CN110863012A

CN110863012A - 一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用

Info

Publication number: CN110863012A
Application number: CN201911154776.8A
Authority: CN
Inventors: 谢方; 王雪; 钱令嘉; 王世达; 赵云
Original assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS
Current assignee: Institute of Pharmacology and Toxicology of AMMS; Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2019-11-22
Filing date: 2019-11-22
Publication date: 2020-03-06

Abstract

本发明涉及一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于治疗应激性认知损伤的药物中的用途，包括上述病毒载体的药物组合物、制备上述病毒载体的方法、以及上述病毒载体在针对表观遗传调控机制的研究中和针对应激所致认知障碍的治疗中的应用，其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性蛋白质；所述治疗性蛋白为TET1(1418‑2136aa)。本发明通过人工制备具有表观遗传修饰功能的腺相关病毒，该腺相关病毒感染机体后可通过表观遗传修饰诱导BDNF等神经营养因子的表达，维持神经元存活和神经发生，促进树突棘成熟，从而起到对抗和治疗应激性认知损伤的作用。

Description

一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及其在应激性认知损伤中的应用。

背景技术

随着现代社会生活节奏的加快和社会竞争的加剧，多数人都处在不同程度的应激负荷之下，表现为交感神经系统的过度活化和HPA轴功能亢进。流行病学调查显示，长期处于应激状态的人群其轻度认知障碍和痴呆的患病率是同年龄非应激人群的两倍以上。在确诊的认知功能障碍患者当中，超过70％伴随有HPA轴的功能紊乱。高水平应激激素可导致多个脑区出现结构和功能改变，包括海马体积缩小、椎体细胞树突棘数量减少、突触可塑性异常、齿状回神经发生受阻、前额叶皮层神经环路重塑、自发活动降低等，但临床上针对应激激素为靶点的药物尚不能够有效地预防和治疗应激相关的认知功能异常。

神经营养因子包含多种不同成员，在中枢神经中分布广泛，对神经元的存活与分化、神经发生、树突结构重塑、突触形成、长时程增强的产生均具有重要的调节作用。应激条件下，海马结构中BDNF等神经营养因子表达显著降低，与成人应激性认知功能损伤具有关联。神经营养因子的表达调控机制各不相同，以BDNF为例，其启动子区具有糖皮质激素反应元件和若干CpG岛区域，可同时受激素核受体类转录因子和DNA表观遗传修饰的调节。因神经营养因子的表达调控机制目前仍不完全清楚，尚未见到通过表观遗传修饰调控其表达治疗应激性认知损伤的报道。

基因治疗是指将特定的遗传物质转入患者特定的靶细胞，以最终达到预防或改变特殊疾病状态的治疗方法。腺相关病毒载体是基因治疗中常用的病毒载体，它具有安全性良好、宿主范围广、感染效率高、制备方便且易纯化浓缩等特点。以腺相关病毒为载体的药物已经广泛应用于包括恶性肿瘤在内的多种疾病的治疗。

本发明通过人工制备具有表观遗传修饰功能的腺相关病毒，该腺相关病毒感染机体后可通过表观遗传修饰诱导BDNF等神经营养因子的表达，维持神经元存活和神经发生，促进树突棘成熟，从而起到对抗和治疗应激性认知损伤的作用，首次解决了通过表观遗传修饰调控脑内基因表达以治疗应激性认知损伤的技术难题

发明内容

针对上述问题，本发明第一方面提供包含一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于治疗应激性认知损伤的药物中的用途，

其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性蛋白质；

其中，所述治疗性蛋白为TET1(1418-2136aa)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示。

本发明另一方面提供一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括上述重组单链DNA病毒载体。

本发明还提供一种制备上述重组单链DNA病毒载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：含TET1酶催化活性结构域真核表达载体的构建及鉴定；

S2：重组质粒表达检测，将鉴定出的阳性重组质粒转染293T细胞，收集细胞提取蛋白，通过western blot实验检测重组质粒表达情况；

S3：包装腺相关病毒，将重组表达质粒pAAV-TET1(1418-2136aa)和pAAV-RC、pHelper共转染AAV-293细胞，3天后收集细胞上清和细胞，裂解获得AAV颗粒，通过CsCl密度梯度离心和超滤对病毒进行浓缩和纯化，最后通过real-time PCR检测病毒的滴度。

其中，步骤S1中，通过PCR获得Tet1酶催化活性结构域的编码基因，再克隆至腺相关表达载体内；

特别地，所述PCR反应所采用的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示；

特别地，所述腺相关表达载体为GV467，元件顺序为CMV-betaGlobin-MCS-EGFP-3Flag-SV40 PolyA；

其中，所述步骤S1中，通过PCR获得的扩增产物翻译产生的肽段为TET11418-2136aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

本发明最后提供上述病毒载体在针对表观遗传调控机制的研究中以及针对应激所致认知障碍的治疗中的应用。

本发明的有益效果在于：

1、本发明制备了包含人甲基胞嘧啶双加氧酶(Tet1)表达序列的腺相关病毒，感染哺乳动物后可高效产生Tet1蛋白，诱导感染区域DNA的表观遗传修饰。该病毒表达Tet酶效率较高，能够实现在体水平对动物局部组织产生明显表观遗传修饰作用，可以用于多种疾病的表观遗传调控研究。

2、在针对表观遗传调控机制的研究中，本发明与现常用的甲基转移酶抑制剂相比，成本低廉，尤其在整体动物水平长时程给药时，仅需局部单次注射3×10⁹个病毒，成本为连续腹腔注射5-aza等甲基转移酶抑制剂的三分之一至一半。同时，本发明所涉及的腺相关病毒，可以诱导主动地DNA去甲基化过程，不依赖于DNA复制，较甲基转移酶抑制剂起效更快，应用范围更广，可用于神经元等不可分裂细胞(图10、11)。另外，本发明所涉及的腺相关病毒可以诱导局部组织的DNA去甲基化，避免了全身给药导致的非特异性作用。

