CN114480309B - 抑制ALKBH1表达的shRNA慢病毒及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本申请提供了抑制ALKBH1表达的shRNA慢病毒及其制备方法，其中所述shRNA针对ALKBH1上的3个干扰位点设计。本申请的慢病毒能够明显纠正应激导致的小鼠海马BDNF基因6mdA甲基化修饰减少，增加BDNF水平；从而起到维持神经元存活和神经发生，促进树突棘成熟，起到对抗和治疗应激性认知损伤的作用病。

Description

抑制ALKBH1表达的shRNA慢病毒及其制备和应用
技术领域
本申请属于生物技术领域和基因治疗领域，具体地，本申请提供了抑制ALKBH1表达的shRNA慢病毒及其制备和应用。
背景技术
随着现代社会生活节奏的加快和社会竞争的加剧，多数人都处在不同程度的应激负荷之下。流行病学调查显示，长期处于应激状态的人群其轻度认知障碍和痴呆的患病率是同年龄非应激人群的两倍以上。高水平应激激素可导致多个脑区出现结构和功能改变，包括海马体积缩小、椎体细胞树突棘数量减少、突触可塑性异常、齿状回神经发生受阻、前额叶皮层神经环路重塑、自发活动降低等，但临床上针对应激激素为靶点的药物尚不能够有效地预防和治疗应激相关的认知功能异常。
神经营养因子包含多种不同成员，在中枢神经中分布广泛，对神经元的存活与分化、神经发生、树突结构重塑、突触形成、长时程增强的产生均具有重要的调节作用。应激条件下，海马结构中BDNF等神经营养因子表达显著降低，与成人应激性认知功能损伤具有关联。神经营养因子的表达调控机制各不相同，以BDNF为例，其启动子区具有糖皮质激素反应元件和6mdA修饰位点，可同时受激素核受体类转录因子和DNA 6mdA表观遗传修饰的调节。
6mdA是DNA腺嘌呤6’-位的甲基化修饰，广泛存在于原核生物基因组中，新近被发现也存在于高等真核生物中，可能与DNA的5mC修饰类似也具有对基因表达的调控作用。但DNA的6mdA修饰对神经营养因子的表达调控机制目前仍不清楚，尚未见到通过干预DNA6mdA修饰调控神经营养因子表达以治疗应激性认知损伤的报道。
基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。慢病毒载体是基因治疗中常用的病毒载体，它具有安全性良好、宿主范围广、感染效率高、制备方便且易纯化浓缩等特点。以慢病毒为载体的药物可应用于包括恶性肿瘤在内的多种疾病的治疗。
发明内容
一方面，本申请提供了一种抑制ALKBH1表达的shRNA慢病毒，所述慢病毒中克隆有针对ALKBH1设计的shRNA。
进一步地，所述shRNA针对ALKBH1转录本NM_001102565.1的序列为SEQ ID NO.1-3靶位点设计。
另一方面，本申请提供了一种抑制ALKBH1表达的shRNA，针对ALKBH1转录本NM_001102565.1的序列为SEQ ID NO.1-3靶位点设计。
进一步地，所述shRNA为SEQ ID NO.4、5所示的核酸，或者SEQ ID NO.6、7所示的核酸，或者SEQ ID NO.8、9所示的核酸。优选SEQ ID NO.6、7所示的核酸。
另一方面，本申请提供了上述慢病毒或者shRNA在制备治疗应激相关疾病的药物中的应用。
进一步地，所述应激相关疾病为应激性认知损伤。
进一步地，所述药物纠正应激导致的小鼠海马BDNF基因6mdA甲基化修饰减少，增加BDNF水平。
进一步地，所述药物维持神经元存活和神经发生，促进树突棘成熟。
另一方面，本申请提供了药物组合物，其包括上述慢病毒。
另一方面，本申请提供了制备上述慢病毒的方法，包括设计和制备shRNA；将shRNA克隆至慢病毒表达载体中；转染细胞；培养并收集病毒。
本申请shRNA设计不局限于依据ALKBH1转录本NM_001102565.1上上述靶位点设计的shRNA，其他转录本序列可能略有区别，但本领域技术人员通过常规比对和分析手段可以确定其中与NM_001102565.1的上述靶位点对应的位置，并依据其设计shRNA；本领域技术人员可以使用现有或研究中的知识和工具设计shRNA。
本申请所述的应激性疾病不限于应激性认知损伤，其他已知和研究中的应激相关疾病，特别是与BDNF水平下降相关的应激性疾病也在本申请应激性疾病的范围内。
本申请的药物组合物中可以为口服、注射等剂型，其中所需的辅料本领域技术人员可以根据药剂学知识常规选用。。
有益效果：
本发明中，具有表观遗传修饰功能的慢病毒感染机体后能够明显纠正应激导致的小鼠海马BDNF基因6mdA甲基化修饰减少，增加BDNF水平，从而起到维持神经元存活和神经发生，促进树突棘成熟，起到对抗和治疗应激性认知损伤的作用，在治疗各种应激压力所致的认知功能下降方面具有潜在应用价值。
