CN116286895B - Ror2突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因技术领域，尤其涉及ROR2的突变体及其应用。核酸，与序列为SEQ ID NO：1的野生型ROR2基因相比，具有c.2257delT突变。多肽，与序列为SEQ ID NO：2的野生型ROR2蛋白多肽相比，多肽具有p.Ser753ProfsTer21突变。检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中应用，试剂盒或设备用于筛查或诊断先天性短指/趾。特异性改变核酸的试剂在制备药物中的用途，药物用于治疗先天性短指/趾；核酸与野生型ROR2基因相比，具有c.2257delT突变。本发明为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究确认了该突变基因的在先天性短指/趾中新用途。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及ROR2突变体及其应用。
背景技术
先天性短指/趾(brachydactyly，BD)畸形是指(趾)骨和(或)掌(跖)骨发育不良导致指(趾)短小、缺失或融合，是一种家族遗传性疾病。短指(趾)畸形也可伴有其他手/足部畸形，如并指(趾)畸形、多指(趾)畸形、缩小畸形。与所有先天性畸形一样，短指畸形可以单独出现或作为复杂畸形综合征的一部分出现。短指畸形可分为5种类型(A～E型)，相同类型的短指表型差异可能很大。B型短指畸形(brachydactyly type B,BDB)是短指畸形中最严重的一种，可分为B1(MIM 113000)和B2(MIM 611377)2个亚型。B1型短指畸形(brachydactyly type B1,BDB1)主要临床特征包括食指到小指末梢发育不全，伴有指甲部分或完全缺失，拇指受累少，偶可见拇指/趾宽大畸形，脚也受到类似影响，但程度较轻，严重程度因人而异。
ROR2基因(OMIM 602337)编码受体酪氨酸激酶样孤儿受体2，致病性突变可导致常染色体隐性遗传Robinow综合征(OMIM 268310)或常染色体显性遗传B1型短指/趾畸型(BDB1，OMIM 113000)。PubMed数据库文献报道，目前发现的BDB1致病突变多位于ROR2的8、9号外显子上，且多为无义突变或移码突变，导致ROR2蛋白胞内区TK附近的结构域缺失。BDB1主要临床特征包括：食指到小指末梢发育不全，伴有指甲部分或完全缺失，拇指受累少，偶可见拇指/趾宽大畸形，脚也受到类似影响，但程度较轻，严重程度因人而异。
目前对于先天性短指/趾的研究还有待进一步补充完善，尤其是引起先天性短指/趾的ROR2基因突变还有很多未被发现。因此，研究人员通过对不同病例的情况进行研究，发现一些新的突变位点，并未研究这些位点的致病性，同时也在相应突变位点的基础上研究疾病的可治性。
发明内容
针对上述问题，本发明提供ROR2突变体及其应用，主要为了填补部分对ROR2基因研究的空白，同时对ROR2基因突变体的致病性尚不明确等问题。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面涉及核酸，包括含下列目标片段，
所述目标片段与序列为SEQ ID NO：1的野生型ROR2基因相比，具有c.2257delT突变。
在前述基础上，所述核酸的类型包括DNA、RNA或cDNA，核酸的类型不做具体的限定，只要其与野生型ROR2基因相比具有特定的突变，则应当认定其为本条范围内的核酸。
本发明第二方面涉及多肽，与序列为SEQ ID NO：2的野生型ROR2相比，所述多肽具有p.Ser753ProfsTer21突变。
本发明第三方面涉及生物模型在筛选药物中的应用，其特征在于，所述生物模型至少携带下列之一：
a.核酸，与序列为SEQ ID NO：1的野生型ROR2基因相比，具有c.2257delT突变，
b.多肽，与序列为SEQ ID NO：2的野生型ROR2相比，所述多肽具有p.Ser753ProfsTer21突变。
所述生物模型一种形式为细胞模型。该细胞模型的一种应用方式为进行规模化的药物筛选，可以通过药物对细胞模型进行作用，验证该药物是否具有抑制相应突变的作用，并可据此进一步验证该药物是否可以通过抑制突变实现治疗相应的疾病，比如通过该细胞模型即可实现模拟先天性短指/趾的疾病环境、然后进一步通过该模型实现体外验证部分药物的作用。在本条中，主要考虑的筛选因素是针对相应的突变，暂不具体限定药物的具体治疗对象，该种应用方式主要在药物研发过程中进行使用。其中，所述药物为治疗先天性短指/趾的药物；先天性短指/趾主要是由前述突变导致。更具体的，所述药物为治疗先天性短指/趾B1型的药物。由此，通过本生物模型实现了对一些作用效果未知的物质进行筛查，方便进一步研究该物质是否具有用于治疗先天性短指/趾的预期。
本发明第四方面涉及检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中应用，所述试剂盒或设备用于筛查或诊断先天性短指/趾；其中，
所述核酸与野生型ROR2基因相比，具有c.2257delT突变；所述多肽与野生型ROR2蛋白相比，具有p.Ser753ProfsTer21突变。筛查先天性短指/趾主要是患病风险排查，便于提前干预；诊断则是对于已经患病的人员进行辅助诊断，当然是否已经患病是以患者机体实际变化为准，不以人的主观认知干预。
