CN113322281B - 一种高效组织特异性表达rs1蛋白的重组腺相关病毒及应用 - Google Patents

一种高效组织特异性表达rs1蛋白的重组腺相关病毒及应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113322281B
CN113322281B CN202110514036.1A CN202110514036A CN113322281B CN 113322281 B CN113322281 B CN 113322281B CN 202110514036 A CN202110514036 A CN 202110514036A CN 113322281 B CN113322281 B CN 113322281B
Authority
CN
China
Prior art keywords
protein
vector
expression
associated virus
recombinant adeno
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202110514036.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113322281A (zh
Inventor
杨阳
魏于全
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Chengdu Jinweike Biological Technology Co ltd
Original Assignee
Chengdu Jinweike Biological Technology Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Chengdu Jinweike Biological Technology Co ltd filed Critical Chengdu Jinweike Biological Technology Co ltd
Priority to CN202110514036.1A priority Critical patent/CN113322281B/zh
Publication of CN113322281A publication Critical patent/CN113322281A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113322281B publication Critical patent/CN113322281B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/0008—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'non-active' part of the composition delivered, e.g. wherein such 'non-active' part is not delivered simultaneously with the 'active' part of the composition
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
    • A61K48/005—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy characterised by an aspect of the 'active' part of the composition delivered, i.e. the nucleic acid delivered
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14121—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2750/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssDNA viruses
    • C12N2750/00011—Details
    • C12N2750/14011—Parvoviridae
    • C12N2750/14111—Dependovirus, e.g. adenoassociated viruses
    • C12N2750/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/22—Vectors comprising a coding region that has been codon optimised for expression in a respective host

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种高效组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒及应用。一种RS1蛋白表达框，由启动子‑目的基因序列‑polyA组成，其中，所述的启动子选自RK启动子，目的基因选自野生型RS1基因或所述的密码子优化的RS1基因，polyA选自rBG或bGH中的任意一种载体，含有本发明所述的RS1蛋白表达框。本发明对基因表达框的优化，利用重组腺相关病毒作为基因递送载体，在视网膜或神经节细胞中，实现RS1蛋白的组织特异性高效且持续的表达，达到治疗X连锁的青少年视网膜劈裂症的目的。通过目的基因组织特异性表达，可以减少病毒载体用量，进而降低免疫的风险,并达到长效治疗的目的。

Description

一种高效组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒及应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种高效组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒及应用。
背景技术
X连锁的青少年视网膜劈裂症(X-Linked juvenile Retinoschisis，XLRS)是一种X染色体连锁的罕见的遗传性致盲眼病，通常是从男性幼年时期开始出现视力低下以及出现严重的并发症，一直发展到老年时期，且病情逐步恶化。在全球范围内，XLRS发病率约为1:5000～1:25000。XLRS主要累及双侧视网膜，在视网膜神经纤维层和神经节细胞层之间出现劈裂腔。XLRS患者初期的视网膜电图(electroretinogram，ERG)反应中暗适应的b波振幅下降，而a波振幅通常保持正常。由于a波来源于光感受器，这表明初期光感受器的活性相对正常，而b波来源于靠近光感受器的双极细胞，其中的Müller细胞是构成视网膜的重要部分，胞体在内核层，轴突贯穿于视网膜各层，b波就是来源于Müller细胞的去极化过程，XLRS会导致Müller细胞变性，导致负性b波说明突触传递过程存在缺陷。在有视网膜病变家族史的男性中发现这种ERG表型是XLRS的临床诊断的关键。随着XLRS疾病恶化，劈裂程度加深，范围扩大，a波振幅也会出现降低，但是由于b波振幅严重降低，b/a比值仍略小于正常，此时ERG仍可作为诊断的方式，但XLRS晚期a波和b波均出现重度异常，b/a比值稍显正常。XLRS诊断的特征性指标为典型的黄斑区车轮状劈裂和ERG b/a比值下降。目前针对XLRS的临床治疗仍以观察及并发症治疗为主，尚无有效的治疗方法，患者的最终结局多为视力丧失(PubMed：30578483)。
X连锁的青少年性视网膜劈裂症的致病基因为Retinoschisin 1(RSl)基因。该基因定位于Xp22.1-p22.2，由6个外显子构成，编码224个氨基酸，有16000余个碱基对。根据人类基因突变数据库(www.hgmd.org)记载目前己报道的突变位点有235个，涵盖了整个基因的所有6个外显子区，包括碱基插入、替代、缺失、重复等。RS1蛋白是一种胞外蛋白，结合带负电荷的膜脂质，例如磷脂酰丝氨酸和磷酸肌醇。可能通过两个相邻细胞表面上存在的八聚体之间的同源相互作用在视网膜的细胞-细胞粘附过程中发挥作用(PubMed：27114531)，是视网膜的正常结构和功能所需的蛋白(PubMed：19093009)。根据在XLRS患者中所描述的视网膜病理进程，表明RS1在视网膜结构的正常发育和维持中是起着重要的作用，这种蛋白对维持功能突触完整性至关重要，这使得基因替代成为一种有潜力的XLRS治疗方法。
腺相关病毒(Adeno-associated virus,AAV)载体介导的基因治疗技术已日趋成熟：2012年，欧洲批准了第一个基于AAV的基因治疗产品Glybera，其为治疗脂蛋白脂酶缺乏症的AAV1-LDL载体；2017年，美国FDA批准了首个针对遗传性视力丧失的AAV基因治疗药物Luxturna，用于治疗RPE65基因突变引起的视网膜营养不良症；2019年，美国FDA又批准了另外一款用于脊髓性肌萎缩症的AAV基因治疗药物Zolgensma；目前，包括眼科等各个方面有多个AAV基因治疗产品正在进行不同阶段的临床试验(PubMed：33309881)。
由于AAV为单链DNA病毒，所以单链AAV(Single-strand AAV,ssAAV)必须首先完成单链基因组向有转录活性的双链形式的转变，然后才能开始表达，这一过程会限制AAV载体介导的外源基因的转导，并且会影响外源基因的表达效率。自身互补的双链DNA的AAV(Self-complementary AAV,scAAV)可以克服这一限制，由于不需要经历由单链变为双链的过程，因此scAAV进入细胞后可以直接表达，并且表达时间更快且表达水平更高(PubMed：18682697)。
针对XLRS基因治疗的现有技术大多使用广谱启动子如CMV启动子，不能实现目的蛋白的组织特异性表达，对治疗效果存在一定的限制。另外非组织特异性表达会增加AAV载体的用量，会增加免疫的风险。而且有研究发现，广谱的启动子(如CMV启动子)对眼部的光感受器和视网膜色素上皮细胞存在毒性，而光感受器细胞特异性启动子Rhodopsin Kinase(RK)启动子对眼部细胞没有毒性(PubMed：30833387)。对于XLRS基因治疗来说，不仅要考虑治疗的有效性，由于患者多自幼年发病，所以在考虑有效性的同时，如何实现药物治疗的长效性，是提高患者依从性的关键，也是目前急需解决的问题。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供一种优化后的RS1基因、包含该基因的表达盒和载体及其应用。
本发明的另一目的是提供一种高效组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒及应用。
本发明的目的可通过以下技术方案实现：
一种RS1蛋白表达框，由启动子-目的基因序列-聚腺苷酸化(polyadenylation，polyA)信号组成，其中，所述的启动子选自RK启动子，目的基因选自野生型RS1基因或密码子优化的RS1基因，polyA信号序列选自rBG(rabbit beta-globin)或bGH(bovine growthhormone)中的任意一种。
作为本发明的一种优选，所述的经密码子优化的RS1基因核苷酸序列如SEQ IDNO.4中645-1319bp所示。
作为本发明的一种优选，所述的启动子选自RK启动子，polyA选自bGH。
作为本发明的一种优选，启动子、目的基因序列和polyA之间通过键或核苷酸连接序列连接。核苷酸连接序列可选自内含子(intron)序列等连接序列。
作为本发明的一种优选，所述的RS1蛋白表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。
一种载体，含有本发明所述的RS1蛋白表达框。
作为本发明的一种优选，所述载体为重组腺相关病毒载体,优选为scAAV。
作为本发明的进一步优选，所述载体选自以下任意一种重组腺相关病毒载体血清型：重组腺相关病毒载体血清型包括AAV1、AAV2、AAV3B、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVrh10，优选AAV2、AAV5、AAV8或AAV9。
作为本发明的更进一步优选，所述的载体全序列如SEQ ID NO.4所示。
一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明所述的RS1基因或本发明所述的RS1蛋白表达框。
作为本发明的一种优选，所述宿主细胞为哺乳动物细胞,所述哺乳动物包括人或非人哺乳动物。
作为本发明的进一步优选，所述宿主细胞为视网膜细胞和/或视神经细胞。
在一些优选例中,所述宿主细胞选自下组:HEK293细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。
在另一优选例中,所述宿主细胞选自下组:视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、视神经细胞、或其组合。较佳地,所述宿主细胞为感光细胞(光感受器细胞)、双极细胞、视神经细胞、或其组合。
一种组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒，是采用转染试剂将AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒、辅助质粒和本发明所述的载体共转染HEK293细胞包装制备得到。