附图说明
图1：慢病毒载体的质粒结构；
图2：ALKBH1-shRNA慢病毒载体对ALKBH1表达的影响，*P<0.05,**P<0.01；
图3：相差与荧光显微镜下质粒转染293T细胞的结果；
图4：应激条件下海马BDNF基因启动子6mdA修饰水平及ALKBH1表达的变化，*P<0.05,**P<0.01；
图5：应激条件下海马BDNF基因表达水平的变化，*P<0.05,**P<0.01；
图6：应激对小鼠认知功能的影响，*P<0.05,**P<0.01；
图7：ALKBH1-shRNA慢病毒转染对海马BDNF基因6mdA修饰水平的影响，*P<0.05,**P<0.01；
图8：ALKBH1-shRNA慢病毒转染对海马BDNF基因表达的影响，*P<0.05,**P<0.01；
图9：ALKBH1-shRNA慢病毒转染对应激小鼠认知功能的改善作用，*P<0.05,**P<0.01。
具体实施方式
以下实施例的方法中如无特别说明，所用的生化试剂均为市售试剂；未记载详细步骤的方法均为常规方法。
实施例1ALKBH1-shRNA慢病毒载体构建及鉴定
从NCBI获得ALKBH1(NM_001102565.1)的转录本序列，设计针对ALKBH1的shRNA干扰位点，筛选出评分较高的3个位点，化学合成ALKBH1-shRNA oligo及阴性对照shRNAoligo(上海吉凯生物有限公司)，退火形成双链，克隆至慢病毒表达载体中，获得重组质粒。
(一)ALKBH1的干扰靶点的设计
从NCBI获得ALKBH1(NM_001102565.1)的转录本序列，设计针对ALKBH1的shRNA干扰位点，筛选出评分较高的3个位点，靶点序列如下：
PSC-1：5’-gcCATCTGCATGACCCGAATA-3’(SEQ ID NO.1)
PSC-2：5’-gaAATACTCAGCAGATCATTA-3’(SEQ ID NO.2)
PSC-3：5’-cgAAGGCTATCCTGGATTTAT-3’(SEQ ID NO.3)
(二)ALKBH1-shRNA慢病毒表达载体的构建
1、化学合成ALKBH1-shRNA oligo及阴性对照shRNA oligo(上海吉凯生物有限公司)，序列如下：
PSC-1shRNA：Top Strand 5'-Ccgg gcCATCTGCATGACCCGAATA CTCGAG
TATTCGGGTCATGCAGATGGC TTTTTg-3'(SEQ ID NO.4)
Bottom Strand 5'-aattcaaaaa gcCATCTGCATGACCCGAATA CTCGAG
TATTCGGGTCATGCAGATGGC-3'(SEQ ID NO.5)
PSC-2shRNA：Top Strand 5'-Ccgg gaAATACTCAGCAGATCATTA CTCGAG
TAATGATCTGCTGAGTATTTC TTTTTg-3'(SEQ ID NO.6)
Bottom Strand 5'-aattcaaaaa gaAATACTCAGCAGATCATTA CTCGAG
TAATGATCTGCTGAGTATTTC-3'(SEQ ID NO.7)
PSC-3shRNA：Top Strand 5'-Ccgg cgAAGGCTATCCTGGATTTAT CTCGAG
ATAAATCCAGGATAGCCTTCG TTTTTg-3'(SEQ ID NO.8)
Bottom Strand 5'-aattcaaaaa cgAAGGCTATCCTGGATTTAT CTCGAG
ATAAATCCAGGATAGCCTTCG-3'(SEQ ID NO.9)
阴性对照shRNA Top Strand 5'-Ccgg TTCTCCGAACGTGTCACGT CTCGAG
TCTTCTTCGTCTTTCACTTCC TTTTTg-3'(SEQ ID NO.10)
Bottom Strand 5'-aattcaaaaa TTCTCCGAACGTGTCACGT CTCGAG
TCTTCTTCGTCTTTCACTTCC-3'(SEQ ID NO.11)
2、将上述合成的DNA干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15min，自然冷却至室温形成双链。
3、载体酶切及回收
(1)所用慢表达载体为GV493；元件顺序为hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puromycin；克隆位点：Age I与EcoR I。(图1)
(2)用限制性内切酶Age I与EcoR I(NEB公司)分别对回收的片段和载体进行切割。按如下体系配制反应溶液，混匀后37℃水浴锅中酶切过夜。
