CN110878306B - 基因突变体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种非综合征型遗传性耳聋相关的核酸、基因突变体及其应用。该非综合征型遗传性耳聋相关的核酸，与野生型COL4A2基因相比，具有c.4951C>T突变。本发明的核酸是非综合征型遗传性耳聋的一种新的相关的致病核酸，通过检测该核酸在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型遗传性耳聋。该核酸或致病突变位点的发现，进一步拓展和完善了遗传性听力损失疾病的检测和研究，为该疾病的诊断或治疗提供了新的检测位点，以及新的检测方法和途径。

Description

基因突变体及其应用
技术领域
本发明涉及生物领域，具体地，本发明涉及基因突变体及其应用，更具体地，本发明涉及核酸、基因突变、多肽、生物模型、用于治疗非综合征型遗传性耳聋的药物、用于检测患非综合征型遗传性耳聋的试剂盒、构建体及重组细胞。
背景技术
耳聋(hearing loss；deafness)是一类听觉功能障碍性疾病的统称。在世界范围内，耳聋是一种常见病、多发病。该病可由听觉系统的传音或感音功能障碍所致，也可能为听觉传导通路中的听神经或各级中枢发生病变所引起。其病因极其复杂多样，诸如遗传、感染、外伤、药物应用不当、免疫性疾病、生理机能退化、噪声、化学物质中毒及心理因素等等均可导致耳聋，其中遗传因素占主导作用。调查显示，在新生儿中先天性耳聋患者的发病率约为1‰，其中多半与遗传因素有关，这部分耳聋被称作遗传性耳聋(hereditary hearingloss,HHL)，是由染色体或基因功能异常而导致的耳聋。
遗传性耳聋分类方法目前尚无统一的标准，依据是否伴随其他组织或器官的症状，可将其分为非综合征型遗传性耳聋(nonsyndromic hereditary hearing loss,NSHHL)和综合征型耳聋(syndromic hereditary hearing loss，SHHL)；按照其对言语功能形成的影响，可分为语前聋(prelingual hearing loss)和语后聋(postlingual hearing loss)；依据耳聋的严重程度，可分为轻度耳聋(mild hearing loss)、中度耳聋(moderatelyhearing loss)、中重度耳聋(moderately severe hearing loss)、重度耳聋(severehearing loss)及极重度耳聋(profound hearing loss)；依据不同频率的听力损失，又可将其分为低频听力损失、中频听力损失、高频听力损失及全频听力损失，等等。
非综合征型耳聋是指耳聋为发病个体唯一的症状，无其它遗传损害性器官功能障碍，在遗传性耳聋中占70％左右。依据遗传方式的不同，通常将其分为常染色体显性(autosomal dominant，DFNA)、常染色体隐性(autosomal recessive，DFNB)、性染色体连锁(sex-linked)及线粒体遗传性(mitochondrial；maternally inherited)耳聋。
与其它遗传性疾病相同，非综合征型常染色体显性遗传性耳聋(autosomaldominant non-syndromic hearing loss,ADNSHL)多为家族性疾病。在临床表型方面，多表现为迟发起病，但患者起病年龄不一，在同一个大家族中发病年龄多集中在某一个年龄阶段，耳聋程度呈渐进性加重，最终直至重度或极重度感音神经性耳聋，甚至全聋。由于在学语后期才出现耳聋，所以患者言语功能多能正常形成，但是随着听觉功能下降，可能会导致部分言语功能丧失。听力损失的特点也不大相同，多数ADNSHL患者首先表现为始发高频听力损失，少数患者具有自己特殊的表型，比如在DFNA1(DIAPH1)及DFNA6/14/38(WFS1)家系中患者首先出现低频听力损失，而在DFNA8/12(TECTA)和DFNA13(COL11A2)家系中则首先出现中频的听力损失，DFNA9(COCH)和DFNA11(MYO7A)致病的患者有时还伴发前庭功能障碍症状。由于表型和基因型在一定程度上具有异质性，所以这些特征性的表型往往有助于研究人员做出合理预判，推测患者的基因型。
随着研究技术、分子遗传学及分子生物学研究水平的提高，耳聋的基因鉴定工作取得了长足的进展，截止到2017年3月，人们共成功克隆或鉴定ADNSHL基因38个。这些基因涉及的种类繁多，包括离子平衡相关分子(components of ion channels and gapjunctions)、毛细胞细胞骨架成分及相关分子(cytoskeletal proteins and motormolecules)、细胞外基质成分及相关分子(extracellular matrix components)、转录因子及激活因子(transcription factors and activators)和其它未归类的基因表达产物。
随着测序技术的发展，越来越多的遗传性耳聋相关基因得到鉴定，为遗传性耳聋的分子学诊断提供了基础，使得更多的遗传性耳聋患者得到诊断与治疗。
然而，由于遗传性耳聋具有很强的遗传异质性，目前仍有大量的致病基因未被鉴定，所以这方面的研究还有很大的空间，仍需要继续加强基因鉴定方面的研究。
发明内容
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。
发明人收集了一个连续3代发病的中国汉族人遗传性耳聋家系，选取了家系中的7个样本，通过全基因组测序技术，获得了样本的变异数据，通过全基因组测序数据分析及变异解读，在基因COL4A2上发现了一个新的杂合错义突变：c.4951C>T(p.Arg1651Cys)。进而发明人通过PCR-Sanger测序法对该突变进行验证，发现COL4A2基因上的c.4951C>T(p.Arg1651Cys)这个错义突变在研究的家系成员中出现了表型-基因型共分离的现象，因此，发明人认为该变异很可能为遗传性耳聋的致病变异。
而已知的COL4A2基因所编码的IV型胶原是基膜的主要结构成分，并且该蛋白的C-末端部分是血管生成和肿瘤生长的抑制剂，与脑穿通(Porencephaly)和颅内出血(Hemorrhage,Intracerebral)相关，其在听觉系统的作用未知。发明人通过小鼠耳蜗冰冻切片及耳蜗基底膜铺片的免疫荧光实验，发现COL4A2蛋白在小鼠内耳有广泛表达，其中，螺旋神经节、螺旋韧带靠近蜗壳处、corti’s器的支持细胞、骨螺旋板内的毛细血管壁等部位表达明显，毛细胞表达微弱。而内耳是形成听觉的关键器官，因此，发明人推测COL4A2基因很有可能与听力的形成有关。