3、使用本发明所构建的腺相关病毒注射应激所致认知障碍大鼠的海马区，能够明显抑制应激大鼠海马结构脑源性神经营养因子BDNF基因启动子的甲基化，增加BDNF水平，从而提升新物体识别能力、增强学习记忆能力。本发明所述的腺相关病毒宿主范围广，导入的人Tet1基因在哺乳动物中有很高的同源性，应用对象不仅限于大鼠、小鼠，还适用于包括人在内的其它哺乳动物，本发明所涉及的Tet1腺相关病毒构建方法在治疗各种应激压力所致的认知功能下降方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1：人Tet1基因的结构与扩增引物位置；

图2：通过PCR方法获取Tet1目的基因的电泳鉴定，其中1为PCR产物，2为Marker；

图3：构建目的基因重组表达载体所用的质粒结构；

图4：重组质粒的转化鉴定，其中1：阴性对照(ddH₂O)，2：阴性对照(空载自连对照组)，3：阳性对照(GAPDH)，4：Marker，自上而下依次为5kb、3kb、2kb、1.5kb、1Kb、750bp、500bp、250bp、100bp，5-12：11-18号转化子；

图5：相差与荧光显微镜下质粒转染293T细胞的结果；

图6：质粒转染后表达的重组Tet1鉴定，其中1：分子量Marker，2：SURVIVIN-3FLAG-GFP标准品阳性对照(分子量48KDa)，3：未转染的293T细胞对照，4：转染表达的目的基因融合蛋白(分子量108KDa)；

图7：应激条件下脑内海马结构神经营养因子BDNF基因启动子甲基化的变化(*：与对照相比p<0.05)；

图8：应激条件下脑内海马结构神经营养因子BDNF基因表达水平的变化(*：与对照相比p<0.05)；

图9：应激对大鼠认知功能的影响(*：与对照相比p<0.05)；

图10：Tet1基因腺相关病毒转染对应激大鼠海马结构神经元BDNF基因启动子甲基化的影响(*：与应激组相比p<0.05)；

图11：Tet1基因腺相关病毒转染对应激大鼠海马结构神经元BDNF基因表达的影响(*：与应激组相比p<0.05)；

图12：Tet1基因腺相关病毒转染对应激大鼠认知功能的改善作用(*：与应激组相比p<0.05)。

具体实施方式

下面结合附图，对实施例作详细说明。

实施例1、含TET1酶催化活性结构域真核表达载体的构建及鉴定

1.1目的基因克隆及纯化

(1)Tet1 mRNA的CDS区序列(NM_030625.3)

>NM_030625.3:529-6939Homo sapiens tet methylcytosine dioxygenase 1(TET1),mRNA，具体序列如SEQ ID NO:1所示，其中下划线为PCR引物位置。

(2)设计并合成克隆用引物。

Tet1的全长基因由于长度较长，无法全部克隆至腺相关表达载体内，因此设计引物通过PCR获得Tet1酶催化活性结构域的编码基因，再克隆至腺相关表达载体内。克隆所用引物序列如下：

SEQ ID NO:3TET1-Forward primer：

GGAGGTAGTGGAATGGATCCCGCCACCATGGAACTGCCCACCTGCAGCTGTC；

SEQ ID NO:4TET1-Reverse primer:

TCACCATGGTGGCGGGATCGACCCAATGGTTATAGGGCCCCGCAAC。

其中，下划线序列为酶切位点(BamHI)。产物长度：2207bp，序列如SEQ ID NO:5所示，退火温度60℃。产物翻译产生的肽段为TET1 1418-2136aa(图1)，氨基酸序列如SEQ IDNO:2所示。

(3)以含有human-TET1全长的质粒为模板，利用高保真酶(Takara公司)进行PCR，扩增获得TET1片段。PCR反应溶液配制如下：

在PCR仪中按如下程序进行PCR反应：98℃预变性5min；98℃变性10sec，60℃退火10sec，72℃延伸2min30 sec，共进行35个循环；最后72℃反应8min。

(4)向PCR产物中加入10μL 6×loading buffer，混匀后进行琼脂糖凝胶电泳，确认产物大小(图2)。将目的条带在紫外灯下切下，并依据胶回收试剂盒(天根生物有限公司)说明书进行回收纯化。

1.2片段和载体的酶切

(1)所用腺相关表达载体为GV467；元件顺序为CMV-betaGlobin-MCS-EGFP-3Flag-SV40 PolyA；克隆位点：BamHI/BamHI。(图3)

(2)用限制性内切酶BamHI(NEB公司)分别对回收的片段和载体进行切割。

按如下体系配制反应溶液，混匀后37℃水浴锅中酶切过夜。

片段酶切体系：

载体酶切体系：

(3)分别向片段和载体的酶切产物中加入10μL 6×loading buffer，进行琼脂糖凝胶电泳，将目的条带在紫外灯下切下，并依据胶回收试剂盒(天根)说明书进行回收。

1.3片段与载体的连接

(1)各取1μL回收的片段和载体进行琼脂糖凝胶电泳，进行灰度定量，计算摩尔质量，按片段和载体的摩尔比3:1进行连接。

(2)按如下体系配制反应溶液，混匀后室温放置1～2hr。

1.4重组载体的转化与筛选

(1)取一只E.coli DH5α感受态细胞(Takara公司)，置于冰上自然融化。将10μL连接产物加到感受态细胞中，冰上静置20min。42℃水浴锅中热休克90sec，立即插到冰上，放置2min。加入700μL LB培养基，37℃摇床摇菌45min。

(2)将菌液均匀涂到含氨苄青霉素的琼脂平板上。先在37℃烘箱里正置30min，后倒置培养12～16hr。

(3)挑取多个单克隆分别放入摇菌管，加3mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床摇菌12～16hr。

1.5阳性重组子的鉴定

(1)设计并合成鉴定PCR用引物，序列如下：

P1：CACTAAAACTTATTCGCTGATG；

P2：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG

产物长度为1007bp，退火温度60℃。

(2)以菌液为模板，进行PCR，反应体系如下：

在PCR仪中按如下程序进行PCR反应：95℃预变性5min；95℃变性30sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共进行35个循环；最后72℃反应10min。

