KR20230084465A - 취약 x 증후군의 치료를 위한 방법 및 조성물 - Google Patents

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어네스트 페다파티
크리스티나 그로스
크레이그 에릭슨
데이빗 디스무크
에란디 칸차나 드 실바
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칠드런즈 호스피탈 메디칼 센터
포지 바이올로직스, 인크.
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Abstract

야생형 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질(인간 FMRP)을 암호화하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 9 바이러스 입자를 사용하여 취약 X 증후군(FXS) 환자의 증상을 완화시키는 방법이 제공된다. 또한 FXS와 관련된 적어도 하나의 증상을 완화시키기 위해 FXS 환자에 대한 AAV9 바이러스 입자의 적절한 투여량을 결정하는 방법뿐만 아니라 치료 효능을 모니터링하는 방법이 본원에서 제공된다.

Description

취약 X 증후군의 치료를 위한 방법 및 조성물
관련 출원의 교차 참조
본 출원은 2020년 7월 17일에 출원된 미국 임시 출원 제63/053,461호의 출원일의 이익을 주장하며, 그 전체 내용이 본원에 인용되어 포함된다.
취약 X 증후군(FXS)은 취약 X 정신지체 단백질(FMR1) 유전자에서 CGG 반복이 확장되어 유전자 산물인 취약 X 정신지체 단백질(FMRP)을 상실하고 유전적 지적 장애의 주요 원인이 되는 단일 유전자성 증후군이다. FXS를 가진 사람들은 IQ가 낮고, 발달이 늦으며, 언어와 비언어적 의사소통에 장애가 있으며(종종 ASD 기준을 충족함), 소리와 빛에 대한 과민증과 간질 발작으로 나타나는 신경 과흥분성으로 고통받는다.
FXS를 가진 개인은 평생 관리가 필요하며 독립적인 삶을 살 수 없으므로 영향을 받은 개인과 그 보호자의 삶의 질이 저하된다. FXS의 치료를 위한 새로운 치료법을 개발할 필요가 있다.
본 개시내용은, 적어도 부분적으로는, 마우스 모델에서, FMRP의 성공적인 생체내 발현으로 이어지는 AAV 벡터의 개발, 및 AAV9 바이러스 입자에 의해 매개되는 낮은 수준의 FMRP 발현이 취약 X 증후군(FXS: Fragile X Syndrome)의 1차 행동 증상을 성공적으로 개선했다는 예상치 못한 발견에 기초한다. 또한 뇌파도(EEG: electroencephalogram), 행동 평가, 인지 신경 재활 평가, 또는 이들의 조합이, 예를 들어 개별 FXS 환자의 증상 완화 및/또는 치료 효능 평가에서 FMR1-함유 AAV9 바이러스 입자의 적절한 용량(개인화된 용량)을 결정하는 데, 진단 및/또는 예측 바이오마커로서 사용될 수 있음이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 한 양태는, FXS를 가진 인간 환자에게 유효량의 복수의 아데노-연관 바이러스(AAV) 9 바이러스 입자를 투여함으로써 인간 환자에서 FXS를 치료하는 방법을 제공한다. AAV9 바이러스 입자는 단일-가닥 AAV DNA 벡터를 포함할 수 있으며, 이는, 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있는, 야생형 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질(human FMRP)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. AAV DNA 벡터는 표준 AAV 벡터일 수 있다. 대안적으로, AAV DNA 벡터는 자기-상보적 AAV(scAAV) 벡터일 수 있다. AAV DNA 벡터는 본원에 개시된 AAV9 바이러스 입자의 감염 후 인간 환자의 뇌에서 야생형 인간 FMRP를 발현할 수 있다.
일부 실시형태에서, 야생형 인간 FMRP는 인간 FMRP 동형체 1일 수 있다. 다른 실시형태에서, 인간 FMRP는 1-297 아미노산 잔기의 N-말단 단편을 포함하거나 포함할 수 있는 야생형 인간 FMRP(예를 들어, 동형체 1)의 단편일 수 있다.
일부 실시형태에서, 프로모터는 닭 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터의 하이브리드일 수 있다. 다른 실시형태에서, 프로모터는 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터일 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV DNA 벡터는 인간 FMRP의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 조절 요소는 인간 β-글로빈 인트론 서열, 하나 이상의 polyA 신호전달 서열, 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 polyA 신호전달 서열은 인간 β-글로빈 polyA 신호전달 서열, SV40 polyA 신호전달 서열, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 예에서 AAV DNA 벡터는 WPRE를 포함하지 않는다.
구체적인 예에서, AAV DNA 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터의 하이브리드, WPRE, 및 인간 FMR1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열을 포함하는 표준 AAV 벡터이다.
다른 구체적인 예에서, AAV DNA 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터의 하이브리드, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열을 포함하는 표준 AAV 벡터이다. 일부 경우, 상기 AAV DNA 벡터는 WPRE를 포함하지 않는다.
또 다른 구체적인 예에서, AAV DNA 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 상류의 인간 β-글로빈 인트론 서열, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열 및 인간 β-글로빈 polyA 신호전달 서열을 포함하는 표준 AAV 벡터이다. 일부 경우, 상기 AAV DNA 벡터는 WPRE를 포함하지 않는다.
일부 실시형태에서, AAV DNA 벡터는 비-뇌 조직에서 야생형 FMRP의 발현을 억제하기 위해 하나 이상의 조직-선택적 마이크로RNA에 대해 특이적인 하나 이상의 마이크로RNA-표적 부위(MTS)를 추가로 포함한다. 일부 예에서, 하나 이상의 MTS는 miR-122의 MTS, miR-208a의 MTS, miR-208b-3p의 MTS, miR-499a-3p의 MTS, 또는 이들의 조합일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV9 바이러스 입자는 정맥내 주사, 뇌실내 주사(intracerebroventricular injection), 대조내 주사(intra-cisterna magna injection), 실질내 주사(intra-parenchymal injection), 또는 이들의 조합에 의해 인간 환자에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, AAV9 바이러스 입자는 적어도 두 가지 투여 경로를 통해 인간 환자에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 적어도 두 가지 투여 경로는 뇌실내 주사와 정맥내 주사; 척수강내 주사와 정맥내 주사; 대조내 주사와 정맥내 주사; 또는 실질내 주사와 정맥내 주사일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV9 바이러스 입자의 투여 전에, 인간 환자에게서 뇌파도(EEG), 행동 및/또는 인지 신경 재활 평가, 또는 이들의 조합을 통해 질환의 표현형 중증도를 결정할 수 있다. 일부 예에서, 상기 방법은 상기 투여 단계 전에 인간 환자에게 뇌파도(EEG), 행동 및/또는 인지 신경 재활 평가, 또는 이들의 조합을 적용하는 것을 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 방법은 EEG 분석, 행동 및/또는 인지 평가, 또는 이들의 조합에 기초하여 AAV9 바이러스 입자의 투여량 및/또는 전달 경로를 결정하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 방법은 GABA 수용체 작용제, PI3K 동형체-선택적 억제제, MMP9 길항제, 또는 이들의 조합을 포함하는 치료를 받았거나 받고 있는 인간 환자에게 사용될 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 방법은 GABA 수용체 작용제, PI3K 동형체-선택적 억제제, MMP9 길항제, 또는 이들의 조합을 유효량으로 인간 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 인간 FXS 환자와 같은 대상에서 FMRP를 발현하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터 및 이러한 벡터를 단일-가닥 형태로 포함하는 AAV 입자, 뿐만 아니라 이러한 AAV 바이러스 입자를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는, 5' 역 말단 반복(ITR) 및 3' ITR을 포함하는 AAV 백본; 야생형 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질(FMRP)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; 야생형 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터; 및 비-뇌 조직에서 야생형 FMRP의 발현을 억제하기 위해 하나 이상의 조직-선택적 마이크로RNA에 대해 특이적인 하나 이상의 마이크로RNA-표적 부위(MTS)를 포함한다. 일부 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 자기-상보적 AAV 벡터일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 개시내용은, (i) 5' 역 말단 반복(ITR) 및 3' ITR을 포함하는 AAV 백본; (ii) 야생형 인간 취약 X 정신지체 1 단백질(FMRP)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (iii) (ii)에 작동가능하게 연결된 프로모터; 및 (iv) FMRP의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 표준 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터를 특징으로 한다.
일부 실시형태에서, 상기 프로모터는 닭 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터의 하이브리드이다. 다른 실시형태에서, 상기 프로모터는 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터이다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 하나 이상의 조절 요소는 인간 β-글로빈 인트론 서열, 하나 이상의 polyA 신호전달 서열, 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE), 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 예에서, 상기 하나 이상의 polyA 신호전달 서열은 인간 β-글로빈 polyA 신호전달 서열, SV40 polyA 신호전달 서열, 또는 이들의 조합을 포함한다. 일부 경우, 상기 AAV DNA 벡터는 WPRE를 포함하지 않는다.
일부 예에서, 상기 AAV 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터의 하이브리드, WPRE, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열을 포함한다.
다른 예에서, 상기 AAV 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터의 하이브리드, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열을 포함하며, 여기서 상기 AAV DNA 벡터는 WPRE를 포함하지 않는다.
또 다른 예에서, 상기 AAV 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 상류의 인간 β-글로빈 인트론 서열, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 및 인간 β-글로빈 polyA 신호전달 서열을 포함하며, 여기서 상기 AAV DNA 벡터는 WPRE를 포함하지 않는다.
또한, 인간 환자에서 FXS를 치료하는데 사용하기 위한 본원에 개시된 AAV9 입자, 및 FXS 치료용 약제를 제조하기 위한 AAV9 입자의 용도가 본 발명의 범위 내에 든다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 구성하고, 본 개시내용의 특정 양태를 더 설명하기 위해 포함되며, 이는 본원에 제시된 구체적인 실시형태들에 대한 상세한 설명과 조합하여 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a 및 도 1b는 인간 FMRP를 생산할 수 있는 자기-상보적 AAV(scAAV) 벡터를 묘사하는 도면을 포함한다. 도 1a: 다이어그램은 하이브리드 CMV 인핸서/베타-액틴 프로모터 CB의 제어 하에 인간 FMR1 암호화 서열을 포함하는 scAAV 백본 기반 구조물인 scAAV9-CB-FMR1에 대한 scAAV 플라스미드 구조를 나타낸다. 도 1b: 이미지는 전장 인간 FMRP, flag-태깅된 전장 인간 FMRP 또는 GFP 중 하나를 포함하는 scAAV 바이러스 게놈의 농도를 증가시키면서 형질도입된 1차 배양된 마우스 피질 뉴런에서 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 상단 패널은 FMRP 단백질 발현, 중간 패널은 flag 단백질 발현, 그리고 하단 패널은 GFP 단백질 발현을 나타낸다.
도 2a 내지 도 2c는 인간 FMRP를 생산할 수 있는 AAV(AAV) 벡터를 묘사하는 도면을 포함한다. 도 2a: 다이어그램은 CAG 프로모터의 제어 하에 인간 FMR1 암호화 서열을 포함하는 AAV 백본 기반 구조물인 AAV-CAG-FMR1에 대한 AAV 플라스미드 구조를 나타낸다. 도 2b: 이미지는 전장 인간 FMRP 또는 GFP를 포함하는 AAV 바이러스 게놈의 농도를 증가시키면서 형질도입된 1차 배양된 마우스 해마 뉴런에서 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다. 상단 패널은 FMRP 단백질 발현, 중간 패널은 GFP 단백질 발현, 그리고 하단 패널은 베타-액틴 단백질 발현(로딩 대조군)을 나타낸다. 도 2c: 그래프는 전장 인간 FMRP 또는 GFP 중 하나를 포함하는 AAV 바이러스 게놈의 농도를 증가시키면서 형질도입된 1차 배양된 마우스 해마 뉴런에서 mRNA 발현의 RT-PCR 분석을 나타낸다. 왼쪽 패널은 FMRP mRNA 발현을 나타내고 오른쪽 패널은 GFP mRNA 발현을 나타낸다.
도 3a 내지 도 3c는 피질 및 해마 마우스 뉴런에서 바이러스로 발현된 FMRP 또는 GFP를 나타내는 도면을 포함한다. 도 3a: 이미지는 scAAV9-CB-GFP 바이러스 게놈의 뇌실내(ICV) 주사 2주 후 마우스 뇌에서의 GFP 발현을 나타낸다. 도 3b 및 도 3c: 이미지는 50 μm(도 3b) 및 100 μm(도 3c)에서 AAV-CAG-FMRP 바이러스 게놈의 ICV 주사 2주 후 마우스 뇌에서의 FMRP 발현을 나타낸다. NeuN은 뉴런 세포의 면역조직화학적 마커로 사용되었다.
도 4a 및 도 4b는 마우스가 AAV-CAG-FMRP 또는 AAV-CAG-GFP 바이러스 게놈의 ICV 주사 10주 후 야생형 및 Fmr1 녹아웃(KO) 마우스에서 채취한 뇌 절편에서 AAV-CAG-FMR1 및 AAV-CAG-GFP의 총 단백질 발현에 대한 웨스턴 블롯 분석 이미지를 포함한다. 도 4a: GFP. 도 4b: hFMRP.
도 5는 AAV-CAG-FMRP 또는 AAV-CAG-GFP 투여 후 Fmr1 KO 및 야생형 마우스의 행동 및 기능 평가 연구를 위한 10주 타임라인을 나타내는 이미지를 포함한다.
도 6a 내지 도 6c는 ICV 주사에 의한 AAV-CAG-FMRP 또는 AAV-CAG-GFP 투여 후 Fmr1 KO 및 야생형 마우스에서 수행된 네스팅(nesting) 분석을 나타내는 도면을 포함한다. 도 6a: 이미지는 야생형, AAV-CAG-GFP 주입 마우스(왼쪽 패널) 및 Fmr1 KO, AAV-CAG-GFP 주입된 마우스(오른쪽 패널)에 새 네스렛을 제공한 지 2시간 후에 파쇄된 네스렛을 보여준다. 도 6b: 그래프는 AAV 주사 후 4주에 한 번씩 네스팅 분석을 수행하여, AAV-CAG-FMRP 또는 AAV-CAG-GFP 투여 후 Fmr1 KO 및 야생형 마우스에 의해 파쇄된 네스렛의 백분율을 보여준다. 도 6c: 그래프는 AAV-CAG-GFP가 주입된 Fmr1 KO 및 야생형 마우스와 비교하여 AAV-CAG-FMRP가 주입된 Fmr1 KO 및 야생형 마우스에 대하여 AAV 주사 후 2주와 4주에 네스팅 행동의 개선 백분율을 보여준다.
도 7a 내지 도 7c는 ICV 주사에 의한 AAV-CAG-FMRP 또는 AAV-CAG-GFP 투여 후 Fmr1 KO 및 야생형 마우스에서 수행된 구슬 파묻기(marble burying) 분석을 도시하는 도면을 포함한다. 도 7a: 이미지는 야생형, AAV-CAG-GFP 주입 마우스 및 Fmr1 KO, AAV-CAG-GFP 주입 마우스에서 구슬 파묻기 거동의 예를 보여준다. 도 7b: 그래프는 AAV-CAG-FMRP 또는 AAV-CAG-GFP 투여 후 Fmr1 KO 및 야생형 마우스에서 구슬을 파묻기 시작하는 잠재기를 보여준다. 도 7c: 그래프는 AAV-CAG-FMRP 또는 AAV-CAG-GFP 투여한 다음 Fmr1 KO 및 야생형 마우스에 의해 15분 후 묻힌 구슬의 양을 나타낸다.
도 8a 내지 도 8c는 ICV 주사에 의한 AAV-CAG-FMRP 또는 AAV-CAG-GFP 투여 6-8주 후에 Fmr1 KO 및 야생형 마우스에서 수행된 모리스 수중 미로(Morris Water Maze) 분석을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 8a: 이미지는 본원에 개시된 바와 같이 수행된 모리스 수중 미로 분석의 다이어그램을 보여준다. 도 8b: 그래프는 숨겨진 플랫폼을 공식적으로 포함하는 사분면에 들어가는 항목 수를 보여준다. 도 8c: 그래프는 AAV-CAG-FMRP 또는 AAV-CAG-GFP 투여 후 Fmr1 KO 및 야생형 마우스에서 이전 플랫폼 위치에 진입하기까지의 잠재기(latency)를 보여준다.
도 9는 과잉활동 및/또는 불안을 측정한, 오픈 필드 활동 분석 동안 AAV-CAG-FMR1- 또는 AAV-CAG-GFP-주입된 Fmr1 KO 및 야생형 마우스가 오픈 필드의 중앙에 있었던 총 시간량을 나타내는 그래프를 포함한다.
도 10은 AAV-CAG-FMR1- 또는 AAV-CAG-GFP-주입된 Fmr1 KO 및 야생형 마우스 사이에서 새로운 물체의 선호도 차이를 나타낸 그래프를 포함하고 있으며, 여기서 선호도는 새로운 물체와 상호작용하는 데 걸린 시간을 새로운 물체와 친숙한 물체 모두를 탐색하는 시간으로 나눈 값으로 계산되었다.
도 11a 및 도 11b는 ICV 주사에 의한 AAV 투여 10주 후 AAV-CAG-FMR1- 또는 AAV-CAG-GFP-주입된 Fmr1 KO 및 야생형 마우스의 뇌로부터 제조된 해마 절편에서의 장기 강화(long-term potentiation)의 전기생리학적 측정값을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 11a: 그래프는 60분에 걸쳐 측정된 세타-돌발파(burst) 자극에 의해 유도된 장기 강화를 보여준다. 도 11b: 그래프는 70분에 걸쳐 측정된 세타-돌발파 자극에 의해 유도된 장기 강화를 보여준다.
도 12a 및 도 12b는 ICV 주사에 의한 AAV 투여 10주 후 AAV-CAG-FMR1- 또는 AAV-CAG-GFP-주입된 Fmr1 KO 및 야생형 마우스로부터 수확한 뇌로부터 제조된 피질 절편에서의 단백질 합성 비율을 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 12a: 이미지는 비히클(대조군) 또는 퓨로마이신으로 대뇌피질 절편을 처리한 후 초기 펩티드 사슬로의 퓨로마이신-혼입에 대한 웨스턴 블롯 분석 프로빙(probing)을 보여준다. 도 12b: 그래프는 웨스턴 블롯 분석에 의해 평가된 퓨로마이신 함량의 베타-튜불린-정규화된 밀도 측정을 나타낸다.
도 13은 야생형(WT) 마우스에 비해 Fmrl KO에서 감마 파워가 증가한 그래프를 포함하며, 여기서 연속 EEG에 의해 측정된 감마 파워는 6일에 걸쳐 5분 동안 계산되었다(n=3, RM 2-way ANOVA, *p<0.05).
도 14a 내지 도 14d는 취약 X 증후군(FXS)의 감마(y) 파워 관련 이상에 대한 인간 데이터의 평가를 나타내는 다이어그램을 포함한다. 도 14a: FXS에서의 과도한 y 파워. 유의한 그룹 차이(p < 0.05 보정)를 포함하는 상대적 y 파워의 토포그래픽 플롯. 도 14b: 청각성 피질 y 파워는 행동과 높은 상관관계가 있다. y가 높을수록 FXS에서의 청각 주의에 대한 성능이 저하된다. 도 14c: 세타 및 알파 파워와의 y 관계는 FXS(회색)와 HC(검은색)를 매우 구별한다. 도 14d: 마우스 EEG 분석을 위한 맞춤형 분석 소프트웨어로부터의 EEG 파워 분석 출력.
