JP2023534293A - 脆弱ｘ症候群の治療のための方法及び組成物 - Google Patents

Abstract

野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質（ヒトＦＭＲＰ）をコードするアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９ウイルス粒子を使用して脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）患者の症状を緩和するための方法。また、本明細書では、ＦＸＳに関連する少なくとも１つの症状を緩和するためのＦＸＳ患者のためのＡＡＶ９ウイルス粒子の好適な用量を決定する方法、並びに治療効果をモニタリングするための方法も提供される。【選択図】図１Ｂ

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年７月１７日に出願された米国仮出願第６３／０５３，４６１号の出願日の利益を主張し、その内容全体が参照により本明細書に組み込まれる。

脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲ１）遺伝子のＣＧＧリピートの拡大によって引き起こされる単遺伝性症候群であり、その結果、遺伝子産物である脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）が失われ、遺伝性知的障害の主な原因となる。ＦＸＳ患者はＩＱが低く、発達が遅れており、言語的及び非言語的コミュニケーションに障害があり（多くの場合ＡＳＤの基準を満たしている）、音及び光に対する過敏症並びにてんかん発作で明らかになる神経細胞の過興奮性に苦しんでいる。

ＦＸＳ患者は生涯にわたるケアを必要とし、自立した生活を送ることができず、患者及びその介護者の生活の質が低下する。ＦＸＳの治療のための新しい治療法を開発する必要がある。

本開示は、少なくとも部分的に、ＦＭＲＰのインビボ発現の成功につながるＡＡＶベクターの開発、及びＡＡＶ９ウイルス粒子によって媒介される低レベルのＦＭＲＰ発現がマウスモデルにおける脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）の一次行動症状の改善に成功した、という予想外の発見に基づく。また、脳波図（ＥＥＧ）、行動評価、認知神経リハビリテーション評価、又はそれらの組み合わせが、個々のＦＸＳ患者の症状の緩和及び／又は治療効果の評価の際に、診断及び／又は予後バイオマーカーとして、例えば、ＦＭＲ１担持ＡＡＶ９ウイルス粒子の好適な用量（個別化された用量）を決定するために使用できることも発見された。

したがって、本開示の一態様は、ＦＸＳを有するヒト患者に有効量の複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９ウイルス粒子を投与することによって、ヒト患者においてＦＸＳを治療するための治療方法を提供する。ＡＡＶ９ウイルス粒子は、一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡベクターを含むことができ、これは、プロモーターに作動可能に連結された野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質（ヒトＦＭＲＰ）をコードするヌクレオチド配列を包含し得る。ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、標準的なＡＡＶベクターであり得る。代替的に、ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターであってもよい。ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、本明細書に開示されるＡＡＶ９ウイルス粒子の感染後、ヒト患者の脳において野生型ヒトＦＭＲＰを発現し得る。

いくつかの実施形態では、野生型ヒトＦＭＲＰは、ヒトＦＭＲＰアイソフォーム１であり得る。他の実施形態では、ヒトＦＭＲＰは、１～２９７個のアミノ酸残基のＮ末端フラグメントを含み得るか、又はそれからなり得る、野生型ヒトＦＭＲＰ（例えば、アイソフォーム１）のフラグメントであり得る。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリｂ－アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッドであり得る。他の実施形態では、プロモーターは、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターであり得る。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、ヒトＦＭＲＰの発現を調節する１つ以上の調節エレメントを更に含み得る。例えば、１つ以上の調節エレメントは、ヒトβグロビンイントロン配列、１つ以上のポリＡシグナル伝達配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、１つ以上のポリＡシグナル伝達配列は、ヒトβグロビンポリＡシグナル伝達配列、ＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列、又はそれらの組み合わせを含む。いくつかの例では、ＡＡＶ ＤＮＡベクターはＷＰＲＥを含まない。

特定の例において、ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたニワトリβ－アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッドと、ＷＰＲＥと、ヒトＦＭＲ１をコードするヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列と、を含む、標準的なＡＡＶベクターである。

他の特定の例では、ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたニワトリβ－アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッドと、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列と、を含む、標準的なＡＡＶベクターである。場合によっては、ＡＡＶ ＤＮＡベクターはＷＰＲＥを含まない。

更に他の特定の例では、ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターと、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列の上流にあるヒトβグロビンイントロン配列と、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列及びヒトβ－グロビンポリＡシグナル伝達配列と、を含む、標準的なＡＡＶベクターである。場合によっては、ＡＡＶ ＤＮＡベクターはＷＰＲＥを含まない。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、非脳組織における野生型ＦＭＲＰの発現を抑制するための、１つ以上の組織選択的マイクロＲＮＡに特異的な１つ以上のマイクロＲＮＡ標的部位（ＭＴＳ）を更に含む。いくつかの例では、１つ以上のＭＴＳは、ｍｉＲ－１２２のＭＴＳ、ｍｉＲ－２０８ａのＭＴＳ、ｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐのＭＴＳ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐのＭＴＳ、又はそれらの組み合わせであり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ９ウイルス粒子は、静脈内注射、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、又はそれらの組み合わせによってヒト患者に投与することができる。いくつかの例では、ＡＡＶ９ウイルス粒子は、少なくとも２つの投与経路を介してヒト患者に投与することができる。いくつかの例では、少なくとも２つの投与経路は、脳室内注射及び静脈内注射、すなわち髄腔内注射及び静脈内注射、大槽内注射及び静脈内注射、又は実質内注射及び静脈内注射であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ９ウイルス粒子の投与の前に、ヒト患者は、疾患の表現型重症度を決定するために、脳波図（ＥＥＧ）、行動及び／若しくは認知神経リハビリテーション評価、又はそれらの組み合わせを受けてもよい。いくつかの例では、方法は、投与するステップの前に、ヒト患者を脳波図（ＥＥＧ）、行動及び／若しくは認知神経リハビリテーション評価、又はそれらの組み合わせに供することを更に含むことができる。いくつかの例では、方法は、ＥＥＧ分析、行動及び／若しくは認知評価、又はそれらの組み合わせに基づいて、ＡＡＶ９ウイルス粒子の投与量及び／若しくは送達経路を決定することを更に含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＧＡＢＡ受容体アゴニスト、ＰＩ３Ｋアイソフォーム選択的阻害剤、ＭＭＰ９アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせを含む治療を受けてきている、又は受けているヒト患者に使用することができる。いくつかの例では、本明細書に開示される方法は、有効量のＧＡＢＡ受容体アゴニスト、ＰＩ３Ｋアイソフォーム選択的阻害剤、ＭＭＰ９アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせをヒト患者に投与することを更に含むことができる。

本開示の別の態様は、ヒトＦＸＳ患者などの対象においてＦＭＲＰを発現するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクター、及びそのようなベクターを一本鎖形態で含むＡＡＶ粒子、並びにそのようなＡＡＶウイルス粒子を含む医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲを含むＡＡＶ骨格；野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質（ＦＭＲＰ）をコードするヌクレオチド配列；野生型ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーター；非脳組織における野生型ＦＭＲＰの発現を抑制するための、１つ以上の組織選択的マイクロＲＮＡに特異的な１つ以上のマイクロＲＮＡ標的部位（ＭＴＳ）を含み得る。いくつかの例において、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶベクターであり得る。

いくつかの実施形態では、本開示は、（ｉ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲを含むＡＡＶ骨格、（ｉｉ）野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１タンパク質（ＦＭＲＰ）をコードするヌクレオチド配列、（ｉｉｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結されたプロモーター、（ｉｖ）ＦＭＲＰの発現を調節する１つ以上の調節エレメントを含む標準的なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを特徴とする。

いくつかの実施形態では、プロモーターは、ニワトリβアクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッドである。他の実施形態では、プロモーターはヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターである。代替的に、又は加えて、１つ以上の調節エレメントは、ヒトβグロビンイントロン配列、１つ以上のポリＡシグナル伝達配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、又はそれらの組み合わせを含む。場合によっては、１つ以上のポリＡシグナル伝達配列は、ヒトβグロビンポリＡシグナル伝達配列、ＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列、又はそれらの組み合わせを含む。場合によっては、ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、ＷＰＲＥを含まない。

いくつかの例では、ＡＡＶベクターは、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたニワトリβ－アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッド、ＷＰＲＥ、及びヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチドの下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列を含む。

他の例では、ＡＡＶベクターは、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたニワトリβ－アクチンプロモーター及びＣＭＶプロモーターとのハイブリッド、及びヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列を含み、ＡＡＶ ＤＮＡベクターがＷＰＲＥを含まない。

更に他の例では、ＡＡＶベクターは、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーター、ヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列の上流にあるヒトβグロビンイントロン配列、及びヒトＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列及びヒトβ－グロビンポリＡシグナル伝達配列を含み、ＡＡＶ ＤＮＡベクターがＷＰＲＥを含まない。

また、本開示の範囲内には、ヒト患者におけるＦＸＳの治療に使用するための本明細書に開示されるＡＡＶ９粒子、及びＦＸＳの治療に使用するための医薬品を製造するためのＡＡＶ９粒子の使用が含まれる。

以下の図面は、本明細書の一部を形成し、本明細書に提示される特定の実施形態の詳細な説明と組み合わせて図面を参照することによってよりよく理解できる、本開示の特定の態様を更に実証するために含まれる。

ヒトＦＭＲＰ産生が可能な自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターを示す図を含む。図１Ａ：図は、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ベータアクチンプロモーターＣＢの制御下にあるヒトＦＭＲ１コード配列を含むｓｃＡＡＶ骨格に基づく構築物である、ｓｃＡＡＶ９－ＣＢ－ＦＭＲ１のｓｃＡＡＶプラスミド構造を示している。図１Ｂ：画像は、完全長ヒトＦＭＲＰ、フラグタグ付き完全長ヒトＦＭＲＰ、又はＧＦＰのいずれかを含むｓｃＡＡＶウイルスゲノムの濃度を増加させて形質導入した初代培養マウス皮質ニューロンにおけるタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示している。上のパネルはＦＭＲＰタンパク質の発現、中央のパネルはｆｌａｇタンパク質の発現、下のパネルはＧＦＰタンパク質の発現を示している。 ヒトＦＭＲＰ産生が可能なＡＡＶ（ＡＡＶ）ベクターを示す図を含む。図２Ａ：図は、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１のＡＡＶプラスミド構造を示し、これは、ＣＡＧプロモーターの制御下にあるヒトＦＭＲ１コード配列を含むＡＡＶ骨格に基づく構築物である。図２Ｂ：画像は、完全長ヒトＦＭＲＰ又はＧＦＰのいずれかを含むＡＡＶウイルスゲノムの濃度を増加させて形質導入した初代培養マウス海馬ニューロンにおけるタンパク質発現のウエスタンブロット分析を示している。上部のパネルはＦＭＲＰタンパク質の発現を示し、中央のパネルはＧＦＰタンパク質の発現を示し、下部のパネルはβ－アクチンタンパク質の発現（ローディングコントロール）を示している。図２Ｃ：グラフは、完全長ヒトＦＭＲＰ又はＧＦＰのいずれかを含むＡＡＶウイルスゲノムの濃度を増加させて形質導入した初代培養マウス海馬ニューロンにおけるｍＲＮＡ発現のＲＴ－ＰＣＲ分析を示している。左のパネルはＦＭＲＰ ｍＲＮＡ発現を示し、右のパネルはＧＦＰ ｍＲＮＡ発現を示している。 マウスの皮質及び海馬ニューロンにおけるウイルス発現ＦＭＲＰ又はＧＦＰを示す図を含む。図３Ａ：画像は、ｓｃＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰウイルスゲノムの脳室内（ＩＣＶ）注射の２週間後のマウス脳におけるＧＦＰ発現を示している。図３Ｂ及び３Ｃ：画像は、５０μｍ（図３Ｂ）及び１００μｍ（図３Ｃ）のＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰウイルスゲノムのＩＣＶ注射の２週間後のマウス脳におけるＦＭＲＰ発現を示している。ＮｅｕＮは、神経細胞の免疫組織化学マーカーとして使用された。 マウスをＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰ又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰウイルスゲノムのＩＣＶ注射に供した後１０週間後に、野生型マウス及びＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）マウスから採取した脳スライスにおけるＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１及びＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰの総タンパク質発現のウエスタンブロット解析の画像を含む。図４Ａ：ＧＦＰ。図４Ｂ：ｈＦＭＲＰ。 ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰ又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ投与後のＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスにおける行動及び機能評価の研究のための１０週間のタイムラインを示す画像を含む。 ＩＣＶ注射によるＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰ又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ投与後に、Ｆｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスにおいて実施されたネスティングアッセイを示す図を含む。図６Ａ：画像は、野生型のＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ注射マウス（左パネル）及びＦｍｒ１ ＫＯ、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ注射マウス（右パネル）に新鮮な巣箱を提供してから２時間後の細断された巣箱を示している）。図６Ｂ：グラフは、ＡＡＶ注射後４週間ごとに１回ネスティングアッセイを行ったＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰ又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ投与後のＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスによって細断された巣箱の割合を示している。図６Ｃ：グラフは、Ｆｍｒ１ ＫＯ及びＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを注射した野生型マウスと比較した、Ｆｍｒ１ ＫＯ及びＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰを注射した野生型マウスにおけるＡＡＶ注射の２週間後及び４週間後のネスティング（営巣）行動の改善率を示している。 ＩＣＶ注射によるＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰ又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ投与後にＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスにおいて実施された大理石埋没アッセイを示す図を含む。図７Ａ：画像は、野生型、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ注射マウス、及びＦｍｒ１ ＫＯ、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦ注射マウスにおける大理石埋没行動の例を示している。図７Ｂ：グラフは、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰ又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ投与後のＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスにおける大理石を埋め始めるまでの潜時を示す。図７Ｃ：グラフは、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰ又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ投与後のＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスによって１５分後に埋められた大理石の量を示す。 ＩＣＶ注射によるＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰ又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ投与の６～８週間後に、Ｆｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスに対して実施されたモリス水迷路アッセイを示す図を含む。図８Ａ：画像は、本明細書に開示されるように実施されたモリス水迷路アッセイの図を示している。図８Ｂ：グラフは、隠れたプラットフォームを正式に含んでいた象限へのエントリの数を示している。図８Ｃ：グラフは、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲＰ又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ投与後のＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスにおける前のプラットフォーム位置に入るまでの潜時を示す。 ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスが、多動性及び／又は不安を測定するオープンフィールド活動アッセイ中にオープンセンタにいた合計時間を示すグラフを含む。 ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯマウス及び野生型マウスの間の新規オブジェクトの嗜好の違いを示すグラフを含む。ここで嗜好は、新規オブジェクトとのインタラクションに費やした時間を、新規オブジェクト及びなじみのあるオブジェクトの両方を探索する時間で割ることにより計算した。 ＩＣＶ注射によるＡＡＶ投与の１０週間後に、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスの脳から調製した海馬切片における長期増強の電気生理学的測定を示す図を含む。図１１Ａ：グラフは、６０分間にわたって測定されたシータバースト刺激によって誘発された長期増強を示している。図１１Ｂグラフは、７０分間にわたって測定されたシータバースト刺激によって誘発された長期増強を示している。 ＩＣＶ注射によるＡＡＶ投与の１０週間後に、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを注射したＦＭＲ１ ＫＯ及び野生型マウスから採取した脳から調製した皮質切片におけるタンパク質合成率を示す図を含む。図１２Ａ：画像は、ビヒクル（対照）又はピューロマイシンによる皮質切片の処理後の新生ペプチド鎖へのピューロマイシンの取り込みを調べるウエスタンブロット分析を示す画像。図１２Ｂ：グラフは、ウエスタンブロット分析によって評価されたピューロマイシン存在量のベータ－チューブリン正規化デンシトメトリーを示している。 野生型（ＷＴ）マウスと比較したＦｍｒｌ ＫＯのガンマパワーの増加を示すグラフを含む。ここで連続ＥＥＧによって測定されたガンマパワーは、６日間にわたり５分間で計算された（ｎ＝３、ＲＭ２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５）。 脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）におけるガンマ（ｙ）パワー関連異常のヒトデータの評価を示す図を含む。図１４Ａ：ＦＸＳの過剰なｙパワー。有意なグループの違いを含む、相対的なｙパワーのトポグラフィープロット（ｐ＜０．０５補正）。図１４Ｂ：聴覚皮質のｙパワーは、行動と高度に相関している。高いｙは、ＦＸＳの聴覚注意タスクのパフォーマンスの低下と関連している。図１４Ｃ：シータ及びアルファパワーとのｙの関係は、ＦＸＳ（グレー）とＨＣ（黒）を高度に区別する。図１４Ｄ：マウスＥＥＧ分析のためのカスタム分析ソフトウェアからのＥＥＧパワー分析出力。 ＣＡＧＷＰＲＥベクターのプラスミドマップを示す図である。 ＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥベクターのプラスミドマップを示す図である。 ｈＰＧＫベクターのプラスミドマップを示す図である。 ベクターＣＡＧＷＰＲＥ（図１８Ａ）及びＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥ（図１８Ｂ）によるＦＭＲＰの発現を示す写真を含む。 ＣＡＧＷＰＲＥベクター、ＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥベクター、ｈＰＧＫベクターによるＦＭＲＰの発現を示す写真である。 ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１ベクターを担持するＡＡＶ粒子を投与した後の様々な組織におけるＧＡＰＤＨに対して正規化されたＦＭＲＰ及びｅＧＦＰの発現を示す図を含む。結果は、ＲＴ－ＰＣＴアッセイによって得られた。図２０Ａ：皮質。図２０Ｂ：海馬。図２０Ｃ：中脳。図２０Ｄ：小脳。図２０Ｅ：心臓。図２０Ｆ：肝臓。図２０Ｇ：腎臓。

脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、Ｍａｒｔｉｎ－Ｂｅｌｌ症候群又はエスカランテ症候群としても知られ、Ｘ染色体上のＦＭＲ１遺伝子のＣＧＧトリヌクレオチドリピートの拡大に起因する遺伝性疾患である。ＦＸＳの原因となる拡張されたＣＧＧトリヌクレオチドリピートは、正常な神経発達に必要な脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）をコードするＦＭＲ１遺伝子の５’非翻訳領域（ＵＴＲ）にある。５’ＵＴＲのトリヌクレオチドリピート（ＣＧＧ）は、通常６～５３コピーで見られる。ただし、ＦＸＳに罹患している個人は、一般にＣＧＧコドンの５５～２３０回のリピートを持ち、ＦＭＲ１プロモーターのメチル化、遺伝子のサイレンシング、及びＦＭＲＰの生成の失敗をもたらす。

