CN111621502A - 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用。具体地，本发明对RS1基因编码序列进行了针对性特殊优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞(如感光细胞、双极细胞、视神经细胞)中高效表达RS1蛋白的核苷酸序列，并构建了一种表达正常人源RS1蛋白的重组AAV病毒。相对于未优化的编码序列，经过特殊优化后的RS1编码序列(SEQ ID NO.:1)的表达量显著提高，非常适合在哺乳动物(尤其是人)细胞内表达，能有效治疗X连锁视网膜劈裂症。

Description

视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用

技术领域

本发明涉及生物制剂领域，尤其涉及视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用。

背景技术

X连锁视网膜劈裂症(X-Linked juvenile Retinoschisis,XLRS)是一种罕见的遗传性致盲性眼病，发病率约为1:5000～1:25000。XLRS主要累及双侧视网膜,在视网膜神经纤维层和神经节细胞层之间出现劈裂腔。此病发生于男性,女性作为携带者无特征性临床表现。XLRS是引起男性青少年黄斑变性的最主要原因。目前对XLRS的各种治疗方法均无满意的效果，患者的最终结局多为视力丧失。

目前认为RS1基因突变是导致视网膜劈裂症的主要基因。与大量的致病突变不同，XLRS基因只有5种良性DNA多态性，这也反映了环状区域的高度保守性。XLRS1基因突变导致所表达蛋白产物的分泌障碍和黏附功能丧失、细胞与细胞间信息传递障碍和视网膜层间黏附作用减弱而在内层视网膜形成劈裂腔。目前对XLRS的各种治疗方法均无满意的效果,患者的最终结局多为视力丧失。

因此，本领域亟需开发一种能够有效治疗视网膜劈裂症的基因治疗方法和治疗药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种能够有效治疗视网膜劈裂症的基因治疗方法和治疗药物。

本发明的另一目的是提供一种编码视网膜劈裂蛋白的编码序列、载体及制备方法。

本发明的第一方面，提供了一种核苷酸序列，所述核苷酸序列编码视网膜劈裂蛋白，且所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％；

(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或

(d)上述(a)-(c)中所述的核苷酸序列的任意组合。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括DNA序列、cDNA序列、或mRNA序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括单链序列和双链序列。

在另一优选例中，所述核苷酸序列包括与SEQ ID NO.:1完全互补的核苷酸序列。

本发明的第二方面，提供了一种融合核酸，所述融合核酸包含如本发明第一方面所述的编码视网膜劈裂蛋白的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述融合核酸还包含UTR序列。

在另一优选例中，所述UTR序列包括3’UTR和/或5’UTR。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’端-3’端具有式I结构：

Z0-Z1-Z2 (I)

式中，

各“-”独立地为键或核苷酸连接序列；

Z0为无、或5’UTR序列；

Z1为如本发明第一方面所述的核苷酸序列；和

Z2为无、或3’UTR序列。

在另一优选例中，所述融合核酸从5’-3’端的结构为5’UTR-RS1-3’UTR。

在另一优选例中，各个核苷酸连接序列的长度为1-30nt，较佳地1-15nt，更佳地3-6nt。

在另一优选例中，所述的核苷酸连接序列来源于限制性内切酶酶切形成的核苷酸接头序列。

本发明的第三方面，提供了一种载体，所述载体含有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述载体包含一个或多个启动子，所述启动子可操作地与所述核酸序列、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、选择性标记、核酸限制性位点、和/或同源重组位点连接。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：质粒、病毒载体。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体(AAV)、或其组合。

在另一优选例中，所述载体为病毒颗粒的形式。

在另一优选例中，所述载体为腺相关病毒AAV载体。

在另一优选例中，所述AAV载体的血清型选自：AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRh10、或其组合。较佳地，所述AAV载体的血清型为AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、或AAVRh10；更佳地，所述AAV载体的血清型为AAV8、AAV9、或AAVRh10。

在另一优选例中，所述载体为AAV8载体、AAV9载体、或AAVRh10载体。

在另一优选例中，所述载体为壳体转移的AAV载体。

在另一优选例中，所述载体包含AAV2基因组和AAV2壳体蛋白(AAV2/2)、AAV2基因组和AAV5壳体蛋白(AAV2/5)、AAV2基因组和AAV8壳体蛋白(AAV2/8)、或AAV2基因组和AAV9壳体蛋白(AAV2/9)、或AAV2基因组和AAVRh10壳体蛋白(AAV2/Rh10)。

在另一优选例中，所述载体为重组腺相关病毒载体rAAV2/8、rAAV2/9、或rAAV2/Rh10。

在另一优选例中，所述的载体包括DNA病毒载体、逆转录病毒载体。

在另一优选例中，所述载体为含有或插入有如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸的AAV载体；较佳地为rAAV2/8、rAAV2/9、或rAAV2/Rh10载体；更佳地为rAAV2/Rh10载体。

在另一优选例中，所述载体的骨架为腺相关病毒载体质粒pAAV-MCS。

在另一优选例中，所述载体用于表达视网膜劈裂蛋白。

本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有本发明第三方面所述的载体，或其染色体中整合有外源的如本发明第一方面所述的核苷酸序列或本发明第二方面所述的融合核酸。

在另一优选例中，所述宿主细胞为哺乳动物细胞，所述哺乳动物包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述宿主细胞为视网膜细胞和/或视神经细胞。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：HEK293细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、视神经细胞、或其组合。较佳地，所述宿主细胞为感光细胞(光感受器细胞)、双极细胞、视神经细胞、或其组合。

本发明的第五方面，提供了如本发明第三方面所述的载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力、和/或治疗或预防眼部疾病。

在另一优选例中，所述眼部疾病为视网膜劈裂症，较佳地X连锁视网膜劈裂症(XLRS)。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗或预防视网膜劈裂症，较佳地治疗或预防X连锁视网膜劈裂症(XLRS)。

在另一优选例中，所述制剂或组合物用于治疗或预防由XLRS引起的男性青少年黄斑变性。

本发明的第六方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂的剂型选自下组：冻干制剂、液体制剂、或其组合。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体；更佳地，所述载体选自下组的重组腺相关病毒载体：rAAV2/2、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9、rAAV2/Rh10、或其组合。

在另一优选例中，所述药物制剂中载体的含量为1×10⁹-1×10¹⁶个病毒/毫升，较佳地1×10¹²-1×10¹³个病毒/毫升。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗或预防眼部疾病，较佳地治疗或预防视网膜劈裂症，更佳地治疗或预防X连锁视网膜劈裂症(XLRS)。

本发明的第七方面，提供了一种治疗或预防疾病的方法，所述方法包括将本发明第三方面所述的载体施用于需要的对象。

在另一优选例中，所述方法为治疗或预防眼部疾病的方法。

在另一优选例中，所述眼部疾病为视网膜劈裂症，较佳地X连锁视网膜劈裂症(XLRS)。

在另一优选例中，所述眼部疾病为由XLRS引起的男性青少年黄斑变性的方法。

在另一优选例中，所述的载体选自下组：慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、或其组合。较佳地，所述载体为AAV载体；更佳地，所述载体选自下组的重组腺相关病毒载体：rAAV2/2、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9、rAAV2/Rh10、或其组合。