도 15는 CAGWPRE 벡터의 플라스미드 맵을 나타낸 다이어그램이다.
도 16은 CAGdelWPRE 벡터의 플라스미드 맵을 나타낸 다이어그램이다.
도 17은 hPGK 벡터의 플라스미드 맵을 나타낸 다이어그램이다.
도 18a 및 도 18b는 벡터 CAGWPRE(도 18a) 및 CAGdelWPRE(도 18b)에 의한 FMRP의 발현을 보여주는 사진을 포함한다.
도 19는 CAGWPRE 벡터, CAGdelWPRE 벡터 및 hPGK 벡터에 의한 FMRP의 발현을 보여주는 사진이다.
도 20a 내지 도 20g는 AAV-CAG-FMR1 벡터를 함유하는 AAV 입자의 투여 후 다양한 조직에서 GAPDH로 정규화된 FMRP 및 eGFP의 발현을 보여주는 도면을 포함한다. 상기 결과는 RT-PCT 분석으로 얻었다. 도 20a: 피질. 도 20b: 해마. 도 20c: 중뇌. 도 20d: 소뇌. 도 20e: 심장. 도 20f: 간. 도 20g: 신장.
취약 X 증후군(FXS)은 마틴-벨(Martin-Bell) 증후군 또는 에스칼란테 증후군(Escalante's syndrome)으로도 알려져 있으며, X 염색체의 FMR1 유전자에서 CGG 트리뉴클레오티드 반복이 확장되어 발생하는 유전 질환이다. FXS를 담당하는 확장된 CGG 트리뉴클레오티드 반복은 정상적인 신경 발달에 필요한 취약 X 정신지체 단백질(FMRP)을 암호화하는 FMR1 유전자의 5' 비-번역 영역(UTR)에 위치한다. 5' UTR에서 트리뉴클레오티드 반복(CGG)은 일반적으로 6-53개의 복사본으로 발견되나, FXS에 걸린 개인은 일반적으로 CGG 코돈의 55-230개의 반복을 가지며, 이는 FMR1 프로모터의 메틸화, 상기 유전자의 침묵 및 FMRP 생성 실패를 초래한다.
FMRP는 번역 및 안정성을 조절하는 수백 개의 mRNA와 관련이 있으며, 또한 시냅스에서 이온 채널을 결합하여 신경 흥분성에 직접적으로 영향을 미칠 수도 있다. 결과적으로 FMRP의 손실은 인간의 단일 약물 전략으로, 불가능하지는 않더라도 보정하기 어려운 분자, 세포 및 구조적 결함의 과잉으로 이어진다. FMRP가 없을 때 발생하는 결과적인 결함은 인지 장애, 의사소통 결핍, 사회적 기술 결핍, 감각 민감성, 부주의, 적응 행동 결핍, 불안, 자율 시스템 조절 장애 및 발작을 초래할 수 있다.
본 개시내용은, FXS와 관련된 행동 및 기능적 증상을 개선하기 위해, 작용성(예를 들어, 야생형) 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질(FMRP)을 발현하기 위한 핵산을 포함하는 AAV9 바이러스 입자에 의해 FXS를 치료하는 것을 개발함을 목적으로 한다 .
본 개시내용은, 마우스 모델에서 FMRP의 성공적인 발현으로 이어진 다양한 AAV 벡터의 개발을 보고한다. 놀랍게도, FXS 마우스 모델에서 관찰된 바와 같이 FXS의 동물 모델의 CNS에 FMRP를 암호화하는 AAV9 바이러스 입자를 전달하는 것을 통한 낮은 수준의 FMRP 발현은 성공적으로 FXS와 관련된 증상을 완화시켰다. 추가로, 본 개시내용은, 뇌파도(EEG), 행동, 인지 신경 재활 평가, 또는 이들의 조합이, 예를 들어 개별 FXS 환자에 대한 FMRP를 암호화하는 AAV9 바이러스 입자의 적절한 용량을 평가하는 데, 진단 및/또는 예측 바이오마커로서 사용될 수 있음을 보고한다. 또한, 이러한 바이오마커들은 치료 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다.
본 개시내용은 연령 및 성별이 일치하는 대조군을 가진 강력한 FXS 샘플에서 강화된 피질 흥분성의 증거를 확립했다. 고밀도 배열 EEG 데이터를 소스 현지화(source localizing)함으로써, 세 가지 주요 관심 결과가 확인되었다: (i) 초점(focal)은 기능 휴지기 네트워크와 피질 영역 내에서의 감마 진동을 증가시킨다; (ii) 저주파 파워 및 커플링 관계의 현저한 변경; 및 (iii) 사례 대조군과 무관한, 기본 모드 네트워크의 소스-평가된 감마 파워는 질환-특이적 지적 장애를 잘 예측하게 한다. 이러한 발견은, FXS 내의 이질성을 "네트워크의 질환" 및 피질의 과잉흥분으로 해석하는 효과적인 방법을 지원하고, 이러한 변화 및 FXS에서의 지적 장애에 대한 임상적 관련성(이는 치료하기에 적합한 환자를 확인하고/하거나 치료 효과를 모니터링하기 위한 바이오마커로서 사용될 수 있다)을 측정하는 실현가능한 방법을 제공한다.
따라서, 본원에서는, FMRP를 발현하기 위한 AAV9 바이러스 벡터 및 입자, 및 FXS 환자에서 FXS 증상을 완화하기 위한 이들의 용도가 제공된다. 또한, 개시된 AAV9 바이러스 입자를 제조하는 방법, 및 본원에 개시된 행동 특징들 중 하나 이상을 바이오마커로서 사용하여 개별 FXS 환자에 대한 AAV9 바이러스 입자의 적절한 용량(개인화된 용량)을 결정하는 방법이 제공된다.
I. FMR1 단백질 발현을 위한 AAV 바이러스 입자
한 양태에서, 본 개시내용은 FXS의 치료가 필요한 대상에게 FMRP를 전달하기 위한 비히클로서 사용하기 위한 AAV 바이러스 입자(예를 들어, AAV9 바이러스 입자)를 제공한다.
파보바이러스과(Parvovirus family)에 속하는 아데노-연관 바이러스(AAV)는 작은, 외피-비보유 바이러스이다. 여기서 AAV 입자는, 단일-가닥 DNA 게놈을 둘러싸는 캡시드 단백질 소단위체인 VP1, VP2 및 VP3로 구성된 AAV 캡시드를 포함할 수 있다. 비병원성, 비분열 세포를 포함한 광범위한 숙주 감염 범위, 통합 결여의 특성은 AAV를 매력적인 유전자 전달 비히클로 만든다.
본원에서 사용되는 AAV 바이러스 입자는 바이러스 캡시드 단백질에 의해 캡슐화된 AAV DNA 벡터를 포함한다. AAV 바이러스 입자는 혈청형에 따라 특정 조직과 세포를 감염시킬 수 있다. 아래 설명을 참조한다. AAV DNA 벡터(또는 AAV 벡터)는, 야생형 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질(FMRP)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 선택적으로 FMRP의 발현을 조절하기 위한 조절 요소를 포함하는 바이러스 입자에 함유된 DNA 분자를 의미한다. 조절 요소는 FMRP의 발현 수준을 조절하고/하거나 안전성을 향상시키기 위해 선택될 수 있다. 예를 들어, FMR1 암호화 서열은 FMRP의 발현을 유도하는 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결될 수 있다. 일부 경우에, AAV DNA 벡터는 FMRP의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 요소, 예를 들어 하나 이상의 miRNA 결합 부위, 인핸서, 전사 인자 결합 부위, polyA 신호전달 요소, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.
(A) FMRP 단백질
본원에 개시된 AAV 바이러스 입자, 예컨대 AAV9 바이러스 입자는 작용성 FMRP를 발현하기 위한 AAV 벡터를 갖는다. FMR1은 특정 mRNA를 핵에서 뉴런 시냅스로 운반하는 뇌에서 고도로 발현되는 mRNA 결합 단백질이다. FMRP가 없으면 시냅스가 적절하게 형성되지 않아 FXS와 관련된 인지 능력의 감소와 발달 장애를 초래한다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 FMRP는 자연-발생 FMRP일 수 있다. 자연-발생 FMRP 또는 하위 단위는 적합한 종, 예를 들어 포유류, 예컨대 마우스, 래트, 토끼, 돼지, 비-인간 영장류 또는 인간으로부터 유도된 것일 수 있다. 일부 예에서 FMRP는 야생형 인간 단백질이다. 다양한 종에서 자연-발생 FMRP는 당업계에 잘 알려져 있으며, 그 서열은 GenBank와 같은 공개 유전자 데이터베이스에서 검색할 수 있다.
자연-발생 인간 FMRP의 구조에는 여러 개의 보존된 작용성 도메인이 포함되어 있다. 예를 들어, FMRP의 작용성 도메인은 2개의 튜더(tudor) 도메인, 핵 위치 신호(NLS), 3개의 K 상동성 도메인(KH0, KH1, KH2), 핵외수송 신호(NES) 및 N-에서 C-말단까지의 아르기닌-글리신-글리신 도메인(RGG)으로 구성된다. 튜더, KH 및 RGG 도메인은 주로 RNA 결합에 관여하지만, 이들은 단백질 상호작용 파트너도 갖는다.
FMR1 유전자는 약 38 kb의 게놈 DNA에 걸쳐 있는 17개의 엑손(exon)으로 구성된 고도로 보존된 유전자이다. FMR1 유전자는 다양한 FMR1 전사 동형체를 생성하는 광범위한 대체 스플라이싱(alternative splicing)을 거쳐, 여러 FMRP 동형체를 생성한다. FMR1 전사 동형체는 아래 표 1과 같이 그들의 엑손 구조에 따라 여러 그룹으로 분류될 수 있다.
Figure pct00001
인간 FMR1 유전자는 대체 스플라이싱의 결과로 총 11개의 FMRP 동형체를 생성할 수 있다. 이러한 FMRP 동형체는 약 400개 잔기의 고도로 보존된 N-말단 단편과 다양한 mRNA 결합 친화성을 갖는 가변 C-말단 서열을 공유한다. FMR1의 임의의 스플라이스 동형체가 본 개시내용에서 사용될 수 있다. 일부 예에서, 본원에서 사용되는 인간 FRMP는 FRMP 동형체 1이다. 인간 FMRP 동형체 1의 아미노산 서열이 아래에 제공된다(서열번호 1).
Figure pct00002
FMRP에 대한 예시적인 암호화 서열은 GenBank 접근 번호 NM_002024에서 확인할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV 입자에 의해 생성되는 FMRP는 자연-발생 인간 FMRP의 작용성 단편일 수 있다. 그러한 작용성 단편은 본원에 개시된 하나 이상의 FMRP 작용성 도메인을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 작용성 단편은 야생형 FMRP의 약 400개 아미노산 길이의 N-말단 보존된 도메인을 포함한다. 일부 예에서, FMRP의 단편은 N-말단 1-297 아미노산 잔기를 포함할(예를 들어, 이로 구성될) 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 상기 작용성 단편은 적어도 하나의 튜더 도메인, 적어도 하나의 NLS, 적어도 하나의 KH, 적어도 하나의 NES, 적어도 하나의 RGG, 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 작용성 단편은 야생형 대응물과 비교하여 N-말단에서 절두부(truncation)를 가질 수 있다. 다른 예에서, 작용성 단편은 야생형 대응물과 비교하여 C-말단에서 절두부를 가질 수 있다. 일부 경우에, 작용성 단편은 야생형 대응물과 비교하여 N-말단 및 C-말단 모두에서 절두부를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV 입자에 의해 생성되는 FMRP는 자연-발생 FMR1의 작용성 변이체(예를 들어, 인간 FMR1 동형체 1의 작용성 변이체)일 수 있다. 이러한 작용성 변이체는 자연-발생 FMR1 대응물(예를 들어, 서열번호 1)과 높은(예를 들어, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상) 서열 상동성을 공유하며, 자연-발생 FMR1 대응물과 실질적으로 유사한 생체 활성(예를 들어, 야생형 대응물과 비교했을 때 적어도 80%의 생체 활성)을 갖는다.
두 아미노산 서열의 "% 동일성"은 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 수정한 것을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 통합된다. BLAST 단백질 검색을 XBLAST 프로그램(점수=50, 단어 길이=3)으로 수행하여 본 발명의 단백질 분자와 상동성인 아미노산 서열을 얻을 수 있다. 두 서열 사이에 갭이 존재하는 경우, 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 설명된 바와 같이 Gapped BLAST를 사용할 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 사용하는 경우, 각 프로그램의 기본 매개변수(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)를 사용할 수 있다.
본원에 개시된 임의의 작용성 변이체는 본원에 설명된 것들과 같은 야생형 FMRP의 작용성 도메인 중 하나 이상, 예를 들어, N-말단 보존된 도메인, 튜더 도메인, KH 도메인 및/또는 RGG 도메인을 포함할 수 있으며, 하나 이상의 비-작용성 도메인에서의 하나 이상의 변이체를 포함한다. 대안적으로, 작용성 변이체는, 예를 들어 하나 이상의 작용성 도메인 및/또는 하나 이상의 비-작용성 도메인에서, 야생형 대응물에 대한 보존적인 아미노산 잔기 치환을 함유할 수 있다.
본원에서 사용된 "보존적 아미노산 치환"은 아미노산 치환이 이루어지는 단백질의 상대 전하 또는 크기 특성을 변경시키지 않는 아미노산 치환을 의미한다. 변이체는 당업자에게 공지된 폴리펩티드 서열을 변경하는 방법, 예를 들어 그러한 방법을 기술하는 참고문헌, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, J. Sambrook, et al., eds., Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989], 또는 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F.M. Ausubel, et al., eds., John Wiley & Sons, Inc., New York]에서 확인되는 방법에 따라 제조될 수 있다. 아미노산의 보존적 치환은 하기 그룹 내의 아미노산 사이에서 이루어진 치환을 포함한다: (a) M, I, L, V; (b) F, Y, W; (c) K, R, H; (d) A, G; (e) S, T; (f) Q, N; 및 (g) E, D.
일부 예에서, 본원에 개시된 임의의 AAV 벡터에서 전이유전자에 의해 암호화된 FMRP는 숙주 세포로부터 FMRP를 분비할 N 말단에 위치한 신호 펩티드를 포함할 수 있다. 이러한 신호 펩티드의 예는 알부민, β-글루쿠로니다제, 알칼리성 프로테아제 또는 피브로넥틴으로부터의 신호 펩티드를 포함한다.
다른 예에서, 본원에 개시된 FMRP는 본원에 개시된 벡터를 포함하는 융합 단백질일 수 있고, 핵산 전이유전자가 FMRP의 분비를 향상시키는 단백질 모티프, 예를 들어, Tat 또는 VP22의 PTD와 같은 단백질 형질도입 도메인(PTD)과 융합된 것을 포함할 수 있다.
(B) AAV 벡터
AAV 벡터는 바이러스의 야생형 게놈(바이러스 골격 요소)에서 유도된 필수적인 유전적 요소로 구성되어 있어, 바이러스 입자 내로 패키징되고 숙주 세포에서 운반되는 전이유전자를 발현할 수 있다. 또한, 본원에 개시된 AAV 벡터는 본원에 개시된 FMRP에 대한 암호화 서열, 및 상기 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 적절한 프로모터를 포함한다. 일부 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 암호화된 FMRP의 발현 및/또는 분비를 조절하는 하나 이상의 조절 서열을 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어, 인핸서, 인트론 서열, 폴리아데닐화 신호전달 부위, 내부 리보솜 진입 부위(IRES), 마이크로RNA-표적 부위, 전사-후 조절 요소(PRE; 예를 들어 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)), 또는 이들의 조합을 포함하지만 이에 한정되는 것은 아니다. 안전 문제가 제기될 수 있는 요소는 제외될 수 있다.
일부 예에서, AAV 벡터는 단일-가닥 핵산을 포함하는 일반(표준) AAV 벡터일 수 있다. 예를 들어, 도 2a 및 도 15 내지 도 17을 예로서 참조한다. 다른 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 내부에 이중 가닥 부분을 포함할 수 있는 자기-상보적 AAV 벡터일 수 있다. 예를 들어, 도 1a를 예로서 참조한다.
(1) 바이러스 백본 요소
본원에 개시된 AAV 벡터는 하나 이상의 AAV-게놈 유래 백본 요소를 포함하며, 이는 AAV 벡터의 생체활성에 필요한 최소 AAV 게놈 요소를 지칭한다. 예를 들어, AAV-게놈 유래 백본 요소는 AAV 바이러스 입자 내로 조립될 AAV 벡터에 대한 패키징 부위, 숙주 세포에서 그 안에 포함된 전이유전자의 벡터 복제 및/또는 발현에 필요한 요소를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상업적으로 입수가능한 AAV 벡터(예를 들어, Addgene로부터 입수가능)가 여기서 사용될 수 있다. 예를 들어, Addgene에 의해 제공되는 AAV 벡터(예를 들어, Addgene 플라스미드 #28014)가 사용될 수 있고, 그 안에 함유된 GFP 유전자가 FMR1에 대한 암호화 서열로 치환될 수 있다.
AAV 벡터에 사용하기 위한 바이러스-유도된 요소는 당업계에 잘 알려져 있다. 전형적으로, AAV 벡터는 야생형 AAV 게놈으로부터 유도된 역 말단 반복(ITR: inverted terminal repeat) 서열 중 하나 또는 둘 모두를 포함할 것이다. 일부 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터의 ITR 서열은 야생형일 수 있다. 다른 예에서, AAV 벡터에서 사용되는 ITR 서열은 야생형 ITR의 변형된 버전(예를 들어, 절두된 버전)일 수 있다. 야생형 또는 변형된 버전을 포함하여 AAV 벡터를 구축하는데 사용하기 위한 ITR 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 문헌[Daya et al., Clinical Microbiology Reviews, 21(4):583-593 (2008)]를 참고하며, 이의 관련 개시 내용은 본원에 언급된 주제 및 목적을 위해 참고로 인용되어 포함된다. 일부 예에서 AAV2 ITR이 사용될 수 있다.
일부 예에서, 본원에 개시된 바이러스 백본 요소는 적어도 하나의 역 말단 반복(ITR) 서열, 예를 들어 2개의 ITR 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하나의 ITR 서열은 FMRP에 대한 암호화 서열의 5'이다. 다른 예에서, 하나의 ITR 서열은 상기 암호화 서열의 3'이다. 일부 예에서, FMRP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 AAV 벡터에서 2개의 ITR 서열 옆에 있다. 일부 예에서, FMRP를 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열은 본원에 개시된 AAV 벡터에서 2개의 스터퍼(stuffer) 서열 옆에 위치될 수 있다.