所述试剂包括特异性针对所述核酸和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。具体为试剂包括特异性检测核酸的产品，还包括特异性检测多肽的产品，该产品至少可为抗体、探针、引物以及质谱检测试剂中任一，同时还可为其他具有相似功能的试剂。另外，试剂盒的形式可为一些与现有产品类似的试剂盒，设备则可为一些序列检测设备。引物和探针均可选择其中任一，也可根据需要进行组合使用。
更为具体的，所述引物包括序列如下的引物对：
正向引物：5'TGATCGAGTGCTGGAACGAG3'，
反向引物：5'CTCCTCCTCCTCTGCTTCCT3'；
所述探针为GGGCAACCTTTCCAACTACAA；
优选的，所述先天性短指/趾为先天性短指/趾B1型。制备所得的相应检测产品不仅可以用于筛查和诊断先天性短指/趾，同时可以更为精准的筛查易感先天性短指/趾B1型人群，还可对先天性短指/趾B1型患者进行诊断，相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，同时前述探针、引物在进行相应检测过程中具有更好的效果。
本发明第五方面涉及筛选先天性短指/趾生物样品的试剂盒，包含有能检测ROR2基因突变体的试剂；
与序列为SEQ ID NO：1的野生型ROR2基因相比，所述ROR2基因突变体具有c.2257delT突变，或与序列为SEQ ID NO：2的野生型ROR2相比，所述ROR2基因突变体具有具有p.Ser753ProfsTer21突变。在该种情况下，只要相应的产品应用到了能够检测前述两种ROR2突变体中任一的试剂时，均应当视为应用了本发明的技术。
所述试剂为核酸探针或引物。所述引物包括序列如下的引物对：
正向引物：5'TGATCGAGTGCTGGAACGAG3'，
反向引物：5'CTCCTCCTCCTCTGCTTCCT3'；
所述探针为GGGCAACCTTTCCAACTACAA；
优选的，先天性短指/趾生物样品为先天性短指/趾B1型样品；该种样品的主要来源为疑似患者，比如患者的外周血、皮肤、皮下组织等。相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，可以更快速的“无创”检查。
本发明第六方面涉及特异性改变核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗先天性短指/趾；其中，所述核酸与野生型ROR2基因相比，具有c.2257delT突变；所述试剂至少为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、锌指核酸酶中之一的试剂。
所述试剂至少为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、锌指核酸酶中之一的试剂，当然还可基于其他具有相似功能的物质。如CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，RISPR-Cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于CRISPR-Cas9的方法，可以设计出sgRNA并合成该序列的gRNA，然后将gRNA与dCas9在细胞中共表达，通过gRNA介导dCas9蛋白与目标DNA区域结合，进而实现特定位点的修复或改变，恢复蛋白功能，相应的编辑技术均已是常规现有技术，在此不做赘述，当然所有项目的实施都必须依法施行。在本条中，主要修复的特定位点就是ROR2基因的c.2257delT的突变位点。优选的，所述先天性短指/趾为先天性短指/趾B1型，通过针对性进行用药，使得相应的致病基因修复，实现疾病的预防和治疗。试剂盒也应当做宽泛的解释，还包括一些检测试纸、设备等。
本发明第七方面涉及构建体，包含有核酸，该核酸包括含下列目标片段，所述目标片段与序列为SEQ ID NO：1的野生型ROR2基因相比，具有c.2257delT突变。构建体同样可以在制药过程中作为药物作用效果的检验模型。
本发明第八方面涉及重组细胞，所述重组蛋白是通过前述的构建体转化受体细胞获得。
>NC_000009.11:94487519-94485519 Homo sapiens chromosome 9,GRCh37.p13Primary Assembly Nucleotide Sequence(2832nt):