ＦＭＲＰは、その翻訳及び安定性を調節する数百のｍＲＮＡと関連しており、シナプスでイオンチャネルを結合することによって神経細胞の興奮性に直接影響を与えることもできる。その結果、ＦＭＲＰの欠損は、不可能ではないにしても、ヒトの単剤戦略で修正することが困難である分子、細胞、及び構造上の欠陥の過多につながる。ＦＭＲＰが存在しない場合に生じる欠陥は、認知障害、コミュニケーション障害、社会的スキル障害、感覚過敏、不注意、適応行動障害、不安、自律神経系の調節不全、及び発作を引き起こす可能性がある。

本開示は、機能的（例えば、野生型）ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質（ＦＭＲＰ）を発現するための核酸を含有するＡＡＶ９ウイルス粒子によるＦＸＳの治療を開発して、ＦＸＳに関連する行動及び機能的症状を改善することを目的とする。

本開示は、マウスモデルにおけるＦＭＲＰの発現の成功につながった様々なＡＡＶベクターの開発を報告する。驚くべきことに、ＦＭＲＰをコードするＡＡＶ９ウイルス粒子をＦＸＳの動物モデルのＣＮＳに送達することによる低レベルのＦＭＲＰ発現は、ＦＸＳマウスモデルで観察されたように、ＦＸＳに関連する症状を首尾よく緩和した。更に、本開示は、例えば、個々のＦＸＳ患者についてＦＭＲＰをコードするＡＡＶ９ウイルス粒子の適切な投与量を評価するために、脳波図（ＥＥＧ）、行動、認知神経リハビリテーション評価、又はそれらの組み合わせを、診断及び／又は予後バイオマーカーとして使用できることを報告する。加えて、そのようなバイオマーカーは、治療の有効性を評価するために使用できる。

本開示は、年齢及び性別が一致した対照を有するＦＸＳの強力なサンプルにおける皮質興奮性の増大の証拠を確立した。高密度アレイＥＥＧデータをソースローカライズすることにより、興味深い３つの主要な発見が特定された：（ｉ）機能的な安静状態のネットワーク及び皮質領域における局所的なガンマ振動の増加；（ｉｉ）低周波のパワー及び結合関係の顕著な変化；（ｉｉｉ）ケースコントロールのコントラストとは無関係に、デフォルトモードネットワークからのソース推定ガンマパワーは、疾患固有の知的障害を高度に予測する。これらの発見は、ＦＸＳ内の不均一性を「ネットワークの疾患」及び皮質過興奮性として解析する効果的な方法を支持し、これらの変化及びＦＸＳにおける知的障害との臨床的関連性を測定する実行可能な方法を提供し、これは治療及び／又は治療効果のモニタリングに好適な患者を特定するためのバイオマーカーとして使用され得る。

したがって、ＦＭＲＰを発現するためのＡＡＶ９ウイルスベクター及び粒子、並びにＦＸＳ患者におけるＦＸＳ症状の緩和におけるそれらの使用が、本明細書において提供される。また、開示されたＡＡＶ９ウイルス粒子を作製し、本明細書に開示された行動特徴の１つ以上をバイオマーカーとして使用して、個々のＦＸＳ患者のためのＡＡＶ９ウイルス粒子の好適な用量（個別化された用量）を決定するための方法も本明細書に提供される。

Ｉ．ＦＭＲ１タンパク質を発現するためのＡＡＶウイルス粒子
一態様では、本開示は、ＦＸＳの治療を必要とする対象にＦＭＲＰを送達するためのビヒクルとして使用するためのＡＡＶウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ９ウイルス粒子）を提供する。

パルボウイルスファミリーのメンバーであるアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）は、エンベロープを持たない小さなウイルスである。ここでのＡＡＶ粒子は、カプシドタンパク質サブユニット、ＶＰ１、ＶＰ２及びＶＰ３から構成されるＡＡＶカプシドを含み得、一本鎖ＤＮＡゲノムを取り囲む。非病原性、非分裂細胞を含む幅広い感染力の宿主範囲、及び統合の欠如の特性により、ＡＡＶは魅力的な遺伝子送達媒体になる。

本明細書で使用される場合、ＡＡＶウイルス粒子は、ウイルスカプシドタンパク質によってカプセル化されたＡＡＶ ＤＮＡベクターを含有する。ＡＡＶウイルス粒子は、その血清型に応じて、特定の組織及び細胞に感染することができる。以下の説明を参照されたい。ＡＡＶ ＤＮＡベクター（又はＡＡＶベクター）は、野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質（ＦＭＲＰ）をコードするヌクレオチド配列、及び任意でＦＭＲＰの発現を制御するための調節エレメントを含む、ウイルス粒子中に担持されるＤＮＡ分子を指す。ＦＭＲＰの発現レベルを調節するため、及び／又は安全性を改善するために、調節エレメントを選択することができる。例えば、ＦＭＲ１コード配列は、ＦＭＲＰの発現を駆動する好適なプロモーターに作動可能に連結することができる。場合によっては、ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、ＦＭＲＰの発現を調節する１つ以上の調節エレメント、例えば、１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位、エンハンサー、転写因子結合部位、ポリＡシグナル伝達要素、又はそれらの組み合わせを含み得る。

（Ａ）ＦＭＲＰタンパク質
ＡＡＶ９ウイルス粒子などの本明細書に開示されるＡＡＶウイルス粒子は、機能的ＦＭＲＰを発現するためのＡＡＶベクターを担持する。ＦＭＲ１は、脳で高度に発現されるｍＲＮＡ結合タンパク質であり、核から神経シナプスに特定のｍＲＮＡを輸送する。ＦＭＲＰが存在しないと、シナプスが適切に形成されず、ＦＸＳに関連する認知能力の低下と発達障害につながる。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＦＭＲＰは、天然に存在するＦＭＲＰであり得る。天然に存在するＦＭＲＰ又はサブユニットは、好適な種、例えば、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、非ヒト霊長類、又はヒトなどの哺乳動物に由来し得る。いくつかの例において、ＦＭＲＰは野生型ヒトタンパク質である。様々な種に由来する天然に存在するＦＭＲＰは、当技術分野で周知であり、それらの配列は、ＧｅｎＢａｎｋなどの公的遺伝子データベースから検索することができる。

天然に存在するヒトＦＭＲＰの構造には、複数の保存された機能ドメインが含まれている。例えば、ＦＭＲＰの機能ドメインは、２つのチューダードメイン、核局在化シグナル（ＮＬＳ）、３つのＫホモロジードメイン（ＫＨ０、ＫＨ１、ＫＨ２）、核外輸送シグナル（ＮＥＳ）、及びＮ末端からＣ末端までのアルギニン－グリシン－グリシンドメイン（ＲＧＧ）からなる。チューダー、ＫＨ、及びＲＧＧドメインは、主にＲＮＡ結合に関与しているが、タンパク質相互作用パートナーも有している。

ＦＭＲ１遺伝子は高度に保存された遺伝子で、約３８ｋｂのゲノムＤＮＡにまたがる１７個のエクソンからなる。ＦＭＲ１遺伝子は、様々なＦＭＲ１転写アイソフォームを生成する広範な選択的スプライシングを受け、その結果、いくつかのＦＭＲＰアイソフォームが生じる。ＦＭＲ１転写アイソフォームは、以下の表１に示すように、そのエクソン構造によってグループに分類できる。

ヒトＦＭＲ１遺伝子は、選択的スプライシングの結果、合計１１のＦＭＲＰアイソフォームを生成できる。これらのＦＭＲＰアイソフォームは、約４００残基の高度に保存されたＮ末端フラグメント、及び様々なｍＲＮＡ結合親和性を持つ可変Ｃ末端配列を共有している。ＦＭＲ１のスプライスアイソフォームのいずれも、本開示において使用することができる。いくつかの例では、本明細書で使用されるヒトＦＲＭＰはＦＲＭＰアイソフォーム１である。ヒトＦＭＲＰアイソフォーム１のアミノ酸配列を以下に提供する（配列番号：１）

ＦＭＲＰのコード配列の例は、ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号ＮＭ＿００２０２４の下にある。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子によって生成されるＦＭＲＰは、天然に存在するヒトＦＭＲＰの機能的フラグメントであり得る。そのような機能的フラグメントは、本明細書に開示されるＦＭＲＰ機能ドメインのうちの１つ以上を含み得る。場合によっては、機能的フラグメントは、野生型ＦＭＲＰの約４００アミノ酸長のＮ末端保存ドメインを含む。いくつかの例では、ＦＭＲＰのフラグメントは、Ｎ末端の１～２９７個のアミノ酸残基を含む（例えば、からなる）ことができる。代替的に、又は加えて、機能的フラグメントは、少なくとも１つのチューダードメイン、少なくとも１つのＮＬＳ、少なくとも１つのＫＨ、少なくとも１つのＮＥＳ、少なくとも１つのＲＧＧ、又はそれらの組み合わせを含み得る。いくつかの例では、機能的フラグメントは、野生型の対応物と比較して、Ｎ末端で切断されている場合がある。他の例では、機能的フラグメントは、野生型の対応物と比較して、Ｃ末端で切断されている場合がある。場合によっては、機能的フラグメントは、野生型の対応物と比較して、Ｎ末端及びＣ末端の両方で切断されている場合がある。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子によって産生されるＦＭＲＰは、天然に存在するＦＭＲ１の機能的変異体（例えば、ヒトＦＭＲ１アイソフォーム１の機能的変異体）であり得る。そのような機能的変異体は、天然に存在するＦＭＲ１対応物（例えば、配列番号１）とともに、高い配列相同性（例えば、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、又はそれ以上）を共有し、天然に存在するＦＭＲ１対応物と実質的に類似の生物活性（例えば、野生型の対応物と比較して生物活性の少なくとも８０％）を有している。

２つのアミノ酸配列の「パーセント同一性」は、Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７：２２６４－６８，１９９０，ｍｏｄｉｆｉｅｄ ａｓ ｉｎ Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３－７７，１９９３のアルゴリズムを使用して決定される。このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ，ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３－１０，１９９０のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。ＢＬＡＳＴタンパク質検索は、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、語長＝３で実施して、本発明のタンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得ることができる。２つの配列間にギャップが存在する場合、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴは、Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９－３４０２，１９９７に記載されているように利用できる。ＢＬＡＳＴ及びＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムを利用する場合、それぞれのプログラムのデフォルトパラメータ（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）を使用することができる。

本明細書に開示される任意の機能的変異体は、本明細書に記載されるものなどの野生型ＦＭＲＰの機能的ドメインのうちの１つ以上、例えば、Ｎ末端保存ドメイン、チューダードメイン、ＫＨドメイン、及び／又はＲＧＧドメインを含み得、１つ以上の非機能ドメインに１つ以上のバリエーションを含み得る。代替的に、機能的変異体は、野生型の対応物と比べて、例えば、１つ以上の機能ドメイン及び／又は１つ以上の非機能ドメインに保存的アミノ酸残基置換を含み得る。

本明細書で使用される場合、「保存的アミノ酸置換」は、アミノ酸置換が行われるタンパク質の相対的電荷又はサイズ特性を変更しないアミノ酸置換を指す。変異体は、当業者に知られているポリペプチド配列を改変するための方法、例えば、そのような方法をまとめた参考文献、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８９、又はＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに見られる方法に従って調製することができる。アミノ酸の保存的置換には、次のグループ内のアミノ酸間で行われる置換が含まれる：（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；及び（ｇ）Ｅ、Ｄ。

いくつかの例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれかにおける導入遺伝子によってコードされるＦＭＲＰは、宿主細胞からＦＭＲＰを分泌するシグナルペプチドをＮ末端に含み得る。そのようなシグナルペプチドの例には、アルブミン、β－グルクロニダーゼ、アルカリプロテアーゼ又はフィブロネクチン由来のシグナルペプチドが含まれる。

他の例では、本明細書に開示されるＦＭＲＰは、本明細書に開示されるベクターを含む融合タンパク質であり得、ＦＭＲＰの分泌を改善するタンパク質モチーフ、例えば、タンパク質伝達ドメイン（ＰＴＤ）、例えば、Ｔａｔ又はＶＰ２２からのＰＴＤであり得る。

（Ｂ）ＡＡＶベクター
ＡＡＶベクターは、ウイルスの野生型ゲノムに由来する必要な遺伝要素（ウイルス骨格要素）を含み、ベクターをウイルス粒子にパッケージ化され、宿主細胞内で担持される導入遺伝子を発現させることができる。更に、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、本明細書に開示されるＦＭＲＰのコード配列、及びコード配列に作動可能に連結された好適なプロモーターを含む。いくつかの例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、コードされたＦＭＲＰの発現及び／又は分泌を調節する１つ以上の調節配列を更に含み得る。例としては、エンハンサー、イントロン配列、ポリアデニル化シグナル部位、内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）、マイクロＲＮＡ標的部位、転写後調節エレメント（ＰＲＥ、例えば、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ））、又はそれらの組み合わせがあるが、これらに限定されない。安全上の懸念を引き起こす可能性のある要素は除外される場合がある。

いくつかの例では、ＡＡＶベクターは、一本鎖核酸を含む通常の（標準）ＡＡＶベクターであり得る。例えば、例として図２Ａ及び図１５～１７を参照されたい。他の例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、その中に二本鎖部分を含むことができる自己相補的ＡＡＶベクターであり得る。例えば、例として図１Ａを参照されたい。

（１）ウイルス骨格要素
本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶベクターの生物活性に必要な最小のＡＡＶゲノム要素を指す、１つ以上のＡＡＶゲノム由来骨格要素を含む。例えば、ＡＡＶゲノム由来骨格要素は、ＡＡＶウイルス粒子に組み立てられるＡＡＶベクターのパッケージング部位、宿主細胞におけるベクター複製及び／又はそこに含まれる導入遺伝子の発現に必要な要素を含み得る。いくつかの例では、市販のＡＡＶベクター（例えば、Ａｄｄｇｅｎｅから）をここで使用することができる。例えば、Ａｄｄｇｅｎｅによって提供されるＡＡＶベクター（例えば、Ａｄｄｇｅｎｅプラスミド＃２８０１４）を使用することができ、そこに含まれるＧＦＰ遺伝子をＦＭＲ１のコード配列で置換することができる。

ＡＡＶベクターで使用するためのウイルス由来エレメントは、当技術分野で周知である。典型的には、ＡＡＶベクターは、野生型ＡＡＶゲノムに由来する逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列の一方又は両方を含む。いくつかの例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクター中のＩＴＲ配列は野生型であり得る。他の例では、ＡＡＶベクターで使用されるＩＴＲ配列は、野生型ＩＴＲの修飾バージョン（例えば、短縮バージョン）であり得る。野生型又は修飾バージョンを含む、ＡＡＶベクターの構築に使用するためのＩＴＲも、当技術分野で周知である。例えば、Ｄａｙａら、Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ、２１（４）：５８３－５９３（２００８）を参照されたい。その関連開示は、本明細書で参照される主題及び目的のために参照により組み込まれる。いくつかの例では、ＡＡＶ２ ＩＴＲを使用することができる。

いくつかの例では、本明細書に開示されるウイルス骨格要素は、少なくとも１つの逆方向末端反復（ＩＴＲ）配列、例えば２つのＩＴＲ配列を含み得る。いくつかの例において、１つのＩＴＲ配列は、ＦＭＲＰのコード配列の５’である。他の例において、１つのＩＴＲ配列はコード配列の３’である。いくつかの例では、ＦＭＲＰをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示されるＡＡＶベクターにおいて２つのＩＴＲ配列に隣接する。いくつかの例では、ＦＭＲＰをコードするポリヌクレオチド配列は、本明細書に開示されるＡＡＶベクター内の２つのスタッファー配列に隣接することができる。

（２）自己相補的ＡＡＶウイルスベクター
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターには、感染細胞に入ったときに自発的にアニーリング（折り畳まれて二本鎖ゲノムを形成する）できる相補配列が含まれているため、細胞のＤＮＡ複製機構を使用して一本鎖のＤＮＡベクターを変換する必要性を回避する。自己補完ＡＡＶベクターは、当技術分野で知られている。例えば、米国特許第６，５９６，５３５号；同第７，１２５，７１７号；同第７，７６５，５８３号；同第７，７８５，８８８号；同第７，７９０，１５４号；同第７，８４６，７２９号；同第８，０９３，０５４号；同第８，３６１，４５７号；及びＷａｎｇ Ｚ．ら（２００３）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ １０：２１０５－２１１１を参照されたい。これらのそれぞれの関連する開示は、本明細書で参照される目的及び主題のために参照により本明細書に組み込まれる。自己補完ゲノムを含むＡＡＶは、その部分的相補配列（例えば、導入遺伝子のコード鎖及び非コード鎖を補完する）によって二本鎖ＤＮＡ分子を迅速に形成することができ、それによってコードされたタンパク質を迅速に産生する。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶウイルスベクターは、鎖内塩基対を形成する第１の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、ＦＭＲ１コード鎖）及び第２の異種ポリヌクレオチド配列（例えば、ＦＭＲ１非コード鎖又はアンチセンス鎖）を含み得る。いくつかの例では、第１の異種ポリヌクレオチド配列及び第２の異種ポリヌクレオチド配列は、鎖内塩基対形成を促進する配列によって連結され、例えば、ヘアピンＤＮＡ構造を形成する。

いくつかの例では、細胞に入る際のｓｃＡＡＶベクターの二量体構造は、２つの末端分解部位（ｔｒｓ）のうちの１つの変異又は欠失によって安定化され得る。ｔｒｓは各ＩＴＲ内に含まれるＲｅｐ結合部位であるため、そのようなｔｒｓの変異又は欠失は、ＡＡＶ Ｒｅｐタンパク質によるｓｃＡＡＶベクターの二量体構造の切断を妨げて単量体を形成し得る。

いくつかの例では、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶウイルスベクターは、切断された５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）、切断された３’ＩＴＲ、又はその両方を含み得る。いくつかの例において、本明細書に開示されるｓｃＡＡＶベクターは、Ｄ領域又はその一部（例えば、その中の末端分解配列）が欠失され得る切断された３’ＩＴＲを含み得る。そのような切断された３’ＩＴＲは、上記の第１の異種ポリヌクレオチド配列と第２の異種ポリヌクレオチド配列との間に位置し得る。