(2) 자기-상보적 AAV 바이러스 벡터
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 자기-상보적 AAV(scAAV) 벡터이다. 자기-상보적 AAV(scAAV) 벡터는 감염된 세포에 들어갈 때 자발적으로 어닐링(자체 상의 접힘을 통해 이중 가닥 게놈을 형성)할 수 있는 상보적 서열을 포함하며, 따라서 세포의 DNA 복제 기계를 사용하여 단일-가닥 DNA 벡터 변환의 필요성을 없앤다. 자기-상보적 AAV 벡터는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제6,596,535호; 제7,125,717호; 제7,765,583호; 제7,785,888호; 제7,790,154호; 제7,846,729호; 제8,093,054호; 및 제8,361,457호; 및 문헌[Wang Z., et al., (2003) Gene Ther 10:2105-2111]을 참조하고, 이들 각각의 관련 개시내용은 본원에서 참조한 목적 및 주제를 위해 참고로 인용하여 포함된다. 자기-상보성 게놈을 포함하는 AAV는 그의 부분-상보성 서열(예를 들어, 전이유전자의 상보성 암호화 및 비암호화 가닥) 덕분에 이중 가닥 DNA 분자를 신속하게 형성할 수 있으며, 이에 의해 암호화된 단백질을 신속하게 생산할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 scAAV 바이러스 벡터는 가닥내 염기쌍을 형성하는 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, FMR1 암호화 가닥) 및 제2 이종 폴리뉴클레오티드 서열(예를 들어, FMR1 비암호화 또는 안티센스 가닥)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열 및 제2 이종 폴리뉴클레오티드 서열은 가닥내 염기쌍 형성을 용이하게 하는 서열에 의해 연결되어, 예를 들어 헤어핀 DNA 구조를 형성한다.
일부 예에서, 세포에 유입될 때 scAAV 벡터의 이량체 구조는 2개의 말단 분해 부위(trs) 중 하나의 돌연변이 또는 결실에 의해 안정화될 수 있다. trs는 각 ITR 내에 포함된 Rep-결합 부위이므로 이러한 trs의 돌연변이 또는 결실은 AAV Rep 단백질이 scAAV 벡터의 이량체 구조를 절단하여 단량체를 형성하는 것을 방지할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 개시된 scAAV 바이러스 벡터는 절두형 5' 역 말단 반복(ITR), 절두형 3' ITR, 또는 둘 모두를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 scAAV 벡터는 절단된 3' ITR을 포함할 수 있고, 여기서 D 영역 또는 이의 일부(예를 들어, 그 안의 말단 분해(resolution) 서열)는 결실될 수 있다. 이러한 절두형 3' ITR은 상기 언급된 제1 이종 폴리뉴클레오티드 서열과 제2 이종 폴리뉴클레오티드 서열 사이에 위치할 수 있다.
(3) 프로모터
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는, 인간 뇌 세포와 같은 적합한 숙주 세포에서 암호화된 FMRP의 발현을 제어하기 위해 FMR1 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 적합한 프로모터를 포함할 수 있다. 이러한 프로모터는, 숙주 세포에서 효율적이고 적합한 단백질 생산을 가능하게 하기 위해 유비쿼터스(ubiquitous)형이거나, 조직 특이적이거나, 강력하거나, 약하거나, 조절형이거나, 키메라형 등일 수 있다. 프로모터는 암호화된 단백질에 대해 동종형이거나, 세포, 바이러스, 진균, 식물 또는 합성 프로모터를 포함한 이종형일 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 임의의 AAV 벡터에 사용되는 프로모터는 인간 세포에서 작용성이며, 예를 들어 뇌 세포에서 작용성이다. 유비쿼터스 프로모터의 비제한적 예는 바이러스 프로모터, 특히 CMV 프로모터, RSV 프로모터, SV40 프로모터 등 및 포스포글리세레이트 키나제(PGK; phosphoglycerate kinase) 프로모터(예를 들어, 인간 PGK 프로모터)와 같은 세포 프로모터를 포함한다.
일부 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 내부의 FMR1 전이유전자의 발현을 제어하기 위한 뇌-특이적 프로모터를 포함할 수 있다. 이러한 뇌-특이적 프로모터는 비-뇌 세포에서보다 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배 더 많은 뇌 조직에서의 전이유전자의 발현을 유도할 수 있다. 다른 예에서, 프로모터는 VE-카드헤린(cadherin) 프로모터와 같은 내피 세포-특이적 프로모터일 수 있다. 또 다른 예에서, 상기 프로모터는 스테로이드 프로모터 또는 메탈로티오네인 프로모터일 수 있다. 바람직하게는, 이 프로모터는 인간 프로모터이다.
일부 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 FMRP의 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, CMV 프로모터는 야생형 CMV 프로모터이다. 다른 예에서, AAV 벡터는 닭 베타-액틴 유전자 프로모터를 포함할 수 있다. 특정 예에서, AAV 벡터는 하이브리드 CMV/닭 베타-액틴 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터는 합성 CAG 프로모터를 포함할 수 있으며, 이는 CMV 초기 인핸서 요소, 프로모터, 닭 베타-액틴 유전자의 첫 번째 엑손 및 첫 번째 인트론, 및 토끼 베타-글로빈 유전자의 스플라이스 수용체를 함유한다. CAG 프로모터의 뉴클레오티드 서열이 하기에 제공된다:
변형된 CAG 서열 (서열번호 2):
Figure pct00003
다른 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 인간 PGK 프로모터와 같은 PGK 프로모터를 포함할 수 있다. 하나의 예가 하기에 제공된다.
hPGK 프로모터 서열 (서열번호 3)
Figure pct00004
(4) 마이크로RNA 표적 부위
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 적어도 하나의 miRNA 표적 부위(MTS)를 포함할 수 있다. 본원에서 "miRNA 표적 부위" 또는 "miRNA 표적 서열"은 miRNA가 특이적으로 결합하는 핵산 서열을 의미한다. 하나 이상의 miRNA 결합 부위를 포함하는 AAV 벡터로부터 전사된 mRNA의 번역은, 해당 miRNA가 miRNA 표적 부위에 결합할 때, 일반적으로 차단(침묵)되어 mRNA의 불안정화를 초래할 수 있다. miRNA 표적 부위는, miRNA가 miRNA 표적 부위에서 염기쌍을 형성할 수 있도록 상응하는 miRNA에 (완전히 또는 부분적으로) 상보적인 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 하나 이상의 miRNA 표적 부위는 FMR1 암호화 서열 하류의 3'에 위치한다. 그 경우에, 생성된 mRNA는 3' 비-번역된 영역(3' UTR)에 miRNA 표적 서열을 포함할 것이다.
일부 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는, 비-뇌 조직에서 FMRP의 발현을 억제하기 위해 하나 이상의 조직-선택적 마이크로RNA에 대해 특이적인 하나 이상의 마이크로RNA-표적 부위(MTS)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, 적어도 하나의 MTS는 MTS가 결여된 벡터와 비교하여 적어도 2배, 5배, 10배, 20배, 50배 또는 100배만큼 비-뇌 조직에서 FMRP를 억제할 수 있다. 일부 예에서, AAV 벡터는, 간, 폐, 췌장, 신장, 심장 등과 같은 비-뇌 기관에 대해 특이적인 miRNA에 의해 결합되어 이러한 기관에서 FMR1의 발현을 차단할 수 있는 적어도 하나의 MTS를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 miR122에 대해 특이적인 MTS를 포함할 수 있다. miR122는 간에 풍부하며, 또한 갑상선, 비장 및 폐에서 발현된다. 췌장, 신장 및 동맥에서는 miR122의 낮은 수준의 발현이 관찰되었다. 다른 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 miR-208a 또는 miR-208b-3p에 대해 특이적인 MTS를 포함할 수 있으며, 이는 심근, 근육에 풍부하고, 또한 갑상선에서 낮은 수준으로 발현된다. 또 다른 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 miR-499a-3p에 대해 특이적인 MTS를 포함할 수 있으며, 이는 심근, 근육, 또한 갑상선, 전립선 및 뼈에 풍부하다. 본원에 개시된 AAV 벡터에 사용하기 위한 추가의 적합한 MTS는 당업계에 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Luwig et al., Nucleic Acid Res. 44(8):3865-3877 (2016)]을 참조하고, 관련 개시 내용은 본원에 참조되는 주제 및 목적을 위해 참고로 인용되어 포함된다. 특정 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 본원에 개시된 것과 같은 조직 특이적 miRNA 표적 부위의 조합을 포함할 수 있다.
(5) 유전자 발현을 위한 기타 조절 요소
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는, 뇌 세포에서 FMRP의 발현을 조절하기 위해 (FMRP를 암호화하는) 전이유전자에 작동가능하게 연결될 수 있는 하나 이상의 조절 요소를 추가로 포함할 수 있다. 예시적인 조절 요소는 전사 개시 부위 및/또는 종결 부위, 인핸서 서열; 스플라이싱 및 폴리아데닐화(polyA) 신호와 같은 효율적인 RNA 처리 신호; 세포질 mRNA를 안정화시키는 서열; 번역 효율을 향상시키는 서열(즉, 코작(Kozak) 컨센서스 서열); 단백질 안정성을 향상시키는 서열; 및 원하는 경우, 암호화된 생성물의 분비를 향상시키는 서열을 포함하며, 이들에 국한되지 않는다. 천연, 구성적, 유도성 및/또는 조직-특이적인 것을 포함하는 다수의 발현 제어 서열이 당업계에 공지되어 있고 본 개시내용에서 이용될 수 있다.
예를 들어, AAV 벡터는 폴리아데닐화 서열, 예컨대 SV40 폴리아데닐화 서열 또는 소 성장 호르몬의 폴리아데닐화 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, AAV 벡터는 하나 이상의 인트론 서열, 하나 이상의 polyA 신호 서열 및/또는 하나 이상의 전사-후 조절 요소를 포함할 수 있다. 안전성 문제를 제기할 수 있는 요소, 예를 들어 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE)는 경우에 따라 배제될 수 있다.
(6) AAV 벡터의 예시적 예
일부 예에서, 본원에 개시된 AAV 벡터는 (a) 5' 역 말단 반복(ITR) 및 3' ITR을 포함할 수 있는 AAV 바이러스 백본; (b) 작용성 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1)(예를 들어, 인간 FMR1 동형체 1) 단백질(FMRP)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (c) 상기 FMRP 암호화 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터, 및 (d) 하나 이상의 마이크로RNA-표적 부위(MTS)를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 프로모터는 닭 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터의 하이브리드(예를 들어, CAG 프로모터)일 수 있다. 대안적으로 또는 추가적으로, 하나 이상의 조직-선택적 miRNA 표적 부위는, 비-뇌 조직에 존재하지만 뇌 세포에는 존재하지 않는 (또는 FMRP의 발현이 유의적으로 영향을 받지 않도록 매우 낮은 수준으로만 존재하는) 하나 이상의 miRNA에 대해 특이적일 수 있다. 예시적인 MTS는 miR-122, miR-208a, miR-208b-3p, miR-499a-3p, 또는 이들의 조합에 대해 특이적인 것들을 포함한다. 이러한 AAV 벡터는 본원에 개시된 조절 요소를 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.
다른 예에서, 본원에서 제공되는 AAV 벡터는, (a) 5' 역 말단 반복(ITR) 및 3' ITR(둘 중 하나 또는 둘 다 절두됨); (b) 야생형 인간 FMR1 동형체 1 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (c) 상기 FMRP-암호화 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는 자기-상보적 AAV(scAAV) 벡터이다. 일부 경우에, 프로모터는 닭 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터의 하이브리드(예를 들어, CAG 프로모터)이다. 일부 예에서, scAAV는 하나 이상의 마이크로RNA-표적 부위(MTS)를 추가로 포함할 수 있으며, 이는 비-뇌 조직에 존재하지만 뇌 세포에는 존재하지 않는(또는 FMRP의 발현이 유의적으로 영향을 받지 않도록 매우 낮은 수준으로만 존재하는) 하나 이상의 miRNA에 대해 특이적일 수 있다. 예시적인 MTS는 miR-122, miR-208a, miR-208b-3p, miR-499a-3p, 또는 이들의 조합에 대해 특이적인 것들을 포함한다. 이러한 scAAV 벡터는 본원에 개시된 조절 요소를 하나 이상 추가로 포함할 수 있다.
scAAV 벡터는 일반적으로 제한된 삽입 용량(insertion capacity)을 갖는 것으로 알려져 있다. 따라서 이러한 유형의 AAV 벡터는 일반적으로 큰 전이유전자에는 적합하지 않은 것으로 간주된다. 본 개시내용에서는, scAAV 벡터를 사용하여 전장 인간 FMR1 동형체 1의 암호화 서열을 성공적으로 클로닝하고 암호화된 FMR1 동형체 1 단백질(FMRP 동형체 1)을 발현했다. 이 데이터는, scAAV 벡터가, 유전자 치료 목적으로 큰 전장 FMR1 동형체 1 단백질(FMRP 동형체 1)을 전달하는 데 사용하기에 적합할 것임을 시사한다.
일부 예에서, 본원에서 제공되는 AAV 벡터는, (i) 5' 역 말단 반복(ITR) 및 3' ITR을 포함하는 AAV 백본; (ii) 야생형 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열; (iii) (ii)에 작동가능하게 연결된 프로모터; 및 (iv) FMRP의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 요소를 포함하는 표준(일반) AAV 벡터일 수 있다. 프로모터는 본원에 개시된 바와 같은 CAG 프로모터일 수 있다. 대안적으로, 프로모터는 또한 본원에 개시된 바와 같은 PGK 프로모터일 수 있다. 일부 경우, AAV 벡터는 하나 이상의 조절 요소를 포함하며, 이는 예컨대 하나 이상의 인트론 서열(예를 들어, 인간 β-글로빈 인트론 서열), 하나 이상의 polyA 신호 서열(예를 들어, SV40 polyA 신호 서열, 인간 β-글로빈 polyA 신호 서열, 또는 이들의 조합), 하나 이상의 전사-후 조절 요소(예를 들어, WRPE), 또는 이들의 조합일 수 있다. 다른 경우에, 본원에서 제공되는 AAV 벡터는 안전성을 개선하기 위해 WRPE 등을 함유하지 않을 수 있다.
본원에 개시된 AAV 벡터의 특정 예는 하기 실시예 1에서 제공된다.
(C) AAV 바이러스 입자의 혈청형
AAV 바이러스 입자는 뇌 세포를 감염시킬 수 있는 적합한 혈청형일 수 있다. 지금까지 확인된 AAV 바이러스의 혈청형은 11가지이다. 이들 혈청형은 그들이 감염시키는 세포의 유형이 다르다. 일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV 바이러스 입자는 AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV8 또는 AAV9일 수 있으며, 이들은 모두 뇌 세포를 감염시킬 수 있다. 일부 예에서, AAV 바이러스 입자는 AAV9이다.
일부 예에서, AAV 바이러스 입자는 하나의 혈청형으로부터의 게놈 요소 및 적어도 다른 혈청형으로부터의 캡시드를 포함하는 하이브리드 AAV일 수 있다. 예를 들어, AAV 벡터는 AAV2로부터의 게놈 요소(예를 들어, AAV2 ITR, 야생형 또는 변형된 버전) 및 뇌 세포를 감염시킬 수 있는 혈청형 중 하나로부터의 캡시드(예를 들어, AAV9)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 개시된 AAV 바이러스 입자는, AAV 바이러스 입자의 향성(tropism)을 변경하여 뇌 세포 감염시킬 수 있도록 하기 위해, 예를 들어 비-바이러스 단백질 또는 펩티드에 의해 또는 구조적 변형에 의해 변형된 캡시드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 캡시드는 이를 포함하는 AAV 바이러스 입자가 뇌 세포를 표적화하고 감염시킬 수 있도록 뇌 세포 수용체(예를 들어, 뇌 세포 특이적 수용체)의 리간드를 포함할 수 있다.
(D) AAV 입자의 제조 방법
본원에 개시된 AAV DNA 벡터 구조물(vector construct)은 공지 기술, 예를 들어 재조합 기술을 사용하여 제조될 수 있다. 예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel., F. et al., eds, Wiley and Sons, New York 1995])을 참조한다. 일부 경우에는, AAV 입자의 패키징 용량을 충족하도록 전이유전자 및 조절 요소의 크기를 설계할 수 있다. 필요한 경우, 비교 목적을 위해, 표준 AAV 게놈 크기를 유지하기 위해 구조물에 "스터퍼" DNA 서열을 추가할 수 있다. 이러한 단편은, 당업자에게 공지되어 있고 이용가능한 이러한 비-바이러스 공급원으로부터 유도될 수 있다.
AAV DNA 벡터는 바이러스 입자로 패키징될 수 있으며, 이는 발현을 위해 전이유전자를 숙주 세포에 전달하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본원에 개시된 바와 같은 AAV 벡터는, AAV 비리온(virion) 패키지에 필요한 캡시드 단백질과 같은 바이러스 단백질을 생산할 수 있는 생산자 세포주(패키징 세포)로 형질감염될 수 있다.
패키징 세포주는, AAV 입자 생성에 필요한 모든 성분, 예를 들어 AAV rep 및 cap 유전자, 및 선택적으로, 선택가능한 마커, 예컨대 네오마이신 내성 유전자로 안정적으로 형질감염된 세포주를 확립함으로써 생성될 수 있다. 예를 들어 문헌[Samulski et al., 1982, Proc. Natl. Acad. S6. USA, 79:2077-2081]을 참조한다. 일부 경우에 패키징 세포주는, AAV 바이러스 입자를 제조할 때, 아데노바이러스와 같은 헬퍼(helper) 바이러스로 감염될 수 있다. 이 방법의 장점은 세포가 선택가능하고 rAAV의 대규모 생산에 적합하다는 것이다. 적합한 방법의 다른 예는, 패키징 세포에 rAAV 게놈 및/또는 rep 및 cap 유전자를 도입하는 데 플라스미드가 아닌 아데노바이러스 또는 배큘로바이러스를 사용한다. rAAV 생산의 일반 원리는 예를 들어 문헌[Carter, 1992, Current Opinions in Biotechnology, 1533-539]; 및 문헌[Muzyczka, 1992, Curr. Topics in Microbial. and Immunol., 158:97-129]를 참조한다. 다양한 접근법이 문헌[Ratschin et al., Mol. Cell. Biol. 4:2072 (1984)]; 문헌[Hermonat et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6466 (1984)]; 문헌[Tratschin et al., Mo1. Cell. Biol. 5:3251 (1985)]; 문헌[McLaughlin et al., J. Virol., 62:1963 (1988)]; 및 문헌[Lebkowski et al., 1988 Mol. Cell. Biol., 7:349 (1988)]; 문헌[Samulski et al. (1989, J. Virol., 63:3822-3828)]; 미국 특허 제5,173,414호; 국제 특허공개 WO 95/13365호 및 상응하는 미국 특허 제5,658.776호; 국제 특허공개 WO 95/13392호; 국제 특허공개 WO 96/17947호; 국제 특허출원 PCT/US98/18600호; 국제 특허공개 WO 97/09441호(국제 특허출원 PCT/US96/14423호); 국제 특허공개 WO 97/08298호(국제 특허출원 PCT/US96/13872호); 국제 특허공개 WO 97/21825호(국제 특허출원 PCT/US96/20777호); 국제 특허공개 WO 97/06243호(국제 특허출원 PCT/FR96/01064호); 국제 특허공개 WO 99/11764호; 문헌[Perrin et al. (1995) Vaccine 13:1244-1250]; 문헌[Paul et al. (1993) Human Gene Therapy 4:609-615]; 문헌[Clark et al. (1996) Gene Therapy 3:1124-1132]; 미국 특허 제5,786,211호; 미국 특허 제5,871,982호; 및 미국 특허 제6,258,595호에 기술되어 있다.