在另一优选例中，将所述载体引入到需要的对象的眼睛内。

在另一优选例中，所述需要的对象包括人和非人哺乳动物。

在另一优选例中，所述方法包括通过视网膜下，直接视网膜注射或玻璃体内注射来将本发明第三方面所述的载体施用至需要的对象的眼。

在另一优选例中，所述方法可使由于X连锁视网膜劈裂症引起的男性青少年黄斑变性在需要的对象的一生中基本上得以阻止。

在另一优选例中，所述方法在处理的眼中视觉功能基本得以恢复或维持。

本发明的第八方面，提供了一种重组视网膜劈裂蛋白的制备方法，包括步骤：培养本发明第四方面所述的宿主细胞，从而得到重组视网膜劈裂蛋白。

本发明的第九方面，提供了一种病毒载体生产系统，其包含一组编码所述病毒载体生产所需要的组分的多核苷酸，其中所述病毒载体基因组包含本发明第一方面所述的核苷酸序列。

本发明的第十方面，提供了用于本发明第九方面所述的病毒载体生产系统的DNA构建体，其包含本发明第一方面所述的核苷酸序列。

本发明的第十一方面，提供了病毒载体生产细胞，其包含本发明第一方面所述的核苷酸序列、或本发明第九方面所述的病毒载体生产系统、或本发明第十方面所述的DNA构建体。

本发明的第十二方面，提供了生产病毒载体的方法，其包括将本发明第一方面所述的核苷酸序列引入细胞并在适合于所述病毒载体生产的条件下培养所述细胞。

在另一优选例中，所述细胞是HEK293或HEK293T细胞。

本发明的第十三方面，提供了一种载体，所述载体含有编码RS1蛋白的核酸分子。

在另一优选例中，所述RS1蛋白具有如SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。

在另一优选例中，所述编码RS1蛋白的核酸分子具有如SEQ ID NO.:1或2所示的核苷酸序列。

在另一优选例中，所述载体为腺相关病毒载体，较佳地为重组腺相关病毒载体rAAV2/8、rAAV2/9或rAAV2/Rh10。

本发明的第十四方面，提供了本发明第十三方面所述载体的用途，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力、和/或治疗或预防眼部疾病。

在另一优选例中，所述眼部疾病包括视网膜劈裂症，较佳地X连锁视网膜劈裂症。

本发明的第十五方面，提供了一种药物制剂，所述的制剂含有(a)本发明第十三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了经优化的人视网膜劈裂蛋白核苷酸序列与原人视网膜劈裂蛋白基因序列对比结果。优化的人视网膜劈裂蛋白核苷酸序列与原人视网膜劈裂蛋白基因开放阅读框序列比较同源性为81.04％(547/675)，一致的用“|”表示。其中上行序列为经优化的人视网膜劈裂蛋白开放阅读框核苷酸序列(优化序列)，下行序列为原人视网膜劈裂蛋白基因序列(野生序列)。

图2显示了重组质粒pAAV-MCS-优化RS1结构图。

图3显示了PCR核酸电泳验证克隆结果，得到一个大小约700bp左右的目的条带。其中，M:DNA Marker,泳道1:RS1序列阳性克隆，泳道2:优化RS1序列阳性克隆，泳道3:阴性对照。

图4显示了rAAV-RS1病毒的蛋白电泳图。其中，泳道1:蛋白marker；泳道2：rAAV-优化RS1。

图5显示了293T细胞分别感染rAAV2/2-EGFP(对照组)、rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/9-优化RS1(B组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(C组)、rAAV2/2-RS1(D组)、rAAV2/9-RS1(E组)和rAAV2/Rh10-RS1(F组)后，RS1基因mRNA水平相对表达量。

图6显示了293T细胞分别感染rAAV2/2-EGFP(对照组)、rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/9-优化RS1(B组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(C组)、rAAV2/2-RS1(D组)、rAAV2/9-RS1(E组)和rAAV2/Rh10-RS1(F组)后，RS1蛋白水平相对表达量。

图7显示了兔眼玻切镜下眼底拍照结果。其中图7A为对照组的拍照结果，图7B为A组的拍照结果。

图8显示了不同组别兔眼的RS1基因的mRNA检测结果。

图9显示了不同组别兔眼的RS1蛋白检测结果。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，对视网膜劈裂蛋白(RS1)基因编码序列进行了针对性优化设计，从而获得了一种特别适合在哺乳动物(如人)细胞中进行高效表达人源RS1蛋白的核苷酸序列，并构建了视网膜劈裂蛋白的重组表达载体。实验结果表明，相对于未优化的编码序列，经过特殊优化后的RS1编码序列(SEQ ID NO.:1)的表达量显著提高，提高了至少五倍。此外，本申请人还意外地发现对于本申请特殊优化后的RS1编码序列，相比其他血清型的AAV载体，AAV2/8、AAV2/9和AAV2/Rh10作为载体能够更好地表达RS1蛋白、更有效地治疗XLRS。在此基础上，发明人完成了本发明。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。

如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

序列同一性通过沿着预定的比较窗(其可以是参考核苷酸序列或蛋白的长度的50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％)比较两个对齐的序列，并且确定出现相同的残基的位置的数目来确定。通常地，这表示为百分比。核苷酸序列的序列同一性的测量是本领域技术人员熟知的方法。

如本文所用，术语“受试者”、“需要的对象”指任何哺乳动物或非哺乳动物。哺乳动物包括但不限于人类、脊椎动物诸如啮齿类、非人类灵长类、牛、马、狗、猫、猪、绵羊、山羊。

如本文所用，术语“视细胞”、“感光细胞”、“光感受细胞”和“光感受器细胞”可互换使用，包括视杆细胞和视锥细胞。

腺相关病毒

腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV),也称腺伴随病毒,属于微小病毒科依赖病毒属,是目前发现的一类结构最简单的单链DNA缺陷型病毒，需要辅助病毒(通常为腺病毒)参与复制。它编码两个末端的反向重复序列(ITR)中的cap和rep基因。ITRs对于病毒的复制和包装具有决定性作用。cap基因编码病毒衣壳蛋白，rep基因参与病毒的复制和整合。AAV能感染多种细胞。

重组腺相关病毒载体(rAAV)源于非致病的野生型腺相关病毒，由于其安全性好、宿主细胞范围广(分裂和非分裂细胞)、免疫源性低，在体内表达外源基因时间长等特点，被视为最有前途的基因转移载体之一，在世界范围内的基因治疗和疫苗研究中得到广泛应用。经过10余年的研究，重组腺相关病毒的生物学特性己被深入了解，尤其是其在各种细胞、组织和体内实验中的应用效果方面已经积累了许多资料。在医学研究中，rAAV被用于多种疾病的基因治疗的研究(包括体内、体外实验)；同时作为一种有特点的基因转移载体，还广泛用于基因功能研究、构建疾病模型、制备基因敲除鼠等方面。

在本发明一个优选的实施例中，载体为重组AAV载体。AAV是相对较小的DNA病毒，其可以稳定和位点特异性方式整合到它们所感染的细胞的基因组中。它们能够感染一大系列的细胞而不对细胞生长、形态或分化产生任何影响，并且它们似乎并不涉及人体病理学。AAV基因组己被克隆、测序及表征。AAV含有大约4700碱基并在每个末端包含约145个碱基的反向末端重复序列(ITR)区域，其作为病毒的复制起点。该基因组的其余被分成两个带有衣壳化功能的重要区域：包含涉及病毒复制和病毒基因表达的rep基因的基因组左边部分；以及包含编码病毒衣壳蛋白的cap基因的基因组右边部分。

AAV载体可采用本领域的标准方法制备。任何血清型的腺相关病毒均是合适的。用于纯化载体的方法可见于例如美国专利No.6566118、6989264和6995006，它们的公开内容整体以引用方式并入本文。杂合载体的制备在例如PCT申请No.PCT/US2005/027091中有所描述，该申请的公开内容整体以引用方式并入本文。用于体外和体内转运基因的衍生自AAV的载体的使用己有描述(参见例如国际专利申请公布No.WO91/18088和WO93/09239；美国专利No.4,797,368、6,596,535和5,139,941，以及欧洲专利No.0488528，它们均整体以引用方式并入本文)。这些专利公布描述了其中rep和/或cap基因缺失并被所关注的基因替换的各种来源于AAV的构建体，以及这些构建体在体外(进入培养的细胞中)或体内(直接进入生物体)转运所关注的基因的用途。复制缺陷重组AAV可通过将以下质粒共转染进被人类辅助病毒(例如腺病毒)感染的细胞系而制备：所含的所关注核酸序列的侧翼为两个AAV反向末端重复序列(ITR)区域的质粒，和携带AAV衣壳化基因(rep和cap基因)的质粒。然后通过标准技术纯化所产生的AAV重组体。