（３）プロモーター
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、ヒト脳細胞などの好適な宿主細胞におけるコード化されたＦＭＲＰの発現を制御するために、ＦＭＲ１コード配列に作動可能に連結された１つ以上の好適なプロモーターを含むことができる。そのようなプロモーターは、宿主細胞におけるタンパク質の効率的かつ好適な産生を可能にするために、遍在し、組織特異的、強い、弱い、調節された、キメラなどであり得る。プロモーターは、コードされたタンパク質と同種であってもよいし、細胞、ウイルス、真菌、植物、又は合成プロモーターを含む異種であってもよい。いくつかの例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターのいずれかで使用されるプロモーターは、ヒト細胞において機能的であり、例えば、脳細胞において機能的である。ユビキタスプロモーターの非限定的な例には、ウイルスプロモーター、特にＣＭＶプロモーター、ＲＳＶプロモーター、ＳＶ４０プロモーターなど、及びＰＧＫ（ホスホグリセリン酸キナーゼ）プロモーター（例えば、ヒトＰＧＫプロモーター）などの細胞プロモーターが含まれる。

いくつかの例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、その中のＦＭＲ１導入遺伝子の発現を制御するための脳特異的プロモーターを含み得る。そのような脳特異的プロモーターは、非脳細胞よりも少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又は１００倍高い脳組織における導入遺伝子の発現を駆動し得る。他の例では、プロモーターは、ＶＥ－カドヘリンプロモーターなどの内皮細胞特異的プロモーターであり得る。更に他の例では、プロモーターはステロイドプロモーター又はメタロチオネインプロモーターであり得る。好ましくは、このプロモーターはヒトプロモーターである。

いくつかの例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、ＦＭＲＰのコード配列に作動可能に連結されたサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターを含み得る。場合によっては、ＣＭＶプロモーターは野生型ＣＭＶプロモーターである。他の例では、ＡＡＶベクターは、ニワトリのベータアクチン遺伝子プロモーターを含み得る。特定の例において、ＡＡＶベクターは、ハイブリッドＣＭＶ／ニワトリベータアクチンプロモーターを含み得る。例えば、ＡＡＶベクターは、ＣＭＶ初期エンハンサーエレメント、プロモーター、ニワトリベータアクチン遺伝子の第１エクソン及び第１イントロン、並びにウサギベータグロビン遺伝子のスプライスアクセプターを含む合成ＣＡＧプロモーターを含み得る。ＣＡＧプロモーターのヌクレオチド配列を以下に提供する：
修飾ＣＡＧ配列（配列番号：２）：

他の例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、ヒトＰＧＫプロモーターなどのＰＧＫプロモーターを含み得る。一例を以下に示す。
ｈＰＧＫプロモーター配列（配列番号：３）

（４）マイクロＲＮＡの標的部位
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、少なくとも１つのｍｉＲＮＡ標的部位（ＭＴＳ）を含み得る。本明細書で使用される場合、「ｍｉＲＮＡ標的部位」又は「ｍｉＲＮＡ標的配列」は、ｍｉＲＮＡが特異的に結合する核酸配列を指す。１つ以上のｍｉＲＮＡ結合部位を含むＡＡＶベクターから転写されたｍＲＮＡの翻訳は、通常、対応するｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ標的部位に結合するとブロック（サイレンシング）され、ｍＲＮＡの不安定化につながる可能性がある。ｍｉＲＮＡ標的部位は、ｍｉＲＮＡがｍｉＲＮＡ標的部位で塩基対を形成できるように、対応するｍｉＲＮＡに（完全に又は部分的に）相補的なヌクレオチド配列を含み得る。いくつかの例では、１つ以上のｍｉＲＮＡ標的部位は、ＦＭＲ１コード配列の３’下流に位置する。その場合、結果として得られるｍＲＮＡは、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）にｍｉＲＮＡ標的配列を含むことになる。

いくつかの例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、非脳組織におけるＦＭＲＰの発現を抑制するための、１つ以上の組織選択的マイクロＲＮＡに特異的な１つ以上のマイクロＲＮＡ標的部位（ＭＴＳ）を含み得る。いくつかの例では、少なくとも１つのＭＴＳは、ＭＴＳを欠くベクターと比較して、非脳組織においてＦＭＲＰを少なくとも２倍、５倍、１０倍、２０倍、５０倍又は１００倍抑制することができる。いくつかの例では、ＡＡＶベクターは、肝臓、肺、膵臓、腎臓、心臓などの非脳器官に特異的なｍｉＲＮＡが結合して、そのような器官におけるＦＭＲ１の発現を遮断することができる少なくとも１つのＭＴＳを含み得る。

いくつかの例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、ｍｉＲ１２２に特異的なＭＴＳを含み得る。ｍｉＲ１２２は肝臓に豊富に存在し、甲状腺、脾臓、肺にも発現している。ｍｉＲ１２２の低レベルの発現は、膵臓、腎臓、及び動脈で観察された。他の例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、ｍｉＲ－２０８ａ又はｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐに特異的なＭＴＳを含み得、これらは、心筋、筋肉において濃縮され、甲状腺においても低レベルで発現される。更に他の例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐに特異的なＭＴＳを含み得、これは、心筋、筋肉、甲状腺、前立腺、及び骨にも富む。本明細書に開示されるＡＡＶベクターで使用するための追加の好適なＭＴＳは、当技術分野で知られており、例えば、Ｌｕｗｉｇら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．４４（８）：３８６５－３８７７（２０１６）に提供されており、その関連する開示は、本明細書に参照される主題及び目的について参照により組み込まれている。特定の例では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、本明細書に開示されるものなどの組織特異的ｍｉＲＮＡ標的部位の組み合わせを含み得る。

（５）その他の遺伝子発現調節エレメント
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、脳細胞におけるＦＭＲＰの発現を調節するために導入遺伝子（ＦＭＲＰをコードする）に作動可能に連結され得る、１つ以上の調節エレメントを更に含み得る。例示的な調節エレメントには、転写開始部位及び／又は終結部位、エンハンサー配列、スプライシング及びポリアデニル化（ポリＡ）シグナルなどの効率的なＲＮＡ処理シグナル、細胞質のｍＲＮＡを安定させる配列、翻訳効率を高める配列（すなわち、コザックコンセンサス配列）、タンパク質の安定性を高める配列；必要に応じて、コード化された産物の分泌を促進する配列が含まれるが、これらに限定されない。天然、構成的、誘導性及び／又は組織特異的を含む多数の発現制御配列が当技術分野で知られており、本開示で利用することができる。

例えば、ＡＡＶベクターは、ＳＶ４０ポリアデニル化配列又はウシ成長ホルモンのポリアデニル化配列などのポリアデニル化配列を含み得る。場合によっては、ＡＡＶベクターは、１つ以上のイントロン配列、１つ以上のポリＡシグナル伝達配列、及び／又は１つ以上の転写後調節エレメントを含み得る。場合によっては、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）など、安全性の懸念を引き起こす可能性のあるエレメントが除外されることがある。

（６）ＡＡＶベクターの代表的な例
いくつかの例において、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲを含み得るＡＡＶウイルス骨格；（ａ）機能的なヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）（例えば、ヒトＦＭＲ１アイソフォーム１）タンパク質（ＦＭＲＰ）をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ＦＭＲＰコード配列に作動可能に連結されたプロモーター、及び（ｄ）１つ以上のマイクロＲＮＡ標的部位（ＭＴＳ）を含み得る。場合によっては、プロモーターはニワトリβ－アクチンプロモーター及びＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーター）のハイブリッドであってもよい。代替的に、又は加えて、１つ以上の組織選択的ｍｉＲＮＡ標的部位は、非脳組織に存在するが脳細胞には存在しない（又はＦＭＲＰの発現が大きく影響を受けないような非常に低いレベルでのみ）１つ以上のｍｉＲＮＡに特異的であり得る。例示的なＭＴＳには、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐ、又はそれらの組み合わせに特異的なものが含まれる。そのようなＡＡＶベクターは、本明細書に開示される調節エレメントのうちの１つ以上を更に含み得る。

他の例では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、（ａ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲ（それらの一方又はそれらの両方のいずれかが切断されている）；（ｂ）野生型ヒトＦＭＲ１アイソフォーム１タンパク質をコードするヌクレオチド配列；（ｃ）ＦＭＲＰをコードするヌクレオチド配列に作動可能に連結されたプロモーターを含む、自己相補的ＡＡＶ（ｓｃＡＡＶ）ベクターである。場合によっては、プロモーターはニワトリβ－アクチンプロモーター及びＣＭＶプロモーター（例えば、ＣＡＧプロモーター）のハイブリッドである。場合によっては、ｓｃＡＡＶは、非脳組織に存在するが脳細胞には存在しない（又はＦＭＲＰの発現が大きく影響を受けないような非常に低いレベルでのみ）１つ以上のｍｉＲＮＡに特異的であり得る、１つ以上のマイクロＲＮＡ標的部位（ＭＴＳ）を更に含み得る。例示的なＭＴＳには、ｍｉＲ－１２２、ｍｉＲ－２０８ａ、ｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐ、又はそれらの組み合わせに特異的なものが含まれる。そのようなｓｃＡＡＶベクターは、本明細書に開示される調節エレメントのうち１つ以上を更に含み得る。

ｓｃＡＡＶベクターは、一般に挿入容量が限られていることが知られている。そのため、このタイプのＡＡＶベクターは、一般的に大きな導入遺伝子には適していないとみなされている。ここでは、ｓｃＡＡＶベクターを使用して、完全長ヒトＦＭＲ１アイソフォーム１のコード配列のクローンを作成し、エンコードされたＦＭＲ１アイソフォーム１タンパク質（ＦＭＲＰアイソフォーム１）を発現させた。このデータは、ｓｃＡＡＶベクターが、遺伝子治療目的で大きな完全長ＦＭＲ１アイソフォーム１タンパク質（ＦＭＲＰアイソフォーム１）を送達する際の使用に適していることを示唆している。

いくつかの例では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲを含むＡＡＶ骨格：（ｉｉ）野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質をコードするヌクレオチド配列；（ｉｉｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結されたプロモーター；（ｉｖ）ＦＭＲＰの発現を調節する１つ以上の調節エレメントを含む、標準的な（通常の）ＡＡＶベクターであり得る。プロモーターは、本明細書に開示されるＣＡＧプロモーターであり得る。代替的に、プロモーターは、本明細書にも開示されているように、ＰＧＫプロモーターであり得る。場合によっては、ＡＡＶベクターは、１つ以上のイントロン配列（例えば、ヒトβグロビンイントロン配列）、１つ以上のポリＡシグナル伝達配列（例えば、ＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列、ヒトβグロビンポリＡシグナル伝達配列、又はそれらの組み合わせ）であり得る１つ以上の調節エレメント、１つ以上の転写後調節エレメント（例えば、ＷＲＰＥ）、又はそれらの組み合わせを含む。他の例では、本明細書で提供されるＡＡＶベクターは、安全性を改善するためにＷＲＰＥなどを含まなくてもよい。

本明細書に開示されるＡＡＶベクターの特定の例は、以下の実施例１に提供される。

（Ｃ）ＡＡＶウイルス粒子の血清型
ＡＡＶウイルス粒子は、脳細胞に感染できる好適な血清型のものであり得る。これまでに確認されたＡＡＶウイルスの血清型は１１種類ある。これらの血清型は、感染する細胞の種類が異なる。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶウイルス粒子は、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ４、ＡＡＶ５、ＡＡＶ８、又はＡＡＶ９であり得、これらは全て脳細胞に感染することができる。いくつかの例では、ＡＡＶウイルス粒子はＡＡＶ９である。

いくつかの例では、ＡＡＶウイルス粒子は、１つの血清型からのゲノムエレメント及び少なくとも別の血清型からのカプシドを含むハイブリッドＡＡＶであり得る。例えば、ＡＡＶベクターは、ＡＡＶ２由来のゲノムエレメント（例えば、ＡＡＶ２ ＩＴＲ、野生型又は修飾バージョン）及び脳細胞に感染可能な血清型の１つ由来のカプシド（例えば、ＡＡＶ９）を含み得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＡＡＶウイルス粒子は、例えば、非ウイルスタンパク質又はペプチドによって、又は構造修飾によって修飾されたカプシドを含み、ＡＡＶウイルス粒子の向性を変化させて脳細胞に感染できるようにすることができる。例えば、カプシドは、脳細胞受容体（例えば、脳細胞特異的受容体）のリガンドを含んでもよく、それを含むＡＡＶウイルス粒子が脳細胞を標的にしてこれに感染し得る。

（Ｄ）ＡＡＶ粒子の作製方法
本明細書に開示されるＡＡＶ ＤＮＡベクター構築物は、既知の技術、例えば組換え技術を使用して調製され得る。例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｕｓｕｂｅｌ．，Ｆ．ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ，Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ１９９５）を参照されたい。場合によっては、導入遺伝子及び調節エレメントのサイズは、ＡＡＶ粒子のパッケージング容量を満たすように設計することができる。必要に応じて、「スタッファー」ＤＮＡ配列をコンストラクトに追加して、比較目的で標準的なＡＡＶゲノムサイズを維持することができる。このようなフラグメントは、当業者に知られており、利用可能な非ウイルス源に由来し得る。

ＡＡＶ ＤＮＡベクターは、ウイルス粒子にパッケージ化され得、発現のために導入遺伝子を宿主細胞に送達するために使用され得る。例えば、本明細書に開示されるＡＡＶベクターは、ＡＡＶビリオンパッケージに必要なカプシドタンパク質などのウイルスタンパク質を産生できるプロデューサー細胞株（パッケージング細胞）にトランスフェクトすることができる。

パッケージング細胞株は、ＡＡＶ粒子産生に必要な全ての成分、例えばＡＡＶ ｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子、及び任意選択でネオマイシン耐性遺伝子などの選択マーカーで安定にトランスフェクトされた細胞株を確立することによって生成され得る。例えば、Ｓａｍｕｌｓｋｉら、１９８２年、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓ６．ＵＳＡ，７９：２０７７－２０８１を参照されたい。場合によっては、パッケージング細胞株は、ＡＡＶウイルス粒子の産生において、アデノウイルスなどのヘルパーウイルスに感染する可能性がある。この方法の利点は、細胞が選択可能であり、ｒＡＡＶの大規模生産に好適である。好適な方法の他の例は、ｒＡＡＶゲノム及び／又はｒｅｐ及びｃａｐ遺伝子をパッケージング細胞に導入するために、プラスミドではなくアデノウイルス又はバキュロウイルスを使用する。ｒＡＡＶ産生の一般原則は、例えば、Ｃａｒｔｅｒ，１９９２，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｏｐｉｎｉｏｎｓ ｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１５３３－５３９；ａｎｄ Ｍｕｚｙｃｚｋａ，１９９２，Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐｉｃｓ ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉａｌ． ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１５８：９７－１２９）で考察されている。様々なアプローチが、Ｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．４：２０７２（１９８４）；Ｈｅｒｍｏｎａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８１：６４６６（１９８４）；Ｔｒａｔｓｃｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏ１．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．５：３２５１（１９８５）；ＭｃＬａｕｇｈｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６２：１９６３（１９８８）；及びＬｅｂｋｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，１９８８ Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，７：３４９（１９８８）．Ｓａｍｕｌｓｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９８９，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．，６３：３８２２－３８２８）；米国特許第５，１７３，４１４号；ＷＯ９５／１３３６５号及び対応する米国特許第５，６５８．７７６号；ＷＯ９５／１３３９２；ＷＯ９６／１７９４７；ＰＣＴ／ＵＳ９８／１８６００；ＷＯ９７／０９４４１（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１４４２３）；ＷＯ９７／０８２９８（ＰＣＴ／ＵＳ９６／１３８７２）；ＷＯ９７／２１８２５（ＰＣＴ／ＵＳ９６／２０７７７）；ＷＯ９７／０６２４３（ＰＣＴ／ＦＲ９６／０１０６４）；ＷＯ９９／１１７６４；Ｐｅｒｒｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｖａｃｃｉｎｅ １３：１２４４－１２５０；Ｐａｕｌ ｅｔ ａｌ．（１９９３）Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ４：６０９－６１５；Ｃｌａｒｋ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ３：１１２４－１１３２；米国特許第５，７８６，２１１号；米国特許第５，８７１，９８２号；及び米国特許第６，２５８，５９５号に記載されている。

ＩＩ．医薬組成物
本明細書に開示されるＡＡＶウイルス粒子（例えば、ＡＡＶ９ウイルス粒子）のいずれかを処方して、薬学的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を更に含み得る医薬組成物を形成し得る。本方法で使用される医薬組成物のいずれも、凍結乾燥製剤又は水溶液の形態で、薬学的に許容される担体、賦形剤、又は安定剤を含むことができる。

医薬組成物中の担体は、組成物の活性成分と適合性があり、好ましくは活性成分を安定化でき、治療対象に有害でないという意味で「許容可能」でなければならない。例えば、「薬学的に許容される」とは、哺乳動物（例えば、ヒト）に投与された場合に生理学的に許容され、典型的に有害な反応を引き起こさないものを含む組成物の分子実体及び他の成分を指し得る。いくつかの例では、本明細書に開示される医薬組成物に使用される「薬学的に許容される」担体は、連邦又は州政府の規制機関によって承認されたもの、又はＵ．Ｓ．Ｐｈａｒｍａｃｏｐｅｉａ又はその他の一般に認められた哺乳動物、特にヒトでの使用のための薬局方にリストされたものであり得る。

緩衝剤を含む薬学的に許容される担体は、当技術分野で周知であり、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸；アスコルビン酸及びメチオニンを含む抗酸化物質；防腐剤；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；アミノ酸；疎水性ポリマー；単糖；二糖類；及び他の炭水化物；金属錯体；及び／又は非イオン性界面活性剤を含み得る。例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ：Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ２０^ｔｈ Ｅｄ．（２０００）Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｅｄ．Ｋ．Ｅ．Ｈｏｏｖｅｒ．を参照されたい。

いくつかの実施形態では、医薬組成物又は製剤は、静脈内、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、又はそれらの組み合わせなどの非経口投与用である。そのような薬学的に許容される担体は、水及び油などの無菌液体であり得、石油、動物、植物又は合成起源のものを含み、例例えばピーナッツ油、大豆油、鉱物油がある。生理食塩水及び水性デキストロース、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びグリセロール溶液も、特に注射用溶液の液体担体として使用できる。本明細書に開示される医薬組成物は、追加の成分、例えば防腐剤、緩衝剤、等張化剤、抗酸化剤及び安定剤、非イオン性湿潤剤又は清澄剤、増粘剤などを更に含んでもよい。本明細書に記載の医薬組成物は、単一の単位用量又は多用量形態で包装することができる。