II. 약학 조성물
임의의 AAV 바이러스 입자(예를 들어, AAV9 바이러스 입자)는 약학 조성물을 형성하도록 제형화될 수 있으며, 이는 약학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용되는 임의의 약학 조성물은 동결건조된 제형 또는 수용액 형태의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 안정화제를 포함할 수 있다.
약학 조성물 내의 담체는, 조성물의 활성 성분과 상용성이고 바람직하게는 활성 성분을 안정화시킬 수 있고 치료 대상에게 유해하지 않는다는 의미에서 "허용되는"것이어야 한다. 예를 들어, "약학적으로 허용되는"은, 생리학적으로 허용가능하고 포유동물(예를 들어, 인간)에게 투여될 때 일반적으로 바람직하지 않은 반응을 일으키지 않도록 포함되는 조성물의 분자 실체 및 기타 성분을 지칭할 수 있다. 일부 예에서, 본원에 개시된 약학 조성물에 사용되는 "약학적으로 허용되는" 담체는, 연방 또는 주 정부의 규제 기관에 의해 승인되거나 포유동물, 특히 미국 약전 또는 기타의 일반적으로 인간에게 사용되는 것으로 인정되는 약전에 열거된 것일 수 있다.
완충제를 포함하는 약학적으로 허용되는 담체는 당업계에 잘 알려져 있으며, 포스페이트, 시트레이트 및 기타 유기산; 아스코르브산 및 메티오닌을 포함하는 항산화제; 방부제; 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 아미노산; 소수성 고분자; 단당류; 이당류; 및 기타 탄수화물; 금속 착체; 및/또는 비이온성 계면활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. (2000) Lippincott Williams and Wilkins, Ed. K. E. Hoover]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 약학 조성물 또는 제형은 비경구 투여, 예를 들어 정맥내, 뇌실내 주사, 대조내 주사, 실질내 주사, 또는 이들의 조합을 위한 것이다. 이러한 약학적으로 허용되는 담체는 멸균 액체, 예를 들어 물 및 오일, 예컨대 석유, 동물성, 식물성 또는 합성 기원의 것, 예를 들어 땅콩유, 대두유, 광유 등일 수 있다. 염수 용액 및 수성 덱스트로스, 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 및 글리세롤 용액 또한, 특히 주사가능한 용액을 위한, 액체 담체로서 사용될 수 있다. 본원에 개시된 약학 조성물은 추가적인 성분, 예를 들어 방부제, 완충제, 등장화제, 항산화제 및 안정화제, 비이온성 습윤제 또는 투명화제, 점도-증가제 등을 추가로 포함할 수 있다. 본원에 기재된 약학 조성물은 단일 단위 투여량 또는 다중 투여량 형태로 패키징될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 제형은, 항산화제, 완충제, 정균제(bacteriostat) 및 의도된 수용자의 혈액과 등장액이 되도록 하는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 주사 용액; 및 현탁제 및 증점제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성 멸균 현탁액을 포함한다. 수성 용액은 적절하게 (바람직하게는 pH 3 내지 9로) 완충될 수 있다. 멸균 상태에서 적합한 비경구 제형의 제조는 당업자에게 잘 알려진 표준 약제학적 기법에 의해 쉽게 달성된다.
생체내 투여에 사용되는 약학 조성물은 멸균성이어야 한다. 이것은 예를 들어 멸균 여과막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성된다. 멸균 주사용 용액은 일반적으로, 필요에 따라, 위에 열거된 다양한 기타 성분과 함께, 적절한 용매에 필요한 양의 AAV 입자를 혼입한 다음 필터 멸균함으로써 제조된다. 일반적으로, 분산액은, 기본 분산 매질 및 위에 열거된 것 중 필요한 기타 성분을 함유하는 멸균 비히클에 멸균된 활성 성분을 혼입함으로써 제조된다. 멸균 주사 용액의 제조를 위한 멸균 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 진공 건조 및 동결 건조 기술이며, 이들 기술은 이전에 멸균-여과된 용액으로부터 활성 성분의 분말과 임의의 추가 목적 성분을 얻는다.
본원에 개시된 약학 조성물은 또한 희석제 및 보조제와 같은 다른 성분을 포함할 수 있다. 허용가능한 담체, 희석제 및 보조제는 투여받는 대상에게 비독성이고, 바람직하게는 사용된 투여량 및 농도에서 불활성이며, 인산염, 구연산염 또는 기타 유기산과 같은 완충제; 아스코르브산과 같은 항산화제; 저분자량 폴리펩티드; 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 고분자; 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 아르기닌 또는 리신과 같은 아미노산; 포도당, 만노스 또는 덱스트린을 포함하는 단당류, 이당류 및 기타 탄수화물; EDTA와 같은 킬레이트제; 만니톨 또는 소르비톨과 같은 당 알코올; 나트륨과 같은 염-형성 반대 이온; 및/또는 Tween, 플루로닉 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 비이온성 계면활성제를 포함한다.
III. FMRP를 생성하는 AAV 입자에 의한 FXS 치료
본원에 개시된 바와 같은 FMRP를 암호화하는 바이러스 벡터를 보유하는 임의의 AAV 입자는, FMRP 발현을 위해 FMRP-암호화 전이유전자를 뇌 세포에 전달하여 FXS와 관련된 하나 이상의 증상을 완화시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 일부 양태에서, 본 개시내용은, 본원에 개시된 AAV9 입자와 같은 복수의 AAV 입자뿐만 아니라 이를 포함하는 약학 조성물을 대상에게 투여함을 포함하는, 치료를 필요로 하는 대상에서 FXS의 하나 이상의 증상을 완화하고/하거나 이를 치료하는 방법을 제공한다. 본원에 개시된 방법을 수행하기 위해, 유효량의 AAV 입자 또는 이를 포함하는 약학 조성물은 본원에 개시된 적합한 양으로 적절한 경로(예를 들어, 정맥내, 뇌실내 주사, 대조내 주사, 또는 실질내 주사)로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "치료하는"은, 치료를 필요로 하는 대상, 예를 들어 표적 질환 또는 장애, 상기 질환/장애의 증상, 또는 상기 질환/ 장애에 대한 소인(predisposition)을 갖는 대상에게, 상기 장애, 상기 질환의 증상 또는 상기 질환 또는 장애에 대한 소인을 치료, 치유, 경감, 구제, 변경, 처리, 경감, 개선 또는 영향을 줄 목적으로 하나 이상의 활성제를 포함하는 조성물을 적용하거나 또는 투여하는 것을 지칭한다.
표적 질환/장애를 완화시키는 것은 상기 질환의 발달 또는 진행을 지연시키거나 질환 중증도를 감소시키는 것을 포함한다. 질환을 완화하는 데 반드시 치료적 결과가 필요한 것은 아니다. 본원에 사용된, 표적 질환 또는 장애의 발달을 "지연시키는" 것은 상기 질환의 진행을 지연, 방해, 둔화, 지체, 안정 및/또는 연장시키는 것을 의미한다. 이 지연은 질환 및/또는 치료 중인 개인의 병력에 따라 다양한 기간이 될 수 있다. 질환의 발달을 "지연" 또는 완화하거나 질환의 발병을 지연시키는 방법은 이 방법을 사용하지 않는 것과 비교할 때 주어진 시간 프레임에서 그 질환의 하나 이상의 증상이 발생할 확률을 줄이고/거나 주어진 시간 프레임에서 그 증상의 범위를 줄이는 방법이다. 이러한 비교는 일반적으로 통계적으로 유의미한 결과를 제공하기에 충분한 다수의 대상을 사용하는 임상 연구를 기반으로 한다.
질환의 "발달" 또는 "진행"은 질환의 초기 증상 및/또는 이어지는 진행을 의미한다. 질환의 발달은 당업계에 잘 알려진 바와 같은 표준 임상 기술을 사용하여 검출가능하고 평가될 수 있다. 그러나, 발달은 감지할 수 없는 진행을 의미하기도 한다. 본 개시의 목적을 위해, 발달 또는 진행은 증상의 생물학적 과정을 의미한다. "발달"에는 발생, 재발 및 발병이 포함된다. 본원에 사용된 표적 질환 또는 장애의 "발병" 또는 "발생"은 초기 개시 및/또는 재발을 포함한다.
본원에 개시된 임의의 방법에 의해 치료될 대상은 FXS를 갖는 인간 환자일 수 있으며, 이는 일상적인 의료 검사, 예를 들어 실험실 테스트, 장기 기능(organ functional) 테스트, 행동 테스트, CT 스캔, 뇌파도 및/또는 자기 공명영상(MRI)에 의해 확인될 수 있다. FXS 환자는 일반적으로 FMR1 유전자에 하나 이상의 유전적 돌연변이가 있으며, 이는 일반적으로 FMRP라고도 지칭되는 취약 X 정신지체 단백질(FMRP)이라고 불리는 단백질을 만든다. 취약 X 증후군의 거의 모든 사례는, CGG 삼중항 반복으로 알려진 DNA 세그먼트가 FMR1 유전자 내에서 확장되는 돌연변이에 의해 발생한다. 일반적으로 이 DNA 세그먼트는 5회에서 40회 정도 반복된다. FXS 환자의 경우는 이 CGG 세그먼트가 200회 이상 반복된다. 비정상적으로 확장된 CGG 세그먼트는 FMR1 유전자를 비활성화(침묵)시켜 유전자가 FMRP를 생산하는 것을 방지한다. CGG 세그먼트가 55~200회 반복되는 남성과 여성은 FMR1 유전자 전돌연변이(premutation)가 있다고 언급된다. 이 전돌연변이를 가진 대부분의 사람들은 지적으로는 정상이다. 그러나 일부 경우에는 전돌연변이가 있는 개인의 FMRP가 정상적인 양보다 적다. 결과적으로, 이들은 FXS에서 물리적 특징부의 마일드(mild) 버전을 가질 수 있다. FXS는 X-연관된 우성 패턴으로 유전된다. 상기 유전은 각 세포에서 변경된 유전자의 한 사본이 상기 증상을 유발하기에 충분할 경우 우성이 된다. X-연관된 우성이란, 여성(2개의 X 염색체를 가짐)에서 각 세포에 있는 유전자의 2개 사본 중 하나에서의 돌연변이가 상기 장애를 유발하기에 충분함을 의미한다. (X 염색체가 하나만 있는) 남성의 경우, 각 세포에 있는 유일한 유전자 사본의 돌연변이가 상기 장애를 일으킨다. 대부분의 경우 남성은 여성보다 장애의 더 심각한 증상을 겪게 된다.
일부 실시형태에서, 상기 대상은 인간 아동 FXS 환자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 상기 대상은 남성 인간 아동 FXS 환자일 수 있다. 이러한 아동 환자는 16세보다 어릴 수 있다. 일부 예에서, 아동 환자는 12세 미만, 예를 들어 10, 8, 6, 4 또는 2세 미만의 연령을 가질 수 있다. 일부 예에서, 아동 환자는 예를 들어 12개월 미만, 예컨대 6개월 이하의 유아이다. 대안적으로, 상기 대상은 FXS를 갖는 인간 청소년 환자(예를 들어, 16-20세) 또는 인간 성인 환자일 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 개시된 방법에서 치료될 FXS 환자는 FMR1 유전자 내에 확장된 CGG 세그먼트를 보유할 수 있다. 일부 예에서, FXS 환자는 FMR1 유전자 내에서 200회 이상 반복되는 확장된 CGG 세그먼트를 보유할 수 있다. 일부 예에서, FXS 환자는 FMR1 유전자에서 X-연관된 돌연변이를 갖는 남성 환자일 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 FMR1 유전자 전돌연변이를 갖는 FXS를 갖는 것으로 의심되거나 가질 위험이 있는 환자는 본원에 개시된 방법으로 치료될 수 있다. 차세대 시퀀싱, 파이로시퀀싱, 생어(Sanger) 시퀀싱, 전체 엑솜 시퀀싱, 전체 게놈 시퀀싱 등을 포함하되 이에 국한되지 않는 일상적인 세대 서열분석 방법을 사용하여 후보 대상에게서 유전자 검사를 수행할 수 있다.
대안적으로 또는 추가적으로, 본원에 개시된 바이오마커(예를 들어, EEG) 중 하나 이상은 본원에 개시된 치료에 적합한 FXS 환자를 식별하는 데 사용될 수 있다.
본원에 개시된 임의의 방법에서, 유효량의 AAV 바이러스 입자가 FXS와 관련된 하나 이상의 증상을 완화시키기 위해 FXS 환자에게 제공될 수 있다. 일부 사례에서 FXS와 관련된 증상은 행동, 인지 신경 재활, 또는 이들의 조합일 수 있다. 일부 예에서, FXS의 증상은 불안 관련 및 반사적 반복 행동, 사회적 행동, 학습, 기억, 또는 이들의 조합일 수 있다.
물론 이러한 양은 치료할 특정 증상, 증상의 중증도, 개별 환자 매개변수(예컨대 연령, 신체 상태, 크기, 성별 및 체중 포함), 치료 기간, 동시 요법의 속성(경우에 따라), 특정 투여 경로 및 기타 의료 종사자의 지식과 전문 지식 내의 요인에 따라 달라질 것이다. 유효량은 또한, FXS 및/또는 수반되는 유전적 돌연변이를 갖는 대상 간의 표현형 가변성에 따라 달라질 수 있다. 본원에서 AAV 바이러스 입자의 역가(titer)는 1 ml당 약 1×106, 약 1×107, 약 1×108, 약 1×109, 약 1×1010, 약 1×1011, 약 1×1012, 약 1×1013 내지 약 1×1014 또는 그 이상의 DNase 내성 입자(DRP) 범위일 수 있다. 투여량은 또한 바이러스 게놈(vg) 단위로 표현될 수 있다. 복용량은 또한 FXS를 가진 인간에의 투여 시점에 따라 달라질 수 있다. AAV 벡터의 투여량은 성인의 체중 킬로그램당 약 1×1011, 약 1×1012, 약 1×1013, 약 1×1014, 약 1×1015, 약 1×1016 또는 그 이상의 바이러스 게놈(vg) 범위일 수 있다. 신생아의 경우, AAV 벡터의 용량은 체중 킬로그램당 약 1×1011, 약 1×1012, 약 3×1012, 약 1×1013, 약 3×1013, 약 1×1014, 약 3×1014, 약 1×1015, 약 3×1015, 약 1×1016, 약 3×1016 또는 그 이상의 바이러스 게놈(vg) 범위일 수 있다. 이러한 양은, 예를 들어 용량이 적절한지 결정하기 위해 투여 후 여러 시점에서 바이러스의 혈중 수준을 검사하는 것과 같은 일상적인 관행에 따라 당업자에 의해 결정될 수 있다.
일부 경우에, AAV 바이러스 입자는 대상에게 다중 용량으로 제공될 수 있다. 일부 예에서, 다중 용량은 결과적으로 동일한 경로를 통해 또는 상이한 경로를 통해 대상에게 투여될 수 있다. 다른 예에서, 다중 용량은 상이한 경로, 예를 들어 본원에 개시된 경로를 통해 대상에게 동시에 투여될 수 있다.
의약 분야의 당업자에게 공지된 통상적인 방법을 사용하여 FXS 대상에게 AAV9 입자 함유 약학 조성물을 투여할 수 있다. 예를 들어, 이 약학 조성물은 또한 예를 들어 정맥내 주사, 뇌실내 주사, 대조내 주사, 실질내 주사, 또는 이들의 조합에 의해 비경구적으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, AAV 입자-함유 약학 조성물은 적어도 2가지의 투여 경로를 통해 인간 환자에게 투여될 수 있다. 일부 예에서, 투여 경로의 조합은 뇌실내 주사와 정맥내 주사일 수 있다. 일부 예에서, 투여 경로의 조합은 경막내 주사와 정맥내 주사일 수 있다. 일부 예에서, 투여 경로의 조합은 대조내 주사와 정맥내 주사일 수 있다. 일부 예에서, 투여 경로의 조합은 실질내 주사와 정맥내 주사일 수 있다.
일부 실시형태에서, 본원에 기재된 방법에 의해 치료될 대상은 또 다른 항-FXS 요법을 받았거나 받고 있는 인간 환자일 수 있다. 이전 항-SFXS 요법이 완료될 수 있다. 달리, 항-FXS 요법이 여전히 진행되는 중일 수 있다. 다른 실시형태에서, FXS 환자는 본원에 개시된 AAV9 입자 요법 및 제2 항-FXS 요법을 포함하는 병용 요법을 받을 수 있다. 항-FXS 치료에는 행동 이상, 발작, 언어 요법, 물리적 요법 등의 치료가 포함되지만 이에 국한되지 않는다. 예시적인 항-FXS 치료는 GABA 수용체 효능제, PI3K 동형체-선택적 억제제, MMP9 길항제, 또는 이들의 조합을 포함하는 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 추가적인 유용한 제제 및 요법은 문헌[Physician's Desk Reference, 59.sup.th edition, (2005), Thomson P D R, Montvale N.J.]; 문헌[Gennaro et al., Eds. Remington's The Science and Practice of Pharmacy 20.sup.th edition, (2000), Lippincott Williams and Wilkins, Baltimore Md.]; 문헌[Braunwald et al., Eds. Harrison's Principles of Internal Medicine, 15.sup.th edition, (2001), McGraw Hill, NY]; 문헌[Berkow et al., Eds. The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, (1992), Merck Research Laboratories, Rahway N.J.]에서 확인할 수 있다.
일부 실시형태에서, AAV9 입자와 같은 AAV 입자 또는 이의 약리학적 조성물의 투여량은 치료에 대한 FXS 환자의 반응에 기초하여 조정될 수 있다. 예를 들어, FXS 환자가 하나 이상의 행동 특징(예를 들어, 행동적 및/또는 인지적 활동)의 악화를 보이는 경우 AAV 입자의 용량을 줄일 수 있다. 달리, FXS 환자가 FXS 증상의 뚜렷한 개선을 보이지 않으면 AAV 입자의 용량을 늘릴 수 있다. 개별 FXS 환자에서 AAV9 입자의 적절한 용량 및/또는 치료 효능을 평가하기 위한 바이오마커로서 행동 특징을 사용하는 것에 대해서는 아래 설명을 참조한다.
IV. 개별 FXS 환자에 대한 AAV9 입자의 개인화된 용량 결정을 위한 EEG 및 행동 특징 바이오마커의 사용
본원에 개시된 임의의 치료 방법에서, 본원에 개시된 하나 이상의 바이오마커는 적합한 환자를 식별하고/하거나 개인화된 AAV 입자 투여량을 결정하고/하거나 치료 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "바이오마커"는, FXS 환자의 임상적 특징, 예를 들어 질환의 표현형 중증도, 치료에 대한 환자 반응성 등에 대한 정보를 제공하는 지표(하나의 인자 또는 인자들의 조합)를 의미한다. 바이오마커는 EEG(예를 들어, 장기 강화 또는 LTP), 하나 이상의 행동 특징(예를 들어, 초조 또는 기억력 결핍), 또는 이들의 조합을 포함한다. FMRP는 시냅스 단백질이며 그 수준 및/또는 분포는 뇌의 신경 활동 수준과 관련이 있다. FMRP의 손실은 LTP에 대한 역치(threshold)를 증가시켜, EEG를 사용하여 측정하고 기록할 수 있는 비정상적인 신경 활동을 초래한다. 따라서 EEG는 FMRP의 수준 및/또는 분포를 모니터링하는 데 사용할 수 있고, 이로써 FXS 환자 진단 및 치료 효능 평가에 도움을 줄 수 있다.