发明人通过全基因组测序及生物信息分析方法发现了COL4A2基因上的c.4951C>T突变可能与非综合征型常染色体显性耳聋(ADNSHL)有关，并通过家系内表型-基因型共分离实验和大样本量正常人群体的遗传学验证证实了COL4A2基因上的这一致病变异，同时通过小鼠内耳表达实验发现了COL4A2基因与听觉系统的关联性。
基于上述发现，本发明拓宽了遗传性耳聋临床诊断和检测/筛查范围，为ADNSHL发病机制的研究奠定了重要基础，也为ADNSHL患者治疗提供了全新的理论依据，从而对ADNSHL患者的临床诊断提供了更多的支持和参考。此外，新的ADNSHL致病基因的克隆，结合遗传或表观遗传修饰因素调节基因表达及构建相应的动物模型将为揭示ADNSHL的发病机理提供重要线索，为进一步阐明人类听觉系统异常的病理机制奠定基础。
在本发明的第一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，与野生型COL4A2基因相比，所述核酸具有c.4951C>T突变。发明人首次发现了COL4A2基因与耳聋相关，并发现COL4A2基因的c.4951C>T突变与非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)的发病密切相关，从而通过检测上述核酸在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)。
在本发明的第二方面，本发明提出了一种基因突变。根据本发明的实施例，与野生型COL4A2基因相比，具有c.4951C>T突变。发明人首次发现了COL4A2基因与耳聋相关，并发现COL4A2基因的c.4951C>T突变与非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)的发病密切相关，从而通过检测上述基因突变在生物样品中是否发生，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)。
在本发明的第三方面，本发明提出了一种多肽。根据本发明的实施例，与野生型COL4A2基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述多肽的氨基酸序列具有p.Arg1651Cys的突变。如前所述，COL4A2基因的c.4951C>T突变与非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)的发病密切相关，因而，可以说c.4951C>T突变COL4A2基因所表达的蛋白-具有p.Arg1651Cys的突变的多肽与非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)的发病密切相关，进而通过检测上述多肽在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)。
在本发明的第四方面，本发明提出了检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒或者设备用于诊断非综合征型遗传性耳聋。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与非综合征型遗传性耳聋的发病密切相关，进而检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂能用于制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或者设备能有效筛选出患非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的生物样品。
在本发明的第五方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)权利要求1所述的核酸；(2)权利要求2所述的基因突变；(3)表达权利要求3所述的多肽。需要说明的是，“生物模型携带前面所述的核酸”表示，本发明的生物模型携带与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变的COL4A2基因突变体的核酸序列；“生物模型携带前面所述的基因突变”表示，本发明的生物模型携带的COL4A2基因与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变。“生物模型携带前面所述的多肽”表示，本发明的生物模型携带与野生型COL4A2基因表达的蛋白相比具有p.Arg1651Cys突变的多肽。根据本发明的实施例的生物模型能有效地用作非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的相关研究的模型。
在本发明的第六方面，本发明提出了特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗非综合征型遗传性耳聋。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的发病密切相关，由此，特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂制备的药物能有效用于治疗非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
在本发明的第七方面，本发明提出了一种用于治疗非综合征型遗传性耳聋的药物。根据本发明的实施例，所述药物含有：特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的发病密切相关，由此，包含特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂的药物能有效用于治疗非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
在本发明的第八方面，本发明提出了一种筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型COL4A2基因相比是否具有c.4951C>T突变，判断所述生物样品是否患非综合征型遗传性耳聋，其中，所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变，是所述生物样品患有非综合征型遗传性耳聋的指示。通过根据本发明实施例的筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法，可以有效地筛选患非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的生物样品。