非経口投与に好適な製剤には、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤、及び意図するレシピエントの血液と製剤を等張にする溶質を含み得る水性及び非水性の滅菌注射液、並びに懸濁剤及び増粘剤を含み得る水性及び非水性滅菌懸濁液が含まれる。水溶液は、適切に緩衝化され得る（好ましくは、ｐＨ３～９）。無菌条件下での好適な非経口製剤の調製は、当業者に周知の標準的な製薬技術によって容易に達成される。

インビボ投与に使用される医薬組成物は無菌でなければならない。これは、例えば、無菌濾過膜による濾過によって容易に達成される。滅菌注射溶液は、一般に、必要に応じて、上記に列挙した様々な他の成分を含む適切な溶媒に必要量のＡＡＶ粒子を組み込み、続いてフィルター滅菌することによって調製される。一般に、分散液は、滅菌活性成分を、基本的な分散媒体及び上に列挙したものからの必要な他の成分を含む滅菌ビヒクルに組み込むことによって調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥及び凍結乾燥技術であり、事前に滅菌濾過されたその溶液から、有効成分に加えて任意の追加の所望の成分の粉末が得られる。

本明細書に開示される医薬組成物はまた、希釈剤及びアジュバントなどの他の成分を含み得る。許容される担体、希釈剤、及びアジュバントは、レシピエントに対して非毒性であり、使用される用量及び濃度で不活性であることが好ましく、リン酸、クエン酸、又は他の有機酸などの緩衝剤；アスコルビン酸などの抗酸化物質；低分子量ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドンなどの親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン、リシンなどのアミノ酸；単糖類、二糖類、及びグルコース、マンノース、又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡなどのキレート剤；マンニトール又はソルビトールなどの糖アルコール；ナトリウムなどの塩形成対イオン；及び／又はＴｗｅｅｎ、プルロニック又はポリエチレングリコールなどの非イオン性界面活性剤を含む。

ＩＩＩ．ＦＭＲＰを生成するＡＡＶ粒子によるＦＸＳの処理
本明細書に開示されるように、ＦＭＲＰをコードするウイルスベクターを担持するＡＡＶ粒子のいずれかを使用して、ＦＭＲＰ発現のために脳細胞にＦＭＲＰをコードする導入遺伝子を送達して、ＦＸＳに関連する１つ以上の症状を緩和することができる。したがって、いくつかの態様において、本開示は、本明細書に開示されるＡＡＶ９粒子などの複数のＡＡＶ粒子の治療を必要とする対象において、１つ以上の症状を軽減するための、及び／又はＦＸＳを治療するための方法、並びに以下を含む医薬組成物を提供する。本明細書に開示される方法を実施するために、有効量のＡＡＶ粒子又はそれを含む医薬組成物を、適切な経路（例えば、静脈内、脳室内注射、大槽内注射、又は実質内注射）を介して本明細書に開示される好適な量で、治療を必要とする対象に投与することができる。

本明細書で使用される場合、「治療する」という用語は、治療を必要とする、例えば、標的疾患又は障害、疾患／障害の症状、又は疾患／障害に対する素因を有する対象に対し、障害、疾患の症状、疾患又は障害に対する素因を治す、癒す、緩和する、軽減する、変更する、治療する、改良する、改善する、又は影響を与えることを目的として、１つ以上の活性剤を含む組成物を適用又は投与することを指す。

標的疾患／障害の緩和には、疾患の発症又は進行を遅らせること、又は疾患の重症度を軽減することが含まれる。疾患を緩和するために、必ずしも治療結果が必要なわけではない。本明細書で使用される場合、標的疾患又は障害の発症を「遅らせる」とは、疾患の進行を遅らせ、妨げ、遅くし、遅らせ、安定させ、及び／又は延期することを意味する。この遅延は、病歴及び／又は治療を受けている個人に応じて、様々な長さになる可能性がある。疾患の発症を「遅らせる」又は緩和する方法、又は疾患の発病を遅らせる方法は、方法を使用しない場合と比較して、特定の時間枠内で疾患の１つ以上の症状を発症する可能性を減らし、及び／又は症状の程度を減らす方法である。このような比較は、通常、統計的に有意な結果を得るのに十分な数の対象を使用した臨床研究に基づいている。

疾患の「発症」又は「進行」は、疾患の初期症状及び／又はその後の進行を意味する。疾患の発症は、当技術分野で周知の標準的な臨床技術を使用して検出及び評価することができる。ただし、発症は、検出できない可能性のある進行も指す。本開示の目的上、発症又は進行は、症状の生物学的経過を指す。「発症」には、発生、再発、及び発病が含まれる。本明細書で使用される場合、標的疾患又は障害の「発病」又は「発生」には、最初の発症及び／又は再発が含まれる。

本明細書に開示される方法のいずれかによって治療される対象は、ＦＸＳを有するヒト患者であり得、この者は、例えば臨床検査、器官機能検査、行動検査、ＣＴスキャン、脳波図、及び／又は共鳴画像法（ＭＲＩ）などの定期的な健康診断によって特定され得る。ＦＸＳ患者は通常、ＦＭＲ１遺伝子に１つ以上の遺伝子変異があり、通常、ＦＭＲＰとも呼ばれる脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）と呼ばれるタンパク質を生成する。脆弱Ｘ症候群のほぼ全ての症例は、ＣＧＧトリプレットリピートとして知られるＤＮＡセグメントがＦＭＲ１遺伝子内で拡張される変異によって引き起こされる。通常、このＤＮＡセグメントは５回から約４０回繰り返される。ＦＸＳ患者では、ＣＧＧセグメントが２００回以上繰り返される。異常に拡大したＣＧＧセグメントは、ＦＭＲ１遺伝子をオフ（サイレンス）にし、遺伝子がＦＭＲＰを生成するのを防ぐ。ＣＧＧセグメントが５５～２００回繰り返される男性及び女性は、ＦＭＲ１遺伝子の前変異があると言われている。この前変異を持つほとんどのヒトは、知的に正常である。ただし、場合によっては、前変異を持つ個人のＦＭＲＰの量が通常よりも少ないことがある。その結果、ＦＸＳに見られる物理的特徴の軽度のバージョンが含まれている可能性がある。ＦＸＳは、Ｘ連鎖優性パターンで継承される。各細胞の変化した遺伝子の１つのコピーが状態を引き起こすのに十分である場合、遺伝は優性である。Ｘ連鎖優性とは、女性（２つのＸ染色体を持つ）では、各細胞の遺伝子の２つのコピーのうちの１つの変異が障害を引き起こすのに十分であることを意味する。男性（Ｘ染色体を１つしか持っていない）では、各細胞にある遺伝子の唯一のコピーの変異がこの障害を引き起こす。ほとんどの場合、男性は女性よりも障害のより深刻な症状を経験する。

いくつかの実施形態では、対象は、ヒト小児ＦＸＳ患者であってもよい。いくつかの実施形態では、対象は、男性のヒト小児ＦＸＳ患者であってもよい。このような小児患者は、１６歳未満の場合がある。いくつかの例では、小児患者は、１２歳未満、例えば、１０歳、８歳、６歳、４歳、又は２歳未満の年齢を有し得る。いくつかの例では、小児患者は乳児であり、例えば１２ヶ月未満、例えば６ヶ月以下である。代替的に、対象は、青年期のヒト患者（例えば、１６～２０歳）又はＦＸＳを有する成人のヒト患者であってもよい。

代替的に、又は加えて、本明細書に開示される方法で治療されるＦＸＳ患者は、ＦＭＲ１遺伝子内に拡張されたＣＧＧセグメントを担持し得る。いくつかの例では、ＦＸＳ患者は、ＦＭＲ１遺伝子内で２００回を超えて繰り返される拡張されたＣＧＧセグメントを担持し得る。いくつかの例では、ＦＸＳ患者は、ＦＭＲ１遺伝子にＸ連鎖変異を有する男性患者であり得る。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのＦＭＲ１遺伝子順列変異を有するＦＸＳを有する疑いがある、又は有するリスクがある患者は、本明細書に開示される方法で治療され得る。次世代シーケンシング、ピロシーケンシング、サンガーシーケンシング、全エクソームシーケンシング、全ゲノムシーケンシングなどを含むがこれらに限定されないルーチンの世代シーケンシング法を使用して、候補対象に対して遺伝子検査を行うことができる。

代替的に、又は加えて、本明細書に開示されるバイオマーカー（例えば、ＥＥＧ）のうちの１つ以上を、本明細書に開示される治療に好適なＦＸＳ患者を特定するために使用することができる。

本明細書に開示される方法のいずれにおいても、ＦＸＳに関連する１つ以上の症状を緩和するために、有効量のＡＡＶウイルス粒子をＦＸＳ患者に投与することができる。場合によっては、ＦＸＳに関連する症状は、行動、認知神経リハビリテーション、又はそれらの組み合わせである可能性がある。いくつかの例では、ＦＸＳの症状は、不安に関連した固執的な行動、社会的行動、学習、記憶、又はそれらの組み合わせである可能性がある。

もちろん、そのような量は、治療される特定の状態、状態の重症度、年齢、身体状態、体格、性別及び体重を含む個々の患者パラメータ、治療期間、同時治療の性質（もしあれば）、特定の投与経路、及び医療従事者の知識と専門知識の範囲内の同様の要因に依存する。有効量は、ＦＸＳを有する対象間の表現型の多様性、及び／又は関与する遺伝子変異によっても異なる。本明細書におけるＡＡＶウイルス粒子の力価は、約１×１０^６、約１×１０^７、約１×１０^８、約１×１０^９、約１×１０^１０、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約１×１０^１３～約１×１０^１４又はそれ以上のＤＮａｓｅ耐性粒子（ＤＲＰ）／ｍｌの範囲であり得る。投与量は、ウイルスゲノム（ｖｇ）の単位で表すこともできる。投与量は、ＦＸＳのヒトへの投与のタイミングによっても異なる。ＡＡＶベクターのこれらの投与量は、成人の体重１ｋｇ当たり、約１×１０^１１ｖｇ／ｋｇ、約１×１０^１２、約１×１０^１３、約１×１０^１４、約１×１０^１５、約１×１０^１６、又はそれ以上のウイルスゲノムの範囲であり得る。新生児の場合、ＡＡＶベクターの投与量は、１ｋｇ体重当たり、約１×１０^１１、約１×１０^１２、約３×１０^１２、約１×１０^１３、約３×１０^１３、約１×１０^１４、約３×１０^１４、約１×１０^１５、約３×１０^１５、約１×１０^１６、約３×１０^１６、又はそれ以上のウイルスゲノムの範囲であり得る。このような量は、例えば、投与後の複数の時点でウイルスの血中レベルを調べて、投与量が適切かどうかを決定するなど、日常的な実践に従い、当業者によって決定することができる。

場合によっては、ＡＡＶウイルス粒子は、複数回投与によって対象に投与され得る。いくつかの例では、複数回投与は、同じ経路又は異なる経路を介して結果として対象に投与することができる。他の例では、複数回投与は、異なる経路、例えば本明細書に開示されている経路を介して、対象に同時に投与することができる。

医学分野の当業者に知られている従来の方法を使用して、ＡＡＶ９粒子含有医薬組成物をＦＸＳ対象に投与することができる。例えば、静脈内注射、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、又はそれらの組み合わせなどにより、この医薬組成物を非経口的に投与することもできる。いくつかの実施形態では、ＡＡＶ粒子含有医薬組成物を少なくとも２つの投与経路を介してヒト患者に投与することができる。いくつかの例では、投与経路の組み合わせは、脳室内注射及び静脈内注射であり得る。いくつかの例では、投与経路の組み合わせは、髄腔内注射及び静脈内注射であり得る。いくつかの例では、投与経路の組み合わせは、大槽内注射及び静脈内注射であり得る。いくつかの例では、投与経路の組み合わせは、実質内注射及び静脈内注射であり得る。

いくつかの実施形態では、本明細書に記載の方法によって治療される対象は、別の抗ＦＸＳ療法を受けたか、又は受けているヒト患者であり得る。以前の抗ＳＦＸＳ療法が完了している場合がある。代替的に、抗ＦＸＳ療法がまだ進行中の場合もある。他の実施形態では、ＦＸＳ患者は、本明細書に開示されるＡＡＶ９粒子療法及び第２の抗ＦＸＳ療法を含む併用療法を受けることができる。抗ＦＸＳ治療には、行動異常、発作の治療、言語療法、理学療法などが含まれるが、これらに限定されない。例示的な抗ＦＸＳ治療には、ＧＡＢＡ受容体アゴニスト、ＰＩ３Ｋアイソフォーム選択的阻害剤、ＭＭＰ９アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせを含む治療が含まれるが、これらに限定されない。追加の有用な薬剤及び療法は、Ｐｈｙｓｉｃｉａｎ’ｓ Ｄｅｓｋ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ，５９．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００５），Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｐ Ｄ Ｒ，Ｍｏｎｔｖａｌｅ Ｎ．Ｊ．；Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ． Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ ２０．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２０００），Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ ａｎｄ Ｗｉｌｋｉｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ Ｍｄ．；Ｂｒａｕｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｈａｒｒｉｓｏｎ’ｓ Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，１５．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ，（２００１），ＭｃＧｒａｗ Ｈｉｌｌ，ＮＹ；Ｂｅｒｋｏｗ ｅｔ ａｌ．，Ｅｄｓ．Ｔｈｅ Ｍｅｒｃｋ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｈｅｒａｐｙ，（１９９２），Ｍｅｒｃｋ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒａｈｗａｙ Ｎ．Ｊ．に見ることができる。

いくつかの実施形態では、ＡＡＶ９粒子などのＡＡＶ粒子又はその薬理学的組成物の投与量は、治療に対するＦＸＳ患者の応答に基づいて調整され得る。例えば、ＦＸＳ患者が１つ以上の行動特徴（例えば、行動及び／又は認知活動）の悪化を示す場合、ＡＡＶ粒子の用量を減らすことができる。代替的に、ＦＸＳ患者がＦＸＳ症状の明確な改善を示さない場合、ＡＡＶ粒子の投与量を増やしてもよい。個々のＦＸＳ患者におけるＡＡＶ９粒子の好適な用量及び／又は治療効果を評価するためのバイオマーカーとして行動特徴の使用については、以下の説明を参照されたい。

ＩＶ．個々のＦＸＳ患者に対するＡＡＶ９粒子の個別化された用量の決定のためのＥＥＧ及び行動特徴バイオマーカーの使用
本明細書に開示される治療方法のいずれかにおいて、本明細書に開示される１つ以上のバイオマーカーは、好適な患者を特定するため、個別化されたＡＡＶ粒子投与量を決定するため、及び／又は治療効果を評価するために使用され得る。本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、ＦＸＳ患者の臨床的特徴、例えば、疾患の表現型の重症度、治療に対する患者の応答性などに関する情報を提供する指標（１つの因子又は因子の組み合わせ）を指す。バイオマーカーには、ＥＥＧ（例えば、長期増強、すなわちＬＴＰ）、１つ以上の行動特徴（例えば、動揺、又は記憶障害）、又はそれらの組み合わせが含まれる。ＦＭＲＰはシナプスタンパク質であり、そのレベル及び／又は分布は脳内の神経活動のレベルと相関している。ＦＭＲＰが失われると、ＬＴＰのしきい値が増加し、ＥＥＧを使用して測定及び記録できる異常な神経活動が発生する。したがって、ＥＥＧを使用してＦＭＲＰのレベル及び／又は分布を監視することができ、それによってＦＸＳ患者の診断及び治療効果の評価に利益をもたらす。

いくつかの実施形態では、脳波図（ＥＥＧ）によって評価される長期増強（ＬＴＰ）パターンは、ＦＸＳを治療する方法で使用するための本明細書に開示されるＡＡＶ９粒子などのＡＡＶ粒子の好適な用量を評価及び決定するためのバイオマーカーとして使用することができる。いくつかの例では、ＡＡＶ粒子の初期用量の投与後、ＥＥＧを使用してＦＸＳ患者のＬＴＰパターンを監視することができる。ＡＡＶ９粒子の初期用量がＦＸＳ患者のＬＴＰパターンに影響を示さない場合、ＡＡＶ９粒子の用量を維持又は増加させることができる。

他の実施形態では、動揺は、本明細書に開示される方法で使用する、又は治療効果を評価するためのＡＡＶ９粒子の好適な用量を評価及び決定するバイオマーカーとして使用することができる。動揺とは、不安に関連した固執的な行動として示される不安又は神経興奮の状態を指す。ＡＡＶ粒子の初期用量の投与後、ＦＸＳ患者における動揺の発症及び／又は進行は、日常的な実践又は本明細書で提供される方法に従って監視され得る。ＦＸＳ患者が動揺を発症するか、動揺が進行しているか、不安感が強まる場合、ＡＡＶ粒子の投与量を減らすことができる。代替的に、ＡＡＶ粒子の初期用量がＦＸＳ患者の動揺の発症をもたらさないか、又は動揺を緩和／軽減する場合、これは初期用量のＡＡＶ９粒子が有効であることを示す。ＡＡＶ粒子の用量は、維持又は増加され得る。

他の実施形態では、記憶障害は、本明細書に開示される方法で使用するため、又は治療効果を評価するためのＡＡＶ９粒子の好適な用量を評価及び決定するバイオマーカーとして使用することができる。記憶障害は、短期記憶によって示されるように、ＦＸＳ患者の学習能力の欠如を指す。ＡＡＶ粒子の初期用量の投与後、ＦＸＳ患者における記憶障害の発症及び／又は進行は、日常的な実践又は本明細書に提供される方法に従って監視され得る。ＦＸＳ患者が記憶障害を発症するか、又は記憶障害が進行している場合、ＡＡＶ粒子の投与量を減らすことができる。代替的に、ＡＡＶ粒子の初期用量がＦＸＳ患者の記憶障害の発症をもたらさないか、又は記憶障害を改善しない場合、これは初期用量のＡＡＶ９粒子が有効であることを示す。ＡＡＶ粒子の用量は、維持又は増加され得る。

本明細書に開示されるＥＥＧ及び／又は行動特徴バイオマーカーのうちの１つ以上を使用して、個々のＦＸＳ患者についてＡＡＶ粒子の好適な用量を決定することができる。

本明細書に開示される１つ以上のＥＥＧ及び／又は行動特徴バイオマーカーは、本明細書に開示されるＡＡＶ粒子が関与する治療の治療効果を評価するためにも使用することができる。このような評価は、更なる治療戦略の決定に役立つ可能性がある。例えば、ＡＡＶを介したＦＭＲ１遺伝子治療を継続する、ＡＡＶを介したＦＭＲ１遺伝子治療を変更する（用量の変更、投与間隔など）、ＡＡＶを介したＦＭＲ１遺伝子治療を別の抗ＦＸＳ療法と組み合わせる、又はＡＡＶを介したＦＭＲ１遺伝子治療を終了するなどである。