일부 실시형태에서, 뇌파도(EEG)에 의해 평가된 장기 강화(LTP) 패턴을, FXS를 치료하는 방법에 사용하기 위한 본원에 개시된 AAV9 입자와 같은 AAV 입자의 적합한 용량을 평가하고 결정하기 위한 바이오마커로서 사용할 수 있다. 일부 예에서, AAV 입자의 초기 용량 투여 후, FXS 환자의 LTP 패턴을 EEG를 사용하여 모니터링할 수 있다. AAV9 입자의 초기 용량이 FXS 환자의 LTP 패턴에 영향을 미치지 않는 경우, AAV9 입자의 용량을 유지하거나 증가시킬 수 있다.
본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 AAV9 입자의 적합한 용량을 평가 및 결정하는 또는 치료 효능을 평가하기 위한 바이오마커로서 "초조"가 사용될 수 있다. 초조는, 불안-관련된 반사적 반복 행동으로 나타나는 불안 또는 신경 흥분 상태를 말한다. AAV 입자의 초기 용량을 투여한 후, FXS 환자에 있어서의 초조의 발달 및/또는 진행을, 일상적인 실험 또는 본원에 제공된 방법에 따라 모니터링할 수 있다. FXS 환자가 초조를 나타내거나 초조가 진행되거나 불안감이 증가하면, AAV 입자의 용량을 줄일 수 있다. 달리, AAV 입자의 초기 용량이 초조를 발생시키지 않거나 FXS 환자에서 초조를 완화/감소시키는 경우, 이는 초기 용량의 AAV9 입자가 효과적이라는 것을 나타낸다. AAV 입자의 용량은 유지되거나 증가될 수 있다.
다른 실시형태에서, 본원에 개시된 방법에서 사용하기 위한 AAV9 입자의 적절한 투여량을 평가 및 결정하는 또는 치료 효능을 평가하기 위한 바이오마커로서 기억력 결핍이 사용될 수 있다. 기억력 결핍은 FXS 환자가 단기 기억으로 표시되는 학습 능력이 없음을 의미한다. AAV 입자의 초기 투여량을 투여한 후, FXS 환자의 기억력 결핍 발달 및/또는 진행을 일상적인 실험 또는 본원에 제공된 방법에 따라 모니터링할 수 있다. FXS 환자가 기억력 결핍이 발생하거나 기억력 결핍이 진행되는 경우, AAV 입자의 용량을 줄일 수 있다. 달리, AAV 입자의 초기 용량이 기억력 결핍의 발달로 이어지지 않거나 FXS 환자의 기억력 결핍이 개선되지 않는 경우, 이는 초기 용량의 AAV9 입자가 효과적이라는 것을 나타낸다. AAV 입자의 용량은 유지되거나 증가될 수 있다.
본원에 개시된 EEG 및/또는 행동 특징 바이오마커 중 하나 이상을 사용하여, 개별 FXS 환자에 대해 AAV 입자의 적절한 용량이 결정될 수 있다.
본원에 개시된 EEG 및/또는 행동 특징 바이오마커 중 하나 이상은 또한 본원에 개시된 AAV 입자-관련 치료의 치료적 효능을 평가하는 데 사용될 수 있다. 이러한 평가는 추가 치료 전략, 예를 들어 AAV-매개 FMR1 유전자 요법의 지속, AAV-매개 FMR1 유전자 요법의 수정(용량 변경, 투여 간격 등), AAV-매개 FMR1 유전자 요법의 다른 항-FXS 요법과의 병용, 또는 AAV-매개 FMR1 유전자 요법의 종료를 결정하는 데 도움이 될 수 있다.
V. FXS 치료에 사용하기 위한 키트
본 개시내용은 또한 본원에 기술된 바와 같이 FXS를 치료하는데 사용하기 위한 키트를 제공한다. 본원에 기술된 바와 같은 치료용 키트는 본원에 기술된 바와 같은 AAV 입자, 예컨대 AAV9 입자를 포함하는 약학 조성물로 제형화된 하나 이상의 용기(container)를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 상기 키트는 본원에 기재된 임의의 방법에서 AAV 입자의 사용을 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다. 포함된 지침서는, 대상에서 의도된 활성을 달성하기 위해, 대상에게 AAV 입자 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것에 대한 설명을 포함할 수 있다. 상기 키트는, 대상이 치료를 필요로 하는지 여부를 확인하는 것에 기초하여 치료에 적합한 대상을 선택하는 것에 대한 설명을 추가로 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 지침서는 FXS를 갖거나 가질 것으로 의심되는 대상에게 라파마이신 화합물 또는 이를 포함하는 약학 조성물을 투여하는 것에 대한 설명을 포함한다.
본원에 기술된 AAV 입자의 사용과 관련된 지침서는 일반적으로 의도된 치료를 위한 투여량, 투여 일정 및 투여 경로에 대한 정보를 포함한다. 일부 실시형태에서, 지침서는 행동 특징 중 하나 이상(예를 들어 본원에 설명된 것)을 바이오마커로서 사용하여 FXS를 갖는 대상에서 라파마이신의 용량을 최적화하는 것에 대한 설명을 포함한다. 상기 용기는 단위 용량, 벌크 패키지(예를 들어, 다중 용량 패키지) 또는 하위-단위 용량일 수 있다. 본 발명의 키트에 제공된 지침서는 일반적으로 라벨 또는 패키지 삽입물에 작성된 지침서이다. 라벨 또는 패키지 삽입물은 상기 약학 조성물이 대상의 질환 또는 장애를 치료, 개시 지연 및/또는 완화하는 데 사용됨을 기재한다.
본원에 제공된 키트는 적절히 패키징되어 있다. 적합한 패키징에는 바이알, 병, 항아리, 가요성 패키징 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 흡입기, 비강 투여 장치 또는 주입 장치와 같은 특정 장치와 함께 사용하기 위한 패키지도 고려된다. 키트에는 멸균 액세스 포트가 있을 수 있다(예를 들어, 용기는 정맥내 주사 용액 백이거나 또는 피하 주사 바늘로 뚫을 수 있는 마개가 있는 바이알일 수 있다). 용기에는 또한 멸균 액세스 포트가 있을 수 있다.
키트는 선택적으로 버퍼(buffer) 및 설명(interpretive) 정보와 같은 추가 구성 요소를 제공할 수 있다. 일반적으로 키트는 용기 및 상기 용기 상의 또는 상기 용기에 결합된 라벨 또는 패키지 삽입물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용은 상기 기술된 키트의 내용물을 포함하는 제조 물품을 제공한다.
일부 실시형태에서, 상기 키트는 본원에 개시된 하나 이상의 AAV 벡터를 포함한다. 일부 예에서, 상기 키트는 본원에 개시된 AAV 벡터와 함께 사용될 하나 이상의 헬퍼 벡터를 추가로 포함할 수 있다. 일부 예에서, 상기 키트는 본원에 개시된 AAV 벡터와 함께 사용하기에 적합한 숙주 세포를 포함할 수 있다. 상기 키트는 본원에 기술된 바와 같은 방법에 따른 AAV 벡터의 사용을 위한 지침서를 추가로 포함할 수 있다.
일반적 기법
본 개시내용의 실시는 달리 나타내지 않는 한 당업계의 기술 내에 있는 분자 생물학(재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은, 예를 들어 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press]; 문헌[Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984)]; 문헌[Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press]; 문헌[Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987)]; 문헌[Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press]; 문헌[Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)]; 문헌[Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.)]; 문헌[Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987)]; 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987)]; 문헌[PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994)]; 문헌[Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991)]; 문헌[Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999)]; 문헌[Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997)]; 문헌[Antibodies (P. Finch, 1997)]; 문헌[Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989)]; 문헌[Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000)]; 문헌[Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999)]; 문헌[The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995)]; 문헌[DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985)]; 문헌[Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985)]; 문헌[Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984)]; 문헌[Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986)]; 문헌[Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986)]; 및 문헌[B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984)]; 문헌[F.M. Ausubel et al. (eds.)]과 같은 공개 자료에 자세히 설명되어 있다.
추가 설명 없이도, 당업자는 상기 설명에 기초하여 본 발명을 최대한으로 활용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 다음의 특정 실시예는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떠한 방식으로든 개시내용의 나머지 부분이 제한적인 것이 아니다. 본원에 인용된 모든 간행물은 여기에 언급된 목적 또는 주제를 위해 참고로 인용되어 포함된다.
실시예
본 개시내용은 특정 실시양태를 참조하여 설명되었지만, 본 발명의 진정한 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변경이 이루어질 수 있고 균등물이 대체될 수 있음을 당업자는 이해해야 한다. 또한, 특정 상황, 재료, 조성물, 공정, 공정 단계 또는 단계들을 본 발명의 목적, 사상 및 범위에 맞도록 많은 변경이 이루어질 수 있다. 이러한 모든 변경은 본 개시내용의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
실시예 1. FMRP를 발현하는 AAV 벡터의 개발
취약 X 증후군(FXS)은 취약 X 정신지체 단백질(FMR1) 유전자에서 CGG 반복이 확장되어 유전자 산물인 취약 X 정신지체 단백질(FMRP)을 상실하고 유전적 지적 장애의 주요 원인이 되는 단일 유전자성 증후군이다. 단일유전자성 장애는, 이론적으로 단일 유전자의 교정이 전체 유기체를 구제할 수 있는 유전자 치료의 특히 매력적인 표적이기 때문에, FXS 환자에서 FMRP 발현을 복원하기 위한 아데노-연관 바이러스(AAV)의 개발은 유용한 치료 전략이 될 수 있다.
인간 FMRP(동형체 1)를 생산할 수 있는 CNS-표적 AAV 벡터를 설계하고 클로닝하였다. 구체적으로, FMRP 또는 GFP(대조군으로서의 녹색 형광 단백질)를 발현하는 하기 2가지의 상이한 바이러스 벡터가 개발되었다: (1) 자기-상보적 AAV 벡터(scAAV; DNA 합성의 필요성 회피)(도 1a) 뿐만 아니라 (2) 일반 AAV 벡터(도 2a). scAAV 벡터인 scAAV9-CB-FMR1은 scAAV 백본을 기반으로 하며, 하이브리드 CMV 인핸서/베타-액틴 프로모터 CB의 제어 하의 인간 FMR1 암호화 서열을 포함한다(도 1a). 일반 AAV 벡터인 AAV-CAGFMR1은 CB 프로모터(즉, CAG 프로모터)의 제어 하에 인간 FMR1 암호화 서열을 포함한다(도 2a). 바이러스는 전뇌 뉴런의 최적의 형질도입을 위한 AAV9 향성을 부여하도록 생성되었으며 FMR1 삽입 단편 크기는 약 3킬로베이스(kb)였다.
두 벡터 모두 일차 해마 및/또는 피질 마우스 뉴런에서 테스트되었고 용량 의존 방식으로 전장 FMRP 단백질을 발현하는 것으로 나타났다. 구체적으로, 일차 배양된 마우스 피질 뉴런을 1, 2, 5 또는 10 μl의 scAAV9-CB-FMR1, scAAV9-CB-GFP 또는 scAAV9-CBflag-FMR1 바이러스 입자로 8번째 세포 분열 시에 형질도입하였다. 13번째 세포 분열 후, 세포를 수확하여 웨스턴 블롯 분석을 수행하였다. 도 1b는 플래그-태깅된 FMR1 및 태깅되지 않은 FMRP 둘 다의 용량 의존적 발현을 보여준다. 추가로, 1차 배양된 마우스 해마 뉴런을 3, 1.5, 0.8 또는 0.4 바이러스 게놈/밀리리터(vg/ml) AAV-CAGFMR1 또는 AAV-CAG-GFP로 형질도입한 후 웨스턴 블롯 분석하였다. 도 2b는 각각 AAV-CAGFMR1 및 AAV-CAG-GFP 형질도입된 세포에서 FMRP 및 대조군 GFP 단백질 모두의 용량 의존적 발현을 보여준다.
FMR1 및 GFP의 mRNA 발현 또한, 3, 1.5, 또는 0.3 바이러스 게놈/밀리리터(vg/ml) AAV-CAG-FMR1 또는 AAV-CAG-GFP로 형질도입된 1차 배양된 마우스 해마 뉴런에서 측정되었다. 도 2c는, 각각 AAV-CB-FMR1 및 AAV-CB-GFP 형질도입된 세포에서의 FMR1 mRNA 및 대조군 GFP mRNA 모두의 용량-의존적 발현을 나타낸다.
FMR1의 발현과 안전성을 최적화하기 위해 3가지의 추가 벡터가 개발되었다. 이러한 추가 벡터를 구성하기 위해, FMR1 전이유전자를 카나마이신 내성 유전자를 운반하는 벡터 백본에 클로닝했다. 추가로, 전이유전자는 스터퍼 서열에 인접하며, 이는, (그렇지 않으면 패키징되게 될 수 있는) 박테리아 서열로 플라스미드 백본을 패키징하는 것을 감소시킨다. 이 벡터를 사용하여 생성된 구조물은 다음과 같다: (1) pTR130-mCAG-huFMRP-WPRE-SV40pA(이하 "CAGWPRE" 벡터)(도 15 참조)(서열번호 4)(이는 상기 기술된 벡터 백본의 AAV-CAGFMR1과 동일한 전이유전자를 포함함); (2) pTR130-mCAG-huFMRP-SV40pA(이하 "CAGdelWPRE 벡터")(도 16 참조)(서열번호 5)(이는 상기 기재된 벡터 백본에서 CAGWPRE 구조물에 비해 WPRE가 결여됨); 및 (3) pTR130-hPGK-hBGin-huFMRP-hBGpA+SV40pA-3'sCHIMin(이하 "hPGK 벡터")(도 17 참조)(서열번호 6)(이는 FMRP의 발현을 유도하는 hPGK 프로모터, 뿐만 아니라 mRNA 전사체 안정화 인자 요소로 작용하는 3' hβ-글로빈 폴리(A) 신호(도 17 참조) 및 작은 키메라 인트론 서열을 상기 기술된 벡터 백본에 함유함). 이러한 변형은 생체내 전이유전자의 최적 발현을 용이하게 하고 구조물의 안전성을 향상시키도록 선택되었다.
CAGWPRE 및 CAGdelWPRE 벡터의 FMRP 발현 효율을 비교하기 위해 CHO-Lec2 세포에 벡터를 형질도입하고 웨스턴 블롯으로 발현을 평가하였다. CAGdelWPRE 벡터로 형질도입된 세포는 FMRP를 발현하였지만, 관찰된 발현이, CAGWPRE 벡터로 형질도입된 세포에서 관찰된 것보다 적었다. 도 18a 및 도 18b.
뉴런 세포에서 hPGK 벡터와 CAGWPRE 및 CAGdelWPRE 벡터의 발현 효율을 비교하기 위해, E17 배양된 마우스 피질 뉴런을 DIV14에서 상기 벡터로 형질도입하고, 5일 동안 벡터를 발현시킨 후 DIV19에서 수확하였다. 수확된 뉴런을 이후 웨스턴 블롯 분석하였다. hPGK 벡터에서 hPGK 프로모터를 사용하는 것은 CAG-구동된 벡터로 형질도입된 뉴런에서 관찰된 것과 비교하여 뉴런에서 FRMP의 발현을 감소시켰다. 도 19.
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실시예 2. FMRP-발현 AAV 벡터의 투여 용량, 시기 및 전달 경로의 최적화
FMRP 발현 AAV 벡터에 대한 최상의 전달 경로와 FMRP의 CNS 특이적 발현에 최적화된 용량 및 시기를 결정하기 위해 scAAV9-CB-FMR1 및 AAV-CAG-FMR1을 사용한 생체내 연구를 마우스 모델에서 수행하였다.
scAAV를 사용하는 형질도입 및 재조합 유전자 발현의 시기를 평가하기 위해 대략 2천만 vg scAAV-GFP를 6주령 야생형 마우스에 뇌실내(ICV) 주사했다. ICV 전달은 전신 면역 반응과 부작용을 최소화하는 동시에 뇌내 광범위한 투여를 보장한다. 바이러스 주사 투여 2주 후, 마우스를 경심장 관류(4% 파라포름알데히드)하고 뇌를 밤새 후고정하고, 30% 수크로스에서 동결 보호하고, 급속 냉동시켰다. 뇌 절편을 처리를 위해 현미경 슬라이드에 장착하고 공초점 현미경을 사용하여 이미지 분석했다. 도 3a는 scAAV-GFP 주입된 야생형 마우스 뇌의 피질 및 해마 영역에서의 scAAV-GFP 발현을 나타낸다.
또한, 약 2천만 vg AAV-CAG-FMR1을 6주령 야생형 마우스에 ICV 주사했다. 바이러스 주사 2주 후, 마우스를 경심장 관류(4% 파라포름알데히드)하고 뇌를 밤새 후고정하고, 30% 수크로스에서 동결 보호하고, 급속 냉동시켰다. 처리를 위해 뇌 절편을 현미경 슬라이드에 장착하고, 문헌[Gross et al., Cell Rep. 2015;11(5):681-688]에 기술된 방법과 유사하게 형광 면역염색을 수행하였다(상기 문헌의 개시 내용은 그 전체가 본원에 참고로 인용되어 포함된다). 도 3b 및 도 3c는 2주 후 증가된 FMRP 단백질 발현을 갖는 피질 및 해마 뉴런(면역형광 마커 NeuN으로 마킹됨)을 보여준다. AAV-CAG-FMR1 및 AAV-CAG-GFP의 총 단백질 발현은 또한 ICV-주입된 마우스로부터 수확된 피질, 해마, 중뇌 및 소뇌를 함유하는 뇌 절편에서도 평가되었다. 간략하게, 약 4천만 vg AAV-CAG-FMR1 또는 AAV-CAG-GFP를 6-7주령 야생형 마우스 및 6-7주령 Fmr1 녹아웃(KO) 마우스에 ICV 주사하였다. 바이러스 주사 10주 후, 뇌를 수확하고 뇌 슬라이드를 수집하여 웨스턴 블롯 분석을 위해 처리했다. 도 4는, CAG 프로모터 하에 FMRP 또는 GFP를 함유하는 일반 AAV를 주사한 마우스에서, GFP는 피질 및 해마에서 웨스턴 블롯에 의해 명확하게 검출가능한 반면, FMRP는 검출 한계 미만임을 보여준다. 뇌 절편의 웨스턴 블롯팅 및 면역조직화학 분석은 또한, 주입된 마우스의 세포 사멸 및 신경교증을 평가하여, 세포 사멸 또는 신경교증의 증상 없이 중간 FMRP 발현(70-110%)으로 이어지는 용량의 식별을 돕는다.
실시예 3: FMRP-발현 AAV 벡터의 투여 용량, 시기 및 전달 경로의 최적화
FMRP-발현 AAV 벡터에 대한 투여, 타이밍 및 전달 경로를 추가로 최적화하기 위해, 상기 벡터를 Fmr1 녹아웃(KO) 마우스에 투여하고, 기능적 및 생리학적 결과를 평가한다.
