CN117683779B - 视网膜劈裂症相关的基因突变体及其应用 - Google Patents

视网膜劈裂症相关的基因突变体及其应用 Download PDF

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本发明属于生物技术领域，特别涉及视网膜劈裂症相关的基因突变体及其应用。本发明RSI基因突变体的序列如SEQ ID NO：1所示，与野生型RS1基因相比，具有如下突变：NM_000330.4 c.157_159位碱基由GGT突变成A。本发明提供了一种视网膜劈裂症相关的基因突变体，为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究了该突变基因的应用。确定了本发明涉及的突变与视网膜劈裂症的联系，并据此为视网膜劈裂症的诊疗提供新的方案，尤其是为视网膜劈裂症提供了诊断治疗的手段。

Description

视网膜劈裂症相关的基因突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，特别涉及视网膜劈裂症相关的基因突变体及其应用。
背景技术
视网膜劈裂症是一种X染色体连锁遗传的视网膜营养不良疾病，是造成男性青少年黄斑变性的主要原因，预估的发病率在1/5000到125000之间。该疾病通常由于神经性视网膜劈裂（裂开）导致受影响的男性视力下降，其他表现包括视网膜变性、视网膜内层分裂、视网膜电图显示b波减少等。一般情况下，女性携带者无症状，但也有受影响个体的报道，而青少年型则在10岁内表现出对称性双侧黄斑病变。视网膜劈裂症的致病基因是视网膜劈裂蛋白（Retinoschisin，RS1），已被定位于染色体Xp22.13，是一个编码224个氨基酸的蛋白质，该蛋白对于保持视网膜的完整性和光感受器-双极突触的功能至关重要。在临床患者的基因检测中，虽然已发现一些与视网膜劈裂症相关的RS1致病位点，但仍存在相当一部分未知的致病位点。因此，目前对视网膜劈裂症的研究还有待进一步的深入。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种视网膜劈裂症相关的基因突变体。所述基因突变体具体为RSI基因上的突变。
本申请通过高通量全外显子组测序联合候选突变位点的Sanger验证的方案，对视网膜劈裂症患者进行了深入的研究，发现了X染色体上RS1基因的一种新的突变类型，即RS1基因NM_000330.4转录本的编码区发生c.197_199delinsA（p.G53Sfs*32）的突变。
本发明的另一目的在于提供上述视网膜劈裂症相关的基因突变的应用。
本发明的目的通过下述方案实现：
根据本发明的第一方面，本发明提出了一种分离的编码RSI基因突变体的核酸，序列如SEQ ID NO：1所示，与野生型RS1基因相比，具有如下突变：NM_000330.4 c.197_199位碱基由GGT突变成A。即相对于野生型RS1基因，本发明的RS1基因的NM_000330.4 c.197_199位碱基发生了突变，由GGT突变成A。
进一步的，所述核酸的类型包括DNA、RNA或cDNA，核酸的类型不做具体的限定，只要其与野生型RSI基因相比具有特定的突变，则应当认定其为本范围内的核酸。
本发明提供了一种RSI基因的新突变体，该突变体与视网膜劈裂症密切相关，从而通过检测该新突变体在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否易患视网膜劈裂症。
根据本发明的第二个方面，本发明提出了一种分离的多肽，该多肽序列如SEQ IDNO：2所示，与野生型RSI基因编码的蛋白相比，具有如下突变：第53位氨基酸发生了突变，由Gly突变为Ser，且其长度由224aa缩短为83aa。突变型RSI基因编码的产物与野生型蛋白（或多肽，两者等同。后续解释相同）相比，第53位氨基酸发生突变，具体为第53位氨基酸由甘氨酸（Gly，G）突变为丝氨酸（Ser，S），同时提前出现终止密码子导致蛋白多肽链合成提前终止，原有的全长224个氨基酸也缩短为83个氨基酸。通过检测生物样品中是否表达该多肽，可以有效地检测生物样品是否易患视网膜劈裂症。本发明上述多肽是由上述核酸编码的。
根据本发明的第三个方面，本发明还提出了一种生物模型在筛选药物中的应用，所述生物模型至少携带上述的分离的编码RSI基因突变体的核酸和分离的多肽的至少任一。
所述的生物模型的一种形式为细胞模型。该细胞模型的一种应用方式为进行规模化的药物筛选，可以通过药物对细胞模型进行作用，验证该药物是否具有抑制相应突变的作用，并可据此进一步验证该药物是否可以通过抑制突变实现治疗相应的疾病，比如通过该细胞模型即可实现模拟视网膜劈裂症的疾病环境、然后进一步通过该模型实现体外验证部分药物的作用。在本条中，主要考虑的筛选因素是针对相应的突变，暂不具体限定药物的具体治疗对象，该种应用方式主要在药物研发过程中进行使用。其中，所述药物为治疗视网膜劈裂症的药物；视网膜劈裂症主要是由前述突变导致。由此，通过本生物模型实现了对一些作用效果未知的物质进行筛查，方便进一步研究该物质是否具有用于治疗视网膜劈裂症的预期。