(3)取6μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确认产物大小(图4)。

(4)对PCR初步鉴定出的阳性菌群进行测序(上海吉凯生物有限公司)，与目的基因序列比对，确认重组质粒序列正确，无基因突变。

(5)将测序正确的菌液加入10mL含氨苄抗生素的LB培养基中，37℃摇床摇菌12～16hr。用质粒小提中量试剂盒(天根生物有限公司)根据说明书提取重组质粒，获得pAAV-TET1(1418-2136aa)。

实施例2、重组质粒表达检测

2.1细胞转染

(1)取对数生长期的293T细胞，按50％的密度接种至6孔培养板中，置于5％CO₂、37℃孵箱内培养至细胞密度达到约80％。

(2)根据lipofectamine 2000转染试剂(invitrogen公司)使用说明书，配制质粒与转染试剂的混合物，逐滴加入细胞。

(3)4～6hr后观察细胞状态，更换为新鲜的完全培养基。转染24～48hr后于荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况，并拍照(图5)。

2.2提取细胞总蛋白

(1)上述细胞长满后，弃去培养基，PBS洗涤两次，每孔加入100μL含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(碧云天公司)，用细胞刮刮下细胞，转移至EP管中，冰上裂解15min。

(2)超声破碎细胞(200W共4次，每次5s，间隔2s)。离心，4℃，12000g×15min，取上清。

(3)用BCA法测定蛋白浓度，根据BCA蛋白定量试剂盒说明书(碧云天公司)操作。根据蛋白定量结果，调整每个样品蛋白浓度为2μg/μL。-80℃保存备用。

2.3SDS-PAGE电泳及转膜

(1)配制SDS-PAGE胶，分离胶浓度为10％，积层胶胶浓度为5％。待胶凝固后拔去梳子，组装好电泳装置，加入电泳缓冲液。

(2)取20μg蛋白样品，加入6.5μL的4×loading buffer，混匀后缓慢加入上样孔中。

(3)先以80V恒压至样品进入分离胶，换成120V电压至溴酚蓝跑至距胶底部约0.5cm。电泳时间一般需要2～3hr。

(4)电泳结束后，使用湿转转膜装置，由正极到负极的方向，按滤纸-膜-胶-滤纸的顺序放入，每层中间不要有气泡。在4℃、300mA恒流条件下电转150min，将蛋白转移到PVDF膜上。

2.4抗体孵育与检测

(1)转膜结束后取出PVDF膜，放入5％脱脂牛奶的封闭液中，置于摇床上室温封闭1hr。

(2)用抗体稀释液按1:3000稀释Flag抗体(sigma)。用TBST溶液将膜洗涤三次，8min/次后，放入一抗，室温孵育2hr或4℃过夜。

(3)用抗体稀释液按1:4000稀释鼠源二抗(santa-cruz)。用TBST溶液将膜洗涤三次，8min/次后，放入二抗，室温孵育1.5hr。

(4)用TBST溶液将膜洗涤三次，8min/次。将PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上，根据ECL底物试剂盒说明书(Thermo)以1:40混合A液和B液，均匀滴加在PVDF膜上，避光反应5min。

(5)将膜取出，稍微沥干多余的ECL底物反应液，放入暗盒，铺上保鲜膜(避免产生气泡)，放上X光片(避免X光片的移动)，关上暗盒，曝光1-2min。

(6)取出X光片，放入显影液中，约1min后取出，在清水中漂洗几秒钟，后放入定影液中至少2min(曝光时间需要多尝试几次，根据肉眼能否看见荧光以及荧光的强弱无适当调整曝光时间)。

(7)取出X光片，晾干，分析并拍照记录(图6)。

实施例3、包装腺相关病毒

3.1AAV-293细胞的培养

(1)复苏AAV-293细胞

a.配置含10％FBS的DMEM培养基(称为完全培养基)，用于AAV-293细胞的培养。

b.将3mL完全培养基加入10mL玻璃离心管中。

c.将细胞从液氮罐或-80℃冰箱取出，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇动1～2min使之完全融化。

d.将冻存管拿至超净台中，用酒精棉球擦拭表面进行消毒。将细胞悬液加至提前准备好的离心管中。

e.离心800g×3min，弃上清，加入2mL新的完全培养基，用滴管轻轻吹打使细胞悬浮，接种至10cm含有8mL新鲜完全培养基的培养皿中，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

3.2AAV-293细胞传代

a.每天观察绅胞生长状态及密度，当细胞密度达到50％时进行传代。

b.吸去原培养基，用10mL生理盐水清洗细胞两次，加1mL 0.5％胰蛋白酶溶液，放入37℃孵箱中消化1～3min至细胞刚从培养皿脱落。

c.加入3mL完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至10mL玻璃离心管。

d.离心800g×3min，弃上清。加入5mL新的完全培养基，用滴管轻轻吹打使细胞悬浮，取1mL接种至10cm含有8mL新鲜完全培养基的培养皿中，共接种5瓶，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养。

3.3冻存AAV-293细胞

a.取对数生长期的AAV-293细胞，吸去原培养基，用10mL生理盐水清洗细胞两次，加1mL 0.5％胰蛋白酶溶液，放入37℃孵箱中消化1～3min至细胞刚从培养皿脱落。

b.加入3mL完全培养基终止消化，将细胞悬液转移至10mL玻璃离心管。

c.离心800g×3min，弃上清。加入3mL细胞冻存液(苏州新赛美有限公司)重悬细胞，分装至冻存管，1mL/管，放入-80℃冰箱，第二天放入液氮罐中长期保存。

3.4细胞转染

(1)取对数生长期的AAV-293细胞，接种至10cm培养皿，置于37℃、5％CO₂孵箱中培养，当细胞密度达到70～80％时进行转染。

(2)取1个1.5mL EP管，加入500μL CaCl₂溶液(0.3M)，然后加入各10μg的pAAV-TET1(1418-2136aa)、pAAV-RC和pHelper，轻轻混合。