마우스는 P21에서 정맥내(IV) 또는 조합된(IV+ICV) 투여 경로를 통해 벡터(들), 예를 들어 CAGWPRE, CAGdelWPRE 또는 hPGK를 투여받았다. 대조군 그룹은 콤보 투여를 통해 비히클을 받는 WT 및 KO 마우스를 포함한다. 실험 그룹의 마우스는 저용량(예를 들어, 1E13-5E13 vg/kg) 또는 고용량(예를 들어, 8E13-2E14 vg/kg)의 벡터를 투여받는다. 모든 그룹의 마우스는 투여 후 60일에 행동 테스트를 거친다. 행동 테스트에는 네스팅 행동 평가, 모리스 수중 미로 실험(Morris Water Maze Task)의 수행 능력 평가, 뇌파도(EEG)를 사용한 기능적 신경생리학적 평가가 포함된다. 모든 그룹의 마우스는 생체내 분포(biodistribution)에 대해 최종 평가를 받는다. 각 실험군과 대조군은 대략 10마리의 마우스로 구성된다.
다른 연구에서, 마우스는 정맥내(IV) 또는 조합된(IV+ICV) 투여 경로를 통해 P21("어린 시기") 또는 P42("나이든 시기")에서 벡터(들), 예를 들어 CAGWPRE, CAGdelWPRE 또는 hPGK를 투여받는다. 대조군 그룹은 P21 또는 P42에서의 IV 또는 IV+ICV 투여를 통해 비히클을 받는 WT 및 KO 마우스를 포함한다. 실험 그룹의 마우스는 투여된 벡터의 용량 범위(예를 들어, 1E13 내지 2E14 vg/kg) 중 하나를 받는다. 모든 그룹의 마우스는 투여 후 90일에 행동 테스트를 거친다. 행동 테스트에는 네스팅 행동 평가, 모리스 수중 미로 실험의 수행 능력 평가, 뇌파도(EEG)를 사용한 기능적 신경생리학적 평가가 포함된다. 모든 그룹의 마우스는 생체내 분포에 대해 최종 평가를 받는다. 각 실험군과 대조군은 약 10마리의 마우스로 구성된다.
위의 실험 결과를 분석하여 Fmr1 KO 마우스의 기능적 및 행동적 결함의 탁월한 치유뿐만 아니라 뇌와 신체의 모든 부분에 우수한 전이유전자 전달을 제공하는 투여 용량, 시기 및 투여 경로를 결정한다. FMR1 유전자가 조직에서 유비쿼터스하게 발현된다는 점을 감안할 때, 테스트된 투여 조건들 중 하나 이상에 의해 달성가능한 교정 전이유전자의 광범위한 분포가 취약 X 증후군의 치료에 유익할 것으로 예상된다.
실시예 4. FMRP 발현 AAV 벡터의 투여 후 FXS 마우스 모델에서의 행동 분석
Fmr1 녹아웃(KO) 마우스는 FMRP를 발현하지 않으며, 뇌 과흥분성 및 행동 및 인지 결함을 포함하여 FXS와 관련된 인간 표현형을 복제한다. 이것은, Fmr1 KO 마우스가 FXS에 대한 우수한 모델임일 뿐만 아니라 Fmr1 KO 마우스에서 전전두엽 피질 기능을 테스트하는 행동 패러다임이 AAV 유전자 요법에 의해 FXS에서의 인지 손상을 치유하는 치료 전략의 잠재력을 평가하는 데 사용될 수 있음을 시사한다.
Fmr1 KO 마우스는 문헌[Gross et al., Cell Rep. 2015;11(5):681-688]에 기술된 방법과 유사하게 생성시켰으며, 상기 문헌의 개시 내용은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다. 간단히 말하면, Fmr1 KO 마우스는 암컷 Fmr1HET 마우스를 수컷 Pik3cb 이형접합 마우스와 교배하여 생성되었고, PCR에 의해 유전자형이 결정되었다. 녹아웃 마우스 계통은 C57BL/6J 배경으로 최소 4회(Pik3cbHET) 또는 10회 초과(Fmr1HET) 역교배되었다.
Fmr1 KO 마우스 및 야생형 대조군 마우스는 도 5에 도시된 타임라인에 따라 AAV 투여 후 행동 및 기능을 평가받았다. 요약하면, Fmr1 KO 마우스 및 야생형 마우스에 4천만 내지 6천만 바이러스 게놈/마우스로 AAV-CAG-FMR1 또는 AAV-CAG-GFP를 ICV 주사하였다. 마우스는 주사 시점에 6-7주령 사이였다. 마우스는 바이러스 주사 후 약 10주 동안 생존했으며 이 기간 동안 여러 행동 분석(네스팅, 구슬 파묻기, 오픈 필드 활동, 새로운 물체 인식 및 모리스 수중 미로 실험)을 받았다.
네스팅은 바이러스 주입 후 1주부터 시작하여 4주 동안 매주 평가되었다. 간단히 말해서, 실험 시작 시 마우스를 3 g의 새 네스렛이 보충된 표준 깔개가 있는 새 케이지에 넣었다. 문헌[Gross et al., Cell Rep. 2015;11(5):681-688]에 기술된 채점 시스템을 사용하여 2시간 후에 네스렛을 평가하였으며, 상기 문헌의 개시 내용은 그 전체가 본원에 인용되어 포함된다. 도 6a는 야생형 마우스와 Fmr1 KO 마우스가 새 네스렛을 받은 지 2시간 후에 네스렛 재료를 파쇄하는 예를 보여준다. 더 많은 파쇄는 인간에서의 "사회적 행동"으로 해석되는 "홈 케이지 행동"을 나타낸다. 도 6b는 전체적으로 Fmr1 KO 마우스가 네스렛을 덜 파쇄했음을 보여준다. AAV-CAG-FMR1을 주입한 Fmr1 KO 마우스는 2주에서 4주 사이에 네스렛의 양을 증가시키면서 파쇄한 반면, AAV-CAG-GFP-주입된 마우스는 개선되지 않았으며, 이는 FMRP 발현의 긍정적인 효과를 시사한다(도 6c). 이 테스트는 또한, 모든 마우스가 네스트 짓기에 관여하고 있음을 보여 주었고, 전반적인 건강이 바이러스 벡터에 의해 영향을 받지 않았음을 확인시켜 주었다.
과도한 구슬 파묻기는 마우스의 반사적 반복 또는 불안-관련 행동을 암시하며, Fmr1 KO 마우스에서는 변경되었다. AAV 투여 4주 후, Fmr1 KO 및 야생형 마우스를 구슬 파묻기 분석에 적용하였다. 간단히 말해서, 마우스를 새 깔개(약 8 cm 깊이)에 5×4 격자로 배열된 20개의 파란색의 작은 유리 구슬이 있는 케이지에 넣었다. 15분 후 마우스를 꺼내고 50% 이상 덮인 구슬은 "묻힘"으로 채점했다. 그 15분 동안 구슬을 파묻기 위해 땅을 파기 시작하는 잠재기(latency)도 측정하였다. 마우스는 오후 12시에서 오후 3시 사이에 테스트되었으며, 구슬을 파묻기 전에 네스팅 행동이 테스트되었다. 도 7a는 마우스의 구슬 파묻기 행동의 예를 보여준다. 왼쪽 패널은 마우스를 넣기 전의 구슬 배열을 보여주고 오른쪽 패널은 마우스를 넣은 후의 구슬 위치를 보여준다. GFP-주입된 Fmr1 KO 마우스(GFP는 Fmr1 KO 마우스에 영향을 미치지 않기 때문에 Fmr1 KO 마우스를 대표함)는 평균적으로 야생형 마우스보다 더 많은 구슬을 파묻고, 파묻기 시작하기까지의 잠재기가 감소했으며; FMRP-발현 AAV 벡터의 주사는 잠재기 감소를 치유하였다(도 7b 및 도 7c).
AAV-CAG-FMR1 또는 AAV-CAG-GFP-주입된 Fmr1 KO 및 야생형 마우스는 AAV 주사 6-8주 후에 모리스 수중 미로 실험 분석을 받았다. 모리스 수중 미로 실험은 일반적으로 해마가 공간 학습에서 어느 정도 역할을 하는지 결정하는 데 사용된다. 도 8a는 본원에 개시된 바와 같이 수행된 모리스 수중 미로 분석의 다이어그램을 보여준다. 모리스 수중 미로의 훈련(획득) 시험 동안, 마우스는 도 8a에서 갈색 표시로 표시된 6개의 시작점 중 하나에서 벽쪽을 향하여 물 속에 놓였다. 마우스를 최대 60초 동안 또는 플랫폼을 찾을 때까지 헤엄치게 하였다. 플랫폼에 도달하는 시간(잠재기)은 초 단위로 측정되었다. 프로브 시험에서 마우스는 제거된 플랫폼의 반대쪽 사분면(OP)에 있는 풀에 놓였다. 프로브 시험에서 각 사분면 및 플랫폼 교차에 소요된 시간을 측정했다. 사분면 TQ는 플랫폼이 위치한 풀의 영역인 목표 사분면이었다. OP는 TQ의 반대쪽 사분면이었다. AR과 AL은 풀을 내려다볼 때 표적 사분면의 인접한 오른쪽 및 왼쪽 사분면이었다. 모든 그룹은 비슷한 속도로 과제를 완결했으며 훈련 종료시 숨겨진 플랫폼을 찾을 수 있었다. 반전 실험에서, 숨겨진 플랫폼의 위치가 미로의 반대쪽 사분면으로 이동했을 때, GFP 주입된 Fmr1 KO 마우스는 이전 사분면으로의 유입이 적었고(도 8b), 이전 플랫폼 위치에 대한 잠재기가 증가했으며(도 8c), 이는 GFP-주입된 Fmr1 KO 마우스가 플랫폼의 위치를 덜 정확하게 기억함을 시사하며, 이는 기억력 결핍과 일치한다. FMRP10-주입된 Fmr1 KO 마우스는 야생형 마우스와 구별할 수 없었고(도 8b 및 도 8c), 이는 기억력 결핍이 개선되었음을 시사한다.
AAV-CAG-FMR1- 또는 AAV-CAG-GFP-주입된 Fmr1 KO 및 야생형 마우스는 또한 AAV 주사 후 6-8주에 오픈 필드 활동 분석을 거쳤다. 오픈 필드 활동 분석은 과잉 행동 및/또는 불안을 측정한다. 간략히 설명하면, 마우스는 시험 시작 30분 전에 실험실에서 길들여졌다. 마우스를 투명한 Plexiglas(40 x 40 x 30) cm 오픈 필드 영역 중앙에 배치하고 15분 동안 탐색하였다. 조명은 영역 내부의 오버헤드 조명(약 800룩스)으로 제공되었으며, 실험은 55데시벨(dB)의 백색 소음이 있는 상태에서 수행되었다. 데이터는 Digiscan 광학 동물 활동 시스템에 의해 제어되며 2분 간격으로 수집되었다. 데이터는 컴퓨터-지정 주변 및 중앙 섹터에 대해 풀링되었으며 유전자형당 평균으로 나타내었다. 이 연구는, GFP-주입된 Fmr1 KO 마우스가 오픈 필드 영역의 중앙에서 더 많은 시간을 보냈으나(2-way ANOVA, 유전자형의 영향 p = 0.02); GFP-주입된 야생형과 Fmr1 KO 마우스 간의 차이는 관찰되지 않았음을 보여주었다(도 9). 전반적으로, 바이러스-발현된 hFMRP는 변경된 오픈 필드 활동에 크게 영향을 미치지 않는다.
AAV-CAG-FMR1- 또는 AAV-CAG-GFP-주입된 Fmr1 KO 및 야생형 마우스는 AAV 주사 후 6-8주 후에 새로운 물체 인식 분석을 거쳤다. 새로운 물체 인식 분석은, 친숙한 물체 대비 새로운 물체 탐색에 대한 마우스의 선천적 선호도에 의존하며, 이 선호도는 Fmr1 KO 마우스에서는 손상되는 것으로 추측된다. 여기서, 본 실시예에 개시된 새로운 물체 인식 테스트에는 무생물, 나무 및 무채색 물체가 사용되었다. 물체는 처음에 별도의 야생형 마우스의 나이브 코호트(naive cohort)를 사용하여 중립적 선호도 강도에 대해 테스트되었으며, 강한 매력이나 혐오 반응을 유도한 물체는 폐기되었다. 첫째 날, 마우스는 30분 동안 원형의 흰색 영역(직경 30 cm)에 대해 길들여졌다. 다음 날, 마우스는 15분 동안 동일한 간격으로 이격된 여러 물체가 있는 영역에 노출되었다. 각 마우스에 대해 각 물체와의 상호 작용 시간이 계산되었으며, 평균적인 반응(response)을 유발하는 두 물체는 다음 이틀의 시험 기간 동안 '익숙한' 물체로 사용되었다. 3일차 및 4일차에 마우스에게 15분 동안 상기 영역의 특정 구역(물체 표시를 위한 균형잡힌(counter-balanced) 위치) 내에서 친숙한 물체를 제시했다. 5일차에는 '익숙한' 물체 중 하나를 네 번째 '새로운' 물체로 교체하고, 마우스의 상호작용 행동을 15분 동안 테스트했다. 마우스가 4개의 물체(익숙한 물체 3개, 새로운 물체 1개)에 노출된 전체 15분의 상호작용 시간이 기록되었다. 상호작용 매개 변수는 개체와의 접촉(꼬리만은 제외됨) 또는 개체 대면(거리<2 cm)으로 정의되었다. 선호도 지수(Preference Index, PI)는 새로운 개체와 상호작용하는 데 소요된 시간을 새로운 개체와 친숙한 개체를 모두 탐색하는 시간으로 나누어 계산했다. 모든 실험은 유전자형과 치료군을 모르는 두 명의 관찰자에 의해 기록된 다음 채점되었다. 도 10에 나타난 바와 같이, 모든 마우스가 신규 개체에 대한 선호도를 나타내었고, 그룹 간에 유의한 차이는 없었다.
전반적으로, 이 실시예에서 수행된 대부분의 행동 분석은 GFP-주입된 Fmr1 KO 마우스와 FXS의 행동 표현형의 지표인 야생형 마우스 간의 차이를 보여주었다. FMR1을 주사한 Fmr1 KO 마우스는 야생형 마우스와 더 유사한 행동을 보였고, 이는 놀랍게도, 성체 마우스의 피질과 해마에 소량의 FMRP를 재도입한 경우에도, 행동이 개선되었음을 나타낸다. 상기 결과는, 바이러스-발현된 FMRP가 적어도 가정/사회적 행동(네스팅), 불안-관련 및 반사적 반복행동(구슬 파묻기) 및 학습 및 기억(모리스 수중 미로 실험)을 개선할 가능성이 있음을 시사했다.
실시예 5. FMRP-발현 AAV 벡터 투여 후 FXS의 마우스 모델로부터 수확된 뇌 절편의 기능적 분석
Fmr1 KO 마우스 및 야생형 마우스에 4천만 내지 6천만 바이러스 게놈/마우스로 AAV-CAG-FMR1 또는 AAV-CAG-GFP를 ICV 주사하였다. 마우스는 주사 시점에 6-7주령 사이였다. 도 5에 도시된 타임라인에 반영된 바와 같이, 마우스는 바이러스 주입 후 약 10주 동안 살았고, 이 기간 동안 다중 행동 분석을 받았다. 마지막 행동 분석 후 적어도 5일(수술 후 약 10주) 후, 뇌 조직을 모든 마우스로부터 수집하고, 이를, 장기 강화(LTP; long-term potentiation) 측정, 및 단백질 합성 분석뿐 아니라 발현 분석(면역조직화학 및 웨스턴 블롯팅)하기 위한 절편에서의 기능적 분석(예를 들어, 다중 전극 어레이(MEA) 사용)에 사용했다.
(i) 장기 강화(LTP)
자극후 시냅스 연결부의 지속적인 강화 형태인 장기 강화는 학습과 기억의 세포적 상관 관계이다. 간단히 말해서, 빙냉된 인공 CSF(ACSF)(mm 단위: 124 NaCl, 3 KCl, 1.25 KH2PO4, 3.4 CaCl2, 2.5 MgSO4, 26 NaHCO3 및 10 덱스트로스, pH 7.35)에서 진동기(vibratome)를 사용하여 중간 중측두 해마를 통한 측방향(transverse) 해마 절편(300 μm)을 제조하였다. 유전자형과 치료 그룹 모두의 절편을 동시에 실행했다. 절편은 인터페이스 기록 챔버에서 31 ± 1℃로 유지되었으며, 절편 표면은 따뜻하고 가습된 95% O2/5% CO2에 노출되었고, 60―70 ml/h의 속도로 지속적으로 ACSF 관류되었다. 절편은 기록이 시작되기 전에 최소 1시간 동안 상기 챔버에서 평형화되었다. 인큐베이션 후, 하나의 절편을 선택하여 전체 HF가 8 × 8 어레이로 완전히 덮이도록 MED64 프로브 상에 배치했다. 절편이 고정되면, 그물 밸러스트(규칙적인 간격의 털 조각이 있는 U자형 백금 와이어)를 절편 위에 조심스럽게 배치하여 고정했다. 전기생리학적 기록을 위해, 고정화된 절편이 있는 프로브를 MED64의 자극/기록 컴포넌트에 연결했다. 상기 절편은 연동 펌프의 도움으로 2-3 ml/분의 속도로 신선한 산소화된 ACSF로 지속적으로 관류되었다. 20분 후 절편을 회수한 후, 도립 현미경(inverted microscope)에 연결된 전하-커플링된 장치 카메라를 통해 육안 관찰 후, 자극을 위해 64-스위치 박스에서 64개의 사용가능한 평면 미세 전극 중 하나를 선택했다. 명시되지 않은 경우, 데이터 수집 소프트웨어에 의해 생성된 단극 2상 정전류 펄스(30-199 μA, 0.1 ms 지속 시간)가 0.1 Hz로 PP에 적용되었다. 나머지 부위에서 유발된 전계 전위는 64채널 주 증폭기에 의해 증폭된 다음, 20 kHz 샘플링 속도로 디지털화되었다. 디지털화된 데이터는 모니터 화면에 표시되고, 마이크로 컴퓨터의 하드 디스크에 저장되었다.
5회의 연속 반응들이 기록 시스템에 의해 실시간으로 자동 평균화되었다. 적절한 진폭의 fEPSP를 불러일으키기 위한 임계값을 측정함으로써 여러 기록 세션 세트에 걸쳐서 절편의 생존가능성을 일정하게 유지했다. LTP 유도의 경우, 100Hz에서 각각 4개의 펄스를 포함하는 10개의 버스트(버스트간 간격 200 ms)로 구성된 TBS 프로토콜이 사용되었다. 이러한 프로토콜은 생체내 조건과 유사하며 인공 및 자연 시냅스 활동 사이의 연결을 설정하는 방법으로 제안된 것으로 널리 받아들여지고 있다. 또한, 이러한 자극에 의해 유도된 LTP는 다른 수단에 의해 유도된 것보다 더 견고하고 안정적인 것으로 보인다. 서로 다른 실험에서 테탄화(tetanization) 강도를 표준화하기 위해, TBS 강도는 fEPSP의 최대 크기의 거의 절반을 유발하는 강도로 설정되었다. TBS 후, 테스트 자극은 LTP 크기 및 기간의 변화를 관찰할 수 있도록 2시간 이상 동안 10분마다 한 번씩 반복적으로 (기준선과 동일한 강도로) 전달되었다.