Ｖ．ＦＸＳ治療に使用するキット
本開示は、本明細書に記載のＦＸＳの治療に使用するためのキットも提供する。本明細書に記載の治療用キットは、医薬組成物に製剤化された、本明細書に記載のＡＡＶ９粒子などのＡＡＶ粒子を含む１つ以上の容器を含み得る。

いくつかの実施形態では、キットは、追加的に、本明細書に記載の方法のいずれかにおけるＡＡＶ粒子の使用説明書を含むことができる。含まれる説明書は、対象において意図された活性を達成するための対象へのＡＡＶ粒子又はそれを含む医薬組成物の投与の説明を含み得る。キットは、対象が治療を必要としているかどうかの識別に基づいて、治療に好適な対象を選択する説明を更に含んでもよい。いくつかの実施形態では、使用説明書は、ＦＸＳを有するか又は有する疑いのある対象にラパマイシン化合物又はそれを含む医薬組成物を投与することの説明を含む。

本明細書に記載のＡＡＶ粒子の使用に関する使用説明書は、一般に、意図する治療のための投与量、投与スケジュール、及び投与経路に関する情報を含む。いくつかの実施形態では、使用説明書は、ＦＸＳを有する対象におけるラパマイシンの投与量をバイオマーカーとして１つ以上の行動特徴、例えば本明細書に記載のものを使用して最適化することの説明を含む。容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば複数用量パッケージ）又はサブユニット用量であり得る。本開示のキットで提供される使用説明書は、典型的には、ラベル又は添付文書に記載された使用説明書である。ラベル又は添付文書は、医薬組成物が、対象の疾患又は障害を治療する、発病を遅らせる、及び／又は緩和するために使用されることを示す。

本明細書で提供されるキットは、好適なパッケージに入っている。好適なパッケージには、バイアル、ボトル、ジャー、柔軟なパッケージなどが含まれるが、これらに限定されない。吸入器、経鼻投与装置、又は注入装置などの特定の装置と組み合わせて使用するためのパッケージも企図される。キットは、無菌のアクセスポートを有してもよい（例えば、容器は、静脈内溶液バッグ又は皮下注射針が突き刺すことができるストッパーを有するバイアルであってもよい）。容器は無菌アクセスポートを有してもよい。

キットは、任意に緩衝剤や解釈情報などの追加コンポーネントを提供する場合がある。通常、キットは、容器、及び容器上若しくは容器に付随するラベル又は添付文書を含む。いくつかの実施形態では、本開示は、上記のキットの内容物を含む製品を提供する。

いくつかの実施形態では、キットは、本明細書に開示される１以上のＡＡＶベクターを含む。いくつかの例では、キットは、追加的に、本明細書に開示されるＡＡＶベクターと組み合わせて使用される１つ以上のヘルパーベクターを含むことができる。いくつかの例では、キットは、本明細書に開示されるＡＡＶベクターとの使用に好適な宿主細胞を含み得る。キットは、本明細書に記載の方法に従ってＡＡＶベクターを使用するための使用説明書を更に含むことができる。

一般的なテクニック
本開示の実施は、別段の指示がない限り、当業者の範囲内である分子生物学（組換え技術を含む）、微生物学、細胞生物学、生化学、及び免疫学の従来の技術を使用する。このような技術は、例えば以下の文献に十分に説明されている：Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，１９８９）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．１９８４）；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｎｏｔｅｂｏｏｋ（Ｊ．Ｅ．Ｃｅｌｌｉｓ，ｅｄ．，１９８９）Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．１９８７）；Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｊ．Ｐ．Ｍａｔｈｅｒ ａｎｄ Ｐ．Ｅ．Ｒｏｂｅｒｔｓ，１９９８）Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ；Ｃｅｌｌ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ：Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｏｃｅｄｕｒｅｓ（Ａ．Ｄｏｙｌｅ，Ｊ．Ｂ．Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ，ａｎｄ Ｄ．Ｇ．Ｎｅｗｅｌｌ，ｅｄｓ．１９９３－８）Ｊ．Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ；Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ａｎｄ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）：Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ａｎｄ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．１９８７）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ，ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｊ．Ｅ．Ｃｏｌｉｇａｎ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９１）；Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，１９９９）；Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ（Ｃ．Ａ．Ｊａｎｅｗａｙ ａｎｄ Ｐ．Ｔｒａｖｅｒｓ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｐ．Ｆｉｎｃｈ，１９９７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃｅ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｄ．Ｃａｔｔｙ．，ｅｄ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，１９８８－１９８９）；Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ ａｐｐｒｏａｃｈ（Ｐ．Ｓｈｅｐｈｅｒｄ ａｎｄ Ｃ．Ｄｅａｎ，ｅｄｓ．，Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ，２０００）；Ｕｓｉｎｇ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ（Ｅ．Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｄ．Ｌａｎｅ（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，１９９９）；Ｔｈｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ（Ｍ．Ｚａｎｅｔｔｉ ａｎｄ Ｊ．Ｄ．Ｃａｐｒａ，ｅｄｓ．Ｈａｒｗｏｏｄ Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，１９９５）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｖｏｌｕｍｅｓ Ｉ ａｎｄ ＩＩ（Ｄ．Ｎ．Ｇｌｏｖｅｒ ｅｄ．１９８５）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ ｅｄｓ．（１９８５＞＞；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ＆ Ｓ．Ｊ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．（１９８４＞＞；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８６＞＞；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ（ｌＲＬ Ｐｒｅｓｓ，（１９８６＞＞；ａｎｄ Ｂ．Ｐｅｒｂａｌ，Ａ ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ Ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）；Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ．）．

更に詳しく説明しなくても、当業者は、上記の説明に基づいて、本発明を最大限に利用できると考えられる。したがって、以下の特定の実施形態は、単なる例示として解釈されるべきであり、決して本開示の残りの部分を限定するものではない。本明細書で引用される全ての刊行物は、本明細書で参照される目的又は主題のために参照により組み込まれる。

本開示は、その特定の実施形態を参照して説明されてきたが、本開示の真の趣旨及び範囲から逸脱することなく、様々な変更を行うことができ、均等物を代用することができることを当業者は理解すべきである。加えて、特定の状況、材料、物質の組成、プロセス、プロセスステップを、本開示の目的、趣旨、及び範囲に適合させるために、多くの修正を行うことができる。そのような修正は全て、本開示の範囲内にあることを意図している。

実施例１．ＦＭＲＰを発現するＡＡＶベクターの開発
脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）は、脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲ１）遺伝子のＣＧＧリピートの拡大によって引き起こされる単遺伝性症候群であり、その結果、遺伝子産物である脆弱Ｘ精神遅滞タンパク質（ＦＭＲＰ）が失われ、遺伝性知的障害の主な原因となる。単一遺伝子疾患は、理論的には単一遺伝子の修正が生物全体を救う可能性がある遺伝子治療の特に魅力的な標的であるため、ＦＸＳ患者のＦＭＲＰ発現を回復するためのアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）の開発は、有用な治療戦略となる可能性がある。

ヒトＦＭＲＰ（アイソフォーム１）を産生できるＣＮＳ標的ＡＡＶベクターを設計し、クローニングした。具体的には、ＦＭＲＰ又はＧＦＰ（対照としての緑色蛍光タンパク質）を発現する２つの異なるウイルスベクターが開発された：（１）自己相補的ＡＡＶベクター（ｓｃＡＡＶ；ＤＮＡ合成の必要性を回避）（図１Ａ）及び（２）通常のＡＡＶベクター（図２Ａ）である。ｓｃＡＡＶベクター、ｓｃＡＡＶ９－ＣＢ－ＦＭＲ１は、ｓｃＡＡＶ骨格に基づいており、ハイブリッドＣＭＶエンハンサー／ベータ－アクチンプロモーターＣＢの制御下にあるヒトＦＭＲ１コード配列を含んでいた（図１Ａ）。通常のＡＡＶベクターであるＡＡＶ－ＣＡＧＦＭＲ１は、ＣＢプロモーター（別名ＣＡＧプロモーター）の制御下にあるヒトＦＭＲ１コード配列を含む（図２Ａ）。ウイルスは、前脳ニューロンの最適な形質導入のためにＡＡＶ９向性を付与するために生成され、ＦＭＲ１挿入フラグメントのサイズは約３キロベース（ｋｂ）であった。

両方のベクターは、一次海馬及び／又は皮質マウスニューロンでテストされ、用量依存的に完全長ＦＭＲＰタンパク質を発現することが示された。具体的には、初代培養マウス皮質ニューロンを、８回目の細胞分裂で、１、２、５、又は１０μｌのｓｃＡＡＶ９－ＣＢ－ＦＭＲ１、ｓｃＡＡＶ９－ＣＢ－ＧＦＰ、又はｓｃＡＡＶ９－ＣＢｆｌａｇ－ＦＭＲ１ウイルス粒子で形質導入した。１３回目の細胞分裂の後、細胞を回収し、ウエスタンブロット分析に供した。図１Ｂは、フラグタグ付きＦＭＲ１及びタグなしＦＭＲＰの両方の用量依存的発現を示している。追加的に、初代培養マウス海馬ニューロンに、１ｍｌ当たり３、１．５、０．８、又は０．４のウイルスゲノム（ｖｇ／ｍｌ）のＡＡＶ－ＣＡＧＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを形質導入し、続いてウエスタンブロット分析を行った。図２Ｂは、それぞれＡＡＶ－ＣＡＧＦＭＲ１及びＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰ形質導入細胞におけるＦＭＲＰ及び対照ＧＦＰタンパク質の両方の用量依存的発現を示す。

ＦＭＲ１及びＧＦＰのｍＲＮＡ発現は、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰの１ｍｌ当たり３、１．５、又は０．３ウイルスゲノム（ｖｇ／ｍｌ）で形質導入された初代培養マウス海馬ニューロンでも測定された。図２Ｃは、それぞれＡＡＶ－ＣＢ－ＦＭＲ１及びＡＡＶ－ＣＢ－ＧＦＰ形質導入細胞におけるＦＭＲ１ ｍＲＮＡ及び対照ＧＦＰｍＲＮＡの両方の用量依存的発現を示す。

ＦＭＲ１の発現及び安全性を最適化するために、３つの追加のベクターが開発された。これらの追加のベクターを構築するために、ＦＭＲ１導入遺伝子を、カナマイシン耐性遺伝子を担持するベクター骨格中にクローニングした。追加的に、導入遺伝子はスタッファー配列に隣接しており、そうでなければパッケージ化される可能性のある細菌配列によるプラスミド骨格のパッケージングを減らす。このベクターを使用して生成された構築物は以下の通りである：（１）ｐＴＲ１３０－ｍＣＡＧ－ｈｕＦＭＲＰ－ＷＰＲＥ－ＳＶ４０ｐＡ（以下、「ＣＡＧＷＰＲＥ」ベクター）（図１５参照）（配列番号４）であって、上記のベクター骨格内のＡＡＶ－ＣＡＧＦＭＲ１と同一の導入遺伝子を含むもの；（２）ｐＴＲ１３０－ｍＣＡＧ－ｈｕＦＭＲＰ－ＳＶ４０ｐＡ（以下、「ＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥベクター」）（図１６参照）（配列番号５）であって、上記のベクター骨格において、ＣＡＧＷＰＲＥ構築物と比べてＷＰＲＥを欠いているもの；（３）ｐＴＲ１３０－ｈＰＧＫ－ｈＢＧｉｎ－ｈｕＦＭＲＰ－ｈＢＧｐＡ＋ＳＶ４０ｐＡ－３’ｓＣＨＩＭｉｎ（以下、「ｈＰＧＫベクター」）（図１７参照）（配列番号６）であって、ＦＭＲＰの発現を駆動するためのｈＰＧＫプロモーター、並びに上記のベクター骨格における、ｍＲＮＡ転写物安定化要素（図１７を参照）及び小さなキメライントロン配列として作用する３’ｈβ－グロビンポリ（Ａ）シグナルを含むもの。これらの変更は、インビボでの導入遺伝子の最適な発現を容易にし、また構築物の安全性を改善するために選択された。

ＣＡＧＷＰＲＥ及びＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥベクターのＦＭＲＰ発現効率を比較するために、ＣＨＯ－Ｌｅｃ２細胞にベクターを形質導入し、発現をウエスタンブロットで評価した。ＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥベクターで形質導入された細胞はＦＭＲＰを発現したが、観察された発現はＣＡＧＷＰＲＥベクターで形質導入された細胞で観察されたものよりも少なかった。図１８Ａ及び１８Ｂ。

ｈＰＧＫベクターの発現効率を神経細胞におけるＣＡＧＷＰＲＥ及びＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥベクターの発現効率と比較するために、Ｅ１７培養マウス皮質ニューロンにＤＩＶ１４でベクターを形質導入し、ＤＩＶ１９で収穫する前に５日間ベクターを発現させた。採取されたニューロンは、その後ウエスタンブロット分析にかけられた。ｈＰＧＫベクターでｈＰＧＫプロモーターを使用すると、ＣＡＧ駆動ベクターで形質導入されたニューロンで観察されたものと比較して、ニューロンでＦＲＭＰの発現が減少した。図１９。

実施例２．ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの投与、タイミング、及び送達経路の最適化
ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの最適な送達経路、及びＦＭＲＰのＣＮＳ特異的発現に最適化された投薬及びタイミングを決定するために、ｓｃＡＡＶ９－ＣＢ－ＦＭＲ１及びＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１を使用したインビボ研究がマウスモデルで実施された。

ｓｃＡＡＶを使用した形質導入及び組換え遺伝子発現のタイミングを評価するために、約２，０００万ｖｇのｓｃＡＡＶ－ＧＦＰを６週齢の野生型マウスに脳室内（ＩＣＶ）注射した。ＩＣＶ送達は、全身性免疫応答及び副作用を最小限に抑えながら、脳内での広範な投与を保証する。ウイルス注射の投与の２週間後、マウスを経心臓的に灌流（４％パラホルムアルデヒド）し、脳を一晩後固定し、３０％スクロースで凍結保護し、急速冷凍した。脳スライスは、処理のために顕微鏡スライドに取り付けられ、共焦点顕微鏡を使用して画像化された。図３Ａは、ｓｃＡＡＶ－ＧＦＰを注射した野生型マウス脳の皮質及び海馬領域におけるｓｃＡＡＶ－ＧＦＰ発現を示す。

追加的に、約２，０００万ｖｇのＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１を６週齢の野生型マウスにＩＣＶ注射した。ウイルス注射の２週間後、マウスを経心臓的に灌流（４％パラホルムアルデヒド）し、脳を一晩後固定し、３０％スクロースで凍結保護し、急速冷凍した。処理のために脳スライスを顕微鏡スライドにマウントし、Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５；１１（５）：６８１－６８８に記載されている方法と同様に蛍光免疫染色を実施し、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。図３Ｂ及び３Ｃは、２週間後にＦＭＲＰタンパク質発現が増加した皮質ニューロン及び海馬ニューロン（免疫蛍光マーカーＮｅｕＮでマーク）を示している。ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１及びＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰの総タンパク質発現も、ＩＣＶ注射マウスから採取した皮質、海馬、中脳、及び小脳を含む脳スライスで評価した。簡単に説明すると、約４，０００万ｖｇのＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを６～７週齢の野生型マウス及び６～７週齢のＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにＩＣＶ注射した。ウイルス注射の１０週間後、脳を採取し、脳スライドを収集してウエスタンブロット分析用に処理した。図４は、ＧＦＰが皮質及び海馬でウエスタンブロットによって明確に検出可能であったのに対し、ＣＡＧプロモーター下でＦＭＲＰ又はＧＦＰを含む通常のＡＡＶを注射されたマウスではＦＭＲＰが検出限界未満であったことを示している。脳スライスのウエスタンブロッティング及び免疫組織化学分析は、注射されたマウスの細胞死及びグリオーシスも評価し、細胞死又はグリオーシスの徴候のない中等度のＦＭＲＰ発現（７０－１１０％）につながる用量の特定に役立つ。

実施例３：ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの投与、タイミング、及び送達経路の最適化
ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの投与、タイミング、及び送達経路を更に最適化するために、当該ベクターをＦｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）マウスに投与し、機能的及び生理学的結果を評価する。

マウスは、静脈内（ＩＶ）又は併用（ＩＶ＋ＩＣＶ）投与経路を介して、Ｐ２１で、ベクター、例えば、ＣＡＧＷＰＲＥ、ＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥ、又はｈＰＧＫを投与される。対照群は、併用投与によりビヒクルを投与されたＷＴ及びＫＯマウスを含む。実験群のマウスは、低用量（例えば、１Ｅ１３－５Ｅ１３ｖｇ／ｋｇ）又は高用量（例えば、８Ｅ１３－２Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）のいずれかの投与ベクターを受ける。全てのグループのマウスは、投与後６０日目に行動試験を受ける。行動試験には、ネスティング（営巣）行動の評価、モリス水迷路タスクでのパフォーマンスの評価、及び脳波（ＥＥＧ）を使用した機能的神経生理学的評価が含まれる。全てのグループのマウスは、生体内分布の最終評価を受ける。各実験群及び対照群は約１０匹のマウスで構成されている。

別の研究では、Ｐ２１（「小児」）又はＰ４２（「高齢」）で、静脈内（ＩＶ）又は併用（ＩＶ＋ＩＣＶ）投与経路を介して、マウスにベクター、例えばＣＡＧＷＰＲＥ、ＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥ、又はｈＰＧＫを投与する。対照群は、Ｐ２１又はＰ４２のいずれかにＩＶ又はＩＶ＋ＩＣＶ投与を介してビヒクルを投与されたＷＴ及びＫＯマウスを含む。実験群のマウスは、投与されたベクターの用量範囲（例えば、１Ｅ１３～２Ｅ１４ｖｇ／ｋｇ）のうちの１つを受ける。全てのグループのマウスは、投与後９０日目に行動試験を受ける。行動試験には、ネスティング（営巣）行動の評価、モリス水迷路タスクでのパフォーマンスの評価、及び脳波（ＥＥＧ）を使用した機能的神経生理学的評価が含まれる。全てのグループのマウスは、生体内分布の最終評価を受ける。各実験群及び対照群は約１０匹のマウスで構成されている。

上記の実験の結果を分析して、どの投薬レジメン、タイミング、及び投与経路が、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスの脳及び身体の全ての部分への導入遺伝子の優れた送達、並びに機能及び行動障害の優れた救助を提供するかを決定する。ＦＭＲ１遺伝子が組織で遍在的に発現することを考えると、試験した投与条件のうちの１つ以上によって達成可能な修正導入遺伝子の広範な分布は、脆弱Ｘ症候群の治療に有益であると予想される。