在一些实施方案中，重组载体被衣壳化到病毒粒子(例如包括但不限于AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAVRh10的AAV病毒粒子)中。因此，本公开包括含有本文所述的任何载体的重组病毒粒子(因其包含重组多核苷酸而为重组的)。产生这样的粒子的方法是本领域己知的，并在美国专利No.6,596,535中有所描述。不同血清型AAV的衣壳蛋白识别细胞表面的受体不同，因而对不同组织细胞的侵染效率差异很大，表现出一定的器官靶向特异性。不同血清型的AAV对不同的目的蛋白编码序列，表达效率也可能存在不同结果。

X连锁视网膜劈裂症(XLRS)

X连锁视网膜劈裂症(X-Linked juvenile Retinoschisis,XLRS)是一种罕见的遗传性致盲性眼病，发病率约为1:5000～1:25000。XLRS主要累及双侧视网膜,在视网膜神经纤维层和神经节细胞层之间出现劈裂腔。此病发生于男性,女性作为携带者无特征性临床表现。XLRS是引起男性青少年黄斑变性的最主要原因。

RS1

如本文所用，术语“视网膜劈裂蛋白”、“RS1蛋白”、“多肽”、“人RS1蛋白”和“hRS1蛋白”具有相同的意义，在本文中可互换使用。

目前认为RS1基因突变是导致视网膜劈裂症的主要基因，RS1基因定位于Xp22.1-p22.2区段，包含大约15000个碱基对，编码成熟的视网膜劈裂蛋白(retinoschisin 1，RS1)。RS1蛋白由视网膜感光细胞分泌，包括一个高度保守的盘状区域(由4-6个外显子编码)，分布于神经细胞层、双极细胞层以及锥杆细胞内核层的细胞质膜表面，主要功能是介导细胞间的黏附。约87％的突变发生于编码环状区域的4～6个外显子。与大量的致病突变不同，XLRS基因只有5种良性DNA多态性，这也反映了环状区域的高度保守性。XLRS1基因突变导致所表达蛋白产物的分泌障碍和黏附功能丧失、细胞与细胞间信息传递障碍和视网膜层间黏附作用减弱而在内层视网膜形成劈裂腔。目前将突变分为三类：第一类为编码RS1疏水引导肽序列的基因突变，阻止信号肽形成螺旋，导致蛋白插入内质网膜障碍而滞留于细胞质，被蛋白酶迅速降解；第二类包括编码环状结构侧翼部分的基因突变，RS1亚单位无法组装成以二硫键连接的有黏附功能的寡聚复合物；第三组是位于编码环状区域的致病突变，直接导致环状区域空间结构改变，错误折叠的蛋白滞留于内质网内而导致疾病发生。

目前对XLRS的各种治疗方法均无满意的效果,患者的最终结局多为视力丧失。由于XLRS的发生具有明确的基因突变的遗传基础，因此基因治疗或在基因水平的干预治疗有可能成为根本的治疗方法和途径。本发明选择重组腺病毒普遍被作为转导目的基因到光感受器细胞及色素细胞的载体，这种载体被注射到视网膜细胞内部具有无毒、无免疫排斥等优点。本发明以腺相关病毒为载体，包装成含有正常RS1基因重组病毒，转导进入视网膜细胞层，表达正常RS1蛋白。在视网膜中RS1蛋白由光感受器细胞与双极细胞合成后分泌，后被Muller细胞摄取并将其传递至内层视网膜发挥作用。

核酸编码序列

本发明的要解决的技术问题是克服现有技术中RS1表达效率不高、治疗效果不佳的技术缺陷。本发明提供一种优化的RS1基因序列。本发明优化后的RS1编码序列如SEQ IDNO：1所示，其大小为675bp。经研究发现，本发明优化的RS1基因序列(SEQ ID NO.:1)，使RS1蛋白表达效率更高，有更多的RS1蛋白在患者视网膜细胞中发挥生理作用。

本发明所述的编码视网膜劈裂蛋白的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。在另一优选例中，所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％。在本发明中，所述经优化的编码视网膜劈裂蛋白的核酸又称作RS1优化编码序列、RS1优化基因、或RS1优化核酸或优化hRS1。

本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。在另一优选例中，所述核苷酸为DNA。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。本发明所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。

RS1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:3所示。

MSRKIEGFLLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQGGPNALWSAGATSLDCIPECPYHKPLGFESGEVTPDQITCSNPEQYVGWYSSWTANKARLNSQGFGCAWLSKFQDSSQWLQIDLKEIKVISGILTQGRCDIDEWMTKYSVQYRTDERLNWIYYKDQTGNNRVFYGNSDRTSTVQNLLRPPIISRFIRLIPLGWHVRIAIRMELLECVSKCA(SEQ ID NO.:3)

核酸序列可以是DNA、RNA、cDNA或PNA。核酸序列可以是基因组的、重组的或合成的。核酸序列可以是分离的或纯化的。核酸序列可以是单链或双链的。优选地，核酸序列将编码如本文描述的RS1蛋白。核酸序列可以通过克隆衍生，例如使用包括限制性酶切、连接、凝胶电泳的标准的分子克隆技术，例如在Sambrook等Molecular Cloning:A laboratorymanual,Cold Spring Harbour Laboratory Press)中描述的。核酸序列可是分离的，例如使用PCR技术分离的。分离意指从任何杂质和从被自然地发现与其来源中的核酸序列缔合的其他核酸序列和/或蛋白中分离核酸序列。优选地，其还将不含细胞材料、培养基或来自纯化/生产过程的其他化学物质。核酸序列可以是合成的，例如通过直接的化学合成产生。核酸序列可以作为裸露的核酸被提供，或可与蛋白或脂质复合提供。

本发明的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据已公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用市售的cDNA库或按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明多肽(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或多肽编码序列经基因工程产生的宿主细胞。上述多核苷酸、载体或宿主细胞可以是分离的。

如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

在本发明较佳的实施方式中，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

此外，还可用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。

应用PCR技术扩增DNA/RNA的方法被优选用于获得本发明的基因。用于PCR的引物可根据本文所公开的本发明的序列信息适当地选择，并可用常规方法合成。可用常规方法如通过凝胶电泳分离和纯化扩增的DNA/RNA片段。

本发明也涉及包含本发明的多核苷酸的载体，以及用本发明的载体或蛋白编码序列经基因工程产生的宿主细胞，以及经重组技术利用所述宿主细胞表达RS1蛋白的方法。

通过常规的重组DNA技术，可利用本发明的多核苷酸序列获得表达本发明RS1蛋白的宿主细胞(如哺乳动物细胞)。一般来说包括步骤：将本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第三方面所述的载体转导入宿主细胞内。

本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含本发明多肽的编码DNA序列和合适的转录/翻译控制信号的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。

此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)，或用于大肠杆菌的四环素或氨苄青霉素抗性。

包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达多肽。

宿主细胞可以是原核细胞，或是低等真核细胞，或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞(包括人和非人哺乳动物)。代表性例子有：CHO、NS0、COS7、或293细胞的动物细胞等。在本发明的一个优选实施方式中，选择HEK细胞、感光细胞(包括锥状细胞和/或杆状细胞)、其他视觉细胞(如双节细胞)、(视)神经细胞为宿主细胞。在另一优选例中，所述宿主细胞选自下组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、或其组合。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的蛋白质。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

序列优化

在本发明中，提供了特殊优化的、表达效率(包括转录效率和/或翻译效率)显著提高的视网膜劈裂蛋白的编码序列，所述编码序列如SEQ ID NO.:1所示。

如本文所用，所述“优化的RS1编码序列”、“优化RS1编码基因”、“hRS1优化基因”、“优化hRS1基因”、“优化RS1核酸”可互换使用，均指本发明经过特殊优化后的编码视网膜劈裂蛋白的核苷酸序列，所述的核苷酸序列编码SEQ ID NO.:3所示的氨基酸序列。本发明优化的RS1编码序列别适合在哺乳动物细胞中表达。

