HUE030510T2 - Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával - Google Patents

Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával Download PDF

Info

Publication number
HUE030510T2
HUE030510T2 HUE12175754A HUE12175754A HUE030510T2 HU E030510 T2 HUE030510 T2 HU E030510T2 HU E12175754 A HUE12175754 A HU E12175754A HU E12175754 A HUE12175754 A HU E12175754A HU E030510 T2 HUE030510 T2 HU E030510T2
Authority
HU
Hungary
Prior art keywords
chromosome
sequences
nucleic acid
biological sample
sequencing
Prior art date
Application number
HUE12175754A
Other languages
English (en)
Inventor
Yuk-Ming Dennis Lo
Rossa Wai Kwun Chiu
Kwan Chee Chan
Original Assignee
Univ Hong Kong Chinese
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39798126&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=HUE030510(T2) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Univ Hong Kong Chinese filed Critical Univ Hong Kong Chinese
Publication of HUE030510T2 publication Critical patent/HUE030510T2/hu

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6883—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for diseases caused by alterations of genetic material
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6869—Methods for sequencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/10—Ploidy or copy number detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B20/00—ICT specially adapted for functional genomics or proteomics, e.g. genotype-phenotype associations
    • G16B20/20—Allele or variant detection, e.g. single nucleotide polymorphism [SNP] detection
    • G—PHYSICS
    • G16—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR SPECIFIC APPLICATION FIELDS
    • G16B—BIOINFORMATICS, i.e. INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR GENETIC OR PROTEIN-RELATED DATA PROCESSING IN COMPUTATIONAL MOLECULAR BIOLOGY
    • G16B30/00—ICT specially adapted for sequence analysis involving nucleotides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/112—Disease subtyping, staging or classification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/154—Methylation markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/38—Pediatrics
    • G01N2800/385—Congenital anomalies
    • G01N2800/387—Down syndrome; Trisomy 18; Trisomy 13
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A90/00—Technologies having an indirect contribution to adaptation to climate change
    • Y02A90/10—Information and communication technologies [ICT] supporting adaptation to climate change, e.g. for weather forecasting or climate simulation