作为本发明的一种优选，所述的AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒选自pAAV2/8。
作为本发明的一种优选，所述的辅助质粒选自pAdΔF6。
本发明所述的RS1基因、所述的RS1蛋白表达框或所述的载体、所述的重组腺相关病毒在制备用于治疗X连锁的青少年视网膜劈裂症的长效药物中的应用。
一种药物制剂，所述的制剂含有本发明所述的载体或所述的重组腺相关病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
本发明所述的药物制剂的注射方式为玻璃体腔或视网膜下腔注射。
有益效果：
本发明对RS1蛋白基因进行密码子优化，结合对基因表达框中启动子、polyA序列的优化，利用重组腺相关病毒作为基因递送载体，我们首先使用了广谱启动子CB7，制备了ssAAV8病毒载体，体内实验中显示在RS1基因敲除(RS1-KO)的XLRS疾病模型小鼠中有治疗效果，但是治疗效果有限，在8周龄小鼠中的疗效远低于2周龄小鼠，并且在不同周龄的小鼠中，治疗效果随着时间的增加均发生了显著的下降，无法实现长效治疗效果。随后我们使用了scAAV8携带组织特异性启动子RK，在视网膜或神经节细胞中，实现RS1蛋白的组织特异性高效且持续的表达，降低达到X连锁的青少年视网膜劈裂症有效性的AAV病毒所需要的剂量，1×1010GC(genome copies)/眼可取得非常显著的治疗效果，并且在2和8周龄疾病小鼠治疗中，注射后三个月仍未见效果减弱，治疗效果较广谱CB7启动子更好，进而增强治疗效果并降低免疫风险。本发明通过新设计优化RS1蛋白编码序列、主要表达调控元件的优化改造并装载至scAAV8表达载体中，实现了新设计RS1蛋白表达框高效地转运至光感受器细胞中表达。将含有新设计RS1表达框的重组scAAV8病毒载体转导至RS1-KO疾病模型小鼠眼中，ERG检测到波形的反转和正常b波的恢复，能极大地促进视网膜结构和功能的修复，治疗效果持久，将大大降低患者的治疗负担，可以实现一次给药，长期有效的目标，显示出巨大的药物开发潜力。
附图说明
图1 ssAAV8.CB7.EGFP.bGH病毒基因组及病毒包装质粒示意图
图2 scAAV8.RK.EGFP.bGH病毒基因组及病毒包装质粒示意图
图3 ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG病毒基因组及病毒包装质粒示意图
图4 scAAV8.RK.cohRS1.bGH病毒基因组及病毒包装质粒示意图
图5 ssAAV8.CB7.EGFP.bGH和scAAV8.RK.EGFP.bGH病毒包装质粒体外表达的特异性比较
图6 RS1-KO疾病模型小鼠的构建
图7 ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠ERG检测结果比较
图8 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠ERG检测结果比较
图9 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠体内表达情况检测
图10 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠视网膜组织形态恢复情况
具体实施方式
实施例1表达载体构建
本发明首先对RS1基因进行了密码子优化，核苷酸序列如SEQ ID NO.4中645-1319bp所示。在对RS1进行优化的基础上，本发明设计了四个表达框，AAV病毒载体基因组示意图与AAV病毒包装顺式质粒图谱分别如图1-4所示。全序列合成四个病毒包装顺式质粒载体。
ssAAV8.CB7.EGFP.bGH病毒包装质粒(简称pAAVss.CB7.EGFP.bGH)，质粒全序列如SEQ ID NO.1所示，主要功能元件位点：1-168为5’端反向末端重复序列(ITR)，241-899为CB7启动子序列，900-1916为intron序列，1982-2701为EGFP基因序列，2717-2941为bGHpolyA序列，2992-3159为3’端ITR序列。
scAAV8.RK.EGFP.bGH病毒包装质粒(简称pAAVsc.RK.EGFP.bGH)，质粒全序列如SEQ ID NO.2所示，主要功能元件位点：1-105为5’端self-complementary ITR(scITR)序列，143-438为RK启动子序列，487-583为intron序列，645-1364为EGFP基因序列，1380-1604为bGH polyA序列，1665-1822为3’端ITR序列。
ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG病毒包装质粒(简称pAAVss.CB7.cohRS1.rBG)，质粒全序列如SEQ ID NO.3所示，主要功能元件位点：1-168为5’端ITR序列，241-899为CB7启动子序列，993-1965为intron序列，1983-2654为人源RS1蛋白经密码子优化后的目的基因序列，2655-2723为HA和OLLAS标签序列，2738-3332为WPRE元件序列，3373-3499为rBG polyA序列，3547-3714为3’端ITR序列。
scAAV8.RK.cohRS1.bGH病毒包装质粒(简称pAAVsc.RK.cohRS1.bGH)，质粒全序列如SEQ ID NO.4所示，主要功能元件位点：1-105为5’端scITR序列，143-438为RK启动子序列，487-583为intron序列，645-1319为人源RS1蛋白经密码子优化后的目的基因序列，1335-1559为bGH polyA序列，1610-1777为3’端ITR序列。
实施例2病毒包装质粒体外表达的特异性比较
将实施例1中的pAAVss.CB7.EGFP.bGH和pAAVsc.RK.EGFP.bGH以相同的质粒量(2μg)转染培养于六孔板中的HEK293细胞和视神经母细胞瘤细胞Y79，48h后通过免疫荧光拍照观察EGFP的表达情况，结果显示表达pAAVss.CB7.EGFP.bGH在HEK293细胞和Y79细胞中均可以表达EGFP，而pAAVsc.RK.EGFP.bGH只会在Y79细胞中表达EGFP，这说明RK启动子可以实现组织特异性启动表达目的蛋白(图5)。
实施例3 AAV病毒制备与纯化
参考Martin Lock等报道包装和纯化重组AAV病毒的方法，采用PEIpro将AAV2的Rep及AAV8的Cap蛋白表达质粒(pAAV2/8)、辅助质粒(pAdΔF6)和AAV目的基因载体顺式质粒(pAAVss.CB7.cohRS1.rBG/pAAVsc.RK.cohRS1.bGH)共转染HEK293细胞包装制备病毒ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG和病毒scAAV8.RK.cohRS1.bGH，转染144h后，收获细胞培养上清，切向过滤(TFF)浓缩病毒液后，使用碘克沙醇超速梯度离心纯化AAV病毒，收集纯化后的AAV病毒，使用Amicon Ultra 100K离心去盐，最后将AAV病毒置于20mM Tris(pH8.0),1mMMgCl2,200mM NaCl和0.001％PF68制剂中备用。制备的AAV病毒通过SDS-PAGE染色检测病毒纯度，以及鲎试剂检测内毒素含量，Taqman荧光定量(qPCR)探针法测定ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG病毒滴度为1.69×1013GC/ml，scAAV8.RK.cohRS1.bGH病毒滴度为2.46×1013GC/ml。
实施例4：RS1-KO疾病模型小鼠的构建
我们通过CRISPR-Cas9基因敲除工具，将C57小鼠的RS1基因的外显子1-3序列进行移除后得到了RS1基因敲除(RS1-KO)鼠(图6a)。小鼠眼组织的Western blotting和免疫荧光结果(图6b和6c)显示RS1-KO鼠没有RS1蛋白的表达。免疫荧光和苏木素-伊红(HE)染色结果(图6c和6d)显示，与野生型(WT)小鼠相比RS1-KO小鼠的视网膜结构异常，内核层和外核层的视网膜存在裂隙腔，外核层中的光感受器细胞数量减少以及光感受器细胞定位异常，与人的XLRS疾病表型类似。暗适应ERG结果(图6e)显示，与4周龄的WT小鼠相比，4周龄的RS1-KO小鼠b波(b wave)波幅明显下降，在1.2log cd s/m2刺激强度下，b波波幅较WT下降了68.8％。a波(a wave)在0，1.2和2.2log cd s/m2刺激强度下波幅也明显下降，而且b波与a波波幅的比值(b/a)也明显降低(1.2log cd s/m2刺激强度下，b/a均值±SEM：RS1-KO1.72±0.06，WT 2.45±0.05，p＜0.0001，n＝6)。暗适应ERG的系列波形图也显示RS1-KO小鼠呈现了负性的波形，ERG结果也与人的XLRS疾病表型相似。上述结果表明，我们构建得到了RS1-KO小鼠并且该小鼠可以模拟人的XLRS疾病表型，可用于我们后续的体内基因治疗研究实验。
实施例5 ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠ERG检测结果比较
分别在2周龄，8周龄的RS1-KO雄性小鼠的视网膜下腔注射1×1010GC/eye剂量的ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG或PBS溶剂对照，注射后4周和12周，通过ERG检测不同刺激强度下各组小鼠b波与a波的强度以及b/a的比值。结果(图7a)显示，病毒注射后4周，2周龄小鼠治疗后的ERG功能提高最为显著(1.2log cd s/m2刺激强度下的b波波幅均值±SEM：治疗组treated 201.6±17.37，对照组control 160.8±16.92，p＜0.05，n＝9)，与此同时b/a治疗组较对照组有明显的提高(1.2log cd s/m2刺激强度下的b/a均值±SEM：treated 2.86±0.12，control 1.64±0.04，p＜0.0001，n＝9)。8周龄小鼠治疗后4周ERG功能有一定提高，但与2周龄开始治疗相比效果较差，不同刺激强度下的b波波幅治疗组相较于对照组之间都没有统计学差异，但是b/a有所提高(1.2log cd s/m2刺激强度下的b/a均值±SEM：treated2.70±0.24，control 1.69±0.05，p＜0.05，n＝5)。ERG系列波形图(图7c和d)显示，2周龄及8周龄小鼠治疗组在病毒治疗后四周都检测到了波形的反转，在高刺激强度下，正向b波大于负向a波，2周龄组的波幅要大于8周龄组，对照组则呈现典型的负性波形。在治疗后12周ERG结果检测中(图7b)，2周龄及8周龄小鼠治疗组的治疗效果均出现了下降，虽然b/a与对照组间仍有差异，但是b波波幅与对照组间没有统计学差异且较治疗后4周发生了下降。以上结果表明广谱启动子的ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG在不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠中都难以维持长期稳定的治疗效果。
实施例6 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠ERG检测结果比较
分别在2周龄，8周龄的RS1-KO雄性小鼠的视网膜下腔注射1×1010GC/eye剂量的scAAV8.RK.cohRS1.bGH或PBS溶剂对照，注射后4周和12周，通过ERG检测不同刺激强度下各组小鼠b波与a波的强度以及b/a的比值。结果(图8a)显示，病毒注射后4周，2周龄组小鼠治疗后ERG功能有很明显的提高(1.2log cd s/m2刺激强度下的b波波幅均值±SEM：treated290.91±14.09，control 141.91±4.02，p＜0.0001，n＝9)，与此同时b/a治疗组较对照组有明显的提高(1.2log cd s/m2刺激强度下的b/a均值±SEM：treated 3.15±0.18，control 1.72±0.05，p＜0.0001，n＝9)。8周龄小鼠治疗后4周ERG功能也有明显的提高(1.2log cd s/m2刺激强度下的b波波幅均值±SEM：治疗组treated 161.82±12.61，对照组control 116.00±11.90，p＜0.0001，n＝9),b/a治疗组较对照组也有明显的提高(1.2log cd s/m2刺激强度下的b/a均值±SEM：treated 3.87±0.28，control 2.04±0.04，p＜0.0001，n＝9)。ERG系列波形图(图8c和d)显示，2周龄及8周龄小鼠治疗组在病毒治疗后四周都检测到了波形的反转，在高刺激强度下，正向b波大于负向a波，2周龄的治疗组小鼠的波形近似于WT波形，对照组则均呈现典型的负性波形。病毒注射后12周ERG检测结果(图8b)显示治疗效果可以稳定维持，2周龄和8周龄小鼠治疗组的b波在多个刺激强度下均较对照组都有统计学差异且波幅相较于治疗后4周时没有下降(2周龄组在1.2log cd s/m2刺激强度下的b波波幅均值±SEM：treated 317.00±29.34，control 132.00±36.63，p＜0.0001，n＝4；8周龄组在1.2log cd s/m2刺激强度下的b波波幅均值±SEM：treated183.08±31.88，control 107.12±8.12，p＜0.05，n＝5)，并且b/a也未有下降(2周龄组在1.2log cd s/m2刺激强度下的b/a均值±SEM：treated 4.06±0.25，control 1.57±0.16，p＜0.001，n＝4；8周龄组在1.2log cd s/m2刺激强度下的b/a均值±SEM：treated 3.73±0.46，control 1.79±0.08，p＜0.005，n＝5)。以上结果表明组织特异性的scAAV8.RK.cohRS1.bGH可以在不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠中均维持长期稳定的治疗效果，相比于广谱启动子的ssAAV8.CB7.cohRS1.rBG有更好的治疗效果以及临床应用前景。