在本发明中，所述RS1的野生DNA编码序列(天然或未优化的DNA编码序列)如SEQID NO.:2所示，所述未优化的野生DNA编码序列的蛋白表达量很低。RS1野生编码序列的具体核酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

ATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCCTGGTACCAAAAAGCATGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAGGTGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGGATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGA(SEQ ID NO.:2)

本发明优化了影响基因表达的序列片段，这些序列片段包括但不限于，密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点，获得了多个经优化的RS1编码序列。

通过大量的分析和试验筛选，最终得到如SEQ ID NO.:1所示的特别优化的重组人视网膜劈裂蛋白(retinoschisin 1，RS1)编码序列，其大小为675bp，起始于密码子ATG，由4个外显子组成，编码225个氨基酸，前69bp编码23个氨基酸，组成信号肽，后202个氨基酸组成成熟肽，增强细胞间的黏附和帮助信息传递。此序列是经过特殊优化，表达效率明显提高，RS1表达量显著提高。特别优化后的SEQ ID NO.:1所示的编码序列与SEQ ID NO.:2所示的野生编码序列相似度为81.04％(547/675)。

ATGAGCCGCAAGATCGAGGGCTTCCTGCTGCTGCTGCTGTTCGGCTACGAGGCCACCCTGGGCCTGAGCAGCACCGAGGACGAGGGCGAGGACCCCTGGTATCAGAAGGCCTGCAAGTGCGACTGCCAGGGCGGCCCCAACGCCCTGTGGAGCGCCGGCGCCACCAGCCTGGACTGCATCCCCGAGTGCCCCTACCACAAGCCCCTGGGCTTCGAGAGCGGCGAGGTGACCCCCGACCAGATCACCTGCAGCAACCCCGAGCAGTACGTGGGCTGGTACAGCAGCTGGACCGCCAACAAGGCCCGCCTGAACAGCCAGGGCTTCGGCTGCGCCTGGCTGAGCAAGTTCCAGGACAGCAGCCAGTGGCTGCAGATCGACCTGAAGGAGATCAAGGTGATCAGCGGCATCCTGACCCAGGGCCGCTGCGACATCGACGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACCGCACCGACGAGCGCCTGAACTGGATCTACTACAAGGACCAGACCGGCAACAACCGCGTGTTCTACGGCAACAGCGACCGCACCAGCACCGTGCAGAACCTGCTGCGCCCCCCCATCATCAGCCGCTTCATCCGCCTGATCCCCCTGGGCTGGCACGTGCGCATCGCCATCCGCATGGAGCTGCTGGAGTGCGTGAGCAAGTGCGCCTAA(SEQ ID NO.:1)

表达载体和宿主细胞

本发明还提供了一种用于RS1蛋白的表达载体，它含有本发明的优化RS1编码序列。

通过提供的序列信息，熟练的技术人员可以使用可用的克隆技术以产生适于转导进入细胞的核酸序列或载体。

优选地，编码RS1蛋白的核酸序列作为载体，优选地表达载体被提供。优选地，其可作为优选地适用于在视网膜靶细胞中转导和表达的基因治疗载体被提供。载体可以是病毒的或非病毒的(例如质粒)。病毒载体包括源自以下的那些病毒载体:腺病毒、包括突变的形式的腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、疱疹病毒、牛痘病毒、MMLV、GaLV、猿猴免疫缺陷病毒(SIV)、HIV、痘病毒和SV40。优选地，病毒载体是复制缺陷的(replicationdefective)，尽管设想其可以是复制缺乏的(replication deficient)、能够复制或条件性复制的。病毒载体通常可以保持染色体外状态而不整合进入靶视网膜细胞的基因组。用于向视网膜靶细胞引入编码RS1蛋白的核酸序列的优选的病毒载体是AAV载体，例如自身互补的腺相关病毒(scAAV)。使用特定的AAV血清型(AAV血清型2到AAV血清型12)或这些血清型中的任何一个的修饰的版本(包括AAV 4YF和AAV 7m8载体)可以实现选择性靶向。

病毒载体可被修饰以缺失任何非必需的序列。例如，AAV中，病毒可被修饰以缺失全部或部分的IX基因、Ela和/或Elb基因。对于野生型AAV，没有辅助病毒诸如腺病毒的存在，复制是非常低效率的。对于重组的腺相关病毒，优选地，复制基因和衣壳基因以反式被提供(在pRep/Cap质粒中)，并且仅AAV基因组的2ITR被保留并且包装进入病毒体，同时需要的腺病毒基因被被腺病毒或另一个质粒提供。也可对慢病毒载体做出类似的修饰。

病毒载体具有进入细胞的能力。然而，非病毒载体诸如质粒可与剂复合以有利于病毒载体被靶细胞的摄取。此类剂包括聚阳离子剂。可选地，递送系统诸如基于脂质体的递送系统可被使用。用于在本发明中使用的载体优选地适于在体内或体外使用，并且优选地适于在人类中使用。

载体将优选地包含一个或多个调节序列以指导核酸序列在视网膜靶细胞中的表达。调节序列可以包括与核酸序列可操作地连接的启动子、增强子、转录终止信号、多腺苷酸化序列、复制起点、核酸限制性位点、和同源重组位点。载体还可包括选择性标记，例如来确定载体在生长系统(例如细菌细胞)中或在视网膜靶细胞中的表达。

“可操作地连接”意指，核酸序列在功能上与其可操作地连接的序列相关，以使得它们以使得它们影响彼此的表达或功能的方式连接。例如，与启动子可操作地连接的核酸序列将具有被启动子影响的表达模式。

启动子介导与其连接的核酸序列的表达。启动子可以是组成型的或可以是诱导型的。启动子可以指导在内视网膜细胞中遍在的表达，或神经元特异的表达。在后一种情况中，启动子可以指导细胞类型特异的表达，例如对给视神经节细胞。合适的启动子将是本领域技术人员己知的。例如，合适的启动子可以选自由以下组成的组:L7、thy-1、恢复蛋白、钙结合蛋白、人类CMV、GAD-67、鸡β肌动蛋白、hSyn、Grm6、Grm6增强子SV40融合蛋白。使用细胞特异的启动子可以实现靶向，例如Grm6-SV40用于选择性靶向给视神经细胞。Grm6启动子是Grm6基因的200碱基对增强子序列和SV40真核启动予的融合体，Grm6基因编码给视神经细胞特异的代谢型谷氨酸受体mGluR6。Grm6基因的优选的来源是小鼠和人类。使用泛-神经元的启动子可以实现遍在的表达，其实例在本领域是己知的并且可得的。一个此类实例是CAG。CAG启动于是CMV早期增强子和鸡β肌动蛋白启动子的融合体。

合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子-1α(EF-1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦-巴尔(Epstein-Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

许多表达载体可应用RS1蛋白在哺乳动物细胞(较佳地为人细胞，更佳地为人感光细胞(或光感受器细胞)、双极细胞、和/或视神经细胞等)表达。本发明优选用腺相关病毒作为表达载体，优选用AAV2/8、AAV2/9或AAV2/Rh10载体作为表达载体。

本发明还提供了一种宿主细胞，用于表达RS1蛋白。优选地，所述宿主细胞为哺乳动物细胞(较佳地为人细胞，更佳地为人视网膜细胞或视神经细胞，如人视神经细胞、感光细胞、双极细胞等)，提高RS1蛋白的表达量。

制剂和组合物

本发明提供一种制剂或组合物，所述制剂或组合物含有(a)本发明第三方面所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗眼部疾病。