Description

Magzati kromoszómáim aneopioidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával
Leírás
ELSŐBBSÉG! IGÉNY
|Ö0011 Jelen bejelentés igényli a 60/861438 számú, ^DETERMINING A NUCLEIC ACID SEQUENCE IMBALANCE” (EGY NU KIÉ INSAV-SZEKVENCIA EGYENSÚLYHIÁNYÁNAK MEGHATÁROZÁSA) című, 2007. július 23-án benyújtott ideiglenes Amerikai Egyesült Államok-beN bejelentés elsőbbségét, és annak nem ideiglenes bejelentése (ügyvivői iktatószám; Ö16280~ÖD62ÖÖUS),
KERESZTHIVATKOZÁS A ROKON BEJELENTÉSEKRE
IOŐ0Z3 Jelen bejelentés kapcsolódik a „DETERMINING A NUCLEIC ACID SEQUENCE IMBALANCE” (EGY N U KLE IN SAV-SZEKVE NCIA EGYENSÚLYHIÁNYÁNAK MEGHATÁROZÁSA} című, egyidejűleg benyújtott, nem Ideiglenes bejelentéshez is (ügyvivői iktatőszám; Ö16285~005210US).
MŰSZAKI TERÜLET
[ÖÖ03J A találmány általánosságban a magzati kromoszőmális aneupioidia diagnosztikai vizsgálatára vonatkozik, amely különböző nukleinsav-szekvencsák közötti egyensúlyhiány meghatározásával történik, közelebbről a 2i~es triszómla (Down-színdrórna) és egyéb kromoszómád aneuploidiák anyai minta (pl,, vér) vizsgálata révén történő azonosítására.
A TECHNIKA ÁLLÁSA
|ÖÖ04| A magzati kromöszómális aneupiöidiát egy kromoszóma vagy kromoszómarégió rendéiíenés adag(ok)ban váló jelenléte eredményezi. A rendellenes adag(ok) lehetmek) rendellenesen magasí ak), pü a 21-és kiszórnia esetében egy extra 21, kromoszóma vagy kromoszőmarégió jelenléte miatt; vagy lehelnek) rendellenesen alacsonyjak} Is, pl ahogy a T u mer-szi nd rom a esetéhen hiányzik az egyik X-kmmoszóma.
[000SJ Magzati kromoszómáiig anéupíöidia, pl, a 21-es iriszömia prenatálls diagnosztizálására szolgáló hagyományos eljárások során Invazív eljárással magzati anyagból vesznek mintát, ilyen például az amniocentézis vagy a kononboholy-niínfavétel. amely a magzat elvesztésének körülhatárolt kockázatával jár. A döntő invazív diagnosztikai eljárások előtt nem invazív eljárásokat, így például ultrahangos szűrést és biokémiai markereket alkalmaznak a terhes nők kockázat szempontjából történő besorolására. Ezek a szűrési eljárások azonban a lényegi kromoszőmáíis rendellenesség helyett tipikusan a kromoszőmáíis aneupíoídiával, pl, 21-es triszómíával járó kísérő jelenségeket mérik, igy szuboptirnális a diagnosztikai pontosságuk és egyéb hátrányaik is vannak, így például nagy mértékben befolyásolja őket, hogy mennyi Idős a terhesség.
[0O0$3 1997-ben felfedezték az anyai plazmában keringő sejtmentes (szabad) magzati DNS~t. és ez új lehetőségeket kínált a nem Invazív prenatálls diagnosztika terén (Lo, YMD és Chiu. RWK 2007. Nat Rév Goráét 8, 71-77.). Bár készséggel alkalmazták ezt az eljárást nemhez kapcsolt (Costa. JIV1 és mtsai. 2002. N Engl J Mód 346, 1502.) és bizonyos egygénes betegségek (Lo, YMD és mtsai. 1998, N Engl J Med 339, 1734-1738.) prenatális diagnosztizálására, a magzati krornoszőmáüs aneupioidiák prenaiáhs kimutatására történő alkalmazása meglehetősen nagy kihívást jelentett (Lo, YMD és Chiu, RWK 2007,, Id, fent). Először is a magzati nukieínsavak az anyai plazmában erős anyai eredetű nuklei nsav-háttérrel együtt vannak jelen, ami gyakran zavarja a magzati nukieínsavak analízisét (Lo, YMD és mtsai, 1998. Am J Hum Genet 62, 768-775,). Másodszor, a magzati oukleinsavak főként sejtmentes formában keringenek az anyai plazmában, ami megnehezíti a magzati genomban lévő gének vagy kromoszómák mennyiségével kapcsolatos információk kinyerését.
[0007] Nemrég jelentős előrelépés történt e kihívások legyőzése terén (Benachi, A és Costa, JM 2007. Lancet 369, 440-442,). Az egyik megközelítés szerint magzatspeoifíkus nukleihsavakat detektálnak az anyai plazmában, Így mégszűntetve az anyai háttér zavaró hatásának problémáját (Lo, YMD és Chiu, RVVK 200?., Id. fent). A 21, kromoszóma mennyiségét a piacenfáeredetú DNS/RNS-molekulákban iévo polimorf ailéiek arányaiból következtették ki. Ez az eljárás azonban kevésbé pontos, ha a minták kevesebbet tartalmaznak a megcélzott nukleinsavbői. és csak olyan magzatok esetében alkalmazható, akik heterozigoták a megcélzott polimorfizmusra, ami csak a populáció egy része* ha egyetlen polimorfizmust alkalmaznak. Hasonló célszekvencia-speciíikus megközelítéseket ismertetnek a következő publikációk: Lo, YMD és mtsai. (2007. Nature Medicine 13(2), 218-223.) összefogiaiják a kromoszómáké aneuploídia prenatális diagnosztizálására jelenleg alkalmazott eljárásokat és javaslatot tesznek egy nem invazív magzati kromoszórnavizsgálati stratégiára, amely az anyai plazmában lévő placentas expresszált mRNS analízisén alapúi. Kimutatták, hogy a magzati 21-es triszömsa nem invazív prenatális diagnózisa felállítható egy, a 21. kromoszóma egyik génje, a FLAC4 mRNS-ben lévő egynukléotidos polimorfizmus (SNP) ailéljei közötts arány alapján. l..o tehát egy a placentában expresszált gének alléiarányának célszekvenoia-specitikus analízisét ismerteti, Tong Yu K és mtsai. (2006. Clinical Chemistry 52(12), 2194-2202.) a 18. humán kromoszómán, a maspin (SERPINBS) praméterszekvanciákban lévő indukált egybázísös variáoíő alléiarányának analízisét ismerteti. A szerzők azt találták, hogy az aliéiarány alkalmas célpont az aneuploid magzatok eupioid magzatoktól való megkülönböztetésére. Az US 2004/137470 A1 számú irat genetikai rendeiienességek, igy például kromoszéma-rendeiíenességek kimutatására szolgáló eljárásokat Ismertet, Az eljárások során meghatározásra kerül egy választott heterozigOta lókusz egy specifikus célailéljének szekvenciája, valamint az allélek egy aránya, [OÖ08J Dhalian és munkatársai (Dhallan, E, és mtsai. 2007 , Id. fent; Dhallan, R, és mtsai. 2007. Lancet 389, 474-481.) egy alternatív stratégiát írtak le, amelynek során feldúsítják a keringésben lévő magzati DNS részarányát úgy, hogy formaldehidet adnak az anyai plazmához. Úgy határozták meg az anyai plazmában a magzat álla! hozzáadott, 21. kromoszómából származó szekvenciák részarányát, hogy megállapították az apától örökölt magzatspecifikus ailéiek és a nem a magzatra specifikus ailéiek arányát a 21. kromoszómán található egynukleofidos polimorfizmusokra (SNP-k), Egy referenciakromoszómára is hasonló módon kiszámították az SNP-arányokat, A magzat 21. kromoszómájának egyensúlyhiányára ezután úgy következtettek, hogy statisztikailag szignifikáns éjiérést mutattak ki a 21. kromoszóma SHP-arányai és a reíerenciakramoszóma SNP-aráhyai között, ahol is. a szignifikánst agy rögzított stö.Üδ-as p-érték alkalmazásával definiálták. A populáció nagymértékű lefedése érdekében kromoszómánként több, mint 500 SNP-t céloztak meg. Azonban ellentmondások jelentkeztek annak kapcsán, bogy a formaldehid hatékonyan magas részarányúra tudja -e dúsítani a magzati DNS-t (Chung, GTY, és mtsai. 2005. din Ghem 51, 655-868.}, Így az eljárás reprodukálhatósága további értékelést Igényel. És mivel minden egyes magzat és anya minden egyes kromoszóma esetében különböző számú SNP~re lenne informatív, minden esetben változó lenne a statisztikai teszt ereje az SNP-arány összehasonlítása tekintetében (Le, YMD és Chiu , RWK. 2007. Lancet 380, 1997.), Emellett mivel ezek a megközelítések genetikai polimorfizmusok detektálásától függenek, a megközelítések e polimorfizmusokra hoterozigöta magzatokra korlátozódnak.
[ÜÖ09J 21-es triszőmiás és euploid magzatokból származó amníocita tenyészetekben egy 21 kromoszómán található fókusz és egy referencialókusz polimeráz láncreakciójával (PCR) és DNS-kvantsfikálásával Zimmermann és munkatársai (2002 Clin Chem 48, 362-383.) meg tudták különböztetni a magzatok két csoportját azon az alapon, hogy az előbbiekben 1,5-szeresére nőtt a 21, kromoszómából származó DNS-szekvenciák mennyisége. Mivel a DNS-fempíát koncentrációjának 2-szeres növekedése csak egy küszöbciklusnyi (Ct) különbséget jelent, az 1,5~szeres eltérés megkülönböztetése jelentette a hagyományos valósidejű PCR határát. Ahhoz, hogy ennél finomabb kvantitatív megkülönböztetést érhessünk el, alternatív stratégiákra van szükség. (0010] Az allélarány elcsúszásának nukléihsav-mintákhan történő kimutatására digitális PCR-t fejlesztettek ki (Chang, HVV és mtsai. 2002. J Ittál! Cancer Inst 94, 1897Ί703.). A digitális PCR egy amplífíkáláson alapuló nukleínsav-anaíizis technika, amelyhez a nuklesnsavakat tartalmazó mintát diszkrét minták sokaságába kel! szétosztani, ahol is átlagban egyik minta sem tartalmaz többet mintánként körülbelül egy céiszekVénciánáL Meghatározott nukleinsav célpontokat szekvenciáspecifskus primerekké! ampííflkáfnak, hogy meghatározott ampllkonokat állítsanak elé digitális PCR-rel. A megcélzándó nukleinsav-lókuszokat és a reakcióba heleteendö szekvenciaspeeifíkus primerek fajtáját vagy paneljét a nukíeínsav-analizis előtt kell meghatározni vagy kiválasztani.
[0011] Klinikaiiag kimutatták, hogy ez alkalmas a heterozigozitas elvesztésének (loss of heterosigosity, LOH) kimutatására tumoreredétű DNS mintákban (Zhou, W, és misal 2002. Láncát 369, 219-225.). A digitális PCR emdményeínek elemzéséhez a korábbi vizsgálatok szekvenciális valószínűségi hányados tesztelést (SPRT) alkalmaztak, hogy aszerint osztályozzák a kísérleti eredményeket, hogy azok utalnak-e váz LÖN jelenlétére egy mintában vagy sem. (El Karoui és mtsai. 2006. itat kled 26, 3124-3133.).
[0012] A korábbi vizsgálatokban alkalmazott eljárásokban a digitális PCR-rel gyűjtött adatok mennyisége meglehetősen kiesi volt. így tehát a kevés adatpont és a tipikus statisztikai fluktuációk miatt romolhat a pontosság.
[0013] Kívánatos tehát, hogy a nem invazív teszteknek nagy legyen az érzékenysége és specifieitása, hogy ily oiődon minimalizálhassuk a fals negatív, illetve fals pozitív eredményeket. A magzati DNS azonban alacsony abszolút koncentrációban van jelen és az anyai plazmában és szérumban lévő összes DNS-szekvenciának csak égy kis részét (hányadát) képviselt. így tehát az is kívánatos, hogy olyan eljárások álljanak rendelkezésre, amelyek lehetővé teszik a magzati kromoszőmáiis aneuploidia nem invazív kimutatását az anyai háttérnukleinsavakaf tartalmazó biológiái mintából egy kisebb populációként létező, korlátozott mennyiségű magzati nukíeinsavakPót nyerhető genetikai Információ mennyiségének maximalizálásával.
RÖVID ÖSSZEFOGLALÁS
[0014] A találmány eljárást biztosít magzati kromoszőmáiis aneuploidia prenatálls diagnosztizálására terhes női alanyból származó biológiai mintából, ahol a biológiai minta anyai plazma és tartalmaz nukieinsav-molekuiákaf, amely eljárás során: megkapjuk a biológiai mintát: a biológiai mintában lévő nukleinsav-molekulák egy sokaságának legalább egy részét véletlenszerűen megszekvenáljuk, ahol a rnegszekvenált rész az emberi genom egy részletét (más szóval frakcióját) reprezentálja; a szekvenálás alapján: meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára az első kromoszómából származóként azonosított: szekvenciákból: meghatározunk egy második mennyiséget egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonosított szekvenciákból; meghatározunk egy paramétert az első mennyiségből és a második mennyiségből; összehasonlítjuk a paramétert egy vagy több küszöbértékkel; és az összehasonlítás alapján megáílapítunk egy besorolást aszerint hogy íennáll-e magzati kromoszómális aneupíoidia az első kromoszóma vonatkozásában.
[0015] Az eljárás egy másik megvalósítási módjában az eisö kromoszóma a 21, kromoszóma, a 18. kromoszóma, a 13. kromoszóma, az X-kromoszóma vagy az Y-kromoszórna.
[0016] Az eljárás egy másik megvalósítási módjában a paraméter az első kromoszómából származó szekvenciák aránya. Az arányt például a következők közül bármelyikből vagy bármelyekből kapjuk: a megszekvenáít darabok (szakaszok) számának egy részaránya, a megszekvenáít nukleotidok számának egy részaránya, és az akkumulálódott szekvenciák hosszának egy részaránya, Az első kromoszómából származó szekvenciákat például úgy választhatjuk ki, hogy rövidebbek legyenek egy adott számú bázispárnál Az adott számú bázispár lehet pl 300 hp; 200 bp vagy 100 hp.
[0Ö17J Az eljárás egy további megvalósítási módjában a biológiai minta nukleinsav-molekuíáit feldúsítottuk legalább egy bizonyos kromoszómábói származó szekvenciákra [00181 Az eljárás egy még további megvalósítási módjában a biológiai minta nukieinsav-molekuláit 300 bp-nál rövidebb szekvenciákra dúsítottuk fel. 100181 Az eljárás egy másik megvalósítási módjában a biológiai minta nukieinsav-molekuláit 2ÖÖ bp-nál rövidebb szekvenciákra dúsítottuk fel. |0O2OJ ^ eljárás· egy további megvalósítási módjában a biológiai minta nukieinsav-molekuláit egy pöísmeráz-láncreakció alkalmazásával ampÜkáltuk, [00211 Az eljárás egy még további megvalósítási módjában a részlet (frakció) az emberi genomnak legalább a 0,1 %-át vagy legalább a 0,5%-ái reprezentálja.
[0022] Az eljárás egy másik megvalósítási módjában a küszöbérték egy normál biológiai mintán alapuló referenciaérték.
[0023] Egy további aspektusból a találmány számitógépes programmal rendelkező terméket biztosit, amely tartalmaz számítógépes adathordozót, amelyre kódolva van számítógépes rendszer irányítására szolgáid utasítások egy sokasága olyan művelet elvégzésére, amelynek célja magzati kromoszómáké aneuploldia prenatális diagnosztizálása terhes női alanyból származó biológiai mintából, ahol a biológiai minta anyai plazma és tartalmaz nukfcinsavmoiekulákat, és amely művelet során; egy terhes női alanyból származó biológiai mintában lévő nukleínsav-molekuíák egy részének véletlenszerű szekvenálásából származó adatokat kapunk, ahol a biológiai minta tartalmaz nukleinsav molekulákat, és ahol a rész az emberi genom egy részletét reprezentálja; a véletlenszerű szekvenálás adatai alapján; meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára az első kromoszómából származóként azonosított szekvenciákból; meghatározunk egy második mennyiséget egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonosított, szekvenciákból; meghatározunk egy paramétert az első mennyiségből és a második mennyiségből; összehasonlítjuk a paramétert egy vagy több küszöbértékké!; ős az összehasonlítás alapján megállapítunk egy besorolást: aszerint, hogy fennáll-e magzati kromoszómáké aneuploldia az első kromoszóma vonatkozásában, [0024] A találmány megvalósítási módjai olyan eljárásokat biztosítanak, Illetve a leírás olyan rendszereket és készülékeket ismertét, amelyekkel meghatározható, hogy fennáll-e egy n uk le i n sa v~szekve nos a egyensúlyhiány (pl kromoszóma-egyensúlyhiány} terhes nőtől származó biológiai mintában. Ez a meghatározás oly módon végezhető el, hogy egy biológiai mintában egy klinikailag releváns kromoszómarégió egy mennyiségi paraméterét alkalmazzuk egyéb, klinikailag nem releváns kromoszőmarégíókhoz (háfíérrég lókhoz) viszonyítva. Egy megvalósítás szerint anyai piazmamintában lévő nukleinsav-motekuiák szökvenálásábői határozunk meg kromoszómáménnyiséget. Ismertetésre kerül továbbá anyai vizeletből, szérumból és más megfelelő biológiai mintákból történő meghatározás. A biológiai minta rmkíeínsav-molekuláit oly módon szekvenáijuk, hogy a genom egy részletét szekvenáijuk. Kiválasztunk egy vagy több küszöbértéket annak meghatározásához, hogy van-e változás egy referenciamennyiséghez képest (vagyis fennáll-e egyensúlyhiány), például két kromoszómarégió (vagy régiőcsoport) mennyiségének arányát tekintve, [002S] A találmány egy példaként felhozható megvalósítási módja szerint magzati kromoszémális aneupioidia prenatáiis diagnosztizálása céljából elemzőnk egy terhes nőtől kapott (leveti) biológiai mintát. A biológiai minta tartalmaz nukieínsav-molekulákat. A biológiai mintában lévő nukleinsav-molekulák egy részét megszekvenáljuk. Egy megvalósítás szerint az így kapott genetikai információmennyiség megfelelő a pontos diagnózishoz, de nem túlzottan nagy mértékű az input biológiai minta költség- és mennyiség-igényének vonatkozásában, [0Ő28] A szekvenáíás alapján meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára az első kromoszómából származóként azonosított szekvenciákból. Meghatározunk egy második mennyiséget egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonosított szekvenciákból. Ezután az első mennyiségből, valamint a második mennyiségből származó valamely paramétert összehasonlítjuk egy vagy több küszöbértékkel. Az összehasonlítás alapján megállapítunk egy besorolást aszerint, hogy fennáll-e magzati kromoszómáké aneupioidia az else kromoszóma vonatkozásában. A szekvenáíás előnyösen maximalizálja az anyai háftérnykíelnsavakat tartalmazó biológiai mintában egy kisebb populációként létező, korlátozott mennyiségű magzati nukleinsavakból nyerhető genetikai információ mennyiségét.
[0027] A találmány egy példaként felhozható megvalósítási módja szerint magzati kromoszómáké aneupioidia prenatáiis diagnosztizálása céljából elemzőnk egy terhes nőtől levett biológiai mintát. A biológiai minta nukíeinsav-molekuíákat tartalmaz. Azonosítjuk a magzati DNS egy adott: százalékát a biológiai mintában. A százalék alapján kiszámítunk egy szekvenosaszámot (N), amelyet a kívánt pontosság alapján elemezni kell, A biológiai mintában lévő hukleínsáv-moiekuiák legalább N számú tagját véletlenszerűen megszekvenáíjuk.
[0028] A random szekvenálás alapján meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára az első kromoszómából származóként azonosított szekvenciákból. Meghatározunk egy második mennyiségét egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonosított szekvenciákból, Ezután az első mennyiségből valamint a második mennyiségből származó valamely paramétert összehasonlítjuk egy vagy több küszöbértékkel. Az Összehasonlítás alapján megállapítunk egy besorolást aszerint, hogy fennáíke magzati kronioszómális aneuploidia az első kromoszóma vonatkozásában. A véletlenszerű szekvenálás előnyösen maximalizálja az anyai háttérnykleinsavakat tartalmazó biológiai mintában egy kisebb populációként létező, korlátozott mennyiségű magzati nukleinsavakbóí nyerhető genetikai információ mennyiségét |ÖÖ29J A találmány egyéb megvalósítási módjai a leírásban ismertetett eljárásokhoz kapcsolódó rendszerekre és számítógépes adathordozókra vonatkoznak, fÖÖ3ÖJ A találmány jellege és előnyei jobban megárthatok az alábbi részletes leírás és a csatolt ábrák alapján.
AZ ÁBRÁK RÖVID ISMERTETÉSE
[00311
Az 1. ábra egy folyamatábra, ami egy terhes női alanytól származó biológiai mintából egy magzati kromoszómális aneuploidia prenatális diagnosztizálására szolgáló, a találmány egy megvalósítási módja szerinti 100 eljárást mutat be. A 2, ábra egy folyamatábra, ami a találmány egy megvalósítási módja szerinti random szekvenálással végzett, egy magzati kromoszómális aneuploidia prenatális diagnosztizálására szolgáló 2ÖÖ eljárást mutat be. A 3Á. ábra a 21, kromoszómából származó szekvenciák százalékos reprezentáltságát mutatja 21~es triszórniás vagy euploid magzatokkal terhes anyák piazmarníniáiban a találmány egy megvalósítási módja szerint. A 3B. ábrán anyai plazmák magzati DNSAoncentrációinák részaránya közötti korreláció látható, amelyet tömeges párhuzamos szekvenáiássai, illetve mikrofluidikai digitális PCR-rel határoztunk meg a találmány egy megvalósítási módja szerint A 4A. ábra a kromoszómánként!, illesztett szekvenciák százalékos reprezentáltságát mutatja a találmány egy megvalósítási módja szerint. A 4B. ábrán a kromoszómánként! százalékos reprezentáltságnak a 4A. ábrán bemutatott 21-es triszómiás eset és euploid eset közötti %~os különbsége látható.
Az 6. ábra a 21. kromoszómából származó szekvenciák túlreprezentáltságának mértéke és a magzati DNS-koncentrácíők részaránya közötti korrelációt mutatja 21-es triszómiás magzatokkal terhes anyák piazmamíntáíban, a találmány egy megvalósítási módja szerint. A 8. ábrán látható táblázat emberi genom olyan részét mutatja, amelyet a találmány egy megvalósítási módja szerint analizáltunk. A Ϊ21 egy 21 es triszómiás magzatta! terhes alanyból származó mintát jelent. A 7, ábrán látható táblázat az euploid magzatoknak a 21 -es triszómiás magzatoktól való megkülönböztetéséhez szükséges szekvencíaszámot mutatja, a találmány egy megvalósítás! módja szerint, A 8A. ábrán látható táblázat a 21. kromoszómához illesztett megszekvenált darabok tíz legfontosabb kezdopozícióját mutatja, a találmány egy megvaSósitási módja szerint. A 88. ábrán látható táblázat a 22. kromoszómához illesztett megszekvenált darabok tíz legfontosabb kezdöpozieiöját mutatja, a találmány egy megvalósítás! módja szerint. A 9. ábrán a találmány megvalósítási módjai szerinti rendszerrel és eljárásokkal alkalmazható, egy példaként említhető számítógépes berendezés blokkdíagramja látható,
DEFINÍCIÓK I0Ö32J A Miöiógíaí minta” kifejezés a leírás szerinti értelemben bármely mintát jelenthet, amelyet egy alanytól (pl. egy embertől, így például egy terhes nőtől} vettek le, és tartalmaz egy vagy több számunkra érdekes nukleinsavak [ÜÖ33J A jiukleinsav’ vagy ,poimukieotkf kifejezés egy dezoxinbonukleinsavat (DNS) vagy ribonukleinsavat (RNS) jelent, vagy ezek egy polimerét, akár egyszálú, akár kétszálá formában. Ellenkező értelmű konkrét korlátozás hiányában a kifejezés a természetes nukleotídok ismert analógjait tartalmazó nukíeinsavakat is magában foglalja, amelyek hasonló kötési tulajdonságokká! rendelkeznek, mint a referencia nukleinsav és amelyek anyagcseréje a természetes előfordulású nukleotidokéhoz hasonlóan történik, Egyébirányú jelzés hiányában egy adott nukleinsav-szekvencia Implicit módon magában foglalja annak konzerválván (pl. degeneráit kodonszubsztitúctákkaí) módosított változatait, aliéijait, ortológjait, SNPat és komplementer szekvenciáit is, valamint magát az explicite megjelöli szekvenciát. A degeneráit kodonszubsztitúciőkat közeíebbröi úgy hozhatjuk létre, hogy olyan szekvenciákat generálunk, amelyekben egy vagy több kiválasztott (vagy az összes) kodon harmadik pozícióját kevert bázisú és/vagy dezoxinozin maradékokkal helyettesítjük [Batzer és mtsai., Nucleic Acid Res. 19:5081 (1991); Ohtsuka és mtsai., J. Biol. Chem. 280:2605-2808 (1986); és Rossolini és mtsai, IVlel, Cell, Probes 8:91-98 (1994)]. A nukleinsav kifejezés helyettesíthető a következőkkel: gén, cDNS, mRNS, kis nem kódoló RNS, mikro RNS (miRNS), plwbvel kölcsönható RNS, és rövid hajtő RNS (shRNS), amelyet egy gén vagy lökusz kódol.
[0034] A „gén” kifejezés olyan DNS~$zegmensf jelent, amely egy poSípeptidláno létrehozásában részt vesz. Emellett jelenthet a kódoló régiét megelőző és kővető (vezető és uszály) régiókat, valamint az egyes kódoló szegmensek (exonok) közé beékelődő szekvenciákat patronokat) is.
[0035] A jeakciá' kifejezés a leírás szerinti értelemben bármilyen eljárást jelenthet, amely olyan kémiai, enzimatíkus vagy fizikai hatást foglal magában, amely jélzi agy adott, számunkra érdekes polinukleotsd jelenlétét vagy hiányát. A »m®kció*~m példaként említhető egy ampliíikálási reakció, így például egy palirriérázdáncreakclö (PCR). Egy másik példa a „reakció” ~ra egy szekvenáiasi reakció, akár szintézissel akár ligáíássai történik. Az „informatív reakció" olyans amely egy vagy több adott, számunkra érdekes polínokleotsd-szekvencia jelenlétét jelzi, és egy esetben, ahol csak egy számunkra érdekes szekvencia van jelen, A „lyuk” kifejezés a leírás szerinti értelemben egy zárt szerkezetben - pl, egy PCR elrendezésben lévő lyuk alakú fiolában, sejtben vagy kamrában ··>- egy előre meghatározott helyen lefolytatott reakciót jeleni.
[ÖÖ3S] A „kiinik&iíag releváns nukíeinsav-szekvenciá" kifejezés a leírás szerinti értelemben jelenthet egy nagyobb genorniális szekvencia egy szegmensének megfelelő olyan poílnukieeiíd-szekvencíái amelynek potenciális egyensúlyhiányát vizsgáljuk, vágy jelentheti magát a nagyobb genomiáiis szekvenciát is. Egy példa a 21, kromoszóma szekvenciája. További példák többek között a 18. kromoszóma, a 13. kromoszóma, az X-kromoszóma és az Y kromoszóma Még további példák többek között az olyan mutált genetikai szekvenciák vagy genetikai polimorfizmusok vagy kőpiaszám-variáoíök, amelyeket a magzat az egyik vagy mindkét szülőtől örökölhet. Még további példák többek között az olyan szekvenciák, amelyek egy rosszindulatú tumorban mutáiódtak, deíéosora kerültek vagy amplifskálódtak, pl. olyan szekvenciák, amelyekben a heterozigozitás elvesztése vagy géndüplikáeió fordul elő. Egyes megvalósítási módokban több kllnlkailag releváns nükleinsav-szekvencia, vagy ezzel egyenértékű módon a kllníkailag releváns nukleinsav-szekvencia több markere alkalmazható az egyensúlyhiány detektálását szolgáló adatok kinyerésére. Például a 21. kromoszóma öt nem konszekutív szekvenciájából kapott adatok additív módon alkalmazhatók a 21. kromoszóma esetleges egyensúlyhiányának meghatározására, amivel gyakorlatilag egyötödére csökkenthető a szükséges mintatérfogat, [0037] A „háttér nukieinsm-smkvenviar kifejezés a leírás szerinti értelemben olyan nukleinsav-szekvencíát jelent, amelynek ismert a klíníkailag releváns nukleinsav-szekvenciához képesti normái aránya, amely például egy 1:1-es arány, Egy példa erre, amikor a háttér nukleinsav-szekvencia és a klínikallag releváns nukleinsav-szekvencia két alléi ugyanarról a kromoszómáról, amelyek a heterozigozitás miatt eltérőek. Egy másik példa szerint a háttér nukleinsav- szekvencia egy olyan alléi, amely heterozigóta egy másik alléira, amely a klinikailag releváns nukleinsav-szekvencia. Emellett az összes háttér nükieinsav-szekvenciák és a klinikailag releváns nukleinsav-szekvencsák egy része származhat különböze egyénekből, [0038] A „referencia nukleinsav-szekvencia’ kifejezés a leírás szerinti értelemben olyan nukleinsav-szekvencsát jelent, amelynek Ismert a reakciónként! átlagos koncentrációja., vagy ezzel egyenértékű módon megmérték azt, [0030] A „túlreprezentált nukleinsav-szekvencia” kifejezés a leírás szerinti értelemben olyan nukieinsav-szekvenciát jelent két számunkra érdekes szekvencia közül (pl. egy klinikailag releváns szekvencia és egy háttérszekvencia). amely nagyobb mennyiségben van jelen egy biológiai1 mintában, mint a másik szekvencia.
[0840] Az „alapján” kifejezés a leírás szerinti értelemben azt jelenti, hogy „legalább részben ,,, alapján", és egy másik érték meghatározására alkalmazott értékre (vagy eredményre) utál, mint az például egy eljárás egy inputja és ugyanannak az eljárásnak egy outputja közötti összefüggésnél előfordul. A „származtat kifejezés a leírás szerinti értelemben ugyancsak egy eljárás egy Inputja és ugyanannak az eljárásnak egy outputja közötti összefüggésre utal, mint amikor például a származtatás egy képlet kiszámítását jelenti., 10041] A „kvantitatív adatok* kifejezés a leírás szerinti értelemben olyan adatokat jelent, amelyeket egy vagy több reakclöból nyertünk, és amelyek egy vagy több számszerű értéket szolgáltatnak. Például, egy adott szekvencia valamely fluoreszcens markéról mutató lyukak száma kvantitatív adatnak minősülne, |0042] A „paraméter kifejezés a leírás szerinti értelemben olyan számszerű értéket jelent, amely jellemez egy kvantitatív adatsort és/vagy egy numerikus összefüggést kvantitatív adatsorok között. Például, egy paraméter lehet egy arány (vagy egy arány függvénye) egy első nukleinsav-szekvencia egy első mennyisége és egy második nukleinsav-szekvencia egy második mennyisége között, [0043] A „küszöbérték” kifejezés a leírás szerinti értelemben olyan számszerű értéket jelent, amelynek értekét arra használjuk, hogy döntést hozzunk két vagy több áilapotbesorolás (pl. kóros (pl. beteg) és nem kőrös (pl nem beteg)) között egy biológiai mintára nézve. Például ha egy paraméter nagyobb, mint a küszöbérték, akkor megállapítjuk a kvantitatív vadatok egy első besorolását (pl kóros állapot); vagy ha a paraméter kisebb, mint a küszöbérték, akkor megállapítjuk a kvantitatív adatok egy eltérő besorolását (pl. nem beteg állapot). [ÖÖ44] Az „egyensúlyhiány' kifejezés a leírás szerint* értelemben a ki ín lka slag releváns nukíeínsav-szekvencia mennyiségének a referenciamennyiséghez képesti bármilyen szignifikáns eltérését jelentheti, amelyet legalább egy küszöbérték definiál. Például; a referenciamennyiség egy 3/5~ös arány, így, ha a mért arány 1:1, akkor egyensúlyhiány áll fenn. |ÖÖ4S] A „kromemzómális aneuploidia” kifejezés a leírás szerinti értelemben egy kromoszóma kvantitatívmennyiségének eltérését jelenti egy diploid génemétől. Az eltérés lehet felszaporodás vagy csökkenés is. Emellett érintheti egy kromoszóma egészét vagy egy kromoszómarégíét is. JOO40] A „random szekvenálás” kifejezés a leírás szerinti értelemben olyan szekvenálást jelent, amelynek révén a szekvenált nukieinsavrtragmensekei specifikusan nem azonosítjuk be vagy célozzuk meg a szekvenálási eljárás előtt. Nincs szükség szekvenc-iaspedfikus primerekre a meghatározott géniókuszok megcélzásához. A megszekvenáít nukíeínsavak halmazai (más szóval elegye! vagy pooljai) mintáról mintára, sót azonos minta esetén elemzésről elemzésre is változnak. A meqszekvenált nukíeínsavak azonossága csak a generált szekvenálási outputból derül ki, A találmány egyes megvalósítási módjaiban a random szekvenálási megelőzhetik olyan műveletek, amelyekkel a biológiai minta feldúsítható bizonyos közös tulajdonságokkal rendelkező nukleinsavmolekulák adott populációira nézve. Egy megvalósítási módban a biológiai mintában tévő minden egyes fragmensnek egyenlő esélye van arra, hogy megszekvenáljuk. p)047j Az „emberi genom egy részlete" vagy az „emberi genom egy része” kifejezés a leírás szerinti értelemben a mintegy 3 milliárd bázispámyi nukíeotidból álló emberi genomban lévő szekvenciák kevesebb, mint 100%-át jelents. A szekvenálás kontextusában az emberi genomban lévő nukleotidszekvendák kevesebb, mint egyszeres lefedését jelenti. A kifejezés a nukleotidok/bázispárok százalékos arányaként vagy abszolút számaként is kifejezhető. Példaként az alkalmazásra, a kifejezés arra is használható, hogy az elvégzett szekvenálás tényleges mennyiségét jelentse. A megvalósítási módok meghatározhatják a pontos diagnózishoz szükséges minimális értéket az emberi genom mégszekvenáif részletére vonatkozóan. Egy másik példaként az alkalmazásra, a kifejezés a betegség besorolása érdekében egy paraméter vagy mennyiség származtatásához felhasznált szekvenálási adatok mennyiségét is jelentheti [ÖÖ48] A jneg&zekvenéíi darab” kifejezés a leírás szerinti értelemben egy nukíeínsav-moiekula egy részéből vagy egészéből megszekvenált nukleotidok egy sorát jelenti. Egy megszekvenált darab lehet például egy rövid nukieotídsor, amelyet egy η υ k le í n sa v~fragmensböI megszekvenáítunk, egy rövid nukieotídsor a n uk le i n sav-f rag mens két végénéi, vagy a kifejezés utalhat a biológiai mintában lévő teljes nukleinsav-f'ragmens szekvénáiására, Egy nukteinsav-fragmens egy nagyobb nukíeinsav-molekula bármely részét jelentheti. Egy fragmens (pl. egy gén) jelen lehet pl, a nagyobb nuklelnsav-moiekula további részeitől elkülönülten (vagyis nem kapcsoltan)