根据本发明的第四个方面，本发明还提出了检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中的应用。所述的试剂盒或设备用于筛查或诊断视网膜劈裂症。其中，所述的核酸为上述的分离的编码RSI基因突变体的核酸，所述的多肽为上述的分离的多肽。
筛查视网膜劈裂症主要是患病风险排查，便于提前干预；诊断则是对于已经患病的人员进行辅助诊断，当然是否已经患病是以患者机体实际变化、相应的标准规范为依据，不以人的主观认知干预。
所述试剂包括特异性针对所述核酸和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。具体为试剂包括特异性检测核酸的产品，还包括特异性检测多肽的产品，该产品至少可为抗体、探针、引物以及质谱检测试剂中任一，同时还可为其他具有相似功能的试剂。另外，试剂盒的形式可为一些与现有产品类似的试剂盒，设备则可为一些序列检测设备。引物和探针均可选择其中任一，也可根据需要进行组合使用。
更为具体的，所述引物至少包括具有序列如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列的引物对。
根据本发明的第五个方面，本发明还提出了一种筛选视网膜劈裂症生物样品的试剂盒，包含有能检测RSI基因突变体的试剂；
所述RSI基因突变体，与野生型RS1基因相比，具有如下突变：NM_000330.4 c.197_199位碱基由GGT突变成A；或与野生型RSl基因编码的蛋白相比，具有如下突变：第53位氨基酸发生了突变，由Gly突变为Ser，且其长度由224aa缩短为83aa。在该种情况下，只要相应的产品应用到了能够检测前述两种RS1基因突变体中任一的试剂时，均应当视为应用了本发明的技术。
所述试剂包括核酸探针或引物。所述引物至少包括具有序列如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列的引物对。
根据本发明的第六个方面，本发明还提出了特异性改变核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗视网膜劈裂症；其中，所述核酸与野生型RSl基因相比，具有如下突变：NM_000330.4 c.197_199位碱基由GGT突变成A；所述试剂至少为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、锌指核酸酶中之一的试剂。
所述试剂至少为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPRCpf1、锌指核酸酶中之一的试剂，当然还可基于其他具有相似功能的物质。如CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，RISPR-Cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于CRISPR-Cas9的方法，可以设计出sgRNA并合成该序列的gRNA，然后将gRNA与dCas9在细胞中共表达，通过gRNA介导dCas9蛋白与目标DNA区域结合，进而实现特定位点的修复或改变，恢复蛋白功能，相应的编辑技术均已是常规现有技术，在此不做赘述，当然所有项目的实施都必须依法施行。在本条中，主要修复的特定位点就是RSl基因的NM_000330.4 c.157_159位碱基由GGT突变成A的突变位点。
试剂盒也应当做宽泛的解释，还包括一些检测试纸、设备等。
根据本发明的第七个方面，本发明还提出了一种构建体。该构建体包含前面所述的分离的编码RSI基因突变体的核酸。需要说明的是，“构建体包含前面所述的分离的编码RSI基因突变体的核酸”表示，本发明的构建体包含有，核酸序列如SEQ ID NO：1所示，与野生型RS1基因相比，具有如下突变：NM_000330.4 c.157_159位碱基由GGT突变成A。构建体同样可以在制药过程中作为药物作用效果的检验模型。由此，利用本发明的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作视网膜劈裂症相关研究的模型。
根据本发明的第八个方面，本发明还提出了一种重组细胞。所述重组细胞是通过前述的构建体转化受体细胞而获得的。根据本发明的实施例，本发明的重组细胞能够有效地用作视网膜劈裂症相关研究的细胞模型，用于科学研究或商业化药物研究，如药物筛选或RSl基因的致病机理研究。