Figure BDA0003516948820000041
(3)向载体的酶切产物中加入10μL 6×loading buffer，进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带在紫外灯下切下，并依据胶回收试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行回收。
4、连接
通过T4 DNA连接酶将线性化的载体和退火双链DNA进行连接反应，按如下体系配制反应溶液，混匀后室温放置1～2hr。
Figure BDA0003516948820000051
5、转化
(1)取一只E.coli DH5感受态细胞(Takara公司)，置于冰上自然融化。将10μL连接产物加到感受态细胞中，冰上静置20min。42℃水浴锅中热休克90sec，立即插到冰上，放置2min。加入700μL LB培养基，37℃摇床摇菌45min。
(2)将菌液均匀涂到含氨苄青霉素的琼脂平板上。先在37℃烘箱里正置30min，后倒置培养12～16hr。
(3)挑取多个单克隆分别放入摇菌管，加3mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床摇菌12～16hr。
6、阳性重组子的鉴定
(1)设计并合成鉴定PCR用引物，序列如下：
P1(5’-3’)：CCATGATTCCTTCATATTTGC(SEQ ID NO.12)；P2(5’-3’)：GTAATACGGTTATCCACGCG(SEQ ID NO.13)
(2)以菌液为模板，进行菌液PCR鉴定实验，反应体系如下：
Figure BDA0003516948820000052
在PCR仪中按如下程序进行PCR反应：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃反应10min。
(3)对PCR初步鉴定出的阳性菌群进行测序(上海吉凯生物有限公司)，测序结果正确，与合成的序列一致。
(4)将测序正确的菌液加入10mL含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃摇床摇菌12～16hr。
用质粒小提中量试剂盒(天根生物有限公司)根据说明书提取重组质粒。
实施例2ALKBH1-shRNA质粒干扰效果检测
将鉴定出的阳性重组质粒转染HT22细胞，收集细胞提取RNA并反转录获得cDNA，通过real-time PCR实验检测重组质粒对ALKBH1表达的影响，选择干扰效果最为显著的质粒进一步进行慢病毒包装。
(一)细胞转染
(1)取对数生长期的HT22细胞，按50％的密度接种至6孔培养板中，置于5％CO2、37℃孵箱内培养至细胞密度达到约80％。
(2)根据jetPEI转染试剂(polyplus公司)使用说明书，配制质粒与转染试剂的混合物，逐滴加入细胞。
(3)24hr后观察细胞状态，更换为新鲜的完全培养基。48hr后收集细胞提取RNA进行Real-time PCR实验。
(二)RNA抽提
(1)生理盐水洗涤两次，加入1mL Trizol(Invitrogen)，室温裂解5min，移入1.5mLEppendorf管中。
(2)加入200μL三氯甲烷，用力摇晃15sec，静置3min。
(3)离心，4℃，12,000g×15min。
(4)轻轻吸取最上层至新1.5mL Eppendorf管中，加入等体积异丙醇，轻轻摇晃，静置10min。
(5)离心，4℃，12,000g×10min。
(6)吸去上清，加入1mL 75％乙醇洗涤，将沉淀轻轻吹起，勿吹散。
(7)离心，4℃，12,000g×5min。
(8)吸去上清，干燥RNA 5～10min至沉淀透明，加入适量DEPC水。
(9)待RNA完全溶解后，取1μL于NanoDrop微量紫外分光光度计(Thermo)，检测RNA的浓度和纯度。
(三)反转录PCR
(1)取2μg RNA，在PCR管中配置以下反应体系：
Figure BDA0003516948820000061
Figure BDA0003516948820000071
(2)在水浴锅或PCR仪中70℃反应5min，立即取出PCR管冰浴至少2min。
(3)向每管中加入下述试剂，轻轻混匀。
Figure BDA0003516948820000072
(4)37℃反应60min，70℃反应10min，获得cDNA。
(四)实时荧光定量PCR(Real-time PCR)
(1)设计并合成检测ALKBH1表达水平所用的real-time PCR引物，序列如下：
Forward Primer(5′-3′)：AGCCGTCATCGACTTCTCAG(SEQ ID NO.14)；