在另一优选例中，所述药物制剂用于治疗视网膜劈裂症，较佳地X连锁视网膜劈裂症。

本发明所述药物组合物中的“活性成分”是指本发明所述的载体(vector)，例如病毒载体(包括腺相关病毒载体)。本发明所述的“活性成分”、制剂和/或组合物可用于治疗眼部疾病。“安全有效量”指的是：活性成分的量足以明显改善病情或症状，而不至于产生严重的副作用。“药学上可接受的载体或赋形剂(excipient)”指的是：一种或多种相容性固体或液体填料或凝胶物质，它们适合于人使用，而且必须有足够的纯度和足够低的毒性。“相容性”在此指的是组合物中各组份能和本发明的活性成分以及它们之间相互掺和，而不明显降低活性成分的药效。

组合物可以是液体或固体，例如粉末、凝胶或糊剂。优选地，组合物是液体，优选地可注射液体。合适的赋形剂将是本领域技术人员己知的。

在本发明中，所述载体可通过视网膜下或玻璃体内施用向眼睛施用。在任一种施用模式中，优选地，载体作为可注射液体被提供。优选地，可注射液体作为胶囊或注射器被提供。

药学上可以接受的载体部分例子有纤维素及其衍生物(如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素钠、纤维素乙酸酯等)、明胶、滑石、固体润滑剂(如硬脂酸、硬脂酸镁)、硫酸钙、植物油(如豆油、芝麻油、花生油、橄榄油等)、多元醇(如丙二醇、甘油、甘露醇、山梨醇等)、乳化剂(如

)、润湿剂(如十二烷基硫酸钠)、着色剂、调味剂、稳定剂、抗氧化剂、防腐剂、无热原水等。

组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂包括水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。

本发明提供的编码RS1的核酸，可以体外或体内生产RS1蛋白，可应用于制备治疗视网膜劈裂症(较佳地X连锁视网膜劈裂症)的药物。

经优化的编码视网膜劈裂蛋白的核酸表达量更高，从而翻译出更多的RS1蛋白。优化RS1核酸比现有技术编码表达更多的RS1蛋白，其转染效率更高，能较好地治疗视网膜劈裂症(较佳地X连锁视网膜劈裂症)。感染视网膜细胞，在视网膜细胞内表达RS1蛋白进发挥作用。

治疗方法

本发明提供了向细胞提供视觉细胞(如感光细胞、双极细胞、和/或视神经细胞)功能的方法，所述方法包括将包含编码RS1的优化序列的载体引入到眼睛内。所述方法可包括向眼睛的内视网膜细胞视网膜下或玻璃体内施用核酸载体。

本发明提供了用于通过向细胞提供视觉细胞(如感光细胞、双极细胞、和/或视神经细胞)功能在治疗视网膜劈裂症的方法中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码RS1的优化序列。本发明组合物可以单独给药，或者与其他治疗药物联合给药(如配制在同一药物组合物中)。

本发明还提供了对受试者恢复视力的方法，所述方法包括将包含编码RS1的优化序列的载体引入到眼睛内。方法可包括视网膜下或玻璃体内施用核酸载体到眼睛的内视网膜细胞。本发明提供了用于在对受试者恢复视力中使用的核酸载体，所述核酸载体包含编码RS1的优化序列。

本发明还提供了治疗受试者中的视网膜疾病的方法，所述方法包括将包含编码RS1的优化序列的载体引入到眼睛内。方法可包括视网膜下或玻璃体内施用核酸载体到眼睛的内视网膜细胞。疾病可以是视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；其他形式的视网膜或黄斑退化、缺血性状况、视网膜劈裂症(较佳地X连锁视网膜劈裂症)、视网膜色素变性、Leber先天性黑蒙症、葡萄膜炎和由视觉细胞(如感光细胞、双极细胞、和/或视神经细胞)能力的丧失导致的任何其他疾病。

如本文所用，向细胞提供视觉细胞(如感光细胞、双极细胞、和/或视神经细胞)功能意指，之前不具有视觉细胞能力或其视觉细胞能力已经完全地或部分地退化的细胞，在其中表达编码RS1的外来核酸序列后，变成感光的。此类细胞在本文中可被称作转化的细胞，因为其在其中包含非天然的核酸。优选地，转化的视网膜细胞展现天然的感光细胞的一些或全部的感光细胞能力。优选地，转化的视网膜细胞展现天然的视神经节细胞的一些或全部的视神经节细胞能力。优选地，转化的细胞展现天然的视网膜感光细胞的至少相同或大体上相同的感光能力。优选地，转化的细胞展现比患病的或正在退化的天然的视网膜感光细胞高的感光能力。因此，转化的细胞相比于来自同一来源、保持在同一条件下、未经处理的退化的或患病的细胞，将优选地具有增加的视觉细胞(如感光细胞、双极细胞、和/或视神经细胞)。转化的细胞通过其中的外源核酸的存在可与天然的细胞区分。

如本文所用，恢复受试者中的视力意指，受试者相比于治疗之前，例如使用如本文描述的视力测试，显示改进的视力。恢复包括任何程度的改进，包括视力的完全恢复到完美的或接近完美的视力。

如本文所用，治疗疾病意指施用如本文描述的核酸或载体以改善或减轻疾病的一种或多种症状，所述疾病选自由以下组成的组:视网膜营养不良，包括视杆营养不良、视杆视锥营养不良、视锥视杆营养不良、视锥营养不良和黄斑营养不良；另一种形式的视网膜或黄斑退化、视网膜劈裂症(较佳地X连锁视网膜劈裂症)、视网膜色素变性、缺血性状况、Leber先天性黑蒙症、葡萄膜炎和由视觉细胞能力的丧失导致的任何其他疾病。改善或减轻可导致外周或中央视力、和/或白天或夜间视力的改善。

本发明的方法包括将编码RS1蛋白的核酸序列引入到眼睛的玻璃体腔内。优选地，方法包括使细胞与包含编码RS1蛋白的核酸序列的载体(较佳地为病毒，更佳地为腺相关病毒)接触。优选地，细胞是视网膜细胞和/或视神经细胞，优选地视锥细胞、视杆细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、视神经细胞、或其组合。

当核酸序列和一种或多种酶以多个(两个或多个)剂量被提供时，这些剂量可分隔合适的时间间隔，例如30秒到若干小时或1天或多天。

每个剂量可包含有效量的核酸序列或病毒载体。核酸序列或病毒载体的有效剂量可以在每治疗方案1×10⁹-1×10¹⁶病毒的范围。

本发明是基于靶向编码RS1的优化的核酸序列到视网膜细胞，以补偿视网膜中感光细胞或双极细胞表达正常RS1蛋白。在视网膜中RS1蛋白由光感受器细胞与双极细胞合成后分泌，后被Muller细胞摄取并将其传递至内层视网膜发挥作用。核酸序列被靶向至的细胞是视网膜的细胞，其是活的并且能够表达外来核酸序列。视网膜细胞是视网膜的细胞，其是神经或神经元细胞并且能够变兴奋并传送电信号。优选地，靶视网膜细胞将能够产生电信号并且起始信号级联，导致信号向视神经的传送。优选地，靶视网膜细胞是内视网膜的细胞。靶细胞可以是视杆或视锥细胞，和/或可以是非感光细胞(即呈其天然形式的对光不响应的视网膜细胞)。靶视网膜细胞可以包括一种或多种细胞类型，所述细胞类型选自由以下组成的组：视杆细胞、视锥细胞、给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、米勒细胞、无长突细胞、视神经细胞、或其组合。

因此，当靶视网膜细胞是靶向视网膜的给光双极细胞、撤光双极细胞、水平细胞、神经节细胞、无长突细胞、视神经细胞、或其组合时，编码RS1的核酸的表达可以被称作异位表达。因此，本发明在其范围内包括在非感光细胞中异位表达编码RS1的核酸序列的方法。此类异位表达通过其中的异源RS1蛋白的表达，具有向细胞提供视觉细胞(如感光细胞、双极细胞、和/或视神经细胞)功能的作用。这用于增加观察到退化的视网膜的感光能力。

水平细胞是内视网膜细胞，参与信号加工和反馈到感光细胞；双极细胞是内视网膜细胞并且在视杆/视锥细胞和无长突和/或神经节细胞间通信；无长突细胞发现于内视网膜并且允许在感光细胞途径和神经节细胞间的通信；神经节细胞是最内部的视网膜细胞，其将信号从感光细胞传递到视神经。

