CN105132572B - 一种无创产前筛查21‑三体综合征试剂盒 - Google Patents

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    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明公开了一种无创产前筛查21‑三体综合征试剂盒，关于核酸的测定或检验方法技术领域。包括PCR 反应液，PCR 反应液中含有探针TaqMam UPL6‑FAM和TaqMam UPL15‑TET 探针，TaqMam UPL6‑FAM和TaqMam UPL15‑TET探针分别用于检测18和21号染色体，针对21和18号染色体分别设计20对引物，基因序列SEQ ID NO.1‑40和SEQ ID NO.41‑80；TaqMam UPL6‑FAM 和TaqMam UPL15‑TET探针基因序列SEQ ID NO.81和SEQ ID NO.82。本发明可以实现21‑三体综合征的无创产前筛查，准确率高。

Description

一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒
技术领域
本发明关于核酸的测定或检验方法技术领域，尤其涉及一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒。
背景技术
21-三体综合征是胎儿最常见的染色体病，在新生儿中的发病率约为1/800，占小儿染色体病的70-80％，发病率随着母亲年龄的增高而增高。目前我国大约有100万以上的患者，平均20分钟就有一例21-三体综合征患儿出生，全国每年出生的21-三体综合征患儿可多达27万例左右。21-三体综合征患者由于多了1条第21号染色体，主要表现为智力低下，发育迟缓和特殊面容。由于21-三体综合征给父母、家庭和社会带来了无可挽回的痛苦和沉重的精神负担，因此对高龄孕妇等高危人群进行产前诊断尤为重要和必要。当前在进行产前诊断时，必须采取创伤性的手段获取胎儿细胞样本如羊水或者绒毛组织，尽管这些创伤性的手段相对比较安全，但是对胎儿和母亲仍然存在一定的风险，因此临床上只对可能怀有遗传异常胎儿的高风险孕妇进行产前诊断。为了避免潜在的风险，在过去几十年中，人们一直广泛应用的方法是从母血中分离胎儿有核红细胞，但是由于胎儿有核红细胞在母血中含量稀少，需要进行细胞富集等种种操作程序限制了该方法的发展和实际应用。
1997年香港中文大学卢煜明 (Dennis Lo)教授发现，母体外周血中存在游离胎儿DNA，大概在孕4周的时候含量很少，孕8周的时候明显增多，随孕周增加稳定存在，浓度约3-13%，被认为主要来自胎盘，并在后数小时内从母体血液中清除。母体血中存在的胎儿游离DNA，此重大发现的论文发表在1997年的《柳叶刀》杂志上（Lancet1997；350:485-87）。从此开辟了无创产前研发的热潮，尤其是高通量测序技术为无创筛查在临床应用方面开辟了先河。该技术通过抽取孕妇静脉血，提取到血清中胎儿游离DNA，利用新一代DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA片段（包含胎儿游离DNA）进行测序，并将测序结果进行生物信息分析，可以从中得到胎儿的遗传信息。
多重杂交特异扩增技术(Multiplex Hybri dization-specific Amplification，MHSA)，是一种灵敏度极高的相对定量技术，它利用核酸杂交、连接反应和PCR扩增反应，可以在同一反应体系内检测多达40个不同核酸序列拷贝数变化，其进行无创产前21-三体检测原理是将制备的长型探针和短型探针同目的基因序列杂交，杂交后短探针的5’-端和长探针的3’-端彼此能够通过连接酶连接成一条DNA片段。不匹配的探针杂交后不能被连接酶连接。所有被连接的DNA序列都有共同的5’和3’末端，因此可以仅仅用一对引物在一个PCR体系中扩增不同的目的基因序列。由于长型探针有片段大小可变的中间序列，因此每对MHSA探针组可以扩增出特定片段大小的一段序列。通过电泳的方法即可以分辨出不同的目的基因序列。
上述的产前基因诊断有建立在羊膜腔穿刺、绒毛吸取等侵入性基础上进行的细胞遗传学诊断，虽然诊断准确，但因其操作有创伤性，易引起宫内感染、流产、甚至对胎儿有一定的影响，属于侵入性检查。而高通量测序方法和其它无创的方法虽然解决了侵入性带来的问题，但是操作相对繁琐，灵敏度有待进一步提高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒，该试剂盒引物设计合理，可以实现21-三体综合征的无创产前筛查，准确率高，有效防止新患儿出生，从根源上阻断有害基因下传，从而实现无创的预防。
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒，包括PCR 反应液，PCR 反应液中包含有探针和引物，所述探针为TaqMam UPL6-FAM 探针和TaqMam UPL15-TET 探针，TaqMam UPL6-FAM探针用于检测18号染色体，TaqMamUPL15-TET探针用于检测21号染色体，针对21号染色体设计20对相应的上游引物与下游引物，进行合成，其基因序列为SEQ ID NO. 1-40；以及针对18号染色体设计20对相应的上游引物与下游引物，进行合成，其基因序列为SEQ ID NO. 41-80；TaqMam UPL6-FAM探针，其基因序列为SEQ ID NO. 81；TaqMam UPL15-TET探针，其基因序列为SEQ ID NO. 82。
优选的，PCR 反应液中还包含有提取的孕妇外周血胎儿cfDNA、TaqManGenotyping Master Mix、美国RainDace Technologies公司的液滴稳定剂和超纯水。液滴稳定剂由Source仪器供应商美国RainDace Technologies公司提供。
进一步有效地，PCR反应液中TaqMan Genotyping Master Mix的终浓度为1×，美国RainDace Technologies公司的液滴稳定剂的终浓度为1×，上游引物的终浓度为0.5μM，下游引物的终浓度为0.5μM，TaqMam UPL6-FAM探针的终浓度为0.2μM，TaqMam UPL15-TET探针的终浓度为0.2μM。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
（1）本发明的试剂盒，引物设计合理，可以实现21-三体综合征的无创产前筛查，准确率高,与目前医学上有创的诊断方法——抽取羊水或绒毛膜等检测结果完全吻合，有效防止新患儿出生，从根源上阻断有害基因下传，从而实现无创的预防。
（2）本发明采集孕妇外周血进行21-三体综合征的无创产前筛查，无需穿刺羊膜腔和插入绒毛组织，对胎儿无任何创伤，安全可靠；且DNA起始量更低，CV值可以达到0.68%，准确度更高。