Reverse Primer(5′-3′)：GCTCACAGGTTCAAGTCCCA(SEQ ID NO.15)
(2)按如下体系配置反应溶液，设置3个复孔：
Figure BDA0003516948820000073
在Real-time PCR仪中按如下程序进行反应：95℃预变性10min；95℃变性5sec，60℃退火30sec，72℃延伸35sec，共进行40个循环；最后72℃反应10min。
(3)β-actin作为内参，对检测结果进行分析，如图2所示，PSC-2shRNA的质粒对ALKBH1表达有显著抑制作用，于是选择该质粒进一步进行慢病毒包装。
实施例3慢病毒包装与质量检测
将ALKBH1-shRNA干扰质粒和VSVG、psPAX2质粒共转染293T细胞，培养48hr后收集细胞上清，通过超速离心进行慢病毒的浓缩与纯化，最后利用荧光法测定病毒滴度。
(一)293T细胞的培养
1、复苏293T细胞
(1)配置含10％FBS的DMEM培养基(称为完全培养基)，用于293T细胞的培养。
(2)将3mL完全培养基加入10mL玻璃离心管中。
(3)将细胞从液氮罐或-80℃冰箱取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇动1～2min使之完全融化。
(4)将冻存管拿至超净台中，用酒精棉球擦拭表面进行消毒。将细胞悬液加至提前准备好的离心管中。
(5)离心800g×3min，弃上清，加入2mL新的完全培养基，用滴管轻轻吹打使细胞悬浮，接种至10cm含有8mL新鲜完全培养基的培养皿中，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。
2、293T细胞传代
(1)每天观察绅胞生长状态及密度，当细胞密度达到80％时进行传代。
(2)吸去原培养基，用10mL生理盐水清洗细胞两次，加1mL 0.5％胰蛋白酶溶液，放入37℃孵箱中消化1～3min至细胞刚从培养皿脱落。
(3)加入3mL完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至10mL玻璃离心管。
(4)离心800g×3min，弃上清。加入5mL新的完全培养基，用滴管轻轻吹打使细胞悬浮，取1mL接种至10cm含有8mL新鲜完全培养基的培养皿中，共接种5瓶，置于37℃、5％CO2孵箱中培养。
3、冻存293T细胞
(1)取对数生长期的293T细胞，吸去原培养基，用10mL生理盐水清洗细胞两次，加1mL 0.5％胰蛋白酶溶液，放入37℃孵箱中消化1～3min至细胞刚从培养皿脱落。
(2)加入3mL完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至10mL玻璃离心管。
(3)离心800g×3min，弃上清。加入3mL细胞冻存液(苏州新赛美有限公司)重悬细胞，分装至冻存管，1mL/管，放入-80℃冰箱，第二天放入液氮罐中长期保存。
(二)质粒转染
(1)将293T细胞种至10cm培养皿中，待细胞密度达到70～80％时进行转染。
(2)取1个1.5mL Eppendorf管，加入500μL 0.9％氯化钠溶液，分别加入2μg VSVG、6μg psPAX2和8μg上述ALKBH1-shRNA质粒，振荡混匀，瞬时离心。
(3)在1.5mL Eppendorf管中加入500μL 0.9％氯化钠溶液，加入64μL转染试剂jetPEI，振荡混匀，瞬时离心。
(4)将脂质体稀释液逐滴加入质粒稀释液中，振荡10sec混匀，瞬时离心，室温放置20min。
(5)细胞换新鲜培养基，7mL/盘。
(6)将含有DNA-脂质体复合物的溶液滴加至细胞表面，置于5％CO2，37℃孵箱内培养，12hr后换液，加10mL新鲜培养基。
(三)慢病毒的收获、浓缩与纯化、
(1)培养48hr后，收集细胞上清，过0.45μM滤器后加至40mL超速离心管中，放入至Beck满超速离心机内，4℃离心，25000rpm×2hr。
(2)离心结束后，弃区上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液，轻轻反复吹打重悬。
(3)经充分溶解后，高速离心10000rpm×5min，取上清分装。
(四)慢病毒滴度检测
1、荧光法测定病毒滴度
(1)测定前一天，将293T细胞接种至96孔板中，每孔4×104个细胞，体积100μL；
(2)根据病毒预期滴度，准备7-10个无菌的EP管，每管中加入90μL无血清培养基；
(3)取待测定的病毒原液10μL加入到第一个管中，混匀后，取10μL加入到第二个管中，继续相同的操作直到最后一管；
(4)选取所需的细胞孔，弃去90μL培养基，加入90μL稀释好的病毒溶液，置于培养箱中培养；