对于本发明中所述核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本发明中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及SEQ ID NO:1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：
本发明提供了一种用于诊断视网膜劈裂症的基因突变体，为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究了该突变基因的应用。确定了本发明涉及的突变与视网膜劈裂症的联系，并据此为视网膜劈裂症的诊疗提供新的方案，尤其是为视网膜劈裂症提供了诊断治疗的手段。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为视网膜劈裂症患者家系图谱。
图2-图7为视网膜劈裂症患者家系成员的RSl基因NM_000330.4 c.157_159位碱基突变位点的Sanger法测序结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下列实施例中涉及的物料若无特殊说明均可从商业渠道获得。所述方法若无特别说明均为常规方法。
实施例1：确定视网膜劈裂症的致病基因及突变位点
1. 样本收集
收集到一个三代的视网膜劈裂症的患者家系，其家系图如图1所示，其中□表示正常男性，○表示正常女性，☉表示携带者的女性，■表示男性患者；Ⅰ表示第一代，Ⅱ表示第二代，Ⅲ表示第三代；Ⅲ-1、Ⅲ-2分别表示第三代的两位成员，Ⅲ-1为16岁的哥哥，自幼视力差，双眼眼球震颤，OCT结果显示双侧黄斑区视网膜劈裂，Ⅲ-2为8岁的弟弟，发现视力差3年，OCT结果也显示双侧黄斑区视网膜劈裂；两位患者的父亲Ⅱ-1表型正常，母亲Ⅱ-2为后天性近视；两位患者的外公Ⅰ-1早年确诊视网膜劈裂，外婆Ⅰ-2表型正常；
DNA提取：
本例采集了视网膜劈裂症家系中所有六名成员的外周血，分别对六个样本的外周血进行DNA提取。使用磁珠法血液DNA快提试剂盒提取样本DNA，并使用NanoDrop测量提取的DNA的浓度和纯度。在纯度方面，要求OD260/OD280比值在1.8-2.0之间，OD260/OD230比值在1.8-2.2之间，若超出上述范围，则认为提取的DNA纯度不符合要求，需重新提取或再纯化；在浓度方面，需保证高于25ng/μL，总量不少于2000ng，即能够满足后续研究的需求。提取的DNA样品常规存储于-20℃备用，长期保存存储于-80℃。
2. 全外显子建库、捕获与测序
将提取的DNA用Q800R超声波破碎仪打断，保证每例样本的片段长度500bp以下，峰值在350bp左右。向每例DNA样本中加入末端修复反应混合物，进行末端修复并纯化（诺唯赞，NDM627-01）。向纯化后的产物中加入加A反应混合物反应液，进行加A并纯化（诺唯赞，NDM627-01）。向纯化后的产物中加入加接头反应混合物，进行加接头并纯化（诺唯赞，NDM627-01）。取加接头的DNA片段样本配置捕获前LM-PCR体系并扩增（反应体系包括25µL 2×KAPA HiFi Hot Start Ready Mix、2.5µL浓度为5µM的Pre-LM-PCR Oligos 1和2、20µL加接头的DNA片段样本；反应条件为98℃，45秒；98℃，15秒，60℃，30秒，72℃，30秒，共9个循环；72℃，1分钟），扩增后获得捕获前LM-PCR文库产物。将待测序的4-12个文库样本混合，使用全外显子捕获探针（纳昂达NEXome Core Panel，货号#1001851）进行杂交富集，将杂交富集后的产物作为模板，进行捕获后的LM-PCR扩增（反应体系包括25µL KAPA HiFi HotStart Ready Mix、2.5µL浓度为5µM的Post-captureLM-PCR Oligos 1和2、 20µL磁珠捕获的DNA样本；反应条件为98℃，45秒；98℃，15秒，60℃，30秒，72℃，30秒，共14个循环；72℃，1分钟）。扩增的文库检测合格后，使用MGISEQ-2000测序平台进行2*150bp的读长测序，获得原始测序数据。
3. 文库比对、变异检测与注释
获得原始测序数据后，首先对数据进行质量控制，删除接头序列、低质量序列和N碱基。将剩余的序列使用BWA（Burrows Wheeler Aligner）比对到UCSC人类参考基因组hg19上，使用GATK（Genome Analysis ToolKit）将比对上的序列进行变异的识别分析。将识别出来的变异与gnomAD、ClinVar、VarCard、HGMD、PubMed等数据库进行注释，过滤掉已知的且在数据库中等位基因人群频率高于0.005，或已被注释为良性变异等相关的位点，再对剩余的非同义突变、剪接受体/供体位点突变、编码区插入和缺失突变这三类最有可能与疾病相关的突变进行分析。