实施例7 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠体内表达情况检测
实施例6中的2周龄和8周龄治疗组小鼠在注射后4周检测完ERG后，处死小鼠并取眼球进行免疫荧光检测视网膜层中RS1蛋白和GFAP蛋白的表达情况，以注射PBS的RS1-KO疾病模型小鼠眼球作为阴性对照，结果(图9)显示RS1基因在2周龄和8周龄组小鼠治疗眼中均高表达且分布在视网膜感光细胞层(RS1染色)，而对照组眼组织中无RS1蛋白表达且可见内核层和外核层的视网膜存在明显的裂隙腔。同时治疗后能明显改善Müller细胞受损的情况(GFAP染色)。
实施例8 scAAV8.RK.cohRS1.bGH治疗不同周龄的RS1-KO疾病模型小鼠视网膜组织形态恢复情况
实施例6中的2周龄和8周龄治疗组小鼠在注射后4周检测完ERG后，处死小鼠并取眼球进行HE染色检测视网膜的组织形态恢复情况。如图10所示，在2周龄注射组中，治疗组的视网膜结构与WT的组织形态接近，相比于对照组具有更厚的光感受器层(视网膜50μm长度内的感光细胞数量均值±SEM：treated 112.89±7.95，control 66.00±4.11，p＜0.0001，n＝9)，并且治疗组相较于对照组，内核层的裂隙腔更少。在相同时间点检测的8周龄注射组中，治疗后小鼠的视网膜组织也有类似的结构改善，感光细胞数量也有明显的增加(视网膜50μm长度内的感光细胞数量均值±SEM：treated 101.20±6.35，control 51.80±5.80，p＜0.0005，n＝5)。综合ERG的检测结果说明，scAAV8.RK.cohRS1.bGH对RS1-KO疾病模型小鼠进行治疗后，能明显改善小鼠眼睛的组织学形态，并且可以有效恢复小鼠的视网膜功能。
序列表
<110> 成都金唯科生物科技有限公司
<120> 一种高效组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒及应用
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 5775
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180
aggaagatcg gaattcgccc ttaagagggt aatggggatc ctctagaact atagctagtc 240
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 300
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 360
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 420
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 480
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 540
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 600
tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 660
cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 720
tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 780
gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 840
cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg 900
gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc 960
cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc1020
cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa1080
gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg1140
tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct1200
gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg1260
gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt1320
gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc1380
cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg1440
gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg1500
ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg1560
gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc1620
agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc1680
cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg1740
gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc1800
ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga1860
ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc1920
tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaatta ccggtgccac1980
catggtgagc aagggcgagg agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga2040
cggcgacgta aacggccaca agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta2100
cggcaagctg accctgaagt tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac2160
cctcgtgacc accctgacct acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa2220
gcagcacgac ttcttcaagt ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt2280
cttcaaggac gacggcaact acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct2340
ggtgaaccgc atcgagctga agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca2400
caagctggag tacaactaca acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa2460
cggcatcaag gtgaacttca agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc2520
cgaccactac cagcagaaca cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca2580
ctacctgagc acccagtccg ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt2640
cctgctggag ttcgtgaccg ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta2700
atgaacgcgt cctcgactgt gccttctagt tgccagccat ctgttgtttg cccctccccc2760
gtgccttcct tgaccctgga aggtgccact cccactgtcc tttcctaata aaatgaggaa2820
attgcatcgc attgtctgag taggtgtcat tctattctgg ggggtggggt ggggcaggac2880
agcaaggggg aggattggga agacaatagc aggcatgctg gggatgcggt gggctctatg2940
gcctcgagtt aagggcgaat tcccgataag gatcttccta gagcatggct acgtagataa3000
gtagcatggc gggttaatca ttaactacaa ggaaccccta gtgatggagt tggccactcc3060
ctctctgcgc gctcgctcgc tcactgaggc cgggcgacca aaggtcgccc gacgcccggg3120
ctttgcccgg gcggcctcag tgagcgagcg agcgcgcagc cttaattaac ctaattcact3180
ggccgtcgtt ttacaacgtc gtgactggga aaaccctggc gttacccaac ttaatcgcct3240
tgcagcacat ccccctttcg ccagctgcat taatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc3300
ggtttgcgta ttgggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt3360
cggctgcggc gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca3420
ggggataacg caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa3480
aaggccgcgt tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat3540
cgacgctcaa gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc3600
cctggaagct ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc3660
gcctttctcc cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt3720
tcggtgtagg tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac3780
cgctgcgcct tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg3840
ccactggcag cagccactgg taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca3900
gagttcttga agtggtggcc taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc3960
gctctgctga agccagttac cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa4020
accaccgctg gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa4080
ggatctcaag aagatccttt gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac4140
tcacgttaag ggattttggt catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta4200
aattaaaaat gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacagt4260