（3）本发明采用20重数字PCR单分子扩增，采用计数的方法进行定量，具有更高的灵敏度。
（4）本发明操作简单快捷，缩短检测周期，仅需两天即可完成整个流程。
（5）本发明全封闭式检测，减少交叉污染。
附图说明
下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明；
图1是本发明实施例2样本1孕妇外周血胎儿cfDNA进行数字PCR后探针荧光强度相位图。
具体实施方式
实施例中用到的仪器如下：
Source仪器：厂家为美国RainDace Technologies公司，型号为RainDrop；Source仪器用于PCR 反应液的油包水微滴制备，Source仪器中文翻译为油包水制备仪；
PCR仪：厂家为北京东胜创新生物科技有限公司，型号为ETC811的基因扩增仪；PCR仪用于PCR 反应液油包水微滴的扩增，得到PCR产物；
Sense仪器：厂家为美国RainDace Technologies公司，型号为RainDrop；Sense仪器用于对PCR产物进行荧光信号检测，Sense仪器中文翻译为荧光信号检测仪。
实施例1
一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒，包括PCR 反应液，PCR 反应液中包含有探针和引物，探针为TaqMam UPL6-FAM 探针和TaqMam UPL15-TET 探针，TaqMam UPL6-FAM探针用于检测18号染色体，TaqMam UPL15-TET探针用于检测21号染色体，针对21号染色体设计20对相应的上游引物与下游引物，进行合成，其基因序列为SEQ ID NO. 1-40；以及针对18号染色体设计20对相应的上游引物与下游引物，进行合成，其基因序列为SEQ ID NO.41-80；TaqMam UPL6-FAM探针，其基因序列为 SEQ ID NO. 81；TaqMam UPL15-TET探针，其基因序列为SEQ ID NO. 82。
PCR 反应液中还包含有提取的孕妇外周血胎儿cfDNA、TaqMan GenotypingMaster Mix、液滴稳定剂和超纯水。
PCR反应液中TaqMan Genotyping Master Mix的终浓度为1×，美国RainDaceTechnologies公司的液滴稳定剂的终浓度为1×，上游引物的终浓度为0.5μM，下游引物的终浓度为0.5μM，TaqMam UPL6-FAM探针的终浓度为0.2μM，TaqMam UPL15-TET探针的终浓度为0.2μM。
实施例2 无创产前筛查21-三体综合征试剂盒的应用，包括以下步骤：
步骤1：采集孕妇外周EDTA抗凝血，进行孕妇外周血中游离DNA提取；
2：利用引物设计软件自主设计引物，进行油包水微滴的制备；
3：20重数字PCR单分子扩增；
4：对PCR产物进行光学信号检测及计数；
5：对结果进行生物信息学分析，获得胎儿遗传数据。
具体包括以下步骤：
从医院抽取5份产检为唐筛高危的孕妇外周血各10mL（这5个孕妇同时在医院进行了抽取羊水进行21-三体综合征的诊断，其中两个被确诊为21-三体综合征，三个为正常胎儿），按照下述步骤进行21-三体综合征的无创产前筛查。
一 孕妇外周血胎儿游离DNA（cell-free DNA, cfDNA）提取
①无菌操作用15mL真空EDTA抗凝采血管采全血10mL，避免溶血。
②低温离心机800g离心，4°C，10分钟，吸取上清液。
③取上清液（血浆约4-5mL）转入15 mL新聚丙烯试管，1600g、4°C离心10 分钟。
④取上清液1mL (2.0 mL新聚丙烯试管)，加入1/10体积的蛋白酶K buffer(10X)，脉冲式震荡混匀30 秒；再加入蛋白酶K（proteinase K，30∪/mL,不含DNase和RNase），使终浓度为0.1-1 mg/mL，脉冲式震荡混匀30 秒。
⑤60°C水浴30分钟，4°C 低温，16,000g 离心10分钟。
⑥吸取含游离DNA片段的上清液，冷却至4 ℃,加等体积Tris饱和酚，震荡混匀30秒充分混匀。4 ℃低温条件，4600g 离心30分钟；吸取上清液于另一新管中，重复一次。
⑦吸取上清液至新管，加等体积氯仿/异戊醇混合液(体积比24∶1)，震荡30秒充分混匀，4 ℃低温条件下4600g离心5分钟，吸取上层溶液。
⑧加入2.5倍体积冷95%乙醇,震荡30秒充分混匀。
⑨4℃低温条件，高速离心5分钟，取得DNA沉淀；
⑩弃上清液，用1mL的70%冷乙醇清洗DNA沉淀3-4次；抽真空干燥，或自然风干（倒置），加100μl TE溶解DNA沉淀。
二 油包水微滴的制备
1 将PCR反应液共30ul按如下配比加入到200ul EP管中，吹打混匀，避免出现气泡；
TaqMam UPL6-FAM 探针，其基因序列为：CAGAGGAA；
TaqMam UPL15-TET探针，其基因序列为：TCCTGCTC；
上下游引物见下表：
针对21号染色体设计合成的20对相应的上游引物与下游引物，其基因序列如表1所示：
针对18号染色体设计合成的20对相应的上游引物与下游引物，其基因序列如表2所示：
2 用移液枪将上述反应液转移到Source芯片中，避免气泡产生。
3 将Source芯片上的LOT-CN号输入软件后，放入Source仪器，将8联排EP管放入芯片下方，用于接收油滴。
4 软件显示各项指示正常，即可点击“Start a Run”进行油包水微滴的制备。
5 查看油包水微滴制备质量是否合格，合格的进行下一步操作。不合格的，查找原因，重新制备（油包水微滴质量主要看微滴数量，50ul的PCR反应液可制备1千万个液滴。如果数量不合格，要检查是否加入了液滴稳定剂，以及试剂中是否有杂质）。
三 PCR反应
将上述制备好的油包水微滴8联排管放置到PCR仪上进行扩增。程序如下：
四 荧光信号检测
1 将PCR产物8联排放入Sense仪器；
2 将Sense检测芯片放入Sense仪器；
3 按程序操作，Sense仪器对PCR产物进行检测。
五 数据分析
利用RainDrop Analyst分析软件，对检测数据进行分析。计算18号染色体和21染色体拷贝数和比值，判断胎儿的遗传信息，发送检测报告。
下表为5例孕妇利用该技术进行无创产前21-三体综合症试验结果，和抽羊水诊断（目前医学上以羊水结果为最终确诊标准）结果完全吻合，准确率100%。
图1为样本1孕妇外周血胎儿cfDNA进行数字PCR后探针荧光强度相位图，横坐标为18号染色体UPL6-FAM探针荧光强度，纵坐标为21号染色体UPL15-TET探针荧光强度。
图中每个黑点代表一条DNA模板及染色体，软件会统计勾选的黑色点的数目，即为样本中某条染色体拷贝数，然后通过上面的表，计算21号染色体和18号染色体数目比值，超出1.032的即为21-三体综合征患儿，小于0.993的为其它染色体问题。
本发明试剂盒引物设计合理，可以实现21-三体综合征的无创产前筛查，准确率高，有效防止新患儿出生，从根源上阻断有害基因下传，从而实现无创的预防。

Claims (3)

1.一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒，其特征在于：包括PCR反应液，PCR反应液中包含有探针和引物，所述探针为TaqMam UPL6-FAM探针和TaqMam UPL15-TET探针，TaqMamUPL6-FAM探针用于检测18号染色体，TaqMam UPL15-TET探针用于检测21号染色体，针对21号染色体设计20对相应的上游引物与下游引物，进行合成，其基因序列为SEQ ID NO.1-40；以及针对18号染色体设计20对相应的上游引物与下游引物，进行合成，其基因序列为SEQID NO.41-80；TaqMam UPL6-FAM探针，其基因序列为SEQ ID NO.81；TaqMam UPL15-TET探针，其基因序列为SEQ ID NO.82；
所述PCR反应液中还包含有提取的孕妇外周血胎儿cfDNA，所述试剂盒用于孕妇外周血中胎儿cfDNA的检测。
2.根据权利要求1所述的一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒，其特征在于所述PCR反应液中还包含有TaqMan Genotyping Master Mix、美国RainDace Technologies公司的液滴稳定剂和超纯水。
3.根据权利要求2所述的一种无创产前筛查21-三体综合征试剂盒，其特征在于：PCR反应液中TaqMan Genotyping Master Mix的终浓度为1×，美国RainDace Technologies公司的液滴稳定剂的终浓度为1×，上游引物的终浓度为0.5μM，下游引物的终浓度为0.5μM，TaqMam UPL6-FAM探针的终浓度为0.2μM，TaqMam UPL15-TET探针的终浓度为0.2μM。
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