本文对细胞的提及包括细胞的后代。优选地，根据本发明的对细胞的修饰还发生在转化的宿主细胞以后的代中。后代细胞可以不与最初的靶向细胞一致，但优选地将也展现非天然的RS1的表达。

本发明还提供视网膜劈裂蛋白基因在兔子中的实验应用，为临床应用提供基础。

本发明具有如下优点和显著的进步：RS1蛋白进入内层视网膜发挥作用。因此，通过构建rAAV2/9-优化RS1或者rAAV2/Rh10-优化RS1，制备玻璃体腔注射的药物，用于研究该基因在视网膜劈裂的基因治疗中的作用。

与现有技术相比，本发明主要具有以下优点：

1.本发明重组人视网膜劈裂蛋白(RS1)编码基因序列经过了针对性的特殊优化，编码序列不同于现有技术。与RS1的未优化的DNA编码序列相比，表达效率显著提高。优化后的序列RS1蛋白表达量显著提高、生物活性高，RS1蛋白表达量提高了至少5倍。

2.本发明rAAV2/2、rAAV2/5、rAAV2/8、rAAV2/9和rAAV2/Rh10，尤其是rAAV2/8、rAAV2/9和rAAV2/Rh10携带优化RS1基因表达效果最好，穿透能力强，感染效率高和表达效率明显更高。

3.本发明优化的RS1编码基因(SEQ ID NO.:1)或重组表达载体能够非常有效地治疗眼部疾病(如X连锁视网膜劈裂症)，并且安全性好，不会发生明显的炎症反应或其他并发症。

4.本发明还提供一种重组人视网膜劈裂蛋白基因的重组应用腺相关病毒载体的构建方法，该方法能快速，简便地构建携带重组人视网膜劈裂蛋白基因的重组腺相关病毒载体，并包装获得复杂缺陷腺相关病毒载体。

下面结合具体实施，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1序列优化

在本实施例中，基于RS1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO.:3)和天然的编码序列(SEQ ID NO.:2)，本发明人对编码序列进行了优化。具体地，本发明优化了影响基因表达的序列片段，这些序列片段包括但不限于：密码子使用偏好性，消除不利于表达的二级结构(如发夹结构)，改变GC含量，CpG二核苷酸含量，mRNA的二级结构，隐蔽剪接位点，早期多聚腺苷化位点，内部核糖体进入位点和结合位点，负CpG岛，RNA不稳定区，重复序列(直接重复、反向重复等)和可能影响克隆的限制性位点。

在本实施例中，设计了数十个优化的RS1编码序列，并对优化的RS1编码序列进行分析和试验筛选，最终得到如SEQ ID NO.:1所示的特别优化的DNA编码序列。结果发现，相比天然的RS1编码序列(SEQ ID NO.:2)，序列如SEQ ID NO.:1所示的特别优化的DNA编码序列，其RS1蛋白表达效率显著提高。

实施例2重组人视网膜劈裂蛋白基因的重组腺相关病毒载体构建及其病毒包装纯化方法，其步骤包括：

(一)含有人视网膜劈裂蛋白基因重组腺相关病毒载体的构建

1)载体构建

将天然未优化的编码序列(SEQ ID NO.:2)和实施例1中优化的重组人视网膜劈裂蛋白基因(SEQ ID NO：1)加Kpn I和Sal I两个酶切位点或者将以该新基因设计引物用PCR扩增的产物与pAAV-MCS质粒载体，分别进行Kpn I和Sal I双酶切，回收酶切产物，T4DNALigase连接过夜，连接产物转化感受态细胞得到重组pAAV-MCS-RS1(含SEQ ID NO.:2所示的编码序列)和pAAV-MCS-优化RS1(含SEQ ID NO.:1所示的编码序列)(图1)。

2)重组子的筛选和鉴定

取37℃培养后的LB平板，出现蓝斑和白斑，其中白色为重组克隆。挑取白色的菌落加入到含有Amp 100mg/L的LB液体培养基中，37℃，200rpm培养8h。培养好后取菌液，提取质粒，质粒提取步骤参照Biomiga说明书。取1uL质粒作为模板，所述特异性引物为：

原RS1-F：CGAGTTGCCATAGAAGACCC(SEQ ID NO.:4)

原RS1-R：CAAGTTCCAGGACAGTAGCC(SEQ ID NO.:5)

优化RS1-F：GATGAAGCGGCTGATGATGG(SEQ ID NO.:6)

优化RS1-R：ATCGACGAGTGGATGACCAAGT(SEQ ID NO.:7)

PCR扩增程序

对PCR产物电泳检测(图2)，得到一个大小约700bp左右的目的条带，M:DNAMarker，泳道1:阳性克隆，泳道2:阳性对照，泳道3:阴性对照。

3)菌液保存及PCR扩增及其片段测序

吸取1mL经过鉴定的菌液与灭菌后的的甘油1:3比例混匀,于-80℃保存，进行菌液测序，将测序得到的序列与重组人视网膜劈裂蛋白基因比对分析，成功得到序列正确的pAAV-MCS-优化RS1(图3)。

(二)rAAV-RS1重组腺相关病毒包被

1)、转染前一天，将293T细胞接种于225cm²细胞培养瓶中，接种密度3.0×10⁷个/mL细胞,培养基为DMEM+10％牛血清，置37℃含5％CO2的培养箱中培养过夜。

2)、转染当天换液，用新鲜的含10％牛血清的DMEM培养基继续培养。待细胞生长至80～90％时，弃去培养基，用PlasmidTrans II(VGTC)转染试剂盒进行转染。具体步骤为：

(a)每个转染瓶取pAdHelper、pAAV-MCS-优化RS1/pAAV-MCS-RS1(选择其中一种基因质粒)、pAAV-r2c2/pAAV-r2c3/pAAV-r2c4/pAAV-r2c5/pAAV-r2c6/pAAV-r2c7/pAAV-r2c8/pAAV-r2c9/pAAV-r2c10(选择一种外壳质粒)、质粒按要求比例与DMEM+PlasmidTransII(VGTC)(转染试剂)在1.5mL无菌Ep管中混匀，编号为A试剂，室温静止10～15min；

(b)将A试剂同30mL DMEM+10％牛血清混合均匀，编号B试剂；

(c)将B试剂均匀加入细胞培养瓶中，37℃含5％CO₂的培养箱中继续培养；

(d)转染16h后，换完全培养基(DMEM+10％牛血清)。

3)转染48h后，收取细胞。

4)将收取细胞用PBS重悬，并反复冻融3次。

(三)rAAV-RS1病毒的纯化与浓缩

采用三步来分离、浓缩和纯化得到rAAV2/2-优化RS1、rAAV2/3-优化RS1、rAAV2/4-优化RS1、rAAV2/5-优化RS1、rAAV2/6-优化RS1、rAAV2/7-优化RS1、rAAV2/8-优化RS1、rAAV2/9-优化RS1、rAAV2/Rh10-优化RS1、rAAV2/2-RS1、rAAV2/9-RS1和rAAV2/Rh10-RS1病毒。

(四)病毒纯度和滴度验证

SDS-PAGE分离胶和积层胶,分离胶浓度为10％。分别按每个加样孔加样15μg。电泳完毕后用考马斯亮蓝染色，用相应的脱色液脱色直到显出低背景的、清晰的条带(图4)。

结果如图4所示，VP1/VP2/VP3＝1:1:10，条带清晰，比例正常，无可见杂带，纯度在99％以上。其中，Lan1:蛋白marker；Lan2：rAAV2/2-优化RS1

rAAV-优化RS1的滴度测定采用荧光定量PCR方法检测rAAV-优化RS1的物理滴度。

SYBRⅡ(takara)；目的片段引物(20uM)；包装病毒用目的质粒(已知浓度)；待测病毒；PCR八联管(Bio-red)。实验方法：模板5ul，SYBRⅡ10ul引物F/R 0.3ul，ROX 0.4ul，加Nuclease-Free水到20ul。QPCR反应条件：预变性：95℃10min；循环40次：95℃15sec，60℃1min。确定其基因组滴度为1×10¹²vg/mL。