実施例４．ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの投与後のＦＸＳのマウスモデルにおける行動分析
Ｆｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）マウスはＦＭＲＰを発現せず、脳の過興奮性及び行動障害及び認知障害など、ＦＸＳに関連するヒトの表現型を複製する。これは、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスがＦＸＳの優れたモデルであるだけでなく、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスの前頭前皮質機能をテストする行動パラダイムを使用して、ＡＡＶ遺伝子治療によるＦＸＳの認知障害を救う治療戦略の可能性を評価できることを示唆した。

Ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５；１１（５）：６８１－６８８（その開示はその全体が本明細書に組み込まれる）に記載されるのと同様の方法で生成された。手短に言えば、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスは、メスのＦｍｒ１ＨＥＴマウスとオスのＰｉｋ３ｃｂヘテロ接合マウスを交配することによって生成され、ＰＣＲによって遺伝子型が特定された。ノックアウトマウス系統は、少なくとも４回（Ｐｉｋ３ｃｂＨＥＴ）又は１０回超（Ｆｍｒ１ＨＥＴ）Ｃ５７ＢＬ／６Ｊのバックグラウンドに戻し交配された。

Ｆｍｒ１ ＫＯマウス及び野生型対照マウスは、図５に示すタイムラインに従って、ＡＡＶ投与後の行動及び機能評価を受けた。簡単に言えば、Ｆｍｒ１ ＫＯマウス及び野生型マウスに、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかのマウス当たり４０００万～６０００万のウイルスゲノムをＩＣＶ注射した。マウスは、注射の時点で生後６～７週であった。マウスは、ウイルス注射後約１０週間生き続け、その間に複数の行動アッセイ（ネスティング、大理石埋没、オープンフィールド活動、新規オブジェクト認識、モリス水迷路）にかけられた。

巣作りは、ウイルス注射の１週間後～４週間毎週評価された。簡単に言えば、実験の開始時に、３グラムの新鮮な巣箱を補充した標準的な寝床を備えた新鮮なケージにマウスを入れた。Ｇｒｏｓｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ Ｒｅｐ．２０１５；１１（５）：６８１－６８８に記載されているスコアリングシステムを使用して、巣を２時間後に評価し、その開示はその全体が本明細書に組み込まれる。図６Ａは、野生型マウス及びＦｍｒ１ ＫＯマウスが新鮮な巣箱を受け取ってから２時間後に巣箱の材料を細断している例を示す。より多くの細断は、人間の「社会的行動」に変換される「ホームケージ行動」を示している。図６Ｂは、全体として、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスが細断した巣が少ないことを示している。ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１を注射したＦｍｒ１ ＫＯマウスは、２週間～４週間の間に巣箱の量を増やしながら裁断したが、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを注射したマウスは改善されず、ＦＭＲＰ発現の正の効果が示唆された（図６Ｃ）。これらのテストでは、全てのマウスが巣作りに従事していることも示され、全体的な健康状態がウイルスベクターの影響を受けていないことが確認された。

過度の大理石の埋没は、マウスの固執又は不安関連の行動を示唆しており、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスで変更された。ＡＡＶ投与の４週間後、Ｆｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスを大理石埋没アッセイにかけた。簡単に言えば、マウスをケージに入れ、２０個の青い小さなガラスビーズを新鮮な寝床（深さ約８ｃｍ）に５×４のグリッドに配置した。１５分後、マウスを取り出し、５０％以上覆われた大理石を「埋没」と採点しました。大理石を埋めるために掘り始めるまでの待ち時間も１５分間測定された。マウスは午後１２時～午後３時の間にテストされ、大理石を埋める前にネスティング（営巣）行動がテストされた。図７Ａは、マウスの大理石を埋める行動の例を示している。左のパネルはマウスを入れる前の大理石の配置を示し、右のパネルはマウスを入れた後の大理石の位置を示している。ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯマウス（ＧＦＰはＦｍｒ１ ＫＯマウスに影響を与えないため、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスを表す）は平均して、野生型マウスよりも埋没を開始するまでの待ち時間が短縮され、より多くの大理石を埋没させた。ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの注射により、待ち時間の短縮が回復した（図７Ｂ及び７Ｃ）。

ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスを、ＡＡＶ注射の６～８週間後にモリス水迷路アッセイに供した。モリス水迷路は、海馬が空間学習においてどの程度の役割を果たしているかを判断するために一般的に使用される。図８Ａは、本明細書に開示されるように実施されたモリス水迷路アッセイの図を示す。モリス水迷路のトレーニング（取得）試行中、マウスは、図８Ａの茶色のマークで示される６つの開始点の１つで、壁に面して水中に置かれた。マウスは、最大６０秒間、又はプラットフォームが見つかるまで泳ぐことが許容された。プラットフォームに到達するまでの時間（待ち時間）は秒単位で測定された。プローブ試行では、マウスを、取り外したプラットフォームの反対側の象限（ＯＰ）のプールに入れた。プローブ試行では、各象限とプラットフォームとの交差に費やされた時間が測定された。Ｑｕａｄｒａｎｔ ＴＱは、プラットフォームが配置されたプールの領域であるターゲット象限であった。ＯＰはＴＱの反対の象限であった。ＡＲ及びＡＬは、プールを見下ろしたときに、ターゲット象限の隣接する左右の象限であった。全てのグループが同様の割合でタスクを達成し、トレーニングの最後に隠されたプラットフォームを見つけることができた。逆転課題において、隠されたプラットフォームの位置が迷路の反対側の象限に移動すると、ＧＦＰを注射されたＦｍｒ１ ＫＯマウスは前の象限へのエントリが少なくなり（図８Ｂ）、以前のプラットフォームの位置への待ち時間が増加し（図８Ｃ）、ＧＦＰを注射されたＦｍｒ１ ＫＯマウスがプラットフォームの位置をあまり正確に記憶していないことを示唆しており、これは記憶障害と一致している。ＦＭＲＰ１０を注射したＦｍｒ１ ＫＯマウスは、野生型マウスと区別がつかず（図８Ｂ及び８Ｃ）、この記憶障害が改善されたことを示唆している。

ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスも、ＡＡＶ注射の６～８週間後にオープンフィールド活動アッセイに供した。オープンフィールド活動アッセイは、多動性及び／又は不安を測定する。簡潔に言えば、試験開始の３０分前に、マウスを実験室に慣らした。マウスを、透明なプレキシガラス（４０×４０×３０）ｃｍのオープンフィールドアリーナの中心に置き、１５分間探索させた。照明はアリーナ内のオーバーヘッドライト（約８００ルクス）によって提供され、実験は５５デシベル（ｄＢ）のホワイトノイズの存在下で行われた。Ｄｉｇｉｓｃａｎ光学動物活動性システムによって制御された２分間隔でデータを収集した。データは、コンピューター指定の周辺及び中央セクターについてプールされ、遺伝子型ごとの平均として表された。これらの研究は、ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯマウスが、オープンフィールドアリーナの中央でより多くの時間を費やしたことを示した（２方向ＡＮＯＶＡ、遺伝子型の効果ｐ＝０．０２）。しかしながら、ＧＦＰを注射した野生型とＦｍｒ１ ＫＯマウスとの間に違いは観察されなかった（図９）。全体として、ウイルス発現ｈＦＭＲＰは、変更されたオープンフィールド活動に大幅に影響しない。

ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯ及び野生型マウスを、ＡＡＶ注射の６～８週間後に新規オブジェクト認識アッセイに供した。新規オブジェクト認識アッセイは、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスでは損なわれていると推測されていた、なじみのあるオブジェクトに対して新規オブジェクトを探索するマウスの生来の嗜好に依存している。ここで、無生物、木製、及び中間色のオブジェクトが、この実施例で開示された新規オブジェクト認識テストで使用された。オブジェクトは最初に、別の野生型マウスの素朴なコホートを使用してニュートラルな嗜好の強さをテストされ、強い魅力又は嫌悪反応のいずれかを誘発するオブジェクトは破棄された。初日に、マウスを円形の白いアリーナ（直径３０ｃｍ）に３０分間慣れさせた。翌日、マウスは複数のオブジェクトが等間隔にアリーナ内に等間隔に配置されたアリーナに、１５分間さらされた。各オブジェクトとの相互作用時間を各マウスについて計算し、中央値の反応を引き起こした２つのオブジェクトを次の２日間のテストで「なじみのある」オブジェクトとして使用した。３日目と４日目に、マウスは１５分間、アリーナの特定の領域（オブジェクトの提示のためのカウンターバランスの取れた場所）内のなじみのあるオブジェクトを提示された。５日目に、「なじみのある」オブジェクトの１つが４番目の「新規」オブジェクトに置き換えられ、マウスの相互作用行動が１５分間テストされた。マウスが４つのオブジェクト（なじみのあるオブジェクトが３つ、新規なものが１つ）にさらされた場合の１５分間の相互作用時間が全て記録された。相互作用パラメータは、オブジェクトとの接触（尾のみを除く）又はオブジェクトに面する（距離＜２ｃｍ）として定義された。嗜好指数（ＰＩ）は、新規オブジェクトとのインタラクションに費やされた時間を、新規オブジェクト及びなじみのあるオブジェクトの両方を探索する時間で割って計算された。全ての実験は記録され、遺伝子型及び治療群を知らされていない２人の観察者によって採点された。図１０に示すように、全てのマウスが新規オブジェクトに対する嗜好を示し、グループ間で有意差はなかった。

全体として、この実施例で実施された行動アッセイのほとんどは、ＦＸＳの行動表現型を示すＧＦＰ注射Ｆｍｒ１ ＫＯマウスと野生型マウスとの間の差異を示した。ＦＭＲ１を注射したＦｍｒ１ ＫＯマウスは、野生型マウスにより類似した行動を示した。これは、驚くべきことに、成体マウスの皮質及び海馬に少量のＦＭＲＰを再導入しても行動が改善されたことを示している。結果は、ウイルスで発現されたＦＭＲＰが、少なくともホームケージ／社会的行動（ネスティング）、不安に関連した固執的行動（大理石埋没）、及び学習及び記憶（モリス水迷路）を改善する可能性があることを示唆した。

実施例５．ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの投与後のＦＸＳのマウスモデルから採取した脳スライスの機能解析
Ｆｍｒ１ ＫＯマウス及び野生型マウスに、ＡＡＶ－ＣＡＧ－ＦＭＲ１又はＡＡＶ－ＣＡＧ－ＧＦＰのいずれかのマウス当たり４０００～６０００万のウイルスゲノムをＩＣＶ注射した。マウスは、注射の時点で生後６～７週であった。図５に示すタイムラインに反映されているように、マウスはウイルス注射後約１０週間生き続け、この期間中に複数の行動アッセイにかけられた。最後の行動アッセイから少なくとも５日後（手術後約１０週間）に、全てのマウスから脳組織を採取し、切片の機能アッセイ（例えば、長期増強（ＬＴＰ）を測定するために多電極アレイ（ＭＥＡ）を使用、及びタンパク質合成アッセイ）に使用し、並びに発現分析（免疫組織化学及びウエスタンブロッティング）に使用した。

（ｉ）長期増強（ＬＴＰ）
刺激に続くシナプス結合の強化の永続的な形態である長期増強は、学習と記憶の細胞相関である。簡単に説明すると、中隔側頭海馬を通る横方向の海馬スライス（３００μｍ）を、氷冷人工ＣＳＦ（ＡＣＳＦ）（ｍｍ：１２４ ＮａＣｌ、３ ＫＣｌ、１．２５ ＫＨ２ＰＯ４、３．４ ＣａＣｌ２、２．５ ＭｇＳＯ４、２６ ＮａＨＣＯ３、及び１０デキストロース、ｐＨ７．３５）でビブラトームを使用して調製した。遺伝子型及び治療群の両方からのスライスを同時に実行した。スライスは、温かく加湿された９５％Ｏ２／５％ＣＯ２にスライス表面がさらされ、６０～７０ｍｌ／ｈの速度で連続ＡＣＳＦが灌流されるインターフェイス記録チャンバー内で３１±１°Ｃに維持された。スライスは、記録が開始される前に、少なくとも１時間チャンバーに平衡化された。インキュベーション後、１つのスライスを選択し、ＨＦ全体が８×８アレイで完全に覆われるようにＭＥＤ６４プローブに配置した。スライスが落ち着いたら、ネットバラスト（規則的な間隔で毛髪片を配置したＵ字型の白金線）を慎重にスライスの上に配置して固定した。電気生理学的記録のために、スライスを固定したプローブをＭＥＤ６４の刺激／記録コンポーネントに接続した。スライスは、蠕動ポンプを用いて２～３ｍｌ／分の速度で、酸素化された新鮮なＡＣＳＦで連続的に灌流された。スライスを２０分間回復させた後、倒立顕微鏡に接続された電荷結合素子カメラを介して視覚的に観察した後、刺激用に６４スイッチボックスから６４の使用可能な平面微小電極の１つを選択した。指定されていない場合、データ収集ソフトウェアによって生成された単極、二相性の定電流パルス（３０～１９９μＡ、持続時間０．１ｍｓ）が０．１ＨｚでＰＰに適用された。残りの部位で誘発されたフィールドポテンシャルは、６４チャネルのメインアンプによって増幅され、２０ｋＨｚのサンプリングレートでデジタル化された。デジタル化されたデータはモニタ画面に表示され、マイコンのハードディスクに保存された。

５つの連続した応答は、記録システムによってリアルタイムで自動的に平均化された。スライスの生存率は、適切な振幅のｆＥＰＳＰを誘発するためのしきい値を測定することにより、様々なセットの記録セッションにわたって一定に保たれた。ＬＴＰ誘導には、バースト間間隔が２００ミリ秒の１００Ｈｚで４つのパルスをそれぞれ含む１０バーストで構成されるＴＢＳプロトコルが使用された。このようなプロトコルはインビボ条件に似ていることが広く受け入れられており、人工シナプス活動と自然シナプス活動との間のリンクを確立する方法として提案されている。加えて、そのような刺激によって誘発されたＬＴＰは、他の手段によって誘発されたものよりも堅牢で安定しているように見える。様々な実験でテタン化強度を標準化するために、ＴＢＳ強度は、ｆＥＰＳＰの最大の大きさのほぼ半分を想起させる強度に設定された。ＴＢＳの後、ＬＴＰの大きさと持続時間の変化を観察できるように、テスト刺激を（ベースラインと同じ強度で）１０分ごとに２時間超、繰り返し送達した。

ＴＢＳ－ＬＴＰは、Ｆｍｒ１ ＫＯ海馬で損なわれていることが示された。ここで、ＬＴＰは、ＦＭＲＰ発現ＡＡＶを注射したｆ５ Ｆｍｒ１ ＫＯマウス、ＧＦＰ発現ＡＡＶを注射した７匹のＦｍｒ１ ＫＯマウス、ＦＭＲＰ発現ＡＡＶを注射した６匹の野生型マウス、及びＧＦＰ発現ＡＡＶを注射した５匹の野生型マウスから記録された。報告されているように、各グループの２～３匹のマウスを使用したデータ分析は、ＧＦＰを注射した野生型スライスと比較してＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯスライスのわずかな欠損、及びＦＭＲＰ注射後の両方の遺伝子型におけるＬＴＰの全体的な増加を示唆した（図１１Ａ）。ＬＴＰの後期を評価するために測定値を７０分間収集したことを除いて、同じ条件下でアッセイを繰り返した。図１１Ｂは、ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯマウスにおいて、ＬＴＰの後期（分３０～７０、紫色の三角形）が損なわれたことを示す。追加的に、ＦＭＲＰ注射はＦｍｒ１ ＫＯマウスでＬＴＰを増強したが、ＦＭＲＰ注射野生型マウスでは増強しなかった（図１１Ｂ）。これらの機能分析は、海馬依存モリス水迷路学習アッセイにおける改善を示した実施例３に開示されたデータを支持する（図８Ｂ～８Ｃ）。

（ｉｉ）タンパク質合成
学習及び記憶などの長期的なシナプス可塑性は、刺激に反応して新しいタンパク質を合成するニューロンの能力に依存している。ＦＸＳマウスモデル及びＦＸＳ患者の細胞におけるタンパク質合成率は、増加し、刺激に敏感でないことが示されている。つまり、可塑性を誘発する刺激の後では増強されない。加えて、強化されたタンパク質合成率の調節不全は、ＦＸＳ（及び一般的な自閉症）の極めて重要な特徴であり、行動及び認知の欠陥の根底にあると考えられている。したがって、ＦＸＳのタンパク質合成の欠陥を救済する場合、ＦＸＳの治療戦略は「治療的」である可能性がある。ＧＦＰ又はＦＭＲＰを発現するＡＡＶを注射した野生型及びＦｍｒ１ ＫＯマウスのタンパク質合成率を評価するために、ＬＴＰ電気生理学用に調製した皮質及び海馬のスライスを、新生ペプチド鎖へのピューロマイシンの取り込みを使用するタンパク質合成アッセイ、それに続くウエスタンブロット分析、Ｆｍｒ１ ＫＯ脳におけるタンパク質合成率の増加を一貫して示した方法に使用した。ピューロマイシン化アッセイは、ＦＭＲＰ発現ＡＡＶを注射した２匹のＦｍｒ１ ＫＯマウス、ＧＦＰ発現ＡＡＶを注射した５匹のＦｍｒ１ ＫＯマウス、ＦＭＲＰ発現ＡＡＶを注射した５匹の野生型マウス、及びＧＦＰ発現ＡＡＶを注射した４匹の野生型マウスで行った。図１２Ａ及び１２Ｂは、ＧＦＰを注射した野生型スライスと比較して、ＧＦＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯスライスにおいてタンパク質合成率が５増加した皮質スライスを示す。追加的に、図１２Ａ及び１２Ｂは、ＦＭＲＰを注射したＦｍｒ１ ＫＯスライスにおけるタンパク質合成率の低下を示す。これらの結果は、ＦＭＲＰ再発現がＦｍｒ１ ＫＯマウスのタンパク質合成速度を正常化したことを示唆しており、これはシナプス可塑性、学習及び記憶の変化の根底にあると考えられている分子的欠陥である。全体として、本明細書で実施された細胞及び分子機能アッセイは、成体Ｆｍｒ１ ＫＯマウスにおける低ＦＭＲＰ再発現の有益な効果を示唆した。