tagaaaaact catcgagcat caaatgaaac tgcaatttat tcatatcagg attatcaata4320
ccatattttt gaaaaagccg tttctgtaat gaaggagaaa actcaccgag gcagttccat4380
aggatggcaa gatcctggta tcggtctgcg attccgactc gtccaacatc aatacaacct4440
attaatttcc cctcgtcaaa aataaggtta tcaagtgaga aatcaccatg agtgacgact4500
gaatccggtg agaatggcaa aagtttatgc atttctttcc agacttgttc aacaggccag4560
ccattacgct cgtcatcaaa atcactcgca tcaaccaaac cgttattcat tcgtgattgc4620
gcctgagcga gacgaaatac gcgatcgctg ttaaaaggac aattacaaac aggaatcgaa4680
tgcaaccggc gcaggaacac tgccagcgca tcaacaatat tttcacctga atcaggatat4740
tcttctaata cctggaatgc tgttttccca gggatcgcag tggtgagtaa ccatgcatca4800
tcaggagtac ggataaaatg cttgatggtc ggaagaggca taaattccgt cagccagttt4860
agtctgacca tctcatctgt aacatcattg gcaacgctac ctttgccatg tttcagaaac4920
aactctggcg catcgggctt cccatacaat cgatagattg tcgcacctga ttgcccgaca4980
ttatcgcgag cccatttata cccatataaa tcagcatcca tgttggaatt taatcgcggc5040
ctagagcaag acgtttcccg ttgaatatgg ctcatactct tcctttttca atattattga5100
agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat5160
aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc5220
attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg5280
cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct5340
tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc5400
gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat5460
atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg5520
ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc5580
cagctggcac gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt5640
gagttagctc actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg ctcgtatgtt5700
gtgtggaatt gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc5760
cagatttaat taagg 5775
<210> 2
<211> 4438
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120
aagatcggaa ttcgccctta agggccccag aagcctggtg gttgtttgtc cttctcaggg 180
gaaaagtgag gcggcccctt ggaggaaggg gccgggcaga atgatctaat cggattccaa 240
gcagctcagg ggattgtctt tttctagcac cttcttgcca ctcctaagcg tcctccgtga 300
ccccggctgg gatttagcct ggtgctgtgt cagccccggt ctcccagggg cttcccagtg 360
gtccccagga accctcgaca gggcccggtc tctctcgtcc agcaagggca gggacgggcc 420
acaggccaag ggcggtactc tagaggatcc ggtactcgag gaactgaaaa accagaaagt 480
taactggtaa gtttagtctt tttgtctttt atttcaggtc ccggatccgg tggtggtgca 540
aatcaaagaa ctgctcctca gtggatgttg cctttacttc taggcctgta cggaagtgtt 600
acttctgctc taaaagctgc ggaattgtac ccgcggccgc caccatggtg agcaagggcg 660
aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac gtaaacggcc 720
acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag ctgaccctga 780
agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg accaccctga 840
cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac gacttcttca 900
agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag gacgacggca 960
actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac cgcatcgagc1020
tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg gagtacaact1080
acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc aaggtgaact1140
tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac taccagcaga1200
acacccccat cggcgacggc cccgtgctgc tgcccgacaa ccactacctg agcacccagt1260
ccgccctgag caaagacccc aacgagaagc gcgatcacat ggtcctgctg gagttcgtga1320
ccgccgccgg gatcactctc ggcatggacg agctgtacaa gtaatgaacg cgtcctcgac1380
tgtgccttct agttgccagc catctgttgt ttgcccctcc cccgtgcctt ccttgaccct1440
ggaaggtgcc actcccactg tcctttccta ataaaatgag gaaattgcat cgcattgtct1500
gagtaggtgt cattctattc tggggggtgg ggtggggcag gacagcaagg gggaggattg1560
ggaagacaat agcaggcatg ctggggatgc ggtgggctct atggcctcga gttaagggcg1620
aattcccgat aaggatcttc ctagagcatg gctacgtaga taagtagcat ggcgggttaa1680
tcattaacta caaggaaccc ctagtgatgg agttggccac tccctctctg cgcgctcgct1740
cgctcactga ggccgggcga ccaaaggtcg cccgacgccc gggctttgcc cgggcggcct1800
cagtgagcga gcgagcgcgc agccttaatt aacctaattc actggccgtc gttttacaac1860
gtcgtgactg ggaaaaccct ggcgttaccc aacttaatcg ccttgcagca catccccctt1920
tcgccagctg cattaatgaa tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg1980
ctcttccgct tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt2040
atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa2100
gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc2160
gtttttccat aggctccgcc cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag2220
gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt2280
gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg2340
aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg2400
ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg2460
taactatcgt cttgagtcca acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac2520
tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg2580
gcctaactac ggctacacta gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt2640
taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg2700
tggttttttt gtttgcaagc agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc2760
tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt2820
ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt2880
taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac ttggtctgac agttagaaaa actcatcgag2940
catcaaatga aactgcaatt tattcatatc aggattatca ataccatatt tttgaaaaag3000
ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc gaggcagttc cataggatgg caagatcctg3060
gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc3120
aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg3180
caaaagttta tgcatttctt tccagacttg ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc3240
aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa3300
tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa3360
cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc tgaatcagga tattcttcta atacctggaa3420
tgctgttttc ccagggatcg cagtggtgag taaccatgca tcatcaggag tacggataaa3480
atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc3540
tgtaacatca ttggcaacgc tacctttgcc atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg3600
cttcccatac aatcgataga ttgtcgcacc tgattgcccg acattatcgc gagcccattt3660