A TALÁLMÁNY RÉSZLETES ISMERTETÉSE
[0049] A találmány megvalósítási módjai olyan eljárásokat biztosítanak, illetve a leírás olyan rendszereket és készülékeket ismertet, amelyekkel meghatározható, hogy fennálLe egy kiinikaiiag releváns kromoszőmarégió felszaporodása vagy csökkenése (kóros állapot) egy nem kóros állapothoz képest. Ez a meghatározás oly módon végezhető el, hogy egy biológiai mintában egy kiinikaiiag releváns kromoszémarégió egy mennyiségi paraméterét alkalmazzuk egyéb, kiinikaiiag nem releváns krornoszómarégíókhoz (háttérrégiókhoz) viszonyítva. A biológiai minta nukielnsav-rnolekuláít oly módon szekvenáljuk, hogy a genom egy részletét szekvenáljuk, és a mennyiség meghatározható a szekvenálás eredményeiből Kiválasztunk egy vagy több küszöbértéket annak meghatározásához, hogy van-e változás egy referenóiamennyíséghez képest (vagyis fennálbe egyensúlyhiány), például két kromoszőmarégió (vagy régiőcsoport) mennyiségének arányát tekintve.
[ÜÜóÖJ A reférenciamennyiségre mért változás bármilyen (felfelé vagy lefelé Irányuló) eltérés lehet a kiinikaiiag releváns nukieinsav-szekvencíának az egyéb, kiinikaiiag nem releváns szekvenciákhoz való viszonyában. A referenciaáilapöt tehát lehet bármilyen arány vagy egyéb mennyiség (pl. az 1 1 ••estö! eltérő megfelelés), és egy változást jelző mért állapot lehet bármilyen arány vagy egyéb mennyiség, amely egy vagy több küszöbérték szerint meghatározva eltér a refe renoia men n yiségtől, iöOSI] A klinikaiíüg releváns krofeöszómarégiő (más néven klinikailag releváns nukleinsav-szekvencia} és a háttér nukleinsav-szekvencia származhat egy első típusú sejtből és egy vagy több második típusú sejtből. Például; magzati vagy piacentasejtekhől származó magzati nukleinsav-szekvenciák égy biológiai mintában, így például anyai plazmában, vannak jelen, amely tartalmazza az anyai sejtekből származó anyai nukleinsav-szekvenciák egy hátterét. Egy megvalósítási módban a küszöbértéket legalább részben egy biológiai mintában lévő sejtek egy első típusának egy százalékos aránya alapján határozzuk meg. Felhívjuk a figyelmet, hogy a magzati szekvenciák százalékos aránya egy mintában bármely magzati eredetű lókusz révén meghatározható és nem korlátozódik a klinikailag releváns nukieinsav-szekvenciák mérésére. Ismertetjük továbbá a küszöbérték meghatározását legalább részben a biológiai mintában - így például plazmában, szárúmban, nyálban vagy vizeletben - lévő tumorszekvenoiák százalékos aránya alapján, amely tartalmazza a szervezet nem rosszindulatú sejtjeiből származó nukieinsav-szekvenciák egy hátterét.
I. ÁLTALÁNOS ELJÁRÁS
[ÜÖS2J Az 1. ábra egy folyamatábra, ami egy terhes női alanytól származó biológiai mintából egy magzati kromoszómáké aneuplokila prenatáiis diagnosztizálására szolgáló, a találmány egy megvalósítási módja szerinti 100 eljárást mutat be. I0CJS31 Á 110 lépésben kapunk egy biológiai mintát a terhes nőtől, A biológiai minta lehet plazma, vizelet, szérum vagy bármely egyéb megfelelő minta. A minta tartalmaz a magzattól, valamint a terhes nőtől származó nukleinsav-molekulákat A nukk-bnsav-molekulák lehetnek például kromoszómák fragmensei.
[Ö064J A 120 lépésben a biológiai mintában lévő nukSeinsav-molekulák egy sokaságának legalább egy részét megszekvenáljuk. A megszekvenáii rész az emberi genom egy részletét reprezentálja. Egy megvalósítási módban a nuklesnsav-molekulák a megfejelő kromoszómák fragmensei MegszekvenáIhafő az egyik vég [pl. 35 bázispár (bp)j. mindkét vég vagy a feíjes fragmens is A mintában lévő összes nukleinsav-molekula megszekvenáIható, vagy csak egy részhalmazuk is rnegszekvenálható. Ez a részhalmaz választható véletlenszerűen, ahogy azt a későbbiekben részletesebben is Ismertetjük, |ÖÖSS| Egy megvalósítási módban a szekvenálás tömeges párhuzamos szekvenálással történik, A tömeges párhuzamos szekvenálás ~ mint péidáu! amely a 454 piaiforrnmaí (Roche) (Marguííes, M. és mtsai. 2005. Nature 437, 376-380.), az Illumine Genome Analyzer-res (vagy a Solexa platformmal) vagy a SOüD System-mel (Applied Biosystems) vagy a Helieos True Single Molecule DNS-szekvenáló technológiával (Harris ID és mtsai. 2008. Science, 320, 106-109,), a Pacific Bmsdences egymolekuíás, valósidejű (SMRTT!v1) technológiájával, és a nanopőrusos szekvenálással (Sons GV és Meíler A, 2007, Clin Chem 53:1996-2001} érhető el - lehetővé teszi egy mintából izolált sok nukielnsav-molekuia magas sokszorosítási nagyságrendbén, párhuzamos módon történő szekvenálását (Dear Brief Fuhct Genomic Proteomic 2003: 1: 387-418). Mindegyik ilyen platform a n uk lel π sav- frag me nsek kionáilsan feiszaporitott vagy akár amplifikáiatlan egyedi molekuláit is rnegszekvenátja, [ÖÖ58| Mivei minden egyes futtatásban minden egyes mintából nagyszámú - akár százezres vagy milliós, vagy akár százmilliós vagy -milliárdos nagyságrendű -szekvencia leolvasása történik, m eredményül kapott szekvenciádéolvasások az eredeti mintában lévő nukleinsav-féleségek keverékének egy reprezentatív profilját alkotják. A szekvencia-leolvasások haplotípus, transzkriptőma és metiiezési profiljai például az eredeti mintáéra hasonlítanak (Brenner és mtsai, Nai Biotech 2000; 18: 630-634; Taylor és mtsai, Cancer Res 2007; 67: 8511-8518), Mivel minden egyes mintából nagy szekvenciamíntát veszünk, az azonos szekvenciák száma ™ így például amely egy nukleinsav-halmaz (nukleinsavpoo!) sokszoros lefedettség vagy nagy redundancia mellett végzett szekvenálásából származik - ugyancsak jó kvantitatív reprezentálása az adott nukleinsav-féieség vagy iékusz számának az eredeti mintában. f005?3 A 130 lépésben a szekvenálás (pl, a szekvenálásból származó adatok) alapján meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára (pl a klinikaílag releváns kromoszómára), Az első mennyiséget az első kromoszómából származóként azonosított szekvenciákból határozzuk meg. Ezt kővetően például egy bioinformatikai eljárást alkalmazhatunk arra, hogy minden egyes Ilyen DNS-szekvenciát lokalizáljunk az emberi genomra. Lehetséges, hogy az ilyen szekvenciák egy részét mellőzni kell a további elemzések során, mivel az emberi genom ismétlődő régióiban vannak jelen, vagy olyan régiókban, amelyek egyénről egyénre változnak, pl, kópiaszám változatok. Tehát meghatározhatjuk a számunkra érdekes kromoszóma és egy vagy több egyéb kromoszóma egy mennyiségét.
[ÜÜ58J A 140 lépésben a szekvenálás alapján meghatározunk egy második mennyiséget egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonosított szekvenciákból. Egy megvalósítási módban a második kromoszómák az elsőn (vagyis a vizsgálton) kívül az összes kromoszómát jelentik. Egy másik megvalósítási módban a második kromoszóma csak egyetlen másik kromoszómát jelent [ÖÖS9J Számos módja van annak, hogy meghatározzuk a mennyiségeket a kromoszómákra, ezen belül többek között, de nem kizárólag megszámlálhatjuk adott kromoszómáikéból vagy kromoszömarégiökbö! származó megszekvenáii darabokat, megszekvenél? nukleotidokat (bázispárokat} vagy megszekvenáii nukieotidok (bázispárok) összesített hosszát.
[0O6OJ Egy másik megvalósítási módban szabályokat alkalmazhatunk a szekvenálás eredményéire, hogy meghatározzuk, mit számítunk. Egy megvalósítás szerint a szekvenáít output egy része alapján határozhatunk meg egy mennyiséget. Például: a bioínformatlkaí analízist követően kiválaszthatunk egy meghatározott mérettartományba eső nukleinsav-fragmenseknek megfelelő székvenálási outputot A mérettartomány lehet például kh, <300 bp, <200 bp vagy <100 bp [00811 A 150 lépésben meghatározunk egy paramétert az első mennyiségből, és a második mennyiségből. A paraméter lehet például az első mennyiségnek a második mennyiséghez viszonyított egyszerű aránya, vagy az első mennyiségnek a második mennyiség és az első mennyiség összegéhez viszonyított egyszerű aránya. Egy megvalósítás szerint mindegyik mennyiség lehet egy függvény vagy külön függvények argumentuma, ahol az arányt azután e külön függvényekből vehetjük A szákember felismeri, hogy sokféle különböző megfelelő paraméter lehetséges.
[00621 %.y megvalósítási módbán a bioi ufóimat! kai eljárás eredményeiből ezt követően kiszámítható egy kromoszómális aneuploldía által potenciálisan érintett kromoszóma ™ pl. a 21. kromoszóma vagy a 18, kromoszóma vagy a 13. kromoszóma - egy paramétere (pl. reprezentáltság! részaránya). A reprezentáltság! részarány megkapható az összes szekvencia (pl. a klinikaiiag releváns kromoszómát is beleértve az összes kromoszóma valamely méröszáma} vagy a kromoszómák agy adott részhalmazának (pl. a vizsgált kromoszómától eltérő egyetlen .kromoszóma) egy mennyisége alapján.
[0083] A 180 lépésben a paramétert összehasonlítjuk egy vagy több küszöbértékkel. A küszöbértékeket bármely számú megfelelő módszerrel meghatározhatjuk. Ilyen módszerek többek között a Bayés-típiisú likelihood módszer, a szekvenciális valószínűségi hányados tesztelés (SPRT), a hamis felfedezés (false discovery), a konfidencíaintervallum, és a vevő működési jellemzők (ROC). ilyen eljárások és míntaspecifikus eljárások alkalmazáséra példákat ismertet a jelen bejelentéssel egyidejűleg benyújtott „Determining a nucleic add sequence imbalance" (Egy rmkíeinsav-szekvenda egyensúlyhiányának meghatározása) című bejelentés (ügyvivői iktatószám: öl6285-0052IDUS), amelynek tartalmát a rá való hivatkozással a jelen leírásba beépítjük.
[0064] Egy megvalósítási módban a paramétert (pl. a kllnikallag releváns kromoszóma reprezentáltság! részarányát) ezután összehasonlítjuk egy referenoiatartománnyal, amely normál (vagyis euploid) magzatot hordozó terhességekben került megállapításra. Lehetséges, hogy az eljárás egyes változataiban a reíereneiatartornányt {vagyis a küszöbértékeket) egy adott anyai plazmamintában lévő magzati DNS koncentrációja ff) részarányénak megfelelően kell majd igazítani. Az f értéke a szekvenálási adatsorbői határozható meg, pl. az Y~kmmoszómára térképezhető szekvenciák alkalmazásával, ha a magzat fiú. Az f értéke külön analízisben Is meghatározható, pl, magzati epigenetikai markerek alkalmazásával (Chan KCA és mtsai, 2006. Clin Chem §2, 2211-8.}, vagy egynukleotidos polimorfizmusok analíziséből Is.
[8068] A 160 lépésben az összehasonlítás alapján megállapítunk egy besorolást aszerint, hogy fennáif-e magzati kromoszómáiig aneuploidia az első kromoszóma vonatkozásában. Egy megvalósítási módban a besorolás határozott nem vágy igen. Egy másik megvalósítási módban a besorolás lehet besorolhatatlan vagy bizonytalan. Egy még további megvalósítási módban a besorolás lehet egy pontszám, amely egy későbbi időpontban értelmezendő - pl. egy örvös által.
II, SZEKVENÁLÁS. ILLESZTÉS ES MENNYISÉGEK MEGHATÁROZÁSA
[8ÖÍ8] Ahogy már említettük, a genomnak csak egy részletét szekvenáljuk meg. Egy aspektus szerint ha egy mintában lévő nukleinsavak egy halmazát többszörös lefedettség helyett 100%-nál kisebb genomiáüs lefedettséggel szekvenáljuk meg, és a kifogott nukleinsav-mofekuíahányadbői, az egyes nukieinsav-féleségek közűi a legtöbb még így is csak egyszer szekvenálódtk meg. Egy adott kromoszóma vagy kromoszómarégié mennyiségbeli egyensúlyhiánya is meghatározható kvantitatívan. Más szóval a kromoszóma vagy kromoszőmarégio mennyiségben egyensúlyhiányára az alapján következtetünk, hogy milyen az adott fókusz százalékos reprezentáltsága a minta egyéb térképezhető, megszekvenált darabjaihoz képest.
[0087] Ezzel szembe állíthatók az olyan szituációk» amikor ugyanazt a nukieinsav-elegye! többszőr is megszekvenáijuk, hogy ily módon magas redundanciái vagy többszörös lefedettséget érjünk el, ami által mindegyik nukleinsav-féíeséget többször is megszekvenáljuk. Ilyen szituációkban az, hogy egy adott nukieinsav-féleség hányszor szekvenáíődik meg egy másik nukleínsav-féleséghez képest, korrelál azzal, hogy milyen a relatív koncentrációjuk az eredeti mintában. A szekvenálásí költségek azzal arányosan nőnek, hogy hányszoros lefedettségre van szükség a nukleinsav-féleséq pontos reprezentálásához.
[0088] Egy példában az ilyen szekvenciák egy része egy aneuploiciia által érintett kromoszómából: Igy például a 21 > kromoszómából származik ebben a szemléltető példában. Egy ilyen szekvenálásí műveletből származó még további szekvenciák az egyéb kromoszómákból származnának. A 21. kromoszóma többi kromoszómához képesti relatív méretét figyelembe véve egy ilyen szekvenálási műveletből megkaphatjuk a 21. kromoszómára specifikus szekvenciák egy normaíizáit gyakoriságát egy referenciatariományon beiül, Ha egy magzat 21-es tnszomiában szenved, akkor a 21. kromoszómából származó szekvenciák normaíizáit gyakorisága meg fog növekedni egy ilyen szekvenáíásbóí, és így lehetővé fogja tenni a 21-es kiszórnia kimutatását. A normaíizáit gyakoriságot illetően a változás mértéke függeni fog az analizált mintában lévő magzati nukleinsavak koncentrációjának részarányától. |ÖÖS9] Egy megvalósítási módban az lllumina Genome Analyzer-! használtuk emberi genomtáhs DNS és emberi plazma DNS mirhák egyvégu szekvenálására. Az lllumina Genome Analyzer egy átfolyócellának nevezett szilárd felületen kifogott, klonáilsan felszaporodott egyedi DNS molekulákat szekvenái meg.
Mindegyik. átfoíyóceíiában 8 sáv van 8 egyedi minta vagy mintaelegy szckvenálására. Mindegyik sáv kb. 200 Mh-nyl szekvenciát tud generálni, amely az emberi genomban lévő 3 milliárd bázispárnyi szekvenciának csak egy résztele. Mindegyik, genomíális DNS vagy plazma DNS mintát egy átfolyőcelía égy sávjának alkalmazásával szekvenálfunk meg, A generált rövid szekvenciadarabokat az emberi referencia genomszekveneiához illesztettük, és feljegyeztük a kromoszómális eredetet. Táblázatba foglaltuk az egyes kromoszómákhoz illeszkedő egyedileg: megszekvenált darabok összesített számát és összehasonlítottuk az egyes kromoszómáknak az emberi referenciagenom vagy nem kóros reprezentatív minták alapján várható relatív méretével Ezt követően azonosítottuk a kromoszóma felszaporodásokat vagy veszteségeket, [0Ö7ÖJ Az ismertetett megközelítés csak egy példa az itt ismertétett gén/kromoszóma mérési stratégiára. Alternatív módon, párosított végű szekvenáíás is végezhető. Ahelyett, hogy összehasonlítottuk volna a megszekvenált fragmensek hosszát azzal, amit a referenoiagenom alapján várhatunk, ahogy azt Campbell és mtsai. (Nat Genet 2008; 40:722-728) ismertetik, az illesztett szekvenáit darabokat számoltuk meg és rendeztük kromoszómális lokalizáció szerint. Kromoszómarégiók vagy teljes kromoszómák felszaporodását vagy veszteségét úgy határoztuk meg, hogy összehasonlítottuk a darabok számát a referencíagenamban várható kromoszómamérettel vagy egy nem kóros reprezentatív mintáéval. Mivel a párosított végű szekvenáíás lehetővé teszi az eredeti nukíeinsav-fragmens méretének megállapítását, az egyik példa szerint arra összpontosítunk, hogy megszámláljuk az egy meghatározott ~ így például 300 bp alatti, 200 bp alatti vagy 100 bp alatti - méretű nukiéi n sav-f rag mense kn ek megfelelő párosodott szekvenáit darabokat.
[0071] igy másik megvalósítási módban a nukíeínsav-elegy egy futtatásban megszekvenált részletét a szekvenáíás előtt szelektáljuk. Például hibrídlzáiáson alapuló módszerek ···· Igy például oligonukleotid array (mátrix) - alkalmazható arra, hogy először szelektáljunk bizonyos kromoszómákból, pl, egy potenciálisan aneuploíd kromoszómából vagy a vizsgált aneuploidia által nem érintett egyéb kromoszómádból származó nukleinsavszekvencíákrá. Még további példa az, amikor a mintaelegybö! származó nukleinsav-szekvencíák egy adott alpopulációját szekvenáíás előtt szelektáljuk vagy feldúsítjuk. Ahogy azt a fentiekben tárgyaltuk, leírták például, hogy a magzati DNS-molekulák az anyai plazmában róvidobb íragmensekbőí állnak, mint as anyai háttér DNS-moíakuiák (Chan és mtsai, Clin Chem 2004; 50:88-92), A mintában lévő nukieinsav-szekvenciák molekulaméret szerinti frakoionáiására tehát alkalmazhatunk agy vagy több, a szakember szamára ismert eljárást, pl, gélelektroforézist vagy méretkizárásos oszlopokat vagy mlkrofluiclskai alapú megközelítési. De alternatív módon, a sajtmentes magzati DNS anyai plazmában történő analízisét bemutató példában a magzati nukleínsav részt olyan eljárással is feldúsíthatjuk, amely elnyomja az anyai hátteret, így például formaldehid hozzáadásával (Dhallan és mtsai, JAMA 2004; 291; 1114-9), Egy megvalósítási módban nukléinsavak egy előre kiválasztott halmazának egy részét vagy részhalmazát random módon megszekvenáíjuk. [0Ü72J Egyéb egymolekuiás szekvenáiási stratégiák, így például a Roche 454 platform, az Applied Bíosystems SOLID platformja, a Melioos Valódi Egymolekuiás (True Single Molecule) ÖNS-szskyenálási technológia, a Pacific Biosciences egymolekuiás valósidejű (SMRT™) technológiája és a nanopórusos szekvenálás is hasonló módon használható ebben az alkalmazásban.
III. A MENNYISÉGEK MEGHAT ÁRQZÁSA.......A.......KROMOSZÓMÁKRA A
SZEKVENÁLÁS OUTPUTJÁBÓL
[0073] Tömeges párhuzamos szekvenáiást követően biolnformatikal analízist végeztünk a megszekvenáit darabok kromoszómálís eredetének lokalizálására. Az eljárást kővetően a potenoláíisan áhéisploid kromoszómából - pl. ebben a vizsgálatban a 21. kromoszórnábél - származóként azonosított darabokat kvanfifativan összehasonlítjuk az összes megszekvenáit darabbal vagy az aneupíoiclia által nem érintett egy vagy több kromoszómából származó darabokkal. Egy tesztminta vonatkozásában összehasonlítjuk a 21. kromoszóma és más, nem 21. kromoszómák szekvenálás! outputja közötti összefüggést a fenti részben ismertetett eljárásokkal nyert küszöbértékekkel, és így meghatározzuk, bogy a minta euploid vagy 21-es triszömiás magzatot hordozó terhességből származik-e. fÖÖ74J Egy sör különböző mennyiség, pl, az alábbiak, a megszekvenáit darabokból volt származtatható. Például, az egy adott kromoszómához illeszkedő megszekvenáit darabok számát, vagyis az abszolút számot a más kromoszómákhoz illeszkedő megszekvenáit darabok abszolút számával hasonlíthatjuk Össze, Alternatív módon, a 21, kromoszómáról rnegszekvenáít darabok mennyiségének az összes vagy egyes egyéb rnegszekvenált darabokhoz képesti részarányát is összehasonlíthatjuk más, nem aneupíoíd kromoszómákéval. A jelen kísérletben mivel minden egyes DNS-fragmensból 38 bp4 szekvenáltunk meg, az égy adott kromoszómáról megszekvenált nukleotidok számát könnyedén megkaphatjuk a 36 bp és a rnegszekvenált darabok számának szorzatából |Ö0?S} Továbbá mivel minden egyes anyai píazrnarnintát csak egyetíen álfoiyócella alkalmazásával szekvenáltunk meg, ami az emberi génemnek csak egy részletét tudja megszekvenáíni, a legtöbb anyai plazma · D N Sí rag mens · féleséget statisztikailag csak úgy szekvenaituk volna meg, hogy 1 megszekvenélt darabszámot generáljon. Más szóval az anyai píazmamintában jelenlévő nukleinsav-iYagrnenseket 1· szeresnél kisebb lefedettség mellett szekvenaituk meg A rnegszekvenált nukleolidok összes száma tehát bármelyik kromoszóma esetében tóként az adott kromoszóma rnegszekvenált része mennyiségének, részarányának vagy hosszának felelne meg. Ezért, a potenciálisan aneupíoíd kromoszóma reprezentáltságának kvantitatív meghatározása származtatható az adott kromoszómáról rnegszekvenált nukleotidok számának vagy ekvivalens hosszának részarányából más kromoszómák egy hasonlóan származtatott mennyiségéhez viszonyítva,
IV. NUKLEINSAV-ELEGYEK S2EKVENÁLÁS CÉLJÁBÓL VÉGZETT DÜSÍTÁSA
[ÖÖT6] Ahogy azt korábban említettük és az alábbi példafejezetben meghatároztuk, az emberi genomnak csak egy részéi keli megszekvenáíni ahhoz, hogy meg tudjuk különböztetni a 21~es tríszómiát az eupíoid esetektől. így tehát lehetséges és költséghatekony lenne feldúsítani a megszekvenáiandó nukíeínsav-eiegyet mielőtt a feldúsított elegy egy részletét random módon megszékvenáinánk. Például, a magzati DNS-molekuiák az anyai plazmában rövidebb fragmensekböl állnak, mini az anyai háttér DNS-molekuiák (Chan és misai, Ciin Chem 2004; 50; 88-92), Á mintában lévő nukleinsav-szekvenoíák moiekuíamérei szerinti frakcíonálására tehát alkalmazhatunk egy vagy több, a szakember számára ismert eljárást, pl, géielektroforézlst vagy méretkizárásos oszlopokat vagy mlkrofluldikai alapú megközelítést.
[ŐÖ77] De alternatív módon, a sejtmentes magzati DNS anyai plazmában történd analízisét bemutató példában a magzati nukleinsav részt olyan eljárással is feldúsíthatjuk, amely elnyomja az anyai hátteret, így például formaldehid hozzáadásával (Dhalian és mtsai, JAIV1A 2004; 291: 1114-9), A magzatból származó szekvenciák részaránya feldúsulna a rövldebb fragrnensekbő! álló nukleinsav-eiegyben. A 7, ábra szerint ahogy nő a magzati DNS koncentrációjának részaránya, úgy csökken az euptoid eseteknek a 21~es triszómiás esetektől való megkülönböztetéséhez szükséges megszekvenált darabok száma. PÖ7S| Alternatív módon, egy potenciálisan aneuplold kromoszómából és az aneuploidia által nem érintett egy vagy több kromoszómából származó szekvenciákat hibridizációs módszerekkel lehetne feldúsítani, például öligonukíeoíid-mikroarraykkei. A nuklelnsavak feldúsított éiegyeit azután random szekvenálásnak vetnénk alá. Ez lehetővé tenné a szekvénáiási költségek csökkentéséi
V. RANDOM SZEiKVENALÁS
[0079] A 2. ábra egy folyamatábra, ami a találmány egy megvalósítási módja szerinti random szekvenálással végzett, egy magzati kromoszómáiig aneuploidia prenatáíis diagnosztizálására szolgáló 200 eljárást mutat, A tömeges párhuzamos szekvenálásl megközelítés egy szempontja szerint az összes kromoszómából egyidejű leg generálható reprezentatív adat. Egy adott fragmens eredetét nem választjuk ki előre. A szekvenálás véletlenszerűen történik, majd adatbáziskeresés végezhető annak megállapítására, hogy egy adott fragmens honnan származik. Ezzel különbözik azoktól a szituációktól, amikor a 21, kromoszómáról származó valamely specifikus fragmenst és az 1, kromoszómáról származó másik fragmenst amplifikálunk. 10080] A 210 lépésben kapunk egy biológiai mintát a terhes nőtől, A 220 lépésben kiszámítunk egy szekvencíaszámot (N), amelyet a kívánt pontossághoz elemezni kell. Egy megvalósítási módban először azonosítjuk a magzati DNS egy adott százalékát a biológiai mintában. Ez bármilyen alkalmas módon elvégezhető, ahogy az á szakember számára ismert. Az azonosítás jelentheti egyszerűen olyan érték leolvasását, amelyet egy másik intézményben mértek meg. Ebben a megvalósítási módban a megszekvenáiandó szekvenciák N számának kiszámítása a százalékos arány alapján történik. Ha például a magzati DNS százalékos aránya csökken, akkor megnő a megszekvenáiandó szekvenciák száma, illetve a magzati DNS növekedése esetén lecsökkenhet Az N szám lehet egy fix szám vagy egy relatív szám is, így például egy százalékos arány, Egy másik megvalósítási módban olyan N számot szekvenálhatunk meg, amelyről ismert, hogy elegendő a betegség (kérj pontos diagnosztizálásához. Az N szám még olyan terhességek esetében is elegendővé tehető, ahol a magzati DNS-koncentrációk a normal tartomány alsó határára esnek.
[SÖ81J A 230 lépésben a biológiái mintában lévő nukleinsav-molekulák egy sokaságából legalább N számú tagot véletlenszerűen megszekvenáfunk. Ennek az ismertetett megközelítésnek az az egyik jellemzője, hogy a megszekvenáiandó nukieinsavakat specifikusan nem azonosítjuk vagy célozzuk be a minta analízise, vagyis á szekvenálás előtt. A szekvenáiáshoz nincs szükség szekvenciaspeeifikus primérekre a meghatározott genlókuszok beoélzásához. A megszekvenált nukieinsavak halmaza (elegye) mintáról mintára, sőt azonos minta esetén elemzésről elemzésre is változik. Ezen kívül az alábbi leírás alapján (6. ábra) a szekvenálás! output esetdiagnözíshoz szükséges mennyisége a vizsgált minták között és a referendapopuláción beiül is változhat. Ezek a szempontok szöges ellentétben állnak a legtöbb molekuláris diagnosztikai megközelítéssel, így például azokkal, amelyek a következőkön alapulnák: fluoreszcenciás ín situ hibridizáció, kvantitatív fluoreszcenciás POR, kvantitatív valósidejű PCR, digitális PCR, összehasonlító genomiális hibridizáció, mikroarrayes összehasoniitő genomiális hibridizáció és így tovább, ahol a megcéízandö génlőkuszok előzetes meghatározást igényeinek, tehát lőkuszspedfikus primerek vagy próbasorozatok vagy ilyenek paneljeinek alkalmazását igénylik, |ÖÖ82] Egy megvalósítási módban agy terhes nő plazmájában jelenlévő DNS-fragmenseken random szekvenálást végzünk, és ezzel olyan genomiális szekvenciákat nyerünk, amelyek eredetileg: vagy a magzatból vagy az anyából származtak. A random szekvenálás során megmintázzuk (megszekvenáljuk) a biológiai mintában jelenlévő nukleinsav-molekulák agy véletlenszerű részét. Mivel az ilyen szekvenálás random, minden egyes analízisben a nukleinsav-molekulák (és Így a genom) egy eltérő részhalmazát (részletét) szekvanálhatjuk meg. A megvalósítási módok akkor is műkődnek, ha ez a részhalmaz mintáról mintára és analizisroi analízisre h változik, ami akkor is előfordul, ha ugyanazt a mintát használjuk A megszekvenált részlet lehet például a genom körülbelül ö,1%-a: 0,5%-a, 1%-a, 5%-a, 1ö%*a, 20%-a vagy 30%-a. yás megvalósítási módokban a részlet a fenti értékek legalább valamelyike, [0083] A fennmaradó 240-270 lépések hasonló modor) történhetnek, mint á 100 eljárás esetében.
VI. A MEGSZEKVENÁLT DARABOK HALMAZAINAK SZEKYENÁLÁST KÖVETŐ SZELEKTÁLÁSA
[0084] Ahogy az a lenti li, és ISI. példában szerepel, a szekvenálási adatok egy részhalmaza elegendő .ahhoz, hogy meg tudjuk különböztetni a 21*0$. trlszómiát az euplöíd esetektől, A szekvenálási adatok részhalmaza lehet azoknak a megszekvenált daraboknak a részaránya, amelyek megfeleltek bizonyos minőségi paramétereknek. Például a II. példában olyan megszekvenált darabokat használtunk, anieiyeket egyedileg illesztettünk az ismétlődő szakaszokra kímaszkirözöit emberi referenciagenomhoz. Alternatív módon, az összes kromoszómából származó nuklesnsav-fragrnensek egy reprezentatív halmazát is megszekvenáihatjuk, de figyelmünket a potenciálisan aneupíöid kromoszóma tekintetében releváns adatok és egy adott számú, nem aneupíöid kromoszóma tekintetében releváns adatok összehasonlítására összpontosíthatjuk. pÖSSJ Ehhez képest is alternatív módon, a szekvenálási kővető analízis során tovább szelektálhatjuk a szekvenálási output olyan részhalmazát, amely az eredeti minta egy adott méretablaknak megfelelő nukieinsav-fragmenseiből generált, megszekvenált darabokat foglalja magában. Például az lllumina Genome Analyzer alkalmazásává! párosított végű szekvenálási alkalmazhatunk, ami azt jelenti, hogy a nukleinsav-fragmehsek két végét szekvenáljuk meg. Ezt követően a minden egyes párosított végből származó szekvéháiási adatokat az emberi referencia genomszekvenoiához illesztjük, hlajd végül kikövetkeztethető a távolság vagy a két vég között húzódó nukieotidok száma. Az eredeti nukleinsav-fragmens teljes hossza is kikövetkeztethető Alternatív módon, szekvenálő platformok, így például a 4S4-es platform, és lehetőleg valamilyen egymolekulás szekvenálási módszer segítségévei egy rövid - például 200 bp-nyi - nukleinsav-fragmens teljes hossza is megszekvenálható. ily módön a nukleinsavíragrnens tényleges hosszai azonnal ismertté válnál a szekvenálási adatokból. |0088] Az ilyen párosított végé analízis megoldható más szekvonáió platformokkal, pl. az Applied Biosystems SöüD rendszerévé! is. A Roche 454 platform esetében, mivel más tömeges párhuzamos szekvensiásf végző rendszerekkel összehasonlítva nagyobb a leolvasási hossz, meg lehet határozni egy fragmens hosszát is a teljes szekvenciájából· [0087] Na az adatanaíízíst a megazekvenáíi darabok azon részhalmazára fókuszáljuk, amely az eredeti anyai plazmamintában léve rövid nukíeinsav-fragmenseknek felel meg, annak megvan az az előnye, hogy az adatsort hatékonyan feldúsítanánk a magzatból származó DMS-szekvenclákka!. Ennek az az oka, hogy váz anyai plazmában lévő magzati DNS-moiekuiák rövidebb fragmensekből áiínak, mint az anyai háttér DNS-molekulák (Chan és mtsai, din Chem 2004; 50. 88-92). A 7. ábra szerint ahogy nő a magzati DNS koncentrációjának részaránya, úgy csökken az euploid eseteknek a 21-es triszőmiás esetektől való megkülönböztetéséhez szükséges megszekvenált darabok száma, [0GS8J A nukleinsav-elegyek részhalmazainak szekvenáíást követé szelektálása eltér az egyéb nykíeinsav-dysítasi stratégiáktól, amelyeket a minta analízise elölt végeznek, azaz például a gélelektroforézis vagy méretkízárásos oszlopok alkalmazásától, amelyhez a feldúsított eiegyet fizikailag el kell választani a háttér-nukiesnsávak elegyétöl. A fizikai eljárások több kísérleti lépést vezetnek be és hajlamosak lehetnek a problémákra, így például az elszennyeződésre, A szekvenálási output részhalmazainak szekvenáíást követő in bííÍgö szelektálása azt is lehetővé teszi, hogy variáljuk a szelektálást attól függően, hogy a betegség megállapításához milyen érzékenység és speciíicitás szükséges. |0ÖS9] Azok a bioinformatikai, számitógépes és statisztikai megközelítések, amelyeket annak meghatározására alkalmaznak, hogy egy anyai píazmamínta egy 21 es tflszárniás vagy egy euploid magzattal megfogant terhes nőtől származik-e, összeállíthatók olyan számítógépes programmal rendelkező termékké, amely felhasználható paraméterek meghatározására a szekvenálási outputból· A számítógépes program működése során meghatároznánk a potenciálisan aneuploid kromoszóma egy kvantitatív mennyiségét, valamint egy vagy több egyéb kromoszóma mennyiségéí/mennyiségeit is. Meghatároznánk egy paramétert és összehasonlítanánk a megfelelő küszöbértékekkel, és ily módon meghatároznánk, hogy fennáll·# magzati kromoszómád aneupioidía a potenciálisan aneuploid kromoszóma vonatkozásában,