（ｉｉｉ）定量的脳波計（ＥＧＧ）
本明細書で提供されるデータは、定量的脳波検査（ＥＥＧ）がＦＸＳ疾患の重症度及び治療反応（安静状態及び聴覚事象関連電位）のバイオマーカーとして使用できることを示している。図１４Ａは、有意な群差（ｐ＜０．０５補正）を含む、ヒトにおける相対的ガンマ出力の地形プロットを示し、ＦＸＳ患者で観察された過度のガンマパワーを実証している。聴覚皮質のガンマパワーは行動機能と高度に相関しており、ガンマパワーが高いほど、ＦＸＳ患者の聴覚注意タスクのパフォーマンスが低下していた（図１４Ｂ）。シータ及びアルファ出力で観察されたガンマ関係は、ＦＸＳと健康なヒト対象とを高度に区別する（図１４Ｃ）。全体として、安静時ガンマパワーの上昇は、ヒトの皮質過興奮性の堅牢な定量化可能なバイオマーカーであることがわかった。

ＦＸＳのマウスモデルにおける同等のＥＥＧバイオマーカーの同定は、前臨床から臨床治療へのパイプラインを促進する可能性がある。Ｆｍｒ１ ＫＯマウスが安静時ガンマ出力の上昇も示すかどうかを判断するために、３０チャネルのマウス多電極アレイ（ＭＥＡ）システムを使用して、野生型及びＦｍｒ１ ＫＯマウスの安静時及び刺激誘発ＥＥＧ信号を記録及び分析した。このシステムを使用して、より高い安静時ＥＥＧパワー、変更されたイベント関連電位（ＥＲＰ）、及びＦｍｒ１ ＫＯマウスにおける聴覚チャープ刺激に対する試行間位相コヒーレンスの減少を含む、ＦＸＳを持つヒトで報告された表現型と非常に類似した堅牢なＭＥＡ由来の表現型が観察された。図１３は、ＷＴマウスと比較したＦｍｒｌ ＫＯにおける増加したガンマパワーを示し、連続ＥＥＧによって測定されたガンマパワーは、６日間にわたる５分間について計算された（ｎ＝３、ＲＭ２－ｗａｙ ＡＮＯＶＡ、＊ｐ＜０．０５）。したがって、ヒトで見られる安静時ガンマパワー増加のＥＥＧバイオマーカーは、皮質ＥＥＧ記録を使用してＦｍｒ１ ＫＯマウスで複製された（図１３）。

マウスＥＥＧバイオマーカーの変化をヒトＥＥＧバイオマーカーに関連付けるために、Ｍａｔｌａｂベースの分析アプローチを使用して、マウスデータをヒトデータに対応させた。図１４Ｄは、人間のデータを使用するＦＸＳの異常に関連するＭａｔｌａｂベースの分析アプローチを使用して実行及び自動化されたガンマパワー分析を示す。マウス脳波データの追加分析により、マウスの周波数帯域固有の脳波パワーとガンマ／シータ結合を評価して、ヒト及びマウスの表現型の直接比較を可能にし、ＦＸＳで定量的及び翻訳的脳波バイオマーカーを確立できる。このようなデータは、ＦＸＳの人間のＥＥＧバイオマーカーが、ＦＸＳ治療の開発及び最適化における客観的な測定値として使用できることを示唆している可能性がある。

実施例６．ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの投与後のインビボでのＦＸＳマウスにおける発現及び生体内分布の評価
この実施例は、上記の実施例１に記載のＡＡＶ－ＣＡＧＦＭＲ１（別名、ＡＡＶ－ＣＢ－ＦＭＲ１）又はＡＡＶ－ＧＦＰ（対照として）を使用した、Ｆｍｒ１^ＫＯ又はＦｍｒ１^ＷＴマウスにおけるＦＭＲ１遺伝子治療に関するパイロット前臨床試験を報告する。図２Ａも参照されたい。この研究では、生後９．５～１１週のオスのマウスを使用する。ウイルス粒子５×１０^１３ｖｇ／ｋｇを各マウスに尾静脈から注射した。３０分～６時間後、マウスに両側脳室内（ＩＣＶ）手術を施し、５×１０^１０ｖｇのウイルス粒子を各半球に送達した。１２～１４日後、マウスを犠牲にした。血液サンプル及び組織サンプル（例えば、脳、筋肉、心臓、肺、腎臓、肝臓、及び脊髄サンプル）を採取した。脳サンプルの半分は、免疫染色（パラホルムアルデヒド後固定）によって分析された。脳サンプルの残りの半分は、海馬、皮質、中脳、及び小脳（急速冷凍）に解剖された。ＦＭＲＰの発現及び分布を評価するために、全ての脳サンプルを免疫染色によって分析した。２セットの他の組織サンプル（肝臓サンプルなど）の切片を作成した。１つはＧＦＰ発現の検出のためであり（ＧＦＰ発現を確認するために、染色することなく切断後に直接画像化されている）、他の１つは免疫染色によりＦＭＲＰ発現の検出のためである。免疫染色アッセイで使用される抗ＦＭＲＰ抗体は、ＷＴマウスでは特異的な染色が少ないヒトＦＭＲＰに特異的である。この研究の結果は、大部分が皮質におけるヒトＦＭＲＰのニューロン発現を示している。

更に、異なる組織サンプル中のｈＦＭＲ１転写産物のレベルを検出するために、脳及び組織サンプルに対してＲＴ－ＰＣＲを実施した。対照としてｅＧＦＰを使用した。結果をＧＡＰＤＨに対して正規化し、図２０Ａ～２０Ｇに提供した。ｈＦＭＲ１の発現は、脳の様々な領域（例えば、皮質）及び様々な臓器（例えば、心臓及び肝臓）で検出された。

実施例７．ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの投与後のインビボでのＦＸＳマウスにおける発現及び生体内分布の評価
この研究の目的は、Ｆｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるヒトＦＭＲＰ（ｈＰＧＫ、ＣＡＧＷＰＲＥ、及びＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥ）をコードするｃＤＮＡを含む３つの異なるウイルスベクターの分布と発現を更にテストすることである。これらの３つのベクターの詳細は、上記の実施例１に記載されている。ウイルスベクターは、脳室内（ＩＣＶ）又は静脈内（ＩＶ、尾静脈）のいずれかで５～７週齢のマウスに送達される。４週間（＋／－３日）後、血液と臓器を採取し、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＦｍｒ１ ＲＮＡ発現、ウエスタンブロット及び／又は免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＦＭＲＰ発現についてテストする。潜伏期間中、マウスの全体的な健康状態及びいずれの有害反応も監視される。

マウスから採取した脳組織は、ＲＴ－ｑＰＣＲによりＦｍｒ１ ＲＮＡ発現について分析し、ＩＨＣ及びウエスタンブロットによりＦＭＲＰ発現について分析する。他の組織は、ＲＴ－ｑＰＣＲによりＦｍｒ１ ＲＮＡ発現について分析し、ウエスタンブロットによりＦＭＲＰ発現について分析する。他の組織には、後根神経節（ＤＲＧ）、肝臓、肺、心臓、脊髄、腎臓、生殖腺、及びふくらはぎの筋肉が含まれる。

上記の実験の結果を分析して、どのベクターが導入遺伝子の優れた発現、並びに脳及び身体の全ての部分への送達を提供するかを決定する。ＦＭＲ１遺伝子が組織で遍在的に発現していることを考えると、１つ以上のテスト済みベクターによって達成可能な修正導入遺伝子の広範な分布は、脆弱Ｘ症候群の治療に有益であると予想される。

実施例８．ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターのＩＣＶ投与後のＦＸＳモデルマウスにおける機能解析：発作感受性
この研究の目的は、ＩＣＶ投与を介して投与されたＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターによる治療後の脆弱Ｘ症候群モデルマウスの発作感受性の低下における３つの異なるウイルスベクターの有効性を更に評価することである。ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターには、ＣＡＧＷＰＲＥ、ＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥ、及びｈＰＧＫベクターが含まれる。

Ｆｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）マウスに、１～３日齢（Ｐ１～３）でＩＣＶ投与を介して６ｅ９ｖｇ／心室の用量でＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターを投与する。対照Ｆｍｒ１ ＫＯマウスには、同じ年齢でビヒクルを投与する。年齢２０－２３日（Ｐ２０－２３）で、マウスは聴覚原性発作（ＡＧＳ）テストを受ける。Ｐ２０－Ｐ２３マウスは、２つのグループでフードホッパーのない通常の寝具を備えたケージに入れられる。Ａ／Ｃ電源ケーブルに接続されたパーソナルアラーム（１２０ｄＢ）は、ケージの蓋の内側に取り付けられている。サウンドはちょうど２分間再生され、その後１分間の無音、及び更に２分間のサウンドが続く。マウスは、テストの全期間にわたって観察される。行動及び発作は、両方の音への曝露中に採点される。以下に示すように、行動は０～４のスケールで採点される。
０＝変更なし
１＝暴走
２＝間代発作
３＝強直発作
４＝死

生き残ったマウスは、性別ごとに最大４匹のケージに入れられる。８週齢で、ＡＧＳテストを生き延びたマウスを、ＣＯ_２は又はペントバルビタールで安楽死させる。血液は、眼窩後出血によりＥＤＴＡ含有チューブに採取される。マウスは、滅菌ＰＢＳで経心的に灌流される。様々な臓器及び組織がマウスから採取され、体内分布分析が行われる。脳組織は、Ｆｍｒ１ ＲＮＡ発現を決定するためにＲＴ－ｑＰＣＲに供され、ＦＭＲＰ発現をプローブするためにＩＨＣに供される。追加的に、後根神経節（ＤＲＧ）、肝臓、肺、心臓、腎臓、生殖腺、ふくらはぎの筋肉組織を処理し、ＲＴ－ｑＰＣＲに供してＦｍｒ１ ＲＮＡ発現レベルをアッセイする。

上記の実験の結果を分析して、どのベクターが導入遺伝子の優れた送達及び発現、並びにＦｍｒ１ ＫＯマウスの高い発作感受性の優れた救助を提供するかを決定する。ＦＭＲ１遺伝子が組織で遍在的に発現することを考えると、試験したベクターのうちの１つ以上によって達成可能な修正導入遺伝子の広範な分布は、脆弱Ｘ症候群の治療に有益であると予想される。

実施例９．ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターのＩＣＶ、ＩＶ、及び組み合わせ（ＩＶ＋ＩＣＶ）投与後のＦＸＳモデルマウスにおける機能解析
この研究の目的は、ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターによる治療後の脆弱Ｘ症候群モデルマウスにおける機能的神経生理学的欠損の救済を更に評価することである。ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターには、ＣＡＧＷＰＲＥ、ＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥ、及びｈＰＧＫベクターが含まれる。研究は２段階（２コホート）で行われる。コホート分布については、表３を参照されたい。

グループ１から６のマウスは、５週齢で試験ＡＡＶベクター候補の注射を受ける。様々な投与経路（ＩＶ、ＩＣＶ、及びＩＶ＋ＩＣＶの組み合わせ）がテストされ、比較される。全ての治療群のマウスは、９週齢で自発運動及び聴覚原性発作感受性（ＡＧＳ）についてテストされる。

コホートごとに、４０匹のマウスからなる７つの試験グループがあり（表１を参照）、２日間連続して試験される（ＡＧＳ試験時間１２：００－４：４５）。追加的に、各テストグループのケージ変更スケジュールは標準化され、時差がある。具体的には、各テストグループは、テストの前日に変更されたケージを持っている。

試験日に、自発運動（ＬＭＡ）試験におけるオープンフィールドチャンバーでの評価の１５分前に、グループ１～７のマウスに生理食塩水（ＩＰ）を投与する。３０分のＬＭＡテストの直後に、マウスをＡＧＳテストにかける。その後、マウスをきれいなケージに移し、個別にＡＧＳ試験室に運ぶ。

（ｉ）自発運動（ＬＭＡ）テスト
ＬＭＡチャンバーに入れる１５分前に、マウスに生理食塩水（ＩＰ、１０ｍＬ／ｋｇ）を投与する。マウスは、自動化された活動監視システム（ＭｅｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して、３０分間のオープンフィールド分析（ＯＦＡ）で評価される。マウスは、ＬＭＡテストの開始の３０分前に部屋に順応させる。次のパラメータがキャプチャされる。
●水平移動距離、総歩行時間、歩行回数
●垂直アクティビティ（時間及び回数）

（ｉｉ）聴覚原性発作（ＡＧＳ）テスト
ＬＭＡ手順の後、マウスをＡＧＳ試験室に１分間順応させる。次に、マウスを高強度の音を発するスピーカーを備えた吸音チャンバーに入れる。マウスは、吸音チャンバー内に入れられる透明な円筒形のプレキシグラスチャンバーに（一度に１匹ずつ）入れる。アラームはプレキシグラスチャンバーの上部に取り付けられている。マウスの行動は、遺伝子型の状態及び薬物治療を知らされていない実験者によってリアルタイムで採点され（以下の採点を参照）、更に分析するためにビデオに録画される。

発作誘発は次のように行われる。
ＬＭＡテストの後、マウスをアラーム付きのテストチャンバーに入れる。１分間の順応の後、アラームが開始され、２分間のアラームチャレンジ中に動物の行動が記録される。動物は、その行動に基づいて採点される。スコアは次の通りである。
０＝応答なし
１＝暴走
２＝間代発作（横臥、けいれん）
３＝強直発作（横臥、じっとしている）
４＝呼吸停止／死亡。

ｔ＝３分。アラームをオフにし、動物を１分間回復させる。この回復後、アラームを再開し、マウスを記録し、上記のように更に２分間（ｔ＝４～ｔ＝６分）採点する。記録後、マウスはすぐにチャンバーから取り除かれる。

データは、上記のスケールに従って発作イベントの大きさとして表される。発作重症度スコア－グループごとの各マウスの最高発作スコアの平均が計算され、分析される。また、２分間で２以上の発作スコアとして定義される発作で発作するマウスのパーセントを計算する（発作発生率）。

ＡＧＳアッセイの直後に、動物をイソフルランで麻酔し、Ｋ２ＥＤＴＡでコーティングされたチューブに血液を採取する。血漿サンプルは、冷蔵遠心分離機（１３，０００ｒｐｍ、４℃で３分間）で血液を回転させることによって調製される。採血直後、該当する場合は脳を摘出し、様々な領域を解剖する（前頭皮質、線条体、海馬、小脳、脳幹など）。血漿を別の１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移し、凍結し、生物分析にかける。脳は急速冷凍するか、固定液に浸して固定することができる。動物は、追加の負荷で脳を除去する前に、生理食塩水及び固定液で灌流することもできる。任意で、追加の臓器（例えば、心臓、肝臓、生殖腺など）を収集し、分析のために急速冷凍することができる。

上記の実験の結果を分析して、Ｆｍｒ１ ＫＯマウスの脳及び身体の全ての部分への導入遺伝子の優れた送達、並びに行動障害の優れた救助及び高い発作感受性を提供する投与経路を決定する。ＦＭＲ１遺伝子が組織で遍在的に発現することを考えると、１回以上の投与によって達成可能な修正導入遺伝子の広範な分布は、疾患の治療に有益であると予想される。

その他の実施形態
本明細書に開示された全ての特徴は、任意の組み合わせで組み合わせることができる。本明細書で開示された各特徴は、同一、同等、又は同様の目的を果たす代替の特徴によって置き換えられる場合がある。したがって、別段の明示的な記載がない限り、開示された各機能は、一般的な一連の同等又は類似の機能の例にすぎない。

上記の説明から、当業者は、本発明の本質的な特徴を容易に確認することができ、本発明の趣旨及び範囲から逸脱することなく、本発明の様々な変更及び修正を行って、様々な用途及び条件に本発明を適合させることができる。したがって、他の実施形態も特許請求の範囲内にある。

同等物
本明細書ではいくつかの発明の実施形態を説明及び図示してきたが、当業者は、本明細書で説明した機能を実行し、及び／又は結果及び／又は利点のうちの１つ以上を得るための様々な他の手段及び／又は構造を容易に想像するであろう。そのような変形及び／又は修正のそれぞれは、本明細書に記載された本発明の実施形態の範囲内にあるとみなされる。より一般的には、当業者は、本明細書に記載された全てのパラメータ、寸法、材料、及び構成が例示的であることを意味し、実際のパラメータ、寸法、材料、及び／又は構成が特定の用途（複数可）に依存することを容易に理解するであろう。そのために本発明の教示（複数可）が使用される。当業者は、本明細書に記載された特定の本発明の実施形態に対する多くの同等物を、通常の実験のみを使用して認識し、又は確認することができるであろう。したがって、前述の実施形態は例としてのみ提示されており、添付の特許請求の範囲及びその均等物の範囲内で、本発明の実施形態は、具体的に説明及び請求された以外の方法で実施できることを理解されたい。本開示の発明の実施形態は、本明細書に記載の個々の特徴、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法を対象とする。加えて、そのような機能、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法が相互に矛盾していない場合、そのような機能、システム、物品、材料、キット、及び／又は方法の２つ以上の任意の組み合わせは、本開示の発明範囲内に含まれる。

本明細書で定義及び使用される全ての定義は、辞書の定義、参照により組み込まれる文書の定義、及び／又は定義された用語の通常の意味を制御するものと理解されるべきである。

本明細書に開示される全ての参考文献、特許、及び特許出願は、場合によっては文書全体を包含する、それぞれが引用される主題に関して参照により組み込まれる。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される不定冠詞「ａ」及び「ａｎ」は、反対に明確に示されない限り、「少なくとも１つ」を意味すると理解されるべきである。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される「及び／又は」という語句は、そのように結合された要素の「いずれか又は両方」、すなわち、ある場合には結合的に存在し、他の場合には分離的に存在する要素を意味すると理解されるべきである。「及び／又は」で列挙された複数の要素は、同じように解釈されるべきである。つまり、そのように結合された要素の「１つ以上」である。「及び／又は」句によって具体的に識別される要素以外の他の要素は、それらの具体的に識別される要素に関連するか、又は関連しないかにかかわらず、任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及び／又はＢ」への言及は、「含む」などの非限定的な文言と併せて使用される場合、一実施形態では、Ａのみを指すことができ（任意にＢ以外の要素を含む）；別の実施形態では、Ｂのみを指すことができ（任意にＡ以外の要素を含む）；更に別の実施形態では、Ａ及びＢの両方を指すことができる（任意に他の要素を含む）。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される「又は」は、上記で定義した「及び／又は」と同じ意味を有すると理解されるべきである。例えば、リスト内の項目を分離する場合、「又は」又は「及び／又は」は包括的であると解釈されるものとする。すなわち、要素の数うち少なくとも１つを含むが、２つ以上も含み、任意でリストに載っていない追加の項目も含むものと解釈される。反対に明確に示されている用語のみ、例えば「～のうち１つだけ」又は「正確に～のうち１つだけ」、又は特許請求の範囲で使用されている場合は「～からなる」など、「～からなる」は、数又は要素のリストのうち正確に１つの要素を含むことを指す。一般に、本明細書で使用される「又は」という用語は、「いずれか」「～のうちの１つ」「～のうちの１つのみ」又は「～のうちの正確に１つ」など、排他的な文言が先行する場合は、排他的な選択肢（すなわち、「どちらか一方しかない」）を示すものとしてのみ解釈される。「～からなる」「実質的に～からなる」は特許請求の範囲で使用される場合、特許法の分野でしようされる通常の意味を有するものとする。