(3)取1个新的1.5mL EP管，加入500μL的2×HBS溶液，逐滴加入DNA/CaCl₂混合液，颠倒混匀。

(4)将混合好的DNA/CaCl₂/HBS溶液滴加至细胞培养皿上，同时轻轻晃动培养皿，使溶液均匀分布在培养基中，置于5％CO2、37℃孵箱内培养。

(5)6hr后换液，加10mL新鲜完全培养基，继续培养66～72hr。

3.5收集腺相关病毒

(1)观察细胞形态及培养基颜色变化，待部分细胞变圆脱落以及培养基的颜色由红色发为橙色或黄色时，说明病毒包装成功。一般转染后三天收集病毒。

(2)用滴管将细胞轻轻吹下，连同培养基转移至15mL离心管中。

(3)离心800g×3min，将上清转移至新的15mL离心管，向细胞沉淀加入1mL PBS进行重悬。

(4)将细胞悬液反复置于液氮和37℃水浴中，冻融4次。

(5)离心10000g×3min，将上清转移至新的EP管。

3.6病毒浓缩

(1)在(三)-(3)上清中加入适量PEG8000(40％)，使其终浓度为8％，冰上放置2hr，期间每15min颠倒混匀一次。

(2)离心2500g×30min，弃去上清，加入PBS重悬，并与(三)-(5)收集的上清合并。

(3)离心3000g×30min，将上清转移至新的EP管中。加入Benzonase核酸酶(终浓度为50U/mL)(Merck公司)消化去除残留的质粒DNA，颠倒混匀，37℃孵育30min。

(4)利用0.45μm的过滤器滤除溶液中的杂质。

3.7病毒纯化

(1)向病毒浓缩液中加固体CsCl，约6.5g/10mL，浓度为1.41g/mL，振荡溶解。

(2)将样品加至超速离心管中，用预先配置的CsCl溶液(1.41g/mL)填满离心管的剩余空间。

(3)离心175000g×24hr，形成密度梯度，按顺序分别收集不同密度的溶液，进行滴度测定，收集含有AAV颗粒的组成。

(4)重复一次上述步骤。

3.8超滤脱盐

(1)向Amicon-15超滤装置中加入4mL去离子水，使膜浸湿。

(2)将纯化得到的病毒溶液加至超滤装置中，用PBS将总体积补至4mL，盖上盖子。

(3)1500g离心，每5min观察剩余溶液体积，直至终体积为200～250μL。

(4)向剩余溶液中加入PBS将体积补至4mL。

(5)重复上述步骤3次。

(6)离心超滤管，使病毒溶液最终体积为0.5mL。

(7)加入适量甘油(终浓度5％)，分装于-80℃保存。

3.9病毒滴度测定

(1)采用Zfcas9质粒(2.45E+13Copies/mL)，用ddH₂O梯度稀释获得标准品，浓度分别2.45E+10、2.45E+9、2.45E+8、2.45E+7、2.45E+6Copies/mL。

(2)按如下方法稀释梯度稀释病毒溶液：

名称	病毒溶液	ddH2O
			Sample-2	10uL原液	40uL
Sample-3	10uL Sample-2	90uL
			Sample-4	10uL Sample-3	90uL
Sample-5	10uL Sample-4	90uL

(3)配制real-time PCR反应溶液，每孔的反应体系如下：

(4)加至96孔板中，每孔15μL，再加入5μL标准品或样品，设置复孔。

(5)将96孔板封膜后放入real-time PCR仪器，按如下程序进行反应：95℃预变性10min；95℃变性15sec，60℃退火30sec，72℃延伸30min，共进行40个循环；95℃反应15sec，60℃ 60sec，95℃ 15sec获得溶解曲线。

(6)根据标准品浓度的对数值和Ct平均值绘制出标准曲线：Y＝-3.345*LOG(X)+39.74,R²＝0.999。

(7)根据各Sample的Ct值计算浓度。由于标准品是双链DNA，而AAV病毒颗粒是单链DNA，病毒原液浓度等于各Sample浓度除以稀释度再乘2。

(8)对各Sample计算得到的病毒原液浓度取平均值，得到AAV病毒滴度为3.07E+13Copies/mL。

实施例4、过表达TET1在应激性认知损伤治疗中的应用

此处以慢性不可预见性温和刺激(CUMS)应激模型为例，但AAV-TET1(1418-2136aa)的应用不仅限于该应激模型，还包括其他应激模型导致的认知损伤的治疗。

4.1应激对bdnf DNA甲基化和认知能力的影响

(1)通过给予大鼠慢性不可预见性温和刺激(CUMS)，建立应激动物模型。取海马组织，提取DNA，进行甲基化特异性PCR实验，检测应激对海马结构神经营养因子bdnf基因启动子甲基化的影响。结果显示应激大鼠海马内bdnf基因启动子甲基化水平升高(图7)。

(2)进一步通过Western blot和免疫组化实验证实应激大鼠海马内BDNF表达降低(图8)。

(3)通过旷场实验、物体识别实验、水迷宫实验检测应激对大鼠认知能力的影响。结果显示与对照组相比，应激组大鼠的旷场得分和物体识别认知指数降低，水迷宫寻台时间增加，表明应激可导致大鼠认知能力降低(图9)。

4.2海马内注射AAV-TET1(1418-2136aa)对bdnf DNA甲基化和认知能力的调控作用

(1)向应激组大鼠海马内注射1μL AAV-TET1(1418-2136aa)和对照病毒(3×10⁹TU/μL)，取海马组织，提取DNA，进行甲基化特异性PCR实验，检测过表达TET1对bdnf基因启动子甲基化的影响。结果显示TET1可降低bdnf基因启动子的甲基化(图10)。