在本发明的第九方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包含前面所述的核酸或前面所述的基因突变。需要说明的是，“构建体包含前面所述的核酸”表示，本发明的构建体包含与野生型COL4A2基因相比，具有c.4951C>T突变的核酸。“构建体包含前面所述的基因突变”表示，本发明的构建体包含的COL4A2基因，与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变。由此，根据本发明实施例的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的相关研究的模型。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞或者表达前面所述的多肽而获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的相关研究的模型。
在本发明的第十一方面，本发明提出了一种检测非综合征型遗传性耳聋的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒中包括检测前面所述的核酸的试剂，和/或检测前面所述的基因突变的试剂，和/或检测前面所述的多肽的试剂。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与非综合征型遗传性耳聋的发病密切相关，进而能用于包含能有效地检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂的试剂盒能有效筛选出患非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的生物样品。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1为根据本发明实施例的家系图谱；
图2为根据本发明实施例的患者纯音测听图(左右耳)，横轴表示声音的频率(即声音音调，单位是Hz)，从左到右，声音音调从低到高，纵轴表示声音的强度(即声音的大小，单位是dB)，从上到下，声音从小到大；
图3为根据本发明实施例的COL4A2c.4951C>T在家系中的Sanger验证峰图(从上至下依次为B1、B2、B3、B4、B6、B7、B8、B11、B12)；
图4为根据本发明实施例的COL4A2小鼠内耳表达分布图：(A)COL4A2在耳蜗corti’s器的示意定位；(B)COL4A2在耳蜗螺旋韧带及血管纹中的表达；(C)COL4A2在耳蜗基底膜上广泛表达，其中，细胞核采用DAPI染色，F-肌动蛋白采用鬼笔环肽染色。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，本领域技术人员能够理解，在本发明中所使用的野生型COL4A2基因序列位置是以人类基因组中野生型COL4A2基因的序列为准，但当该野生型COL4A2基因存在与其他物种中时，该序列可能会有差异，可以通过将该物种的野生型COL4A2基因与人野生型COL4A2基因进行比对获得该物种的野生型COL4A2基因中所对应的位置。
需要说明的是，非综合征型常染色体显性遗传性耳聋表现为常染色体显性遗传病，是指生物个体的常染色体上的COL4A2基因只需要等位基因其中之一的相应位点发生c.4951C>T突变即可致病，例如，将COL4A2基因的等位基因发生c.4951C>T突变记为A，不发生c.4951C>T突变记为a，如果基因型表现为Aa或AA，则该生物个体患有非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。因而，在本发明中筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法中，所涉及的“与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变”是指COL4A2至少一条等位基因具有c.4951C>T突变。
核酸
在本发明的第一方面，本发明提出了一种核酸。根据本发明的实施例，与野生型COL4A2基因相比，所述核酸具有c.4951C>T突变。发明人首次发现了COL4A2基因与耳聋相关，并发现COL4A2基因的c.4951C>T突变与非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)的发病密切相关，从而通过检测上述核酸在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)。
对于本发明说明书和权利要求书中，提及核酸，本领域技术人员应当理解，实际包括互补双链的任意一条，或者两条。为了方便，在本说明书和权利要求书中，虽然多数情况下只给出了一条链，但实际上也公开了与之互补的另一条链。例如，提及COL4A2基因的序列，实际包括其互补序列。本领域技术人员还可以理解，利用一条链可以检测另一条链，反之亦然。
发明人发现的COL4A2基因突变体，与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变，换句话说，也就是与野生型COL4A2基因相比，基因突变体的48号外显子区第4951位的碱基由C突变为T。其中，野生型COL4A2基因的序列的获取网址如下所示：http:// grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/Transcript/Summary？db＝core；g＝ ENSG00000134871；r＝13:110959614-110980896；t＝ENST00000360467。本发明所述的c.4951C>T突变是以上述网址所对应的cDNA序列进行定位的。
发明人首次提出了COL4A2基因为非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的致病基因，并首次发现了COL4A2基因的c.4951C>T突变能够导致患者患非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的致病基因。
基因突变
在本发明的第二方面，本发明提出了一种基因突变。根据本发明的实施例，与野生型COL4A2基因相比，具有c.4951C>T突变。换句话说，也就是与野生型COL4A2基因相比，所述基因突变位于COL4A2基因48号外显子第4951位的碱基由C突变为T。发明人首次发现了COL4A2基因与耳聋相关，并发现COL4A2基因的c.4951C>T突变与非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)的发病密切相关，从而通过检测上述基因突变在生物样品中是否发生，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)。