TBS-LTP는 Fmr1 KO 해마에서 손상이 있는 것으로 나타났다. 여기에서, LTP는 FMRP 발현 AAV를 주입한 Fmr1 KO 마우스 5마리, GFP 발현 AAV를 주입한 Fmr1 KO 마우스 7마리, FMRP 발현 AAV를 주입한 야생형 마우스 6마리, GFP 발현 AAV를 주입한 야생형 마우스 5마리에서 기록되었다. 각 그룹에서 2-3마리의 마우스를 사용한 데이터 분석은, 보고된 바와 같이, GFP-주입된 야생형 절편과 비교하여 GFP-주입된 Fmr1 KO 절편에서 약간의 결손 및 FMRP 주사 후 두 유전자형 모두에서 LTP의 전반적인 증가를 제시하였다(도 11a). LTP의 후기 단계를 평가하기 위해, 70분 동안 측정값을 수집한 것을 제외하고는 동일한 조건에서 상기 분석을 반복했다. 도 11b는 LTP의 후기 단계(30-70분, 자주색 삼각형)에 GFP-주입된 Fmr1 KO 마우스에서 손상이 있음을 보여준다. 추가로, FMRP 주사는 Fmr1 KO 마우스에서 LTP를 향상시켰지만, FMRP-주입된 야생형 마우스에서는 그렇지 않았다(도 11b). 이러한 기능적 분석은 해마 의존적 모리스 수중 미로 학습 분석에서 개선을 보여준 실시예 3에 개시된 데이터를 뒷받침한다(도 8b 및 도 8c).
(ii) 단백질 합성
학습 및 기억과 같은 장기 시냅스 가소성은 자극에 반응하여 새로운 단백질을 합성하는 뉴런의 능력에 따라 달라진다. FXS 마우스 모델 및 FXS 환자의 세포에서 단백질 합성 속도는 증가하고 자극에 둔감한 것(즉, 가소성-유도 자극 후에 향상되지 않음)으로 나타났다. 또한, 강화되고 조절되지 않는 단백질 합성 속도는 FXS(및 일반 자폐증)의 중추적 특성이며, 행동 및 인지의 결손의 기초가 되는 것으로 여겨진다. 따라서 FXS에 대한 치료 전략은 FXS에서 단백질 합성 결함을 치유하는 경우 "치료적"일 수 있다. GFP- 또는 FMRP-발현 AAV를 주사한 야생형 및 Fmr1 KO 마우스에서 단백질 합성률을 평가하기 위해, LTP 전기생리학을 위해 준비된 피질 및 해마 절편을, 이어서, 초기 펩티드 사슬 내로의 퓨로마이신 혼입을 사용하는 단백질 합성 분석에 이어, Fmr1 KO 뇌에서 증가된 단백질 합성률을 일관되게 보여주는 방법인 웨스턴 블롯 분석에 사용하였다. 퓨로마이시닐화 분석은, FMRP-발현 AAV를 주사한 Fmr1 KO 마우스 2마리, GFP-발현 AAV를 주사한 Fmr1 KO 마우스 5마리, FMRP-발현 AAV를 주사한 야생형 마우스 5마리 및 GFP-발현 AAV를 주사한 야생형 마우스 4마리에서 수행하였다. 도 12a 및 도 12b는 GFP-주입된 야생형 절편과 비교하여 GFP-주입된 Fmr1 KO 절편에서 단백질 합성 속도가 증가된 피질 절편을 보여준다. 또한, 도 12a 및 도 12b는 FMRP-주입된 Fmr1 KO 절편에서 감소된 단백질 합성 속도를 보여준다. 이러한 결과는, Fmr1 KO 마우스에서 FMRP 재발현 정규화된 단백질 합성 비율이 시냅스 가소성, 학습 및 기억의 변화의 기초가 되는 것으로 여겨지는 분자 결함을 나타냄을 시사한다. 전반적으로 여기에서 수행된 세포 및 분자 기능 분석은 성인 Fmr1 KO 마우스에서 낮은 FMRP 재발현의 유익한 효과를 제시했다.
(iii) 정량적 뇌파도(EGG)
여기에서 제공된 데이터는 정량적 뇌파도(EEG)가 FXS 질환 중증도 및 치료 반응(휴지기 상태 및 청각성 이벤트 관련 전위)의 바이오마커로 사용될 수 있음을 보여준다. 도 14a는, FXS 환자에서 관찰되는 과도한 감마 파워를 나타내는, 유의미한 그룹 차이(p < 0.05 보정됨)를 포함하는 인간의 상대적 감마 파워의 토포그래픽 플롯을 보여 준다. 청각성 피질 감마 파워는 행동 기능과 높은 상관관계가 있었고, 더 높은 감마 파워는 FXS 환자의 청각 주의력에서 더 낮은 성능과 연관되었다(도 14b). 관찰된 감마와 세타 및 알파 파워의 상관관계는 FXS와 건강한 인간 대상을 뚜렷하게 구별한다(도 14c). 전반적으로, 상승된 휴지기 감마 파워는 인간의 대뇌피질 과흥분성에 대한 강력한 정량화가능한 바이오마커인 것으로 밝혀졌다.
FXS의 마우스 모델에서 필적가능한 EEG 바이오마커를 식별하는 것은 임상 치료 파이프라인에 대한 전임상을 용이하게 할 수 있다. Fmr1 KO 마우스가 높은 휴지기 감마 파워를 나타내는지 확인하기 위해, 30채널 마우스 다중 전극 어레이(MEA) 시스템을 사용하여 야생형 및 Fmr1 KO 마우스에서 휴지기 및 자극 유발 EEG 신호를 기록하고 분석하였다. 이 시스템을 사용할 때, FXS를 가진 인간에게서 보고된 것과 매우 유사하게, Fmr1 KO 마우스에서 청각 소리 자극에 대한 더 높은 휴지기 EEG 파워, 변경된 이벤트-관련 전위(ERP) 및 시험간 위상 일관성 감소를 포함하는 강력한 MEA-유도된 표현형이 관찰되었다. 도 13은, 연속 EEG에 의해 측정된 감마 파워가 6일에 걸쳐 5분 동안 계산되는 경우(n=3, RM 2-way ANOVA, *p<0.05), WT 마우스와 비교할 때 Fmrl KO에서 증가된 감마 파워를 보여준다. 따라서, 인간에서 발견된 증가된 휴지기 감마 파워의 EEG 바이오마커는 피질 EEG 기록을 사용하는 Fmr1 KO 마우스에서 되풀이되었다(도 13).
마우스 EEG 바이오마커의 변화를 인간 EEG 바이오마커와 상관관계화하기 위해 Matlab 기반 분석 접근법을 사용하여 마우스 데이터를 인간 데이터에 정렬했다. 도 14d는 인간 데이터를 사용하여 FXS의 이상과 관련된 Matlab 기반 분석 접근법을 사용하여 수행되고 자동화된 감마 파워 분석을 보여준다. 뮤린 EEG 데이터의 추가 분석은, 인간과 뮤린 표현형의 직접적인 비교를 가능하게 하고 FXS에서 정량적 및 번역 EEG 바이오마커를 확립하기 위해, 마우스의 주파수 대역별 EEG 파워와 감마/세타 커플링을 평가할 수 있다. 이러한 데이터는 FXS의 인간 EEG 바이오마커가 FXS 치료의 개발 및 최적화에서 객관적인 척도로 사용될 수 있음을 시사할 수 있다.
실시예 6. FMRP-발현 AAV 벡터 투여 후 생체내 FXS 마우스에서의 발현 및 생체내 분포 평가
상기 실시예 1에 기술된 AAV-CAGFMR1(즉, AAV-CB-FMR1) 또는 AAV-GFP(대조군으로서)를 사용하여 Fmr1KO 또는 Fmr1WT 마우스에서의 FMR1 유전자 요법에 대한 파일럿 전임상 연구를 보고한다. 또한, 도 2a를 참조한다. 9.5-11주령의 수컷 마우스를 본 연구에 사용하였다. 5x1013 vg/kg의 바이러스 입자를 꼬리 정맥을 통해 각 마우스에 주사했다. 30분 내지 6시간 후, 마우스는 양측 뇌실내(ICV) 수술을 받고, 5x1010 vg 바이러스 입자를 각 반구에 전달하였다. 12-14일 후, 마우스를 희생시켰고, 혈액 샘플 및 조직 샘플(예를 들어, 뇌, 근육, 심장, 폐, 신장, 간 및 척수 샘플)을 수집했다. 뇌 샘플의 절반을 면역염색(파라포름알데히드 후-고정됨)으로 분석했다. 뇌 샘플의 나머지 절반은 해마, 피질, 중뇌 및 소뇌로 해부되었다(급속 동결됨). FMRP 발현 및 분포를 평가하기 위해 모든 뇌 샘플을 면역염색에 의해 분석하였다. 두 세트의 다른 조직 샘플(예를 들어, 간 샘플)을 절편화했는데, 한 세트는 GFP 발현의 검출을 위한 것이고(GFP 발현을 확인하기 위해 염색하지 않고 절단 직후 이미지 분석됨), 다른 한 세트는 면역염색을 통한 FMRP 발현을 확인하기 위한 것이다. 면역염색 분석에 사용되는 항-FMRP 항체는 인간 FMRP에 대해 특이적이며, WT 마우스에서는 낮은 특이적 염색성을 갖는다. 이 연구의 결과는 주로 피질에서 인간 FMRP의 신경 발현을 보여준다.
또한, 상이한 조직 샘플에서 hFMR1 전사체의 수준을 검출하기 위해 뇌 및 조직 샘플에 대해 RT-PCR을 수행하였다. eGFP이 대조군으로 사용되었다. 그 결과는 GAPDH로 정규화되었고 도 20a 내지 도 20g에 제공되었다. hFMR1의 발현은 뇌의 다양한 영역(예를 들어, 피질)에서 및 또한 다양한 기관(예를 들어, 심장 및 간)에서 검출되었다.
실시예 7. FMRP-발현 AAV 벡터 투여 후 생체내 FXS 마우스에서의 발현 및 생체내 분포 평가
이 연구의 목적은 Fmr1 녹아웃(KO) 마우스에서 인간 FMRP(hPGK, CAGWPRE 및 CAGdelWPRE)를 암호화하는 cDNA를 포함하는 3가지 다른 바이러스 벡터의 분포 및 발현을 추가로 테스트하는 것이다. 이들 3가지의 벡터에 대한 세부 사항은 위의 실시예 1에 제공되어 있다. 바이러스 벡터는 5-7주령 마우스에 뇌실내(ICV) 또는 정맥내(IV, 꼬리 정맥)로 전달된다. 4주(+/-3일) 후, 혈액 및 장기를 수확하고, RT-qPCR에 의한 Fmr1 RNA 발현, 및 웨스턴 블롯 및/또는 면역조직화학(IHC)에 의한 FMRP 발현에 대해 테스트한다. 인큐베이션 동안 마우스의 전반적인 건강 상태와 이상 반응을 모니터링한다.
마우스에서 수확한 뇌 조직을 RT-qPCR로 Fmr1 RNA 발현에 대해 분석하고 IHC 및 웨스턴 블롯으로 FMRP 발현에 대해 분석한다. 다른 조직은 RT-qPCR에 의한 Fmr1 RNA 발현에 대해, 그리고 웨스턴 블롯에 의한 FMRP 발현에 대해 분석된다. 다른 조직에는 배측(dorsal) 경로 신경절(DRG), 간, 폐, 심장, 척수, 신장, 생식선 및 종아리 근육이 포함된다.
상기 실험의 결과를 분석하여 어떤 벡터(들)가 뇌 및 신체의 모든 부분에 우수한 발현 및 전이유전자 전달을 제공하는지를 결정한다. FMR1 유전자가 조직에서 유비쿼터스하게 발현된다는 점을 감안할 때, 하나 이상의 테스트된 벡터에 의해 달성가능한 수정 전이유전자의 광범위한 분포가 취약 X 증후군의 치료에 유익할 것으로 예상된다.
실시예 8. FMRP-발현 AAV 벡터의 ICV 투여 후 FXS 모델 마우스에서의 기능적 분석: 발작 민감성
이 연구의 목적은, ICV 투여를 통해 투여된 FMRP-발현 AAV 벡터로 치료한 후, 취약 X 증후군 모델 마우스에서 발작 민감성의 감소에 있어서의 세 가지 다른 바이러스 벡터의 효과를 추가로 평가하는 것이다. FMRP-발현 AAV 벡터는 CAGWPRE, CAGdelWPRE 및 hPGK 벡터를 포함한다.
Fmr1 녹아웃(KO) 마우스에게 ICV 투여를 통해 FMRP-발현 AAV 벡터를 1-3일령(P1-3)에게 6e9 vg/심실 용량으로 투여하였다. 대조군 Fmr1 KO 마우스에게는 동일한 주령의 것에 비히클을 투여하였다. 20-23일령(P20-23)에 마우스는 청각원성 발작(AGS; audiogenic seizure) 테스트를 받는다. P20-P23 마우스는 먹이 호퍼가 없이 일반 깔개가 있는 케이지에 2개의 그룹으로 배치된다. A/C 전원 케이블에 연결된 개별 경보기(120dB)가 케이지 뚜껑 안쪽에 부착되어 있다. 소리는 정확히 2분 동안 재생되고 1분은 무음으로 유지되고 추가 2분은 소리가 재생된다. 테스트 기간 동안 마우스를 관찰한다. 행동과 발작은 소리에 노출되는 동안 채점된다. 행동은 아래에 설명된 대로 0 내지 4의 척도로 채점된다.
0 = 변화 없음
1 = 거친 달리기(wild running)
2 = 간대성 발작(clonic seizure)
3 = 강직 발작(tonic seizure)
4 = 사망
살아남은 마우스는 성별에 의해 분리된 최대 4마리의 케이지에 넣는다. 8주령에, AGS 테스트에서 살아남은 마우스를 CO2 또는 펜토바르비탈로 안락사시킨다. 혈액을 후안와 출혈을 통해 EDTA 함유 튜브로 수집한다. 이어서, 마우스를 멸균 PBS로 경심장 관류한다. 마우스로부터 다양한 장기 및 조직을 채취하여 생체내 분포 분석을 실시한다. 뇌 조직은, Fmr1 RNA 발현을 결정하기 위해 RT-qPCR을 받게 되고, FMRP 발현을 조사하기 위해 IHC를 받게 된다. 또한, 후근 신경절(DRG), 간, 폐, 심장, 신장, 생식선 및 종아리 근육 조직을 처리하고 RT-qPCR을 수행하여 Fmr1 RNA 발현 수준을 분석한다.
상기 실험의 결과를 분석하여 Fmr1 KO 마우스에서 높은 발작 민감성의 우수한 치유뿐만 아니라 전이유전자의 우수한 전달 및 발현을 제공하는 벡터(들)을 결정한다. FMR1 유전자가 조직에서 유비쿼터스하게 발현된다는 점을 감안할 때, 하나 이상의 테스트된 벡터에 의해 달성가능한 수정 전이유전자의 광범위한 분포가 취약 X 증후군의 치료에 유익할 것으로 예상된다.
실시예 9. FMRP-발현 AAV 벡터의 ICV, IV 및 조합된(IV+ICV) 투여 후의 FXS 모델 마우스에서의 기능적 분석
이 연구의 목적은 FMRP-발현 AAV 벡터로 치료한 후 취약 X 증후군 모델 마우스에서 기능적 신경생리학적 결함의 치유를 추가로 평가하는 것이다. FMRP-발현 AAV 벡터는 CAGWPRE, CAGdelWPRE 및 hPGK 벡터를 포함한다. 상기 연구는 두 단계(2개의 코호트)로 수행된다. 코호트 분포는 표 3을 참조한다.
Figure pct00018
그룹 1에서 6까지의 마우스는 5주령에 테스트 AAV 벡터 후보 주사를 받는다. 상이한 투여 경로(IV, ICV 및 조합된 IV+ICV)를 시험하고 비교한다. 모든 처리 그룹의 마우스를 9주령에 운동 활동 및 청각원성 발작 민감성(AGS)에 대해 테스트한다.
각 코호트에 대해 40마리의 마우스로 구성된 7개의 테스트 그룹이 있고(표 1 참조), 이들은 연속 2일 동안 테스트받는다(AGS 테스트 시간 12:00-4:45). 추가적으로, 각 테스트 그룹의 케이지 교체 일정은 표준화되고 시차가 있다. 구체적으로, 각 테스트 그룹은 테스트 전날 케이지를 교체했다.
시험 당일에 그룹 1에서 7까지의 마우스에게, 운동 활동(LMA) 테스트에서 오픈 필드 챔버에서의 평가 15분 전에 식염수(IP)를 투여한다. 30분의 LMA 테스트 직후, 마우스는 AGS 테스트를 받게 된다. 이어서, 마우스를 깨끗한 케이지로 옮기고 개별적으로 AGS 시험실로 옮긴다.
(i) 운동 활동(LMA) 테스트
LMA 챔버에 넣기 15분 전에 마우스에 식염수를 투여(IP, 10 mL/kg)한다. 마우스는 자동 활동 모니터링 시스템(MedAssociates)을 사용하여 30분의 오픈 필드 분석(OFA)으로 평가된다. 마우스는 LMA 테스트 시작 30분 전에 룸에 적응시킨다. 다음 매개변수를 포착한다.
ㆍ 수평 이동 거리, 전체 보행 시간 및 보행 횟수
ㆍ 수직적 활동(시간 및 횟수)
(ii) 청각원성 발작(AGS) 테스트
LMA 절차 후, 마우스를 AGS 시험실에 1분 동안 적응시킨다. 이어서, 마우스를 고강도 톤 방출 스피커가 있는 흡음실에 넣는다. 마우스를 흡음실 내부의 투명한 원통형 플렉시글라스 챔버에 넣는다(한 번에 1마리씩). 알람은 플렉시글라스 챔버 상단에 장착된다. 마우스의 행동은 유전자형 상태 및 약물 치료에 대해 모르는 실험자에 의해 실시간으로 채점되고(아래 채점 기준 참조), 추가 분석을 위해 비디오로 녹화된다.
발작 유도는 다음과 같이 수행된다.
LMA 테스트 후, 마우스는 알람이 부착된 테스트 챔버에 배치된다. 1분 적응 후, 알람이 시작되고 2분의 알람 챌린지 동안 동물 행동이 기록된다. 동물의 행동에 따라 채점된다. 채점 기준은 다음과 같다.
0 = 반응 없음
1 = 거친 달리기
2 = 간대성 발작(옆으로 누워 경련)
3 = 강직 발작(옆으로 누워 가만히 있음)
4 = 호흡 정지/사망.
t = 3분에서 알람이 꺼지고 동물이 1분 동안 회복되게 한다. 이 회복 후, 알람이 다시 시작되고 추가 2분 동안(t=4에서 t=6분까지) 마우스를 위에서 기술한 바와 같이 기록하고 채점한다. 기록 후 마우스는 챔버에서 즉시 꺼낸다.
데이터는 위에서 설명한 채점에 따라 발작 이벤트의 규모로 표현된다. 발작 심각도 점수(그룹당 각 마우스에 대한 최고 발작 점수의 평균)를 계산하고 분석한다. 또한, 2분 기간 내에 발작 점수가 2 이상인 것으로 정의되는 발작으로 발작하는 마우스의 백분율을 계산하였다(발작 발생률).