「約」又は「およそ」という用語は、当業者によって決定される特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味し、これは、値がどのように測定又は決定されるか、すなわち、測定系の限界に部分的に依存するものとする。例えば、「約」は、当技術分野の慣行に従って、許容可能な標準偏差の範囲内を意味することができる。代替的に、「約」は、所与の値の最大２０％、好ましくは最大１０％、より好ましくは最大５％、更により好ましくは最大１％の範囲を意味することができる。代替的に、特に生物学的な系又はプロセスに関して、本用語は、値の１桁以内、好ましくは２倍以内を意味することができる。特定の値が本出願及び特許請求の範囲に記載される場合、特記しない限り、「約」の用語は暗示的であり、この文脈では特定の値について許容可能な誤差範囲内を意味する。

本明細書及び特許請求の範囲で使用される場合、「少なくとも１つの」という語句は、１つ以上の要素のリストを参照して、要素のリスト内の要素のうちいずれか１つ以上から選択される少なくとも１つの要素を意味すると理解されるべきである。ただし、要素のリスト内に具体的にリストされている全ての要素のうち少なくとも１つを含む必要はなく、要素のリスト内の要素の任意の組み合わせを除外するものではない。この定義により、それらの具体的に識別される要素に関連するか、又は関連しないかにかかわらず、「少なくとも１つ」という語句が指す要素のリスト内で具体的に特定された要素以外の要素が任意に存在し得る。したがって、非限定的な例として、「Ａ及びＢのうちの少なくとも１つ」（又は同等に「Ａ又はＢのうちの少なくとも１つ」、又は同等に「Ａ及び／又はＢのうちの少なくとも１つ」）は、以下を指すことができる。一実施形態では、Ｂが存在しない少なくとも１つ、任意に２つ以上含むＡ（及び任意にＢ以外の要素を含む）を指し；別の実施形態では、Ａが存在しない少なくとも１つ、任意に２つ以上含むＢ（及び任意にＡ以外の要素を含む）を指す。更に別の実施形態では、少なくとも１つ、任意に２つ以上含むＡ、及び少なくとも１つ、任意に２つ以上含むＢ（任意に他の要素を含む）等を指すことができる。

また、反対に明確に示されない限り、本明細書で特許請求される、複数のステップ又は行為を含む任意の方法において、方法のステップ又は行為の順序は、方法のステップ又は行為が記載される順序に必ずしも限定されないことも理解されるべきである。

ＩＶ．個々のＦＸＳ患者に対するＡＡＶ９粒子の個別化された用量の決定のためのＥＥＧ及び行動特徴バイオマーカーの使用
本明細書に開示される治療方法のいずれかにおいて、本明細書に開示される１つ以上のバイオマーカーは、好適な患者を特定するため、個別化されたＡＡＶ粒子投与量を決定するため、及び／又は治療効果を評価するために使用され得る。本明細書で使用される「バイオマーカー」という用語は、ＦＸＳ患者の臨床的特徴、例えば、疾患の表現型の重症度、治療に対する患者の応答性などに関する情報を提供する指標（１つの因子又は因子の組み合わせ）を指す。バイオマーカーには、ＥＥＧ（例えば、長期増強、すなわちＬＴＰ）、１つ以上の行動特徴（例えば、動揺、又は記憶障害）、又はそれらの組み合わせが含まれる。ＦＭＲＰはシナプスタンパク質であり、そのレベル及び／又は分布は脳内の神経活動のレベルと相関している。ＦＭＲＰが失われると、ＬＴＰのしきい値が増加し、ＥＥＧを使用して測定及び記録できる異常な神経活動が発生する。したがって、ＥＥＧを使用してＦＭＲＰのレベル及び／又は分布をモニタリングすることができ、それによってＦＸＳ患者の診断及び治療効果の評価に利益をもたらす。

いくつかの実施形態では、脳波図（ＥＥＧ）によって評価される長期増強（ＬＴＰ）パターンは、ＦＸＳを治療する方法で使用するための本明細書に開示されるＡＡＶ９粒子などのＡＡＶ粒子の好適な用量を評価及び決定するためのバイオマーカーとして使用することができる。いくつかの例では、ＡＡＶ粒子の初期用量の投与後、ＥＥＧを使用してＦＸＳ患者のＬＴＰパターンをモニタリングすることができる。ＡＡＶ９粒子の初期用量がＦＸＳ患者のＬＴＰパターンに影響を示さない場合、ＡＡＶ９粒子の用量を維持又は増加させることができる。

他の実施形態では、動揺は、本明細書に開示される方法で使用する、又は治療効果を評価するためのＡＡＶ９粒子の好適な用量を評価及び決定するバイオマーカーとして使用することができる。動揺とは、不安に関連した固執的な行動として示される不安又は神経興奮の状態を指す。ＡＡＶ粒子の初期用量の投与後、ＦＸＳ患者における動揺の発症及び／又は進行は、日常的な実践又は本明細書で提供される方法に従ってモニタリングされ得る。ＦＸＳ患者が動揺を発症するか、動揺が進行しているか、不安感が強まる場合、ＡＡＶ粒子の投与量を減らすことができる。代替的に、ＡＡＶ粒子の初期用量がＦＸＳ患者の動揺の発症をもたらさないか、又は動揺を緩和／軽減する場合、これは初期用量のＡＡＶ９粒子が有効であることを示す。ＡＡＶ粒子の用量は、維持又は増加され得る。

他の実施形態では、記憶障害は、本明細書に開示される方法で使用するため、又は治療効果を評価するためのＡＡＶ９粒子の好適な用量を評価及び決定するバイオマーカーとして使用することができる。記憶障害は、短期記憶によって示されるように、ＦＸＳ患者の学習能力の欠如を指す。ＡＡＶ粒子の初期用量の投与後、ＦＸＳ患者における記憶障害の発症及び／又は進行は、日常的な実践又は本明細書に提供される方法に従ってモニタリングされ得る。ＦＸＳ患者が記憶障害を発症するか、又は記憶障害が進行している場合、ＡＡＶ粒子の投与量を減らすことができる。代替的に、ＡＡＶ粒子の初期用量がＦＸＳ患者の記憶障害の発症をもたらさないか、又は記憶障害を改善しない場合、これは初期用量のＡＡＶ９粒子が有効であることを示す。ＡＡＶ粒子の用量は、維持又は増加され得る。

実施例７．ＦＭＲＰ発現ＡＡＶベクターの投与後のインビボでのＦＸＳマウスにおける発現及び生体内分布の評価
この研究の目的は、Ｆｍｒ１ノックアウト（ＫＯ）マウスにおけるヒトＦＭＲＰ（ｈＰＧＫ、ＣＡＧＷＰＲＥ、及びＣＡＧｄｅｌＷＰＲＥ）をコードするｃＤＮＡを含む３つの異なるウイルスベクターの分布と発現を更にテストすることである。これらの３つのベクターの詳細は、上記の実施例１に記載されている。ウイルスベクターは、脳室内（ＩＣＶ）又は静脈内（ＩＶ、尾静脈）のいずれかで５～７週齢のマウスに送達される。４週間（＋／－３日）後、血液と臓器を採取し、ＲＴ－ｑＰＣＲによるＦｍｒ１ ＲＮＡ発現、ウエスタンブロット及び／又は免疫組織化学（ＩＨＣ）によるＦＭＲＰ発現についてテストする。潜伏期間中、マウスの全体的な健康状態及びいずれの有害反応もモニタリングされる。

（ｉ）自発運動（ＬＭＡ）テスト
ＬＭＡチャンバーに入れる１５分前に、マウスに生理食塩水（ＩＰ、１０ｍＬ／ｋｇ）を投与する。マウスは、自動化された活動モニタリングシステム（ＭｅｄＡｓｓｏｃｉａｔｅｓ）を使用して、３０分間のオープンフィールド分析（ＯＦＡ）で評価される。マウスは、ＬＭＡテストの開始の３０分前に部屋に順応させる。次のパラメータがキャプチャされる。
●水平移動距離、総歩行時間、歩行回数
●垂直アクティビティ（時間及び回数）

Claims (47)

1. 脆弱Ｘ症候群（ＦＸＳ）を治療するための方法であって、ＦＸＳを有するヒト患者に有効量の複数のアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９ウイルス粒子を投与することを含み、前記ＡＡＶ９ウイルス粒子が、一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡベクターを含み、前記一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質（ヒトＦＭＲＰ）をコードするヌクレオチド配列を含み、前記ヌクレオチド配列が、プロモーターに作動可能に連結されており、前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、前記ＡＡＶ９ウイルス粒子による感染後の前記ヒト患者の脳において前記野生型ヒトＦＭＲ１を発現させる、方法。
2. 前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、自己相補的ＡＡＶベクターである、請求項１に記載の方法。
3. 前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、標準的なＡＡＶベクターである、請求項１に記載の方法。
4. 前記プロモーターが、ニワトリβアクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッドである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記プロモーターが、ヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターである、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
6. 前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、ヒトＦＭＲＰの発現を調節する１つ以上の調節エレメントを更に含む、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 前記１つ以上の調節エレメントが、ヒトβグロビンイントロン配列、１つ以上のポリＡシグナル伝達配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記１つ以上のポリＡシグナル伝達配列が、ヒトβグロビンポリＡシグナル伝達配列、ＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列、又はそれらの組み合わせを含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、ＷＰＲＥを含まない、請求項４～８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたニワトリβ－アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッドと、ＷＰＲＥと、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列と、を含む、標準的なＡＡＶベクターである、請求項１に記載の方法。
11. 前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたニワトリβ－アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッドと、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列と、を含む、標準的なＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、ＷＰＲＥを含まない、請求項１に記載の方法。
12. 前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターと、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列の上流にあるヒトβグロビンイントロン配列と、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列及びヒトβ－グロビンポリＡシグナル伝達配列と、を含む、標準的なＡＡＶベクターであって、前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、ＷＰＲＥを含まない、請求項１に記載の方法。
13. 前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、非脳組織における前記野生型ＦＭＲＰの発現を抑制するための、１つ以上の組織選択的マイクロＲＮＡに特異的な１つ以上のマイクロＲＮＡ標的部位（ＭＴＳ）を更に含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記１つ以上のＭＴＳが、ｍｉＲ－１２２のＭＴＳ、ｍｉＲ－２０８ａのＭＴＳ、ｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐのＭＴＳ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐのＭＴＳ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記野生型ヒトＦＭＲＰが、ヒトＦＭＲＰアイソフォーム１である、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記ヒトＦＭＲＰが、Ｎ末端１～２９７アミノ酸残基を含む野生型ヒトＦＭＲＰのフラグメントである、請求項１～１４のいずれか一項に記載の方法。
17. 前記ＡＡＶ９ウイルス粒子が、静脈内注射、脳室内注射、大槽内注射、実質内注射、又はそれらの組み合わせによって前記ヒト患者に投与される、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記ＡＡＶ９ウイルス粒子が、少なくとも２つの投与経路を介して前記ヒト患者に投与される、請求項１～１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 前記少なくとも２つの投与経路が、
    （ａ）脳室内注射及び静脈内注射、
    （ｂ）髄腔内注射及び静脈内注射、
    （ｃ）大槽内注射及び静脈内注射、並びに
    （ｄ）実質内注射及び静脈内注射からなる群から選択される、請求項１８に記載の方法。
20. 前記投与の前に、前記ヒト患者が、疾患の表現型重症度を決定するために、脳波図（ＥＥＧ）、行動及び／若しくは認知神経リハビリテーション評価、又はそれらの組み合わせに供される、請求項１～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記方法が、前記投与ステップの前に、前記ヒト患者を脳波図（ＥＥＧ）、行動及び／若しくは認知神経リハビリテーション評価、又はそれらの組み合わせに供するステップを更に含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記ＥＥＧ分析、前記行動及び／若しくは認知評価、又は前記それらの組み合わせに基づいて、前記ＡＡＶ９ウイルス粒子の投与量及び／又は送達経路を決定することを更に含む、請求項２１に記載の方法。
23. 前記ヒト患者が、ＧＡＢＡ受容体アゴニスト、ＰＩ３Ｋアイソフォーム選択的阻害剤、ＭＭＰ９アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせを含む治療を受けてきている、又は受けている、請求項１～２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 有効量のＧＡＢＡ受容体アゴニスト、ＰＩ３Ｋアイソフォーム選択的阻害剤、ＭＭＰ９アンタゴニスト、又はそれらの組み合わせを前記ヒト患者に投与することを更に含む、請求項１～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 治療効果をモニタリングするために、前記ＡＡＶ９ウイルス粒子の投与後に前記ヒト患者をＥＥＧに供することを更に含む、請求項１～２４のいずれか一項に記載の方法。
26. 前記ヒト患者を行動及び／又は認知神経リハビリテーションに供することを更に含む、請求項１～２５のいずれか一項に記載の方法。
27. 前記神経リハビリテーションが、前記ＡＡＶ９ウイルス粒子の投与後に行われる、請求項２６記載の方法。
28. 前記ヒト患者が、ヒトの子供である、請求項１～２７のいずれか一項に記載の方法。
29. アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    （ｉ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲを含むＡＡＶ骨格、
    （ｉｉ）野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結されたプロモーター、並びに
    （ｉｖ）非脳組織における前記野生型ＦＭＲＰの発現を抑制するための、１つ以上の組織選択的マイクロＲＮＡに特異的な１つ以上のマイクロＲＮＡ標的部位（ＭＴＳ）を含む、ＡＡＶベクター。
30. 自己相補的ＡＡＶベクターである、請求項２９に記載のＡＡＶベクター。
31. 前記プロモーターが、ニワトリβアクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッドである、請求項２９又は３０に記載のＡＡＶベクター。
32. 前記１つ以上のＭＴＳが、ｍｉＲ－１２２のＭＴＳ、ｍｉＲ－２０８ａのＭＴＳ、ｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐのＭＴＳ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐのＭＴＳ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項２９～３１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
33. 前記野生型ヒトＦＭＲＰがヒトＦＭＲＰアイソフォーム１である、請求項２９～３２のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
34. 自己相補的アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    （ｖ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び切断された３’ＩＴＲ（それらの一方又はそれらの両方のいずれかが切断されている）を含む、ＡＡＶ骨格、
    （ｖｉ）野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質（ヒトＦＭＲＰ）をコードするヌクレオチド配列であって、前記野生型ＦＭＲＰが、ＦＭＲＰアイソフォーム１である、ヌクレオチド配列、並びに
    （ｖｉｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結されたプロモーターを含む、自己相補的ＡＡＶベクター。
35. 非脳組織における前記野生型ＦＭＲＰの発現を抑制するために、１つ以上の組織選択的マイクロＲＮＡに特異的な１つ以上のマイクロＲＮＡ標的部位（ＭＴＳ）を更に含む、請求項３４に記載の自己相補的ＡＡＶベクター。
36. 前記プロモーターが、ニワトリｂ－アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッドである、請求項３４又は３５に記載の自己相補的ＡＡＶベクター。
37. 前記１つ以上のＭＴＳが、ｍｉＲ－１２２のＭＴＳ、ｍｉＲ－２０８ａのＭＴＳ、ｍｉＲ－２０８ｂ－３ｐのＭＴＳ、ｍｉＲ－４９９ａ－３ｐのＭＴＳ、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３４～３６のいずれか一項に記載の自己相補的ＡＡＶベクター。
38. 標準的なアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、
    （ｉ）５’逆方向末端反復（ＩＴＲ）及び３’ＩＴＲを含むＡＡＶ骨格、
    （ｉｉ）野生型ヒト脆弱Ｘ精神遅滞１（ＦＭＲ１）タンパク質をコードするヌクレオチド配列、
    （ｉｉｉ）（ｉｉ）に作動可能に連結されたプロモーター、並びに
    （ｉｖ）前記ＦＭＲＰの発現を調節する１つ以上の調節エレメントを含む、標準的なＡＡＶベクター。
39. 前記プロモーターが、ニワトリβアクチンプロモーターとＣＭＶプロモーター又はヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーターとのハイブリッドである、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
40. 前記１つ以上の調節エレメントが、ヒトβグロビンイントロン配列、１つ以上のポリＡシグナル伝達配列、ウッドチャック肝炎ウイルス転写後調節エレメント（ＷＰＲＥ）、又はそれらの組み合わせを含む、請求項３８又は３９に記載のＡＡＶベクター。
41. 前記１つ以上のポリＡシグナル伝達配列が、ヒトβグロビンポリＡシグナル伝達配列、ＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列、又はそれらの組み合わせを含む、請求項４０に記載のＡＡＶベクター。
42. 前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、ＷＰＲＥを含まない、請求項３８～４１のいずれか一項に記載のＡＡＶベクター。
43. 前記ＡＡＶベクターが、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたニワトリβ－アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッド、ＷＰＲＥ、及び前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列を含む、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
44. 前記ＡＡＶベクターが、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたニワトリβ－アクチンプロモーターとＣＭＶプロモーターとのハイブリッド、及び前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列を含み、前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、ＷＰＲＥを含まない、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
45. 前記ＡＡＶベクターが、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列に作動可能に連結されたヒトホスホグリセリン酸キナーゼ（ｈＰＧＫ）プロモーター、前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列の上流にあるヒトβグロビンイントロン配列、及び前記ヒトＦＭＲＰをコードする前記ヌクレオチド配列の下流にあるＳＶ４０ポリＡシグナル伝達配列及びヒトβ－グロビンポリＡシグナル伝達配列を含み、前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、ＷＰＲＥを含まない、請求項３８に記載のＡＡＶベクター。
46. 一本鎖ＡＡＶ ＤＮＡベクターを封入するＡＡＶ９カプシドを含むアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）９ウイルス粒子であって、前記ＡＡＶ ＤＮＡベクターが、請求項２９～４５のいずれか一項に記載される、ウイルス粒子。
47. 前記ＡＡＶ９ウイルス粒子及び薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物。