多肽
在本发明的第三方面，本发明提出了一种多肽根据本发明的实施例，与野生型COL4A2基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述多肽的氨基酸序列具有p.Arg1651Cys的突变。如前所述，COL4A2基因的c.4951C>T突变与非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)的发病密切相关，因而，可以说c.4951C>T突变COL4A2基因所表达的蛋白-具有p.Arg1651Cys的突变的多肽与非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)的发病密切相关，进而通过检测上述多肽在生物样品中是否存在，可以有效地检测生物样品是否患非综合征型遗传性耳聋(如非综合征型常染色体显性遗传性耳聋)。
发明人发现的COL4A2基因突变体所表达的多肽，与野生型COL4A2基因表达的多肽相比具有p.Arg1651Cys突变，换句话说，也就是与野生型COL4A2基因表达的相比，基因突变体的48号外显子区1651位的氨基酸由精氨酸突变为半胱氨酸。其中，野生型COL4A2基因表达的多肽的序列的获取网址如下所示：http://grch37.ensembl.org/Homo_sapiens/ Transcript/Summary？db＝core；g＝ENSG00000134871；r＝13:110959614-110980896；t＝ ENST00000360467。本发明所述的p.Arg1651Cys突变是以上述网址所对应的氨基酸序列进行定位的。
检测前面所述的核酸、基因突变、多肽的试剂在制备试剂盒或设备中的用途
在本发明的第四方面，本发明提出了检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途。根据本发明的实施例，所述试剂盒或者设备用于诊断非综合征型遗传性耳聋。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与非综合征型遗传性耳聋的发病密切相关，进而检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂用于制备试剂盒或者设备，所得到的试剂盒或者设备能有效筛选出患非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的生物样品。
根据本发明的实施例，所述非综合征型遗传性耳聋为非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
根据本发明的实施例，所述试剂包括特异性针对所述核酸、所述基因突变和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。例如，发明人可通过特异性识别所述多肽的抗体与所述多肽的特异性结合来检测待测样品中是否存在上述突变，即通过特异性抗体与抗原的相互作用来检测上述多肽是否存在；发明人还可以通过预先设计特异性识别所述核酸或基因突变的探针，通过探针与上述核酸或基因突变位点所在的核酸片段发生互补配对，来鉴别上述核酸或基因突变的存在；发明人还可以设计用于扩增上述基因突变所在外显子的特异性引物，进而通过基因扩增以及测序，确定上述基因突变是否存在；发明人还可以通过质谱来检测多肽的m/z来判断，上述发生p.Arg1651Cys突变的多肽是否存在。根据本发明的具体实施例的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一能特异性、高灵敏性地检测出前面所述的核酸或者前面所述的基因突变或者前面所述的多肽，进而特异性、高灵敏性地筛选出患非综合征型遗传性耳聋，尤其是患非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的生物样品，进而能有效用于制备筛选患非综合征型遗传性耳聋，尤其是患非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的生物样品的试剂盒或者设备。
生物模型
在本发明的第五方面，本发明提出了生物模型在筛选药物中的用途。根据本发明的实施例，所述生物模型携带下列至少之一：(1)权利要求1所述的核酸；(2)权利要求2所述的基因突变；(3)表达权利要求3所述的多肽。需要说明的是，“生物模型携带前面所述的核酸”表示，本发明的生物模型携带与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变的COL4A2基因突变体的核酸序列；“生物模型携带前面所述的基因突变”表示，本发明的生物模型携带的COL4A2基因与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变。“生物模型携带前面所述的多肽”表示，本发明的生物模型携带与野生型COL4A2基因表达的蛋白相比具有p.Arg1651Cys突变的多肽。根据本发明的实施例的生物模型能有效地用作非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的相关研究的模型。
根据本发明的实施例，所述生物模型为细胞模型或者动物模型。
试剂在制备药物中的用途
在本发明的第六方面，本发明提出了特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗非综合征型遗传性耳聋。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的发病密切相关，由此，特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂制备的药物能有效用于治疗非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
根据本发明的实施例，所述非综合征型遗传性耳聋为非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
根据本发明的实施例，所述试剂为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。例如，CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，CRISPR-Cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于CRISPR-Cas9的方法，发明人可以设计出sgRNA并合成该序列的gRNA，然后将gRNA与d Cas9在细胞中共表达，通过gRNA介导d Cas9蛋白与目标DNA区域结合，进而实现特定位点的修复或改变。