ATGGCCCGGGGCTCGGCGCTCCCGCGGCGGCCGCTGCTGTGCATCCCGGCCGTCTGGGCGGCCGCCGCGCTTCTGCTCTCAGTGTCCCGGACTTCAGGTGAAGTGGAGGTTCTGGATCCGAACGACCCTTTAGGACCCCTTGATGGGCAGGACGGCCCGATTCCAACTCTGAAAGGTTACTTTCTGAATTTTCTGGAGCCAGTAAACAATATCACCATTGTCCAAGGCCAGACGGCAATTCTGCACTGCAAGGTGGCAGGAAACCCACCCCCTAACGTGCGGTGGCTAAAGAATGATGCCCCGGTGGTGCAGGAGCCGCGGCGGATCATCATCCGGAAGACAGAATATGGTTCACGACTGCGAATCCAGGACCTGGACACGACAGACACTGGCTACTACCAGTGCGTGGCCACCAACGGGATGAAGACCATTACCGCCACTGGCGTCCTGTTTGTGCGGCTGGGTCCAACGCACAGCCCAAATCATAACTTTCAGGATGATTACCACGAGGATGGGTTCTGCCAGCCTTACCGGGGAATTGCCTGTGCACGCTTCATTGGCAACCGGACCATTTATGTGGACTCGCTTCAGATGCAGGGGGAGATTGAAAACCGAATCACAGCGGCCTTCACCATGATCGGCACGTCTACGCACCTGTCGGACCAGTGCTCACAGTTCGCCATCCCATCCTTCTGCCACTTCGTGTTTCCTCTGTGCGACGCGCGCTCCCGGACACCCAAGCCGCGTGAGCTGTGCCGCGACGAGTGCGAGGTGCTGGAGAGCGACCTGTGCCGCCAGGAGTACACCATCGCCCGCTCCAACCCGCTCATCCTCATGCGGCTTCAGCTGCCCAAGTGTGAGGCGCTGCCCATGCCTGAGAGCCCCGACGCTGCCAACTGCATGCGCATTGGCATCCCAGCCGAGAGGCTGGGCCGCTACCATCAGTGCTATAACGGCTCAGGCATGGATTACAGAGGAACGGCAAGCACCACCAAGTCAGGCCACCAGTGCCAGCCGTGGGCCCTGCAGCACCCCCACAGCCACCACCTGTCCAGCACAGACTTCCCTGAGCTTGGAGGGGGGCACGCCTACTGCCGGAACCCCGGAGGCCAGATGGAGGGCCCCTGGTGCTTTACGCAGAATAAAAACGTACGCATGGAACTGTGTGACGTACCCTCGTGTAGTCCCCGAGACAGCAGCAAGATGGGGATTCTGTACATCTTGGTCCCCAGCATCGCAATTCCACTGGTCATCGCTTGCCTTTTCTTCTTGGTTTGCATGTGCCGGAATAAGCAGAAGGCATCTGCGTCCACACCGCAGCGGCGACAGCTGATGGCCTCGCCCAGCCAAGACATGGAAATGCCCCTCATTAACCAGCACAAACAGGCCAAACTCAAAGAGATCAGCCTGTCTGCGGTGAGGTTCATGGAGGAGCTGGGAGAGGACCGGTTTGGGAAAGTCTACAAAGGTCACCTGTTCGGCCCTGCCCCGGGGGAGCAGACCCAGGCTGTGGCCATCAAAACGCTGAAGGACAAAGCGGAGGGGCCCCTGCGGGAGGAGTTCCGGCATGAGGCTATGCTGCGAGCACGGCTGCAACACCCCAACGTCGTCTGCCTGCTGGGCGTGGTGACCAAGGACCAGCCCCTGAGCATGATCTTCAGCTACTGTTCGCACGGCGACCTCCACGAATTCCTGGTCATGCGCTCGCCGCACTCGGACGTGGGCAGCACCGATGATGACCGCACGGTGAAGTCCGCCCTGGAGCCCCCCGACTTCGTGCACCTTGTGGCACAGATCGCGGCGGGGATGGAGTACCTATCCAGCCACCACGTGGTTCACAAGGACCTGGCCACCCGCAATGTGCTAGTGTACGACAAGCTGAACGTGAAGATCTCAGACTTGGGCCTCTTCCGAGAGGTGTATGCCGCCGATTACTACAAGCTGCTGGGGAACTCGCTGCTGCCTATCCGCTGGATGGCCCCAGAGGCCATCATGTACGGCAAGTTCTCCATCGACTCAGACATCTGGTCCTACGGTGTGGTCCTGTGGGAGGTCTTCAGCTACGGCCTGCAGCCCTACTGCGGGTACTCCAACCAGGATGTGGTGGAGATGATCCGGAACCGGCAGGTGCTGCCTTGCCCCGATGACTGTCCCGCCTGGGTGTATGCCCTCATGATCGAGTGCTGGAACGAGTTCCCCAGCCGGCGGCCCCGCTTCAAGGACATCCACAGCCGGCTCCGAGCCTGGGGCAACCTTTCCAACTACAACAGCTCGGCGCAGACCTCGGGGGCCAGCAACACCACGCAGACCAGCTCCCTGAGCACCAGCCCAGTGAGCAATGTGAGCAACGCCCGCTACGTGGGGCCCAAGCAGAAGGCCCCGCCCTTCCCACAGCCCCAGTTCATCCCCATGAAGGGCCAGATCAGACCCATGGTGCCCCCGCCGCAGCTCTACGTCCCCGTCAACGGCTACCAGCCGGTGCCGGCCTATGGGGCCTACCTGCCCAACTTCTACCCGGTGCAGATCCCAATGCAGATGGCCCCGCAGCAGGTGCCTCCTCAGATGGTCCCCAAGCCCAGCTCACACCACAGTGGCAGTGGCTCCACCAGCACAGGCTACGTCACCACGGCCCCCTCCAACACATCCATGGCAGACAGGGCAGCCCTGCTCTCAGAGGGCGCTGATGACACACAGAACGCCCCAGAAGATGGGGCCCAGAGCACCGTGCAGGAAGCAGAGGAGGAGGAGGAAGGCTCTGTCCCAGAGACTGAGCTGCTGGGGGACTGTGACACTCTGCAGGTGGACGAGGCCCAAGTCCAGCTGGAAGCTTGA(SEQ ID NO：1)；