(2)通过Western blot和免疫组化实验证实在应激大鼠海马内过表达TET1可促进BDNF表达(图11)。

(3)通过旷场实验、物体识别实验、水迷宫实验检测过表达TET1对应激大鼠认知能力的影响。结果显示与注射对照病毒相比，过表达TET1大鼠的旷场得分和物体识别认知指数升高，水迷宫寻台时间减少，表明过表达TET1能够促进应激大鼠的认知能力的恢复，提示TET1可能是应激性认知损伤治疗的潜在靶点(图12)。

此实施例仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。

序列表

<110> 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院

<120> 一种具有表观遗传修饰功能腺相关病毒的制备方法及应用

<160> 5

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6411

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 1

atgtctcgat cccgccatgc aaggccttcc agattagtca ggaaggaaga tgtaaacaaa 60

aaaaagaaaa acagccaact acgaaagaca accaagggag ccaacaaaaa tgtggcatca 120

gtcaagactt taagccctgg aaaattaaag caattaattc aagaaagaga tgttaagaaa 180

aaaacagaac ctaaaccacc cgtgccagtc agaagccttc tgacaagagc tggagcagca 240

cgcatgaatt tggataggac tgaggttctt tttcagaacc cagagtcctt aacctgcaat 300

gggtttacaa tggcgctacg aagcacctct cttagcaggc gactctccca acccccactg 360

gtcgtagcca aatccaaaaa ggttccactt tctaagggtt tagaaaagca acatgattgt 420

gattataaga tactccctgc tttgggagta aagcactcag aaaatgattc ggttccaatg 480

caagacaccc aagtccttcc tgatatagag actctaattg gtgtacaaaa tccctcttta 540

cttaaaggta agagccaaga gacaactcag ttttggtccc aaagagttga ggattccaag 600

atcaatatcc ctacccacag tggccctgca gctgagatcc ttcctgggcc actggaaggg 660

acacgctgtg gtgaaggact attctctgaa gagacattga atgataccag tggttcccca 720

aaaatgtttg ctcaggacac agtgtgtgct ccttttcccc aaagagcaac ccccaaagtt 780

acctctcaag gaaaccccag cattcagtta gaagagttgg gttcacgagt agaatctctt 840

aagttatctg attcttacct ggatcccatt aaaagtgaac atgattgcta ccccacctcc 900

agtcttaata aggttatacc tgacttgaac cttagaaact gcttggctct tggtgggtct 960

acgtctccta cctctgtaat aaaattcctc ttggcaggct caaaacaagc gacccttggt 1020

gctaaaccag atcatcaaga ggccttcgaa gctactgcaa atcaacagga agtttctgat 1080

accacctctt tcctaggaca ggcctttggt gctatcccac atcaatggga acttcctggt 1140

gctgacccag ttcatggtga ggccctgggt gagaccccag atctaccaga gattcctggt 1200

gctattccag tccaaggaga ggtctttggt actattttag accaacaaga aactcttggt 1260

atgagtggga gtgttgtccc agacttgcct gtcttccttc ctgttcctcc aaatccaatt 1320

gctaccttta atgctccttc caaatggcct gagccccaaa gcactgtctc atatggactt 1380

gcagtccagg gtgctataca gattttgcct ttgggctcag gacacactcc tcaatcatca 1440

tcaaactcag agaaaaattc attacctcca gtaatggcta taagcaatgt agaaaatgag 1500

aagcaggttc atataagctt cctgccagct aacactcagg ggttcccatt agcccctgag 1560

agaggactct tccatgcttc actgggtata gcccaactct ctcaggctgg tcctagcaaa 1620

tcagacagag ggagctccca ggtcagtgta accagcacag ttcatgttgt caacaccaca 1680

gtggtgacta tgccagtgcc aatggtcagt acctcctctt cttcctatac cactttgcta 1740

ccgactttgg aaaagaagaa aagaaagcga tgtggggtct gtgaaccctg ccagcagaag 1800

accaactgtg gtgaatgcac ttactgcaag aacagaaaga acagccatca gatctgtaag 1860

aaaagaaaat gtgaggagct gaaaaagaaa ccatctgttg ttgtgcctct ggaggttata 1920

aaggaaaaca agaggcccca gagggaaaag aagcccaaag ttttaaaggc agattttgac 1980

aacaaaccag taaatggccc caagtcagaa tccatggact acagtagatg tggtcatggg 2040

gaagaacaaa aattggaatt gaacccacat actgttgaaa atgtaactaa aaatgaagac 2100

agcatgacag gcatcgaggt ggagaagtgg acacaaaaca agaaatcaca gttaactgat 2160

cacgtgaaag gagattttag tgctaatgtc ccagaagctg aaaaatcgaa aaactctgaa 2220

gttgacaaga aacgaaccaa atctccaaaa ttgtttgtac aaaccgtaag aaatggcatt 2280

aaacatgtac actgtttacc agctgaaaca aatgtttcat ttaaaaaatt caatattgaa 2340

gaattcggca agacattgga aaacaattct tataaattcc taaaagacac tgcaaaccat 2400

aaaaacgcta tgagctctgt tgctactgat atgagttgtg atcatctcaa ggggagaagt 2460

aacgttttag tattccagca gcctggcttt aactgcagtt ccattccaca ttcttcacac 2520

tccatcataa atcatcatgc tagtatacac aatgaaggtg atcaaccaaa aactcctgag 2580

aatataccaa gtaaagaacc aaaagatgga tctcccgttc aaccaagtct cttatcgtta 2640

atgaaagata ggagattaac attggagcaa gtggtagcca tagaggccct gactcaactc 2700

tcagaagccc catcagagaa ttcctcccca tcaaagtcag agaaggatga ggaatcagag 2760

cagagaacag ccagtttgct taatagctgc aaagctatcc tctacactgt aagaaaagac 2820

ctccaagacc caaacttaca gggagagcca ccaaaactta atcactgtcc atctttggaa 2880

