温下将膜与HRP偶联的二抗孵育1小时后，在化学发光系统上检测条带。使用LabImage软件分析和量化免疫印迹条带强度。GAPDH用作内参对照。
如图6所示，将GAPDH抗体用作内参对照，说明所有组蛋白上样量是基本一致的；Ndufs1过表达病毒带有Flag标签，用Flag抗体检测，第一行黑色条带中只有AAV-Ndufs1组能检测到蛋白条带，证实基于AAV9的过表达Ndufs1的病毒载体效果显著。
如图7所示，cleaved caspase3是细胞凋亡的关键标志物，与对照病毒组相比，Ndufs1过表达组明显减少了改蛋白的表达，证实过表达Ndufs1可显著减少心梗引起的细胞凋亡。
序列表
<110> 中国人民解放军空军军医大学
<120> Ndufs1基因在治疗心梗后心衰中的应用和相关产品
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 2184
<212> DNA
<213> Ndufs1基因
<400> 1
atgttaagga tacctataaa aagggccttg ataggccttt ctaattctcc taaaggatat 60
gttcgcacaa ctggcacagc agcaagtaac ttgattgaag tatttgttga tggtcagtct 120
gtcatggtgg aaccaggaac cactgttctg caggcttgcg agaaggtcgg catgcaaatc 180
cctcgattct gttaccatga aaggttgtct gttgctggaa attgcaggat gtgcctggta 240
gagattgaga aagctccaaa ggttgtcgct gcttgtgcta tgcctgtaat gaagggctgg 300
aatatcttga caaactcgga aaaatctaag aaagccagag aaggtgtgat ggagttctta 360
ttagcaaatc acccattgga ttgtcctatt tgtgaccagg gaggtgaatg tgatctgcag 420
gaccagtcca tgatgtttgg aagtgatagg agccgatttc tagaggggaa gcgtgctgtg 480
gaggacaaga acattgggcc cctagtaaag accatcatga ctagatgcat ccagtgtacc 540
cggtgcatca ggtttgcaag tgagattgca ggagtagatg atttgggaac aacaggaaga 600
ggaaatgaca tgcaagttgg cacatacatt gaaaaaatgt ttatgtctga actgtctggg 660
aatgtcattg atatctgccc tgtaggggcc ctaacctcta agccttatgc ctttactgcc 720
cggccttggg aaacaagaaa gacagagtcc attgatgtaa tggatgcagt gggaagtaac 780
attgtggtta gcacaagaac tggagaggta atgaggattt tgccaagaat gcatgaagat 840
attaatgaag aatggatctc tgataaaacc aggtttgctt atgatggact aaaacgtcaa 900
agacttactg aaccaatggt cagaaacgaa aaagggcttt taacttatac ctcctgggaa 960
gatgcactct ctcgtgtagc tggaatgtta cagaattttg aaggcaatgc tgtggcagcg 1020
attgcaggag gcttggtgga tgctgaagcc ttagtagctc tgaaagactt gcttaataaa 1080
gttgactctg acaacttatg cactgaagag atcttcccca ctgaaggagc tggtacagac 1140
ttacgttcca attatcttct caataccaca attgctggtg tggaagaagc agatgttgtt 1200
cttctagttg gtacaaatcc acgttttgag gcaccgctgt ttaatgctag aattagaaag 1260
agctggcttc ataatgactt aaaagtggcc ctcatcggta gtccagtgga cctcacttac 1320
agatacgacc atctaggaga ctctcctaaa attctgcaag acattgcttc agggaggcat 1380
tcattctgcg aggtcttaaa ggatgctaaa aaaccaatgg tggttttagg cagttctgca 1440
ctccagagag atgatggagc agcaattctt gtagctgtgt ccaacatggt acaaaagatt 1500
cgagtgacaa ccggtgttgc tgcagagtgg aaagttatga atattctgca taggattgca 1560
agccaggtag ctgctttgga ccttggctat aaacctgggg tagaagcgat taggaagaac 1620
cctcccaaaa tgctgtttct tctgggagca gatggaggtt gtatcacgcg acaggacttg 1680
ccaaaggatt gtttcattgt ttatcaagga caccatggtg atgttggtgc tcccatggct 1740
gatgttattc tcccaggggc tgcttacaca gaaaagtctg ctacttatgt caatactgag 1800
ggcagagctc agcaaaccaa agtagcagtg acgcctcctg gcttggcacg agaagactgg 1860
aaaatcataa gagctctctc tgagattgca ggtatcactc ttccatatga cactctggat 1920
caagtaagga accgtcttga agaggtctct cctaatctgg ttcgatatga tgatattgaa 1980
gaaactaatt actttcagca agcaagtgag cttgccaagc tagtaaacca ggaggttctt 2040
gctgacccac tcgttccacc tcagctaact ataaaagact tctatatgac agactccatt 2100
agcagagcct cacagacaat ggccaagtgt gtcaaagctg tcaccgaggg cgctcaggca 2160
gtagaggagc cgtccatatg ctga 2184
<210> 2
<211> 62
<212> DNA
<213> Ndufs1(66517-1)-P1
<400> 2
agagtactgc tagcaccggt cgccaccatg ttaaggatac ctataaaaag ggccttgata 60
gg 62
<210> 3
<211> 48
<212> DNA
<213> Ndufs1(66517-1)-P2
<400> 3
gcctcagcta tttaaagctt tcatttgtcg tcatcatcct tatagtcc 48
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> KL66517-P3
<400> 4
agaagcagat gttgttcttc 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> SV40 PolyA-R
<400> 5
cattctagtt gtggtttgtc c 21

Claims (5)

1.Ndufs1基因在制备治疗心梗后心衰的药物中的用途。
2.一种过表达质粒在制备治疗心梗后心衰的药物中的用途，其特征在于，将Ndufs1基因作为目的基因插入携带心脏特异性启动子cTNT的质粒中构建得到过表达质粒。
3.根据权利要求2所述的一种过表达质粒在制备治疗心梗后心衰的药物中的用途，其特征在于，所述质粒为GV618，克隆位点为AgeI / HindIII，构建过表达质粒时，正向引物的碱基序列如SEQ ID NO:2所示，反向引物的碱基序列碱基序列如SEQ ID NO:3所示。
4.一种AAV过表达病毒载体在制备治疗心梗后心衰的药物中的用途，其特征在于，采用AAV9型病毒，由pHelper、pAAV-RC与权利要求2所述的过表达质粒载体共转染AAV-293细胞得到。
5.一种细胞在制备治疗心梗后心衰的药物中的用途，其特征在于，所述细胞中含有权利要求4所述的AAV过表达病毒载体。
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