治疗非综合征型遗传性耳聋的药物
在本发明的第七方面，本发明提出了一种用于治疗非综合征型遗传性耳聋的药物。根据本发明的实施例，所述药物含有：特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂。需要说明的是，这里的特异性改变是指能使得突变的核酸或者基因突变的位点恢复到原来的野生状态或者其他不具有致病性的状态，而对于个体基因组的其他序列不产生实质影响。如前所述，前面所述的核酸或者前面所述的基因突变与非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的发病密切相关，由此，包含特异性改变前面所述的核酸或者前面所述的基因突变的试剂的药物能有效用于治疗非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
根据本发明的实施例，所述非综合征型遗传性耳聋为非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
根据本发明的实施例，所述试剂为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。例如，CRISPRs技术是一种由RNA指导Cas蛋白对靶向基因进行修饰的技术，CRISPR-Cas9主要通过基因敲除、特种变异的引入和定点转基因三种途径来实现基因组改造，基于CRISPR-Cas9的方法，发明人可以设计出sgRNA并合成该序列的gRNA，然后将gRNA与d Cas9在细胞中共表达，通过gRNA介导d Cas9蛋白与目标DNA区域结合，进而实现特定位点的修复或改变。
筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法
在本发明的第八方面，本发明提出了一种筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括以下步骤：从生物样品提取核酸样本；确定所述核酸样本的核酸序列；所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型COL4A2基因相比是否具有c.4951C>T突变，判断所述生物样品是否患非综合征型遗传性耳聋，其中，所述核酸样本的核酸序列或其互补序列，与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变，是所述生物样品患有非综合征型遗传性耳聋的指示。通过根据本发明实施例的筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法，可以有效地筛选患非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的生物样品。
首先，从生物样品提取核酸样本。根据本发明的实施例，生物样品的类型并不受特别限制，只要从该生物样品中能够提取到反映生物样品COL4A2基因是否存在突变的核酸样本即可。根据本发明的实施例，生物样品可以为选自人体血液、皮肤、皮下组织的至少一种。由此，可以方便地进行取样和检测，从而能够进一步提高筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的效率。根据本发明的实施例，这里所使用的术语“核酸样本”应做广义理解，其可以是任何能够反映生物样品中COL4A2基因是否存在突变的样本，例如可以是从生物样品中直接提取的全基因组DNA，也可以是该全基因组中包含COL4A2基因编码序列的一部分，可以是从生物样品中提取的总RNA，也可以是从生物样品中提取的mRNA。根据本发明的一个实施例，所述核酸样本为全基因组DNA。由此，可以扩大生物样品的来源范围，并且可以同时对生物样品的多种信息进行确定，从而能够提高筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的效率。另外，根据本发明的实施例，针对采用RNA作为核酸样本，从生物样品提取核酸样本可以进一步包括：从生物样品提取RNA样本，优选RNA样本为mRNA；以及基于所得到的RNA样本，通过反转录反应，获得cDNA样本，所得到的cDNA样本构成核酸样本。由此，可以进一步提高利用RNA作为核酸样本筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的效率。
接下来，在得到核酸样本之后，可以对核酸样本进行分析，从而能够确定所得到核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，确定所得到核酸样本的核酸序列的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的具体实施例，可以通过测序方法，确定核酸样本的核酸序列。根据本发明的实施例，可以用于进行测序的方法和设备并不受特别限制。根据本发明的实施例，可以采用第二代测序技术，也可以采用第三代以及第四代或者更先进的测序技术。根据本发明的具体实施例，可以利用选BGISEQ-500、BGISEQ-500RS、HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对核酸序列进行测序。由此，结合最新的测序技术，针对单个位点可以达到较高的测序深度，检测灵敏度和准确性大大提高，因而能够利用这些测序装置的高通量、深度测序的特点，进一步提高对核酸样本进行检测分析的效率。从而，能够提高后续对测序数据进行分析时的精确性和准确度。由此，根据本发明的实施例，确定核酸样本的核酸序列可以进一步包括：首先，针对所得到的核酸样本，构建核酸测序文库；以及对所得到的核酸测序文库进行测序，以便获得由多个测序数据构成的测序结果。根据本发明的一些实施例，可以采用选自BGISEQ-500、BGISEQ-500RS、HISEQ2000、SOLiD、454和单分子测序装置的至少一种对所得到的核酸测序文库进行测序。另外，根据本发明的实施例，可以对核酸样本进行筛选，富集COL4A2基因外显子，该筛选富集可以在构建测序文库之前，构建测序文库过程中，或者构建测序文库之后进行。可以采用外显子靶向序列富集系统如：华大自主外显子捕获芯片，Aglient SureSelect，Nimblegen等其他外显子或目标区域捕获平台，对目标片段进行富集。根据本发明的一个实施例，针对核酸样本，构建核酸测序文库进一步包括：利用选自COL4A2基因特异性引物的至少一种，对核酸样本进行PCR扩增；以及针对所得到的扩增产物，构建核酸测序文库。由此，可以通过PCR扩增，富集COL4A2基因外显子，从而能够进一步提高筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的效率。