aaacaaagtt catgcaacac ggtggttttc aatgggcaaa ctactaccct ttccaactca 2940

catatcaact cagctactaa ccaagcatcc acaaagtcac atgaatattc aaaagtcaca 3000

aattcattat ctctttttat accaaaatca aattcatcca agattgacac caataaaagt 3060

attgctcaag ggataattac tcttgacaat tgttccaatg atttgcatca gttgccacca 3120

agaaataatg aagtggagta ttgcaaccag ttactggaca gcagcaaaaa attggactca 3180

gatgatctat catgtcagga tgcaacccat acccaaattg aggaagatgt tgcaacacag 3240

ttgacacaac ttgcttcgat aattaagatc aattatataa aaccagagga caaaaaagtt 3300

gaaagtacac caacaagcct tgtcacatgt aatgtacagc aaaaatacaa tcaggagaag 3360

ggcacaatac aacagaaacc accttcaagt gtacacaata atcatggttc atcattaaca 3420

aaacaaaaga acccaaccca gaaaaagaca aaatccaccc catcaagaga tcggcggaaa 3480

aagaagccca cagttgtaag ttatcaagaa aatgatcggc agaagtggga aaagttgtcc 3540

tatatgtatg gcacaatatg cgacatttgg atagcatcga aatttcaaaa ttttgggcaa 3600

ttttgtccac atgattttcc tactgtattt gggaaaattt cttcctcgac caaaatatgg 3660

aaaccactgg ctcaaacgag gtccattatg caacccaaaa cagtatttcc accactcact 3720

cagataaaat tacagagata tcctgaatca gcagaggaaa aggtgaaggt tgaaccattg 3780

gattcactca gcttatttca tcttaaaacg gaatccaacg ggaaggcatt cactgataaa 3840

gcttataatt ctcaggtaca gttaacggtg aatgccaatc agaaagccca tcctttgacc 3900

cagccctcct ctccacctaa ccagtgtgct aacgtgatgg caggcgatga ccaaatacgg 3960

tttcagcagg ttgttaagga gcaactcatg catcagagac tgccaacatt gcctggtatc 4020

tctcatgaaa cacccttacc ggagtcagca ctaactctca ggaatgtaaa tgtagtgtgt 4080

tcaggtggaa ttacagtggt ttctaccaaa agtgaagagg aagtctgttc atccagtttt 4140

ggaacatcag aattttccac agtggacagt gcacagaaaa attttaatga ttatgccatg 4200

aacttcttta ctaaccctac aaaaaaccta gtgtctataa ctaaagattc tgaactgccc 4260

acctgcagct gtcttgatcg agttatacaa aaagacaaag gcccatatta tacacacctt 4320

ggggcaggac caagtgttgc tgctgtcagg gaaatcatgg agaataggta tggtcaaaaa 4380

ggaaacgcaa taaggataga aatagtagtg tacaccggta aagaagggaa aagctctcat 4440

gggtgtccaa ttgctaagtg ggttttaaga agaagcagtg atgaagaaaa agttctttgt 4500

ttggtccggc agcgtacagg ccaccactgt ccaactgctg tgatggtggt gctcatcatg 4560

gtgtgggatg gcatccctct tccaatggcc gaccggctat acacagagct cacagagaat 4620

ctaaagtcat acaatgggca ccctaccgac agaagatgca ccctcaatga aaatcgtacc 4680

tgtacatgtc aaggaattga tccagagact tgtggagctt cattctcttt tggctgttca 4740

tggagtatgt actttaatgg ctgtaagttt ggtagaagcc caagccccag aagatttaga 4800

attgatccaa gctctccctt acatgaaaaa aaccttgaag ataacttaca gagtttggct 4860

acacgattag ctccaattta taagcagtat gctccagtag cttaccaaaa tcaggtggaa 4920

tatgaaaatg ttgcccgaga atgtcggctt ggcagcaagg aaggtcgtcc cttctctggg 4980

gtcactgctt gcctggactt ctgtgctcat ccccacaggg acattcacaa catgaataat 5040

ggaagcactg tggtttgtac cttaactcga gaagataacc gctctttggg tgttattcct 5100

caagatgagc agctccatgt gctacctctt tataagcttt cagacacaga tgagtttggc 5160

tccaaggaag gaatggaagc caagatcaaa tctggggcca tcgaggtcct ggcaccccgc 5220

cgcaaaaaaa gaacgtgttt cactcagcct gttccccgtt ctggaaagaa gagggctgcg 5280

atgatgacag aggttcttgc acataagata agggcagtgg aaaagaaacc tattccccga 5340

atcaagcgga agaataactc aacaacaaca aacaacagta agccttcgtc actgccaacc 5400

ttagggagta acactgagac cgtgcaacct gaagtaaaaa gtgaaaccga accccatttt 5460

atcttaaaaa gttcagacaa cactaaaact tattcgctga tgccatccgc tcctcaccca 5520

gtgaaagagg catctccagg cttctcctgg tccccgaaga ctgcttcagc cacaccagct 5580

ccactgaaga atgacgcaac agcctcatgc gggttttcag aaagaagcag cactccccac 5640

tgtacgatgc cttcgggaag actcagtggt gccaatgcag ctgctgctga tggccctggc 5700

atttcacagc ttggcgaagt ggctcctctc cccaccctgt ctgctcctgt gatggagccc 5760

ctcattaatt ctgagccttc cactggtgtg actgagccgc taacgcctca tcagccaaac 5820

caccagccct ccttcctcac ctctcctcaa gaccttgcct cttctccaat ggaagaagat 5880

gagcagcatt ctgaagcaga tgagcctcca tcagacgaac ccctatctga tgaccccctg 5940

tcacctgctg aggagaaatt gccccacatt gatgagtatt ggtcagacag tgagcacatc 6000

tttttggatg caaatattgg tggggtggcc atcgcacctg ctcacggctc ggttttgatt 6060

gagtgtgccc ggcgagagct gcacgctacc actcctgttg agcaccccaa ccgtaatcat 6120

ccaacccgcc tctcccttgt cttttaccag cacaaaaacc taaataagcc ccaacatggt 6180

tttgaactaa acaagattaa gtttgaggct aaagaagcta agaataagaa aatgaaggcc 6240