atacccatat aaatcagcat ccatgttgga atttaatcgc ggcctagagc aagacgtttc3720
ccgttgaata tggctcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta3780
ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc3840
gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt3900
aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg3960
tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc4020
cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct4080
taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgcggt gtgaaatacc4140
gcacagatgc gtaaggagaa aataccgcat caggcgccat tcgccattca ggctgcgcaa4200
ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta cgccagctgg cacgacaggt4260
ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa tgtgagttag ctcactcatt4320
aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg4380
gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta cgccagattt aattaagg 4438
<210> 3
<211> 8778
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtggccaa ctccatcact 120
aggggttcct tgtagttaat gattaacccg ccatgctact tatctacgta gccatgctct 180
aggaagatcg gaattcgccc ttaagagggt aatggggatc ctctagaact atagctagtc 240
gacattgatt attgactagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc 300
catatatgga gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca 360
acgacccccg cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga 420
ctttccattg acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc 480
aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct 540
ggcattatgc ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat 600
tagtcatcgc tattaccatg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 660
cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 720
tgggggcggg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg 780
gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc 840
cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg 900
gagtcgctgc gcgctgcctt cgccccgtgc cccgctccgc cgccgcctcg cgccgcccgc 960
cccggctctg actgaccgcg ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc1020
cgggctgtaa ttagcgcttg gtttaatgac ggcttgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa1080
gccttgaggg gctccgggag ggccctttgt gcggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg1140
tgtgtgtgtg cgtggggagc gccgcgtgcg gctccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct1200
gcgggcgcgg cgcggggctt tgtgcgctcc gcagtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg1260
gcggtgcccc gcggtgcggg gggggctgcg aggggaacaa aggctgcgtg cggggtgtgt1320
gcgtgggggg gtgagcaggg ggtgtgggcg cgtcggtcgg gctgcaaccc cccctgcacc1380
cccctccccg agttgctgag cacggcccgg cttcgggtgc ggggctccgt acggggcgtg1440
gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg1500
ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg aggggcgcgg cggcccccgg agcgccggcg1560
gctgtcgagg cgcggcgagc cgcagccatt gccttttatg gtaatcgtgc gagagggcgc1620
agggacttcc tttgtcccaa atctgtgcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc1680
cctctagcgg gcgcggggcg aagcggtgcg gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg1740
gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc ttctccctct ccagcctcgg ggctgtccgc1800
ggggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga1860
ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc1920
tgggcaacgt gctggttatt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattc accggtgcca1980
ccatgagcag aaagatcgag ggcttcctgc tgctgctcct gttcggctat gaagccacac2040
tgggcctgag cagcacagag gatgaaggcg aggacccctg gtatcagaaa gcctgcaagt2100
gcgactgtca aggcggccct aatgctcttt ggagcgctgg cgctacaagc ctggattgca2160
tccctgagtg cccctaccac aagcctctgg gctttgagag cggcgaagtg acccctgacc2220
agatcacctg tagcaacccc gagcagtacg tcggctggta ctctagctgg acagccaaca2280
aggcccggct gaactctcaa ggctttggct gtgcctggct gagcaagttc caggactcta2340
gccagtggct gcagatcgac ctgaaagaga tcaaagtcat cagcggcatc ctgacacagg2400
gcagatgcga catcgacgag tggatgacca agtacagcgt gcagtaccgg accgacgaga2460
gactgaactg gatctactac aaggaccaga ccggcaacaa ccgggtgttc tacggcaaca2520
gcgacagaac cagcaccgtg cagaatctgc tgcggcctcc tatcatcagc cggtttatca2580
gactgatccc tctcggctgg cacgtgcgga tcgccatcag aatggaactg ctggaatgcg2640
tgtccaagtg cgcctaccca tacgatgttc cagattacgc tagcggcttc gccaacgagc2700
ttggacccag gttgatggga aagtgataaa cgcgtatcga taatcaacct ctggattaca2760
aaatttgtga aagattgact ggtattctta actatgttgc tccttttacg ctatgtggat2820
acgctgcttt aatgcctttg tatcatgcta ttgcttcccg tatggctttc attttctcct2880
ccttgtataa atcctggttg ctgtctcttt atgaggagtt gtggcccgtt gtcaggcaac2940
gtggcgtggt gtgcactgtg tttgctgacg caacccccac tggttggggc attgccacca3000
cctgtcagct cctttccggg actttcgctt tccccctccc tattgccacg gcggaactca3060
tcgccgcctg ccttgcccgc tgctggacag gggctcggct gttgggcact gacaattccg3120
tggtgttgtc ggggaaatca tcgtcctttc cttggctgct cgcctgtgtt gccacctgga3180
ttctgcgcgg gacgtccttc tgctacgtcc cttcggccct caatccagcg gaccttcctt3240
cccgcggcct gctgccggct ctgcggcctc ttccgcgtct tcgccttcgc cctcagacga3300
gtcggatctc cctttgggcc gcctccccgc atcgataccc tcgaggacgg ggtgaactac3360
gcctgaggat ccgatctttt tccctctgcc aaaaattatg gggacatcat gaagcccctt3420
gagcatctga cttctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat3480
tttttgtgtc tctcactcgg aagttaaggg cgaattcccg ataaggatct tcctagagca3540
tggctacgta gataagtagc atggcgggtt aatcattaac tacaaggaac ccctagtgat3600
ggagttggcc actccctctc tgcgcgctcg ctcgctcact gaggccgggc gaccaaaggt3660
cgcccgacgc ccgggctttg cccgggcggc ctcagtgagc gagcgagcgc gcagccttaa3720
ttaacctaat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc ctggcgttac3780
ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tgcattaatg aatcggccaa3840
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg3900
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg3960
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag4020
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac4080
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga4140
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt4200
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc4260