Translation(943aa):
MARGSALPRRPLLCIPAVWAAAALLLSVSRTSGEVEVLDPNDPLGPLDGQDGPIPTLKGYFLNFLEPVNNITIVQGQTAILHCKVAGNPPPNVRWLKNDAPVVQEPRRIIIRKTEYGSRLRIQDLDTTDTGYYQCVATNGMKTITATGVLFVRLGPTHSPNHNFQDDYHEDGFCQPYRGIACARFIGNRTIYVDSLQMQGEIENRITAAFTMIGTSTHLSDQCSQFAIPSFCHFVFPLCDARSRTPKPRELCRDECEVLESDLCRQEYTIARSNPLILMRLQLPKCEALPMPESPDAANCMRIGIPAERLGRYHQCYNGSGMDYRGTASTTKSGHQCQPWALQHPHSHHLSSTDFPELGGGHAYCRNPGGQMEGPWCFTQNKNVRMELCDVPSCSPRDSSKMGILYILVPSIAIPLVIACLFFLVCMCRNKQKASASTPQRRQLMASPSQDMEMPLINQHKQAKLKEISLSAVRFMEELGEDRFGKVYKGHLFGPAPGEQTQAVAIKTLKDKAEGPLREEFRHEAMLRARLQHPNVVCLLGVVTKDQPLSMIFSYCSHGDLHEFLVMRSPHSDVGSTDDDRTVKSALEPPDFVHLVAQIAAGMEYLSSHHVVHKDLATRNVLVYDKLNVKISDLGLFREVYAADYYKLLGNSLLPIRWMAPEAIMYGKFSIDSDIWSYGVVLWEVFSYGLQPYCGYSNQDVVEMIRNRQVLPCPDDCPAWVYALMIECWNEFPSRRPRFKDIHSRLRAWGNLSNYNSSAQTSGASNTTQTSSLSTSPVSNVSNARYVGPKQKAPPFPQPQFIPMKGQIRPMVPPPQLYVPVNGYQPVPAYGAYLPNFYPVQIPMQMAPQQVPPQMVPKPSSHHSGSGSTSTGYVTTAPSNTSMADRAALLSEGADDTQNAPEDGAQSTVQEAEEEEEGSVPETELLGDCDTLQVDEAQVQLEA(SEQ IDNO：2)。
需要说明的是，上述给出的突变位点以及序列等，均是以Burrows Wheeler测序平台内容作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准找到，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果是：
为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究了该突变基因的应用。确定了本发明涉及的重复型突变与天性短指/趾的联系，并据此为先天性短指/趾的治疗提供新的治疗方案，尤其是为先天性短指/趾B1型提供了诊断治疗的手段。
附图说明
图1为先天性短指/趾患者家系图谱；
图2为先天性短指/趾患者家系中患者ROR2基因c.2257delT变异高通量测序结果图；
图3为先天性短指/趾患者家系中患者及其父母和姐姐ROR2基因c.2257delT突变位点的Sanger法测序结果图。
具体实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
实施例1：
本实施例涉及一种分离的编码ROR2基因突变体的核酸，与SEQ ID NO.1相比，该核酸具有选自c.2257delT。所述编码ROR2基因突变体的核酸是指与编码ROR2基因突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受限制，可以是任何包含与ROR2基因突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。
所述核酸，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本技术方案中，虽然只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，只要覆盖任一就应当视为在本发明范围内。例如，提及SEQ ID NO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
该编码ROR2突变体的核酸，是发明人通过全外显子组测序联合突变验证的方法确定的先天性短指/趾的致病基因上的突变。虽然有关于先天性短指/趾的基因报道，但本发明人首次证实了ROR2基因与先天性短指/趾有关的的突变位点，在现有技术中并未被提到。野生型的ROR2基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，共含有2832个碱基。野生型ROR2基因编码的蛋白含943个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