tcagagcaaa aagaccaggc agctaatgaa ggtccagaac agtcctctga agtaaatgaa 6300

ttgaaccaaa ttccttctca taaagcatta acattaaccc atgacaatgt tgtcaccgtg 6360

tccccttatg ctctcacaca cgttgcgggg ccctataacc attgggtctg a 6411

<210> 2

<211> 719

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 2

Glu Leu Pro Thr Cys Ser Cys Leu Asp Arg Val Ile Gln Lys Asp Lys

1 5 10 15

Gly Pro Tyr Tyr Thr His Leu Gly Ala Gly Pro Ser Val Ala Ala Val

20 25 30

Arg Glu Ile Met Glu Asn Arg Tyr Gly Gln Lys Gly Asn Ala Ile Arg

35 40 45

Ile Glu Ile Val Val Tyr Thr Gly Lys Glu Gly Lys Ser Ser His Gly

50 55 60

Cys Pro Ile Ala Lys Trp Val Leu Arg Arg Ser Ser Asp Glu Glu Lys

65 70 75 80

Val Leu Cys Leu Val Arg Gln Arg Thr Gly His His Cys Pro Thr Ala

85 90 95

Val Met Val Val Leu Ile Met Val Trp Asp Gly Ile Pro Leu Pro Met

100 105 110

Ala Asp Arg Leu Tyr Thr Glu Leu Thr Glu Asn Leu Lys Ser Tyr Asn

115 120 125

Gly His Pro Thr Asp Arg Arg Cys Thr Leu Asn Glu Asn Arg Thr Cys

130 135 140

Thr Cys Gln Gly Ile Asp Pro Glu Thr Cys Gly Ala Ser Phe Ser Phe

145 150 155 160

Gly Cys Ser Trp Ser Met Tyr Phe Asn Gly Cys Lys Phe Gly Arg Ser

165 170 175

Pro Ser Pro Arg Arg Phe Arg Ile Asp Pro Ser Ser Pro Leu His Glu

180 185 190

Lys Asn Leu Glu Asp Asn Leu Gln Ser Leu Ala Thr Arg Leu Ala Pro

195 200 205

Ile Tyr Lys Gln Tyr Ala Pro Val Ala Tyr Gln Asn Gln Val Glu Tyr

210 215 220

Glu Asn Val Ala Arg Glu Cys Arg Leu Gly Ser Lys Glu Gly Arg Pro

225 230 235 240

Phe Ser Gly Val Thr Ala Cys Leu Asp Phe Cys Ala His Pro His Arg

245 250 255

Asp Ile His Asn Met Asn Asn Gly Ser Thr Val Val Cys Thr Leu Thr

260 265 270

Arg Glu Asp Asn Arg Ser Leu Gly Val Ile Pro Gln Asp Glu Gln Leu

275 280 285

His Val Leu Pro Leu Tyr Lys Leu Ser Asp Thr Asp Glu Phe Gly Ser

290 295 300

Lys Glu Gly Met Glu Ala Lys Ile Lys Ser Gly Ala Ile Glu Val Leu

305 310 315 320

Ala Pro Arg Arg Lys Lys Arg Thr Cys Phe Thr Gln Pro Val Pro Arg

325 330 335

Ser Gly Lys Lys Arg Ala Ala Met Met Thr Glu Val Leu Ala His Lys

340 345 350

Ile Arg Ala Val Glu Lys Lys Pro Ile Pro Arg Ile Lys Arg Lys Asn

355 360 365

Asn Ser Thr Thr Thr Asn Asn Ser Lys Pro Ser Ser Leu Pro Thr Leu

370 375 380

Gly Ser Asn Thr Glu Thr Val Gln Pro Glu Val Lys Ser Glu Thr Glu

385 390 395 400

Pro His Phe Ile Leu Lys Ser Ser Asp Asn Thr Lys Thr Tyr Ser Leu

405 410 415

Met Pro Ser Ala Pro His Pro Val Lys Glu Ala Ser Pro Gly Phe Ser

420 425 430

Trp Ser Pro Lys Thr Ala Ser Ala Thr Pro Ala Pro Leu Lys Asn Asp

435 440 445

Ala Thr Ala Ser Cys Gly Phe Ser Glu Arg Ser Ser Thr Pro His Cys

450 455 460

Thr Met Pro Ser Gly Arg Leu Ser Gly Ala Asn Ala Ala Ala Ala Asp

465 470 475 480

Gly Pro Gly Ile Ser Gln Leu Gly Glu Val Ala Pro Leu Pro Thr Leu

485 490 495

Ser Ala Pro Val Met Glu Pro Leu Ile Asn Ser Glu Pro Ser Thr Gly

500 505 510

Val Thr Glu Pro Leu Thr Pro His Gln Pro Asn His Gln Pro Ser Phe

515 520 525

Leu Thr Ser Pro Gln Asp Leu Ala Ser Ser Pro Met Glu Glu Asp Glu

530 535 540

Gln His Ser Glu Ala Asp Glu Pro Pro Ser Asp Glu Pro Leu Ser Asp

545 550 555 560

Asp Pro Leu Ser Pro Ala Glu Glu Lys Leu Pro His Ile Asp Glu Tyr

565 570 575

Trp Ser Asp Ser Glu His Ile Phe Leu Asp Ala Asn Ile Gly Gly Val

580 585 590

Ala Ile Ala Pro Ala His Gly Ser Val Leu Ile Glu Cys Ala Arg Arg

595 600 605

Glu Leu His Ala Thr Thr Pro Val Glu His Pro Asn Arg Asn His Pro

610 615 620

Thr Arg Leu Ser Leu Val Phe Tyr Gln His Lys Asn Leu Asn Lys Pro

625 630 635 640

Gln His Gly Phe Glu Leu Asn Lys Ile Lys Phe Glu Ala Lys Glu Ala

645 650 655

Lys Asn Lys Lys Met Lys Ala Ser Glu Gln Lys Asp Gln Ala Ala Asn

660 665 670

Glu Gly Pro Glu Gln Ser Ser Glu Val Asn Glu Leu Asn Gln Ile Pro

675 680 685

Ser His Lys Ala Leu Thr Leu Thr His Asp Asn Val Val Thr Val Ser

690 695 700

Pro Tyr Ala Leu Thr His Val Ala Gly Pro Tyr Asn His Trp Val

705 710 715

<210> 3

<211> 52

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ggaggtagtg gaatggatcc cgccaccatg gaactgccca cctgcagctg tc 52