根据本发明的实施例，COL4A2基因特异性引物的序列不受特别限制，例如可以参考人类基因组序列数据库GRCh37.1/hg19，采用Primer3.0在线设计获得，例如可以参考UCSC(http://genome.ucsc.edu/)，应用Primer3(version 0.4.0,http://primer3.ut.ee/)设计候选基因的引物并合成(北京六合华大基因科技有限公司合成)，并利用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)验证引物特异性。根据本发明的一些具体示例，针对c.4951C>T突变，所述COL4A2基因特异性引物具有如SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列。发明人惊奇地发现，通过采用SEQ ID NO：1-2所示的引物，可以在PCR反应体系中显著有效地完成对COL4A2基因突变的全基因组序列的扩增。需要说明的是，SEQ ID NO：1-2所示的核苷酸序列是本发明的发明人在付出了艰苦的劳动后，意外获得的。
正向引物：GGCTGTGAATTAGTGTCCAT(SEQ ID NO：1)，
反向引物：TGGCACCTGAGGTAATAAGT(SEQ ID NO：2)。
关于针对核酸样本，构建测序文库的方法和流程，本领域技术人员可以根据不同的测序技术进行适当选择，关于流程的细节，可以参见测序仪器的厂商例如Illumina公司所提供的规程，例如参见Illumina公司Multiplexing Sample Preparation Guide(Part#1005361；Feb 2010)或Paired-End SamplePrep Guide(Part#1005063；Feb 2010)，通过参照将其并入本文。根据本发明的实施例，从生物样品提取核酸样本的方法和设备，也不受特别限制，可以采用商品化的核酸提取试剂盒进行。
需要说明的是，在这里所使用的术语“核酸序列”应作广义理解，其可以是在对核酸样本进行测序得到的测序数据进行组装后，得到的完整的核酸序列信息，也可以是直接采用通过对核酸样本进行测序所得到的测序数据(reads)作为核酸序列，只要这些核酸序列中含有对应COL4A2基因的编码序列即可。
最后，在确定核酸样本的核酸序列之后，将所得到的核酸样本的核酸序列相应的参考序列进行比对，当所得到的核酸序列中具有前述的突变时，即指示生物样品患非综合征型遗传性耳聋。由此，通过根据本发明实施例的筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法，可以有效地筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品。根据本发明的实施例，对核酸序列与相应野生型基因序列进行比对的方法和设备并不受特别限制，可以采用任意常规的软件进行操作，根据本发明的具体实例，可以采用SOAPALIGNER/SOAP2进行比对。
需要说明的是，根据本发明实施例的“筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法”的用途不受特别限制，例如可以用作非诊断目的的筛选方法。
构建体及重组细胞
在本发明的第九方面，本发明提出了一种构建体。根据本发明的实施例，所述构建体包含前面所述的核酸或前面所述的基因突变。需要说明的是，“构建体包含前面所述的核酸”表示，本发明的构建体包含与野生型COL4A2基因相比，核酸具有c.4951C>T突变。“构建体包含前面所述的基因突变”表示，本发明的构建体包含的COL4A2基因与野生型COL4A2基因相比具有c.4951C>T突变。由此，根据本发明实施例的构建体转化受体细胞获得的重组细胞，能够有效地用作非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的相关研究的模型。其中，所述受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选该受体细胞来源于哺乳动物。
在本发明中所使用的术语“构建体”是指这样的一种遗传载体，其包含特定核酸序列，并且能够将目的核酸序列转入宿主细胞中，以获得重组细胞。根据本发明的实施例，构建体的形式不受特别限制。根据本发明的实施例，其可以为质粒、噬菌体、人工染色体、粘粒(Cosmid)、病毒的至少一种，优选质粒。质粒作为遗传载体，具有操作简单，可以携带较大片段的性质，便于操作和处理。质粒的形式也不受特别限制，既可以是环形质粒，也可以是线性质粒，即可以是单链的，也可以是双链的。本领域技术人员可以根据需要进行选择。在本发明中所使用的术语“核酸”可以是任何包含脱氧核糖核苷酸或者核糖核苷酸的聚合物，包括但不限于经过修饰的或者未经修饰的DNA、RNA，其长度不受任何特别限制。对于用于构建重组细胞的构建体，优选所述核酸为DNA，因为DNA相对于RNA而言，其更稳定，并且易于操作。
在本发明的第十方面，本发明提出了一种重组细胞。根据本发明的实施例，所述重组细胞是通过前面所述的构建体转化受体细胞或者表达前面所述的多肽而获得的。根据本发明的一些实施例，本发明的重组细胞，能够有效地用作非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的相关研究的模型。
根据本发明的实施例，受体细胞的种类不受特别限制，例如可以为大肠杆菌细胞、哺乳动物细胞，优选所述受体细胞来源于非人哺乳动物。
检测非综合征型遗传性耳聋的试剂盒
在本发明的第十一方面，本发明提出了一种检测非综合征型遗传性耳聋的试剂盒。根据本发明的实施例，所述试剂盒中包括检测前面所述的核酸的试剂，和/或检测前面所述的基因突变的试剂，和/或检测前面所述的多肽的试剂。如前所述，前面所述的核酸、基因突变、多肽与非综合征型遗传性耳聋的发病密切相关，进而能用于包含能有效地检测前面所述的核酸或前面所述的基因突变或前面所述的多肽的试剂的试剂盒能有效筛选出患非综合征型遗传性耳聋，尤其是非综合征型常染色体显性遗传性耳聋的生物样品。
需要说明的是，在本文前面筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法部分中所描述的特征和优点，同样适用于筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的系统或者试剂盒，在此不再赘述。
此外，还需要说明的是，根据本发明实施例的筛选患非综合征型遗传性耳聋的生物样品的方法、系统以及试剂盒，是本申请的发明人经过艰苦的创造性劳动和优化工作才完成的。