(5)24h后，加入完全培养基100μL；
(6)培养4天后，观察荧光表达情况，荧光细胞数随稀释倍数的增加而减少。
2、病毒滴度计算方法
计算公式为病毒滴度＝荧光细胞数/病毒原液量(TU/mL)
根据荧光图片中GFP表达情况(图3)，在10-6μL病毒原液感染孔中观察到2个荧光细胞，得到病毒滴度为2×109(TU/mL)。
实施例4 ALKBH1-shRNA慢病毒对应激性认知损伤的改善作用
建立小鼠应激模型，检测海马内BDNF基因启动子6mdA修饰及ALKBH1蛋白表达水平，通过行为学实验验证应激对认知功能的损伤作用。为进一步观察ALKBH1-shRNA慢病毒对应激性认知损伤的调控作用，向应激组小鼠海马内定点注射LV-ALKBH1和对照病毒，检测抑制ALKBH1对海马BDNF基因6mdA修饰和蛋白表达水平以及对认知功能的影响。
(一)应激对BDNF基因6mdA修饰和认知能力的影响
(1)通过给予小鼠慢性不可预见性温和刺激(CUMS)，建立应激动物模型。取海马组织，提取DNA，进行甲基化特异性PCR实验，检测应激对海马结构神经营养因子bdnf基因启动子6mdA修饰的影响。结果显示应激小鼠海马内bdnf基因启动子6mdA修饰水平降低(图4)。
(2)进一步通过Western blot和免疫组化实验证实应激小鼠海马内BDNF表达降低(图5)。
(3)通过旷场实验、物体识别实验、水迷宫实验检测应激对小鼠认知能力的影响。结果显示与对照组相比，应激组小鼠的旷场得分和物体识别认知指数降低，水迷宫寻台时间增加，表明应激可导致小鼠认知能力降低(图6)。
(二)ALKBH1-shRNA慢病毒对小鼠应激性认知损伤的改善作用
(1)向应激组小鼠海马内注射1μL ALKBH1-shRNA和对照病毒(3×109TU/μL)，取海马组织，提取DNA，进行6mdA甲基化检测，观察抑制ALKBH1对BDNF基因6mdA修饰的影响。结果显示抑制ALKBH1可增加BDNF基因启动子6mdA修饰水平(图7)。
(2)通过Western blot和免疫组化实验证实在应激小鼠海马内抑制ALKBH1可促进BDNF表达(图8)。
通过旷场实验、物体识别实验、水迷宫实验检测抑制ALKBH1对应激小鼠认知能力的影响。结果显示与注射对照病毒相比，ALKBH1-shRNA慢病毒注射小鼠的旷场得分和物体识别认知指数升高，水迷宫寻台时间减少，表明抑制ALKBH1能够促进应激小鼠的认知能力的恢复(图9)。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院
<120> 抑制ALKBH1表达的shRNA慢病毒及其制备和应用
<160> 15
<170> PatentIn version 3.5
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<211> 21
<212> DNA
<213> artificial
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<213> artificial
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<213> artificial
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cgaaggctat cctggattta t 21
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<213> artificial
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<212> DNA
<213> artificial
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<213> artificial
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Claims (2)

1.一种抑制ALKBH1表达的shRNA慢病毒在制备治疗应激性认知损伤的药物中的应用，所述慢病毒中克隆有针对ALKBH1设计的shRNA，所述shRNA的序列如SEQ ID NO.6和7所示。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述药物纠正应激导致的小鼠海马BDNF基因6mdA甲基化修饰减少，增加BDNF水平。
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