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc4320
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta4380
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat4440
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca4500
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct4560
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt4620
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct4680
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc4740
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa4800
acttggtctg acagttagaa aaactcatcg agcatcaaat gaaactgcaa tttattcata4860
tcaggattat caataccata tttttgaaaa agccgtttct gtaatgaagg agaaaactca4920
ccgaggcagt tccataggat ggcaagatcc tggtatcggt ctgcgattcc gactcgtcca4980
acatcaatac aacctattaa tttcccctcg tcaaaaataa ggttatcaag tgagaaatca5040
ccatgagtga cgactgaatc cggtgagaat ggcaaaagtt tatgcatttc tttccagact5100
tgttcaacag gccagccatt acgctcgtca tcaaaatcac tcgcatcaac caaaccgtta5160
ttcattcgtg attgcgcctg agcgagacga aatacgcgat cgctgttaaa aggacaatta5220
caaacaggaa tcgaatgcaa ccggcgcagg aacactgcca gcgcatcaac aatattttca5280
cctgaatcag gatattcttc taatacctgg aatgctgttt tcccagggat cgcagtggtg5340
agtaaccatg catcatcagg agtacggata aaatgcttga tggtcggaag aggcataaat5400
tccgtcagcc agtttagtct gaccatctca tctgtaacat cattggcaac gctacctttg5460
ccatgtttca gaaacaactc tggcgcatcg ggcttcccat acaatcgata gattgtcgca5520
cctgattgcc cgacattatc gcgagcccat ttatacccat ataaatcagc atccatgttg5580
gaatttaatc gcggcctaga gcaagacgtt tcccgttgaa tatggctcat actcttcctt5640
tttcaatatt attgaagcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa5700
tgtatttaga aaaataaaca aataggggtt ccgcgcacat ttccccgaaa agtgccacct5760
gacgtctaag aaaccattat tatcatgaca ttaacctata aaaataggcg tatcacgagg5820
ccctttcgtc tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg5880
gagacggtca cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg5940
tcagcgggtg ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta6000
ctgagagtgc accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc6060
atcaggcgcc aaccaagata gcactcgaac gacgaagtaa agaacgcgaa aaagcggaaa6120
aagcagcaga gaagaaacga cgacgagagg agcagaaaca gaaagataaa cttaagattc6180
gaaaactcgc cttaaagccc cgcagttact ggattaaaca agcccaacaa gccgtaaacg6240
ccttcatcag agaaagagac cgcgacttac catgtatctc gtgcggaacg ctcacgtctg6300
ctcagtggga tgccggacat taccggacaa ctgctgcggc acctcaactc cgatttaatg6360
aacgcaatat tcacaagcaa tgcgtggtgt gcaaccagca caaaagcgga aatctcgttc6420
cgtatcgcgt cgaactgatt agccgcatcg ggcaggaagc agtagacgaa atcgaatcaa6480
accataaccg ccatcgctgg actatcgaag agtgcaaggc gatcaaggca gagtaccaac6540
agaaactcaa agacctgcga aatagcagaa gtgaggccgc atgacgttct cagtaaaaac6600
cattccagac atgctcgttg aaacatacgg aaatcagaca gaagtagcac gcagactgaa6660
atgtagtcgc ggtacggtca gaaaatacgt tgatgataaa gacgggaaaa tgcacgccat6720
cgtcaacgac gttctcatgg ttcatcgcgg atggagtgaa agagatgcgc tattacgaaa6780
aaattgatgg cagcaaatac cgaaatattt gggtagttgg cgatctgcac ggatgctaca6840
cgaacctgat gaacaaactg gatacgattg gattcgacaa caaaaaagac ctgcttatct6900
cggtgggcga tttggttgat cgtggtgcag agaacgttga atgcctggaa ttaatcacat6960
tcccctggtt cagagctgta cgtggaaacc atgagcaaat gatgattgat ggcttatcag7020
agcgtggaaa cgttaatcac tggctgctta atggcggtgg ctggttcttt aatctcgatt7080
acgacaaaga aattctggct aaagctcttg cccataaagc agatgaactt ccgttaatca7140
tcgaactggt gagcaaagat aaaaaatatg ttatctgcca cgccgattat ccctttgacg7200
aatacgagtt tggaaagcca gttgatcatc agcaggtaat ctggaaccgc gaacgaatca7260
gcaactcaca aaacgggatc gtgaaagaaa tcaaaggcgc ggacacgttc atctttggtc7320
atacgccagc agtgaaacca ctcaagtttg ccaaccaaat gtatatcgat accggcgcag7380
tgttctgcgg aaacctaaca ttgattcagg tacagggaga aggcgcatga gactcgaaag7440
cgtagctaaa tttcattcgc caaaaagccc gatgatgagc gactcaccac gggccacggc7500
ttctgactct ctttccggta ctgatgtgat ggctgctatg gggatggcgc aatcacaagc7560
cggattcggt atggctgcat tctgcggtaa gcacgaactc agccagaacg acaaacaaaa7620
ggctatcaac tatctgatgc aatttgcaca caaggtatcg gggaaatacc gtggtgtggc7680
aaagcttgaa ggaaatacta aggcaaaggt actgcaagtg ctcgcaacat tcgcttatgc7740
ggattattgc cgtagtgccg cgacgccggg ggcaagatgc agagattgcc atggtacagg7800
ccgtgcggtt gatattgcca aaacagagct gtgggggaga gttgtcgaga aagagtgcgg7860
aagatgcaaa ggcgtcggct attcaaggat gccagcaagc gcagcatatc gcgctgtgac7920
gatgctaatc ccaaacctta cccaacccac ctggtcacgc actgttaagc cgctgtatga7980
cgctctggtg gtgcaatgcc acaaagaaga gtcaatcgca gacaacattt tgaatgcggt8040
cacacgttag cagcatgatt gccacggatg gcaacatatt aacggcatga tattgactta8100
ttgaataaaa ttgggtaaat ttgactcaac gatgggttaa ttcgctcgtt gtggtagtga8160
gatgaaaaga ggcggcgctt actaccgatt ccgcctagtt ggtcacttcg acgtatcgtc8220
tggaactcca accatcgcag gcagagaggt ctgcaaaatg caatcccgaa acagttcgca8280
ggtaatagtt agagcctgca taacggtttc gggatttttt atatctgcac aacaggtaag8340
agcattgagt cgataatcgt gaagagtcgg cgagcctggt tagccagtgc tctttccgtt8400
gtgctgaatt aagcgaatac cggaagcaga accggatcac caaatgcgta caggcgtcat8460
cgccgcccag caacagcaca acccaaactg agccgtagcc actgtctgtc ctggcgccat8520
tcgccattca ggctgcgcaa ctgttgggaa gggcgatcgg tgcgggcctc ttcgctatta8580
cgccagctgg cacgacaggt ttcccgactg gaaagcgggc agtgagcgca acgcaattaa8640
tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc cggctcgtat8700
gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg accatgatta8760
cgccagattt aattaagg 8778
<210> 4
<211> 4393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcaaagc ccgggcgtcg ggcgaccttt 60
ggtcgcccgg cctcagtgag cgagcgagcg cgcagagagg gagtgtagcc atgctctagg 120
aagatcggaa ttcgccctta agggccccag aagcctggtg gttgtttgtc cttctcaggg 180
gaaaagtgag gcggcccctt ggaggaaggg gccgggcaga atgatctaat cggattccaa 240
gcagctcagg ggattgtctt tttctagcac cttcttgcca ctcctaagcg tcctccgtga 300
ccccggctgg gatttagcct ggtgctgtgt cagccccggt ctcccagggg cttcccagtg 360
gtccccagga accctcgaca gggcccggtc tctctcgtcc agcaagggca gggacgggcc 420
acaggccaag ggcggtactc tagaggatcc ggtactcgag gaactgaaaa accagaaagt 480
taactggtaa gtttagtctt tttgtctttt atttcaggtc ccggatccgg tggtggtgca 540
aatcaaagaa ctgctcctca gtggatgttg cctttacttc taggcctgta cggaagtgtt 600