PÉLDÁK
[0Ö9ÖJ Az alábbi példákat csak Illusztrációként kínáljuk, nem pedig az igényelt találmány korlátozásaként.
L A MAGZATj 21-E8 TRSSZOMIA PRENATÁLIS DIAGNOSZTIZÁLÁSA
[ÖÖ91J A vizsgálat céljára nyolc terhes nőt toboroztunk. Mindegyik terhes nő a várandósság 1. vagy 2, trimeszierében volt és egyszeres volt a terhességük. Négyük 21 es ihszómiás magzattal volt terhes, a másik négy pedig euploid magzattal. Mindegyik alanytól húsz milliliter perifériás vénás vért vettünk Az anyai plazmát 10 percig 1600xg-n történő centrifugálist követően gyűjtöttük össze, majd további 10 percig centrifugáltuk 18Ö0()xg~n. Ezt követően mindegyik plazmaminta 5~1ö ml-éböl DNS-t exiraháltunk, Az anyai plazma DNS-bői azután Hlumina Genome Analyzer-re! a gyártó utasításai szerinti tömeges párhuzamos szekvenálási végeztünk. A szekvenálás és a szekvenciaadatok elemzése során a szekvenálást végző technikusok számára nem fedtük fel a magzati diagnózisokat. [0092] Röviden, körülbelül 50 ng anyai plazma DNSrt használtunk a DNS-könyvíár előállítására. Kisebb mennyiséggel., így például 15 ng vagy 10 ng anyai plazma DNS-sei is lehet kezdeni. Az anyai plazma DNS-íragmenseket tompavégűvé tettük, Solexa adapterekhez lígáítuk és géltisztítással 150- 300 bp-os fragmenseket szelektáltunk ki Alternatív módon, a tompavégűvé tett és adapterhez ligáit anyai plazma DNS-fragmenseket oszlopokon (pl. AMPure, Ageneert) is át lehet engedni annak érdekében, hogy a kiaszterek létrehozása előtt a ligálaflan adaptereket méret szerinti szelekció nélkül eltávoiltsuk Az adapterhez ligáit DNS-t az átfotyőcellák felszínéhez hibridizáliattuk, és lilumlna Cluster Station alkalmazásával létrehoztuk a DKS~klaszfereket majd lilumlna Genome Analyzer-en 36 ciklusban megszekvenáltuk őket. Mindegyik anyai piazmaminíábőí származó DNS-t megszekvenálta egy átfolyócella. A leolvasott szekvenciákat Solexa Analysis Pipeline alkalmazásával szereltük össze Ezután az Eland alkalmazás segítségévei mindegyik leolvasást hozzáiilesztettük az ismétlődő szakaszokra kimaszkirozott emberi referencia genomszekvenciához, az NCBI 38 összeállításhoz (GenBank hozzáférési szám: NC 000001 és NCJ)Ö0024>.
[0093] Ebben a vizsgálatban az adatanallzis komplexitásának csökkentése érdekében csak azokat a szekvenciákat vettük a továbbiakban figyelembe, amelyek az ismétlődő szakaszokra kímaszkírözott emberi reíereneiagenöm egyedi helyére térképezodtek. Alternatív módon, a megszekvenálf adatok más részhalmazai vagy teljes halmaza is használható, Minden egyes mintára meghatároztuk az egyedileg térképezödő szekvenciák összesített számát, A 21. kromoszómához egyedileg illeszkedő szekvenciák számát az egyes mintákra az illeszkedő szekvenciák összesített számának részarányaként. Mivel az anyai plazma az anyai eredetű DNS-ekhői álló háttér mellett magzati DNS4 is tartalmaz, a 21-es triszómiás magzat a 21, kromoszómából származó extra megszekvenált darabokat juttatna az anyai plazmába amiatt, hogy a magzat genömjában van egy extra kópia a 21. kromoszómából. Ezért 21-es triszómiás magzatot hordozó terhesség esetén nagyobb lenne a 21, kromoszómából származó szekvenciák százalékos aránya az anyai plazmában, mint egy euploid magzatot hordozó terhesség esetében. Az analízis nem igényli magzatspecifikus szekvenciák megcéizásál. Nem igényli továbbá azt sem, hogy előzőleg fizikailag elválasszuk egymástól a magzati és az anyai nukieinsavakat. Nem igényli továbbá azt sem, hogy a szekvenilást követően megkülönböztessük egymástól vagy azonosítsuk a magzati és az anyai szekvenciákat, |Ö094J A 3A. ábra a 21. kromoszómára térképezett szekvenciák százalékos arányát (a 21, kromoszóma százalékos reprezentáltságát} mutatja mind a 8 anyai plazma DNS-minta esetében. A 21. kromoszóma százalékos reprezentáltsága szignifikánsan nagyobb volt a 21-es triszómiás terhességekből származó anyai plazmában, mint az euploid terhességek esetében. Ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy a magzati kromoszómáké sneuploidía nem invazív prenatáiis diagnosztizálása ágy is történhetne, hogy meghatározzuk az aneupíoíd kromoszóma százalékos reprezentáltságát egy referenciapopulációéval összehasonlítva. Alternatív módon, a 21. kromoszóma túlreprezentáltsága is detektálható oly módon, hogy összehasonlítjuk a 21. kromoszóma kísérletesen meghatározott százalékos reprezentáltságát a 21 kromoszóma szekvenciák egy euploid emberi genom esetén várható százalékos reprezentáltságával. Ezt úgy végezhetjük, hogy maszkírozzuk vagy nem maszkírozzuk az emberi genom Ismétlődő régióit [0095] A nyolc terhes no közül Ötnek fúmagzata volt. Az Y-kremosZómára térképeződö szekvenciák specifikusak tennének a magzatra. Az Y'-kremoszómára térképeződö szekvenciák százalékos arányának segítségével kiszámítottuk a magzati DNS koncentrációjának részarányát az eredeti anyai piazmamlntáhan. A magzati DNS koncentrációjának részarányát ezen kívül mikrofluldikai digitális PCR-rel is meghatároztuk, amelyhez az X-kapcsolt cinkujj fehérje (ZFX) és az Y--kapcsoít cinkujj fehérje paraíóg génjeit használtuk.
[O096J A 38. ábra az Y-kromoszoma szekvenálással, illetve ZFY/ZFX míkrofluidlkai digitális POR segítségével meghatározott százalékos reprezentáltsága alapján kikövetkeztetett magzati DNS~kοnoentrácsók részaránya közötti korrelációt mutatja. Pozitív korreláció áll! fenn az anyai plazmából é két eljárással meghatározott magzati DNS-konceníráciök részaránya között. A korrelációs együttható (r) a Pearsomféie korrelációs analízisben 0,917-nek adódott, |009?| A 24 kromoszóma mindegyikéhez (22 autoszómához, és az X* és az Y~ kromoszómához) illeszkedő anyai plazma DNS-szekvenclák százalékát két reprezentatív esetre a 4Á, ábrán mutatjuk be. Egy terhes nő egy 21-0¾ triszőmíás magzattal volt terhes, a másik pedig egy euploid magzattal. A normái magzattal terhes növel összehasonlítva a 21-es triszómiás magzattal terhes nőben magasabb volt a 21. kromoszómára térképeződö szekvenciák százalékos reprezentáltsága. 100S8] A fenti két eset közötti %-os eltérést a kromoszómánként! százalékos reprezentáltságban az anyai plazma DNS-míntákban a 48. ábra mutatja. Egy adott kromoszóma esetében a százalékos eltérést az alábbi képlet alkalmazásával számítjuk ki;
Százalékos különbség (%) ~ (Pgt - Pg}/ Pfc χ 100%, ahol P21 jelentése azoknak a plazma DNS-szekvenciáknak a százalékos aránya, amelyek a 21 es triszómiás magzattal terhes nőben az adott kromoszómához, illeszkedtek; és
Pe jelentése azoknak a plazma DNS-szekvenciáknak a százalékos aránya, amelyek az eupioid magzattal terhes nőben az adott kromoszómához illeszkedtek, [0099] Ahogy az a 48. ábrán látható, az eupioid magzattal terhes nővel összehasonlítva a 21-es triszómiás magzattal terhes nő plazmájában 11 %-osan túlreprezentáltak a 21 kromoszómából származó szekvenciák. Az egyéb kromoszómákhoz Illeszkedő szekvenciák esetében a két eset közötti különbségek 5%-on belül maradtak. Mivel az eupioid anyai plazmamintákkai összehasonlítva a 21-es triszómiás esetben megnövekszik a 21, kromoszóma százalékos reprezentáltsága, a %~os különbség alternatív módon a 21. kromoszómából származó szekvenciák túlreprezentáltságának mértékeként is kifejezhető, A 21, kromoszóma százalékos reprezentáltsága között! százalékos különbségek és abszolút különbségek mellett a teszt-· és a referenciamintákból meghatározott számértékek arányai is kiszámíthatók, és ezek is indikafivak lesznek arra nézve, hogy az eupioid mintákkal összehasonlítva milyen mértékű a 21. kromoszóma túlreprezentáltsága 21~es triszómia esetén, [0100] Az eupioid magzattal terhes négy nőben a plazma DNS-szekvenciáík átlagosan 1345%-a Illeszkedett a 21 kromoszómához. Á 21-es triszómiás magzattal terhes négy no közül három magzata fiú volt. Ennek a három esetnek mindegyikére kiszámítottuk a 21 kromoszóma százalékos reprezentáltságát. A fentiek szerint e három 21-es iriszömiás eset mindegyikére meghatároztuk a 21. kromoszóma százalékos reprezentáltságának százalékos eltérését a 21. kromoszóma átlagos százalékos reprezentáltságától, amelyet a négy eupioid magzat értékesből származtattunk, Más szóval ebben a számításban az eupioid magzattal terhes négy eset átlagát használtuk referenciaként, E három 21~es triszómiás fiúmagzat esetében a magzati DNS frakcionáíis koncentrációira (azaz a koncentrációk részarányára) az V-kromoszómából származó szekvenciák százalékos reprezentáltsága alapján következtettünk.
[Öl Öl] A 21 kromoszómából származó szekvenciák túlreprezentáltságának mértéke és a magzati DNS-konceníráciők részaránya közötti korrelációt az 5. ábra mutatja. Szignifikáns pozitív korreláció állt fenn a két paraméter között. A korrelációs együttható, (r) a Fearsomféie korrelációs analízisben ö,898-nak adódott Ezek az eredmények azt jelzik, hogy a 21. kromoszómából származó szekvenciák anyai plazmában lévő túlreprezentáltságának mértéke összefügg a magzati DNS· koncentrációk anyai plazmamintában levő részarányával. Tehát a 21 kromoszómából származó szekvenciák túlreprezentáltságának mértékére vonatkozóan a magzati DNS koncentrációk részarányára releváns küszöbértékeket határozhatunk meg a 21es triszómiás magzatokat hordozó terhességek azonosítására, |O102| A magzati DNS koncentrációjának részarányát az anyai plazmában a szekvenáló futtatástól elkülönülten is meghatározhatjuk. Valósidejű PCR, mikroftuidlkaí PCR vagy tömegspektfornetrla alkalmazásával például előre meghatározható az Y-kromoszómából származó DNS koncentrációja. A 3B. ábrán például azt demonstráltuk, hogy jő korreláció ált fenn a szekvenáló futtatás során meghatározott Y-kramoszőma szám alapján beesült magzati DNS koncentrációk és a szekvenáiáss futtatástól elkülönítetten meghatározott ZFY/ZFX arányok között, A. magzati DNS-koncenirációk valójában meghatározhatók az Y-kromoszómától eltérő fókuszok alkalmazásával is, amelyék leánymagzatok esetén is használhatók, Chan és mfsai. például kimutatták, hogy magzateredetű metílezett RASSF1A szekvenciákat lehet detektálni a terhes nők plazmájában az anyai eredetű nem metílezett RASSF1A szekvenciaháttér mellett (Chan és mtsai. Clin Chem 2006: 52.2211-8). A magzati DNS koncentrációjának részarányát tehát úgy határozhatjuk meg, hogy elosztjuk a metílezett RASSF1Á szekvenciák mennyiségét a RASSF1A szekvenciák összes (metílezett és nem meiilezett) mennyiségével.
[0103J A találmány megvalósításához várhatóan előnyösebb lesz az anyai plazma, mint az anyai szérum, mivel véralvadás során kiszabadul a DNS az anyái verseitekből, Ha tehát szérumot használunk,, akkor várhatóan alacsonyabb lesz a magzati DNS koncentrációjának részaránya az anyai plazmában, mint az anyai szérumban. Más szóval ha anyai szérumot használunk, akkor várhatóan több szekvenciát kell generálni a magzati kromoszómáké aneuploidía diagnosztizálásához, mint amennyit az ugyanattól a terhes nőtől ugyanabban az időpontban levett plazmaminta esetében kellene. f1Ő4j A magzati DNS-koncentrácIó részarányának meghatározására egy még további alternatív módszer a terhes nő és a magzat közötti polimorfizmusom különbségek számszerűsítése (Dhallan R, és mtsai. 2007. Lancet, 380, 474-481). Erre az eljárásra példa, hogy olyan polimorf helyeket célzónk meg, ahol a terhes no homozigóta, a magzat pedig heterozigöta. A roagzatspecifikus alléi mennyiségét összehasonlíthatjuk a közös alléi mennyiségével, és ily módon meghatározhatjuk a magzati DNS koncentrációjának részarányát.
[01ÖSJ A kromoszóma-rendellenességek kimutatásira szolgáié meglévő módszerekkel és ezen beiül az összehasonlító genomiáiis hibridizációval, a mikroarrayés összehasonlító genomiáiis hibridizációval, és a kvantitatív valósidejű po lime rá z- Iá n oreakcióval ellentétben - amelyek egy vagy több specifikus szekvenciát: detektálnak és számszerüsítenek a tömeges párhuzamos szekvenáíás nem függ a DNS-szekvenclák egy előre meghatározott vagy elöredeíiniáii halmazának kimutatásától vagy analízisétől A DNS-molekuiák egy random reprezentatív részletét szekven áljuk meg a mintaéíegybőí. A számunkra érdekes PNS-féíeséget tartalmazó· vagy nem tartalmazó mintákban összehasonlítjuk a különféle kromoszómarégiókhöz iiieszkedö rnegszekvenált darabok számát, A kromoszóma-rendelienességek a mintákban lévő bármeiy krömöszomaréglőhoz iiieszkedö szekvenciák száma (vagy százalékos aránya) közötti különbség alapján derülnek ki |Ö1Ö6J Egy másik példában a sejtfnenies plazma DNS-hez alkalmazható szekvenáló módszert használhatjuk a kromoszóma-rendellenességek plazma DNS-ben történő kimutatására egy meghatározói rákbetegség kimutatása céljából A különböző rákbetegségekhez tipikus kromoszóma-rendellenességek tartoznak. Több kromoszőmarégíőí érintő változásokat (amplifikáíódásokat vagy deíéciókat) is alkalmazhatunk. Tehát ienne az arnpliflkált régiókhoz illeszkedő szekvenciáknak egy megnövekedelf. részaránya és a csökkent régiókhoz. Illeszkedő szekvenciáknak egy csökkent részaránya. A kromoszómánként! százalékos reprezentáltságot összehasonlíthatjuk az. egyes megfelelő kromoszómák egy referenciagenomban mérhető méretével, amelyet bármelyik kromoszóma teljes genomhoz képesti genomiáiis reprezentáltságának százalékos arányaként fejezhetünk ki Közvetlen : összehasonlítások és referenciakrornoszömákka! történő összeírásonIitások is alkalmazhatók,
II AZ EMBERI GENOM CSAK EGY RÉSZLETÉNEK MBGSZEKYENÁLÁSA p10?| Az I. példában ismertetett kísérletben mindegyik egyedi mintából mindössze egyetlen átfölyócella alkalmazásával szekvenáltuk meg az anyai plazma DNS~t. Az egyes vizsgált mintákból a szekvenáió futtatás által generált megszekvenáit darabok száma a Θ- ábrán látható, A 121 egy 21 -es triszőrniás magzatot hordozó terhességből származó mintát jelent [Ö1ÖBJ Mivel minden egyes merészek vénáit anyai plazma DNS-íragmensbői 36 bp~ t szekvenáitunk meg, az egyes mintákból megszekvenáit nukieotidok/bázsspárok számát a 36 bp és a megszekvenáit darabok számának szorzatából határozhatjuk meg, ahogy az a 6, ábrán szerepel, Mivel körülbelül 3 milliárd bázispár van az emberi genomban, az egyes anyai plazmamintákból generált szekvenálási adatok mennyisége csak egy részletet képviselt, ami 10%-tól 13'Ang terjedt, [Ö1Ő9] Ezen kívül ebben a vizsgálatban a csak az egyedileg térképezhető megszekvenáit darabokat - ami az Eland szoftver nómenklatúrája szerint az UÖ ~ arra is felhasználtuk, hogy demonstráljuk a 21 kromoszómából származó szekvenciák 21-es triszómiás magzatot horodozó terhességekből származó anyai pfazmamintákban mérhető mennyisége túlreprezentáltságának meglétét, ahogy azt az I. példánál ismertettük. Ahogy az a 6, ábrán látható, az UÖ szekvenciák az egyes mintákból generált megszekvenáit daraboknak csak egy részhalmazát reprezentálják, illetve az emberi genomnak csak egy még kisebb részét* mintegy 2%-át Ezek az adatok azt jelzik, hogy a magzati aneuplöídía diagnosztizálásához elegendő, ha a vizsgált mintákban az emberi genorniális szekvenciáknak csak egy részét székvenáfjuk meg.
ill, A SZEKVENCIÁK SZÜKSÉGES SZÁMÁNAK MEGHATÁROZÁSA £01101 Ehhez az analízishez egy eupícid fiümagzatta! terhes nőből származó plazma DNS szekvenálási eredményét használjuk, A hibás porosodás nélkül az emberi referenciagenomhoz térképezhető megszekvenáit darabok száma 1 990 ÖÖÖ volt. Random módon kiválasztottuk a szekvenciák egyes részhalmazait ebből az 1 990 ÖÖÖ darabból, és minden egyes részhalmazban kiszámoltuk a 21. kromoszómához illeszkedő szekvenciák százalékos arányát. A részhalmazokban tévő szekvenciák számát 60 ezer szekvenciától 540 ezer szekvenciáig változtattuk, Minden egyes részhalmaz-méret esetében a megszekvenáit daraboknak a teljes elegyből történő random szelektálásával addig állítottuk össze az ugyanolyan számú megszekvenáit darabból álló számos részhalmazt, amíg már nem volt több tehetséges kombináció. Ezt követően mindegyik részhalmaz méreten belül a számos részhalmazból kiszámoltuk a 21 kromoszómához illeszkedő szekvenciák átlagos százalékos arányát és a standard eltérést (SD), Az adatokat összehasonlítottuk a különféle részhalmaz-méretek között és Ily módon meghatároztuk a részhalmaz-méret hatását a 21. kromoszómához illeszkedő szekvenbiák százalékos arányának eloszlására. Ezt követően az átlag és az SD alapján kiszámoltuk a százalékok S. és 95. perceníilisét.
[Öl 11] Ha egy nő egy 21-es triszőmlás magzattal terhes, akkor a 21. kromoszómához illeszkedő megszekvenált daraboknak túlreprezentáltaknak kell lenniük az anyai plazmában a magzatból származó, extra adagé 21. kromoszóma miatt. A túlreprezentáltság mértéke az alábbi képlet szerint függ az anyai plazma DNS-mintában lévő magzati DNS százalékos arányától:
ahol a PerTSi azoknak a szekvenciáknak a százalékos arányát jelenti, amelyek egy 21-es túszomiás magzattal terhes nőben a 21. kromoszómához illeszkedtek; és a PerEy azoknak a szekvenciáknak a százalékos arányát jelenti, amelyek egy euploid magzattal terhes nőben a 21. kromoszómához illeszkedtek· és az f pedig a magzati DNS százalékos arányát jelenti az anyai plazma DNS-ben. [0112] Ahogy az a 7. ábrán látható, a 21 kromoszómához illeszkedő szekvenciák százalékos arányára vonatkozó SD az egyes részhalmazokban lévő szekvenciák számának növekedésével csökken. Ha tehát az egyes részhalmazokban lövő szekvenciák száma nő, akkor csökken az 5. és a 95, percentllls közötti intervallum. Ha az euploid és a 21-es tríszómiás esetekben nem fed át az 5%-95% közötti intervallum, akkor az esetek két csoportja közötti különbségtétel 95% feletti pontossággal lehetséges, [Ö113J Ahogy az a 7. ábrán szerepel, a 21-es tnszömiás eseteknek az euploid esetektől való elkülönítéséhez szükséges minimális részhalmaz-méret a magzati DNS százalékos arányától függ. A 21-es triszőmiás eseteknek az euploid esetektől vaiő elkülönítéséhez szükséges minimális részhalmaz-méret 120 000, ISO 000, illetve 540 000 szekvencia 20%-nyi, 10%-nyf, illetve 5%-nyí magzati DNS esetén. Más szóval ha egy anyai plazma DNS-minta 20% magzati ONS-t tartalmaz, akkor 126 ezer m analizálandó szekvenciák száma annak meghatározásához, hogy egy magzat esetében tonnáiké a 21-es triszómia. Ha a magzati DNS százalékos aránya 5%-ra csökken, akkor az analizálandó szekvenciák száma 540 ezerre nő, [0114] Mivel az adatokat 36 bázispáros szekvenálássai generáltuk, 120 000, 180 000, illetve 540 000 szekvencia az emberi genom 0,14%-ának, 0,22%-ának, illetve 0,85%-ának felel meg. Mivel korai terhességekből származó anyai plazmában mintegy 5%~osnak mérték a magzati DNS·koncentrációk alsóbb tartományát (Lo, YMD és mtsai 1998. Am J Hum Genet 82. 768-775.}, az emberi genom körülbelül 0,6%-ának megszekvenáíása jelentheti a legalább 96%-os pontoaságó diagnózishoz szükséges minimális szekvenáíásí mennyiséget a magzati kromoszómáké aneupioídia bármely terhességre vonatkozó kimutatásakor
IV. RANDOM SZEKVENÁLÁS
[011§3 Annak illusztrálására, hogy a megszekvenáit DNS-fragmensék a szekvenáló futtatás során véletlenszerűen kerültek kiválasztásra, kinyertük az l> példában elemzett nyolc anyai plazmamíniáboí generált megszekvenáit darabokat Minden egyes anyai plazmaminta esetében meghatároztuk a 21. kromoszómához egyedileg, hibás bázispárosodás nélkül illeszkedő összes 36 hp-os megszekvenáit darab indító pozícióit az emberi róferenciagenomhoz, az NCBI 36 összeállításhoz képest. Ezt követően növekvő sorrendbe tettük az egyes mintákból származó illesztett megszekvenáit darabok halmazaira vonatkozó kezdőpozlció számát. Hasonló analízist végeztünk a 22. kromoszómára is, Szemléltetési céllal a 8A,, illetve 8B. ábrán bemutatjuk a 21. kromoszóma, illetve a 22. kromoszóma iegfontosabb tíz kezdőpozícíóját minden egyes anyai píazrnamintára. Ahogy az ezekből a táblázatokból nyilvánvaiő, a DNS-fragmensek megszekvenáit halmazai nem voltak azonosak az egyes minták esetén [8116J A jelen bejelentésben ismertetett bármelyik szoftverkomponens vagy funkció megvalósítható egy szoftverkód formájában, amelyet egy processzor hajt végre bármilyen megfelelő számítógépes nyelv, például Java O* vagy Perl alkalmazásával, amihez például konvencionális vagy objektum-orientált módszereket alkalmazhatunk A szoftverkód egy sor utasítás vagy parancs formájában tárolható tárolásra és/vagy adatátvitelre alkalmazható számítógépes adathordozón, a megfeleld adathordozók közé tartozik többek között egy tetszőleges hozzáférésű memória (RAM), egy csak olvasható memória (ROM), egy mágneses adathordozó, Így például egy merevlemez-meghajtó vagy egy floppy lemez, vagy egy optikai adathordozó, így például egy kompakt lemez (CD) vagy egy DVD (digitális sokoldalú lemez), egy flash memória és a hasonlók is, A számítógépes adathordozó lehet az ilyen tároló és adatátviteli eszközök bármely kombinációja.
[0117] Az ilyen programok a sokféle protokollnak megfelelő vezetékes, optikai és/vagy vezetéknélkülí hálózatokon ezen belül az interneten — történő adatátvitelhez adaptált vivöjeíek alkalmazásával is kódolásra és átvitelre kerülhetnek Így a találmány egy megvalósítási módja szerint egy számítógépes adathordozó hozható létre, Ilyen programokkal kódolt adatszignál alkalmazásával. A programkóddal kódolt számítógépes adathordozó egy kompatibilis eszközbe csomagolható, vagy más eszközöktől szeparáltan is biztosítható· (pl. az internetről történő letöltéssel). Bármilyen ilyen számítógépes adathordozó elhelyezhető egyetlen számítógépes programmal rendelkező terméken vagy termékben (pl, merevlemezen vagy egy egész számítógépes rendszeren), és lehet egy rendszeren vagy haíözaion belüli különböző számítógépes programmal rendelkező termékeken vagy termékekben Is. Egy számitógépes rendszer magában foglalhat monitort, nyomtatót vagy egyéb megfelelő képernyőt is ahhoz, hogy biztosítsa egy felhasználó számára a leírásban említett bármely eredményt, P118] Számítógépes rendszerre a 9. ábra mutat be példát. A 9. ábrán bemutatott alrendszerek 975 rendszerbusz révén összeköttetésben állnak egymással. További alrendszerek is láthatók, így például 974 nyomtató, 978 billentyűzet 979 merevlemez, 976 monitor, amely a 982 képernyőadapterhez van kapcsolva, és egyebek is he vannak mutatva. A számítógépes rendszerre perifériák és a 971 I/O vezérlőhöz kapcsolódó input/output (I/O) eszközök Is fákapcsoíhátők a technikában Ismert sokféle mód bármelyike szerint, így például a 977 soros port révén. A számítógépes berendezést például 977 soros port vagy 881 külső Interfész segítségével kapcsolhatjuk egy nagy kiterjedésű hálózathoz, így például az internethez, vagy egér formátumú inputeszközhöz vagy szkennerhez, A rendszerbuszon keresztüli összeköttetés lehetővé teszi, hogy a 973 központi processzor mindegyik alrendszerrel kommunikáljon, és ellenőrizze az instrukciók végrehajtását a 972 rendszermemóriából vagy a 979 merevlemezről, valamint az. alrendszerek .közötti információcserét í$. Egy számítógépes «adathordozói testesít meg a 972 rendszermemória és/vagy a 979 merevlemez.
[Ö119J A találmány megvalósítási módjaira példákat adó fenti ismertetést illusztratív, leíró céllal közöltük.. Nem volt szándékunkban kimerítő ismertetést adni vagy a pontosan leirt formára korlátozni a találmányt, és számos módosítás és variáció lehetséges a fenti kitanitás fényében. A megvalósítási módokat égy választottuk ki és mutattuk be, hogy a legjobban megvilágítsák a találmány alapolveit és gyakorlati alkalmazásait, hogy ezáltal más szakemberek a legjobban kiaknázhassák a találmányt annak különféle megvalósítási módjaiban és különféle módosításokkal, ahogy az á kérdéses tervezett alkalmazáshoz megfelel. P12ÖJ Az alábbi bekezdésekben a találmány megvalósítási módjait ismertetjük, 1, Eljárás egy magzati kramoszórnális aneupioidia iprenatáiis diagnosztizálására egy terhes női alanyból származó biológiai mintában, ahol a biológiai minta nukleinsav-moiekuIákat tartalmaz, amely eljárás során: megkapjuk a biológiai mintát; megszekvénáljUk a biológiai mintában jelén lévő nukieínsav-molekulák égy sokaságának legalább egy részét, ahol a megszekvenáit rész az emberi genom egy részletét reprezentálja; a szekvenálás alapján: meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára az első kromoszómából származóként azonosítóit szekvenciákból; meghatározunk egy második mennyiséget egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonosítói! szekvenciákból; meghatározunk egy paramétert az első mennyiségbői és a második, mennyiségből; Összehasonlítjuk a paramétert egy vagy több küszöbértékké!; és az összehasonlítás alapján megállapítunk egy besorolási aszerint, hogy fennálí e magzati kromoszómáké aneupioidia az első kromoszóma vonatkozásában. 2 Az 1, bekezdés szerinti eljárás, ahol a szekvenálás véletlenszerűen történik a biológiai mintában lévő nukíeinsav-molekulák egy részén. 3. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol a biológiai minta anyai vár, plazma, szérum, vizelet vagy nyál. 4. Az 1, bekezdés szerinti eljárás, ahol a biológiai minta transzcervikáiis öblitöfolyaciék. 6. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol az első kromoszóma a 21. kromoszóma, a 10. kromoszóma, a 13. kromoszóma, az X-kromoszóma vagy az Y-kromoszoma. b. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol a paraméter az első kromoszómából származó szekvenciák egy aránya. 7. A 8, bekezdés szerinti eljárás, ahol az arányt a következők közül bármelyikből vagy bármelyekből' kapjuk: a megszekvenált darabok számának egy részaránya, a megszekvenált nukleotidok számának egy részaránya, és az akkumulálódott szekvenciák hosszának egy részaránya, 8. A 8. bekezdés szerinti eljárás, ahol az első kromoszómából származó szekvenciákat úgy választjuk ki, hogy rövidebhek legyenek egy adott számú bázispárnál. 9. Az 8. bekezdés szerinti eljárás, ahol az adott számú bázispár 300 bp, 200 bp vagy 100 bp. 10 Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol a biológiai minta nukleinsav-rnolekuláit teldúsitottuk legalább egy bizonyos kromoszómából származó szekvenciákra. 11. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol a biológiai minta nuktelnsav-molekuláit 300 bpnáí rövidebb szekvenciákra dúsítottuk fel. 12. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol a biológiai minta nukleinsav-molekuláit 200 bp~nál rövidebb szekvenciákra dúsiiottuk fel. 13. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol a biológiai minta nukleinsav-molekylált égy pölímerázdáncreakció alkalmazásával amplifikáltuk. 14. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol a megszekvenált rész a humán genom legalább egy előre meghatározott részletét reprezentálja. 18. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol a részlet: a humán genomnak legalább a 0,1 %-át reprezentálja. 16, Az 1, bekezdés szerinti eljárás, ahol a részlet a humán genomnak legalább a 0,5% át reprezentálja, 17. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, ahol a küszöbértékek legalább egyike összefügg azzal, hogy a biológiai mintában lévő magzati DMS-koneentrádőjának mekkora a részaránya, 18. A 17. bekezdés szerinti eljárás, ahol a magzati DNS4:oneentrácio részarányának meghatározása a biológiai mintában Y W kromoszóma szekvenciák egy része vagy egy magzati eugenetikái marker közül egy vagy több segítségével, vagy egynukleotdos polimorfizmus analízis alkalmazásával történik, 19. Az f. békezdes szerinti eljárás, ahol a küszöbérték egy normál biológiai mintából meghatározott referenciaérték. 20. Az 1. bekezdés szerinti eljárás, amelynek során azonosítjuk a biológiai mintában lévé magzati DNS egy mennyiségét, és kiszámítjuk azoknak a szekvenciáknak a számát (N), amelyeket a kívánt pontosság alapján analizálni kell, 21. Számítógépes programmal rendelkező termék, amely tartalmaz számítógépes adathordozót, amelyre egy számítógépes rendszer irányítására szolgáló utasítások egy sokasága van fejkódolva agy művelet elvégzésére, amelynek célja egy magzati kromoszőrnális aneuplordia prenatáSis diagnosztizálása egy terhes női alanyból származó biológiai mintában, ahol a biológiai minta nukíeinsav-molekulákat tartalmaz, és amely művelet során: egy terhes női alanyból származó biológiai mintában lévő nukleínsav-moiekuiák egy részének véletlenszerű szekvenálásáböl származó adatokat kapunk, ahol a biológiai minta nukleinsav--molekulákat tartalmaz, és ahol a rész az emberi genom egy részletét reprezentálja; a véletlenszerű szekvenáiás adatai alapján: meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára az első kromoszómából származóként azonosított szekvenciákból; meghatározunk egy második mennyiséget egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonosított szekvenciákból; meghatározunk egy paramétert az első mennyiségből és a második mennyiségből; összehasonlítjuk a paramétert egy vagy több küszöbértékkel; és az összehasonlítás alapján megállapítunk egy besorolást aszerint, hogy fennáll··© magzati kromoszómáit® aneuploidia az első kromoszóma vonatkozásában. 22 Eljárás egy magzati kromoszómáüs aneuploidia prenatáiis diagnosztizálására egy terhes női alanyból származó biológiai mintában, ahol a biológiai minta nukiemsav-motekulákat tartalmaz, és amely eljárás során: kapunk egy biológiai mintát; kiszámítjuk azoknak a szekvenciáknak a számát (M), amelyeket a kívánt pontosság alapján analizálni kall; véletlenszerűen megszekvenáíjuk a biológiai minta legalább N számú hukíeinsavmioíekulájáí, ahol a részlet az emberi genom egy részletét reprezentálja; a véletlenszerű szekvenálás alapján: meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára az első kromoszómából származóként azonosított szekvenciákból; meghatározunk egy második mennyiséget egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonosított szekvenciákból; meghatározunk egy paraméteri az első mennyiségből és a második mennyiségből; összehasonlítjuk a paramétert egy vagy több köszőbértékkel; és az összehasonlítás alapján megállapítunk egy besorolást aszerint, hogy fennáll·© magzati kromoszómális aneuplöidia az első kromoszóma vonatkozásában. 23. Az 22. bekezdés szerinti eljárás, amelynek során azonosítjuk a biológiai mintában lévő magzati DNS egy adott százalékát, ahol azon szekvenciák számának (N) a kiszámítása, amelyeket a kívánt pontosság alapján analizálni keit, ezen százalék alapján történik.