对过滤后的变异进行家系分析，发现三名患者在X染色体的RS1基因中均存在NM_000330.4 c.157_159delinsA(p.G53Sfs*32)的突变，该突变遗传至无症状的母亲，同时表型正常的父亲未发现该突变，符合家系共分离。
对该移码突变进行极强致病性等级证据（Very strong evidence ofpathogenicity，PVS1）（https://autopvs1.bgi.com/）分析。PVS1的评估结果为VeryStrong，同时基因与疾病的关联为明确（Definitive），同时单倍剂量不足（Haploinsufficiency）评分为3分，因此可使用该极强致病性等级证据。
该变异在现有人群数据库和公开文献中均尚未报道，根据其人群频率、序列信息、PVS1算法预测、家系分析和患者临床症状，参考美国医学遗传学与基因组学学会（AmericanCollege of Medical Genetics and Genomics，ACMG）的遗传变异分类标准与指南，该变异评级表明RS1基因的NM_000330.4 c.157_159delinsA(p.G53Sfs*32)突变是该视网膜劈裂症家系的致病突变位点。即确认出一种与视网膜劈裂症相关的新的基因突变位点，根据测序结果，该突变基因的mRNA CDS序列为SEQ ID NO.1所示序列，其第157-159位碱基由野生型的GGT突变为A（ACC突变成T的反向互补序列），发生移码突变，使得编码的多肽第53位由野生型的Gly突变为Ser，同时因为该移码突变导致提前出现终止密码子，原有的全长224个氨基酸也缩短为83个氨基酸，即该移码突变得到的SEQ ID NO.1所示序列的基因翻译得到了一条新的短的氨基酸多肽，该多肽如SEQ ID NO.2所示序列。
SEQ ID NO.1：
5-’ATGTCACGCAAGATAGAAGGCTTTTTGTTATTACTTCTCTTTGGCTATGAAGCCACATTGGGATTATCGTCTACCGAGGATGAAGGCGAGGACCCCTGGTACCAAAAAGCATGCAAGTGCGATTGCCAAGGAGGACCCAATGCTCTGTGGTCTGCAAGCCACCTCCTTGGACTGTATACCAGAATGCCCATATCACAAGCCTCTGGGTTTCGAGTCAGGGGAGGTCACACCGGACCAGATCACCTGCTCTAACCCGGAGCAGTATGTGGGCTGGTATTCTTCGTGGACTGCAAACAAGGCCCGGCTCAACAGTCAAGGCTTTGGGTGTGCCTGGCTCTCCAAGTTCCAGGACAGTAGCCAGTGGTTACAGATAGATCTGAAGGAGATCAAAGTGATTTCAGGGATCCTCACCCAGGGGCGCTGTGACATCGATGAGTGGATGACCAAGTACAGCGTGCAGTACAGGACCGATGAGCGCCTGAACTGGATTTACTACAAGGACCAGACTGGAAACAACCGGGTCTTCTATGGCAACTCGGACCGCACCTCCACGGTTCAGAACCTGCTGCGGCCCCCCATCATCTCCCGCTTCATCCGCCTCATCCCGCTGGGCTGGCACGTCCGCATTGCCATCCGGATGGAGCTGCTGGAGTGCGTCAGCAAGTGTGCCTGATGCCTGCCTCAGCTCGGCGCCTGCCAGGGGGTGACTGGCACAGAGCGGGCCGTAGGGGACCCCCTCACACACCACCGAGATGGACAGGGCTATATTTCGCAAAGCAATTGTAACTGCAGTGCTGGGTAGATAATTTTTTTTTTTTTAAGATATAGCTTTCTGATTTCAATGAAATAAAAATGAACTTATTCCCCACTCAGGGCCAGAGAAAGTCAGAACAAAGAAAATGTCCCCGAAACGAATTTTCTTACAAAAGCCTAAGTAGCAGGGGTAATTTTCTGCTCATTTTTTGTCTCAGTGATACTGTGAAAGGTGCAGTCTCAGGGGAACACAAAGCAGCCCTGATAATTTGAAAATTCATTTGCTTTACCACATTCAAGACAGAAACATACAGTTTCCTAAAGCCTGGCTTTGAATGCAGAAGGGAGCAGCTCCTCCTAGTTAAGTTTCCACTAAATCATCGCCAAAGAGGACTTCAGAGCCCTGGGGAGGCAGCTGAGGGTCTCAAGGGTGACTGGGTGGCAGGGATGAGTGCGGTGGGTGAGAATCCCGGTGCCCTGAGAGGCTATACGTGACAAATGACCAAAAGCCCAAGGTAGGGGAGTTTCCTCTGCTCACAGTTCTTACCTTCAAGGCGGATCTGGGCTTCCACCCTCATGAACACAGGGATTGGGGAGGGACCAGAGCGCCCAATACACACAGCTCCATTATGCAATCCATTCCAGCAAATTCCCCGTGTCTGTGGTCACCATTTAGGTGATCATACAGGACAGGCTGCACATCTCAGTATATGTAGGGACCCCAAATGACCACAACACAGTACAATTGCCCTTTACCTAGGGCTACCATTTCCTAGCAAACCAAACATAGTTCGAGAACAGCTGGCCCAGGAGCTACCACTGGCTACTCAGAGGAGGCTCATTAGCTGGCTACATGCTTCGCAGGAAGTGGGAAGGACTCACATCATAAAAAGGACCATGTAGCTTTTTCCCTGAAAGCTTCTCACCCTCCACCCTCTGCCTTGCAATACGCAAACTGCGCCTGCTCCTGAAAAGCTCTCTGGGAAGGAATGGGCCTGGCTTTCCGTTCCTGGAGGCGGCGCCTTAGATTGGGAGGCCTCATTGGCCACTTAGAGCGCAGCCTGAGTTTCCAGGCCCCTTCCTGGGAGAGGCTGTTAACACGGGGGAGGGGCAGGAGAGGGATATGGAGAGCAGGTGGTGGAATCAGAGGACGAGGCTGCTCTAAAGACTGTTCTGGCCCCAGACACAGGGTAGTCTTTGCTAGCAGCTCATTTCCGAGTTACTTTTCATTTTCAAATGCCAAGGCAAGTGACTAGACTCGCGCTAATACAGTGCTGGACAACACATTCACCTTTTCTGTGAACAGGCAGCCTTCTAAAAGCCCCAAACATCCTTCTTGATGCTTTGGGGGCTCAATTATTTTATATCCAACCCAGCATCTTTCTAGTCCCTATGCTGTATGCTTGAACTTCGGAAAATGCTTTTCCCCGCCCAATCTTCTCTCAAATATAAACACATCACACAGGGTGTTGGGGGTGGGGGGGGGGGGTGGGGGGACTTATCCCTGGCCTTAGGACACAGGACAAATCTATTTTGGATAGAAATGCCTGAACAGAGACCCTTATTTGGAAAGGTGAATTAACTTTGGTCACGACATGGACTGTCAGACAAAATGGCAGTATCCTAAGAGTTAAGGCACATCAAACACAGGAGTCGAGAGAGTGCAGTTCAGGGAAAAAGGAGAGGAGGAAACAGTGAGGCAGGGAGAAAGGCTTTCCAAATAAGAGTTCATGTTGGAAACTTTTGTCACGGCTTTATTGAGATTAAGTTCACATACAATTTGTATCCATTTAAAGTGTACAATTTGATGACTTTTGGTATATTCAGAGTTGTGCAACCATTATCACTAGATCAATTTTAGAAAGTTTATCACCCCAAAGAGAAATCCTGCACCCATCAGCCAACACTCCCCAACCCATCGGCCACCCCAAGCCCTCTGCAACCACGAATCGACTGTCTCTGTAGATTGGCCTTCTGGACGTTCTACATAAATGAAATCATATAGTATGTGGTATTTCGTGACTGGCTTCTTTCACTTAGCATAGTGTTTTAAAGTTCATCCACGTTATAACATGTGTATCACTATGTCACTTGTCACTCCTTTTTATTGCTGAACATCATTGTTCAGTATCATGTCAAGAGCACATTGTTATTTATCCATTCATCCATTGATGGATATTTGGGTTTCCACTCTTTAGCTATTATGAATAATGCTGCTATGAACATTTGTGTATAA-3’
本发明提供的具有SEQ ID NO.1所示序列的核酸，与野生型RS1基因相比，RS1基因转录本NM_000330.4 c.157_159位碱基突变成了A，而野生型RS1基因的碱基为GGT。
SEQ ID NO.2:
MSRKIEGFLLLLLFGYEATLGLSSTEDEGEDPWYQKACKCDCQGGPNALWSASHLLGLYTRMPISQASGFRVRGGHTGPDHLL