acttctgctc taaaagctgc ggaattgtac ccgcggccgc caccatgagc agaaagatcg 660
agggcttcct gctgctgctc ctgttcggct atgaagccac actgggcctg agcagcacag 720
aggatgaagg cgaggacccc tggtatcaga aagcctgcaa gtgcgactgt caaggcggcc 780
ctaatgctct ttggagcgct ggcgctacaa gcctggattg catccctgag tgcccctacc 840
acaagcctct gggctttgag agcggcgaag tgacccctga ccagatcacc tgtagcaacc 900
ccgagcagta cgtcggctgg tactctagct ggacagccaa caaggcccgg ctgaactctc 960
aaggctttgg ctgtgcctgg ctgagcaagt tccaggactc tagccagtgg ctgcagatcg1020
acctgaaaga gatcaaagtc atcagcggca tcctgacaca gggcagatgc gacatcgacg1080
agtggatgac caagtacagc gtgcagtacc ggaccgacga gagactgaac tggatctact1140
acaaggacca gaccggcaac aaccgggtgt tctacggcaa cagcgacaga accagcaccg1200
tgcagaatct gctgcggcct cctatcatca gccggtttat cagactgatc cctctcggct1260
ggcacgtgcg gatcgccatc agaatggaac tgctggaatg cgtgtccaag tgcgcctaat1320
gaacgcgtcc tcgactgtgc cttctagttg ccagccatct gttgtttgcc cctcccccgt1380
gccttccttg accctggaag gtgccactcc cactgtcctt tcctaataaa atgaggaaat1440
tgcatcgcat tgtctgagta ggtgtcattc tattctgggg ggtggggtgg ggcaggacag1500
caagggggag gattgggaag acaatagcag gcatgctggg gatgcggtgg gctctatggc1560
ctcgagttaa gggcgaattc ccgataagga tcttcctaga gcatggctac gtagataagt1620
agcatggcgg gttaatcatt aactacaagg aacccctagt gatggagttg gccactccct1680
ctctgcgcgc tcgctcgctc actgaggccg ggcgaccaaa ggtcgcccga cgcccgggct1740
ttgcccgggc ggcctcagtg agcgagcgag cgcgcagcct taattaacct aattcactgg1800
ccgtcgtttt acaacgtcgt gactgggaaa accctggcgt tacccaactt aatcgccttg1860
cagcacatcc ccctttcgcc agctgcatta atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg1920
tttgcgtatt gggcgctctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg1980
gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg2040
ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa2100
ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg2160
acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg cgtttccccc2220
tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc2280
ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc2340
ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg2400
ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc2460
actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga2520
gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc2580
tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac2640
caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg2700
atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc2760
acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa2820
ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt ctgacagtta2880
gaaaaactca tcgagcatca aatgaaactg caatttattc atatcaggat tatcaatacc2940
atatttttga aaaagccgtt tctgtaatga aggagaaaac tcaccgaggc agttccatag3000
gatggcaaga tcctggtatc ggtctgcgat tccgactcgt ccaacatcaa tacaacctat3060
taatttcccc tcgtcaaaaa taaggttatc aagtgagaaa tcaccatgag tgacgactga3120
atccggtgag aatggcaaaa gtttatgcat ttctttccag acttgttcaa caggccagcc3180
attacgctcg tcatcaaaat cactcgcatc aaccaaaccg ttattcattc gtgattgcgc3240
ctgagcgaga cgaaatacgc gatcgctgtt aaaaggacaa ttacaaacag gaatcgaatg3300
caaccggcgc aggaacactg ccagcgcatc aacaatattt tcacctgaat caggatattc3360
ttctaatacc tggaatgctg ttttcccagg gatcgcagtg gtgagtaacc atgcatcatc3420
aggagtacgg ataaaatgct tgatggtcgg aagaggcata aattccgtca gccagtttag3480
tctgaccatc tcatctgtaa catcattggc aacgctacct ttgccatgtt tcagaaacaa3540
ctctggcgca tcgggcttcc catacaatcg atagattgtc gcacctgatt gcccgacatt3600
atcgcgagcc catttatacc catataaatc agcatccatg ttggaattta atcgcggcct3660
agagcaagac gtttcccgtt gaatatggct catactcttc ctttttcaat attattgaag3720
catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt agaaaaataa3780
acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca cctgacgtct aagaaaccat3840
tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg aggccctttc gtctcgcgcg3900
tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg3960
tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg4020
gtgtcggggc tggcttaact atgcggcatc agagcagatt gtactgagag tgcaccatat4080
gcggtgtgaa ataccgcaca gatgcgtaag gagaaaatac cgcatcaggc gccattcgcc4140
attcaggctg cgcaactgtt gggaagggcg atcggtgcgg gcctcttcgc tattacgcca4200
gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga gcgcaacgca attaatgtga4260
gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat gcttccggct cgtatgttgt4320
gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag ctatgaccat gattacgcca4380
gatttaatta agg 4393
<210> 5
<211> 1417
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ggccccagaa gcctggtggt tgtttgtcct tctcagggga aaagtgaggc ggccccttgg 60
aggaaggggc cgggcagaat gatctaatcg gattccaagc agctcagggg attgtctttt 120
tctagcacct tcttgccact cctaagcgtc ctccgtgacc ccggctggga tttagcctgg 180
tgctgtgtca gccccggtct cccaggggct tcccagtggt ccccaggaac cctcgacagg 240
gcccggtctc tctcgtccag caagggcagg gacgggccac aggccaaggg cggtactcta 300
gaggatccgg tactcgagga actgaaaaac cagaaagtta actggtaagt ttagtctttt 360
tgtcttttat ttcaggtccc ggatccggtg gtggtgcaaa tcaaagaact gctcctcagt 420
ggatgttgcc tttacttcta ggcctgtacg gaagtgttac ttctgctcta aaagctgcgg 480
aattgtaccc gcggccgcca ccatgagcag aaagatcgag ggcttcctgc tgctgctcct 540
gttcggctat gaagccacac tgggcctgag cagcacagag gatgaaggcg aggacccctg 600
gtatcagaaa gcctgcaagt gcgactgtca aggcggccct aatgctcttt ggagcgctgg 660
cgctacaagc ctggattgca tccctgagtg cccctaccac aagcctctgg gctttgagag 720
cggcgaagtg acccctgacc agatcacctg tagcaacccc gagcagtacg tcggctggta 780
ctctagctgg acagccaaca aggcccggct gaactctcaa ggctttggct gtgcctggct 840
gagcaagttc caggactcta gccagtggct gcagatcgac ctgaaagaga tcaaagtcat 900
cagcggcatc ctgacacagg gcagatgcga catcgacgag tggatgacca agtacagcgt 960
gcagtaccgg accgacgaga gactgaactg gatctactac aaggaccaga ccggcaacaa1020
ccgggtgttc tacggcaaca gcgacagaac cagcaccgtg cagaatctgc tgcggcctcc1080
tatcatcagc cggtttatca gactgatccc tctcggctgg cacgtgcgga tcgccatcag1140
aatggaactg ctggaatgcg tgtccaagtg cgcctaatga acgcgtcctc gactgtgcct1200
tctagttgcc agccatctgt tgtttgcccc tcccccgtgc cttccttgac cctggaaggt1260