实施例3RS1原核酸序列和优化序列体外细胞有效性实验

1、细胞感染

取6孔板分为7组，分别接种5×10⁵细胞在每个孔内，接种一天后，细胞计数在1×10⁶左右，分别接种10¹⁰vg/50ul rAAV2/2-EGFP(对照组)、rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/9-优化RS1(B组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(C组)、rAAV2/2-RS1(D组)、rAAV2/9-RS1(E组)和rAAV2/Rh10-RS1(F组)。培养48小时后，分别提取mRNA和总蛋白进行检测分析。

2、Real-Time PCR检测RS1基因的表达

首先用NCBI的保守结构域分析软件分析ND6的保守结构，确保所设计引物的扩增片段位于非保守区；然后根据荧光定量PCR的引物设计原则，用premier 5设计引物：

β-actin-F：CTCCATCCTGGCCTCGCTGT(SEQ ID NO.:8)

β-actin-R：GCTGTCACCTTCACCGTTCC(SEQ ID NO.:9)

原RS1-F：CGAGTTGCCATAGAAGACCC(SEQ ID NO.:4)

原RS1-R：CAAGTTCCAGGACAGTAGCC(SEQ ID NO.:5)

优化RS1-F：GATGAAGCGGCTGATGATGG(SEQ ID NO.:6)

优化RS1-R：ATCGACGAGTGGATGACCAAGT(SEQ ID NO.:7)

1)提取RNA、反转录

利用TRIZOL试剂盒提取细胞总RNA并反转录合成cDNA模板。

2)荧光定量PCR的反应体系和反应程序

SYBRⅡ(takara)；目的片段引物(20uM)；包装病毒用目的质粒(已知浓度)；待测病毒；PCR八联管(Bio-red)。实验方法：模板5ul，SYBRⅡ10ul引物F/R 0.3ul，ROX 0.4ul，加Nuclease-Free水到20ul。QPCR反应条件：预变性：95℃10min；循环40次：95℃15sec，60℃1min。采用2-△△CT相对定量方法(Livak等，2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以β-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值。

结果如图5所示，rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/9-优化RS1(B组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(C组)、rAAV2/2-RS1(D组)、rAAV2/9-RS1(E组)和rAAV2/Rh10-RS1(F组)目的基因mRNA的相对表达量均比对照组均有显著提高，其中rAAV2/Rh10-优化RS1(C组)和rAAV2/Rh10-RS1(F组)提高的最显著，比对照组提高40倍。这表明，AAV2/Rh10携带RS1基因表达效果更好。

3、Western blot检测RS1蛋白的表达

分离不同实验组的293T细胞，用细胞总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，按100μL/50mg组织加入对应体积的RIPA裂解液，混匀。取适当量的裂解液，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。对于贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍(如果血清中的蛋白没有干扰，可以不洗)。按照6孔板每孔加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。用枪吹打数下，使裂解液和细胞充分接触。通常裂解液接触细胞1-2秒后，细胞就会被裂解。对于悬浮细胞：离心收集细胞，用手指把细胞用力弹散。按照6孔板每孔细胞加入150-250微升裂解液的比例加入裂解液。再用手指轻弹以充分裂解细胞。充分裂解后应没有明显的细胞沉淀。如果细胞量较多，必需分装成50-100万细胞/管，然后再裂解。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清。BCA法测定蛋白浓度后，按总蛋白50μg计算实验组和对照组上样体积，进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot。一抗和二抗体孵育后进行化学发光成像拍照。

结果如图6所示，rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/9-优化RS1(B组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(C组)、rAAV2/2-RS1(D组)、rAAV2/9-RS1(E组)和rAAV2/Rh10-RS1(F组)目的蛋白的相对表达量均比对照组均有显著提高。并且，各rAAV2-优化RS1组(A组、B组、C组)的相对蛋白表达量明显比对应的rAAV2-RS1组(未优化组，D组、E组、F组)更高，均高于5倍以上。这表明，本发明的经特殊优化的RS1的编码核苷酸序列(SEQ ID NO.:1)表达效率比未优化的原RS1序列更高。

此外，C组的RS1蛋白表达明显比其他组提高，这证明AAVRh10携带RS1基因蛋白表达效果最好，优化序列比原始序列RS1基因蛋白表达效果更好。

实施例4原序列和优化序列兔子有效性实验

1.兔眼玻璃体腔注射

取30只兔子分为10组，分为rAAV2/2-EGFP(对照组)、rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/3-优化RS1(C组)、rAAV2/4-优化RS1(D组)、rAAV2/5-优化RS1(E组)、rAAV2/6-优化RS1(F组)、rAAV2/7-优化RS1(G组)、rAAV2/8-优化RS1(H组)、rAAV2/9-优化RS1(I组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(J组)，分别吸取50ul 1×10¹²vg/mL的腺相关病毒，在距角膜缘外3mm处穿刺睫状体平坦部进入玻璃体腔内，进行玻璃体腔注射。

2、裂隙灯、眼压、眼底照相检查

两组(对照组和A组)兔子分别于术后1、3、7、30天进行裂隙灯，眼压的检查。所有兔子均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示(图7)，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明正规标准的玻璃体腔注射不会发生明显的炎症反应或其他并发症。

3、Real-Time PCR检测RS1基因的表达

1)提取RNA、反转录

利用TRIZOL试剂盒提取不同实验组兔子视神经组织细胞总RNA并反转录合成cDNA模板。

2)荧光定量PCR的反应体系和反应程序

SYBRⅡ(takara)；目的片段引物(20uM)；包装病毒用目的质粒(已知浓度)；待测病毒；PCR八联管(Bio-red)。实验方法：模板5ul，SYBRⅡ10ul引物F/R 0.3ul，ROX 0.4ul，加Nuclease-Free水到20ul。QPCR反应条件：预变性：95℃10min；循环40次：95℃15sec，60℃1min。采用2-△△CT相对定量方法(Livak等，2001)研究基因表达量的差异，该方法无需制作标准曲线，以β-actin为内参基因，仪器自带的分析软件即可自动生成表达数值。

结果如图8所示，rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/3-优化RS1(C组)、rAAV2/4-优化RS1(D组)、rAAV2/5-优化RS1(E组)、rAAV2/6-优化RS1(F组)、rAAV2/7-优化RS1(G组)、rAAV2/8-优化RS1(H组)、rAAV2/9-优化RS1(I组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(J组)目的蛋白的相对表达量均比对照组均有显著提高。其中rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/5-优化RS1(E组)、rAAV2/8-优化RS1(H组)、rAAV2/9-优化RS1(I组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(J组)提高的最显著，比对照组提高20-40倍。这表明，AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9和AAV2/Rh10携带RS1基因表达效果更好。

4、Western blot检测RS1蛋白的表达

分离不同实验组的视神经组织，加入液氮，充分捣碎组织，用组织总蛋白提取试剂盒提取总蛋白，按100μL/50mg组织加入对应体积的RIPA裂解液，混匀。充分裂解后，10000-14000g离心3-5分钟，取上清。BCA法测定蛋白浓度后，按总蛋白50μg计算实验组和对照组上样体积，进行SDS-PAGE凝胶电泳和Western blot。一抗和二抗体孵育后进行化学发光成像拍照。

结果如图9所示，rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/3-优化RS1(C组)、rAAV2/4-优化RS1(D组)、rAAV2/5-优化RS1(E组)、rAAV2/6-优化RS1(F组)、rAAV2/7-优化RS1(G组)、rAAV2/8-优化RS1(H组)、rAAV2/9-优化RS1(I组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(J组)的目的蛋白相对表达量均比对照组均有显著提高。其中rAAV2/2-优化RS1(A组)、rAAV2/5-优化RS1(E组)、rAAV2/8-优化RS1(H组)、rAAV2/9-优化RS1(I组)、rAAV2/Rh10-优化RS1(J组)提高的更加显著，提高10倍以上。这表明，AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9和AAV2/Rh10携带RS1基因表达效果更好。