<210> 4

<211> 46

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

tcaccatggt ggcgggatcg acccaatggt tatagggccc cgcaac 46

<210> 5

<211> 2157

<212> DNA

<213> Homo sapiens

<400> 5

gaactgccca cctgcagctg tcttgatcga gttatacaaa aagacaaagg cccatattat 60

acacaccttg gggcaggacc aagtgttgct gctgtcaggg aaatcatgga gaataggtat 120

ggtcaaaaag gaaacgcaat aaggatagaa atagtagtgt acaccggtaa agaagggaaa 180

agctctcatg ggtgtccaat tgctaagtgg gttttaagaa gaagcagtga tgaagaaaaa 240

gttctttgtt tggtccggca gcgtacaggc caccactgtc caactgctgt gatggtggtg 300

ctcatcatgg tgtgggatgg catccctctt ccaatggccg accggctata cacagagctc 360

acagagaatc taaagtcata caatgggcac cctaccgaca gaagatgcac cctcaatgaa 420

aatcgtacct gtacatgtca aggaattgat ccagagactt gtggagcttc attctctttt 480

ggctgttcat ggagtatgta ctttaatggc tgtaagtttg gtagaagccc aagccccaga 540

agatttagaa ttgatccaag ctctccctta catgaaaaaa accttgaaga taacttacag 600

agtttggcta cacgattagc tccaatttat aagcagtatg ctccagtagc ttaccaaaat 660

caggtggaat atgaaaatgt tgcccgagaa tgtcggcttg gcagcaagga aggtcgtccc 720

ttctctgggg tcactgcttg cctggacttc tgtgctcatc cccacaggga cattcacaac 780

atgaataatg gaagcactgt ggtttgtacc ttaactcgag aagataaccg ctctttgggt 840

gttattcctc aagatgagca gctccatgtg ctacctcttt ataagctttc agacacagat 900

gagtttggct ccaaggaagg aatggaagcc aagatcaaat ctggggccat cgaggtcctg 960

gcaccccgcc gcaaaaaaag aacgtgtttc actcagcctg ttccccgttc tggaaagaag 1020

agggctgcga tgatgacaga ggttcttgca cataagataa gggcagtgga aaagaaacct 1080

attccccgaa tcaagcggaa gaataactca acaacaacaa acaacagtaa gccttcgtca 1140

ctgccaacct tagggagtaa cactgagacc gtgcaacctg aagtaaaaag tgaaaccgaa 1200

ccccatttta tcttaaaaag ttcagacaac actaaaactt attcgctgat gccatccgct 1260

cctcacccag tgaaagaggc atctccaggc ttctcctggt ccccgaagac tgcttcagcc 1320

acaccagctc cactgaagaa tgacgcaaca gcctcatgcg ggttttcaga aagaagcagc 1380

actccccact gtacgatgcc ttcgggaaga ctcagtggtg ccaatgcagc tgctgctgat 1440

ggccctggca tttcacagct tggcgaagtg gctcctctcc ccaccctgtc tgctcctgtg 1500

atggagcccc tcattaattc tgagccttcc actggtgtga ctgagccgct aacgcctcat 1560

cagccaaacc accagccctc cttcctcacc tctcctcaag accttgcctc ttctccaatg 1620

gaagaagatg agcagcattc tgaagcagat gagcctccat cagacgaacc cctatctgat 1680

gaccccctgt cacctgctga ggagaaattg ccccacattg atgagtattg gtcagacagt 1740

gagcacatct ttttggatgc aaatattggt ggggtggcca tcgcacctgc tcacggctcg 1800

gttttgattg agtgtgcccg gcgagagctg cacgctacca ctcctgttga gcaccccaac 1860

cgtaatcatc caacccgcct ctcccttgtc ttttaccagc acaaaaacct aaataagccc 1920

caacatggtt ttgaactaaa caagattaag tttgaggcta aagaagctaa gaataagaaa 1980

atgaaggcct cagagcaaaa agaccaggca gctaatgaag gtccagaaca gtcctctgaa 2040

gtaaatgaat tgaaccaaat tccttctcat aaagcattaa cattaaccca tgacaatgtt 2100

gtcaccgtgt ccccttatgc tctcacacac gttgcggggc cctataacca ttgggtc 2157

Claims

1.包含一种异源核酸序列的重组单链DNA病毒载体在制备用于治疗应激性认知损伤的药物中的用途，

其中，所述重组单链DNA病毒载体为腺相关病毒载体，所述异源核酸编码治疗性蛋白质。

2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述治疗性蛋白为TET1(1418-2136aa)，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括权利要求1-2任一项所述重组单链DNA病毒载体。

4.一种制备权利要求1-2任一项所述重组单链DNA病毒载体的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：含TET1酶催化活性结构域真核表达载体的构建及鉴定；

5.根据权利要求4所述的制备方法，其中，步骤S1中，通过PCR获得Tet1酶催化活性结构域的编码基因，再克隆至腺相关表达载体内。

6.根据权利要求4-5任一项所述的制备方法，其中，所述PCR反应所采用的引物序列如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

7.根据权利要求4-5所述的制备方法，其特征在于，所述腺相关表达载体为GV467，元件顺序为CMV-betaGlobin-MCS-EGFP-3Flag-SV40 PolyA。

8.权利要求4-7任一项所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，通过PCR获得的扩增产物翻译产生的肽段为TET1 1418-2136aa，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

9.权利要求1-3任一项所述的病毒载体在针对表观遗传调控机制的研究中以及针对应激所致认知障碍的治疗中的应用。