Claims (7)

  1. Szabadalmi igénypontok
    1. Eljárás egy magzati kromoszómábaaneuploldla prenatáiis diagnosztizálására terhes női alanyból származó biológiai mintából ahol a biológiai minta anyai plazma és tartalmaz nukteinsav-moiekuiákat, amely eljárás során; megkapjuk a biológiai mintát; a biológiai mintában lévő nukieinsav-molekulák egy sokaságának legalább egy részét véletlenszerűen rnegszekvenáljuk, ahol a rnegszekvenált rész az emberi genom egy részletét reprezentálja; a szekvenáiás alapján: meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára az első kromoszómából származóként azonosított szekvenciákból; meghatározunk egy második mennyiséget egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonos ltot! szekvenciákból; meghatározunk egy paramétert az első mennyiségből és á második mennyiségbői; összehasonlítjuk a páramétert egy vagy több küszöbértékkel; és az összehasonlítás alapján megállapítunk egy besorolást aszerint, hogy fennáll-e magzati kromoszömáiís aneuplosdsa az első kromoszóma vonatkozásában.
  2. 2. Az ! igénypont szerinti eljárás, ahoi az első kromoszóma a 21. kromoszóma* a 18. kromoszóma, a 13 kromoszóma, az X-kromoszóma vagy az Y-kromoszóma.
  3. 3. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a paraméter az első kromoszómából származó szekvenciák egy aránya. 4. A'3, Igénypont szerinti eljárás, ahol az arányt a következők közül bármelyikből vagy bármelyekből kapjuk: a megszekvenált darabok számának egy részaránya, a megszakvenáSí nukieotidok számának egy részaránya, és az akkumulálódott szekvenciák hosszának egy részaránya. I, A 3. igénypont szerinti eljárás, ahol az első kromoszómából származó szekvenciákat úgy választjuk, hogy rövidebbek legyenek egy adott számit bázispárnái. Az 5, igénypont szerinti eljárás, ahol az adott számú bázispár 300 bp, 200 bp vagy 100 bp. '7. Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a biológiai minta nukíeinsav-moíekulátt feldúsítottuk legalább egy bizonyos kromoszómából származó szekvenciákra
  4. 8- Az 1 igénypont szerinti eljárás, ahol a biológiai minta ndkleinsavmioíekuláit 300 hp-ná! rövidebb szekvenciákra dúsítottuk fai, B, Az 1, igénypont szerinti eljárás, ahol a biológiai minta nuklesnsav-molekuláit 20Ö hp-nál rövidebb szekvenciákra dúsítottuk fel.
  5. 10, Az 1. igénypont szerinti eljárás, ahol a biológiai minta nukleínsav-moiekuláit pojimeráz-láncreakcíó alkalmazásávai ampíifikáltuk. II, Az 1. Igénypont szerinti eljárás, ahol a részlet az emberi genomnak legalább a 0,1 %-át vagy legalább a 0,5%-át reprezentálja,
  6. 12, Az 1, igénypont szerinti eljárás, ahol a küszöbérték egy normál biológiai mintából meghatározott referenciaérték.
  7. 13, Számitógépes programmal rendelkező termék, amely tartalmaz számitógépes adathordozót, amelyre kódolva van számítógépes rendszer irányítására szolgáló utasítások egy sokasága olyan művelet elvégzésére, amelynek célja magzati kromoszómáiis aneuploidia prenatáíis diagnosztizálása terhes női alanyból származó biológiai mintából, ahol a biológiai minta anyai plazma és tartalmaz nukleinsav-molekulákat, és ameiy műveiét során: egy terhes női alanyból származó biológia! mintában lévő nukleinsav-moiekuiák egy részének véletlenszerű szekvenálásáböl származó adatokat kapunk, ahol a biológiai minta tartalmaz n uklemsa v · molekulákat, és ahol a rész az emberi genom egy részletét reprezéntaija: a véletlenszerű szekvenálás adatai alapján: meghatározunk egy első mennyiséget egy első kromoszómára az első kromoszómából származóként azonosított szekvenciákból; meghatározunk agy második mennyiségét egy vagy több második kromoszómára a második kromoszómák egyikéből származóként azonosított szekvenciákból; meghatározunk egy paramétert az első mennyiségből és a második mennyiségből; ősszehasonlitiuk a paramétert egy vagy több küszöbértékkel: és az összehasonlítás alapján megállapítunk egy besorolást aszerint, hogy fennáíl-e magzati kfömoszőmális aneuploidia az első kromoszóma vonatkozásában.
HUE12175754A 2007-07-23 2008-07-23 Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával HUE030510T2 (hu)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US95143807P 2007-07-23 2007-07-23