gccactccca ctgtcctttc ctaataaaat gaggaaattg catcgcattg tctgagtagg1320
tgtcattcta ttctgggggg tggggtgggg caggacagca agggggagga ttgggaagac1380
aatagcaggc atgctgggga tgcggtgggc tctatgg 1417

Claims (6)

1.一种载体，其特征在于，所述载体含有RS1蛋白表达框,所述的RS1蛋白表达框的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述载体为scAAV腺相关病毒载体。
2. 根据权利要求1所述的载体，其特征在于，所述的载体全序列如SEQ ID NO. 4所示。
3.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求1-2中任一项所述的载体，或其染色体中整合有外源的权利要求1中所述的RS1蛋白表达框。
4.一种组织特异性表达RS1蛋白的重组腺相关病毒，其特征在于是采用转染试剂将AAV的Rep及Cap蛋白表达质粒、辅助质粒和权利要求1-2中任一项所述的载体共转染HEK293细胞包装制备得到。
5.权利要求1-2中任一项所述的载体、权利要求3所述的宿主细胞、权利要求4所述的重组腺相关病毒在制备用于治疗X连锁的青少年视网膜劈裂症的药物中的应用。
6.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有权利要求1-2中任一项所述的载体或权利要求4所述的重组腺相关病毒，以及药学上可接受的载体或赋形剂。
CN202110514036.1A 2021-05-12 2021-05-12 一种高效组织特异性表达rs1蛋白的重组腺相关病毒及应用 Active CN113322281B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110514036.1A CN113322281B (zh) 2021-05-12 2021-05-12 一种高效组织特异性表达rs1蛋白的重组腺相关病毒及应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110514036.1A CN113322281B (zh) 2021-05-12 2021-05-12 一种高效组织特异性表达rs1蛋白的重组腺相关病毒及应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113322281A CN113322281A (zh) 2021-08-31
CN113322281B true CN113322281B (zh) 2024-01-05

Family

ID=77415398

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110514036.1A Active CN113322281B (zh) 2021-05-12 2021-05-12 一种高效组织特异性表达rs1蛋白的重组腺相关病毒及应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113322281B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114848850B (zh) * 2022-04-28 2023-12-15 武汉中眸生物科技有限责任公司 Rs1基因在制备xlrs治疗剂中的应用及治疗剂
CN116254298B (zh) * 2022-09-28 2023-10-13 云舟生物科技(广州)股份有限公司 一种慢病毒包装试剂盒
CN115968834A (zh) * 2023-01-20 2023-04-18 北京因诺惟康医药科技有限公司 一种rs1点突变小鼠模型的制备方法及其用途

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019113225A1 (en) * 2017-12-05 2019-06-13 University Of Washington Compositions and methods for enhancing functional expression of therapeutic genes in photoreceptors
CN110423281A (zh) * 2019-07-31 2019-11-08 成都金唯科生物科技有限公司 用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白、病毒载体和药物
CN111621502A (zh) * 2019-02-28 2020-09-04 武汉纽福斯生物科技有限公司 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用
CA3145112A1 (en) * 2019-07-26 2021-02-04 Chunping Qiao Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof
CN115074369A (zh) * 2022-06-24 2022-09-20 成都金唯科生物科技有限公司 表达全长abca4基因的腺相关病毒载体及应用

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10266845B2 (en) * 2013-02-08 2019-04-23 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Enhanced AAV-mediated gene transfer for retinal therapies
AU2014216160B2 (en) * 2013-02-15 2017-03-30 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services AAV8 retinoschisin expression vector for treating X-linked retinoschisis
EP3638316A4 (en) * 2017-06-14 2021-03-24 The Trustees Of The University Of Pennsylvania GENE THERAPY FOR EYE DISORDERS
WO2020222858A1 (en) * 2019-04-27 2020-11-05 Ocugen, Inc. Adeno-associated virus vector mediated gene therapy for ophthalmic diseases

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019113225A1 (en) * 2017-12-05 2019-06-13 University Of Washington Compositions and methods for enhancing functional expression of therapeutic genes in photoreceptors
CN111621502A (zh) * 2019-02-28 2020-09-04 武汉纽福斯生物科技有限公司 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用
CA3145112A1 (en) * 2019-07-26 2021-02-04 Chunping Qiao Engineered nucleic acid regulatory element and methods of uses thereof
CN110423281A (zh) * 2019-07-31 2019-11-08 成都金唯科生物科技有限公司 用于治疗老年性黄斑变性的融合蛋白、病毒载体和药物
CN115074369A (zh) * 2022-06-24 2022-09-20 成都金唯科生物科技有限公司 表达全长abca4基因的腺相关病毒载体及应用

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAV cis-regulatory sequences are correlated with ocular toxicity;Proc Natl Acad Sci USA;第116卷(第12期);摘要，第5876页右栏第1段 *
Retinal AAV8-RS1 Gene Therapy for X-Linked Retinoschisis: Initial Findings from a Phase I/IIa Trial by Intravitreal Delivery;Cukras C等;《Mol Ther》;20180707;第26卷(第9期);2282-2294 *
Retinal AAV8-RS1 Gene Therapy for X-Linked Retinoschisis: Initial Findings from a Phase I/IIa Trial by Intravitreal Delivery;Cukras C等;Mol Ther;第26卷(第9期);摘要 *
Retinoschisin gene therapy in photoreceptors, Müller glia or all retinal cells in the Rs1h-/- mouse;Byrne LC等;《Gene Ther》;20140403;第21卷(第6期);摘要，第3页第1段，第2页第4段，第7页第4段 *
X连锁视网膜劈裂症分子遗传学研究与基因治疗的现状及进展;张阳阳等;《中华眼底病杂志》;20161231;第32卷(第6期);657-660 *
关注遗传性视网膜疾病的治疗性方法;庞继景;《中华实验眼科杂志》;20191016;第37卷;689-693 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN113322281A (zh) 2021-08-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
AU2020260491B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
AU2023214366B2 (en) Gene therapies for lysosomal disorders
CN113322281B (zh) 一种高效组织特异性表达rs1蛋白的重组腺相关病毒及应用
RU2758489C2 (ru) Композиции и способы для экспрессии нескольких биологически активных полипептидов с одного вектора для лечения заболеваний сердца и других патологий
AU2021200988A1 (en) Gene therapy for retinitis pigmentosa
AU2015263150B2 (en) Lentiviral vectors
CA2462455C (en) Development of a preventive vaccine for filovirus infection in primates
KR20150014505A (ko) 아과 e 원숭이 아데노바이러스 a1302, a1320, a1331 및 a1337 및 이것들의 사용
CN111164211A (zh) 用于治疗β-血红蛋白病的组合物和方法
KR20220007155A (ko) 코로나바이러스 스파이크 단백질의 변형된 s1 서브유닛
KR20210150486A (ko) 리소좀 장애에 대한 유전자 요법
WO2021050948A1 (en) Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
KR20230066360A (ko) 신경퇴행성 장애를 위한 유전자 요법
KR20230054840A (ko) rAAV 비리온의 유도 생산을 위한 안정화된 세포주
KR20150021839A (ko) 암특이적 유전자를 표적하는 트랜스-스플라이싱 라이보자임의 조절 유도체를 포함하는 재조합 아데노바이러스 및 이의 용도
KR20210150487A (ko) 리소좀 장애를 위한 유전자 요법
TW202309287A (zh) 調節基因表現之組合物及方法
KR20230160829A (ko) 재조합 aav 벡터의 제조 및 사용
Carlson Microscopic studies in nascent frustule formation from protoplasts of the marine pennate apochlorotic diatom Nitzschia alba and production of novel transformation vectors for studies in N. alba and the marine centric photoautotrophic diatom Thalassiosira pseudonana

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant