CN116144669B - Tcof1基因突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及基因技术领域，尤其涉及TCOF1基因突变体及其应用。核酸，与序列为SEQ ID NO：1的野生型TCOF1基因相比，具有c.3337C>T突变。多肽，与序列为SEQ ID NO：2的野生型TCOF1基因编码的蛋白相比，所述多肽具有p.Q1113*突变。检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中应用，试剂盒或设备用于筛查或诊断TCS‑1综合征。特异性改变核酸的试剂在制备药物中的用途，药物用于治疗TCS‑1综合征；核酸与野生型TCOF1基因相比，具有c.3337C>T突变。本发明为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究确认了该突变基因在TCS‑1综合征中的新用途。

Description

TCOF1基因突变体及其应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，尤其涉及TCOF1基因突变体及其应用。
背景技术
Treacher-Collins综合征(Treacher-Collins syndrome：TCS，OMIM：154500)是一种极为罕见的先天性颅面部发育异常，常见的遗传模式为常染色体显性遗传。其主要临床表现为：颅面骨发育不全，包括颧骨和下颌发育不良、小耳畸形、外耳道闭锁、睑裂外下垂、唇裂或巨口等，形成特征性的“鱼面样”面容，发病率约为1/50000，约40%的病例有家族史，60%的病例为散发病例。
TCOF1基因（OMIM 606847）位于染色体5q32-33.1区，由28个外显子构成，编码由1411个氨基酸组成的Treacle蛋白。Treacle蛋白位于细胞核的致密纤维成分上，研究者推测适当的Treacle蛋白对于调节神经上皮和神经嵴细胞的成熟核糖体的产生有重要作用。TCOFl基因突变导致Treacle蛋白单倍剂量不足，在胚胎第15～18周影响第一、二腮弓的形成，无法满足颅面神经嵴细胞增殖，从而导致颅面畸形。根据人类基因突变数据库(HumanGeneMutation Database，HGMD)已报道的TCOFl基因突变已有250余种，包括错义突变、无义突变、缺失突变和插入突变等多种突变类型，同时还包括剪切位点突变和DNA片段重排，其中缺失突变、剪切位点突变可致阅读框的移码突变，使蛋白质肽链合成提前终结，即主要为移码突变导致Treacle截短蛋白。
目前对于TCOF1基因的研究亟需深入的探索TCOF1基因中会导致TCS综合征的突变，并且据此可研发相应的诊断和治疗的方案。比如，还需进一步研究TCOF1基因对TCS综合征的影响，进而研究从基因层面实现对TCS综合征的预防和治疗。
发明内容
针对上述问题，本发明提供TCOF1基因突变体及其应用，主要为了填补部分对TCOF1基因研究的空白，同时对TCS综合征致病原因做进一步研究，探究其成因和可治疗方案。
为了解决上述问题，本发明采用如下技术方案：
本发明第一方面涉及核酸，包括含下列目标片段，
所述目标片段与序列为SEQ ID NO：1的野生型TCOF1基因相比，具有c.3337C>T突变。
在前述基础上，所述核酸的类型包括DNA、RNA或cDNA，核酸的类型不做具体的限定，只要其与野生型TCOF1基因相比具有特定的突变，则应当认定其为本条范围内的核酸。
本发明第二方面涉及多肽，与序列为SEQ ID NO：2的野生型TCOF1基因编码的蛋白相比，所述多肽具有p.Q1113*突变。突变型TCOF1基因编码的产物与野生型蛋白（或多肽，两者等同。后续解释相同）(SEQ ID NO：2)相比，具有p.Q1113*突变，即第1113位氨基酸由谷氨酰胺变为终止密码子，使蛋白多肽链合成提前终止。
本发明第三方面涉及生物模型在筛选药物中的应用，其特征在于，所述生物模型至少携带下列之一：
a.核酸，与序列为SEQ ID NO：1的野生型TCOF1基因相比，具有c.3337C>T突变，
b.多肽，与序列为SEQ ID NO：2的野生型TCOF1基因编码的蛋白相比，所述多肽具有p.Q1113*突变。
所述生物模型一种形式为细胞模型。该细胞模型的一种应用方式为进行规模化的药物筛选，可以通过药物对细胞模型进行作用，验证该药物是否具有抑制相应突变的作用，并可据此进一步验证该药物是否可以通过抑制突变实现治疗相应的疾病，比如通过该细胞模型即可实现模拟TCS综合征的疾病环境、然后进一步通过该模型实现体外验证部分药物的作用。在本条中，主要考虑的筛选因素是针对相应的突变，暂不具体限定药物的具体治疗对象，该种应用方式主要在药物研发过程中进行使用。其中，所述药物为治疗TCS综合征的药物；TCS综合征主要是由前述突变导致。更具体的，所述药物为防治TCS-1综合征的药物。由此，通过本生物模型实现了对一些作用效果未知的物质进行筛查，方便进一步研究该物质是否具有用于治疗TCS综合征的预期。
本发明第四方面涉及检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中应用，所述试剂盒或设备用于筛查或诊断TCS综合征；其中，
所述核酸与野生型TCOF1基因相比，具有c.3337C>T突变；所述多肽与野生型TCOF1基因编码的蛋白相比，具有p.Q1113*突变。筛查TCS综合征主要是患病风险排查，便于提前干预；诊断则是对于已经患病的人员进行辅助诊断，当然是否已经患病是以患者机体实际变化、相应的标准规范为依据，不以人的主观认知干预。
所述试剂包括特异性针对所述核酸和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。具体为试剂包括特异性检测核酸的产品，还包括特异性检测多肽的产品，该产品至少可为抗体、探针、引物以及质谱检测试剂中任一，同时还可为其他具有相似功能的试剂。另外，试剂盒的形式可为一些与现有产品类似的试剂盒，设备则可为一些序列检测设备。引物和探针均可选择其中任一，也可根据需要进行组合使用。
更为具体的，所述引物至少包括序列如下的引物对（60度，386bp）：
正向引物：CTGCATGTGTGCCCCATCTA，
反向引物：CCACACAACACCCTCTTCCT；
所述探针序列为：GAGGTGCTCTGGGGACTTGTT。
优选的，所述TCS综合征为TCS-1综合征。制备所得的相应检测产品不仅可以用于筛查和诊断TCS综合征，同时可以更为精准地筛查易感TCS综合征人群，还可对TCS综合征患者进行诊断，相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，同时前述探针、引物在进行相应检测过程中具有更好的效果。
本发明第五方面涉及筛选TCS综合征生物样品的试剂盒，包含有能检测TCOF1基因突变体的试剂；
与序列为SEQ ID NO：1的野生型TCOF1基因相比，所述TCOF1基因突变体具有c.3337C>T突变，或与序列为SEQ ID NO：2的野生型TCOF1基因编码的蛋白相比，所述TCOF1基因突变体具有p.Q1113*突变。在该种情况下，只要相应的产品应用到了能够检测前述两种TCOF1基因突变体中任一的试剂时，均应当视为应用了本发明的技术。
所述试剂为核酸探针或引物。所述引物包括序列如下的引物对：
正向引物：CTGCATGTGTGCCCCATCTA，
反向引物：CCACACAACACCCTCTTCCT；
所述探针序列为：GAGGTGCTCTGGGGACTTGTT。
优选的，TCS综合征生物样品为TCS-1综合征样品；该种样品的主要来源为疑似患者，比如患者的外周血、皮肤、皮下组织等。相应的探针、引物都具有较高的检测精度和准确性，可以更快速的“无创”检查。该种试剂盒可用于对风险病例进行检测，也可在某些场景中进行大规模的风险排查，尽早的筛查出风险人群。文中提到的野生型TCOF1的相关序列也可直接查询领域内常用的网站，其为公知内容。
本发明第六方面涉及特异性改变核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗TCS综合征；其中，所述核酸与野生型TCOF1基因相比，具有c.3337C>T突变；所述试剂至少为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、锌指核酸酶中之一的试剂。
所述试剂至少为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1、锌指核酸酶中之一的试剂，当然还可基于其他具有相似功能的物质。如CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，RISPR-Cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于CRISPR-Cas9的方法，可以设计出sgRNA并合成该序列的gRNA，然后将gRNA与dCas9在细胞中共表达，通过gRNA介导dCas9蛋白与目标DNA区域结合，进而实现特定位点的修复或改变，恢复蛋白功能，相应的编辑技术均已是常规现有技术，在此不做赘述，当然所有项目的实施都必须依法施行。在本条中，主要修复的特定位点就是TCOF1基因的c.3337C>T的突变位点。优选的，所述TCS综合征为TCS-1综合征，通过针对性进行用药，使得相应的致病基因修复，实现疾病的预防和治疗。试剂盒也应当做宽泛的解释，还包括一些检测试纸、设备等。
本发明第七方面涉及构建体，包含有核酸，该核酸包括含下列目标片段，所述目标片段与序列为SEQ ID NO：1的野生型TCOF1基因相比，具有c.3337C>T突变。构建体同样可以在制药过程中作为药物作用效果的检验模型。
本发明第八方面涉及重组细胞，所述重组蛋白是通过前述的构建体转化受体细胞获得。根据本发明实施例的重组细胞可作为细胞模型，用于科学研究或商业化药物研究，如药物筛选或TCOF1基因的致病机理研究。
需要说明的是，上述给出的突变位点以及序列等，均是以Burrows Wheeler测序平台内容作为参考，本领域技术人员应该理解的是，由于数据库的更新或者数据库的不同，所示出的突变位点以及序列可能会稍有不同或者变化，这些不同或者变化均可以给出的该数据库中的内容为标准找到，这些不同或者变化也均包含在本发明的保护范围之内。
本发明的有益效果是：
为现有的基因领域提供了新的突变型基因，并进一步研究了该突变基因的应用。确定了本发明涉及的突变与TCS综合征的联系，并据此为TCS综合征的治疗提供新的治疗方案，尤其是为TCS综合征提供了诊断治疗的手段。
附图说明
图1为TCS综合征患者家系图谱；
图2为TCS综合征患者家系中先证者TCOF1基因c.3337C>T变异高通量测序结果图；
图3为TCS综合征患者家系中先证者及其母亲、弟弟及出生后双胎婴儿TCOF1基因c.3337C>T突变位点的Sanger法测序结果图。
实施方式
下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步说明。
实施例
本实施例涉及分离的编码TCOF1基因突变体的核酸，与SEQ ID NO.1相比，该核酸具有c.3337C>T突变。所述编码TCOF1基因突变体的核酸是指与编码TCOF1基因突变体的基因相对应的核酸物质，即核酸的类型不受限制，可以是任何包含与TCOF1基因突变体的编码基因相对应的脱氧核糖核苷酸和/或核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于DNA、RNA或cDNA。
所述核酸，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本技术方案中，虽然只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链，只要覆盖任一就应当视为在本发明范围内。例如，提及SEQ ID NO：1，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
该编码TCOF1基因突变体的核酸，是发明人通过全外显子组测序技术联合突变验证的方法确定的TCS综合征的致病基因上的突变。虽然有关于TCS综合征的基因报道，但发明人首次证实了TCOF1基因与TCS综合征有关的c.3337C>T突变位点，在现有技术中并未被提到。野生型的TCOF1基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，共含有4467个碱基。野生型TCOF1基因编码的蛋白含1488个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。
TCOF1基因突变体与SEQ ID NO：1相比，具有选自c.3337C>T，即相对野生型TCOF1基因，本发明的TCOF1基因突变体的cDNA中第3337位发生碱基C替换为碱基T，由此所编码的产物与蛋白(SEQ ID NO：2)相比，具有p.Q1113*突变，即第1113位氨基酸由谷氨酰胺变为终止密码子，使蛋白多肽链合成提前终止（PVS1）。
本实施例还涉及一种筛选易患TCS综合征的生物样品的方法。该方法包括以下步骤：
S1、从生物样品提取核酸样本（该步骤中的样本也可由检测方直接提供）。
所述生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品TCOF1基因是否存在突变的核酸样本即可；生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种，优选外周血。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选易患TCS综合征的生物样品的效率；需要说明的是，本部分所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中TCOF1基因是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含TCOF1基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选易患TCS综合征的生物样品的效率。另外，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选易患TCS综合征的生物样品的效率。
S2、在得到核酸样本之后，对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列；确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。
可以通过测序的方法，确定核酸样本的核酸序列。用于进行测序的方法和设备并不受特别限制，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术；利用选自HISEQ2000、SOLID、454、ABI3730XL和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序；由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因此能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率，从而能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度；由此，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及所得到的核酸序列文库进行测序，以便获得多个测序数据构成的数据结果；需要说明的是，本部分所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据（reads）作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应TCOF1基因的编码序列即可。
S3、在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列与SEQ IDNO：1的序列相比对，如果在所得到的核酸序列中具有选自c.3337C>T，则指示生物样品易患TCS综合征（同时还可判定该方法也使用了“筛选TCS综合征生物样品的试剂盒”、“检测核酸和/或多肽的试剂在制备试剂盒或设备中应用”）。
由此，通过根据本发明实施例的筛选易患TCS综合征的生物样品的方法，可以有效地筛选易患TCS综合征的生物样品；其中，对核酸序列与SEQ ID NO：1进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作。若未特别说明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟悉的常规手段，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均与首次标明的内容相同。
实施例2：确定TCS综合征致病基因及突变位点
样本采集对象：先证者（孕妇），研究过程中处于中孕期（双胎），因超声提示胎儿之一室间隔膜部偶见穿隔血流信号，束宽约0.20cm而就诊。查体：先证者即孕妇本人“鱼面样”面容，颧骨发育不全，眼裂向外倾斜，小下颌和颌后缩，外耳发育不全，小耳，外耳道狭窄，听力异常，佩戴助听器，其他无显著异常。询问其孕产史，自述2018年顺产一先心女孩（具体异常不详），面部异常，无耳廓，孩子约5月龄夭折；2019年，孕6月时因超声提示胎儿心脏异常（具体异常不详），耳廓畸形，自行引产。询问其家族史，父亲正常，母亲及弟弟特殊面容，否认其他颅面畸形家族史，否认遗传病史，否认近亲结婚，家系图见图1。2022年6月，孕37+2周，孕妇因高血压入院，行剖宫产术，分娩龙凤胎，男婴，重2500克，身长45cm，室间隔缺损，阿氏评分8分，女婴，重2300克，身长46cm，阿氏评分10分。两个婴儿面容均无异常，听力筛查顺利通过。本研究先证者及其家属均签署了知情同意书。
本病典型的临床表现包括颧骨和下颌发育不良、睑裂向下倾斜、下眼睑缺失、小耳畸形和耳部的其他畸形、颧骨发育不良和巨口等，并伴有传导性耳聋和腭裂。患者的症状存在明显的临床异质性，病例之间差异较大。一些患者存在上述全部表现，并且较为严重，而一些患者受累较轻，仅有部分症状。在本家系中，先证者孕妇临床症状较为严重，如颧骨发育不全，眼裂向外倾斜，小下颌和颌后缩，小耳，听力低下需佩戴助听器等等，为TCS-1综合征，而其母亲及弟弟面部异常较轻，外耳发育较为正常，仅有左耳听力稍差。
样本采集：取检体静脉外周血5ml，加入 EDTA抗凝，其中2ml利用Qiagen BloodDNA mini kit (Qiagen) 提取基因组DNA，Qubit(Qubit® dsDNA HS Assay Kit,Invitrogen)测定浓度后-20℃保存备用。余下3ml外周血放置-80℃冰箱中冻存备用。
2. 全外显子组测序
捕获及建库：首先，采用Covaris 超声波破碎仪对基因组DNA进行片段化处理，利用VAHTS Universal DNA Library Prep Kit for Illumina V3（Vazyme）建库试剂盒对打断产物进行末端修复、加A、加接头及扩增操作，完成预文库构建，过程中每个样本都会加上特殊标签index。然后，采用Roche公司的KAPA HyperExome人类全外显子序列捕获试剂盒处理上述预文库，通过探针（GAGGTGCTCTGGGGACTTGTT）杂交捕获方法靶向富集目标区域，获得最终文库；文库经Qubit及QIAGEN QIAxcel Advanced全自动核酸分析系统进行浓度和片段分布分析；对合格文库利用定量试剂盒进行文库定量。最后，在华大DNBSEQ-T7基因测序仪上完成测序反应。
3. 数据处理：测序完成后，用BWA软件将通过质控的序列比对到人类基因组参考序列；采用GATK软件识别目标序列中的突变位点，采用Annovar注释软件将突变位点注释到公共突变数据库，根据突变位点在正常人群中的频率、序列保守性、突变引起的氨基酸改变以及在蛋白质结构中所处的位置，预测突变对蛋白功能的影响程度；然后结合样本临床表型，根据ACMG变异分类标准与指南对突变进行致病性解读。具体可为：将原始测序数据转换为fastq文件后，使用BWA软件将reads比对到人类参考基因组 GRCh37 /hg19上，生成bam文件。生成的bam文件采用GATK系列软件进行局部重新比对， 去除重复序列并进行变异注释。利用变异频率数据库gnomAD，1000G，ExAC对低频变异位点进行筛选。利用SIFT、Polyphen2、MutationTaster及Revel等多种蛋白功能预测软件对变异进行致病性预测分析。利用AlignX软件(Invitrogen)对不同物种的候选基因突变位点进行保守性分析。结合dbSNP、OMIM、HGMD、ClinVar等多种数据库对致病变异位点进行评估。依据美国医学遗传学与基因组学学会（American College of Medical Genetics and Genomics，ACMG）指南对变异进行致病性评级分析。
对先证者进行全外显子组测序分析，结果显示先证者TCOF1基因的第21号外显子内存在一个杂合变异c.3337C>T，该变异为无义突变，导致蛋白合成提前终止(p.Q1113*)(PVS1-Strong)；该变异在正常人群基因数据库中未报道（等位基因频率(%)：gnomeAD:.;1000 Genome:.;ExAC:.）（PM2），患者症状与Treacher-Collins 综合征高度符合（PP4）；且PubMed数据库文献报道，目前发现的TCS综合征致病突变多位于TCOF1基因的第10、12、15、16、23、24等6个外显子上，而本研究中c.3337 C>T无义突变位于第21号外显子。依据美国ACMG（The American College of Medical Genetics and Genomics, 美国医学遗传学与基因组学学会）的变异分类指南，该变异为致病性变异（ACMG: PVS+PM+PP）。
4.Sanger法测序验证：对所发现的突变使用Sanger测序进行位点验证。 取20ngDNA（比如外周血基因组DNA），使用待测位点的特异性引物，按照TaKaRa LA PCR™ KitVer.2.1（TaKaRa）操作流程进行PCR反应；
特异性引物序列：
正向引物：CTGCATGTGTGCCCCATCTA，
反向引物：CCACACAACACCCTCTTCCT。
PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析并使用NucleoSpin® Gel and PCR Clean-up（MACHEREY-NAGEL）切胶回收纯化。回收产物稀释至10ng/μL，按照BigDye® Terminatorv3.1Cycle Sequencing Kit（Applied Biosystems）操作流程进行测序PCR反应及纯化。每孔加入10μL Hi-Di（Applied Biosystems），变性5min，取出置于冰上冷却后，转入上机用96孔板中，在ABI3730XL（Applied Biosystems）平台进行测序分析。
5.结论：采用全外显子测序技术检测到TCOF1基因中c.3337 C>T的杂合突变是该TCS家系的致病原因。本研究结果拓宽了TCS综合征的基因谱，加强了临床医生对该罕见病的认识，为临床TCS综合征的筛查和诊断提供了经验，同时也为产前诊断提供了依据。因此，有针对性地对TCS综合征开展遗传学研究，明确致病基因及其致病机制，对TCS综合征患者的遗传咨询和个体化防治具有潜在的临床意义，为TCS综合征早期诊断和有效治疗提供研究方向和新的理论依据，也将在实践上为研发治疗TCS综合征的特效药物提供新的分子靶点。
本领域的技术人员可以明确，在不脱离本发明的总体精神以及构思的情形下，可以做出对于以上实施例的各种变型。其均落入本发明的保护范围之内。本发明的保护方案以本发明所附的权利要求书为准。

Claims (7)

1.TCOF1基因突变体，其特征在于，所述TCOF1基因突变体的序列如SEQ ID NO：1所示，且其第3337位碱基由C突变为T。
2.检测权利要求1中TCOF1基因突变体的试剂在制备试剂盒中应用，其中，所述试剂盒用于筛查或诊断TCS-1综合征；所述基因突变体与SEQ ID NO:1所示的野生型TCOF1基因相比，在第3337位碱基存在c.3337C>T突变。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性针对所述TCOF1基因突变体的探针、引物中的至少之一；其中，
所述引物至少包括序列如下的引物对：
正向引物：CTGCATGTGTGCCCCATCTA，
反向引物：CCACACAACACCCTCTTCCT；
所述探针序列为：GAGGTGCTCTGGGGACTTGTT。
4.筛选TCS-1综合征生物样品的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含能检测权利要求1中TCOF1基因突变体的试剂，所述基因突变体与SEQ ID NO:1所示的野生型TCOF1基因相比，在第3337位碱基存在c.3337C>T突变。
5.根据权利要求4所述的筛选TCS-1综合征生物样品的试剂盒，其特征在于，所述试剂为核酸探针和/或引物；其中，
所述引物至少包括序列如下的引物对：
正向引物：CTGCATGTGTGCCCCATCTA，
反向引物：CCACACAACACCCTCTTCCT；
所述探针序列为：GAGGTGCTCTGGGGACTTGTT。
6.构建体，其特征在于，包含有权利要求1中的TCOF1基因突变体。
7.重组细胞，其特征在于，所述重组细胞通过权利要求6所述的构建体转化受体细胞获得。
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Treacher Collins 综合征患儿临床特征 及致病基因分析;冯英秋 等;《中国听力语言康复科学杂志》;第20卷(第3期);187-190 *

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