Publications (1)

Publication Number Publication Date
HUE030510T2 true HUE030510T2 (hu) 2017-05-29

Family

ID=39798126

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUE12175754A HUE030510T2 (hu) 2007-07-23 2008-07-23 Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával
HUE12180122A HUE061020T2 (hu) 2007-07-23 2008-07-23 Nukleinsav-szekvencia kiegyensúlyozatlanságának meghatározására
HUE12180138A HUE054639T2 (hu) 2007-07-23 2008-07-23 Nukleinsav-szekvencia kiegyensúlyozatlanságának meghatározása

Family Applications After (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
HUE12180122A HUE061020T2 (hu) 2007-07-23 2008-07-23 Nukleinsav-szekvencia kiegyensúlyozatlanságának meghatározására
HUE12180138A HUE054639T2 (hu) 2007-07-23 2008-07-23 Nukleinsav-szekvencia kiegyensúlyozatlanságának meghatározása

Country Status (26)

Country Link
US (10) US8706422B2 (hu)
EP (15) EP2557520B1 (hu)
JP (16) JP5519500B2 (hu)
KR (23) KR102339760B1 (hu)
CN (11) CN106676188A (hu)
AU (1) AU2008278839B2 (hu)
BR (1) BRPI0814670B8 (hu)
CA (10) CA2694007C (hu)
CY (3) CY1114773T1 (hu)
DK (6) DK2557520T3 (hu)
EA (6) EA035451B9 (hu)
ES (6) ES2933486T3 (hu)
FI (1) FI2557517T3 (hu)
HK (5) HK1177768A1 (hu)
HR (4) HRP20230033T3 (hu)
HU (3) HUE030510T2 (hu)
IL (2) IL203311A (hu)
LT (2) LT2557517T (hu)
MX (3) MX341573B (hu)
NZ (2) NZ582702A (hu)
PL (4) PL2183693T5 (hu)
PT (3) PT2557517T (hu)
SG (1) SG183062A1 (hu)
SI (4) SI2514842T1 (hu)
WO (2) WO2009013496A1 (hu)
ZA (1) ZA201000524B (hu)