ROR2基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有选自c.2257delT，即相对野生型ROR2基因，本发明的ROR2基因突变体的cDNA中第2257位发生碱基T缺失，由此所编码的产物与蛋白(SEQ ID NO：2)相比，具有p.Ser753ProfsTer21突变。
本实施例还涉及一种筛选易患先天性短指/趾的生物样品的方法。该方法包括以下步骤：
S1、从生物样品提取核酸样本(该步骤中的样本也可由检测方直接提供)。
所述生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品ROR2是否存在突变的核酸样本即可；生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患先天性短指/趾的生物样品的效率；需要说明的是，本部分所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中ROR2是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含ROR2编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患先天性短指/趾的生物样品的效率。另外，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患先天性短指/趾的生物样品的效率。
S2、在得到核酸样本之后，对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列；确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。
可以通过测序的方法，确定核酸样本的核酸序列。用于进行测序的方法和设备并不受特别限制，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术；利用选自HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序；由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因此能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率，从而能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度；由此，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及所得到的核酸序列文库进行测序，以便获得多个测序数据构成的数据结果；需要说明的是，本部分所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应ROR2的编码序列即可。
S3、在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ IDNO：1的序列相比对，如果在所得到的核酸序列中具有选自c.2257delT，则指示生物样品易患先天性短指/趾(同时还可判定该方法也使用了“筛选先天性短指/趾生物样品的试剂盒”、“检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中应用”)。
由此，通过根据本发明实施例的筛选易患先天性短指/趾的生物样品的方法，可以有效地筛选易患先天性短指/趾的生物样品；其中，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作。若未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟悉的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
实施例2：确定先天性短指/趾致病基因及突变位点
1.样本采集：取检体静脉外周血5ml，加入EDTA抗凝，其中2ml利用Qiagen BloodDNAmini kit(Qiagen)提取基因组DNA，Qubit(dsDNA HS Assay Kit,Invitrogen)测定浓度后-20℃保存备用。余下3ml外周血放置-80℃冰箱中冻存备用。
2.全外显子组测序
捕获及建库：采用Covaris超声波破碎仪对基因组DNA进行片段化处理，利用VAHTSUniversal DNA Library Prep Kit for IlluminaV3(Vazyme)建库试剂盒对打断产物进行末端修复、加A、加接头及扩增操作，完成预文库构建，过程中每个样本都会加上特殊标签index
(VAHTS DNA Adapters set3-set6 for Illumina,Vazyme)。其次，采用Roche公司KAPA HyperExome人类全外显子序列捕获试剂盒处理上述预文库，通过探针(GGGCAACCTTTCCAACTACAA)杂交捕获方法靶向富集目标区域，获得最终文库。文库经Qubit及QIAGEN QIAxcel Advanced全自动核酸分析系统进行浓度和片段分布分析。对合格文库利用定量试剂盒(Illumina DNA Standa ds and Primer Premix Kit,kapa)进行文库定量。最后，在华大DNBSEQ-T7基因测序仪上完成测序反应。
3.数据处理：首先，将高通量基因靶向测序数据Fastq进行低质量过滤，用BWA序列比对方法将通过质控的序列比对到人类基因组参考序列；然后，采用GATK识别目标序列中的突变位点，采用Annovar注释软件将突变位点注释到公共突变数据库，根据突变位点在正常人群中的频率、序列保守性、突变引起的氨基酸改变以及在蛋白质结构中所处的位置，预测突变对蛋白功能的影响程度；最后结合样本自身情况，根据ACMG标准与指南对突变进行致病性解读。具体可为：将原始测序数据转换为fastq文件后，使用BWA软件将reads比对到人类参考基因组GRCh37/hg19上，生成bam文件。生成的bam文件采用GATK系列软件进行局部重新比对，去除重复序列并进行变异注释。利用变异频率数据库gnomAD：https://gnomad.broadinstitute.org，1000G：http://browser.1000genomes.org，ExAC:http://exac.broadinstitute.org/对低频变异位点进行筛选。利用SIFT、Polyphen2、MutationTaster及Revel等多种蛋白功能预测软件对变异进行致病性预测分析。利用AlignX软件(Invitrogen)对不同物种的候选基因突变位点进行保守性分析。结合dbSNP、OMIM、HGMD、ClinVar等多种数据库对致病变异位点进行评估。依据美国医学遗传学与基因组学学会(American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG)指南对变异进行致病性评级分析。
对先证者进行全外显子组测序分析，结果显示先证者ROR2基因的第9号外显子内存在一个杂合变异c.2257delT，该变异为移码突变，导致蛋白合成提前终止(p.Ser753ProfsTer21)(PVS1-Strong)；该变异在正常人群基因数据库中未报道(等位基因频率(％)：gnomeAD:.；1000Genome:.；ExAC:.)(PM2-PP)；患者及家系成员表型高度符合B1型短指/趾畸型(BDB1)临床表现(PP4)；PubMed数据库文献报道，目前发现的BDB1致病突变多位于ROR2的8、9号外显子上，且多为无义突变或移码突变，导致ROR2蛋白胞内区TK附近的结构域缺失。依据美国ACMG(The American College of Medical Genetics andGenomics,美国医学遗传学与基因组学学会)的变异分类指南，该变异为可能致病性变异(ACMG:PS+2PP)。
4.Sanger法测序验证：对所发现的突变使用Sanger测序进行位点验证。取20ngDNA(比如外周血基因组DNA)，使用待测位点的特异性引物，按照TaKaRa LA PCRTMKitVer.2.1(TaKaRa)操作流程进行PCR反应；
特异性引物序列：
ROR2-2257-FOR:TGATCGAGTGCTGGAACGAG
ROR2-2257-REV:CTCCTCCTCCTCTGCTTCCT。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并使用Gel and PCR Clean-up(MACHEREY-NAGEL)切胶回收纯化。回收产物稀释至10ng/μL，按照/>Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)操作流程进行测序PCR反应及纯化。每孔加入10μL Hi-Di(Applied Biosystems)，变性5min，取出置于冰上冷却后，转入上机用96孔板中，在ABI3730XL(Applied Biosystems)平台进行测序分析。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。
Claims (3)
1.检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中的应用，所述试剂盒或设备用于筛查或诊断先天性短指/趾B1型；其中，
所述核酸与序列为SEQ ID NO：1的野生型ROR2基因相比，具有c.2257delT突变，
所述多肽与序列为SEQ ID NO：2的野生型ROR2蛋白相比，具有p.Ser753ProfsTer21突变。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性针对所述核酸和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述引物包括序列如下的引物对：
正向引物：5'TGATCGAGTGCTGGAACGAG3'，
反向引物：5'CTCCTCCTCCTCTGCTTCCT3'；
所述探针为GGGCAACCTTTCCAACTACAA。
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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