AGS 분석 직후 동물을 이소플루란으로 마취시키고 혈액을 K2EDTA-코팅된 튜브에 수집한다. 혈장 시료는 냉장된 원심분리기에서 혈액을 회전시키는 것(13,000 rpm 및 4℃에서 3분)에 의해 제조된다. 혈액 수집 직후, 해당되는 경우, 뇌를 제거하고, 다양한 영역을 해부한다(예를 들어, 전두엽 피질, 선조체, 해마, 소뇌, 뇌간). 혈장은 별도의 1.5 mL 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 옮겨져 냉동되고 생체 분석된다. 뇌는 급속 동결되거나 고정액에 침지될 수 있다. 동물은 또한, 추가적인 부하를 위해 뇌를 제거하기 전에, 식염수와 고정제로 관류될 수 있다. 선택적으로, 추가적인 장기(예를 들어, 심장, 간, 생식선 등)를 수집하고 분석을 위해 급속 냉동할 수 있다.
위의 실험 결과를 분석하여, Fmr1 KO 마우스에서 뇌와 신체의 모든 부분으로의 우수한 전이유전자 전달뿐만 아니라 행동 결함 및 높은 발작 민감성의 우수한 치유를 제공하는 투여 경로를 결정한다. FMR1 유전자가 조직에서 유비쿼터스하게 발현된다는 점을 고려할 때, 하나 이상의 투여에 의해 달성될 수 있는 교정 전이유전자의 광범위한 분포가 질환의 치료에 유익할 것으로 예상된다.
다른 실시형태
본원에 개시된 모든 특징들은 임의의 조합으로 조합될 수 있다. 본원에 개시된 각 특징은 동일하거나 동등하거나 유사한 목적을 제공하는 대체 특징으로 대체될 수 있다. 따라서 달리 명시되지 않는 한, 개시된 각 특징은 동등하거나 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 한 예일 뿐이다.
상기 설명으로부터 당업자는 본 발명의 본질적인 특성을 쉽게 확인할 수 있고, 그 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 용도 및 조건에 적응시키기 위해 본 발명을 다양하게 변경 및 변형할 수 있다. 따라서, 다른 실시형태도 청구범위 내에 있다.
균등물
여러 가지의 본 발명의 실시형태가 본원에서 설명되고 예시되었지만, 당업자는, 본원에 기술된 기능을 수행하고/하거나 결과 및/또는 장점 중 하나 이상을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 것이다. 이러한 변형 및/또는 변경 각각은 본원에 설명된 본 발명의 실시양태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다. 보다 일반적으로, 당업자는 본원에 기술된 모든 매개변수, 치수, 재료 및 구성이 예시적인 것을 의미하며 실제 매개변수, 치수, 재료 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 특정 용도 또는 용도들에 따라 달라질 것임을 쉽게 이해할 것이다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여서도 본원에 기술된 특정 발명의 실시형태에 대한 많은 균등물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시양태는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 청구범위 및 그에 대한 균등물의 범위 내에서, 본 발명의 실시형태는 구체적으로 기술되고 청구된 것과 달리 실시될 수 있음을 이해해야 한다. 본 발명의 실시형태는 본원에 기술된 각각의 개별 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법이 상호 불일치하지 않는 경우 두 가지 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 재료, 키트 및/또는 방법의 임의의 조합이 본 개시내용의 발명 범위내에 포함된다.
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본원 및 청구범위에서 사용된 단수형 표현은 명백히 달리 나타내지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본원 및 청구범위에서 사용된 "및/또는"이라는 어구는 그렇게 결합된 요소 중 "하나 또는 둘 모두", 즉 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 이접적으로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 여러 요소는 동일한 방식으로, 즉 그렇게 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있든 없든 상관없이 "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별된 요소 이외의 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 일 실시형태에서는 A만을 지칭할 수 있고(선택적으로, B와 다른 요소를 포함함); 다른 실시형태에서는 B만을 지칭하고(선택적으로 A 와 다른 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서, A 및 B 모두를 지칭한다(선택적으로 다른 요소를 포함함).
본원 및 청구범위에서 사용된 "또는"은 상기 정의된 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때 "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것(즉, 요소의 개수 또는 목록 및 선택적으로 목록에 없는 추가 항목 중 적어도 하나를 포함할 뿐 아니라 하나 초과를 포함하는 것)으로 해석되어야 한다. "오직 하나" 또는 "정확히 하나", 또는 청구범위에서 사용될 때, "구성되는"과 같이 명백히 반대되게 기재된 용어는, 요소의 개수 또는 목록의 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 의미한다. 일반적으로 본원에서 사용된 "또는"이라는 용어는, "어느 것", "~중 하나", "~중 단지 하나" 또는 "~중 정확히 하나"와 같이 배타적인 용어가 선행될 때 배타적인 대안(즉, "둘 다가 아니라 둘 중 하나 또는 다른 하나")을 나타내는 것으로만 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용될 때 "본질적으로 구성된"은 특허법 분야에서 사용되는 일반적인 의미를 갖는다.
용어 "약" 또는 "대략"은 당업자에 의해 결정된 특정 값에 대한 허용가능한 오차 범위 내를 의미하며, 이는 부분적으로는 그 값이 측정 또는 결정되는 방식, 즉, 측정 시스템의 한계치에 좌우될 것이다. 예를 들어, "약"은 해당 기술 분야의 관례에 따라 허용가능한 표준 편차 이내를 의미할 수 있다. 달리, "약"은 주어진 값의 최대 ±20%, 바람직하게는 최대 ±10%, 보다 바람직하게는 최대 ±5%, 더욱 바람직하게는 최대 ±1%의 범위를 의미할 수 있다. 달리, 특히 생물학적 시스템 또는 공정과 관련하여, 상기 용어는 값의 10배 이내, 바람직하게는 2배 이내를 의미할 수 있다. 출원 및 청구범위에 특정 값이 기술되어 있는 경우, 달리 명시되지 않는 한, "약"이라는 용어는 함축적이며 이러한 맥락에서 특정 값에 대해 허용가능한 오류 범위 내를 의미한다.
본원 및 특허청구범위에서 사용된 "적어도 하나"라는 어구는, 하나 이상의 구성요소의 목록과 관련하여, 요소 목록내 요소들 중 임의의 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소 목록에 구체적으로 나열된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함할 필요는 없으며 요소 목록의 요소 조합을 배제하지 않는다. 이 정의는 또한, "적어도 하나"라는 문구가 지칭하는 요소 목록 내에서 특별히 식별된 요소와 관련이 있는지 여부에 관계없이, 상기 요소와 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적 예로서, "A 및 B 중 적어도 하나"(또는 동등하게 "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는, 일 실시형태에서는, 선택적으로는 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A(B가 존재하지 않고, 선택적으로 B 이외의 요소를 포함함)를 지칭하고; 또 다른 실시형태에서는, 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B(A가 존재하지 않고, 선택적으로 A 이외의 요소를 포함함)를 지칭하고; 또 다른 실시형태에서는, 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A, 및 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B(및 선택적으로 다른 요소들을 포함함)를 지칭할 수 있다.
또한 명백히 반대로 나타내지 않는 한, 하나 이상의 단계 또는 동작을 포함하는 본원에 청구된 임의의 방법에서, 그 방법의 단계 또는 동작의 순서는 반드시 그 방법의 단계 또는 동작이 언급되는 그 순서에 제한되지 않는다는 것을 이해해야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Children's Hospital Medical Center <120> METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATMENT OF FRAGILE X SYNDROME <130> 112149-0232-70043WO00 <140> Not Yet Assigned <141> Concurrently Herewith <150> US 63/053,461 <151> 2020-07-17 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 632 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met Glu Glu Leu Val Val Glu Val Arg Gly Ser Asn Gly Ala Phe Tyr 1 5 10 15 Lys Ala Phe Val Lys Asp Val His Glu Asp Ser Ile Thr Val Ala Phe 20 25 30 Glu Asn Asn Trp Gln Pro Asp Arg Gln Ile Pro Phe His Asp Val Arg 35 40 45 Phe Pro Pro Pro Val Gly Tyr Asn Lys Asp Ile Asn Glu Ser Asp Glu 50 55 60 Val Glu Val Tyr Ser Arg Ala Asn Glu Lys Glu Pro Cys Cys Trp Trp 65 70 75 80 Leu Ala Lys Val Arg Met Ile Lys Gly Glu Phe Tyr Val Ile Glu Tyr 85 90 95 Ala Ala Cys Asp Ala Thr Tyr Asn Glu Ile Val Thr Ile Glu Arg Leu 100 105 110 Arg Ser Val Asn Pro Asn Lys Pro Ala Thr Lys Asp Thr Phe His Lys 115 120 125 Ile Lys Leu Asp Val Pro Glu Asp Leu Arg Gln 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gtcaatgccc ttctaccagc catttgagac actaccaggc 7020 aggcaaagcc aagtggcttc actccttatt tatattagct cagaggagcc atctaacagc 7080 tcttactcaa ctagactagc tgcatgaaca gtgtacagct agctgcgcaa tcggatcccg 7140 ggcccgtcga ctgcagaggc ctgcatgcaa gcttggtgta atcatggtca tagctgtttc 7200 ctgtgtgaaa ttgttatccg ctcacaattc cacacaacat acgagccgga agcataaagt 7260 gtaaagcctg gggtgcctaa tgagtgagct aactcacatt aattgcgttg cgctcactgc 7320 ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg 7380 ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 7440 cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 7500 cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 7560 accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 7620 acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 7680 cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 7740 acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 7800 atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 7860 agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 7920 acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 7980 gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 8040 gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 8100 gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 8160 gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 8220 acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 8280 tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caagcccaat ctgaataatg ttacaaccaa 8340 ttaaccaatt ctgattagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata 8400 tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca 8460 ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca 8520 acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca 8580 ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact 8640 tgttcaacag gccagccatt 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Claims (47)

  1. 취약 X 증후군(FXS)을 치료하는 방법으로서, FXS를 갖는 인간 환자에게 유효량의 복수의 아데노-연관 바이러스(AAV) 9 바이러스 입자를 투여하는 단계를 포함하며, 여기서 AAV9 바이러스 입자는, 야생형 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질(인간 FMRP)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 단일-가닥 AAV DNA 벡터를 포함하고, 뉴클레오티드 서열은 프로모터에 작동가능하게 연결되고, AAV DNA 벡터는 AAV9 바이러스 입자에 의한 감염 후 인간 환자의 뇌에서 야생형 인간 FMR1을 발현하는, 방법.
  2. 제1항에 있어서, AAV DNA 벡터가 자기-상보적 AAV 벡터인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, AAV DNA 벡터가 표준 AAV 벡터인, 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 닭 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터의 하이브리드인, 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK: human phosphoglycerate kinase) 프로모터인, 방법.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, AAV DNA 벡터가 인간 FMRP의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 요소를 추가로 포함하는, 방법.
  7. 제6항에 있어서, 하나 이상의 조절 요소가 인간 β-글로빈 인트론 서열, 하나 이상의 polyA 신호전달 서열, 우드척(woodchuck) 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE), 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  8. 제7항에 있어서, 하나 이상의 polyA 신호전달 서열이 인간 β-글로빈 polyA 신호전달 서열, SV40 polyA 신호전달 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  9. 제4항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, AAV DNA 벡터가 WPRE를 함유하지 않는, 방법.
  10. 제1항에 있어서, AAV DNA 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터의 하이브리드, WPRE, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열을 포함하는 표준 AAV 벡터인, 방법.
  11. 제1항에 있어서, AAV DNA 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터의 하이브리드, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열을 포함하는 표준 AAV 벡터이고, 여기서 AAV DNA 벡터는 WPRE를 함유하지 않는, 방법.
  12. 제1항에 있어서, AAV DNA 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 상류의 인간 β-글로빈 인트론 서열, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열 및 인간 β-글로빈 polyA 신호전달 서열을 포함하는 표준 AAV 벡터이고, 여기서 AAV DNA 벡터는 WPRE를 함유하지 않는, 방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, AAV DNA 벡터는 비-뇌 조직에서 야생형 FMRP의 발현을 억제하기 위해 하나 이상의 조직-선택적 마이크로RNA에 대해 특이적인 하나 이상의 마이크로RNA-표적 부위(MTS)를 추가로 포함하는, 방법.
  14. 제13항에 있어서, 하나 이상의 MTS는 miR-122의 MTS, miR-208a의 MTS, miR-208b-3p의 MTS, miR-499a-3p의 MTS, 또는 이들의 조합을 포함하는, 방법.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 인간 FMRP가 인간 FMRP 동형체 1인, 방법.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 FMRP가, N-말단 1-297 아미노산 잔기를 포함하는 야생형 인간 FMRP의 단편인, 방법.
  17. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 바이러스 입자가 정맥내 주사, 뇌실내 주사, 대조내 주사, 실질내 주사, 또는 이들의 조합에 의해 인간 환자에게 투여되는, 방법.
  18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, AAV9 바이러스 입자가 적어도 2가지의 투여 경로를 통해 인간 환자에게 투여되는, 방법.
  19. 제18항에 있어서, 적어도 2가지의 투여 경로가 하기로 이루어진 군으로부터 선택되는, 방법:
    (a) 뇌실내 주사와 정맥내 주사;
    (b) 척수강내 주사와 정맥내 주사;
    (c) 대조내 주사와 정맥내 주사; 그리고
    (d) 실질내 주사와 정맥내 주사.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 투여 전에 인간 환자에게 상기 질환의 표현형 중증도를 결정하기 위해 뇌파도(EEG) 검사, 행동 및/또는 인지 신경 재활 평가, 또는 이들의 조합을 적용하는, 방법.
  21. 제20항에 있어서, 상기 방법이 투여 단계 이전에 인간 환자에게 뇌파도(EEG) 검사, 행동 및/또는 인지 신경 재활 평가, 또는 이들의 조합을 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 방법이 EEG 분석, 행동 및/또는 인지 평가, 또는 이들의 조합에 기초하여 AAV9 바이러스 입자의 투여량 및/또는 전달 경로를 결정하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자가 GABA 수용체 작용제, PI3K 동형체-선택적 억제제, MMP9 길항제, 또는 이들의 조합을 포함하는 치료를 받았거나 받고 있는 중인, 방법.
  24. 제1 항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자에게 유효량의 GABA 수용체 작용제, PI3K 동형체-선택적 억제제, MMP9 길항제, 또는 이들의 조합을 투여하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  25. 제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 치료 효능을 모니터링하기 위해 AAV9 바이러스 입자의 투여 후 인간 환자에게 EEG 검사를 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자에게 행동 및/또는 인지 신경 재활 평가를 적용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
  27. 제26항에 있어서, 신경 재활 평가는 AAV9 바이러스 입자의 투여 후에 수행되는, 방법.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 환자가 인간 아동인, 방법.
  29. 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서,
    (i) 5' 역 말단 반복(ITR) 및 3' ITR을 포함하는 AAV 백본;
    (ii) 야생형 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
    (iii) (ii)에 작동가능하게 연결된 프로모터; 및
    (iv) 비-뇌 조직에서 야생형 FMRP의 발현을 억제하기 위한, 하나 이상의 조직-선택적 마이크로RNA에 대해 특이적인 하나 이상의 마이크로RNA-표적 부위(MTS)를 포함하는, 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  30. 제29항에 있어서, 자기-상보적 AAV 벡터인 AAV 벡터.
  31. 제29항 또는 제30항에 있어서, 프로모터가 닭 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터의 하이브리드인, AAV 벡터.
  32. 제29항 내지 제31항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 MTS가 miR-122의 MTS, miR-208a의 MTS, miR-208b-3p의 MTS, miR-499a-3p의 MTS, 또는 이들의 조합을 포함하는, AAV 벡터.
  33. 제29항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 야생형 인간 FMRP가 인간 FMRP 동형체 1인, AAV 벡터.
  34. 자기-상보적 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서,
    (i) 5' 역 말단 반복(ITR) 및 절두된(truncated) 3' ITR(둘 중 하나 또는 둘 다 절두됨)을 포함하는 AAV 백본;
    (ii) 야생형 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질(인간 FMRP)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로서, 여기서 야생형 FMRP는 FMRP 동형체 1인, 뉴클레오티드 서열; 및
    (iii) (ii)에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함하는, 자기-상보적 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  35. 제34항에 있어서, 비-뇌 조직에서 야생형 FMRP의 발현을 억제하기 위한, 하나 이상의 조직-선택적 마이크로RNA에 대해 특이적인 하나 이상의 마이크로RNA-표적 부위(MTS)를 추가로 포함하는 자기-상보적 AAV 벡터.
  36. 제34항 또는 제35항에 있어서, 프로모터가 닭 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터의 하이브리드인, 자기-상보적 AAV 벡터.
  37. 제34항 내지 제36항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 MTS가 miR-122의 MTS, miR-208a의 MTS, miR-208b-3p의 MTS, miR-499a-3p의 MTS, 또는 이들의 조합을 포함하는, 자기-상보적 AAV 벡터.
  38. 표준 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터로서,
    (i) 5' 역 말단 반복(ITR) 및 3' ITR을 포함하는 AAV 백본;
    (ii) 야생형 인간 취약 X 정신지체 1(FMR1) 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
    (iii) (ii)에 작동가능하게 연결된 프로모터; 및
    (iv) FMRP의 발현을 조절하는 하나 이상의 조절 요소를 포함하는, 표준 아데노-연관 바이러스(AAV) 벡터.
  39. 제38항에 있어서, 프로모터가 닭 β-액틴 프로모터와 CMV 프로모터 또는 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터의 하이브리드인, AAV 벡터.
  40. 제38항 또는 제39항에 있어서, 하나 이상의 조절 요소가 인간 β-글로빈 인트론 서열, 하나 이상의 polyA 신호전달 서열, 우드척 간염 바이러스 전사-후 조절 요소(WPRE), 또는 이들의 조합을 포함하는, AAV 벡터.
  41. 제40항에 있어서, 하나 이상의 polyA 신호전달 서열이 인간 β-글로빈 polyA 신호전달 서열, SV40 polyA 신호전달 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는, AAV 벡터.
  42. 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, AAV DNA 벡터가 WPRE를 함유하지 않는, AAV 벡터.
  43. 제38항에 있어서, AAV 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터의 하이브리드, WPRE, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열을 포함하는 AAV 벡터.
  44. 제38항에 있어서, AAV 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 닭 β-액틴 프로모터 및 CMV 프로모터의 하이브리드, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열을 포함하고, 여기서 AAV DNA 벡터는 WPRE를 함유하지 않는, AAV 벡터.
  45. 제38항에 있어서, AAV 벡터는, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 인간 포스포글리세레이트 키나제(hPGK) 프로모터, 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 상류의 인간 β-글로빈 인트론 서열, 및 인간 FMRP를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 하류의 SV40 polyA 신호전달 서열 및 인간 β-글로빈 polyA 신호전달 서열을 포함하고, 여기서 AAV DNA 벡터는 WPRE를 함유하지 않는, AAV 벡터.
  46. 단일-가닥 AAV DNA 벡터를 캡슐화하는 AAV9 캡시드를 포함하는 아데노-연관 바이러스(AAV) 9 바이러스 입자로서, AAV DNA 벡터는 제29항 내지 제45항 중 어느 한 항에 기재된 것인, 아데노-연관 바이러스(AAV) 9 바이러스 입자.
  47. AAV9 바이러스 입자 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
KR1020237005196A 2020-07-17 2021-07-16 취약 x 증후군의 치료를 위한 방법 및 조성물 KR20230084465A (ko)

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