Families Citing this family (270)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8024128B2 (en) * 2004-09-07 2011-09-20 Gene Security Network, Inc. System and method for improving clinical decisions by aggregating, validating and analysing genetic and phenotypic data
ATE406463T1 (de) 2005-04-06 2008-09-15 Maurice Stroun Methode zur krebsdiagnose mittels nachweis von dna und rna im kreislauf
US20090317798A1 (en) * 2005-06-02 2009-12-24 Heid Christian A Analysis using microfluidic partitioning devices
US9424392B2 (en) 2005-11-26 2016-08-23 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals
US10081839B2 (en) * 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US20070027636A1 (en) * 2005-07-29 2007-02-01 Matthew Rabinowitz System and method for using genetic, phentoypic and clinical data to make predictions for clinical or lifestyle decisions
US8532930B2 (en) * 2005-11-26 2013-09-10 Natera, Inc. Method for determining the number of copies of a chromosome in the genome of a target individual using genetic data from genetically related individuals
US10083273B2 (en) 2005-07-29 2018-09-25 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111543B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US8515679B2 (en) 2005-12-06 2013-08-20 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US11111544B2 (en) 2005-07-29 2021-09-07 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number
US20070178501A1 (en) * 2005-12-06 2007-08-02 Matthew Rabinowitz System and method for integrating and validating genotypic, phenotypic and medical information into a database according to a standardized ontology
PL1981995T5 (pl) * 2006-02-02 2019-10-31 Univ Leland Stanford Junior Nieinwazyjne genetyczne badania przesiewowe płodu metodą analizy cyfrowej
US20080050739A1 (en) 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US8137912B2 (en) 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
EP2029779A4 (en) * 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
EP2589668A1 (en) 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
HUE030510T2 (hu) 2007-07-23 2017-05-29 Univ Hong Kong Chinese Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával
US20100112590A1 (en) 2007-07-23 2010-05-06 The Chinese University Of Hong Kong Diagnosing Fetal Chromosomal Aneuploidy Using Genomic Sequencing With Enrichment
US7888127B2 (en) 2008-01-15 2011-02-15 Sequenom, Inc. Methods for reducing adduct formation for mass spectrometry analysis
WO2009105531A1 (en) * 2008-02-19 2009-08-27 Gene Security Network, Inc. Methods for cell genotyping
US8709726B2 (en) * 2008-03-11 2014-04-29 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for prenatal gender determination
DE102008019132A1 (de) * 2008-04-16 2009-10-22 Olympus Life Science Research Europa Gmbh Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Kopienzahl einer vorbestimmten Sequenz in einer Probe
WO2009146335A1 (en) * 2008-05-27 2009-12-03 Gene Security Network, Inc. Methods for embryo characterization and comparison
EP4047367A1 (en) 2008-07-18 2022-08-24 Bio-Rad Laboratories, Inc. Method for detecting target analytes with droplet libraries
CN104732118B (zh) * 2008-08-04 2017-08-22 纳特拉公司 等位基因调用和倍性调用的方法
EP2318552B1 (en) 2008-09-05 2016-11-23 TOMA Biosciences, Inc. Methods for stratifying and annotating cancer drug treatment options
US8476013B2 (en) 2008-09-16 2013-07-02 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based acid enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
US8962247B2 (en) * 2008-09-16 2015-02-24 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non invasive prenatal diagnoses
AU2015202167B2 (en) * 2008-09-20 2017-12-21 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive diagnosis of fetal aneuploidy by sequencing
US20100112575A1 (en) 2008-09-20 2010-05-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive Diagnosis of Fetal Aneuploidy by Sequencing
US8563242B2 (en) * 2009-08-11 2013-10-22 The Chinese University Of Hong Kong Method for detecting chromosomal aneuploidy
US20120185176A1 (en) 2009-09-30 2012-07-19 Natera, Inc. Methods for Non-Invasive Prenatal Ploidy Calling
CA2778926C (en) 2009-10-26 2018-03-27 Lifecodexx Ag Means and methods for non-invasive diagnosis of chromosomal aneuploidy
WO2011053790A2 (en) * 2009-10-30 2011-05-05 Fluidigm Corporation Assay of closely linked targets in fetal diagnosis and coincidence detection assay for genetic analysis
CA2779695C (en) * 2009-11-05 2016-05-24 The Chinese University Of Hong Kong Fetal genomic analysis from a maternal biological sample
CN102712954A (zh) 2009-11-06 2012-10-03 小利兰·斯坦福大学托管委员会 器官移植患者移植排斥的非侵入性诊断
EP3406737B1 (en) 2009-11-06 2023-05-31 The Chinese University of Hong Kong Size-based genomic analysis
WO2011074960A1 (en) * 2009-12-17 2011-06-23 Keygene N.V. Restriction enzyme based whole genome sequencing
EP3088532B1 (en) 2009-12-22 2019-10-30 Sequenom, Inc. Processes and kits for identifying aneuploidy
EP3382037B1 (en) * 2010-01-19 2021-02-17 Verinata Health, Inc. Methods for determining fraction of fetal nucleic acids in maternal samples
WO2011090556A1 (en) 2010-01-19 2011-07-28 Verinata Health, Inc. Methods for determining fraction of fetal nucleic acid in maternal samples
US20120100548A1 (en) 2010-10-26 2012-04-26 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
AU2015203579B2 (en) * 2010-01-19 2017-12-21 Verinata Health, Inc. Sequencing methods and compositions for prenatal diagnoses
AU2011207561B2 (en) 2010-01-19 2014-02-20 Verinata Health, Inc. Partition defined detection methods
EP2513341B1 (en) 2010-01-19 2017-04-12 Verinata Health, Inc Identification of polymorphic sequences in mixtures of genomic dna by whole genome sequencing
US9323888B2 (en) 2010-01-19 2016-04-26 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
AU2015204302B2 (en) * 2010-01-19 2017-10-05 Verinata Health, Inc. Method for determining copy number variations
US9260745B2 (en) 2010-01-19 2016-02-16 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
US10388403B2 (en) 2010-01-19 2019-08-20 Verinata Health, Inc. Analyzing copy number variation in the detection of cancer
US20110312503A1 (en) 2010-01-23 2011-12-22 Artemis Health, Inc. Methods of fetal abnormality detection
KR20120107512A (ko) * 2010-01-26 2012-10-02 엔아이피디 제네틱스 리미티드 태아 이수성의 비침해성 출생전 진단을 위한 방법과 조성물
JP5934657B2 (ja) * 2010-02-12 2016-06-15 レインダンス テクノロジーズ， インコーポレイテッド デジタル検体分析
CN102753703B (zh) * 2010-04-23 2014-12-24 深圳华大基因健康科技有限公司 胎儿染色体非整倍性的检测方法
US11339429B2 (en) 2010-05-18 2022-05-24 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US10316362B2 (en) 2010-05-18 2019-06-11 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
WO2013052557A2 (en) * 2011-10-03 2013-04-11 Natera, Inc. Methods for preimplantation genetic diagnosis by sequencing
US11939634B2 (en) 2010-05-18 2024-03-26 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US20190010543A1 (en) 2010-05-18 2019-01-10 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11332793B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US9677118B2 (en) 2014-04-21 2017-06-13 Natera, Inc. Methods for simultaneous amplification of target loci
US11326208B2 (en) 2010-05-18 2022-05-10 Natera, Inc. Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA
US11332785B2 (en) 2010-05-18 2022-05-17 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11408031B2 (en) 2010-05-18 2022-08-09 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
AU2011255641A1 (en) 2010-05-18 2012-12-06 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
US11322224B2 (en) 2010-05-18 2022-05-03 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
CA2802111A1 (en) * 2010-07-23 2012-01-26 Esoterix Genetic Laboratories, Llc Identification of differentially represented fetal or maternal genomic regions and uses thereof
US11031095B2 (en) 2010-08-06 2021-06-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Assay systems for determination of fetal copy number variation
US10167508B2 (en) 2010-08-06 2019-01-01 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
US20130040375A1 (en) * 2011-08-08 2013-02-14 Tandem Diagnotics, Inc. Assay systems for genetic analysis
US11203786B2 (en) 2010-08-06 2021-12-21 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20140342940A1 (en) 2011-01-25 2014-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of Target Nucleic Acids using Hybridization
US20120034603A1 (en) 2010-08-06 2012-02-09 Tandem Diagnostics, Inc. Ligation-based detection of genetic variants
US10533223B2 (en) 2010-08-06 2020-01-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Detection of target nucleic acids using hybridization
US20120077185A1 (en) * 2010-08-06 2012-03-29 Tandem Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities and infectious disease
US20130261003A1 (en) 2010-08-06 2013-10-03 Ariosa Diagnostics, In. Ligation-based detection of genetic variants
US8700338B2 (en) 2011-01-25 2014-04-15 Ariosa Diagnosis, Inc. Risk calculation for evaluation of fetal aneuploidy
EP2604700B1 (en) * 2010-08-13 2015-07-22 BGI Diagnosis Co., Ltd. A method for analyzing cell chromosomes
EP2619329B1 (en) 2010-09-24 2019-05-22 The Board of Trustees of The Leland Stanford Junior University Direct capture, amplification and sequencing of target dna using immobilized primers
CN103534591B (zh) * 2010-10-26 2016-04-06 利兰·斯坦福青年大学托管委员会 通过测序分析进行的非侵入性胎儿遗传筛选
CN108899091B (zh) * 2010-11-30 2022-04-15 香港中文大学 与癌症相关的遗传或分子畸变的检测
WO2012078792A2 (en) 2010-12-07 2012-06-14 Stanford University Non-invasive determination of fetal inheritance of parental haplotypes at the genome-wide scale
AU2011348100B2 (en) 2010-12-22 2016-08-25 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal paternity testing
AU2012204748C1 (en) * 2011-01-05 2021-12-23 The Chinese University Of Hong Kong Noninvasive prenatal genotyping of fetal sex chromosomes
US10131947B2 (en) 2011-01-25 2018-11-20 Ariosa Diagnostics, Inc. Noninvasive detection of fetal aneuploidy in egg donor pregnancies
US11270781B2 (en) 2011-01-25 2022-03-08 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
US9994897B2 (en) 2013-03-08 2018-06-12 Ariosa Diagnostics, Inc. Non-invasive fetal sex determination
US8756020B2 (en) 2011-01-25 2014-06-17 Ariosa Diagnostics, Inc. Enhanced risk probabilities using biomolecule estimations
US20120190021A1 (en) * 2011-01-25 2012-07-26 Aria Diagnostics, Inc. Detection of genetic abnormalities
AU2011358564B9 (en) * 2011-02-09 2017-07-13 Natera, Inc Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
EP2902500B1 (en) * 2011-02-09 2017-01-11 Natera, Inc. Methods for non-invasive prenatal ploidy calling
EP3736281A1 (en) 2011-02-18 2020-11-11 Bio-Rad Laboratories, Inc. Compositions and methods for molecular labeling
CA3160848A1 (en) * 2011-02-24 2013-03-28 The Chinese University Of Hong Kong Molecular testing of multiple pregnancies
WO2012129436A1 (en) * 2011-03-22 2012-09-27 Life Technologies Corporation Identification of linkage using multiplex digital pcr
US9260753B2 (en) 2011-03-24 2016-02-16 President And Fellows Of Harvard College Single cell nucleic acid detection and analysis
US20150065358A1 (en) * 2011-03-30 2015-03-05 Verinata Health, Inc. Method for verifying bioassay samples
DK3567124T3 (da) 2011-04-12 2022-03-07 Verinata Health Inc Opløsning af genomfraktioner ved anvendelse af polymorfisme-optællinger
GB2484764B (en) * 2011-04-14 2012-09-05 Verinata Health Inc Normalizing chromosomes for the determination and verification of common and rare chromosomal aneuploidies
US9411937B2 (en) 2011-04-15 2016-08-09 Verinata Health, Inc. Detecting and classifying copy number variation
CN103717750B (zh) 2011-04-29 2017-03-08 塞昆纳姆股份有限公司 少数核酸物质的定量
US20140235474A1 (en) 2011-06-24 2014-08-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non invasive assessment of a genetic variation
MY172864A (en) 2011-06-29 2019-12-13 Bgi Shenzhen Co Ltd Noninvasive detection of fetal genetic abnormality
US20140141997A1 (en) * 2011-06-30 2014-05-22 National University Of Singapore Foetal nucleated red blood cell detection
US20130157875A1 (en) * 2011-07-20 2013-06-20 Anthony P. Shuber Methods for assessing genomic instabilities
EP2563937A1 (en) * 2011-07-26 2013-03-06 Verinata Health, Inc Method for determining the presence or absence of different aneuploidies in a sample
US8712697B2 (en) 2011-09-07 2014-04-29 Ariosa Diagnostics, Inc. Determination of copy number variations using binomial probability calculations
CN104160391A (zh) * 2011-09-16 2014-11-19 考利达基因组股份有限公司 确定异质样本的基因组中的变异
WO2013040773A1 (zh) * 2011-09-21 2013-03-28 深圳华大基因科技有限公司 确定单细胞染色体非整倍性的方法和系统
US10424394B2 (en) 2011-10-06 2019-09-24 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US10196681B2 (en) 2011-10-06 2019-02-05 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9984198B2 (en) 2011-10-06 2018-05-29 Sequenom, Inc. Reducing sequence read count error in assessment of complex genetic variations
AU2012318371B2 (en) 2011-10-06 2018-03-22 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP2764458B1 (en) 2011-10-06 2021-04-07 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
US9367663B2 (en) 2011-10-06 2016-06-14 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
DK2766496T3 (en) 2011-10-11 2017-05-15 Sequenom Inc METHODS AND PROCESSES FOR NON-INVASIVE ASSESSMENT OF GENETIC VARIATIONS
US8688388B2 (en) 2011-10-11 2014-04-01 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN102329876B (zh) * 2011-10-14 2014-04-02 深圳华大基因科技有限公司 一种测定待检测样本中疾病相关核酸分子的核苷酸序列的方法
ES2651612T3 (es) 2011-10-18 2018-01-29 Multiplicom Nv Diagnóstico de aneuploidía cromosómica fetal
US9845552B2 (en) 2011-10-27 2017-12-19 Verinata Health, Inc. Set membership testers for aligning nucleic acid samples
EP2602733A3 (en) * 2011-12-08 2013-08-14 Koninklijke Philips Electronics N.V. Biological cell assessment using whole genome sequence and oncological therapy planning using same
AU2013209499B2 (en) 2012-01-20 2018-05-10 Sequenom, Inc. Diagnostic processes that factor experimental conditions
EP3757210B1 (en) 2012-03-02 2022-08-24 Sequenom, Inc. Methods for enriching cancer nucleic acid from a biological sample
US9892230B2 (en) 2012-03-08 2018-02-13 The Chinese University Of Hong Kong Size-based analysis of fetal or tumor DNA fraction in plasma
AU2013240088B2 (en) 2012-03-26 2017-02-02 The Johns Hopkins University Rapid aneuploidy detection
EP2834376B1 (en) * 2012-04-06 2017-03-15 The Chinese University Of Hong Kong Noninvasive prenatal diagnosis of fetal trisomy by allelic ratio analysis using targeted massively parallel sequencing
EP3741871A3 (en) 2012-04-19 2021-02-17 The Medical College of Wisconsin, Inc. Highly sensitive surveillance using detection of cell free dna
EP2852682B1 (en) 2012-05-21 2017-10-04 Fluidigm Corporation Single-particle analysis of particle populations
US10289800B2 (en) 2012-05-21 2019-05-14 Ariosa Diagnostics, Inc. Processes for calculating phased fetal genomic sequences
US9920361B2 (en) 2012-05-21 2018-03-20 Sequenom, Inc. Methods and compositions for analyzing nucleic acid
US10504613B2 (en) 2012-12-20 2019-12-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
ES2772029T3 (es) 2012-05-21 2020-07-07 Sequenom Inc Métodos y procesos para la evaluación no invasiva de variaciones genéticas
US11261494B2 (en) * 2012-06-21 2022-03-01 The Chinese University Of Hong Kong Method of measuring a fractional concentration of tumor DNA
US10497461B2 (en) 2012-06-22 2019-12-03 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA2878979C (en) * 2012-07-13 2021-09-14 Sequenom, Inc. Processes and compositions for methylation-based enrichment of fetal nucleic acid from a maternal sample useful for non-invasive prenatal diagnoses
AU2013292287A1 (en) 2012-07-19 2015-02-19 Ariosa Diagnostics, Inc. Multiplexed sequential ligation-based detection of genetic variants
US20160040229A1 (en) 2013-08-16 2016-02-11 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US11913065B2 (en) 2012-09-04 2024-02-27 Guardent Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
CN104781421B (zh) 2012-09-04 2020-06-05 夸登特健康公司 检测稀有突变和拷贝数变异的系统和方法
US10876152B2 (en) 2012-09-04 2020-12-29 Guardant Health, Inc. Systems and methods to detect rare mutations and copy number variation
US10706957B2 (en) 2012-09-20 2020-07-07 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of tumor from plasma
KR20230145530A (ko) 2012-09-20 2023-10-17 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 혈장으로부터 태아 또는 종양 메틸롬의 비침습적 결정
US9732390B2 (en) 2012-09-20 2017-08-15 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive determination of methylome of fetus or tumor from plasma
US20150275300A1 (en) * 2012-09-26 2015-10-01 Agency For Science, Technology And Research Biomarkers for down syndrome prenatal diagnosis
US10482994B2 (en) 2012-10-04 2019-11-19 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CA3120521A1 (en) 2012-10-04 2014-04-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
DK2728014T3 (en) * 2012-10-31 2016-01-25 Genesupport Sa A non-invasive method for the detection of fetal chromosomal aneuploidy
US10643738B2 (en) 2013-01-10 2020-05-05 The Chinese University Of Hong Kong Noninvasive prenatal molecular karyotyping from maternal plasma
US20130309666A1 (en) 2013-01-25 2013-11-21 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
JP6542676B2 (ja) * 2013-02-20 2019-07-10 バイオナノ ジェノミクス、 インコーポレイテッド ナノフルイディクスにおける分子の特性解析
SG10201609080WA (en) 2013-02-28 2016-12-29 Univ Hong Kong Chinese Maternal plasma transcriptome analysis by massively parallel rna sequencing
WO2014133369A1 (ko) * 2013-02-28 2014-09-04 주식회사 테라젠이텍스 유전체 서열분석을 이용한 태아 염색체 이수성의 진단 방법 및 장치
US20130189684A1 (en) 2013-03-12 2013-07-25 Sequenom, Inc. Quantification of cell-specific nucleic acid markers
EP2971100A1 (en) 2013-03-13 2016-01-20 Sequenom, Inc. Primers for dna methylation analysis
US9305756B2 (en) 2013-03-13 2016-04-05 Agena Bioscience, Inc. Preparation enhancements and methods of use for MALDI mass spectrometry
AU2014231358A1 (en) 2013-03-15 2015-09-24 The Chinese University Of Hong Kong Determining fetal genomes for multiple fetus pregnancies
FI2981921T3 (fi) 2013-04-03 2023-03-09 Sequenom Inc Menetelmiä ja prosesseja geneettisten variaatioiden ei-invasiiviseen arviointiin
WO2014182726A2 (en) 2013-05-07 2014-11-13 Sequenom, Inc. Genetic markers for macular degeneration disorder treatment
KR20230082691A (ko) 2013-05-24 2023-06-08 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
WO2014200579A1 (en) * 2013-06-13 2014-12-18 Ariosa Diagnostics, Inc. Statistical analysis for non-invasive sex chromosome aneuploidy determination
KR102447079B1 (ko) 2013-06-21 2022-09-23 시쿼넘, 인코포레이티드 유전적 변이의 비침습 평가를 위한 방법 및 프로세스
CN104520437B (zh) * 2013-07-17 2016-09-14 深圳华大基因股份有限公司 一种染色体非整倍性检测方法及装置
US10174375B2 (en) 2013-09-20 2019-01-08 The Chinese University Of Hong Kong Sequencing analysis of circulating DNA to detect and monitor autoimmune diseases
US10262755B2 (en) 2014-04-21 2019-04-16 Natera, Inc. Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments
US10577655B2 (en) 2013-09-27 2020-03-03 Natera, Inc. Cell free DNA diagnostic testing standards
WO2015048535A1 (en) 2013-09-27 2015-04-02 Natera, Inc. Prenatal diagnostic resting standards
EP4258269A3 (en) 2013-10-04 2024-01-10 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN111863131A (zh) 2013-10-07 2020-10-30 塞昆纳姆股份有限公司 用于非侵入性评估染色体改变的方法和过程
EP3061021B1 (en) * 2013-10-21 2023-05-10 Verinata Health, Inc. Method for improving the sensitivity of detection in determining copy number variations
WO2015089726A1 (zh) * 2013-12-17 2015-06-25 深圳华大基因科技有限公司 一种染色体非整倍性检测方法及装置
JP6571665B2 (ja) 2013-12-28 2019-09-04 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 遺伝的バリアントを検出するための方法およびシステム
WO2015138774A1 (en) 2014-03-13 2015-09-17 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
CN106460070B (zh) 2014-04-21 2021-10-08 纳特拉公司 检测染色体片段中的突变和倍性
RU2602366C2 (ru) * 2014-05-21 2016-11-20 Общество С Ограниченной Ответственностью "Тестген" Способ получения днк-праймеров и зондов для малоинвазивной пренатальной пцр-диагностики трисомии 21-й хромосомы у плода по крови беременной женщины и диагностический набор для ее осуществления
KR101663171B1 (ko) * 2014-05-27 2016-10-14 이원 다이애그노믹스 게놈센타(주) 다운증후군 진단을 위한 바이오마커 및 그의 용도
WO2016003047A1 (ko) * 2014-07-01 2016-01-07 바이오코아 주식회사 디지털 ｐｃｒ을 이용하여 임부의 혈액 또는 혈장으로부터 태아의 유전자 정보를 분석하는 방법
WO2016010401A1 (ko) * 2014-07-18 2016-01-21 에스케이텔레콘 주식회사 산모의 혈청 dna를 이용한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법
US11062789B2 (en) 2014-07-18 2021-07-13 The Chinese University Of Hong Kong Methylation pattern analysis of tissues in a DNA mixture
KR20160010277A (ko) * 2014-07-18 2016-01-27 에스케이텔레콤 주식회사 산모의 무세포 dna의 차세대 서열분석을 통한 태아의 단일유전자 유전변이의 예측방법
US20160026759A1 (en) * 2014-07-22 2016-01-28 Yourgene Bioscience Detecting Chromosomal Aneuploidy
JP2017522908A (ja) 2014-07-25 2017-08-17 ユニヴァーシティ オブ ワシントン セルフリーｄｎａを生じる組織及び／又は細胞タイプを決定する方法、並びにそれを用いて疾患又は異常を識別する方法
WO2016019042A1 (en) 2014-07-30 2016-02-04 Sequenom, Inc. Methods and processes for non-invasive assessment of genetic variations
EP3230469B1 (en) 2014-12-12 2019-04-03 Verinata Health, Inc. Using cell-free dna fragment size to determine copy number variations
US10364467B2 (en) 2015-01-13 2019-07-30 The Chinese University Of Hong Kong Using size and number aberrations in plasma DNA for detecting cancer
US10319463B2 (en) 2015-01-23 2019-06-11 The Chinese University Of Hong Kong Combined size- and count-based analysis of maternal plasma for detection of fetal subchromosomal aberrations
ES2908347T3 (es) 2015-02-10 2022-04-28 Univ Hong Kong Chinese Detección de mutaciones para cribado de cáncer y análisis fetal
CN104789686B (zh) * 2015-05-06 2018-09-07 浙江安诺优达生物科技有限公司 检测染色体非整倍性的试剂盒和装置
CN104789466B (zh) * 2015-05-06 2018-03-13 安诺优达基因科技(北京)有限公司 检测染色体非整倍性的试剂盒和装置
US11479812B2 (en) 2015-05-11 2022-10-25 Natera, Inc. Methods and compositions for determining ploidy
US10395759B2 (en) 2015-05-18 2019-08-27 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods and systems for copy number variant detection
EP3666902A1 (en) 2015-05-22 2020-06-17 Nipd Genetics Public Company Limited Multiplexed parallel analysis of targeted genomic regions for non-invasive prenatal testing
CN104951671B (zh) * 2015-06-10 2017-09-19 东莞博奥木华基因科技有限公司 基于单样本外周血检测胎儿染色体非整倍性的装置
WO2016207647A1 (en) * 2015-06-24 2016-12-29 Oxford Biodynamics Limited Epigenetic chromosome interactions
EP3118323A1 (en) 2015-07-13 2017-01-18 Cartagenia N.V. System and methodology for the analysis of genomic data obtained from a subject
EP3636777A1 (en) 2015-07-13 2020-04-15 Agilent Technologies Belgium NV System and methodology for the analysis of genomic data obtained from a subject
EP3325663B1 (en) 2015-07-20 2020-08-19 The Chinese University Of Hong Kong Methylation pattern analysis of haplotypes in tissues in dna mixture
ES2960201T3 (es) 2015-07-23 2024-03-01 Univ Hong Kong Chinese Análisis de los patrones de fragmentación del ADN acelular
IL285795B (en) 2015-08-12 2022-07-01 Univ Hong Kong Chinese Sequencing a single molecule of DNA. plasma
WO2017044609A1 (en) 2015-09-08 2017-03-16 Cold Spring Harbor Laboratory Genetic copy number determination using high throughput multiplex sequencing of smashed nucleotides
US10774375B2 (en) 2015-09-18 2020-09-15 Agena Bioscience, Inc. Methods and compositions for the quantitation of mitochondrial nucleic acid
WO2017051996A1 (ko) * 2015-09-24 2017-03-30 에스케이텔레콤 주식회사 비침습적 태아 염색체 이수성 판별 방법
CN105132572B (zh) * 2015-09-25 2018-03-02 邯郸市康业生物科技有限公司 一种无创产前筛查21‑三体综合征试剂盒
KR101848438B1 (ko) * 2015-10-29 2018-04-13 바이오코아 주식회사 디지털 pcr을 이용한 산전진단 방법
EP3390668A4 (en) 2015-12-17 2020-04-01 Guardant Health, Inc. METHODS OF DETERMINING THE NUMBER OF TUMOR GENE COPIES BY ACELLULAR DNA ANALYSIS
GB201522665D0 (en) * 2015-12-22 2016-02-03 Premaitha Ltd Detection of chromosome abnormalities
KR101817180B1 (ko) * 2016-01-20 2018-01-10 이원다이애그노믹스(주) 염색체 이상 판단 방법
US10095831B2 (en) 2016-02-03 2018-10-09 Verinata Health, Inc. Using cell-free DNA fragment size to determine copy number variations
WO2017192589A1 (en) 2016-05-02 2017-11-09 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Neutralizing antibodies to influenza ha and their use and identification
KR101879329B1 (ko) * 2016-06-13 2018-07-17 충북대학교 산학협력단 유전자 차별 발현 분석을 위한 RNA-seq 발현량 데이터 시뮬레이션 방법 및 이를 기록한 기록매체
CA3030890A1 (en) 2016-07-27 2018-02-01 Sequenom, Inc. Genetic copy number alteration classifications
CA3037366A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Myriad Women's Health, Inc. Noninvasive prenatal screening using dynamic iterative depth optimization
US20200013482A1 (en) 2016-09-30 2020-01-09 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
US9850523B1 (en) 2016-09-30 2017-12-26 Guardant Health, Inc. Methods for multi-resolution analysis of cell-free nucleic acids
US11485996B2 (en) 2016-10-04 2022-11-01 Natera, Inc. Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing
EP3535415A4 (en) 2016-10-24 2020-07-01 The Chinese University of Hong Kong TUMOR DETECTION METHODS AND SYSTEMS
KR20230062684A (ko) 2016-11-30 2023-05-09 더 차이니즈 유니버시티 오브 홍콩 소변 및 기타 샘플에서의 무세포 dna의 분석
US10011870B2 (en) 2016-12-07 2018-07-03 Natera, Inc. Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules
US20200255896A1 (en) * 2017-01-11 2020-08-13 Quest Diagnostics Investments Llc Method for non-invasive prenatal screening for aneuploidy
WO2018140521A1 (en) 2017-01-24 2018-08-02 Sequenom, Inc. Methods and processes for assessment of genetic variations
SG11201906397UA (en) 2017-01-25 2019-08-27 Univ Hong Kong Chinese Diagnostic applications using nucleic acid fragments
EP3585889A1 (en) 2017-02-21 2020-01-01 Natera, Inc. Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids
CA3067637A1 (en) 2017-06-20 2018-12-27 The Medical College Of Wisconsin, Inc. Assessing transplant complication risk with total cell-free dna
LT3658689T (lt) 2017-07-26 2021-06-25 Trisomytest, S.R.O. Neinvazinis prenatalinis vaisiaus chromosomos aneuploidijos nustatymo būdas iš motinos kraujo remiantis bajeso tinklu
EP3662479A1 (en) 2017-08-04 2020-06-10 Trisomytest, s.r.o. A method for non-invasive prenatal detection of fetal sex chromosomal abnormalities and fetal sex determination for singleton and twin pregnancies
US11519024B2 (en) 2017-08-04 2022-12-06 Billiontoone, Inc. Homologous genomic regions for characterization associated with biological targets
WO2019028462A1 (en) 2017-08-04 2019-02-07 Billiontoone, Inc. TARGET-ASSOCIATED MOLECULES FOR CHARACTERIZATION ASSOCIATED WITH BIOLOGICAL TARGETS
SK862017A3 (sk) 2017-08-24 2020-05-04 Grendar Marian Doc Mgr Phd Spôsob použitia fetálnej frakcie a chromozómovej reprezentácie pri určovaní aneuploidného stavu v neinvazívnom prenatálnom testovaní
WO2019043656A1 (en) * 2017-09-01 2019-03-07 Genus Plc METHODS AND SYSTEMS FOR ASSESSING AND / OR QUANTIFYING POPULATIONS OF SPERMATOZOIDS WITH SEXUAL ASYMMETRY
US20200299677A1 (en) 2017-10-27 2020-09-24 Juno Diagnostics, Inc. Devices, systems and methods for ultra-low volume liquid biopsy
US11168356B2 (en) 2017-11-02 2021-11-09 The Chinese University Of Hong Kong Using nucleic acid size range for noninvasive cancer detection
CN112365927B (zh) * 2017-12-28 2023-08-25 安诺优达基因科技(北京)有限公司 Cnv检测装置
PT3735470T (pt) 2018-01-05 2024-01-31 Billiontoone Inc Modelos de controlo de qualidade para garantir a validade dos ensaios baseados em sequenciamento
CN108282396B (zh) * 2018-02-13 2022-02-22 湖南快乐阳光互动娱乐传媒有限公司 一种im集群中的多级消息广播方法及系统
KR102099151B1 (ko) * 2018-03-05 2020-04-10 서강대학교산학협력단 마이크로웰 어레이를 이용한 dPCR 분석방법 및 분석장치
CA3095292A1 (en) 2018-04-02 2019-10-10 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
EP3775278A1 (en) 2018-04-02 2021-02-17 Illumina Inc. Compositions and methods for making controls for sequence-based genetic testing
CA3105349A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 The Chinese University Of Hong Kong Size-tagged preferred ends and orientation-aware analysis for measuring properties of cell-free mixtures
WO2019232435A1 (en) 2018-06-01 2019-12-05 Grail, Inc. Convolutional neural network systems and methods for data classification
US11525159B2 (en) 2018-07-03 2022-12-13 Natera, Inc. Methods for detection of donor-derived cell-free DNA
JP2021534803A (ja) * 2018-09-04 2021-12-16 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド 無細胞核酸試料におけるアレル不均衡を検出するための方法およびシステム
CA3107467A1 (en) 2018-09-07 2020-03-12 Sequenom, Inc. Methods, and systems to detect transplant rejection
WO2020076474A1 (en) 2018-10-12 2020-04-16 Nantomics, Llc Prenatal purity assessments using bambam
JP2022512848A (ja) * 2018-10-31 2022-02-07 ガーダント ヘルス， インコーポレイテッド エピジェネティック区画アッセイを較正するための方法、組成物およびシステム
CN109545379B (zh) * 2018-12-05 2021-11-09 易必祥 基于基因大数据的治疗系统
US11581062B2 (en) 2018-12-10 2023-02-14 Grail, Llc Systems and methods for classifying patients with respect to multiple cancer classes
JP2020108548A (ja) * 2019-01-04 2020-07-16 株式会社大一商会 遊技機
JP6783437B2 (ja) * 2019-01-04 2020-11-11 株式会社大一商会 遊技機
CN113661249A (zh) 2019-01-31 2021-11-16 夸登特健康公司 用于分离无细胞dna的组合物和方法
WO2020172164A1 (en) 2019-02-19 2020-08-27 Sequenom, Inc. Compositions, methods, and systems to detect hematopoietic stem cell transplantation status
KR20200109544A (ko) * 2019-03-13 2020-09-23 울산대학교 산학협력단 공통 유전자 추출에 의한 다중 암 분류 방법
CA3130810A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 The Chinese University Of Hong Kong Determining linear and circular forms of circulating nucleic acids
WO2020206170A1 (en) 2019-04-02 2020-10-08 Progenity, Inc. Methods, systems, and compositions for counting nucleic acid molecules
US11931674B2 (en) 2019-04-04 2024-03-19 Natera, Inc. Materials and methods for processing blood samples
RU2717023C1 (ru) * 2019-04-24 2020-03-17 Общество с ограниченной ответственностью "ГЕНОТЕК ИТ" Способ определения кариотипа плода беременной женщины на основании секвенирования гибридных прочтений, состоящих из коротких фрагментов внеклеточной ДНК
CA3110884A1 (en) 2019-08-16 2021-02-25 The Chinese University Of Hong Kong Determination of base modifications of nucleic acids
TWI724710B (zh) * 2019-08-16 2021-04-11 財團法人工業技術研究院 建構數位化疾病模組的方法及裝置
WO2021067417A1 (en) * 2019-09-30 2021-04-08 Myome, Inc. Polygenic risk score for in vitro fertilization
CN114585749A (zh) * 2019-10-16 2022-06-03 斯蒂拉科技公司 核酸序列浓度的确定
WO2021137770A1 (en) 2019-12-30 2021-07-08 Geneton S.R.O. Method for fetal fraction estimation based on detection and interpretation of single nucleotide variants
JP2023510318A (ja) * 2020-01-08 2023-03-13 ザ チャイニーズ ユニバーシティ オブ ホンコン 無細胞試料の二末端ｄｎａ断片タイプおよびその用途
US11475981B2 (en) 2020-02-18 2022-10-18 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for dynamic variant thresholding in a liquid biopsy assay
US11211147B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Estimation of circulating tumor fraction using off-target reads of targeted-panel sequencing
US11211144B2 (en) 2020-02-18 2021-12-28 Tempus Labs, Inc. Methods and systems for refining copy number variation in a liquid biopsy assay
US20230120825A1 (en) 2020-02-28 2023-04-20 Laboratory Corporation Of America Holdings Compositions, Methods, and Systems for Paternity Determination
US20220254153A1 (en) * 2020-05-11 2022-08-11 Nec Corporation Determination device, determination method, and recording medium
US20220245934A1 (en) 2020-05-11 2022-08-04 Nec Corporation Determination device, determination method, and recording medium
WO2021237105A1 (en) * 2020-05-22 2021-11-25 Invitae Corporation Methods for determining a genetic variation
CN114645080A (zh) * 2020-12-21 2022-06-21 高嵩 一种利用多态性位点和靶位点测序检测胎儿遗传变异的方法
WO2022246291A1 (en) * 2021-05-21 2022-11-24 Invitae Corporation Methods for determining a genetic variation
CN113981062B (zh) * 2021-10-14 2024-02-20 武汉蓝沙医学检验实验室有限公司 以非生父和母亲dna评估胎儿dna浓度的方法及应用
WO2024058850A1 (en) * 2022-09-16 2024-03-21 Myriad Women's Health, Inc. Rna-facs for rare cell isolation and detection of genetic variants