基因治疗在眼部疾病治疗的研究和应用已经越来越深入，由RS1基因突变引起的视网膜劈裂也迎来了最理想的治疗方法。本发明进行了细胞体外实验证明了腺相关病毒可以携带基因进行基因治疗，而优化的RS1序列表达效果更佳，并且因为人眼与兔眼的解剖和体积相似，本发明以兔子眼睛为模型进行rAAV-RS1的玻璃体腔注射。本实验研究注射剂量，安全水平，术后并发症，为未来的临床试验提供重要的参考。所有兔子的裂隙灯，眼压的检查，均无明显异常，无结膜充血、分泌物，无眼内炎，眼压均无升高。术后一个月的眼底照相显示，所有兔子的视网膜血管和视神经均无明显并发症或损害。表明本实验是安全的。

因为RS1基因突变会引起视盘周围的的视网膜出现裂痕，能到达病人眼中病变的区域，免疫荧光、实时定量PCR和Western blot的结果可以证明RS1能稳定地表达于兔子的视网膜上。眼底照相、OCT的结果显示单次玻璃体腔注射腺相关病毒是安全的，并且没有视网膜毒性，能被应用在未来的临床试验。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 武汉纽福斯生物科技有限公司

<120> 视网膜劈裂蛋白的编码序列、其表达载体构建及其应用

<130> P2019-0019

<160> 9

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 675

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atgagccgca agatcgaggg cttcctgctg ctgctgctgt tcggctacga ggccaccctg 60

ggcctgagca gcaccgagga cgagggcgag gacccctggt atcagaaggc ctgcaagtgc 120

gactgccagg gcggccccaa cgccctgtgg agcgccggcg ccaccagcct ggactgcatc 180

cccgagtgcc cctaccacaa gcccctgggc ttcgagagcg gcgaggtgac ccccgaccag 240

atcacctgca gcaaccccga gcagtacgtg ggctggtaca gcagctggac cgccaacaag 300

gcccgcctga acagccaggg cttcggctgc gcctggctga gcaagttcca ggacagcagc 360

cagtggctgc agatcgacct gaaggagatc aaggtgatca gcggcatcct gacccagggc 420

cgctgcgaca tcgacgagtg gatgaccaag tacagcgtgc agtaccgcac cgacgagcgc 480

ctgaactgga tctactacaa ggaccagacc ggcaacaacc gcgtgttcta cggcaacagc 540

gaccgcacca gcaccgtgca gaacctgctg cgccccccca tcatcagccg cttcatccgc 600

ctgatccccc tgggctggca cgtgcgcatc gccatccgca tggagctgct ggagtgcgtg 660

agcaagtgcg cctaa 675

<210> 2

<211> 675

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

atgtcacgca agatagaagg ctttttgtta ttacttctct ttggctatga agccacattg 60

ggattatcgt ctaccgagga tgaaggcgag gacccctggt accaaaaagc atgcaagtgc 120

gattgccaag gaggacccaa tgctctgtgg tctgcaggtg ccacctcctt ggactgtata 180

ccagaatgcc catatcacaa gcctctgggt ttcgagtcag gggaggtcac accggaccag 240

atcacctgct ctaacccgga gcagtatgtg ggctggtatt cttcgtggac tgcaaacaag 300

gcccggctca acagtcaagg ctttgggtgt gcctggctct ccaagttcca ggacagtagc 360

cagtggttac agatagatct gaaggagatc aaagtgattt cagggatcct cacccagggg 420

cgctgtgaca tcgatgagtg gatgaccaag tacagcgtgc agtacaggac cgatgagcgc 480

ctgaactgga tttactacaa ggaccagact ggaaacaacc gggtcttcta tggcaactcg 540

gaccgcacct ccacggttca gaacctgctg cggcccccca tcatctcccg cttcatccgc 600

ctcatcccgc tgggctggca cgtccgcatt gccatccgga tggagctgct ggagtgcgtc 660

agcaagtgtg cctga 675

<210> 3

<211> 224

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 3

Met Ser Arg Lys Ile Glu Gly Phe Leu Leu Leu Leu Leu Phe Gly Tyr

1 5 10 15

Glu Ala Thr Leu Gly Leu Ser Ser Thr Glu Asp Glu Gly Glu Asp Pro

20 25 30

Trp Tyr Gln Lys Ala Cys Lys Cys Asp Cys Gln Gly Gly Pro Asn Ala

35 40 45

Leu Trp Ser Ala Gly Ala Thr Ser Leu Asp Cys Ile Pro Glu Cys Pro

50 55 60

Tyr His Lys Pro Leu Gly Phe Glu Ser Gly Glu Val Thr Pro Asp Gln

65 70 75 80

Ile Thr Cys Ser Asn Pro Glu Gln Tyr Val Gly Trp Tyr Ser Ser Trp

85 90 95

Thr Ala Asn Lys Ala Arg Leu Asn Ser Gln Gly Phe Gly Cys Ala Trp

100 105 110

Leu Ser Lys Phe Gln Asp Ser Ser Gln Trp Leu Gln Ile Asp Leu Lys

115 120 125

Glu Ile Lys Val Ile Ser Gly Ile Leu Thr Gln Gly Arg Cys Asp Ile

130 135 140

Asp Glu Trp Met Thr Lys Tyr Ser Val Gln Tyr Arg Thr Asp Glu Arg

145 150 155 160

Leu Asn Trp Ile Tyr Tyr Lys Asp Gln Thr Gly Asn Asn Arg Val Phe

165 170 175

Tyr Gly Asn Ser Asp Arg Thr Ser Thr Val Gln Asn Leu Leu Arg Pro

180 185 190

Pro Ile Ile Ser Arg Phe Ile Arg Leu Ile Pro Leu Gly Trp His Val

195 200 205

Arg Ile Ala Ile Arg Met Glu Leu Leu Glu Cys Val Ser Lys Cys Ala

210 215 220

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

cgagttgcca tagaagaccc 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 5

caagttccag gacagtagcc 20

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

gatgaagcgg ctgatgatgg 20

<210> 7

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

atcgacgagt ggatgaccaa gt 22

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 8

ctccatcctg gcctcgctgt 20

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

gctgtcacct tcaccgttcc 20

Claims (10)

1.一种核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列编码视网膜劈裂蛋白，且所述核苷酸序列选自下组：

(a)所述核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示；

(b)所述核苷酸序列与SEQ ID NO.:1所示的核苷酸序列有≥95％相同性，优选地≥98％，更优选地≥99％；

(c)与(a)或(b)所述的核苷酸序列互补的核苷酸序列；或

(d)上述(a)-(c)中所述的核苷酸序列的任意组合。

2.一种融合核酸，其特征在于，所述融合核酸包含如权利要求1所述的核苷酸序列。

3.一种载体，其特征在于，所述载体含有如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。

4.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体为腺相关病毒载体。

5.如权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体选自下组的腺相关病毒载体：AAV2/2、AAV2/5、AAV2/8、AAV2/9、AAV2/Rh10、或其组合。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3所述的载体，或其染色体中整合有外源的如权利要求1所述的核苷酸序列或权利要求2所述的融合核酸。

7.如权利要求3所述的载体的用途，其特征在于，用于制备一制剂或组合物，所述制剂或组合物用于恢复受试者视力、和/或治疗或预防眼部疾病。

8.如权利要求7所述的载体的用途，其特征在于，所述眼部疾病为视网膜劈裂症。

9.一种药物制剂，其特征在于，所述的制剂含有(a)权利要求3所述的载体，以及(b)药学上可接受的载体或赋形剂。

10.一种载体，其特征在于，所述载体含有编码RS1蛋白的核酸序列。

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