下面参考具体实施例，对本发明进行说明，需要说明的是，这些实施例仅仅是说明性的，而不能理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所采用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，可以参照《分子克隆实验指南》第三版或者相关产品进行，所采用的试剂和产品也均为可商业获得的。未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法，所用试剂的来源、商品名以及有必要列出其组成成分者，均在首次出现时标明，其后所用相同试剂如无特殊说明，均以首次标明的内容相同。
实施例
发明人通过外显子测序及连锁定位技术筛选一个非综合型常染色体显性耳聋家系的候选变异，通过生物信息学分析，筛除非致病核苷酸变异，缩小候选变异数目，对候选变异设计引物，进行PCR扩增，产物纯化，Sanger测序，对家系内成员和正常对照人群进行候选变异检测，共分离分析，明确基因突变与疾病的关系。对比其它生物中的同源基因，生物学软件预测突变致病性，通过小鼠内耳表达发现COL4A2基因与听觉系统的关系，分析多肽表达情况。具体方法步骤如下：
1、样本收集：
发明人收集到一个连续4代发病的中国汉族人遗传性耳聋家系(家系图见图1)，该家系由26名成员组成，其中确诊患者10例，现存患者8例，其中7例患者(B1、B2、B3、B4、B6、B7、B11)做了纯音测听测试(纯音测听图见图2)，收集到的患者血液样本7例(B1、B2、B3、B4、B6、B7、B11)；收集到的表型正常人血液人样本4例(B5、B9、B10、B12)。每个样本采集外周血样品2mL，加入EDTA抗凝，-80摄氏度保存。
2、DNA提取
采用OMEGA Blood DNA Midi Kit全血DNA提取试剂盒从外周血样品中提取DNA，提取步骤如下：
(1)取2ml全血样本，加入150ul OB Protease，2.1mL Buffer BL和20uL RNase A，最大速度漩涡1分钟，彻底混匀；
(2)65摄氏度水浴15-20分钟，并在水浴过程中漩涡5次；
(3)加入2.2mL无水乙醇，最大速度漩涡30秒，彻底混匀；
(4)将3.5mL裂解液移入带过滤柱的15ml离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤；
(5)将第3步剩余裂解液加入带过滤柱的15mL离心管，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；
(6)加入3mL HB Buffer，洗涤过滤柱，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；
(7)加入3mL DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；
(8)再次加入3mL DNA Wash Buffer，4000转离心5分钟，取出过滤柱，倒掉过滤液体，放回过滤柱；
(9)4000转离心15分钟，甩干过滤柱；
(10)将过滤柱移至新的15mL离心管，加入500uL 70摄氏度的Elution Buffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液；
(11)再次将过滤柱移至新的15mL离心管，加入500uL 70摄氏度的ElutionBuffer，室温静置5分钟，4000转离心5分钟，收集含有DNA的过滤液。
3、外显子捕获测序与变异分析
发明人对家系中的7例样本(B1、B3、B4、B5、B6、B7、B8)进行全基因组测序及数据分析。
其中，基于BGISEQ-500高通量测序平台，对上述7例样本进行全基因组测序，具体步骤如下：
(1)样品制备
分别取上述7份样本(B1、B3、B4、B5、B6、B7、B8)的外周血样品的基因组DNA，利用分光光度计及凝胶电泳法测量DNA的浓度及纯度，所得的每个标本基因组DNA的OD260/OD280均位于1.7-2.0之间，浓度不少于200ng/μL，总量不少于30μg，备用。
(2)文库构建及测序
利用自适应高聚焦超声技术(Covaris)将各基因组DNA样本随机打断成150-200bp左右的片段，随后按照制造商提供的操作说明书，在片段两端分别连接上接头制备文库。
文库制备过程和测序过程如下所述：
a)设计引物：文库构建所用到的引物由北京六合华大基因科技有限公司合成，并利用Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/)验证引物特异性，引物序列如下：
正向引物：5'-GGCTGTGAATTAGTGTCCAT-3'(SEQ ID NO：1)
反向引物：5'-TGGCACCTGAGGTAATAAGT-3'(SEQ ID NO：2)。
b)利用所设计的引物对提取的DNA标本进行扩增，其中PCR扩增体系和扩增条件如下所述：
PCR反应体系：
Figure BDA0001791443190000151
PCR反应条件：
Figure BDA0001791443190000152
c)PCR产物分析：将PCR产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳(据扩增片段大小选择合适的电压)，分析电泳图谱；
d)选择带型单一且浓度较高的样本经PCR产物纯化后获得测序文库，文库检测合格后即可上机测序，以便获得原始测序数据。其中，参照BGISEQ-500的protocol进行测序，读取长度为100bp，样本的平均测序深度约为40X。
(3)变异检测及筛选
将上述测序产出数据依次进行初步统计分析、SNP检测和注释及氨基酸替换的预测，主要步骤如下：
将测序产出数据进行基本数据分析统计：测得的序列reads长度分析、统计reads数量和数据的产量、reads序列与参考基因组序列的比对、测序深度(Depth)等。根据以上基本数据的统计结果，得到通过全基因组测序的样本基本信息，并判断数据是否符合要求。
将各样本的高质量的原始reads通过SOAPaligner(v2.21)及Burrows-WheelerAligner(BWA,0.7.15)比对软件比对到参考基因组(hg19)上，然后利用Genome AnalysisToolkit(GATK,v3.3-0)软件检测SNP和Indel，使用Variant Effect Predictor(VEP)对检测到的变异进行变异注释，同时添加1KG/ESP/HapMap/ExAC等频率数据库及OMIM、GO、KEGG、危害性预测等信息。根据非综合征型常染色体显性遗传性耳聋(ADNSHL)的患病率，过滤掉低质量值、高频(1KG/ESP/HapMap/ExAC/gnomAD>0.005)及内含子区的变异。然后，根据家系遗传模式，筛选出患者共有而家系中正常人不具有的变异，最后筛选出12个候选变异。