Family Cites Families (94)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5641628A (en) * 1989-11-13 1997-06-24 Children's Medical Center Corporation Non-invasive method for isolation and detection of fetal DNA
AU2765992A (en) * 1991-10-03 1993-05-03 Indiana University Foundation Method for screening for alzheimer's disease
US6100029A (en) * 1996-08-14 2000-08-08 Exact Laboratories, Inc. Methods for the detection of chromosomal aberrations
US20010051341A1 (en) * 1997-03-04 2001-12-13 Isis Innovation Limited Non-invasive prenatal diagnosis
GB9704444D0 (en) * 1997-03-04 1997-04-23 Isis Innovation Non-invasive prenatal diagnosis
US6143496A (en) * 1997-04-17 2000-11-07 Cytonix Corporation Method of sampling, amplifying and quantifying segment of nucleic acid, polymerase chain reaction assembly having nanoliter-sized sample chambers, and method of filling assembly
US6558901B1 (en) * 1997-05-02 2003-05-06 Biomerieux Vitek Nucleic acid assays
US6566101B1 (en) * 1997-06-16 2003-05-20 Anthony P. Shuber Primer extension methods for detecting nucleic acids
US20030022207A1 (en) * 1998-10-16 2003-01-30 Solexa, Ltd. Arrayed polynucleotides and their use in genome analysis
US6613513B1 (en) * 1999-02-23 2003-09-02 Caliper Technologies Corp. Sequencing by incorporation
AUPQ008799A0 (en) * 1999-04-30 1999-05-27 Tillett, Daniel Genome sequencing
US6818395B1 (en) * 1999-06-28 2004-11-16 California Institute Of Technology Methods and apparatus for analyzing polynucleotide sequences
US6440706B1 (en) * 1999-08-02 2002-08-27 Johns Hopkins University Digital amplification
KR20020064298A (ko) * 1999-10-13 2002-08-07 시쿼넘, 인코포레이티드 다형성 유전 마커를 동정하기 위한 데이타베이스 및 이의제조 방법
GB0009784D0 (en) * 2000-04-20 2000-06-07 Simeg Limited Methods for clinical diagnosis
GB0016742D0 (en) * 2000-07-10 2000-08-30 Simeg Limited Diagnostic method
US6664056B2 (en) * 2000-10-17 2003-12-16 The Chinese University Of Hong Kong Non-invasive prenatal monitoring
US8898021B2 (en) * 2001-02-02 2014-11-25 Mark W. Perlin Method and system for DNA mixture analysis
US20060068433A1 (en) * 2004-09-20 2006-03-30 Godfrey Tony E Multiple mode multiplex reaction quenching method
US20020164816A1 (en) * 2001-04-06 2002-11-07 California Institute Of Technology Microfluidic sample separation device
WO2002081729A2 (en) * 2001-04-06 2002-10-17 California Institute Of Technology Nucleic acid amplification utilizing microfluidic devices
US7118907B2 (en) * 2001-06-06 2006-10-10 Li-Cor, Inc. Single molecule detection systems and methods
US20050037388A1 (en) * 2001-06-22 2005-02-17 University Of Geneva Method for detecting diseases caused by chromosomal imbalances
US6927028B2 (en) * 2001-08-31 2005-08-09 Chinese University Of Hong Kong Non-invasive methods for detecting non-host DNA in a host using epigenetic differences between the host and non-host DNA
GT200200183A (es) * 2001-09-28 2003-05-23 Procedimiento para preparar derivados de heterocicloalquilsulfonil pirazol
WO2003030823A2 (en) 2001-10-05 2003-04-17 Combinatorx, Incorporated Combinations for the treatment of immunoinflammatory disorders
JP2005509871A (ja) * 2001-11-20 2005-04-14 エグザクト サイエンシーズ コーポレイション 自動化サンプル調製方法および装置
US7691333B2 (en) * 2001-11-30 2010-04-06 Fluidigm Corporation Microfluidic device and methods of using same
JP4355210B2 (ja) 2001-11-30 2009-10-28 フルイディグム コーポレイション 微小流体デバイスおよび微小流体デバイスの使用方法
US20030180765A1 (en) 2002-02-01 2003-09-25 The Johns Hopkins University Digital amplification for detection of mismatch repair deficient tumor cells
NZ535045A (en) 2002-03-01 2008-04-30 Ravgen Inc Rapid analysis of variations in a genome
US6977162B2 (en) 2002-03-01 2005-12-20 Ravgen, Inc. Rapid analysis of variations in a genome
US7727720B2 (en) * 2002-05-08 2010-06-01 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US7442506B2 (en) * 2002-05-08 2008-10-28 Ravgen, Inc. Methods for detection of genetic disorders
US20070178478A1 (en) * 2002-05-08 2007-08-02 Dhallan Ravinder S Methods for detection of genetic disorders
KR100500697B1 (ko) 2002-10-21 2005-07-12 한국에너지기술연구원 다단계 열회수형 물유동층 열교환기
US7704687B2 (en) * 2002-11-15 2010-04-27 The Johns Hopkins University Digital karyotyping
EP1583846B1 (en) 2003-01-17 2011-11-16 The Chinese University Of Hong Kong Circulating mrna as diagnostic markers for pregnancy-related disorders
JP2006521086A (ja) 2003-02-28 2006-09-21 ラブジェン， インコーポレイテッド 遺伝子疾患の検出方法
US8394582B2 (en) * 2003-03-05 2013-03-12 Genetic Technologies, Inc Identification of fetal DNA and fetal cell markers in maternal plasma or serum
WO2004081183A2 (en) * 2003-03-07 2004-09-23 Rubicon Genomics, Inc. In vitro dna immortalization and whole genome amplification using libraries generated from randomly fragmented dna
WO2004083816A2 (en) 2003-03-14 2004-09-30 John Wayne Cancer Institute Loss of heterozygosity of the dna markers in the 12q22-23 region
WO2004089810A2 (en) * 2003-04-03 2004-10-21 Fluidigm Corp. Microfluidic devices and methods of using same
US7604965B2 (en) * 2003-04-03 2009-10-20 Fluidigm Corporation Thermal reaction device and method for using the same
US7476363B2 (en) * 2003-04-03 2009-01-13 Fluidigm Corporation Microfluidic devices and methods of using same
US20040197832A1 (en) * 2003-04-03 2004-10-07 Mor Research Applications Ltd. Non-invasive prenatal genetic diagnosis using transcervical cells
US20050145496A1 (en) * 2003-04-03 2005-07-07 Federico Goodsaid Thermal reaction device and method for using the same
RU2249820C1 (ru) * 2003-08-18 2005-04-10 Лактионов Павел Петрович Способ ранней диагностики заболеваний, связанных с нарушением функционирования генетического аппарата клетки
EP2354253A3 (en) * 2003-09-05 2011-11-16 Trustees of Boston University Method for non-invasive prenatal diagnosis
US20050282213A1 (en) * 2003-09-22 2005-12-22 Trisogen Biotechnology Limited Partnership Methods and kits useful for detecting an alteration in a locus copy number
WO2005035725A2 (en) 2003-10-08 2005-04-21 The Trustees Of Boston University Methods for prenatal diagnosis of chromosomal abnormalities
EP1524321B2 (en) * 2003-10-16 2014-07-23 Sequenom, Inc. Non-invasive detection of fetal genetic traits
WO2005039389A2 (en) * 2003-10-22 2005-05-06 454 Corporation Sequence-based karyotyping
WO2005044086A2 (en) * 2003-10-30 2005-05-19 Tufts-New England Medical Center Prenatal diagnosis using cell-free fetal dna in amniotic fluid
US20060046258A1 (en) * 2004-02-27 2006-03-02 Lapidus Stanley N Applications of single molecule sequencing
US20100216153A1 (en) * 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US20100216151A1 (en) * 2004-02-27 2010-08-26 Helicos Biosciences Corporation Methods for detecting fetal nucleic acids and diagnosing fetal abnormalities
US7709194B2 (en) 2004-06-04 2010-05-04 The Chinese University Of Hong Kong Marker for prenatal diagnosis and monitoring
DE102004036285A1 (de) * 2004-07-27 2006-02-16 Advalytix Ag Verfahren zum Bestimmen der Häufigkeit von Sequenzen einer Probe
CN1779688A (zh) * 2004-11-22 2006-05-31 寰硕数码股份有限公司 交互式医疗信息系统及方法
CN101137761B (zh) * 2005-03-18 2010-12-08 香港中文大学 产前诊断和监测的标记
US7645576B2 (en) * 2005-03-18 2010-01-12 The Chinese University Of Hong Kong Method for the detection of chromosomal aneuploidies
US20070196820A1 (en) 2005-04-05 2007-08-23 Ravi Kapur Devices and methods for enrichment and alteration of cells and other particles
US20090317798A1 (en) 2005-06-02 2009-12-24 Heid Christian A Analysis using microfluidic partitioning devices
WO2007001259A1 (en) * 2005-06-16 2007-01-04 Government Of The United States Of America, Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Methods and materials for identifying polymorphic variants, diagnosing susceptibilities, and treating disease
US20070059680A1 (en) * 2005-09-15 2007-03-15 Ravi Kapur System for cell enrichment
US20070122823A1 (en) 2005-09-01 2007-05-31 Bianchi Diana W Amniotic fluid cell-free fetal DNA fragment size pattern for prenatal diagnosis
US20070184511A1 (en) * 2005-11-18 2007-08-09 Large Scale Biology Corporation Method for Diagnosing a Person Having Sjogren's Syndrome
AU2006318425B2 (en) * 2005-11-26 2013-05-02 Natera, Inc. System and method for cleaning noisy genetic data and using data to make predictions
PL1981995T5 (pl) * 2006-02-02 2019-10-31 Univ Leland Stanford Junior Nieinwazyjne genetyczne badania przesiewowe płodu metodą analizy cyfrowej
DK1996728T3 (da) 2006-02-28 2011-08-15 Univ Louisville Res Found Detektering af føtale chromosomale abnormiteter under anvendelse af tandem-enkeltnukleotid-polymorfismer
US20080038733A1 (en) * 2006-03-28 2008-02-14 Baylor College Of Medicine Screening for down syndrome
US8058055B2 (en) * 2006-04-07 2011-11-15 Agilent Technologies, Inc. High resolution chromosomal mapping
US7754428B2 (en) 2006-05-03 2010-07-13 The Chinese University Of Hong Kong Fetal methylation markers
US7901884B2 (en) * 2006-05-03 2011-03-08 The Chinese University Of Hong Kong Markers for prenatal diagnosis and monitoring
WO2008111990A1 (en) * 2006-06-14 2008-09-18 Cellpoint Diagnostics, Inc. Rare cell analysis using sample splitting and dna tags
EP2029778B1 (en) 2006-06-14 2018-05-02 Verinata Health, Inc Diagnosis of fetal abnormalities
US20080050739A1 (en) * 2006-06-14 2008-02-28 Roland Stoughton Diagnosis of fetal abnormalities using polymorphisms including short tandem repeats
US8137912B2 (en) * 2006-06-14 2012-03-20 The General Hospital Corporation Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
EP2029779A4 (en) * 2006-06-14 2010-01-20 Living Microsystems Inc HIGHLY PARALLEL SNP GENOTYPING UTILIZATION FOR FETAL DIAGNOSIS
EP2589668A1 (en) * 2006-06-14 2013-05-08 Verinata Health, Inc Rare cell analysis using sample splitting and DNA tags
WO2009035447A1 (en) * 2006-06-14 2009-03-19 Living Microsystems, Inc. Diagnosis of fetal abnormalities by comparative genomic hybridization analysis
EP3406736B1 (en) 2006-06-14 2022-09-07 Verinata Health, Inc. Methods for the diagnosis of fetal abnormalities
JP2009540802A (ja) * 2006-06-16 2009-11-26 セクエノム， インコーポレイテッド サンプルからの核酸を増幅、検出および定量するための方法および組成物
WO2008014516A2 (en) * 2006-07-28 2008-01-31 Living Microsystems, Inc. Selection of cells using biomarkers
KR101489310B1 (ko) * 2007-01-30 2015-02-04 인터디지탈 테크날러지 코포레이션 Ｌｔｅ＿활성 모드에서 암묵적 ｄｒｘ 싸이클 길이 조절 제어
WO2008098142A2 (en) * 2007-02-08 2008-08-14 Sequenom, Inc. Nucleic acid-based tests for rhd typing, gender determination and nucleic acid quantification
EP2153361A4 (en) * 2007-05-04 2010-09-29 Genes It Software Ltd SYSTEM, METHOD AND DEVICE FOR COMPLETE INDIVIDUALIZED GENETIC INFORMATION OR GENETIC CONSULTATION
CA2688032C (en) 2007-05-24 2015-11-03 Apceth Gmbh & Co. Kg Cd34 stem cell-related methods and compositions
HUE030510T2 (hu) 2007-07-23 2017-05-29 Univ Hong Kong Chinese Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával
US20090053719A1 (en) 2007-08-03 2009-02-26 The Chinese University Of Hong Kong Analysis of nucleic acids by digital pcr
EP3103463B1 (en) 2007-09-19 2020-01-01 Pluristem Ltd. Adherent cells from adipose or placenta tissues and use thereof in therapy
US20100112575A1 (en) * 2008-09-20 2010-05-06 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Noninvasive Diagnosis of Fetal Aneuploidy by Sequencing
EP3406737B1 (en) * 2009-11-06 2023-05-31 The Chinese University of Hong Kong Size-based genomic analysis

Also Published As

Publication number Publication date
EP2514842B1 (en) 2016-02-24
JP6522554B2 (ja) 2019-05-29
EP2514842A2 (en) 2012-10-24
JP6629940B2 (ja) 2020-01-15
EP3892736A1 (en) 2021-10-13
JP2016185162A (ja) 2016-10-27
HRP20230033T3 (hr) 2023-03-03
EP2557517A3 (en) 2014-11-05
EA201000231A1 (ru) 2010-06-30
CA3076142C (en) 2023-01-03
JP6151739B2 (ja) 2017-06-21
EP2183692A1 (en) 2010-05-12
CN103902809B (zh) 2017-11-28
NZ582702A (en) 2012-07-27
ES2933486T3 (es) 2023-02-09
IL233261A (en) 2016-07-31
JP7457399B2 (ja) 2024-03-28
KR102443163B1 (ko) 2022-09-14
CN103853916A (zh) 2014-06-11
DK2183693T5 (en) 2019-02-18
JP2010534068A (ja) 2010-11-04
EP2557519A3 (en) 2014-07-23
US20190136323A1 (en) 2019-05-09
EA017966B1 (ru) 2013-04-30
EA039167B1 (ru) 2021-12-13
CN103853916B (zh) 2018-07-27
KR20160113145A (ko) 2016-09-28
US11725245B2 (en) 2023-08-15
HK1177768A1 (zh) 2013-08-30
CA3176319A1 (en) 2009-01-29
EA201600280A1 (ru) 2016-07-29
JP2017148073A (ja) 2017-08-31
CN101971178A (zh) 2011-02-09
SI2183693T1 (sl) 2014-02-28
JP2022103371A (ja) 2022-07-07
EP2183693B2 (en) 2018-11-14
PT2183693E (pt) 2014-01-14
EP2557520B1 (en) 2021-04-07
EP3745405A1 (en) 2020-12-02
JP6695392B2 (ja) 2020-05-20
CY1124357T1 (el) 2022-07-22
KR102147626B1 (ko) 2020-08-24
KR102076438B1 (ko) 2020-02-11
ES2441807T5 (es) 2019-04-25
CA3009992C (en) 2021-10-19
EP2557517B1 (en) 2022-10-26
CN101849236A (zh) 2010-09-29
US20140045181A1 (en) 2014-02-13
CA2900927C (en) 2018-08-14
CA2693081A1 (en) 2009-01-29
JP2023178477A (ja) 2023-12-14
HUE061020T2 (hu) 2023-05-28
EP2557518B1 (en) 2017-03-15
DK2183693T4 (en) 2019-02-11
EP4134960A1 (en) 2023-02-15
HK1182195A1 (zh) 2013-11-22
KR102222378B1 (ko) 2021-03-04
KR102197512B1 (ko) 2021-01-04
MX346069B (es) 2017-03-06
EP3656870A1 (en) 2020-05-27
KR20160113147A (ko) 2016-09-28
HRP20160493T1 (hr) 2016-07-15
LT2557520T (lt) 2021-05-25
CN106834474A (zh) 2017-06-13
DK2527471T3 (da) 2020-05-18
CY1114773T1 (el) 2016-12-14
CN106886688B (zh) 2020-07-10
CA3076142A1 (en) 2009-01-29
HK1199067A1 (en) 2015-06-19
CA2694007C (en) 2019-02-26
SI2557520T1 (sl) 2021-08-31
HUE054639T2 (hu) 2021-09-28
EP2557520A2 (en) 2013-02-13
CA3076159A1 (en) 2009-01-29
KR20210028263A (ko) 2021-03-11
EP2183693A1 (en) 2010-05-12
KR20180100713A (ko) 2018-09-11
ZA201000524B (en) 2011-03-30
CA3029497C (en) 2023-08-08
CA3200589A1 (en) 2009-01-29
EP2527471A2 (en) 2012-11-28
CA3029497A1 (en) 2009-01-29
ES2869347T3 (es) 2021-10-25
EP2514842A3 (en) 2012-12-26
AU2008278843A1 (en) 2009-01-29
KR102060911B1 (ko) 2019-12-30
JP7081829B2 (ja) 2022-06-07
HRP20210983T1 (hr) 2021-09-17
US20140256559A1 (en) 2014-09-11
CA3009992A1 (en) 2009-01-29
KR20170127073A (ko) 2017-11-20
JP2020115887A (ja) 2020-08-06
KR20210130269A (ko) 2021-10-29
KR101829564B1 (ko) 2018-02-14
CA2694007A1 (en) 2009-01-29
PL2514842T3 (pl) 2016-08-31
KR20100075826A (ko) 2010-07-05
CN103902809A (zh) 2014-07-02
DK2557517T3 (da) 2022-11-28
US20140256560A1 (en) 2014-09-11
HRP20140009T1 (hr) 2014-03-14
EA201791612A3 (ru) 2018-03-30
EA202192446A1 (ru) 2022-01-31
LT2557517T (lt) 2023-01-10
KR101916456B1 (ko) 2018-11-07
BRPI0814670A2 (pt) 2015-02-18
KR20180121695A (ko) 2018-11-07
EA035451B1 (ru) 2020-06-18
EA201791612A2 (ru) 2017-11-30
ES2441807T3 (es) 2014-02-06
KR101896167B1 (ko) 2018-09-07
KR20200055151A (ko) 2020-05-20
EA201300072A1 (ru) 2014-11-28
US20090029377A1 (en) 2009-01-29
JP2020031663A (ja) 2020-03-05
KR102339760B1 (ko) 2021-12-14
KR20100058503A (ko) 2010-06-03
NZ600407A (en) 2013-12-20
US20140329696A1 (en) 2014-11-06
JP7381116B2 (ja) 2023-11-15
KR102112438B1 (ko) 2020-06-04
CN103849684A (zh) 2014-06-11
US10208348B2 (en) 2019-02-19
AU2008278839B2 (en) 2013-04-04
CN106834481A (zh) 2017-06-13
SG183062A1 (en) 2012-08-30
US8706422B2 (en) 2014-04-22
PL2183693T5 (pl) 2019-04-30
EP2527471A3 (en) 2012-12-26
EP2557519A2 (en) 2013-02-13
US8972202B2 (en) 2015-03-03
JP6383837B2 (ja) 2018-08-29
KR20160113148A (ko) 2016-09-28
CN106834474B (zh) 2019-09-24
EA028642B1 (ru) 2017-12-29
CN106676188A (zh) 2017-05-17
SI2514842T1 (sl) 2016-06-30
KR20190143494A (ko) 2019-12-30
IL233261A0 (en) 2014-08-31
PL2183693T4 (pl) 2015-11-30
SI2183693T2 (sl) 2019-02-28
EP2557520A3 (en) 2015-04-29
HK1144024A1 (en) 2011-01-21
KR101966262B1 (ko) 2019-04-08
KR20190114039A (ko) 2019-10-08
JP2022040312A (ja) 2022-03-10
KR20160030404A (ko) 2016-03-17
KR102516709B1 (ko) 2023-04-03
KR101829565B1 (ko) 2018-03-29
US9051616B2 (en) 2015-06-09
WO2009013492A1 (en) 2009-01-29
CN101971178B (zh) 2014-03-26
JP2010534069A (ja) 2010-11-04
EP3067807A1 (en) 2016-09-14
DK2514842T3 (en) 2016-05-30
US20230323462A1 (en) 2023-10-12
PL2557520T3 (pl) 2021-10-11
DK2183693T3 (da) 2014-01-20
JP2024056078A (ja) 2024-04-19
KR20190114041A (ko) 2019-10-08
JP2015142588A (ja) 2015-08-06
CN106886688A (zh) 2017-06-23
WO2009013496A1 (en) 2009-01-29
KR101972994B1 (ko) 2019-04-29
JP5519500B2 (ja) 2014-06-11
CA3076159C (en) 2022-05-24
EP2557519B1 (en) 2020-08-19
KR102128960B1 (ko) 2020-07-02
SI2557517T1 (sl) 2023-03-31
PL2557517T3 (pl) 2023-03-06
HRP20140009T4 (hr) 2019-03-08
EP2183692B1 (en) 2017-08-23
CA2900927A1 (en) 2009-01-29
US20200056242A1 (en) 2020-02-20
CA3127930A1 (en) 2009-01-29
CN107083425A (zh) 2017-08-22
JP2019013245A (ja) 2019-01-31
EP2183693B1 (en) 2014-01-01
EP3540739A1 (en) 2019-09-18
HK1224033A1 (zh) 2017-08-11
KR20230117256A (ko) 2023-08-07
EA201201551A1 (ru) 2013-08-30
ES2792802T3 (es) 2020-11-12
KR20220127377A (ko) 2022-09-19
KR20160113146A (ko) 2016-09-28
MX341573B (es) 2016-08-25
BRPI0814670B1 (pt) 2019-10-01
ES2820866T3 (es) 2021-04-22
JP5736170B2 (ja) 2015-06-17
KR20220146689A (ko) 2022-11-01
EP2557518A2 (en) 2013-02-13
PT2557520T (pt) 2021-05-06
FI2557517T3 (fi) 2022-11-30
EP2527471B1 (en) 2020-03-04
CY1117525T1 (el) 2017-04-26
US20090087847A1 (en) 2009-04-02
JP2019000113A (ja) 2019-01-10
KR101646978B1 (ko) 2016-08-09
EP2557518A3 (en) 2014-10-08
KR102458210B1 (ko) 2022-10-24
DK2557519T3 (da) 2020-09-21
KR20230047215A (ko) 2023-04-06
EP2557517A2 (en) 2013-02-13
CN107083424A (zh) 2017-08-22
US20140329695A1 (en) 2014-11-06
BRPI0814670B8 (pt) 2021-07-27
JP2022173465A (ja) 2022-11-18
EA035451B9 (ru) 2020-09-09
DK2557520T3 (da) 2021-05-31
JP2014073134A (ja) 2014-04-24
KR20200100860A (ko) 2020-08-26
KR20210006468A (ko) 2021-01-18
ES2571738T3 (es) 2016-05-26
JP2020031664A (ja) 2020-03-05
KR102561664B1 (ko) 2023-07-28
KR20180114251A (ko) 2018-10-17
PL2183693T3 (pl) 2014-03-31
MX2010000846A (es) 2010-04-21
PT2557517T (pt) 2023-01-04
AU2008278839A1 (en) 2009-01-29
EP3770275A1 (en) 2021-01-27
CA2693081C (en) 2016-01-26
JP7026303B2 (ja) 2022-02-28
IL203311A (en) 2014-07-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11142799B2 (en) Detecting chromosomal aberrations associated with cancer using genomic sequencing
HUE030510T2 (hu) Magzati kromoszómális aneuploidia diagnosztizálása genomszekvenálás alkalmazásával
TW202336235A (zh) 血漿粒線體dna分析之應用
AU2013203077B2 (en) Diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using genomic sequencing
AU2013200581B2 (en) Diagnosing cancer using genomic sequencing
AU2008278843B2 (en) Diagnosing fetal chromosomal aneuploidy using genomic sequencing