本发明提供的具有SEQ ID NO.2所示序列的多肽，与野生型RS1基因编码的蛋白相比，具有如下突变：第53位氨基酸发生了突变，由G（甘氨酸Gly，G）突变为S（丝氨酸Ser，S）。其后续所有的氨基酸序列均发生改变，同时其长度也由原有的224个氨基酸缩短为83个氨基酸。
同时，本发明对RS1基因该位点的保守性进行了分析。基因或位点高度保守，说明其在不同物种中的变化很小，一般预示着其具有重要的功能，或在个体的生长发育过程中发挥着重要作用，其突变极有可能导致个体的异常，该位点也不会在种群内部扩散。本案选取了9种动物的RS1基因进行分析，分别包括鸡(Gallus gallus)、马(Equus caballus)、人类(Homo sapiens)、恒河猴(Macaca mulatta)、小鼠(Mus musculus)、大鼠(Rattusnorvegicus)、狗(Canis lupus familiaris)、猪(Sus scrofa)和牛(Bos taurus)。根据NCBI数据库下载这9种动物的RS1氨基酸序列，使用CLUSTALO（https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/）进行比对。结果显示，该位点除了在狗(Canis lupus familiaris)中为组氨酸（His，缩写为H）外，在其他8种动物中均为甘氨酸G，表明该位点高度保守。这些数据表明，RS1基因转录本NM_000330.4上的c.157_159delinsA(p.G53Sfs*32)突变很可能是视网膜劈裂症患者的致病位点。
实施例2：Sanger法测序验证
本例采用Sanger法测序验证所获得的基因突变。具体的，针对RS1基因转录本NM_000330.4 c.157_159delinsA突变序列设计引物，然后通过PCR扩增、产物纯化和Sanger测序，对视网膜劈裂症家系所有六名成员的RS1基因进行检测；根据序列测定结果判断属于突变型还是野生型，结合其本身的患病情况，验证RS1基因转录本NM_000330.4的c.157_159delinsA突变与视网膜劈裂症疾病之间的相关性。
具体方法步骤如下：
1. DNA提取：按照实施例1的提取DNA的方法，提取四名家系成员外周血中的基因组DNA，以备检测。
2. 引物设计及PCR反应
参考人类基因组序列数据库hg19/GRCh37，设计RS1基因3号外显子的特异性引物，扩增区域长度为541bp，具体如下表所示，使用该引物对分别对6名家系成员的基因组DNA进行PCR扩增。
引物序列：
PCR扩增体系如下：
PCR反应程序如下：
3. Sanger测序
对步骤2获得的PCR扩增产物进行Sanger测序。Sanger测序结果显示，I-1、Ⅲ-1和Ⅲ-2的RS1基因NM_000330.4 c.157_159位碱基均为T（箭头所示区域），如图2、图3和图4，为突变型，根据测序结果判断为视网膜劈裂症患者，均与其临床症状相符；Ⅱ-2的RS1基因NM_000330.4 c.157_159位碱基为T和ACC的杂合体，如图5所示，为女性携带者，根据测序结果判断为正常，该结果与其临床表型一致；I-2、Ⅱ-1的RS1基因NM_000330.4 c.157_159位碱基为ACC（图7）或其反向互补序列GGT（图6），为野生型，根据测序结果判断为正常，该结果与其临床表型一致。即三位视网膜劈裂症患者都有检出RS1基因NM_000330.4 c.157_159delinsA的突变，该突变存在于表型正常的携带者的II-2，而表型正常的I-2、II-1未检出该突变；可见患者在X染色体上RS1基因NM_000330.4的c.157_159delinsA变异属于XL遗传。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种用于筛查或诊断视网膜劈裂症的编码RS1基因突变体的核酸，其特征在于，序列如SEQ ID NO：1所示；所述如SEQ ID NO：1所示的序列与野生型RS1基因相比，具有如下突变：NM_000330.4 c.157_159位碱基由GGT突变成A。
2.检测RS1基因突变体的试剂在制备试剂盒中的应用，其特征在于所述的试剂盒用于筛查或诊断视网膜劈裂症；所述RS1基因突变体如SEQ ID NO：1所示。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述试剂包括特异性针对所述RS1基因突变体的引物，其中，所述引物至少包括具有序列如SEQ ID NO：3-4所示的核苷酸序列的引物对。
CN202410110813.XA 2024-01-26 2024-01-26 视网膜劈裂症相关的基因突变体及其应用 Active CN117683779B (zh)

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