采用美国ABI公司自动基因分析仪3500测序分析PCR扩增产物，分析测序图，与标准序列进行对比，分析突变。鉴定致病基因及致病突变，表示COL4A2基因编码区第4951位碱基发生C→T改变(图3)。
4、实验验证
COL4A2基因编码的IV型胶原是基膜的主要结构成分。该蛋白的C-末端部分，被称为血管能抑素，是血管生成和肿瘤生长的抑制剂。与脑穿通和颅内出血相关。在UniGene数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/unigene)及SHIELD数据库(https://shield.hms.harvard.edu/gene_search.html)均记录该基因在耳部有表达。
COL4A2基因具有48个外显子，突变c.4951C>T位于第48号外显子，导致48号外显子1651位精氨酸突变为半胱氨酸。迄今为止，尚未发现COL4A2基因在听觉系统的作用。为了进一步研究COL4A2在听觉系统的功能，发明人通过小鼠耳蜗冰冻切片及耳蜗基底膜铺片的免疫荧光实验，发现Col4a2蛋白在小鼠内耳有广泛表达，其中，螺旋神经节、螺旋韧带靠近蜗壳处、corti’s器的支持细胞、骨螺旋板内的毛细血管壁等部位表达明显，毛细胞表达微弱，见图4。此外，COL4A2与多个已知的耳聋致病基因COL4A3、COL4A4、COL4A5等高度同源，因此，COL4A2c.4951C>T(p.Arg1651Cys)可能会导致非综合征型常染色体显性遗传性耳聋(ADNSHL)的发生。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，本领域的普通技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国人民解放军总医院
深圳华大生命科学研究院
<120> 基因突变体及其应用
<130> PIDC3183601
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 正向引物
<400> 1
ggctgtgaat tagtgtccat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 反向引物
<400> 2
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Claims (8)

1.检测核酸或多肽的试剂在制备试剂盒或者设备中的用途，所述试剂盒或者设备用于诊断非综合征型遗传性耳聋；
所述核酸与野生型COL4A2基因相比，具有c.4951C>T突变；
所述多肽与野生型COL4A2基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述多肽的氨基酸序列具有p.Arg1651Cys的突变；
所述非综合征型遗传性耳聋为非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述试剂包括特异性针对所述核酸和所述多肽的至少之一的抗体、探针、引物以及质谱检测试剂的至少之一。
3.生物模型在筛选药物中的用途，所述生物模型携带下列至少之一：
（1）核酸，所述核酸与野生型COL4A2基因相比，具有c.4951C>T突变；
（3）多肽，所述多肽与野生型COL4A2基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述多肽的氨基酸序列具有p.Arg1651Cys的突变；
所述生物模型为细胞模型。
4.特异性改变核酸的试剂在制备药物中的用途，所述药物用于治疗非综合征型遗传性耳聋；
所述核酸与野生型COL4A2基因相比，具有c.4951C>T突变；
所述非综合征型遗传性耳聋为非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述试剂为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。
6.一种用于治疗非综合征型遗传性耳聋的药物，其特征在于，所述药物含有：
特异性改变核酸的试剂；
所述核酸与野生型COL4A2基因相比，具有c.4951C>T突变；
所述非综合征型遗传性耳聋为非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
7.根据权利要求6所述的药物，其特征在于，所述试剂为基于shRNA、反义核酸、核酶、显性负突变、CRISPR-Cas9、CRISPR-Cpf1和锌指核酸酶至少之一的试剂。
8.一种检测非综合征型遗传性耳聋的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括检测的核酸的试剂，和/或检测多肽的试剂；
所述核酸与野生型COL4A2基因相比，具有c.4951C>T突变；
所述多肽与野生型COL4A2基因表达的多肽的氨基酸序列相比，所述多肽的氨基酸序列具有p.Arg1651Cys的突变；
所述非综合征型遗传性耳聋为非综合征型常染色体显性遗传性耳聋。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1733917A (zh) * 2004-09-17 2006-02-15 中国人民解放军总医院 与人类感音神经性耳聋相关的wfs1突变基因及其在诊断遗传性耳聋中的应用
CN103710340A (zh) * 2013-10-12 2014-04-09 中国人民解放军总医院 一种i型usher综合征相关基因突变及应用此突变基因的耳聋分子病因学诊断试剂
CN104450726A (zh) * 2013-09-17 2015-03-25 深圳华大基因科技有限公司 Col4a5基因突变体及其应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1733917A (zh) * 2004-09-17 2006-02-15 中国人民解放军总医院 与人类感音神经性耳聋相关的wfs1突变基因及其在诊断遗传性耳聋中的应用
CN104450726A (zh) * 2013-09-17 2015-03-25 深圳华大基因科技有限公司 Col4a5基因突变体及其应用
CN103710340A (zh) * 2013-10-12 2014-04-09 中国人民解放军总医院 一种i型usher综合征相关基因突变及应用此突变基因的耳聋分子病因学诊断试剂

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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